KR102362006B1 - 항-트립타제 항체, 이의 조성물, 및 그의 용도 - Google Patents

항-트립타제 항체, 이의 조성물, 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-트립타제 항체 및 이의 약제학적 조성물을 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 상기 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

항-트립타제 항체, 이의 조성물, 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 U.S. 가출원 번호 62/457,722(2017년 2월 10일 출원)에 대한 이점을 주장하며, 상기 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 편입되어 있다.
서열 목록
본원은 ASCII 포맷으로 전자 형식으로 제출되어, 그 전체가 참조로 본원에 편입된 서열 목록을 포함한다. 상기 ASCII 복사물 (2018년 2월 9일 제작)는 50474-112WO2_Sequence_Listing_2.9.18_ST25로 명명하고 그 크기는 108,967 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 항-트립타제 항체, 약제학적 조성물, 및 그것을 사용하는 방법에 관한 것이다.
인간 트립타제 베타는 비만 세포에서 그리고, 적게는, 호염기구에서 풍부한 트립신-유사 세린 프로테아제이다. TPSAB1 및 TPSB2 유전자좌에 의해 생산된 인간 트립타제 베타 (이들 중 3 아형, 트립타제 베타 1, 트립타제 베타 2, 및 트립타제 베타 3이 있다)는 인간 비만 세포에 의해 생산된 우세한 활성 트립타제이다. 이들 2 유전자좌는 4 트립타제 동형체를 생산하고; TPSAB1은 트립타제 알파 및 트립타제 베타 1을 생산하며, 반면에 TPSB2는 트립타제 베타 2 및 트립타제 베타 3을 생산한다. 트립타제 알파, 뿐만 아니라 다른 동형체 예컨대 트립타제 감마, 트립타제 델타, 및 트립타제 엡실론은 주로 불활성이다.
단백질분해로 가공된, 활성 트립타제 베타는 헤파린과 복합체에서 사량체로서 비만 세포의 분비성 과립에서 저장된다. IgE-의존적 자극 (예를 들어, 알러지항원), 또는 비-IgE-의존적 자극 (예를 들어, 서브스턴스 P 또는 활성 트립타제)에 의해 야기될 수 있는, 비만 세포 탈과립화는 다른 과립 효소 및 히스타민과 함께 트립타제 베타의 방출을 유발시킨다. 이전의 연구는 천식 환자의 기관지 평활근 및 상피에서 증가된 비만 세포 수, 뿐만 아니라 기관지폐포 세척 유체에서 트립타제 베타의 증가된 수준을 관측하여 왔다. 또한, 트립타제는 기도 기관지수축 및 과반응성에 기여하고, 기도 재형성 과정의 특질인, 섬유증 및 세포외 기질 턴오버에서 역할을 하도록 또한 제안되어 왔다.
트립타제는, 천식 및 다른 폐, 염증성, 자가면역, 및 섬유성 장애를 포함하여, 다양한 질환 및 장애에 관여되도록 제안되어 왔고, 이에 대하여 치료적 항-트립타제 길항제, 및 치료 방법을 포함하여, 개선된 치료제에 대한 요구가 남아 있다. 소분자 트립타제 억제제를 개발하기 위한 시도가 있었지만 (참고, 예를 들어, Cairns, J.A., 2005, Pulmonary Pharmacology & Therapeutics 18:55-66); 우리가 아는 바로는, 생물학적 트립타제 길항적 치료제, 특히 항-트립타제 길항적 항체는 보고되지 않았다.
본 발명은 항-트립타제 항체 및 이의 약제학적 조성물, 뿐만 아니라 그것을 사용하는 방법에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 트립타제 베타 1, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 상기 항체는 하기 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DYGMV (서열번호:7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RNYDDWYFDV (서열번호:8); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6). 일부 구현예에서, 항체는 하기의 아미노산 서열을 포함하는 6개의 HVR에 의해 정의된다: 서열번호:7, 2, 8, 4, 5, 및 6. 일부 구현예에서, 항체는 추가로, 경쇄 가변성 (VL) 도메인 프레임워크 영역 L2 (FR-L2) (카밧 넘버링)에서 S43, P46, 및 W47을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 도메인; (b) 서열번호:10의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 (VL) 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체는 추가로 하기의 VH 도메인 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (서열번호:11); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGKGLEWVA (서열번호:12); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (서열번호:13); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:14). 일부 구현예에서, VH 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:9. 일부 구현예에서, 항체는 추가로 하기의 VL 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호:15); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKSPKPWIY (서열번호:16); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호:17); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열번호:18). 일부 구현예에서, VL 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:10. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 다른 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 트립타제 베타 1, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 상기 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호:10의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 다른 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 항체를 특징으로 한다: (a) 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 항체를 특징으로 한다: (a) 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 트립타제 베타 1, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 상기 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DYGMV (서열번호:7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RDNYDWYFDV (서열번호:29); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및
(f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6). 일부 구현예에서, 항체는 추가로, 하기 VH 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVKLVESGGGSVQPGGSRKLSCAASGFTFS (서열번호:21); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGKGLEWVA (서열번호:22); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RFTISRDNPKNTLFLQMSSLRSEDTAMYYCAR (서열번호:23); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGTGTTVTVSS (서열번호:24). 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 하기 VL 도메인 FR을 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISC (서열번호:25); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGSSPKPWIY (서열번호:26); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC (서열번호:27); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGAGTKLELK (서열번호:28). 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호:20의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 트립타제 베타 1, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 상기 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95% 서열, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:19; (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:20; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체는 추가로, 하기 VH 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVKLVESGGGSVQPGGSRKLSCAASGFTFS (서열번호:21); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGKGLEWVA (서열번호:22); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RFTISRDNPKNTLFLQMSSLRSEDTAMYYCAR (서열번호:23); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGTGTTVTVSS (서열번호:24). 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호:19의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 하기 VL 도메인 FR을 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISC (서열번호:25); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGSSPKPWIY (서열번호:26); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC (서열번호:27); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGAGTKLELK (서열번호:28). 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호:20의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 트립타제 베타 1, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 상기 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:19 및 (b) 하기의 아미노산 서열에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:20.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 상기 항체는 하기의 His51, Val80, Lys81, 및 Asp82로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 또는 모두 4개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 상기 항체는 하기의 His51, Val80, Lys81, 및 Asp82로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 또는 모두 4개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 상기 항체는 His51 및 하기의 Val80, Lys81, 및 Asp82로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 추가로, 하기의 Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 하기의 Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 모두 12개의 아미노산 잔기를 포함한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 서열번호:71의 His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130을 포함한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 인간 트립타제 베타 1 단량체 또는 사량체와 관련된다. 일부 구현예에서, 에피토프는 X-선 결정학 모델에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 항체는 사량체 인간 트립타제 베타 1의 작은 계면과 사량체 인간 트립타제 베타 1의 큰 계면 둘 모두를 해리시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 트립타제 베타 1, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 상기 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYAIT (서열번호:30); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GISSAATTFYSSWAKS (서열번호:31); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: DPRGYGAALDRLDL (서열번호:32); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: QSIKSVYNNRLG (서열번호:33); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ETSILTS (서열번호:34); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: AGGFDRSGDTT (서열번호:35). 일부 구현예에서, 항체는 하기의 아미노산 서열을 포함하는 6개의 HVR에 의해 정의된다: 서열번호:30, 31, 32, 33, 34, 및 35. 일부 구현예에서, 항체는 추가로, VH 도메인 FR-H3 (카밧 넘버링)에서 Arg71 및 Val78을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 추가로, 하기 VH 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (서열번호:38); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WIRQPPGKGLEWIG (서열번호:42); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (서열번호:43); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:41). 일부 구현예에서, VH 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:36. 일부 구현예에서, 항체는 하기 VL 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호:64); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호:65); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호:66); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열번호:63). 일부 구현예에서, VL 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:37. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 다른 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 트립타제 베타 1, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 상기 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:36, 47, 48, 49, 50, 51, 및 52 중 임의의 하나의 하기의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열번호:37, 53, 58, 또는 59 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체는 추가로, 하기 VH 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (서열번호:38); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WIRQPPGKGLEWIG (서열번호:42); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (서열번호:43); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:41). 일부 구현예에서, VH 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:36. 일부 구현예에서, 항체는 하기 VL 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호:64); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호:65); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호:66); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열번호:63). 일부 구현예에서, VL 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:37. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 다른 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 트립타제, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 상기 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:36의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호:37의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 다른 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 항체를 특징으로 한다: (a) 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 항체를 특징으로 한다: (a) 서열번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 트립타제, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 상기 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:52의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호:53의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 상기 항체는 하기의 Gln100, Leu101, 및 Leu102로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 추가로, 하기를 포함한다: 하기의 Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, 및 Glu129로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 하기를 포함한다: 하기의 Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, 및 Glu129로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 또는 모두 14개의 아미노산 잔기: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 에피토프는 하기를 포함한다: 하기의 Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Gln100, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129, 및 Arg216: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 에피토프는 인간 트립타제 베타 1 단량체 또는 사량체와 관련된다. 일부 구현예에서, 에피토프는 인간 트립타제 베타 1 사량체와 관련되고, 그리고 상기 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 추가로, 하기를 포함한다: 하기의 Gln35 및 Arg216 중 하나 또는 둘 모두: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 에피토프는 X-선 결정학 모델에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 트립타제 베타 1의 작은 계면 및/또는 큰 계면을 해리시킬 수 있다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 추가로, 사이노몰구스 원숭이 (사이노) 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 추가로, 인간 트립타제 알파에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 추가로, 인간 트립타제 베타 2 또는 인간 트립타제 베타 3에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 트립타제 베타 2 및 인간 트립타제 베타 3에 결합한다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 약 1 nM 이하의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, KD는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검정에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 항체는 약 120 pM 내지 약 0.5 nM의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 120 pM 내지 약 300 pM의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 120 pM 내지 약 200 pM의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 180 pM의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 400 pM의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, SPR 검정은 25 ℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, KD는, 예를 들어, 실시예 1, 부문 (A)(vii)에서 기재된 바와 같이 BIACORE® SPR 검정을 사용하여 측정된다. 일부 구현예에서, SPR 검정은 BIAcore® T200 또는 동등한 디바이스를 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, BIAcore® 시리즈 S CM5 센서 칩 (또는 동등한 센서 칩)은 단클론성 마우스 항-인간 IgG (Fc) 항체로 고정되고 항-트립타제 항체는 후속으로 유동 세포에서 포착된다. 하기의 연속 3-배 희석액: His-태깅된 인간 트립타제 베타 1 단량체 (서열번호:128)은 30 μl/분의 유량으로 주입된다. 각각의 샘플은 3 분 회합 및 10 분 해리로 분석된다. 검정은 25 ℃에서 수행된다. 각각의 주입 후, 칩은 3 M MgCl2를 이용하여 재생된다. 결합 반응은 유사한 밀도에 무관한 IgG를 포착하는 유동 세포로부터 반응 단위 (RU)를 감산함으로써 정정된다. kon 및 koff의 동시 적합화의 1:1 랭뮤어 모델은 동력학 분석에 사용된다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 인간 트립타제 베타 1의 효소적 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 기질로서 합성 펩타이드 S-2288을 사용하는 인간 트립타제 베타 효소적 검정로 결정시, 약 2.5 nM 이하의 IC50로 트립타제의 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 550 pM 내지 약 2.5 nM의 IC50로 트립타제의 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 500 pM 내지 약 2 nM의 IC50로 트립타제의 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 550 nM 및 1.5 nM의 IC50로 트립타제의 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 500 pM 내지 약 700 pM의 IC50로 트립타제의 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, 항체의 억제 활성은 실시예 1(A)(viii)(a))에 기재된 바와 같이 결정된다. 일부 구현예에서, 합성 펩타이드 S-2288을 사용하는 인간 트립타제 베타 효소적 검정에서 헤파린의 최종 농도는 66 μg/ml이다. 일부 구현예에서, 재조합 인간 트립타제 베타 1 사량체 활성 효소는 TNH 완충액 (200 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mg/mL 헤파린, 0.01% TRITON™ X-100, pH 8.0) 중 0.75 nM로 희석되고, 384-웰 플레이트에서 항-트립타제 항체 (PBS에서 희석됨)와 1:1 조합된다. 플레이트는 온화한 진탕과 함께 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션된다. 비색계 기질 S-2288 (Chromogenix, 부품 번호 82-0852-39), 또는 동등한 기질은 TNH 완충액내 1200 μM로 희석되고 플레이트에 첨가된다. 일부 구현예에서, 최종 인-웰 농도는 400 μM S-2288, 0.25 nM 재조합 인간 트립타제 베타 1 사량체, 66 μg/mL 헤파린, 및 0.10 내지 222 nM 항-트립타제 항체이다. 플레이트는 온화한 진탕과 함께 주위 온도에서 40분 동안 인큐베이션되고 그 다음 A405에서 판독된다. 항-트립타제 항체의 IC50은 그들의 각각의 곡선의 4-파라미터 적합으로부터 결정된다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 pH 6에서 인간 트립타제 베타 1의 효소적 활성을 억제할 수 있다. 특히, 항체의 억제 활성은 pH 6에서 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 기관지 평활근 세포 증식 및/또는 콜라겐-기반 수축의 트립타제-매개된 자극을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 비만 세포 히스타민 방출을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 IgE-유발된 히스타민 방출 및/또는 트립타제-유발된 히스타민 방출을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 활성 트립타제 ELISA 검정에 의한 평가시, 사이노 트립타제 D1을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 사이노몰구스 원숭이 세기관지 세척 (BAL) 또는 비수착 샘플에서 트립타제 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 1가 형식일 때 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 1가 형식은 Fab 형식이다. 일부 구현예에서, 항체는 헤파린의 존재에서 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 66 μg/ml 헤파린의 존재에서 사량체 트립타제 베타를 해리시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이전의 항체 중 임의의 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 상기 항체가 동일한 에피토프에 결합하거나 인간 트립타제 베타 1에 결합하기 위해 경쟁하는 지는 에피토프 비닝 검정에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 에피토프 비닝 검정은 OCTET® 에피토프 비닝 검정 예컨대 실시예 3, 부문 C에 기재된 것이다. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 단량체 단백질은 NHS-PEG4-바이오틴과 반응시킴으로써 Lys 잔기에서 바이오닐화된다. 바이오티닐화된 단량체는 동력학 완충액 (ForteBio, Inc.)내 5 μg/ml로 희석되고 스트렙타비딘 센서 끝 (ForteBio, Inc.)에 고정된다. 고정화 단계후, 인간 트립타제 베타 1-고정된 센서는 제1 항체로 포화되고, 10-20 μg/ml로 희석되고, 이어서 2.5 μg/ml로 희석된 제2 항체와 결합된다. 일부 구현예에서, 에피토프 비닝 검정은 30 ℃에서 수행된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 인간 트립타제 베타 1에 결합하기 위해, 이전의 항체 중 임의의 하나와 경쟁하거나, 그것을 교차-차단하거나 그것에 의해 교차-차단된 항체를 특징으로 한다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 단클론성, 인간, 인간화된, 또는 키메라이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화된다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 트립타제에 결합하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fab, Fab’-SH, Fv, scFv, 및 (Fab’)2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 전장 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 구현예에서, IgG 항체는 IgG1 항체이다. 일부 구현예에서, IgG 항체는 IgG4 항체이다. 일부 구현예에서, IgG4 항체는 힌지 영역에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 치환 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 치환 돌연변이는 아미노산 잔기 S228 (EU 넘버링)에 있다. 일부 구현예에서, IgG4 항체는 S228P 돌연변이 (EU 넘버링)을 포함한다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 단일특이적 항체이다.
이전의 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 다중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 트립타제에 결합하는 제1 결합 도메인 및 제2 생물학적 분자에 결합하는 제2 결합 도메인를 포함하되, 상기 제2 생물학적 분자는 인터류킨-13 (IL-13), 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-5 (IL-5), 인터류킨-17 (IL-17), IgE, 및 인터류킨-33 (IL-33)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 분자는 IL-13이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 분자는 IL-33이다. 일부 구현예에서, 제2 생물학적 분자는 IgE이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 또는 상기 항체를 함께 인코딩하는 단리된 핵산의 세트 중 임의의 것을 인코딩하는 단리된 핵산을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 특징으로 한다: 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및/또는 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는 상기 항체를 인코딩하는 단리된 핵산의 세트, 상기 핵산은 서열번호:104 및/또는 서열번호:105의 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 상기 핵산 또는 세트는 서열번호:106 및/또는 서열번호:107의 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (b) 서열번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 상기 핵산 또는 세트는 서열번호:108 및/또는 서열번호:107의 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 또는 세트는 하기의 서열을 포함한다: 서열번호:108 및/또는 서열번호:107.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 특징으로 한다: 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및/또는 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는 상기 항체를 인코딩하는 단리된 핵산의 세트, 상기 핵산은 하기의 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다: 서열번호:109 및/또는 서열번호:110. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (b) 서열번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 상기 핵산 또는 세트는 서열번호:111 및/또는 서열번호:112의 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 (b) 서열번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 상기 핵산 또는 세트는 하기의 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다: 서열번호:113 및/또는 서열번호:112. 일부 구현예에서, 핵산 또는 세트는 하기의 서열을 포함한다: 서열번호:113 및/또는 서열번호:112.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트 중 임의의 것을 포함하는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 또는 벡터의 세트를 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 이전의 핵산 및/또는 벡터 및/또는 핵산의 세트 및/또는 벡터의 세트를 포함하는 숙주세포를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주세포는 원핵 세포이다. 일부 구현예에서, 원핵 세포는 E. 콜리이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 중 임의의 것을 생산하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 항체의 생산을 허용하는 적당한 조건 하에서 배양 배지에서 이전의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 또는 벡터의 세트 중 임의의 것을 포함하는 숙주세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 상기 숙주세포 또는 배양 배지로부터 상기 항체를 회수하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이전의 항체 중 임의의 하나를 포함하는 조성물 (예를들어, 약제학적 조성물)을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 단리된 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 하고, 상기 항체는 약 0.1 nM 내지 약 1 nM의 KD 로 단량체성 트립타제 베타 1에 결합하고/거나 상기 항체는 S-2288을 기질로서 사용하는 시험관내 트립타제 효소적 검정에 의한 결정시, 약 0.1 nM 내지 약 5 nM의 반-최대 억제 농도 (IC50)로 트립타제의 효소적 활성을 억제할 수 있다.
이전의 양태의 일부 구현예에서, 항체는 약 0.5 nM 내지 약 1 nM의 KD 로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.1 nM 내지 약 0.5 nM의 KD 로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.4 nM의 KD 로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.2 nM의 KD 로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, KD는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검정에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, SPR 검정은 25 ℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, KD는, 예를 들어, 실시예 1, 부문 (A)(vii)에서 기재된 바와 같이 BIACORE® SPR 검정을 사용하여 측정된다. 일부 구현예에서, SPR 검정은 BIAcore® T200 또는 동등한 디바이스를 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, BIAcore® 시리즈 S CM5 센서 칩 (또는 동등한 센서 칩)은 단클론성 마우스 항-인간 IgG (Fc) 항체로 고정되고 항-트립타제 항체는 후속으로 유동 세포에서 포착된다. 하기의 연속 3-배 희석액: His-태깅된 인간 트립타제 베타 1 단량체 (서열번호:128)은 30 μl/분의 유량으로 주입된다. 각각의 샘플은 3 분 회합 및 10 분 해리로 분석된다. 검정은 25 ℃에서 수행된다. 각각의 주입 후, 칩은 3 M MgCl2를 이용하여 재생된다. 결합 반응은 유사한 밀도에 무관한 IgG를 포착하는 유동 세포로부터 반응 단위 (RU)를 감산함으로써 정정된다. kon 및 koff의 동시 적합화의 1:1 랭뮤어 모델은 동력학 분석에 사용된다.
이전의 양태의 일부 구현예에서, 항체는 약 0.5 nM 내지 약 5 nM의 IC50로 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.1 nM 내지 약 2 nM의 IC50로 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약 4 nM의 IC50로 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.6 nM의 IC50로 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 S-2288을 기질로서 사용하는 시험관내 트립타제 효소적 검정에서 pH 6에서 트립타제 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체의 억제 활성은 실시예 (예를 들어, 실시예 1, 부문 (A)(viii)(a))에 기재된 바와 같이 결정된다. 일부 구현예에서, 재조합 인간 트립타제 베타 1 사량체 활성 효소는 TNH 완충액 (200 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mg/mL 헤파린, 0.01% TRITON™ X-100, pH 8.0) 중 0.75 nM로 희석되고, 384-웰 플레이트에서 항-트립타제 항체 (PBS에서 희석됨)와 1:1 조합된다. 플레이트는 온화한 진탕과 함께 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션된다. 비색계 기질 S-2288 (Chromogenix, 부품 번호 82-0852-39), 또는 동등한 기질은 TNH 완충액내 1200 μM로 희석되고 플레이트에 첨가된다. 일부 구현예에서, 최종 인-웰 농도는 400 μM S-2288, 0.25 nM 재조합 인간 트립타제 베타 1 사량체, 66 μg/mL 헤파린, 및 0.10 내지 222 nM 항-트립타제 항체이다. 플레이트는 온화한 진탕과 함께 주위 온도에서 40분 동안 인큐베이션되고 그 다음 A405에서 판독된다. 항-트립타제 항체의 IC50은 그들의 각각의 곡선의 4-파라미터 적합으로부터 결정된다. 일부 구현예에서, 합성 펩타이드 S-2288을 사용하는 인간 트립타제 베타 효소적 검정에서 헤파린의 최종 농도는 66 μg/ml이다.
이전의 양태의 일부 구현예에서, 항체는 기관지 평활근 세포 증식 및/또는 콜라겐-기반 수축의 트립타제-매개된 자극을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 비만 세포 히스타민 방출을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 IgE-유발된 히스타민 방출 및/또는 트립타제-유발된 히스타민 방출을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 사이노몰구스 원숭이 세기관지 세척 (BAL) 또는 비수착 샘플에서 트립타제 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 1가 형식일 때 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 1가 형식은 Fab 형식이다. 일부 구현예에서, 항체는 헤파린의 존재에서 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 66 μg/ml 헤파린의 존재에서 사량체 트립타제 베타를 해리시킬 수 있다.
이전의 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DYGMV (서열번호:7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RNYDDWYFDV (서열번호:8); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6). 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 도메인; (b) 서열번호:10의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 (VL) 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체는 추가로, 하기 VH 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (서열번호:11); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGKGLEWVA (서열번호:12); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (서열번호:13); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:14). 일부 구현예에서, 항체의 VH 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:9. 일부 구현예에서, 항체는 하기 VL 도메인 FR을 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호:15); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKSPKPWIY (서열번호:16); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호:17); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열번호:18). 일부 구현예에서, 항체의 VL 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:10. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 일부 구현예에서, 상기 항체는 하기의 His51, Val80, Lys81, 및 Asp82로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 또는 모두 4개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 상기 항체는 His51 및 하기의 Val 80, Lys81, 및 Asp82로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 추가로, 하기의 Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 하기의 Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 모두 12개의 아미노산 잔기를 포함한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 서열번호:71의 His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130을 포함한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 인간 트립타제 베타 1 단량체 또는 사량체와 관련된다. 일부 구현예에서, 에피토프는 X-선 결정학 모델에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 항체는 사량체 인간 트립타제 베타 1의 작은 계면과 사량체 인간 트립타제 베타 1의 큰 계면 둘 모두를 해리시킬 수 있다.
이전의 양태의 다른 구현예에서, 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYAIT (서열번호:30); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GISSAATTFYSSWAKS (서열번호:31); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: DPRGYGAALDRLDL (서열번호:32); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: QSIKSVYNNRLG (서열번호:33); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ETSILTS (서열번호:34); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: AGGFDRSGDTT (서열번호:35). 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:36, 47, 48, 49, 50, 51, 및 52 중 임의의 하나의 하기의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열번호:37, 53, 58, 또는 59 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체는 추가로, 하기 VH 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (서열번호:38); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WIRQPPGKGLEWIG (서열번호:42); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (서열번호:43); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:41). 일부 구현예에서, 항체의 VH 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:36. 일부 구현예에서, 항체는 하기 VL 도메인 FR을 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호:64); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호:65); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호:66); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열번호:63). 일부 구현예에서, 항체의 VL 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:37. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 일부 구현예에서, 상기 항체는 하기의 Gln100, Leu101, 및 Leu102로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 추가로, 하기를 포함한다: 하기의 Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, 및 Glu129로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 하기를 포함한다: 하기의 Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, 및 Glu129로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 또는 모두 14개의 아미노산 잔기: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 에피토프는 하기를 포함한다: 하기의 Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Gln100, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129, 및 Arg216: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 에피토프는 인간 트립타제 베타 1 단량체 또는 사량체와 관련된다. 일부 구현예에서, 에피토프는 인간 트립타제 베타 1 사량체와 관련되고, 그리고 상기 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 추가로, 하기를 포함한다: 하기의 Gln35 및 Arg216 중 하나 또는 둘 모두: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 에피토프는 X-선 결정학 모델에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 트립타제 베타 1의 작은 계면 및/또는 큰 계면을 해리시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 단리된 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물)을 특징으로 하고, 상기 항체는 하기의 His51, Val80, Lys81, 및 Asp82로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 또는 모두 4개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 상기 항체는 His51 및 하기의 Val80, Lys81, 및 Asp82로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 추가로, 하기의 Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 하기의 Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 모두 12개의 아미노산 잔기를 포함한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 서열번호:71의 His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130을 포함한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 인간 트립타제 베타 1 단량체 또는 사량체와 관련된다. 일부 구현예에서, 에피토프는 X-선 결정학 모델에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 항체는 사량체 인간 트립타제 베타 1의 작은 계면과 사량체 인간 트립타제 베타 1의 큰 계면 둘 모두를 해리시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 하기 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DYGMV (서열번호:7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RNYDDWYFDV (서열번호:8); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6). 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 도메인; (b) 서열번호:10의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 (VL) 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체는 추가로, 하기 VH 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (서열번호:11); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGKGLEWVA (서열번호:12); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (서열번호:13); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:14). 일부 구현예에서, 항체의 VH 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:9. 일부 구현예에서, 항체는 하기 VL 도메인 FR을 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호:15); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKSPKPWIY (서열번호:16); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호:17); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열번호:18). 일부 구현예에서, 항체의 VL 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:10. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 단리된 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물)을 특징으로 하고, 상기 항체는 하기의 Gln100, Leu101, 및 Leu102로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 추가로, 하기를 포함한다: 하기의 Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, 및 Glu129로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 하기를 포함한다: 하기의 Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, 및 Glu129로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 또는 모두 14개의 아미노산 잔기: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 에피토프는 하기를 포함한다: 하기의 Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Gln100, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129, 및 Arg216: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 에피토프는 인간 트립타제 베타 1 단량체 또는 사량체와 관련된다. 일부 구현예에서, 에피토프는 인간 트립타제 베타 1 사량체와 관련되고, 그리고 상기 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 추가로, 하기를 포함한다: 하기의 Gln35 및 Arg216 중 하나 또는 둘 모두: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 에피토프는 X-선 결정학 모델에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 트립타제 베타 1의 작은 계면 및/또는 큰 계면을 해리시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYAIT (서열번호:30); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GISSAATTFYSSWAKS (서열번호:31); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: DPRGYGAALDRLDL (서열번호:32); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: QSIKSVYNNRLG (서열번호:33); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ETSILTS (서열번호:34); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: AGGFDRSGDTT (서열번호:35). 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:36, 47, 48, 49, 50, 51, 및 52 중 임의의 하나의 하기의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열번호:37, 53, 58, 또는 59 중 임의의 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체는 추가로, 하기 VH 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (서열번호:38); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WIRQPPGKGLEWIG (서열번호:42); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (서열번호:43); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:41). 일부 구현예에서, 항체의 VH 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:36. 일부 구현예에서, 항체는 하기 VL 도메인 FR을 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호:64); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호:65); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호:66); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열번호:63). 일부 구현예에서, 항체의 VL 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호:37. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 항체는 인간 트립타제 알파, 트립타제 베타 2, 트립타제 베타 3 및/또는 사이노 트립타제 D1에 추가로 결합할 수 있다.
이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것에서, 항체는 단클론성, 인간, 인간화된, 또는 키메라일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화된다.
이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것에서, 본 조성물은 인간에게 사용될 수 있다.
이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것은 동결건조될 수있다. 다른 구현예에서, 이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것은 액체일 수 있다.
이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것에서, 부형제는 산화방지제일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 N-아세틸트립토판, 트립토판, 메티오닌, 시스테인, 글루타티온, 티오소르비톨, 아스코르브산, 모노티오글리세롤, 사이클로덱스트린, 트롤록스 (6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산), 피리독신, 만니톨, 및 금속 킬레이터 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 산화방지제를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 N-아세틸트립토판 또는 메티오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 N-아세틸트립토판 및 메티오닌을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물)을 특징으로 한다: (i) 인간 트립타제 베타 1, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 단리된 항체, 상기 항체는 하기 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DYGMV (서열번호:7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RNYDDWYFDV (서열번호:8); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6), 하기의 위치 6에 있는 상기 트립토판의 산화: HVR-H3 (서열번호:8)는 30% 이하이다. 일부 구현예에서, 하기의 위치 6에 있는 트립토판의 산화: HVR-H3 (서열번호:8)는 28%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 6% 이하인, 조성물. 일부 구현예에서, 하기의 위치 6에 있는 트립토판의 산화: HVR-H3 (서열번호:8)는 AAPH 스트레스 테스트에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 하기의 위치 6에 있는 트립토판의 산화: HVR-H3 (서열번호:8)는 상기 조성물의 초기 생산으로부터 1년 재네 결정된다.
이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것은 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도로 N-아세틸트립토판을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, N-아세틸트립토판의 농도는 약 0.3 mM이다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 약 1 mM 내지 약 20 mM의 농도로 메티오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 메티오닌의 농도는 약 1 mM 내지 약 10 mM이다. 일부 구현예에서, 메티오닌의 농도는 약 5 mM이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물)을 특징으로 한다: (i) o 인간 트립타제, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 단리된 항체, 상기 항체는 하기 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DYGMV (서열번호:7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RNYDDWYFDV (서열번호:8); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및
(f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6); (ii) 약 0.1 mM 내지 약 1 mM의 농도의 N-아세틸트립토판 및 (iii) 약 1 mM 내지 약 10 mM의 농도의 메티오닌.
이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것에서, 항체 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/ml일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 농도는 약 150 mg/ml이다.
이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것은 안정화제, 완충액, 계면활성제, 및 긴장제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아르기닌 석시네이트 및/또는 히스티딘 석시네이트. 일부 구현예에서, 완충액은 아르기닌 석시네이트 및 히스티딘 석시네이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 아르기닌 석시네이트의 농도는 약 50 mM 내지 약 500 mM이다. 일부 구현예에서, 아르기닌 석시네이트의 농도는 약 100 mM 내지 약 300 mM이다. 일부 구현예에서, 아르기닌 석시네이트의 농도는 약 200 mM이다. 일부 구현예에서, 히스티딘 석시네이트의 농도는 약 1 mM 내지 약 50 mM이다. 일부 구현예에서, 히스티딘 석시네이트의 농도는 약 15 mM 내지 약 25 mM이다. 일부 구현예에서, 히스티딘 석시네이트의 농도는 약 20 mM이다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 추가로, 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머 188 또는 폴리소르베이트 20이다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 폴록사머 188이다. 일부 구현예에서, 폴록사머 188의 농도는 약 0.005% 내지 약 0.1%이다. 일부 구현예에서, 폴록사머 188의 농도는 약 0.005% 내지 약 0.05%이다. 일부 구현예에서, 폴록사머 188의 농도는 약 0.02%이다. 일부 구현예에서, 조성물의 pH는 약 4.5 내지 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 조성물의 pH는 약 4.5 내지 약 6.5이다. 일부 구현예에서, 조성물의 pH는 약 5.5이다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 내광성 용기 내에 있다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 미리 충전된 주사기 내에 있다.
이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것은 추가로, IL-13 축 결합 길항제, IL-5 축 결합 길항제, IL-33 축 결합 길항제, M1 프라임 길항제, IgE 길항제, TRPA1 길항제, CRTH2 길항제, 기관지확장제 또는 천식 증상 컨트롤러 약물, 면역조절물질, 코르티코스테로이드, Th2 경로 억제제, 티로신 키나제 억제제, 또는 포스포디에스테라제 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-13 축 결합 길항제는 항-IL-13 항체이다. 일부 구현예에서, 항-IL-13 항체는 레브리키주맙이다. 일부 구현예에서, IL-5 축 결합 길항제는 IL-5 결합 길항제 또는 IL-5 수용체 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 축 결합 길항제는 IL-33 결합 길항제 또는 ST2 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 결합 길항제는 항-IL-33 항체이다. 일부 구현예에서, M1 프라임 길항제는 퀼리주맙이다. 일부 사례에서, IgE 길항제는 오말리주맙 (XOLAIR®)이다.
이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것은 인간에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 비-인간 불변 영역 서열을 포함하지 않는 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 비-인간 프레임워크 및 비-인간 불변 영역 서열을 포함하지 않는 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라 항체인 항체를 포함한다.
일부 양태에서, 이전의 항체 중 임의의 것은 약제로서 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 이전의 항체 중 임의의 것은 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 림프구성 장애, 또는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애로 구성된 군으로부터 선택된다 . 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애이다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식, 기도 과반응성, 및 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 Th2-높은 천식 또는 Th2-낮은 천식이다. 일부 구현예에서, 자가면역 장애는 류마티스성 관절염, 건선, 호산구 식도염, 염증성 장 질환 (IBD), 및 크론병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 만성 특발성 두드러기 (CIU, 로도 알려지다 만성 자발적인 두드러기, CSU), 과민증, 과민성 쇼크, 아토피 피부염, 또는 알러지성 비염이다. 일부 구현예에서, 섬유성 장애는 특발성 폐 섬유증 (IPF)이다. 일부 구현예에서, 장애는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애이다. 일부 구현예에서, 장애는 비만세포증이다. 일부 구현예에서, 항체는 추가의 치료제와 함께 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료제는 IL-13 축 결합 길항제, IL-5 축 결합 길항제, IL-33 축 결합 길항제, M1 프라임 길항제, IgE 길항제, TRPA1 길항제, CRTH2 길항제, 기관지확장제 또는 천식 증상 컨트롤러 약물, 면역조절물질, 코르티코스테로이드, Th2 경로 억제제, 티로신 키나제 억제제, 또는 포스포디에스테라제 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-13 축 결합 길항제는 항-IL-13 항체이다. 일부 구현예에서, 항-IL-13 항체는 레브리키주맙이다. 일부 구현예에서, IL-5 축 결합 길항제는 IL-5 결합 길항제 또는 IL-5 수용체 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 축 결합 길항제는 IL-33 결합 길항제 또는 ST2 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 결합 길항제는 항-IL-33 항체이다. 일부 구현예에서, M1 프라임 길항제는 퀼리주맙이다. 일부 구현예에서, 항체는 피하로, 정맥내로, 근육내로, 국소적으로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 피하로 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 대상체에서 사용하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것은 약제 로서 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것은 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 림프구성 장애, 또는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애로 구성된 군으로부터 선택된다 . 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애이다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식, 기도 과반응성, 및 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 Th2-높은 천식 또는 Th2-낮은 천식이다. 일부 구현예에서, 자가면역 장애는 류마티스성 관절염, 건선, 호산구 식도염, 염증성 장 질환 (IBD), 및 크론병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 만성 특발성 두드러기 (CIU 또는 CSU), 과민증, 과민성 쇼크, 아토피 피부염, 또는 알러지성 비염이다. 일부 구현예에서, 섬유성 장애는 특발성 폐 섬유증 (IPF)이다. 일부 구현예에서, 장애는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애이다. 일부 구현예에서, 장애는 비만세포증이다. 일부 구현예에서, 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물)은 추가의 치료제와 함께 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료제는 IL-13 축 결합 길항제, IL-5 축 결합 길항제, IL-33 축 결합 길항제, M1 프라임 길항제, IgE 길항제, TRPA1 길항제, CRTH2 길항제, 기관지확장제 또는 천식 증상 컨트롤러 약물, 면역조절물질, 코르티코스테로이드, Th2 경로 억제제, 티로신 키나제 억제제, 또는 포스포디에스테라제 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-13 축 결합 길항제는 항-IL-13 항체이다. 일부 구현예에서, 항-IL-13 항체는 레브리키주맙이다. 일부 구현예에서, IL-5 축 결합 길항제는 IL-5 결합 길항제 또는 IL-5 수용체 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 축 결합 길항제는 IL-33 결합 길항제 또는 ST2 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 결합 길항제는 항-IL-33 항체이다. 일부 구현예에서, M1 프라임 길항제는 퀼리주맙이다. 일부 구현예에서, 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물)은 피하로, 정맥내로, 근육내로, 국소적으로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물)은 피하로 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물)은 인간 대상체에서 사용하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 이전의 항체 중 임의의 것은 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 림프구성 장애, 또는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애로 구성된 군으로부터 선택된다 . 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애이다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식, 기도 과반응성, 및 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 Th2-높은 천식 또는 Th2-낮은 천식이다. 일부 구현예에서, 자가면역 장애는 류마티스성 관절염, 건선, 호산구 식도염, 염증성 장 질환 (IBD), 및 크론병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 만성 특발성 두드러기 (CIU 또는 CSU), 과민증, 과민성 쇼크, 아토피 피부염, 또는 알러지성 비염이다. 일부 구현예에서, 섬유성 장애는 특발성 폐 섬유증 (IPF)이다. 일부 구현예에서, 장애는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애이다. 일부 구현예에서, 장애는 비만세포증이다. 일부 구현예에서, 약제는 추가의 치료제와 함께 사용하기 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 추가의 치료제는 IL-13 축 결합 길항제, IL-5 축 결합 길항제, IL-33 축 결합 길항제, M1 프라임 길항제, IgE 길항제, TRPA1 길항제, CRTH2 길항제, 기관지확장제 또는 천식 증상 컨트롤러 약물, 면역조절물질, 코르티코스테로이드, Th2 경로 억제제, 티로신 키나제 억제제, 또는 포스포디에스테라제 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-13 축 결합 길항제는 항-IL-13 항체이다. 일부 구현예에서, 항-IL-13 항체는 레브리키주맙이다. 일부 구현예에서, IL-5 축 결합 길항제는 IL-5 결합 길항제 또는 IL-5 수용체 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 축 결합 길항제는 IL-33 결합 길항제 또는 ST2 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 결합 길항제는 항-IL-33 항체이다. 일부 구현예에서, M1 프라임 길항제는 퀼리주맙이다. 일부 구현예에서, 약제는 피하로, 정맥내로, 근육내로, 국소적으로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여하기 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제는 투여 피하로 투여하기 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제는 인간 대상체에서 사용하기 위해 제형화된다.
일부 양태에서, 이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것은 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 림프구성 장애, 또는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애로 구성된 군으로부터 선택된다 . 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애이다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식, 기도 과반응성, 및 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 Th2-높은 천식 또는 Th2-낮은 천식이다. 일부 구현예에서, 자가면역 장애는 류마티스성 관절염, 건선, 호산구 식도염, 염증성 장 질환 (IBD), 및 크론병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 만성 특발성 두드러기 (CIU 또는 CSU), 과민증, 과민성 쇼크, 아토피 피부염, 또는 알러지성 비염이다. 일부 구현예에서, 섬유성 장애는 특발성 폐 섬유증 (IPF)이다. 일부 구현예에서 장애는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애이다 . 일부 구현예에서, 장애는 비만세포증이다. 일부 구현예에서, 약제는 추가의 치료제와 함께 사용하기 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 추가의 치료제는 IL-13 축 결합 길항제, IL-5 축 결합 길항제, IL-33 축 결합 길항제, M1 프라임 길항제, IgE 길항제, TRPA1 길항제, CRTH2 길항제, 기관지확장제 또는 천식 증상 컨트롤러 약물, 면역조절물질, 코르티코스테로이드, Th2 경로 억제제, 티로신 키나제 억제제, 또는 포스포디에스테라제 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-13 축 결합 길항제는 항-IL-13 항체이다. 일부 구현예에서, 항-IL-13 항체는 레브리키주맙이다. 일부 구현예에서, IL-5 축 결합 길항제는 IL-5 결합 길항제 또는 IL-5 수용체 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 축 결합 길항제는 IL-33 결합 길항제 또는 ST2 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 결합 길항제는 항-IL-33 항체이다. 일부 구현예에서, M1 프라임 길항제는 퀼리주맙이다. 일부 구현예에서, 약제는 피하로, 정맥내로, 근육내로, 국소적으로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여하기 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제는 투여 피하로 투여하기 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제는 인간 대상체에서 사용하기 위해 제형화된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에서 장애를 치료하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 상기 대상체에게 이전의 항체 중 임의의 하나의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 림프구성 장애, 또는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애로 구성된 군으로부터 선택된다 . 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애이다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식, 기도 과반응성, 및 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 Th2-높은 천식 또는 Th2-낮은 천식이다. 일부 구현예에서, 자가면역 장애는 류마티스성 관절염, 건선, 호산구 식도염, 염증성 장 질환 (IBD), 및 크론병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 만성 특발성 두드러기 (CIU 또는 CSU), 과민증, 과민성 쇼크, 아토피 피부염, 또는 알러지성 비염이다. 일부 구현예에서, 섬유성 장애는 특발성 폐 섬유증 (IPF)이다. 일부 구현예에서, 장애는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애이다. 일부 구현예에서, 장애는 비만세포증이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 추가의 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 치료제는 IL-13 축 결합 길항제, IL-5 축 결합 길항제, IL-33 축 결합 길항제, M1 프라임 길항제, IgE 길항제, TRPA1 길항제, CRTH2 길항제, 기관지확장제 또는 천식 증상 컨트롤러 약물, 면역조절물질, 코르티코스테로이드, Th2 경로 억제제, 티로신 키나제 억제제, 또는 포스포디에스테라제 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-13 축 결합 길항제는 항-IL-13 항체이다. 일부 구현예에서, 항-IL-13 항체는 레브리키주맙이다. 일부 구현예에서, IL-5 축 결합 길항제는 IL-5 결합 길항제 또는 IL-5 수용체 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 축 결합 길항제는 IL-33 결합 길항제 또는 ST2 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 결합 길항제는 항-IL-33 항체이다. 일부 구현예에서, M1 프라임 길항제는 퀼리주맙이다. 일부 구현예에서, IgE 길항제는 오말리주맙 (Xolair®)이다. 일부 구현예에서, 항체는 피하로, 정맥내로, 근육내로, 국소적으로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에서 장애를 치료하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 상기 대상체에게, 이전의 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물) 중 임의의 것의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 림프구성 장애, 또는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애로 구성된 군으로부터 선택된다 . 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애이다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식, 기도 과반응성, 및 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 Th2-높은 천식 또는 Th2-낮은 천식이다. 일부 구현예에서, 자가면역 장애는 류마티스성 관절염, 건선, 호산구 식도염, 염증성 장 질환 (IBD), 및 크론병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 만성 특발성 두드러기 (CIU 또는 CSU), 과민증, 과민성 쇼크, 아토피 피부염, 또는 알러지성 비염이다. 일부 구현예에서, 섬유성 장애는 특발성 폐 섬유증 (IPF)이다. 일부 구현예에서 장애는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애이다 . 일부 구현예에서, 장애는 비만세포증이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 추가의 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 치료제는 IL-13 축 결합 길항제, IL-5 축 결합 길항제, IL-33 축 결합 길항제, M1 프라임 길항제, IgE 길항제, TRPA1 길항제, CRTH2 길항제, 기관지확장제 또는 천식 증상 컨트롤러 약물, 면역조절물질, 코르티코스테로이드, Th2 경로 억제제, 티로신 키나제 억제제, 또는 포스포디에스테라제 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-13 축 결합 길항제는 항-IL-13 항체이다. 일부 구현예에서, 항-IL-13 항체는 레브리키주맙이다. 일부 구현예에서, IL-5 축 결합 길항제는 IL-5 결합 길항제 또는 IL-5 수용체 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 축 결합 길항제는 IL-33 결합 길항제 또는 ST2 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 결합 길항제는 항-IL-33 항체이다. 일부 구현예에서, M1 프라임 길항제는 오말리주맙 (Xolair®)이다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 피하로, 정맥내로, 근육내로, 국소적으로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
도 1은 카밧, 초티아 및 컨택 지정에 따른 상보성 결정 영역 (CDRs)를 나타내는 hu31A.v11 및 huE104.v2의 VH 및 VL 도메인의 서열 정렬이다. 초가변 영역 (HVR)은 밑줄친다.
도 2A는 인간 트립타제 효소적 검정에 의해 결정된 경우 hu31A.v11 및 huE104.v2 IgG의 억제 분석의 결과를 나타내는 일련의 그래프이다. 양쪽 항체는 트립타제 효소적 활성을 완전히 억제시켰다.
도 2B 및 2C는 인간 1차 기도 평활근 세포 (SMC) 증식 (도 2B) 및 수축 (도 2C) 검정의 결과를 나타내는 그래프이다. 트립타제 베타의 첨가는, 항-트립타제 항체 hu31A.v11 IgG4 또는 huE104.v2 IgG4의 첨가에 의해 용량-의존 방식으로 억제되었던, 인간 1차 기도 SMC 증식을 자극시켰다 (도 2B). 트립타제의 첨가는, 또한 hu31A.v11 IgG4 및 huE104.v2 IgG4의 첨가에 의해 억제되었던, 인간 1차 기도 SMC 수축을 또한 자극시켰다 (도 2C).
도 2D 및 2E는 비만 세포가 트립타제 베타 또는 항-4-하이드록시-3-니트로페닐아세틸 (NP) IgE 및 NP의 첨가에 의해 시험관내 자극되었던 비만 세포 탈과립화 검정의 결과를 나타내는 그래프이다. 트립타제의 첨가는, hu31A.v11의 첨가에 의해 차단되었던, 히스타민 방출을 초래하였다 (도 2D). 촉매적으로-불활성 돌연변이체 트립타제 (S195A)는 대조군으로서 수행하였다. IgE 및 NP의 첨가는 또한, 이것은 트립타제 소분자 억제제 (SMI) 또는 hu31A.v11의 첨가에 의해 억제되었던 (30-50%), 히스타민 방출을 초래하였다 (도 2E).
도 3A는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 분석된 hu31A.v11 Fab에 의한 인간 트립타제 베타 1 사량체의 해리의 결과를 나타내는 그래프이다. 3 실행은 SEC로 분석되었다: 실행 1은, 체류 시간 Tr = 26 분, 체류 용적 Vr = 13 ml를 가진 피크 1을 초래하였던, WT 사량체 트립타제 단독을 함유하였고; 실행 2는, 피크 2 (Tr = 27.6 분, Vr= 13.8 ml) 및 피크 4 (Tr = 31 분, Vr = 15.5 ml)를 초래하였던, WT 사량체 트립타제 + Fab hu31A.v11 + 헤파린을 함유하였고; 실행 3은, 피크 3 (Tr = 28.1 분, Vr = 14 ml) 및 피크 4 (Tr = 31 분, Vr = 15.5 ml)를 초래하였던, 헤파린 없이 WT 사량체 트립타제 + Fab hu31A.v11을 함유하였다.
도 3B는 huE104.v2 Fab에 의한 인간 트립타제 베타 1 사량체의 해리의 결과를 나타내는 그래프이다. 3 실행은 SEC로 분석되었다: 실행 1은, 피크 2 (Tr = 25.8 분) 및 피크 6 (31.6 분)을 초래하였던, His-태깅된 단량체성 트립타제 + Fab huE104.v2를 함유하였고; 실행 2는, 피크 3 (Tr = 26 분) 및 피크 7 (Tr = 31.8 분)을 초래하였던, WT 사량체 트립타제 + Fab huE104.v2를 함유하였고; 실행 3은, 피크 1 (Tr= 21 분), 피크 4 (Tr = 27.2 분) 및 피크 5 (Tr= 31.2 분)을 초래하였던, WT 사량체 트립타제 + Fab huE104.v2 + 헤파린을 함유하였다.
도 4A 및 4B는 기준선 트립타제 수준 (4 ng/ml 혈청, 10 ng/ml 폐 조직, 도 4A) 또는 높은 트립타제 수준 (10 ng/ml 혈청, 40 ng/ml 폐 조직, 도 4B)에서 트립타제 사량체-특이적 안정화 항체로 항-트립타제 항체의 PK 및 중화 활성을 비교하는 약동학적 (PK) 시뮬레이션의 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 4C는 기준선 트립타제 수준 또는 높은 트립타제 수준에서 항-트립타제 항체 및 트립타제 사량체-특이적 안정화 항체 해리를 비교하는 중화 활성 시뮬레이션의 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 5A 및 5B는, 인간 트립타제 베타 1이 양쪽 pH 6 (도 5A) 및 7.5 (도 5B)에서 피브리노겐을 펩타이드 단편으로 절단시켰던 것을 보여주는, 쿠마씨 블루-염색된 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 겔 (최상부 패널)의 이미지를 도시한다. 항-트립타제 항체 hu31A.v11 Fab는 양쪽 pH 6 및 pH 7.5에서 피브리노겐 절단을 차단시켰고, 한편 huE102.v2 Fab는, 헤파린의 고농도의 실험 조건 하에서, 하지 않았다. 레인 1, 피브리노겐 단독, 비절단된 피브리노겐의 알파, 베타, 및 감마 쇄를 나타냄; 레인 2, 피브리노겐 및 트립타제 베타; 레인 3, 피브리노겐, 트립타제 베타, 및 hu31A.v11 Fab; 레인 4, 피브리노겐, 트립타제 베타, 및 B12 IgG; 레인 5, 피브리노겐, 트립타제 베타 1, 및 huE104.v2 Fab; 그리고 레인 6은 B12 mIgG1 단독을 나타낸다. 알파 쇄의 강도에서 감소는 트립타제 단백질분해 활성을 나타내고, 이것은 최하부 패널에서 분석 및 정량화되었다.
도 6A는 hu31A.v11 Fab에 의한 WT 또는 돌연변이체 사량체의 해리의 결과를 나타내는 그래프이다. 4 실행은 SEC로 분석되었다: 실행 1은, 기준 피크 (Tr = 21.6 분)을 초래하였던, WT 사량체 + huE104.v1 Fab를 함유하였고; 실행 2는, 피크 1 (Tr = 25.6 분) 및 피크 4 (Tr = 31.6 분)을 초래하였던, 사량체 Y75C 변이체 + hu31A.v11 Fab를 함유하였고; 실행 3은, 피크 2 (Tr = 23.9 분) 및 피크 4 (Tr = 31.6 분)을 초래하였던, 사량체 I99C 변이체 + hu31A.v11 Fab를 함유하였고; 루네 4는, 피크 3 (Tr = 28.1 분) 및 피크 4 (Tr = 31.6 분)을 초래하였던, WT 사량체 + hu31A.v11 Fab를 함유하였다.
도 6B는 크기 배제 크로마토그래피 피크 도 6A의 쿠마씨-블루 염색된 SDS-PAGE 겔 분석의 결과를 도시한다. hu31A.v11 Fab는 트립타제 돌연변이체 Y75C 및 I99C와 복합체를 형성하였고 사량체를 공유결합된 이량체로 해리시켰다.
도 6C는 huE104.v2 Fab에 의한 WT 또는 돌연변이체 사량체의 해리의 결과를 나타내는 그래프이다. 3 실행은 SEC로 분석되었다: 실행 1은, 피크 1 (Tr = 21.6 분) 및 피크 4 (Tr= 31 분)을 초래하였던, 사량체 Y75C 변이체 + huE104.v2 Fab를 함유하였고; 실행 2는, 피크 2 및 피크 5 (Tr = 31 분)을 초래하였던, 사량체 I99C 변이체 + huE104.v2 Fab를 함유하였고; 그리고 실행 3은, 피크 3 (Tr = 26 분) 및 피크 6 (Tr = 31.8 분)을 초래하였던, WT 사량체 + huE104.v2 Fab를 함유하였다. 상기 결과는 huE104.v2 Fab가 트립타제 돌연변이체 Y75C 및 I99C와 복합체를 형성하였고 I99C 큰 계면-잠금된 사량체를 공유결합된 이량체로 단지 해리시켰다는 것을 나타낸다. 피크 4, 5 및 6 모두는 SDS-PAGD에 의해 결정된 경우 과잉 Fab를 함유한다 (데이터 도시되지 않음).
도 7은 포유동물 세린 트립신에 전형적으로 사용된 유전자 순차적인 넘버링 및 키모트립시노겐 넘버링 ("chymo-numb") 시스템과 함께 성숙한 인간 트립타제 베타 1의 아미노산 서열을 도시한다.
도 8은 인간 트립타제 베타 1에서 Fab hu31A.v11의 결합 에피토프를 도시한다 (트립타제 잔기 모두 키모트립시노겐 넘버링).
도 9는 트립타제 사량체에서 Fab hu31A.v11의 모델링을 나타내는 렌더링이다. Fab hu31A.v11과 복합체에서 트립타제 단량체는 트립타제 사량체에서 프로토머 A 및 C에 정렬되었다. 중쇄 및 경쇄는 표시된다. 이 모델에서 인접한 트립타제 프로토머상의 Fab hu31A.v11의 경쇄 사이 충돌은 대시기호로 된 타원형으로 강조된다.
도 10은 복합체 구조에서 검출된 트립타제의 60s 루프에서 구조적 변화를 도시한다. (스틱으로 나타난) Val60c 및 Val90은 사량체 트립타제의 큰 계면에서 단백질-단백질 상호작용의 일부로서 인접하는 프로토머로부터 Tyr173d의 결합용 소수성 포켓을 창출한다. 사량체 형태에서 트립타제 프로토머는 표시된다. Fab hu31A.v11에 결합된 트립타제는 사량체 복합체의 1 프로토머에 겹쳐 놓는다. Val60c의 형태는 Fab hu31A.v11이 결합되는 경우 변화하고, 이것은 그 포켓에 결합으로부터 Tyr173d를 예방하도록 기대되는 입체 장애를 창출한다 (트립타제 잔기 모두 키모트립시노겐 넘버링).
도 11은 hu31A.v11에 결합후 복합체 구조에서 검출된 작은 계면에서 위치한 트립타제의 30s 루프에서 구조적 변화를 도시한다.
도 12A는 4 huE104.v1 Fabs와 복합체에서 WT 트립타제 사량체의 결정 구조의 렌더링이다. 트립타제 프로토머는 문자 라벨링 또는 프로토머에 따라 표시된다 (참고 Pereira 등 Nature 392:306-311, 1998).
도 12B는 수소-중수소 교환 (HDX)로 평가된 경우 트립타제 사량체의 작은 계면상에서 huE104.v1 결합의 효과의 렌더링이다.
도 13은, C57BL/6 마우스에 1 또는 10 mg/kg으로 정맥내 (IV) 주사로 각각 투여된, 인간화된 항-트립타제 항체 huE104.v2 및 hu31A.v11의 약동학적 (PK) 분석의 결과를 도시하는 그래프이다. 그래프는 시간 (일)의 함수로서 항-트립타제 항체 농도 (μg/mL)를 도시한다. 결과는 3 동물로부터이다.
도 14는 대조군 항-gD IgG4 항체에 비교된 인간화된 항-트립타제 항체 huE104.v2 및 hu31A.v11의 PK 분석의 결과를 도시하는 그래프이다. 각각의 항체는 사이노몰구스 (사이노) 원숭이에 30 mg/kg으로 IV 주사로 투여되었다. 그래프는 시간 (일)의 함수로서 항-트립타제 항체 농도 (μg/mL)를 도시한다.
도 15는 샘플에서 활성 트립타제 (좌측 패널) 및 총 트립타제 (우측 패널)의 양 측정용 검정의 개략도이다. 트립타제 단량체 및 사량체는 표시된다. 좌측 패널에서, 대두 트립신 억제제 (SBTI)는 첨가된다. 다음으로, 예시적인 바이오티닐화된 활성-기반 프로브 (ABP)는 트립타제-함유 샘플 (예를 들어, 기관지폐포 세척 유체 (BAL))에 첨가되어 활성 트립타제를 라벨링한다. 라벨링은 하기의 첨가에 의해 중단되었다: 예시적인 소분자 억제제 G02849855 (예를 들어, BMS-262084, Sutton 등 Bioorg.Med. Chem. Lett.12:3229-33, 2002, Qian 등, J. Org.Chem. 2002, 67:3595-3600). hu31A.v11 항체는 첨가되어 트립타제 사량체를 해리시켰다. 라벨링된 트립타제는 그 다음 스트렙타비딘에 접합된 홀스래디쉬 페록시다아제를 이용하여 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에서 검출되었다. 총 트립타제 검정에서, hu31A.v11은 샘플에 첨가되어 샘플에서 트립타제 사량체를 해리시켰다. 트립타제의 양은 그 다음 ELISA를 이용하여 결정되었다.
도 16은 30 mg/kg으로 정맥내 (IV) 투여로 항-트립타제 항체 hu31A.v11 투여되었던 사이노 원숭이로부터 수득된 BAL 샘플에서 수행된 활성 트립타제 검정의 결과를 도시한다. 최상부 패널은 실험적 프로토콜의 개략도를 도시한다.
도 17은 실시예 6에서 기재된 사이노 아스카리스 도전 모델의 실험적 프로토콜을 도시하는 개략도이다.
도 18A 및 18B는 실시예 6에서 기재된 사이노 아스카리스 도전 실험에서 개별 동물로부터 수득된 BAL에서 수행된 활성 트립타제 검정 (도 18A) 및 총 트립타제 검정 (도 18B)의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 18C는 실시예 6에서 기재된 사이노 아스카리스 도전 실험에서 개별 동물로부터 합성 흡수성 매트릭스 (SAM)을 이용하는 비수착으로 수득된 비강 점막 라이닝 유체 (MLF)에서 총 트립타제의 양을 결정하기 위한 총 트립타제 검정의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 19는 인간 접목된 마우스에서 항-트립타제 항체 hu31A.v11의 투여가 IgE-매개된 수동적인 전신 과민증을 억제시켰다는 것을 나타내는 그래프이다. IgE 면역성 검사시, 항-트립타제 항체 hu31A.v11로 처리된 마우스는 대조군 항-gD 항체로 처리된 마우스에 비교된 경우 개선된 체온 유지를 나타냈다. *** P < 0.0001 (페어링된 T 테스트).
I. 정의
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "약"은 당업자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 보통의 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 "약" 값 또는 파라미터 지칭은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 구현예를 포함한다 (그리고 기재한다).
본 명세서에서의 목적을 위한 "억셉터 인간 프레임워크"는, 하기 정의된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 "유래된" 억셉터 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 구현예에서, VL 억셉터 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열에 서열이 동일하다.
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위 (예를 들어, 항체)와 이의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않은 한, 본 명세서에 기재된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합쌍 (예를 들면, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 그 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는, 본 명세서에 기재된 것을 포함하여, 당해 분야에 공지된 흔한 방법으로 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 전형적인 구현예는 하기에 기재되어 있다.
용어 "KD는 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 측정된다"는, 청구항의 맥락에서 사용될 때, KD가 실시예 1(A)(vii)에서 기재된 방법에 따라 측정되는 것을 의미하고, 이는 인간 트립타제 베타 1 단량체, 예를 들어, 하기에서 나타낸 바와 같은 His6-태깅된 트립타제 단량체에 항-트립타제 항체의 결합용 동력학 파라미터를 측정한다: 서열번호:128 (트립타제 사량체를 자발적으로 형성하지 않음). 검정은 BIAcore® T200 또는 동등한 디바이스를 이용할 수 있다. 간단히, BIAcore® 시리즈 S CM5 센서 칩 (또는 동등한 센서 칩)은 단클론성 마우스 항-인간 IgG (Fc) 항체로 고정되고 항-트립타제 항체는 후속으로 유동 세포에서 포착된다. 인간 트립타제 베타 1 단량체의 연속 3-배 희석액은 30 μl/분의 유량으로 주사된다. 각각의 샘플은 3 분 회합 및 10 분 해리로 분석된다. 검정은 25 ℃에서 수행된다. 각각의 주사후, 칩은 3 M MgCl2를 사용하여 재생된다. 결합 반응은 유사한 밀도에 무관한 IgG를 포착하는 유동 세포로부터 반응 단위 (RU)를 감산함으로써 정정된다. kon 및 koff의 동시 적합화의 1:1 랭뮤어 모델은 동력학 분석에 사용된다.
"친화도-성숙된" 항체는, 그들 변경(들)을 보유하지 않는 모체 항체에 비교된, 항원용 항체의 친화도에서 개선을 초래하는 하나 이상의 HVR 및/또는 프레임워크 영역에서 하나 이상의 변경을 가진 것이다. 바람직한 친화도-성숙된 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 가질 것이다. 친화도-성숙된 항체는 당업계에서 알려진 절차로 생산된다. 예를 들어, Marks 등 Bio/Technology 10:779-783, 1992는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 기재한다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 다음 문헌에 기재되어 있다: Barbas 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-3813, 1994; Schier 등 Gene 169:147-155, 1995; Yelton 등 J. Immunol. 155:1994-2004, 1995; Jackson 등 J. Immunol. 154(7): 3310-3319, 1995; 및 Hawkins 등 J. Mol. Biol. 226:889-896, 1992.
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 사용되고, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 비제한적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하는, 다양한 항체 구조를 포괄한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "트립타제"는, 달리 나타내지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 토종 트립타제를 지칭한다. 트립타제는 또한 비만 세포 트립타제, 비만 세포 프로테아제 II, 피부 트립타제, 폐 트립타제, 뇌하수체 트립타제, 비만 세포 중성 프로테이나제, 및 비만 세포 세린 프로테이나제 II로서 당업계에서 공지된다. 용어 "트립타제"는 트립타제 알파 (TPSAB1에 의해 인간에서 인코딩됨), 트립타제 베타 (TPSAB1 및 TPSB2에 의해 인간에서 인코딩됨; 참고 아래), 트립타제 델타 (TPSD1에 의해 인간에서 인코딩됨), 트립타제 감마 (TPSG1에 의해 인간에서 인코딩됨), 및 트립타제 엡실론 (PRSS22에 의해 인간에서 인코딩됨)을 포괄한다. 트립타제 알파, 베타, 및 감마 단백질은 가용성이고, 반면에 트립타제 엡실론 단백질은 막 고정된다. 트립타제 베타 및 감마는, 이들이 상이한 특이성을 갖고 있어도, 활성 세린 프로테아제이다. 트립타제 알파 및 델타 단백질은 이들이 전형적인 활성 세린 프로테아제와 상이한 중요한 위치에서 잔기를 갖기 때문에 주로 불활성 프로테아제이다. 예시적인 트립타제 알파 전장 단백질 서열은 하기하에 찾아질 수 있다: NCBI 유전자은행 수탁 번호 ACZ98910.1 (서열번호:118). 예시적인 트립타제 감마 전장 단백질 서열은 Uniprot 수탁 번호 Q9NRR2 또는 유전자은행 수탁 번호 Q9NRR2.3, AAF03695.1, NP_036599.3 또는 AAF76457.1 하에 찾아질 수 있다. 예시적인 트립타제 델타 전장 단백질 서열은 Uniprot 수탁 번호 Q9BZJ3 또는 유전자은행 수탁 번호 NP_036349.1 하에 찾아질 수 있다. 몇 개의 트립타제 유전자는 인간 염색체 16p13.3에서 클러스터링된다. 상기 용어는 "전장", 미가공된 트립타제 뿐만 아니라 세포에서 가공으로 생기는 트립타제의 임의의 형태를 포괄한다. 트립타제 베타는 비만 세포에서 발현된 주요 트립타제이고, 반면에 트립타제 알파는 호염기구에서 발현된 주요 트립타제이다. 트립타제 알파 및 트립타제 베타는 전형적으로 대략 30 아미노산의 선도 서열 및 대략 245 아미노산의 촉매적 서열을 포함한다 (참고, 예를 들어, Schwartz, Immunol. Allergy Clin.N.Am. 26:451-463, 2006).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "트립타제 베타"는, 달리 나타내지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 토종 트립타제 베타를 지칭한다. 트립타제 베타는 비만 세포 분비성 과립의 주요 구성성분인 세린 프로테아제이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 트립타제 베타 1 (트립타제 알파 1을 또한 인코딩하는, TPSAB1 유전자에 의해 인코딩됨), 트립타제 베타 2 (TPSB2 유전자에 의해 인코딩됨), 및 트립타제 베타 3 (또한 TPSB2 유전자에 의해 인코딩됨)을 포괄한다. 예시적인 인간 트립타제 베타 1 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:71 (참고 또한 유전자은행 수탁 번호 NP_003285.2). 예시적인 인간 트립타제 베타 2 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:72 (참고 또한 유전자은행 수탁 번호 AAD13876.1). 예시적인 인간 트립타제 베타 3 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:73 (참고 또한 유전자은행 수탁 번호 NP_077078.5). 용어 트립타제 베타는 "전장", 미가공된 트립타제 베타 뿐만 아니라, 단백질분해 가공을 포함하는, 번역후 변형으로 생기는 트립타제 베타를 포괄한다. 전장, 프로-트립타제 베타는 2 단백질분해 단계에서 가공되는 것으로 생각된다. 먼저, R-3에서, 특히 산성 pH에서 그리고 다중음이온 (예를 들어, 헤파린 또는 덱스트란 설페이트)의 존재 하에서 자가촉매 분자간 절단은 발생한다. 다음으로, 나머지 프로’ 디펩타이드는 제거된다 (디펩티딜 펩티다아제 I에 의해 유사하게). 전장 인간 트립타제 베타 1에 대하여, 하기와 관련하여: 서열번호:71 아래, 밑줄친 아미노산 잔기는 토종 선도 서열에 상응하고, 굵은 및 회색-음영된 아미노산 잔기는 프로-도메인에 상응하고, 이는 절단되어 성숙한 단백질을 형성한다 (참고, 예를 들어, Sakai 등 J. Clin.Invest. 97:988-995, 1996)
Figure 112019095769167-pct00001
Figure 112019095769167-pct00002
(서열번호:71).
성숙한, 효소 활성 트립타제 베타는, 활성 단량체가 보고되어 있어도, 전형적으로 호모테트라머 또는 헤테로사량체이다 (참고, 예를 들어, Fukuoka 등 J. Immunol. 176:3165, 2006). 트립타제 베타 사량체의 서브유닛은 서브유닛 간의 소수성 및 극성 상호작용에 의해 함께 유지되고 다중음이온 (특히 헤파린 및 덱스트란 설페이트)에 의해 안정화된다. 용어 트립타제는 트립타제 사량체 또는 트립타제 단량체를 지칭할 수 있다. 성숙한 인간 트립타제 베타 1, 베타 2, 및 베타 3에 대한 예시적인 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:97, 서열번호:116, 및 서열번호:117, 각각.각각의 서브유닛의 활성 부위는, 대략 50 x 30 옹스트롬을 측정하는, 사량체의 중심 기공에 직면한다 (참고, 예를 들어, Pereira 등 Nature 392:306-311, 1998). 중심 기공의 크기는 전형적으로 억제제에 의한 활성 부위의 접근을 제한한다. 트립타제 베타의 예시적인 기질은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: PAR2, C3, 피브리노겐, 파이브로넥틴, 및 키니노겐.
용어들 "항-트립타제 항체", "트립타제에 결합하는 항체", 및 "트립타제를 특이적으로 결합시키는 항체"는 항체가 트립타제 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 트립타제를 결합시킬 수 있는 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, 관련없는, 비-트립타제 단백질에 항-트립타제 항체의 결합의 정도는, 예를 들어, 방사선면역검정 (RIA)에 의해 측정된 경우 트립타제에 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, 트립타제에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 또는 그 미만, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-트립타제 항체는 상이한 종으로부터 트립타제 중에서 보존되는 트립타제의 에피토프에 결합한다.
기준 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 기준 항체에 비교된 경우 항원의 아미노산 잔기의 중첩 세트를 접촉시키는 또는 경쟁 검정에서 그것의 항원에 기준 항체의 결합을 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 또는 그 초과만큼 차단시키는 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항체에 의해 접촉된 아미노산 잔기의 세트는 기준 항체에 의해 접촉된 아미노산 잔기의 세트로 완전히 중첩 또는 부분적으로 중첩중일 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 경쟁 검정에서 그것의 항원에 기준 항체의 결합을 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상만큼 차단시키고, 반대로, 기준 항체는 경쟁 검정에서 그것의 항원에 항체의 결합을 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 또는 그 초과만큼 차단시킨다. 예시적 경쟁 검정은 본 명세서에서 제공된다.
용어 "에피토프 비닝 검정에 의해 결정되는"은, 청구항의 맥락에서, 항체가 예컨대 실시예 3, 부문 C에서 기재된 OCTET® 에피토프 비닝 검정을 이용하여 기준 항-트립타제 항체 (예를 들어, hu31A.v11 또는 huE104.v2)와 결합을 경쟁하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하도록 결정되는 것을 의미한다. 간단히, 인간 트립타제 베타 1 단량체 단백질은 NHS-PEG4-바이오틴과 반응함으로써 Lys 잔기에서 바이오티닐화된다. 바이오티닐화된 단량체는 동력학 완충액 (ForteBio, Inc.)내 5 μg/ml로 희석되고 스트렙타비딘 센서 끝 (ForteBio, Inc.)에 고정된다. 고정화 단계후, 인간 트립타제 베타 1-고정된 센서는 제1 항체로 포화되고, 10-20 μg/ml로 희석되고, 이어서 2.5 μg/ml로 희석된 제2 항체와 결합된다. 그러한 에피토프 결합 검정용 실행 온도는 30 ℃다. 제2 항체에 의한 결합 신호는 2 항체가 뚜렷한, 비-중첩 에피토프에서 동시에 항원을 결합시킬 수 있다는 것을 암시하고, 반면에 결합 신호 없음은 이들이 공통 에피토프를 고유한다는 것을 암시한다. 일부 사례에서, 제2 항체에 의한 부분적인 신호는 관측되고 (즉, 신호는 제1 항체가 첨가되지 않으면 관측된 신호보다 작지만, 배경보다 크다), 이는 에피토프가 부분적으로 중첩중임을 암시한다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일 부분, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 하기를 포함한다: Fab, Fab’, F(ab’)2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (참고 미국특허 번호 5,641,870, 실시예 2; Zapata 등 Protein Eng. 8(10): 1057-1062, 1995); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체.
항체의 파파인 소화는, "Fab" 단편으로 불리는, 2개의 동일한 항원-결합 단편, 그리고 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인, 잔존 "Fc" 단편을 생산한다. Fab 단편은 H 쇄 (VH)의 가변 영역 도메인, 및 1개의 중쇄 (CH1)의 제1 불변 도메인과 함께 전체 L 쇄로 이루어진다. 항체의 펩신 처리는 2가 항원-결합 활성을 갖는 2개의 디설파이드 연결된 Fab 단편에 거의 상응하는 그리고 가교결합 항원을 여전히 할 수 있는 단일 큰 F(ab’)2 단편을 산출한다. Fab’ 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카복시 말단에서 추가의 소수 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab’-SH는 본 명세서에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab’에 대한 명칭이다. F(ab’)2 항체 단편은 본래 이들 사이 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링은 또한 공지되어 있다.
본 명세서에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 토종 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실 말단까지 연장한다. 그러나, Fc 영역의 C 말단 라이신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본 명세서에서 달리 구체화되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은, 카밧 등 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 기재된 바와 같이, EU 지수로도 불리는, EU 넘버링 시스템에 따른 것이다.
"Fv"는 단단한, 비-공유 회합에서 1 중쇄 및 1 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 두 도메인의 폴딩으로부터 항원 결합에 대한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 대해 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프 (각각 H 쇄 및 L 쇄로부터 3개의 루프)가 나온다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대하여 특이적인 단지 3 Hs를 포함하는 Fv의 절반)은, 종종 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에서 있어도, 항원을 인식 및 결합하는 능력을 갖는다.
또한 "sFv" 또는 "scFv"로서 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 단일 폴리펩타이드 쇄에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩타이드는 sFv가 항원 결합에 대해 목적으로 하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 검토를 위하여, 참고 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994.
용어 "디아바디"는 V 도메인의 쇄내가 아닌 쇄간 페어링이 달성되도록 VH와 VL 도메인 사이 짧은 링커 (약 5-10 잔기)로 sFv 단편을 작제함으로써 (참고 선행 단락) 제조된 작은 항체 단편을 지칭하고, 2가 단편, 즉, 2 항원-결합 부위를 갖는 단편을 초래한다. 이중특이성 디아바디는 2 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩타이드 쇄 상에 존재하는 2개의 "크로스오버" sFv 단편의 이형이량체이다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993에서 더욱 완전하게 기재된다.
"결합 도메인"은 표적 에피토프, 항원, 리간드, 또는 수용체에 특이적으로 결합하는 화합물 또는 분자의 일 부분을 의미한다. 결합 도메인은 비제한적으로 항체 (예를 들어, 단클론성, 다클론성, 재조합, 인간화된, 및 키메라 항체), 항체 단편 또는 이의 부분 (예를 들어, Fab 단편, Fab’2, scFv 항체, SMIP, 도메인 항체, 디아바디, 미니바디, scFv-Fc, 아피바디, 나노바디, 및 항체의 VH 및/또는 VL 도메인), 수용체, 리간드, 압타머, 및 확인된 결합 파트너를 갖는 다른 분자를 포함한다.
"차단 항체" 또는 "길항제" 항체는 이 항체가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제 또는 감소시키는 것이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제시킨다. 일부 구현예에서, 활성은 트립타제 효소적 활성, 예를 들어, 프로테아제 활성일 수 있다. 다른 사례에서, 활성은 기관지 평활근 세포 증식 및/또는 콜라겐-기반 수축의 트립타제-매개된 자극일 수 있다. 다른 사례에서, 활성은 비만 세포 히스타민 방출 (예를 들어, IgE-유발된 히스타민 방출 및/또는 트립타제-유발된 히스타민 방출)일 수 있다. 본 발명의 항체는 트립타제의 생물학적 활성을 적어도 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100% 억제시킬 수 있다.
용어 "기질로서 합성 펩타이드 S-2288을 사용하는 인간 트립타제 베타 효소적 검정으로 결정시"는, 청구항의 맥락에서, 억제 활성이 실시예 1(A)(viii)(a)에서 기재된 검정에 따라 측정되는 것을 의미한다. 간단히, 재조합 인간 트립타제 베타 1 사량체 활성 효소는 TNH 완충액 (200 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mg/mL 헤파린, 0.01% TRITON™ X-100, pH 8.0)내 0.75 nM로 희석되고, 384-웰 플레이트에서 (PBS에서 희석된) 항-트립타제 항체와 1:1 조합된다. 플레이트는 온화한 진탕과 함께 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션된다. 비색계 기질 S-2288 (Chromogenix, 부품 번호 82-0852-39), 또는 동등한 기질은 TNH 완충액내 1200 μM로 희석되고 플레이트에 첨가된다. 최종 인-웰 농도는 400 μM S-2288, 0.25 nM 재조합 인간 트립타제 베타 1 사량체, 66 μg/ mL 헤파린, 및 0.10 내지 222 nM 항-트립타제 항체이다. 플레이트는 온화한 진탕과 함께 주위 온도에서 40분 동안 인큐베이션되고 그 다음 A405에서 판독된다. 항-트립타제 항체의 IC50은 그들의 각각의 곡선의 4-파라미터 적합으로부터 결정된다.
항체의 "클래스"는 이의 중쇄가 보유한 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5개 주요 클래스의 항체가 있고:IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 몇 개의 이들은 서브클래스 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 a, d, e, g, 및 m, 각각으로 불린다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 그들 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 아이소타입에 따라 다양하다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
"항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포, 중성구, 및 대식세포)에서 존재하는 Fc 수용체 (FcRs)상에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 효과기 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합 그리고 후속으로 상기 표적 세포를 세포독소로 사멸시키게 할 수 있는 세포독성의 형태를 지칭한다. 항체 "아암" 세포독성 세포는 그리고 그러한 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC, NK 세포 매개용 1차 세포는 FcγRIII 만을 발현시키고, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현시킨다. 조혈 세포상의 FcR 발현은 하기의 464페이지에서 표 3에 요약된다: Ravetch 등 Annu.Rev. Immunol. 9:457-492, 1991.당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에서 기재된 것이 수행될 수 있다. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 당해 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어, 동물 모델 예컨대 Clynes 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656, 1998에서 개시된 것에서 생체내 평가될 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 토종 서열 인간 FcR이다. 게다가, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)를 결합하는 것이고 그리고, 대립유전자 변이체 및 대안적으로 이들 수용체의 스플라이스된 형태를 포함하여, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이는 이의 세포질 도메인 내에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)을 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그것의 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)을 함유한다 (참고 검토 M. in Daeron, Annu.Rev. Immunol. 15:203-234, 1997). FcRs는, 예를 들어, 하기에서 검토된다: Ravetch 등 Annu.Rev. Immunol. 9:457-492, 1991; Capel 등 Immunomethods 4:25-34, 1994; 및 de Haas 등 J. Lab.Clin.Med. 126:330-41, 1995.장래에 동정되는 것을 포함하는 다른 FcR은 본 명세서에서 용어 "FcR"에 의해 포함된다. 상기 용어는, 태아에 모 IgG의 이동을 책임지는, 신생아 수용체를 또한 포함한다 (참고, 예를 들어, Guyer 등 J. Immunol. 117:587, 1976; 및 Kim 등 J. Immunol. 24:249, 1994).
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR를 발현시키고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현시키고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포, 및 중성구를 포함하고; PBMCs 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 천연 공급원으로부터, 예를 들어, 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전형적 보체 경로의 활성화는 이들의 동종 항원에 결합되는 (적당한 서브클래스의) 항체로의 보체 시스템 제1 성분(C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, Gazzano-Santoro 등 J. Immunol. Methods 202:163, 1996에서 기재된 바와 같이, CDC 검정은 수행될 수 있다.
"에피토프"는 항체가 선택적으로 결합하는 항원의 부분이다. 폴리펩타이드 항원에 대하여, 선형 에피토프는 약 4-15 (예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 아미노산 잔기의 펩타이드 부분일 수 있다. 비-선형, 형태적 에피토프는 단백질의 3차원 (3D) 구조에서 가까이 근접하는 폴리펩타이드 서열의 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 에피토프는 항체의 임의의 원자의 4 옹스트롬 (Å) 이내인 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 파트너 Fab의 임의의 원자의 4 Å 이내인 트립타제 프로토머의 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 에피토프는 항체의 임의의 원자의 3.5 Å, 3 Å, 2.5 Å, 또는 2 Å 이내인 아미노산을 포함한다. 항원 (즉, 파라토프)를 접촉시키는 항체의 아미노산 잔기는, 예를 들어, 항원과 복합체에서 항체의 결정 구조를 결정함으로써 또는 수소/중수소 교환을 수행함으로써 결정될 수 있다.
용어 "에피토프는 X-선 결정학 모델에 의해 결정된다"는, 청구항의 맥락에서 사용될 때, 트립타제 아미노산 잔기 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1 잔기)의 원자가, 예를 들어, 실시예 3에서 기재된 바와 같이, X-선 결정학 모델에서 항-트립타제 항체 (예를 들어,. 본 명세서에 기재된 임의의 항-트립타제 항체, 예를 들어, hu31A.v11 또는 huE104.v2)의 임의의 원자의 4 Å 이내이도록 결정되는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, X-선 결정학 모델은 약 3.5 Å 또는 그 미만, 약 3 Å 또는 그 미만, 약 2.5 Å 또는 그 미만, 약 2.15 Å 또는 그 미만, 또는 약 2 Å 또는 그 미만의 해상도를 갖는다.
용어들 "전장 항체", "온전한 항체", 및 "전체의 항체"는 천연 항체 구조에 실질적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본 명세서에서 정의된 바와 같이 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 본 명세서에서 사용된다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 및/또는 인간 항체의 임의의 제조 기술을 이용하여 만들어진 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이 정의는 구체적으로 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 공통으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹 유래이다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 카밧 등 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD, vols. 1-3, 1991에서처럼 하위그룹이다. 일 구현예에서, VL에 대하여, 하위그룹은 카밧 등 상동에서처럼 하위그룹 카파 III 또는 카파 IV이다. 일 구현예에서, VH에 대하여, 하위그룹은 카밧 등 상동에서처럼 하위그룹 III이다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대개, 인간화된 항체는 수령체의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화도, 및 능력을 가지는 비-인간 종 (공여체 항체) 예컨대 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 수행능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의 가변 도메인 모두를 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화된 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 부분을 포함할 것이다. 추가 세부사항에 대하여, 참고 Jones 등 Nature 321:522-525, 1986; Riechmann 등 Nature 332:323-329, 1988; 및 Presta, Curr.Op.Struct.Biol. 2:593-596, 1992.
"면역콘주게이트"는, 비제한적으로 세포독성제를 포함하는, 하나 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체이다.
용어 "단리된"은 본 명세서에서 개시된 다양한 항체를 기재하는데 사용될 때, 발현되었던 세포 또는 세포 배양물로부터 확인 및 분리된 및/또는 회수된 항체를 의미한다. 그것의 천연 환경의 오염물질 성분은 폴리펩타이드에 대하여 진단 또는 치료 용도를 전형적으로 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는, 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 결정된 경우 95% 또는 99% 초과 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위하여, 참고, 예를 들어, Flatman 등 J. Chromatogr.B 848:79-87, 2007.바람직한 구현예에서, 항체는 (1) 회전 컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15 잔기를 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠마씨 블루 또는, 바람직하게는,은 염색을 이용하여 비-환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제될 것이다. 단리된 항체는, 폴리펩타이드 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재할 수 없을 것이기 때문에, 재조합 세포 내에서 원위치 항체를 포함한다. 통상적으로, 그러나, 단리된 폴리펩타이드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 모집단을 포함하는 개별 항체는, 예를 들어, 자연 발생 돌연변이를 함유하는 또는 단클론성 항체 제제의 생산 동안 발생하는, 그러한 변이체가 일반적으로 소량으로 존재하는, 가능한 변이체 항체를 제외하고, 동일하고/하거나 항원상의 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정부위 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는, 다클론성 항체 제제와 반대로, 단클론성 항체 제제의 각 단클론성 항체는 항원상의 단일 결정부위에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균일한 모집단으로부터 수득된 경우 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는, 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물을 사용하는 방법을 포함하는, 각종 기술들에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 방법 그리고 단클론성 항체를 제조하기 위한 기타의 예시적인 방법들은 본원에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 용어 "단클론성 항체"는 이중특이적 항체를 포괄한다.
용어 "2가 항체"는 2개의 항원용 결합 부위를 갖는 항체를 지칭한다. 2가 항체는, 비제한적으로, IgG 형식 또는 F(ab’)2 형식일 수 있다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미에서 사용되고 1 항원상의 2 또는 그 초과 결정인자 또는 에피토프 혹은 1 초과 항원 상의 2 또는 그 초과 결정인자 또는 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 상기 다중특이적 항체는, 비제한적으로, 전장 항체, 2 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디 및 트리아바디와 같은 항체 단편, 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 항체 단편을 포함한다. "다중에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들)상에 2 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. 특정 구현예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다. "이원 특이성" 또는 "이중특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들)상에 2 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. 그러나, 이중특이적 항체와 대조적으로, 이원-특이적 항체는 아미노산 서열에서 동일한 2개의 항원-결합 아암을 갖고 각각의 Fab 아암은 2개의 항원을 인식할 수 있다. 이원-특이성은 단일 Fab 또는 IgG 분자로서 2개의 상이한 항원과 높은 친화도로 항체를 상호작용하게 한다. 일 구현예에 따르면, 다중특이적 항체는 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 각각의 에피토프에 결합한다. "단일특이적"은 단지 하나의 에피토프에 결합하는 능력을 지칭한다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사선라벨에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 약제학적 조성물에서 존재할 수 있다.
표적 분자에 항체의 결합에 관하여, 특정 폴리펩타이드 표적상에 특정 폴리펩타이드 또는 에피토프를 "결합한다" 또는 "결합하는" 또는 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 상기에 "특이적인" 용어는 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써, 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적, 예를 들어 과잉의 라벨링되지 않은 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우에, 프로브에 대한 라벨링된 표적의 결합이 과잉의 라벨링되지 않은 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우 특이적 결합은 나타난다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 특정 폴리펩타이드 표적상에 특정 폴리펩타이드 또는 에피토프를 "특이적 결합" 또는 "상기에 특이적으로 결합하는" 또는 "상기에 특이적인" 용어는, 예를 들어, 10-4 M 이하, 대안적으로 10-5 M 이하, 대안적으로 10-6 M 이하, 대안적으로 10-7 M 이하, 대안적으로 10-8 M 이하, 대안적으로 10-9 M 이하, 대안적으로 10-10 M 이하, 대안적으로 10-11 M 이하, 대안적으로 10-12 M 이하의 상기 표적에 대한 KD 또는 10-4 M 내지 10-6 M 또는 10-6 M 내지 10-10 M 또는 10-7 M 내지 10-9 M의 범위에서 KD를 갖는 분자에 의해 제시될 수 있다. 숙련가에 의해 인정되는 바와 같이, 친화도 및 KD 값은 반대로 관련된다. 항원에 대한 고 친화도는 저 KD 값으로 측정된다. 일 구현예에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프에 실질적으로 결합 없이 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프 또는 특정 폴리펩타이드에 결합하는 경우의 결합을 지칭한다.
"파라토프"는 항원의 에피토프를 결합시키는 항체의 일부를 의미한다. 파라토프는 전형적으로 항체의 Fv 영역의 약 15-22 아미노산 잔기의 영역이고 항체의 VH 및 VL 쇄로부터 아미노산을 함유할 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 분절이 항체 중 서열에서 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. 가변 또는 "V" 도메인은 항원 결합을 매개하고 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110-아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각 9-12 아미노산 길이인 "초가변 영역"이라 불리는 극단적인 가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리된 15-30 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)로 불리는 상대적으로 비변이적 스트레치로 이루어진다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 항원-결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로, 예를 들어, 하기를 포함한다: VL에서 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 부근, 및 VH에서 약 잔기 26-35 (H1), 49-65 (H2) 및 95-102 (H3) 부근 (일 구현예에서, H1는 약 잔기 31-35 부근이다); 카밧 등 상동)으로부터 아미노산 잔기 및/또는 "초가변 루프"로부터 그들 잔기 (예를 들어, VL에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 및 91-96 (L3), 및 VH에서 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3); Chothia 등 J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987.천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 베타-시트 입체배치를 채택하는, 4개의 FR을 포함하여, 베타-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄에서 초가변 영역은 FR에 의해 가까이 근접하여 함께 유지되고, 다른 쇄로부터 초가변 영역과, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (참고 카밧 등 상동). 따라서 HVR과 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 출현한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. 불변 도메인은 항원에 항체를 결합하는 것에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체 의존성 세포 독성 (ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 작용을 나타낸다.
용어 "카밧에서와 같이 넘버링된 가변 도메인 잔기" 또는 "카밧에서와 같이 넘버링된 아미노산 위치" 및 이의 변이는, 하기에서 항체의 편입의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다: 상기의 카밧 등.상기 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 대응하는 더 적거나 더 많은 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인에는 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입(카밧에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기(예를 들면, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)가 포함될 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카밧 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다.
카밧 넘버링 시스템은 가변 도메인에서의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 언급할 때 일반적으로 사용된다 (예를 들어, 상기의 카밧 등). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지수"는 면역글로불린 중쇄 불변 영역에서 잔기를 언급할 때 일반적으로 사용된다 (예를 들어, 상기의 카밧 등에서 보고된 EU 지수). "카밧으로의 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본원에서 달리 언급하지 않는다면, 항체의 가변 도메인에서 잔기 수에 대한 언급은 카밧 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급하지 않는다면, 항체의 불변 도메인의 잔기 수에 대한 언급은, EU 넘버링 시스템 (예컨대, 참고: 미국 가출원 번호 60/640,323, EU 넘버링에 대한 도면)에 의한 잔기 넘버링을 의미한다.
"장애" 또는 "질환"는 항체 (예를 들어, 임의의 본 명세서에 기재된 항-트립타제 항체)에 의한 치료로 유익한 임의의 병태이다. 이는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다 (포유동물에 상기 장애에 대한 의심 소인이 있는 병리학적 조건을 포함). 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 림프구성 장애, 또는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애이다. 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애이다. 일부 예에서, 장애은 트립타제-연관된 장애 또는 트립타제-매개된 장애일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어들 "트립타제-연관된 장애" 및 "트립타제-매개된 장애"는, 트립타제에 의해 매개되거나 그것과 연관된 임의의 장애 또는 병태를 지칭한다. 일부 구현예에서, 트립타제-연관된 장애는, 비정형 증상이 신체에서 국소적으로 및/또는 전신으로 트립타제의 수준 또는 활성으로 인해 나타날 수 있는 과잉 트립타제 수준 또는 활성과 연관된다.
일부 구현예에서, 폐 장애는 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 생명을 위협할 수 있는 악화되는 증상 (악화 또는 발적)의 급성 사건을 가지고 있는 지속적 만성 중증 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 아토피성 (알러지성으로도 알려짐) 천식, 비-알러지성 천식 (예를 들어, 종종 호흡 바이러스 (예를 들어, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 리노바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 및 호흡기 세포융합 바이러스)를 가지고 있는 감염 또는 흡입된 자극제 (공기 오염물질, 스모그, 디젤 입자, 휘발성 화학물질 및 가스 실내 또는 야외에 의해, 또는 심지어 차가운 건조 공기에 의해 유발됨)이다.
일부 구현예에서, 천식은 간헐적 또는 운동-유도된, "연기" (전형적으로 담배, 여송연, 파이프)에 대한 급성 또는 만성 일차 또는 간접 노출로 인한 간헐적 또는 운동-유도된, 천식, (담배, 마라화나 또는 다른 그와 같은 서브스턴스)의 흡입 또는 "증발", 또는 아스피린 또는 관련된 NSAIDS의 최근 섭취에 의해 유발된 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 온건한, 또는 코르티코스테로이드 미접촉 천식, 새로 진단된 및 미치료 천식이거나, 또는 증상 (기침, 쌕쌕거림, 숨가쁨/헐떡임, 또는 가슴 통증)을 조절하기 위해 흡입된 국소 또는 전신의 만성적 사용을 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 천식은 만성, 코르티코스테로이드 저항성 천식, 코르티코스테로이드 난치성 천식, 코르티코스테로이드 또는 다른 만성 천식 컨트롤러 약물 상에서 조절되지 않는 천식이다.
일부 구현예에서, 천식은 보통 내지 중증 천식이다. 특정 구현예에서, 천식은 Th2-높은 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 중증 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 아토피성 천식, 알러지성 천식, (예를 들어, 감염 및/또는 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)로 인한) 비-알러지성 천식, 운동-유도된 천식, 아스피린 감수성/악화된 천식, 온건한 천식, 보통 내지 중증 천식, 코르티코스테로이드 미접촉 천식, 만성 천식, 코르티코스테로이드 저항성 천식, 코르티코스테로이드 난치성 천식, 새로 진단된 및 미치료 천식, 흡연으로 인한 천식, 코르티코스테로이드 상에서 조절되지 않는 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 T 헬퍼 림프구 2형 (Th2) 또는 2형 (Th2) 높은, 또는 2형 (T2)-유도된 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 호산구 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 알러지성 천식이다. 일부 구현예에서, 개체는 호산구 염증 양성 (EIP)인 것으로 결정되었다. 참고: WO 2015/061441. 일부 구현예에서, 천식은 (예를 들어, 페리오스틴 수준 적어도 약 임의의 20 ng/mL, 25 ng/mL, 또는 50 ng/mL 혈청을 갖는) 페리오스틴-높은 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 호산구-높은 천식 (예를 들어, 적어도 약 임의의 150, 200, 250, 300, 350, 400 호산구 수/ml 혈액)이다. 특정 구현예에서, 천식은 Th2-낮은 천식 또는 논(non)Th2-유도된 천식이다. 일부 구현예에서, 개체는 호산구 염증 음성 (EIN)일 것으로 결정되었다. 참고: WO 2015/061441. 일부 구현예에서, 천식은 페리오스틴-낮은 (예를 들어, 약 20 ng 미만/mL 혈청의 페리오스틴 수준을 갖는) 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 호산구-낮은 천식 (예를 들어, 약 150 미만의 호산구 수/μl 혈액 또는 약 100 미만의 호산구 수/μl 혈액)이다.
용어 "Th2-높은 천식," 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 지 하나 이상의 Th2 세포-관련된 사이토카인, 예를 들어, IL13, IL4, IL9, IL5의 높은 수준을 나타내거나, 또는 Th2 사이토카인-연관된 염증을 타나재는 천식을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 Th2-높은 천식은 호산구-높은 천식과 교환가능하게 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, Th2-높은 천식은 Th2 유도된 천식이다. 일부 구현예에서, 천식 환자는 호산구 염증 양성 (EIP) 인 것으로 결정되었다. 참고, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/061441 (이는 본 명세서에 천체적으로 참고로 편입되어 있음). 특정 구현예에서, 개체는 대조군 또는 기준 수준과 비교하여 호산구 서명 유전자 중 적어도 하나의 상승된 수준을 갖는 것으로 결정되었다. 참고 WO2015/061441.특정 구현예에서, Th2-높은 천식은 페리오스틴-높은 천식이다. 일부 구현예에서, 개체는 높은 혈청 페리오스틴을 갖는다. 특정 구현예에서, 개체는 18세 이상이다. 특정 구현예에서, 개체는 대조군 또는 기준 수준과 비교하여 혈청 페리오스틴상승된 수준을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 대조군 또는 기준 수준은 모집단에서 페리오스틴의 중앙 수준이다. 특정 구현예에서, 개체는 20 ng/ml 이상의 혈청 페리오스틴을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 개체는 25 ng/ml 이상의 혈청 페리오스틴을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 개체는 50 ng/ml 이상의 혈청 페리오스틴을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 혈청 페리오스틴의 대조군 또는 기준 수준은 20 ng/ml, 25 ng/ml, 또는 50 ng/ml이다. 특정 구현예에서, 천식은 호산구-높은 천식이다. 특정 구현예에서, 개체는 대조군 또는 기준 수준과 비교하여 상승된 호산구 수을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 대조군 또는 기준 수준은 모집단의 중앙 수준이다. 특정 구현예에서, 개체는 150 이상의 호산구 수 /μl 혈액을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 개체는 200 이상의 호산구 수 /μl 혈액을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 개체는 250 이상의 호산구 수 /μl 혈액을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 개체는 300 이상의 호산구 수 /μl 혈액을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 개체는 350 이상의 호산구 수 /μl 혈액을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 개체는 400 이상의 호산구 수 /μl 혈액을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 개체는 450 이상의 호산구 수 /μl 혈액을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 개체는 500 이상의 호산구 수 /μl 혈액을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 바람직한 구현예에서, 개체는 300 이상의 호산구 수/μl 혈액을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 호산구는 말초 혈액 호산구이다. 특정 구현예에서, 호산구는 가래 호산구이다. 특정 구현예에서, 개체는 상승된 수준의 FeNO (단편적인 내쉬는 질산) 및/또는 상승된 수준의 IgE를 나타낸다. 예를 들어, 일부 사례에서, 개체는 약 250 십억분율 (ppb) 초과, 약 275 ppb 초과, 약 300 ppb 초과, 약 325 ppb 초과, 약 325 ppb 초과, 또는 약 350 ppb 초과의 FeNO 수준을 나타낸다. 일부 사례에서, 개체는 50 IU/ml 초과인 IgE 수준을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은용어 "Th2-낮은 천식" 또는 "비-Th2-높은 천식"은, 하나 이상의 Th2 세포-관련된 사이토카인, 예를 들어, IL13, IL4, IL9, IL5의 저수준을 나타내거나 비-Th2 사이토카인-연관된 염증을 나타내는 천식을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 Th2-낮은 천식은 호산구-낮은 천식과 교환가능하게 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 천식 환자는 호산구 염증 음성 (EIN) 인 것으로 결정되었다. 참고, 예를 들어, WO 2015/061441.특정 구현예에서, Th2-낮은 천식은 Th17-유도된 천식이다. 특정 구현예에서, Th2-낮은 천식은 페리오스틴-낮은 천식이다. 특정 구현예에서, 개체는 18세 이상이다. 특정 구현예에서, 개체는 대조군 또는 기준 수준과 비교하여 감소 수준의 혈청 페리오스틴을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 대조군 또는 기준 수준은 모집단에서 페리오스틴의 중앙 수준이다. 특정 구현예에서, 개체는 20 ng/ml 미만의 혈청 페리오스틴을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 천식은 호산구-낮은 천식이다. 특정 구현예에서, 개체는 대조군 또는 기준 수준과 비교하여 감소된 호산구 수를 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 대조군 또는 기준 수준은 모집단의 중앙 수준이다. 특정 구현예에서, 개체는 150 미만의 호산구 수 /μl 혈액을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 구현예에서, 개체는 100 미만 호산구 수 /μl 혈액을 갖는 것으로 결정되었다. 특정 바람직한 구현예에서, 개체는 300 미만의 호산구 수/μl 혈액을 갖는 것으로 결정되었다.
일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 또는 림프구성 장애는 식도염 (예를 들어, 호산구 식도염), 알러지성 비염, 비-알러지성 비염, 용종을 가지고 있는 비부비동염, 비강 폴립증, 기관지염, 만성 폐렴, 알러지성 기관지폐 아스페르길루스증, 기도 염증, 알러지성 비염, 기관지 확장증, 및/또는 만성 기관지염이다.
일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 또는 림프구성 장애는 관절염이다. 일부 구현예에서, 관절염은 류마티스성 관절염이다. 일부 구현예에서, 관절염은 골관절염, 류마티스성 관절염, 소아 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 조기 관절염, 다수관절 류마티스성 관절염, 전신-개시 류마티스성 관절염, 장병증성 관절염, 반응 관절염, 건선성 관절염, 및/또는 손상의 결과로서 관절염이다.
일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 또는 림프구성 장애는 위장 염증성 병태이다. 일부 구현예에서, 위장 염증성 병태는 IBD (염증성 장 질환), 궤양성 대장염 (UC), 크론병 (CD), 결장염 (예를 들어, 환경 모욕에 의해 야기된, 예를 들어, 치료 레지멘, 예컨대 화학요법, 방사선 요법 등에 의해 야기되거나 그것과 연관된) 결장염), 감염성 결장염, 허혈성 대장염, 교원성 또는 림프구성 결장염, 괴사성 전장염, 병태 예컨대 만성 육아종 질환 또는 소아지방변증에서의 결장염, 음식 알러지, 위염, 위장염, 감염성 위염 또는 전장염 (예를 들어, 헬리코박터 파일로리-감염된 만성 활성 위염), 식도염, 및 감염원, 또는 불확정 결장염에 의해 야기된 위장 염증의 다른 형태이다.
일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 또는 림프구성 장애는 위장 염증성 병태이다. 일부 구현예에서, 위장 염증성 병태는 IBD (염증성 장 질환)이다. 일부 구현예에서 염증성 장 질환은 궤양성 대장염 (UC) 또는 크론병 (CD)이다. 일부 구현예에서, 위장 염증성 병태는 결장염 (예를 들어, 환경 모욕에 의해 야기된 (예를 들어, 치료 레지멘, 예컨대 화학요법, 방사선 요법, 등에 의해 야기되거나 그것과 연관된) 결장염), 감염성 결장염, 허혈성 대장염, 교원성 또는 림프구성 결장염, 괴사성 전장염, 병태 예컨대 만성 육아종 질환 또는 소아지방변증에서 결장염, 음식 알러지, 위염, 위장염, 감염성 위염 또는 전장염 (예를 들어, 헬리코박터 파일로리-감염된 만성 활성 위염), 및 감염원, 또는 불확정 결장염에 의해 야기된 위장 염증의 다른 형태이다. 일부 구현예에서, 위장 염증성 병태는 궤양성 대장염 (UC) 또는 크론병 (CD)이다. 일부 구현예에서, 위장 염증성 병태는 궤양성 대장염 (UC)이다. 일부 구현예에서, 궤양성 대장염은 경도 내지 중간 정도 원위 결장염이다. 일부 구현예에서, 궤양성 대장염은 경도 내지 중간 정도 광범위한 결장염이다. 일부 구현예에서, 궤양성 대장염은 중증 결장염이다. 일부 구현예에서, 위장 염증성 병태는 크론병 (CD)이다. 일부 구현예에서, 크론병은 급성 질환 단계에 있다. 일부 구현예에서, 크론병은 유도된 임상 차도 단계에 있다. 일부 구현예에서, 크론병은 유지 반응/차도 단계에 있다. 일부 구현예에서, 크론병은 경도 내지 중간 정도 질환이다. 일부 구현예에서, 크론병은 보통 내지 중증 질환이다. 일부 구현예에서, 크론병은 중증/전격성 질환이다. 일부 구현예에서, 크론병은 회장, 회장결장, 또는 결장 질환이다.
일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 또는 림프구성 장애, 또는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애는 낭창 또는 전신 홍반성 낭창 (SLE), 또는 낭창의 하나 이상의 장기-특이적 징후 (예를 들어, 신장에 영향을 주는 낭창성 신염 (LN), 또는 혈액 및/또는 림프양 기관 (림프절, 비장, 가슴샘, 및 연관된 림프관), 및/또는 관절 및/또는 다른 기관, 그러나 반드시 신장은 아닌 것에 영향을 주는 추가의-신장 낭창 (ERL)).
일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 또는 섬유성 장애는 하기와 관련된다: 패혈증 및/또는 트라우마, HIV 감염, 또는 (알려지지 않은 병인의) 특발성 예컨대 ANCA-연관된 혈관염 (AAV), 다발성맥관염을 갖는 육아종증 (예전에 베게너 육아종증으로 알려짐), 베체트병, 심혈관 질환, 호산구 기관지염, 라이터 증후군, SEA 증후군 (혈청음성, 부착부위병증, 관절병증 증후군), 강직 척추염, 피부근염, 경피증, 예를 들어, 전신 경피증 또한 소위 전신 경화증, 혈관염 (예를 들어, 거대세포 동맥염 (GCA), 또한 소위 일시적 동맥염, 두개 동맥염 또는 호튼병), 근염, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발동맥염, 동맥염, 류마티스성 다발근육통, 유육종증, 일차 담도 경화증, 경화 담관염, 쇼그렌 증후군, 건선, 판상 건선, 적상 건선, 역형 건선, 농포성 건선, 홍피성 건선, 피부염, 아토피 피부염, 천포창, 예를 들어, 심상성 천포창, 죽상경화증, 낭창, 스틸 질환, 중증 근무력증, 소아지방변증, 재발 완화성 (RRMS) 또는 일차 진행성 (PPMS) 또는 이차 진행성 (SPMS) 아형의 다발성 경화증 (MS), 길랑-바레 질환, 유형 I 진성 당뇨병 (T1DM) 또는 인슐린-의존적 (IDDM) 또는 유년 발병형 DM 유형, 갑상선염 (예를 들어, 그레이브스병), 만성적 소화장애증, 처그-스트라우스 증후군, 근육통 증후군, 호산구과다 증후군, 간헐적 맥관부종을 포함하는 부종성 반응, 연충 감염, 사상충 피부염, 호산구 식도염, 호산구 장염, 호산구 결장염, 폐쇄성 수면 무호흡, 심내막심근 섬유증, 애디슨병, 레이노 질환 또는 현상, 자가면역 간염, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 또는 장기 이식 거부.
일부 구현예에서, 장애는 피부의 염증성 장애이다. 일부 구현예에서, 장애는 아토피 피부염 또는 사상충 피부염이다. 일부 구현예에서, 장애는 만성 특발성 두드러기 (CIU 또는 CSU)이다.
일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 중성구 장애, 또는 호산구 장애는 섬유성 장애이다. 일부 구현예에서, 섬유성 장애은 하기를 포함한다: 폐 섬유증, 간 섬유증 (예를 들어, 간경변 (예를 들어, 알코올-유도된 간경변, 바이러스-유도된 간경변, 후-간염 C 간경변, 및 원발성 담도 간경변증)과 연관된 섬유증, 주혈협충병, 담관염 (예를 들어, 경화 담관염), 및 자가면역-유도된 간염), 신장 섬유증 (예를 들어, 세뇨관간질 섬유증, 경피증, 당뇨병성 신염, 및 사구체 신염), 진피 섬유증 (예를 들어, 경피증, 비대성 및 켈로이드 반흔, 신원발성 섬유성 피부병, 및 화상), 골수섬유증, 신경섬유종증, 섬유종, 장내 섬유증, 및 수술 과정에서 초래된 섬유성 유착), 심장 섬유증 (예를 들어, 심근경색증과 연관된 섬유증), 혈관 섬유증 (예를 들어, 혈관성형후 동맥 재협착증 및 죽상경화증과 연관된 섬유증), 눈 섬유증 (예를 들어, 백내장후 수술과 연관된 섬유증, 증식성 유리체망막병증, 및 안와후 섬유증), 및 골수 섬유증 (예를 들어, 특발성 골수섬유증 및 약물 유도 골수섬유증). 섬유증은 장기-특이적 또는 전신 (예를 들어, GVHD와 연관된 전신 경화증 및 섬유증)일 수 있다. 일부 구현예에서, 섬유성 장애는 폐 섬유증이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 섬유성 간질성 폐렴이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증 (IPF), 로도 알려지다 특발성 섬유성 폐포염이다. 일부 구현예에서, IPF는 성별, 연령 및 생리학 (GAP)-단계 I이다. 일부 구현예에서, IPF는 GAP-단계 II이다. 일부 구현예에서, IPF는 GAP-단계 III이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 산발적 IPF이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 가족성 폐 섬유증이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 조합된 폐 섬유증 및 폐공기증이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 하기 중 하나 이상과 연관된다: 보통의 사이질 폐렴; 특발성 사이질 폐렴; 박리성 사이질 폐렴; 호흡 세기관지염-사이질 폐 질환; 급성 사이질 폐렴; 비특이적 사이질 폐렴; 유육종증; 원인불명의 기질화 폐렴; 호산구 폐렴; 감염; 직업적 또는 환경 물질에 대한 노출; 담배 흡연; 약물 또는 방사선과 연관된 사이질 폐 질환; 류마티스성 질환-연관된 사이질 폐 질환; 림프양 사이질 폐렴; 흉막폐 섬유탄력증; 폐 랑게르한스 세포 조직구증; 전신 경화증-사이질 폐 질환; 헤르만스키-푸들라크 증후군; 및 텔로미어병증.
일부 구현예에서, 폐 장애, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 중성구 장애, 또는 호산구 장애는 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD)이다. 일부 구현예에서, COPD는 만성적 폐쇄성 폐 질환 (GOLD) 카테고리 A에 대한 세계적인 구상 이다. 일부 구현예에서, COPD는 GOLD 카테고리 B이다. 일부 구현예에서, COPD는 GOLD 카테고리 C이다. 일부 구현예에서, COPD는 GOLD 카테고리 D이다. 일부 구현예에서, COPD는 만성 기관지염이다. 일부 구현예에서, COPD는 폐공기증이다. 일부 구현예에서, 폐공기증은 근위 소엽, 전폐포성, 또는 원위 소엽 폐공기증이다. 일부 구현예에서, 폐공기증은 담배-유도된 폐공기증이다. 일부 구현예에서, COPD는 미립자 분진, 화학 매연, 및/또는 대기 오염에 대한 노출과 연관된다. 일부 구현예에서, COPD는 손상된 폐 발달과 연관된다. 일부 구현예에서, COPD는 만성적 폐쇄성 천식이다. 일부 구현예에서, COPD는 알파-1 항트립신 결핍과 연관된다. 일부 구현예에서, COPD는 세린 프로테아제 억제제 분기군 E, 구성원 2 (세르핀2) 파괴와 연관된다. 일부 구현예에서, COPD는 지속적 전신 염증을 갖는 COPD 이다. 일부 구현예에서, COPD는 호산구 또는 T-헬퍼 2형 (TH2) 높은 COPD이다. 일부 구현예에서, COPD는 지속적 박테리아 군집화를 갖는 COPD이다. 일부 구현예에서, COPD는 악화가 빈번한 COPD 이다. 일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 중성구 장애, 또는 호산구 장애는 천식-COPD 중복 증후군 (ACOS)이다. 일부 구현예에서, ACOS는 호산구-우세한, 중성구-우세한, 혼합된-패턴, 또는 염증 없는 (소과립구성) ACOS이다. 일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 중성구 장애, 또는 호산구 장애는 COPD-폐쇄성 수면 무호흡 (OSA) 중복 증후군이다.
상기 목록은 모두를 포함하는 것은 아니고, 질환 또는 장애가 다양한 카테고리 내에 있을 수 있는 것으로 숙련가에 의해 이해될 것이다.
용어 "패키지 인서트"는 적응증, 용법, 투약량, 투여, 병용 치료, 금기 및/또는 이러한 치료학적 생성물의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 치료학적 생성물의 상업용 패키지에서 관례상 포함된 설명서를 의미하도록 사용된다.
용어들 "약제학적 제형" 및 "약제학적 조성물"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 효과적이도록 그안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 허용하기 위한 그와 같은 형태인, 그리고 제형이 투여될 대상체에 허용불가능하게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제형은 멸균성이다. 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물 또는 약제학적 제형은 인간 대상체에 투여된다.
"멸균" 약제학적 제형은 무균성이거나 모든 살아있는 미생물 및 그것의 포자가 없거나 또는 본질적으로 없다.
"안정한" 약제학적 제형은 그안에 단백질 (예를 들어, 항체, 예컨대 항-트립타제 항체)가 보관시 그것의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 것이다. 바람직하게는, 제형은 보관시 그의 물리적 및 화학적 안정성, 뿐만 아니라 그의 생물학적 활성을 본질적으로 유지한다. 보관 기간은 일반적으로 제형의 의도된 유효 기간에 기초하여 선택된다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석적 기술은 당업계에서 이용가능하고 하기에서 검토된다: Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs.(1991) 및 Jones, A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90 (1993). 안정성은 선택된 시간 동안 선택된 광 노출량 및/또는 온도에서 측정될 수 있다. 안정성은, 하기를 포함하는, 다양한 상이한 방식에서 정성적으로 및/또는 정량적으로 평가될 수 있다: 응집물 형성의 평가 (예를 들어, 탁도 측정에 의한, 및/또는 육안 검사에 의한, 크기 배제 크로마토그래피 이용); ROS 형성의 평가 (예를 들어, 광 스트레스 검정 또는 AAPH 스트레스 검정 이용); 단백질의 특이적 아미노산 잔기 (예를 들어, 단클론성 항체의 Trp 잔기 및/또는 Met 잔기)의 산화; 양이온 교환 크로마토그래피, 이미지 모세관 등전점 전기영동 (icIEF) 또는 모세관 구역 전기영동을 이용하는 전하 불균질성 평가; 아미노-말단 또는 카복시-말단 서열 분석; 질량 분광 분석; 환원된 및 온전한 항체를 비교하기 위한 SDS-PAGE 분석; 펩타이드 맵 (예를 들어, 트립신 또는 LYS-C) 분석; 단백질의 표적 결합 기능 (예를 들어, 항체의 항원 결합 기능) 또는 생물학적 활성 평가; 및 기타 동종의 것.불안정성은 하기 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다: 응집, 탈아미드화 (예를 들어, Asn 탈아미드화), 산화 (예를 들어, Met 산화 및/또는 Trp 산화), 이성질체화 (예를 들어, Asp 이성질체화), 클리핑/가수분해/단편화 (예를 들어, 힌지 영역 단편화), 석신이미드 형성, 페어링되지 않은 시스테인(들), N-말단 연장, C-말단 가공, 당화 차이, 및 기타 동종의 것.
항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 색상 및/또는 명료성의 시각적 시험시, 또는 UV 광 산란에 의해 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 경우 응집, 침전, 단편화, 및/또는 변성의 징후가 없거나 매우 적은 경우 약제학적 제형에서 "그것의 물리적 안정성"을 유지한다.
항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는, 주어진 시간에 화학적 안정성이 항체가 아래에 정의된 바와 같이 그것의 생물학적 활성을 여전히 유지하도록 간주되는 경우, 약제학적 제형에서 "그것의 화학적 안정성"을 유지한다. 화학적 안정성은 항체의 화학적으로 변경된 형태의 검출 및 정량화로 평가될 수 있다. 화학적 변형은 예를 들어 트립신 펩타이드 맵핑, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC/MS)을 사용하여 평가될 수 있는 단백질 산화를 포함할 수 있다. 다른 유형의 화학적 변형은 예를 들어 이온교환 크로마토그래피 또는 icIEF에 의해 평가될 수 있는 항체의 전하 변경을 포함한다.
항체 (예를 들어,. 항-트립타제 항체)는, 주어진 시간에 항체의 생물학적 활성이 단클론성 항체 (예를 들어, 항-트립타제 단클론성 항체)에 대하여 예를 들어 항원 결합 검정 또는 시험관내 억제성 검정에서 결정된 바와 같이, 약제학적 제형이 (검정의 오차 내에서) 제조되었던 시간에 나타났던 생물학적 활성의 약 20% 이내 (예컨대 약 10% 이내)인 경우, 약제학적 제형에서 "그의 생물학적 활성"을 유지한다. 일부 구현예에서, 주어진 시간에 항체의 생물학적 활성은 약제학적 제형이 제조되었던 시간에 나타났던 생물학적 활성의 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50% 이내이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)의 "생물학적 활성"은 그의 표적을 결합시키기 위한 항체의 능력, 예를 들어 항원에 결합하기 위한 단클론성 항체의 능력을 지칭한다. 시험관내 또는 생체내 측정될 수 있는 생물학적 반응을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 활성은 길항적 또는 작용적일 수 있다.
"산화에 민감한" 단백질 (예를 들어, 항체, 예컨대 항-트립타제 항체)는 산화되기 쉬운 것으로 밝혀졌던 하나 이상의 잔기(들) 예컨대, 비제한적으로, 메티오닌 (Met), 시스테인 (Cys), 히스티딘 (His), 트립토판 (Trp), 및 티로신 (Tyr)을 포함하는 것이다. 예를 들어, 단클론성 항체의 Fab 부분 내의 트립토판 아미노산 또는 단클론성 항체의 Fc 부분 내의 메티오닌 아미노산은 산화에 민감할 수 있다.
용어 "퍼센트 산화"는 특정 아미노산 잔기, 예를 들어, Trp 잔기 (예를 들어, hu31A.v11의 HVR-H3내 Trp100) 또는 Met 잔기에서 산화되는 제형 (예를 들어, 약제학적 조성물)에서 항체의 백분율을 지칭한다. 퍼센트 산화는, 예를 들어, 하나 이상의 트립신분해 펩타이드의 질량 분광 (MS) 분석에 의해 결정될 수 있고, 여기에서 하나 이상의 특정 산화되기 쉬운 아미노산 잔기가 거주한다. 특정 구현예에서, hu31A.v11의 HVR-H3내 Trp100의 백분율 산화는, MS 분석에 의해 결정된 바와 같이, 전체적인 (산화된 및 비-산화된) 트립신분해 펩타이드의 질량에 대해, Trp 100이 거주하는 산화된 트립신분해 펩타이드의 질량에 의해 결정된다. 퍼센트 산화는, 예를 들어, 항체 또는 이의 약제학적 조성물의 초기 생산으로부터 9 개월, 12 개월, 18 개월, 또는 2 년 이내 결정될 수 있다.
용어 "는 AAPH 스트레스 테스트에 따라 결정된다"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 특정 아미노산 잔기에서 (예를 들어, hu31A.v11의 HVR-H3내 Trp100에서) 퍼센트 산화가, 예를 들어, 실시예 5에서 기재된 바와 같이, 40 ℃에서 25 시간 동안 5 mM AAPH내 150 mg/ml로 항체 제형화 이후 트립신분해 펩타이드의 질량 분광 분석에 의해 결정된다. 스트레스 받은 항체는 트립신으로 소화되고 소화된 펩타이드는 초고성능 액체 크로마토그래피-고해상도 질량 분광분석법 (UHPLC-HRMS)를 거치게 되어 산화의 백분율을 결정한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "완충액"은 그의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH의 변화를 저항하는 완충된 용액을 지칭한다. 본 발명의 완충액은 바람직하게는 약 4.5 내지 약 8.0 (예를 들어, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 또는 약 8)의 범위에서 pH, 예를 들어, 약 pH 5.5를 갖는다. 예를 들어, 히스티딘 아세테이트는 pH를 이 범위로 조절하는 완충액의 예이다. 또 다른 적합한 완충액은 아르기닌 석시네이트 및/또는 히스티딘 석시네이트이다.
"보존제"는 내부의 박테리아 작용을 감소시켜, 예를 들어 다용도 제형의 생산을 촉진시키기 위해 제형에서 선택적으로 포함될 수 있는 화합물이다. 잠재적인 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬 기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 유형의 보존제는 방향족 알코올 예컨대 페놀, 부틸, 및 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀, 및 m-크레졸을 포함한다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 보존제는 벤질 알콜이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "계면활성제"는 표면활성제, 바람직하게는 비이온성 계면활성제를 지칭한다. 본 명세서에서 계면활성제의 예는 하기를 포함한다: 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80); 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188); TRITON®; 나트륨 도데실 설페이트 (SDS); 나트륨 라우렐 설페이트; 나트륨 옥틸 글리코사이드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미토프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미토프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 디나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUAT™ 시리즈 (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어, PLURONIC® 유형 블록 공중합체, 예를 들어, PLURONIC® F-68); 및 기타 동종의 것. 일 구현예에서, 본 명세서에서 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 계면활성제는 폴록사머 188이다.
"약제학적으로 허용가능한 담체"는, 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의, 약제학적 제형에서의 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는, 비제한적으로, 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "전구약물"은 모 약물에 비교하여 종양 세포에 덜 세포독성인 그리고 더욱 활성 모 형태로 효소적으로 활성화 또는 전환될 수 있는 약제학적으로 활성 서브스턴스의 전구체 또는 유도체를 지칭한다. 참고, 예를 들어, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella 등 "Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt 등 (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). 본 발명의 전구약물은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 설페이트-함유 전구약물, 펩타이드-함유 전구약물, D-아미노산-변형된 전구약물, 글리코실화된 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 선택적으로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 선택적으로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물 (보다 더 활성인 세포독성 없는 약물로 전환될 수 있음). 본 발명에서의 사용을 위하여 전구약물 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예는, 비제한적으로, 상기 기재된 화학치료제를 포함한다.
"대상체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간이다. 포유동물은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 농장 동물 (예컨대 소, 및 양), 스포츠 동물, 애완동물 (예컨대 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 원숭이 (예를 들어, 사이노몰구스 원숭이)), 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "투여하는"은, 대상체에 화합물 (예를 들어, 본 발명의 항-트립타제 항체 또는 추가의 치료제) 또는 조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물, 예를 들어, 부형제 예컨대 산화방지제 (예를 들어, N-아세틸트립토판 및/또는 메티오닌)을 포함할 수 있는, 본 발명의 항-트립타제 항체를 포함하는, 선택적으로 또한 추가의 치료제를 포함하는 약제학적 조성물)의 투약량의 제공 방법을 의미한다. 본 명세서에서 기재된 방법에서 이용된 조성물은, 예를 들어, 유리체내로, 근육내로, 정맥내로, 진피내로, 경피로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 늑막내로, 기관내로, 척추강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 국소적으로, 종양내로, 복막으로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 안구내로, 안와내로, 경구로, 국소적으로, 경피로, 눈주위로, 결막으로, 테논낭하로, 전방내로, 망막하로, 안구뒤로, 소관내로, 흡입에 의해, 주사로, 이식에 의해, 주입으로, 연속적 주입으로, 표적 세포를 직접적으로 수영하는 국소화된 관류로, 카테터에 의해, 세척으로, 크림으로, 또는 지질 조성물로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 방법에서 이용된 조성물은 또한 전신으로 또는 국소로 투여될 수 있다. 투여 방법은 다양한 인자 (예를 들면, 투여될 화합물 또는 조성물 및 치료될 병태, 질환, 또는 장애의 중증도)에 따라 가변될 수 있다.
제제, 예를 들어, 항-트립타제 항체 또는 약제학적 제형 (예를 들어, 부형제 예컨대 산화방지제 (예를 들어, N-아세틸트립토판 및/또는 메티오닌)을 포함할 수 있는, 항-트립타제 항체를 포함하는 약제학적 제형)의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은, 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해, 필요한 기간 동안 그리고 투약량에서, 효과적인 양을 지칭한다. 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 항-트립타제 항체), 또는 이의 조성물의 치료적 유효량은 장애 또는 질환을 개선 또는 치료할 수 있거나, 또는 장애 또는 질환과 연관된 증상을 예방, 감소, 개선, 또는 치료할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 이의 문법적 변형)은 치료되는 개체의 자연적인 과정을 변경하려는 시도에서 임상적 중재술을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는, 비제한적으로, 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행의 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 그리고 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발병을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 느리게 하는데 사용된다. 환자는, 예를 들어, 천식 요법을 받은 후, 환자가 하기 중 하나 이상의 부재 또는 하기에서의 관측가능한 및/또는 측정가능한 감소를 보여주는 경우 천식에 대하여 성공적으로 "치료"될 수 있다: 재발성 쌕쌕거림, 기침, 숨쉬기 곤란, 가슴 압박감, 밤에 발생하거나 악화되는 증상, 차가운 공기에 의해 유발되는 증상, 운동 또는 알러지항원에 노출.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "인터류킨-5 (IL-5)"는, 달리 나타내지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 토종 IL-5를 지칭한다. 상기 용어는 "전장", 가공되지 않은 IL-5, 성숙한 IL-5, 뿐만 아니라 번역후 변형에서 생기는 IL-5의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한 IL-5의 자연 발생 변이체, 예컨대 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 예시적인 IL-5의 아미노산 서열은, 예를 들어, UniProtKB 수탁 번호 P05113 하에 찾아질 수 있다.
용어 "IL-5 축 결합 길항제"는 그것의 결합 파트너 중 하나 이상, 예컨대 IL-5 수용체, 알파 (IL5RA)와 IL-5의 상호작용으로부터 생기는 신호 전달을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 분자를 지칭한다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 IL-5 축 결합 길항제는, 예를 들어, IL-5 결합 길항제 (예를 들어, 항-IL-5 항체 (예를 들어, 메폴리주맙, 벤랄리주맙, 및 레슬리주맙) 및 IL-5 수용체 결합 길항제 (예를 들어, 항-IL-5R 항체))를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인터류킨-13 (IL-13)"은, 달리 나타내지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 토종 IL-13을 지칭한다. IL-13은, T 헬퍼 2형 (Th2) 세포를 포함하는, 많은 세포 유형에 의해 분비된 사이토카인이다. 상기 용어는 "전장", 가공되지 않은 IL-13, 성숙한 IL-13, 뿐만 아니라 번역후 변형에서 생기는 IL-13의 임의의 형태를 포괄한다. 예시적인 인간 IL-13의 아미노산 서열은, 예를 들어, UniProtKB 수탁 번호 P35225 하에 찾아질 수 있다.
용어 "IL-13 축 결합 길항제"는 그것의 결합 파트너 중 하나 이상, 예컨대 IL-4 수용체 알파 (IL4Rα), IL-13 수용체 알파1 (IL13RA1) 및 IL-13 수용체 알파2 (IL13RA2)와 IL-13의 상호작용으로부터 생기는 신호 전달을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 분자를 지칭한다. IL-13 축 결합 길항제는 하기를 포함한다: IL-13 결합 길항제 (예를 들어, 항-IL-13 항체, 예를 들어, 레브리키주맙, 228B/C-1, 228A-4, 227-26, 및 227-43 (참고, 예를 들어, 미국특허 번호 7,674,459; 8,067,199; 8,088,618; 8,318,160; 및 8,734,797) 및 IL-13 수용체 결합 길항제 (예를 들어, 항-IL4Rα 항체, 항-IL13RA1 항체, 또는 항-IL13RA2 항체).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인터류킨-17 (IL-17)"은, 달리 나타내지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 토종 IL-17을 지칭하고, 패밀리 일원 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, 및 IL-17F를 포함한다. 상기 용어는 "전장", 가공되지 않은 IL-17, 성숙한 IL-17, 뿐만 아니라 번역후 변형으로부터 생기는 IL-17의 임의의 형태를 포괄한다. 예시적인 인간 IL-17A의 아미노산 서열은, 예를 들어, UniProtKB 수탁 번호 Q16552 하에 찾아질 수 있다. 예시적인 인간 IL-17B의 아미노산 서열은, 예를 들어, UniProtKB 수탁 번호 Q9UHF5 하에 찾아질 수 있다. 예시적인 인간 IL-17C의 아미노산 서열은, 예를 들어, UniProtKB 수탁 번호 Q9P0M4 하에 찾아질 수 있다. 예시적인 인간 IL-17D의 아미노산 서열은, 예를 들어, UniProtKB 수탁 번호 Q8TAD2 하에 찾아질 수 있다. 예시적인 인간 IL-17E의 아미노산 서열은, 예를 들어, UniProtKB 수탁 번호 Q9H293 하에 찾아질 수 있다. 예시적인 인간 IL-17F의 아미노산 서열은, 예를 들어, UniProtKB 수탁 번호 Q96PD4 하에 찾아질 수 있다.
용어 "IL-17 축 결합 길항제"는 그것의 결합 파트너 중 하나 이상, 예컨대 인터류킨-17 수용체 (IL-17R) 패밀리 일원 단백질 인터류킨 17 수용체 A (IL17RA), 인터류킨 17 수용체 B (IL17RB), 인터류킨 17 수용체 C (IL17RC), 인터류킨 17 수용체 D (IL17RD), 인터류킨 17 수용체 E (IL17RE), 및 인터류킨 17 수용체 E-유사 (IL17REL)과 IL-17의 상호작용으로부터 생기는 신호 전달을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해하는 분자를 지칭한다. 예시적인 IL-17 축 결합 길항제는, 예를 들어, IL-17 결합 길항제 (예를 들어, 항-IL-17 항체 (예를 들어, 세쿠키누맙 (AIN417), 익세키주맙 (LY2439821), 비메키주맙, 및 NI-1401) 및 IL-17 수용체 결합 길항제 (예를 들어, 항-IL-17R 항체 (예를 들어, 브로달루맙 (AMG-827)))를 포함한다. 참고, 예를 들어, WO 2006/013107, WO 2007/070750, WO 2012/156219, 및 미국특허 번호 8,715,669.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "인터류킨-33 (IL-33)"은, 달리 나타내지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간 및 사이노몰구스 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 토종 IL-33을 지칭한다. IL-33은 또한 하기로서 당업계에서 지칭된다: 높은 내피 세정맥의 핵 인자 (NF-HEV; 참고, 예를 들어, Baekkevold 등 Am. J. Pathol.163(1): 69-79, 2003), DVS27, C9orf26, 및 인터류킨-1 패밀리 일원 11 (IL-1F11). 상기 용어는 "전장", 가공되지 않은 IL-33, 성숙한 IL-33, 뿐만 아니라 번역후 변형으로부터 생기는 IL-33의 임의의 형태를 포괄한다. 인간 전장, 가공되지 않은 IL-33은 270 아미노산 (a.a.)를 함유하고 또한 IL-331-270으로서 지칭될 수 있다. 인간 IL-33의 가공된 형태는, 예를 들어, 하기를 포함한다: IL-3395-270, IL-3399-270, IL-33109-270, IL-33112-270, IL-331-178, 및 IL-33179-270 (Lefrancais 등 Proc. Natl. Acad. Sci. 109(5): 1673-1678, 2012 및 Martin, Semin.Immunol. 25:449-457, 2013). 일부 구현예에서, 인간 IL-33의 가공된 형태, 예를 들어, IL-3395-270, IL-3399-270, IL-33109-270, 또는 프로테아제 예컨대 칼페인, 프로테이나제 3, 중성구 엘라스타제, 및 카텝신 G에 의해 가공된 다른 형태는 전장 IL-33에 비교하여 증가된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 상기 용어는 또한 하기를 포괄한다: IL-33의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 (예를 들어, 엑손 3이 부족한 구성적으로 활성 스플라이스 변이체 spIL-33, Hong 등 J. Biol. Chem. 286(22): 20078-20086, 2011) 또는 대립유전자 변이체.IL-33은 세포 내에서 (예를 들어, 핵 내에서) 또는 분비된 사이토카인 형태로서 존재할 수 있다. 전장 IL-33 단백질은, 하기를 포함하는, 핵 편재화 서열 (인간 IL-33의 a.a.1-75)를 포함하여 헬릭스-턴-헬릭스 DNA-결합 모티프를 함유한다: 염색질 결합 모티프 (a.a.인간 IL-33의 40-58). 가공 및 분비되는 IL-33의 형태는 이들 N-말단 모티프가 부족하다. 예시적인 인간 IL-33의 아미노산 서열은, 예를 들어, UniProtKB 수탁 번호 O95760 하에 찾아질 수 있다.
본 명세서에서 교환가능하게 사용된, 용어들 "인터류킨 1 수용체-유사 1 (IL1RL1)" 및 "ST2"는, 달리 나타내지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 토종 ST2 형태를 지칭한다. ST2는 또한 당업계에서 DER4, T1, 및 FIT-1로서 지칭된다. 상기 용어는 "전장", 가공되지 않은 ST2, 성숙한 ST2, 뿐만 아니라 번역후 변형으로부터 생기는 ST2의 임의의 형태를 포괄한다. 아래에 기재된 바와 같이, 이중 프로모터 시스템으로부터 차별적인 mRNA 발현으로부터 생기는, 가용성 (sST2, IL1RL1-a로도 알려짐) 및 막관통 (ST2L, IL1RL1-b로도 알려짐), 그리고 대안적인 스플라이싱으로부터 생기는, ST2V 및 ST2LV를 포함하여, ST2의 적어도 4 동형체는 당해 기술에 공지되어 있다. ST2L의 도메인 구조는 3개의 세포외 면역글로불린-유사 C2 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 Toll/인터류킨-1 수용체 (TIR) 도메인을 포함한다. sST2는 ST2L 내에서 함유된 막관통 및 세포질 도메인이 부족하고 하기를 포함한다: 고유의 9개의 아미노산 (a.a.)C-말단 서열 (참고, 예를 들어, Kakkar 등 Nat. Rev. Drug Disc.7:827-840, 2008). sST2는 가용성 IL-33을 억제시키기 위한 유인 수용체로서 기능할 수 있다. 상기 용어는 또한 ST2의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 (예를 들어, 제3 면역글로불린 모티프가 부족하고 고유의 소수성 꼬리를 갖는, ST2V, 그리고 ST2L의 막관통 도메인이 부족한, ST2LV) 또는 대립유전자 변이체 (예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 천식 위험을 부여하는 또는 천식 위험에 대해 보호하는 변이체)를 포괄한다. 예시적인 인간 ST2의 아미노산 서열은, 예를 들어, UniProtKB 수탁 번호 Q01638 하에 찾아질 수 있다. ST2는 공-수용체 단백질 IL-1RAcP와 함께 IL-33 수용체의 일부이다. ST2 및 공-수용체 인터류킨-1 수용체 보조 단백질 (IL-1RAcP)에 IL-33의 결합은 1:1:1 3원 신호화 복합체를 형성하여 다운스트림 신호 전달을 촉진시킨다 (참고, 예를 들어, Lingel 등 Structure 17(10): 1398-1410, 2009, 및 Liu 등 Proc. Natl. Acad. Sci. 110(37): 14918-14924, 2013).
"IL-33 축"은 IL-33 신호 전달에서 관여되는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 유전자로부터 전사된 mRNA) 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, lL-33 축은 리간드 IL-33, 수용체 (예를 들어, ST2 및/또는 IL-1RAcP), 어댑터 분자 (예를 들어, MyD88), 또는 수용체 분자 및/또는 어댑터 분자 (예를 들어, 키나제, 예컨대 인터류킨-1 수용체-연관된 키나제 1 (IRAK1) 및 인터류킨-1 수용체-연관된 키나제 4 (IRAK4), 또는 E3 유비퀴틴 리가제, 예컨대 TNF 수용체 연관된 인자 6 (TRAF6))과 회합하는 단백질을 포함할 수 있다.
"IL-33 축 결합 길항제"는 그것의 결합 파트너 중 하나 이상과 IL-33 축 결합 파트너의 상호작용을 억제하는 분자를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, IL-33 축 결합 길항제는 IL-33 결합 길항제, ST2 결합 길항제, 및 IL1RAcP 결합 길항제를 포함한다. 예시적인 IL-33 축 결합 길항제는 하기를 포함한다: 항-IL-33 항체 및 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항-IL-33 항체 예컨대 ANB-020 (AnaptysBio, Inc.) 또는 EP1725261, US8187596, WO2011031600, WO2014164959, WO2015099175 또는 WO2015106080에서 기재된 임의의 항체, 이들은 전체적으로 각각 참고로 본 명세서에 편입된다); IL-33 및/또는 그것의 수용체 (ST2 및/또는 IL-1RAcP)를 결합시키고 리간드-수용체 상호작용을 차단시키는 폴리펩타이드 (예를 들어, ST2-Fc 단백질, 예컨대 WO 2014/152195에서 기재된 것, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 편입된다; 면역부착소, 펩티바디, 및 가용성 ST2, 또는 이의 유도체); 항-IL-33 수용체 항체 (예를 들어, 항-ST2 항체, 예를 들어, AMG-282 (Amgen) 또는 STLM15 (Janssen) 또는 WO 2013/173761 및 WO 2013/165894에서 기재된 임의의 항-ST2 항체, 이들은 전체적으로 각각 참고로 본 명세서에 편입된다; 또는 ST2-Fc 단백질, 예컨대 WO 2013/173761; WO 2013/165894; 또는 WO 2014/152195에서 기재된 것, 이들은 전체적으로 각각 참고로 본 명세서에 편입된다); 및 IL-33 수용체 길항제, 예컨대 소분자 억제제, IL-33을 결합시키는 압타머, 그리고, 하기에서 기재된 바와 같이 crRNA 및 tracrRNA 서열을 갖는 단일 가이드 RNAs (sgRNAs)를 포함하는, 엄격한 조건 하에 IL-33 축 핵산 서열 (예를 들어, 짧은 간섭 RNAs (siRNA) 또는 클러스터링된 규칙적으로 공간사이의 짧은 회문성 반복 RNAs (CRISPR-RNA 또는 crRNA)에 하이브리드화하는 핵산: Mali 등 (Science.339:823-26, 2013) (이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 편입되어 있음)).
용어들 "항-IL-33 항체", "IL-33에 결합하는 항체", 그리고 "IL-33을 특이적으로 결합시키는 항체"는 항체가 IL-33 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 IL-33을 결합시킬 수 있는 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, 관련없는, 비-IL-33 단백질에 항- IL-33 항체의 결합의 정도는, 예를 들어, 방사선면역검정 (RIA)에 의해 측정된 경우 IL-33에 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, IL-33에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 또는 그 미만, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항- IL-33 항체는 상이한 종으로부터 IL-33 중에서 보존되는 IL-33의 에피토프에 결합한다.
용어 "ST2 결합 길항제"는 IL-33, IL1RAcP, 및/또는 제2 ST2 분자와 ST2의 상호작용을 억제시키는 분자를 지칭한다. ST2 결합 길항제는, 링커 (예를 들어, 세린-글리신 (SG) 링커, 글리신-글리신 (GG) 링커, 또는 그것의 변이체 (예를 들어, SGG, GGS, SGS, 또는 GSG 링커))를 통해 어느 한쪽 직접적으로 또는 간접적으로 서로에 부착되는, 단백질, 예컨대 IL-33-결합 도메인 (예를 들어, ST2 또는 IL1RAcP 단백질의 전부 또는 일부) 및 다량체화 도메인 (예를 들어, 면역글로불린의 Fc 부분, 예를 들어, 아이소타입 lgG1, lgG2, lgG3, 및 lgG4로부터 선택된 IgG의 Fc 도메인, 뿐만 아니라 각각의 아이소타입 그룹 내에서 임의의 동종이인자형)을 포함하는 "ST2-Fc 단백질"일 수 있고, 비제한적으로, 하기에서 기재된 ST2-Fc 단백질 및 이의 변이체를 포함한다: WO 2013/173761, WO 2013/165894, 및 WO 2014/152195, 이들은 전체적으로 각각 참고로 본 명세서에 편입된다. 일부 구현예에서, ST2 결합 길항제는 항-ST2 항체, 예를 들어, AMG-282 (Amgen) 또는 STLM15 (Janssen) 또는 WO 2013/173761 및 WO 2013/165894에서 기재된 임의의 항-ST2 항체일 수 있다.
"단리된 핵산"은 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 대개는 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 이의 천연 염색체 위치로부터 상이한 염색체 위치에서 또는 염색체외 존재한다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 암호 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵 세포에 적합한 조절 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양"은 상호 교환되어 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포, 예를 들어 이러한 세포의 자손을 의미한다. 숙주 세포는 계대배양의 수와 관련 없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 모 세포에 대해 핵산 함량에서 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본 명세서에 포함된다.
핵산은 이것이 또 하나의 핵산 서열과 기능적 관계로 놓이는 경우, "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 전구서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 암호화 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 촉진시키도록 위치할 경우에 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우 인접하며 해독 상에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 관례에 따라 사용된다.
본원에 식별된 폴리펩티드 서열과 관련하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우 최대 퍼센트 서열 동일성을 성취하기 위해 갭을 도입한 후 비교되는 폴리펩티드 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 %로서 정의되고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존성 치환을 고려하지 않는다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적을 위한 정렬은, 예를 들어, 공공연하게 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 정렬을 측정하기 위하여, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐서 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제조사 (Genentech, Inc.)에 의해 개발되었고, 소스 코드는 사용자 기록문서와 함께 미국저작권 청, 워싱턴 D.C., 20559 (미국저작권 등록 번호 TXU510087 하에서 등록됨)와 같이 제출되었다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아 주 사우스샌프란시스코 소재의 Genentech, Inc.을 통해 공공연하게 이용가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우에, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(대안적으로 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 하기한 바대로 계산된다:
분수 X/Y의 100배
여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 동일한 매치로서 스코어되는 아미노산 잔기의 수이고 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우, A 대 B의 % 아미노산 서열 동일성이 B 대 A의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않는 것으로 이해될 것이다. 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 즉시 이전의 문단에 기재된 바대로 얻어진다.
본 명세서에 기재된 아미노산 서열은 달리 구체화되지 않는 한 인접 아미노산 서열이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 하나의 유형은, 추가의 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이되, 추가적인 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 그들이 도입된 숙주 세포에서 자율적 복제를 할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점 및 에피솜 포유류 벡터를 갖는 박테리아 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 게다가, 특정 벡터는 그들이 조작 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그와 같은 벡터는 본 명세서에서 일명 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "재조합 벡터" 또는 "발현 벡터")이다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용성의 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
II. 조성물 및 방법
일 양태에서, 본 발명는, 부분적으로, 트립타제에 결합하는 신규한 항체을 기반으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명는 based, 부분적으로, 항-트립타제 항체의 특정 잔기 (예를 들어, HVR 잔기, 예컨대 HVR-H3 W100, 이는 항-트립타제 항체 hu31A.v11의 VH 도메인의 W100을 지칭함)가 산화에 민감할 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)의 산화를 감소 도는 예방하기 위해 산화방지제 (예를 들어, N-아세틸트립토판 및/또는 메티오닌)을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 다른 적합한 산화방지제 부형제는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 유리 트립토판, 사이클로덱스트린, 트롤록스 (6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산), 피리독신, 폴리올 (예를 들어, 만니톨), 및 금속 킬레이터 (예를 들어, EDTA). 참고, 예를 들어, Ji 등, Biotechnology 98:4485-4500, 2009.본 발명의 항체 및 약제학적 조성물은, 예를 들어, 하기의 진단 및/또는 치료 에 유용하다: 장애 (예를 들어, 폐 장애, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 림프구성 장애, 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애, 또는 트립타제-연관된 장애 또는 트립타제-매개된 장애.또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)의 산화를 감소 또는 예방하기 위해 동결건조된 약제학적 조성물을 제공한다.
A. 예시적인 항- 트립타제 항체
본 발명은 트립타제에 결합하는 단리된 항체르르 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-트립타제 항체는 약 100 nM 이하 (예를 들어, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 10 pM 이하, 1 pM 이하, 또는 0.1 pM 이하)의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 10 nM 이하 (예를 들어, 10 nM 이하, 1 nm 이하, 100 pM 이하, 10 pM 이하, 1 pM 이하, 또는 0.1 pM 이하)의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 1 nM 이하 (예를 들어, 1 nm 이하, 100 pM 이하, 10 pM 이하, 1 pM 이하, 또는 0.1 pM 이하)의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 0.5 nM 이하 (예를 들어, 0.5 nm 이하, 400 pM 이하, 300 pM 이하, 200 pM 이하, 100 pM 이하, 50 pM 이하, 25 pM 이하, 10 pM 이하, 1 pM 이하, 또는 0.1 pM 이하)의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.1 nM 내지 약 0.5 nM (예를 들어, 약 0.1 nM, 약 0.2 nM, 약 0.3 nM, 약 0.4 nM, 또는 약 0.5 nM)의 KD 로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 1 pM 내지 약 500 pM, 약 1 pM 내지 약 400 pM, 약 1 pM 내지 약 300 pM, 약 1 pM 내지 약 200 pM, 약 1 pM 내지 약 100 pM, 약 1 pM 내지 약 50 pM, 약 25 pM 내지 약 500 pM, 약 25 pM 내지 약 400 pM, 약 25 pM 내지 약 300 pM, 약 25 pM 내지 약 100 pM, 약 50 pM 내지 약 500 pM, 약 50 pM 내지 약 450 pM, 약 50 pM 내지 약 425 pM, 약 50 pM 내지 약 400 pM, 약 50 pM 내지 약 375 pM, 약 50 pM 내지 약 350 pM, 약 50 pM 내지 약 325 pM, 약 50 pM 내지 약 300 pM, 약 50 pM 내지 약 275 pM, 약 50 pM 내지 약 250 pM, 약 50 pM 내지 약 200 pM, 약 50 pM 내지 약 180 pM, 약 50 pM 내지 약 175 pM, 약 50 pM 내지 약 150 pM, 약 50 pM 내지 약 125 pM, 약 50 pM 내지 약 100 pM, 약 50 pM 내지 약 75 pM, 약 100 pM 내지 약 500 pM, 약 100 pM 내지 약 475 pM, 약 100 pM 내지 약 450 pM, 약 100 pM 내지 약 425 pM, 약 100 pM 내지 약 400 pM, 약 100 pM 내지 약 375 pM, 약 100 pM 내지 약 350 pM, 약 100 pM 내지 약 325 pM, 약 100 pM 내지 약 300 pM, 약 100 pM 내지 약 275 pM, 약 100 pM 내지 약 250 pM, 약 100 pM 내지 약 225 pM, 약 100 pM 내지 약 200 pM, 약 100 pM 내지 약 180 pM, 약 100 pM 내지 약 175 pM, 약 100 pM 내지 약 150 pM, 약 100 pM 내지 약 125 pM, 약 150 pM 내지 약 500 pM, 약 150 pM 내지 약 475 pM, 약 150 pM 내지 약 450 pM, 약 150 pM 내지 약 425 pM, 약 150 pM 내지 약 400 pM, 약 150 pM 내지 약 375 pM, 약 150 pM 내지 약 350 pM, 약 150 pM 내지 약 325 pM, 약 150 pM 내지 약 300 pM, 약 150 pM 내지 약 375 pM, 약 150 pM 내지 약 350 pM, 약 150 pM 내지 약 325 pM, 약 150 pM 내지 약 300 pM, 약 150 pM 내지 약 275 pM, 약 150 pM 내지 약 225 pM, 약 150 pM 내지 약 200 pM, 약 175 pM 내지 약 500 pM, 약 175 pM 내지 약 475 pM, 약 175 pM 내지 약 450 pM, 약 175 pM 내지 약 425 pM, 약 175 pM 내지 약 400 pM, 약 175 pM 내지 약 375 pM, 약 175 pM 내지 약 350 pM, 약 175 pM 내지 약 325 pM, 약 175 pM 내지 약 300 pM, 또는 약 180 pM 내지 약 400 pM의 KD 로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.4 nM의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.2 nM의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.18 nM의 KD로 트립타제에 결합한다. 일부 구현예에서, 트립타제는 인간 트립타제, 예를 들어, 인간 트립타제 베타 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1, 인간 트립타제 베타 2, 및/또는 인간 트립타제 베타 3)이다. 일부 구현예에서, KD는 BIACORE® SPR 검정에서 결정된다. 특정 구현예에서, 트립타제는 인간 트립타제 알파이다. 특정 구현예에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다.
또 다른 예에서, 일부 구현예에서, 본 발명의 항-트립타제 항체 (이전의 항-트립타제 항체 중 임의의 것 포함)는 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-트립타제 항체는, 예를 들어, 시험관내 트립타제 효소적 검정에서 측정시, 트립타제의 단백질분해 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 인공 기질, 예를 들어, 합성 펩타이드 S-2288은 시험관내 트립타제 효소적 검정에서 기질로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-트립타제 항체는 예를 들어, 기질로서 S-2288을 사용하여 시험관내 트립타제 효소적 검정에 의해 측정시, 약 100 nM 이하 (예를 들어, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2.5 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 10 pM 이하, 1 pM 이하, 또는 0.1 pM 이하)의 반-최대 억제 농도 (IC50)로 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어, 기질로서 S-2288을 사용하여 시험관내 트립타제 효소적 검정에 의해 측정시, 약 10 nM 이하 (예를 들어, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2.5 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 10 pM 이하, 1 pM 이하, 또는 0.1 pM 이하)의 IC50로 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어, 기질로서 S-2288을 사용하여 시험관내 트립타제 효소적 검정에 의해 측정시, 약 2.5 nM 이하 (예를 들어, 2.5 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 10 pM 이하, 1 pM 이하, 또는 0.1 pM 이하)의 IC50로 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.1 nM 내지 약 2 nM (예를 들어, 약 0.1 nM, 약 0.2 nM, 약 0.3 nM, 약 0.4 nM, 약 0.5 nM, 약 0.6 nM, 약 0.7 nM, 약 0.8 nM, 약 0.9 nM, 약 1.0 nM, 약 1.1 nM, 약 1.2 nM, 약 1.3 nM, 약 1.4 nM, 약 1.5 nM, 약 1.6 nM, 약 1.7 nM, 약 1.8 nM, 약 1.9 nM, 또는 약 2.0 nM)의 IC50로 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.5 nM 내지 약 2.5 nM (예를 들어, 약 0.5 nM, 약 0.6 nM, 약 0.7 nM, 약 0.8 nM, 약 0.9 nM, 약 1.0 nM, 약 1.1 nM, 약 1.2 nM, 약 1.3 nM, 약 1.4 nM, 약 1.5 nM, 약 1.6 nM, 약 1.7 nM, 약 1.8 nM, 약 1.9 nM, 약 2.0 nM, 약 2.1 nM, 약 2.2 nM, 약 2.3 nM, 약 2.4 nM, 또는 약 2.5 nM)의 IC50로 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약 1 pM 내지 약 2.5 nM, 약 25 pM 내지 약 2.5 nM, 약 50 pM 내지 약 2.5 nM, 약 75 pM 내지 약 2.5 nM, 약 100 pM 내지 약 2.5 nM, 약 125 pM 내지 약 2.5 nM, 약 150 pM 내지 약 2.5 nM, 약 175 pM 내지 약 2.5 nM, 약 200 pM 내지 약 2.5 nM, 약 225 pM 내지 약 2.5 nM, 약 250 pM 내지 약 2.5 nM, 약 300 pM 내지 약 2.5 nM, 약 325 pM 내지 약 2.5 nM, 약 325 pM 내지 약 2.5 nM, 약 350 pM 내지 약 2.5 nM, 약 375 pM 내지 약 2.5 nM, 약 400 pM 내지 약 2.5 nM, 약 425 pM 내지 약 2.5 nM, 약 450 pM 내지 약 2.5 nM, 약 500 pM 내지 약 2.5 nM, 약 450 pM 내지 약 2.5 nM, 약 500 pM 내지 약 2.5 nM, 약 550 pM 내지 약 2.5 nM, 약 600 pM 내지 약 2.5 nM, 약 650 pM 내지 약 2.5 nM, 약 700 pM 내지 약 2.5 nM, 약 750 pM 내지 약 2.5 nM, 약 800 pM 내지 약 2.5 nM, 약 850 pM 내지 약 2.5 nM, 약 900 pM 내지 약 2.5 nM, 약 950 pM 내지 약 2.5 nM, 약 1 nM 내지 약 2.5 nM, 약 1.1 nM 내지 약 2.5 nM, 약 1.2 nM 내지 약 2.5 nM, 약 1.3 nM 내지 약 2.5 nM, 약 1.4 nM 내지 약 2.5 nM, 약 1.5 nM 내지 약 2.5 nM, 약 1.6 nM 내지 약 2.5 nM, 약 1.7 nM 내지 약 2.5 nM, 약 1.8 nM 내지 약 2.5 nM, 약 1.9 nM 내지 약 2.5 nM, 약 2.0 nM 내지 약 2.5 nM, 약 2.1 nM 내지 약 2.5 nM, 약 2.2 nM 내지 약 2.5 nM, 약 2.3 nM 내지 약 2.5 nM, 약 500 pM 내지 약 1.9 pM, 약 750 pM 내지 약 1.9 pM, 약 1 nM 내지 약 1.9 pM, 약 1.25 nM 내지 약 1.9 pM, 약 1.5 nM 내지 약 1.9 pM, 약 1 nM 내지 약 1.85 nM, 약 1.25 nM 내지 약 1.85 nM, 약 1.25 nM 내지 약 1.85 nM, 약 1.5 nM 내지 약 1.85 nM, 약 1 nM 내지 약 1.8 nM, 약 1.25 nM 내지 약 1.8 nM, 약 1.5 nM 내지 약 1.8 nM, 또는 약 1.6 nM 내지 약 1.8 nM의 IC50로 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약 1.8 nM의 IC50로 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 다른 구현예에서, 항체는 약 0.5 nM 내지 약 1 nM (예를 들어, 약 0.5 nM, 약 0.6 nM, 약 0.7 nM, 약 0.8 nM, 약 0.9 nM, 또는 약 1.0 nM)의 IC50로 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약 1 pM 내지 약 1 nM, 약 25 pM 내지 약 1 nM, 약 50 pM 내지 약 1 nM, 약 75 pM 내지 약 1 nM, 약 100 pM 내지 약 1 nM, 약 125 pM 내지 약 1 nM, 약 150 pM 내지 약 1 nM, 약 175 pM 내지 약 1 nM, 약 200 pM 내지 약 1 nM, 약 225 pM 내지 약 1 nM, 약 250 pM 내지 약 1 nM, 약 300 pM 내지 약 1 nM, 약 325 pM 내지 약 1 nM, 약 350 pM 내지 약 1 nM, 약 375 pM 내지 약 1 nM, 약 400 pM 내지 약 1 nM, 약 425 pM 내지 약 1 nM, 약 450 pM 내지 약 1 nM, 약 500 pM 내지 약 1 nM, 약 450 pM 내지 약 1 nM, 약 500 pM 내지 약 1 nM, 약 550 pM 내지 약 1 nM, 약 600 pM 내지 약 1 nM, 약 650 pM 내지 약 1 nM, 약 700 pM 내지 약 1 nM, 약 750 pM, 약 250 pM 내지 약 800 pM, 약 300 pM 내지 약 800 pM, 약 325 pM 내지 약 800 pM, 약 325 pM 내지 약 800 pM, 약 350 pM 내지 약 800 pM, 약 375 pM 내지 약 800 pM, 약 400 pM 내지 약 800 pM, 약 425 pM 내지 약 800 pM, 약 450 pM 내지 약 800 pM, 약 500 pM 내지 약 800 pM, 약 450 pM 내지 약 800 pM, 약 500 pM 내지 약 800 pM, 약 550 pM 내지 약 800 pM, 약 600 pM 내지 약 800 pM, 약 650 pM 내지 약 800 pM, 약 700 pM 내지 약 800 pM, 약 750 pM 내지 약 800 pM, 약 1 pM 내지 약 600 pM, 약 25 pM 내지 약 600 pM, 약 50 pM 내지 약 600 pM, 약 75 pM 내지 약 600 pM, 약 100 pM 내지 약 600 pM, 약 125 pM 내지 약 600 pM, 약 150 pM 내지 약 600 pM, 약 175 pM 내지 약 600 pM, 약 200 pM 내지 약 600 pM, 약 225 pM 내지 약 600 pM, 약 250 pM 내지 약 600 pM, 약 300 pM 내지 약 600 pM, 약 325 pM 내지 약 600 pM, 약 325 pM 내지 약 600 pM, 약 350 pM 내지 약 600 pM, 약 375 pM 내지 약 600 pM, 약 400 pM 내지 약 600 pM, 약 425 pM 내지 약 600 pM, 약 450 pM 내지 약 600 pM, 약 500 pM 내지 약 600 pM, 약 450 pM 내지 약 600 pM, 약 500 pM 내지 약 600 pM, 또는 약 550 pM 내지 약 600 pM의 IC50로 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.6 nM의 IC50로 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 트립타제는 인간 트립타제, 예를 들어, 인간 트립타제 베타 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1, 인간 트립타제 베타 2, 및/또는 인간 트립타제 베타 3)이다. 일부 사례에서, 항체의 억제 활성은 본 명세서에서, 예를 들어, 실시예 (예를 들어, 실시예 1, 특히 부문 (A)(viii)(a))에서, 또는 다른 접근법 당업계에서 알려진 다른 접근법에 의해 결정된다. 특정 구현예에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 1가 항체 또는 이의 항원-결합 항체 단편 (예를 들어, Fab)으로서 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다. 다른 구현예에서, 항체는 2가 항체 (예를 들어, IgG 항체 (예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체) 또는 F(ab’)2)로서 인간 트립타제의 활성을 억제할 수 있다.
일부 사례에서, 본 명세서에 기재된 항-트립타제 항체 중 임의의 것은 인간 일차 기도 평활근 세포의 트립타제-자극된 수축을 억제할 수 있다. 다른 사례에서, 본 명세서에 기재된 항-트립타제 항체 중 임의의 것은 인간 일차 기도 평활근 세포의 트립타제-자극된 수축을 억제할 수 있다. 또 다른 사례에서, 본 명세서에 기재된 항-트립타제 항체 중 임의의 것은 트립타제 또는 IgE-자극된 비만 세포 탈과립화 및/또는 히스타민 방출을 억제할 수 있다. 추가 사례에서, 본 명세서에 기재된 항-트립타제 항체 중 임의의 것은 예를 들어, 대상체에게 투여시 (예를 들어, 샘플 예컨대 기관지폐포 세척 유체 또는 비수착 샘플에서) 활성 트립타제의 양을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항-트립타제 항체 중 임의의 것은 활성 트립타제의 양을 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 그 초과까지 감소시킬 수 있다. 감소는 활성 트립타제의 기준 양, 예를 들어, 항-트립타제 항체의 투여 전에 샘플에서 활성 트립타제의 양에 대한 것일 수 있다.
일부 사례에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: X1X2GMX3 (서열번호:1) (여기서, X1는 Asp 또는 Ser이고, X2는 Tyr 또는 Phe이고, 그리고 X3는 Val 또는 His임); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RX1X2X3DWYFDV (서열번호:3) (여기서, X1는 Asn 또는 Asp이고, X2는 Tyr 또는 Asn이고, 그리고 X3는 Asp 또는 Tyr임); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6), 또는 하기 중 임의의 하나에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상과 이의 하나 이상의 변이체의 조합: 서열번호:포함한 시스템에서 구현된다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DYGMV (서열번호:7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RNYDDWYFDV (서열번호:8); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6), 또는 하기 중 임의의 하나에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상과 이의 하나 이상의 변이체의 조합: 서열번호:2 또는 4-8.
하나의 특정 예에서, 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DYGMV (서열번호:7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RNYDDWYFDV (서열번호:8); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6). 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 도메인: 서열번호:9; (b) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 (VL) 도메인: 서열번호:10; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (서열번호:11); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGKGLEWVA (서열번호:12); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (서열번호:13); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:14). 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기 경쇄 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호:15); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKSPKPWIY (서열번호:16); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호:17); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열번호:18). 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기를 포함한다: 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 예컨대 항체 hu31A.v11.
또 다른 특정 예에서, 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DYGMV (서열번호:7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RDNYDWYFDV (서열번호:29); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6). 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 도메인: 서열번호:19; (b) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 (VL) 도메인: 서열번호:20; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVKLVESGGGSVQPGGSRKLSCAASGFTFS (서열번호:21); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGKGLEWVA (서열번호:22); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RFTISRDNPKNTLFLQMSSLRSEDTAMYYCAR (서열번호:23); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGTGTTVTVSS (서열번호:24). 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기 경쇄 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISC (서열번호:25); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGSSPKPWIY (서열번호:26); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC (서열번호:27); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGAGTKLELK (서열번호:28). 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:19 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:20, 예컨대 항체 31a.
일부 사례에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기를 포함한다: (a) 하기 중 임의의 하나의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 도메인: 서열번호:9, 101, 102, 103, 및 104; (b) 하기 중 임의의 하나의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 (VL) 도메인: 서열번호:10, 105, 및 106; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 예를 들어, 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:98의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:102의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:98의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:98의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:103의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:99의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:102의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:99의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:99의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:103의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:100 및 서열번호:102의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:100 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:100 및 서열번호:103의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:102의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:103의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:101 및 서열번호:102의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:101 및 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 다른 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:101 및 서열번호:103의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
일부 사례에서, 이전의 항체 중 임의의 것은 하기의 His51, Val80, Lys81, 및 Asp82로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 또는 모두 4개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 상기 항체는 하기의 His51, Val80, Lys81, 및 Asp82로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 또는 모두 4개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 상기 항체는 His51 및 하기의 Val 80, Lys81, 및 Asp82로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 추가로, 하기의 Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 하기의 Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 모두 12개의 아미노산 잔기를 포함한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 서열번호:71의 His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130을 포함한다. 일부 구현예에서, 에피토프는 인간 트립타제 베타 1 단량체 또는 사량체와 관련된다. 일부 구현예에서, 에피토프는 X-선 결정학 모델에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 항체는 사량체 인간 트립타제 베타 1의 작은 계면과 사량체 인간 트립타제 베타 1의 큰 계면 둘 모두를 해리시킬 수 있다.
일부 사례에서, 이전의 항-트립타제 항체 중 임의의 것은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19개의 아미노산 잔기)을 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1)에 결합하는 파라토프를 포함한다: : 경쇄 가변 영역 아미노산 잔기 Val30; Thr31; Tyr32; Tyr34; Arg50; Tyr90; His92; Ser93; 및 Tyr94 및 중쇄 가변 영역 아미노산 잔기 Phe50; Ser52; Gly53; Ser54; Ser55; Thr56; Tyr58; Arg95; Tyr97; 및 Asp98.
예를 들어, 일부 사례에서, 항-트립타제 항체는 경쇄 가변 영역 아미노산 잔기 Val30, Thr31, Tyr32, Tyr34, Arg50, Tyr90, His92, Ser93, 및 Tyr94 또는 중쇄 가변 영역 아미노산 잔기 Phe50, Ser52, Gly53, Ser54, Ser55, Thr56, Tyr58, Arg95, Tyr97, 및 Asp98을 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1)에 결합하는 파라토프를 포함한다. 일부 사례에서, 항-트립타제 항체는 경쇄 가변 영역 아미노산 잔기 Val30, Thr31, Tyr32, Tyr34, Arg50, Tyr90, His92, Ser93, 및 Tyr94 및 중쇄 가변 영역 아미노산 잔기 Phe50, Ser52, Gly53, Ser54, Ser55, Thr56, Tyr58, Arg95, Tyr97, 및 Asp98을 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1)에 결합하는 파라토프를 포함한다.
일부 사례에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYAIT (서열번호:30); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GISSAATTFYSSWAKS (서열번호:31); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: DPRGYGAALDRLDL (서열번호:32); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: QSIKSVYNNRLG (서열번호:33); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ETSILTS (서열번호:34); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: AGGFDRSGDTT (서열번호:35), 또는 하기 중 임의의 하나에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상과 이의 하나 이상의 변이체의 조합: 서열번호:30-35.
일부 사례에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기를 포함한다: (a) 하기 중 임의의 하나의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 도메인: 서열번호:36, 47, 48, 49, 50, 51, 및 52; (b) 하기 중 임의의 하나의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 (VL) 도메인: 서열번호:37, 53, 58, 또는 59; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인.
일부 사례에서, 이전의 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체) 중 임의의 것은 하기 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열 또는 그것의 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (서열번호:38); (b) 하기의 아미노산 서열 또는 그것의 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WX1RQPPGKGLEWIG (서열번호:39) (여기서, X1는 Ile 또는 Val임); (c) 하기의 아미노산 서열 또는 그것의 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RX1TISX2DTSKNQX3SLKLSSVTAADTAVYX4CAR (서열번호:40) (여기서, X1는 Val 또는 Ser이고, X2는 Arg 또는 Val이고, X3는 Val 또는 Phe이고, 그리고 X4는 Tyr 또는 Phe임); 및 (d) 하기의 아미노산 서열 또는 그것의 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:41).
예를 들어, 일부 사례에서, 이전의 항체 중 임의의 것 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기 중쇄 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (서열번호:38); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WIRQPPGKGLEWIG (서열번호:42); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (서열번호:43); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:41).
또 다른 예에서, 일부 사례에서, 이전의 항체 중 임의의 것 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기 중쇄 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSRFSLI (서열번호:44); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGKGLEWIG (서열번호:45); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCAR (서열번호:46); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:41).
또 다른 예에서, 일부 사례에서, 이전의 항체 중 임의의 것 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기 중쇄 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSRFSLI (서열번호:44); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGKGLEWIG (서열번호:45); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCAR (서열번호:46); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:41).
일부 사례에서, 이전의 항체 중 임의의 것 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기 경쇄 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DX1QX2TQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호:60) (여기서, X1는 Ile 또는 Ala이고, 그리고 X2는 Met 또는 Leu임); (b) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2; WYQQKPGKX1PKLLIY (서열번호:61) (여기서, X1는 Ala 또는 Pro임); (c) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: VPSRFSGSGSX1TDFTLTISSLQPEDFATYX2C (서열번호:62) (여기서, X1는 Gly 또는 Glu이고, 그리고 X2는 Tyr 또는 Phe임); 및 (d) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열번호:63).
예를 들어, 특히 사례s, 이전의 항체 중 임의의 것 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기 경쇄 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다(a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호:64); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호:65); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호:66); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열번호:63).
일부 구현예에서, 이전의 항체 중 임의의 것 (예를 들어, 항-트립타제 항체)은 하기 경쇄 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다(a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: AAVLTQTPASVSAAVGGTVSISC (서열번호:67); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGQPPKLLIY (서열번호:68); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFKGSGSETQFTLTISDVQX1DDAATYFC (서열번호:69) (여기서, X1는 Cys 또는 Ala임); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK FGGGTEVVVK (서열번호:70).
일부 사례에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기를 포함한다: (a) 하기 중 임의의 하나의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 도메인: 서열번호:36, 47, 48, 49, 50, 51, 및 52; (b) 하기 중 임의의 하나의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 (VL) 도메인: 서열번호:37, 53, 58, 및 59; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 예를 들어, 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:47 및 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:48 및 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:49 및 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:50 및 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:50 및 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:51 및 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:52 및 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:53. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:47 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:53. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:48 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:53. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:49 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:53. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:50 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:53. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:51 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:53. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:52 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:53. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:58. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:47 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:58. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:48 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:58. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:49 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:58. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:50 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:58. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:51 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:58. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:59. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:47 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:59. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:48 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:59. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:49 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:59. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:50 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:59. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:51 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:59.
또 다른 특정 예에서, 일부 구현예에서, 항-트립타제 항체는 하기를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYAIT (서열번호:30); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GISSAATTFYSSWAKS (서열번호:31); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: DPRGYGAALDRLDL (서열번호:32); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: QSIKSVYNNRLG (서열번호:33); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ETSILTS (서열번호:34); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: AGGFDRSGDTT (서열번호:35). 일부 구현예에서, 항-트립타제 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 도메인: 서열번호:36; (b) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 (VL) 도메인: 서열번호:37; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항-트립타제 항체는 하기 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGPGLVKPSETLSLTCTVSRFSLI (서열번호:38); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WIRQPPGKGLEWIG (서열번호:42); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RVTISRDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (서열번호:43); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:41). 일부 구현예에서, 항-트립타제 항체는 하기 경쇄 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호:64); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKAPKLLIY (서열번호:65); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열번호:66); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열번호:63). 일부 구현예에서, 항-트립타제 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:36의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호:37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 예컨대 항-트립타제 항체 huE104.v2.
또 다른 특정 예에서, 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)은 하기를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYAIT (서열번호:30); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GISSAATTFYSSWAKS (서열번호:31); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: DPRGYGAALDRLDL (서열번호:32); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: QSIKSVYNNRLG (서열번호:33); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ETSILTS (서열번호:34); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: AGGFDRSGDTT (서열번호:35). 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 도메인: 서열번호:52; (b) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 (VL) 도메인: 서열번호:53; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: QXSLEESGGGLFKPTDTLTLTCTVSRFSLI (서열번호:54); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQSPENGLEWIG (서열번호:55); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RSTITRNTNENTVTLKMTSLTAADTATYFCAR (서열번호:56); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열번호:57). 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기 경쇄 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: AAVLTQTPASVSAAVGGTVSISC (서열번호:67); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGQPPKLLIY (서열번호:68); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFKGSGSETQFTLTISDVQX1DDAATYFC (서열번호:69) (여기서, X1는 Cys 또는 Ala임); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIKFGGGTEVVVK (서열번호:70). 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:52 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:53, 예컨대 항체 E104. 일부 구현예에서, 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:52 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:59.
일부 사례에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열번호:76 및/또는 (b) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열번호:77. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 일부 구현예에서, 중쇄는 추가로, C-말단에서 라이신 (K) 잔기를 포함한다.
일부 사례에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열번호:78 및/또는 (b) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열번호:79. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호:79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 일부 구현예에서, 중쇄는 추가로, C-말단에서 라이신 (K) 잔기를 포함한다.
일부 사례에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열번호:80 및/또는 (b) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열번호:81. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호:81의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 일부 구현예에서, 중쇄는 추가로, C-말단에서 라이신 (K) 잔기를 포함한다.
일부 사례에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열번호:82 및/또는 (b) 하기의 아미노산 서열 또는 그 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열번호:83. 일부 사례에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열번호:82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호:83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄. 일부 구현예에서, 중쇄는 추가로, C-말단에서 라이신 (K) 잔기를 포함한다.
일부 사례에서, 이전의 항체 중 임의의 것 하기의 Gln100, Leu101, 및 Leu102로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 잔기를 포함하는 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프에 결합한다: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 추가로, 하기를 포함한다: 하기의 Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, 및 Glu129로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 하기를 포함한다: 하기의 Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, 및 Glu129로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 또는 모두 14개의 아미노산 잔기: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 에피토프는 하기를 포함한다: 하기의 Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Gln100, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129, 및 Arg216: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 에피토프는 인간 트립타제 베타 1 단량체 또는 사량체와 관련된다. 일부 구현예에서, 에피토프는 인간 트립타제 베타 1 사량체와 관련되고, 그리고 상기 인간 트립타제 베타 1 상의 에피토프는 추가로, 하기를 포함한다: 하기의 Gln35 및 Arg216 중 하나 또는 둘 모두: 서열번호:71. 일부 구현예에서, 에피토프는 X-선 결정학 모델에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 트립타제 베타 1의 작은 계면 및/또는 큰 계면을 해리시킬 수 있다.
일부 사례에서, 이전의 항-트립타제 항체 중 임의의 것은 경쇄 가변 영역 아미노산 잔기 Tyr29; Asn30; Arg32; 및 Arg94 및 중쇄 가변 영역 아미노산 잔기 Gly31; Tyr32; Ser52; Ser53; Ala54; Thr56; Phe58; Pro96; Arg97; Gly98; Tyr99; 및 Arg100e 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 19개의 아미노산 잔기)을 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1)에 결합하는 파라토프를 포함한다.
예를 들어, 일부 사례에서, 항-트립타제 항체는 경쇄 가변 영역 아미노산 잔기 Tyr29; Asn30; Arg32; 및 Arg94 또는 중쇄 가변 영역 아미노산 잔기 Gly31; Tyr32; Ser52; Ser53; Ala54; Thr56; Phe58; Pro96; Arg97; Gly98; Tyr99; 및 Arg100e을 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1)에 결합하는 파라토프를 포함한다. 일부 사례에서, 항-트립타제 항체는 경쇄 가변 영역 아미노산 잔기 Tyr29; Asn30; Arg32; 및 Arg94 및 중쇄 가변 영역 아미노산 잔기 Gly31; Tyr32; Ser52; Ser53; Ala54; Thr56; Phe58; Pro96; Arg97; Gly98; Tyr99; 및 Arg100e을 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1)에 결합하는 파라토프를 포함한다.
일부 사례에서, 이전의 항-트립타제 항체 중 임의의 것은 인간 트립타제에 결합한다. 일부 사례에서, 이전의 항체 중 임의의 것은 사이노몰구스 원숭이 (사이노) 트립타제에 결합한다. 일부 사례에서, 항체는 인간 트립타제 알파 또는 인간 트립타제 베타에 결합한다. 일부 사례에서, 항체는 인간 트립타제 베타 1, 인간 트립타제 베타 2, 또는 인간 트립타제 베타 3에 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합하는 항-트립타제 항체를 제공한다: 하기의 아미노산 서열과 관련될 수 있는 His51, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, 및 Ala85 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산 잔기): 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 His51, Val80, Lys81, 및 Asp82로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 또는 모두 4개의 잔기: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 구현예에서, 상기 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: His51 및 하기의 Val 80, Lys81, 및 Asp82로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 잔기: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 구현예에서, 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프는 추가로, 하기의 Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 구현예에서, 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프는 하기의 Gln67, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 모두 12개의 아미노산 잔기를 포함한다: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 구현예에서, 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프는 하기를 포함한다: 서열번호:71의 His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 구현예에서, 에피토프는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 단량체 또는 사량체와 관련된다. 일부 구현예에서, 에피토프는 X-선 결정학 모델에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 항체는 사량체 트립타제의 작은 계면 및 사량체 트립타제 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1)의 큰 계면 둘 모두를 해리시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합하는 항-트립타제 항체를 제공한다: 하기의 아미노산 서열과 관련될 수 있다 Gln100, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, 및 Arg106로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산 잔기): 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 구현예에서, 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프는 추가로, 하기를 포함한다: 하기의 Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, 및 Glu129로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 구현예에서, 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프는 하기를 포함한다: 하기의 Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, 및 Glu129로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 또는 모두 14개의 아미노산 잔기: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 구현예에서, 에피토프는 하기를 포함한다: 하기의 Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Gln100, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129, 및 Arg216: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 구현예에서, 에피토프는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 단량체 또는 사량체와 관련된다. 일부 구현예에서, 에피토프는 사량체와 관련되고, 그리고 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프는 추가로, 하기를 포함한다: 하기의 Gln35 및 Arg216 중 하나 또는 둘 모두: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 구현예에서, 에피토프는 X-선 결정학 모델에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 항체는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1)의 작은 계면 및/또는 큰 계면을 해리시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 이전의 항체 중 임의의 것은 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 아미노산 서열과 관련될 수 있는 Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, 및 Glu129로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산 잔기): 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산.
예를 들어, 일부 사례에서, 이전의 항체 중 임의의 것은 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Gln67: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Asp82: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Leu83: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Ala84: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Arg87: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Pro103: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Val104: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Ser105: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Arg106: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Glu128: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Glu129: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산.
일부 구현예에서, 이전의 항체 중 임의의 것은 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 아미노산 서열과 관련될 수 있는 Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, 및 Glu129로 구성된 군으로부터 선택된 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6개의 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 또는 모든 11개의 아미노산 잔기: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산.
일부 사례에서, 이전의 항체 중 임의의 것은 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 아미노산 서열과 관련될 수 있는 His51, Val80, Lys81, Ala85, 및 Pro130으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 추가 아미노산 잔기): 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 예를 들어, 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 His51: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Val80: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 구현예에서 항-트립타제 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Lys81: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Ala85: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Pro130: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산.
일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 아미노산 서열과 관련될 수 있는 His51, Val80, Lys81, Ala85, 및 Pro130으로 구성된 군으로부터 선택된 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5 또는 그 초과 추가의 아미노산 잔기: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산.
일부 사례에서, 항-트립타제 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130: 서열번호:71 (이는 하기의 아미노산 서열과 관련될 수 있음): 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 항-트립타제 항체는 하기로 구성된 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 His51, Gln67, Val80, Lys81, Asp82, Leu83, Ala84, Ala85, Arg87, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu128, Glu129, 및 Pro130: 서열번호:71.
다른 사례에서, 이전의 항-트립타제 항체 중 임의의 것은 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 아미노산 서열과 관련될 수 있는 Gln35, Trp55, Gln100, Leu101, Leu102, Glu126, Leu127, 및 Arg216로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8) 추가의 아미노산 잔기: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 예를 들어, 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Gln35: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Trp55: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Gln100: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Leu101: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Leu102: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Glu126: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Leu127: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 Arg216: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 상기 항체는 하기를 추가로 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 아미노산 서열과 관련될 수 있는 Gln35, Trp55, Gln100, Leu101, Leu102, Glu126, Leu127, 및 Arg216로 구성된 군으로부터 선택된 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 또는 8 또는 그 초과 개의 추가의 아미노산 잔기: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산.
일부 사례에서, 항-트립타제 항체는 하기를 포함하는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프에 결합한다: 하기의 아미노산 서열과 관련될 수 있는 Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Gln100, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129, 및 Arg216: 서열번호:71 또는 임의의 트립타제 단백질의 상응하는 아미노산. 일부 사례에서, 항-트립타제 항체는 하기의 Gln35, Trp55, Gln67, Asp82, Leu83, Ala84, Arg87, Gln100, Leu101, Leu102, Pro103, Val104, Ser105, Arg106, Glu126, Leu127, Glu128, Glu129, 및 Arg216로 구성된 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1) 상의 에피토프 에 결합한다: 서열번호:71.
또 다른 양태에서, 본 발명은 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제 베타 1)에 결합하기 위해 이전의 항체 중 임의의 것과 경쟁하는 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이전의 항체 중 임의의 것과 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
일부 구현예에서, 이전의 항체 중 임의의 것은 사량체 구조를 갖는 트립타제 (예컨대 비만 세포 분비성 과립에 존재하거나 그것으로부터 방출된 성숙한 트립타제)를 파괴하여 더 작은 분자량 종, 예를 들어, 단량체, 이량체, 및/또는 삼량체를 형성하는 능력을 가질 수 있다.
추가 양태에서, 임의의 상기 구현예에 따른 항체는, 아래 부문 1-7에서 기재된 바와 같이, 단독으로 또는 조합으로, 임의의 특징을 편입시킬 수 있다:
1. 항체 친화도
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, ≤ 1 pM, 또는 ≤ 0.1 pM (예를 들어, 10-6 M 또는 그 미만, 예를 들어, 10-6 M 내지 10-9 M 또는 그 미만, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M 또는 그 미만)의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-트립타제 항체는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제, 예를 들어, 인간 트립타제 베타)에 약 100 nM 이하 (예를 들어, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 10 pM 이하, 1 pM 이하, 또는 0.1 pM 이하)의 KD 로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제, 예를 들어, 인간 트립타제 베타)를 10 nM 이하 (예를 들어, 10 nM 이하, 1 nm 이하, 100 pM 이하, 10 pM 이하, 1 pM 이하, 또는 0.1 pM 이하)의 KD로 결합시킨다. 일부 구현예에서, 항체는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제, 예를 들어, 인간 트립타제 베타)를 1 nM 이하 (예를 들어, 1 nm 이하, 100 pM 이하, 10 pM 이하, 1 pM 이하, 또는 0.1 pM 이하)의 KD로 결합시킨다. 일부 구현예에서, 상기 또는 본 명세서에서 기재된 임의의 항-트립타제 항체는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제, 예를 들어, 인간 트립타제 베타)에 약 0.5 nM 이하 (예를 들어, 0.5 nm 이하, 400 pM 이하, 300 pM 이하, 200 pM 이하, 100 pM 이하, 50 pM 이하, 25 pM 이하, 10 pM 이하, 1 pM 이하, 또는 0.1 pM 이하)의 KD로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제, 예를 들어, 인간 트립타제 베타)를 약 0.1 nM 내지 약 0.5 nM (예를 들어, 약 0.1 nM, 약 0.2 nM, 약 0.3 nM, 약 0.4 nM, 또는 약 0.5 nM)의 KD 로 결합시킨다. 일부 구현예에서, 항체는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제, 예를 들어, 인간 트립타제 베타)를 약 0.4 nM의 KD로 결합시킨다. 일부 구현예에서, 항체는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제, 예를 들어, 인간 트립타제 베타)를 약 0.18 nM의 KD로 결합시킨다.
일 구현예에서, KD는 방사선라벨링된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 일 구현예에서, RIA는 당해 항체의 Fab 버젼 및 이의 항원으로 수행된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fabs의 용액 결합 친화도는 라벨링되지 않은 항원의 적정 시리즈의 존재 하에서 (125I)-라벨링된 항원의 최소 농도로 Fab 평형화, 그 다음 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 결합된 항원 포착에 의해 측정된다 (참고, 예를 들어, Chen 등 J. Mol. Biol. 293:865-881, 1999). 검정에 대한 조건을 확립하기 위해, MICROTITER® 멀티웰 플레이트 (Thermo Scientific)은 50mM 탄산나트륨(pH 9.6) 중에 5㎍/㎖의 포착 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 밤새 코팅되고, 후속하여 실온 (대략 23℃)에서 2시간 내지 5시간 동안 PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비-흡착제 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 하기와 혼합된다: 당해 Fab의 연속 희석액 (예를 들어, 하기에서, 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치: Presta 등 Cancer Res.57:4593-4599, 1997). 이후, 당해 Fab는 밤새 인큐베이션되지만, 인큐베이션은 평형이 도달된다는 것을 보장하도록 더 긴 기간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속할 수 있다. 이후, 혼합물은 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션을 위해 포착 플레이트로 이동된다. 용액은 그 다음 제거되고 플레이트는 PBS 내 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN®-20)으로 8회 세정된다. 플레이트가 건조된 경우, 150 μl/웰의 섬광기 (MICROSCINT-20TM; Packard)는 첨가되고, 플레이트는 TOPCOUNT™ 감마 계수기 (Packard)에서 10 분 동안 계수된다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도는 경쟁적 결합 검정에서의 사용을 위해 선택된다.
또 다른 구현예에 따르면, KD는 BIACORE® 표면 플라즈몬 공명 검정을 이용하여 측정된다. 예를 들어, BIACORE®-2000 또는 BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)를 이용하는 검정은 ~10 반응 단위 (RU)에 고정된 항원 CM5 칩으로 25 ℃에서 수행된다. 일 구현예에서, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)는 공급체의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8로, 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석된 다음 5 μl/분의 유량으로 주입되어 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)를 달성한다. 항원의 주입 이후, 1M 에탄올아민은 주입되어 미처리된 그룹을 차단시킨다. 동력학 측정을 위하여, Fab (0.78 nM 내지 500 nM)의 2-배 연속 희석액은 대략 25 μl/분의 유량으로 25 ℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN®-20) 계면활성제 (PBST)를 가진 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에서 주입된다. 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 회합 및 해리 센서그램의 동시 적합화에 의한 단순 일대일 랑뮤어 결합 모델 (BIACORE® 평가 소프트웨어 버전 3.2)를 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (KD)는 비 koff/kon으로서 계산된다. 참고, 예를 들어, Chen 등 (J. Mol. Biol. 293:865-881, 1999). 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정으로 106 M-1s-1를 초과하면, 온-레이트는 분광기, 예컨대 교반된 큐벳을 가진 정지-유동 구비된 분광측정기 (Aviv Instruments) 또는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광측정기 (ThermoSpectronic)에서 측정된 바와 같이 항원의 증가하는 농도의 존재 하에서, pH 7.2, PBS 내 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25 ℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역통과)에서 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용함으로써 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, KD는, 예를 들어, 실시예 1, 부문 (A)(vii)에서 기재된 바와 같이, BIACORE® SPR 검정을 사용하여 측정된다. 일부 구현예에서, SPR 검정은 BIAcore® T200 또는 동등한 디바이스를 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, BIAcore® 시리즈 S CM5 센서 칩 (또는 동등한 센서 칩)은 단클론성 마우스 항-인간 IgG (Fc) 항체로 고정되고 항-트립타제 항체는 후속으로 유동 세포에서 포착된다. 하기의 연속 3-배 희석액: His-태깅된 인간 트립타제 베타 1 단량체 (서열번호:128)은 30 μl/분의 유량으로 주입된다. 각각의 샘플은 3 분 회합 및 10 분 해리로 분석된다. 검정은 25 ℃에서 수행된다. 각각의 주입 후, 칩은 3 M MgCl2를 이용하여 재생된다. 결합 반응은 유사한 밀도에 무관한 IgG를 포착하는 유동 세포로부터 반응 단위 (RU)를 감산함으로써 정정된다. kon 및 koff의 동시 적합화의 1:1 랭뮤어 모델은 동력학 분석에 사용된다.
2. 항체 단편
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, 및 scFv 단편, 및 아래 기재된 다른 단편.소정의 항체 단편의 검토를 위해, 참고 Hudson 등 Nat. Med. 9: 129-134 (2003). scFv 단편의 검토를 위해, 참고, 예를 들어, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); 또한 참고 WO 93/16185; 및 미국특허 번호 5,571,894 및 5,587,458.회수 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해, 참고 미국특허 번호 5,869,046.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 참고, 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 등 Nat. Med. 9:129-134, 2003; 및 Hollinger 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993.트리아바디 및 테트라바디는 또한 Hudson 등 Nat. Med. 9:129-134, 2003에서 기재된다.
단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 혹은 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (참고, 예를 들어, 미국특허 번호 6,248,516 B1).
항체 단편은, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 비제한적으로 온전한 항체의 단백질분해 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주세포 (예를 들어, E. 콜리 또는 파아지)에 의한 생산을 포함하는, 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화된 항체
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는, 예를 들면, 하기에서 기재된다: 미국특허 번호 4,816,567; 및 Morrison 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984). 일 예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 하위클래스가 모 항체로부터 변한 "클래스 스위치된" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비인간 항체는, 모성 비인간 항체의 특이성 및 친화도를 보유하면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시키도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR (또는 이의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되는, 그리고 FRs (또는 이의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기는 비인간 항체 (예를 들면, HVR 잔기가 유도되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화도를 회복 또는 개선한다.
인간화된 항체 및 이들의 제조 방법은, 예를 들어, 하기에서 검토되고: Almagro 등 Front.Biosci.13:1619-1633, 2008, 그리고, 예를 들어, 하기에서 추가로 기재된다: Riechmann 등 Nature 332:323-329, 1988; Queen 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989; 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri 등 Methods 36:25-34, 2005 (특이성 결정 영역 (SDR) 그라프팅 기재); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498, 1991 ("재표면화" 기재); Dall’Acqua 등 Methods 36:43-60, 2005 ("FR 셔플링" 기재); 및 Osbourn 등 Methods 36:61-68, 2005 및 Klimka 등 Br.J. Cancer, 83:252-260, 2000 (FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근법 기재).
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 하기를 포함한다: "최적화" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역 (참고, 예를 들어, Sims 등 J. Immunol. 151:2296, 1993); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고, 예를 들어, Carter 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285, 1992; 및 Presta 등 J. Immunol., 151:2623, 1993); 인간 성숙한 (체세포적으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (참고, 예를 들어, Almagro 등 Front.Biosci.13:1619-1633, 2008); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고, 예를 들어, Baca 등 J. Biol. Chem. 272:10678-10684, 1997 및 Rosok 등 J. Biol. Chem. 271:22611-22618, 1996).
4. 인간 항체
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에서 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 하기에서 기재된다: van Dijk 등 Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74, 2001 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459, 2008.
인간 항체는 항원성 시험감염에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 온전한 인간 항체 또는 온전한 항체를 생산하기 위해 변형된 형질전환 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 유전좌위를 대체하거나, 염색체외 존재하거나 무작위로 동물의 염색체로 통합된, 인간 면역글로불린 유전좌위의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 형질전환 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전좌위는 일반적으로 불활성화된다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 검토를 위하여, 참고 Lonberg, Nat. Biotech.23:1117-1125, 2005.참고: 예를 들어, 미국특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (XENOMOUSETM 기술을 기재함); 미국특허 번호 5,770,429 (HUMAB® 기술을 기재함); 미국특허 번호 7,041,870 (K-M MOUSE® 기술을 기재함), 및 미국특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (VELOCIMOUSE® 기술을 기재함). 이러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마 기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론성 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 기재되어 있다. (참고, 예를 들어, Kozbor J. Immunol. 133:3001, 1984; Brodeur 등 Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner 등 J. Immunol. 147:86, 1991). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 하기에서 기재된다: Li 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562, 2006.추가의 방법은, 예를 들어, 하기에서 기재된 것들을 포함한다: 미국특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단클론성 인간 IgM 항체의 생산을 기재함) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268, 2006 (인간-인간 하이브리도마를 기재함). 인간 하이브리도마 기술 (Trioma 기술)은 또한 하기에서 기재된다: Vollmers 등 Histology and Histopathology 20(3): 927-937, 2005 및 Vollmers 등 Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3): 185-91, 2005.
인간 항체는 또한 인간 유래된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리시킴으로써 생성될 수 있다. 이후, 이러한 가변 도메인 서열은 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기술은 아래 기재된다.
5. 라이브러리 유래 항체
본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 다양한 방법은 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 그리고 원하는 결합 특징을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 종래 기술에서 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 하기에서 검토되고: Hoogenboom 등 in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien 등, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) 그리고 추가로, 예를 들어, 하기에서 기재된다: McCafferty 등 Nature 348:552-554, 1990; Clackson 등 Nature 352:624-628, 1991; Marks 등 J. Mol. Biol. 222:581-597, 1992; Marks 등, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu 등 J. Mol. Biol. 338(2): 299-310, 2004; Lee 등 J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093, 2004; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472, 2004; 및 Lee 등 J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132, 2004.
특정 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 무작위로 파아지 라이브러리에서 재조합되며, 그 다음 하기에서 기재된 바와 같이 항원-결합 파아지에 대해 스크리닝될 수 있다: Winter 등 Ann.Rev. Immunol., 12:433-455, 1994.파아지는 전형적으로, 어느 한쪽 단일쇄 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서, 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터 라이브러리는 하이브리도마 작제의 필요 없이 면역원에 고친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 비접촉 레퍼토리는 하기에 의해 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝될 수 있다: Griffiths 등 EMBO J. 12:725-734, 1993.마지막으로, 비접촉 라이브러리는 또한, 하기에 의해 기재된 바와 같이, 시험관내 재배열을 달성하기 위해 그리고 고도로 가변 HVR3 영역을 인코딩하기 위해 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 이용함으로써 그리고, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝함으로써 합성으로 제조될 수 있다: Hoogenboom 등 J. Mol. Biol., 227:381-388, 1992.인간 항체 파아지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는 예를 들어, 다음의 문헌을 포함한다: 미국특허 번호 5,750,373, 및 U.S. 특허 공보 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본 명세서에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 생각된다.
6. 다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 트립타제의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 트립타제에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원 (예를 들어, 제2 생물학적 분자)에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 트립타제의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 트립타제 (예를 들어, 인간 트립타제, 예를 들어, 인간 트립타제 베타)에 대한 것이고 다른 것은 임의의 다른 항원 (예를 들어, 제2 생물학적 분자, 예를 들어, IL-13, IL-4, IL-5, IL-17, IL-33, IgE, M1 프라임, CRTH2, 또는 TRPA)에 대한 것이다. 따라서, 이중특이적 항체는 트립타제 및 IL-13; 트립타제 및 IL-4; 트립타제 및 IL-5; 트립타제 및 IL-17, 또는 트립타제 안트(ant) IL-33 에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다. 특히, 이중특이적 항체는 트립타제 및 IL-13 또는 트립타제 및 IL-33 에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
예를 들어, 일부 사례에서, 이중특이적 항체는 트립타제에 결합하는 제1 결합 도메인 및 IL-13에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 트립타제에 결합하는 제1 결합 도메인은, 예를 들어, 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: X1X2GMX3 (서열번호:1) (여기서, X1는 Asp 또는 Ser이고, X2는 Tyr 또는 Phe이고, 그리고 X3는 Val 또는 His임); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RX1X2X3DWYFDV (서열번호:3) (여기서, X1는 Asn 또는 Asp이고, X2는 Tyr 또는 Asn이고, 그리고 X3는 Asp 또는 Tyr임); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6), 또는 하기 중 임의의 하나에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상과 이의 하나 이상의 변이체의 조합: 서열번호:1-6을 포함한 시스템에서 구현된다. 일부 사례에서, IL-13에 결합하는 제2 결합 도메인은 예를 들어, 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: AYSVN (서열번호:84); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: MIWGDGKIVYNSALKS (서열번호:85); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: DGYYPYAMDN (서열번호:86); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASKSVDSYGNSFMH (서열번호:87); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: LASNLES (서열번호:88); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQNNEDPRT (서열번호:89), 또는 하기 중 임의의 하나에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상과 이의 하나 이상의 변이체의 조합: 서열번호:84-89. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 항-IL-13 항체 레브리키주맙의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함한다.
예를 들어, 일부 사례에서, 트립타제에 결합하는 제1 결합 도메인은 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DYGMV (서열번호:7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RNYDDWYFDV (서열번호:8); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6), 예컨대 hu31a.v11. 일부 사례에서, IL-13에 결합하는 제2 결합 도메인은 예를 들어, 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: AYSVN (서열번호:84); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: MIWGDGKIVYNSALKS (서열번호:85); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: DGYYPYAMDN (서열번호:86); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASKSVDSYGNSFMH (서열번호:87); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: LASNLES (서열번호:88); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQNNEDPRT (서열번호:89). 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 항-IL-13 항체 레브리키주맙의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 Hu31a.v11의 VH 및/또는 VL의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 결합 도메인은 항-IL-13 항체 레브리키주맙의 VH 및/또는 VL의 아미노산 서열을 포함한다.
이전의 이중특이적 항-트립타제/항-IL-13 항체 중 임의의 것은 하기를 포함하는 트립타제에 결합하는 제1 결합 도메인을 포함할 수 있다: (a) 하기에 대해 또는 그것의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성 (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:9; (b) 하기 또는 그것의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성 (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:10; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인.이전의 이중특이적 항-트립타제/항-IL-13 항체 중 임의의 것은 하기를 포함하는 IL-13에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다: (a) 하기 또는 그것의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성 (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:서열번호 90 또는 서열번호114; (b) 하기 또는 그것의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성 (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:서열번호 91 또는 서열번호115; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 사례에서, 제2 결합 도메인은 레브리키주맙의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 예에서, 일부 사례에서, 이중특이적 항체는 트립타제에 결합하는 제1 결합 도메인 및 IL-33에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다. IL-33에 결합하는 제2 결합 도메인은 예를 들어 하기에 기재된 항-IL-33 항체 중 임의의 것을 포함할 수 있다: U.S. 특허 공보 No. 2016/0168242 (이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입되어 있음). 일부 구현예에서, 트립타제에 결합하는 제1 결합 도메인은, 예를 들어, 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: X1X2GMX3 (서열번호:1) (여기서, X1는 Asp 또는 Ser이고, X2는 Tyr 또는 Phe이고, 그리고 X3는 Val 또는 His임); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RX1X2X3DWYFDV (서열번호:3) (여기서, X1는 Asn 또는 Asp이고, X2는 Tyr 또는 Asn이고, 그리고 X3는 Asp 또는 Tyr임); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6), 또는 하기 중 임의의 하나에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상과 이의 하나 이상의 변이체의 조합: 서열번호:포함한 시스템에서 구현된다. 일부 사례에서, IL-33에 결합하는 제2 결합 도메인은, 예를 들어, 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: SFSMS (서열번호:120); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: TISGGKTFTDYVDSVKG (서열번호:121); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: ANYGNWFFEV (서열번호:122); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASESVAKYGLSLLN (서열번호:123); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: AASNRGS (서열번호:124); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQSKEVPFT (서열번호:125), 또는 하기 중 임의의 하나에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상과 이의 하나 이상의 변이체의 조합: 서열번호:120-125. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 항-IL-33 항체 10C12.38.H6.87Y.58I의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함한다.
예를 들어, 일부 사례에서, 트립타제에 결합하는 제1 결합 도메인은 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DYGMV (서열번호:7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RNYDDWYFDV (서열번호:8); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6), 예컨대 hu31a.v11. 일부 사례에서, IL-33에 결합하는 제2 결합 도메인은, 예를 들어, 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: SFSMS (서열번호:120); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: TISGGKTFTDYVDSVKG (서열번호:121); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: ANYGNWFFEV (서열번호:122); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASESVAKYGLSLLN (서열번호:123); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: AASNRGS (서열번호:124); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQSKEVPFT (서열번호:125). 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 항-IL-33 항체 10C12.38.H6.87Y.58I의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 Hu31a.v11의 VH 및/또는 VL의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 결합 도메인은 항-IL-33 항체 10C12.38.H6.87Y.58I의 VH 및/또는 VL의 아미노산 서열을 포함한다.
이전의 이중특이적 항-트립타제/항-IL-33 항체 중 임의의 것은 하기를 포함하는 트립타제에 결합하는 제1 결합 도메인을 포함할 수 있다: (a) 하기 또는 그것의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성 (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:9; (b) 하기 또는 그것의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성 (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:10; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인.이전의 이중특이적 항-트립타제/항-IL-33 항체 중 임의의 것은 하기를 포함하는 IL-33에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다: (a) 하기 또는 그것의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성 (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열번호:126; (b) 하기 또는 그것의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성 (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열번호:127; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 사례에서, 제2 결합 도메인은 10C12.38.H6.87Y.58I의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다.
다중특이적 항체를 제조하는 기술은 비제한적으로, 하기를 포함한다: 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (참고 Milstein 등 Nature 305:537, 1983; WO 93/08829; 및 Traunecker 등 EMBO J. 10:3655, 1991), 및 "놉-인-홀" 엔지니어링 (참고, 예를 들어, U.S. 특허 번호 5,731,168). 다중-특이적 항체는 또한, 하기로 만들어질 수 있다: 항체 Fc-헤테로이량체성 분자를 제조하기 위해 정전기 조향 효과를 인지니어링함 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시킴 (참고, 예를 들어, US 특허 번호 4,676,980, 및 Brennan 등 Science, 229:81, 1985); 이중특이적 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼 사용 (참고, 예를 들어, Kostelny 등 J. Immunol., 148(5): 1547-1553, 1992); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위해 "디아바디" 기술 사용 (참고, 예를 들어, Hollinger 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993); 및 단일-사슬 Fv (scFv) 이량체 사용 (참고, 예를 들어, Gruber 등 J. Immunol. 152:5368, 1994); 및 예를 들어 하기에 기재된 바와 같이 삼중특이적 항체 제조: Tutt 등 J. Immunol. 147:60, 1991.
"옥터퍼스 항체"를 포함하는 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체는 또한 본 명세서에 포함된다 (참고, 예를 들어, US 2006/0025576A1).
본 명세서의 항체 또는 단편은 또한 트립타제 뿐만 아니라 또 다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"를 포함한다 (참고, US 2008/0069820, 예를 들어).
놉-인투-홀
다중특이적 항체를 제조하는 방법으로서 놉-인투-홀의 사용은 예를 들어, 하기에 기재되어 있다: U.S. 특허 번호 5,731,168, WO2009/089004, US2009/0182127, US2011/0287009, Marvin 및 Zhu, Acta Pharmacol.Sin.(2005) 26(6): 649-658, 및 Kontermann (2005) Acta Pharmacol.Sin.26:1-9. 간단한 비제한적 논의가 아래에서 제공된다.
"돌출부"는 제1 폴리펩타이드의 계면으로부터 돌출되고 따라서 인접한 계면 (즉, 제2 폴리펩타이드의 계면)에서 보상성 공동에서 배치가능하여 이종다량체를 안정화시키고, 그것에 의해 예를 들어 동종다량체 형성에 보다 이종다량체 형성을 선호하는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 본 돌출부는 최초 인터페이스에 존재할 수 있거나, (예를 들면, 인터페이스를 코딩하는 핵산을 변경시킴에 의해) 합성적으로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드의 계면을 인코딩하는 핵산은 돌출부를 인코딩하도록 변경된다. 이를 달성하기 위해, 제1 폴리펩타이드의 인터페이스 내 적어도 1종의 "최초" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산은 최초 아미노산 잔기보다 더 큰 측쇄 용적을 갖는 적어도 1종의 "도입" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산으로 대체된다. 1 초과 최초 및 상응하는 도입 잔기가 있을 수 있음을 인식할 것이다. 다양한 아미노 잔기의 측쇄 용적는 예를 들어, 하기에서 보여진다: US 2011/0287009의 표1 또는 하기의 표 1: U.S. 특허 번호 7,642,228.
일부 구현예에서, 돌출부의 형성을 위한 도입 잔기는 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W)으로부터 선택된 천연 발생 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, 도입 잔기는 트립토판 또는 티로신이다. 일부 구현예에서, 돌출부의 형성을 위한 최초 잔기는 작은 측쇄 용적, 예컨대 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌, 또는 발린을 갖는다. 하기를 참고한다: 예를 들어, 미국특허 번호 7,642,228.
"공동"은 제2 폴리펩타이드의 인터페이스로부터 오목하고 따라서 제1 폴리펩타이드의 인접한 인터페이스 상의 상응하는 돌출부를 수용하는 적어도 1종의 아미노산 측쇄를 언급한다. 공동은 최초 계면에서 존재할 수 있거나 또는 (예를 들어, 계면을 인코딩하는 핵산을 변경시킴으로써) 합성으로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드의 인터페이스를 코딩하는 일부 핵산은 공동을 코딩하도록 변경된다. 이를 달성하기 위해, 제2 폴리펩타이드의 인터페이스 내 적어도 1종의 "최초" 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산은 최초 아미노산 잔기보다 더 작은 측쇄 용적을 갖는 적어도 1종의 "도입" 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA로 대체된다. 1 초과 최초 및 상응하는 도입 잔기가 있을 수 있음을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 공동의 형성을 위한 도입 잔기는 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 및 발린 (V)로부터 선택된 자연 발생 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, 도입 잔기는 세린, 알라닌, 또는 트레오닌. 일부 구현예에서, 공동의 형성을 우이한 최초 잔기는 큰 측쇄 용적, 예컨대 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌, 또는 트립토판을 갖는다.
돌출부는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 각각의 인터페이스 상의 돌출부 및 공동의 공간적 위치 및 돌출부 및 공동의 크기가, 돌출부가 인터페이스에서 제1 및 제2 폴리펩타이드의 정상 회합을 유의미하게 방해함에 없이 공동 내에 위치될 수 있도록 하는 것을 의미하는 공동 내에 "위치할 수" 있다. 돌출부 예컨대 Tyr, Phe, 및 Trp는 계면의 축으로부터 수직으로 연장되지 않아서 바람직한 형태를 가지고 있기 때문에, 상응하는 공동을 갖는 돌출부의 정렬은, 일부 사례에서, 예컨대 X-선 결정학 또는 핵자기 공명 (NMR)에 의해 수득된 3차원 구조를 기반으로 돌출부/공동 쌍의 모델링에 좌우될 수 있다. 이것은 당업계에서 널리-허용된 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, IgG1 불변 영역 중 놉 돌연변이는 T366W이다. 일부 구현예에서, IgG1 불변 영역 중 홀 돌연변이는 T366S, L368A, 및 Y407V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, IgG1 불변 영역 중 홀 돌연변이는 T366S, L368A, 및 Y407V를 포함한다.
일부 구현예에서, IgG4 불변 영역 중 놉 돌연변이는 T366W이다. 일부 구현예에서, IgG4 불변 영역 중 홀 돌연변이는 T366S, L368A, 및 Y407V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, IgG4 불변 영역 중 홀 돌연변이는 T366S, L368A, 및 Y407V를 포함한다.
7. 항체 변이체
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성, 예컨대 억제 활성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 적절한 변형을 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 이것으로의 삽입 및/또는 이것의 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물이 원하는 특징, 예를 들어, 항원-결합을 보유하는 경우, 최종 작제물에 도달하도록 이뤄질 수 있다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
소정의 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발에 대한 관심 대상의 부위는 HVR 및 FR을 포함하다. 보존적 치환은 "바람직한 치환."의 제목하에 표 1에서 보여준다. 보다 실질적 변화는 "예시적 치환"의 표제하에 표 1에 제공되고, 추가로 아미노산 측쇄 부류를 참조로 하기에 기재된 바와 같다. 아미노산 치환은 원하는 활성, 예를 들어 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝되는 관심 대상의 항체 및 생성물로 도입될 수 있다.
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아미노산은 공통 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 또 다른 클래스에 대해 이 클래스의 하나의 구성원을 교환하는 것을 포함할 것이다.
치환형 변이체의 한 유형은 친계 항체 (예를 들면 인간화 또는 인간 항체)의 하나 또는 그 초과 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구에 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 소정의 생물학적 특성(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어, 개선)을 갖고/갖거나, 모 항체의 실질적으로 보유된 소정의 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환형 변이체는, 예컨대, 본원에 기재된 것과 같은 파아지 디스플레이-기반의 친화도 성숙 기술을 사용하여, 간편하게 생성될 수 있는 친화도 성숙된 항체이다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기는 돌연변이화되고 파아지에서 변이체 항체 표시되고 특정한 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화도)에 대하여 스크리닝된다.
예를 들어, 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 변경(예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. 그와 같은 변경은 HVR "핫스팟" 즉, 체세포 성숙 과정 동안에 고주파수에서 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기 (참고, 예를 들어, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196, 2008), 및/또는 항원을, 결합 친화도에 대해 시험되고 있는 수득한 변이체 VH 또는 VL과 접촉시키는 잔기에서 만들어질 수 있다. 이차 라이브러리의 구성 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어, 하기에 기재되었다: Hoogenboom 등, Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien 등 ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2001). 친화도 성숙의 몇몇 실시형태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법(예를 들어, 오차 발생이 쉬운 PCR, 사슬 셔플링 또는 올리고뉴클레오타이드 지시된 돌연변이유발)에 의해 성숙에 대해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이후, 2차 라이브러리가 생성된다. 이후, 라이브러리는 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하도록 스크리닝된다. 다양성을 도입하기 위한 또 다른 방법은 HVR 지시된 접근법을 수반하고, 여기서 몇몇 HVR 잔기(예를 들어, 한 번에 4개 내지 6개의 잔기)가 랜덤화된다. 항원 결합에 관여된 HVR 잔기는 구체적으로 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 확인될 수 있다. HVR-H3 및 HVR-L3은 특히 종종 표적화된다.
소정의 실시형태에서, 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에 치환, 삽입 또는 결실이 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 보존적 치환)은 HVR에서 이루어질 수 있다. 상기 변경은, 예를 들면, HVR에서 항원 접촉 잔기의 외부일 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 소정의 실시형태에서, 각각의 HVR은 비변경되거나, 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 하기에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 부른다: Cunningham 등 Science 244:1081-1085, 1989.상기 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹 (예를 들어, 하전된 잔기 예컨대 Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu)이 확인되고, 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는 지를 결정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, Ala 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 추가의 치환은 아미노산 위치에서 도입될 수 있어서 초기 치환에 대한 작용기 민감도를 나타낸다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉 점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조.이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환에 대한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이것이 원하는 특성을 함유하는 지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드의 길이의 범위의 아미노 및/또는 카복실 말단 융합, 및 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 (예를 들어, ADEPT에 대한) 효소 또는 폴리펩타이드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단으로의 용합을 포함한다.
b) 글라이코실화 변이체
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 항체가 글리이코실화된 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글라이코실화 부위의 부가 또는 결실은 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있어서, 하나 이상의 글라이코실화 부위는 생성되거나 제거된다.
항체가 Fc 영역을 포함할 때, 이것에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 제조된 네이티브 항체는 통상적으로 N 연결에 의해 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 부착된 분지된 2안테나(바이안테너리) 올리고사카라이드를 포함한다. 참고, 예를 들어, Wright 등 TIBTECH 15:26-32, 1997.올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산, 뿐만 아니라 2분지형 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 소정의 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체에서의 올리고사카라이드의 변형이 이루어질 수 있다.
일 실시형태에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서의 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의한 측정시, Asn 297에 부착된 모든 당구조 (예를 들어 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조)의 합에 대해, Asn297에서 당 사슬 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역(Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에서 약 297번 위치에 위치한 아스파라긴 잔기를 의미하지만, Asn297은 항체에서의 소수의 서열 변이로 인해 297번 위치의 상류에서 또는 하류에서 약 ± 3개의 아미노산에, 즉 294번 위치와 300번 위치 사이에 또한 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 참고, 예를 들어, US 특허 공보 번호 2003/0157108 및 2004/0093621."탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 공보의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki 등 J. Mol. Biol. 336:1239-1249, 2004; Yamane-Ohnuki 등 Biotech.Bioeng.87:614, 2004.탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 하기를 포함한다: 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka 등 Arch.BioChem. Biophys.249:533-545, 1986; US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312 A1, 특히 실시예 11에서), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (참고, 예를 들어, Yamane-Ohnuki 등 Biotech.Bioeng.87:614, 2004; Kanda 등 Biotechnol.Bioeng.94(4): 680-688, 2006; 및 WO 2003/085107).
항체 변이체는 올리고사카라이드, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 2안타나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 2분할되는 2분할된 올리고사카라이드가 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 그와 같은 항체 변이체의 예는 예를 들어 하기에 기재되어 있다: WO 2003/011878; US 특허 번호 6,602,684; 및 US 2005/0123546.Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드에서 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 그와 같은 항체 변이체는 예를 들어 하기에 기재되어 있다: WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764.
c) Fc 영역 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 본 명세서에 제공된 항체의 Fc 영역으로 도입될 수 있어서, Fc 영역 변이체를 생성한다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 모든 효과기 작용은 아니지만 일부 효과기 작용을 지니는 항체 변이체를 고려하며, 이 기능은 상기 항체 변이체를 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정 효과기 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)가 불필요하거나 해로운 용도에 바람직한 후보로 만든다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하도록 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정은 항체가, FcRn 결합 능력을 보유하지만, FcγR 결합이 부족한 (그러므로 유사하게 ADCC 활성이 부족한) 것을 확실히 하기 위해 수행될 수 있다. ADCC 매개용 1차 세포, NK 세포는 FcγRIII만을 발현시키고, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현시킨다. 조혈 세포상의 FcR 발현은 하기의 464페이지에서 표 3에 요약된다: Ravetch 등 Annu.Rev. Immunol. 9:457-492, 1991.당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비-제한 예는 하기에 기재된다: 미국특허 번호 5,500,362 (참고, 예를 들어, Hellstrom 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063, 1986 및 Hellstrom 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502, 1985; U.S. 특허 번호 5,821,337 (참고 Bruggemann 등 J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987). 대안적으로, 비-방사능활성 검정 방법은 사용될 수 있다 (참고, 예를 들어, 유동 세포측정을 위한 ACTI™ 비-방사능활성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc.Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI). 이러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 당해 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어, 동물 모델 예컨대 하기에서 개시하였던 것에서 생체내 평가될 수 있다: Clynes 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656, 1998.C1q 결합 검정은 항체가 C1q에 결합할 수 없고 그러므로 CDC 활성이 부족하다는 것을 확인하도록 또한 수행될 수 있다. 참고, 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA.보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정은 수행될 수 있다 (참고, 예를 들어, Gazzano-Santoro 등 J. Immunol. Methods 202:163, 1996; Cragg 등 Blood 101:1045-1052, 2003; 및 Cragg 등 Blood 103:2738-2743, 2004). FcRn 결합 및 생체내 청소능/반감기 결정은 또한 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (참고, 예를 들어, Petkova 등 Intl.Immunol. 18(12): 1759-1769, 2006).
감소된 효과기 기능을 가진 항체는 하나 이상의 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329의 치환을 가진 것들을 포함한다 (미국특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는, 알라닌에 잔기 265 및 297의 치환을 가진 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2 이상에서 치환을 가진 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국특허 번호 7,332,581).
FcR에 대한 개선된 또는 감소된 결합을 가진 특정 항체 변이체는 기재된다. (참고: 예를 들어, 미국특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312; 및 Shields 등 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604, 2001).
특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 변경은, 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같이 변경된 (즉, 어느 한쪽 개선된 또는 줄어든) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)를 초래하는 Fc 영역에서 실시된다: 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 Idusogie 등 J. Immunol. 164:4178-4184, 2000.
태아에 모계 IgGs의 이동을 책임지는, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 증가된 반감기 및 개선된 결합을 가진 항체 (Guyer 등 J. Immunol. 117:587, 1976 및 Kim 등 J. Immunol. 24:249, 1994)는 US2005/0014934에서 기재된다. 이 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 그안에 하나 이상의 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기의 하나 이상에서 치환을 가진 것을 포함한다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환 (미국 특허 번호 7,371,826).
참고 또한 Duncan 등 Nature 322:738-40, 1988; 미국특허 번호 5,648,260 및 5,624,821; 그리고 Fc 영역 변이체의 다른 예에 관한 WO 94/29351.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, "thioMAbs"를 창출하는 것이 바람직할 수 있고, 여기에서 항체의 하나 이상의 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다. 특정한 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기는 이로써 항체의 접근가능한 부위에 위치하고, 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 면역접합체를 창출하기 위해, 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 항체를 접합시키는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카밧 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다: 미국특허 번호 7,521,541.
e) 항체 유도체
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 당해 분야에 공지되고 용이하게 이용 가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는, 비제한적으로, 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비-제한 예는, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 그리고 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물 중의 이의 안정성으로 인해 제조에서 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지 또는 비분지될 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 1 초과 중합체가 부착되면, 이들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 중합체의 수 및/또는 유형은, 비제한적으로, 개선되어야 하는 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건 하에서 요법에서 사용될지 여부, 그리고 기타 동종의 것을 포함하는 고려사항들에 기반하여 결정될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 방사선에 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티 및 항체의 접합체는 제공된다. 일 구현예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605, 2005). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 보통의 세포에 해롭지 않지만, 항체-비단백질성 모이어티에 근위인 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열시키는 파장을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들어, 하기에서 기재된 바와 같이, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다: 미국특허 번호 4,816,567. 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항-트립타제 항체를 인코딩하는 단리된 핵산은 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)를 인코딩할 수 있다. 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)는 제공된다. 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포는 제공된다. 하나의 이러한 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들면, 하기로 형질전환된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 그리고 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 일 구현예에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 293 세포, 또는 림프양 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 구현예에서, 항-트립타제 항체의 제조 방법은 제공되고, 여기서 상기 방법은, 항체의 발현에 적합한 조건 하에서, 상기 제공된 바와 같이, 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양시키는 단계, 그리고 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 선택적으로 회수하는 단계를 포함한다.
항-트립타제 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이, 항체를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위하여 하나 이상의 벡터에 단리 및 삽입된다. 이러한 핵산은 종래의 절차를 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 항체는 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서 폴리펩타이드 및 항체 단편의 발현에 대하여, 참고, 예를 들어, 미국특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523.참고 또한 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254 (E. 콜리에서 항체 단편의 발현을 기재함). 발현 후, 항체는 가용성 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대 섬질 진균 또는 효모는 글리코실화 경로가 "인간화"되어서, 부분 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 가진 항체의 생산을 초래하는, 진균 및 효모 균주를 포함하는, 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참고 Gerngross Nat. Biotech.22:1409-1414, 2004 및 Li 등 Nat. Biotech.24:210-215, 2006.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (비척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 비척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루지페르다 세포의 형질주입을 위하여, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주는 확인되었다.
식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (형질전환 식물에서 항체 생산을 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기재함).
척추동물 세포는 숙주로서 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에 성장하도록 적응된 포유류 세포주는 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 하기이다: SV40 (COS-7)에 의해 전환된 원숭이 신장 CV1 라인; 인간 배아 신장 라인 (예를 들어, 하기에서 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포: Graham 등 J. Gen Virol.36:59, 1977); 어린 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 하기에서 기재된 바와 같은 TM4 세포: Mather Biol. Reprod.23:243-251, 1980); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 갯과 신장 세포 (MDCK; 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); 예를 들어, 하기에서 기재된 바와 같은 TRI 세포: Mather 등, Annals N.Y.Acad. Sci. 383:44-68, 1982; MRC 5 세포; 및 FS4 세포. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 하기를 포함한다: 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, DHFR- CHO 세포 (Urlaub 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980) 포함; 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0.항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위하여, 참고, 예를 들어, Yazaki 등 Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268, 2003.
C. 검정
본 명세서에 제공된 항-트립타제 항체는 당업계에서 공지된 다양한 검정으로 그것의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대하여 확인, 스크리닝, 또는 특성규명될 수 있다.
1. 결합 검정 및 기타 검정
일 양태에서, 본 발명의 항-트립타제 항체는, 예를 들어, 알려진 방법 예컨대 ELISA, 웨스턴 블랏, 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 및 기타 동종의 것으로 그것의 항원-결합 활성에 대하여 시험된다.
또 다른 양태에서, 경쟁 검정은 트립타제에 대한 결합에 대하여 본 발명의 항-트립타제 항체와 경쟁하는 항체를 동정하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 그와 같은 경쟁 항체는 본 발명의 항-트립타제 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 형태적 에피토프)에 결합한다. 특정 구현예에서, 그와 같은 경쟁 항체는 본 발명의 항-트립타제 항체에 의해 결합되는 중첩 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 것에 에피토프의 상세한 예시적인 맵핑 방법은 하기에서 제공된다: Morris "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology Vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ), 1996.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 트립타제는 트립타제에 결합하는 제1 라벨링된 항체 및 트립타제에 결합을 위하여 제1 항체와 경쟁하는 그것의 능력에 대하여 시험중인 제2 라벨링되지 않은 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에서 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 트립타제는 제2 라벨링되지 않은 항체가 아닌 제1 라벨링된 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. 트립타제에 제1 항체의 결합을 위하여 허용된 조건 하에서 인큐베이션후, 과잉의 미결합된 항체는 제거되고, 고정된 트립타제와 회합된 라벨의 양은 측정된다. 고정된 트립타제와 회합된 라벨의 양이 대조군 샘플에 비해 테스트 샘플에서 실질적으로 감소되면, 그것은 제2 항체가 트립타제에 대한 결합을 위하여 제1 항체와 경쟁중임을 나타낸다. 참고 Harlow 등 Antibodies:A Laboratory Manual Ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 1988.
또 다른 구현예에서, 동일한 에피토프에 대한 결합을 위하여 2 항체의 경쟁은 에피토프 비닝에 의해 결정된다. 예를 들어, 라벨링된 항원은 고체 표면상에서 고정되고, 제1 항체의 포화 양과 반응된다. 제2 경쟁 항체는 그 다음 첨가된다. 예를 들어, OCTET® (ForteBio) 또는 다른 바이오-층 간섭법 (BLI) 기술에 의해 검출된 바와 같이 제2 항체에 의한 임의의 추가의 결합은 2개의 항체가 뚜렷한, 비-중첩 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 추가의 결합 없음은 2개의 항체가 동일한 또는 중첩 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. ELISA, 크기 배제 크로모타그래피, 결정학, HDX-MS, 돌연변이유발, 및 다른 SPR 방법을 포함하는, 몇 개의 다른 방법은 또한 2개의 항체가 동일한 또는 중첩 에피토프에 결합한다는 것을 입증하는데 이용될 수 있다. 유사한 기술은 항체가 본 발명의 항체를 교차-차단하는지, 또는 상기에 의해 교차-차단되는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
2. 활성 검정
일 양태에서, 생물학적 활성을 갖는 이의 항-트립타제 항체를 동정하기 위한 검정은 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어, 트립타제 (예를 들어, 혈류에서 또는 기도에서 트립타제), 또는 이의 펩타이드 단편에, 어느 한쪽 생체내, 시험관내, 또는 생체외 결합을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 생물학적 활성은 트립타제 차단 또는 중화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 생물학적 활성은 트립타제 단백질분해 활성 차단 또는 중화를 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체는 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 상기 생물학적 활성에 대하여 시험된다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 실시예 (예를 들어, 실시예 1, 특히 부문 (A)(viii)(a))에서 기재된 바와 같이, 예를 들어, 펩타이드 기질 (예를 들어, 합성 펩타이드 S-2288)을 사용하는, 또는 당해 분야에서 공지된 방법 (참고, 예를 들어, Fukuoka 등 J. Immunol. 176:3165-3172, 2006)을 사용하는, 트립타제 효소적 검정에서 트립타제 활성의 억제에 대하여 시험된다. 일부 구현예에서, 트립타제 효소적 검정에서 트립타제 활성의 억제는 하기에서 또는 하기 부근에서 수행된다: 중성 pH (예를 들어, pH 7 부근, 예를 들어, 약 pH 7, 약 pH.7.4, 또는 약 pH 8). 다른 구현예에서, 트립타제 효소적 검정에서 트립타제 활성의 억제는 하기에서 수행된다: 산성 pH (예를 들어, 약 pH 6.0, 예를 들어, 약 pH 4.0, 약 pH 5.0, 약 pH 6.0, 또는 약 pH 6.5).
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는, 겔 여과 크로마토그래피 (예를 들어, SUPEROSE® 12 겔 여과 크로마토그래피)를 포함하는, 당업계에서 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있는, 단량체를 형성하기 위해 사량체 구조를 갖는 트립타제 (예컨대 비만 세포 분비성 과립에서 존재하는, 또는 상기로부터 방출된 성숙한 트립타제)를 파괴하는 능력에 대하여 시험된다. 참고, 예를 들어, Fukuoka 등 J. Immunol. 176:3165-3172, 2006.
더욱 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 실시예 1에서 기재된 바와 같이, 인간 1차 기도 평활근 세포의 트립타제-자극된 증식 및/또는 수축을 억제하는 능력에 대하여 시험된다.
더 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 트립타제 및/또는 IgE에 의해 자극된 비만 세포 탈과립화 및/또는 히스타민 방출을 억제하는 능력에 대하여 시험된다. 상기 검정은, 예를 들어, 하기에서 기재된다: 실시예 1.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 대상체에 (예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사로) 항체의 투여 이후 대상체로부터 수득된 샘플 (예를 들어, 기관지폐포 세척 유체)에서, 예를 들어, 활성 트립타제 검정 (참고, 예를 들어, 도 15 및 실시예 6)에서, 활성 트립타제를 억제하는 능력에 대하여 시험된다.
더욱 추가 구현예에서, 본 발명의 항체는, 대상체에 (예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사로) 항체의 투여 이후 대상체로부터 수득된 샘플 (예를 들어, 기관지폐포 세척 유체)에서, 예를 들어, 총 트립타제 검정 (참고, 예를 들어, 도 15 및 실시예 6)에서, 총 트립타제 수준을 조절 (예를 들어, 증가 또는 감소)하는 능력에 대하여 시험된다.
D. 면역콘주게이트
본 발명은 또한, 하나 이상의 세포독성 약물, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 억제성 제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 명세서의 항-트립타제 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
일 구현예에서, 면역콘주게이트는 항체가 비제한적으로 하기를 포함하는 하나 이상 상의 약물에 콘주게이트되는 항체-약물 콘주게이트 (ADC)이다: 메이탄시노이드(미국특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298); 돌라스타틴; 칼리키아마이신 또는 이의 유도체 (참고 U.S. 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; Hinman 등 Cancer Res.53:3336-3342, 1993; 및 Lode 등 Cancer Res.58:2925-2928, 1998); 안트라사이클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (참고 Kratz 등 Current Med. Chem. 13:477-523, 2006; Jeffrey 등 Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362, 2006; Torgov 등 Bioconj.Chem. 16:717-721, 2005; Nagy 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834, 2000; Dubowchik 등 Bioorg.& Med. Chem. Letters 12:1529-1532, 2002; King 등 J. Med. Chem. 45:4336-4343, 2002; 및 미국미국 특허 번호 6,630,579); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065.
또 다른 구현예에서, 면역콘주게이트는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 애루기노사(슈도모나스 에어루기노사)로부터의) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 유동(알류라이테스 포르디) 단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(파이톨라카 아메리카나) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(모모르디카 차란티아) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(사파오나리아 오피시날리스) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함하지만 이에 제한되지 않는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 콘주게이트된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 면역콘주게이트는 본원에 기술된 바와 같이, 방사성 원자에 접합되어 방사콘주게이트를 형성하는 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사콘주게이트의 생산을 위해 사용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성콘주게이트가 검출을 위해 사용될 때, 섬광계수법 연구를 위한 방사선 원자, 예를 들어 테크네튬-99m (tc99m) 또는 I123, 또는 핵자기 공명 (NMR) 이미지형성 (자기 공명 영상, mri 로도 알려지다)을 스핀 표지, 예컨대 요오드-123 또, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 콘주게이트는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들면, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예를 들면, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르(예를 들면, 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들면, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들면, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들면, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들면, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들면, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta 등 Science 238:1098, 1987에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)이 항체에의 방사성 뉴클레오티드의 콘주게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다. 참고: WO 94/11026.상기 링커는 상기 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "쪼개질 수 있는 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다아제-감수성 링커, 광불안정적인 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커가 사용될 수 있다 (참고, 예를 들어, Chari 등 Cancer Res.52:127-131, 1992; U.S. 특허 번호 5,208,020).
본원에서 면역콘주게이트 또는 ADC는 상업적으로 가용한 (가령, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S. A로부터) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 그리고 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 교차연결제 시약으로 제조된 이와 같은 접합체를 명시적으로 예기하지만, 이들에 한정되지 않는다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 항-트립타제 항체 중 임의의 것은 생물학적 샘플에서 트립타제의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 비만 세포, 호염기구, 상피 세포, 또는 폐 조직 (예를 들어, 기관지 평활근)를 비제한적으로 포함하는 세포 또는 조직을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 (예를 들어, 전혈, 혈청, 또는 혈장), 가래, 기관지폐포 세척, 또는 비수착 샘플을 포함한다.
일 구현예에서, 진단 또는 검출의 방법에서 사용되는 항-트립타제 항체가 제공된다. 추가 양태에서, 생물학적 샘플에서 트립차제의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 항-트립타제 항체의 트립타제에의 결합을 위해 허용된 조건 하에서 상기 생물학적 샘플을 본 명세서에서 기재된 바와 같은 항-트립타제 항체과 접촉시키는 단계, 및 복합체가 항-트립타제 항체와 트립타제 사이에 형성되는 지를 검출하는 단계를 포함한다. 그와 같은 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일 구현예에서, 항-트립타제 항체는, 예를 들어, 트립타제가 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우 항-트립타제 항체를 요법에 대해 자격있는 대상체를 선택하기 위해 사용된다.
본 발명의 항체를 사용하는 진단될 수 있는 예시적인 장애의 예는 하기를 포함한다: 폐 장애 (예를 들어, 천식 (예를 들어, Th2-높은 천식 또는 Th2-낮은 천식), 기도 과반응성, 또는 COPD), 자가면역 장애 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 건선, 호산구 식도염, IBD, 및 크론병), 염증성 장애 (예를 들어, 만성 특발성 두드러기 (CIU 또는 CSU), 아토피 피부염, 또는 알러지성 비염), 섬유성 장애 (예를 들어, IPF), 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 림프구성 장애, 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애, 및 트립타제-연관된 장애 또는 트립타제-매개된 장애.
예를 들어, 일부 사례에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 하기에 기재된 바와 같이, 과민증 (예를 들어, 급성 전신 과민증) 또는 비만세포증 (예를 들어, 비급성 전신 비만세포증)을 진단 또는 검출하기 위해 사용될 수 있다: Schwartz 등 Immunol. Allergy Clin.N.Am. 26:451-463, 2006). 본 발명의 항체는 총 트립타제, 프로-트립타제, 및/또는 성숙한 트립타제의 수준을 검출하기 위해 예를 들어, ELISA에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 ELISA에서 포획 항체 로서 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 ELISA에서 검출 항체 로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 혈청 또는 혈장 중 총 트립타제 중 정상 기준 수준 약 1-15 ng/mL (예를 들어, 약 1 ng/mL, 약 2 ng/mL, 약 3 ng/mL, 약 4 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 6 ng/mL, 약 7 ng/mL, 약 8 ng/mL, 약 9 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 11 ng/mL, 약 12 ng/mL, 약 13 ng/mL, 약 14 ng/mL, 또는 약 15 ng/mL)일 수 있다. 일부 사례에서, 총 트립타제 중 정상 기준 수준에 대한 증가는 트립타제-연관된 장애의 진단 지표로서 사용된다. 일부 구현예에서, 혈청 또는 혈장 중 성숙한 트립타제의 정상 기준 수준은 <1 ng/mL일 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 트립타제의 정상 기준 수준에 대한 증가는 트립타제 연관된 장애의 진단 지표로서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 라벨링된 항-트립타제 항체는 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(예를 들면, 형광성, 발색성, 전자-밀도, 화학발광성, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예를 들면, 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 표지는 비제한적으로, 하기를 포함한다: 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그것의 유도체, 로다민 및 그것의 유도체, 단실, 엄벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들어, 개똥벌레 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제 (U.S. 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 당류 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 복소환형 옥시다제 예컨대 우리카제 및 잔틴 옥시다제 (이는 염료 전구체 예컨대 HRP를 산화시키기 위해 과산화수소를 이용하는 효소와 커플링됨), 락토페록시다아제, 또는 마이크로페록시다아제, 바이오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파아지 라벨, 안정한 자유 라디칼, 및 기타 동종의 것.
F. 약제학적 제제
본 발명의 항-트립타제 항체의 약제학적 제형은 원하는 정도의 순도를 같은 그와 같은 항체를 하기의 형태의 하나 이상의 선택적인 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 제조된다 (참고, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed., 1980), 동결건조된 제형 또는 수용액.약제학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 이용된 투약량 및 농도에서 수령체에 대해 비독성이고, 비제한적으로 하기를 포함한다: 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 염화물; 헥사메토늄 염화물; 벤즈알코늄 염화물; 벤즈에토늄 염화물; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린를 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본 명세서에서 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 간질성 약물 분산제, 예컨대 가용성 천연 활성 히알우로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알우로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는 소정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 일 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가적인 글라이코스아미노글라이카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제제는 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 US 특허 번호 6,171,586 및 WO 2006/044908에 기재된 것들을 포함하고, 후자 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원에서 상기 제형은 또한 치료될 특정 징후에 필요한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게 서로에 역으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 인터류킨-13 (IL-13) 결합 길항제, 인터류킨-17 (IL-17) 축 결합 길항제, 인터류킨-5 (IL-5) 축 결합 길항제, IL-33 축 결합 길항제, M1 프라임 길항제, IgE 길항제, TRPA1 길항제, CRTH2 길항제, 기관지확장제 또는 천식 증상 컨트롤러 약물, 면역조절물질, 코르티코스테로이드, Th2 경로 억제제, 티로신 키나제 억제제, 또는 포스포디에스테라제 억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-13 축 결합 길항제는 항-IL-13 항체, 예를 들어, 레브리키주맙이다. 일부 구현예에서, IL-5 축 결합 길항제는 IL-5 결합 길항제 또는 IL-5 수용체 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 축 결합 길항제는 IL-33 결합 길항제 또는 ST2 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 결합 길항제는 항-IL-33 항체이다. 일부 사례에서, M1 프라임 길항제는 퀼리주맙이다. 일부 사례에서, IgE 길항제는 오말리주맙 (XOLAIR®)이다. 그와 같은 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 적합하게 존재한다.
활성 성분은 콜리이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐)에서 각각 예를 들어 코아세르베이션(코아세르베이션) 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에서 또는 또는 마크로에멀션에서 포획될 수 있다. 상기 기술은 다음 문헌에 개시되어 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed., 1980.
서방출성(지속-방출) 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하되, 상기 매트릭스는 형상화된 물품, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 무균이다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
본 발명은 산화방지제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 그와 같은 조성물은 본 명세서에 기재된 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체, 예컨대 hu31A.v11)의 산화를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 산화방지제는 가변 영역의 HVR 영역 또는 FR 영역에서 트립토판 잔기, 예를 들어, 트립토판 잔기의 산화를 감소시키기 위해 포함된다. 특정 사례에서, 산화방지제는 항-트립타제 항체, 예를 들어, Hu31A.v11 중 W100의 HVR-H3 잔기를 산화를 감소키기 위해 포함된다. 일부 사례에서, 산화방지제는 메티오닌 잔기, 예를 들어 항체 (예를 들어, 항-트립타제 항체)의 Fc 영역 에서의 메티오닌 잔기, 예컨대 (예를 들어, hu31A.v11의) Fc 잔기 M251, M357, 및/또는 M427의 산화를 감소시키기 위해 조성물 내에 포함된다.
일부 사례에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 항체 중 임의의 것 및 산화방지제를 포함한다. 일부 사례에서, 항체는 산화 (예를 들어, 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의) 트립토판 또는 메티오닌 잔기에서) 산화에 민감하다. 임의의 적합한 산화방지제가은 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 사례에서, 본 조성물은 N-아세틸트립토판 (예를 들어, N-아세틸 DL-트립토판 또는 N-아세틸 D-트립토판), 트립토판, 메티오닌 (예를 들어, L-메티오닌), 시스테인, 글루타티온, 티오소르비톨, 아스코르브산, 모노티오글리세롤, 사이클로덱스트린, 트롤록스, 피리독신, 폴리올 (예를 들어, 만니톨), 수크로스, 금속 킬레이터 (예를 들어, EDTA), 및 이들의 조합 (예를 들어, N-아세틸트립토판과 메티오닌의 조합)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 산화방지제 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 종의 산화방지제)를 포함한다. 일부 사례에서, 산화방지제는 N-아세틸트립토판 (예를 들어, N-아세틸 DL-트립토판 또는 N-아세틸 D-트립토판)이다. 다른 사례에서, 산화방지제는 메티오닌 (예를 들어, L-메티오닌 또는 D-메티오닌)이다. 특정 사례에서, 본 조성물은 N-아세틸트립토판 (예를 들어, N-아세틸 DL-트립토판 또는 N-아세틸 D-트립토판) 및 메티오닌 (예를 들어, L-메티오닌 또는 D-메티오닌)를 포함한다. 일부 사례에서, N-아세틸트립토판은 항체에서 트립토판의 산화를 감소 또는 방지한다. 일부 사례에서, 메티오닌은 항체에서 메티오닌의 산화를 감소 또는 방지한다.
약제학적 조성물은 산화를 감소 또는 제거하기 위해 산화방지제의 임의의 적합한 농도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리올 (예를 들어, 만니톨) 또는 수크로스의 농도는 약 1% (w/v) 내지 약 25% (w/v), 예를 들어, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 또는 약 25% (w/v)일 수 있다. 특정 사례에서, 폴리올 (예를 들어, 만니톨) 또는 수크로스의 농도는 약 15% (w/v)일 수 있다. 또 다른 예에서, 금속 킬레이터 (예를 들어, EDTA)의 농도는 약 0.01% (w/v) 내지 약 1% (w/v), 예를 들어, 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 약 0.1%, 약 0.15%, 약 0.2%, 약 0.25%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.45%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 또는 약 1% (w/v) 일 수 있다. 특정 사례에서, 금속 킬레이터 (예를 들어, EDTA)의 농도는 약 0.4% (w/v) 일 수 있다. 또 다른 예에서, 메티오닌의 농도 및/또는 트립토판은 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/ml, 예를 들어, 약 0.1 mg/ml, 약 0.5 mg/ml, 약 1 mg/ml, 약 2 mg/ml, 약 3 mg/ml, 약 4 mg/ml, 약 5 mg/ml, 약 6 mg/ml, 약 7 mg/ml, 약 8 mg/ml, 약 9 mg/ml, 또는 약 10 mg/ml일 수 있다. 일부 사례에서, 메티오닌의 농도 및/또는 트립토판은 약 2 mg/ml이다.
예를 들어, 일부 사례에서, 본 발명은 하기를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다:
(i) 인간 트립타제, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 단리된 항체로서, 하기 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함하는 단리된 항체:(a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DYGMV (서열번호:7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: RNYDDWYFDV (서열번호:8); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: SASSSVTYMY (서열번호:4); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: RTSDLAS (서열번호:5); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QHYHSYPLT (서열번호:6); (ii) N-아세틸트립토판 (예를 들어, N-아세틸 DL-트립토판 또는 N-아세틸 D-트립토판); 및 (iii) 메티오닌 (예를 들어, L-메티오닌 또는 D-메티오닌).
임의의 적합한 N-아세틸트립토판 (예를 들어, N-아세틸 DL-트립토판 또는 N-아세틸 D-트립토판)의 농도는 본 명세서에 기재된 조성물 중 임의의 것에서 사용될 수 있다. 일부 사례에서, N-아세틸트립토판 (예를 들어, N-아세틸 DL-트립토판 또는 N-아세틸 D-트립토판)의 농도는 약 0.05 mM 내지 약 20 mM (예를 들어, 약 0.05 mM 내지 약 20 mM, 약 0.05 mM 내지 약 19 mM, 약 0.05 mM 내지 약 18 mM, 약 0.05 mM 내지 약 17 mM, 약 0.05 mM 내지 약 16 mM, 약 0.05 mM 내지 약 15 mM, 약 0.05 mM 내지 약 14 mM, 약 0.05 mM 내지 약 13 mM, 약 0.05 mM 내지 약 13 mM, 약 0.05 mM 내지 약 12 mM, 약 0.05 mM 내지 약 11 mM, 약 0.05 mM 내지 약 10 mM, 약 0.05 mM 내지 약 9 mM, 약 0.05 mM 내지 약 8 mM, 약 0.05 mM 내지 약 7 mM, 약 0.05 mM 내지 약 6 mM, 약 0.05 mM 내지 약 5 mM, 약 0.05 mM 내지 약 4 mM, 약 0.05 mM 내지 약 3 mM, 약 0.05 mM 내지 약 2 mM, 약 0.05 mM 내지 약 1 mM, 약 0.1 mM 내지 약 20 mM, 약 0.1 mM 내지 약 19 mM, 약 0.1 mM 내지 약 18 mM, 약 0.1 mM 내지 약 17 mM, 약 0.1 mM 내지 약 16 mM, 약 0.1 mM 내지 약 15 mM, 약 0.1 mM 내지 약 14 mM, 약 0.1 mM 내지 약 13 mM, 약 0.1 mM 내지 약 13 mM, 약 0.1 mM 내지 약 12 mM, 약 0.1 mM 내지 약 11 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 mM 내지 약 9 mM, 약 0.1 mM 내지 약 8 mM, 약 0.1 mM 내지 약 7 mM, 약 0.1 mM 내지 약 6 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 4 mM, 약 0.1 mM 내지 약 3 mM, 약 0.1 mM 내지 약 2 mM, 약 0.1 mM 내지 약 1 mM, 약 0.1 mM 내지 약 0.9 mM, 약 0.1 내지 약 0.8 mM, 약 0.1 mM 내지 약 0.7 mM, 약 0.1 mM 내지 약 0.6 mM, 약 0.1 mM 내지 약 0.5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 0.4 mM, 약 0.1 mM 내지 약 0.3 mM, 약 0.2 mM 내지 약 20 mM, 약 0.2 mM 내지 약 19 mM, 약 0.2 mM 내지 약 18 mM, 약 0.2 mM 내지 약 17 mM, 약 0.2 mM 내지 약 16 mM, 약 0.2 mM 내지 약 15 mM, 약 0.2 mM 내지 약 14 mM, 약 0.2 mM 내지 약 13 mM, 약 0.2 mM 내지 약 13 mM, 약 0.2 mM 내지 약 12 mM, 약 0.2 mM 내지 약 11 mM, 약 0.2 mM 내지 약 10 mM, 약 0.2 mM 내지 약 9 mM, 약 0.2 mM 내지 약 8 mM, 약 0.2 mM 내지 약 7 mM, 약 0.2 mM 내지 약 6 mM, 약 0.2 mM 내지 약 5 mM, 약 0.2 mM 내지 약 4 mM, 약 0.2 mM 내지 약 3 mM, 약 0.2 mM 내지 약 2 mM, 약 0.2 mM 내지 약 1 mM, 약 0.2 mM 내지 약 0.9 mM, 약 0.2 내지 약 0.8 mM, 약 0.2 mM 내지 약 0.7 mM, 약 0.2 mM 내지 약 0.6 mM, 약 0.2 mM 내지 약 0.5 mM, 약 0.2 mM 내지 약 0.4 mM, 약 0.2 mM 내지 약 0.3 mM, 약 0.3 mM 내지 약 20 mM, 약 0.3 mM 내지 약 19 mM, 약 0.3 mM 내지 약 18 mM, 약 0.3 mM 내지 약 17 mM, 약 0.3 mM 내지 약 16 mM, 약 0.3 mM 내지 약 15 mM, 약 0.3 mM 내지 약 14 mM, 약 0.3 mM 내지 약 13 mM, 약 0.3 mM 내지 약 13 mM, 약 0.3 mM 내지 약 12 mM, 약 0.3 mM 내지 약 11 mM, 약 0.3 mM 내지 약 10 mM, 약 0.3 mM 내지 약 9 mM, 약 0.3 mM 내지 약 8 mM, 약 0.3 mM 내지 약 7 mM, 약 0.3 mM 내지 약 6 mM, 약 0.3 mM 내지 약 5 mM, 약 0.3 mM 내지 약 4 mM, 약 0.3 mM 내지 약 3 mM, 약 0.3mM 내지 약 2 mM, 약 0.3 mM 내지 약 1 mM, 약 0.3 mM 내지 약 0.9 mM, 약 0.3 내지 약 0.8 mM, 약 0.3 mM 내지 약 0.7 mM, 약 0.3 mM 내지 약 0.6 mM, 약 0.3 mM 내지 약 0.5 mM, 또는 약 0.3 mM 내지 약 0.4 mM)이다. 일부 사례에서, N-아세틸트립토판은 그 농도가 약 0.1 mM 내지 약 1 mM (예를 들어, 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 0.8 mM, 약 0.9 mM, 또는 약 1 mM)이다. 특정 사례에서, N-아세틸트립토판 (예를 들어, N-아세틸 DL-트립토판 또는 N-아세틸 D-트립토판)의 농도는 약 0.3 mM이다. 특정 사례에서, N-아세틸트립토판은 N-아세틸 DL-트립토판이다.
임의의 적합한 메티오닌 (예를 들어, L-메티오닌 또는 D-메티오닌)의 농도는 본 명세서에 기재된 조성물 중 임의의 것에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 사례에서, 메티오닌 (예를 들어, L-메티오닌 또는 D-메티오닌)의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 30 mM (예를 들어, 약 0.1 mM 내지 약 30 mM, 약 0.1 mM 내지 약 25 mM, 약 0.1 mM 내지 약 20 mM, 약 0.1 mM 내지 약 19 mM, 약 0.1 mM 내지 약 18 mM, 약 0.1 mM 내지 약 17 mM, 약 0.1 mM 내지 약 16 mM, 약 0.1 mM 내지 약 15 mM, 약 0.1 mM 내지 약 14 mM, 약 0.1 mM 내지 약 13 mM, 약 0.1 mM 내지 약 13 mM, 약 0.1 mM 내지 약 12 mM, 약 0.1 mM 내지 약 11 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 mM 내지 약 9 mM, 약 0.1 mM 내지 약 8 mM, 약 0.1 mM 내지 약 7 mM, 약 0.1 mM 내지 약 6 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 4 mM, 약 0.1 mM 내지 약 3 mM, 약 0.1 mM 내지 약 2 mM, 약 0.1 mM 내지 약 1 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 19 mM, 약 1 mM 내지 약 18 mM, 약 1 mM 내지 약 17 mM, 약 1 mM 내지 약 16 mM, 약 1 mM 내지 약 15 mM, 약 1 mM 내지 약 14 mM, 약 1 mM 내지 약 13 mM, 약 1 mM 내지 약 13 mM, 약 1 mM 내지 약 12 mM, 약 1 mM 내지 약 11 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 9 mM, 약 1 mM 내지 약 8 mM, 약 1 mM 내지 약 7 mM, 약 1 mM 내지 약 6 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 1 mM 내지 약 4 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1 mM 내지 약 2 mM, 약 2 mM 내지 약 20 mM, 약 2 mM 내지 약 19 mM, 약 2 mM 내지 약 18 mM, 약 2 mM 내지 약 17 mM, 약 2 mM 내지 약 16 mM, 약 2 mM 내지 약 15 mM, 약 2 mM 내지 약 14 mM, 약 2 mM 내지 약 13 mM, 약.2 mM 내지 약 13 mM, 약 2 mM 내지 약 12 mM, 약 2 mM 내지 약 11 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 약 2 mM 내지 약 9 mM, 약 2 mM 내지 약 8 mM, 약 2 mM 내지 약 7 mM, 약 2 mM 내지 약 6 mM, 약 2 mM 내지 약 5 mM, 약 2 mM 내지 약 4 mM, 약 2 mM 내지 약 3 mM, 약 5 mM 내지 약 20 mM, 약 5 mM 내지 약 19 mM, 약 5 mM 내지 약 18 mM, 약 5 mM 내지 약 17 mM, 약 5 mM 내지 약 16 mM, 약 5 mM 내지 약 15 mM, 약 5 mM 내지 약 14 mM, 약 5 mM 내지 약 13 mM, 약 5 mM 내지 약 13 mM, 약 5 mM 내지 약 12 mM, 약 5 mM 내지 약 11 mM, 약 5 mM 내지 약 10 mM, 약 5 mM 내지 약 9 mM, 약 5 mM 내지 약 8 mM, 약 5 mM 내지 약 7 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 6 mM)이다. 일부 사례에서, 메티오닌 (예를 들어, L-메티오닌 또는 D-메티오닌)는 그 농도가 약 1mM 내지 약 10 mM (예를 들어, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 또는 약 10 mM)이다. 특정 사례에서, 메티오닌 (예를 들어, L-메티오닌 또는 D-메티오닌)의 농도는 약 5 mM이다. 다른 사례에서, 메티오닌의 농도는 약 10 mM이다. 특정 사례에서, 메티오닌은 L-메티오닌이다.
일부 사례에서, 산화방지제 (예를 들어, N-아세틸트립토판 (예를 들어, N-아세틸 DL-트립토판) 및/또는 메티오닌 (예를 들어, L-메티오닌 또는 D-메티오닌))의 존재는, 예를 들어, 산화방지제의 부재에서 잔기에서의 산화 퍼센트에 비해 특정 잔기 (예를 들어, 트립토판 잔기 또는 메티오닌 잔기에서, 예를 들어, HVR-H3 잔기 (예를 들어, Hu31A.v11의 VH 도메인의 W100)에서 또는 Fc 잔기 (예를 들어, (예를 들어, hu31A.v11의) Fc 잔기 M251, M357, 및/또는 M427)에서 by 약 1%, 약 2%, 약 5%, 약 6%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 28%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 그 초과까지 항-트립타제 항체의 산화 퍼센트를 감소시킨다.
항체가 산화에 민감한 HVR-H3 중 VH 도메인 W100 잔기 (예를 들어, hu31A.v11)를 포함하는 사례에서, 일부 사례에서, HVR-H3 중 VH 도메인 W100 잔기는 약 35% 미만 (예를 들어, 35% 미만, 34% 미만, 33% 미만, 32% 미만, 31% 미만, 30% 미만, 29% 미만, 28% 미만, 27% 미만, 26% 미만, 25% 미만, 24% 미만, 23% 미만, 22% 미만, 21% 미만, 20% 미만, 19% 미만, 18% 미만, 17% 미만, 16% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 또는 그 미만)의 산화 퍼센트를 갖는다. 예를 들어, 일부 사례에서, HVR-H3 중 W100 잔기는 약 35% 미만의 산화 퍼센트를 갖는다. 다른 사례에서, HVR-H3 중 W100 잔기는 약 25% 미만의 산화 퍼센트를 갖는다. 또 다른 사례에서, HVR-H3 중 W100 잔기는 미만의 산화 퍼센트를 갖는다 약 15% 미만의 산화 퍼센트를 갖는다. 또 다른 사례에서, HVR-H3 중 W100 잔기는 미만의 산화 퍼센트를 갖는다 약 10% 미만의 산화 퍼센트를 갖는다. 다른 사례에서, HVR-H3 중 W100 잔기는 약 5% 미만의 산화 퍼센트를 갖는다. 다른 사례에서, HVR-H3 중 W100 잔기는 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 산화 퍼센트를 갖는다.
예로서, 항체가 산화에 민감한 HVR-H3 중 VH 도메인 W100 잔기를 포함하는 일부 사례에서, 일부 사례에서, HVR-H3 중 VH 도메인 W100 잔기는 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 45%, 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 35%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 25%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 4%, 약 1% 내지 약 3%, 약 1% 내지 약 2%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 35%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 45%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 35%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 20%, 약 25% 내지 약 50%, 또는 약 30% 내지 약 50%의 산화 퍼센트를 갖는다.
산화 퍼센트는 항체 또는 이의 약제학적 조성물의 초기 생산으로부터, 예를 들어, 약 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 18 개월, 2 년, 또는 그 초과 내에 결정될 수 있다. 일부 사례에서, 산화 퍼센트는 항체 또는 이의 약제학적 조성물의 초기 생산으로부터 약 9 개월, 약 12 개월, 약 18 개월, 또는 2 년 내에 결정된다.
본 발명의 조성물 중 항체의 농도는, 그 범위가 예를 들어, 약 1 mg/mL 내지 약 350 mg/mL (예를 들어, 약 1 mg/mL 내지 약 350 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 325 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 275 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 225 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 175 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 150 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 125 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 350 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 325 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 275 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 225 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 175 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 150 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 125 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 350 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 325 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 275 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 225 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 175 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 150 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 125 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 75 mg/mL 내지 약 350 mg/mL, 약 75 mg/mL 내지 약 325 mg/mL, 약 75 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 약 75 mg/mL 내지 약 275 mg/mL, 약 75 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 75 mg/mL 내지 약 225 mg/mL, 약 75 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 75 mg/mL 내지 약 175 mg/mL, 약 75 mg/mL 내지 약 150 mg/mL, 약 75 mg/mL 내지 약 125 mg/mL, 약 75 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 100 mg/mL 내지 약 350 mg/mL, 약 100 mg/mL 내지 약 325 mg/mL, 약 100 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 약 100 mg/mL 내지 약 275 mg/mL, 약 100 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 100 mg/mL 내지 약 225 mg/mL, 약 100 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 100 mg/mL 내지 약 175 mg/mL, 약 100 mg/mL 내지 약 150 mg/mL, 약 100 mg/mL 내지 약 125 mg/mL, 또는 약 150 mg/mL 내지 약 175 mg/mL일 수 있다. 일부 사례에서, 항체는, 그 농도가 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL (예를 들어, 약 50 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 90 mg/mL, 약 100 mg/mL, 약 110 mg/mL, 약 120 mg/mL, 약 130 mg/mL, 약 140 mg/mL, 약 150 mg/mL, 약 160 mg/mL, 약 170 mg/mL, 약 180 mg/mL, 약 190 mg/mL, 또는 약 200 mg/mL이다. 특정 사례에서, 항체 농도는 약 150 mg/mL이다.
본 명세서에 기재된 조성물 중 임의의 것은 안정화제, 완충액, 계면활성제, 및 긴장제 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 부형제를 포함할 수 있다. 일부 사례에서, 완충액은 아르기닌 석시네이트 및/또는 히스티딘 석시네이트를 포함한다. 일부 사례에서, 완충액은 아르기닌 석시네이트 및 히스티딘 석시네이트를 포함한다.
임의의 적합한 아르기닌 석시네이트의 농도가은 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 사례에서, 아르기닌 석시네이트의 농도는 약 10 mM 내지 약 500 mM (예를 들어, 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 75 mM, 약 100 mM, 약 125 mM, 약 150 mM, 약 175 mM, 약 200 mM, 약 225 mM, 약 250 mM, 약 275 mM, 약 300 mM, 약 325 mM, 약 350 mM, 약 375 mM, 약 400 mM, 약 425 mM, 약 450 mM, 약 475 mM, 또는 약 500 mM)이다. 예를 들어, 일부 사례에서, 아르기닌 석시네이트의 농도는 약 100 mM 내지 약 300 mM, 약 125 mM 내지 약 300 mM, 약 150 mM 내지 약 300 mM, 약 175 mM 내지 약 300 mM, 약 200 mM 내지 약 300 mM, 약 225 mM 내지 약 300 mM, 약 250 mM 내지 약 300 mM, 약 275 mM 내지 약 300 mM, 약 100 mM 내지 약 250 mM, 약 125 mM 내지 약 250 mM, 약 150 mM 내지 약 250 mM, 약 175 mM 내지 약 250 mM, 약 200 mM 내지 약 250 mM, 약 100 mM 내지 약 225 mM, 약 125 mM 내지 약 225 mM, 약 150 mM 내지 약 225 mM, 약 175 mM 내지 약 225 mM, 약 200 mM 내지 약 225 mM, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 약 125 mM 내지 약 200 mM, 약 150 mM 내지 약 200 mM, 또는 약 175 mM 내지 약 200 mM이다. 특정 사례에서, 아르기닌 석시네이트의 농도는 약 200 mM이다.
임의의 적합한 히스티딘 석시네이트의 농도가은 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 히스티딘 석시네이트의 농도는 약 1 mM 내지 약 100 mM (예를 들어, 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 또는 약 100 mM)이다. 특정 사례에서, 히스티딘 석시네이트의 농도는 약 20 mM이다.
본 명세서에 기재된 조성물 중 임의의 것은 약 4.0 내지 약 7.0 (예를 들어, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 또는 약 7.0)의 pH를 가질 수 있다. 일부 사례에서, pH는 약 4.5 내지 약 7.0 (예를 들어, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 또는 약 7.0)이다. 일부 사례에서, pH는 약 4.5 내지 약 6.5 (예를 들어, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 또는 약 6.5)이다. 일부 사례에서, pH는 약 5.0 내지 약 6.0 (예를 들어, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 또는 약 6.0)이다. 일부 사례에서, pH는 약 5.5이다.
임의의 적합한 계면활성제는 본 명세서에 기재된 조성물에서 사용될 수 있다. 일부 사례에서, 계면활성제는 폴록사머 188 또는 폴리소르베이트 20이다. 임의의 적합한 폴록사머 188의 농도가은 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴록사머 188의 농도는 약 0.005% 내지 약 0.5%, 약 0.005% 내지 약 0.05%, 또는 약 0.02%일 수 있다. 일부 사례에서, 폴록사머 188의 농도는 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 또는 약 0.1%이다. 특정 구현예에서, 폴록사머 188의 농도는 약 0.02%이다. 폴리소르베이트 20의 임의의 적합한 농도가은 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리소르베이트 20의 농도는 약 0.005% 내지 약 0.5%, 약 0.005% 내지 약 0.05%, 또는 약 0.02%일 수 있다. 일부 사례에서, 폴리소르베이트 20의 농도는 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 또는 약 0.1%이다.
특정 사례에서, 본 조성물은 약 150 mg/mL의 본 명세서에 기재된 항-트립타제 항체 (예를 들어, hu31A.v11), 약 200 mM 아르기닌 석시네이트, 약 20 mM 히스티딘 석시네이트, 약 0.3 mM N-아세틸 DL-트립토판), 약 5 mM L-메티오닌, 약 0.02% 폴록사머 188를 포함하고, 약 5.8의 pH를 갖는다.
본 명세서에 기재된 조성물 중 임의의 것은 임의의 적합한 경로에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 특정 사례에서, 본 조성물은 피하 투여 또는 정맥내 투여를 위해 제형화된다. 일부 사례에서, 본 조성물은 피하 투여를 위해 제형화된다.
G. 치료학적 방법 및 조성물
본 발명의 항-트립타제 항체 또는 약제학적 조성물 중 임의의 것은 치료 방법에서 사용될 수 있다.
일 양태에서, 약제로서 사용되는 항-트립타제 항체, 또는 이의 약제학적 조성물이 제공된다. 추가 양태에서, 장애를 치료하는데 사용되는 항-트립타제 항체, 또는 이의 약제학적 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에서 사용되는 항-트립타제 항체, 또는 이의 약제학적 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 장애를 가지고 있는 대상체를 치료하는 방법에서 사용되는 항-트립타제 항체, 또는 이의 약제학적 조성물을 제공하되, 상기 방법은 상기 대상체에게 항-트립타제 항체의 유효량을 투여하는 것을 수반한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 상기 대상체에게 예를 들어, 아래에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "대상체"는 바람직하게는 인간이다.
추가 양태에서, 본 발명은 약제의 제조 및 준비에서 항-트립타제 항체, 또는 이의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 약제는 장애의 치료를 위한 것이다. 추가 구현예에서, 약제는 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이고, 상기 방법은 장애를 가지고 있는 대상체에게 약제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 하나의 그와 같은 구현예에서, 본 방법은 추가로, 상기 대상체에게 예를 들어, 아래에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "대상체"는 인간일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 하기 예를 포함하는 장애를 치료하는 방법을 제공한다: 폐 장애 (예를 들어, 천식 (예를 들어, Th2-높은 천식 또는 Th2-낮은 천식), 기도 과반응성, 또는 COPD), 자가면역 장애 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 건선, 호산구 식도염, IBD, 또는 크론병), 염증성 장애 (예를 들어, 만성 특발성 두드러기 (CIU or CSU), 과민증, 아토피 피부염, 또는 알러지성 비염), 섬유성 장애 (예를 들어, IPF), 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 림프구성 장애, 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애, 및 트립타제-연관된 장애 또는 트립타제-매개된 장애. 일 구현예에서, 상기 방법은 장애를 가지고 있는 대상체에게 항-트립타제 항체, 또는 이의 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 하나의 그와 같은 구현예에서, 본 방법은 추가로, 상기 대상체에게 아래에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "대상체"는 인간일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 상기 치료 방법 중 임의의 것에서 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 항-트립타제 항체 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 일 구현예에서, 약제학적 제형은 본 명세서에 제공된 항-트립타제 항체 중 임의의 것 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 제형은 본 명세서에 제공된 항-트립타제 항체 중 임의의 것 및 예를 들어, 아래에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다. 상기의 부문 F에 기재된 약제학적 제형 중 임의의 것 (예를 들어, 산화방지제 예컨대 N-아세틸트립토판 및/또는 메티오닌을 포함하는 것들)은 본 명세서에서 기재된 용도 또는 방법 중 임의의 것에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 장애는 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 림프구성 장애, 또는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애이다. 일부 구현예에서, 장애는 폐 장애이다.
일부 구현예에서, 폐 장애는 과립구성 (호산구 및/또는 중성구) 폐 염증, 감염-유도된 폐 병태 (바이러스 (예를 들어, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 리노바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 및 호흡기 세포융합 바이러스)와 연관된 것들 포함), 박테리아, 또는 진균 (예를 들어, 아스페르길루스) 트리거와 연관된다. 일부 구현예에서, 장애는 알러지항원-유도된 폐 병태, 독성 환경 오염물질-유도된 폐 병태 (예를 들어, 석면증, 규폐증, 또는 베릴륨증), 면역 조절장애와 연관된 위 흡인-유도된 폐 병태, 또는 유전적 소인을 가지고 있는 염증성 병태 예컨대 낭포성 섬유증이다. 일부 구현예에서, 장애는 신체적 외상-유도된 폐 병태 (예를 들어, 벤틸레이터 손상), 폐공기증, 담배-유도된 폐공기증, 기관지염, 유육종증, 조직구증, 림프관근종증, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 만성 폐 질환, 기관지폐 이형성증, 폐렴 (예를 들어, 공동체-획득된 폐렴, 병원 폐렴, 벤틸레이터-연관된 폐렴, 바이러스 폐렴, 세균성 폐렴, 및 중증 폐렴), 기도 악화, 및 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS))이다. 일부 구현예에서, 폐 장애는 COPD이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 폐 장애는 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 생명을 위협할 수 있는 악화되는 증상 (악화 또는 발적)의 급성 사건을 가지고 있는 지속적 만성 중증 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 아토피성 (알러지성으로도 알려짐) 천식, 비-알러지성 천식 (예를 들어, 종종 호흡 바이러스 (예를 들어, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 리노바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 및 호흡기 세포융합 바이러스)를 가지고 있는 감염 또는 흡입된 자극제 (공기 오염물질, 스모그, 디젤 입자, 휘발성 화학물질 및 가스 실내 또는 야외에 의해, 또는 심지어 차가운 건조 공기에 의해 유발됨)이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 천식은 "연기" (전형적으로 담배, 여송연, 파이프)에 대한 급성 또는 만성 일차 또는 간접 노출로 인한 간헐적 또는 운동-유도된, 천식, (담배, 마라화나 또는 다른 그와 같은 서브스턴스)의 흡입 또는 "증발", 또는 아스피린 또는 관련된 NSAIDS의 최근 섭취에 의해 유발된 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 온건한, 또는 코르티코스테로이드 미접촉 천식, 새로 진단된 및 미치료 천식이거나, 또는 증상 (기침, 쌕쌕거림, 숨가쁨/헐떡임, 또는 가슴 통증)을 조절하기 위해 흡입된 국소 또는 전신의 만성적 사용을 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 천식은 만성, 코르티코스테로이드 저항성 천식, 코르티코스테로이드 난치성 천식, 코르티코스테로이드 또는 다른 만성 천식 컨트롤러 약물 상에서 조절되지 않는 천식이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 천식은 보통 내지 중증 천식이다. 특정 구현예에서, 천식은 Th2-높은 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 중증 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 아토피성 천식, 알러지성 천식, (예를 들어, 감염 및/또는 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)로 인한) 비-알러지성 천식, 운동-유도된 천식, 아스피린 감수성/악화된 천식, 온건한 천식, 보통 내지 중증 천식, 코르티코스테로이드 미접촉 천식, 만성 천식, 코르티코스테로이드 저항성 천식, 코르티코스테로이드 난치성 천식, 새로 진단된 및 미치료 천식, 흡연으로 인한 천식, 코르티코스테로이드 상에서 조절되지 않는 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 T 헬퍼 림프구 2형 (Th2) 또는 2형 (Th2) 높은, 또는 2형 (T2)-유도된 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 호산구 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 알러지성 천식이다. 일부 구현예에서, 개체는 호산구 염증 양성 (EIP)인 것으로 결정되었다. 참고 WO2015/061441. 일부 구현예에서, 천식은 (예를 들어, 페리오스틴 수준 적어도 약 임의의 20 ng/mL, 25 ng/mL, 또는 50 ng/mL 혈청을 갖는) 페리오스틴-높은 천식이다. 혈청 페리오스틴 수준을 결정하는 방법은 제공된, 예를 들어, US2012/0156194에서 제공된다. 일부 구현예에서, 천식은 호산구-높은 천식 (예를 들어, 적어도 약 임의의 150, 200, 250, 300, 350, 400 호산구 수/ml 혈액)이다. 특정 구현예에서, 천식은 Th2-낮은 천식 또는 논(non)Th2-유도된 천식이다. 일부 구현예에서, 개체는 호산구 염증 음성 (EIN)일 것으로 결정되었다. 참고 WO2015/061441. 일부 구현예에서, 천식은 페리오스틴-낮은 (예를 들어, 약 20 ng 미만/mL 혈청의 페리오스틴 수준을 갖는) 천식이다. 일부 구현예에서, 천식은 호산구-낮은 천식 (예를 들어, 약 150 미만의 호산구 수/μl 혈액 또는 약 100 미만의 호산구 수/μl 혈액)이다. 특정 구현예에서, 개체는 상승된 수준의 FeNO (단편적인 내쉬는 질산) 및/또는 상승된 수준의 IgE를 나타낸다. 예를 들어, 일부 사례에서, 개체는 약 250 십억분율 (ppb) 초과, 약 275 ppb 초과, 약 300 ppb 초과, 약 325 ppb 초과, 약 325 ppb 초과, 또는 약 350 ppb 초과의 FeNO 수준을 나타낸다. 일부 사례에서, 개체는 50 IU/ml 초과인 IgE 수준을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 예상된 40% 내지 80%의 1초간 강제 호기량 (FEV1)을 갖는다.
본 방법 중 임의의 것의 다른 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 중성구 장애, 또는 호산구 장애는 폐 섬유증이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증 (IPF)이다.
본 방법 중 임의의 것의 또 추가의 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 또는 림프구성 장애는 식도염 (예를 들어, 호산구 식도염), 알러지성 비염, 비-알러지성 비염, 용종을 가지고 있는 비부비동염, 비강 폴립증, 기관지염, 만성 폐렴, 알러지성 기관지폐 아스페르길루스증, 기도 염증, 알러지성 비염, 기관지 확장증, 및/또는 만성 기관지염이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 또는 림프구성 장애는 관절염이다. 일부 구현예에서, 관절염은 류마티스성 관절염이다. 일부 구현예에서, 관절염은 골관절염, 류마티스성 관절염, 소아 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 조기 관절염, 다수관절 류마티스성 관절염, 전신-개시 류마티스성 관절염, 장병증성 관절염, 반응 관절염, 건선성 관절염, 및/또는 손상의 결과로서 관절염이다.
또 본 방법 중 임의의 것의 다른 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 또는 림프구성 장애는 위장 염증성 병태이다. 일부 구현예에서, 위장 염증성 병태는 IBD (염증성 장 질환), 궤양성 대장염 (UC), 크론병 (CD), 결장염 (예를 들어, 환경 모욕에 의해 야기된, 예를 들어, 치료 레지멘, 예컨대 화학요법, 방사선 요법 등에 의해 야기되거나 그것과 연관된) 결장염), 감염성 결장염, 허혈성 대장염, 교원성 또는 림프구성 결장염, 괴사성 전장염, 병태 예컨대 만성 육아종 질환 또는 소아지방변증에서의 결장염, 음식 알러지, 위염, 위장염, 감염성 위염 또는 전장염 (예를 들어, 헬리코박터 파일로리-감염된 만성 활성 위염), 식도염, 및 감염원, 또는 불확정 결장염에 의해 야기된 위장 염증의 다른 형태이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 또는 림프구성 장애는 위장 염증성 병태이다. 일부 구현예에서, 위장 염증성 병태는 IBD (염증성 장 질환)이다. 일부 구현예에서 염증성 장 질환은 궤양성 대장염 (UC) 또는 크론병 (CD)이다. 일부 구현예에서, 위장 염증성 병태는 결장염 (예를 들어, 환경 모욕에 의해 야기된 (예를 들어, 치료 레지멘, 예컨대 화학요법, 방사선 요법, 등에 의해 야기되거나 그것과 연관된) 결장염), 감염성 결장염, 허혈성 대장염, 교원성 또는 림프구성 결장염, 괴사성 전장염, 병태 예컨대 만성 육아종 질환 또는 소아지방변증에서 결장염, 음식 알러지, 위염, 위장염, 감염성 위염 또는 전장염 (예를 들어, 헬리코박터 파일로리-감염된 만성 활성 위염), 및 감염원, 또는 불확정 결장염에 의해 야기된 위장 염증의 다른 형태이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 위장 염증성 병태는 궤양성 대장염 (UC) 또는 크론병 (CD)이다. 일부 구현예에서, 위장 염증성 병태는 궤양성 대장염 (UC)이다. 일부 구현예에서, 궤양성 대장염은 경도 내지 중간 정도 원위 결장염이다. 일부 구현예에서, 궤양성 대장염은 경도 내지 중간 정도 광범위한 결장염이다. 일부 구현예에서, 궤양성 대장염은 중증 결장염이다. 일부 구현예에서, 위장 염증성 병태는 크론병 (CD)이다. 일부 구현예에서, 크론병은 급성 질환 단계에 있다. 일부 구현예에서, 크론병은 유도된 임상 차도 단계에 있다. 일부 구현예에서, 크론병은 유지 반응/차도 단계에 있다. 일부 구현예에서, 크론병은 경도 내지 중간 정도 질환이다. 일부 구현예에서, 크론병은 보통 내지 중증 질환이다. 일부 구현예에서, 크론병은 중증/전격성 질환이다. 일부 구현예에서, 크론병은 회장, 회장결장, 또는 결장 질환이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애, 단구성 장애, 또는 림프구성 장애, 또는 정상 또는 비정상적인 조직 상주하는 세포 (예컨대 비만 세포, 대식세포, 또는 림프구) 또는 기질 세포 (예컨대 섬유모세포, 근섬유모세포, 평활근 세포, 상피, 또는 내피)의 증가된 수 또는 분포와 연관된 장애는 낭창 또는 전신 홍반성 낭창 (SLE), 또는 낭창의 하나 이상의 장기-특이적 징후 (예를 들어, 신장에 영향을 주는 낭창성 신염 (LN), 또는 혈액 및/또는 림프양 기관 (림프절, 비장, 가슴샘, 및 연관된 림프관), 및/또는 관절 및/또는 다른 기관, 그러나 반드시 신장은 아닌 것에 영향을 주는 추가의-신장 낭창 (ERL)).
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 또는 섬유성 장애는 하기와 관련된다: 패혈증 및/또는 트라우마, HIV 감염, 또는 (알려지지 않은 병인의) 특발성 예컨대 ANCA-연관된 혈관염 (AAV), 다발성맥관염을 갖는 육아종증 (예전에 베게너 육아종증으로 알려짐), 베체트병, 심혈관 질환, 호산구 기관지염, 라이터 증후군, SEA 증후군 (혈청음성, 부착부위병증, 관절병증 증후군), 강직 척추염, 피부근염, 경피증, 예를 들어, 전신 경피증 또한 소위 전신 경화증, 혈관염 (예를 들어, 거대세포 동맥염 (GCA), 또한 소위 일시적 동맥염, 두개 동맥염 또는 호튼병), 근염, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발동맥염, 동맥염, 류마티스성 다발근육통, 유육종증, 일차 담도 경화증, 경화 담관염, 쇼그렌 증후군, 건선, 판상 건선, 적상 건선, 역형 건선, 농포성 건선, 홍피성 건선, 피부염, 아토피 피부염, 천포창, 예를 들어, 심상성 천포창, 죽상경화증, 낭창, 스틸 질환, 중증 근무력증, 소아지방변증, 재발 완화성 (RRMS) 또는 일차 진행성 (PPMS) 또는 이차 진행성 (SPMS) 아형의 다발성 경화증 (MS), 길랑-바레 질환, 유형 I 진성 당뇨병 (T1DM) 또는 인슐린-의존적 (IDDM) 또는 유년 발병형 DM 유형, 갑상선염 (예를 들어, 그레이브스병), 만성적 소화장애증, 처그-스트라우스 증후군, 근육통 증후군, 호산구과다 증후군, 간헐적 맥관부종을 포함하는 부종성 반응, 연충 감염, 사상충 피부염, 호산구 식도염, 호산구 장염, 호산구 결장염, 폐쇄성 수면 무호흡, 심내막심근 섬유증, 애디슨병, 레이노 질환 또는 현상, 자가면역 간염, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 또는 장기 이식 거부.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 장애는 피부의 염증성 장애이다. 일부 구현예에서, 장애는 아토피 피부염 또는 사상충 피부염이다. 일부 구현예에서, 장애는 만성 특발성 두드러기 (CIU 또는 CSU)이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, IL-13 길항제, IL-33 길항제, IgE 길항제, 칼슘 억제제, 류코트리엔 억제제, 또는 항히스타민제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-13 길항제는 레브리키주맙이다. 일부 구현예에서, IgE 길항제는 오말리주맙 또는 리겔리주맙이다.
본 방법 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 중성구 장애, 또는 호산구 장애는 섬유성 장애이다. 일부 구현예에서, 섬유성 장애은 하기를 포함한다: 폐 섬유증, 간 섬유증 (예를 들어, 간경변 (예를 들어, 알코올-유도된 간경변, 바이러스-유도된 간경변, 후-간염 C 간경변, 및 원발성 담도 간경변증)과 연관된 섬유증, 주혈협충병, 담관염 (예를 들어, 경화 담관염), 및 자가면역-유도된 간염), 신장 섬유증 (예를 들어, 세뇨관간질 섬유증, 경피증, 당뇨병성 신염, 및 사구체 신염), 진피 섬유증 (예를 들어, 경피증, 비대성 및 켈로이드 반흔, 신원발성 섬유성 피부병, 및 화상), 골수섬유증, 신경섬유종증, 섬유종, 장내 섬유증, 및 수술 과정에서 초래된 섬유성 유착), 심장 섬유증 (예를 들어, 심근경색증과 연관된 섬유증), 혈관 섬유증 (예를 들어, 혈관성형후 동맥 재협착증 및 죽상경화증과 연관된 섬유증), 눈 섬유증 (예를 들어, 백내장후 수술과 연관된 섬유증, 증식성 유리체망막병증, 및 안와후 섬유증), 및 골수 섬유증 (예를 들어, 특발성 골수섬유증 및 약물 유도 골수섬유증). 섬유증은 장기-특이적 또는 전신 (예를 들어, GVHD와 연관된 전신 경화증 및 섬유증)일 수 있다. 일부 구현예에서, 섬유성 장애는 폐 섬유증이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 섬유성 간질성 폐렴이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증 (IPF), 로도 알려지다 특발성 섬유성 폐포염이다. 일부 구현예에서, IPF는 성별, 연령 및 생리학 (GAP)-단계 I이다. 일부 구현예에서, IPF는 GAP-단계 II이다. 일부 구현예에서, IPF는 GAP-단계 III이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 산발적 IPF이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 가족성 폐 섬유증이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 조합된 폐 섬유증 및 폐공기증이다. 일부 구현예에서, 폐 섬유증은 하기 중 하나 이상과 연관된다: 보통의 사이질 폐렴; 특발성 사이질 폐렴; 박리성 사이질 폐렴; 호흡 세기관지염-사이질 폐 질환; 급성 사이질 폐렴; 비특이적 사이질 폐렴; 유육종증; 원인불명의 기질화 폐렴; 호산구 폐렴; 감염; 직업적 또는 환경 물질에 대한 노출; 담배 흡연; 약물 또는 방사선과 연관된 사이질 폐 질환; 류마티스성 질환-연관된 사이질 폐 질환; 림프양 사이질 폐렴; 흉막폐 섬유탄력증; 폐 랑게르한스 세포 조직구증; 전신 경화증-사이질 폐 질환; 헤르만스키-푸들라크 증후군; 및 텔로미어병증.
본 방법 중 일의의 것의 일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 중성구 장애, 또는 호산구 장애는 만성적 폐쇄성 폐 질환 (COPD)이다. 일부 구현예에서, COPD는 만성적 폐쇄성 폐 질환 (GOLD) 카테고리 A에 대한 세계적인 구상 이다. 일부 구현예에서, COPD는 GOLD 카테고리 B이다. 일부 구현예에서, COPD는 GOLD 카테고리 C이다. 일부 구현예에서, COPD는 GOLD 카테고리 D이다. 일부 구현예에서, COPD는 만성 기관지염이다. 일부 구현예에서, COPD는 폐공기증이다. 일부 구현예에서, 폐공기증은 근위 소엽, 전폐포성, 또는 원위 소엽 폐공기증이다. 일부 구현예에서, 폐공기증은 담배-유도된 폐공기증이다. 일부 구현예에서, COPD는 미립자 분진, 화학 매연, 및/또는 대기 오염에 대한 노출과 연관된다. 일부 구현예에서, COPD는 손상된 폐 발달과 연관된다. 일부 구현예에서, COPD는 만성적 폐쇄성 천식이다. 일부 구현예에서, COPD는 알파-1 항트립신 결핍과 연관된다. 일부 구현예에서, COPD는 세린 프로테아제 억제제 분기군 E, 구성원 2 (세르핀2) 파괴와 연관된다. 일부 구현예에서, COPD는 지속적 전신 염증을 갖는 COPD 이다. 일부 구현예에서, COPD는 호산구 또는 T-헬퍼 2형 (TH2) 높은 COPD이다. 일부 구현예에서, COPD는 지속적 박테리아 군집화를 갖는 COPD이다. 일부 구현예에서, COPD는 악화가 빈번한 COPD 이다. 일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 중성구 장애, 또는 호산구 장애는 천식-COPD 중복 증후군 (ACOS)이다. 일부 구현예에서, ACOS는 호산구-우세한, 중성구-우세한, 혼합된-패턴, 또는 염증 없는 (소과립구성) ACOS이다. 일부 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 섬유성 장애, 중성구 장애, 또는 호산구 장애는 COPD-폐쇄성 수면 무호흡 (OSA) 중복 증후군이다.
본 발명의 항체, 또는 이의 약제학적 조성물은, 단독으로 또는 요법에서 다른 제제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체, 또는 이의 약제학적 조성물은, 적어도 하나의 추가의 치료제와 공투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가의 치료제는 인터류킨-13 (IL-13) 결합 길항제, 인터류킨-17 (IL-17) 축 결합 길항제, 인터류킨-5 (IL-5) 축 결합 길항제, 또는 IL-33 축 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-13 축 결합 길항제는 항-IL-13 항체, 예를 들어, 레브리키주맙이다. 일부 구현예에서, IL-5 축 결합 길항제는 IL-5 결합 길항제 또는 IL-5 수용체 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 축 결합 길항제는 IL-33 결합 길항제 또는 ST2 결합 길항제이다. 일부 구현예에서, IL-33 결합 길항제는 항-IL-33 항체이다.
일부 구현예에서, 추가의 치료제는 아래에 기재된 바와 같은 천식 요법이다중간 정도 천식은 현재 돌발성 증상 또는 알러지항원- 또는 운동-유도된 천식을 경감시키기 위해 매일 흡입된 항-염증성-코르티코스테로이드 또는 비만 세포 억제제 예컨대 크로몰린 나트륨 또는 네도크로밀 플러스 흡입된 베타2-효능제 필요에 따라 (3-4 회/일)으로 치료된다. 예시적인 흡입된 코르티코스테로이드는 QVAR®, PULMICORT®, SYMBICORT®, AEROBID®, FLOVENT®, FLONASE®, ADVAIR®, 및 AZMACORT®을 포함한다. 추가의 천식 요법은 지효성 기관지 확장제 (LABD)를 포함한다. 특정 구현예에서, LABD는 지속성 베타-2 효능제 (LABA), 류코트리엔 수용체 길항제 (LTRA), 지속성 무스카린성 길항제 (LAMA), 테오필린, 또는 경구 코르티코스테로이드 (OCS)이다. 예시적인 LABD는 SYMBICORT®, ADVAIR®, BROVANA®, FORADIL®, PERFOROMIST™, 및 SEREVENT®을 포함한다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 기관지확장제 또는 천식 증상 컨트롤러 약물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 기관지확장제 또는 천식 컨트롤러 약물은 β2-아드레날린 효능제, 예컨대 단기 작용 β2-효능제 (SABA) (예컨대 알부테롤), 또는 지속성 β2-아드레날린 효능제 (LABA)이다. 일부 구현예에서, LABA는 살메테롤, 아베디테롤, 인다카테롤, 빌란테롤, 및/또는 포르모테롤 (포르모테롤 푸마레이트 탈수물)이다. 일부 구현예에서, 천식 컨트롤러 약물은 류코트리엔 수용체 길항제 (LTRA)이다. 일부 구현예에서, LTRA는 몬텔루카스트, 자피를루카스트, 및/또는 질류톤이다. 일부 구현예에서, 기관지확장제 또는 천식 컨트롤러 약물은 무스카린성 길항제, 예컨대 지속성 무스카린성 아세틸콜린 수용체 (콜린성) 길항제 (LAMA)이다. 일부 구현예에서, LAMA는 글리코파이로니움이다. 일부 구현예에서, 기관지확장제 또는 천식 컨트롤러 약물은 이온 통로 예컨대 쓴맛 수용체 (예컨대 TAS2R)의 효능제이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 기관지확장제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 기관지확장제는 흡입된 기관지확장제이다. 일부 구현예에서, 흡입된 기관지확장제는 β2-아드레날린 효능제이다. 일부 구현예에서, β2-아드레날린 효능제는 단기 작용 β2-아드레날린 효능제 (SABA)이다. 일부 구현예에서, SABA는 비톨테롤, 페노테롤, 이소프로테레놀, 레발부테롤, 메타프로테레놀, 피르부테롤, 프로카테롤, 리토드린, 알부테롤, 및/또는 테르부탈린이다. 일부 구현예에서, β2-아드레날린 효능제는 지속성 β2-아드레날린 효능제 (LABA)이다. 일부 구현예에서, LABA는 아르포르모테롤, 밤부테롤, 클렌부테롤, 포르모테롤, 살메테롤, 아베디테롤, 카모테롤, 인다카테롤, 올로다테롤, 및/또는 빌란테롤이다. 일부 구현예에서, 흡입된 기관지확장제는 무스카린성 수용체 길항제이다. 일부 구현예에서, 무스카린성 수용체 길항제는 단기 작용 무스카린성 수용체 길항제 (SAMA)이다. 일부 구현예에서, SAMA는 이프라트로피움 브로마이드이다. 일부 구현예에서, 무스카린성 수용체 길항제는 지속성 무스카린성 수용체 길항제 (LAMA)이다. 일부 구현예에서, LAMA는 티오트로피움 브로마이드, 글리코파이로니움 브로마이드, 우메클리디늄 브로마이드, 아클리디늄 브로마이드, 및/또는 레베페나신이다. 일부 구현예에서, 흡입된 기관지확장제는 SABA/SAMA 조합이다. 일부 구현예에서, SABA/SAMA 조합은 알부테롤/이프라트로피움이다. 일부 구현예에서, 흡입된 기관지확장제는 LABA/LAMA 조합이다. 일부 구현예에서, LABA/LAMA 조합은 포르모테롤/아클리디늄, 포르모테롤/글리코파이로니움, 포르모테롤/티오트로피움, 인다카테롤/글리코파이로니움, 인다카테롤/티오트로피움, 올로다테롤/티오트로피움, 살메테롤/티오트로피움, 및/또는 빌란테롤/우메클리디늄이다. 일부 구현예에서, 흡입된 기관지확장제는 이중작용성 기관지확장제이다. 일부 구현예에서, 이중작용성 기관지확장제는 무스카린성 길항제/β2-효능제 (MABA)이다. 일부 구현예에서, MABA는 바테페테롤, THRX 200495, AZD 2115, LAS 190792, TEI3252, PF-3429281 및/또는 PF-4348235이다. 일부 구현예에서, 흡입된 기관지확장제는 TAS2R의 효능제이다. 일부 구현예에서, 기관지확장제는 분무된 SABA이다. 일부 구현예에서, 분무된 SABA는 알부테롤 및/또는 레발부테롤이다. 일부 구현예에서, 기관지확장제는 분무된 LABA이다. 일부 구현예에서, 분무된 LABA는 아르포르모테롤 및/또는 포르모테롤이다. 일부 구현예에서, 기관지확장제는 분무된 SAMA이다. 일부 구현예에서, 분무된 SAMA는 이프라트로피움이다. 일부 구현예에서, 기관지확장제는 분무된 LAMA이다. 일부 구현예에서, 분무된 LAMA는 글리코파이로니움 및/또는 레베페나신이다. 일부 구현예에서, 기관지확장제는 분무된 SABA/SAMA 조합이다. 일부 구현예에서, 분무된 SABA/SAMA 조합은 알부테롤/이프라트로피움이다. 일부 구현예에서, 기관지확장제는 류코트리엔 수용체 길항제 (LTRA)이다. 일부 구현예에서, LTRA는 몬텔루카스트, 자피를루카스트, 및/또는 질류톤이다. 일부 구현예에서, 기관지확장제는 메틸잔틴이다. 일부 구현예에서, 메틸잔틴은 테오필린이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 면역조절물질을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역조절물질은 면역글로불린 유형 E (IgE) 또는 항-IgE (IgE 억제제)에 대한 항체이다. 일부 구현예에서, 항-IgE는 오말리주맙 및/또는 리겔리주맙이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 크로몰린을 포함한다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 메틸잔틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 메틸잔틴은 테오필린 또는 카페인이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 하나 이상의 코르티코스테로이드, 예컨대 흡입된 코르티코스테로이드 (ICS) 또는 경구 코르티코스테로이드를 투여하는 것을 포함한다. 비제한적인 예시적인 코르티코스테로이드는 흡입된 코르티코스테로이드, 예컨대 베클로메타손 디프로피오네이트, 부데소니드, 시클레소나이드, 플루니솔라이드, 플루티카손 프로피오네이트, 플루티카손 푸로에이트, 모메타손, 및/또는 트리암시놀론 아세토나이드 및 경구 코르티코스테로이드, 예컨대 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 및 프레드니손을 포함한다. 일부 구현예에서, 코르티코스테로이드는 ICS이다. 일부 구현예에서, ICS는 베클로메타손, 부데소니드, 플루니솔라이드, 플루티카손 푸로에이트, 플루티카손 프로피오네이트, 모메타손, 시클레소나이드, 및/또는 트리암시놀론이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, ICS/LABA 및/또는 LAMA 조합을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, ICS/LABA 및/또는 LAMA 조합은 플루티카손 프로피오네이트/살메테롤, 부데소니드/포르모테롤, 모메타손/포르모테롤, 플루티카손 푸로에이트/빌란테롤, 플루티카손 프로피오네이트/포르모테롤, 베클로메타손/포르모테롤, 플루티카손 푸로에이트/우메클리디늄, 플루티카손 푸로에이트/빌란테롤/우메클리디늄, 플루티카손/살메테롤/티오트로피움, 베클로메타손/포르모테롤/글리코파이로니움, 부데소니드/포르모테롤/글리코파이로니움, 및/또는 부데소니드/포르모테롤/티오트로피움이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 분무된 코르티코스테로이드를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 분무된 코르티코스테로이드는 부데소니드이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 경구 또는 정맥내 코르티코스테로이드를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 경구 또는 정맥내 코르티코스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 및/또는 하이드로코르티손이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 하기로부터 선택된 하나 이상의 표적을 억제하는 TH2 또는 T2 경로 억제제를 투여하는 것을 포함한다: ITK, BTK, JAK (JAK1, JAK2 및/또는 JAK3), IL-9, IL-6, IL-5, IL-13, IL-4, IL-17 (예를 들어, IL-17A 및 IL-17F), OX40L, TSLP, IL-25, IL-33, IgE, IL-9 수용체, IL-5 수용체, IL-4 수용체 α, IL-13 수용체 (예를 들어, IL-13 수용체 α1 및/또는 α2), OX40, TSLP-R, IL-7 수용체 (예를 들어, IL7Rα), IL-17 수용체 (예를 들어, IL-17Rβ), ST2 (IL-33 수용체), CCR3, CCR4, CRTH2, FcεRI, FcεRII/CD23, Flap, Syk 키나제; CCR4, TLR9, CCR3, 케모카인 수용체 길항제, 및 GM-CSF. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, IL-5 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-5 길항제는 벤랄리주맙, 메폴리주맙, 및/또는 레슬리주맙이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, IL-13 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-13 길항제는 레브리키주맙, 데크트레쿠맙, 또는 트랄로키누맙이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, IL-4 길항제 (IL-4/IL-13 길항제 포함)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-4 길항제는 두필루맙 또는 QBX-258 (Novartis)이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, TSLP 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, TSLP 길항제는 AMG-157 (MEDI-9929)이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, ST2 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, IL-17 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-17 길항제는 세쿠키누맙, 익세키주맙 또는 비메키주맙이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 페비피프란트를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 마시티닙를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 포스포디에스테라제 (PDE) 억제제 또는 길항제, 예컨대 PDE3 및/또는 PDE4 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, PDE 길항제는 Theo-24, 달리레스프, 또는 로플루밀라스트이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 아미노살리실레이트; 스테로이드; 생물학적; 티오퓨린; 메토트렉세이트; 칼시뉴린 억제제, 예를 들어 사이클로스포린 또는 타크롤리무스; 및 항생제 로부터 선택된 하나 이상의 활성 성분을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 상기 방법은 경구 또는 국소 제형 중 추가의 활성 성분을 투여하는 것을 포함한다. 아미노살리실레이트의 예는 유드라짓-S-코팅된, pH-의존적 메살라민, 에틸셀룰로스-코팅된 메살라민, 및 멀티매트릭스-방출 메살라민과 같은 형태로 4-아미노살리실 산, 설파살라진, 발살라자이드, 올살라진 및 메살라진을 포함한다. 스테로이드는의 예는 코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코스테로이드를 포함한다. 코르티코스테로이드의 예는 하기와 같은 형태로 프레드니손 및 하이드로코르티손 또는 메틸프레드니솔론, 또는 제2 세대 코르티코스테로이드, 예를 들어 부데소니드 또는 아자티오프린를 포함한다: 예를 들어 하이드로코르티손 관장 또는 하이드로코르티손 포움.생물제제의 예는 에타네르셉트; 종양 괴사 인자 알파에 대한 항체, 예를 들어 인플릭시맙, 아달리무맙 또는 세르톨리주맙; IL-12 및 IL-23에 대한 항체, 예를 들어 우스테키누맙; 베돌리주맙; 에트롤리주맙, 및 나탈리주맙을 포함한다. 티오퓨린의 예는 아자티오프린, 6-머캅토퓨린 및 티오구아닌을 포함한다. 항생제의 예는 반코마이신, 리팍시민, 메트로니다졸, 트리메토프림, 설파메톡사졸, 디아미노디페닐 설폰 및 시프로플록사신; 및 항바이러스제 예컨대 강시클로비르를 포함한다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 항섬유제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 항섬유제는 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)-자극된 콜라겐 합성을 억제하고, 세포외 기질을 감소시키고/거나, 섬유모세포 증식을 차단한다. 일부 구현예에서, 항섬유제는 피르페니돈이다. 일부 구현예에서, 항섬유제는 PBI-4050이다. 일부 구현예에서, 항섬유제는 티펠루카스트이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 티로신 키나제 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 티로신 키나제 억제제는 하나 이상의 섬유형성 성장 인자의 정교화를 배개하는 티로신 키나제를 억제한다. 일부 구현예에서, 섬유형성 성장 인자는 혈소판-유래된 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 및/또는 섬유모세포 성장 인자이다. 일부 구현예에서, 티로신 키나제 억제제는 이마티닙 및/또는 닌테다닙이다. 일부 구현예에서, 티로신 키나제 억제제는 닌테다닙이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 지사제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 지사제는 로페르아미드이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 항-인터류킨 (IL)-13 항체이다. 일부 구현예에서, 항-IL-13 항체는 트랄로키누맙이다. 일부 구현예에서, 항체는 항-IL-4/항-IL-13 항체이다. 일부 구현예에서, 항-IL-4/항-IL-13 항체는 SAR 156597이다. 일부 구현예에서, 항체는 항-결합 조직 성장 인자 (CTGF) 항체이다. 일부 구현예에서, 항-CTGF 항체는 FG-3019이다. 일부 구현예에서, 항체는 항-라이실 옥시다제-유사 2 (LOXL2) 항체이다. 일부 구현예에서, 항-LOXL2 항체는 심투주맙이다. 일부 구현예에서, 항체는 항-αvβ6 인테그린 수용체 항체이다. 일부 구현예에서, 항-αvβ6 인테그린 수용체 항체는 STX-100이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단클론성 항체이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 라이소포스파티드산-1 (LPA1) 수용체 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, LPA1 수용체 길항제는 BMS-986020이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 갈렉틴 3 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 갈렉틴 3 억제제는 TD-139이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 일시적 처방 요법를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 일시적 처방 요법은 항생제, 항불안제, 코르티코스테로이드, 및 오피오이드 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 항생제는 넓은-스펙트럼 항생제이다. 일부 구현예에서, 항생제는 페니실린, β-락타마제 억제제, 및/또는 세팔로스포린이다. 일부 구현예에서, 항생제는 피페라실린/타조박탐, 세픽심, 세프트리악손 및/또는 세프디니르이다. 일부 구현예에서, 항불안제는 알프라졸람, 부스피론, 클로르프로마진, 디아제팜, 미다졸람, 로라제팜, 및/또는 프로메타진이다. 일부 구현예에서, 코르티코스테로이드는 글루코코르티코스테로이드이다. 일부 구현예에서, 글루코코르티코스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 및/또는 하이드로코르티손이다. 일부 구현예에서, 오피오이드는 모르핀, 코데인, 디하이드로코데인, 및/또는 디아모르핀이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 항생제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 항생제는 매크롤라이드이다. 일부 구현예에서, 매크롤라이드는 아지트로마이신, 및/또는 클라리트로마이신이다. 일부 구현예에서, 항생제는 독시사이클린이다. 일부 구현예에서, 항생제는 트리메토프림/설파메톡사졸이다. 일부 구현예에서, 항생제는 세팔로스포린이다. 일부 구현예에서, 세팔로스포린는 세페핌, 세픽심, 세프포독심, 세프프로질, 세프타지딤, 및/또는 세푸록심이다. 일부 구현예에서, 항생제는 페니실린이다. 일부 구현예에서, 항생제는 아목시실린, 암피실린, 및/또는 피밤실린이다. 일부 구현예에서, 항생제는 페니실린/β-락타마제 억제제 조합이다. 일부 구현예에서, 페니실린/β-락타마제 억제제 조합은 아목시실린/클라불라네이트 및/또는 피페라실린/타조박탐이다. 일부 구현예에서, 항생제는 플루오로퀴놀론이다. 일부 구현예에서, 플루오로퀴놀론는 시프로플록사신, 제미플록사신, 레보플록사신, 목시플록사신, 및/또는 오플록사신이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 포스포디에스테라제 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 포스포디에스테라제 억제제는 포스포디에스테라제 유형 5 억제제이다. 일부 구현예에서, 포스포디에스테라제 억제제는 아바나필, 벤자미데나필, 다산타필, 이카린, 로데나필, 마이크로데나필, 실데나필, 타달라필, 우데나필, 및/또는 바르데나필이다. 일부 구현예에서, PDE 억제제는 PDE-4 억제제이다. 일부 구현예에서, PDE-4 억제제는 로플루밀라스트, 실로밀라스트, 테토밀라스트, 및/또는 CHF6001이다. 일부 구현예에서, PDE 억제제는 PDE-3/PDE-4 억제제이다. 일부 구현예에서, PDE-3/PDE-4 억제제는 RPL-554이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 세포독성 및/또는 면역억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포독성 및/또는 면역억제제는 아자티오프린, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실아민, 및/또는 탈리도마이드이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 폐에서 감손된 글루타티온 수준을 회복시키는 제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 폐에서 감손된 글루타티온 수준을 회복시키는 제제는 N-아세틸시스테인이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 항응고제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 항응고제는 와파린, 헤파린, 활성화된 단백질 C, 및/또는 조직 인자 경로 억제제이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 엔도텔린 수용체 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법 엔도텔린 수용체 길항제는 보센탄, 마시텐탄, 및/또는 암브리센탄이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, administering TNF-α 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, TNF-α 길항제는 중 에타네르셉트, 아달리무맙, 인플릭시맙, 세르톨리주맙, 및 골리무맙 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 인터페론 감마-1b를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 인터류킨 (IL) 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, IL 억제제는 IL-5 억제제이다. 일부 구현예에서, IL-5 억제제는 메폴리주맙 및/또는 벤랄리주맙이다. 일부 구현예에서, IL 억제제는 IL-17A 억제제이다. 일부 구현예에서, IL-17A 억제제는 CNTO-6785이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, p38 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, p38 MAPK 억제제는 로스마피모드 및/또는 AZD-7624이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, CXCR2 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CXCR2 길항제는 다니릭신이다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 백신접종을 포함한다. 일부 구현예에서, 백신접종은 폐렴구균 및/또는 인플루엔자에 대항하는 백신접종이다. 일부 구현예에서, 백신접종은 폐렴연쇄상구균 및/또는 인플루엔자에 대항하는 백신접종이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 항바이러스 요법을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 항바이러스 요법은 오셀타미비르, 페라미비르, 및/또는 자나미비르.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 위식도 역류 및/또는 재발성 미세흡인의 예방을 포함한다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 환기 보조를 포함한다. 일부 구현예에서, 환기 보조는 기계적 환기이다. 일부 구현예에서, 환기 보조는 비침습성 환기이다. 일부 구현예에서, 환기 보조는 보충 산소이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 폐 재활을 포함한다.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 폐 이식을 포함한다. 일부 구현예에서, 폐 이식은 단일 폐 이식이다. 일부 구현예에서, 폐 이식은 양측 폐 이식.
본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 비-약리적 개입을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-약리적 개입은 흡연 중단, 건강한 다이어트, 및/또는 규칙적 운동이다. 본 발명의 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 흡연 중단용 약리 조제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 흡연 중단용 약리 조제는 니코틴 대체 요법, 부프로피온, 및/또는 바레니클린이다. 일부 구현예에서, 비-약리적 개입은 폐 요법이다. 일부 구현예에서, 폐 요법은 폐 재활 및/또는 보충 산소이다. 일부 구현예에서, 비-약리적 개입은 폐 수술이다. 일부 구현예에서, 폐 수술는 폐 용적 감소 수술, 단일 폐 이식, 양측 폐 이식, 또는 폐포절제술이다. 일부 구현예에서, 비-약리적 개입은 디바이스의 사용이다. 일부 구현예에서, 디바이스는 폐 용적 감소 코일, 날숨 기도 스텐트, 및/또는 비강 환기 보조 시스템이다.
상기에 언급된 그와 같은 병용 요법은 병용 투여 (여기서 2 이상의 치료제가 동일 또는 개별 제형 내에 포함됨), 및 별개의 투여를 포괄하고, 이 경우에, 항-트립타제 항체, 또는 이의 약제학적 조성물의 투여는, 추가의 치료제(들)의 투여 전에, 동시에, 및/또는 그 후에 일어날 수 있다. 일 구현예에서, 항-트립타제 항체, 또는 이의 약제학적 조성물의 투여, 및 추가의 치료제의 투여는 서로 약 1 개월 내에; 또는 약 1, 2, 또는 3 주 내에; 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 일 내에; 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 시간 내에; 또는 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 또는 50 분 내에 일어난다. 순차적인 투여를 수반하는 구현예에 대해, 항-트립타제 항체는 추가의 치료제(들)의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 항-트립타제 항체, 또는 이의 약제학적 조성물, (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내, 및 비강내 투여를 포함하는 임의의 적당한 수단 에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 사례에서, 본 발명의 항-트립타제 항체는 유리체내로, 근육내로, 정맥내로, 진피내로, 경피로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 늑막내로, 기관내로, 척추강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 국소적으로, 종양내로, 복막으로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 안구내로, 안와내로, 경구로, 국소적으로, 경피로, 눈주위로, 결막으로, 테논낭하로, 전방내로, 망막하로, 안구뒤로, 소관내로, 흡입에 의해, 주사로, 이식에 의해, 주입에 의해, 연속적 주입에 의해, 국소화된 관류 수영 표적 세포에 의해 직접적으로, 카테터에 의해, 세척에 의해, 크림 내에서, 또는 지질 조성물 내에서 투여될 수 있다. 특정 사례에서, 항체, 또는 이의 약제학적 조성물은, 피하 투여에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 방법에서 이용된 조성물은 또한 전신으로 또는 국소로 투여될 수 있다. 투약은, 투여가 간단하거나 만성인지에 부분적으로 의존하여 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 주사로, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 비제한적으로 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 비롯한 다양한 복용 스케줄이 본원에 고안되었다.
본 발명의 항체, 또는 이의 약제학적 조성물은, 양호한 의료 실시와 일치하는 방식으로 제형화되고, 투약되고, 그리고 투여될 수 있다. 본 맥락에서 고려되는 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 동물, 개별적인 환자의 임상 조건, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에에 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체, 또는 이의 약제학적 조성물은, 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용된 하나 이상의 제제로 선택적으로 반드시 제형화될 필요는 없다. 상기 다른 제제의 유효량은 제형 중에 존재하는 항체의 양, 장애의 유형 또는 치료 및 상기 논의된 다른 인자들에 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 용량으로 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 용량의 약 1 내지 99%, 또는 적절하다고 경험적/임상적으로 결정된 임의 용량으로 및 임의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 조합되어 사용될 때) 본 발명의 항체의 적절한 투약량은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방학적 또는 치료학적 목적을 위해 투여되는지, 이전의 치료, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 유형 및 질환의 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체는, 예를 들어, 하나 이상의 별개의 투여에 의해, 또는 연속적 주입에 의해 환자에게 투여하기 위해 초기 후보 투약량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투약량은 상기에 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 200 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 병태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 항체의 하나의 예시적인 투약량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 그와 같은 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주, 2 주마다, 3 주 마다, 또는 4 주 마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 이로써, 상기 환자는 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어, 약 6개의 용량의 항체를 수용한다). 예를 들어, 용량은 (예를 들어, 피하 주사에 의해) 개월당 1회 투여될 수 있다. 최초의 더 많은 부하 용량에 이어, 하나 이상의 더 적은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 레지멘이 유용할 수 있다. 이 치료의 진행은 종래의 기법 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다. 일부 사례에서, 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL (예를 들어, 약 50 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 90 mg/mL, 약 100 mg/mL, 약 110 mg/mL, 약 120 mg/mL, 약 130 mg/mL, 약 140 mg/mL, 약 150 mg/mL, 약 160 mg/mL, 약 170 mg/mL, 약 180 mg/mL, 약 190 mg/mL, 또는 약 200 mg/mL의 항체의 용량이 예를 들어, 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 사례에서, 약 150 mg/mL의 항체는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 제형 또는 치료 방법 중 임의의 것은 항-트립타제 항체 대신에 또는 그 외에 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
H. 제조 물품
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 기재된 장애 (예를 들어, 트립타제-연관된 장애)의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품은 제공된다. 제조 물품은 용기 그리고 용기와 연관된 또는 용기 상에서 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백, 등등을 포함한다. 용기는 다양한 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 병태 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합되거나 그 자체인 조성물을 수용하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 상기 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 바이알 또는 정맥내 용액 백일 수 있다). 본 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체, 또는 이의 약제학적 조성물이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 나아가, 제조 물품은 (a) 본 조성물이 본 발명의 항체를 포함하는, 그안에 함유된 조성물을 가진 제1 용기; 및 (b) 본 조성물이 추가의 치료제를 포함하는, 그안에 함유된 조성물을 가진 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 구현예에서의 제조 물품은 조성물이 특정한 병태를 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은 약제학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 정균 주사용수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품이 항-트립타제 항체 대신에 또는 상기에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있다는 것이 이해된다.
III. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적인 설명이 주어지면, 다양한 다른 구현예가 실시될 수 있다는 것이 이해된다. 구체적으로 나타내지 않는 한, 인간 트립타제 베타 1은 본 연구에서 사용되었다.
실시예 1:항 - 트립타제 항체의 생성 및 인간화
A. 물질 및 방법
잔기 수는 하기에 따른다: 카밧 등 Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
(i) 곤충 세포 및 포유동물 세포에서 트립타제의 재조합 발현 및 정제
하기를 인코딩하는 서열: 성숙한 야생형 인간 트립타제 베타 1 (Ile16 - Pro246 키모트립시노겐 넘버링, 서열번호:97)은 다면체 프로모터 및 gp67 분비 신호 서열 뒤에서 변형된 pAcGP67A 벡터에 클로닝되었다. 달리 명시되지 않는 한, 이 부문에서, 트립타제는 인간 트립타제 베타 1 (또한 일명 인간 트립타제 b1)을 지칭한다. 작제물은 N-말단 His6 태그, 엔테로키나제 절단 부위 및, 일부 작제물에 대하여, C-말단 FLAG 태그를 함유한다. 부위 지향적 돌연변이유발은 트립타제 돌연변이체를 생성하기 위해 표준 QuikChange™ 프로토콜 (Stratagene)을 사용하여 수행되었다. 모든 작제물은 DNA 서열분석으로 확인되었다. 재조합 배큘로바이러스는 표준 프로토콜에 따라 Sf9 세포에서 BaculoGold™ 시스템 (BD Biosciences)를 사용하여 생성되었다. 트리코플루시아니 세포는 대규모 단백질 생산을 위하여 감염되었고 감염 48 시간 후 수확되었다. 수확된 배지는 1 mM NiCl2, 5 mM CaCl2 및 20 mM Tris pH 8로 보충되었고, 30 분 동안 진탕되었고, 그 다음 20 분 동안 8500 x g로 원심분리되어 세포를 제거하였고 배지로부터 침전시켰다. 상청액 배지는 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 친화도 칼럼상의 장입에 앞서 0.22 μm 폴리에테르설폰 (PES) 필터를 통해 여과되었다. 인간 트립타제 베타 1은 CHO DP12 포유동물 세포주에서 일시적 형질감염으로 또한 발현되었다. 세포 배양 배지는 아래 기재된 바와 같이 Ni-NTA 친화도 정제와 함께 시작하는 동일한 정제를 거치게 되었다.
분비된 His6-태깅된 재조합 트립타제 (야생형 또는 돌연변이체)를 함유하는 CHO 세포 배지 또는 곤충 세포 배지는 170 cm/시간의 용적측정 유량으로 10 mL Ni-NTA Superflow 칼럼 (Qiagen)상에 장입되었다. 칼럼은 10 CV (칼럼 용적)의 세정 완충액 (20 mM Tris pH 8, 10 mM 이미다졸, 300 mM NaCl)로 세정되었고 8 CV 용출 완충액 (20 mM Tris pH 8, 300 mM 이미다졸, 300 mM NaCl)로 용출되었다. 트립타제를 함유하는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 검정된 분획은 풀링되었고, 농축되었고, 그리고 제조자에 의해 권고된 유량으로 작동 완충액 (10 mM 3-(N-모폴리노)프로판설폰산 (MOPS) pH 6.8, 2 M NaCl)을 이용하여 S200 크기 배제 칼럼 (GE Healthcare)상에 장입되었다. His-태깅된 재조합 트립타제 (단량체성)을 함유하는 분획은 풀링 및 농축되었다. 재조합 트립타제는 그 다음 0.5 mg/ml 헤파린 (Sigma Aldrich) 및 0.1 mg/ml 엔테로키나제 (New England Biolabs, Inc)를 함유하는 완충액 (10 mM MOPS pH 6.8, 0.2 M NaCl) 내 2 mg/ml의 농도로 실온에서 밤새 절단되었다. 이 단계는 N-말단 His6-태그를 제거하고 사량체화 및 단백질분해적으로 활성 트립타제를 초래하고, 이는 잔기 16 (키모트립시노겐 넘버링)에서 시작하는 새로 형성된 N-말단 서열로서 IVGG를 갖는다. 사량체 트립타제는 그 다음 엔테로키나제 및 임의의 비절단된 재조합 트립타제 제거에 의해 사량체 트립타제를 정제하기 위해 완충액 (10 mM MOPS pH 6.8 및 2 M NaCl)내 S200 칼럼 (GE Healthcare)를 사용하는 크기 배제 크로마토그래피를 거치게 되었다.
트립타제 돌연변이체 Y75C 및 I99C, 뿐만 아니라 촉매적으로 불활성 돌연변이체 S195A (키모트립시노겐 넘버링, 하기의 Ser224 내지 Ala 치환에 상응: 전장 트립타제 서열 서열번호:71)은 상기 기재된 바와 같이 Ni-친화도 크로마토그래피로 정제되었다. 디설파이드-연결된 트립타제 이량체 돌연변이체는 그 다음 S200 크기 배제 크로마토그래피에 의해 비-디설파이드-연결된 트립타제 단량체 돌연변이체로부터 분리되었다. 디설파이드-연결된 이량체 돌연변이체는 야생형 트립타제에 대하여 상기 기재된 바와 같이 사량체로 추가 가공되었다.
(ii) 항-인간 트립타제 토끼 및 마우스 단클론성 항체 생성
2마리 토끼는 프로인트 완전 아주반트 (CFA)와 CHO-유래된 인간 트립타제 베타 1 (사량체)로 면역화되었다. 토끼는, 프로인트 불완전한 아주반트 (IFA)와, 동일한 단백질로, 매 2 주 1회 부스팅되었다. 4 주사 이후, 정제된 혈청 샘플은 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의한 결합 그리고 효소적 활성 검정을 사용하는 인간 트립타제 활성의 억제에 대하여 평가되었다. 인간 트립타제 활성의 억제를 실증하였던, 토끼들 중 하나로부터 수확된 비장에서 B 세포는 그 다음 토끼 융합 파트너와 융합되었다. 10-14 일후, 상청액은 수확되었고 ELISA에 의한 단백질 결합을 위하여 스크리닝되었다.
ELISA 프로토콜은 아래와 같았다. 96-웰 NUNC MAXISORB® ELISA 플레이트는 5 μg/ml, 100 μl/웰로 NeutrAvidin® 바이오틴 결합 단백질 (Thermo Scientific Catalog No. 31000, 스톡 10 mg/ml)로 밤새 코팅되었다. 웰들은 세정 완충액 (0.05% TWEEN®-20을 가진 PBS)로 3회 세정되었고 건조 블랏팅되었다. 웰들은 그 다음 200 μl/웰의 차단 완충액 (0.5% 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.05% TWEEN®-20을 가진 PBS)로 차단되었고 실온에서 30 분 이상 동안 인큐베이션되었다. (0.5% BSA, 0.05% TWEEN®-20, 및 0.1 mg/ml 헤파린을 가진 PBS; 검정 완충액에서 희석된) 바이오티닐화된 인간 트립타제 베타 1 단백질은 웰들에 1 μg/ml로 첨가되었고 실온에서1 시간 ± 10 분 동안 인큐베이션되었다. 헤파린은 트립타제가 사량체로서 잔류하였다는 것을 보장하기 위해 포함되었다. 웰들은 세정 완충액 (200 μl/웰)로 3회 세정되었고 건조 블랏팅되었다. 하이브리도마 상청액 (샘플) 또는 대조군 (예를 들어, 양성 대조군 토끼 정제된 다클론성 항체 YZ4209 (스톡 0.25 mg/ml)는 웰들 (검정 완충액에서 희석됨, 100 μl/웰)에 첨가되었고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 다음으로, 웰들은 세정 완충액 (200 μl/웰)로 3회 세정되었고 건조 블랏팅되었다. 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP) 접합체 (염소 항-토끼 IgG (H+L) HRP; Thermo Scientific Catalog No. 31460)은 첨가되었고 (검정 완충액에서 1:10,000 희석됨, 100 μl/웰) 실온에서 30 분 동안 인큐베이션되었다. 웰들은 재차 세정 완충액 (200 μl/웰)로 3회 세정되었고 건조 블랏팅되었다. 기질 (BioFX TMB Substrate, 제품 번호:TMBW-1000-01)은 첨가되었고 (100 μl/웰) 5 분 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 반응은 하기의 첨가로 중단되었고: 100 μl/웰의 BioFX 중단 용액 (제품 번호:BSTP-0100-01), 및 플레이트는 A650에서 판독되었다.
모든 ELISA-양성 클론은 표준 방법 (MabSelect SuRe™; GE Healthcare)를 사용하는 친화도 크로마토그래피로 정제되었고 그 다음 재조합 트립타제 활성 검정에서 인간 트립타제 활성의 억제를 위하여 스크리닝되었다. 간단히, 항체는 PBS, pH 7.4에서 0.007 내지 100,000 ng/mL (0.046 pM 내지 667 nM)로 희석되었다. 재조합 인간 트립타제 베타 1은 TNH 완충액 (200 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mg/mL 헤파린, 0.01% TRITON™ X-100, pH 8.0)에서 3 nM로 희석되었고 흑색 384-웰 플레이트 (ViewPlate-384 F, Black, Clear-Bottom, Perkin Elmer, Catalog No. 6007470)에서 항-트립타제 항체와 1:1 조합되었다. 플레이트는 1시간 동안 주위 온도에서 온화한 진탕과 함께 인큐베이션되었다. 비색계 기질 S-2288 (Chromogenix, 부품 번호 82-0852-39)는 TNH 완충액에서 900 μM로 희석되었고 플레이트에 첨가되었다. 최종 인-웰 농도는 300 μM S-2288, 1 nM 재조합 인간 트립타제 베타 1, 및 0.015 pM 내지 222 nM 항-트립타제 항체이었다. 플레이트는 40 분 동안 주위 온도에서 온화한 진탕과 함께 인큐베이션되었고 그 다음 A405에서 판독되었다. 항-트립타제 항체의 절반-최대 억제 농도 (IC50)은 그들의 각 곡선의 4-파라미터 적합으로부터 결정되었다. 원하는 억제를 입증하는 클론은 그 다음 희석 (단일 세포/웰)을 제한시킴으로써 서브클로닝되었고, 상기 기재된 바와 같이 재시험되었고 추가로 특성규명되었다.
마우스 하이브리도마는 생성되었고 스크리닝되었으며 양성 클론은 유사한 방식으로 분석되었다. 3마리 A/J 마우스 (Harlan, Indianapolis, Ind.)는 하기로서 정제된 트립타제 단백질로 면역화되었다: 항원 (EPC, Inc.#TR913). 완전한 프로인트 아쥬반트 (제1 면역화) 또는 불완전한 프로인트 아쥬반트 (제2, 제3, 및 제4 면역화)와 혼합 및 1:1 유화 후 피하로 및 복강내로 면역화에 따라 20 μg/마우스로 투여된 경우 효소적으로 활성 트립타제.부스트 (제5 면역화)는 아쥬반트를 갖지 않았다. 제4 면역화 후, 면역화된 마우스로부터 혈청은 ELISA로 시험되었고 1:1.28 x 104의 희석액에서 OD450 >2.16보다 더 높은 혈청 역가를 가진 마우스는 하이브리도마 융합을 위하여 선택되었다. 107 x 106 단리된 비장 세포는 하기의 존재 하에서 융합을 위하여 100 x 106 Sp2/0 골수종 세포 (ATCC)와 혼합되었다: 폴리에틸렌 글리콜 (Sigma-Aldrich, Cat.No. P7777-5G). 24 클론은 트립타제에 결합을 위하여 스크리닝되었고 트립타제 효소적 활성의 억제를 위하여 검정되었다. 클론 T31a (또한 본 명세서에서 일명 "31A" 및 "mu.31A")는 인간화를 위하여 선택되었다.
(iii) 토끼 항-트립타제 하이브리도마 클론의 분자 클로닝 및 재형식화
총 RNA는 토끼 항-트립타제 단클론성 항체 (RNeasy® 미니 키트, Qiagen)을 생산하는 하이브리도마 세포로부터 추출되었다. SMARTer® RACE cDNA 증폭 키트 (Clontech)를 사용하여, RNA는 먼저 역전사되었고, 그 다음 하기 프라이머를 가진 가변 경 (VL) 및 가변 중 (VH) 도메인의 5’ RACE PCR 증폭 및 제1 가닥 cDNA 합성을 거치게 되었다:
경쇄 (LC) 정방향 프라미어:
보편적인 프라이머 믹스 (SMARTer® RACE cDNA 증폭 키트, Clontech, 카탈로그 #634858)
중쇄 (HC) 정방향 프라미어:
보편적인 프라이머 믹스 (SMARTer® RACE cDNA 증폭 키트, Clontech, 카탈로그 #634858)
LC 역방향 프라이머:
5’-GATGGTGACTGTTCCAGTTGC-3’ (서열번호:74)
HC 역방향 프라이머:
5’-CATTGGTGAGGGTGCCCGAGTTC-3’ (서열번호:75)
LC 및 HC 역방향 프라이머는 불변 경 (CL) 및 불변 중 도메인 1 (CH1)에서 영역에 어닐링되어도록 설계되었다.
증폭된 PCR 생성물은 직접적으로 서열분석되었다. 확인된 VL DNA 서열은 그 다음 인간 카파 불변 도메인을 함유하는 pRK 포유동물 세포 발현 벡터로 서브클로닝되었다. VH DNA 서열은 전장 인간 γ1 불변 도메인을 인코딩하는 pRK 벡터에 삽입되었다.
(iv) 토끼 항-트립타제 단클론성 항체 E104의 인간화
VL (서열번호:53) 및 VH (서열번호:52) 도메인 (토끼 항-트립타제 단클론성 항체 E104로부터)은 하기로 정렬되었다: 인간 VL 카파 I (VLKI) 및 인간 VH 하위그룹 IV (VHIV) 공통 서열 (서열번호:92 및 93, 각각). 참고, 예를 들어, Dennis, Ch.2 CDR 복구:A Novel Approach to Antibody Humanization in Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Eds. Shire 등 Springer, New York, NY.초가변 영역 (HVR)은 공통 인간 VLKI 및 VHIV 수용체 프레임워크에 조작되어 CDR-그라프트 변이체를 생성하였다. E104 VL 도메인으로부터, 위치 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3)은 VLKI에 그라프팅되었다. VH 도메인으로부터, 위치 26-35b (H1), 50-65 (H2) 및 93-102 (H3)은 VHIV에 그라프팅되었다. 중요할 수 있는 프레임워크 버니어 위치를 평가하기 위해, 선택된 버니어 위치는 토끼 서열에 역으로 돌연변이되었다. 토끼 서열에 역으로 돌연변이된 버니어 위치는 VL에서 2, 4, 43, 68, 및 87 그리고 VH에서 37, 67, 71, 78, 및 91을 포함하였다.
토끼 항-트립타제 단클론성 항체 E104로부터 VL 및 VH 도메인은 하기로 또한 정렬되었다: 인간 VL 카파 I (VLKI) 및 인간 VH 하위그룹 III (VHIII) 공통 서열 (서열번호:92 및 94, 각각). 참고 Dennis, 상동. 초가변 영역 (HVR)은 공통 인간 VLKI 및 VHIII 수용체 프레임워크에 조작되어 CDR-그라프트 변이체를 생성하였다. rab.E104 VL 도메인으로부터, 위치 24-34 (L1), 50-56 (L2), 및 89-97 (L3)은 VLKI에 그라프팅되었다. VH 도메인으로부터, 위치 26-35 (H1), 50-65 (H2), 및 93-102 (H3)은 VHIII에 그라프팅되었다.
전체로, 인간화된 VL 서열의 2개의 상이한 버전 그리고 인간화된 VH 서열의 6개의 상이한 버전은 합성되었고 후속으로 pRK 포유동물 발현 벡터에 서브클로닝되었다. LC 및 HC의 상이한 버전을 배합시킴으로써, 총 12개의 상이한 인간화된 E104 변이체 (v1 내지 v12)는 생성되었다 (표 3). 모든 인간화된 항-트립타제 변이체는 포유동물 세포에서 IgG1 또는 IgG4 항체로서 발현되었다. 항체는 표준 방법 (MabSelect SuRe™; GE Healthcare)를 사용하는 친화도 크로마토그래피로 정제되었다. 실시예 부문에서 사용된 IgG4 항체 모두는 중쇄 불변 영역에서 S228P 돌연변이 (EU 넘버링)을 포함하였지만; 본 명세서에 기재된 발명은 S228P 돌연변이를 가진 IgG4 변이체에 제한되지 않는다.
huE104.v2의 VH 도메인을 인코딩하는 DNA 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:109.huE104.v2의 VL 도메인을 인코딩하는 DNA 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:110.중쇄 (IgG1)을 인코딩하는 DNA 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:111.중쇄 (IgG4.S228P)를 인코딩하는 DNA 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:113. 경쇄 (IgG1 및 IgG4)를 인코딩하는 DNA 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:112.huE104.v2 IgG1의 중쇄 (HC)의 아미노산 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:80.huE104.v2 (IgG1 또는 IgG4)의 경쇄 (LC)의 아미노산 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:81.huE104.v2 IgG4 S228P의 HC의 아미노산 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:82.
(v) 마우스 항-트립타제 단클론성 항체 31A의 인간화
VL (서열번호:20) 및 VH (서열번호:19) 도메인 (마우스 항-트립타제 단클론성 항체 31A ("mu.31A")로부터)는 하기로 정렬되었다: 인간 VL 카파 I (VLKI) 및 인간 VH 하위그룹 III (VHIII) 공통 서열 (서열번호:92 및 93, 각각). 초가변 영역 (HVR)은 공통 인간 VLKI 및 VHIII 수용체 프레임워크에 조작되어 CDR-그라프트 변이체를 생성하였다. mu.31A VL 도메인으로부터, 위치 24-34 (L1), 50-56 (L2), 및 89-97 (L3)은 VLKI에 그라프팅되었다. mu.31A VH 도메인으로부터, 위치 26-35 (H1), 50-65 (H2), 및 93-102 (H3)은 VHIII에 그라프팅되었다. 프레임워크 버니어 위치의 중요성을 평가하기 위해, 선택된 버니어 위치는 마우스 서열에 역으로 돌연변이되었다. 마우스 서열에 역으로 돌연변이된 버니어 위치는 VL에서 위치 4, 43, 46, 47, 및 71 그리고 VH에서 위치 49를 포함하였다.
요약하면, 3 인간화된 LC 및 5 인간화된 HC는 합성되었고 pRK 포유동물 발현 벡터에 후속으로 서브클로닝되었다. LC 및 HC의 상이한 버전을 배합시킴으로써, 31A ("hu31A")의 총 15개의 상이한 인간화된 변이체 (v1 내지 v15)는 생성되었다 (표 4).
모든 인간화된 항-트립타제 변이체는 포유동물 세포에서 IgG1 또는 IgG4 항체로서 발현되었다. 항체는 표준 방법 (MabSelect SuRe™; GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)를 사용하는 친화도 크로마토그래피로 정제되었다.
Hu31A.v11의 VH 도메인을 인코딩하는 DNA 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:104. hu31A.v11의 VL 도메인을 인코딩하는 DNA 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:105.중쇄 (IgG1)을 인코딩하는 DNA 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:106.중쇄 (IgG4.S228P)를 인코딩하는 DNA 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:108. 경쇄 (IgG1 및 IgG4)를 인코딩하는 DNA 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:107. hu31A.v11 IgG1의 HC의 아미노산 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:76.hu31A.v11 IgG1의 LC의 아미노산 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:77. hu31A.v11 IgG4 S228P의 HC의 아미노산 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:78. hu31A.v11 IgG4 S228P의 LC의 아미노산 서열은 하기에서 나타난다: 서열번호:79.
(vi) Fab 단편의 클로닝, 발현, 및 정제
Fabs는 이전에 기재된 바와 같이 E. 콜리에서 클로닝 및 발현되었다 (참고 Simmons 등 J. Immunol. Methods 263:133-147, 2002; Lombana 등 Sci. Rep.5:17488, 2015). 발현된 Fab를 함유하는 E. 콜리 세포 페이스트는 Fabs를 발현시키는 발효물로부터 수확되었고 25 mM EDTA 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF)를 함유하는 PBS 완충액에 용해되었다. 혼합물은 균질화되었고 그 다음 미세유동화기를 통해 2회 통과되었다. 현탁액은 그 다음 21,500 x g로 60 분 동안 원심분리되었다. 상청액은 그 다음 5 ml/분으로 PBS로 평형화된 단백질 G 칼럼상에 장입되었다. 칼럼은 기준선까지 PBS 완충액으로 세정되었고 단백질은 그 다음 0.6% 아세트산으로 용출되었다. SDS-PAGE에 의해 분석된 바와 같이 Fabs를 함유하는 분획은 풀링되었고 그 다음 20 mM MES (pH 5.5)에서 평형화된 50 mL SP SEPHAROSE® 칼럼상에 장입되었다. 칼럼은 2 칼럼 용적에 대하여 20 mM MES 완충액 (pH 5.5)로 세정되었고 그 다음 20 mM MES 완충액 (pH 5.5)에서 0.5M NaCl에 선형 구배로 용출되었다. 최종 정제를 위하여, 이온 교환 크로마토그래피로부터 Fab-함유 분획은 농축되었고 PBS 완충액의 S75 크기 배제 칼럼상에서 실행되었다. 동일한 프로토콜은 실험에서 사용된 모든 Fabs에 대하여 사용되었다.
(vii) 인간화된 항-트립타제 변이체의 BIAcore® 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석
이 실험에서, 모든 인간화된 변이체는 293 세포의 일시적 형질감염으로 IgG로서 발현되었다. IgG는 단백질 G 친화도 크로마토그래피로 정제되었다. 하기에 대한 각각의 변이체의 친화도: 재조합 His-태깅된 인간 트립타제 베타 1 단량체 (서열번호:128)은 BIAcore® T200을 사용하는 SPR 분석으로 결정되었다. BIAcore® 시리즈 S CM5 센서 칩은 단클론성 마우스 항-인간 IgG (Fc) 항체 (GE Healthcare로부터 인간 항체 포착 키트)로 고정되었고 항-트립타제 변이체는 각각의 유동 세포에서 후속으로 포착되었다. 인간 트립타제 베타 1 단량체의 연속 3-배 희석액은 30 μl/분의 유량으로 주입되었다. 각각의 샘플은 3 분 회합 및 10 분 해리로 분석되었다. 각각의 주입후, 칩은 3 M MgCl2를 사용하여 재생되었다. 결합 반응은 유사한 밀도에서 무관한 IgG를 포착하는 유동 세포로부터 반응 단위 (RU)를 감산함으로써 정정되었다. kon 및 koff의 동시 적합화의 1:1 랭뮤어 모델은 동력학 분석에 사용되었다.
(viii) 인간화된 항-트립타제 변이체의 억제 활성의 분석
a. 트립타제 효소적 검정
인간화된 항-트립타제 항체에 의한 인간 트립타제 활성의 억제는 재조합 트립타제 활성 검정을 사용하여 측정되었다. hu31a.v11 IgG4 및 hu31a.v11 IgG1은 PBS, pH 7.4에서 0.05 내지 100 μg/ml (0.30 내지 667 nM) 희석되었고, huE104.v2 IgG4 및 huE104.v2 IgG1은 PBS pH 7.4에서 0.02 내지 50 μg/ml (0.15 내지 333 nM) 희석되었다. 재조합 인간 트립타제 베타 1 사량체 활성 효소는 TNH 완충액 (200 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mg/mL 헤파린, 0.01% TRITON™ X-100, pH 8.0)에서 0.75 nM로 희석되었고, 흑색 384-웰 플레이트 (ViewPlate-384 F, Black, Clear-Bottom, Perkin Elmer, 카탈로그 번호 6007470)에서 항-트립타제 항체와 1:1 조합되었다. 플레이트는 1시간 동안 주위 온도에서 온화한 진탕과 함께 인큐베이션되었다. 비색계 기질 S-2288 (Chromogenix, 부품 번호 82-0852-39)는 TNH 완충액에서 1200 μM로 희석되었고 플레이트에 첨가되었다. 최종 인-웰 농도는 400 μM S-2288, 0.25 nM 재조합 인간 트립타제 베타 1 사량체, 66 μg/ mL 헤파린, 그리고 hu31A.v11에 대하여 0.10 내지 222 nM 항-트립타제 항체 및 huE104.v2에 대하여 0.05 내지 111 nM이었다. 플레이트는 40 분 동안 주위 온도에서 온화한 진탕과 함께 인큐베이션되었고 그 다음 A405에서 판독되었다. 항-트립타제 항체의 IC50은 그들의 각 곡선의 4-파라미터 적합으로부터 결정되었다.
b. 기관지 평활근 세포 증식 검정 및 콜라겐-기반 수축 검정
인간 기관지 평활근 세포 (BSMCs; 카탈로그 번호 CC-2576, Lonza Minneapolis, MN)은 완전한 배양 배지 SmGM-2 (카탈로그 번호 CC-3182, Lonza)에서 5% CO2가 있는 37 ℃의 가습된 인큐베이터에서 배양되었다. 검정 배지는 첨가된 인간 혈청 또는 보충물 (카탈로그 번호 CC-3181, Lonza) 없이 SmGm-2 배양 배지이었다. 인간 야생형 사량체 트립타제 또는 인간 S195A 촉매적으로-불활성 트립타제 효소 (키모트립시노겐 넘버링)은 명시된 농도에서 사용되었다. 항-인간 트립타제 항체 hu31A.v11 IgG4 및 E104.v2 IgG4는 명시된 농도에서 사용되었다.
증식 검정을 위하여, 검정 수행에 1 일 앞서, BSMCs는 완전한 배양 배지내 96 웰 조직 배양 플레이트 (카탈로그 번호 353072, Falcon BD)에서 2x105 세포/ml로 플레이팅되었다. 24 시간 후, 배양 배지는 검정 배지로 대체되었고 세포는 추가의 24 시간 동안 인큐베이션되었다. 항-인간 트립타제 항체는 96 웰 조직 배양판 (카탈로그 번호 353072, Falcon BD)에서 검정 배지내 3.3-배 연속으로 희석되었다. 100 μl의 희석된 hu31A.v11 IgG4는 100 μl의 200 nM 인간 트립타제를 함유하는 96 웰 플레이트로 이동되었다. 활성 트립타제 및 항-인간 트립타제 항체는 30 분 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 이때, 검정 배지는 플레이팅된 세포로부터 제거되었고 100 μl의 희석된 항체 플러스 트립타제로 대체되었다. 항체의 최종 농도는 2.0 μM 내지 4 pM 범위이었다. 트립타제의 최종 농도는 100 nM (헤파린 없음)이었다. 최종 염 농도는 약 130 mM이었다. 트립타제 단독을 가진 웰들은 자극 대조군으로서 포함되었다. 검정 배지 단독을 가진 웰들은 미자극된 대조군으로서 포함되었다. 플레이트는 24 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션된 다음 1 μCi의 H3-티미딘 / 웰이 첨가되었다. 추가의 6 시간의 인큐베이션 후, 증식은 H3-티미딘 편입으로 측정되었다. 세포-연관된 방사능은 섬광 계수로 정량화되었다. 결과는 3중 샘플의 평균으로서 표현되었다. 그래프는 생성되었고 통계 분석은 KaleidaGraph (Synergy Software)를 사용하여 수행되었다.
콜라겐-기반 수축 검정을 위하여, 검정 수행에 1 일 앞서, BSMCs는 제조자의 지침 (카탈로그 번호 CBA-201, Cell BioLabs Inc.)에 따라 24 웰 플레이트 (카탈로그 번호 353047, Falcon BD)에서 9x106 세포/mL로 콜라겐내 플레이팅되었다. 37 ℃에서 1 시간 인큐베이션 후, 세포는 1 mL의 검정 배지로 오버레이되었다. 37 ℃에서 24 시간 인큐베이션 후, 배지는 250 μl의 신선한 검정 배지로 대체되었다. 트립타제는 4 μM의 항-인간 트립타제 항체의 존재 또는 부재 하에서 660 nM까지 250 μL 검정 배지에서 희석되었고 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션된 다음 세포:콜라겐 매트릭스를 함유하는 명시된 웰들에 첨가되었다. 최종 농도는 330 nM 트립타제 및 2 μM 항체 (헤파린 없음)이었다. 최종 염 농도는 약 130 mM이었다. 세포 수축은 멸균 피펫 끝을 사용하여 플레이트 벽으로부터 세포:콜라겐 매트릭스의 방출로 개시되었다. 검정 배지 단독은 미자극된 대조군으로서 사용되었다. 세포 수축의 시작 (t=0)에서, 세포:콜라겐 매트릭스는 시각화되었고, 이미지화되었고, ProteinSimple AlphaImager®을 사용하여 기록되었다. 세포는 37° 에서 추가의 3 시간 동안 인큐베이션되었고 세포:콜라겐 매트릭스는 재이미지화 및 기록되었다 (t=3). 데이터는 NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 데이터는 수축의 시작 (t=0)부터 3 시간 시점 (t=3)까지 세포:콜라겐 매트릭스 직경에서 퍼센트 변화로서 제시되었다. 결과는 3중 샘플의 평균으로서 표현되었다.
c. 비만 세포 히스타민 방출 검정
인간 비만 세포주 LAD2는 사용되었다. LAD2 세포는, StemPro®-34 영양소 보충물 (카탈로그 번호 10640-019, Gibco/Life Technologies), 1x 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 (카탈로그 번호 10378-016, Gibco/Life Technologies) 및 100 ng/mL 재조합 인간 줄기 세포 인자 (SCF) (카탈로그 번호 573908, BioLegend)를 함유하는, 무혈청 성장 배지, StemPro®-34내 5% CO2가 있는 37 ℃의 가습된 인큐베이터에서 배양되었다. 참고 Kirshenbaum 등 Leukemia Research 27:677-682, 2003. 인간 트립타제 야생형 또는 인간 트립타제 S195A 돌연변이체는 명시된 농도에서 사용되었다. 항-NP 인간 IgE (JW8.5.13; 참고 Jackman 등 J. Biol Chem. 285(27): 20850-20859, 2010)은 Serotec Inc.로부터 수득되었다. NP-BSA (카탈로그 번호 N5050H-10, Biosearch Technologies, Petaluma, CA)는 히스타민 방출 유발을 위하여 명시된 농도에서 사용되었다. 항-인간 트립타제 항체 hu31A.v11 IgG4 및 E104.v2 IgG4는 명시된 농도에서 사용되었다. 소분자 억제제 G02849855는 명시된 농도에서 사용되었다. 세포 자극은 타이로드의 염 (카탈로그 번호 T-2397, Sigma)를 사용하여 수행되었다. 히스타민은 하기를 사용하여 측정되었다: 히스타민 ELISA 키트 (GenWay. 카탈로그 번호 40-371-25010).
인간 IgE 유발된 히스타민 방출 검정을 위하여, LAD2 세포는 6 웰 접시의 2 웰들에서 4x106 세포/4 ml로 플레이팅되었다. 항-NP IgE (100 ng/ml)는 하나의 웰에 첨가되었고 세포는 37 ℃에서 밤새 인큐베이션되어 세포를 프라이밍하였다. 다른 웰에서, 세포는 항-NP IgE의 첨가 없이 배지 단독에서 배양되어 음성 대조군으로서 작용하였다. 밤새 인큐베이션 후, 세포는 세포 배양 배지로 3회 세정되어 미결합된 IgE를 제거하였다. 세포는 4 mL 타이로드의 염 (세포 밀도 1x106 세포/ml)에서 재현탁되었고 Eppendorf® 튜브 (300,000 세포/튜브)에 분취되었다. 샘플은 100 μg/mL hu31A.v11 IgG4 또는 10 μM G02849855로 인큐베이션되었고, 철저하게 혼합되었고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 이 인큐베이션 이후, NP-BSA는 샘플에 0.1 μg/mL의 최종 농도로 첨가되어 세포 탈과립화를 유발시켰다. 샘플은 철저하게 혼합되었고 1시간 동안 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에 인큐베이션되었다. 세포는 그 다음 3000 rpm으로 5 분 동안 실온에서 원심분리되었고, 상청액은 히스타민 측정을 위하여 수집되었다. 탈과립화 상청액에서 히스타민은 히스타민 ELISA 키트를 사용하여 정량화되었다. 데이터는 2중 샘플의 평균으로서 제시되었다.
인간 트립타제 유발된 히스타민 방출 검정을 위하여, LAD2 세포는 106 세포/mL의 농도로 타이로드의 염에서 재현탁되었고 Eppendorf® 튜브 (300,000 세포/튜브)에 분취되었다. 세포 탈과립화를 촉진시키기 위해, 세포는 45 분 동안 실온에서 100 μg/mL hu31A.v11로 사전-인큐베이션된 3 μg/mL 트립타제 (야생형 또는 S195A 돌연변이체) 또는 3 μg/mL 트립타제로 처리되었다. PBS는 무 자극 대조군으로서 사용되었다. 샘플은 철저하게 혼합되었고 1시간 동안 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에 인큐베이션되었다. 최종 염 농도는 약 140 mM이었다. 세포는 그 다음 3000 rpm으로 5 분 동안 실온에서 원심분리되었고, 상청액은 히스타민 측정을 위하여 수집되었다. 탈과립화 상청액에서 히스타민은 히스타민 ELISA 키트를 사용하여 정량화되었다. 데이터는 2중 샘플의 평균으로서 제시되었다.
(ix) 재조합 트립타제 단량체 및 사량체의 정제
내인성 신호 펩타이드 (서열번호:71의 아미노산 잔기 1-15) 및 프로-펩타이드 (서열번호:71의 아미노산 잔기 16-30) 없이 인간 트립타제는 조작된 엔테로키나제 절단 부위를 가진 His-태깅된 재조합 단백질로서 포유동물 CHO 세포에서 발현되었고 5x 한외여과 이어서 PBS에 5x 희석되었다. 배지는 그 다음 Ni-NTA 칼럼 위에 장입되었고 250 mM 이미다졸로 용출되었다. 용출물은 단량체성 트립타제를 산출하는 10 mM MOPS, 0.2M NaCl, pH 6.8 완충액에 투석되었다. 비절단된 His6-태깅된 트립타제 단량체는 단량체성으로 남아있고 사량체를 형성하지 않는다.
사량체 트립타제를 생성하기 위해, His 태그를 함유하는 단량체성 트립타제는 0.1 mg/ml의 엔테로키나제 효소를 사용하여 소화되었고 실온에서 16-20 시간 동안 0.5 mg/ml로 덱스트란 설페이트-10 나트륨 염으로 안정화되었다. 단백질은 SUPERDEX™ 200 칼럼을 거쳐 10 mM MOPS, 2M NaCl, pH 6.8의 최종 완충액에 단량체로부터 그리고 임의의 잔존 오염 프로테아제로부터 별개의 사량체까지 통과되었다. 예시적인 정제된 사량체는 도 3A, 피크 1에서 나타난다. 풀링된 사량체 트립타제는 면역화 및 활성 검정에 사용되었다.
B. 결과
(i) 하이브리도마 클로닝
ELISA-양성 하이브리도마 클론으로부터 5마리 토끼 항-트립타제 항체의 분자 클로닝은 4 고유의 항-트립타제 클론을 드러냈다. 이들 중, 클론 E104는 효소적 검정에서 가장 강력한 억제 활성을 보여주었고, 추가 조작을 위하여 선택되었다. 병렬적으로, 효소적 검정에서 억제 활성을 보여주었던 쥣과 항-트립타제 단클론성 항체 클론 31A는 추가 조작을 위하여 또한 선택되었다.
(ii) 키메라 E104 (chE104) 변이체의 생성
토끼 항-트립타제 단클론성 항체 E104의 경쇄는, 가변 도메인 (VL)의 FR3내 Cys80과 불변 도메인 (CL)내 Cys170 사이 디설파이드 브릿지를 함유하는, 토끼 카파 경쇄이다. VL에서 Cys80의 중요성을 평가하기 위해, 알라닌으로 돌연변이된 위치 80에서 시스테인 (Cys80Ala)를 가진 키메라 E104 변이체는 생성되었다. 표 2에서 나타낸 바와 같이, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 양쪽 Cys80 및 Cys80Ala 키메라 변이체에서 높은 % 단량체로 입증된 바와 같이, 수율 또는 응집의 관점에서 2개의 변이체 사이 차이 없음.따라서, Cys80 잔기가 임계적이지 않고 인간화된 버전에서, Cys80이 VH4 그라프트에서처럼 프롤린 잔기로 변화되지 않음이 결정되었다. 또한, 인간 IgG1 또는 IgG4 불변 도메인에 어느 한쪽 융합된, 가변 도메인 FR3에서 Cys80Ala 돌연변이를 가진 키메라 E104 항체는 위치 80에서 시스테인을 가진 토끼 단클론성 항체로서 유사한 억제성 활성을 보여주었다 (데이터 도시되지 않음).
Figure 112019095769167-pct00004
(iii) 토끼 항-트립타제 단클론성 항체 클론 E104 및 마우스 항-트립타제 단클론성 항체 클론 31A의 인간화
인간화된 변이체 모두는 IgG로서 발현되었고 그들의 결합 친화도는 BIAcore® SPR 검정에서 평가되었다. 일반적으로, 모든 인간화된 E104 변이체 (huE104)는 인간 트립타제 베타 1 단량체에 대해 유사한 결합 친화도를 보여주었다 (표 3). 표 3은 BIAcore® SPR 분석에 의해 결정된 바와 같이 huE104 변이체 뿐만 아니라 결합 친화도를 (KD 관점에서) 열거한다. 표 3은 또한 각각의 변이체에 대하여 VH 및 VL 도메인의 서열번호를 제공한다. 표 3에서 각각의 클론은 IgG1 형식으로 시험되었다. 일관되게, 매우 유사한 IC50 값은 상기 기재된 효소적 활성 검정에서 이들 항체에 대하여 관측되었고, 단, huE104.v1 및 huE104.v5 클론, 그리고 더 적게는, huE104.v11 및 huE104.v12는 효소적 검정에서 일부 "후크 효과"를 보여주었다 (여기에서 효소적 활성의 증가, 즉, 항체 억제 활성에서 감소는 높은 항체 농도에서 관측되었다). 인간화된 항체의 V71부터 토끼 단클론성 항체 (V71R)의 최초 Arg 잔기까지 그리고 인간화된 항체의 F78부터 토끼 단클론성 항체 (F78V)의 최초 Val 잔기까지 중쇄 FR3 영역에서 변형은 E104.v1, v5, v11 및 v12에서 보이는 후크 효과를 제거하였다. E104.v9 키메라 클론은 모 토끼 단클론성 Ab E104에서처럼 R71 및 V78을 함유한다. 참고 표 3.도 12B에서 나타낸 바와 같이, 위치 71에서 아르기닌 (R) 잔기 그리고 위치 78에서 발린 (V) 잔기 (둘 모두 카밧 넘버링)은 HVR-H2의 형태에서, 그리고 따라서 항체의 트립타제에의 결합에서 중요한 역할을 할 수 있다. 그 결과, huE104.v2에서 V71R 및 F78V 변형은 작은 계면을 형성하는 2 프로토머의 회합에서 중요한 트립타제 80 루프의 형태에 영향을 미칠 수 있다. 참고 아래 실시예 3.따라서, V71R 및 F78V 복귀를 갖는, hu104.v2는, 위치 71에서 V 그리고 위치 78에서 F를 갖는, v1에 비교된 경우 개선된 결합 및 억제 활성을 갖는다. v1, v5, v11, 및 v12를 제외한 모든 변이체는 상기 기재된 효소적 검정으로 측정된 바와 같이 트립타제 활성의 완전한 억제를 보여주었다. 인간화된 클론 huE104.v2는 추가 평가를 위하여 선택되었다. huE104.v2의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 도 1에서 나타난다.
Figure 112019095769167-pct00005
표 4는 BIAcore® SPR 분석에 의해 측정된 바와 같이 hu31A 변이체 뿐만 아니라 결합 친화도를 (KD, 나노몰의 관점에서) 열거한다. 표 4는 또한 각각의 항체에 대하여 VH 및 VL의 서열번호를 보여준다. 모든 변이체는 효소적 검정으로 측정된 바와 같이 트립타제 활성의 완전한 억제를 보여준다 (데이터 도시되지 않음). 표 4에서 각각의 클론은 IgG1 형식으로 시험되었다. 클론 hu31A.v11은 효소적 검정에서 최상의 친화도 및 최상의 억제 활성을 보여주었고 따라서 추가 평가를 위하여 선택되었다. hu31A.v11의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 도 1에서 나타난다.
Figure 112019095769167-pct00006
인간화된 항-트립타제 항체의 억제 활성은 상기 기재된 재조합 트립타제 효소적 활성 검정을 사용하여 또한 결정되었다. 양쪽 h31A.v11 및 huE104.v2, IgG1 및 IgG4는 효소적 검정에서 트립타제 활성을 완전히 억제시켰다 (참고 도 2A). IC50 값은 아래 나타난다 (표 5).
Figure 112019095769167-pct00007
양쪽 hu31A.v11 및 huE104.v2는, 트립타제 베타 1에 더하여, 인간 트립타제 베타 2 및 베타 3을 결합 및 억제시킨다. 대표적인 데이터는 표적으로서 인간 트립타제 베타 1을 사용하는 친화도 분석 및 효소적 검정에 대하여 상기 기재된 프로토콜에 기반하여 표 6에서 아래 나타난다. 양쪽 hu31A.v11 및 huE104.v2는 또한 사이노 트립타제 D1을 결합 및 억제시킨다.
Figure 112019095769167-pct00008
hu31A.v11 IgG4 또는 huE104.v2 IgG4의 억제 활성은 인간 1차 기도 평활근 세포 (SMC) 기능의 몇 개의 생체외 모델에서 추가로 평가되었다. 배양 배지에 트립타제 베타 1의 첨가는 인간 1차 기도 SMCs의 증식 (도 2B), 뿐만 아니라 세포의 수축 (도 2C)에서 증가를 초래한다. hu31A.v11 또는 huE104.v2의 첨가는 증식에서 용량-의존적 감소를 초래하였고, 300 μg/ml에서 증식을 기준선 수준까지 억제시켰다 (도 2B). 유사하게, hu31A.v11 또는 huE104.v2의 첨가는 수축을 기준선 수준까지 감소시켰다 (도 2C). 이들 데이터는 항-트립타제 항체 hu31A.v11 및 huE104.v2가 트립타제 기능을 억제시켰다는 것을 입증한다.
비만 세포에 트립타제 또는 IgE의 첨가는 탈과립화 그리고 히스타민의 방출을 초래한다 (도 2D-2E). 히스타민 방출을 억제시키는 hu31A.v11의 능력은 평가되었다. S195A 치환을 가진 트립타제 베타 1은 촉매적으로 불활성이다. hu31A.v11의 첨가는 히스티민 방출을 촉진시키는 트립타제의 능력을 차단시켰다 (도 2D-2E). 억제의 정도 (30-50%)는 트립타제 베타 1 활성의 소분자 억제제, G02849855와 유사하였다 (도 2E). 이들 결과는 항-트립타제 항체 hu31A.v11이 트립타제 기능을 억제시킨다는 것을 추가로 나타낸다.
실시예 2: hu31A .v11 및 huE104.v2 IgG는 인간 트립타제 베타 사량체를 해리시킨다
활성 사량체 트립타제의 결정 구조는 각각의 프로토머의 촉매 부위 (각각의 프로토머의 S195, H57, 및 D102에 의해 제시됨, 키모트립시노겐 넘버링)이 사량체의 기공 내부에 위치한다는 것, 그리고 활성 부위에 대한 접근이 제한되어 이로써 단지 펩타이드 기질 및 더 작은 분자가 접근할 수 있다는 것을 나타낸다 (Pereira 등 Nature 392:306-11, 1999). 현재까지, 포유동물 세린 프로테아제 억제제는 트립타제의 단백질분해 활성을 억제시킨다고 공지되지 않는다. 쿠니츠-도메인 유형 구조의 인간 세린 프로테아제 억제제는 활성 부위에 접근하기에 너무 크다. 인간에서 트립타제의 알려진 천연 억제제는 없다. 현재까지 트립타제의 유일하게 알려진 천연 거대분자 억제제는 하기이다: 거머리-유래된 트립타제 억제제 (LDTI) (Sommerhoff 등 Biol. Chem. 373:685-94, 1997) 및 진드기-유래된 프로테아제 억제제 (TdPI) (Paesen 등 J. Mol. Biol. 368:1172-86, 2007). LDTI (4.7 kDa) 및 TdPI (11.1 kDa)는 트립타제 사량체의 4 활성 부위 중 2 또는 3개, 각각을 차단하는 능력을 갖는다. LDTI 및 TdPI는 트립타제 사량체를 해리시키지 않는다. hu31A.v11의 양쪽 IgG 및 Fab는 LDTI 또는 TdPI보다 훨씬 더 크고, 그러면서도 이들은 트립타제를 완전히 억제시킨다.
우리는 용액에서 사량체 트립타제에 대한 Fab hu31A.v11 결합의 화학양론을 결정하였다. 활성 사량체 트립타제 베타 1은 각각의 프로토머에 2-배 몰 과잉의 Fab hu31A.v11과 혼합되었고 복합체 형성은 평형에 도달하도록 허용되었다. 사량체가 비-공유적으로 조립되기 때문에, 사량체 구조상의 각각의 항체의 해리 효과는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 분석되었고 개별 단백질 피크의 분자량 및 체류 시간/용적은 결정되었다. 단백질을 함유하는 분획은 단백질 성분을 결정하기 위해 SDS-PAGE를 특징으로 하였다 (도 3A). 사량체 트립타제 단독의 체류 시간은 Fab hu31A.v11과 복합체인 경우 (tr = 28.1 분, 실행 3, 피크 3)보다 상당히 더 짧았다 (tr = 26 분, 실행 1, 피크 1)다중-각 광 산란 (MALS)와 조합으로 추가의 SEC 분석은 용출된 단백질 복합체의 분자량을 결정하기 위해 수행되었다. 사량체 트립타제는 MALS에 따른 120 kDa ± 0.2 %의 분자량을 가졌고, 이는 (당화 제외) 아미노산 서열에 기반된 109.537 kDa의 이론적 분자량과 일치한다. Fab hu31A.v11과 복합체에서 트립타제를 함유하는 단백질 피크는 MALS에 의해 67.7 kDa ± 3% (피크 3)인 것으로 측정되었고, 이는 1 Fab에 결합된 1 트립타제 단량체를 포함하는 복합체를 반영한다. 이것은 트립타제 사량체가 Fab hu31A.v11에 결합시 단량체로 해리하는 것을 나타내고, 이는 hu31A.v11 Fab의 억제 활성 및 결정 구조 (참고 실시예 3)에 의해 추가로 확증된다.
동일한 사량체 트립타제/Fab hu31A.v11 복합체가 고농도의 헤파린, 예를 들어, 100 μg/ml 헤파린을 함유하는 효소 검정 완충액에서 SEC로 분석되었던 경우 (실행 2), 트립타제-Fab 복합체의 체류 시간은, 유사하게 트립타제 단량체 및 Fab의 단백질 복합체에 헤파린 결합으로 인해, 28.1 분 (실행 3, 피크 3) 내지 27.6 분 (실행 2, 피크 2) 단지 약간 감소되었다. 돼지 장내 점막으로부터 헤파린은, 17 내지 19 kDa의 범위에서 대부분의 쇄를 가진, 6 내지 30 kDa 범위의 분자량을 갖는 다중음이온 쇄의 혼합물이다. 이 결과는 사량체 트립타제상의 헤파린의 안정화 효과가 또한 Fab hu31A.v11에 의해 중화 또는 파괴되고; 심지어 고농도 100 μg/ml의 헤파린이 사량체의 완전한 해리로부터 Fab hu31A.v11을 방해할 수 없다는 것을 나타낸다. 참고 도 3A.
용액에서 사량체 트립타제에 대한 huE104.v1 및 huE104.v2 Fabs의 결합 화학양론은 또한 결정되었다. 활성 사량체 트립타제는 각각의 프로토머에 2-배 몰 과잉의 Fab와 혼합되었고 복합체 형성은 평형에 도달하도록 허용되었다. 생성된 복합체 혼합물은 헤파린 없이 트립타제 SEC 완충액을 가진 SEC로 분리되었고 개별 단백질 피크의 분자량 및 체류 시간/용적은 결정되었다). 단백질을 함유하는 분획은 단백질 성분을 결정하기 위해 SDS-PAGE를 특징으로 하였다 (데이터 도시되지 않음). WT 사량체 트립타제는 MALS에 따라 tr = 26 분의 체류 시간 (참고 예를 들어, 도 3A의 피크 1) 및 120 kDa ± 0.2 %의 분자량을 가졌고, 이는 (당화 제외) 아미노산 서열에 기반된 109.537 kDa의 이론적 분자량과 일치한다.
huE104.v1 Fabs는, SEC-MALS로 결정된 경우, tr= 21.6 mL의 체류 시간 및 276.1 kDa의 분자량을 가진 WT 사량체 트립타제와 균질한 복합체를 형성하였다 (데이터 도시되지 않음). 이것은 트립타제 사량체와 이에 결합된 4 Fabs와의 복합체를 나타낼 것이다. 이 피크로부터 분획의 SDS-PAGE 분석은 Fabs 및 트립타제 프로토머의 존재를 확인하였다. 따라서, huE104.v1 Fabs는 사량체 트립타제와 안정한 복합체를 형성하였고 사량체 안정성에 영향을 주지 않았다 (데이터 도시되지 않음).
단량체성 His6-태깅된 트립타제 (도 3B, 실행 1) 또는 WT 사량체 트립타제 (도 3B, 실행 2)는 2-배 몰 과잉의 huE104.v2 Fab와 혼합되었고 각각의 복합체 혼합물은 SEC로 개별적으로 분석되었다. 각각의 크로마토그램의 제1 단백질 피크는 체류 시간 tr= 25.8 분 (도 2B, 실행 1, 피크 2) 및 tr= 26 분 (도 2B, 실행 2, 피크 3), 각각을 가졌다. 이들 2개의 제1 피크로부터 분획의 SDS-PAGE 분석은 양쪽, 트립타제 및 E104.v2 Fab가 이 피크에서 존재한다는 것을 나타냈다. 양쪽 단백질 피크는 또한 MALS로 분석되었고 68 kDa ± 3%의 분자량이 결정되었고, 이는 1 Fab에 결합된 1 트립타제 단량체를 포함하는 복합체를 반영한다. 각 실행의 제2 피크는 tr=31.6 분 분 (실행 1, 피크 6) 및 tr=31.8 (실행 2, 피크 7), 각각의 체류 시간을 가졌고, SDS-PAGE로 결정된 경우, Fab huE104.v2만을 함유하였다. 양쪽 SEC 실행의 크로마토그램이 실제로 겹쳐서, huE104.v2 Fab 결합이 WT 사량체 트립타제를 단량체로 해리시킨다는 것을 나타내는 것은, 체류 시간이, 사량체 트립타제 또는 His-태깅된 단량체성 트립타제가 복합체 형성에 사용되었는지 여부와 독립적으로, 실제로 동일하였기 때문이었다.
사량체 트립타제가 100 μg/mL 헤파린의 존재 하에서 과잉 huE104.v2 Fab와 재차 혼합되었고 작동 완충액으로서 TNH 완충액에서 SEC로 분석되었던 경우 (실행 3), 3 단백질 피크는 관측되었다: 제1 피크는 WT 사량체 트립타제 단독 (tr= 26 분, 예를 들어, 도 3A, 피크 1)보다 훨씬 더 짧은 체류 시간 (tr= 21 분, 도 3B, 실행 3, 피크 1)을 가졌다. 제2 피크는 tr= 27.2 분 (도 3B, 실행 3, 피크 4)의 체류 시간을 가지고 마지막 것은 tr= 31.2 분 (도 3B, 실행 3, 피크 5)의 체류 시간을 갖고, 이는 Fab 단독을 나타낸다. SDS-PAGE 분석은 양쪽 트립타제 및 Fab가 피크 1 및 4에서 존재한다는 것을 나타냈고, 여기서 피크 1은 huE104.v2 Fabs에 의해 결합된 활성 사량체를 함유하고, 피크 4는 huE104.v2 Fab에 의해 결합된 트립타제 단량체를 함유한다 (데이터 도시되지 않음). 이것은 100 μg/mL 고농도의 헤파린의 존재 하에서, 사량체 트립타제의 단지 일 분획이 피크 4에서처럼 huE104.v2 Fab에 의해 해리되었고, 반면에 다수의 트립타제가 피크 1에서 hu104.v2 Fabs에 결합된 사량체 트립타제로 남아있었다는 결론으로 이어졌다. 요약하면, huE104.v1 Fab는 검출가능한 억제 활성을 보여주지 못했고, 반면에 huE104.v2 Fab는 트립타제 사량체를 완전히 해리시켰다. hu31A.v11 Fab 또는 huE104.v2 IgG와 달리, 그러나, 사량체를 해리시키는 huE104.v2 Fab의 능력은 고농도의 헤파린에 의해 부분적으로 중화되었다. 따라서, 이들 데이터에 기반하여, 우리는 hu31A.v11 Fab가 고농도의 헤파린이 있든 없든 트립타제 사량체를 해리시킬 수 있고, huE104.v2 Fab가 고농도의 헤파린의 부재 하에서 트립타제 사량체를 해리시킬 수 있음을 결론진다.
각각의 트립타제 단량체는 촉매적 3잔기의 동일한 세트를 갖고, 4 단량체는 기질이 진입하는 중간 기공을 직면하는 4 촉매 부위와 사량체를 형성하도록 조립한다. 참고 Pereira 등, 상동. Pereira 등은 활성 부위를 차단시킴으로써 소분자 트립타제 억제제의 디자인을 논의한다. 개발 중인 몇 개의 소분자 트립타제 억제제는 불량한 선택성 또는 불량한 생체이용률로 인해 중단되었다. 참고, 예를 들어, Cairns, J.A., 2005, Pulmonary Pharmacology & Therapeutics 18:55-66.
야생형 사량체 트립타제는 함께 공유적으로 유지되지 않았고 생리적 병태 하에서 단량체로 해리할 수 있다 (Schwartz 등 J. Biol. Chem. 261:7372-7370, 1986; Alter 등 BioChem. J. 248:821-827, 1987; Schwartz 등 J. Immunol. 144:2304-2311, 1990). 성숙한 트립타제가 사량체로서 높은 효소적 활성을 입증하고, 생리적으로 관련된 병태 하에서 단량체로서 불활성인 것이 보고되었다 (Schwartz 등, J. Biol. Chem. 261:7372-7379, 1986). 본 명세서에 나타난 데이터는 양쪽 hu31.v11 및 huE104.v2가 트립타제 단량체에 결합하고, 적어도 저농도의 헤파린에서 사량체를 단량체로 해리시키고, 해리후, 단량체에 결합된채 남아았다는 것을 입증한다. 또한 단량체성 트립타제가 특정 조건 하에서 효소 활성일 수 있다는 것이 보고되었다 (Fukuoka 등 J. Immunol. 176:3165, 2006; Fajardo 등, 2003, BioChem. J. 369:603-610). 상기 관찰은, 혈청 불활성 단량체가 단량체에 결합하는 해리 항체에 대한 주요 싱크로서 작용할 수 있기 때문에, 항-트립타제 항체 해리가 활성 부위 차단 억제제 예컨대 사량체-안정화, 활성 부위 차단 항체보다 열등할 수 있는지의 질문을 제기한다. 그리고 사량체-안정화, 활성 부위 차단 항체는 단량체가 특정 조건 하에서 효소 활성일 수 있다면 치료제로서 더욱 유리할 수 있다.
우리는 약동학적-약력학적 (PKPD) 모델을 사용하는 인실리코 실험에서 사량체-안정화, 중화 항체에 비교하여 사량체-해리 항체의 효능을 먼저 조사하였다. 모델은 순환에서 그리고 폐 조직에서 사량체 트립타제 생성, 해리, 및 청소능, 뿐만 아니라 항-트립타제 항체의 PK 및 결합 효과를 시뮬레이션하기 위해 Simbiology ® 소프트웨어 (Mathworks Inc, Cambridge MA)로 개발되었다. 2 유형의 항체는 고려된다: (1) 결합시 빠르게 사량체를 해리시키는, 뿐만 아니라 단량체를 결합시키는 해리 항체; 및 (2) 활성 사량체만을 결합시키고 그의 기질에 접근을 차단시킴으로써 그의 활성을 중화시키고, 뿐만 아니라 사량체의 반감기를 확장시키는, 안정화 사량체-특이적 항체.0.2 nM의 KD를 가진 사량체-해리 항체는 매 4 주 피하로 투여된 300 mg의 가설 용량 레지멘 하에서 시뮬레이션되었다. 우리는 항체의 10% 폐 분배 계수를 추정하였다. 기준선 시나리오에 대하여, 우리는 혈청에서 4 ng/ml 총 트립타제 그리고 조직 구획에서 10 ng/ml 총 트립타제를 추정하였고, 고-트립타제 시나리오에 대하여, 우리는 10 ng/ml 혈청 트립타제 및 40 ng/ml 조직 트립타제 수준을 추정하였다. 단량체로의 생리적 사량체 해리에 대한 상대 속도 상수 그리고 각 종의 청소능은 총 트립타제 풀 내에서 단량체 대 사량체의 8:1 비를 초래한다.
어느 한쪽 해리 또는 안정화 항체의 300 mg sc q4w의 시뮬레이션된 용량 레지멘에 대하여, 도 4A 좌측 패널은 기준선 시나리오 하에 폐에서 양쪽 총 항체 및 자유/미결합된 항체의 항체 농도를 도시하고, 우측 패널은 양쪽 단량체 및 사량체에 대하여 전처리 수준에 비해 상응하는 폐 (자유) 트립타제 수준을 도시한다. 결과는 KD=0.2nM을 가진 해리 항체 (최상부 패널)에 대하여, 대부분의 폐 항체가 단량체 및 사량체에 결합에도 불구하고 적절한 약물 이용가능성을 나타내는 자유롭게 남아있음 (최상부 좌측 패널)을 시사하고; 결과는 추가로 해리 항체가 사량체 (활성) 트립타제에서 90% 초과의 지속된 감소를 달성할 것을 나타낸다 (최상부 우측 패널). 　안정화 항체 (최하부 패널)에 대하여, 거의 모든 항체는 자유지만 (최하부 좌측 패널); 사량체에서 감소는 80%에서 또는 초과로 겨우 유지된다.
안정화 항체의 사량체-특이성이 높은 총 트립타제 조건 하에서 유리하게 고려될 수 있기 때문에, 이들 시뮬레이션은 더 높은 트립타제 시나리오 하에서 반복되었다 (도 4B). 이들 조건 하에서, 더 많은 해리 항체는 불활성 단량체성 트립타제에 의해 결합되어, 더 낮은 자유 항체를 초래하고 (도 4A의 것과 도 4B의 최상부 좌측 패널을 비교한다) 그리고 해리 항체에 의해 더 적은 그러나 여전히 양호한 사량체 중화 (최소 ~80%)로 이어진다 (도 4B, 최상부 우측 패널). 그에 비해, 사량체-안정화 항체에 대하여, 단량체에 결합의 부재로 인한 더 큰 자유 항체에도 불구하고 (도 4B, 최하부 좌측 패널), 항체는, 시뮬레이션에서 안정화 항체에 대해 추정된 10-배 더 높은 친화도 (KD=0.02nM)에도 불구하고, 동일한 조건 하에서 해리 항체와 비교된 경우 더 적은 중화 (최소 ~70%)를 달성한다 (도 4B, 최하부 우측 패널). 더 적은 중화는 사량체에 대한 "저장소"로서 작용하는 결합된 표적의 더 큰 안정성 (반감기)에 기인한다. 따라서, 우리의 시뮬레이션은 해리 항체가 유망하고 시험된 상이한 시나리오 하에서 사량체-특이적 안정화 항체보다 더 양호하게 수행할 것을 예측한다. 　
우리는 다음으로 해리 항체가 상이한 항체 용량에서 사량체-특이적 안정화 항체와 비교하는 방법을 시험하였다. 도 4C는, 항체 용량 수준 (30, 100, 300mg sc q4w)의 함수로서, 양쪽 기준선 및 높은 트립타제 시나리오에서, 양쪽 유형의 항체에 대한 사량체 중화를 도시한다. 　기준선 시나리오 (도 4C, 좌측 패널)에서, 해리 항체는, 고려된 모든 용량에 걸쳐, 안정화 항체보다 더욱 사량체 활성을 일관되게 감소시킨다. 높은 트립타제 시나리오 (도 4C, 우측 패널)에서, 해리 항체는 거의 최저 용량 (30 mg)에서 사량체 중화에 대해 안정화 항체를 능가하고, 이 시점에서 2 항체는 비교가능하게 수행한다. 해리 항체 (KD=0.2nM)보다 10x 더 큰 친화도 (KD=0.02 nM)에도 불구하고 안정화 항체를 사용하여 달성된 일반적으로 더 적은 중화는 해리 항체에 비교된 안정화 항체를 사용하는 비교할만한 사량체 중화에 대하여 훨씬 높은 친화도 요건 (>10x)를 나타낸다. 양쪽 시나리오에 대하여, (90%) 사량체 중화용 최적의 용량은, 안정화 항체에 대하여 추정된 10x 더 큰 친화도에도 불구하고, 안정화 항체보다 해리 항체에 대하여 더 낮다 (결과 도시되지 않음). 따라서, 모델 하에서, 해리 항체는, 시험된 용량 범위 및 혈청 및 폐 트립타제 농도에 걸쳐, 10x 더 높은 친화도를 갖는 안정화 항체를 능가 또는 적어도 매칭할 것이다. 또한, 우리는 본 명세서에서 hu31A.v11 및 huE104.v2 IgG가 모든 트립타제 활성을 완전히 억제시킨다는 것을 실증하였다. 참고 도 2A 및 표 5.
우리가 아는 바로는, 치료 용도로 개발된 트립타제 사량체 해리 항체의 임의의 예는 없었다. 급성 천식 폐를 포함하는 질환 조직의 염증성 유전자좌가 대조군 대상체에 비교된 경우 산성인 것이 공지된다; 참고, 예를 들어, Hunt 등 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 161:694-699, 2000; Steen 등 J. Neuroscience 15:3982, 1995; Bellocq 등 J. Biol. Chem. 273:5086, 1998; 및 Lardner J. Leukocyte Biol. 69:522, 2001). 공개된 데이터는 쥣과 단클론성 항-트립타제 항체 B12가 중성 pH에서 인간 트립타제 베타를 중화시키지만 산성 pH 6에서 인간 트립타제 베타 활성을 효소적 검정으로 중화시킬 수 없다는 것을 보여주었다 (참고 Fukuoka 등 J. Immunol. 176:3165, 2006). 따라서, 우리는 양쪽 중성 pH에서 그리고 산성 pH에서 피브리노겐 절단시 인간 트립타제 베타의 활성을 억제시키는 그들의 능력에 대하여 항체 hu31a.v11 및 huE104.v2를 시험하였다.
간단히, 인간 트립타제 베타 사량체 (1.0 μg/mL)는 실온에서 pH 6.0 또는 7.5에 TNH 완충액 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mg/ml 헤파린)에서 30 분 동안 시험된 항체로 사전인큐베이션되었다. 혼합물은 그 다음 하기로 인큐베이션되었다: 5 μg 인간 피브리노겐 기질 (Haematologic Technologies, Inc., Cat.No. HIC-0150R) 2.5 시간 동안 37 ℃에서. hu31A.v11 Fab, huE104.v2 Fab, 및 B12 mIgG1은 200 μg/mL에서 각각 시험되었다. 절단 생성물은 SDS-PAGE 및 쿠마씨 블루 염색으로 분석되었다.
도 5A 및 5B에서 나타낸 바와 같이, 인간 트립타제 베타 1은 양쪽 pH 6 및 7.5에서 피브리노겐 알파 및 베타 쇄를 절단시켰다 (레인 1, 피브리노겐 단독을, 레인 2, 피브리노겐 플러스 트립타제 베타 1과 비교한다). 항체 hu31A.v11 Fab는 양쪽 pH 6 및 pH 7.5 (레인 3)에서 인간 트립타제 베타를 억제시켰고, 반면에 huE104.v2 Fab는, 0.1 mg/ml의 고농도의 헤파린의 검정 조건 하에서, 하지 않았다 (레인 5). 레인 6은 B12 mIgG1 단독이었다. 피브리노겐 알파 쇄에서 감소는 트립타제 단백질분해 활성을 나타낸다. 피브리노겐 베타 쇄는 또한 절단되지만, 베타 쇄 절단은 겔 상에서 불명확해지는 경향이 있다. 알파 쇄의 강도는 따라서 정량화되었고 도 5A 및 5B의 최하부 패널에서 나타났다. 따라서, hu31A.v11 Fab는 pH 6 및 7.5에서 트립타제 활성을 억제시켰고, 반면에 huE104.v2 Fab는 높은 헤파린 농도의 검정 조건 하에서 억제성이지 않았다.
IgG 형식 항체 (hu31A.v11 IgG4 및 huE104.v2 IgG4)의 억제 활성은 또한 pH 6, 7, 또는 8에서 TNH 완충액내 1 nM 트립타제 및 400 μM 발색 S-2288의 존재 하에 억제 검정에서 기질로서 S-2288 펩타이드를 사용하여 평가되었다. 이 실험에서 헤파린의 최종 농도는 약 95 μg/ml이었다. IgG 형식에서 양쪽 hu31A.v11 및 huE104.v2는 pH 6, 7, 및 8에서 트립타제 활성을 완전히 억제시켰다 (데이터 도시되지 않음).
따라서, hu31A.v11 IgG 및 huE104.v2 IgG 양쪽은 트립타제에 고친화도로 결합하고 또한 효율적으로 생리적으로 관련된 병태 하에서 트립타제-연관된 장애 예컨대 천식에 대하여 트립타제 활성을 억제시킨다. 흥미롭게도, 우리의 실험 조건에서, 쥣과 단클론성 항-인간 트립타제 항체 B12 IgG1은 또한, 공개된 결과와 반대로, pH 6에서 인간 트립타제 베타의 억제를 보여주었다 (도 5A, 레인 4). 차이는 산성 pH에서 활성화되었고 B12 억제에 저항성이었던 공개된 데이터에서 검정에 사용된 물질에서 존재하는 임의의 잔존 비-트립타제 프로테아제 활성에 기인될 수 있다.
실시예 3: 항- 트립타제 항체의 구조적 분석
A. 31A 계열 항체
(i). X-선 결정학
야생형 사량체 트립타제는 1.5-배 몰 과잉 Fab hu31A.v11 및 2-배 몰 과잉 대두 트립신 억제제 (STI) (Roche)와 혼합되었고 10 분 동안 실온에서 인큐베이션되었다. STI는 첨가되어 결정화를 촉진시켰다. 혼합물은 그 다음 10 mM MOPS (pH 6.8), 0.5 M NaCl의 S200 칼럼 (GE Healthcare)를 사용하는 SEC에 거치게 되었다. 트립타제, STI, 및 Fab hu31A.v11의 3원 복합체를 함유하는 분획은 풀링되었고 40 mg/mL로 농축되었다.
트립타제/Fab hu31A.v11/STI의 결정은 현적에서 증기 확산 방법을 사용하여 19 ℃에서 성장되었다. 　0.1 M Tris (pH 7.5), 0.2 M 리튬 설페이트, 및 5% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 4000을 함유하는 결정화 완충액은 단백질 용액과 동등 용적으로 혼합되었다. 결정은 25% 에틸렌 글리콜을 함유하는 인공 모액에서 침지되었고 액체 질소에서 유리화되었다.
표 7은 Fab hu31A.v11/트립타제/STI의 구조에 대하여 개량 정보 및 X-선 데이터 수집을 보여주었다. 2.15 Å까지 확장하는 회절 데이터는 ALS 빔라인 5.0.2에서 육각형 격자로 수집되었다. 데이터 감소 및 스케일링은 라우에 클래스의 배정을 6/mmm로 허용하였다 (Otwinowski, Methods in Enzymol. 276, 307-326, 1997; Winn 등 Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 67, 235-242, 2011). 단위 격자 용적 및 제안된 단백질 함량에 기반하여, 단일 Fab hu31A.v11/트립타제/STI 복합체는 결정학상 비대칭 단위에서 예상되었다. 구조는 하기를 사용하여 해결되었다: 분자 대체 (McCoy 등 J. Appl.Crystallogr.40:658-674, 2007) 공간 그룹 P6222에서.각각 별개의 바디로서, 하기 검색 프로브는 사용되었다: PDB 수탁 4A6L로부터 유래된 이전에 결정된 트립타제 프로토머 (Liang 등 Bioorg.Med. Chem. Lett. 22: 1049-1054, 2012), PDB 1AVU로부터 STI (Song 등 J. Mol. Biol. 275:347-363, 1998), PDB 1FVC로부터 CDR 루프의 박리된 Fv 단편 (Eigenbrot 등 J. Mol. Biol. 229:969-995, 1993), 및 PDB 1FVD로부터 불변 영역. 일부 절제된 개량 후 (Murshudov 등 Acta Crystallogr.Sect.D-Biol. Crystallogr. 67:355-367, 2011), 전자 밀도 맵은 Fab 단백질 서열의 정정 그리고 누락 잔기 및 측쇄의 투명한 밀도로의 적합화를 허용하였다 (Emsley 등 Acta Crystallogr.Sect.D-Biol. Crystallogr. 66:486-501, 2010). 물은 자동으로 첨가되었다 (Adams 등 Acta Crystallogr.Sect.D-Biol. Crystallogr. 66:213-221, 2010). 더 많은 라운드의 모델 조정 및 개량 (BUSTER 소프트웨어; Global Phasing Ltd., 2011)은 최종 모델로 이어졌다. 모델은 하기에 대하여 연속적이다: 트립타제 잔기 Ile16 - Lys244 (키모트립시노겐 넘버링), STI 잔기 Asp1 - Asp177, Fab 경쇄 잔기 Asp1 - Cys214 (카밧 넘버링) (카밧, Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda, MD, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, 1991). Fab 중쇄는 불변 도메인에서 5 아미노산 잔기 갭을 제외하고 연속적이다. 형상 상보성 통계 (Sc) (Lawrence 등 J. Mol. Biol. 234:946-950, 1993)에 대한 값은, 다른 단단히 결합하는 Fab/항원 복합체와 일치하는, 0.73이다. 최대 인터-단백질 접촉 면적은, 이들 각각이 하기를 상실함에 따라, 트립타제와 STI 사이의 것이다: 1260 Å2 용매 접근가능한 표면 (Broger C, xsae, F.Hoffman-La Roche, Basel, Switzerland, 2000) 그들의 계면에서. 그에 반해서, Fab/트립타제 접촉은, Fab의 경쇄와 중쇄 사이 고르게 분포된, 각 면에서 단지 760 Å2 이다. 결정 팩킹 접촉 4 Å 또는 그 미만은 STI, 트립타제, 및 모두 4개의 Fab 도메인 주위에서 양호하게 분포되고, 수많은 수소 결합 뿐만 아니라 소수성 접촉을 포함한다.
Figure 112019095769167-pct00009
(ii) 수소-중수소 교환 ( HDX )로 분석된 그리고 MS로 측정된 항- 트립타제 항체의 에피토프 맵핑
항체의 존재 및 부재 하에서 단량체성 트립타제의 중수소 흡수율은 항체 결합시 변형되는 구조적 영역을 결정하기 위해 측정되었다. 결합된 샘플은 트립타제 및 각각의 항체의 1:1 혼합물을 함유하였고, 제조되었고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 중수소 라벨링에 앞서 트립타제 농도는 항체-결합된 및 미결합된 샘플에서 30 μM이었다. HDX 실험은 pD 7.0에서 20 mM 히스티딘 아세테이트를 함유하는 중수소 라벨링 완충액에 샘플 15-배 희석을 포함하였다. 30 초와 1000 분 사이 대수적으로 샘플링된, 6 라벨링 시간은 3중으로 실시되었고, pH를 pH 2.5로 저하시킴 그리고 2 M 구아니디늄 클로라이드 (GdmCl) 및 0.25 M 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP)를 첨가함으로써 켄칭되었고, 이전에 기재된 바와 같이, 차가운 온라인 시스템에 주사되었다 (Mayne 등, J. Am. Soc.Mass.Spectrom.22: 1898-1905, 2011).
간단히, 샘플은 고정된 펩신 칼럼 (2.1 x 30 mm, Applied Biosystems)를 통해 먼저 통과되었고 탈염을 위하여 트랩 칼럼 (Acquity Vanguard C8)에 장입되었다. 펩타이드 단편은 그 다음 Acquity UPLC™ BEH C18 칼럼 (1.7 μm 입자 크기, 1.0 x 50 mm)를 사용하는 역상 크로마토그래피로 분리되었고 질량 분석을 위하여 질량 분광분석기 (Thermo Orbitrap Elite™, m/z 400에서 120k Hz 해상도)에 도입되었다. 크로마토그래피 이동상은 이전에 기재된 바와 같이 제조되어 중수소 역교환을 최소화시켰다 (Walters 등, J. Am. Soc. Mass Spectrom.23:2132-2139, 2012). ExMS 프로그램 (Kan 등 J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22: 1906-1915, 2011)은 중수소화된 펩타이드를 동정하는데 그리고 추출된 이온 크로마토그램을 제조하는데 사용되었고, 그 다음 인하우스 파이씬 스크립트로 분석되었다 (Walters 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:18898-18903, 2013). 이들 스크립트는 축퇴 전하 상태를 조합하고, 동위원소 분포를 이항식으로 맞춤화하고, 평균적으로, 각각의 펩타이드에 의해 운반된 중수소의 수를 추출한다.
(iii) 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법 (LC/MS)에 의한 온전한 질량
(트립타제 및 이의 돌연변이체를 포함하는) 정제된 단백질은 0.1% 트리플루오로산성 산 (TFA) (Thermo, Rockford, IL)로 산성화되었고 10 μM의 최종 농도로 희석되었다. 샘플은 Agilent 1260 Infinity 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)-Chip Cube Interface (Agilent, Santa Clara, CA)와 커플링된 Agilent 6520 정확한-질량 사중극자 비과시간 (Q-TOF)에서 분석되었다. 단백질은 유기 용매 B (98% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)에 대한 수성 용매 A (97% H2O, 3% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)의 10 분, 5-80% 구배와 40 nL/분 유량으로 PLRP-S 150 mm x 75 μm 칼럼에서 역상 HPLC로 분리되었다. 데이터는 MassHunter® Workstation (Agilent, Santa Clara, CA)로 수집되었고 미가공 질량 스펙트럼은 디콘볼루션되어 온전한 질량 데이터를 생성하였다. 주요 피크는 61764.4 Da 및 63152.9 Da에서 관측되었다. 다중 GlcNAc (203 Da) 질량의 첨가는 또한 관측되었다.
(iv) 결과
인간 트립타제의 결정 구조는 사량체의 각각의 단량체가 하기에 의해 기재된 프로토머 명명법에 따라 6개의 루프 분절을 통해 2개의 상이한 계면: 큰 계면 (프로토머 A/D와 B/C 사이) 또는 작은 계면 (프로토머 A/B와 C/D 사이)에서 그의 이웃을 접촉한다는 것을 보여준다: Pereira 등 Nature 392:306-11, 1998 (이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입되어 있음). 각각의 프로토머의 6개의 표면 루프는 활성 부위를 둘러싸고 인터모노머 접촉에 참여한다 (Pereira, 상동). 이들 중에서, 147 루프, 70-80 루프 및 37 루프는 작은 계면의 상호작용에 참여하고, 173 플랩, 97 루프 및 60 루프는 큰 계면 상호작용에서 중요하다. 작은 계면이 단지 소수성 상호작용을 포함하는 반면, 큰 계면은 소수성 상호작용에 더하여 몇 개의 극성, 충전된 상호작용을 포함한다. 헤파린은 추가로, 2개의 인접한 프로토머 A/B 및 C/D에 미치는 양으로 하전된 잔기에 비-공유적으로 결합함으로써, 사량체의 전단점인 것으로 믿어지는, 작은 계면을 안정화시킨다. 참고 Pereira 상동. 자연적으로, 작은 계면은, 이어서 큰 계면에 의해 유지된 이량체가 해리되는, 사량체의 전단점이다. 트립타제의 반감기는 전신 과민증의 발달 후 인간 혈액내 순환에서 약 2-3 시간이다 (참고, 예를 들어, Schwartz 등 J. Clin.Invest. 83:1551-1555,1989). 사량체의 정상 반감기는 약 30 분이다.
우리는 트립타제 사량체를 함께 보유하는 작은 또는 큰 단백질 계면이 트립타제에 hu31A.v11 또는 huE104.v2 결합시 탈안정화되는지를 결정하였다. Pereira 등 상동에 의해 기재된 프로토머 명명법에 따라 어느 한쪽 큰 계면 (프로토머 A/D와 B/C 사이) 또는 작은 계면 (프로토머 A/B와 C/D 사이)에서 분자간 디설파이드 결합을 통해 사량체에서 2개의 인접하는 프로토머의 공유결합을 초래하였던 2개의 트립타제 돌연변이체는 생성되었다. 따라서, 작은 계면의 해리가 공유 디설파이드-연결된 이량체 형성으로 인해 방해되는 경우, 큰 계면의 해리는 여전히 허용된다. 반대로, 큰 계면의 해리가 공유 디설파이드-연결된 이량체 형성으로 인해 방해되는 경우, 작은 계면의 해리는 여전히 허용된다.
작은 계면에서 Tyr75 그리고 큰 계면에서 Ile99 (키모트립시노겐 넘버링, 도 7)은 시스테인으로 개별적으로 돌연변이되었다. 이들 부위는 이들이 사량체의 준 2-배 대칭으로 인해 이들 계면에서 자체 직면하기 때문에 선택되었다 (Sommerhoff 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10984-91, 1999). PyMOL 소프트웨어를 사용하여 Tyr75 또는 Ile99의 시스테인으로의 인실리코 대체는 각각의 대향하는 시스테인의 티올 사이 2.4 Å 및 3.2 Å의 각각의 거리를 보여주었고, 이는 어느 정도 2.05 Å의 전형적인 디설파이드 결합 길이 초과이다. 그럼에도 불구하고, 2개의 생성된 사량체 돌연변이체는 발현되었고 정제되었고 트립신분해 펩타이드 MS 분석으로 결정된 바와 같이 각각의 계면 사이 형성된 디설파이드 결합을 함유하였다. 또한, 양쪽 돌연변이체는 또한 효소 활성이었지만, 야생형 사량체 트립타제에 비교된 경우 촉매적 효율 (kcat/KM)의 약 절반이었다 (표 8).
Figure 112019095769167-pct00010
hu31A.v11 Fab 또는 huE104.v1 Fab와 복합체화된 이들 돌연변이체의 크기는 분석되었다. 트립타제 돌연변이체 Y75C 및 I99C은, 야생형 트립타제에 대하여 상기 기재된 바와 같이, 복합체 형성을 위하여 2-배 몰 과잉의 Fab hu31A.v11과 각각 혼합되었고, 크기 배제 크로마토그래피로 분석되었다. 비교용 참조로서, 야생형 사량체 트립타제는 항체 huE104.v1로부터 Fab와 복합체화되었고, 이는 트립타제에 특이적으로 결합하지만, 사량체를 해리시키지 않고, 높은 항체 대 사량체 비에서 억제 활성을 상실한다. huE104.v1 Fab와 복합체화된 야생형 사량체 트립타제는 21.6 분의 체류 시간을 가졌다 (도 6A, 참조 피크). 이 복합체의 SEC-MALS 분석은, 4 결합된 Fabs와 1 트립타제 사량체를 포함하는 복합체를 나타내는, 276.1 kDa의 분자량을 결정하였다.
Fab hu31A.v11은 25.6 분 (도 6A, 실행 2, 피크 1) 및 23.9 분 (도 6A, 실행 3, 피크 2), 각각의 체류 시간을 가진 사량체 트립타제 돌연변이체 Y75C 및 I99C와 복합체를 형성하였다 (도 6A). 양쪽 체류 시간은 참조 복합체의 것보다 길어서, 양쪽 사량체 돌연변이체가 Fab hu31A.v11과 복합체 형성시 그들의 각각의 공유결합된 이량체로 해리시킨다는 것을 나타낸다. 각각의 피크로부터 샘플은 수집되었고 SDS-PAGE로 분석되어 각각의 피크에서 종을 확인하였다 (도 6B). 이들 용출된 단백질 피크의 SDS-PAGE 분석은 양쪽 Fab hu31A.v11 및 각각의 트립타제 이량체가 동일한 분획에서 존재하였다는 것을 보여준다 (도 6B). 실행 4의 피크 3 (28.1 분의 Tr) 및 피크 4 (31.6 분의 Tr)은 Fab hu31A.v11, 및 과잉 Fab, 각각과 복합체화된 WT 단량체를 제시하였다. 소량의 피크 3 샘플은 SDS PAGE에서 피크 4 샘플에 운반되었다. Fab hu31A.v11과 복합체에서 양쪽 트립타제 돌연변이체는 참조 피크보다 더 긴 체류 시간으로 실행하여, 양쪽 큰 및 작은 계면이 Fab hu31A.v11 결합시 탈안정화되는 것을 나타낸다. 이 탈안정화는, 야생형 트립타제 사량체에 대하여 관측된 바와 같이, 사량체 해리를 초래하여, 이는 궁극적으로 트립타제의 단백질분해 활성을 비활성화시킨다. B12 Fab는 또한 양쪽 돌연변이체 사량체를 탈안정화시켰다 (데이터 도시되지 않음).
성숙한 인간 트립타제 베타 1에 인간화된 항-트립타제 항체 hu31A.v11의 결합은 2.15 Å 해상도에서 hu31A.v11의 Fab 단편과 트립타제 사이 분자 복합체의 구조를 결정하기 위해 X-선 결정학을 사용하여 연구되었다. 결과는 하나의 hu31A.v11 Fab와 상호작용하는 하나의 트립타제/STI (대두 트립신 억제제) 복합체를 함유하는 결정학상 비대칭 단위이었다. STI는 결정화의 목적을 위하여 포함되었다.
에피토프의 하나의 정의는 hu31A.v11 Fab의 임의의 원자의 4 Å 이내인 트립타제 아미노산의 세트이다. 프로그램 PyMOL은 에피토프를 찾는데 사용되었다. 트립타제 폴리펩타이드 쇄에서 아미노산 잔기는 상동성 단백질에 걸쳐 비교를 허용하기 위해 순차적인 넘버링을 벗어나는 관례 (키모트립시노겐 넘버링)에 따라 넘버링될 수 있다. 이 트립타제 잔기 넘버링 체계와 단순 순차적인 반응식 사이를 번역하는 표는 제공된다 (도 7). 아래 트립타제 잔기는, 괄호내 유전자-순차적인 넘버링 체계가 있는, 관습에 따라 명명된다.
트립타제 상에서 hu31A.v11의 에피토프는 하기 잔기를 포함한다: H36, Q50, V60c, K60d, D60e, L61, A62, A63, R65, P84, V85, S86, R87, E109, E110, P111 (키모트립시노겐 넘버링, 하기의 H51, Q67, V80, K81, D82, L83, A84, A85, R87, P103, V104, S105, R106, E128, E129, 및 P130, 각각에 상응함: 서열번호:71). 참고 도 8. 트립타제의 60s, 80s, 및 100s 루프의 잔기는 Fab hu31A.v11과 긴밀한 접촉이고, 반면에 His36 및 Gln50 잔기는 Fab와 상호작용의 주변에서 더하다. 참고 또한 Pereira 등, 상동. Fab-트립타제 접촉은, Fab 경쇄 (Val30, Thr31, Tyr32, Tyr34, Arg50, Tyr90, His92, Ser93, Tyr94) 및 중쇄 (Phe50, Ser52, Gly53, Ser54, Ser55, Thr56, Tyr58, Arg95, Tyr97, Asp98)로부터 동등 기여로, 용매 (각 면)으로부터 760 Å2를 배제한다. 상기 기재된 에피토프 잔기가 또한 다른 31A-유래된 항체에 적용할 거이 고려된다.
3원 복합체로부터 Fab/트립타제 이량체가 야생형 사량체로부터 트립타제 프로토머 A 및 D상에 겹쳐 놓여진 경우 (Pereira 등 상동), 우리는 2개의 Fabs가, 사량체 평면에 거의 수직인, 사량체의 같은 면에 위치하는 것을 알아내었다 (도 9). 프로토머 B 및 C에 대하여 이 공정의 반복은 2개의 Fabs를 사량체의 반대 측에 위치시킨다. 현저히, 이들 결과는, Fab가 사량체 트립타제와 복합체로서가 아니고 SEC상의 단량체성 트립타제와 1:1 복합체로서 용출한다는 사실과 일치하는, Fab 경쇄 사이 입체 충돌을 강조한다 (도 9).
사량체 트립타제는, 경시적으로 효소적 활성에서 붕괴 및 용액내 원형 2색성 (CD) 스펙트럼에서 변화로 모니터링된 바와 같이, 함께 공유적으로 유지되지 않고 생리적 병태 하에서 단량체로 해리할 수 있다 (Schwartz 등 J. Biol. Chem. 261:7372-7379, 1986; Schwartz 등 J. Immunol. 144:2304-11, 1990). 사량체의 각각의 프로토머에 hu31A.v11 (Fab 또는 IgG)의 결합은 트립타제에 결합된 경우 Fabs의 입체 충돌로 인해 사량체의 해리를 촉진 및 가속화시킬 것이고 임의의 사량체 재-회합을 방해할 것이다. 따라서, 트립타제는 hu31A.v11 결합에 의해 야기된 각각의 프로토머에서 알로스테릭 변화로 인해 더욱 신속 방식으로 불활성 단량체를 해리시키고 효소적으로 만든다. 사량체에서 슈도-2-배 대칭 때문에, 작은 및 큰 계면을 구성하는 거의 모든 상호작용은 2회 실존한다. 이것은 또한 hu31A.v11 결합에 의해 야기된 트립타제 구조에서 각각의 미묘한 변화가 각각의 계면에서 2회 발생하고, 그것에 의해 탈안정화를 강력하게 한다는 것을 의미한다.
트립타제와 Fab hu31A.v11의 복합체 구조는, 큰 계면인, 60s 루프에서 유의미한 변화를 나타낸다. 특히, hu31A.v11 Fab에 의해 결합된 경우, 잔기 Val60c (하기의 Val80에 상응함: 서열번호:71)은 미결합된 트립타제 구조에서 발견된 그의 위치에 비교된 경우 측쇄에서 상당한 쉬프트를 갖는다. 미결합된 트립타제 사량체에서, 인접하는 프로토머로부터 Tyr173d는 잔기 Val60c 및 Val90 (도 10, 둘 모두는 키모트립시노겐 넘버링에 의한 것임, 참고 또한 도 7)에 의해 창출된 소수성 포켓에 참가한다. 항체 복합체에서, Val60c의 구조적 변화는 그 포켓에 Tyr173d 결합을 방해하는 입체 장애를 창출한다. 트립타제에 hu31A.v11의 결합이 60s 루프의 일부 및 가까운 잔기와 상호작용을 포함하기 때문에, Val60c에서 이 구조적 변화에 대하여 책임질 수 있다. 이것은 큰 계면의 탈안정화로 이어질 수 있고 따라서 트립타제 사량체의 불활성 단량체로의 해리를 증강시킬 것이다.
하기의 이미다졸 고리: His36 (키모트립시노겐 넘버링; 하기의 His51에 상응함: 서열번호:71) (트립타제내)는 Fab hu31A.v11과 소수성 상호작용을 하여, 미결합된 사량체 구조에서 트립타제 프로토머에 비교된 경우 트립타제 잔기 His36, Pro37a, 및 Tyr37b의 30s 루프에서 Cα 미량 변화를 초래한다. 이것은 Tyr37b 측쇄의 형태에 영향을 주어서, 이로써 작은 계면에서 Pro152 및 Pro152a를 포함하는 인접하는 프로토머와 핵심 소수성 상호작용은 약화될 수 있다 (도 11, 모두는 키모트립시노겐 넘버링에 의한 것임, 참고 또한 도 7).
hu31A.v11 Fab와 2개의 상이한 디설파이드-잠금된 트립타제 변이체 Y75C 및 I99C의 복합체 형성 연구는 사량체 트립타제의 큰 및 작은 계면 둘 모두가 항체에 의해 탈안정화되는 것을 보여준다. 큰 및 작은 계면의 핵심 상호작용 잔기에 구조적 변화 그리고 사량체에 결합된 Fabs의 입체 충돌 둘 모두는 사량체 해리에 기여에서 유사하게 중요하다. 이들 2개 인자는 상호 배타적이지 않다. 인실리코 실증된 사량체의 각각의 프로토머에 결합된 경우 hu31A.v11 Fabs에서 기인하는 입체 장애는 단일 IgG로부터 2 Fabs가 전형적으로 1 사량체에 동시에 결합할 수 없다는 것을 나타낸다 (도 9). 이 관찰은 hu31A.v11의 Fab 및 IgG 둘 모두가 사량체를 해리시킬 수 있고, 그것에 의해 효소적 활성을 억제시킨다는 발견과 일치한다. 이 관찰은 또한 항체에 의해 결합된 해리된 단량체가 사량체를 형성하기 위해 재조립될 것 같지 않다는 것을 나타낸다.
다음으로, hu31A.v11 Fab에 결합된 단량체성 트립타제의 HDX 실험은 용액내 결합 상호작용을 연구하기 위해 수행되었다. 경시적으로 HDX의 정도는 질량 분광분석법으로 모니터링되었다. 이 방법이 hu31A.v11의 결합 에피토프를 나타내는 정보를 제공하는 한편, 항체 결합 에피토프로부터 떨어져서 발생할 수 있는 형태적 안정성에서 알로스테릭 변화를 또한 검출한다. hu31A.v11이 결합되었던 트립타제에서 더 느린 변화를 보여주었던 아미드 결합은 잔기 25-29, 40-41, 57-59, 60-61, 66-67, 83-88, 108-110, 및 231-233 (키모트립시노겐 넘버링)의 영역에서 위치하였다. 결정 구조에서 나타낸 바와 같이 Fab hu31A.v11의 4 Å 이내 트립타제 잔기와 이들 영역을 비교하는 경우, 60s, 80s 및 100s-루프에서 결합 에피토프 잔기를 확인하는 양쪽 방법 사이 고도의 중첩은 관측되었다 (도 8). 1차 트립타제 서열의 20s, 40s, 50s, 및 230s 영역에서 HDX에 의해 확인된 다른 구역 예컨대 위치는 결정 구조에 따라 항체와 직접 접촉하지 않지만, hu31A.v11의 존재 하에 형태적 동력학에서 감소를 보여준다. 흥미롭게도, 잔기 57-59는 hu31A.v11 결합에 의해 알로스테릭하게 영향받는 것처럼 보인다. 이 짧은 α-나선은 세린 프로테아제내 촉매적 3잔기의 일부인 그리고 촉매적 활성에 필수적인 잔기 His57 (키모트립시노겐 넘버링)을 함유한다. HDX에 의해 확인된 잔기 40 및 41이 hu31A.v11과 직접 접촉하지 않아도, 이들은, 상기 논의된 바와 같이 작은 계면에 대하여 중요한 접촉 잔기인, 그들의 헤어핀 루프에서 항-평행한 베타-시트 디스플레이하는 Tyr37b (키모트립신 넘버링)의 일부로서 구조적 위치를 모의한다 (도 11). 이 구역에 구조적 변경은 작은 계면의 안정성에 영향을 미칠 수 있고 잠재적으로 사량체 해리로 이어질 수 있다.
HDX에 따른 그들의 구조적 동력학에서 또한 변화하는, 20s 루프 (비구조적인 루프에서 모든 잔기) 및 230s 영역 (또한 일명 230s 나선)에서 펩타이드 결합은 hu31A.v11의 결합 부위에서 멀리 떨어져 있다. HDX 실험은 구조적 동력학에서 변화를 모니터링하고, 벌크 형태내 변화 대 특정 형태의 정력적인 안정성에서 변화 사이를 식별하지 않는다. 전반적으로, 우리는 HDX 및 X-선 결정학에 의해 수득된 구조적 정보와 hu31A.v11 결합에 의해 알로스테릭하게 영향받은 확인된 추가의 잔기 사이 고도의 일관성을 알아내었다.
B. E104- 유래된 항- 트립타제 항체의 구조적 분석
(i) 물질 및 방법
huE104.v1 Fab는 huE104.v1의 결합이 사량체를 해리시키지 않기 때문에 트립타제 사량체를 가진 결정 구조를 생성하는데 사용되었다. 트립타제/huE104.v1 결정은 0.1 M Tris (pH 8.5), 0.2 M 염화칼슘, 20% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 4000 및 8% 펜타에리트리톨 에톡실레이트를 함유하는 저장소 용액과 1:1 (v/v)로 단백질을 혼합함으로써 증기 확산 방법을 사용하여 19 ℃에서 성장되었다. 　결정은 0.1 M Tris (pH 8.5), 0.2 M 염화칼슘, 35% PEG 3350을 함유하는 인공 모액에서 동결-보호되었고 액체 질소에서 플래시 냉동되었다. 회절 데이터는 Pilatus 6M 픽셀 어레이 검출기 및 0.9795 Å 파장 X-선을 사용하는 3Å 해상도까지 확장하는 단사정계 격자의 SSRL 빔라인 12-2에서 수집되었다. 데이터는 감소되었고 (Kabsch, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66:125-132, 2010; Vonrhein 등 Acta.Crystallogr.D67: 293-302, 2011) 그리고 확장되었고 (Winn 등 Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67: 235-242, 2011), 및 구조는 분자 대체로 해결되었다 (McCoy 등 J. Appl.Crystallogr.40: 658-674, 2007) (4 Fabs에 의해 결합된 트립타제 사량체를 드러내는 공간 그룹 P21에서). 분자 대체 검색 프로브는 회전 기능만을 사용하는 팔꿈치 각의 범위로 변형된 버전을 스캐닝함으로써 PDB 수탁 1FVD로부터 유래된 항체 Fab 단편 그리고 PDB 수탁 4A6L로부터 트립타제 프로토머이었다. 제한된 개량 후, 하나의 Fab 불변 영역은 1FVD로부터 단지 불변 영역을 사용하는 분자 대체 검색에서 대체되었다. 트립타제 잔기 넘버링은 키모트립시노겐 반응식으로 변화되었고 Fab-E104v1 잔기 넘버링은 카밧 반응식으로 변화되었다. 모델 및 전자 밀도 맵 점검 및 조정은 하기를 사용하여 수행되었고: Coot (Emsley 등 Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr.66:486-501, 2010) 그리고 구조는 하기를 사용하여 정제되었다: REFMAC5 (Murshudov 등 Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr.67:355-367, 2011) 및 Phenix.refine (Adams 등 Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr.66, 213-221, 2010). 데이터 수집 및 개량 메트릭스는 표 9에 나타난다. HDX 실험은 상기 기재된 바와 같이 수행되었다.
Figure 112019095769167-pct00011
(ii) 결과
함께 트립타제 사량체를 보유하는 작은 또는 큰 단백질 계면이 huE104.v2 Fab 결합시 탈안정화되는지를 결정하기 위해, 사량체 트립타제 돌연변이체 Y75C 또는 I99C (참고 상기)는 복합체 형성을 위하여 2-배 몰 과잉의 Fab huE104.v2와 혼합되었고 SEC로 분석되었다 (도 6C). huE104.v2 Fab는 사량체 트립타제 돌연변이체 Y75C와 복합체를 형성하였고 크로마토그램은 과잉 Fab를 포함하는 tr=31 분 (피크 4) 및 tr=21.6 분 (도, 6C, 실행 1, 피크 1)의 체류 시간을 가진 2 피크를 보여준다. huE104.v2 Fab는 사량체 트립타제 돌연변이체 I99C와 복합체를 형성하였고 크로마토그램은 과잉 Fab를 포함하는 tr=31 분 (실행 2, 피크 5) 및 tr=23.8 분 (도 6C, 실행 2, 피크 2)의 체류 시간을 가진 2 피크를 보여준다. SDS-PAGE 분석은 huE104.v2 Fab 및 트립타제 이량체 돌연변이체 둘 모두가 피크 1 및 2에서 존재하였고 과잉 Fab가 피크 4 및 5에서 존재하였다는 것을 보여주었다 (데이터 도시되지 않음). 비교하기 위해, WT 트립타제 사량체와 복합체에서 huE104.v2 Fab는, huE104.v2 (tr = 23.8 분, 실행 2, 피크 2)와 복합체에서 트립타제 사량체 돌연변이체 I99C보다 더 작은, Fab huE104.v에 의해 결합된 단량체를 포함하는, tr= 26 분 (도 6C, 실행 3, 피크 3)의 체류 시간을 가졌다. huE104.v2 Fab와 복합체에서 트립타제 돌연변이체 Y75C (작은 계면-잠금된 돌연변이체 사량체)는 huE104.v1의 4개의 Fabs에 결합된 WT 트립타제 사량체의 안정한, 온전한 복합체와 유사한 체류 시간을 가졌다 (참고 도 6A, 실행 1, ref 피크). 다른 한편으로, huE104.v2와 복합체에서 트립타제 돌연변이체 I99C (큰 계면-잠금된 돌연변이체 사량체)는 실행 1에서 제1 피크보다 더 작은 복합체를 나타내는 더 긴 체류 시간을 가졌다. 결과는 huE104.v2 Fab가, 사량체의 큰 계면이 아닌, 작은 계면을 해리시킬 수 있을 뿐이었음을 나타낸다. 따라서, 야생형 트립타제 사량체에 결합하는 경우, huE104.v2 Fab 결합은 작은 계면만을 해리시킨다. 실험 조건 하에서, 해리된 작은 계면은, 사량체의 재조립으로 이어질 수 있는, 높은 국소 농도 (예를 들어, 0.1 mg/ml)에서 존재하는 헤파린에 의해 빠르게 회복될 수 있다. 이 헤파린 농도는 생리적 헤파린 농도보다 실질적으로 더 높고, 이는 혈청의 약 1.5 μg/ml인 것으로 보고되었다 (참고, 예를 들어, Engelberg 등, Circulation 23:578-581, 1961 및 Davids 등 S.Afr.Med. J. 100:307-307, 2010). 저농도의 헤파린에서, huE104.v2 Fab는, IgG 형식에서 huE104.v2보다 덜 강력하여도, WT 트립타제 사량체를 완전히 해리시킬 수 있고 트립타제 활성을 중화시킬 수 있다.
트립타제에서 huE104.v2의 정확한 결합 에피토프에 추가 통찰력을 얻기 위해, 우리는 Fab huE104.v2/트립타제 복합체의 결정화를 시도하였다. 우리가 임의의 적합한 결정을 수득할 수 없기 때문에, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단리된 4 Fabs E104.v1에 결합된 WT 사량체 트립타제의 복합체는 결정화에 사용되었다. huE104.v1 및 huE104.v2는 단지 2 버니어 프레임워크 위치에서 상이하고, 반면에 HVR은 동일하다. 따라서 huE104.v1은 huE104.v2의 결합 에피토프를 설명하기 위한 양호한 대리물이었다. 성숙한 인간 트립타제 베타 1에 인간화된 항-트립타제 항체 huE104.v1 (참고 실시예 1)의 결합은 3.0 옹스트롬 (Å) 해상도에서 huE104.v1의 Fab 단편과 트립타제 사이 분자 복합체의 구조를 결정하기 위해 X-선 결정학을 사용하여 연구되었다. 결과는 각각의 Fab가 트립타제 프로토머의 단 하나와 거의 독점적으로 상호작용하는 그와 같은 방식으로 4 huE104.v1 Fabs와 상호작용하는 EGR-클로로메틸케톤과 복합체화에 의해 안정화된, 하나의 트립타제 사량체를 함유하는 결정학상 비대칭 단위이었다 (도 12A). 분자간 결정 팩킹 환경은 큰 공동을 포함하지 않고, 4Å 미만의 결정 팩킹 접촉의 중간 정도 수를 갖는다. 예를 들어, 2 huE104.v1 Fab VL 도메인은, Thr 및 Ser 쇄 그리고 기타로부터 H-결합을 포함하는, 그들의 ABDE β-가닥 겉면에서 비-결정학상 2-배 접촉을 경험한다. 몇 개의 분자간 접촉을 가진 또 다른 더 작은 영역은 중쇄 불변 도메인 (동일한 쇄의 가변 도메인에 펩타이드 연결 근처)와 인접한 경쇄 불변 도메인의 "최하부" 사이 실존한다. 더 많은 잔기 (243 대 대략 215)를 갖는 트립타제 프로토머에도 불구하고, 트립타제 프로토머 (평균 3.5)보다 Fabs (평균 12)에 대하여 팩킹 접촉에서 더 많은 잔기가 있다. 이 의미로, 결정은 Fab-Fab 분자간 접촉을 통해 적어도 부분적으로 형성된다.
huE104.v1 Fab의 3 카피는 아주 유사한 팔꿈치 각 (140˚, 138˚ 및 141˚의 가변 도메인 (VH 및 VL)과 불변 도메인 (CH 및 CL) 사이 각을 표시하였다. huE104.v1 Fab의 제4 카피는 그것의 불변 영역에 대하여 상대적 불량한 전자 밀도를 특징으로 하였고 152˚의 팔꿈치 각을 표시하였다. 상실된 용매 접근가능한 표면적으로서 계산된, 항체 항원-결합 표면적 (파라토프) (Adams 등 Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.66: 213-221, 2010) 트립타제 프로토머와 접촉에, 평균 682 Å2 그리고 경쇄에 대하여 29% 대 71%, 중쇄에 의해 지배된다. 형상 상보성 통계 (Lawrence 등 J. Mol. Biol. 234:946-950, 1993), Sc, 평균 0.76은, 단백질 항원과 항체에 대하여 최고이다. 우리 결과의 해상도는 수 구조를 알아보기에 너무 낮았지만, Sc 값은 유사하게 아주 적은 계면 수가 있다는 것을 시사한다. 비-결정학상 대칭 (NCS) 규제의 사용은 R-없음의 값에 따라 우월한 개량을 생산하였다. Fab 도메인 (VL, CL, VH 또는 CH1)의 Cα 원자의 중첩용 평균 제곱근 편차 (RMSDs)는 몇 십분의 일의 옹스트롬 정도이었다.
그들의 파트너 트립타제의 4Å 이내 항체 잔기는 4 카피와 아주 유사하였고 하기를 포함한다: 경쇄 잔기 Y29, N30, R32 (HVR-L1), R94 (HVR-L3) 및 중쇄 잔기 G31, Y32 (HVR-H1), S52, S53, A54, T56, F58 (HVR-H2) 및 P96, R97, G98, Y99, R100e (HVR-H3).
각각의 huE104.v1 Fab는 파트너 트립타제 프로토머의 매우 유사한 영역을 접촉한다. 이 에피토프는 활성 부위 기질 결합 틈으로부터 대략 90˚ 떨어져 있고, 거의 정사각형 평면 트립타제 사량체의 평면으로부터 수직 돌출하는 각각의 Fab를 배치한다. 트립타제 프로토머가 트립타제 고리 주위에서 상/하/상/하 방식으로 회합하기 때문에, 사량체로부터 "상" 돌출하는 2 Fabs 그리고 "하" 돌출하는 2 Fabs가 있다 (도 12A).
결정학상 비대칭 단위 (asu)는 대략 대칭 사량체로 조직화된 4 트립타제 프로토머를 포함한다. 4 트립타제 프로토머 각각은 (Glu-Gly-Arg-클로로메틸 케톤을 사용하는 처리로부터) 활성 부위에서 공유결합으로 변형되고 약 0.1Å의 Cα 원자에 기반하여 쌍별 rmsd와 중첩된다. 각각의 프로토머가 asu에서 4 Fabs 중 단 하나의 4 Å 이내이었다면, 각각의 트립타제 프로토머에 대한 것이고, 엄격한 대칭이 부족한, 4 huE104.v1 에피토프를 정의하는 것이 가능할 것이고, 이들 4 에피토프는 약간 상이할 수 있다. 본 명세서에서 일명 "비-파트너 Fab"인, 이와 상호작용의 벌크를 제공하지 않는 Fab의 4 Å 이내인 몇몇의 트립타제 잔기가 있다. 이것이 사실이기 때문에, 트립타제 사량체에 대하여 huE104.v1 에피토프를 정의하는 것이 또한 가능하다.
프로그램 PyMOL은, 이 실시예에서 huE104.v1 Fab의 임의의 원자의 4 Å 이내인 트립타제 아미노산의 세트인, 에피토프를 동정하는데 사용되었다. 트립타제 폴리펩타이드 쇄에서 아미노산 잔기는, 상기 기재된 바와 같이, 키모트립시노겐 넘버링 체계에 따라 넘버링될 수 있다 (도 7). 아래 트립타제 잔기는, 괄호내 유전자-순차적인 넘버링 체계와, 키모트립시노겐 넘버링 체계에 따라 명명된다.
트립타제 프로토머와 그것의 파트너 Fab 사이 정의된 4 에피토프가 있다. 모두 4개는 트립타제 아미노산 잔기의 매우 거의 동일한 세트를 함유한다. 그들 잔기는 하기이다: W38, Q50, D60e, L61, A62, R65, Q81, L82, L83, P84, V85, S86, R87, E107, L108, E109, 및 E110 (키모트립시노겐 넘버링, 잔기 W55, Q67, D82, L83, A84, R87, Q100, L101, L102, P103, V104, S105, R106, E126, L127, E128, 및 E129, 각각에 상응함, 하기의 위치에 상응하는 잔기와, 유전자-순차적인 넘버링 체계를 사용함: 서열번호:71). 잔기 L61 (하기의 L83: 서열번호:71)은 4개 중 2개가 부족하지만, 4Å 기준을 겨우 초과한다. 잔기 Q81 (하기의 Q100: 서열번호:71)은 4개 중 하나가 부족하다. 만약 이것이 아니었다면, 모두 4개는 정의 기준에 의해 동일할 것이다.
또한, 비-파트너 Fabs는 사량체에서 작은 수의 4 Å 접촉을 만든다. 프로토머 에피토프와 사량체 에피토프를 식별하는 이들 트립타제 잔기이다. 접촉된 트립타제 잔기는 하기이다: Q20 및 R187 (하기의 Q35 및 R216, 각각: 서열번호:71).
따라서, 트립타제 사량체에서 huE104.v1의 에피토프는 하기의 합계이다: 각각의 하기의 4 사례: W38, Q50, D60e, L61, A62, R65, L82, L83, P84, V85, S86, R87, E107, L108, E109 및 E110 (키모트립시노겐 넘버링, 하기의 잔기 W55, Q67, D82, L83, A84, R87, L101, L102, P103, V104, S105, R106, E126, L127, E128, 및 E129, 각각에 상응함: 서열번호:71), 플러스 Q81의 3 사례 (하기의 Q100: 서열번호:71), 플러스 Q20의 1 사례 (하기의 Q35: 서열번호:71), 플러스 R187의 3 사례 (하기의 R216: 서열번호:71). 상기 기재된 에피토프 잔기가 또한, huE104.v2를 포함하는, 다른 E104-유래된 항체에 적용할 것이 고려된다.
huE104.v1 및 v2가 동일한 CDR 서열을 가져도, 그리고 동일한 에피토프에 결합하여도, 2 변이체는 Fab에서 뿐만 아니라 IgG에서 상이하게 거동한다: huE104.v2 Fab는 사량체를 그리고 더욱 구체적으로 작은 계면에서 해리시키고, 반면에 huE104.v1 Fab는 하지 않고; IgG에서, huE104.v2는 사량체를 해리 및 불활성화시키고, 반면에 huE104.v1은 높은 항체 대 트립타제 비로 억제 활성을 상실한다. 우리는 huE104.v1 및 huE104.v2가 트립타제상의 동일한 접촉 잔기에 결합하여도, 미묘한 차이가 이들이 트립타제와 상호작용하는 방법 사이 실존한다고 가정하였다. 용액내 트립타제와 huE104.v1 및 huE104.v2 Fabs 사이 상호작용에서 차이를 확인하기 위해, HDX 실험은 어느 한쪽 huE104.v1 또는 huE104.v2에 결합된 또는 단독으로 단량체성 트립타제로 수행되었고, 경시적으로 수소-중수소 교환의 정도는 질량 분광분석법으로 모니터링되었다. 이 방법이 huE104.v1 및 huE104.v2의 결합 에피토프를 나타내는 정보를 제공하는 동안, 항체 결합 에피토프로부터 멀리 떨어질 수 있는 구조적 동력학에서 변화를 전체적으로 모니터링한다. 이들 측정은 벌크 형태에서 변화 대 특정 형태의 정력적인 안정성에서 변화 사이를 식별하지 못한다.
어느 한족 huE104.v1 또는 huE104.v2가 결합된 경우 트립타제에서 더 느린 교환을 보여주었던 아미드 결합은 잔기 25-27, 60-61, 66-68, 88 및 108-110 (키모트립시노겐 넘버링; 표 10)의 영역에 위치하였지만, 단지 huE104.v1 또는 huE104.v2에 특이적이었던 더 느린 교환을 보여주었던 아미드 결합은 또한 발견되었다. 예를 들어, 트립타제 잔기 47-50, 54-55, 85-87, 119-122, 179, 230-231, 및 244-245 (키모트립시노겐 넘버링)의 아미드 결합은 huE104.v1이 결합된 경우만 더 느린 교환을 보여주었다. 다른 한편으로, 트립타제 잔기 25, 41-43, 81-81, 및 160-162의 아미드 결합은 huE104.v2가 결합된 경우만 더 느린 교환을 보여주었다 (표 10). 더 느린 수소 교환에서 가장 흥미로운 차이는 하기의 아미드 결합이다: 잔기 81-83 (키모트립시노겐 넘버링에서 Q81, L82, 및 L83, 하기의 Q100, L101, 및 L102에 상응함: 서열번호:71) (트립타제내, huE104.v2가 결합된 경우 더 느린 교환을 단지 보여주었다). 이 구역은 작은 계면의 2 중요한 접촉 잔기 (Y74 및 Y75)가 거주하는 루프의 일부이기 대문에 특히 흥미롭다. 트립타제 잔기 81-83은 또한, 사량체 트립타제와 결정 구조 복합체에서 나타낸 바와 같이, huE104.v1의 HVR-H2와 직접 접촉하지만, HDX 결과에 따르면 이 구역이 트립타제와 huE104.v1의 상호작용보다 huE104.v2와 더 강력한 그리고 짐작컨대 상이한 상호작용을 한다고 고려된다. 80s 루프 Cα-백본 및 측쇄에 구조적 변화는, 사량체 복합체에서 2 트립타제 프로토머 사이 소수성 작은 계면에 핵심인, Y74 및 Y75의 형태에 영향을 줄 수 있다. 계면이 대칭이기 때문에, 양쪽 상호작용 프로토머로부터 잔기 Y74 및 Y75는 huE104.v2가 각각의 프로토머에 결합되는 경우 영향받고, 이는 이 계면의 임의의 변화 및 불안정을 증폭시킬 것이다.
상기 언급된 바와 같이, huE104.v1과 huE104.v2 사이 차이는 버니어 프레임워크 잔기 V71R 및 F78V이다. 항체의 중쇄내 위치 71에서 프레임워크 잔기 변화가 HVR-H2의 형태에 영향을 준다는 것이 이전에 보고되었다. huE104.v1 및 huE104.v2에서 HVR-H2의 모델링 실험은 이것이 사실임을 확인한다 (데이터 도시되지 않음). 이론에 의한 구속됨 없이, 양쪽 버니어 잔기에서 변화는 트립타제 잔기 81 내지 83과 상호작용이 상이하고 사량체의 작은 계면의 변화로 바뀌도록 HVR-H2의 형태에 영향을 줄 수 있다. 부가적으로, 구조적으로 매우 근접한, 잔기 R69 및 E70 (키모트립시노겐 넘버링)의 트립타제 아미드 결합은 또한 huE104.v2가 결합되는 경우만 더 느린 HDX를 보여준다. 이 발견은, 작은 계면의 상당한 일부를, 심지어 더욱 유사하게 구성하는, 70s 루프를 변화시킬 것이다.
결정 구조에서 나타낸 바와 같이 Fab E104.v1의 4 Å 이내 트립타제 잔기와 Fab 결합으로 인해 더 느린 HDX의 영역을 비교하는 경우, 고도의 오버랩은 양쪽 방법 사이 관측되어, 20s, 40s, 60s, 80s 및 100-루프에서 결합 에피토프 잔기를 동정하였다 (표 10). HDX에 의해 확인된 다른 구역, 예컨대1차 트립타제 서열의 110s, 160s, 179, 230s 및 245 영역에서 위치는 결정 구조에 따라 항체와 직접 접촉하지 않지만, huE104.v1 및 huE104.v2의 존재 하에 형태적 동력학에서 감소를 보여준다.
Figure 112019095769167-pct00012
이들 데이터를 요약하기 위해, huE104.v1 및 huE104.v2는 인간 트립타제 베타 1에서 동일한 HVR 서열 및 동일한 접촉 잔기를 갖는다. HDX 연구에 기반하여, 그러나, 2 항체가 상기 표적에 결합하는 방식에서 미묘한 차이는 검출되었다. huE104.v1의 중쇄 FR3 영역에서 V71 및 F78은 도 12B에서 도시된다. 도에서 나타난 바와 같이, huE104.v2내 중쇄의 FR3 영역에서 V71R 및 F78V은, huE104.v2가 결합되는 경우 Q81, L82, 및 L83 영역 (키모트립시노겐 넘버링)에서 더 느린 HDX에 의해 입증된, 트립타제에 HVR-H2의 결합 그리고 HVR-H2의 위치에 영향을 줄 수 있다. Q81, L82 및 L83 잔기는 huE104.v2가 미결합된 트립타제에 비교된 때 트립타제에 결합되는 경우 더 느린 HDX를 보여주었다. 그 결과, 인접하는 프로토머와 Y75의 소수성 상호작용은 약화된다. huE104.v1은 (VHIV 그라프트에서처럼) 위치 71에서 V 그리고 위치 78에서 F를 갖는다. 이 문맥에서, HVR-H2는 약간 상이하게 제시되고, 트립타제에 E104.v1의 결합의 효과는, 동일한 접촉 잔기에서라도, E104.v2에 비교된 경우, 작은 계면의 해리에서 약간 상이하다.
요약하면, hu31A.v11 Fab 및 IgG 둘 모두는 트립타제 사량체를 해리시킨다. 양쪽 huE104.v2 Fab 및 IgG는 또한 트립타제 사량체를 해리시킨다. Fab가 아닌, huE104.v1 IgG는 트립타제 사량체를 해리시킬 수 있다. 그러나, 높은 항체 대 사량체 비에서 huE104.v1 IgG는 억제 활성을 상실한다. 동일한 사량체에 1 초과 hu31A.v11 Fab 결합은 입체 충돌을 야기시킬 것이고, 반면에 동일한 사량체에 huE104.v2 Fabs 결합은 하지 않는다. 따라서, IgG1 또는 IgG4의 힌지 영역은 huE104.v1 IgG의 2 Fabs 배향에서 역할을 할 수 있고 사량체의 해리를 초래하는 충분한 긴장을 창출한다 (데이터 도시되지 않음). 높은 항체 대 사량체 비에서, 그러나, huE104.v1 IgG는 1가 결합제, 즉, Fab로서 사량체에 더욱 결합할 것 같고, 억제 활성을 상실한다.
C. hu31A .v11 및 huE104.v2는 인간 트립타제 베타 1에 결합하기 위해 경쟁한다.
X-선 결정학에 의해 결정된 hu31A.v11의 에피토프는 huE104.v1 및 huE104.v2의 에피토프와 실질적으로 오버랩한다. 우리는 다음으로 hu31A.v11 및 huE104.v2가 에피토프 비닝에 의해 인간 트립타제 베타 1에 결합하기 위해 경쟁하는지를 결정하였다. 에피토프 비닝은 OCTET® RED384 시스템 (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA, USA)를 사용하여 실시되었다. 간단히, 인간 트립타제 베타 1 단량체 단백질은 NHS-PEG4-바이오틴과 반응시킴으로써 Lys 잔기에서 바이오티닐화되었다. 바이오티닐화된 단량체는 동력학 완충액 (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA, USA)내 5 μg/ml로 희석되었고 스트렙타비딘 센서 끝 (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA, USA)에 고정되었다. 고정화 단계 후, 인간 트립타제 베타 1-고정된 센서는 제1 항체로 포화되었고, 10-20 μg/ml로 희석되었고, 이어서 2.5 μg/ml로 희석된 제2 항체와 결합되었다. 제2 항체에 의한 결합 신호는 2 항체가 뚜렷한, 비-중첩 에피토프에서 동시에 항원을 결합시킬 수 있다는 것을 암시하고, 반면에 결합 신호 없음은 이들이 공통 에피토프를 공유한다는 것을 암시한다. Forte Bio 데이터 분석 소프트웨어 8.1은 에피토프-비닝 매트릭스를 생성하는데 사용되었다.
아래 표 11에서 나타난 결과는 추가의 결합 신호 없음이 제1 항체로서 huE104.v2 및 제2 항체로서 hu31A.v11 또는 그 반대를 어느 한쪽으로 사용하여 검출되었다는 것을 입증한다. 완충액 후 첨가된 어느 한쪽의 항체는 추가의 결합을 초래하였다. 따라서, 2 항체는 인간 트립타제 베타 1에 결합하기 위해 경쟁한다.
Figure 112019095769167-pct00013
실시예 4: 인간화된 항- 트립타제 항체의 약동학적 (PK) 분석
인간화된 항-트립타제 항체의 약력학 (PK) 특성을 평가하기 위해, huE104.v2 또는 hu31A.v11 IgG4 항체는 C57BL/6 마우스, n = 3에 1 또는 10 mg/kg에 정맥내 (IV) 주사로 투여되었다. C57-BL6 마우스 혈청에서 항-gD IgG4, 항-트립타제 hu31A.v11 IgG4, 또는 항-트립타제 huE104.v2 IgG4의 농도는 포착을 위하여 양-항-인간-IgG (The Binding Site; San Diego, CA) 그리고 검출을 위하여, HRP-접합된-양 항-인간-IgG (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)를 사용하는 일반적인 면역글로불린 약동학적 ELISA로 결정되었다. 검정 감수성은 혈청에서 15.6 ng/mL이었다. huE104.v2 및 hu31A.v11 IgG4 항체는, 시험된 용량 범위에 걸쳐 용량-비례 및 선형 PK를 특징으로 하는, 유사한 PK를 나타냈다 (도 13 및 표 12). 또한, 양쪽 항체는 상대적으로 낮은 청소능 (~5 ml/일/kg)을 가졌고, 양쪽 항체가 단일 용량 투여후 양호하게 그리고 허용된 범위 내에서 양호하게 거동한다는 것을 시사한다. 다른 실험에서, huE104.v2 IgG1은 huE104.v2 IgG4 및 hu31A.v11 IgG4 항체와 유사하게 수행하였다 (데이터 도시되지 않음).
Figure 112019095769167-pct00014
인간화된 항-트립타제 항체의 PK 특성은 남성 사이노몰구스 원숭이 (사이노), n=3에서 또한 평가되었다. 대조군 항체 (항-gD), huE104.v2 IgG4, 또는 hu31A.v11 IgG4는 30 mg/kg에 정맥내 (IV) 주사로 투여되었다 (도 14 및 표 13). 사이노몰구스 원숭이 혈청에서 항-gD IgG4, 항-트립타제 hu31A.v11 IgG4, 또는 항-트립타제 huE104.v2 IgG4의 농도는 바이오틴-접합된 염소 항-인간 IgG (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) 포착 및 Alexa® Fluor 647-접합된 마우스 항-인간 Fc (R10Z8E9) 검출로 이루어지는 Gyrolab XP 면역검정으로 결정되었다. 검정 감수성은 혈청에서 41 ng/mL이었다. 표 13은 곡선하 면적 (AUC), 청소능 (CL), Cmax, 및 반감기 (T1/2)를 보여준다. hu31A.v11은 대조군 항-gD 항체와 유사한 약동학을 나타냈다. 대략 3 mL/일/kg의 낮은 청소능 (CL) 그리고 약 15 일의 T1/2는 허용가능한 범위 내에서 양호하엿다.
Figure 112019095769167-pct00015
실시예 5: HVR -H3 Trp100 (W100) 산화를 개선하기 위한 항- 트립타제 항체 hu31A.v11의 제형
양쪽 hu31A.v11 및 huE104.v2 항체를 평가하는 동안, hu31A.v11의 HVR-H3 영역에 존재하는 VH Trp100 잔기 (도 1)이, 예를 들어, 2,2-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH) (또한 일명 "AAPH 스트레스") 또는 주위 광 ("주위 광 스트레스")에 노출 이후, 산화에 민감하다는 것이 예상외로 발견되었다. 이 산화는 치료적 항체의 맥락에서 바람직하지 않다고 고려될 수 있다. 그러나, Trp100 잔류물은 hu31A.v11의 트립타제에의 결합에, 뿐만 아니라 억제 활성에 중요한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 하기 기재된 바와 같이, 산화를 완화시키기 위한 Trp100의 돌연변이는 감소된 결합 친화도 및 억제 활성을 가진 변이체를 초래하였다. 따라서, 특히 HVR-H3 W100에서, hu31A.v11의 산화는 산화방지제 부형제, 예를 들어, N-아세틸트립토판 및/또는 메티오닌을 함유하는 제형을 사용하여 완화되었다.
트립타제 결합 및 억제 활성에 관하여 AAPH 스트레스 및 hu31A.v11 HVR-H3 W100 (즉, VH 도메인의 위치 100에서 트립토판 잔기, 참고 도1) 산화의 효과는 평가되었다. 샘플은 40 ℃에 16 시간 동안 1 mM AAPH에서 제형화되었다. 이들 조건 하에서, W100 산화 (퍼센트 산화)에서 75% 증가율이었다. 스트레스 받은 항체는 트립신으로 소화되었고 소화된 펩타이드는 UHPLC-HRMS (초고성능 액체 크로마토그래피-고해상도 질량 분광분석법)을 거치게 되어 트립토판 산화의 백분율을 결정하였다. 간단히, hu31A.v11의 250 μg 샘플은 1시간 동안 pH 8.6에서 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드내 20 mM DTT, 360 mM Tris, 및 2 mM EDTA로 환원되었다. 환원된 샘플은 실온으로 냉각되었고 암실에서 15 분 동안 1 M 아이오도아세트산 (최종 농도, 50 mM)를 사용하여 알킬화되었다. 샘플은 그 다음 소화 완충액 (25 mM Tris, 2 mM CaCl2, pH 8.2)로 완충액-교환되었다. 완충액-교환된 샘플은 1:40 (w/w) 효소 대 항체 비를 사용하여 37 ℃에 4시간 동안 트립신으로 소화되었다. 소화는 3.0%의 최종 농도까지 100% 포름산의 첨가로 중단되었다.
10 μg의 트립신분해 펩타이드는, 하기 구배를 가진 Q Exactive 질량 분광기 시스템에 커플링된 77 ℃에 0.2 mL/분의 유량에서 실행하는, 1.7 μm, 130 Å 입자를 가진 Waters 2.1 x 150 mm, Acquity UPLC® CSH C18 칼럼에 주사되었다: 0-2 분에서 1% B (아세토니트릴내 0.1% 포름산); 7 분에서 13% B; 42 분에서 35% B; 85% B 44-46 분; 1% B 46.1 분. Q Exactive는 데이터 의존적 방식으로 작동되어, 35,000 해상도에서 200-2000 m/z로부터 전체 MS 스캔, 및 1x106의 자동 이득 제어 (AGC) 표적을 수집하였다. 8개의 가장 풍부한 이온/스캔은 17,500 해상도에서 탠덤 MS 그리고 1x105의 AGC 표적에 대하여 선택되었다. W100 산화의 상대적 정량화는 아래와 같이 생성되었다: (1) 피크 면적은 토종 트립신분해 펩타이드 및 그것의 산화된 대응물에 대하여 10% 및 초과의 상대 존재비로 전하 상태로부터 최상위 3 가장 풍부한 동위원소의 추출된 이온 크로마토그램을 통합시킴으로써 계산되었다. (2) 총 산화된 피크 면적은 산화된 및 토종 피크 면적의 합계로 분할되었고 100 곱셈되어 퍼센트 산화를 수득하였다.
표 14에서 결과는 AAPH 스트레스가 BIAcore® SPR 분석으로 측정된 바와 같이 트립타제 단량체에 hu31A.v11의 결합을 감소시켰다는 것을 보여준다 (표 14). 감소된 결합은 트립타제 사량체에 결합에 대하여 또한 관측되었다. 그에 반해서, 트립타제 단량체 및 사량체에 대한 huE104.v2의 결합은 AAPH 스트레스에 의해 영향받지 않았다 (표 14). 추가로, AAPH 스트레스는 시험관내 트립타제 효소적 활성 검정에서 hu31A.v11의 활성을 약 5-배만큼 감소시켰고, 반면에 huE104.v2의 억제 활성은 영향받지 않았다 (데이터 도시되지 않음). 요약하면, AAPH 스트레스 후, HVR-H3 W100에서 75% 산화를 가졌던, hu31A.v11 IgG4는 대략 6-배 더 높은 KD (즉, 감소된 친화도) (35% Rmax로), 및 IC50에서 5-배수 증가 (즉, 효력에서 감소)를 보여주었다. Rmax는 BIAcore® SPR 실험에서 최대 반응을 나타내고, Rmax에서 감소는 AAPH-스트레스 받은 항체의 더 적은 양이 트립타제에 결합하였다는 사실을 반영한다. 그에 반해서, AAPH 스트레스는 huE104.v2 IgG4의 결합 및 효력에 관하여, 있다면, 최소 효과를 가졌다.
Figure 112019095769167-pct00016
HVR-H3 산화를 감소시키기 위한 일 접근법에서, HVR-H3 W100에 치환을 갖는 변이체 항체는 생산되었고, 트립타제 베타 1 단량체에 이들 변이체의 결합은 평가되었다 (표 15). hu31A.v11의 잔기 W100은 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 발린 (V), 류신 (L), 또는 아르기닌 (R)로 돌연변이되었다. 놀랍게도, 모든 변이체는 트립타제 베타 1 단량체에 감소된 결합을 보여주었다. hu31A.v11 W100F 변이체는 다른 변이체에 비교된 경우 트립타제 베타 1 단량체에 대하여 최고 친화도를 가졌지만, 유사한 온-레이트 (Kon)과, 야생형 hu31A.v11에 비교하여 대략 100-배 더 빠른 오프-레이트 (Koff)를 나타냈다 (표 15). 또한, 이들 변이체는 억제 활성의 관점에서 hu31A.v11 WT보다 열등하였다 (표 15). 변이체의 일부에 대하여, 억제 활성은 본질적으로 상실되었다 (예를 들어, W100R, W100L, 및 W100V에 대하여). hu31A.v11 W100F 및 W100Y 변이체는 인간 트립타제 베타 1을 억제시켰지만, hu31A.v11 WT에 비교하여 대략 2- 내지 3-배수 증가된 IC50 값 (즉, 감소된 활성)을 가졌다. 표 15에서, "nd"는 검출불가능 또는 1 μM 초과를 나타낸다.
Figure 112019095769167-pct00017
상기 기재된 바와 같이, 구조적 연구는 HVR-H3 W100이, hu31A.v11의 접촉 잔기의 일부이도록 결정된, 트립타제의 R65 (키모트립시노겐 넘버링)과 상호작용을 포함하는, 트립타제와 다중 상호작용을 하였다는 것을 드러냈다 (참고 도 8). 위치 100에서 Trp는 W100F 돌연변이체에서 Phe보다 훨씬 더 트립타제와 상호작용하는 것으로 간주되어, 더 높은 결합 친화도 및 더 강한 억제 활성을 초래한다.
HVR-H3 W100에서 산화를 갖는 hu31A.v11의 감소된 친화도 및 억제 활성, 뿐만 아니라 트립타제 억제에서 W100의 중요성의 관점에서, 상기에서 나타낸 바와 같이, W100에서 산화를 완화시키기 위한 대안적인 전략은 추구되었다. W100 산화를 감소시키기 위한 산화방지제 부형제의 능력은 결정되었다. 일 예에서, 샘플은, 0.02% 폴리소르베이트 20, 200 mM 아르기닌 석시네이트 (pH 5.5), 및 150 mg/mL의 hu31A.v11 항체를 함유하는 제형에서 예시적인 산화방지제 부형제, 즉, 0.3 mM N-아세틸트립토판 (NAT) 및 5 mM 메티오닌 (Met)가 있든 없든, 40 ℃에 24 시간 동안 5 mM AAPH를 거치게 되었다. CDR H3 W100의 산화 수준 및 항체의 효력은 발색 S-2288 효소적 검정에 기반하여 측정되었다. 하기 표 16에서 데이터는 이 실험에서, AAPH 스트레스가, 대조군, 비-스트레스 받은 항체 샘플 (n=2)에 비교된 경우 32%만큼 효력 손실로 이어졌던, hu31A.v11 IgG4의 W100에서 38% 산화를 초래하였다는 것을 보여준다. 0.3 mM NAT 및 5 mM Met를 함유하는 제형에서 항체 조성물은 38% 내지 26 %의 감소된 산화 수준, 및 32% 내지 21% (n=2)의 감소된 효력 손실을 보여주었다. 따라서, 산화방지제 부형제 예컨대 NAT 및 Met를 함유하는 제형은 W100에서 AAPH-유도된 산화를 감소시켰고 항체 효력을 회복시켰다. 별개의 예에서, 샘플은 산화방지제 부형제가 있든 없든 동일한 제형에서 주위 광 스트레스 상태 (AAPH보다 약한 스트레스 상태인, 5000 Lux/시간에서 60 시간)을 거치게 된다. 약한 주위 광 스트레스 상태는 W100에서 6% 산화를 초래하였고, 부형제의 존재는 산화의 수준을 추가로 감소시켰다 (표 16). 주위 광-유도된 스트레스 공정에 의해 유도된 산화 수준은 항체 효력에 영향을 주지 않았다.
Figure 112019095769167-pct00018
요약하면, 이들 결과는 hu31A.v11 HVR-H3 W100이 예상외로 산화에 민감하다는 것을 보여준다. 돌연변이유발 데이터는 W100이 hu31A.v11 항체의 결합 친화도 및 억제 활성에 중요하다는 것, 그리고 이 잔기에서 시험된 변이체의 어느 것도 야생형 hu31A.v11에 비교할만한 친화도 또는 억제 활성을 갖지 않았다는 것을 보여주었다. 산화방지제 예컨대 NAT 및 Met는, 예를 들어, 장애 (예를 들어, 천식)의 치료용 약제학적 항체 제형에서, hu31A.v11 HVR-H3 W100에 관측된 예기치 못한 산화를 완화시키는데 사용될 수 있다.
실시예 6: 항- 트립타제 항체 hu31A .v11는 생체내 트립타제 활성을 억제시킨다
A. 물질 및 방법
(i) 사이노 활성 트립타제 ELISA 검정
생물학적 샘플, 예를 들어, 기관지폐포 세척 유체 (BAL)에서 사이노몰구스 원숭이 (사이노) 활성 트립타제 (사량체)의 농도는 ELISA 검정으로 결정되었다. 사이노 트립타제 D1을 인식하는 단클론성 항체는 포착 항체로서 사용되었다. 재조합 사이노 활성 트립타제 D1은 검정 표준의 제조용 원료 물질로서 사용되었다. 검정 표준, 대조군, 및 희석된 샘플은 하기로 인큐베이션되었고: 500 μg/ml 대두 트립신 억제제 (SBTI; Sigma Cat.No. 10109886001) 10 분 동안 그 다음 활성-기반 프로브 (ABP; G0353816)으로 1시간 동안 라벨링되었다. 참고 Pan 등 Bioorg.Med. Chem. Lett.16:2882-85, 2006.SBTI는 단량체에서 활성 부위에 결합하는데 사용되었고, 이는 특이적 시험관내 조건에서 형성할 수 있는 종인, 활성 단량체에 의해 야기된 임의의 배경을 감소시킨다. SBTI는 트립타제가 사량체 형태인 경우 활성 부위에 결합할 수 없다. 소분자 트립타제 억제제 (G02849855)는 20 분 동안 첨가되어 ABP 라벨링을 중단시켰다. 사량체-해리 항체 (예를 들어, hu31A.v11 IgG4)는 10 분 동안 첨가되어 양쪽 ABP-라벨링된 및 라벨링되지 않은 사량체를 해리시켰다. 이 혼합물은 1시간 동안 포착 항체를 가진 ELISA 플레이트에 첨가되었고, 1x PBST로 세정되었고, SA-HRP 시약 (스트렙타비딘-접합된 홀스래디쉬 페록시다아제, General Electric (GE) 카탈로그 번호 RPN4401V)로 2시간 동안 인큐베이션되었다. 비색계 신호는 HRP 기질, 테트라메틸벤지딘 (TMB)를 적용함으로써 생성되었고, 반응은 인산 첨가로 중단되었다. 플레이트는 기준 흡광도로 650 nm 및 검출 흡광도로 450 nm를 사용하는 SpectraMax® M5 (Molecular Devices; Sunnyvale, CA) 플레이트 판독기에서 판독되었다. 검정은 20-0.04 ng/mL (인-웰)의 보고가능한 범위를 가졌고, 검정 최소 정량화가능 농도 (MQC)는 사이노 BAL의 1:2 희석액에서 0.08 ng/mL인 것으로 결정되었다. 각각의 개별 사이노 샘플은 2중으로 단일 희석액에서 스크리닝되었다. MQC 아래로 떨어지는 최소 희석액에서 분석된 샘플은 보고가능 미만 (LTR)로서 보고되었다.
(ii) 시아노 총 트립타제 ELISA 검정
생물학적 샘플, 예를 들어, BAL에서 사이노몰구스 원숭이 (사이노) 총 트립타제의 농도는 ELISA 검정으로 결정되었다. 사이노 트립타제 D1을 인식하는 항체는 포착 항체로서 사용되었다. 사이노 트립타제 D1에 결합을 위하여 사량체-해리 항체와 경쟁 없이 사이노 트립타제 D1을 인식하는 항체는 검출 항체로서 사용되었다. 재조합 사이노 활성 트립타제 D1은 검정 표준의 제조용 원료 물질로서 사용되었다. 사량체-해리 항체 (예를 들어, hu31A.v11, IgG4)는 존재하는 임의의 사량체를 해리시키기 위해 검정 표준, 대조군, 및 희석된 샘플에 10 분 동안 첨가되었다. 이 혼합물은 2시간 동안 포착 항체를 가진 ELISA 플레이트에 첨가되었고 그 다음 1x PBST로 세정되었다. 바이오티닐화된 검출 항체는 1시간 동안 첨가되었다. 다음으로, SA-HRP 시약은 1시간 동안 첨가되었다. 비색계 신호는 TMB에 의해 생성되었고, 반응은 인산 첨가로 중단되었다. 플레이트는 기준 흡광도로 650 nm 및 검출 흡광도로 450 nm를 사용하는 SpectraMax® M5 플레이트 판독기에서 판독되었다. 검정은 20-0.02 ng/mL (인-웰)의 보고가능한 범위를 가졌고, 검정 MQC는 사이노 BAL의 1:2 희석액에서 0.08 ng/mL인 것으로 결정되었다. 각각의 개별 사이노 샘플은 2중으로 단일 희석액에서 스크리닝되었다. MQC 아래로 떨어지는 최소 희석액에서 분석된 샘플은 보고가능 미만 (LTR)로서 보고되었다.
(iii) 인간 활성 트립타제 ELISA 검정
인간 활성 트립타제 (사량체)의 농도는 ELISA 검정으로 결정되었다. 인간 트립타제를 인식하는 그리고 트립타제 사량체를 해리시킬 수 있는 마우스 단클론성 항체 클론 B12는 포착 항체로서 사용되었다 (Fukuoka 등 상동). 인간 트립타제를 결합시키는 다른 항체는 또한 사용될 수 있다. 재조합 인간 활성 트립타제 베타 1은 정제되었고 검정 표준의 제조용 원료 물질로서 사용되었다. 검정 표준, 대조군, 및 희석된 샘플은 10 분 동안 500 μg/ml SBTI로 인큐베이션되었고 그 다음 1시간 동안 ABP (G0353816)으로 라벨링되었다. 소분자 트립타제 억제제 (G02849855)는 20 분 동안 첨가되어 ABP 라벨링을 중단시켰다. 이 혼합물은 1시간 동안 포착 항체를 가진 ELISA 플레이트에 첨가되었고, 1x PBST로 세정되었고, 2시간 동안 SA-HRP 시약으로 인큐베이션되었다. 비색계 신호는 TMB 적용으로 생성되었고, 반응은 인산 첨가로 중단되었다. 플레이트는 기준 흡광도로 650 nm 및 검출 흡광도로 450 nm를 사용하는 SpectraMax® M5 플레이트 판독기에서 판독되었다.
(iv) 인간 총 트립타제 ELISA 검정
인간 총 트립타제의 농도는 ELISA 검정으로 결정되었다. 인간 트립타제를 인식하는 그리고 트립타제 사량체를 해리시킬 수 있는 항체 (클론 B12)는 포착 항체로서 사용되었다. 인간 트립타제를 인식하는 단클론성 항체는 검출 항체로서 사용되었다. 재조합 인간 활성 트립타제 베타 1은 정제되었고 검정 표준의 제조용 원료 물질로서 사용되었다. 샘플은 2시간 동안 포착 항체를 가진 ELISA 플레이트에 첨가되었고 그 다음 1x PBST로 세정되었다. 바이오티닐화된 검출 항체는 1시간 동안 첨가되었다. 다음으로, SA-HRP 시약은 1시간 동안 첨가되었다. 비색계 신호는 TMB 적용으로 생성되었고, 반응은 인산 첨가로 중단되었다. 플레이트는 기준 흡광도로 650 nm 및 검출 흡광도로 450 nm를 사용하는 SpectraMax® M5 플레이트 판독기에서 판독되었다. 　
B. 결과
항-트립타제 항체 예컨대 hu31A.v11이 생체내 트립타제를 표적하고 활성 트립타제 활성도를 억제시키는지를 평가하기 위해, 더 적은 침습성 방법 예컨대 비수착에 의해 실시된 또는 샘플 예컨대 기관지폐포 세척 유체 (BAL)에서 (예를 들어, 사이노로부터) 존재하는 활성 트립타제의 양을 측정하기 위해 검정은 개발되었다. 활성 트립타제와 반응하는 라벨 (예를 들어, 바이오틴), 링커, 및 반응성 기를 포함하는, 활성-기반 프로브는 개발되었다. 이 프로브는 활성 트립타제에 선택적으로 및 공유적으로 결합한다. 참고 Pan 등 상동. 이 도구는 샘플에서 활성 트립타제의 양을 측정하는데 사용될 수 있다 (도 15). BAL 수집 절차는 완충액의 기도로의 점적주입 및 (가변성일 수 있는) 그 유체의 후속적인 회수를 포함하고 따라서 정규화 인자는 시점 및 동물에 걸쳐 샘플을 비교하는데 필요하다. 우레아가 혈관과 기도 구획 사이 수동 확산을 가진 소분자이기 때문에, BAL내 우레아/혈청내 우레아의 비는 시점에 걸쳐 그리고 동물에 걸쳐 정규화하는데 사용될 수 있다. 참고 Pinheiro de Oliveira 등 2010, Critical Care 14:R39.
hu31A.v11의 투여가 생체내 트립타제를 표적화하였는지를 결정하기 위해, 30 mg/kg 용량은 건강한, 장애가 없는 사이노 원숭이에 정맥내 주사로 투여되었고, BAL내 활성 트립타제의 양은 결정되었다. 기준선에서, 활성 트립타제 수준은 상대적으로 낮았고 동물에 걸쳐 가변성이었다. 활성 트립타제의 줄어든 수준의 추세는 기준선에서 검출가능한 활성 트립타제를 가진 동물내 hu31A.v11의 투여 후 BAL에서 관측되었다 (도 16).
hu31A.v11 투여의 효과는 사이노 원숭이가 다양한 경로에 의한 반복된 투여로 기생충 선충 벌레 아스카리스에 감작화되는 알러지항원 도전 모델에서 또한 평가되었다 (도 17). 감작화 단계는 일 0, 7, 15, 71, 78, 및 85에서 복강내로 및 근육내로; 일 29, 50, 120, 184, 및 198-205에서 흡입에 의해; 그리고 일 34에서 근육내로 아스카리스의 투여를 포함하였다 (도 17). 팽진 발적은 그 날들에 진피내 투여 이후 일 -7, 57, 및 140에서 평가되었다. 각각의 동물은, (감작화 단계 동안 수행된) 각각의 동물에서 원하는 반응을 유도하기 위해 아스카리스의 적절한 용량 수준을 특성규명하도록 수행되었던, ORD (최적의 반응 용량)으로 결정된 바와 같이 아스카리스의 최적의 용량을 받았다. 용량은 4, 400, 및 4000 μg/ml를 포함하였다. 실험적 단계는, 비히클이 일 1에서 투여된, 비히클 단계, 이어서 일 2에서 흡입에 의한 아스카리스의 투여, 이어서 BAL의 샘플링 그리고 총 및 활성 트립타제의 양을 평가하기 위한 30 분 후 비수착을 포함하였다 (도 17). 4 주 후에, 약물 단계는 일 1에서 hu31A.v11의 투여, 이어서 일 2에서 아스카리스의 투여, 및 BAL의 샘플링 그리고 총 및 활성 트립타제의 양을 평가하기 위한 30 분 후 비수착을 포함하였다 (도 17).
아스카리스 감작화 모델에서, 항-트립타제 항체 hu31A.v11의 투여는 기준선에서 검출가능한 활성 트립타제 수준을 가졌던 5 동물에서 BAL내 활성 트립타제에서 상당한 감소로 이어졌고 (도 18A), 이 항체가 생체내 트립타제 활성을 억제시킨다는 것을 나타낸다. 부가적으로, 항-트립타제 항체의 투여는 또한 모든 동물에서 BAL내 총 트립타제의 양에서 증가로 이어졌다 (도 18B). 다른 실험은 비강 점막 라이닝 유체 (MLF)에서 총 트립타제의 수준이, 비수착 샘플에서 총 트립타제의 수준에 의해 평가된 바와 같이, 항-트립타제 항체 hu31A.v11 투약후 증가되었다는 것을 보여주었다 (도 18C). 이 실험에서, MLF는 합성 흡수성 매트릭스 (SAM; Hunt Developments (UK), Ltd, West Sussex, England)를 사용하여 수집되었다. 투약후 총 트립타제의 증가는 표적 참여를 나타낸다. 활성 트립타제는 투약 이전 및 이후 비수착 샘플에서 검출불가능하였다. 도 18A 및 18C에서 *는 검출 미만 수준을 나타낸다.
다음으로, 활성의 생체내 증거는 인간-접목된 IL2Rgnull-3/GM/SF NOD-SCID 마우스에서 또한 시험되었다. 인간 비만 세포 생착 및 인간 IgE-의존적 알러지성 반응용 인간화된 마우스 모델은 이전에 개발되었다. 간단히, NSG-SGM3 마우스 (Jackson Laboratory, 스톡 # 013062)는 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 배경으로부터 개발되었고, 그것의 NSG 부모처럼, NSG-SGM3 마우스는 성숙한 T 세포, B 세포, 및 기능적 NK 세포가 부족하고, 마우스 사이토카인 신호전달에서 결핍된다. 이들 마우스는, 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터/향상제 서열에 의해 각각 유도된, 3개의 공-주사된 이식유전자를 함유한다. 삼중 형질전환 NSG-SGM3 마우스는 인간 SCF, GM-CSF, 및 IL-3의 2-4 ng/ml 혈청 수준을 구성적으로 생산하여, 세포 증식 및 생존 신호를 제공한다 (참고, 예를 들어, Bryce 등 J. Allergy Clin Immunol. 138(3): 769-779, 2016). NSG-SGM3 BLT 마우스는 주변 림프양 조직, 점막 조직, 및 복강에 거주하는 인간 비만 세포를 개발한다. NSG-SGM3 BLT 마우스에서 인간 비만 세포는 CD117, 트립타제, 및 IgE-수용체를 발현시키고, 칼슘 유동을 경험할 수 있고 IgE-의존적 항원-특이적 방식으로 탈과립화할 수 있다. 면역성 검사시, NSG-SGM3-BLT 마우스는 체온으로 변화 측정에 의해 분석될 수 있는 인간 비만 세포 의존적, 항원-특이적 IgE-매개된 수동적인 전신 과민증 반응을 개발한다.
실험은 접목된 마우스에서 IgE-매개된 수동적인 전신 과민증 억제에 있어서 항-트립타제 항체의 능력을 조사하도록 설계되었다. 10-12 주령 NSG-SGM3 마우스 (Jackson Laboratory 스톡 # 013062)는 3 그룹으로 분할되었다: 그룹 1:NSG-SGM3 마우스는 아이소타입 항체 (500 μg/마우스)로 복강내로 (i.p.) 처리되었고; 그룹 2:NSG-SGM3 마우스는 인간 항-트립타제 항체 (hu31A.v11 IgG4, 13.3 mg/mL) i.p. (500 μg/마우스)로 처리되었고; 그룹 3:NSG-SGM3 마우스는 트립타제 소분자 억제제 G02849855 (30 mg/kg) i.p.로 처리되었다. 일 -1에서, 모든 마우스는 복부 모발이 깨끗하게 면도되어 체온 측정을 촉진시켰다. 0 일에서, 동물은 어느 한쪽 대조군 아이소타입 항체 또는 항-트립타제 항체로 주사되었다. 용량 용적은 100 μL로 제형화되었다. 항-트립타제 항체는 주사용 200 μL 염수에 용해되었다. 처리 15 분 후, 그룹 1-3으로부터 마우스는 하기로 정맥내로 감작화되었다: 항-NP (4-하이드록시-3-니트로페닐아세틸 합텐) IgE JW8.5.13 (Sigma Cat.No. 87080706-1VL; 참고 또한 US20070253948 및 Jackman 등 J. Biol. Chem. 285(27): 20850-20859, 2010) (200 μl의 염수내, 1.6 μg). 일 1 (처리 후 24 시간)에서, 체온은 마우스를 수작업으로 제한하고 흉골 바로 밑에서 면도된 복부 피부에 대해 Braun ThermoScan® Pro 4000을 견고하게 배치시킴으로써 측정되었다. 기준선 체온 측정 직후, 마우스는 200 μL 염수내 운반 단백질 BSA (NP-BSA)에 접합된500 μg의 항원 NP로 i.v. 면역성 검사되었다. 면역성 검사 매 15 분 후, 체온은 적어도 60 분 동안 측정될 것이다.
도 19에서 나타낸 바와 같이, 항-트립타제 항체 hu31A.v11로 처리된 마우스는, IgE 면역성 검사시, 대조군 항-gD 항체로 처리된 마우스에 비교된 경우 개선된 체온 유지를 보여주었다.
이들 데이터는 항-트립타제 항체 hu31A.v11이 활성이고 생체내 트립타제 활성을 결합 및 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 이들 데이터는 항-트립타제 항체 예컨대 hu31A.v11이 트립타제-연관된 장애 예컨대 천식의 치료용 치료제로서 사용될 수 있다는 추가 증거를 제공한다.
기타 구현예
비록 전술한 발명이 이해의 명확함을 위해 설명 및 실시예로서 일부 상세히 기재되었지만, 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학적 문헌의 개시내용은 명확히 그 전체가 참고로 편입된다.
IV. 서열 목록
표 17은 본 출원 전체에 사용된 서열을 나타낸다.
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<110> Genentech, Inc. F. Hoffman-La Roche AG <120> ANTI-TRYPTASE ANTIBODIES, COMPOSITIONS THEREOF, AND USES THEREOF <130> 50474-112WO2 <150> US 62/457,722 <151> 2017-02-10 <160> 128 <170> KoPatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Asp or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Tyr or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> X is Val or His <400> 1 Xaa Xaa Gly Met Xaa 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Val Tyr Tyr Ala Asp Thr Met Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Asn or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> X is Tyr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> X is Asp or Tyr <400> 3 Arg Xaa Xaa Xaa Asp Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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Lys 210 215 220 Val Asn Gly Thr Trp Leu Gln Ala Gly Val Val Ser Trp Gly Glu Gly 225 230 235 240 Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Ile Tyr Thr Arg Val Thr Tyr Tyr 245 250 255 Leu Asp Trp Ile His Arg Tyr Val Pro Glu Lys Pro 260 265 <210> 120 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 120 Ser Phe Ser Met Ser 1 5 <210> 121 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 121 Thr Ile Ser Gly Gly Lys Thr Phe Thr Asp Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 122 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 122 Ala Asn Tyr Gly Asn Trp Phe Phe Glu Val 1 5 10 <210> 123 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 123 Arg Ala Ser Glu Ser Val Ala Lys Tyr Gly Leu Ser Leu Leu Asn 1 5 10 15 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 124 Ala Ala Ser Asn Arg Gly Ser 1 5 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 125 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Phe Thr 1 5 <210> 126 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 126 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Lys Thr Phe Thr Asp Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ala Asn Tyr Gly Asn Trp Phe Phe Glu Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 127 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 127 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ala Lys Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Leu Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Arg Gly Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 128 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 128 Ala Gly Ser Thr His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Ile 1 5 10 15 Val Gly Gly Gln Glu Ala Pro Arg Ser Lys Trp Pro Trp Gln Val Ser 20 25 30 Leu Arg Val His Gly Pro Tyr Trp Met His Phe Cys Gly Gly Ser Leu 35 40 45 Ile His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Val Gly Pro Asp 50 55 60 Val Lys Asp Leu Ala Ala Leu Arg Val Gln Leu Arg Glu Gln His Leu 65 70 75 80 Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Leu Pro Val Ser Arg Ile Ile Val His Pro 85 90 95 Gln Phe Tyr Thr Ala Gln Ile Gly Ala Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu 100 105 110 Glu Glu Pro Val Asn Val Ser Ser His Val His Thr Val Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ala Ser Glu Thr Phe Pro Pro Gly Met Pro Cys Trp Val Thr Gly 130 135 140 Trp Gly Asp Val Asp Asn Asp Glu Arg Leu Pro Pro Pro Phe Pro Leu 145 150 155 160 Lys Gln Val Lys Val Pro Ile Met Glu Asn His Ile Cys Asp Ala Lys 165 170 175 Tyr His Leu Gly Ala Tyr Thr Gly Asp Asp Val Arg Ile Val Arg Asp 180 185 190 Asp Met Leu Cys Ala Gly Asn Thr Arg Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp 195 200 205 Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Lys Val Asn Gly Thr Trp Leu Gln Ala 210 215 220 Gly Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Gln Pro Asn Arg Pro Gly 225 230 235 240 Ile Tyr Thr Arg Val Thr Tyr Tyr Leu Asp Trp Ile His His Tyr Val 245 250 255 Pro Lys Lys Pro 260

Claims (336)

  1. 하기 6개의 초가변성 영역 (HVR)을 포함하며 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1:
    DYGMV (서열번호:7),
    (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2:
    FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2),
    (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3:
    RNYDDWYFDV (서열번호:8),
    (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1:
    SASSSVTYMY (서열번호:4),
    (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2:
    RTSDLAS (서열번호:5), 및
    (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3:
    QHYHSYPLT (서열번호:6).
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 서열번호:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 (VH) 도메인,
    (b) 서열번호:10의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 (VL) 도메인, 또는
    (c) 상기 (a)에서와 같은 VH 도메인, 및 상기 (b)에서와 같은 VL 도메인
    을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며,
    여기서 상기 항체의 HVR 서열은 제1항에서 정의된 바와 같은, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, VH 도메인이 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, VL 도메인이 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 인간 트립타제 베타 1의 효소적 활성을 억제할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 120 pM 내지 0.5 nM의 KD로 트립타제에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 400 pM의 KD로 트립타제에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제5항에 있어서, 비색계 합성 펩타이드 기질을 사용하는 인간 트립타제 베타 효소적 검정으로 측정시에 2.5 nM 이하의 IC50으로 트립타제의 활성을 억제하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제5항에 있어서,
    (i) pH 6에서 인간 트립타제 베타 1의 효소적 활성을 억제할 수 있거나,
    (ii) 기관지 평활근 세포 증식 또는 콜라겐-기반 수축의 트립타제-매개된 자극을 억제할 수 있거나,
    (iii) 비만 세포 히스타민 방출을 억제할 수 있거나,
    (iv) IgE-유발된 히스타민 방출 또는 트립타제-유발된 히스타민 방출을 억제할 수 있거나,
    (v) 사이노몰구스 원숭이 세기관지 세척 (bronchoalveolar lavage; BAL) 또는 비수착 샘플에서 트립타제 활성을 억제할 수 있거나,
    (vi) 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있거나,
    (vii) 1가 형식일 때 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있거나,
    (viii) 헤파린의 존재에서 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있는
    항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항에 있어서, 사량체 인간 트립타제 베타 1의 작은 계면과 사량체 인간 트립타제 베타 1의 큰 계면 둘 모두를 해리시킬 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항에 있어서, 사이노몰구스 원숭이 트립타제, 인간 트립타제 알파, 인간 트립타제 베타 2 또는 인간 트립타제 베타 3에 추가로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항에 있어서, 인간화된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제1항에 있어서, IgG 항체인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, IgG 항체가 IgG1 항체 또는 IgG4 항체인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, IgG4 항체가 EU 넘버링 시스템에 따라 중쇄 불변 영역에 S228P 돌연변이를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제1항에 있어서, 단일특이적 항체인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제1항에 있어서, 다중특이적 항체인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 제17항에 있어서, 다중특이적 항체가 이중특이적 항체인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 제18항에 있어서,
    인간 트립타제 베타 1에 결합하는 제1 결합 도메인, 및
    제2 생물학적 분자에 결합하는 제2 결합 도메인
    을 포함하며,
    제2 생물학적 분자는 인터류킨-13 (IL-13), 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-5 (IL-5), 인터류킨-17 (IL-17), IgE, 및 인터류킨-33 (IL-33)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인
    항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제1항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및
    약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제
    를 포함하는, 천식을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 부형제가 산화방지제인 약제학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 부형제가 0.1 mM 내지 1 mM 농도의 N-아세틸트립토판 및 1 mM 내지 10 mM 농도의 메티오닌을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 내광성 용기 또는 미리 충전된 주사기 내에 있는 약제학적 조성물.
  24. 제5항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및
    약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제
    를 포함하는, 천식을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  25. (a) 서열번호:76 또는 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 단리된 항체.
  26. 제25항에 있어서, 중쇄가 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  27. (a) 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및
    (b) 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  28. 제27항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및
    약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제
    를 포함하는, 천식을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  29. 하기 6개의 HVR을 포함하며 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트:
    (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1:
    DYGMV (서열번호:7),
    (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2:
    FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2),
    (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3:
    RNYDDWYFDV (서열번호:8),
    (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1:
    SASSSVTYMY (서열번호:4),
    (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2:
    RTSDLAS (서열번호:5), 및
    (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3:
    QHYHSYPLT (서열번호:6).
  30. 제29항에 있어서, 상기 항체가
    (a) 서열번호:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인,
    (b) 서열번호:10의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (c) 상기 (a)에서와 같은 VH 도메인, 및 상기 (b)에서와 같은 VL 도메인
    을 포함하며,
    여기서 상기 항체의 HVR 서열은 제29항에서 정의된 바와 같은, 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  31. 제29항에 있어서, 상기 항체가
    (a) 서열번호:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인,
    (b) 서열번호:10의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (c) 상기 (a)에서와 같은 VH 도메인, 및 상기 (b)에서와 같은 VL 도메인
    을 포함하며,
    여기서 상기 항체의 HVR 서열은 제29항에서 정의된 바와 같은, 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  32. 제29항에 있어서, 상기 항체가
    (a) 서열번호:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인,
    (b) 서열번호:10의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (c) 상기 (a)에서와 같은 VH 도메인, 및 상기 (b)에서와 같은 VL 도메인
    을 포함하며,
    여기서 상기 항체의 HVR 서열은 제29항에서 정의된 바와 같은, 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  33. 제29항에 있어서, 상기 항체가
    서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인
    을 포함하는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  34. 제29항에 있어서, 상기 항체가
    서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  35. 제29항에 있어서, 상기 항체가 사량체 인간 트립타제 베타 1의 작은 계면과 사량체 인간 트립타제 베타 1의 큰 계면 둘 모두를 해리시킬 수 있는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  36. 제29항에 있어서, 상기 항체가 사이노몰구스 원숭이 트립타제, 인간 트립타제 알파, 인간 트립타제 베타 2 또는 인간 트립타제 베타 3에 추가로 결합하는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  37. 제29항에 있어서, 상기 항체가 1 nM 이하의 KD로 트립타제에 결합하는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  38. 제37항에 있어서, 상기 항체가 120 pM 내지 0.5 nM의 KD로 트립타제에 결합하는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  39. 제38항에 있어서, 상기 항체가 400 pM의 KD로 트립타제에 결합하는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  40. 제29항에 있어서, 상기 항체가 인간 트립타제 베타 1의 효소적 활성을 억제할 수 있는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  41. 제40항에 있어서, 상기 항체가, 비색계 합성 펩타이드 기질을 사용하는 인간 트립타제 베타 효소적 검정으로 측정시에 2.5 nM 이하의 IC50으로 트립타제의 활성을 억제하는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  42. 제29항에 있어서,
    (i) 상기 항체가 pH 6에서 인간 트립타제 베타 1의 효소적 활성을 억제할 수 있거나,
    (ii) 상기 항체가 기관지 평활근 세포 증식 또는 콜라겐-기반 수축의 트립타제-매개된 자극을 억제할 수 있거나,
    (iii) 상기 항체가 비만 세포 히스타민 방출을 억제할 수 있거나,
    (iv) 상기 항체가 IgE-유발된 히스타민 방출 또는 트립타제-유발된 히스타민 방출을 억제할 수 있거나,
    (v) 상기 항체가 사이노몰구스 원숭이 BAL 또는 비수착 샘플에서 트립타제 활성을 억제할 수 있거나,
    (vi) 상기 항체가 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있거나,
    (vii) 상기 항체가 1가 형식일 때 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있거나,
    (viii) 상기 항체가 헤파린의 존재에서 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있는 것인
    단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  43. 제29항에 있어서, 상기 항체가 단클론성 또는 인간화된 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  44. 제29항에 있어서, 상기 항체가 IgG 항체인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  45. 제44항에 있어서, IgG 항체가 IgG1 항체 또는 IgG4 항체인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  46. 제45항에 있어서, IgG4 항체가 EU 넘버링 시스템에 따라 중쇄 불변 영역에 S228P 돌연변이를 포함하는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  47. 제29항에 있어서, 상기 항체가 단일특이적 항체 또는 다중특이적 항체인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  48. 제47항에 있어서, 다중특이적 항체가 이중특이적 항체인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  49. 제48항에 있어서,
    상기 항체가
    인간 트립타제 베타 1에 결합하는 제1 결합 도메인, 및
    제2 생물학적 분자에 결합하는 제2 결합 도메인
    을 포함하며,
    제2 생물학적 분자는 IL-13, IL-4, IL-5, IL-17, IgE, 및 IL-33으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인
    단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  50. (a) 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및
    (b) 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하며 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하며,
    서열번호:104 또는 서열번호:105의 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는
    단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  51. 제50항에 있어서, 서열번호:104 또는 서열번호:105의 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  52. 제51항에 있어서, 서열번호:104 또는 서열번호:105의 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  53. 제52항에 있어서, 서열번호:104 또는 서열번호:105의 서열에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  54. 제53항에 있어서, 서열번호:104 또는 서열번호:105의 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  55. 제50항에 있어서,
    상기 항체가
    (a) 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는
    (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것이고,
    서열번호:106 또는 서열번호:107의 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는
    단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  56. 제55항에 있어서, 서열번호:106 또는 서열번호:107의 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  57. 제56항에 있어서, 서열번호:106 또는 서열번호:107의 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  58. 제57항에 있어서, 서열번호:106 또는 서열번호:107의 서열에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  59. 제58항에 있어서, 상기 항체가 서열번호:106 또는 서열번호:107의 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  60. 제50항에 있어서,
    상기 항체가
    (a) 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 또는
    (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것이고,
    서열번호:108 또는 서열번호:107의 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는
    단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  61. 제60항에 있어서, 서열번호:108 또는 서열번호:107의 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  62. 제61항에 있어서, 서열번호:108 또는 서열번호:107의 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  63. 제62항에 있어서, 서열번호:108 또는 서열번호:107의 서열에 대해 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  64. 제63항에 있어서, 서열번호:108 또는 서열번호:107의 서열을 포함하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  65. 제29항에 있어서,
    상기 항체가
    (a) 서열번호:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및
    (b) 서열번호:10의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하며,
    여기서 상기 항체의 HVR 서열은 제29항에서 정의된 바와 같은, 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  66. 제65항에 있어서,
    상기 항체가
    서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및
    서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  67. (a) 서열번호:76 또는 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 항체를 인코딩하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  68. 제67항에 있어서,
    상기 항체가
    (a) 서열번호:76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  69. 제67항에 있어서,
    상기 항체가
    (a) 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것인 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트.
  70. 제29항의 단리된 핵산 또는 단리된 핵산의 세트를 포함하는 벡터 또는 벡터의 세트.
  71. 제70항의 벡터 또는 벡터의 세트를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  72. 제71항에 있어서, 포유동물 세포 또는 원핵 세포인 단리된 숙주 세포.
  73. 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 항체를 생산하는 방법이며,
    제71항의 단리된 숙주 세포를, 항체의 생산을 허용하는 적당한 조건 하의 배양 배지에서 배양하는 단계
    를 포함하는 방법.
  74. 하기 6개의 HVR을 포함하며 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편
    을 포함하는, 천식의 치료가 필요한 대상체에서 천식을 치료하기 위한 약제학적 조성물:
    (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1:
    DYGMV (서열번호:7),
    (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2:
    FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2),
    (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3:
    RNYDDWYFDV (서열번호:8),
    (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1:
    SASSSVTYMY (서열번호:4),
    (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2:
    RTSDLAS (서열번호:5), 및
    (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3:
    QHYHSYPLT (서열번호:6).
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 제74항에 있어서, 추가의 치료제와 함께 투여되도록 제형화된 약제학적 조성물.
  78. 제77항에 있어서, 추가의 치료제가 IL-13 축 결합 길항제, IL-5 축 결합 길항제, IL-33 축 결합 길항제, M1 프라임 길항제, IgE 길항제, TRPA1 길항제, CRTH2 길항제, 기관지확장제 또는 천식 증상 컨트롤러 약물, 면역조절물질, 코르티코스테로이드, Th2 경로 억제제, 티로신 키나제 억제제, 또는 포스포디에스테라제 억제제인 약제학적 조성물.
  79. 제74항에 있어서, 항체가 피하로, 정맥내로, 근육내로, 국소적으로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내로, 심실내로, 또는 비강내로 투여되도록 제형화된 것인 약제학적 조성물.
  80. 제74항에 있어서,
    항체가
    (a) 서열번호:9의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인,
    (b) 서열번호:10의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
    (c) 상기 (a)에서와 같은 VH 도메인, 및 상기 (b)에서와 같은 VL 도메인
    을 포함하며,
    여기서 상기 항체의 HVR 서열은 제74항에서 정의된 바와 같은, 약제학적 조성물.
  81. 제74항에 있어서, VH 도메인이 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  82. 제74항에 있어서, VL 도메인이 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  83. 제74항에 있어서,
    상기 항체가
    (a) 서열번호:9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및
    (b) 서열번호:10의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인
    을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  84. 제74항에 있어서,
    상기 항체가
    (a) 서열번호:76 또는 서열번호:78의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    (b) 서열번호:77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  85. 제74항에 있어서, 상기 항체가 인간 트립타제 베타 1의 효소적 활성을 억제할 수 있는 것인 약제학적 조성물.
  86. 제85항에 있어서, 상기 항체가 120 pM 내지 0.5 nM의 KD로 트립타제에 결합하는 것인 약제학적 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 상기 항체가 400 pM의 KD로 트립타제에 결합하는 것인 약제학적 조성물.
  88. 제85항에 있어서, 상기 항체가, 비색계 합성 펩타이드 기질을 사용하는 인간 트립타제 베타 효소적 검정으로 측정시에 2.5 nM 이하의 IC50으로 트립타제의 활성을 억제하는 것인 약제학적 조성물.
  89. 제85항에 있어서,
    (i) 상기 항체가 pH 6에서 인간 트립타제 베타 1의 효소적 활성을 억제할 수 있거나,
    (ii) 상기 항체가 기관지 평활근 세포 증식 또는 콜라겐-기반 수축의 트립타제-매개된 자극을 억제할 수 있거나,
    (iii) 상기 항체가 비만 세포 히스타민 방출을 억제할 수 있거나,
    (iv) 상기 항체가 IgE-유발된 히스타민 방출 또는 트립타제-유발된 히스타민 방출을 억제할 수 있거나,
    (v) 상기 항체가 사이노몰구스 원숭이 BAL 또는 비수착 샘플에서 트립타제 활성을 억제할 수 있거나,
    (vi) 상기 항체가 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있거나,
    (vii) 상기 항체가 1가 형식일 때 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있거나,
    (viii) 상기 항체가 헤파린의 존재에서 사량체 인간 트립타제 베타 1을 해리시킬 수 있는 것인
    약제학적 조성물.
  90. 제74항에 있어서, 상기 항체가 사량체 인간 트립타제 베타 1의 작은 계면과 사량체 인간 트립타제 베타 1의 큰 계면 둘 모두를 해리시킬 수 있는 것인 약제학적 조성물.
  91. 제74항에 있어서, 상기 항체가 사이노몰구스 원숭이 트립타제, 인간 트립타제 알파, 인간 트립타제 베타 2 또는 인간 트립타제 베타 3에 추가로 결합하는 것인 약제학적 조성물.
  92. 제74항에 있어서, 상기 항체가 인간화된 것인 약제학적 조성물.
  93. 제74항에 있어서, 상기 항체가 IgG 항체인 약제학적 조성물.
  94. 제93항에 있어서, IgG 항체가 IgG1 항체 또는 IgG4 항체인 약제학적 조성물.
  95. 제94항에 있어서, IgG4 항체가 EU 넘버링 시스템에 따라 중쇄 불변 영역에 S228P 돌연변이를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  96. 제74항에 있어서, 상기 항체가 단일특이적 항체인 약제학적 조성물.
  97. 제74항에 있어서, 상기 항체가 다중특이적 항체인 약제학적 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 다중특이적 항체가 이중특이적 항체인 약제학적 조성물.
  99. 제98항에 있어서,
    상기 항체가
    인간 트립타제 베타 1에 결합하는 제1 결합 도메인 및
    제2 생물학적 분자에 결합하는 제2 결합 도메인
    을 포함하며,
    제2 생물학적 분자는 IL-13, IL-4, IL-5, IL-17, IgE, 또는 IL-33인
    약제학적 조성물.
  100. 제74항에 있어서, 상기 항체가 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물 중에 포함된 것인 약제학적 조성물.
  101. 하기 6개의 HVR을 포함하며 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편
    을 포함하는, 자가면역 장애의 치료가 필요한 대상체에서 자가면역 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물이며, 여기서 자가면역 장애는 류마티스성 관절염, 건선, 호산구 식도염, 염증성 장 질환 (IBD), 또는 크론병인, 약제학적 조성물:
    (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1:
    DYGMV (서열번호:7),
    (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2:
    FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2),
    (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3:
    RNYDDWYFDV (서열번호:8),
    (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1:
    SASSSVTYMY (서열번호:4),
    (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2:
    RTSDLAS (서열번호:5), 및
    (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3:
    QHYHSYPLT (서열번호:6).
  102. 삭제
  103. 하기 6개의 HVR을 포함하며 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편
    을 포함하는, 염증성 장애의 치료가 필요한 대상체에서 염증성 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물이며, 여기서 염증성 장애는 만성 자발적인 두드러기 (CSU), 과민증, 과민성 쇼크, 아토피 피부염, 또는 알러지성 비염인, 약제학적 조성물:
    (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1:
    DYGMV (서열번호:7),
    (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2:
    FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2),
    (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3:
    RNYDDWYFDV (서열번호:8),
    (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1:
    SASSSVTYMY (서열번호:4),
    (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2:
    RTSDLAS (서열번호:5), 및
    (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3:
    QHYHSYPLT (서열번호:6).
  104. 삭제
  105. 하기 6개의 HVR을 포함하며 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편
    을 포함하는, 섬유성 장애의 치료가 필요한 대상체에서 섬유성 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물이며, 여기서 섬유성 장애는 특발성 폐 섬유증인, 약제학적 조성물:
    (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1:
    DYGMV (서열번호:7),
    (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2:
    FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2),
    (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3:
    RNYDDWYFDV (서열번호:8),
    (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1:
    SASSSVTYMY (서열번호:4),
    (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2:
    RTSDLAS (서열번호:5), 및
    (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3:
    QHYHSYPLT (서열번호:6).
  106. 삭제
  107. 하기 6개의 HVR을 포함하며 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편
    을 포함하는, 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애의 치료가 필요한 대상체에서 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물이며, 여기서 과립구성 (중성구 또는 호산구) 장애는 천식-COPD 중복 증후군 (ACOS) 또는 COPD-폐쇄성 수면 무호흡 (OSA) 중복 증후군인, 약제학적 조성물:
    (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1:
    DYGMV (서열번호:7),
    (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2:
    FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2),
    (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3:
    RNYDDWYFDV (서열번호:8),
    (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1:
    SASSSVTYMY (서열번호:4),
    (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2:
    RTSDLAS (서열번호:5), 및
    (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3:
    QHYHSYPLT (서열번호:6).
  108. 삭제
  109. 하기 6개의 HVR을 포함하며 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편
    을 포함하는, 단구성 장애 또는 림프구성 장애의 치료가 필요한 대상체에서 단구성 장애 또는 림프구성 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물이며, 여기서 단구성 장애 또는 림프구성 장애는 관절염, 식도염, 비-알러지성 비염, 용종을 갖는 비부비동염, 비강 폴립증, 기관지염, 만성 폐렴, 알러지성 기관지폐 아스페르길루스증, 기도 염증, 기관지 확장증, 만성 기관지염, 위장 염증성 병태, 낭창, 또는 전신 홍반성 낭창 (SLE)인, 약제학적 조성물:
    (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1:
    DYGMV (서열번호:7),
    (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2:
    FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2),
    (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3:
    RNYDDWYFDV (서열번호:8),
    (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1:
    SASSSVTYMY (서열번호:4),
    (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2:
    RTSDLAS (서열번호:5), 및
    (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3:
    QHYHSYPLT (서열번호:6).
  110. 삭제
  111. 삭제
  112. 삭제
  113. 하기 6개의 HVR을 포함하며 인간 트립타제 베타 1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편
    을 포함하는, 비만세포증의 치료가 필요한 대상체에서 비만세포증을 치료하기 위한 약제학적 조성물:
    (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1:
    DYGMV (서열번호:7),
    (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2:
    FISSGSSTVYYADTMKG (서열번호:2),
    (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3:
    RNYDDWYFDV (서열번호:8),
    (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1:
    SASSSVTYMY (서열번호:4),
    (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2:
    RTSDLAS (서열번호:5), 및
    (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3:
    QHYHSYPLT (서열번호:6).
  114. 제113항에 있어서, 비만세포증이 비급성 전신 비만세포증인 약제학적 조성물.
  115. 삭제
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