JP2004500876A - 組換え体のタンパク質分解トリプターゼ、組換え体のタンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異、及びそれらの生成方法 - Google Patents
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Abstract
開示は、形質転換された宿主で酵素的に活性なトリプターゼの生成を導く発現構成である、真核生物の宿主細胞で酵素的に活性な組換え体のタンパク質分解トリプターゼを発現する方法、及び酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼを発現する発現構成を含有する遺伝子工学的に改変された真核生物の宿主細胞である。さらに、かかる方法で生成されたタンパク質分解トリプターゼの使用が開示される。また、開示は、形質転換された真核生物の宿主細胞で突然変異の生成を導く発現構成である、真核生物の宿主細胞でタンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異を生成する方法、及びタンパク質分解トリプターゼの活性部位が突然変異した形態を発現する発現構成を含有する遺伝子工学的に改変された真核生物の宿主細胞である。
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、発現が酵素学的に活性なタンパク質分解トリプターゼのコード化を構成し、酵素学的に活性な組換え体のタンパク質分解トリプターゼを発現する遺伝子工学的に改変された真核生物である、微生物の宿主で遺伝子工学的に改変された酵素学的に活性な組換え体のタンパク質分解トリプターゼの生成方法を導く。本発明はまた、発現が活性部位の突然変異による酵素活性を欠損した変異型タンパク質分解トリプターゼのコード化を構成し、活性部位の突然変異を有する変異型組換えタンパク質分解トリプターゼを発現する、遺伝子工学的に改変された真核生物である、遺伝子工学的に改変された微生物の宿主で組換え体のタンパク質分解のトリプターゼの活性部位の突然変異の合成方法を導く。
【０００２】
文献目録
ここに言及される参考文献としての完全な引例は、配列リストの直前の文献目録に含まれる。
【０００３】
関連する技術の記載
マスト細胞β−トリプターゼは、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で未知の生物学的機能である中立のセリンプロテアーゼである。しかしながら、それは喘息、脈管形成及び組織を改変に密接に結び付けられている。それは、マスト細胞の顆粒タンパク質の合計の２０％ｗ／ｖ以内を構成する。β−トリプターゼは、マスト細胞の顆粒に選択的に保存されて、マスト細胞脱顆粒反応で作動される。β−トリプターゼはマスト細胞にとって独占的であるために、マスト細胞を媒介として病理学の特定のマーカーとして好意を獲得した。マスト細胞の異質性、構造及び媒介物質に関する完全な議論のためにはニルソン及びスキワーツ（Ｎｉｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ）（１９９４）を参照すること。
【０００４】
喘息において、マスト細胞は、アレルゲンの攻撃に続いて直ちに起こる、急性の免疫反応に密接に関係している。例えば、ホルゲートとチャーチ（Ｈｏｌｇａｔｅ ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈ）（１９９２）を参照のこと。羊をモデルにしたアレルギーにおいて、Ｊ．Ｍ．クラーク等（Ｊ．Ｍ．Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．）（１９９５）のトリプターゼは抗原に引き起こされる気道反応での重要な仲介者の役割をすることを示している。
【０００５】
多くのタンパク質は、フィブリノーゲンのα及びβチェーンを含有して、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのトリプターゼ切断の基質であることが報告されている。スキワーツ等（１９８５）を参照すること。トリプターゼはフィブリノーゲンを血餅活性を欠損し、潜在的にマスト細胞脱顆粒反応の部位で抗凝血剤の役割をするフラグメントに切断する。
【０００６】
精製された天然のヒトβ−トリプターゼは約１３４ｋＤａの四量体のエンドプロテアーゼである。４つのサブユニットの各々は、約３１乃至３４ｋＤａの大きさである。スキワーツ（１９９５）に言及されるように、１９８１年にヒトのトリプターゼは分散されて富化された肺のマスト細胞から明らかに均一になるように第一に精製された。しかしながら、さらなる調査は、哺乳類のトリプターゼの少なくとも二つの異なるタイプ又はグループが存在することを示しており、それらはタンパク質分解トリプターゼと非タンパク質分解トリプターゼである。それらのトリプターゼ形態のタンパク質分解トリプターゼは、活性トリプターゼを算出するために分解できる。切断可能なタンパク質分解のトリプターゼはβ−トリプターゼ、β型のトリプターゼ、及びトランスメンブラントリプターゼを含む。さらに、β−トリプターゼは２つの優勢なイソ型に分けられて、それらはβ−Ｉとβ−ＩＩである。β−Ｉのイソ型はスキントリプターゼと呼ばれ、β−ＩＩのイソ型はスキントリプターゼは肺トリプターゼと呼ばれる。この新しい命名法がここでは使用される。
【０００７】
切断可能なタンパク質分解トリプターゼと対照的に、第二のタイプであるトリプターゼの非タンパク質分解トリプターゼは切断できない。このようにして、非タンパク質分解トリプターゼは酵素的に活性ではない。非タンパク質分解トリプターゼはα−トリプターゼを含む。フアング（Ｈｕａｎｇ）等（１９９９）は、タンパク質分解トリプターゼをアミノ酸１（分解されたタンパク質分解トリプターゼの第一のアミノ酸）からアミノ酸−３及び−２でのアミノ酸Ｒ−Ｖへの分解に貢献する。Ｒ−Ｖはβ−トリプターゼに存在し、一方でα−トリプターゼには存在しない。さらに、タンパク質分解及び非タンパク質分解トリプターゼは、はっきりした遺伝子からの由来である。
【０００８】
ヒトのトリプターゼは、スミス等（１９８４）によって記載のように、死体の肺組織から慣習的に分離される。
【０００９】
ヒトのトリプターゼをコード化する、クローニングｃＤＮＡが多くの調査で報告されている。イデ（Ｉｄｅ）等（１９９５）を参照するラットのマスト細胞トリプターゼと同様に、ミラー等（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ）（１９９０）、バンダーライス等（Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ ｅｔ ａｌ）（１９９０）及びブロムとヘルマン（Ｂｌｏｍ ａｎｄ Ｈｅｌｌｍａｎ）（１９９３）を参照のこと。
【００１０】
しかしながら、特に活発なトリプターゼを発現する、ヒトのトリプターゼを発現する以前からの試みは、細菌の発現システム又はバキュロウィルスの発現システムを使用することは、酵素力の欠損に帰着するタンパク質の折りたたみ問題を含む無数の問題で悩まされる。これらの失敗は、少なくとも一部分は、トリプターゼ酵素が酵素の活性形態を産出するために翻訳後で大規模に修飾されるという事実による。したがって、原核生物で生成された組換え体トリプターゼの比活性は翻訳後のグリコシル化の欠如により低いと予想されるだろう。さらなる結果として、酵素的に活性な組換え体ヒトトリプターゼの以前からの試みは、方法が酵素前駆体を活性化する発現後の化学的修飾及び後の精製を要求するので、理想とははるかに掛け離れたものであることが分かった。
【００１１】
例えば、サカイ等（１９９６）はバキュロウィルスシステムでの組換え体ヒトα−トリプターゼとβ−トリプターゼ前駆体の発現と精製を報告している。しかしながら、形成されたトリプターゼ前駆体は不活性である。
【００１２】
異種のタンパク質合成のための宿主としてのメチロトローフな酵母（例えばＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋ１ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の使用に関して、これらの生物の特性及びかかる使用におけるそれらの適応性は広範囲に重要な文献において調査された。例えば、フェイバー等（Ｆａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．）（１９９５）、バックホルツ及びグリーソン（ＢｕｃｋｈｏＩｚ ａｎｄ Ｇｌｅｅｓｏｎ）（１９９１）を参照してください。
【００１３】
チェン等（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ）（１９９９）は、メチロトローフな酵母でプロトリプターゼをクローニングした。チェン等の発現した合成物は、活性な四量体トリプターゼを形成するために外因的に処理されるべきである、プロトリプターゼモノマーである。この変換は、活性段階に依存するヘパリン−及びジペプチジルペプチダーゼＩを含有する、追加的な２つのカラム精製方法を必要とする。これらの外生の処理段階は、非常に低い発現レベル、各段階での酵素の量の大規模な欠損及び精製された酵素の非常に低い終量に帰着する。
【００１４】
事前にクローニングされたトリプターゼは、切断部位を含まない。したがって、クローニングされたトリプターゼはアミノ酸−３と−２でＲＶを欠損する。したがって、それらのクローニングされたトリプターゼは切断されない。それらの以前のトリプターゼシステムは切断しないために、以前のトリプターゼは酵素的に活性な四量体を同時に形成しない。
【００１５】
タンパク質分解トリプターゼの活性部位は事前に決定されない。アミノ酸４４、９１、及び１９４がタンパク質分解トリプターゼで保存され、酵素的な活性部位の存在と関係する一方で、これらの三つのアミノ酸が活性のために必要になるという事前の実証はなかった。
【００１６】
フアング等（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ）（１９９９）はα−トリプターゼを突然変異させ、α−トリプターゼの基質と結合するクレフトを形成する表面ループの一つである、残存の２１５の重要性を決定するために昆虫の細胞で発現した。フアング等による昆虫細胞での異種のα−トリプターゼの発現は、タンパク質を活性化するために数多のエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）の翻訳後段階を必要とする。
【００１７】
発明の概要
酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼ（例えば、β−Ｉ，β−ＩＩ，β型）とタンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異だけの発現システムを提供する酵母でのトリプターゼの発現は合成される。様々な活性のタンパク質分解トリプターゼを合成するために、ＤＮＡ発現の構築がＤＮＡと細菌及び酵母との間を行き来するために使用される。例えば、トリプターゼをコード化するＤＮＡの部位直結型突然変異は従来のエシェリヒア．コリの宿主でなされ、次いで、変異型ＤＮＡは、新規なトリプターゼの発現のために適切な真核細胞の宿主に転換される。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様は、５´から３´へ移動する、プロモーターを含有するＤＮＡ発現構成を導き、プロモーターは分泌シグナルの配列に機能的にリンクして、分泌シグナルの配列は活性部位の変位を有するタンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡ配列に機能的にリンクし、ここで発現構成は、活性部位の変位により酵素活性が欠損した成熟なタンパク質分解トリプターゼの発現を導く。
【００１９】
本発明の他の好ましい実施態様は、ＡＯＸ１、ＧＡＰ，ＭＯＸ，ＦＭＤ，ＡＤＨ，ＬＡＣ４，ＸＰＲ２，ＬＥＵ２，ＧＡＭ１、ＰＧＫ１，ＧＡＬ７，ＧＡＰＤＨ，ＣＹＣ１及びＣＵＰ１から構成されるグループから選択される５´から３´へ移動する、プロモーターを含有するＤＮＡ発現構成を導き、プロモーターは分泌シグナルの配列に機能的にリンクして、分泌シグナルの配列は活性部位の変位を有するタンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡ配列に機能的にリンクし、ＤＮＡ配列はターミネーター配列に機能的にリンクする。
【００２０】
本発明によると、タンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡは、タンパク質分解トリプターゼの３つの活性部位アミノ酸（アミノ酸４４、９１、及び１９４）のうちの一つが突然変位される。変異されたＤＮＡは真核細胞の発現システムにクローニングされ、好ましくは酵母の宿主細胞である、適切な真核細胞の宿主細胞に形質転換される。形質転換が成功した宿主細胞は発現し、翻訳後処理を行ない、好ましくは発現を誘発する、活性部位変異型成熟トリプターゼを分泌する。
【００２１】
本発明の他の実施態様は、発現構成を含み発現するために形質転換された生物によって合成される、トリプターゼの酵素活性を欠損する、組換え体タンパク質を導く。好ましくは、ＤＮＡ発現の構成は、アミノ酸４４のヒスチジン、アミノ酸９１のアスパラギン酸、アミノ酸１９４のセリンである、タンパク質分解トリプターゼ遺伝子内の３つの推定される活性部位の一つで突然変異を有する。好ましくは、突然変異はそれらのアミノ酸位置でアラニンに変化する。
【００２２】
さらに、本発明はポリクローナル又はモノクローナル抗ヒトタンパク質分解トリプターゼ抗体の産出方法を導く。好ましい実施態様は、発現構成を含み発現するために形質転換された生物によって合成される、タンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異を備える動物の接種を含む。抗体生成の他の組換え方法は、制限しないが、ファージの表示技術、ライブラリースクリーニング、及びそれら二つの方法の組み合わせを含有して使用できる。本発明はまた、それによって生成される、ポリクローナル、モノクローナル、またはキメラのモノクローナル抗ヒトタンパク質分解トリプターゼ抗体を導く。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施態様は、５´から３´へ移動する、プロモーターを含有するＤＮＡ発現構成を導き、プロモーターは分泌シグナルの配列に機能的にリンクして、分泌シグナルの配列は活性部位の変位を有するタンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡ配列に機能的にリンクし、ここで発現構成は発現構成を含むために形質転換された宿主に酵素活性を有する成熟のタンパク質分解トリプターゼの発現を導く。
【００２４】
本発明のさらなる別の実施態様は、５´から３´へ移動する、プロモーターを含有するＤＮＡ発現構成を導き、プロモーターは分泌シグナルの配列に機能的にリンクして、分泌シグナルの配列は配列番号６のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を有するタンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡ配列に機能的にリンクし、ここで発現構成は発現構成を含むために形質転換された宿主に酵素活性を有する成熟のβ−ＩＩトリプターゼの発現を導く。アミノ酸１０２でのβ−Ｉトリプターゼの突然変異はβ−ＩＩトリプターゼと同一の配列を産出する。β−ＩＩトリプターゼのコード領域の残存部分において変化はない。突然変異がβ−Ｉトリプターゼの突然変異として産出されるが、これより後ではβ−ＩＩトリプターゼと呼ばれ、β−ＩＩトリプターゼと同一のコード領域である。組換え体β−ＩＩトリプターゼは、酵母のゲノムに統合されるＤＮＡ構成を発現する。好ましい実施態様において、遺伝子工学的に改変された酵母細胞は、ここに記載のようにβ−ＩＩトリプターゼ発現構成を含み発現するために形質転換されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を含む。
【００２５】
本発明は、すぐ下流（つまり３´方向）のタンパク質分解トリプターゼの成熟形態をコード化する、機能的にリンクしているＤＮＡ配列を必要とし、発現構成を産出するための分泌シグナル配列をフレーム内に必要とする。ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋをデザインしたプラスミドである好ましい実施態様である、発現構成は、好ましくは酵母菌株であり、最も好ましくはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属菌株である、適切な宿主に形質転換される。そのように形質転換された宿主は、発現構成によってコード化されたβ−ＩＩトリプターゼを発現し分泌する。発現されたβ−ＩＩトリプターゼは、宿主細胞によって正確に処理され、トリプターゼの代替のイソ型として細胞培養液に分泌される。
【００２６】
本発明は、天然型のトリプターゼがプロタンパク質として合成されるという利点を有する。ここに記載される修飾型トリプターゼアンプリコンはＮ−末端アミノ酸前駆体をコード化する配列を欠如する。フレーム内の融合としてこの配列をＮ−末端酵母分泌シグナル配列にクローニングすることによって、分泌されたトリプターゼタンパク質を活性処理することを問題にする必要はない。切断され、セルフアセンブルを行ない、さらに必要とされる外因性の操作なしで活性な四量体酵素を同時に形成する成熟モノマーとして分泌される。
【００２７】
この結果を達成するために、シグナルペプチドの切断部位は、成熟トリプターゼタンパク質のＮ−末端に隣接して位置している。真核細胞の宿主細胞のプロテアーゼの作用によるシグナルペプチドの切断は、分泌されるトリプターゼからシグナルペプチドを移動する。この結果は、ヒトの組織から分離された成熟な天然型トリプターゼ分子で見られる同一のアミノ酸末端残基を含有するトリプターゼの酵素的に活性な成熟形態の分泌である。
【００２８】
ここに記載のタンパク質分解トリプターゼの生成方法の明確な利点は、以前の方法と異なり、そのようにして生成されたトリプターゼは、トリプターゼ作用を開始するための任意の外因性又はヒト支援型発現後若しくは精製後修飾或いは操作を必要としないことである。本発明において、モノマーは分泌されるように切断される。モノマーの活性な四量体へのセルフアセンブルは、細胞からの分泌後に発生する。これは分泌後に自動的に起こる。本発明にしたがって生成されたタンパク質分解トリプターゼは、死体のトリプターゼに比較して優れている酵素活性を有する。
【００２９】
ここに記載されるタンパク質分解トリプターゼの生成方法の他の明白な利点は、前述のようにして生成されたトリプターゼは高い発現レベルを有することである。酵素が死体から精製される従来の精製工程と比較して、ここに記載の方法と結果となるトリプターゼは死体からのトリプターゼで共通して見られる不純物を欠損する。さらに、死体供給源の物質を使用することに関連するバイオハザードを欠損する。ここに記載される方法及び結果となるトリプターゼはまた、バッチ間の偏差が少なく、精製されたトリプターゼの高い均一性を有する。結果となるトリプターゼはまた、高い比活性を有する。
【００３０】
本発明によって産する酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼの即座の有効性は、直ちにいくつかの未到の長所がある。それらは、マスト細胞が介在する疾病でのトリプターゼの生物学的に重要な理解の前進と同様に、潜在的な治療として特定のトリプターゼ阻害剤における組み合わせライブラリーの大規模なスクリーニングを容易にすることを含む。
【００３１】
本発明によって提供されるタンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異は、このユニークなプロテアーゼの構造と機能的な特性についての理解を促進するツールを供給する。活性部位は、酵素反応において必要な部位を意味する。活性部位は、活性部位の表面ループに限定しない。ここに記載の活性部位の突然変異は四量体を形成できる。
【００３２】
本発明による方法は、確定される規格を有するトリプターゼの大きく標準化されたロット（１００ｍｇ以上又は５リットルの酵母培養液）を生成するために使用できる。本方法はまた、マイクログラムからグラム又はキログラム単位の量までトリプターゼを生成するために容易く計量できる。死体からトリプターゼを精製するための従来の方法を用いて、一体のヒトの肺からはほんの１０ミリグラムのトリプターゼが得られる。
【００３３】
好ましいピキアの形質転換体で生成されるトリプターゼの量は、例えば、製薬研究、組み合わせライブラリースクリーニング、及びＸ線結晶学的な研究などの大量規模の研究を可能にするために過去において可能であった量よりも十分に多い。さらに、大量に生成されるトリプターゼはトリプターゼのアゴニスト及び／又はアンタゴニストの発展を可能にする。
【００３４】
本発明の他の目的及び利点は、本発明の下記の詳細な記載及び請求項の読み込みによって明らかになるだろう。
【００３５】
発明の詳細な記載
定義
明細書及び請求項についての明瞭で一貫した理解を提供するために、次の定義はここに使用される。 明らかに記述されない用語は当業者によって理解されるような標準的な意味を有している。
【００３６】
活性部位変位型−活性部位は酵素反応に必要な部位を意味する。活性部位は活性部位の表面ループに制限されない。ここで使用されるように、タンパク質分解トリプターゼの活性部位はアミノ酸４４、９１、及び１９４又はタンパク質分解トリプターゼにおけるそれらの比較可能なアミノ酸である。ここに記載されるタンパク質分解トリプターゼの活性部位変位型は切断可能であり、四量体を形成する。活性部位変位型は酵素的活性を欠損する。活性のこの欠損は、成熟四量体を形成する能力の欠損によるものではなく、活性部位の突然変異によるためである。
【００３７】
酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼ−遺伝子工学的に改変された宿主細胞からの異種のタンパク質の発現に適用するように、発現された／抽出されたタンパク質が所望の活性を有するために分泌シグナルペプチド又は人工的なグリコシル化の人工的切断などの発現後又は抽出後の化学処理処理を必要としない場合にタンパク質は酵素的に活性である。タンパク質分解トリプターゼは、酵素的な活性となる四量体形態に正確に形成されるべきである。“成熟したタンパク質分解トリプターゼ”と共に同義的に使用した。
【００３８】
発現構成−構成が適切な宿主細胞に形質転換される場合にコード化されたタンパク質又はペプチドの発現を導く一つ以上の抑制的なサブシークエンスに機能的にリンクされた、関心のあるタンパク質又はペプチドをコード化する少なくとも一つのサブシークエンスを含有するＤＮＡ構成。かかる構成は、さらに形質転換細胞への抗生物質耐性又は栄養の制限を与えるサブシーケンスのような構成を含むために変形された宿主細胞を選択するためのサブシーケンスのコード化する方法を含んでいるかもしれない。
【００３９】
宿主細胞−一般的に、形質転換を行ない易い真核生物細胞は、限定しないが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ， Ｋ１ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ， Ｐｉｃｈｉａ， Ｓａｃｃｈａｒｏｉｎｙｃｅｓ， Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ，Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｒｎｙｃｅｓ， Ｙａｒｒｏｗｉａ，並びに、同様に， Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ， Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ， Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ， Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ及び
【外１】
属の生物を含有する。ピキア属の宿主が好ましく、最も好ましい宿主細胞はＡＴＣＣ２０８６４の特徴を有するピキア・パストリスである。
【００４０】
成熟した、タンパク質分解トリプターゼ−遺伝子工学的に改変された宿主細胞からの異種のタンパク質の発現に適用するように、発現された／抽出されたタンパク質が所望の活性を有するために分泌シグナルペプチド又は人工的なグリコシル化の人工的切断などの発現後又は抽出後の化学処理処理を必要としない場合にタンパク質は酵素的に活性である。タンパク質分解トリプターゼは、酵素的な活性となる四量体形態に正確に形成されるべきである。“酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼ”と共に同義的に使用した。
【００４１】
非タンパク質分解トリプターゼ−切断せずセルフアセンブルしないトリプターゼの形態。非タンパク質分解トリプターゼの例は、限定しないが、α−トリプターゼを含む。従来技術でのトリプターゼの命名法は一貫していないことを注意する。
【００４２】
機能的にリンク−連結されたＤＮＡ配列を参照する場合、配列が同じリーディングフレームにあり、上流の調節配列が下流の構造配列に関して実行するだろうことを示す。機能的にリンクされるＤＮＡ配列は、必ずしも物理的に互いに直接的にリンクされないが、リンクした配列の機能上の関係に干渉しない、介在するヌクレオチドによって分離されるかもしれない。
【００４３】
ピキア・パストリス−インビトロジェンコーポレーション（米国、カリフォリニア、サンディエゴ）から入手可能なピキア・パストリス菌株ＫＭ７１と同様に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（米国、２０１１０−２２０９、バージニア州、マナサス、ユニバーシティビルディング、１０８０１、ＡＴＣＣ）登録番号２６０４、２０８６４（菌株ＧＳ１１５と同義である）、２８４８５、６０３７２、６６３９０乃至６６３９５、７６２７３、及び７６２７４の寄託された菌株の特徴を有する菌株を含有する任意のピキア・パストリス菌株。ＡＴＣＣ２０８６４（菌株ＧＳ１１５）と菌株ＫＭ７１が好ましい宿主細胞のタイプである。
【００４４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）−大量の所望のポリヌクレオチド配列を産出するために、ＤＮＡポリメラーゼと一対のプライマーを用いて、変性、アニーリング、伸長反応を行なう技術である。反応の詳細は米国特許第４，６８３，１９５号明細書と４，６８３，２０２号明細書を参照のこと。
【００４５】
プロモーター−ＲＮＡポリメラーゼが結合し、ＤＮＡ配列を対応するＲＮＡ配列に下流（つまり３´）へと特異的な転写を導くＤＮＡ配列。ＲＮＡ合成の開始シグナルとしてのプロモーター機能。本プロモーター自身は転写されない。
【００４６】
タンパク質分解トリプターゼ−プロトリプターゼ形態に切断可能でセルフアセンブルするトリプターゼであり、ここでモノマーはトリプターゼ活性を開始するための任意の外因性の若しくはヒト支援型発現後又は精製後の修飾或いは操作を伴わないで四量体にアセンブルされる。タンパク質分解トリプターゼの例は、制限されないが、β−Ｉトリプターゼ（以前はスキントリプターゼと呼ばれていた）、β−ＩＩトリプターゼ（以前は肺トリプターゼと呼ばれていた）、β型トリプターゼ、及びトランスメンブラントリプターゼである。従来技術でのトリプターゼの命名法は一貫していないことを注意する。
【００４７】
分泌シグナルペプチド−一般的に１０乃至８５の優先的な疎水性のアミノ酸残基からのＮ末端伸長。分泌シグナルペプチドは分泌シグナル配列によってコード化され、細胞質のコンパートメントからの成熟したタンパク質の動態化に帰着する分泌経路を開始する。分泌シグナルペプチドは成熟したタンパク質鎖の翻訳後から切断され、成熟したタンパク質の一部を形成しない。発現されたタンパク質はタンパク質分解トリプターゼの酵素的に活性な四量体形態を形成するために分泌されるに違いない。
【００４８】
分泌シグナル配列−オペロンの転写開始部位と第一構造遺伝子との間に位置するＤＮＡ配列。分泌シグナルは分泌シグナルペプチドと呼ばれる短いペプチドをコード化する。
【００４９】
セルフアセンブルする四量体のトリプターゼ−切断可能でセルフアセンブルするトリプターゼ。タンパク質分解トリプターゼはこの用語に含まれる。発明者はセルフアセンブルの特定のモードを制限することを望まないが、アミノ酸１（切断されたタンパク質分解トリプターゼの第一アミノ酸）からのアミノ酸−３と−２でのＲ−Ｖがこの活性に必須であることが信じられている。
【００５０】
ターミネ−ター−転写の停止を示す、転写された配列の３´末端に位置するＤＮＡ配列。
【００５１】
トリプターゼ：他の方法で識別されないのであれば、タンパク質分解トリプターゼ。
【００５２】
遺伝子工学：
制限酵素であるエンドヌクレアーゼでの消化、ＰＣＲによる増幅、ゲルエレクトロフォレシスによるハイブリダイゼーション、ライゲーション、分離及び抽出、異種のＤＮＡと細胞の形質転換、成功した形質転換体の選択、等のＤＮＡの操作における下記に記載の多くの段階は、当業者によって周知であり幅広く実行され、広範囲にここにさらに詳しく述べられない。もし他の方法で言及されないのであれば、ここで利用されるＤＮＡプロトコールは、サンブルック、フリッシュ及びマニアチス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）（１９８９）に記載される。
【００５３】
組換え体の酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼ
タンパク質分解トリプターゼは、酵素的に活性な四量体を形成する、切断可能でセルフアセンブルするトリプターゼである。非タンパク質分解トリプターゼは、切断可能でない。切断は自発的なアセンブルにおいて必要とされる。したがって、非タンパク質分解トリプターゼはセルフアセンブルしない。図１のアミノ酸配列に示されるように、ヒトのタンパク質分解トリプターゼはある配列の相同性を共有する。特に、アミノ酸Ｒ−Ｖは、切断されたタンパク質分解トリプターゼの第一のアミノ酸である、アミノ酸１からの位置−３及び−２でアミノ酸を見つける。ＲＶモチーフはタンパク質分解トリプターゼの切断を暗示する。ＲＶモチーフは切断できないα−トリプターゼでは存在せず、したがって四量体にセルフアセンブルしない。
【００５４】
以前からの組換え体トリプターゼとは異なり、本発明のタンパク質分解トリプターゼは切断部位より前の配列を含み、切断されセルフアセンブルするタンパク質分解トリプターゼを許容する存在を含む。β−ＩＩ及びβ−ＩＩトリプターゼ，β型トリプターゼ、並びにトランスメンブラントリプターゼはタンパク質分解トリプターゼに含まれる。ヒトβ−Ｉ及びβ−ＩＩは、１０２の位置のアミノ酸（β−Ｉはアスパラギンで、一方のβ−ＩＩはリジンである）によって異なる。さらに、ヒトβ−Ｉは２つのＮ−リンクされた部位でグリコシル化され、一方でβ−ＩＩは唯一一つの部位でグリコシル化される。この違いが配列の分析によって予測される一方、本発明によって提供される組換え体タンパク質は、Ｎ１０２が実際にグリコシル化されることを例証する第一のものである。β−トリプターゼ及びα−トリプターゼに存在するアミノ酸Ｎ２０４は、すべてのβ−トリプターゼ及びα−トリプターゼにおいてグリコシル化されると考えられる。
【００５５】
組換え体の酵素的に活性なβ−Ｉトリプターゼ
β−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡの抽出：
実施例１ａの構成を参照するに、β−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡはドナーからマスト細胞のサンプル（４ｘ１０６、全細胞の１．１％）を最初に集めることによって抽出される。次いで、ポリ（Ａ）＋がＬｉＣｌ沈澱及びオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーによって抽出された。ｃＤＮＡライブラリーが適切なファージベクター（米国、カリフォリニア、ラジョラ、ストラタジーン、λ ＺＡＰ ＩＩベクター）で構成されて、スクリーニング以前にエシェリヒア．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞で一旦増幅された。
【００５６】
実施例１ａのライブラリーは、３０％ホルムアミドのハイブリダイゼーション溶液と５ｘＳＳＣを除いて、従来の手法でニックトランスレーションによって２ｘ１０８ｃｐｍ／μｇに３２Ｐラベルされた犬のトリプターゼのｃＤＮＡで４２℃でスクリーニングされた。ポジティブな組換え体は、オートラジオグラフィー、プラーク精製、及びリプロービングによって判別された。ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズするインサートを含有するファージミドは、Ｒ４０８ヘルパーファージを用いてファージベクターから除去されて、エシェリヒア．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に形質転換されて、アルカリ溶菌によって精製される。ｃＤＮＡインサートの配列は、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）ブランドのシークエンシングキット（米国、オハイオ州、クリーブランド、ユナイテッドステイツバイオケミカル）を用いて２本鎖ＤＮＡにおいて修飾されたジデオキシチェインターミネ−ションによって決定された。Ｍ１３フォワード、リバース、及びＫＳプライマー（ストラタジーン）が最初のシークエンス反応に使用された。続くシークエンス反応は、事前に決定されたシークエンスから消化されたオリゴプライマーを使用した。
【００５７】
ポジティブなクローンはまた、ＥＭＢＬ−３のヒトの胎盤の遺伝子ライブラリーなどの市販のライブラリー（米国、カリフォルニア州、パロアルト、クローンテック）をスクリーニングするために使用された。ここで、ｃＤＮＡはニックトランスレーションによってビオチン−７−ｄＡＴＰでラベルされ、固定化されたファージＤＮＡに５０℃でハイブリダイズして、可視化された。ポジティブなクローンはプラーク精製と再度スクリーニングされた。ファージＤＮＡは従来の手法のプレートライセート方法によって精製されて、遺伝子断片を産出するためにＢａｍＨＩで消化された。遺伝子断片はアガロースゲル電気泳動によって分離され、ニトロセルロースに転写されて、トリプターゼｃＤＮＡにハイブリダイズされる。断片のハイブリダイズはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）ファージミド（ストラタジーン）のＢａｍＨＩ部位にライゲートされて、ｃＤＮＡにおける記載のようにヌクレオチド配列が決定される。バンダースライス等（Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ ｅｔ ａｌ）（１９９０）を参照のこと。
【００５８】
前述に記載のようにβ−Ｉトリプターゼをコード化する分離された断片のＤＮＡ配列は、配列番号６に示されるアミノ酸をコード化する配列番号５に描写されている。配列番号６のアミノ酸は、配列番号２に記載される、成熟したタンパク質分解トリプターゼを形成するために切断される。β−Ｉトリプターゼをコード化する断片のＤＮＡ配列は、配列番号１（コード化されたタンパク質は配列番号２に示される。）に記載される。
【００５９】
発現構成へβ−ＩトリプターゼＤＮＡの組み込み：
実施例１ａを参照するに、β−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡは、発現構成を産出する真核生物の宿主でトリプターゼをコード化する配列の発現を導くために適切な調整サブシークエンスと機能的にリンクしている。好ましくは、構成はポジティブな形質転換体の容易い識別を可能にする一つ以上のサブシークエンスを含んでいる。最低条件として、発現構成は、機能的にリンクする５´から３´に向かうプロモーター配列、分泌シグナル配列、β−Ｉトリプターゼをコード化する配列、及びターミネ−ター配列を含むべきである。この手法において、プロモーターは、適切な宿主に組み込まれた場合に、下流の分泌シグナル配列とβ−Ｉトリプターゼ構造遺伝子の転写を開始するだろう。
【００６０】
サブシークエンスをコード化する選択可能な構成物質及び／又は栄養要求性のマーカー並びに複数のクローニング部位と同様に必要なサブシークエンスを含有する数多のプラスミドは市販されており入手可能である。ｐＰＩＣ９の好ましいプラスミドはインビトロジェン（米国、カリフォルニア、サンディエゴ）から入手可能である。ｐＰＩＣ９の概略は図２に提供される。
【００６１】
ｐＰＩＣ９は８０２３の塩基対を有し、１乃至９４８の塩基に５´ＡＯＸＩプロモーター、９４９乃至１２１８塩基にα−機能の分泌シグナル（図２にＳで示されている）、１１９２乃至１２４１塩基に複数のクローニング部位、１２５３乃至１５８６塩基に３´ＡＯＸＩターミネ−ター断片（３´ＡＯＸＩ（ＴＴ）で示されている）を含む環状ＤＮＡプラスミドである。ｐＰＩＣ９はまた、７７１３乃至６８５３塩基にアンピシリン耐性の遺伝子と６７０８乃至６０３４塩基にＣｏｌＥＩオリジンを含む。複数のクローニング部位はＸｈｏＩ， ＳｎａＢＩ， ＥｃｏＲＩ、ＡｖｒＩＩ及びＮｏｔＩの制限酵素部位を含む。このプラスミドはまた、ＢｇｌＩＩ， ＳａｃＩ， ＳａｌＩ，及びＳｔｕＩの制限酵素部位を含む。
【００６２】
他の真核細胞プロモーター及びターミネ−ター配列は、発現構成において比較可能な結果として使用できる。一般的に、これは必要とされないが、プロモーターは、コード化されたトリプターゼの効率的な発現を確定するために選択されたホストと相同性である。プロモーターは構造的であるか又は誘導的であり得る。適切な真核細胞のプロモーター及びターミネ−ター配列は、（ＡＯＸ１に加えて）ＧＡＰ， ＭＯＸ， ＦＭＤ， ＡＤＨ， ＬＡＣ４， ＸＰＲ２， ＬＥＵ２，ＧＡＭ１， ＰＧＫ１， ＧＡＬ７，ＧＡＰＤＨ， ＣＹＣ１，ＣＵＰ１等を含む。この列記は例示であり、独占的ではない。
【００６３】
実施例１ａに示されるように、β−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡ配列は、ｐＰＩＣ９の複数のクローニング部位に含まれる制限酵素部位によって与えられる付着末端との相補的なオーバーハングを産出するために分離されたトリプターゼＤＮＡ配列の５´と３´末端を修飾することによって、ｐＰＩＣ９の複数のクローニング部位に導入される。ｐＰＩＣ９プラスミドと増幅されたβ−Ｉトリプターゼの断片は、すべて従来の周知の手法において、適切な制限酵素で消化され、ハイブリダイズされて、ライゲート（Ｔ４ＤＮＡライゲース）され、適切な細菌の宿主（エシェリヒア．コリ菌株ＪＭ１０９、プロメガコーポレーション、米国、ウィスコンシン州、マジソンが好まれる）に形質転換（塩化カルシウム）され、アンピシリン耐性によってポジティブクローンが選択される。
【００６４】
β−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡ断片の末端を修飾するために、β−ＩトリプターゼＤＮＡは、適切な制限酵素ヌクレア−ゼ認識部位を含むが、コード化されたタンパク質のアミノ酸配列は変化しない、部分的に相同性なヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。結果となるアンプリコンはしたがって同一のタンパク質をコード化するが、β−Ｉトリプターゼをコード化する断片を発現構成に組み込むことを必要とする制限酵素部位を含む。β−ＩトリプターゼＤＮＡとＤＮＡコードの退化の知識を用いて、コード化されたペプチドのアミノ酸配列を変化しない適切な認識部位を導入する多くの適切なプライマーが構成される。
【００６５】
実施例により完璧に記載されるように、配列番号３と配列番号４に描写される例示的なプライマーを備える配列番号５に示されるようなＤＮＡ配列の増幅は、５´末端に近接するＸｈｏＩ制限部位の断片と３´末端に近接するＮｏｔＩ制限部位の断片を含有する増幅されたβ−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡ断片を３産出した。それら２つの制限部位は見本としてのみである。事実上、任意の制限部位は、コード化されたβ−Ｉトリプターゼ酵素の配列を変化せずに、β−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡ断片のターミナル末端に導入できる。選択はユーザー次第であり、最後の発現構成に組み込まれる他のサブシークエンスで利用可能な形態、位置、制限部位の数にほとんど完全に依存する。
【００６６】
末端のＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位を含有する修飾されたアンプリコンは、任意のプラスミド又はＸｈｏＩ認識部位とＮｏｔＩ認識部位を含有する構成に従来の周知の手法で容易くインサートできる。
【００６７】
他のサブシークエンスはまた発現構成に含むことができる。一つの特異的な支援型のサブシークエンスは、細胞から発現されたタンパク質の分泌を導くためのシグナルペプチドをコード化する分泌シグナル配列である。シグナルペプチドは成熟したタンパク質のいずれの部分を形成せず、シグナルペプチドは細胞壁を通過するようにタンパク質から切断され、それによって成熟したタンパク質を産出する。本発明の目的において、好ましい分泌シグナル配列は、処理されないタンパク質のＫＥＸ２切断部位をコード化する配列である。次いで、酵母のシグナルペプチダーゼのＫＥＸ２の作用は、タンパク質の残存物からシグナルペプチドを切断し、それによって成熟したβ−Ｉトリプターゼ酵素を産出する。α−機能の分泌シグナルのサブシークエンスはピキア宿主を用いて組換え体β−Ｉトリプターゼの分泌において好ましい。
【００６８】
実施例１ａに記載のように、クローニングのために細菌に宿主にβ−Ｉトリプターゼをコード化する構成を形質転換した後、ポジティブな形質転換体はアンピシリン耐性コロニーから抽出されたプラスミドの制限分析によって適切にアセンブルされた発現構成においてスクリーニングされた。次いで、発現構成は標準的な手法で抽出され、コード化されたヒトのβ−Ｉトリプターゼの発現において適切な真核細胞の宿主に形質転換された。
【００６９】
真核細胞の宿主の形質転換：
次いで、ヒトのβ−Ｉトリプターゼをコード化する発現構成は実施例２ａに記載のような適切な真核細胞の宿主に組み込まれる。好ましい宿主は酵母細胞である。翻訳後に細胞によって発現されたβ−Ｉトリプターゼが適切に処理されるために、真核細胞の宿主が使用されるべきである。真核細胞の宿主の宿主によって処理される翻訳後の細胞間処理は、成熟なタンパク質の酵素活性に影響を与えるために重要である。
【００７０】
好ましい宿主は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ， Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ， Ｓａｃｃｈａｒｏｎｉｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ， Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む。最も好ましい宿主は、ピキア属である。ピキアから、最も好ましい宿主はＡＴＣＣ２０８６４（菌株ＧＳ１１５）又はＫＭ７１（インビトロジェン）の特性を有するピキア・パストリスである。
【００７１】
形質転換は、従来の手法のエレクトロポレーションによって好ましく達成される。宿主細胞は１Ｍのソルビトールでの広範囲な洗浄によってエレクトロコンペテントになり、次いで、適切な単一の切断する制限酵素（例えば、ｐＰＩＣ９，ＳａｌＩ又はＳａｃＩで）で事前に消化された発現構成のアリコートで混合され、形質転換された。形質転換が成功した栄養要求体は最小限の培養液でスクリーニングされ、次いで高レベルのトリプターゼを生成するクローンを識別するためにフレッシュな培養液で再度スクリーニングされた。
【００７２】
誘導プロモーターに機能的にリンクしている場合、形質転換が成功した栄養要求体はβ−Ｉトリプターゼの生成を開始するために必要とされる誘導物質を含有する培養液でスクリーニングされる。
【００７３】
β−Ｉトリプターゼは、ここに参照として組み込まれる、プロメガコープレーションに譲渡された、１９９７年１月１４日に出願されたＮｉｌｅｓとＨａａｋ−Ｆｒｅｎｄｓｃｈｏの米国特許第５，５９４，１１６号明細書の記載のように酵素とリンクした免疫吸着アッセイを用いて培養液からアッセイできる。簡略すると、適切なマイクロタイタープレートは、特にニワトリである、免疫されたトリ由来のヒトのトリプターゼに特異的な捕獲抗体でコーティングされた。これは捕獲抗体の溶液でマイクロタイタープレートをコーティングすることによってなされ、４℃で８乃至４８時間インキュベーションする。次いで、コーティングされたプレートはＴＢＳＴ溶液（Ｔｗｅｅｎ２０のトリスで緩衝された食塩水）で完全に洗浄された。次いで、マイクロタイタープレート自体への非特異的な残存する結合は、ブロッキングバッファーでプレートをコーティングすることによってブロックされた。一般的に使用されるブロッキングバッファーは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液である。プレートはＴＢＳＴで再度洗浄された。
【００７４】
次いで、試験される溶液はブロッキングバッファーで希釈された。多くの連続した希釈の準備が推奨される。次いで、プレートはテスト溶液でコーティングされ、室温で少なくとも２時間インキュベートされた。
【００７５】
インキュベーション後、プレートはＴＢＴＳＴで再度洗浄された。リン酸で緩衝した食塩水又はＴｗｅｅｎのリン酸で緩衝した食塩水などの他の緩衝液がまた使用されるかもしれない。
【００７６】
次ぎの段階は捕獲されたトリプターゼに結合する抗体溶液を検出するトリプターゼを導入することである。好ましい検出抗体は、トリプターゼに特異的なネズミ由来のモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の溶液は調製され、ウェルはコーティングされ、室温で少なくとも２時間インキュベートされた。インキュベーション後、プレートは再びＴＢＳＴで洗浄された。
【００７７】
プレートはＴＢＳＴで洗浄され、次いでホースラディッシュペルオキシダ−ゼ結合の特定の抗体でコーティングされた。かかるホースラディッシュペルオキシダーゼ結合の特定の抗体は当業者において周知である。かかる結合を調製するための従来の方法は、ホースラディッシュペルオキシダーゼの活性化されたペルオキシダーゼとアミノ基の間のシッフ塩基の形成を後に続けて、酵素の炭水化物側鎖を酸化させるために過ヨウ素酸ナトリウムを使用することを含んでいる。結合の好ましい抗体は、ゴート由来の抗マウスＩｇＧ抗体である。次いで、シッフ塩基は安定した抗体／酵素結合を産出するために還元（ホウ素水素化ナトリウム）された。次いで、マイクロタイタープレートのウェルは室温で少なくとも２時間インキュベートされた。結合抗体は捕獲抗体又はトリプターゼ自体と反応するべきではないことがここで重要である。プレートは、基質を添加する前にＴＢＳで三回洗浄されることが好ましい。
【００７８】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質溶液は各ウェルに添加され、室温で１５分間インキュベートされた。カラー反応が停止するまで酸が添加された。次いで、ウェルは４５０ｎｍで分光計で試験された。比色検定において、基質３，３´，５，５´−テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）との接合で使用されるホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体が好ましい。他のホースラディッシュペルオキシダーゼ、例えばＯ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド（ＯＰＤ）及び抗マウスアルカリフォスファターゼなどが等しい成功で接合する。比色の二重の抗体サンドイッチＥＬＩＳＡは約２０ｐｇ／ｍｌの感度を有し、１５乃至２０００ｐｇ／ｍｌの範囲の線形の反応を有し、ｒは０．９９以上である。
【００７９】
ＣＢＺ Ｌｙｓ−チオベニルエステル／ＤＮＴＰ結合切断アッセイ又は他の酵素切断アッセイはまた、β−Ｉトリプターゼの酵素活性を分析するために使用できる。
【００８０】
組換え体の酵素的に活性なβ−ＩＩトリプターゼ
ヒトβ−Ｉトリプターゼを組換え体ヒトβ−ＩＩトリプターゼに変換：
ヒトβ−Ｉ及びヒトβ−ＩＩトリプターゼはアミノ酸１０２以外は相同性のアミノ酸であり、β−Ｉトリプターゼのアミノ酸１０２はアスパラギン残基であり、一方でβ−ＩＩトリプターゼのアミノ酸１０２はリジン残基である。実施例１ｂにより詳細に記載のように、アミノ酸１０２は、β−ＩトリプターゼのクローンｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙで突然変異しアスパラギンからリジンに変換し、それによってβ−Ｉトリプターゼのアミノ酸配列からβ−ＩＩトリプターゼのアミノ酸配列に変化する。新規のクローンはｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋと呼ばれる。遺伝子は、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（登録商標）（プロメガコーポレーション）でキットの指示書にしたがって突然変異された。この突然変異に使用されたオリゴヌクレオチドは、配列番号７：（５´―ＧＡＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣ―３´）である。結果となる突然変異されたトリプターゼＤＮＡ、つまり組換え体β−ＩＩトリプターゼは配列番号８で示され、そのアミノ酸配列は配列番号９に記載される。配列番号９のペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸を有する、成熟したβ−ＩＩトリプターゼを形成するために切断される。切断されて成熟したβ−ＩＩトリプターゼをコード化するＤＮＡは、配列番号１０に示される。
【００８１】
実施例１ｂに記載のように、突然変異の反応は細菌株ＢＭＨ７１−１８（キットに含まれている）を形質転換するために使用される。同様の結果をもたらす例えば、ＥＳ１３０１などのｍｕｔＳ遺伝子のトランスポゾンの挿入を含む、他の菌株は同様が使用できる。ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ能力細胞が好ましい。ＤＮＡは細胞から分離されて、ＪＭ１０９エシェリヒア．コリ細胞を形質転換するために使用される。ＪＭ１０９細胞から分離されたＤＮＡは、アミノ酸１０２の突然変異を確認するために制限酵素で消化される。
【００８２】
ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋ ＤＮＡをピキアと形質転換：
次いで、ヒトβ−ＩＩトリプターゼをコード化する発現構成ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋは、前述のように適切な真核細胞の宿主に組み込まれた。翻訳後に細胞によってβ−ＩＩトリプターゼが適切に処理されるために真核細胞の宿主が使用されるべきである。真核細胞の宿主による翻訳後の細胞間処理は、成熟したタンパク質に酵素活性を与えるために重要である。前述したように、発現構成は、好ましくは酵母である、任意の適切な真核細胞の宿主に組み込むことができる。好ましい宿主は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ， Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ， Ｓａｃｃｈａｒｏｎｉｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ， Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む。最も好ましい宿主は、ピキア属である。ピキアから、最も好ましい宿主はＡＴＣＣ２０８６４（菌株ＧＳ１１５）、ＳＭＤ１１６８（インビトロジェン）又はＫＭ７１（インビトロジェン）の特性を有するピキア・パストリスである。実施例２ｂは、ｐＰＩＣ−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋとピキア・パストリス菌株、ＳＭＤ１１６８、ＧＳ１１５及びＫＭ７１との形質転換構成を詳細に記する。ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋ ＤＮＡは、宿主に形質転換される前にＳａｌＩで消化された。
【００８３】
宿主細胞は、従来の手法のエレクトロポレーションによって形質転換され、前述したようにスクリーニングされた。誘導プロモーターに機能的にリンクしている場合、形質転換が成功した栄養要求体は、前述のようにトリプターゼの生成を開始するために必要とされる誘導物質を含有する培養液でスクリーニングされる。
【００８４】
最良の発現反応：
クローンは最良の表現反応において有効になることができる。ここにおいて、様々なクローンの単一コロニーは５０ｍｌのＹＰＤ肉汁培養液（内容／Ｌ：２０ｇのペプトン−Ｙ，１０ｇの酵母抽出物−Ｙ，２０ｇのデキストロース、３０℃でｐＨ６．５）に加えられた。細胞は３０℃で攪拌してオーバーナイトで培養された。次の日に、Ａ６００のオーバーナイトの培養液が確認された。各クローンにおいて、細胞（３００Ａ６００ユニット）は臨床用遠心機で回転数２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。細胞は２５ｍｌのＢＭＭＹ（緩衝された最低限のメタノール複合体培養液：０．５％メタノールを含有するが１％グリセロールを含有しないＢＭＧＹ）で再度懸濁された。ＢＭＧＹは、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、１３．４ｇ／Ｌの窒素を基にした酵母、０．４ｍｇ／Ｌのビオチン、及び１％のグリセロールを含む、最低限のグリセロール複合体培養液で緩衝された。両ＢＭＭＹとＢＭＧＹはインビトロジェンから市販されており入手可能である。細胞は５００ｍｌのＢＭＭＹ培養に移された。次いで、植付けされた培養のＡ６００が確認された。細胞は３０℃で攪拌してオーバーナイトで培養された。
【００８５】
次ぎの日、各培養の５ｍｌのサンプルを採取して、各培養のＡ６００が確認された。各培養に２．５ｍｌのメタノールが供給された。培養液は５ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌヘパリン（ＢＭＭＹで調製）で補われた。細胞は３０℃の攪拌でオーバーナイト培養された。次の日、各培養から５ｍｌのサンプルを採取した。各培養のＡ６００が確認された。各培養に２．５ｍｌのメタノールが供給された。細胞は３０℃の攪拌でオーバーナイト培養された。次ぎの日、各培養の５ｍｌのサンプルを採取して、各培養のＡ６００が確認された。Ａ６００の分析から、成長曲線がお互いに比較できる。活性データもまた比較できる。
【００８６】
酵素的に活性な組換え体タンパク質分解トリプターゼにおける最終使用
ここに記載された組換え体タンパク質分解トリプターゼの明かな利点は、酵素的な活性である。組換え体タンパク質分解トリプターゼが活性であるために、死体のトリプターゼの使用を必要としない、すべての適用において使用できる。
【００８７】
例えば、本発明の組換え体タンパク質分解トリプターゼは死体のトリプターゼと等価の生物的な活性を有するので、様々な動物における抗ヒトトリプターゼ抗体を産出する抗体として使用できる。これは、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ギニアピッグ、ニワトリ、ゴート又は他の動物などの試験動物を一連のブースターインジェクションに続き、組換え体トリプターゼの初期の植え付けで植え付けることによる周知の従来の手法においてなされる。インジェクションは動物において免疫反応を開始して、結果として組換え体トリプターゼに対するポリクローナル抗体の生成に帰着する。
【００８８】
抗体を抽出するために、血清（又は鳥の場合は卵黄）のＩｇＧフラクションが通常の手法で抽出された。卵黄では、これはプロメガコーポレーションの“ＥＧＧｓｔａｒｔ”ＴＭＩｇＹ精製システム（プロメガコーポレーション、米国、ウィスコンシン州、マジソン）市販製品を利用して達成できる。当該技術において周知である他の連続的な沈澱方法などの血清又は卵黄からイミュノグロブリンを抽出する多くの他の方法が存在する。例えば、スクープＲ．Ｋ．（Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．）を参照のこと。抗ヒトトリプターゼ抗体を抽出する十分に完全なタンパク質抽出の従来の方法は、食塩溶液からタンパク質を沈澱することによってタンパク質フラクションを“塩析”することである。試験動物の血清からのＩｇＹポリクローナル抗体は、例えば、クロマトグラフィーの方法を用いて抽出できる。再度、当業者に周知の血清又は卵黄からイミュノグロブリンを抽出するための多くの方法が存在する。
【００８９】
同様な手法において、ここに記載の組換え体タンパク質分解トリプターゼは、従来のハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗ヒトトリプターゼ抗体を生成するために使用できる。この技術において、マウス又は他の試験動物は、所望の免疫反応を開始するために組換え体ヒトトリプターゼで免疫化される。ネズミ由来のモノクローナル抗体において、ブリスタン調製したハツカネズミが幅広く利用される。免疫化動物からの脾臓細胞は、髄腫細胞株のような永久の細胞株を備えた融合によって不滅になる。次いで、融合細胞は、組換え体トリプターゼに特異的な抗体を分泌する細胞において連続的に希釈され、培養され、スクリーニングされる。そのようにして形成されたモノクローナル抗体は多くの適用に使用され、それらの適用は、例えば、ヒトトリプターゼの検出アッセイ、ヒトトリプターゼのエピトープマッピング、又は治療若しくは他の適用でのトリプターゼ活性の阻害などである。前述で記載のような抗体生成の他の組換え技術は、組換え体タンパク質分解トリプターゼに対する抗体を生成するために使用できる。
【００９０】
本発明の組換え体タンパク質分解トリプターゼは、トリプターゼ阻害剤、アンタゴニスト、アゴニスト等として作用する化合物におけるドラッグスクリーニングで使用できる。例えば、トリプターゼ阻害剤をスクリーニングするために、本発明の組換え体タンパク質分解トリプターゼは、推定されるトリプターゼ阻害剤と接触できる。次いで、阻害剤の有効性は、トリプターゼ活性の標準曲線と比較してトリプターゼ酵素活性の欠損を測定することによって決定される。
【００９１】
同様にして、同一のアプローチはタンパク質分解トリプターゼの酵素活性での作用に対する有望な薬の候補をスクリーニングするために使用することができる。これは溶液段階で組換え体タンパク質分解トリプターゼを用いてなされる。主題の組換え体タンパク質分解トリプターゼは酵素的に活性であるために、タンパク質分解トリプターゼに与えられた化合物の作用は、タンパク質分解トリプターゼの酵素活性で有する化合物の作用を測定することによって容易に決定できる。
【００９２】
組換え体タンパク質分解トリプターゼにおける他の使用は、化学的なライブラリー、ペプチドライブラリー等のスクリーニングを含む。組換え体タンパク質分解トリプターゼはまた、インビトロ、インビボ及びエクスビボでの基質の試験において使用できる。加えて、モデル化は組換え体タンパク質分解トリプターゼにおいてなされ得る。
【００９３】
組換え体タンパク質分解トリプターゼはまた、生物的又は他の溶液でのタンパク質分解トリプターゼの存在を分析するために使用できる。例えば、組換え体トリプターゼは、ヒトトリプターゼでの酵素リンク型免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）を発達するために使用できる。例えば、ここに参照として組み入れられた、二重の抗体サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを記載するＮｉｌｅｓとＨａａｋ−Ｆｒｅｎｄｓｃｈｏの米国特許第５，７４４，３１９号明細書を参照のこと。ＥＬＩＳＡｓは多数において異なっているようになるが、構成（そのすべては当該技術において十分に周知である）は関連している。比較的容易い使用で幅広く線形反応範囲により幅広く使用される構成は、二重の抗体サンドイッチＥＬＩＳＡとして周知である。二重の抗体サンドイッチＥＬＩＳＡの基本的なプロトコールは下記の様である。プレートはアッセイされるイミュノグロブリンに特異的な抗体（捕獲抗体と呼ばれる）によってコーティングされる。この場合、捕獲抗体は、前述のように抽出された組換え体トリプターゼに特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体である。次いで、プレートは、試験プレートに対してイミュノグロブリンの非特異的な結合をブロックするウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング剤で洗浄された。次いで、トリプターゼの存在を試験する溶液は、捕獲抗体でコーティングされたプレートでインキュベートされる。次いで、プレートは洗浄され、検出抗体でインキュベートされ、再度洗浄されて、酵素結合の特異的な抗体でインキュベートされる。インキュベーション後、非結合の接合はプレートから洗い流されて、酵素の基質が加えられる。酵素結合の抗体結合の存在は、測定し定量できる、相対的な色の変化に帰着する。
【００９４】
非常に低レベルのタンパク質分解トリプターゼを検出するために、与えられたアッセイの検出限界よりも低いレベルである、組換え体タンパク質分解トリプターゼはサンプルをスパイクするために既知量（又は活性）で使用でき、それによってアッセイされるサンプルのトリプターゼ濃度を検出限界以上に増大し、使用されるアッセイの線形反応の範囲に増大する。
【００９５】
本発明が広範囲に特徴づけられ、品質管理手段に従わせられる、酵素的に活性な組換え体タンパク質分解トリプターゼの大量生産を可能にするために、組換え体トリプターゼに対する抗体は増大し、トリプターゼの存在を検出し、トリプターゼの酵素活性の異なる化合物の作用を測定する多くのアッセイの構成で利用できる。
【００９６】
本発明が提供する組換え体タンパク質分解トリプターゼは、タンパク質分解トリプターゼのホモ四量体を研究するために使用できる。以前は、酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼは、様々なタンパク質分解トリプターゼ遺伝子（例えば、β−Ｉとβ−ＩＩ）からの合成物がヘテロな四量体タンパク質分解トリプターゼを形成する場合にインビボのみで合成された。すなわち、四量体の単一の分子である、酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼは異なるモノマーからなる。対照的に、本発明によって提供されるタンパク質分解トリプターゼにおいて、単一の酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼの四量体分子は同一のモノマー（例えば、β−Ｉモノマーだけが四量体を形成する）で合成される。
【００９７】
さらに、酵素的に活性な組換え体β−ＩＩトリプターゼは、β−Ｉとβ−ＩＩトリプターゼとの差異を判読する実験での制御として使用できる。これは、死体から調製されたトリプターゼが決して１００％純粋でないという事実の見地において特に有用である。代わって、ヒトの死体のトリプターゼはα−トリプターゼと様々な形態のβ−トリプターゼの混合である。したがって、酵素的に活性な組換え体β−ＩＩトリプターゼは、α−トリプターゼと様々な形態のβ−トリプターゼ（図３を参照）との差異を判読する実験での制御として使用できる。
【００９８】
β−トリプターゼの活性部位の突然変異：
トリプターゼの活性部位は、図１に示されるように７つのループ（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，３，１及び２）の位置であると予測される。これを確定するために、突然変異がアミノ酸４４，９１及び１９４になされた。保存されない変化が様々なアミノ酸でなされた。アミノ酸４４，９１及び１９４はアラニンに変化した。しかしながら、アミノ酸は任意の非電荷残基に突然変異できる。分子モデル化によって、それらの単一のポイントミューテーションは二次構造を破壊することを予測しなかった。
【００９９】
図１から見られるように、アミノ酸４４は推定されるＢループ内に位置し、アミノ酸９１はループＣのＣ末端方向に位置し、アミノ酸１９４はループ１内である。アミノ酸４４，９１及び１９４は、触媒性三構造と呼ばれる。タンパク質分解トリプターゼの活性部位が残基４４のヒスチジン、残基９１のアスパラギン、及び残基１９４のセリンを含むかどうかを決定するために、推定される活性部位の突然変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン、カリフォルニア州、ラジョラ）（実施例１ｃで詳細に記載）で産出された。
【０１００】
実施例１ｃで記載のように、突然変異の反応は、細菌の菌株Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ（登録商標）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ超能力細胞を形質転換するために使用された。次いで、構成は実施例２ｃに記載のような適切な真核生物の宿主に形質転換された。ピキア細胞が好ましい。簡略すると、ＤＮＡは第一に直線化された。直線化ＤＮＡはピキアＧＳ１１５細胞に加えられ、前述のようにエレクトロポレーションされた。形質転換されたピキアはｍｕｔ＋とｍｕｔＳの表現型でスクリーニングされた。
【０１０１】
活性部位の突然変異の特異的な切断活性：
実施例４ａ乃至４ｂで示されるように、活性部位の突然変異を有する未精製のβ−Ｉとβ−ＩＩトリプターゼはＣＢＺ−Ｌｙｓ−チオベンジルエステル切断アッセイによって決定される。実施例５に記載のようにタンパク質分解トリプターゼが精製された後、特異的な活性が再度アッセイされる。実施例６ｂの詳細のように、β−Ｉとβ−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変異の比活性は、組換え体の酵素的に活性なβ−Ｉとβ−ＩＩトリプターゼタンパク質よりもほぼ１０００倍低い。
【０１０２】
活性部位の突然変異によるトリプターゼの生成の検証：
活性部位の突然変異により、成熟の欠損によるものではないβ−Ｉとβ−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変位の比活性の欠損を証明するために、タンパク質分解トリプターゼ発現である、活性部位の突然変位の発現が実施例３ｂの詳細のようなβ−トリプターゼに対する抗体を用いてウェスタンブロットで立証された。実施例７に示されるように、β−Ｉとβ−ＩＩトリプターゼのゲルフィルタレーション分析とさらに活性部位の突然変異が確定されたＳ１９４Ａ β−Ｉトリプターゼの活性部位の突然変異は、四量体である。
【０１０３】
タンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異の最終使用：
タンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異における使用は下記を含む。インビトロとインビボの活性研究はトリプターゼに導かれた。多くの幅広いスペクトルのプロテアーゼ阻害剤がインビトロで特効を有し、インビボでは非常に毒性であることが周知である。不運にも、トリプターゼの天然の阻害剤は知られていない。したがって、データ解釈はこれらのインビボ研究で複雑になる。エクシピエントバッファー（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ）（ＮａＣｌ，ＭＥＳ，バッファー、グリセロール、及びヘパリンを含有する）、タンパク質のロード、発熱物質又は低分子のピキアアレルゲンを含有する内因性の生理学的な作用を完全に一致させることは困難である。活性部位の突然変異はタンパク質分解トリプターゼの阻害された形態を提供する。したがって、インビボ研究は、前述に列記した複雑さを伴わずに活性部位の突然変異で処理する。インビトロ、エクスビボ及び他の研究は活性部位の突然変異で実行できる。加えて、活性部位の突然変異はモデル化の研究に使用できる。
【０１０４】
さらに、トリプターゼ酵素の活性部位の突然変異はさらなる研究を補足するために使用できる。両組換え体のヒトβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼイソマーのアミノ酸４４、９１、及び１９４の単一のアミノ酸置換は、組換え体トリプターゼの比活性を突然変異しない酵素の活性よりも１％未満で減少する。高い純度にに精製され、活性酵素の調製と同様の手法で保存できるために、それらの活性が減少されたタンパク質分解トリプターゼはインビボ実験における理想的な制御を提供する。
【０１０５】
活性部位の突然変異はまた、酵素活性を越えて、このユニークなプロテアーゼのさらなる構造的及び機能的な特質を調査するツールを提供する。
【０１０６】
実施例
下記の実施例は、主題である発明のより完全な理解を提供するために単に含まれる。実施例は、ここに記載され請求される本発明の範囲をどのような手法においても限定しない。
【０１０７】
構成の生成
実施例１ａ：ヒトβ−Ｉトリプターゼ発現ベクターの構成：
ｐＢＳＨｕｍＴｒｙ（Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ等、１９９０を参照）によってコード化されたヒトβ−Ｉトリプターゼ遺伝子の５´と３´末端は、一対の部分的に相同性なオリゴヌクレオチドプライマーである、配列番号２と配列番号３を用いＰＣＲを介して修飾される。修飾されたトリプターゼの断片は、ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙを示す発現構成を産出するためにｐＰＩＣ９（図２の“Ｓ”を参照）に見られるα−ファクター分泌シグナルの下流のｐＰＩＣ９（インビトロジェン）のＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位にライゲーションされる。エシェリヒア．コリ菌株ＪＭ１０９（プロメガコーポレーション、米国、ウィスコンシン州、マジソン）は、形質転換体のライブラリーを形成するために標準プロトコール（塩化カルシウム）を用いてライゲーションミックスで形質転換される。形質転換体は、アンピシリン耐性コロニーから抽出されたプラスミドＤＮＡの制限分析によって適切に構成されたｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙ構成においてスクリーニングされる。
【０１０８】
実施例１ｂ：ヒトβ−ＩＩトリプターゼ発現ベクターの構成：
ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙのヒトβ−Ｉトリプターゼのアミノ酸１０２は、アスパラギンからリジンに突然変異し、ヒトβ−Ｉトリプターゼからヒトβ−ＩＩトリプターゼのタンパク質に変化する。遺伝子は、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（プロメガコーポレーション）を用い、キットの説明書にしたがって突然変異された。この突然変異に使用されたオリゴヌクレオチドは前述に記載の配列番号７である。
【０１０９】
突然変異の反応は細菌株ＢＭＨ７１−１８を形質転換するために使用された。例えば、ＥＳ１３０１などのｍｕｔＳ遺伝子でのトランスポゾンインサーションを含有する他の菌株は等しく使用できる。ＤＮＡは細胞から抽出され、ＪＭ１０９エシェリヒア．コリ細胞を形質転換するために使用される。ＪＭ１０９細胞から抽出されたＤＮＡは、アミノ酸１０２の突然変異を確定するために制限酵素で消化された。
【０１１０】
実施例１ｃ：Ｈ４４ａ、Ｄ９１Ａ及びＳ１９４Ａ突然変異の構成：
β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ遺伝子において、３つの推定される活性部位の一つの突然変異を有する突然変異の構成が生成された。各突然変異はアミノ酸残基がアラニンに変化した。
【０１１１】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン、カリフォルニア、ラジョラ）を用いて、部位特異的突然変異が実行された。上部と下部のストランドのオリゴは、各アミノ酸で対になっている。Ｓ１９４Ａにおいて、オリゴの突然変異の対はループ構造を形成することが予期された。したがって、オリゴの２つの対（１つの対はループ構造を形成することが予期されたが、もう一方は形成しない）は別々に試験された。ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙ（β−Ｉトリプターゼ）プラスミドとｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋ（β−ＩＩトリプターゼ）プラスミドは、３つの推定される活性部位で突然変異された。個々の突然変異は各部位で生成された。
【０１１２】
下記のオリゴヌクレオチドは突然変異に使用された。
【０１１３】
配列番号１２、Ｈ４４Ａの上部の鎖：
（５´―ＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＴＧＣＧＴＧＧＧＡＣＣＧＧＡＣ―３´）；
配列番号１３、Ｈ４４Ａの下部の鎖：
（５´―ＧＴＣＣＧＧＴＣＣＣＡＣＧＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＡＧＣＡＣ―３´）；
配列番号１４、Ｄ１９Ａの上部の鎖：
（５´―ＧＣＣＣＡＧＡＴＣＧＧＡＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧ―３´）；
配列番号１５、Ｄ１９Ａの下部の鎖：
（５´―ＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＡＴＴＧＣＣＧＣＴＣＣＧＡＴＣＴＧＧＧＣ―３´）；
配列番号１６、４４℃でループを形成したＳ１９４Ａの第一の上部の鎖：
（５´―ＴＧＴＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧ―３´）；
配列番号１７、Ｓ１９４Ａの第一の下部の鎖：
（５´―ＣＡＣＣＡＧＡＧＧＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡ―３´）；
配列番号１８、ループを形成しないＳ１９４Ａの第二の上部の鎖：
（５´―ＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧＣＣＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＴＧ―３´）；及び
配列番号１９、Ｓ１９４Ａの第二の下部の鎖：
（５´―ＧＣＡＣＡＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＡ―３´）。
【０１１４】
上のオリゴで生成された突然変異は表１に示される配列を有する。
【０１１５】
【表１】
すべての突然変位体はＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｋｉｔに含まれる細胞、Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ超能力細胞に形質転換された。下記の点を除いて、キットの説明書にしたがった。ｐＰＩＣ９ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋプラスミドのテンプレートは、各反応で１６、３２、及び６４ｎｇ使用した。さらに、最終の伸長反応が６８℃で１８分であることを除いて、反応はキットの記載にしたがってサイクル反応した。
【０１１６】
Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ超能力細胞は突然変異反応で形質転換した。各突然変異から、９つのコロニーを採取し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを備えるＬＢでオーバーナイト培養した。プラスミドはＷｉｚａｒｄＳ／Ｖ（プロメガ、ウィスコンシン州、マジソン）を用いて抽出された。突然変異を確定するために、制限酵素の消化は、ＳａｃＩ又はＮａｅＩ Ｔｕｒｂｏを用いて５μｌの各ＤＮＡで２０μｌの終量を導いた。次いで、ＤＮＡは突然変異を確定するためにシークエンスされた。
【０１１７】
構成とピキア・パストリスの形質転換：
実施例２ａ：ヒトβ−Ｉトリプターゼ：
ピキア・パストリス菌株ＧＳ１１５（ＡＴＣＣ２０８６４）とＫＭ７１（インビトロジェン）のフレッシュな培養液は、１Ｍソルビトールの広範囲な洗浄によってエレクトロポレーションのために調製された。エレクトロコンペテントな細胞は、ＳａｌＩ，ＢｇｌＩＩ又はＳａｃＩのいずれか一つで消化された実施例１ａにより生成されたｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙ ＤＮＡのアリコートで混合され、形質転換された。形質転換体は最低限の培養液でＨｉｓ＋プロトトロフとして最初に識別された。メタノールを利用する表現型は、最小のデキストロースと最小のメタノールグリッドプレートのレプリカプレートを介して分析された。
【０１１８】
実施例２ｂ：ヒトβ−ＩＩトリプターゼ：
ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋ ＤＮＡはＳａｌＩで消化された。消化物は３７℃で９０分間インキュベートされ、６５℃で混合物をインキュベートすることで停止された。次いで、混合物はエタノール沈澱され、ペレットは５０μｌの水で再度懸濁された。
【０１１９】
ピキア細胞（ＳＭＤ１１６８、インビトロジェン；ＡＴＣＣ２０８６４；及びＫＭ７１、インビトロジェン）は下記のプロトコールでエレクトロポレーションによってＤＮＡと形質転換された。キュベットは冷蔵庫で予め冷却された。８０μｌのエレクトロコンペテントな細胞はキュベットに移された。ＤＮＡを切断する１０μｌのＳａｌＩが添加された。下記のパラメータ−にしたがって細胞に電流が送られた。ギャップは０．２ｃｍで、電圧は１５００ｖｏｌｔｓで、キャパシタンスは２５μＦで、抵抗は２００Ω。１ｍｌの予め冷却した１Ｍのソルビトールが添加された。２００μｌのエレクトロポレーションされた細胞が最小限のデキストロースプレートに拡散された。プレートは３０℃でインキュベートされた。
【０１２０】
ピキアクローンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｎｕａｌに記載のようにＭｕｔ＋及びＭｕｔＳ形質転換体においてスクリーニングされた。
【０１２１】
実施例２ｃ：Ｈ４４Ａ，Ｄ９１Ａ及びＳ１９４Ａの突然変異
活性部位の突然変異はＳａｃＩで部分的に切断された。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５は、エレクトロポレ−ションによる部分的な切断の活性部位の構成と形質転換され、実施例２ｂに記載のようにスクリーニングされた。
【０１２２】
ウェスタンブロット解析
実施例３ａ：ヒトβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ
ＰＧＮａｓｅＦとのグリコシダーゼ消化はβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼで実行された。図３はβ−Ｉトリプターゼ（ｒｈβＩ）、β−ＩＩトリプターゼ（ｒｈβＩＩ）、及び死体から抽出されたβ−トリプターゼ（天然型β）のウェスタンブロットである。転写されたトリプターゼは、ビオチン化された抗ヒトトリプターゼＡＡ５モノクローナル抗体（プロメガコーポレーション）をプローブにすることで可視化された。未消化のトリプターゼ（最初の３つのレーンを参照）は、消化されたトリプターゼ（２番目の３つのレーンを参照）と比較された。図３に示されるように、グリコシダーゼ消化は組換え体タンパク質分解トリプターゼの単一のトリプターゼのコアタンパク質を産出する。天然のトリプターゼの同様の分解物の存在に注意する。
【０１２３】
組換え体β−Ｉトリプターゼ、組換え体β−ＩＩトリプターゼ、及び死体の肺トリプターゼは、タンパク質のグリコシル化状態を示すためにＣＯＯＭＡＳＳＩＥ（登録商標）で染色されたＳＤＳ ＰＡＧＥにロードされた。図４を参照するに、ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋから産出されたβ−ＩＩトリプターゼは、組換え体β−Ｉトリプターゼよりも一つ少ないグリコシル化部位を有する。ＰＮＧａｓｅＦ又はＥｎｄｏＨのいずれかで消化される場合、ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋから産出されたβ−ＩＩトリプターゼは、ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙトリプターゼ（１コアに減少された）から由来のβ−Ｉトリプターゼと同様な挙動をする（データは示されていない）。死体のトリプターゼはＥｎｄｏＨの追加によって消化されない（データは示されていない）。
【０１２４】
実施例３ｂ：Ｈ４４Ａ，Ｄ９１Ａ及びＳ１９４Ａの突然変異
図５は、β−Ｉトリプターゼのピキア・パストリスの発酵誘発と二つの活性部位の突然変異（Ｈ４４ＡとＳ１９４Ａ）のウェスタンブロットである。ゲルは、ビオチン化された抗ヒトトリプターゼＡＡ５モノクローナル抗体（プロメガコーポレーション）をプローブにすることで可視化された。図５に示されるようにグリコシル化の研究が活性部位の突然変異で実行されないが、活性部位の突然変異は、活性部位の突然変異の活性なカウンターパートとして同一の分子量で移動する。
【０１２５】
酵素アッセイ（未精製の酵素で）
実施例４ａ：ヒトβ−Ｉトリプターゼとヒトβ−ＩトリプターゼのＨ４４Ａ，及びＳ１９４Ａの突然変異：
β−Ｉトリプターゼの活性部位の突然変異Ｈ４４Ａ，及びＳ１９４Ａ並びに組換え体β−Ｉトリプターゼからの未精製サンプルは、ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｓ−チオベンジルエステル／ＤＮＴＢ結合切断アッセイで分析される。アッセイの結果（ユニット／ｍｌ／分）は図５のゲルの下部に示される。
【０１２６】
実施例４ｂ：ヒトβ−ＩＩトリプターゼとヒトβ−ＩＩトリプターゼのＳ１９４Ａの突然変異：
β−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変異Ｓ１９４Ａで形質転換されたピキア・パストリスは培養され、トリプターゼは誘発された。図６はこのクローンから６４時間後のピキア・パストリスの誘発の上澄みのウェスタンブロットである。ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｓ−チオベンジルエステル／ＤＮＴＢ結合切断アッセイは、ロードされたサンプルで実行された。アッセイからの対応するユニット／ｍｌ／分はゲルの下部に示される。
【０１２７】
トリプターゼ精製スキーム
実施例５：組換え体タンパク質分解トリプターゼの精製
下記の実施例はβ−Ｉトリプターゼのクローンで実行される。この精製スキームはまた、β−ＩＩトリプターゼとβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変異で使用される。
【０１２８】
β−Ｉトリプターゼを発現するピキア・パストリスのクローンは、２５０回転／分の攪拌率により３０℃で培養器においてＢＭＭＹ培養液で培養した。培養液のｐＨは５．０乃至５．１に維持され、発現はメタノールを０．５％（ｖ／ｖ）まで添加することによって誘発した。７２時間後に、細胞を有しない培養液は集められて、細胞をペレットにするまで４００ｇで遠心分離され、−７０℃で保存された。β−Ｉトリプターゼの精製は、３７℃のインキュベーターで攪拌して解凍され、活性がアッセイされるβ−Ｉトリプターゼを含有する１１２ｍｌの細胞を有しない培養液で始めた。すべての続く酵素精製段階は室温で処理された。死体のヒトの肺トリプターゼの確立された疎水性でヘパリンと結合する特徴は、β−Ｉトリプターゼのアフィニティ精製における簡素なスキームを考案するために開発された。上澄みは、３０分間の磁石攪拌しながら２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４の固体をゆっくりと添加することでなされた。１５分間の２０，０００ｇの遠心分離後、上澄みはサンプリングされ、活性がアッセイされた。次いで、２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する上澄みは、１０ｍＭＭｅｓ／２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４／０．５ＭＮａＣｌ／１０％（ｖ／ｖ）グリセロール／０．０２％ＮａＮ３（ｐＨ６．１）で事前に平衡化された、６５０Ｍ疎水性の相互作用ゲルマトリックスの６０ｍｌのトヨピアルブチル（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｂｕｔｙｌ）のベッド容量で混合された。混合物は酵素の結合を可能にするために室温で１時間穏やかに攪拌された。
【０１２９】
周期的に、ゲルマトリックスの上澄みはサンプリングされ、結合効率を決定するためにアッセイされた。かなりの活性が未結合のままでない場合、レジンはカラムにロードされ、１リットルの事前に平衡化されたバッファーで洗浄された。結合したタンパク質は、１０ｍＭＭｅｓ／０．２ＭＮａＣｌ／１０％（ｖ／ｖ）グリセロール／０．０２％ＮａＮ３（ｐＨ５．５）の添加によってカラムから溶出された。フラクション（５ｍｌ）が回収されて活性がアッセイされ、２ユニット／ｍｌ以上の含有がプールされた。緑のピキア色素を含有する数多の非トリプターゼタンパク質が共にブチルカラムクロマトグラフィーにおいて精製されたが、この段階は、ピキアの発酵培養液に残存する構成部分を削除する一方でトリプターゼ活性を濃縮する役目をした。ブチルカラムからの活性なフラクションがプールされ、アッセイされ、塩濃度を減少するためにナノピュア水で１：２に希釈し、１０ｍＭＭｅｓ／０．２ＭＮａＣｌ／１０％（ｖ／ｖ）グリセロール／０．０２％ＮａＮ３（ｐＨ５．５）で事前に平衡化された、６５０Ｍのトヨピアル（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ＡＦ−ヘパリンの６０ｍｌのベッド容量で混合された。
【０１３０】
室温で１時間のインキュベーションの間、結合効率を決定するために、上澄みは周期的にアッセイされた。かなりの活性が未結合のままでない場合、レジンはカラムにロードされ、１リットルの事前に平衡化されたバッファーで洗浄された。酵素の溶出は、１０ｍＭＭｅｓ／２ＭＮａＣｌ／１０％（ｖ／ｖ）グリセロール／０．０２％ＮａＮ３（ｐＨ６．１）によって達成された。フラクション（５ｍｌ）が回収されて、少なくとも２ユニット／ｍｌの活性の含有がプールされた。活性のアッセイ後、β−Ｉトリプターゼは透析されて、１０ｋＤａの切断メンブランが設備されたＡＭＩＣＯＮ（登録商標）ブランドの攪拌型細胞濃縮機で濃縮された。精製されたβ−Ｉトリプターゼは、ヘパリンカラム溶出バッファーに保存された。
【０１３１】
ヘパリンアフィニティカラムはβ−Ｉトリプターゼ活性の最も高い濃縮を提供した。精製されたβ−ＩトリプターゼのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析は、精製されたβ−Ｉトリプターゼが、３３，０００Ｄａで弱いバンドでほぼ５０，０００Ｄａで拡散領域である、３５、９００と３４，２００Ｄａの推定される分子量の２つの主要なバンドを含むことを示した。バンドの強度とエリアの画像解析は、２つの主要なバンドが全体の反応性タンパク質の９０％以上を占めることを示した。精製されたβ−Ｉトリプターゼの比活性は、α−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−リジンチオベンジルエステル切断アッセイによって１００ユニット／ｍよりも高く一貫しており、純粋な完全に活性である天然の死体のヒトの肺トリプターゼの比活性よりもほぼ二倍であった。β−Ｉトリプターゼの濃度は、グリコシル化されないタンパク質のサブユニットの分子量としての２７，５００Ｄａ、及び純粋な死体のヒトの肺トリプターゼにおいて決定される２８．１のＡ２８０（１％）によって計算された。フルオレセイン４−メチルルンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）ｐ−グアニジノベンゾアート滴定液での活性部位滴定は、β−Ｉトリプターゼの２つの調製が９４％と９６％の活性サブユニットを含んだことを示した。死体のヒトの肺トリプターゼの２つの調製は、８８％と９６％の活性部位を含んで同時に滴定された。
【０１３２】
酵素活性（精製された酵素で）
実施例６ａ：ヒトβ−Ｉトリプターゼ
この実施例において、β−ＩトリプターゼクローンのＧＳ１１５／ＨｕｍＴｒｙ５−３７の発酵からの培養液の１１２ｍｌサンプルからの精製されたトリプターゼの収率と活性が表示された。比活性は、ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢ結合切断アッセイによって決定された。表２は結果を要約している。この実施例は、主題の発明を用いた精製の容易さと、トリプターゼの高収率を実証する。
【０１３３】
【表２】
実施例６ｂ：β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変異
β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼから精製されたトリプターゼとそれらのそれぞれのＳ１９４Ａ活性部位の突然変異はＣＢＺ−Ｌｙｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢアッセイによってアッセイされた。β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼが活性を有し、一方でβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変異は、最小限であるか又は全く活性を有せず、アミノ酸４４、９１及び１９４がタンパク質分解トリプターゼ活性において必須であることを示唆することを結果は示した。
【０１３４】
β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの両者から精製された酵素の特異的な切断の活性とβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変異はＣＢＺ−Ｌｙｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢアッセイによって決定された。表３は結果を要約する。
【０１３５】
【表３】
明かに、表３に示された結果は活性部位の突然変異による特異的な切断の活性の消滅を示している。
【０１３６】
活性部位の突然変異によるものであって発現の欠損によるものではない活性が欠損した発現したトリプターゼの活性部位の突然変異を確定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが、β−Ｉトリプターゼの活性部位の突然変異（Ｈ４４ＡとＳ１９４Ａ）及び組換え体β−Ｉトリプターゼの酵素的な活性形態で行なわれた。タンパク質はメンブランに転写されて、前述のようにビオチン化抗ヒトトリプターゼＡＡ５モノクローナル抗体（プロメガコーポレーション）でブロッティングされた。図５は、活性部位の突然変異がトリプターゼタンパク質を発現する、この研究のウェスタンブロットの結果を示している。したがって、それらの突然変異の比活性の欠損は活性部位の突然変異によるものであり、タンパク質生成の欠如によるものではない。
【０１３７】
実施例６ｃ：組換え体β−Ｉトリプターゼとヒトの死体のトリプターゼとの動態比較：
この実施例において、本発明による組換え体β−Ｉトリプターゼの動態（ｒＨＴ）は、肺から抽出されたヒトの死体のトリプターゼの動態（ＨＬＴ）と比較された。結果は表４に示される。
【０１３８】
【表４】
実施例６ｄ：組換え体β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼのＫｍの決定：
組換え体β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼイソ型のＫｍは、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット（ＬＢＰ）及びＥａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅプロット（ＥＨＰ）の両者によって決定される。得られた値は：トリプターゼβ−Ｉ＝３６μＭ（ＬＢＰ）と２４．５μＭ（ＥＨＰ）；β−ＩＩトリプターゼ＝３０μＭ（ＬＢＰ）と２９．１μＭ（ＥＨＰ）。
【０１３９】
ゲル濾過アッセイ
実施例７：β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ及びβ−Ｉトリプターゼの活性部位の突然変異のゲル濾過：
β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ及びβ−Ｉトリプターゼの活性部位の突然変異のゲル濾過アッセイは、それらの組換え体のホモ酵素のさらなる４量体構造を確定するために処理された。図７はβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼとＳ１９４Ａのβ−Ｉトリプターゼの活性部位の突然変異のすべてが同一の分子量を有し、それらすべてが四量体であることを確定することが示される。トリプターゼの既知の天然の生理的な阻害剤が存在しないために、酵素は活性な四量体形態から不活性な分離物への分離によって制御されると考えられる。スキワーツＬ及びブラッドフォードＴ（ＳｃｈｗａｒｔｚＬ．Ａｎｄ ＢｒａｄｆｏｒｄＴ．）（１９８６）を参照のこと。したがって、β−Ｉトリプターゼに導入された突然変異が四量体を形成する、その性能ではなく酵素の触媒部位に影響したことを確認すると同様に四量体形態にβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ活性を関連させることは重要であった。
【０１４０】
阻害アッセイ：
実施例８ａ：ＡＥＢＳＦでのβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの阻害
２つのイソ型間に阻害の差異がある場合に、セリンプロテアーゼの阻害剤である、ＡＥＢＳＦ（Ａ．Ｇ．サイエンティフィックインク、カリフォルニア州、サンディエゴ）が組換え体ヒトβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼを阻害するかどうかを決定する研究が行なわれた。
【０１４１】
２００μｇ／ｍｌのβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼのサンプルは、可溶化された０．１ｍＭ又は１．０ｍＭ（終濃度）ＡＥＢＳＦのいずれかで処理され、ＣＢＺ−Ｌｙｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢ結合切断アッセイによって６０分後にモニターされた。
【０１４２】
図８に示されるように、特に１ｍＭの終濃度で使用された場合、ＡＥＢＳＦは組換え体のヒトのイソ型の非常に有力な阻害剤である。２つのイソ型間の明白な差異は見られなかった。
【０１４３】
実施例８ｂ：ＥＬＭＩＲＯＮ（登録商標）アッセイ：
ＥＬＭＩＲＯＮ（アルザ、カリフォルニア州、マウンテンビュー）は、膀胱と胃腸管（ＧＩ）で炎症を抑える薬剤である。トリプターゼは膀胱と胃腸管（ＧＩ）の炎症を多大に介在すると信じられている。したがって、ＥＬＭＩＲＯＮは、トリプターゼに薬剤を滴定することによってｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋから産出される組換え体β−ＩＩトリプターゼの酵素的な阻害に直接作用することを試験した。
【０１４４】
β−ＩＩトリプターゼは、ＥＬＭＩＲＯＮ（５０ｍｇ／ｍｌの保存濃度でｐＨ６．０の水で懸濁した）の１０の十分な希釈液において、２０μｇ／ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ、０．２Ｍ ＮａＣｌ、及び０．５ｍｇ／ｍｌヘパリン、ｐＨ６．１のフラクションに希釈された。様々な濃度（２５、２．５、０．２５及び０．０２５ｍｇ／ｍｌ）はβ−ＩＩトリプターゼと３時間インキュベートされた。活性は、ＣＢＺ−Ｌｙｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢ結合切断によってアッセイされた。ＥＬＭＩＲＯＮは２５乃至０．０２５ｍｇ／ｍｌの試験濃度範囲でβ−ＩＩトリプターゼを阻害しないことが判明した。
【０１４５】
フィブリノーゲン切断アッセイ
実施例９：組換え体及び天然のβ−トリプターゼのフィブリノーゲン溶解活性：
図９を参照するに、生成された天然と組換え体のβ−トリプターゼは、スキワーツ等（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ）（１９８５）によって記載されるようなヒトフィブリノーゲンを代謝する天然と組換え体のβ−トリプターゼの性能を評価した。凍結されたフィブリノーゲンは、０．５ｍｇ／ｍｌヘパリンを伴う１０ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１．０ｍｇ／ｍｌ濃度の１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４によって再度懸濁された。フィブリノーゲンのマスターミックスは４つの１００ｍｌアリコートに分割されて、５μｇの組換え体β−Ｉトリプターゼ（Ｒ βＩトリプターゼ）、組換え体β−ＩＩトリプターゼ（Ｒ βＩＩトリプターゼ）、又は天然のβ−トリプターゼ（天然β）は３つの試験管のうちの一つに添加された。残りの試験管はコントロール（酵素なし）とした。トリプターゼとフィブリノーゲンを含有する試験管は、さらに２つの試験管に分配されて、１つの試験管は−２０℃で、もう一方の試験管は３７℃で６０分間インキュベートされた。次いで、反応は標準の電気泳動方法で４乃至２０％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで２μｇに相当するタンパク質をローディングすることによって解析した。ゲルはＧｅｌＣｏｄｅで染色され、乾燥されてスキャニングにより画像化された。
【０１４６】
図９に示されるように、フィブリノーゲンα、β、γサブユニットはトリプターゼ酵素の不在においても、またインキュベーション処理でも分解されなかった。αとβのサブユニットは、冷却のインキュベーション中でさえも組換え体β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ酵素によって効率的に加水分解された。天然のβ−トリプターゼはフィブリノーゲン溶解の効率が低いが、しかしこれは組換え体酵素と比較して合成基質での全体の低い比活性によって予期された。
【０１４７】
組換え体ヒトトリプターゼ及び組換え体ヒトトリプターゼを得る方法は、ここに例証し記載した特定の試薬、宿主生物、及び遺伝子操作に限定しないが、しかし、付随の請求項の範囲内であるように、それらの修正されて等価な形態をすべて包含することが理解される。
【０１４８】
（文献目録）
【図面の簡単な説明】
【図１】
タンパク質分解及び非タンパク質分解トリプターゼのアミノ酸配列である。図中の黒塗りの下向き三角形は、各成熟したトリプターゼの第一のアミノ酸を示す。記号Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，３，１，及び２は、ウシの膵臓のトリプターゼ及びヒトβ−ＩＩトリプターゼの構造に基づく各トリプターゼの基質と結合するクリフトを形成することを予期される７つのループを与える。
【図２】
ｐＰＩＣ９の概略図である。
【図３】
ヒトβ−Ｉトリプターゼ（ｒｈβＩ）、β−ＩＩトリプターゼ（ｒｈβＩＩ）、及び死体から分離されたβ−Ｉトリプターゼ（天然型β）のウェスタンブロットを示す。ゲルは、ビオチン化された抗ヒトトリプターゼＡＡ５モノクローナル抗体（プロメガコーポレーション）をプローブにすることで可視化できる。ＰＧＮａｓｅＦでのグリコシダーゼ消化がサンプルで実行された。最初の三つのレーンは未消化のトリプターゼを含む。２番目の３つのレーンは消化されたトリプターゼを含む。グリコシダーゼ消化は単一のトリプターゼのコアタンパク質を生じる。
【図４】
タンパク質のグリコシル化の状態を示す組換え体ヒトβ−Ｉ及びβ―ＩＩトリプターゼ並びに天然型トリプターゼのＣＯＯＭＡＳＳＩＥダイで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図５】
ヒトβ−Ｉトリプターゼとその二つの活性部位の突然変位（Ｈ４４Ａ及びＳ１９４Ａ）のピキア・パストリスの発酵誘発のウェスタンブロットである。ゲルは、ビオチン化された抗ヒトトリプターゼＡＡ５モノクローナル抗体（プロメガコーポレーション）をプローブにすることで可視化できる。ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢ結合切断アッセイはロードされたサンプルで実行された。アッセイにより対応するユニット／ｍｌ／分がゲルの下に示されている。
【図６】
８つの異なるヒトβ−ＩＩＳ１９４Ａ活性部位変異型クローンからの６４時間後のピキア・パストリス誘発の上澄みのウェスタンブロットである。ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢ結合切断アッセイはロードされたサンプルで実行された。アッセイにより対応するユニット／ｍｌ／分がゲルの下に示されている。
【図７】
ゲルフィルタレーションによるヒトβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ並びにβ−Ｉトリプターゼ変位型Ｓ１９４Ａにおける分子量の決定を示す。
【図８】
不可逆的セリンプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦによってヒトβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの阻害を例示するグラフである。
【図９】
ヒトβ−トリプターゼによってフィブリノーゲンの切断及び不活性のバイオアッセイの比較を示す。
発明の分野
本発明は、発現が酵素学的に活性なタンパク質分解トリプターゼのコード化を構成し、酵素学的に活性な組換え体のタンパク質分解トリプターゼを発現する遺伝子工学的に改変された真核生物である、微生物の宿主で遺伝子工学的に改変された酵素学的に活性な組換え体のタンパク質分解トリプターゼの生成方法を導く。本発明はまた、発現が活性部位の突然変異による酵素活性を欠損した変異型タンパク質分解トリプターゼのコード化を構成し、活性部位の突然変異を有する変異型組換えタンパク質分解トリプターゼを発現する、遺伝子工学的に改変された真核生物である、遺伝子工学的に改変された微生物の宿主で組換え体のタンパク質分解のトリプターゼの活性部位の突然変異の合成方法を導く。
【０００２】
文献目録
ここに言及される参考文献としての完全な引例は、配列リストの直前の文献目録に含まれる。
【０００３】
関連する技術の記載
マスト細胞β−トリプターゼは、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で未知の生物学的機能である中立のセリンプロテアーゼである。しかしながら、それは喘息、脈管形成及び組織を改変に密接に結び付けられている。それは、マスト細胞の顆粒タンパク質の合計の２０％ｗ／ｖ以内を構成する。β−トリプターゼは、マスト細胞の顆粒に選択的に保存されて、マスト細胞脱顆粒反応で作動される。β−トリプターゼはマスト細胞にとって独占的であるために、マスト細胞を媒介として病理学の特定のマーカーとして好意を獲得した。マスト細胞の異質性、構造及び媒介物質に関する完全な議論のためにはニルソン及びスキワーツ（Ｎｉｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ）（１９９４）を参照すること。
【０００４】
喘息において、マスト細胞は、アレルゲンの攻撃に続いて直ちに起こる、急性の免疫反応に密接に関係している。例えば、ホルゲートとチャーチ（Ｈｏｌｇａｔｅ ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈ）（１９９２）を参照のこと。羊をモデルにしたアレルギーにおいて、Ｊ．Ｍ．クラーク等（Ｊ．Ｍ．Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．）（１９９５）のトリプターゼは抗原に引き起こされる気道反応での重要な仲介者の役割をすることを示している。
【０００５】
多くのタンパク質は、フィブリノーゲンのα及びβチェーンを含有して、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのトリプターゼ切断の基質であることが報告されている。スキワーツ等（１９８５）を参照すること。トリプターゼはフィブリノーゲンを血餅活性を欠損し、潜在的にマスト細胞脱顆粒反応の部位で抗凝血剤の役割をするフラグメントに切断する。
【０００６】
精製された天然のヒトβ−トリプターゼは約１３４ｋＤａの四量体のエンドプロテアーゼである。４つのサブユニットの各々は、約３１乃至３４ｋＤａの大きさである。スキワーツ（１９９５）に言及されるように、１９８１年にヒトのトリプターゼは分散されて富化された肺のマスト細胞から明らかに均一になるように第一に精製された。しかしながら、さらなる調査は、哺乳類のトリプターゼの少なくとも二つの異なるタイプ又はグループが存在することを示しており、それらはタンパク質分解トリプターゼと非タンパク質分解トリプターゼである。それらのトリプターゼ形態のタンパク質分解トリプターゼは、活性トリプターゼを算出するために分解できる。切断可能なタンパク質分解のトリプターゼはβ−トリプターゼ、β型のトリプターゼ、及びトランスメンブラントリプターゼを含む。さらに、β−トリプターゼは２つの優勢なイソ型に分けられて、それらはβ−Ｉとβ−ＩＩである。β−Ｉのイソ型はスキントリプターゼと呼ばれ、β−ＩＩのイソ型はスキントリプターゼは肺トリプターゼと呼ばれる。この新しい命名法がここでは使用される。
【０００７】
切断可能なタンパク質分解トリプターゼと対照的に、第二のタイプであるトリプターゼの非タンパク質分解トリプターゼは切断できない。このようにして、非タンパク質分解トリプターゼは酵素的に活性ではない。非タンパク質分解トリプターゼはα−トリプターゼを含む。フアング（Ｈｕａｎｇ）等（１９９９）は、タンパク質分解トリプターゼをアミノ酸１（分解されたタンパク質分解トリプターゼの第一のアミノ酸）からアミノ酸−３及び−２でのアミノ酸Ｒ−Ｖへの分解に貢献する。Ｒ−Ｖはβ−トリプターゼに存在し、一方でα−トリプターゼには存在しない。さらに、タンパク質分解及び非タンパク質分解トリプターゼは、はっきりした遺伝子からの由来である。
【０００８】
ヒトのトリプターゼは、スミス等（１９８４）によって記載のように、死体の肺組織から慣習的に分離される。
【０００９】
ヒトのトリプターゼをコード化する、クローニングｃＤＮＡが多くの調査で報告されている。イデ（Ｉｄｅ）等（１９９５）を参照するラットのマスト細胞トリプターゼと同様に、ミラー等（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ）（１９９０）、バンダーライス等（Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ ｅｔ ａｌ）（１９９０）及びブロムとヘルマン（Ｂｌｏｍ ａｎｄ Ｈｅｌｌｍａｎ）（１９９３）を参照のこと。
【００１０】
しかしながら、特に活発なトリプターゼを発現する、ヒトのトリプターゼを発現する以前からの試みは、細菌の発現システム又はバキュロウィルスの発現システムを使用することは、酵素力の欠損に帰着するタンパク質の折りたたみ問題を含む無数の問題で悩まされる。これらの失敗は、少なくとも一部分は、トリプターゼ酵素が酵素の活性形態を産出するために翻訳後で大規模に修飾されるという事実による。したがって、原核生物で生成された組換え体トリプターゼの比活性は翻訳後のグリコシル化の欠如により低いと予想されるだろう。さらなる結果として、酵素的に活性な組換え体ヒトトリプターゼの以前からの試みは、方法が酵素前駆体を活性化する発現後の化学的修飾及び後の精製を要求するので、理想とははるかに掛け離れたものであることが分かった。
【００１１】
例えば、サカイ等（１９９６）はバキュロウィルスシステムでの組換え体ヒトα−トリプターゼとβ−トリプターゼ前駆体の発現と精製を報告している。しかしながら、形成されたトリプターゼ前駆体は不活性である。
【００１２】
異種のタンパク質合成のための宿主としてのメチロトローフな酵母（例えばＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋ１ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の使用に関して、これらの生物の特性及びかかる使用におけるそれらの適応性は広範囲に重要な文献において調査された。例えば、フェイバー等（Ｆａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．）（１９９５）、バックホルツ及びグリーソン（ＢｕｃｋｈｏＩｚ ａｎｄ Ｇｌｅｅｓｏｎ）（１９９１）を参照してください。
【００１３】
チェン等（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ）（１９９９）は、メチロトローフな酵母でプロトリプターゼをクローニングした。チェン等の発現した合成物は、活性な四量体トリプターゼを形成するために外因的に処理されるべきである、プロトリプターゼモノマーである。この変換は、活性段階に依存するヘパリン−及びジペプチジルペプチダーゼＩを含有する、追加的な２つのカラム精製方法を必要とする。これらの外生の処理段階は、非常に低い発現レベル、各段階での酵素の量の大規模な欠損及び精製された酵素の非常に低い終量に帰着する。
【００１４】
事前にクローニングされたトリプターゼは、切断部位を含まない。したがって、クローニングされたトリプターゼはアミノ酸−３と−２でＲＶを欠損する。したがって、それらのクローニングされたトリプターゼは切断されない。それらの以前のトリプターゼシステムは切断しないために、以前のトリプターゼは酵素的に活性な四量体を同時に形成しない。
【００１５】
タンパク質分解トリプターゼの活性部位は事前に決定されない。アミノ酸４４、９１、及び１９４がタンパク質分解トリプターゼで保存され、酵素的な活性部位の存在と関係する一方で、これらの三つのアミノ酸が活性のために必要になるという事前の実証はなかった。
【００１６】
フアング等（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ）（１９９９）はα−トリプターゼを突然変異させ、α−トリプターゼの基質と結合するクレフトを形成する表面ループの一つである、残存の２１５の重要性を決定するために昆虫の細胞で発現した。フアング等による昆虫細胞での異種のα−トリプターゼの発現は、タンパク質を活性化するために数多のエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）の翻訳後段階を必要とする。
【００１７】
発明の概要
酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼ（例えば、β−Ｉ，β−ＩＩ，β型）とタンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異だけの発現システムを提供する酵母でのトリプターゼの発現は合成される。様々な活性のタンパク質分解トリプターゼを合成するために、ＤＮＡ発現の構築がＤＮＡと細菌及び酵母との間を行き来するために使用される。例えば、トリプターゼをコード化するＤＮＡの部位直結型突然変異は従来のエシェリヒア．コリの宿主でなされ、次いで、変異型ＤＮＡは、新規なトリプターゼの発現のために適切な真核細胞の宿主に転換される。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様は、５´から３´へ移動する、プロモーターを含有するＤＮＡ発現構成を導き、プロモーターは分泌シグナルの配列に機能的にリンクして、分泌シグナルの配列は活性部位の変位を有するタンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡ配列に機能的にリンクし、ここで発現構成は、活性部位の変位により酵素活性が欠損した成熟なタンパク質分解トリプターゼの発現を導く。
【００１９】
本発明の他の好ましい実施態様は、ＡＯＸ１、ＧＡＰ，ＭＯＸ，ＦＭＤ，ＡＤＨ，ＬＡＣ４，ＸＰＲ２，ＬＥＵ２，ＧＡＭ１、ＰＧＫ１，ＧＡＬ７，ＧＡＰＤＨ，ＣＹＣ１及びＣＵＰ１から構成されるグループから選択される５´から３´へ移動する、プロモーターを含有するＤＮＡ発現構成を導き、プロモーターは分泌シグナルの配列に機能的にリンクして、分泌シグナルの配列は活性部位の変位を有するタンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡ配列に機能的にリンクし、ＤＮＡ配列はターミネーター配列に機能的にリンクする。
【００２０】
本発明によると、タンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡは、タンパク質分解トリプターゼの３つの活性部位アミノ酸（アミノ酸４４、９１、及び１９４）のうちの一つが突然変位される。変異されたＤＮＡは真核細胞の発現システムにクローニングされ、好ましくは酵母の宿主細胞である、適切な真核細胞の宿主細胞に形質転換される。形質転換が成功した宿主細胞は発現し、翻訳後処理を行ない、好ましくは発現を誘発する、活性部位変異型成熟トリプターゼを分泌する。
【００２１】
本発明の他の実施態様は、発現構成を含み発現するために形質転換された生物によって合成される、トリプターゼの酵素活性を欠損する、組換え体タンパク質を導く。好ましくは、ＤＮＡ発現の構成は、アミノ酸４４のヒスチジン、アミノ酸９１のアスパラギン酸、アミノ酸１９４のセリンである、タンパク質分解トリプターゼ遺伝子内の３つの推定される活性部位の一つで突然変異を有する。好ましくは、突然変異はそれらのアミノ酸位置でアラニンに変化する。
【００２２】
さらに、本発明はポリクローナル又はモノクローナル抗ヒトタンパク質分解トリプターゼ抗体の産出方法を導く。好ましい実施態様は、発現構成を含み発現するために形質転換された生物によって合成される、タンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異を備える動物の接種を含む。抗体生成の他の組換え方法は、制限しないが、ファージの表示技術、ライブラリースクリーニング、及びそれら二つの方法の組み合わせを含有して使用できる。本発明はまた、それによって生成される、ポリクローナル、モノクローナル、またはキメラのモノクローナル抗ヒトタンパク質分解トリプターゼ抗体を導く。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施態様は、５´から３´へ移動する、プロモーターを含有するＤＮＡ発現構成を導き、プロモーターは分泌シグナルの配列に機能的にリンクして、分泌シグナルの配列は活性部位の変位を有するタンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡ配列に機能的にリンクし、ここで発現構成は発現構成を含むために形質転換された宿主に酵素活性を有する成熟のタンパク質分解トリプターゼの発現を導く。
【００２４】
本発明のさらなる別の実施態様は、５´から３´へ移動する、プロモーターを含有するＤＮＡ発現構成を導き、プロモーターは分泌シグナルの配列に機能的にリンクして、分泌シグナルの配列は配列番号６のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を有するタンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡ配列に機能的にリンクし、ここで発現構成は発現構成を含むために形質転換された宿主に酵素活性を有する成熟のβ−ＩＩトリプターゼの発現を導く。アミノ酸１０２でのβ−Ｉトリプターゼの突然変異はβ−ＩＩトリプターゼと同一の配列を産出する。β−ＩＩトリプターゼのコード領域の残存部分において変化はない。突然変異がβ−Ｉトリプターゼの突然変異として産出されるが、これより後ではβ−ＩＩトリプターゼと呼ばれ、β−ＩＩトリプターゼと同一のコード領域である。組換え体β−ＩＩトリプターゼは、酵母のゲノムに統合されるＤＮＡ構成を発現する。好ましい実施態様において、遺伝子工学的に改変された酵母細胞は、ここに記載のようにβ−ＩＩトリプターゼ発現構成を含み発現するために形質転換されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を含む。
【００２５】
本発明は、すぐ下流（つまり３´方向）のタンパク質分解トリプターゼの成熟形態をコード化する、機能的にリンクしているＤＮＡ配列を必要とし、発現構成を産出するための分泌シグナル配列をフレーム内に必要とする。ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋをデザインしたプラスミドである好ましい実施態様である、発現構成は、好ましくは酵母菌株であり、最も好ましくはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属菌株である、適切な宿主に形質転換される。そのように形質転換された宿主は、発現構成によってコード化されたβ−ＩＩトリプターゼを発現し分泌する。発現されたβ−ＩＩトリプターゼは、宿主細胞によって正確に処理され、トリプターゼの代替のイソ型として細胞培養液に分泌される。
【００２６】
本発明は、天然型のトリプターゼがプロタンパク質として合成されるという利点を有する。ここに記載される修飾型トリプターゼアンプリコンはＮ−末端アミノ酸前駆体をコード化する配列を欠如する。フレーム内の融合としてこの配列をＮ−末端酵母分泌シグナル配列にクローニングすることによって、分泌されたトリプターゼタンパク質を活性処理することを問題にする必要はない。切断され、セルフアセンブルを行ない、さらに必要とされる外因性の操作なしで活性な四量体酵素を同時に形成する成熟モノマーとして分泌される。
【００２７】
この結果を達成するために、シグナルペプチドの切断部位は、成熟トリプターゼタンパク質のＮ−末端に隣接して位置している。真核細胞の宿主細胞のプロテアーゼの作用によるシグナルペプチドの切断は、分泌されるトリプターゼからシグナルペプチドを移動する。この結果は、ヒトの組織から分離された成熟な天然型トリプターゼ分子で見られる同一のアミノ酸末端残基を含有するトリプターゼの酵素的に活性な成熟形態の分泌である。
【００２８】
ここに記載のタンパク質分解トリプターゼの生成方法の明確な利点は、以前の方法と異なり、そのようにして生成されたトリプターゼは、トリプターゼ作用を開始するための任意の外因性又はヒト支援型発現後若しくは精製後修飾或いは操作を必要としないことである。本発明において、モノマーは分泌されるように切断される。モノマーの活性な四量体へのセルフアセンブルは、細胞からの分泌後に発生する。これは分泌後に自動的に起こる。本発明にしたがって生成されたタンパク質分解トリプターゼは、死体のトリプターゼに比較して優れている酵素活性を有する。
【００２９】
ここに記載されるタンパク質分解トリプターゼの生成方法の他の明白な利点は、前述のようにして生成されたトリプターゼは高い発現レベルを有することである。酵素が死体から精製される従来の精製工程と比較して、ここに記載の方法と結果となるトリプターゼは死体からのトリプターゼで共通して見られる不純物を欠損する。さらに、死体供給源の物質を使用することに関連するバイオハザードを欠損する。ここに記載される方法及び結果となるトリプターゼはまた、バッチ間の偏差が少なく、精製されたトリプターゼの高い均一性を有する。結果となるトリプターゼはまた、高い比活性を有する。
【００３０】
本発明によって産する酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼの即座の有効性は、直ちにいくつかの未到の長所がある。それらは、マスト細胞が介在する疾病でのトリプターゼの生物学的に重要な理解の前進と同様に、潜在的な治療として特定のトリプターゼ阻害剤における組み合わせライブラリーの大規模なスクリーニングを容易にすることを含む。
【００３１】
本発明によって提供されるタンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異は、このユニークなプロテアーゼの構造と機能的な特性についての理解を促進するツールを供給する。活性部位は、酵素反応において必要な部位を意味する。活性部位は、活性部位の表面ループに限定しない。ここに記載の活性部位の突然変異は四量体を形成できる。
【００３２】
本発明による方法は、確定される規格を有するトリプターゼの大きく標準化されたロット（１００ｍｇ以上又は５リットルの酵母培養液）を生成するために使用できる。本方法はまた、マイクログラムからグラム又はキログラム単位の量までトリプターゼを生成するために容易く計量できる。死体からトリプターゼを精製するための従来の方法を用いて、一体のヒトの肺からはほんの１０ミリグラムのトリプターゼが得られる。
【００３３】
好ましいピキアの形質転換体で生成されるトリプターゼの量は、例えば、製薬研究、組み合わせライブラリースクリーニング、及びＸ線結晶学的な研究などの大量規模の研究を可能にするために過去において可能であった量よりも十分に多い。さらに、大量に生成されるトリプターゼはトリプターゼのアゴニスト及び／又はアンタゴニストの発展を可能にする。
【００３４】
本発明の他の目的及び利点は、本発明の下記の詳細な記載及び請求項の読み込みによって明らかになるだろう。
【００３５】
発明の詳細な記載
定義
明細書及び請求項についての明瞭で一貫した理解を提供するために、次の定義はここに使用される。 明らかに記述されない用語は当業者によって理解されるような標準的な意味を有している。
【００３６】
活性部位変位型−活性部位は酵素反応に必要な部位を意味する。活性部位は活性部位の表面ループに制限されない。ここで使用されるように、タンパク質分解トリプターゼの活性部位はアミノ酸４４、９１、及び１９４又はタンパク質分解トリプターゼにおけるそれらの比較可能なアミノ酸である。ここに記載されるタンパク質分解トリプターゼの活性部位変位型は切断可能であり、四量体を形成する。活性部位変位型は酵素的活性を欠損する。活性のこの欠損は、成熟四量体を形成する能力の欠損によるものではなく、活性部位の突然変異によるためである。
【００３７】
酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼ−遺伝子工学的に改変された宿主細胞からの異種のタンパク質の発現に適用するように、発現された／抽出されたタンパク質が所望の活性を有するために分泌シグナルペプチド又は人工的なグリコシル化の人工的切断などの発現後又は抽出後の化学処理処理を必要としない場合にタンパク質は酵素的に活性である。タンパク質分解トリプターゼは、酵素的な活性となる四量体形態に正確に形成されるべきである。“成熟したタンパク質分解トリプターゼ”と共に同義的に使用した。
【００３８】
発現構成−構成が適切な宿主細胞に形質転換される場合にコード化されたタンパク質又はペプチドの発現を導く一つ以上の抑制的なサブシークエンスに機能的にリンクされた、関心のあるタンパク質又はペプチドをコード化する少なくとも一つのサブシークエンスを含有するＤＮＡ構成。かかる構成は、さらに形質転換細胞への抗生物質耐性又は栄養の制限を与えるサブシーケンスのような構成を含むために変形された宿主細胞を選択するためのサブシーケンスのコード化する方法を含んでいるかもしれない。
【００３９】
宿主細胞−一般的に、形質転換を行ない易い真核生物細胞は、限定しないが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ， Ｋ１ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ， Ｐｉｃｈｉａ， Ｓａｃｃｈａｒｏｉｎｙｃｅｓ， Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ，Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｒｎｙｃｅｓ， Ｙａｒｒｏｗｉａ，並びに、同様に， Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ， Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ， Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ， Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ及び
【外１】
【００４０】
成熟した、タンパク質分解トリプターゼ−遺伝子工学的に改変された宿主細胞からの異種のタンパク質の発現に適用するように、発現された／抽出されたタンパク質が所望の活性を有するために分泌シグナルペプチド又は人工的なグリコシル化の人工的切断などの発現後又は抽出後の化学処理処理を必要としない場合にタンパク質は酵素的に活性である。タンパク質分解トリプターゼは、酵素的な活性となる四量体形態に正確に形成されるべきである。“酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼ”と共に同義的に使用した。
【００４１】
非タンパク質分解トリプターゼ−切断せずセルフアセンブルしないトリプターゼの形態。非タンパク質分解トリプターゼの例は、限定しないが、α−トリプターゼを含む。従来技術でのトリプターゼの命名法は一貫していないことを注意する。
【００４２】
機能的にリンク−連結されたＤＮＡ配列を参照する場合、配列が同じリーディングフレームにあり、上流の調節配列が下流の構造配列に関して実行するだろうことを示す。機能的にリンクされるＤＮＡ配列は、必ずしも物理的に互いに直接的にリンクされないが、リンクした配列の機能上の関係に干渉しない、介在するヌクレオチドによって分離されるかもしれない。
【００４３】
ピキア・パストリス−インビトロジェンコーポレーション（米国、カリフォリニア、サンディエゴ）から入手可能なピキア・パストリス菌株ＫＭ７１と同様に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（米国、２０１１０−２２０９、バージニア州、マナサス、ユニバーシティビルディング、１０８０１、ＡＴＣＣ）登録番号２６０４、２０８６４（菌株ＧＳ１１５と同義である）、２８４８５、６０３７２、６６３９０乃至６６３９５、７６２７３、及び７６２７４の寄託された菌株の特徴を有する菌株を含有する任意のピキア・パストリス菌株。ＡＴＣＣ２０８６４（菌株ＧＳ１１５）と菌株ＫＭ７１が好ましい宿主細胞のタイプである。
【００４４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）−大量の所望のポリヌクレオチド配列を産出するために、ＤＮＡポリメラーゼと一対のプライマーを用いて、変性、アニーリング、伸長反応を行なう技術である。反応の詳細は米国特許第４，６８３，１９５号明細書と４，６８３，２０２号明細書を参照のこと。
【００４５】
プロモーター−ＲＮＡポリメラーゼが結合し、ＤＮＡ配列を対応するＲＮＡ配列に下流（つまり３´）へと特異的な転写を導くＤＮＡ配列。ＲＮＡ合成の開始シグナルとしてのプロモーター機能。本プロモーター自身は転写されない。
【００４６】
タンパク質分解トリプターゼ−プロトリプターゼ形態に切断可能でセルフアセンブルするトリプターゼであり、ここでモノマーはトリプターゼ活性を開始するための任意の外因性の若しくはヒト支援型発現後又は精製後の修飾或いは操作を伴わないで四量体にアセンブルされる。タンパク質分解トリプターゼの例は、制限されないが、β−Ｉトリプターゼ（以前はスキントリプターゼと呼ばれていた）、β−ＩＩトリプターゼ（以前は肺トリプターゼと呼ばれていた）、β型トリプターゼ、及びトランスメンブラントリプターゼである。従来技術でのトリプターゼの命名法は一貫していないことを注意する。
【００４７】
分泌シグナルペプチド−一般的に１０乃至８５の優先的な疎水性のアミノ酸残基からのＮ末端伸長。分泌シグナルペプチドは分泌シグナル配列によってコード化され、細胞質のコンパートメントからの成熟したタンパク質の動態化に帰着する分泌経路を開始する。分泌シグナルペプチドは成熟したタンパク質鎖の翻訳後から切断され、成熟したタンパク質の一部を形成しない。発現されたタンパク質はタンパク質分解トリプターゼの酵素的に活性な四量体形態を形成するために分泌されるに違いない。
【００４８】
分泌シグナル配列−オペロンの転写開始部位と第一構造遺伝子との間に位置するＤＮＡ配列。分泌シグナルは分泌シグナルペプチドと呼ばれる短いペプチドをコード化する。
【００４９】
セルフアセンブルする四量体のトリプターゼ−切断可能でセルフアセンブルするトリプターゼ。タンパク質分解トリプターゼはこの用語に含まれる。発明者はセルフアセンブルの特定のモードを制限することを望まないが、アミノ酸１（切断されたタンパク質分解トリプターゼの第一アミノ酸）からのアミノ酸−３と−２でのＲ−Ｖがこの活性に必須であることが信じられている。
【００５０】
ターミネ−ター−転写の停止を示す、転写された配列の３´末端に位置するＤＮＡ配列。
【００５１】
トリプターゼ：他の方法で識別されないのであれば、タンパク質分解トリプターゼ。
【００５２】
遺伝子工学：
制限酵素であるエンドヌクレアーゼでの消化、ＰＣＲによる増幅、ゲルエレクトロフォレシスによるハイブリダイゼーション、ライゲーション、分離及び抽出、異種のＤＮＡと細胞の形質転換、成功した形質転換体の選択、等のＤＮＡの操作における下記に記載の多くの段階は、当業者によって周知であり幅広く実行され、広範囲にここにさらに詳しく述べられない。もし他の方法で言及されないのであれば、ここで利用されるＤＮＡプロトコールは、サンブルック、フリッシュ及びマニアチス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）（１９８９）に記載される。
【００５３】
組換え体の酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼ
タンパク質分解トリプターゼは、酵素的に活性な四量体を形成する、切断可能でセルフアセンブルするトリプターゼである。非タンパク質分解トリプターゼは、切断可能でない。切断は自発的なアセンブルにおいて必要とされる。したがって、非タンパク質分解トリプターゼはセルフアセンブルしない。図１のアミノ酸配列に示されるように、ヒトのタンパク質分解トリプターゼはある配列の相同性を共有する。特に、アミノ酸Ｒ−Ｖは、切断されたタンパク質分解トリプターゼの第一のアミノ酸である、アミノ酸１からの位置−３及び−２でアミノ酸を見つける。ＲＶモチーフはタンパク質分解トリプターゼの切断を暗示する。ＲＶモチーフは切断できないα−トリプターゼでは存在せず、したがって四量体にセルフアセンブルしない。
【００５４】
以前からの組換え体トリプターゼとは異なり、本発明のタンパク質分解トリプターゼは切断部位より前の配列を含み、切断されセルフアセンブルするタンパク質分解トリプターゼを許容する存在を含む。β−ＩＩ及びβ−ＩＩトリプターゼ，β型トリプターゼ、並びにトランスメンブラントリプターゼはタンパク質分解トリプターゼに含まれる。ヒトβ−Ｉ及びβ−ＩＩは、１０２の位置のアミノ酸（β−Ｉはアスパラギンで、一方のβ−ＩＩはリジンである）によって異なる。さらに、ヒトβ−Ｉは２つのＮ−リンクされた部位でグリコシル化され、一方でβ−ＩＩは唯一一つの部位でグリコシル化される。この違いが配列の分析によって予測される一方、本発明によって提供される組換え体タンパク質は、Ｎ１０２が実際にグリコシル化されることを例証する第一のものである。β−トリプターゼ及びα−トリプターゼに存在するアミノ酸Ｎ２０４は、すべてのβ−トリプターゼ及びα−トリプターゼにおいてグリコシル化されると考えられる。
【００５５】
組換え体の酵素的に活性なβ−Ｉトリプターゼ
β−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡの抽出：
実施例１ａの構成を参照するに、β−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡはドナーからマスト細胞のサンプル（４ｘ１０６、全細胞の１．１％）を最初に集めることによって抽出される。次いで、ポリ（Ａ）＋がＬｉＣｌ沈澱及びオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーによって抽出された。ｃＤＮＡライブラリーが適切なファージベクター（米国、カリフォリニア、ラジョラ、ストラタジーン、λ ＺＡＰ ＩＩベクター）で構成されて、スクリーニング以前にエシェリヒア．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞で一旦増幅された。
【００５６】
実施例１ａのライブラリーは、３０％ホルムアミドのハイブリダイゼーション溶液と５ｘＳＳＣを除いて、従来の手法でニックトランスレーションによって２ｘ１０８ｃｐｍ／μｇに３２Ｐラベルされた犬のトリプターゼのｃＤＮＡで４２℃でスクリーニングされた。ポジティブな組換え体は、オートラジオグラフィー、プラーク精製、及びリプロービングによって判別された。ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズするインサートを含有するファージミドは、Ｒ４０８ヘルパーファージを用いてファージベクターから除去されて、エシェリヒア．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に形質転換されて、アルカリ溶菌によって精製される。ｃＤＮＡインサートの配列は、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標）ブランドのシークエンシングキット（米国、オハイオ州、クリーブランド、ユナイテッドステイツバイオケミカル）を用いて２本鎖ＤＮＡにおいて修飾されたジデオキシチェインターミネ−ションによって決定された。Ｍ１３フォワード、リバース、及びＫＳプライマー（ストラタジーン）が最初のシークエンス反応に使用された。続くシークエンス反応は、事前に決定されたシークエンスから消化されたオリゴプライマーを使用した。
【００５７】
ポジティブなクローンはまた、ＥＭＢＬ−３のヒトの胎盤の遺伝子ライブラリーなどの市販のライブラリー（米国、カリフォルニア州、パロアルト、クローンテック）をスクリーニングするために使用された。ここで、ｃＤＮＡはニックトランスレーションによってビオチン−７−ｄＡＴＰでラベルされ、固定化されたファージＤＮＡに５０℃でハイブリダイズして、可視化された。ポジティブなクローンはプラーク精製と再度スクリーニングされた。ファージＤＮＡは従来の手法のプレートライセート方法によって精製されて、遺伝子断片を産出するためにＢａｍＨＩで消化された。遺伝子断片はアガロースゲル電気泳動によって分離され、ニトロセルロースに転写されて、トリプターゼｃＤＮＡにハイブリダイズされる。断片のハイブリダイズはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）ファージミド（ストラタジーン）のＢａｍＨＩ部位にライゲートされて、ｃＤＮＡにおける記載のようにヌクレオチド配列が決定される。バンダースライス等（Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ ｅｔ ａｌ）（１９９０）を参照のこと。
【００５８】
前述に記載のようにβ−Ｉトリプターゼをコード化する分離された断片のＤＮＡ配列は、配列番号６に示されるアミノ酸をコード化する配列番号５に描写されている。配列番号６のアミノ酸は、配列番号２に記載される、成熟したタンパク質分解トリプターゼを形成するために切断される。β−Ｉトリプターゼをコード化する断片のＤＮＡ配列は、配列番号１（コード化されたタンパク質は配列番号２に示される。）に記載される。
【００５９】
発現構成へβ−ＩトリプターゼＤＮＡの組み込み：
実施例１ａを参照するに、β−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡは、発現構成を産出する真核生物の宿主でトリプターゼをコード化する配列の発現を導くために適切な調整サブシークエンスと機能的にリンクしている。好ましくは、構成はポジティブな形質転換体の容易い識別を可能にする一つ以上のサブシークエンスを含んでいる。最低条件として、発現構成は、機能的にリンクする５´から３´に向かうプロモーター配列、分泌シグナル配列、β−Ｉトリプターゼをコード化する配列、及びターミネ−ター配列を含むべきである。この手法において、プロモーターは、適切な宿主に組み込まれた場合に、下流の分泌シグナル配列とβ−Ｉトリプターゼ構造遺伝子の転写を開始するだろう。
【００６０】
サブシークエンスをコード化する選択可能な構成物質及び／又は栄養要求性のマーカー並びに複数のクローニング部位と同様に必要なサブシークエンスを含有する数多のプラスミドは市販されており入手可能である。ｐＰＩＣ９の好ましいプラスミドはインビトロジェン（米国、カリフォルニア、サンディエゴ）から入手可能である。ｐＰＩＣ９の概略は図２に提供される。
【００６１】
ｐＰＩＣ９は８０２３の塩基対を有し、１乃至９４８の塩基に５´ＡＯＸＩプロモーター、９４９乃至１２１８塩基にα−機能の分泌シグナル（図２にＳで示されている）、１１９２乃至１２４１塩基に複数のクローニング部位、１２５３乃至１５８６塩基に３´ＡＯＸＩターミネ−ター断片（３´ＡＯＸＩ（ＴＴ）で示されている）を含む環状ＤＮＡプラスミドである。ｐＰＩＣ９はまた、７７１３乃至６８５３塩基にアンピシリン耐性の遺伝子と６７０８乃至６０３４塩基にＣｏｌＥＩオリジンを含む。複数のクローニング部位はＸｈｏＩ， ＳｎａＢＩ， ＥｃｏＲＩ、ＡｖｒＩＩ及びＮｏｔＩの制限酵素部位を含む。このプラスミドはまた、ＢｇｌＩＩ， ＳａｃＩ， ＳａｌＩ，及びＳｔｕＩの制限酵素部位を含む。
【００６２】
他の真核細胞プロモーター及びターミネ−ター配列は、発現構成において比較可能な結果として使用できる。一般的に、これは必要とされないが、プロモーターは、コード化されたトリプターゼの効率的な発現を確定するために選択されたホストと相同性である。プロモーターは構造的であるか又は誘導的であり得る。適切な真核細胞のプロモーター及びターミネ−ター配列は、（ＡＯＸ１に加えて）ＧＡＰ， ＭＯＸ， ＦＭＤ， ＡＤＨ， ＬＡＣ４， ＸＰＲ２， ＬＥＵ２，ＧＡＭ１， ＰＧＫ１， ＧＡＬ７，ＧＡＰＤＨ， ＣＹＣ１，ＣＵＰ１等を含む。この列記は例示であり、独占的ではない。
【００６３】
実施例１ａに示されるように、β−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡ配列は、ｐＰＩＣ９の複数のクローニング部位に含まれる制限酵素部位によって与えられる付着末端との相補的なオーバーハングを産出するために分離されたトリプターゼＤＮＡ配列の５´と３´末端を修飾することによって、ｐＰＩＣ９の複数のクローニング部位に導入される。ｐＰＩＣ９プラスミドと増幅されたβ−Ｉトリプターゼの断片は、すべて従来の周知の手法において、適切な制限酵素で消化され、ハイブリダイズされて、ライゲート（Ｔ４ＤＮＡライゲース）され、適切な細菌の宿主（エシェリヒア．コリ菌株ＪＭ１０９、プロメガコーポレーション、米国、ウィスコンシン州、マジソンが好まれる）に形質転換（塩化カルシウム）され、アンピシリン耐性によってポジティブクローンが選択される。
【００６４】
β−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡ断片の末端を修飾するために、β−ＩトリプターゼＤＮＡは、適切な制限酵素ヌクレア−ゼ認識部位を含むが、コード化されたタンパク質のアミノ酸配列は変化しない、部分的に相同性なヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。結果となるアンプリコンはしたがって同一のタンパク質をコード化するが、β−Ｉトリプターゼをコード化する断片を発現構成に組み込むことを必要とする制限酵素部位を含む。β−ＩトリプターゼＤＮＡとＤＮＡコードの退化の知識を用いて、コード化されたペプチドのアミノ酸配列を変化しない適切な認識部位を導入する多くの適切なプライマーが構成される。
【００６５】
実施例により完璧に記載されるように、配列番号３と配列番号４に描写される例示的なプライマーを備える配列番号５に示されるようなＤＮＡ配列の増幅は、５´末端に近接するＸｈｏＩ制限部位の断片と３´末端に近接するＮｏｔＩ制限部位の断片を含有する増幅されたβ−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡ断片を３産出した。それら２つの制限部位は見本としてのみである。事実上、任意の制限部位は、コード化されたβ−Ｉトリプターゼ酵素の配列を変化せずに、β−Ｉトリプターゼをコード化するＤＮＡ断片のターミナル末端に導入できる。選択はユーザー次第であり、最後の発現構成に組み込まれる他のサブシークエンスで利用可能な形態、位置、制限部位の数にほとんど完全に依存する。
【００６６】
末端のＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位を含有する修飾されたアンプリコンは、任意のプラスミド又はＸｈｏＩ認識部位とＮｏｔＩ認識部位を含有する構成に従来の周知の手法で容易くインサートできる。
【００６７】
他のサブシークエンスはまた発現構成に含むことができる。一つの特異的な支援型のサブシークエンスは、細胞から発現されたタンパク質の分泌を導くためのシグナルペプチドをコード化する分泌シグナル配列である。シグナルペプチドは成熟したタンパク質のいずれの部分を形成せず、シグナルペプチドは細胞壁を通過するようにタンパク質から切断され、それによって成熟したタンパク質を産出する。本発明の目的において、好ましい分泌シグナル配列は、処理されないタンパク質のＫＥＸ２切断部位をコード化する配列である。次いで、酵母のシグナルペプチダーゼのＫＥＸ２の作用は、タンパク質の残存物からシグナルペプチドを切断し、それによって成熟したβ−Ｉトリプターゼ酵素を産出する。α−機能の分泌シグナルのサブシークエンスはピキア宿主を用いて組換え体β−Ｉトリプターゼの分泌において好ましい。
【００６８】
実施例１ａに記載のように、クローニングのために細菌に宿主にβ−Ｉトリプターゼをコード化する構成を形質転換した後、ポジティブな形質転換体はアンピシリン耐性コロニーから抽出されたプラスミドの制限分析によって適切にアセンブルされた発現構成においてスクリーニングされた。次いで、発現構成は標準的な手法で抽出され、コード化されたヒトのβ−Ｉトリプターゼの発現において適切な真核細胞の宿主に形質転換された。
【００６９】
真核細胞の宿主の形質転換：
次いで、ヒトのβ−Ｉトリプターゼをコード化する発現構成は実施例２ａに記載のような適切な真核細胞の宿主に組み込まれる。好ましい宿主は酵母細胞である。翻訳後に細胞によって発現されたβ−Ｉトリプターゼが適切に処理されるために、真核細胞の宿主が使用されるべきである。真核細胞の宿主の宿主によって処理される翻訳後の細胞間処理は、成熟なタンパク質の酵素活性に影響を与えるために重要である。
【００７０】
好ましい宿主は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ， Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ， Ｓａｃｃｈａｒｏｎｉｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ， Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む。最も好ましい宿主は、ピキア属である。ピキアから、最も好ましい宿主はＡＴＣＣ２０８６４（菌株ＧＳ１１５）又はＫＭ７１（インビトロジェン）の特性を有するピキア・パストリスである。
【００７１】
形質転換は、従来の手法のエレクトロポレーションによって好ましく達成される。宿主細胞は１Ｍのソルビトールでの広範囲な洗浄によってエレクトロコンペテントになり、次いで、適切な単一の切断する制限酵素（例えば、ｐＰＩＣ９，ＳａｌＩ又はＳａｃＩで）で事前に消化された発現構成のアリコートで混合され、形質転換された。形質転換が成功した栄養要求体は最小限の培養液でスクリーニングされ、次いで高レベルのトリプターゼを生成するクローンを識別するためにフレッシュな培養液で再度スクリーニングされた。
【００７２】
誘導プロモーターに機能的にリンクしている場合、形質転換が成功した栄養要求体はβ−Ｉトリプターゼの生成を開始するために必要とされる誘導物質を含有する培養液でスクリーニングされる。
【００７３】
β−Ｉトリプターゼは、ここに参照として組み込まれる、プロメガコープレーションに譲渡された、１９９７年１月１４日に出願されたＮｉｌｅｓとＨａａｋ−Ｆｒｅｎｄｓｃｈｏの米国特許第５，５９４，１１６号明細書の記載のように酵素とリンクした免疫吸着アッセイを用いて培養液からアッセイできる。簡略すると、適切なマイクロタイタープレートは、特にニワトリである、免疫されたトリ由来のヒトのトリプターゼに特異的な捕獲抗体でコーティングされた。これは捕獲抗体の溶液でマイクロタイタープレートをコーティングすることによってなされ、４℃で８乃至４８時間インキュベーションする。次いで、コーティングされたプレートはＴＢＳＴ溶液（Ｔｗｅｅｎ２０のトリスで緩衝された食塩水）で完全に洗浄された。次いで、マイクロタイタープレート自体への非特異的な残存する結合は、ブロッキングバッファーでプレートをコーティングすることによってブロックされた。一般的に使用されるブロッキングバッファーは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液である。プレートはＴＢＳＴで再度洗浄された。
【００７４】
次いで、試験される溶液はブロッキングバッファーで希釈された。多くの連続した希釈の準備が推奨される。次いで、プレートはテスト溶液でコーティングされ、室温で少なくとも２時間インキュベートされた。
【００７５】
インキュベーション後、プレートはＴＢＴＳＴで再度洗浄された。リン酸で緩衝した食塩水又はＴｗｅｅｎのリン酸で緩衝した食塩水などの他の緩衝液がまた使用されるかもしれない。
【００７６】
次ぎの段階は捕獲されたトリプターゼに結合する抗体溶液を検出するトリプターゼを導入することである。好ましい検出抗体は、トリプターゼに特異的なネズミ由来のモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の溶液は調製され、ウェルはコーティングされ、室温で少なくとも２時間インキュベートされた。インキュベーション後、プレートは再びＴＢＳＴで洗浄された。
【００７７】
プレートはＴＢＳＴで洗浄され、次いでホースラディッシュペルオキシダ−ゼ結合の特定の抗体でコーティングされた。かかるホースラディッシュペルオキシダーゼ結合の特定の抗体は当業者において周知である。かかる結合を調製するための従来の方法は、ホースラディッシュペルオキシダーゼの活性化されたペルオキシダーゼとアミノ基の間のシッフ塩基の形成を後に続けて、酵素の炭水化物側鎖を酸化させるために過ヨウ素酸ナトリウムを使用することを含んでいる。結合の好ましい抗体は、ゴート由来の抗マウスＩｇＧ抗体である。次いで、シッフ塩基は安定した抗体／酵素結合を産出するために還元（ホウ素水素化ナトリウム）された。次いで、マイクロタイタープレートのウェルは室温で少なくとも２時間インキュベートされた。結合抗体は捕獲抗体又はトリプターゼ自体と反応するべきではないことがここで重要である。プレートは、基質を添加する前にＴＢＳで三回洗浄されることが好ましい。
【００７８】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質溶液は各ウェルに添加され、室温で１５分間インキュベートされた。カラー反応が停止するまで酸が添加された。次いで、ウェルは４５０ｎｍで分光計で試験された。比色検定において、基質３，３´，５，５´−テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）との接合で使用されるホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体が好ましい。他のホースラディッシュペルオキシダーゼ、例えばＯ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド（ＯＰＤ）及び抗マウスアルカリフォスファターゼなどが等しい成功で接合する。比色の二重の抗体サンドイッチＥＬＩＳＡは約２０ｐｇ／ｍｌの感度を有し、１５乃至２０００ｐｇ／ｍｌの範囲の線形の反応を有し、ｒは０．９９以上である。
【００７９】
ＣＢＺ Ｌｙｓ−チオベニルエステル／ＤＮＴＰ結合切断アッセイ又は他の酵素切断アッセイはまた、β−Ｉトリプターゼの酵素活性を分析するために使用できる。
【００８０】
組換え体の酵素的に活性なβ−ＩＩトリプターゼ
ヒトβ−Ｉトリプターゼを組換え体ヒトβ−ＩＩトリプターゼに変換：
ヒトβ−Ｉ及びヒトβ−ＩＩトリプターゼはアミノ酸１０２以外は相同性のアミノ酸であり、β−Ｉトリプターゼのアミノ酸１０２はアスパラギン残基であり、一方でβ−ＩＩトリプターゼのアミノ酸１０２はリジン残基である。実施例１ｂにより詳細に記載のように、アミノ酸１０２は、β−ＩトリプターゼのクローンｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙで突然変異しアスパラギンからリジンに変換し、それによってβ−Ｉトリプターゼのアミノ酸配列からβ−ＩＩトリプターゼのアミノ酸配列に変化する。新規のクローンはｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋと呼ばれる。遺伝子は、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（登録商標）（プロメガコーポレーション）でキットの指示書にしたがって突然変異された。この突然変異に使用されたオリゴヌクレオチドは、配列番号７：（５´―ＧＡＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣ―３´）である。結果となる突然変異されたトリプターゼＤＮＡ、つまり組換え体β−ＩＩトリプターゼは配列番号８で示され、そのアミノ酸配列は配列番号９に記載される。配列番号９のペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸を有する、成熟したβ−ＩＩトリプターゼを形成するために切断される。切断されて成熟したβ−ＩＩトリプターゼをコード化するＤＮＡは、配列番号１０に示される。
【００８１】
実施例１ｂに記載のように、突然変異の反応は細菌株ＢＭＨ７１−１８（キットに含まれている）を形質転換するために使用される。同様の結果をもたらす例えば、ＥＳ１３０１などのｍｕｔＳ遺伝子のトランスポゾンの挿入を含む、他の菌株は同様が使用できる。ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ能力細胞が好ましい。ＤＮＡは細胞から分離されて、ＪＭ１０９エシェリヒア．コリ細胞を形質転換するために使用される。ＪＭ１０９細胞から分離されたＤＮＡは、アミノ酸１０２の突然変異を確認するために制限酵素で消化される。
【００８２】
ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋ ＤＮＡをピキアと形質転換：
次いで、ヒトβ−ＩＩトリプターゼをコード化する発現構成ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋは、前述のように適切な真核細胞の宿主に組み込まれた。翻訳後に細胞によってβ−ＩＩトリプターゼが適切に処理されるために真核細胞の宿主が使用されるべきである。真核細胞の宿主による翻訳後の細胞間処理は、成熟したタンパク質に酵素活性を与えるために重要である。前述したように、発現構成は、好ましくは酵母である、任意の適切な真核細胞の宿主に組み込むことができる。好ましい宿主は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ， Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ， Ｓａｃｃｈａｒｏｎｉｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ， Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む。最も好ましい宿主は、ピキア属である。ピキアから、最も好ましい宿主はＡＴＣＣ２０８６４（菌株ＧＳ１１５）、ＳＭＤ１１６８（インビトロジェン）又はＫＭ７１（インビトロジェン）の特性を有するピキア・パストリスである。実施例２ｂは、ｐＰＩＣ−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋとピキア・パストリス菌株、ＳＭＤ１１６８、ＧＳ１１５及びＫＭ７１との形質転換構成を詳細に記する。ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋ ＤＮＡは、宿主に形質転換される前にＳａｌＩで消化された。
【００８３】
宿主細胞は、従来の手法のエレクトロポレーションによって形質転換され、前述したようにスクリーニングされた。誘導プロモーターに機能的にリンクしている場合、形質転換が成功した栄養要求体は、前述のようにトリプターゼの生成を開始するために必要とされる誘導物質を含有する培養液でスクリーニングされる。
【００８４】
最良の発現反応：
クローンは最良の表現反応において有効になることができる。ここにおいて、様々なクローンの単一コロニーは５０ｍｌのＹＰＤ肉汁培養液（内容／Ｌ：２０ｇのペプトン−Ｙ，１０ｇの酵母抽出物−Ｙ，２０ｇのデキストロース、３０℃でｐＨ６．５）に加えられた。細胞は３０℃で攪拌してオーバーナイトで培養された。次の日に、Ａ６００のオーバーナイトの培養液が確認された。各クローンにおいて、細胞（３００Ａ６００ユニット）は臨床用遠心機で回転数２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。細胞は２５ｍｌのＢＭＭＹ（緩衝された最低限のメタノール複合体培養液：０．５％メタノールを含有するが１％グリセロールを含有しないＢＭＧＹ）で再度懸濁された。ＢＭＧＹは、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、１３．４ｇ／Ｌの窒素を基にした酵母、０．４ｍｇ／Ｌのビオチン、及び１％のグリセロールを含む、最低限のグリセロール複合体培養液で緩衝された。両ＢＭＭＹとＢＭＧＹはインビトロジェンから市販されており入手可能である。細胞は５００ｍｌのＢＭＭＹ培養に移された。次いで、植付けされた培養のＡ６００が確認された。細胞は３０℃で攪拌してオーバーナイトで培養された。
【００８５】
次ぎの日、各培養の５ｍｌのサンプルを採取して、各培養のＡ６００が確認された。各培養に２．５ｍｌのメタノールが供給された。培養液は５ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌヘパリン（ＢＭＭＹで調製）で補われた。細胞は３０℃の攪拌でオーバーナイト培養された。次の日、各培養から５ｍｌのサンプルを採取した。各培養のＡ６００が確認された。各培養に２．５ｍｌのメタノールが供給された。細胞は３０℃の攪拌でオーバーナイト培養された。次ぎの日、各培養の５ｍｌのサンプルを採取して、各培養のＡ６００が確認された。Ａ６００の分析から、成長曲線がお互いに比較できる。活性データもまた比較できる。
【００８６】
酵素的に活性な組換え体タンパク質分解トリプターゼにおける最終使用
ここに記載された組換え体タンパク質分解トリプターゼの明かな利点は、酵素的な活性である。組換え体タンパク質分解トリプターゼが活性であるために、死体のトリプターゼの使用を必要としない、すべての適用において使用できる。
【００８７】
例えば、本発明の組換え体タンパク質分解トリプターゼは死体のトリプターゼと等価の生物的な活性を有するので、様々な動物における抗ヒトトリプターゼ抗体を産出する抗体として使用できる。これは、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ギニアピッグ、ニワトリ、ゴート又は他の動物などの試験動物を一連のブースターインジェクションに続き、組換え体トリプターゼの初期の植え付けで植え付けることによる周知の従来の手法においてなされる。インジェクションは動物において免疫反応を開始して、結果として組換え体トリプターゼに対するポリクローナル抗体の生成に帰着する。
【００８８】
抗体を抽出するために、血清（又は鳥の場合は卵黄）のＩｇＧフラクションが通常の手法で抽出された。卵黄では、これはプロメガコーポレーションの“ＥＧＧｓｔａｒｔ”ＴＭＩｇＹ精製システム（プロメガコーポレーション、米国、ウィスコンシン州、マジソン）市販製品を利用して達成できる。当該技術において周知である他の連続的な沈澱方法などの血清又は卵黄からイミュノグロブリンを抽出する多くの他の方法が存在する。例えば、スクープＲ．Ｋ．（Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．）を参照のこと。抗ヒトトリプターゼ抗体を抽出する十分に完全なタンパク質抽出の従来の方法は、食塩溶液からタンパク質を沈澱することによってタンパク質フラクションを“塩析”することである。試験動物の血清からのＩｇＹポリクローナル抗体は、例えば、クロマトグラフィーの方法を用いて抽出できる。再度、当業者に周知の血清又は卵黄からイミュノグロブリンを抽出するための多くの方法が存在する。
【００８９】
同様な手法において、ここに記載の組換え体タンパク質分解トリプターゼは、従来のハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗ヒトトリプターゼ抗体を生成するために使用できる。この技術において、マウス又は他の試験動物は、所望の免疫反応を開始するために組換え体ヒトトリプターゼで免疫化される。ネズミ由来のモノクローナル抗体において、ブリスタン調製したハツカネズミが幅広く利用される。免疫化動物からの脾臓細胞は、髄腫細胞株のような永久の細胞株を備えた融合によって不滅になる。次いで、融合細胞は、組換え体トリプターゼに特異的な抗体を分泌する細胞において連続的に希釈され、培養され、スクリーニングされる。そのようにして形成されたモノクローナル抗体は多くの適用に使用され、それらの適用は、例えば、ヒトトリプターゼの検出アッセイ、ヒトトリプターゼのエピトープマッピング、又は治療若しくは他の適用でのトリプターゼ活性の阻害などである。前述で記載のような抗体生成の他の組換え技術は、組換え体タンパク質分解トリプターゼに対する抗体を生成するために使用できる。
【００９０】
本発明の組換え体タンパク質分解トリプターゼは、トリプターゼ阻害剤、アンタゴニスト、アゴニスト等として作用する化合物におけるドラッグスクリーニングで使用できる。例えば、トリプターゼ阻害剤をスクリーニングするために、本発明の組換え体タンパク質分解トリプターゼは、推定されるトリプターゼ阻害剤と接触できる。次いで、阻害剤の有効性は、トリプターゼ活性の標準曲線と比較してトリプターゼ酵素活性の欠損を測定することによって決定される。
【００９１】
同様にして、同一のアプローチはタンパク質分解トリプターゼの酵素活性での作用に対する有望な薬の候補をスクリーニングするために使用することができる。これは溶液段階で組換え体タンパク質分解トリプターゼを用いてなされる。主題の組換え体タンパク質分解トリプターゼは酵素的に活性であるために、タンパク質分解トリプターゼに与えられた化合物の作用は、タンパク質分解トリプターゼの酵素活性で有する化合物の作用を測定することによって容易に決定できる。
【００９２】
組換え体タンパク質分解トリプターゼにおける他の使用は、化学的なライブラリー、ペプチドライブラリー等のスクリーニングを含む。組換え体タンパク質分解トリプターゼはまた、インビトロ、インビボ及びエクスビボでの基質の試験において使用できる。加えて、モデル化は組換え体タンパク質分解トリプターゼにおいてなされ得る。
【００９３】
組換え体タンパク質分解トリプターゼはまた、生物的又は他の溶液でのタンパク質分解トリプターゼの存在を分析するために使用できる。例えば、組換え体トリプターゼは、ヒトトリプターゼでの酵素リンク型免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）を発達するために使用できる。例えば、ここに参照として組み入れられた、二重の抗体サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを記載するＮｉｌｅｓとＨａａｋ−Ｆｒｅｎｄｓｃｈｏの米国特許第５，７４４，３１９号明細書を参照のこと。ＥＬＩＳＡｓは多数において異なっているようになるが、構成（そのすべては当該技術において十分に周知である）は関連している。比較的容易い使用で幅広く線形反応範囲により幅広く使用される構成は、二重の抗体サンドイッチＥＬＩＳＡとして周知である。二重の抗体サンドイッチＥＬＩＳＡの基本的なプロトコールは下記の様である。プレートはアッセイされるイミュノグロブリンに特異的な抗体（捕獲抗体と呼ばれる）によってコーティングされる。この場合、捕獲抗体は、前述のように抽出された組換え体トリプターゼに特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体である。次いで、プレートは、試験プレートに対してイミュノグロブリンの非特異的な結合をブロックするウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング剤で洗浄された。次いで、トリプターゼの存在を試験する溶液は、捕獲抗体でコーティングされたプレートでインキュベートされる。次いで、プレートは洗浄され、検出抗体でインキュベートされ、再度洗浄されて、酵素結合の特異的な抗体でインキュベートされる。インキュベーション後、非結合の接合はプレートから洗い流されて、酵素の基質が加えられる。酵素結合の抗体結合の存在は、測定し定量できる、相対的な色の変化に帰着する。
【００９４】
非常に低レベルのタンパク質分解トリプターゼを検出するために、与えられたアッセイの検出限界よりも低いレベルである、組換え体タンパク質分解トリプターゼはサンプルをスパイクするために既知量（又は活性）で使用でき、それによってアッセイされるサンプルのトリプターゼ濃度を検出限界以上に増大し、使用されるアッセイの線形反応の範囲に増大する。
【００９５】
本発明が広範囲に特徴づけられ、品質管理手段に従わせられる、酵素的に活性な組換え体タンパク質分解トリプターゼの大量生産を可能にするために、組換え体トリプターゼに対する抗体は増大し、トリプターゼの存在を検出し、トリプターゼの酵素活性の異なる化合物の作用を測定する多くのアッセイの構成で利用できる。
【００９６】
本発明が提供する組換え体タンパク質分解トリプターゼは、タンパク質分解トリプターゼのホモ四量体を研究するために使用できる。以前は、酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼは、様々なタンパク質分解トリプターゼ遺伝子（例えば、β−Ｉとβ−ＩＩ）からの合成物がヘテロな四量体タンパク質分解トリプターゼを形成する場合にインビボのみで合成された。すなわち、四量体の単一の分子である、酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼは異なるモノマーからなる。対照的に、本発明によって提供されるタンパク質分解トリプターゼにおいて、単一の酵素的に活性なタンパク質分解トリプターゼの四量体分子は同一のモノマー（例えば、β−Ｉモノマーだけが四量体を形成する）で合成される。
【００９７】
さらに、酵素的に活性な組換え体β−ＩＩトリプターゼは、β−Ｉとβ−ＩＩトリプターゼとの差異を判読する実験での制御として使用できる。これは、死体から調製されたトリプターゼが決して１００％純粋でないという事実の見地において特に有用である。代わって、ヒトの死体のトリプターゼはα−トリプターゼと様々な形態のβ−トリプターゼの混合である。したがって、酵素的に活性な組換え体β−ＩＩトリプターゼは、α−トリプターゼと様々な形態のβ−トリプターゼ（図３を参照）との差異を判読する実験での制御として使用できる。
【００９８】
β−トリプターゼの活性部位の突然変異：
トリプターゼの活性部位は、図１に示されるように７つのループ（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，３，１及び２）の位置であると予測される。これを確定するために、突然変異がアミノ酸４４，９１及び１９４になされた。保存されない変化が様々なアミノ酸でなされた。アミノ酸４４，９１及び１９４はアラニンに変化した。しかしながら、アミノ酸は任意の非電荷残基に突然変異できる。分子モデル化によって、それらの単一のポイントミューテーションは二次構造を破壊することを予測しなかった。
【００９９】
図１から見られるように、アミノ酸４４は推定されるＢループ内に位置し、アミノ酸９１はループＣのＣ末端方向に位置し、アミノ酸１９４はループ１内である。アミノ酸４４，９１及び１９４は、触媒性三構造と呼ばれる。タンパク質分解トリプターゼの活性部位が残基４４のヒスチジン、残基９１のアスパラギン、及び残基１９４のセリンを含むかどうかを決定するために、推定される活性部位の突然変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン、カリフォルニア州、ラジョラ）（実施例１ｃで詳細に記載）で産出された。
【０１００】
実施例１ｃで記載のように、突然変異の反応は、細菌の菌株Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ（登録商標）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ超能力細胞を形質転換するために使用された。次いで、構成は実施例２ｃに記載のような適切な真核生物の宿主に形質転換された。ピキア細胞が好ましい。簡略すると、ＤＮＡは第一に直線化された。直線化ＤＮＡはピキアＧＳ１１５細胞に加えられ、前述のようにエレクトロポレーションされた。形質転換されたピキアはｍｕｔ＋とｍｕｔＳの表現型でスクリーニングされた。
【０１０１】
活性部位の突然変異の特異的な切断活性：
実施例４ａ乃至４ｂで示されるように、活性部位の突然変異を有する未精製のβ−Ｉとβ−ＩＩトリプターゼはＣＢＺ−Ｌｙｓ−チオベンジルエステル切断アッセイによって決定される。実施例５に記載のようにタンパク質分解トリプターゼが精製された後、特異的な活性が再度アッセイされる。実施例６ｂの詳細のように、β−Ｉとβ−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変異の比活性は、組換え体の酵素的に活性なβ−Ｉとβ−ＩＩトリプターゼタンパク質よりもほぼ１０００倍低い。
【０１０２】
活性部位の突然変異によるトリプターゼの生成の検証：
活性部位の突然変異により、成熟の欠損によるものではないβ−Ｉとβ−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変位の比活性の欠損を証明するために、タンパク質分解トリプターゼ発現である、活性部位の突然変位の発現が実施例３ｂの詳細のようなβ−トリプターゼに対する抗体を用いてウェスタンブロットで立証された。実施例７に示されるように、β−Ｉとβ−ＩＩトリプターゼのゲルフィルタレーション分析とさらに活性部位の突然変異が確定されたＳ１９４Ａ β−Ｉトリプターゼの活性部位の突然変異は、四量体である。
【０１０３】
タンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異の最終使用：
タンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異における使用は下記を含む。インビトロとインビボの活性研究はトリプターゼに導かれた。多くの幅広いスペクトルのプロテアーゼ阻害剤がインビトロで特効を有し、インビボでは非常に毒性であることが周知である。不運にも、トリプターゼの天然の阻害剤は知られていない。したがって、データ解釈はこれらのインビボ研究で複雑になる。エクシピエントバッファー（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ）（ＮａＣｌ，ＭＥＳ，バッファー、グリセロール、及びヘパリンを含有する）、タンパク質のロード、発熱物質又は低分子のピキアアレルゲンを含有する内因性の生理学的な作用を完全に一致させることは困難である。活性部位の突然変異はタンパク質分解トリプターゼの阻害された形態を提供する。したがって、インビボ研究は、前述に列記した複雑さを伴わずに活性部位の突然変異で処理する。インビトロ、エクスビボ及び他の研究は活性部位の突然変異で実行できる。加えて、活性部位の突然変異はモデル化の研究に使用できる。
【０１０４】
さらに、トリプターゼ酵素の活性部位の突然変異はさらなる研究を補足するために使用できる。両組換え体のヒトβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼイソマーのアミノ酸４４、９１、及び１９４の単一のアミノ酸置換は、組換え体トリプターゼの比活性を突然変異しない酵素の活性よりも１％未満で減少する。高い純度にに精製され、活性酵素の調製と同様の手法で保存できるために、それらの活性が減少されたタンパク質分解トリプターゼはインビボ実験における理想的な制御を提供する。
【０１０５】
活性部位の突然変異はまた、酵素活性を越えて、このユニークなプロテアーゼのさらなる構造的及び機能的な特質を調査するツールを提供する。
【０１０６】
実施例
下記の実施例は、主題である発明のより完全な理解を提供するために単に含まれる。実施例は、ここに記載され請求される本発明の範囲をどのような手法においても限定しない。
【０１０７】
構成の生成
実施例１ａ：ヒトβ−Ｉトリプターゼ発現ベクターの構成：
ｐＢＳＨｕｍＴｒｙ（Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ等、１９９０を参照）によってコード化されたヒトβ−Ｉトリプターゼ遺伝子の５´と３´末端は、一対の部分的に相同性なオリゴヌクレオチドプライマーである、配列番号２と配列番号３を用いＰＣＲを介して修飾される。修飾されたトリプターゼの断片は、ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙを示す発現構成を産出するためにｐＰＩＣ９（図２の“Ｓ”を参照）に見られるα−ファクター分泌シグナルの下流のｐＰＩＣ９（インビトロジェン）のＸｈｏＩとＮｏｔＩ部位にライゲーションされる。エシェリヒア．コリ菌株ＪＭ１０９（プロメガコーポレーション、米国、ウィスコンシン州、マジソン）は、形質転換体のライブラリーを形成するために標準プロトコール（塩化カルシウム）を用いてライゲーションミックスで形質転換される。形質転換体は、アンピシリン耐性コロニーから抽出されたプラスミドＤＮＡの制限分析によって適切に構成されたｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙ構成においてスクリーニングされる。
【０１０８】
実施例１ｂ：ヒトβ−ＩＩトリプターゼ発現ベクターの構成：
ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙのヒトβ−Ｉトリプターゼのアミノ酸１０２は、アスパラギンからリジンに突然変異し、ヒトβ−Ｉトリプターゼからヒトβ−ＩＩトリプターゼのタンパク質に変化する。遺伝子は、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（プロメガコーポレーション）を用い、キットの説明書にしたがって突然変異された。この突然変異に使用されたオリゴヌクレオチドは前述に記載の配列番号７である。
【０１０９】
突然変異の反応は細菌株ＢＭＨ７１−１８を形質転換するために使用された。例えば、ＥＳ１３０１などのｍｕｔＳ遺伝子でのトランスポゾンインサーションを含有する他の菌株は等しく使用できる。ＤＮＡは細胞から抽出され、ＪＭ１０９エシェリヒア．コリ細胞を形質転換するために使用される。ＪＭ１０９細胞から抽出されたＤＮＡは、アミノ酸１０２の突然変異を確定するために制限酵素で消化された。
【０１１０】
実施例１ｃ：Ｈ４４ａ、Ｄ９１Ａ及びＳ１９４Ａ突然変異の構成：
β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ遺伝子において、３つの推定される活性部位の一つの突然変異を有する突然変異の構成が生成された。各突然変異はアミノ酸残基がアラニンに変化した。
【０１１１】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン、カリフォルニア、ラジョラ）を用いて、部位特異的突然変異が実行された。上部と下部のストランドのオリゴは、各アミノ酸で対になっている。Ｓ１９４Ａにおいて、オリゴの突然変異の対はループ構造を形成することが予期された。したがって、オリゴの２つの対（１つの対はループ構造を形成することが予期されたが、もう一方は形成しない）は別々に試験された。ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙ（β−Ｉトリプターゼ）プラスミドとｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋ（β−ＩＩトリプターゼ）プラスミドは、３つの推定される活性部位で突然変異された。個々の突然変異は各部位で生成された。
【０１１２】
下記のオリゴヌクレオチドは突然変異に使用された。
【０１１３】
配列番号１２、Ｈ４４Ａの上部の鎖：
（５´―ＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＴＧＣＧＴＧＧＧＡＣＣＧＧＡＣ―３´）；
配列番号１３、Ｈ４４Ａの下部の鎖：
（５´―ＧＴＣＣＧＧＴＣＣＣＡＣＧＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＡＧＣＡＣ―３´）；
配列番号１４、Ｄ１９Ａの上部の鎖：
（５´―ＧＣＣＣＡＧＡＴＣＧＧＡＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧ―３´）；
配列番号１５、Ｄ１９Ａの下部の鎖：
（５´―ＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＡＴＴＧＣＣＧＣＴＣＣＧＡＴＣＴＧＧＧＣ―３´）；
配列番号１６、４４℃でループを形成したＳ１９４Ａの第一の上部の鎖：
（５´―ＴＧＴＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧ―３´）；
配列番号１７、Ｓ１９４Ａの第一の下部の鎖：
（５´―ＣＡＣＣＡＧＡＧＧＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＧＣＣＴＴＧＡＣＡ―３´）；
配列番号１８、ループを形成しないＳ１９４Ａの第二の上部の鎖：
（５´―ＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧＣＣＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＴＧ―３´）；及び
配列番号１９、Ｓ１９４Ａの第二の下部の鎖：
（５´―ＧＣＡＣＡＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＡ―３´）。
【０１１４】
上のオリゴで生成された突然変異は表１に示される配列を有する。
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ超能力細胞は突然変異反応で形質転換した。各突然変異から、９つのコロニーを採取し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを備えるＬＢでオーバーナイト培養した。プラスミドはＷｉｚａｒｄＳ／Ｖ（プロメガ、ウィスコンシン州、マジソン）を用いて抽出された。突然変異を確定するために、制限酵素の消化は、ＳａｃＩ又はＮａｅＩ Ｔｕｒｂｏを用いて５μｌの各ＤＮＡで２０μｌの終量を導いた。次いで、ＤＮＡは突然変異を確定するためにシークエンスされた。
【０１１７】
構成とピキア・パストリスの形質転換：
実施例２ａ：ヒトβ−Ｉトリプターゼ：
ピキア・パストリス菌株ＧＳ１１５（ＡＴＣＣ２０８６４）とＫＭ７１（インビトロジェン）のフレッシュな培養液は、１Ｍソルビトールの広範囲な洗浄によってエレクトロポレーションのために調製された。エレクトロコンペテントな細胞は、ＳａｌＩ，ＢｇｌＩＩ又はＳａｃＩのいずれか一つで消化された実施例１ａにより生成されたｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙ ＤＮＡのアリコートで混合され、形質転換された。形質転換体は最低限の培養液でＨｉｓ＋プロトトロフとして最初に識別された。メタノールを利用する表現型は、最小のデキストロースと最小のメタノールグリッドプレートのレプリカプレートを介して分析された。
【０１１８】
実施例２ｂ：ヒトβ−ＩＩトリプターゼ：
ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋ ＤＮＡはＳａｌＩで消化された。消化物は３７℃で９０分間インキュベートされ、６５℃で混合物をインキュベートすることで停止された。次いで、混合物はエタノール沈澱され、ペレットは５０μｌの水で再度懸濁された。
【０１１９】
ピキア細胞（ＳＭＤ１１６８、インビトロジェン；ＡＴＣＣ２０８６４；及びＫＭ７１、インビトロジェン）は下記のプロトコールでエレクトロポレーションによってＤＮＡと形質転換された。キュベットは冷蔵庫で予め冷却された。８０μｌのエレクトロコンペテントな細胞はキュベットに移された。ＤＮＡを切断する１０μｌのＳａｌＩが添加された。下記のパラメータ−にしたがって細胞に電流が送られた。ギャップは０．２ｃｍで、電圧は１５００ｖｏｌｔｓで、キャパシタンスは２５μＦで、抵抗は２００Ω。１ｍｌの予め冷却した１Ｍのソルビトールが添加された。２００μｌのエレクトロポレーションされた細胞が最小限のデキストロースプレートに拡散された。プレートは３０℃でインキュベートされた。
【０１２０】
ピキアクローンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｎｕａｌに記載のようにＭｕｔ＋及びＭｕｔＳ形質転換体においてスクリーニングされた。
【０１２１】
実施例２ｃ：Ｈ４４Ａ，Ｄ９１Ａ及びＳ１９４Ａの突然変異
活性部位の突然変異はＳａｃＩで部分的に切断された。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５は、エレクトロポレ−ションによる部分的な切断の活性部位の構成と形質転換され、実施例２ｂに記載のようにスクリーニングされた。
【０１２２】
ウェスタンブロット解析
実施例３ａ：ヒトβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ
ＰＧＮａｓｅＦとのグリコシダーゼ消化はβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼで実行された。図３はβ−Ｉトリプターゼ（ｒｈβＩ）、β−ＩＩトリプターゼ（ｒｈβＩＩ）、及び死体から抽出されたβ−トリプターゼ（天然型β）のウェスタンブロットである。転写されたトリプターゼは、ビオチン化された抗ヒトトリプターゼＡＡ５モノクローナル抗体（プロメガコーポレーション）をプローブにすることで可視化された。未消化のトリプターゼ（最初の３つのレーンを参照）は、消化されたトリプターゼ（２番目の３つのレーンを参照）と比較された。図３に示されるように、グリコシダーゼ消化は組換え体タンパク質分解トリプターゼの単一のトリプターゼのコアタンパク質を産出する。天然のトリプターゼの同様の分解物の存在に注意する。
【０１２３】
組換え体β−Ｉトリプターゼ、組換え体β−ＩＩトリプターゼ、及び死体の肺トリプターゼは、タンパク質のグリコシル化状態を示すためにＣＯＯＭＡＳＳＩＥ（登録商標）で染色されたＳＤＳ ＰＡＧＥにロードされた。図４を参照するに、ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋから産出されたβ−ＩＩトリプターゼは、組換え体β−Ｉトリプターゼよりも一つ少ないグリコシル化部位を有する。ＰＮＧａｓｅＦ又はＥｎｄｏＨのいずれかで消化される場合、ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋから産出されたβ−ＩＩトリプターゼは、ｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙトリプターゼ（１コアに減少された）から由来のβ−Ｉトリプターゼと同様な挙動をする（データは示されていない）。死体のトリプターゼはＥｎｄｏＨの追加によって消化されない（データは示されていない）。
【０１２４】
実施例３ｂ：Ｈ４４Ａ，Ｄ９１Ａ及びＳ１９４Ａの突然変異
図５は、β−Ｉトリプターゼのピキア・パストリスの発酵誘発と二つの活性部位の突然変異（Ｈ４４ＡとＳ１９４Ａ）のウェスタンブロットである。ゲルは、ビオチン化された抗ヒトトリプターゼＡＡ５モノクローナル抗体（プロメガコーポレーション）をプローブにすることで可視化された。図５に示されるようにグリコシル化の研究が活性部位の突然変異で実行されないが、活性部位の突然変異は、活性部位の突然変異の活性なカウンターパートとして同一の分子量で移動する。
【０１２５】
酵素アッセイ（未精製の酵素で）
実施例４ａ：ヒトβ−Ｉトリプターゼとヒトβ−ＩトリプターゼのＨ４４Ａ，及びＳ１９４Ａの突然変異：
β−Ｉトリプターゼの活性部位の突然変異Ｈ４４Ａ，及びＳ１９４Ａ並びに組換え体β−Ｉトリプターゼからの未精製サンプルは、ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｓ−チオベンジルエステル／ＤＮＴＢ結合切断アッセイで分析される。アッセイの結果（ユニット／ｍｌ／分）は図５のゲルの下部に示される。
【０１２６】
実施例４ｂ：ヒトβ−ＩＩトリプターゼとヒトβ−ＩＩトリプターゼのＳ１９４Ａの突然変異：
β−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変異Ｓ１９４Ａで形質転換されたピキア・パストリスは培養され、トリプターゼは誘発された。図６はこのクローンから６４時間後のピキア・パストリスの誘発の上澄みのウェスタンブロットである。ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｓ−チオベンジルエステル／ＤＮＴＢ結合切断アッセイは、ロードされたサンプルで実行された。アッセイからの対応するユニット／ｍｌ／分はゲルの下部に示される。
【０１２７】
トリプターゼ精製スキーム
実施例５：組換え体タンパク質分解トリプターゼの精製
下記の実施例はβ−Ｉトリプターゼのクローンで実行される。この精製スキームはまた、β−ＩＩトリプターゼとβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変異で使用される。
【０１２８】
β−Ｉトリプターゼを発現するピキア・パストリスのクローンは、２５０回転／分の攪拌率により３０℃で培養器においてＢＭＭＹ培養液で培養した。培養液のｐＨは５．０乃至５．１に維持され、発現はメタノールを０．５％（ｖ／ｖ）まで添加することによって誘発した。７２時間後に、細胞を有しない培養液は集められて、細胞をペレットにするまで４００ｇで遠心分離され、−７０℃で保存された。β−Ｉトリプターゼの精製は、３７℃のインキュベーターで攪拌して解凍され、活性がアッセイされるβ−Ｉトリプターゼを含有する１１２ｍｌの細胞を有しない培養液で始めた。すべての続く酵素精製段階は室温で処理された。死体のヒトの肺トリプターゼの確立された疎水性でヘパリンと結合する特徴は、β−Ｉトリプターゼのアフィニティ精製における簡素なスキームを考案するために開発された。上澄みは、３０分間の磁石攪拌しながら２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４の固体をゆっくりと添加することでなされた。１５分間の２０，０００ｇの遠心分離後、上澄みはサンプリングされ、活性がアッセイされた。次いで、２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する上澄みは、１０ｍＭＭｅｓ／２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４／０．５ＭＮａＣｌ／１０％（ｖ／ｖ）グリセロール／０．０２％ＮａＮ３（ｐＨ６．１）で事前に平衡化された、６５０Ｍ疎水性の相互作用ゲルマトリックスの６０ｍｌのトヨピアルブチル（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｂｕｔｙｌ）のベッド容量で混合された。混合物は酵素の結合を可能にするために室温で１時間穏やかに攪拌された。
【０１２９】
周期的に、ゲルマトリックスの上澄みはサンプリングされ、結合効率を決定するためにアッセイされた。かなりの活性が未結合のままでない場合、レジンはカラムにロードされ、１リットルの事前に平衡化されたバッファーで洗浄された。結合したタンパク質は、１０ｍＭＭｅｓ／０．２ＭＮａＣｌ／１０％（ｖ／ｖ）グリセロール／０．０２％ＮａＮ３（ｐＨ５．５）の添加によってカラムから溶出された。フラクション（５ｍｌ）が回収されて活性がアッセイされ、２ユニット／ｍｌ以上の含有がプールされた。緑のピキア色素を含有する数多の非トリプターゼタンパク質が共にブチルカラムクロマトグラフィーにおいて精製されたが、この段階は、ピキアの発酵培養液に残存する構成部分を削除する一方でトリプターゼ活性を濃縮する役目をした。ブチルカラムからの活性なフラクションがプールされ、アッセイされ、塩濃度を減少するためにナノピュア水で１：２に希釈し、１０ｍＭＭｅｓ／０．２ＭＮａＣｌ／１０％（ｖ／ｖ）グリセロール／０．０２％ＮａＮ３（ｐＨ５．５）で事前に平衡化された、６５０Ｍのトヨピアル（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ＡＦ−ヘパリンの６０ｍｌのベッド容量で混合された。
【０１３０】
室温で１時間のインキュベーションの間、結合効率を決定するために、上澄みは周期的にアッセイされた。かなりの活性が未結合のままでない場合、レジンはカラムにロードされ、１リットルの事前に平衡化されたバッファーで洗浄された。酵素の溶出は、１０ｍＭＭｅｓ／２ＭＮａＣｌ／１０％（ｖ／ｖ）グリセロール／０．０２％ＮａＮ３（ｐＨ６．１）によって達成された。フラクション（５ｍｌ）が回収されて、少なくとも２ユニット／ｍｌの活性の含有がプールされた。活性のアッセイ後、β−Ｉトリプターゼは透析されて、１０ｋＤａの切断メンブランが設備されたＡＭＩＣＯＮ（登録商標）ブランドの攪拌型細胞濃縮機で濃縮された。精製されたβ−Ｉトリプターゼは、ヘパリンカラム溶出バッファーに保存された。
【０１３１】
ヘパリンアフィニティカラムはβ−Ｉトリプターゼ活性の最も高い濃縮を提供した。精製されたβ−ＩトリプターゼのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析は、精製されたβ−Ｉトリプターゼが、３３，０００Ｄａで弱いバンドでほぼ５０，０００Ｄａで拡散領域である、３５、９００と３４，２００Ｄａの推定される分子量の２つの主要なバンドを含むことを示した。バンドの強度とエリアの画像解析は、２つの主要なバンドが全体の反応性タンパク質の９０％以上を占めることを示した。精製されたβ−Ｉトリプターゼの比活性は、α−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−リジンチオベンジルエステル切断アッセイによって１００ユニット／ｍよりも高く一貫しており、純粋な完全に活性である天然の死体のヒトの肺トリプターゼの比活性よりもほぼ二倍であった。β−Ｉトリプターゼの濃度は、グリコシル化されないタンパク質のサブユニットの分子量としての２７，５００Ｄａ、及び純粋な死体のヒトの肺トリプターゼにおいて決定される２８．１のＡ２８０（１％）によって計算された。フルオレセイン４−メチルルンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）ｐ−グアニジノベンゾアート滴定液での活性部位滴定は、β−Ｉトリプターゼの２つの調製が９４％と９６％の活性サブユニットを含んだことを示した。死体のヒトの肺トリプターゼの２つの調製は、８８％と９６％の活性部位を含んで同時に滴定された。
【０１３２】
酵素活性（精製された酵素で）
実施例６ａ：ヒトβ−Ｉトリプターゼ
この実施例において、β−ＩトリプターゼクローンのＧＳ１１５／ＨｕｍＴｒｙ５−３７の発酵からの培養液の１１２ｍｌサンプルからの精製されたトリプターゼの収率と活性が表示された。比活性は、ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢ結合切断アッセイによって決定された。表２は結果を要約している。この実施例は、主題の発明を用いた精製の容易さと、トリプターゼの高収率を実証する。
【０１３３】
【表２】
β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼから精製されたトリプターゼとそれらのそれぞれのＳ１９４Ａ活性部位の突然変異はＣＢＺ−Ｌｙｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢアッセイによってアッセイされた。β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼが活性を有し、一方でβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変異は、最小限であるか又は全く活性を有せず、アミノ酸４４、９１及び１９４がタンパク質分解トリプターゼ活性において必須であることを示唆することを結果は示した。
【０１３４】
β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの両者から精製された酵素の特異的な切断の活性とβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの活性部位の突然変異はＣＢＺ−Ｌｙｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢアッセイによって決定された。表３は結果を要約する。
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
活性部位の突然変異によるものであって発現の欠損によるものではない活性が欠損した発現したトリプターゼの活性部位の突然変異を確定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが、β−Ｉトリプターゼの活性部位の突然変異（Ｈ４４ＡとＳ１９４Ａ）及び組換え体β−Ｉトリプターゼの酵素的な活性形態で行なわれた。タンパク質はメンブランに転写されて、前述のようにビオチン化抗ヒトトリプターゼＡＡ５モノクローナル抗体（プロメガコーポレーション）でブロッティングされた。図５は、活性部位の突然変異がトリプターゼタンパク質を発現する、この研究のウェスタンブロットの結果を示している。したがって、それらの突然変異の比活性の欠損は活性部位の突然変異によるものであり、タンパク質生成の欠如によるものではない。
【０１３７】
実施例６ｃ：組換え体β−Ｉトリプターゼとヒトの死体のトリプターゼとの動態比較：
この実施例において、本発明による組換え体β−Ｉトリプターゼの動態（ｒＨＴ）は、肺から抽出されたヒトの死体のトリプターゼの動態（ＨＬＴ）と比較された。結果は表４に示される。
【０１３８】
【表４】
組換え体β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼイソ型のＫｍは、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット（ＬＢＰ）及びＥａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅプロット（ＥＨＰ）の両者によって決定される。得られた値は：トリプターゼβ−Ｉ＝３６μＭ（ＬＢＰ）と２４．５μＭ（ＥＨＰ）；β−ＩＩトリプターゼ＝３０μＭ（ＬＢＰ）と２９．１μＭ（ＥＨＰ）。
【０１３９】
ゲル濾過アッセイ
実施例７：β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ及びβ−Ｉトリプターゼの活性部位の突然変異のゲル濾過：
β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ及びβ−Ｉトリプターゼの活性部位の突然変異のゲル濾過アッセイは、それらの組換え体のホモ酵素のさらなる４量体構造を確定するために処理された。図７はβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼとＳ１９４Ａのβ−Ｉトリプターゼの活性部位の突然変異のすべてが同一の分子量を有し、それらすべてが四量体であることを確定することが示される。トリプターゼの既知の天然の生理的な阻害剤が存在しないために、酵素は活性な四量体形態から不活性な分離物への分離によって制御されると考えられる。スキワーツＬ及びブラッドフォードＴ（ＳｃｈｗａｒｔｚＬ．Ａｎｄ ＢｒａｄｆｏｒｄＴ．）（１９８６）を参照のこと。したがって、β−Ｉトリプターゼに導入された突然変異が四量体を形成する、その性能ではなく酵素の触媒部位に影響したことを確認すると同様に四量体形態にβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ活性を関連させることは重要であった。
【０１４０】
阻害アッセイ：
実施例８ａ：ＡＥＢＳＦでのβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの阻害
２つのイソ型間に阻害の差異がある場合に、セリンプロテアーゼの阻害剤である、ＡＥＢＳＦ（Ａ．Ｇ．サイエンティフィックインク、カリフォルニア州、サンディエゴ）が組換え体ヒトβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼを阻害するかどうかを決定する研究が行なわれた。
【０１４１】
２００μｇ／ｍｌのβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼのサンプルは、可溶化された０．１ｍＭ又は１．０ｍＭ（終濃度）ＡＥＢＳＦのいずれかで処理され、ＣＢＺ−Ｌｙｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢ結合切断アッセイによって６０分後にモニターされた。
【０１４２】
図８に示されるように、特に１ｍＭの終濃度で使用された場合、ＡＥＢＳＦは組換え体のヒトのイソ型の非常に有力な阻害剤である。２つのイソ型間の明白な差異は見られなかった。
【０１４３】
実施例８ｂ：ＥＬＭＩＲＯＮ（登録商標）アッセイ：
ＥＬＭＩＲＯＮ（アルザ、カリフォルニア州、マウンテンビュー）は、膀胱と胃腸管（ＧＩ）で炎症を抑える薬剤である。トリプターゼは膀胱と胃腸管（ＧＩ）の炎症を多大に介在すると信じられている。したがって、ＥＬＭＩＲＯＮは、トリプターゼに薬剤を滴定することによってｐＰＩＣ９−ＨｕｍＴｒｙＮ１０２Ｋから産出される組換え体β−ＩＩトリプターゼの酵素的な阻害に直接作用することを試験した。
【０１４４】
β−ＩＩトリプターゼは、ＥＬＭＩＲＯＮ（５０ｍｇ／ｍｌの保存濃度でｐＨ６．０の水で懸濁した）の１０の十分な希釈液において、２０μｇ／ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ、０．２Ｍ ＮａＣｌ、及び０．５ｍｇ／ｍｌヘパリン、ｐＨ６．１のフラクションに希釈された。様々な濃度（２５、２．５、０．２５及び０．０２５ｍｇ／ｍｌ）はβ−ＩＩトリプターゼと３時間インキュベートされた。活性は、ＣＢＺ−Ｌｙｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢ結合切断によってアッセイされた。ＥＬＭＩＲＯＮは２５乃至０．０２５ｍｇ／ｍｌの試験濃度範囲でβ−ＩＩトリプターゼを阻害しないことが判明した。
【０１４５】
フィブリノーゲン切断アッセイ
実施例９：組換え体及び天然のβ−トリプターゼのフィブリノーゲン溶解活性：
図９を参照するに、生成された天然と組換え体のβ−トリプターゼは、スキワーツ等（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ）（１９８５）によって記載されるようなヒトフィブリノーゲンを代謝する天然と組換え体のβ−トリプターゼの性能を評価した。凍結されたフィブリノーゲンは、０．５ｍｇ／ｍｌヘパリンを伴う１０ｍＭ ＣａＣｌ２と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１．０ｍｇ／ｍｌ濃度の１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４によって再度懸濁された。フィブリノーゲンのマスターミックスは４つの１００ｍｌアリコートに分割されて、５μｇの組換え体β−Ｉトリプターゼ（Ｒ βＩトリプターゼ）、組換え体β−ＩＩトリプターゼ（Ｒ βＩＩトリプターゼ）、又は天然のβ−トリプターゼ（天然β）は３つの試験管のうちの一つに添加された。残りの試験管はコントロール（酵素なし）とした。トリプターゼとフィブリノーゲンを含有する試験管は、さらに２つの試験管に分配されて、１つの試験管は−２０℃で、もう一方の試験管は３７℃で６０分間インキュベートされた。次いで、反応は標準の電気泳動方法で４乃至２０％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで２μｇに相当するタンパク質をローディングすることによって解析した。ゲルはＧｅｌＣｏｄｅで染色され、乾燥されてスキャニングにより画像化された。
【０１４６】
図９に示されるように、フィブリノーゲンα、β、γサブユニットはトリプターゼ酵素の不在においても、またインキュベーション処理でも分解されなかった。αとβのサブユニットは、冷却のインキュベーション中でさえも組換え体β−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ酵素によって効率的に加水分解された。天然のβ−トリプターゼはフィブリノーゲン溶解の効率が低いが、しかしこれは組換え体酵素と比較して合成基質での全体の低い比活性によって予期された。
【０１４７】
組換え体ヒトトリプターゼ及び組換え体ヒトトリプターゼを得る方法は、ここに例証し記載した特定の試薬、宿主生物、及び遺伝子操作に限定しないが、しかし、付随の請求項の範囲内であるように、それらの修正されて等価な形態をすべて包含することが理解される。
【０１４８】
（文献目録）
【図面の簡単な説明】
【図１】
タンパク質分解及び非タンパク質分解トリプターゼのアミノ酸配列である。図中の黒塗りの下向き三角形は、各成熟したトリプターゼの第一のアミノ酸を示す。記号Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，３，１，及び２は、ウシの膵臓のトリプターゼ及びヒトβ−ＩＩトリプターゼの構造に基づく各トリプターゼの基質と結合するクリフトを形成することを予期される７つのループを与える。
【図２】
ｐＰＩＣ９の概略図である。
【図３】
ヒトβ−Ｉトリプターゼ（ｒｈβＩ）、β−ＩＩトリプターゼ（ｒｈβＩＩ）、及び死体から分離されたβ−Ｉトリプターゼ（天然型β）のウェスタンブロットを示す。ゲルは、ビオチン化された抗ヒトトリプターゼＡＡ５モノクローナル抗体（プロメガコーポレーション）をプローブにすることで可視化できる。ＰＧＮａｓｅＦでのグリコシダーゼ消化がサンプルで実行された。最初の三つのレーンは未消化のトリプターゼを含む。２番目の３つのレーンは消化されたトリプターゼを含む。グリコシダーゼ消化は単一のトリプターゼのコアタンパク質を生じる。
【図４】
タンパク質のグリコシル化の状態を示す組換え体ヒトβ−Ｉ及びβ―ＩＩトリプターゼ並びに天然型トリプターゼのＣＯＯＭＡＳＳＩＥダイで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図５】
ヒトβ−Ｉトリプターゼとその二つの活性部位の突然変位（Ｈ４４Ａ及びＳ１９４Ａ）のピキア・パストリスの発酵誘発のウェスタンブロットである。ゲルは、ビオチン化された抗ヒトトリプターゼＡＡ５モノクローナル抗体（プロメガコーポレーション）をプローブにすることで可視化できる。ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢ結合切断アッセイはロードされたサンプルで実行された。アッセイにより対応するユニット／ｍｌ／分がゲルの下に示されている。
【図６】
８つの異なるヒトβ−ＩＩＳ１９４Ａ活性部位変異型クローンからの６４時間後のピキア・パストリス誘発の上澄みのウェスタンブロットである。ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｓ−チオベンゾイルエステル／ＤＮＴＢ結合切断アッセイはロードされたサンプルで実行された。アッセイにより対応するユニット／ｍｌ／分がゲルの下に示されている。
【図７】
ゲルフィルタレーションによるヒトβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼ並びにβ−Ｉトリプターゼ変位型Ｓ１９４Ａにおける分子量の決定を示す。
【図８】
不可逆的セリンプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦによってヒトβ−Ｉ及びβ−ＩＩトリプターゼの阻害を例示するグラフである。
【図９】
ヒトβ−トリプターゼによってフィブリノーゲンの切断及び不活性のバイオアッセイの比較を示す。
Claims (61)
- 活性部位の突然変異を有するタンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡ配列に機能的にリンクしている分泌シグナル配列に機能的にリンクした５´から３´に移動するプロモーターを含有するＤＮＡ発現構成であって、ここで該発現構成は、前記活性部位の突然変異により酵素活性欠損の前記発現構成を含むように形質転換された宿主で酵素活性を欠損する成熟したタンパク質分解トリプターゼの発現を導くことを特徴とするＤＮＡ発現構成。
- 活性部位の突然変異を有する前記タンパク質分解トリプターゼをコード化する前記ＤＮＡ配列はβ−Ｉトリプターゼをコード化することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ発現構成。
- 活性部位の突然変異を有する前記タンパク質分解トリプターゼをコード化する前記ＤＮＡ配列はβ−ＩＩトリプターゼをコード化することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ発現構成。
- 活性部位の突然変異を有する前記タンパク質分解トリプターゼをコード化する前記ＤＮＡ配列はヒトタンパク質分解トリプターゼをコード化することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ発現構成。
- 前記活性部位の突然変異は天然のアミノ酸を非電荷型アミノ酸に変えることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ発現構成。
- 前記活性部位の突然変異は天然のアミノ酸をアラニンに変えることを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ発現構成。
- 活性部位の突然変異を有する前記タンパク質分解トリプターゼをコード化する前記ＤＮＡ配列は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、及び配列番号４２からなるグループから選択されるＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ発現構成。
- 前記タンパク質分解トリプターゼは、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、及び配列番号４３からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ発現構成。
- 前記分泌シグナル配列はＫＥＸ２切断部位をコード化することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ発現構成。
- 前記分泌シグナル配列は、アミノ酸残基ロイシン−グルタミン酸−リジン−アルギニンをコード化する３´末端を含むことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ発現構成。
- 前記プロモーターは構成的プロモーターであることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ発現構成。
- 前記プロモーターは誘導プロモーターであることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ発現構成。
- ＡＯＸ１，ＧＡＰ，ＭＯＸ，ＦＭＤ，ＡＤＨ，ＬＡＣ４，ＸＰＲ２，ＬＥＵ２，ＧＡＭ１，ＰＧＫ１，ＧＡＬ７，ＧＡＤＰＨ，ＣＹＣ１，及びＣＵＰ１からなるグループから選択される５´から３´に移動するプロモーターを含有するＤＮＡ発現構成であって、前記プロモーターは分泌シグナル配列に機能的にリンクしており、前記分泌シグナル配列は活性部位の突然変異を有するタンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡ配列に機能的にリンクしており、前記ＤＮＡ配列はターミネーター配列に機能的にリンクしていることを特徴とするＤＮＡ発現構成。
- 前記タンパク質分解トリプターゼをコード化する前記ＤＮＡ配列はβ−Ｉトリプターゼをコード化することを特徴とする請求項１３に記載のＤＮＡ発現構成。
- 前記タンパク質分解トリプターゼをコード化する前記ＤＮＡ配列はβ−ＩＩトリプターゼをコード化することを特徴とする請求項１３に記載のＤＮＡ発現構成。
- 活性部位の突然変異を有する前記タンパク質分解トリプターゼをコード化する前記ＤＮＡ配列はヒトタンパク質分解トリプターゼをコード化することを特徴とする請求項１３に記載のＤＮＡ発現構成。
- 活性部位の突然変異を有する前記タンパク質分解トリプターゼをコード化する前記ＤＮＡ配列は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、及び配列番号４２からなるグループから選択されるＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項１３に記載のＤＮＡ発現構成。
- 前記タンパク質分解トリプターゼは、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、及び配列番号４３からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１３に記載のＤＮＡ発現構成。
- 前記分泌シグナル配列はＫＥＸ２切断部位をコード化することを特徴とする請求項１３に記載のＤＮＡ発現構成。
- 請求項１による発現構成で真核生物の宿主細胞を形質転換することを含有するタンパク質分解トリプターゼの活性部位の突然変異の生成方法であって、前記真核生物の宿主細胞は酵素的に不活性なタンパク質分解トリプターゼを発現することを特徴とする方法。
- 酵母の宿主細胞が形質転換されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
- ピキア属の宿主細胞が形質転換されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
- ピキア・パストリスの宿主細胞が形質転換されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
- ピキア・パストリス ＡＴＣＣ２０８６４又はピキア・パストリス菌株ＫＭ７１の特徴を有する宿主細胞が形質転換されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
- 生成された前記酵素的に不活性なタンパク質分解トリプターゼの抽出をさらに含有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 生成された前記酵素的に不活性なタンパク質分解トリプターゼでのライブラリーのスクリーニングをさらに含有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 化学的なライブラリーがスクリーニングされることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
- ペプチドライブラリーがスクリーニングされることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
- 生成された前記酵素的に不活性なタンパク質分解トリプターゼでの基質の試験をさらに含有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 前記試験はインビボ試験であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
- 前記試験はインビトロ試験であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
- 前記試験はエクスビボ試験であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
- 生成された前記酵素的に不活性なタンパク質分解トリプターゼのモデル化をさらに含有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 請求項１による発現構成を含み発現するために形質転換された真核生物の宿主細胞を含有する酵素的に不活性なタンパク質分解トリプターゼを発現する遺伝子工学的に改変された真核細胞。
- 前記真核細胞は酵母細胞であることを特徴とする請求項３４に記載の遺伝子工学的に改変された真核細胞。
- 前記酵母細胞はピキア属であることを特徴とする請求項３５に記載の遺伝子工学的に改変された真核細胞。
- 請求項１３による発現構成を含み発現するために形質転換された真核生物の宿主細胞を含有する酵素的に不活性なタンパク質分解トリプターゼを発現する遺伝子工学的に改変された真核細胞。
- 請求項２０による酵素的に不活性なタンパク質分解トリプターゼに対する抗体の産出を含有するポリクローナル又はモノクローナル抗ヒトトリプターゼ抗体の産出方法。
- 請求項３８の方法により生成されるポリクローナル又はモノクローナル抗ヒトタンパク質分解トリプターゼ抗体。
- 配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、及び配列番号５１からなるグループから選択されるポリペプチドをコード化するアミノ酸配列を含有する活性部位の突然変異を有する組換え体の成熟したタンパク質分解トリプターゼ。
- タンパク質分解トリプターゼをコード化するＤＮＡ配列に機能的にリンクしている分泌シグナル配列に機能的にリンクした５´から３´に移動するプロモーターを含有するＤＮＡ発現構成であって、ここで該発現構成は、前記発現構成を含むために形質転換された宿主で酵素活性を有する成熟したタンパク質分解トリプターゼの発現を導くことを特徴とするＤＮＡ発現構成。
- 前記タンパク質分解トリプターゼをコード化する前記ＤＮＡ配列はヒトタンパク質分解トリプターゼをコード化することを特徴とする請求項４１に記載のＤＮＡ発現構成。
- 前記ＤＮＡ配列は配列番号８を含み、前記発現構成は前記発現構成を含むために形質転換された宿主で酵素活性を有する成熟したβ−ＩＩトリプターゼの発現を導くことを特徴とする請求項４２に記載のＤＮＡ発現構成。
- 請求項４３による発現構成での真核生物の宿主細胞の形質転換を含有する酵素的に活性なβ−ＩＩトリプターゼの生成方法であって、前記宿主細胞は酵素的に活性なβ−ＩＩトリプターゼを発現することを特徴とする方法。
- 生成された前記酵素的に不活性なタンパク質分解トリプターゼの抽出をさらに含有することを特徴とする請求項４４に記載の方法。
- 生成された前記酵素的に不活性なタンパク質分解トリプターゼでのライブラリーのスクリーニングをさらに含有することを特徴とする請求項４４に記載の方法。
- 化学的なライブラリーがスクリーニングされることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
- ペプチドライブラリーがスクリーニングされることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
- 生成された前記酵素的に不活性なタンパク質分解トリプターゼでの基質の試験をさらに含有することを特徴とする請求項４４に記載の方法。
- 前記試験はインビボ試験であることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
- 前記試験はインビトロ試験であることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
- 前記試験はエクスビボ試験であることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
- 生成された前記酵素的に不活性なタンパク質分解トリプターゼのモデル化をさらに含有することを特徴とする請求項４４に記載の方法。
- 酵母の宿主が形質転換されることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
- ピキアの宿主が形質転換されることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
- 請求項４３による発現構成を含み発現するために形質転換された真核生物の宿主細胞を含有する酵素的に活性なβ−ＩＩトリプターゼを発現する遺伝子工学的に改変された真核細胞。
- 前記真核細胞は酵母細胞であることを特徴とする請求項５６に記載の遺伝子工学的に改変された真核細胞。
- 前記酵母細胞はピキア細胞であることを特徴とする請求項５７に記載の遺伝子工学的に改変された真核細胞。
- 請求項４４に記載の方法によって生成されるトリプターゼ活性を有する、酵素的に活性でグリコシル化された組換え体のヒトβ−ＩＩトリプターゼ。
- 配列番号９を含有するアミノ酸配列を含む組換え体のβ−ＩＩトリプターゼ。
- 配列番号１１を含有するアミノ酸配列を含む組換え体の成熟したβ−ＩＩトリプターゼ。
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