KR20180069069A - 항-HtrA1 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

항-HtrA1 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-HtrA1 항체 (이중특이적 항-HtrA1 항-인자 D 항체 포함) 및 상기를 제조하고 사용하는 방법, 예를 들어, HtrA1-연관된 장애, 안구 장애, 및/또는 보체-연관된 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

항-HtrA1 항체 및 이의 사용 방법
서열 목록
본원은 ASCII 포맷으로 전자 형식으로 제출되어, 그 전체가 참조로 본원에 편입된 서열 목록을 포함한다. 2016년 10월 25일 화요일에 작성된 상기의 ASCII 사본은 파일명을 "50474-117WO4_Sequence_Listing_10_25_16_ST25"라고 하고, 크기는 114,779 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 항-HtrA1 항체 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
세린 프로테아제 HtrA 세린 펩티다제 1 (HtrA1) (PRSS11; Clan PA, 패밀리 51)은 HtrA 단백질의 진화론적으로 보존된 패밀리에 속한다. 인간에 있어서, HtrA1, HtrA3, 및 HtrA4는 동일한 도메인 구조를 갖는다: N-말단 IGFBP-유사 모듈 및 카잘-유사 모듈, 트립신-유사 폴드를 가진 프로테아제 도메인, 및 C-말단 PDZ 도메인. HtrA1의 생리적 관련성은 가족성 허혈성 뇌 소혈관 질환을 일으키는 인간 기능상실 돌연변이의 확인에 의해 확고하게 확립되어 왔다. 분자 기전은 증가된 TGFβ 신호전달을 초래하는 HtrA1에 의한 결핍된 TGFβ 억제를 포함한다. 비정상적인 HtrA1 발현에 의한 이상조절된 TGFβ 신호전달은, 아마 다양한 세포외 매트릭스 성분의 HtrA1-매개된 열화와 함께, 또는 간접적으로 매트릭스 메탈로프로테아제의 상향조절을 통해, 관절염 질환에 또한 기여할 수 있다. 또한, 인간 유전적 연구는 증가된 HtrA1 전사체 수준을 초래하는 HtrA1 프로모터 영역에서 SNP와 연령 관련 황반 변성 (AMD)의 진행 사이 강한 상관관계를 확인하였다 (참고: 예를 들면, Dewan et al., Science 314:989-992, 2006 및 Yang et al., Science 314:992-993, 2006).
AMD는 시력에 대하여 상당한 결과를 가진 중심 망막의 진행성 만성 질환이다. 질환의 말기 형태는 선진국에서 시력 손실의 주된 원인이다. 40 세 이상(≥)의 백인 집단에 대하여, 초기 AMD의 유병률은 약 6.8%로 추정되고 진행성 AMD는 약 1.5%로 추정된다. 말기 AMD의 유병률은 80 세 이후 약 11.8%까지 상승하는 나이듬에 따라 극적으로 증가한다. 2 유형의 AMD, 비-삼출성 (건조) 및 삼출성 (습성) AMD가 존재한다. 더욱 흔한 건조 AMD는 중심 망막 (황반)에 근원적인 망막 색소 상피 (RPE)에서 위축성 및 비대성 변화 뿐만 아니라 RPE에서 침전 (결정강)을 포함한다. 진행성 건식 AMD는, 비가역적 시력 손실과 함께, 지도형 위축증 (GA)를 포함하는, 상당한 망막 손상을 초래할 수 있다. 또한, 건조 AMD를 가진 환자는, 맥락막 신생혈관 막 (CNVM)으로 불리는 비정상 혈관이 망막 아래 발생하고, 유체 및 혈액을 누출시키고, 궁극적으로 망막내 그리고 망막 아래 눈이 부신 원반 반흔을 유발시키는, 습성 형태로 진행할 수 있다.
개선된 특성, 예컨대 결합 친화성, 안정성, 및 억제성 (차단) 활성, 뿐만 아니라 이들의 치료 및 진단 용도를 가진 항-HtrA1 항체에 대한 요구가 남아 있다.
본 발명은 항-HtrA1 항체 그리고 치료 및 진단 목적으로 동일한 것의 이용 방법을 제공한다. 본 발명의 항-HtrA1 항체는 고도로 강력하고 HtrA1에 대하여 높은 결합 친화성을 갖는다. 본 발명의 항체의 개선된 특성은 요법에서 사용을 위하여 이들을 적당하게 만든다.
일 양태에서, 본 발명은 HtrA1 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 포괄하며, 여기서 상기 HtrA1 에피토프는 Arg190, Leu192, Pro193, Phe194, 및 Arg197로 이루어진 군으로부터 선택된 HtrA1 단백질의 적어도 하나의 아미노산을 포함하며, 상기 아미노산 넘버링은 인간 HtrA1 전구체 단백질에 대한 넘버링을 지칭한다.
일 구현예에서, HtrA1 에피토프는 Leu192, Pro193, 및 Arg197로 이루어진 군으로부터 선택된 HtrA1 단백질의 적어도 하나의 아미노산을 포함한다.
또 다른 구현예에서, HtrA1 에피토프는 Leu192, Pro193, 및 Arg197로 이루어진 군으로부터 선택된 HtrA1 단백질의 적어도 2개의 아미노산을 포함한다.
특정 구현예에서, HtrA1 에피토프는 HtrA1 아미노산 Leu192, Pro193, 및 Arg197을 포함한다.
또 다른 구현예에서, HtrA1 에피토프는 HtrA1 아미노산 Arg190, Leu192, Pro193, 및 Arg197을 포함한다.
추가 구현예에서, HtrA1 에피토프는 HtrA1 아미노산 Arg190, Leu192, Pro193, Phe194, 및 Arg197을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 약 550 pM 이하의 KD로 인간 HtrA 세린 펩티다제 1 (HtrA1)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 40 pM 내지 약 550 pM의 KD 로 인간 HtrA1에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 40 pM 내지 약 250 pM의 KD 로 인간 HtrA1에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 50 pM 내지 약 125 pM의 KD 로 인간 HtrA1에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 110 pM의 KD 로 인간 HtrA1에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 약 60 pM의 KD 로 인간 HtrA1에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, KD는 표면 플라스몬 공명 (SPR) (예를 들면, BIACORE® SPR)에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, SPR은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 (예를 들면, 실시예 섹션에서) 수행된다.
일부 구현예에서, 선행 항체의 어느 하나는 HtrA1의 활성을 억제시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 1.5 nM 이하의 50% 억제성 농도 (IC50)로 인간 HtrA1(huHtrA1-PD)의 프로테아제 도메인의 활성을 억제시킨다. 일부 구현예에서, 항체는 0.25 nM 내지 약 0.5 nM의 IC50으로 huHtrA1-PD의 활성을 억제시킨다. 일부 구현예에서, 항체는 약 0.3 nM의 IC50으로 huHtrA1-PD의 활성을 억제시킨다. 일부 구현예에서, 억제성 활성은 시험관내 FRET-기반 차단 검정 측정이다. 일부 구현예에서, 시험관내 FRET-기반 차단 검정은 H2-Opt 프로브의 절단을 포함한다 (예를 들면, 서열 번호: 152). 일부 구현예에서, 시험관내 FRET-기반 차단 검정은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 (예를 들면, 실시예에서) 수행된다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEX1H (서열 번호: 1) (여기서 X1 은 Met 또는 Leu임); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETX2GAAYNQKFKG (서열 번호: 2) (여기서 X2 은 Glu 또는 Asp임); 및 (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3). 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEMH (서열 번호: 7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETEGAAYNQKFKG (서열 번호: 8); 및 (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3). 일부 구현예에서, 항체는 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX1FX2 (서열 번호: 12) (여기서 X1 은 Lys 또는 Thr이고, 그리고 X2 는 Thr, Lys, 또는 Arg임); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGQGLEWIG (서열 번호: 13); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR (서열 번호: 14); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열 번호: 15). 일부 구현예에서, 항체는 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT (서열 번호: 16); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGQGLEWIG (서열 번호: 13); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR (서열 번호: 14); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열 번호: 15).
상기 양태의 일부 구현예에서, 결합 도메인은 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVX3FIH (서열 번호: 4) (여기서 X3 은 Glu 또는 Asn임); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSX4LAS (서열 번호: 5) (여기서 X4 는 Asn, His 또는 Glu임); 및 (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWX5SX6PWT (서열 번호: 6), (여기서 X5 는 Ser 또는 Tyr이고 X6 은 Ala 또는 Asn임). 일부 구현예에서, 결합 도메인은 추가로 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVEFIH (서열 번호: 9); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSNLAS (서열 번호: 10); 및 (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWSSAPWT (서열 번호: 11). 일부 구현예에서, 항체는 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 번호: 17); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKAPKPLIS (서열 번호: 18); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 번호: 19); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열 번호: 20).
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인; (b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT (서열 번호: 16); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGQGLEWIG (서열 번호: 13); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR (서열 번호: 14); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열 번호: 15). 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 번호: 17); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKAPKPLIS (서열 번호: 18); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 번호: 19); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열 번호: 20). 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하며, 여기서 상기 항체는 하기 6개 HVR을 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEX1H (서열 번호: 1) (여기서 X1 은 Met 또는 Leu임); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETX2GAAYNQKFKG (서열 번호: 2) (여기서 X2 은 Glu 또는 Asp임); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVX3FIH (서열 번호: 4) (여기서 X3 은 Glu 또는 Asn임); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSX4LAS (서열 번호: 5) (여기서 X4 는 Asn, His 또는 Glu임); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWX5SX6PWT (서열 번호: 6), (여기서 X5 는 Ser 또는 Tyr이고 X6 은 Ala 또는 Asn임). 일부 구현예에서, 결합 도메인은 하기 6개 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEMH (서열 번호: 7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETEGAAYNQKFKG (서열 번호: 8); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVEFIH (서열 번호: 9); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSNLAS (서열 번호: 10); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWSSAPWT (서열 번호: 11).
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT (서열 번호: 16); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGQGLEWIG (서열 번호: 13); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR (서열 번호: 14); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열 번호: 15). 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 번호: 17); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKAPKPLIS (서열 번호: 18); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 번호: 19); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열 번호: 20). 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열에 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열 번호: 23의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인; (b) 서열 번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFT (서열 번호: 24); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVKQTPVHGLEWIG (서열 번호: 25); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: KATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTR (서열 번호: 26); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTSVTVSS (서열 번호: 27). 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC (서열 번호: 29); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGQPPKLLIY (서열 번호: 30); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC (서열 번호: 31); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGGGTKLEIK (서열 번호: 32). 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열 번호: 23의 아미노산 서열에 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열 번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하며, 여기서 상기 항체는 하기 6개 HVR을 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: SYIMS (서열 번호: 39); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: YISNGGGTTYYSDTIKG (서열 번호: 40); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: QNFRSDGSSMDY (서열 번호: 41); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASESVDSYGKSFMH (서열 번호: 42); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: LASKLES (서열 번호: 43); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQNNEDPYT (서열 번호: 44).
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열 번호: 45의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열 번호: 46의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (서열 번호: 47); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGKGLEWVA (서열 번호: 48); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 번호: 49); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열 번호: 50). 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (서열 번호: 51); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGQPPKLLIY (서열 번호: 52); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (서열 번호: 53); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열 번호: 54). 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열 번호: 45의 아미노산 서열에 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 서열 번호: 46의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열 번호: 55의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인; (b) 서열 번호: 56의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVKLVESGGGLVEPGGSLKLACVASGFTFS (서열 번호: 57); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQTPEKRLEWVA (서열 번호: 58); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RFTISRDNAKNTLYLQMSTLKSEDTAIYFCAR (서열 번호: 59); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTAVTVSS (서열 번호: 60). 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 하기를 추가로 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC (서열 번호: 61); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGQPPKLLIY (서열 번호: 62); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC (서열 번호: 63); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGGGTKLEIK (서열 번호: 64). 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열 번호: 55의 아미노산 서열에 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열 번호: 56의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열 번호: 65의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인; (b) 서열 번호: 66의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a)서열 번호: 67의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인; (b) 서열 번호: 68의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a)서열 번호: 69의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인; (b) 서열 번호: 70의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인.
임의의 선행 측면의 일부 구현예에서, 항체는 단클론성, 인간, 인간화된, 또는 키메라성이다. 특정 구현예에서, 항체는 단클론성, 인간화, 또는 키메라성이다.
선행 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 HtrA1에 결합하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fab, Fab’-SH, Fv, scFV, 및 (Fab’)2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fab이다. 일부 구현예에서, Fab는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역에서 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, Fab는 중쇄 불변 영역의 상부 힌지에서 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 위치 221 (EU 넘버링)에서 종결한다. 일부 구현예에서, 위치 221에서 아미노산 잔기는 아스파르트산 (Asp) 잔기이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 156. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열 번호: 160. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열 번호: 159. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열 번호: 160, 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열 번호: 159.
일부 구현예에서, Fab는 IgG1 Fab이다.
선행 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 전장 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 단일특이적 항체이다.
선행 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 인자 D에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 하기 6개 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYAX1DFKG (서열 번호: 110) (여기서 X1 은 Asp 또는 Glu임); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVX1N (서열 번호: 111) (여기서 X1 는 Asn 또는 Ser임); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTX1IX2X3DMN (서열 번호: 112) (여기서 X1 은 Asp 또는 Ser이고, 그리고 X2 는 Asp 또는 Glu이며, 그리고 X3 은 Asp 또는 Ser임); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSX1SLPYT (서열 번호: 114), 여기서 X1 은 Asp 또는 Glu이다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 하기 6개 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYADDFKG (서열 번호: 115); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVNN (서열 번호: 116); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTDIDDDMN (서열 번호: 117); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSDSLPYT (서열 번호: 118). 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 하기를 포함한다: (a) 서열 번호: 119의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열 번호: 120의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열 번호: 120의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1 및 인자 D 둘 모두에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하며, 여기서 상기 항체는 하기 6개 HVR을 포함하는 HtrA1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEMH (서열 번호: 7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETEGAAYNQKFKG (서열 번호: 8); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVEFIH (서열 번호: 9); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSNLAS (서열 번호: 10); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWSSAPWT (서열 번호: 11); 및 하기 6개 HVR을 포함하는 인자 D에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYADDFKG (서열 번호: 115); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVNN (서열 번호: 116); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTDIDDDMN (서열 번호: 117); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSDSLPYT (서열 번호: 118).
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1 및 인자 D에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 특징으로 하고, 여기서 상기 항체는 하기를 포함한다: 하기를 포함하는 HtrA1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인: (a) 하기의 아미노산 서열에 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 21 및 (b) 하기의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열 번호: 22, 및 하기를 포함하는, 인자 D에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인: (a) 하기의 아미노산 서열과 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 119 및 (b) 하기의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열 번호: 120.
상기 양태 중 일부 구현예에서, 본 발명은 HtrA1 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 포괄하며, 여기서 상기 HtrA1 에피토프는 Arg190, Leu192, Pro193, Phe194, 및 Arg197로 이루어진 군으로부터 선택된 HtrA1 단백질의 적어도 하나의 아미노산을 포함하며, 상기 아미노산 넘버링은 인간 HtrA1 전구체 단백질에 대한 넘버링을 지칭한다.
일 구현예에서, HtrA1 에피토프는 Leu192, Pro193, 및 Arg197로 이루어진 군으로부터 선택된 HtrA1 단백질의 적어도 하나의 아미노산을 포함한다.
특정 구현예에서, HtrA1 에피토프는 HtrA1 아미노산 Leu192, Pro193, 및 Arg197을 포함한다.
또 다른 구현예에서, HtrA1 에피토프는 HtrA1 아미노산 Arg190, Leu192, Pro193, 및 Arg197을 포함한다.
추가 구현예에서, HtrA1 에피토프는 HtrA1 아미노산 Arg190, Leu192, Pro193, Phe194, 및 Arg197을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 발현하는 단리된 핵산을 포함하는, 벡터 (예컨대, 발현 벡터)를 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 선행 핵산 및/또는 벡터를 포함하는, 숙주 세포를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 293 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 구현예에서, 원핵생물 세포는 이. 콜라이이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체를 생산하는 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 배양 배지에서 임의의 이전의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 선행 항체 중 임의의 하나를 포함하는, 조성물을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약제학적 조성물이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 동결건조시킨다. 일부 구현예에서, 조성물은 추가로 인자 D 결합 길항제를 포함한다. 일부 구현예에서, 인자 D 결합 길항제는 항-인자 D 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 Fab 또는 (Fab')2 이다. 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYAX1DFKG (서열 번호: 110) (여기서 X1 은 Asp 또는 Glu임); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVX1N (서열 번호: 111) (여기서 X1 는 Asn 또는 Ser임); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTX1IX2X3DMN (서열 번호: 112) (여기서 X1 은 Asp 또는 Ser이고, 그리고 X2 는 Asp 또는 Glu이며, 그리고 X3 은 Asp 또는 Ser임); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSX1SLPYT (서열 번호: 114), 여기서 X1 은 Asp 또는 Glu이다. 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYADDFKG (서열 번호: 115); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVNN (서열 번호: 116); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTDIDDDMN (서열 번호: 117); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSDSLPYT (서열 번호: 118). 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다: (a) 서열 번호: 119의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열 번호: 120의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열 번호: 120의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-인자 D 항원-결합 항체 단편은 람팔리주맙이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 임의의 선행 항-HtrA1 항체 및 인자 D 길항제를 포함하는 병용 요법을 포함한다. 특정 구현예에서, 인자 D 길항제는 항-인자 D 항체이다. 특정 구현예에서, 인자 D 길항제는 람팔리주맙이다. 특정 구현예에서, 항-인자 D 길항제는 순차적으로 투여된다.
일부 양태에서, 선행 항체의 어느 하나는 약제로서 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 선행 항체의 어느 하나는 HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애 치료에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애는 연령-관련된 황반 퇴화 (AMD), 당뇨성 망막병증, 조숙증의 망막병증, 또는 결절 맥락막 혈관병증이다. 일부 구현예에서, HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애는 AMD이다. 일부 구현예에서, AMD는 초기 건식 AMD, 중간 건식 AMD, 또는 진행성 건식 AMD이다. 일부 구현예에서, 진행성 건식 AMD는 지도형 위축증이다.
일부 양태에서, 선행 항체 중 임의의 것은 HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애는 AMD, 당뇨성 망막병증, 조숙증의 망막병증, 또는 결절 맥락막 혈관병증이다. 일부 구현예에서, HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애는 AMD이다. 일부 구현예에서, AMD는 초기 건식 AMD, 중간 건식 AMD, 또는 진행성 건식 AMD이다. 일부 구현예에서, 진행성 건식 AMD는 지도형 위축증이다. 일부 구현예에서, 약제는 인자 D 결합 길항제와 조합으로 사용을 위하여 제형화된다. 일부 구현예에서, 인자 D 결합 길항제는 항-인자 D 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 Fab 또는 (Fab')2 이다. 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYAX1DFKG (서열 번호: 110) (여기서 X1 은 Asp 또는 Glu임); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVX1N (서열 번호: 111) (여기서 X1 는 Asn 또는 Ser임); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTX1IX2X3DMN (서열 번호: 112) (여기서 X1 은 Asp 또는 Ser이고, 그리고 X2 는 Asp 또는 Glu이며, 그리고 X3 은 Asp 또는 Ser임); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSX1SLPYT (서열 번호: 114), 여기서 X1 은 Asp 또는 Glu이다. 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYADDFKG (서열 번호: 115); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVNN (서열 번호: 116); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTDIDDDMN (서열 번호: 117); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSDSLPYT (서열 번호: 118). 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다: (a) 서열 번호: 119의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열 번호: 120의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열 번호: 120의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-인자 D 항원-결합 단편은 람팔리주맙이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에 HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애의 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 선행 항체의 어느 하나의 항체의 치료적 유효량 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애는 AMD, 당뇨성 망막병증, 조숙증의 망막병증, 또는 결절 맥락막 혈관병증이다. 일부 구현예에서, HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애는 AMD이다. 일부 구현예에서, AMD는 초기 건식 AMD, 중간 건식 AMD, 또는 진행성 건식 AMD이다. 일부 구현예에서, 진행성 건식 AMD는 지도형 위축증이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 추가로 인자 D 결합 길항제의 투여를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 망막 또는 광수용체 세포 변성의 억제 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 대상체에 선행 항체의 어느 하나의 유효량의 투여, 이로써 망막 또는 광수용체 세포 변성의 억제를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성의 억제 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 대상체에 선행 항체의 어느 하나의 유효량의 투여, 이로써 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성의 억제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 추가로 인자 D 결합 길항제의 투여를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에서 HtrA1-관련 장애, 또는 보체-관련 장애의 치료 방법을 특징으로 하고, 상기 방법은 HtrA1 결합 길항제 또는 인자 D 결합 길항제의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, HtrA1-관련 장애 또는 보체-연관된 장애는 안구 장애이다. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD, 당뇨 망막병증, 맥락막 신생혈관형성 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, 중심 망막 정맥 폐색, 각막 혈관형성, 및 망막 신생혈관형성으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD이다. 일부 구현예에서, AMD는 초기 건식 AMD, 중간 건식 AMD, 또는 진행성 건식 AMD이다. 일부 구현예에서, 진행성 건식 AMD는 지도형 위축증이다. 일부 구현예에서, HtrA1 결합 길항제는 항-HtrA1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab’-SH, Fv, scFV, 및 (Fab’)2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 Fab이다. 일부 구현예에서, Fab는 중쇄 불변 영역의 상부 힌지에서 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 위치 221 (EU 넘버링)에서 종결한다. 일부 구현예에서, 위치 221에서 아미노산 잔기는 아스파르트산 (Asp) 잔기이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호:　156. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열 번호: 160. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열 번호: 159. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열 번호: 160, 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열 번호: 159. 일부 구현예에서, Fab는 IgG1 Fab이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이를 필요로하는 대상체에서 HtrA1-연관된 장애 또는 보체-연관된 장애를 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 선행 항체 중 임의의 것 및 치료적 유효량의 인자 D 결합 길항제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
선행 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 인자 D 결합 길항제는 항-인자 D 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 Fab 또는 (Fab')2 이다. 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYAX1DFKG (서열 번호: 110) (여기서 X1 은 Asp 또는 Glu임); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVX1N (서열 번호: 111) (여기서 X1 는 Asn 또는 Ser임); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTX1IX2X3DMN (서열 번호: 112) (여기서 X1 은 Asp 또는 Ser이고, 그리고 X2 는 Asp 또는 Glu이며, 그리고 X3 은 Asp 또는 Ser임); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSX1SLPYT (서열 번호: 114), 여기서 X1 은 Asp 또는 Glu이다. 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYADDFKG (서열 번호: 115); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVNN (서열 번호: 116); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTDIDDDMN (서열 번호: 117); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSDSLPYT (서열 번호: 118). 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 119; (b) 서열 번호: 120의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열 번호: 120의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-인자 D 항원-결합 단편은 람팔리주맙이다.
선행 양태 중 임의의 것의 일부 구현예에서, HtrA1-관련 장애 또는 보체-연관된 장애는 안구 장애이다. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD, 당뇨 망막병증, 맥락막 신생혈관형성 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, 중심 망막 정맥 폐색, 각막 혈관형성, 및 망막 신생혈관형성으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD이다. 일부 구현예에서, AMD는 초기 건식 AMD, 중간 건식 AMD, 또는 진행성 건식 AMD이다. 일부 구현예에서, 진행성 건식 AMD는 지도형 위축증이다.
임의의 선행 측면의 일부 구현예에서, 항체는 초자체내로, 안구로, 안구내로, 공막주변으로, 테논낭하로, 상맥락막으로, 국소적으로, 정맥내로, 근육내로, 진피내로, 경피로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 늑막내로, 기관내로, 척추강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 국소적으로, 복강내로, 복막으로, 심실내로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 안와내로, 경구로, 경피로, 흡입으로, 주사로, 점안액에 의해, 이식에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 직접적으로 표적 세포를 수영하는 국재화된 관류에 의해, 카테터에 의해, 세척에 의해, 크림으로, 또는 지질 조성물로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체는 초자체내로, 안구로, 안구내로, 공막주변으로, 테논낭하로, 상맥락막으로, 또는 국소적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체는 주사에 의하여 유리체내로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체는 점안액 또는 연고에 의해 국소적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항체는 지속성 전달 시스템에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 지속성 전달 시스템은 PLGA-기반 고체 이식물 또는 이식가능 포트 전달 시스템이다.
선행하는 양태 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
도 1a-1b는 다수의 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)-양성 하이브리도마 클론이 양쪽 인간 (hu) 및 뮤린 (mu) HtrA1 프로테아제 도메인 (PD)에 유사한 반응성 프로파일을 보여주었던 것을 나타내는 그래프이다. 상기 그래프는 각각의 지시된 75 클론에 대하여 650 nm (OD650nm)에서 광학 밀도를 보여준다. 상기 검정에서 배경 신호는 < 0.05 OD650nm이었다. 상기 인간 및 뮤린 HtrA1 프로테아제 도메인은 91% 상동성을 공유한다.
도 2a는 BODIPY® FL-표지된 형광 기질의 HtrA1-PD-매개된 절단을 억제시키기 위해 지시된 항-HtrA1 하이브리도마 클론 상청액의 능력을 결정하는데 사용된 차단 검정의 개략도이다.
도 2b-2c는 10 항-HtrA1 하이브리도마 클론 상청액이 도 2a 및 실시예 1에 기재된 차단 검정을 이용하여 인간 HtrA1-PD-매개된 기질 절단을 현저하게 억제시켰다는 것을 나타내는 그래프이다. 상기 그래프는 지시된 클론으로부터 하이브리도마 상청액에 대하여 평균 형광 신호 (밀리 상대 형광 유닛 (mRFU)/분)을 보여준다. 컨디셔닝된 배지 (CM 또는 cond. 배지)내 10 ㎍/ml로 항체 YW505.94 (또한 "94 IgG"로서 지칭됨, 참고 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/055998, 이의 전체가 참조로 본 명세서에서 편입됨)은 상기 검정이 배지로 인해 변화 없음을 보여주었던 것을 나타내기 위해 양성 대조군으로서 작용하였고 검정 시간 동안 안정적이다. 버퍼 또는 배지는 음성 대조군으로서 작용하였다. 도 2c는 버퍼, E 배지 (CLONACELL™으로부터 영양소-풍부 배지), 및 컨디셔닝된 배지에 대하여 검정의 초기 및 최종 결과를 보여준다. 100%는 완전한 억제를 지시한다.
도 3a-3b는 muHtrA1-PD (도 3a) 또는 huHtrA1-PD (도 3b)에 의한 형광 기질의 절단을 억제시키는 지시된 하이브리도마 상청액의 능력을 보여주는 그래프이다. 도 3a에서, 40 nM의 muHtrA1-PD는 40 ㎕ muHtrA1-PD 대 60 ㎕ 하이브리도마 상청액의 비로 사용되었다. 도 3b에서, 20 nM의 huHtrA1-PD는 40 ㎕ huHtrA1-PD 대 60 ㎕ 하이브리도마 상청액의 비로 사용되었다. 항체 YW505.94 ("94 IgG")는 양성 대조군으로서 작용하였다. 버퍼 및 CM은 음성 대조군으로서 작용하였다.
도 4a는 FRET-기반 기질, H2-Opt의 HtrA1-PD -매개된 절단을 억제시키기 위해 정제된 항-HtrA1 항체 클론의 능력을 결정하는데 사용된 FRET-기반 차단 검정의 개략도이다.
도 4b-4c는 정제된 항체 클론 15H6, 19B12, 3A5, 12A5, 및 20E2가 뮤린 (도 4b) 및 인간 (도 4c) HtrA1-PD-매개된 기질 절단을 억제시키는 능력을 유지하였던 것을 나타내는 그래프이다. 무 항체 ("no ab")의 첨가는 음성 대조군으로서 작용하였고, 반면 항체 YW505.94 ("94 IgG")는 양성 대조군으로서 작용하였다. 정제된 항체는 5 nM, 50 nM, 또는 500 nM의 농도에서 첨가되었다. 15 nM 또는 muHtrA1-PD-Fc는 도 4b에서 나타난 검정에서 사용되었고, 반면 3 nM의 huHtrA1-PD-Fc는 도 4c에서 나타난 검정에서 사용되었다.
도 5a-5b는 지시된 정제된 mIgG 항체 클론이 FRET 펩타이드 기질의 전장 인간 HtrA1 (huHtrA1-FL)-매개된 절단을 억제시키는 것을 나타내는 그래프이다. 상기 그래프는 IgG 농도의 함수로서 활성 (mRFU/분)을 보여준다. huHtrA1-FL은 5 nM의 농도로 첨가되었다. Cifferi et al. (2015) Biochem . J. 472(2):169-81에 기재된 바와 같이 IgG 포멧 ("IgG94") 및 이의 키메라성 변이체 ("IgG94-ch")에서 YW505.94는 양성 대조군으로서 작용하였다. 각각의 항체 클론에 대하여 절반 최대 억제성 농도 (IC50)은 보여진다.
도 5c-5d는 지시된 정제된 mIgG 항체 클론이 FRET 펩타이드 기질의 muHtrA1-FL-매개된 절단을 억제시키는 것을 나타내는 그래프이다. 상기 그래프는 IgG 농도의 함수로서 활성 (mRFU/분)을 보여준다. muHtrA1-FL은 5 nM로 첨가되었다. IgG94 및 IgG94-ch는 도 5a 및 5b에 대하여 도 설명에서 기재된 바와 같이 양성 대조군으로서 작용하였다. 절반 최대 억제성 농도 (IC50)는 보여진다.
도 6a는 항체 클론 19B12, 20E2, 3A5, 12A5, 및 15H6의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열의 서열 정렬을 보여준다.
도 6b는 항체 클론 19B12, 20E2, 3A5, 12A5, 및 15H6의 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열의 서열 정렬을 보여준다.
도 7a-7b는 하이브리도마 상청액 ("hyb")로부터 정제된 또는 293 세포 ("293")으로부터 재조합으로 발현된 mIgG 항체 클론 15H6 (도 7a) 또는 클론 19B12 (도 7b)를 이용하여 FRET-기반 차단 검정의 결과를 보여주는 그래프이다. 상기 그래프는 항체 농도 (nM)의 함수로서 Vmax (mRFU/분)을 플롯팅한다. 3 nM의 huHtrA1-FL은 각각의 검정에서 사용되었다. 지시된 항체 클론에 대하여 IC50 값은 또한 보여진다.
도 8a-8b는 인간 공통 κ1 서열 (도 8a) 또는 VH1 서열 (도 8b)에 비교된 (또한 본 명세서에서 "h15H6.v3"으로서 지칭된) 항-HtrA1 항체 클론 m15H6, H15H6.v1, H15H6.v2, 및 h15H6.v2.APEG의 VL (도 8a) 및 VH (도 8b)의 아미노산 서열의 서열 정렬을 보여준다. HVR 서열은 각각의 항체 클론에 대하여 표시된 박스에 의해 경계가 정해진다. 카밧 정의에 따른 HVR 서열은 밑줄친다. 그늘진 박스에서 백색 텍스트로 보여진 잔기는 인간 공통 VH1 서열과 항-HtrA1 항체 클론 사이 상이한 잔기를 나타낸다.
도 9a-9d는 스트렙타비딘-포착된 바이오티닐화된 인간 또는 뮤린 HtrA1에 m15H6 또는 h15H6.v1의 결합의 BIACORE™ 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. 단일 사이클 동력학 분석은 이용되었다. 상기 그래프는 시간 (sec)의 함수로서 응답 유닛 (RU)을 보여준다. 도 9a는 huHtrA1에 m15H6 Fab의 결합으로부터 결과를 보여준다. 도 9b는 muHtrA1에 m15H6 Fab의 결합으로부터 결과를 보여준다. 도 9c는 huHtrA1에 h15H6.v1의 결합으로부터 결과를 보여준다. 도 9d는 huHtrA1에 h15H6.v1의 결합으로부터 결과를 보여준다. 각각의 분석으로부터 결정된 Kon, Koff, 및 KD는 각각의 그래프 내부에서 텍스트로서 보여진다.
도 10a-10b는 뮤린 (도 10a) 또는 인간 (도 10b) HtrA1에 지시된 h15H6.v1 Fab 변이체의 결합용 파아지 경쟁 ELISA 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. 상기 그래프는 HtrA1 농도 (nM)의 함수로서 결합된 파아지 (OD450 nm)을 보여준다.
도 11a-11b는 뮤린 (도 11a) 또는 인간 (도 11b) HtrA1에 항체 클론 h15H6.v2 및 HVR-L3 LC-W91L 그리고 LC-W91Y 변이체의 결합을 비교하는 BIACORE™ SPR 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. 사용된 항체는 Fab 포멧이었다. 각각의 분석으로부터 결정된 Kon, Koff, 및 KD는 각각의 그래프 내부에서 텍스트로서 보여진다.
도 12a는 huHtrA1에 VL 위치 94 (즉, LC-N94A LC-P95 (AP), LC-N94E LC-P95 (EP), LC-N94Q LC-P95 (QP), 및 LC-N94S LC-P95 (SP))에서 항체 클론 h15H6.v2 (모체) 및 지시된 변이체의 결합을 비교하는 BIACORE™ SPR 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. 사용된 항체는 Fab 포멧이었다. 상기 그래프는 시간 (sec)의 함수로서 응답 유닛 (RU)를 보여준다.
도 12b는 도 12a에서 보여진 BIACORE™ SPR 분석의 결과를 요약하는 표이다.
도 13a는 huHtrA1에 VH 위치 55 및/또는 56 (즉, HC-D55A HC-G56 (AG), HC-D55E HC-G56 (EG), HC-D55S HC-G56 (SG) 및 HC-D55 HC-G56A (DA))에서 항체 클론 h15H6.v2 (모체) 및 지시된 변이체의 결합을 비교하는 BIACORE™ SPR 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. 사용된 항체는 Fab 포멧이었다. 상기 그래프는 시간 (sec)의 함수로서 응답 유닛 (RU)를 보여준다.
도 13b는 도 13a에서 보여진 BIACORE™ SPR 분석의 결과를 요약하는 표이다.
도 14a는 huHtrA1에 VL 위치 94 및 VH 위치 55 및/또는 56에서 항체 클론 h15H6.v2 ("모체") 및 지시된 조합 변이체의 결합을 비교하는 BIACORE™ SPR 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. AP_EG: LC-N94A LC-P95 HC-D55E HC-G56 (또한 "h15H6.v2.APEG" 및 "h15H6.v3"으로서 지칭됨). EP_EG: LC-N94E LC-P95 HC-D55E HC-G56. QP_EG: LC-N94Q LC-P95 HC-D55E HC-G56. SP_EG: LC-N94S LC-P95 HC-D55E HC-G56.
도 14b는 도 14a에서 보여진 BIACORE™ SPR 분석의 결과를 요약하는 표이다.
도 14c는 HtrA1의 활성을 억제시키기 위해 VL 위치 94 및 VH 위치 55 및/또는 56에서 h15H6.v2 IgG, h15H6.v2 Fab, 및 지시된 조합 변이체의 능력을 시험하는 FRET-기반 차단 검정의 결과를 보여주는 그래프이다. 상기 그래프는 log 항체 농도 (M)의 함수로서 퍼센트 최대 활성을 플롯팅한다.
도 14d는 도 14c에서 시험된 각각의 항체 클론용 IC50 값을 보여주는 표이다.
도 15a-15b는 인간 공통 κ4 서열 (도 15a) 또는 VH3 서열 (도 15b)에 비교된 항-HtrA1 항체 클론 m19B12 및 h19B12.v1의 VL (도 15a) 및 VH (도 15b)의 아미노산 서열의 서열 정렬을 보여준다. HVR 서열은 각각의 항체 클론에 대하여 표시된 박스에 의해 경계가 정해진다. 카밧 정의에 따른 HVR 서열은 밑줄친다. 그늘진 박스에서 백색 텍스트로 보여진 잔기는 인간 공통 VH1 서열과 항-HtrA1 항체 클론 사이 상이한 잔기를 나타낸다.
도 16a-16d는 인간 또는 뮤린 HtrA1에 항체 클론 m19B12 또는 h19B12.v1의 결합의 BIACORE™ SPR 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. 단일 사이클 동력학 분석은 이용되었다. 상기 그래프는 시간 (sec)의 함수로서 응답 유닛 (RU)를 보여준다. 도 16a는 huHtrA1에 m19B12 Fab의 결합으로부터 결과를 보여준다. 도 16b는 muHtrA1에 m19B12 Fab의 결합으로부터 결과를 보여준다. 도 16c는 huHtrA1에 h19B12.v1 Fab의 결합으로부터 결과를 보여준다. 도 16d는 huHtrA1에 h19B12.v1 Fab의 결합으로부터 결과를 보여준다. 각각의 분석에 대하여 Kon, Koff, 및 KD는 각각의 그래프 내부에서 텍스트로서 보여진다.
도 17은 친화성 성숙용 h15H6.v2의 HC 및 LC HVRs의 NNK 심도 스캐닝 돌연변이유발에 사용된 파아지 패닝 전략을 개요하는 개략도이다.
도 18a-18b는 미분류된 샘플에서 매우 동일한 돌연변이의 빈도로 분류된 샘플에서 제공된 위치에 제공된 돌연변이의 빈도를 나눗셈하여 계산된 지시된 VH (도 18a) 또는 VL (도 18b) HVR 위치에서 돌연변이에 대하여 존재비의 log2의 히트맵을 보여준다. 예시적 돌연변이의 존재비는 히트 맵 하에 지시된다.
도 19는 h15v6.v2의 VH 및 VL의 연성 무작위화 라이브러리 및/또는 NNK 라이브러리로부터 미분류된 샘플에 비교된 경우 분류된 샘플에서 풍부한 것으로서 확인된 돌연변이를 보여주는 표이다.
도 20은 지시된 친화성 성숙된 Fab 항체 변이체 클론의 결합의 BIACORE™ SPR 분석의 결과를 보여주는 표이다. 상기 분석으로부터 수득된 각각의 친화성 성숙된 항체 변이체 클론에 대하여 Kon, Koff, 및 KD는 (또한 h15H6.v3으로서 지칭된) h15H6.v2 및 h15H6.v2.APEG에 비교된 바와 같이 보여진다.
도 21a-21b는 친화성 성숙된 변이체 항-HtrA1 항체 클론의 VL (도 21a) 및 VH (도 21b)의 아미노산 서열의 서열 정렬을 보여준다.
도 22a는 FRET-기반 H2-Opt 활성 검정에서 평가된 경우 HtrA1의 활성을 억제시키기 위해 지시된 친화성 성숙된 변이체 항-HtrA1 Fab 항체 클론의 결과를 요약하는 표이다. 상기 표는 3 독립적인 실험 뿐만 아니라 평균 및 표준 편차 (StDev)로부터 결과를 보여준다. 이들 실험은 비율 (RFU/s) 분석을 이용하였다.
도 22b는 도 22a에서 묘사된 재조합 HtrA1을 이용하여 H2-Opt 활성 검정으로부터 결과의 예시적 플롯을 나타내는 그래프이다. 상기 검정 조건은 400 pM HtrA1, 및 2.5 μM 기질을 포함하였다. 상기 버퍼는 50 mM Tris, 200 mM NaCl, 0.25% CHAPS, pH 8.3이었다. 이들 데이터는 도 22a에서 3 독립적인 실험의 제2 반복으로부터이다.
도 23a-23d는 RFU/s 비율 접근법을 이용하여 분석된 지시된 h15H6 항체 변이체 포맷용 H2-Opt 활성 검정으로부터 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 그래프는 h15H6.v4 IgG 단클론성 항체 (mAb) (도 23a), 양성 대조군 항-HtrA1 항체 (YW505.94A IgG, 참고, 예를 들면, WO 2013/055998) (도 23b), h15H6.v4 Fab (도 23c), 및 15H6.v2 Fab (도 23d)에 대하여 항체 농도 (nM)의 함수로서 대조군의 백분율 (RFU/S)를 보여준다. 각각의 그래프 옆의 표는 IC50, Y 범위, 기울기 인자, 및 각각의 분석으로부터 배경을 보여준다.
도 23e-23h는 종점 (RFU) 접근법을 이용하여 분석된 지시된 h15H6 항체 변이체 포맷용 H2-Opt 활성 검정으로부터 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 그래프는 h15H6.v4 IgG Mab (도 23e), 양성 대조군 항-HtrA1 항체 (YW505.94A IgG) (도 23f), h15H6.v4 Fab (도 23g), 및 15H6.v2 Fab (도 23h)에 대하여 항체 농도 (nM)의 함수로서 대조군의 백분율 (RFU/S)를 보여준다. 각각의 그래프 옆의 표는 IC50, Y 범위, 기울기 인자, 및 각각의 분석으로부터 배경을 보여준다.
도 24a-24b는 3 독립적인 실험의 제1 세트로부터 지시된 h15H6 항체 변이체 포맷에 대하여 IC50 (도 24a) 및 IC90 (도 24b) 결과를 보여주는 표이다. IC50 값은 4-파라미터 적합을 이용하여 결정되었다. IC90 값은 적합의 IC50 값 및 기울기로부터 결정되었다. 실험 I은 도 23a-23f에서 나타난 데이터에 대응한다. CV%, 변동 계수. 상기 데이터는 비율 (RFU/s) 접근법을 이용하여 분석되었다.
도 25a-25b는 3 독립적인 실험의 제2 세트로부터 지시된 h15H6 항체 변이체 포맷에 대하여 IC50 (도 25a) 및 IC90 (도 25b) 결과를 보여주는 표이다. IC50 값은 4-파라미터 적합을 이용하여 결정되었다. IC90 값은 적합의 IC50 값 및 기울기로부터 결정되었다. 데이터는 어느 한쪽 비율 (RFU/s) 접근법 또는 종점 (RFU) 접근법을 이용하여 분석되었다.
도 26a는 온전한 α-카세인 적정 곡선을 나타내는 그래프이다. 실험적 농도는 이론적 스파이크-인 농도 (㎍/ml)의 함수로서 플롯팅되었다. 상관 계수 (R2)는 0.999이었다.
도 26b는 질량-분광분석법-기반 HtrA1 활성 검정의 결과를 나타내는 그래프이다. Htra1-PD 활성을 억제시키기 위한 APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4)의 능력은 실시예 3, 섹션 G에 기재된 바와 같이 평가되었다. 작은 분자 억제제 ucf-101은 양성 대조군으로서 작용하였다.
도 27a-27b는 2 독립적인 내인성 HtrA1 활성 검정, 실험 I (도 27a) 및 실험 II (도 27b)로부터 결과를 나타내는 그래프이다. 각각의 항체 Fab에 대하여, #1 및 #2는, 개별적으로 수행된 초기 희석과 함께, 동일한 항체의 별도의 희석 시리즈를 지시한다. 2 희석 시리즈는 동일한 제조로부터인 다른 시약과 동일한 플레이트에서 운영되었다.
도 27c는 도 27a 및 27b에서 묘사된 내인성 HtrA1 활성 검정의 결과를 요약하는 표이다.
도 28은 지시된 h15H6.v2 Fab 변이체 및 유도체의 동력학 결합 특성 및 억제성 활성을 요약하는 표이다. YW505.94a.28 (참고, 예를 들면, WO 2013/055998)은 양성 대조군으로서 작용하였다. 모든 h15H6 Fab 변이체 및 유도체는 YW505.94a.28 Fab와 비교된 경우 개선된 친화성 및 개선된 효력을 보여주었고, h15H6.v4 Fab는 상기 항체와 비교된 경우 친화성에서 대략 30-배 개선을 보여주었다.
도 29a는 인간 HtrA1의 아미노산 서열을 보여준다. 성숙 서열은 대문자로 나타나고, 프로테아제 도메인은 밑줄치고, 잔기 N224 및 K248은 그늘진다.
도 29b는 뮤린 HtrA1의 아미노산 서열을 보여준다. 성숙 서열은 대문자로 나타나고, 프로테아제 도메인은 밑줄친다.
도 30은 참조 항-인자 D 항체 ("WT") 및 이의 선택 변이체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 정렬을 보여준다. 상기 가변 도메인 이내 HVRs는 밑줄친다. 변이체에서 잔기 치환은 볼드체로 나타난다.
도 31a-31b는 HtrA1에 (WO 2013/055998에 기재된 바와 같이) YW505.94 Fab의 결합을 묘사한다. 도 31a에서 지정된 아미노산이 알라닌으로 대체되는 경우, 돌연변이된 단백질용 YW505.94 Fab의 결합 친화성은 감소된다. 도 31b에서 나타난 구조는 Ciferri et al. (2015) Biochem . J. 472(2):169-81에 기재된 바와 같이 전자 현미경검사를 이용하여 생성되었다. 원은 HtrA1 단백질에서 YW505.94 Fab용 에피토프를 보여준다. YW505.94 Fab는 HtrA1 단백질의 루프 "B" 및 "C"에 결합한다.
도 32a-32b는 HtrA1에 15H6.v4 Fab의 결합을 묘사하고, 15H6.v4 Fab에 의해 결합된 HtrA1 에피토프가 YW505.94 Fab에 의해 결합된 에피토프와 구별되는 것을 보여준다. 도 32a는, X-선 결정학에 의해 결정된 바와 같이, HtrA1 단백질에서 15H6.v4 Fab와 이의 에피토프 사이 상호작용을 도시한다. 15H6.v4 Fab는 HtrA1 단백질의 LA 루프에 결합한다 (참고, 예를 들어, Glaza P et al. (2015) PLoS One 10(6):e0131142). 도 32b에서 나타난 구조는 전자 현미경검사를 이용하여 생성되었다. 원은 HtrA1 단백질에서 15H6V.4 Fab 에피토프를 보여준다.
I.정의
본원에 사용된 바와 같이 용어 "약"은 본 기술 분야의 숙련가에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본원에서 "약(about)" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 상기 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 구현예를 포함한다 (그리고 기술한다).
본원의 목적을 위해 "수용체 인간 프레임워크"는 아래에 정의된 바와 같은 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유도된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유도된" 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이것은 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 구현예에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 서열에 있어서 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 동일하다.
본 발명의 항체의 문맥에서 "활성(active)" 또는 "활성(activity)" 또는 "생물학적 활성"은, 예를 들어, 시험관내 및/또는 생체내, 이의 표적의 생물학적 활성을 길항하는 (부분적으로 또는 완전히 억제시키는) 능력이다. 항체의 생물학적 활성의 하나의 예는 이의 표적과 관련된 장애의 상태, 예를 들면, 병리학에서 측정가능한 개선을 달성하는 능력이다. 예를 들어, 항-HtrA1 항체에 대하여, 장애는 HtrA1-관련 장애, 예컨대, 예를 들어, AMD (예를 들면, 지도형 위축증)일 수 있다. 항-HtrA1 항체의 활성은, 관련된 동물 모델, 또는 인간 임상시험을 이용하여, 결합 검정, 활성 검정 (예를 들면, (예를 들면, H2-Opt 기질을 이용하는) FRET-기반 활성 검정 또는 질량 분광분석법-기반 활성 검정)을 포함하는, 시험관내 또는 생체내 시험에서 결정될 수 있다. 또 다른 예에서, 항-인자 D 항체 (예를 들면, 항-HtrA1/항-인자 D 항체)에 대하여, 장애는 보체-관련 장애, 예컨대, 예를 들어, 보체-관련 안구 장애일 수 있다. 항-인자 D 항체의 활성은, 관련 동물 모델, 또는 인간 임상 시험을 사용한, 결합 검정, 대안적 경로 용혈 검정 (예컨대, 대안적 경로 보체 활성 또는 활성화의 억제율을 측정하는 검정)을 포함하는, 시험관내 또는 생체내 시험 중 계측될 수 있다.
“친화도"는 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 상대 (예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 다르게 지시되지 않으면, 본원에서 사용된 바와 같이 "결합 친화도"는 결합 쌍 멤버(예를 들면, 항체 및 항원) 간 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 나타낸다. 상대 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (KD)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 계측될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정의 구체적이고 예시적인 구현예들이 아래에 기재되어 있다.
“친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도에 있어서의 개선을 야기하는 변경을 갖지 않는 친계 항체와 비교하여, 하나 이상의 초가변 영역(HVR) 및/또는 프레임워크 영역 (FR)에 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 나타내며, 상기 변경은 항원에 대한 항체의 친화도에 있어서의 개선을 야기한다.
용어 "항-HtrA1 항체" 및 "HtrA1에 특이적으로 결합하는 항체"는 항체가 HtrA1를 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 하기에 충분한 친화도로 HtrA1에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 일 구현예에서, 관련없는, 비-HtrA1 단백질에 항-HtrA1 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역검정 (RIA)에 의해 측정 시 HtrA1에 대한 항체의 약 10% 미만의 결합이다. 특정 구현예에서, HtrA1에 결합하는 항체는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM (예컨대, 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-HtrA1 항체는 상이한 종 유래의 HtrA1 중 보존되어 있는 HtrA1의 에피토프에 결합한다. 항-HtrA1 항체는, 예를 들어, 본 명세서에서 또는, 이의 전체가 참조로 본 명세서에서 편입되는, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/055998에 기재된 임의의 항-HtrA1 항체일 수 있다.
용어 "항-인자 D 항체" 및 "인자 D에 특이적으로 결합하는 항체"는 항체가, 예를 들어, 보체 활성화를 억제 또는 실질적으로 감소시키기 위한 그와 같은 방식으로, 인자 D 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 인자 D를 결합시킬 수 있는 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, 비관련, 비-인자 D 단백질에 대한 항-인자 D 항체의 결합 정도는, 예를 들면, RIA으로 측정 시 약 10% 미만의 인자 D에 대한 항체의 결합이다. 특정 구현예에서, 인자 D에 결합하는 항체는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM (예컨대, 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-인자 D 항체는 상이한 종으로부터 인자 D 중에 보존된 인자 D의 에피토프에 결합한다. 항-인자 D 항체는 본 명세서에서 및/또는, 각각의 이들이 그 전문이 참조로 본 명세서에서 편입되는, 미국 특허 번호 8,067,002; 8,273,352; 및 8,268,310; 및 미국 특허 출원 번호 14/700,853에 기재된 임의의 항-인자 D 항체일 수 있다.
본원에서의 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 비제한적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
“항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원과 결합하는 무손상 항체의 일부분을 포함하는 무손상 항체가 아닌 분자를 가리킨다. 항체 단편들의 예시들은 비제한적으로 Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2 ; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예컨대, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다가특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편을 생산하고, 그리고 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인 잔여 "Fc" 단편을 생산한다. Fab 단편은 중쇄 (H) 사슬의 가변 영역 도메인 (VH), 그리고 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)과 함께, 전체 경쇄 (L) 사슬로 구성된다. 항체의 펩신 처리는 단일의 큰 F(ab')2 단편을 산출하고, 이는 일상적으로 2가 항원-결합 활성을 갖는 2개의 이황화 연결된 Fab 단편에 상응하고, 여전히 항원과 가교결합할 수 있다. Fab' 단편은 항체-힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 추가의 소수 잔기를 가짐에 의하여 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어있다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 적어도 불변 영역의 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 원상태 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다.　 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226 또는 Pro230으로부터 카복실-말단까지 연장된다.　　그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역 내에 아미노산 잔기의 넘버링은 하기에서 설명된 바와 같이, EU 인덱스로 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
“Fv”는 조밀한, 비-공유 연합으로의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 2개 도메인으로부터, 항원 결합에 대하여 아미노산 잔기를 부여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개 초가변 루프 (H 및 L 쇄로부터 각각 3개 루프)가 산출된다. 그러나, 종종 전체 결합 부위에 대하여 더 낮은 친화도에서지만, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대하여 특이적인 3 개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
또한 “sFv” 또는 “scFv”로서 약칭되는 “단일 사슬 Fv”는 단일 폴리펩티드 사슬 내로 연결된 VH와 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더욱 포함하는데, 이것은 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 재고를 위해, 하기를 참고한다:
Figure pct00001
in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
용어 “디아바디”는 V 도메인의 사슬내가 아닌 사슬간 짝짓기가 달성되어 이가 단편, 다시 말하면, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편이 산출되도록, VH와 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10 잔기)로 sFv 단편 (선행하는 단락 참조)을 구축함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아바디는 2개 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄 상에 존재하는, 2개의 "크로스오버(crossover)" sFv 항체 단편의 이종이량체이다. 디아바디는 하기에 더욱 충분히 기술된다: 예를 들면, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 90:6444-6448,1993.
"차단 항체" 또는 "길항제" 항체는 이 항체가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 저해시킨다.
참조 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 50% 이상만큼 경쟁 검정에서 이의 항원에 참조 항체의 결합을 차단하는 또는 참조 항체에 비교된 경우 항원의 아미노산 잔기의 중첩 세트를 접촉시키는 항체를 지칭한다. 항원을 접촉시키는 항체의 아미노산 잔기는, 예를 들어, 항원과 복합체로 항체의 결정 구조 결정 또는 수소/중수소 교환 수행에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 5 Å 이내인 항체의 잔기는 항원을 접촉시키는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 이의 항원으로의결합을 50% 이상 차단하고, 역으로, 참조 항체는 경쟁 검정에서 50% 이상으로 항체의 이의 항원으로의 결합을 차단한다. 예시적인 경쟁 검정은 본원에 제공되어 있다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 공급원 또는 종으로부터 유도되는 반면 나머지 중쇄 및/또는 경쇄는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유도되는 항체를 나타낸다.
항체의 “부류”는 이의 중쇄가 소유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 언급한다. 5개 주요 부류의 항체가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류(이소형), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가 구분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다.
“효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 나타내며, 이것은 항체 이소형에 따라 가변한다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절 (예를 들면, B 세포 수용체); 및 B 세포 활성화.
"프레임워크", “프레임워크 영역” 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4가지 FR 도메인으로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타내기 위해 상호교환 가능하게 본원에서 사용된다.
"힌지 영역"은 인간 IgG1의 216-238 (EU 넘버링) 또는 226-251 (카밧 넘버링)으로부터 스트레칭으로서 일반적으로 정의된다. 힌지는 3 구별되는 영역, 상부, 중간 (예를 들면, 코어), 및 하부 힌지로 추가로 분할될 수 있다. 특정한 구현예에서, 인간 IgG1 항체의 힌지 영역은 일반적으로 아래와 같이 정의된다:
상부 힌지는 하기를 갖는 아미노산을 포함한다: 서열 EPKSCDKTHT (서열 번호: 157). 특정한 구현예에서, 상부 힌지는 위치 216-225 (EU 넘버링) 또는 226-238 (카밧 넘버링)에서 아미노산을 포함한다.
하기 서열을 포함하는 중간 (예컨대, 코어) 힌지: CPPC (서열 번호: 122). 특정한 구현예에서, 코어 힌지는 위치 226-229 (EU 넘버링) 또는 239-242 (카밧 넘버링)에서 아미노산을 포함한다.
하부 힌지는 하기를 갖는 아미노산을 포함한다: 서열 PAPELLGGP (서열 번호: 158). 특정한 구현예에서, 하부 힌지는 위치 230-238 (EU 넘버링) 또는 243-251 (카밧 넘버링)에서 아미노산을 포함한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 기타의 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유도되는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특이적으로 비인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
“인간 공통 프레임워크”는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터이다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 하기에서의 것과 같다: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. 일 구현예에서, VL에 대하여, 하위그룹은 Kabat et al, 상기에서와 같이 하위그룹 카파 I이다. 일 구현예에서, VH에 대해, 하위그룹은 Kabat et al., 상기에서와 같이 하위그룹 III이다.
비-인간 (예를 들면, 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 항체로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라성 항체이다. 대개, 인간화된 항체는 수령체의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화도, 및 능력을 가지는 비-인간 종 (공여체 항체) 예컨대 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기들에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 수행능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변성 루프는 비-인간 면역글로불린의 것과 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 부분을 포함할 것이다. 추가 세부사항에 대해서는, 하기를 참고한다: Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op. Struct. Biol . 2:593-596 (1992).
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 분절에서 항체 간 서열이 항체 중 차례로 광범위하게 상이한 사실을 지칭한다. 가변 또는 “V” 도메인은 항원 결합을 매개하고, 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 범위에 균일하게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각 9-12 아미노산 길이인 "초가변성 영역"이라 불리는 극단적인 가변성의 짧은 영역에 의해 분리된 15-30 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 상대적으로 불변의 뻗기로 구성된다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 "초가변성 영역” 또는 “HVR”은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로, 예를 들어, VL에서 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 부근, 및 VH에서 약 잔기 26-35 (H1), 49-65 (H2) 및 95-102 (H3) 부근으로부터 아미노산 잔기를 포함한다 (하나의 구현예에서, H1은 약 잔기 31-35 부근이다); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "초가변성 루프"로부터의 이들 잔기 (예를 들면 VL 내 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 VH 내 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987). 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 크게는 베타-시트 입체배치를 채택한 4개의 FR을 포함하여, 베타-시트 구조를 연결하고, 그리고 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 근접하여 함께 유지되고, 그리고 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 따라서 HVR과 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 출현한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. 불변 도메인은 항원에 항체를 결합하는 것에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 작용을 나타낸다.
용어 "카밧에서의 가변-도메인 잔기-넘버링", “카밧 아미노산 잔기”, 또는 "카밧에서의 아미노산-위치 넘버링" 및 이들의 변형은 [Kabat et al.,상기]에서 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대하여 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 상기 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 대응하는 더 적거나 더 많은 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인에는 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입(카밧에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기(예를 들면, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)가 포함될 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카밧 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대하여 계측될 수 있다.
카밧 넘버링 시스템은 가변 도메인 내 잔기(대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)에 대하여 지칭할 때 일반적으로 사용된다(예를 들면, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지수" 는 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭할 경우 사용된다 (예컨대, 상기 Kabat et al. 에 보고된 EU 지수). “카밧으로의 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 가변 도메인에서 잔기 수에 대한 참조는 카밧 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급하지 않는다면, 항체의 불변 도메인의 잔기 수에 대한 언급은, EU 넘버링 시스템 (예컨대, 참고: 미국 가출원 번호 60/640,323, EU 넘버링에 대한 도면)에 의한 잔기 넘버링을 의미한다.
다르게 명시되지 않으면, 가변 도메인 (예를 들면, FR 잔기)에서 HVR 잔기 및 다른 잔기는 Kabat et al., 상기에 따라 본원에서 넘버링된다.
"면역콘주게이트"는 세포독성제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 이종성 분자(들)에 콘주게이트된 항체이다.
본원에 기재된 다양한 항체를 기재하기 위해 사용되는 경우 용어 "단리된 항체"는 이것이 발현되는 세포 또는 세포 배양으로부터 동정되고 단리되고/되거나 회수된 항체를 의미한다. 자연 환경의 오염체 성분은, 전형적으로, 상기 폴리펩티드에 대한 진단적 또는 치료적 이용을 간섭하는 물질이고, 그리고 효소, 호르몬, 그리고 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 다음 기술에 의하여 계측시 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다: 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 접근법. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 하기를 참고한다: 예를 들면, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007). 바람직한 구현예에서, 항체는 (1) 회전 컵 서열분석기를 사용함에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게, 은 염색을 사용한 비-환원 또는 환원 조건하에 SDS-PAGE에 의한 동질성으로 정제된다. 단리된 항체는 폴리펩티드 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내에서 동일계내에 항체를 포함한다. 그러나 일반적으로, 단리된 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 수득한 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 포함하는 개개의 항체는 동일하고 및/또는 예를 들면 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 또는 단클론성 항체 제조의 제조 과정에서 발생되는 가능한 변이체 항체를 제외하고 동일한 에피토프를 결합하고, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체와 대조로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원에서 단일 결정인자에 대해서 유도된다. 따라서, 형용사 "단클론"은 항체가 실질적으로 균일한 항체 집단에서 수득된 것이라는 속성을 명시하고, 어떤 특정한 방법에 의한 상기 항체의 생산을 요구하는 것으로 간주되지 않는다.　 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-디스플레이 방법, 및 모든 또는 일부의 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있고, 단클론성 항체를 제조하기 위한 그와 같은 방법 및 다른 예시적인 방법은 본원에 기재되어 있다.　
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미에서 사용되고 특이적으로 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체에 이르고, 여기에서 VH-VL 유닛은 폴리에피토프 특이성을 갖는다 (즉, 1개의 생물학적 분자에서 2개의 상이한 에피토프 또는 상이한 생물학적 분자에서 각각의 에피토프에 결합할 수 있다). 상기 다중특이적 항체는 전장 항체, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디 및 트리아바디와 같은 항체 단편, 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 항체 단편을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. "다중에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들)상에 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. "이중에피토프 특이성” 또는 “이중특이성”은 동일하거나 상이한 표적(들)상에 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. 그러나, 이중특이적 항체와 대조적으로, 이중-특이적 항체는 아미노산 서열에서 동일한 2 항원-결합 아암을 갖고 각각의 Fab 아암은 2 항원을 인식할 수 있다. 이중-특이성은 단일 Fab 또는 IgG 분자로서 2개의 상이한 항원과 높은 친화성으로 항체를 상호작용하게 한다. 일 구현예에 따라서, IgG1 형태의 다중특이적 항체는 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 각 에피토프에 결합한다. "단일 특이적"은 단지의 하나의 에피토프에 결합하는 능력을 언급한다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 디설파이드 결합된 두 개의 동일한 경쇄 및 두 개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이질사량체성 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어 세 개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어 불변(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, (κ) 및 람다 (λ)라고 불리는 두 가지 타입 중의 하나에 할당될 수 있다.
표적 분자에 대한 항체의 결합에 관하여, 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적인"이라는 용어는 비-특이적 상호작용과는 다른 측정가능한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어, 대조군 분자로의 결합과 비교하여 분자로의 결합을 계측함에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적, 예를 들어 과량의 비표지된 표적과 유사한 조절 분자와의 경쟁에 의해 계측될 수 있다. 이 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 저해되는 경우 특이적 결합이 나타난다. 본원에 사용된, 용어 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 "특이적 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적인"은, 예를 들어, 표적에 대해 10-4 M 이하, 대안적으로 10-5 M 이하, 대안적으로 10-6 M 이하, 대안적으로 10-7 M 이하, 대안적으로 10-8 M 이하, 대안적으로 10-9 M 이하, 대안적으로 10-10 M 이하, 대안적으로 10-11 M 이하, 대안적으로 10-12 M 이하의 KD 또는 10-4 M 내지 10-6 M 또는 10-8 M 내지 10-10 M 또는 10-7 M 내지 10-9 M 범위의 KD를 갖는 분자에 의해 나타낼 수 있다. 당업자에게 인지되는 바와 같이, 친화성 및 KD 값은 역으로 관련된다. 항원에 대한 고친화성은 낮은 KD 값에 의해 측정된다. 일 구현예에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하는 것 없이 특정 폴리펩티드 상의 특정 폴리펩티드 또는 에피토프에 결합하는 경우의 결합을 언급한다.
"항체를 암호화하는 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 이러한 핵산 분자(들)를 단일 벡터 또는 별도의 벡터로 포함하여 나타내며, 이러한 핵산 분자(들)는 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 핵산은 항-HtrA1 항체를 암호화한다. 다른 구현예에서, 핵산은 항-인자 D 항체 (예를 들면, 항-HtrA1/항-인자 D 항체)를 암호화할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결되는 또 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 이것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 삽입되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고 상기 세포의 후손을 포함하는, 외인성 핵산이 도입된 세포를 언급한다. 숙주 세포는 1차 형질전환된 세포 및 계대 횟수와 상관없이 이로부터 유래된 후손을 포함하는 ”형질전환체” 및 “형질전환된 세포”를 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전히 동일하지 않고, 돌연변이를 내포할 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
표준 폴리펩티드 서열과 관련하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우 최대 퍼센트 서열 동일성을 성취하기 위해 갭을 도입한 후 표준 폴리펩티드 서열내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 %로서 정의되고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존성 치환을 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 목적으로의 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 재량 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업계의 숙련가들은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하는데 필요한 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제조사 (Genentech, Inc.)에 의해 개발되었고, 소스 코드는 사용자 기록문서와 함께 하기와 같이 제출되었다: 미국 저작권 청, 워싱턴 D.C., 20559, 하기 하에서 등록됨: 미국 저작권 등록 번호 TXU510087. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코에 소재하는 Genentech, Inc.로부터 공개적으로 이용 가능하거나, 또는 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 예컨대 디지털 UNIX V4.0D 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 바뀌지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 A 내지, 및, 또는 소정의 아미노산 서열 B(이것은 소정의 아미노산 서열 B에 대해 특정의 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)의 아미노산 서열 동일성 %는 다음과 같이 계산된다: 분수 X/Y의 100배, 여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 동일한 매치로서 스코어되는 아미노산 잔기의 수이고 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 % 아미노산서열 동일성은 B 대 A의 % 아미노산 서열 동일성은 동일하지 않음을 인식할 것이다. 달리 구체적으로 기재하지 않은 경우, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 직전의 문단에 기재된 바와 같이 수득한다.
항체를 포함하는, 단백질은 온전한 형태적 구조 및 생물학적 활성을 본질적으로 보유하면 "안정적인" 것으로 언급된다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석적 기술은 본 분야에서 수득가능하며 하기에 검토된다: 예를 들어, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones (1993) Adv . Drug Delivery Rev. 10: 29-90. "개선된 안정성"을 가진 항체 변이체는 개시 참조 항체에 비교하여 더욱 안정적인 항체 변이체를 지칭한다. 바람직하게는, 개선된 안정성을 가진 항체 변이체는 특이적 아미노산 잔기가 물리적 안정성, 및/또는 화학적 안정성, 및/또는 생물학적 활성 개선, 및/또는 천연 항체의 면역원성 감소의 목적을 위하여 변경되는 참조 (야생형) 항체의 변이체이다.
용어 "이성질체화"는 일반적으로 화합물이 임의의 이의 이성질체 형태, 즉, 동일한 화학적 조성물을 갖지만 상이한 구조 또는 배치구성을 갖는, 및, 그러므로, 일반적으로 상이한 물리적 및 화학적 특성을 가진 형태로 전환되는 화학 공정을 지칭한다. 폴리펩타이드의 1종 이상의 아스파르트산 (D 또는 Asp) 잔기(들)이 이소아스파르트산 잔기(들)로 전환된 공정인, 아스파르테이트 이성질체화가 본 명세서에서 특이적으로 사용된다. 참고: 예컨대, Geigeret al., J. Biol . Chem. 262:785-94, 1987.
용어 "탈아미드화"는 일반적으로 아미드 작용기가 유기 화합물로부터 제거되는 화학적 반응을 지칭한다. 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 하나 이상의 아스파라긴 (N 또는 Asn) 잔기(들)이 아스파르트산 (D 또는 Asp)으로 전환된, 즉, 중성 아미드 측쇄가 전체 산성 특성을 갖는 잔기로 전환된 공정, 아스파라긴 탈아미드화가 본원에서 구체적으로 사용된다. 참고: 예컨대, Xie et al., J. Pharm . Sci. 88:8-13, 1999.
폴리펩타이드 분자 (예를 들면, 항체)의 "산화된" 변이체는 최초 폴리펩타이드의 1종 이상의 메티오닌 (M 또는 Met) 또는 트립토판 (W 또는 Trp) 잔기(들)이 메티오닌의 황을 통해 설폰 또는 설폭사이드로 전환된 폴리펩타이드이다. 산화는 메티오닌 (M 또는 Met)를 류신 (L 또는 Leu) 또는 이소류신 (I 또는 Ile)로 전환시킴으로써 예방될 수 있다. 참고: 예컨대, Amphlettet al., Pharm . Biotechnol., 9:1-140, 1996.
특정 확인된 물리적 또는 화학 공정 (예를 들면, 이성질체화, 탈아미드화, 또는 산화)하기 "쉬운" 아미노산 잔기는 확인된 공정 예컨대 이성질체화, 탈아미드화, 또는 산화를 경험하는 경향을 갖는 것으로 확인된 특이적 단백질 분자 내의 잔기를 지칭한다. 그들의 경항은 종종 단백질의 기본적인 및/또는 형태적 구조 이내 그들의 상대 위치에 의해 결정된다. 예를 들어, Asp-XXX 모티프 (여기서 XXX는 Asp, Gly, His, Ser 또는 Thr일 수 있다)에서 제1 Asp가 이의 인접한 잔기의 관여로 인해 Asp 이성질체화하기 쉬운 것이 나타났고, 여기에서 동일한 단백질 이내 일부 다른 Asp는 상기 경향을 보유할 수 없다. 특이적 단백질 분자 이내 특정 공정하기 쉬운 잔기 확인용 검정은 당해 기술에 공지되어 있다. 참고: 예컨대, Cacia et al., Biochem. 35:1897-1903, 1996.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 “HtrA 세린 펩티다제 1 (HtrA1)” 또는 "HtrA1"는, 달리 나타내지 않는 한, 영장류 (예컨대, 인간) 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 랫트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 HtrA1을 지칭한다. 용어는 "전장" 비가공된 HtrA1 뿐만 아니라 세포에서의 가공으로부터 야기되는 HtrA1의 임의의 형태를 포함한다. 용어는 또한 HtrA1의 자연 발생 변이체, 예컨대, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 HtrA1의 아미노산 서열은 하기에 나타나 있다: 서열 번호:　121 (참고: 도 29a). 인간 HtrA1용 UniProt 수탁 번호는 Q92743이다. 예시적인 뮤린 HtrA1의 아미노산 서열은 하기에 나타나 있다: 서열 번호: 155 (참고: 도 29b). 뮤린 HtrA1용 UniProt 수탁 번호는 Q9R118이다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, huHtrA1 및 muHtrA1의 아미노산 잔기는 하기에 참조로 만들어진다: 서열 번호: 121 및 서열 번호: 155, 각각. 아미노산 위치는 하기 이내 1 문자 아미노산 코드 그 다음 이의 위치에 의해 지정된다: 서열 번호: 121, 또는 서열 번호: 155 (참고: 도 29b). 도 29a에 나타낸 바와 같이, 인간 HtrA1의 성숙 서열은 하기를 포함한다: 서열 번호: 121의 위치 23에서의 글루타민에서 개시되며, 그리고 예컨대, Q23-P480의 위치 480에서의 프롤린에서 종료되는, 서열. 인간 HtrA1의 예시적 단편은 아미노산 D161-K379를 포함하는, 본질적으로 상기로 이루어지는, 또는 상기로 이루어지는 단편을 포함한다. HtrA1은 프로테아제, 세린, 11 (IGF 결합) (PRSS11), ARMD7, HtrA, 및 IGFBP5-프로테아제로서 당해 분야에서 또한 공지된다.
용어 "HtrA1"은 또한, 천연 서열 HtrA1 폴리펩타이드, 예컨대 하기에 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 활성 HtrA1 폴리펩타이드를 의미하는, "HtrA1 변이체"를 포함한다: 서열 번호: 121, 또는 서열 번호: 155. 통상적으로, HtrA1 변이체는 천연 HtrA1 서열, 예를 들면, 하기와 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다: 서열 번호: 121, 또는 서열 번호: 155.
용어 "HtrA1 결합 길항제"는 가장 넓은 의미에서 사용되고, HtrA1 생물학적 활성을 중화, 차단, 부분적으로 또는 완전히 억제, 무효화, 감소 또는 방해할 수 있는 임의의 분자를 포함한다. HtrA1 결합 길항제는, HtrA1에 결합하고 HtrA1 활성, 예컨대 시험관내 (예를 들면, H2-Opt 기질 또는 카세인) 또는 생체내 기질을 절단시키는 HtrA1의 능력 (예를 들면, 안구 장애 (예를 들면, AMD (예를 들면, 지도형 위축증)의 병리학에 기여하는 HtrA1의 능력)을 중화, 차단, 부분적으로 또는 완전히 억제, 무효화, 감소 또는 방해할 수 있는, 항-HtrA1 항체, 및 이들의 항체 변이체, 이들의 항원-결합 단편, 다른 결합 폴리펩타이드, 펩타이드, 및 비-펩타이드 작은 분자를, 제한 없이, 포함한다.
용어 "인자 D"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 천연 서열 및 변이체 인자 D 폴리펩타이드를 지칭한다. 인자 D는 당해 분야에서 보체 인자 D (CFD), C3 전활성제 전환효소, 프로페르딘 인자 D 에스테라제, 및 아딥신으로서 또한 공지된다.
"천연 서열 인자 D"는, 이의 제조 방식과 무관하게, 자연에서 유래된 인자 D 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 따라서, 천연 서열 인자 D는 천연으로부터 단리될 수 있으며, 재조합 그리고/또는 합성 수단에 의하여 생산될 수 있다. 하기에 부가하여: 성숙 인자 D 단백질, 예컨대 성숙 인간 인자 D 단백질 (참고, 예를 들면, NCBI 참조 서열 NM_001928, 서열 번호: 126), 용어 “천연 서열 인자 D”는 구체적으로 하기를 포괄한다: 인자 D의 천연 발생 전구체 형태 (예컨대, 활성 형태를 생산하기 위하여 단백질가수분해적으로 절단된 비활성 전구단백질), 천연-발생 변이체 형태 (예컨대, 대안적으로 스플라이싱된 형태) 및 인자 D의 천연-발생 대립유전자 변이체, 뿐만 아니라 천연으로부터 유도된 인자 D 폴리펩티드와 상동한 아미노산 서열을 갖는 인자 D 분자의 구조이성질체 변이체. 인간 인자 D용 UniProt 수탁 번호는 P00746이다. 더욱 고등 영장류 및 비-인간 포유동물을 포함하는, 비-인간 동물의 인자 D 폴리펩타이드는 상기 정의 내에 특이적으로 포함된다.
"인자 D 변이체"는 천연 서열 인자 D 폴리펩타이드, 예컨대 천연 서열 인간 인자 D 폴리펩타이드에 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 활성 인자 D 폴리펩타이드를 의미한다 (예컨대, NM_001928, 서열 번호: 126). 통상적으로, 인자 D는 하기와 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다: 성숙 인간 아미노산 서열 (예컨대, NM_001928, 서열 번호: 126).
용어 "인자 D 결합 길항제"는 가장 넓은 의미에서 사용되고, 인자 D 생물학적 활성을 중화, 차단, 부분적으로 또는 완전히 억제, 무효화, 감소 또는 방해할 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 인자 D 결합 길항제는, 인자 D에 결합하고 인자 D 활성, 예컨대 보체-관련 눈 병태의 병리학에 참여하는 인자 D의 능력을 중화, 차단, 부분적으로 또는 완전히 억제, 무효화, 감소 또는 방해할 수 있는, 항-인자 D 항체, 및 이들의 항체 변이체, 이들의 항원-결합 단편, 다른 결합 폴리펩타이드, 펩타이드, 및 비-펩타이드 작은 분자를, 제한 없이, 포함한다.
본원에 사용된 용어 "VEGF 길항제"는, 비제한적으로, 하나 이상의 VEGF 수용체에 결합하는 VEGF, VEGF 신호전달, 및 VEGF 매개된 혈관신생 및 내피 세포 생존 또는 증식을 포함하여, VEGF에 결합할 수 있고, VEGF 발현 수준을 감소하거나 또는 VEGF 생물학적 활성을 중화, 차단, 억제, 소거, 감소 또는 방해하는 분자를 지칭한다. 예를 들면, VEGF 생물학적 활성을 중화, 차단, 억제, 소거, 감소 또는 방해하는 분자는 하나 이상의 VEGF 수용체 (VEGFR) (예를 들면, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, 막-결합 VEGF 수용체 (mbVEGFR), 또는 가용성 VEGF 수용체 (sVEGFR))에 결합함에 의해 그것의 효과를 발휘할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 VEGF 길항제로서 포함되는 것은, VEGF에 특이적으로 결합하여 하나 이상의 수용체, 융합 단백질(예컨대, VEGF-트랩(Trap)(리제네론(Regeneron)) 및 VEGF121-겔로닌(gelonin)(페레그린(Peregrine))과의 결합을 격리시키는 VEGF, 항-VEGF 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드이다. VEGF 길항제는 또한 VEGF 폴리펩티드의 길항제 변이체, VEGF 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 핵산 분자의 단편에 상보적인 안티센스 핵염기 올리고머; VEGF 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 핵산 분자의 단편에 상보적인 작은 RNAs; VEGF를 표적하는 리보자임; VEGF에 대한 펩티바디; 및 VEGF 압타머를 포함한다. VEGF 길항제는 또한 VEGFR, 항-VEGFR 항체, 및 항원-결합 그것의 단편에 결합하는 폴리펩티드, 및 VEGFR에 결합하고 그렇게 함으로써 VEGF 생물학적 활성 (예를 들면, VEGF 신호전달)을 차단, 억제, 소거, 감소 또는 방해하는 유도체, 또는 융합 단백질을 포함한다. VEGF 길항제는 또한 VEGF 또는 VEGFR에 결합하고 그리고 VEGF 생물학적 활성을 차단, 억제, 소거, 감소 또는 방해할 수 있는 비펩티드 소분자를 포함한다. 따라서, 용어 "VEGF 활성"은 특이적으로 VEGF의 VEGF 매개된 생물학적 활성을 포함한다. 특정 구현예에서, VEGF 길항제는 VEGF의 발현 수준 또는 생물학적 활성을, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 만큼 감소시키거나 억제한다. 일부 구현예에서, VEGF-특이적 길항제에 의해 억제된 VEGF는 VEGF(8-109), VEGF(1-109) 또는 VEGF165 이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 VEGF 길항제는, 비제한적으로, 항-VEGFR2 항체 및 관련된 분자 (예를 들면, 라무시루맙, 타니비루맙, 아플리베르셉트), 항-VEGFR1 항체 및 관련된 분자 (예를 들면, 이크루쿠맙, 아플리베르셉트 (VEGF 트랩-아이(Trap-Eye); EYLEA®), 및 지브-아플리베르셉트 (VEGF 트랩; ZALTRAP®)), 이중특이적 VEGF 항체 (예를 들면, MP-0250, 바누시주맙 (VEGF-ANG2), 및 US 2001/0236388에 개시된 이중특이적 항체), 항-VEGF, 항-VEGFR1, 및 항-VEGFR2 아암 중 둘의 조합을 포함하는 이중특이적 항체, 항-VEGF 항체 (예를 들면, 베바시주맙, 세바시주맙, 및 라니비주맙), 및 비펩티드 소분자 VEGF 길항제 (예를 들면, 파조파닙, 악시티닙, 반데타닙, 스티바가, 카보잔티닙, 렌바티닙, 닌테다닙, 오란티닙, 텔라티닙, 도비티니그, 세디라닙, 모테사닙, 설파티닙, 아파티닙, 포레티닙, 파미티닙, 및 티보자닙)를 포함할 수 있다.
용어 "항-VEGF 항체" “VEGF에 결합하는 항체” 및 "VEGF에 특이적으로 결합하는 항체"는 상기 항체가 VEGF를 표적으로 할 때 진단 및/또는 치료 제제로서 유용하도록 충분한 친화도로 VEGF와 결합할 수 있는 항체를 가리킨다. 일 구현예에서, 비관련, 비-VEGF 단백질에 대한 항-VEGF 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역검정법(RIA)으로 측정 시, 약 10% 미만의 VEGF에 대한 항체의 결합이다. 특정 구현예에서, VEGF에 결합하는 항체는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM (예컨대, 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-VEGF 항체는 상이한 종으로부터의 VEGF 중에서 보존된 VEGF의 에피토프에 결합한다.
특정 구현예에서, 항-VEGF 항체는 질병 또는 질환을 표적으로 삼을 때 및 방해할 때 치료제로서 사용될 수 있되, VEGF 활성이 수반된다. 또한 상기 항체는 예컨대, 치료로서 효과성을 평가하기 위해 기타 생물학적 활성 분석을 받을 수 있다. 이와 같은 분석은 당해기술에 알려져 있고 표적 항원 및 상기 항체에 대한 의도된 사용에 의존한다. 예에는 HUVEC 억제 분석; 종양 세포 성장 억제 분석(예를 들어 WO 89/06692에 기술된 바와 같음); 항체-의존 세포 세포독성(ADCC) 및 보완-매개 세포독성(CDC) 분석(미국 특허 번호 5,500,362); 및 길항(agonistic) 활성 또는 조혈 분석(WO 95/27062 참조). 항-VEGF 항체는 일반적으로 다른 VEGF 상동체, 예컨대 VEGF-B 또는 VEGF-C, 또는 기타 다른 성장 인자, 예컨대 PIGF, PDGF 또는 bFGF와 결합하지 않는다. 일 구현예에서, 항-VEGF 항체는 혼성세포(hybridoma) ATCC HB 10709에 의해 생산된 단클론성 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 항원결정부에 결합하는 단클론성 항체이다. 또 다른 구현예에서, 항-VEGF 항체는 하기에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 단클론성 항체이다: (1997) Cancer Res. 57:4593-4599 (베바시주맙 (BV; AVASTIN®)으로도 공지된 항체를 비제한적으로 포함).
항-VEGF 항체 “라니비주맙” (또한 “Lucentis®” 또는 “rhuFab V2”로서 공지됨)은 인간화되고, 친화도-성숙된 항-인간 VEGF Fab 단편이다. 라니바이주맙은 에스케리치아 콜리 발현 벡터 및 박테리아 발효에서의 표준 재조합 기술 방법으로 생성된다. 라니바이주맙은 당화되지 않으며 ~48,000 달톤의 분자량을 갖는다. 참고: WO 98/45331 및 US 2003/0190317. 추가의 바람직한 항체는 하기에 기재된 바와 같은 G6 또는 B20 시리즈 항체 (예를 들면, G6-31, B20-4.1)를 포함한다: PCT 출원 공보 번호 WO 2005/012359 및 WO 2005/044853 (이의 전문이 각각 본원에 참고로 포함됨). 추가 바람직한 항체에 대하여, 하기를 참고한다: 미국 특허 7,060,269, 6,582,959, 6,703,020; 6,054,297; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; 미국 특허 출원 공보 번호 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409, 및 20050112126; 및 Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004). 기타 바람직한 항체는 잔기 F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, E103, 및 C104를 포함하거나, 대안적으로 잔기 F17, Y21, Q22, Y25, D63, 183 및 Q89를 포함하는 인간 VEGF 상에서 기능적 에피토프에 결합하는 것들을 포함한다. 추가의 항-VEGF 항체는 PCT 출원 공개 번호 WO 2009/155724에 기재된 항-VEGF 항체를 포함한다.
용어 "IL-6 결합 길항제"는, IL-6 의, 이의 결합 상대 예컨대 인터류킨-6 수용체 (IL-6R) (또한 CD126으로 지칭됨) 및/또는 gp130 (또한 CD130으로 지칭됨) 중 하나 이상과의 상호작용으로부터 유발된 신호 형질도입을 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 억제하는 분자를 지칭한다. 예시적 IL-6 결합 길항제는, 예를 들어, (항-IL-6 항체, 예를 들면, EBI-031 (Eleven Biotherapeutics)을 포함하는) 항-IL-6 길항제 및 (항-IL-6R 항체, 예를 들면, 토실리주맙 (ACTEMRA®)를 포함하는 항-IL-6R 길항제를 포함한다. “소분자”는 약 600 미만의, 바람직하게는 약 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것으로 정의된다.
“장애”는 항체로의 치료에 의하여 이점을 제공받을 임의의 병태이다. 여기에는 포유동물이 문제 장애를 갖기 쉽게 만드는 병리적 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다. 본 명세서에서 치료받는 장애의 비-제한적인 예는 HtrA1-관련 장애, 안구 장애, 및/또는 보체-관련 장애를 포함한다.
용어 "HtrA1-관련 장애"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 가장 넓은 의미로 비정상 HtrA1 발현 또는 활성과 관련된 임의의 장애 또는 병태를 지칭한다. 일부 구현예에서, HtrA1-연관된 장애는 체내에서 HtrA1의 국부 (예컨대, 안구 내에서) 및/또는 전신성 수준 또는 활성으로 인해 비정형 증상이 나타날 수 있는 과잉의 HtrA1 수준 또는 활성과 관련된 질환을 의미한다. 예시적 HtrA1-연관된 장애는 하기를 포함한다: 예를 들어, 노화관련 황반 퇴화 (AMD) (습식 (삼출성) AMD (초기, 중간, 및 진행성 습식 AMD 포함) 및 건식 (비삼출성) AMD (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예컨대, 지도상항위축 (GA) 포함) 포함함)를 비제한적으로 포함하는 HtrA1-연관된 안구 장애.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “안구 장애”는 비제한적으로 하기를 포함한다: 황반 퇴행성 질환 예컨대 노화관련 황반 퇴화 (AMD) (습식 (삼출성) AMD (초기, 중간, 및 진행성 습식 AMD 포함) 및 건식 (비삼출성) AMD (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예컨대, 지도상항위축 (GA)) 포함) 포함함); 당뇨성 망막병증 (DR) 및 기타 허혈-관련 망막병증; 안구내염; 포도막염; 맥락막 혈관신생 (CNV); 조숙증의 망막병증 (ROP); 결절 맥락막 혈관병증 (PCV); 당뇨성 황반 부종; 병리학적 근시; 폰힙펠 린도우(von Hippel-Lindau) 질환; 눈의 히스토플라스마증; 망막 중심 정맥 폐색 (CRVO); 각막 혈관신생; 및 망막 혈관신생을 포함하는 눈의 장애. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD (예컨대, GA)이다.
용어 "보체-관련 장애"는 가장 넓은 의미로 사용되고 과도한 또는 조절되지 않는 보체 활성화와 관련된 장애를 포함한다. 이들은 심폐 우회 수술 동안 보체 활성화; 급성 심근경색증, 동맥류, 뇌졸중, 출혈성 쇼크, 압좌 손상, 다발성 장기 부전, 혈액상실 쇼크, 장 허혈, 또는 다른 사건 유발 허혈 이후 허혈-재관류로 인한 보체 활성화를 포함한다. 보체 활성화는 또한 염증성 병태 예컨대 중증 화상, 내독소혈증, 패혈성 쇼크, 성인 호흡 곤란 증후군, 혈액투석; 과민성 쇼크, 중증 천식, 맥관부종, 크론병, 겸상 세포 빈혈, 연쇄상구균감염후 사구체신염, 및 췌장염과 관련되는 것으로 나타났다. 장애는 부정적인 약물 반응, 약물 알러지, IL-2 유도된 혈관 누출 증후군, 또는 방사선 사진 콘트라스트 배지 알러지의 결과일 수 있다. 또한 자가면역 질환 예컨대 전신 홍반성 낭창, 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 알츠하이머병, 및 다발성 경화증을 포함한다. 보체 활성화는 이식 거부와 또한 관련된다. 보체 활성화는 안구 장애, 예컨대 보체-관련 안구 장애와 또한 관련된다.
용어 "보체-관련 안구 장애"는 가장 넓은 의미에서 사용되고 고전적 및 대체 경로, 및 특히 보체의 대체 경로를 포함하는, 보체를 연루시키는 병리학의 모든 눈 병태를 포함한다. 보체-관련 안구 장애는, 제한 없이, 황반 퇴행성 질환, 예컨대 연령 관련 황반 변성 (AMD), 맥락막 신생혈관형성 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 및 다른 허혈-관련된 망막증, 내안구염, 포도막염, 및 다른 안구내 신생혈관 질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, 중심 망막 정맥 폐색 (CRVO), 각막 신생혈관형성, 및 망막 신생혈관형성의 모든 단계를 포함한다. 일 예시에서, AMD는 하기를 포함한다: 습식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 습식 AMD 포함) 및 건식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예컨대, 지도상항위축 (GA) 포함). 추가 예에서, 건조 (비삼출성) AMD는 경질 결정강, 연질 결정강, 지도형 위축증, 및/또는 안료 군집의 존재를 포함할 수 있다. 초기 AMD는, 예를 들어, 다중의, 소형 내지 하나 이상의 비-확장성 배지 크기의 드루젠(drusen)을 포함할 수 있다. 중간 AMD는, 예를 들어, 광범위한 배지 결정강 내지 1종 이상의 큰 결정강을 포함할 수 있다. 참고: 예컨대, Ferris et al., AREDS Report No. 18; Sallo et al., Eye Res, 34(3):238-40,2009; Jager et al., New Engl . J. Med ., 359(1):1735, 2008. 추가 예에서, 중간 건식 AMD는 큰 융합성 결정강을 포함할 수 있다. 추가 예에서, 지도형 위축증은 광수용체 및/또는 망막 색소 상피성 (RPE) 손실을 포함할 수 있다. 추가 예에서, 지도형 위축증의 면적은 작거나 클 수 있고/있거나 황반 면적에서 또는 주변 망막에서 일 수 있다. 하나의 예에서, 보체-관련 안구 장애는 중간 건식 AMD이다. 하나의 예에서, 보체-관련 안구 장애는 지도형 위축증이다. 일 예시에서, 보체-연관된 안구 장애는 습식 AMD (예컨대, 맥락막 혈관신생 (CNV))이다.
상기 리스트는 모두를 포함하지 않으며, 질환 또는 장애가 다양한 카테고리 내에 해당할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, AMD는 일부 경우에서 HtrA1-관련 장애, 안구 장애, 및 보체-관련 장애로서 분류될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "투여"란 화합물(예를 들면, 본 발명의 항-HtrA1 항체, 본 발명의 항-HtrA1 항체를 암호화하는 핵산) 또는 조성물(예를 들면, 약제학적 조성물, 예를 들면, 본 발명의 항-HtrA1 항체를 포함하는 약제학적 조성물)의 투여량을 대상체에 제공하는 방법을 의미한다. 본 명세서에서 기재된 방법에서 이용된 조성물은, 예를 들어, 초자체내로 (예를 들면, 초자체내 주사에 의해), 안구로 (예를 들면, 안구 주사에 의해), 안구내로 (예를 들면, 안구내 주사에 의해), 공막주변으로 (예를 들면, 공막주변 주사에 의해), 테논낭하로 (예를 들면, 테논낭하 주사에 의해), 상맥락막으로 (예를 들면, 상맥락막 주사에 의해), 국소적으로 (예를 들면, 점안제에 의해), 근육내로, 정맥내로, 진피내로, 경피로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 늑막내로, 기관내로, 척추강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 종양내로, 복막으로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 안와내로, 경구로, 경피로, 흡입으로, 주사로, 이식에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 직접적으로 국재화된 관류 수영 표적 세포에 의해, 카테터에 의해, 세척에 의해, 크림으로, 또는 지질 조성물로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 방법에서 이용된 조성물은 또한 전신으로 또는 국소로 투여될 수 있다. 투여 방법은 다양한 인자 (예를 들면, 투여될 화합물 또는 조성물 및 치료될 병태, 질환, 또는 장애의 중증도)에 따라 가변될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 항체 (예를 들면, 항-HtrA1 항체, 항-인자 D 항체, 및 항-HtrA1/항-인자 D 항체)는 초자체내 주사에 의해 투여된다.
하나 이상의 추가 치료제와 "병용된" 투여는 임의의 순서로 동시(병행) 및 연속적인 투여를 포함한다.
용어 "지속성 전달", "지속-방출", 및 "조절 방출"은 치료제 (예를 들면, 본 발명의 항체)의 장기적인 또는 연장 방출 또는 생체이용률을 달성하기 위해 제형, 복용 형태, 디바이스, 또는 다른 유형의 기술을 이용하여 전달 기전을 기재하는데 일반적으로 사용된다. 일반적인 체순환 또는 대상체에 또는 (비제한적으로) 세포, 조직, 기관, 관절, 영역, 및 동종을 포함하는 대상체에서 국부 작용 부위에 약물의 장기적인 또는 연장 방출 또는 생체이용률을 제공하는 기술을 지칭할 수 있다. 더욱이, 이들 용어들은 제형 또는 복용 형태로부터 약물의 방출을 장기화 또는 연장하기 위해 사용되는 기술을 지칭할 수 있거나 이들은 대상체에 약물의 생체이용률 또는 약동학 또는 작용의 지속기간을 연장 또는 장기화하기 위해 사용된 기술을 지칭할 수 있거나 이들은 제형에 의해 유발된 약동학적 효과를 연장 또는 장기화하기 위해 사용되는 기술을 지칭할 수 있다.
“지속성 제형”, “지속 방출 제형”, 또는 “제어 방출 제형”은 약제학적 제형, 복용 형태, 또는 지속성 전달을 제공하기 위해 사용되는 다른 기술이다. 일 양태에서, 조절 방출은 치료제의 국부 생체이용률, 특이적으로 안구 전달의 문맥에서 안구 체류 시간을 개선하는데 사용된다. "증가된 안구 체류 시간"은 전달된 안구 약물이 품질 (예를 들면, 활성)에 관하여 및 양 (예를 들면, 유효량)에 관하여 양쪽에서 효과적으로 남아있는 동안 전달후 기간을 지칭한다. 고용량 및 조절 방출 이외에 또는 대신에, 약물은 증가된 생체내 반감기를 달성하기 위해 번역후로, 예컨대 PEG화를 통해 변형될 수 있다.
제제, 예를 들면, 약제학적 제형의 "유효량"은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 시간의 기간동안 효과적인 양을 지칭한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물에는 가축 (가령, 소, 양, 고양이, 개, 그리고 말), 영장류 (가령, 인간과 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (가령, 생쥐와 쥐)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다. “대상체”는 “환자”일 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료학적 제품의 상업 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하기 위해 사용되고 이는 상기 치료학적 제품의 사용에 관한 지적사항, 용도, 투여량, 투여, 병용 요법, 사용금지 사항 및/또는 경고에 관한 정보를 함유한다.
“약제학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에 무독성인, 활성 성분 이외의, 약제학적 제제 중의 성분을 나타낸다. 약제학적으로 허용가능한 담체에는 비제한적으로, 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제가 포함된다.
용어 "약제학적 제제"는 그안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하기 위한 형태인, 그리고 제제가 투여되는 대상체에 허용불가능하게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "치료"(및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 이의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적인 과정을 변경하려는 임상적 중재술을 나타내며, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환 또는 장애의 발병 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환 또는 장애의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질환 진행 속도의 감소, 질환 또는 장애 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 발병을 지연시키거나 또는 질환 또는 장애의 진행을 느리게 하는데 사용된다. 일부 예시에서, 상기 장애는 HtrA1-연관된 장애, 안구 장애, 및/또는 보체-연관된 장애, 예를 들어, AMD (예컨대, GA)이다.
"단리된" 핵산 분자는, 본래 핵산의 천연 공급원과 관계된 적어도 하나의 오염물질 핵산 분자로부터 동정 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 설정 이외의 것이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 이것이 천연 세포 내에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나 단리된 핵산 분자에는, 예를 들면 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 있는, 항체를 대개 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자가 포함된다.
표현 "조절 서열"은 특정한 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 나타낸다. 원핵 세포에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 이것이 또 하나의 핵산 서열과 기능적 관계로 놓이는 경우, "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 전구서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 암호 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 촉진시키도록 위치할 경우에 암호 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 분비 리더의 경우에는 인접하고, 리딩 단계에서 인접하다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위 에서의 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 관례에 따라 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은, 표현 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고 모든 상기 지정은 후손을 포함한다. 따라서, 단어 "변형체" 및 "변형된 세포"는 전달 수와 관련 없이 주요 대상체 세포 및 그들로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 후손이 의도하거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해 DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 본래 변형된 세포에서 선별된 바와 같은 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 뚜렷이 다른 지정이 의도되는 경우, 맥락에서 명확해질 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "라이브러리"는 복수의 항체 또는 항체 단편 서열 (예를 들면, 본 발명의 항-HtrA1 항체), 또는 이들 서열을 암호화하는 핵산을 지칭하고, 상기 서열은, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 이들 서열에 도입되는 변이체 아미노산의 조합에서 상이하다.
"돌연변이"는 참조 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 야생형 서열에 비해 뉴클레오타이드(들)의 결실, 삽입, 또는 치환이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "코돈 세트"는 요망된 변이체 아미노산을 암호화하는 사용된 일련의 상이한 뉴클레오타이드 삼중항 서열을 지칭한다. 일련의 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 코돈 세트에 의해 제공된 뉴클레오타이드 삼중항의 모든 가능한 조합을 나타내는 그리고 아미노산의 요망된 그룹을 암호화할 서열을 포함하는, 고상 합성에 의해 합성될 수 있다. 코돈 지정의 표준 양식은, 당해 기술에 공지되어 있는, IUB 코드의 것이다. 코돈 세트는 전형적으로 이탤릭체로 3 대문자, 예를 들면, NNK , NNS , XYZ, DVK 및 동종에 의해 표시된다. 특정 위치에서 선택된 뉴클레오타이드 "축퇴"로 올리고뉴클레오타이드의 합성은 그 종래 기술, 예를 들어 트림(TRIM) 접근법에서 공지된 웰이다 (Knappek et al., J. Mol . Biol . 296:57-86, 1999; Garrard et al., Gene 128:103, 1993). 특정 코돈 세트를 갖는 올리고뉴클레오타이드의 상기 세트는 (예를 들어, Applied Biosystems, Foster City, CA로부터 이용가능한) 상업적 핵산 합성기를 이용하여 합성될 수 있거나, 상업적으로 (예를 들어, Life Technologies, Rockville, MD로부터) 수득될 수 있다. 따라서, 특정한 코돈 세트를 갖는 합성된 일련의 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 상이한 서열, 전반적인 서열 이내 코돈 세트에 의해 확립된 차이를 가진 복수의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 올리고뉴클레오타이드는, 본 발명에 따라 사용된 바와 같이, 가변 도메인 핵산 템플레이트에 하이브리드화를 허용하는 서열을 갖고 또한, 예를 들어, 클로닝 목적에 유용한 제한 효소 부위를 포함할 수 있지만, 필연적으로 포함하지 않는다.
"파아지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드가 파아지, 예를 들면, 섬유상 파아지인 입자의 표면 상의 코트 단백질 중 적어도 일부에 대한 융합 단백질로서 표시되는 기술이다. 파아지 디스플레이의 일 유용성은 무작위적 단백질 변이체의 큰 라이브러리가 표적 항원에 높은 친화도로 결합하는 이들 서열에 대해 신속하고 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 있다. 파아지 상에 펩티드 및 단백질 라이브러리의 디스플레이는 특이적 결합 특성을 가진 것에 대한 수백만의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되었다. 다가 파아지 디스플레이 방법은 섬유상 파아지의 어느 한쪽 유전자 III 또는 유전자 VIII에 융합을 통해 작은 랜덤 펩타이드 및 작은 단백질 디스플레이에 사용되어 왔다. 참고: 예컨대, Wells et al., Curr . Opin . Struct. Biol ., 3:355-362, 1992 및 상기 내에 인용된 참조문헌. 1가 파아지 디스플레이에서, 단백질 또는 펩타이드 라이브러리는 유전자 III 또는 이들의 부분에 융합되고, 야생형 유전자 III 단백질의 존재하에 낮은 수준에서 발현되어 파아지 입자가 융합 단백질 중 하나의 카피를 디스플레이하거나 어느 것도 디스플레이하지 않는다. 결합능 효과는 다가 파아지에 비해 감소하여 분류가 고유 리간드 친화도에 기초되며, 그리고 파아지미드 벡터가 사용되어, DNA 가공을 간소화한다. 참고: 예컨대, Lowman et al., Methods : A companion to Methods in Enzymology, 3:205-216, 1991.
개시 또는 참조 폴리펩타이드 (예를 들면, 참조 항체 또는 이의 가변 도메인(들)/HVR(들))의 "변이체" 또는 "돌연변이체"는 (1) 개시 또는 참조 폴리펩타이드의 것과 상이한 아미노산 서열을 갖는 그리고 (2) 어느 한쪽 천연 또는 인공 (사람이 만든) 돌연변이유발을 통해 개시 또는 참조 폴리펩타이드로부터 유래된 폴리펩타이드이다. 상기 변이체는, 예를 들어, 본 명세서에서 "아미노산 잔기 변경"으로서 지칭된, 관심 폴리펩타이드의 아미노산 서열 이내 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 따라서, 변이체 HVR은 개시 또는 참조 폴리펩타이드 서열 (예컨대 공급원 항체 또는 항원 결합 단편의 것)에 대해 변이체 서열을 포함하는 HVR을 지칭한다. 아미노산 잔기 변경은, 상기 맥락에서, 개시 또는 참조 폴리펩타이드 서열 (예컨대 참조 항체 또는 이들의 단편의 것)에서 대응하는 위치에 아미노산과 상이한 아미노산을 지칭한다. 최종 변이체 또는 돌연변이체 작제물에 도달하도록 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있으며, 단, 최종 작제물은 목적 기능적 특징을 가져야 한다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같은 폴리펩티드의 번역 후 과정을 변화시킬 수 있다.
"야생형 (WT)" 또는 "참조" 서열 또는 "야생형" 또는 "참조" 단백질/폴리펩타이드, 예컨대 참조 항체의 HVR 또는 가변 도메인은 변이체 폴리펩타이드가 돌연변이의 도입을 통해 유래되는 참조 서열일 수 있다. 일반적으로, 제공된 단백질용 "야생형" 서열은 자연에서 가장 흔한 서열이다. 유사하게, "야생형" 유전자 서열은 자연에서 가장 흔하게 발견되는 그 유전자용 서열이다. 돌연변이는 "야생형" 유전자 (및 따라서 암호화하는 단백질)에 어느 한쪽 자연적 과정을 통해 또는 인간-유도된 수단을 통해 도입될 수 있다. 상기 공정의 생성물은 최초 "야생형" 단백질 또는 유전자의 "변이체" 또는 "돌연변이체" 형태이다.
"참조 항체"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 명세서에서 기재된 기준에 따른 다양성이 수행되는 경우 항원-결합 서열이 템플레이트 서열로서 작용하는 항체 또는 이들의 단편을 지칭한다. 항원-결합 서열은 일반적으로 항체 가변 영역, 바람직하게는 적어도 1종의 HVR을 포함하고, 바람직하게는 프레임워크 영역을 포함한다.
"풍부한"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 독립체 (예를 들면, 아미노산 잔기 변경)이 대응하는 참조 라이브러리 (예를 들면, 미분류된 라이브러리, 또는 상이한 또는 비-관련 항원으로 분류된 라이브러리)에 비교된 경우 분류된 라이브러리에서 더 높은 빈도로 존재하는 것을 의미한다. 대조적으로, "고갈된"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 독립체 (예를 들면, 아미노산 잔기 변경)이 대응하는 참조 라이브러리 (예를 들면, 미분류된 라이브러리, 또는 상이한 또는 비-관련 항원으로 분류된 라이브러리)에 비교된 경우 분류된 라이브러리에서 더 낮은 빈도로 존재하는 것을 의미한다. 용어 “중성”은, 아미노산 잔기 변이체를 식별하는 방법에 대해 언급하는데 사용되는 경우, 단위체가 농축되거나 고갈되지 않았다는 것을, 즉, 상응하는 참조 라이브러리 (예컨대, 비분류된 라이브러리, 또는 상이하거나 비-관련 항원에 대해 분류된 라이브러리)와 비교하여, 분류된 라이브러리 중 대략적으로 상동한 빈도로 존재한다는 것을 의미한다.
"등전점 (pI)"은 분자 (예를 들면, 단백질, 예컨대 항체)가 순 전하를 운반하지 않는 pH를 의미하고, 또한 당해 분야에서 "pH(I)" 또는 "IEP"로서 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
본 발명은 HtrA1에 결합하는 신규한 항체, 및 예를 들어, 치료적 및 진단적 용도를 위하여 상기를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는, 예를 들면, 연령 관련 황반 변성 (예를 들면, 지도형 위축증)을 포함하는, HtrA1-관련 장애, 안구 장애, 및/또는 보체-관련 장애를 포함하는, 다양한 장애의 진단 또는 치료에 유용하다.
A.예시적인 항- HtrA1 항체
일 양태에서, 본 발명은, 부분적으로, HtrA1에 특이적으로 결합하는 항체에 기반된다. 본 발명의 항체는, 예를 들면, 연령 관련 황반 변성 (예를 들면, 지도형 위축증)을 포함하는, HtrA1-관련 장애, 안구 장애, 및/또는 보체-관련 장애를 포함하는, 장애의 치료 또는 진단에 유용하다.
본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 일부 경우에서, HtrA1은 인간 HtrA1 (huHtrA1)이다. 기타 경우에서, HtrA1은 뮤린 HtrA1 (muHtrA1)이다. 특정한 경우에서, 본 발명의 항-HtrA1 항체는 100 nM 이하 (예를 들면, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2.5 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 10 pM 이하, 1 pM 이하, 또는 0.1 pM 이하)의 KD로 huHtrA1을 특이적으로 결합시킨다. 예를 들어, 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 1 nM 이하 (예컨대, 1 nM 이하, 900 pM 이하, 800 pM 이하, 700 pM 이하, 600 pM 이하, 550 pM 이하, 500 pM 이하, 400 pM 이하, 300 pM 이하, 200 pM 이하, 150 pM 이하, 125 pM 이하, 100 pM 이하, 75 pM 이하, 50 pM 이하, 25 pM 이하, 또는 1 pM 이하)의 KD로 huHtrA1에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 KD 약 40 pM 내지 약 700 pM (예를 들면, 약 40 pM 내지 약 700 pM, 약 40 pM 내지 약 600 pM, 약 40 pM 내지 약 550 pM, 약 40 pM 내지 약 500 pM, 약 40 pM 내지 약 400 pM, 약 40 pM 내지 약 300 pM, 약 40 pM 내지 약 250 pM, 약 50 pM 내지 약 200 pM, 약 50 pM 내지 약 175 pM, 약 50 pM 내지 약 150 pM, 약 50 pM 내지 약 125 pM, 약 70 pM 내지 약 125 pM, 또는 약 50 pM 내지 약 125 pM)으로 huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 약 110 pM의 KD로 huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 약 60 pM의 KD로 huHtrA1에 결합한다. 임의의 선행 KD 값은, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 예를 들어, BIACORE® 표면 플라스몬 공명을 이용하여 측정된 바와 같이, huHtrA1 (huHtrA1-PD)의 프로테아제 도메인 (PD)에 본 발명의 항-HtrA1 항체 (예를 들면, 본 발명의 항-HtrA1 항체의 Fab)의 결합 친화성을 나타낼 수 있다.
일부 경우에서, 본 발명의 항-HtrA1 항체는 HtrA1의 활성을 억제시킬 수 있다. 일부 경우에서, 항체는 10 nM 이하 (예컨대, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 1.5 nM 이하, 1 nM 이하, 900 pM 이하, 800 pM 이하, 700 pM 이하, 600 pM 이하, 500 pM 이하, 400 pM 이하, 300 pM 이하, 200 pM 이하, 100 pM 이하, 50 pM 이하, 또는 1 pM 이하)의 50% 억제성 농도 (IC50)로 huHtrA1-PD의 프로테아제 도메인의 활성을 억제한다. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기의 IC50으로 huHtrA1-PD의 활성을 억제한다: 약 0.25 nM 내지 약 1 nM (예컨대, 약 0.25 nM 내지 약 1 nM, 약 0.25 nM 내지 약 0.9 nM, 약 0.25 nM 내지 약 0.8 nM, 약 0.25 nM 내지 약 0.7 nM, 약 0.25 nM 내지 약 0.6 nM, 약 0.25 nM 내지 약 0.5 nM, 또는 약 0.25 nM 내지 약 0.4 nM). 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 약 0.3 nM의 IC50으로 huHtrA1-PD의 활성을 억제시킨다. 임의의 선행 사례에서, 억제성 활성은 시험관내 FRET-기반 차단 검정 측정일 수 있다. 일부 경우에서, 시험관내 FRET-기반 차단 검정은 H2-Opt 프로브의 절단을 포함한다 (예를 들면, (Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK (서열 번호: 152). 임의의 선행 사례에서, IC50 값은 huHtrA1-PD 활성을 억제시키기 위해 2가 포멧 (예를 들면, IgG 포멧)으로 항-HtrA1의 능력에 기반될 수 있다.
본 발명은 또한 HtrA1 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 포괄하며, 여기서 상기 HtrA1 에피토프는 Arg190, Leu192, Pro193, Phe194, 및 Arg197로 이루어진 군으로부터 선택된 HtrA1 단백질의 적어도 하나의 아미노산을 포함하며, 상기 아미노산 넘버링은 인간 HtrA1 전구체 단백질에 대한 넘버링을 지칭한다. 하나의 구현예에서, 인간 HtrA1 전구체 단백질은 서열 번호: 121의 서열을 갖는다. 일 구현예에서, HtrA1 에피토프는 Leu192, Pro193, 및 Arg197로 이루어진 군으로부터 선택된 HtrA1 단백질의 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, HtrA1 에피토프는 Leu192, Pro193, 및 Arg197로 이루어진 군으로부터 선택된 HtrA1 단백질의 적어도 2개의 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, HtrA1 에피토프는 HtrA1 아미노산 Leu192, Pro193, 및 Arg197을 포함한다. 또 다른 구현예에서, HtrA1 에피토프는 HtrA1 아미노산 Arg190, Leu192, Pro193, 및 Arg197을 포함한다. 추가 구현예에서, HtrA1 에피토프는 HtrA1 아미노산 Arg190, Leu192, Pro193, Phe194, 및 Arg197을 포함한다.
일부 구현예에서, HtrA1에 결합된 경우 항-HtrA1 항체는 1종 이상의 아미노산 Arg190, Leu192, Pro193, Phe194, 및 Arg197로부터 4 옹스트롬 이하로 배치된다. 일부 구현예에서, 항체와 1종 이상의 아미노산 사이 거리는, 예를 들어 실시예에 기재된 결정학 방법을 이용하여, 결정학에 의해 결정된다.
일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 초가변 영역 (HVRs)를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEX1H (서열 번호: 1) (여기서 X1 은 Met 또는 Leu임); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETX2GAAYNQKFKG (서열 번호: 2) (여기서 X2 은 Glu 또는 Asp임); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVX3FIH (서열 번호: 4) (여기서 X3 은 Glu 또는 Asn임); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSX4LAS (서열 번호: 5) (여기서 X4 는 Asn, His 또는 Glu임); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWX5SX6PWT (서열 번호: 6) (여기서 X5 는 Ser 또는 Tyr이며, 그리고 X6 은 Ala 또는 Asn임) 또는 하기 중 임의의 것과 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합: 서열 번호: 1-6.
예를 들어, 항-HtrA1 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEMH (서열 번호: 7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETEGAAYNQKFKG (서열 번호: 8); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVEFIH (서열 번호: 9); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSNLAS (서열 번호: 10); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWSSAPWT (서열 번호: 11), 또는 하기와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합: 서열 번호: 3 또는 7-11.
일부 경우에서, 선행 항-HtrA1 항체 중 임의의 것은 하기 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크 영역 (FR) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX1FX2 (서열 번호: 12) (여기서 X1 은 Lys 또는 Thr이고, 그리고 X2 는 Thr, Lys, 또는 Arg임); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGQGLEWIG (서열 번호: 13); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR (서열 번호: 14); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열 번호: 15).
일부 경우에서, 선행 항-HtrA1 항체 중 임의의 것은 하기 경쇄 가변 도메인 (VL) FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 번호: 17); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKAPKPLIS (서열 번호: 18); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 번호: 19); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열 번호: 20).
예를 들어, 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기 6개 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEMH (서열 번호: 7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETEGAAYNQKFKG (서열 번호: 8); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVEFIH (서열 번호: 9); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSNLAS (서열 번호: 10); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWSSAPWT (서열 번호: 11). 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기 4개 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFT (서열 번호: 16); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGQGLEWIG (서열 번호: 13); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR (서열 번호: 14); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열 번호: 15). 추가 예시에서, 항-HtrA1 항체는 하기 4개 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 번호: 17); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKAPKPLIS (서열 번호: 18); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 번호: 19); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열 번호: 20). 일부 예시에서, 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 21 및 (b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 APEG.LC3.HC3이다.
또 다른 예시에서, 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기 6개 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEMH (서열 번호: 7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETDGAAYNQKFKG (서열 번호: 123); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVNFIH (서열 번호: 124); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSNLAS (서열 번호: 10); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWSSAPWT (서열 번호: 125). 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기 4개 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFT (서열 번호: 25); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVKQTPVHGLEWIG (서열 번호: 26); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: KATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTR (서열 번호: 27); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTSVTVSS (서열 번호: 28). 추가 예시에서, 항-HtrA1 항체는 하기 4개 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC (서열 번호: 29); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGQPPKLLIY (서열 번호: 30); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC (서열 번호: 31); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGGGTKLEIK (서열 번호: 32). 일부 예시에서, 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 (또한 m15H6으로서 지칭된) 15H6이다.
또 다른 예시에서, 항-HtrA1 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: SYIMS (서열 번호: 39); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: YISNGGGTTYYSDTIKG (서열 번호: 40); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: QNFRSDGSSMDY (서열 번호: 41); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASESVDSYGKSFMH (서열 번호: 42); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: LASKLES (서열 번호: 43); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQNNEDPYT (서열 번호: 44), 또는 하기와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합: 서열 번호: 39-44.
일부 경우에서, 선행 항-HtrA1 항체 중 임의의 것은 하기 중쇄 가변 도메인 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (서열 번호: 47), 또는 EVKLVESGGGLVEPGGSLKLACVASGFTFS (서열식별번호: 57); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGKGLEWVA (서열 번호: 48), 또는 WVRQTPEKRLEWVA (서열식별번호: 58); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 번호: 49), 또는 RFTISRDNAKNTLYLQMSTLKSEDTAIYFCAR (서열 번호: 59); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열 번호: 50), 또는 WGQGTAVTVSS (서열 번호: 60).
일부 경우에서, 선행 항-HtrA1 항체 중 임의의 것은 하기 경쇄 가변 도메인 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (서열 번호: 51), 또는 NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC (서열 번호: 61); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGQPPKLLIY (서열 번호: 52), 또는 WYQQKPGQPPKLLIY (서열 번호: 62); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (서열 번호: 53), 또는 GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC (서열 번호: 63); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열 번호: 54), 또는 FGGGTKLEIK (서열 번호: 64).
예를 들어, 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기 6개 HVR을 포함한다: SYIMS (서열 번호: 39); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: YISNGGGTTYYSDTIKG (서열 번호: 40); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: QNFRSDGSSMDY (서열 번호: 41); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASESVDSYGKSFMH (서열 번호: 42); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: LASKLES (서열 번호: 43); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQNNEDPYT (서열 번호: 44). 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기 4개 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (서열 번호: 47); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGKGLEWVA (서열 번호: 48); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 번호: 49); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열 번호: 50). 추가 예시에서, 항-HtrA1 항체는 하기 4개 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (서열 번호: 51); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGQPPKLLIY (서열 번호: 52); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (서열 번호: 53); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열 번호: 54). 일부 예시에서, 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 h19B12.v1이다.
또 다른 예시에서, 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기 6개 HVR을 포함한다: SYIMS (서열 번호: 39); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: YISNGGGTTYYSDTIKG (서열 번호: 40); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: QNFRSDGSSMDY (서열 번호: 41); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASESVDSYGKSFMH (서열 번호: 42); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: LASKLES (서열 번호: 43); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQNNEDPYT (서열 번호: 44). 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기 4개 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVKLVESGGGLVEPGGSLKLACVASGFTFS (서열 번호: 57); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQTPEKRLEWVA (서열 번호: 58); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RFTISRDNAKNTLYLQMSTLKSEDTAIYFCAR (서열 번호: 59); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTAVTVSS (서열 번호: 60). 추가 예시에서, 항-HtrA1 항체는 하기 4개 중쇄 가변 도메인 FR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC (서열 번호: 61); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGQPPKLLIY (서열 번호: 62); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC (서열 번호: 63); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGGGTKLEIK (서열 번호: 64). 일부 예시에서, 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: (a) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 (또한 m19B12으로서 지칭된) 19B12이다.
또 다른 예시에서, 본 발명의 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: 하기의 HVR의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개: 항체 20E2 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 (서열 번호: 66 및 65, 각각), (여기서 (i) HVR-L1 서열은 카밧 아미노산 잔기 24-34를 포함하고, HVR-L2 서열은 카밧 아미노산 잔기 50-56을 포함하며, 그리고 HVR-L3 서열은 카밧 아미노산 잔기 89-97를 포함하며 (서열 번호: 66), 그리고 (ii) HVR-H1 서열은 카밧 아미노산 잔기 31-35를 포함하며, HVR-H2 서열은 카밧 아미노산 잔기 50-65를 포함하며, 그리고 HVR-H3 서열은 아미노산 잔기 95-102를 포함함 (서열 번호: 65), 또는 항체 20E2의 상기 HVR 중 임의의 것과 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기와 적어도 약 90% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖거나, 또는 이의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 65; (b) 하기와 적어도 약 90% 서열 (예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖거나 이의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 66; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
또 다른 예시에서, 본 발명의 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: 하기의 HVR의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개: 항체 3A5 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 (서열 번호: 68 및 67, 각각), (여기서 (i) HVR-L1 서열은 카밧 아미노산 잔기 24-34를 포함하고, HVR-L2 서열은 카밧 아미노산 잔기 50-56을 포함하며, 그리고 HVR-L3 서열은 카밧 아미노산 잔기 89-97를 포함하며 (서열 번호: 68), 그리고 (ii) HVR-H1 서열은 카밧 아미노산 잔기 31-35를 포함하며, HVR-H2 서열은 카밧 아미노산 잔기 50-65를 포함하며, 그리고 HVR-H3 서열은 아미노산 잔기 95-102를 포함함 (서열 번호: 67), 또는 항체 3A5의 상기 HVR 중 임의의 것과 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기와 적어도 약 90% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖거나, 또는 이의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 67; (b) 하기와 적어도 약 90% 서열 (예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖거나 이의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 68; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
또 다른 예시에서, 본 발명의 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: 하기의 HVR의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개: 항체 12A5 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 (서열 번호: 70 및 69, 각각), (여기서 (i) HVR-L1 서열은 카밧 아미노산 잔기 24-34를 포함하고, HVR-L2 서열은 카밧 아미노산 잔기 50-56을 포함하며, 그리고 HVR-L3 서열은 카밧 아미노산 잔기 89-97를 포함하며 (서열 번호: 70), 그리고 (ii) HVR-H1 서열은 카밧 아미노산 잔기 31-35를 포함하며, HVR-H2 서열은 카밧 아미노산 잔기 50-65를 포함하며, 그리고 HVR-H3 서열은 아미노산 잔기 95-102를 포함함 (서열 번호: 69), 또는 항체 12A5의 상기 HVR 중 임의의 것과 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기와 적어도 약 90% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖거나, 또는 이의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 69; (b) 하기와 적어도 약 90% 서열 (예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖거나 이의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 70; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기 중 임의의 것과 적어도 약 90% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖거나, 또는 이의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 21, 23, 76, 77, 78, 93-101, 106, 또는 107; (b) 하기 중 임의의 것과 적어도 약 90% 서열 (예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖거나 이의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 22, 24, 72-74, 81-92, 105, 또는 108; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 예를 들어, 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 105의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 105의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
일부 경우에서, 선행 항-HtrA1 항체 중 임의의 것은 하기 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 (FR) 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX1FX2 (서열 번호: 12) (여기서 X1 은 Lys 또는 Thr이고, 그리고 X2 는 Thr, Lys, 또는 Arg임); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVRQAPGQGLEWIG (서열 번호: 13); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: RATITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCTR (서열 번호: 14); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTLVTVSS (서열 번호: 15). 기타 경우에서, 선행 항-HtrA1 항체 중 임의의 것은 하기 중쇄 가변 도메인 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H1: QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFT (서열 번호: 25); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H2: WVKQTPVHGLEWIG (서열 번호: 26); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3: KATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTR (서열 번호: 27); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H4: WGQGTSVTVSS (서열 번호: 28).
일부 경우에서, 선행 항-HtrA1 항체 중 임의의 것은 하기 경쇄 가변 도메인 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 번호: 17); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGKAPKPLIS (서열 번호: 18); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 번호: 19); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGQGTKVEIK (서열 번호: 20). 기타 경우에서, 선행 항-HtrA1 항체 중 임의의 것은 하기 경쇄 가변 도메인 FR 중 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L1: NIVVTQSPASLAVSLGQRATISC (서열 번호: 29); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L2: WYQQKPGQPPKLLIY (서열 번호: 30); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L3: GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC (서열 번호: 31); 및 (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 FR-L4: FGGGTKLEIK (서열 번호: 32).
일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기 중 임의의 것과 적어도 약 90% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖거나, 또는 이의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 45, 55, 65, 67, 또는 69; (b) 하기 중 임의의 것과 적어도 약 90% 서열 (예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖거나 이의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 46, 56, 66, 68, 또는 70; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 예를 들어, 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
일부 경우에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 21 및 (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열 번호: 22, 예컨대 본원에서 APEG.LC3.HC3로 지칭되는 항체.
일부 경우에서, 본 발명은 HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 45 및 (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열 번호: 46, 예컨대 본원에서 h19B6.v1로 지칭되는 항체.
특정 경우에서, 본 발명은 선행 항체 중 임의의 하나와 상동한 에피토프에 결합하는 항-HtrA1 항체를 제공한다. 일부 경우에서, 본 발명은 HtrA1 로의 결합에 대해 선행 항체 중 임의의 하나와 경쟁하는 항-HtrA1 항체를 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 선행 항-HtrA1 항체 중 임의의 것은 하기 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다: (i) HtrA1에 1 가변 도메인 대 HtrA1 삼량체의 1 하위단위의 비로 결합하는 특성 (예를 들면, Fab는 HtrA1 삼량체에 3 Fab 대 1 HtrA1 삼량체의 비로 결합하고, IgG는 HtrA1 삼량체에 3 IgG 대 2 HtrA1 삼량체의 비로 결합한다), (ii) 2 가변 도메인을 포함하는 항체에 대하여, 미국 특허 출원 공개 US 2013/0129743의 도 9에서 보여진 것과 유사한 "케이지" 형성을 초래하는 방식으로 HtrA1에 결합하는 특성, (iii) HtrA1의 삼량체 형성을 예방하지 않는 특성, (iv) 뮤린 HtrA1과 교차-반응하는 특성; (v) HtrA2, HtrA3 및/또는 HtrA4와 교차-반응하지 않는 특성; (vi) 항-HtrA1 항체 YW505.94.28a와 경쟁적으로 HtrA1에 결합하는 특성 (참고, 예를 들면, WO 2013/055998), (vii) HtrA1과 al-항트립신 (AlAT) 사이 착물 형성을 억제시키는 특성. 일부 구현예에서, 본 발명은 임의의 선행 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
추가의 측면에서, 상기 임의의 구현예에 따른 항-HtrA1 항체는 하기 섹션 C “항체 특성 및 특징부”의 섹션 1-8에 기재된 바와 같이단독으로 또는 조합적으로 임의의 특징을 혼입할 수 있다.
B. 예시적 항-인자 D 항체
본 발명은, 예를 들어, HtrA1-관련 장애, 안구 장애, 및/또는 보체-관련 장애 (예를 들면, AMD (예를 들면, 지도형 위축증))을 포함하는, 장애의 치료 방법에서, 본 발명의 항-HtrA1 항체와 함께 사용될 수 있는 항-인자 D 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 HtrA1 및 인자 D에 특이적으로 결합하는 다중특이적 (예를 들면, 이중특이적) 항체 (예를 들면, 항-HtrA1/항-인자 D 항체)를 제공한다. 임의의 적당한 항-인자 D 항체는 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. 비제한적 예시로서, 본원 및/또는 미국 특허 번호 8,067,002; 8,268,310; 8,273,352; 및/또는 미국 특허 출원 번호 14/700,853에 기술된 임의의 항-인자 D 항체가 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 경우에서, 항-인자 D 항체는, 미국 유형 배양 수집물 (ATCC)로 증착되고, 그리고 HB12476로 지정된 하이브리도마로부터 생산된 단클론성 항체 166-32의 서열, 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서, 항-인자 D 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기의 서열 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 136; (b) 하기의 서열, 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열 번호: 137; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 예를 들어, 일부 경우에서, 항-인자 D 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 136의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 137의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 예컨대 항-인자 D 단클론성 항체 166-32. 일부 경우에서, 항-인자 D 항체는 단클론성 항체 166-32의 인간화된 유도체이다. 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체는 단클론성 항체 166-32와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, 항-인자 D 항체는 단클론성 항체 166-32로부터 유래된 항체 단편이다. 일부 경우에서, 단클론성 항체 166-32로부터 유도된 항체 단편은 Fab, Fab’-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab’)2 단편이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 166-32로부터 유도된 항체 단편은 Fab이다.
일부 경우에서, 단클론성 항체 166-32의 인간화된 유도체는 본 발명의 조성물 및 방법에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법에서, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,067,002에 기재된 단클론성 항체 166-32의 임의의 인간화된 유도체는 사용될 수 있다. 미국 특허 번호 8,067,002에 기재된 단클론성 항체 166-32의 예시적 인간화된 유도체는, 예를 들어, 인간화된 항-인자 D 항체 클론 #111, #56, #250, 및 #416을 포함한다. 인간화된 항-인자 D 항체 클론 #111, #56, #250, 및 #416의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열은, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,067,002의 도 5에서 보여진다. 일부 경우에서, 항-인자 D 항체는 항-인자 D 항체 클론 #111, #56, #250, 또는 #416에 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들면, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열, 또는 상기의 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 변형된, 또는 변이체 인간화된 항-인자 D 항체, 및 이의 단편은 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 예컨대, 미국 특허 번호 8,273,352에서 기술된 인간화 항-인자 D 항체 클론 #111의 임의의 변형된 또는 변이체 버젼은, 본 발명의 조성물 및 방법, 예를 들어, 항체 클론 238 또는 238-1에서 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 항-인자 D 항체는 항-인자 D 항체 클론 238 또는 238-1에 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들면, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열, 또는 상기의 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 항-인자 D 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 HVR을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYAX1DFKG (서열 번호: 110) (여기서 X1 은 Asp 또는 Glu임); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVX1N (서열 번호: 111) (여기서 X1 는 Asn 또는 Ser임); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTX1IX2X3DMN (서열 번호: 112) (여기서 X1 은 Asp 또는 Ser이고, 그리고 X2 는 Asp 또는 Glu이며, 그리고 X3 은 Asp 또는 Ser임); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSX1SLPYT (서열 번호: 114) (여기서 X1 은 Asp 또는 Glu임) 또는 하기 중 임의의 것과 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합: 서열 번호: 109-114. 예를 들어, 일부 경우에서, 항-인자 D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYAX1DFKG (서열 번호: 110) (여기서 X1 은 Asp 또는 Glu임); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVX1N (서열 번호: 111) (여기서 X1 는 Asn 또는 Ser임); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTX1IX2X3DMN (서열 번호: 112) (여기서 X1 은 Asp 또는 Ser이고, 그리고 X2 는 Asp 또는 Glu이며, 그리고 X3 은 Asp 또는 Ser임); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSX1SLPYT (서열 번호: 114), 여기서 X1 은 Asp 또는 Glu이다.
예를 들어, 일부 경우에서, 항-인자 D 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 HVR을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYADDFKG (서열 번호: 115); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVNN (서열 번호: 116); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTDIDDDMN (서열 번호: 117); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSDSLPYT (서열 번호: 118), 또는 하기와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합: 서열 번호: 109, 113, 또는 115-118. 예를 들어, 일부 경우에서, 항-인자 D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYADDFKG (서열 번호: 115); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVNN (서열 번호: 116); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTDIDDDMN (서열 번호: 117); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSDSLPYT (서열 번호: 118).
일부 경우에서, 항-인자 D 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기 중 임의의 것과 적어도 약 90% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖거나, 또는 이의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 119, 131, 또는 132; (b) 하기 중 임의의 것과 적어도 약 90% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖거나 이의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열 번호: 120, 133, 134, 또는 135; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 및 (b)에서와 같은 VL. 예를 들어, 일부 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 120의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 기타 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 131의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 133의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 기타 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 131의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 134의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 기타 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 131의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 135의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 기타 경우에서, 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 132의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 135의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 도 30에서 보여진 임의의 항-인자 D 항체, 또는 이들의 변이체, 또는 이들의 단편은 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다: 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 120의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인. 일부 경우에서, 항-인자 D 항원-결합 항체 단편은 Cas 레지스트리 번호 1278466-20-8를 갖는 람팔리주맙이다.
또 다른 예에서, 일부 경우에서, 항-인자 D 항체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,268,310에 기재된 바와 같이, 20D12 항체이거나 상기로부터 유래된다. 일 예시에서, 항-인자 D 항체는 하기를 포함한다: 하기의 HVR의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개: 항체 20D12 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 (서열 번호: 128 및 127, 각각), (여기서 (i) HVR-L1 서열은 카밧 아미노산 잔기 24-34를 포함하고, HVR-L2 서열은 카밧 아미노산 잔기 50-56을 포함하며, 그리고 HVR-L3 서열은 카밧 아미노산 잔기 89-97를 포함하며 (서열 번호: 128), 그리고 (ii) HVR-H1 서열은 카밧 아미노산 잔기 31-35를 포함하며, HVR-H2 서열은 카밧 아미노산 잔기 50-65를 포함하며, 그리고 HVR-H3 서열은 아미노산 잔기 95-102를 포함함 (서열 번호: 127), 또는 항체 20D12의 상기 HVR 중 임의의 것과 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합.
일부 경우에서, 항-인자 D 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기의 서열 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 127; (b) 하기의 서열, 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열 번호: 128; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 예를 들어, 일부 경우에서, 항-인자 D 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 127 및 서열 번호: 128의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 예컨대 항-인자 D 항체 20D12. 일부 경우에서, 항-인자 D 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열 번호: 129, 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열 번호: 130. 일부 경우에서, 항-인자 D 항체는 단클론성 항체 20D12의 인간화된 유도체이다. 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체는 단클론성 항체 20D12 또는 이의 인간화 유도체와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 경우에서, 항-인자 D 항체는 단클론성 항체 20D12로부터 유도된 항체 단편 또는 이의 인간화 단편이다. 일부 경우에서, 단클론성 항체 20D12 또는 이의 인간화 유도체로부터 유도된 항체 단편은 Fab, Fab’-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab’)2 단편이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체 20D12 또는 이의 인간화 유도체로부터 유도된 항체 단편은 Fab이다.
일부 경우에서, 선행 항-인자 D 항체 (예컨대, 항원-결합 단편) 중 임의의 것의 단편은 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 것이다. 본 발명의 항체 단편은, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, 초가변 영역 (HVR) 단편, 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자, 미니바디, 디아바디, 또는 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체일 수 있다. 추가 구현예에서, 실질적으로 망막 전체를 관통할 수 있는 항-인자 D 항체 단편 (예컨대, 항원-결합 단편)은 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. 또 다른 추가 구현예에서, 망막 전체 두께를 관통할 수 있는 항-인자 D 항체 단편 (예컨대, 항원-결합 단편)은 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다.
일부 경우에서, 본 발명은 인간화된 항-인자 D 항체의 용도를 포함할 수 있고, 여기서 상기 항체의 Fab 단편은 단일 초자체내 주사를 통해 포유동물 눈 (예를 들면, 인간)에 투여 이후 적어도 3, 5, 7, 10, 또는 12 일의 반감기를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간화 항-인자 D 항체의 용도를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 항체의 Fab 단편은, 단일 유리체내 주입을 통한, 포유동물 눈 (예컨대, 인간)으로의 투여 후 적어도 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 또는 115 일 동안 대안적 경로 (AP) 보체 활성화를 억제시킨다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간화 항-인자 D 항체의 용도를 포함할 수 있으며, 여기서 대안적 경로 (AP) 보체 활성화를 억제하는 상기 항체의 Fab 단편의 농도는, 단일 유리체내 주입을 통한, 포유동물 눈 (예컨대, 인간)으로의 투여 후 적어도 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 또는 85 일 동안 망막 조직 내 유지된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간화 항-인자 D 항체의 용도를 포함할 수 있으며, 여기서 대안적 경로 (AP) 보체 활성화를 억제하는 상기 항체의 Fab 단편의 농도는, 단일 유리체내 주입을 통한, 포유동물 눈 (예컨대, 인간)으로의 투여 후 적어도 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 또는 115 일 동안 유리액 내 유지된다. 하나의 예에서, 본 발명은 상기 항-인자 D 항체의 단편 (예를 들면, 항원-결합 단편)의 용도를 포함한다.
일부 경우에서, 선행 항-인자 D 항체 중 임의의 것은 이의 1가 형태로 약 20 nM 이하의 KD로 (예컨대, Fab 단편으로서의 항체의, 인자 D로의 KD로), 인자 D에 결합한다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 항체는 이의 1가 형태로 약 10 nM 이하의 KD로, 인자 D에 결합한다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 항체는 이의 1가 형태로 약 5 nM 이하의 KD로, 인자 D에 결합한다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 항체는 이의 1가 형태로 약 2 nM 이하의 KD로, 인자 D에 결합한다. 예를 들어, 일부 경우에서, 항체는, 이의 1가 형태로, 약 0.5 pM 및 약 2 nM (예컨대, 약 0.5 pM, 약 1 pM, 약 2 pM, 약 3 pM, 약 4 pM, 약 5 pM, 약 6 pM, 약 7 pM, 약 8 pM, 약 9 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 약 25 pM, 약 50 pM, 약 75 pM, 약 100 pM, 약 125 pM, 약 150 pM, 약 175 pM, 약 200 pM, 약 225 pM, 약 250 pM, 약 275 pM, 약 300 pM, 약 325 pM, 약 350 pM, 약 375 pM, 약 400 pM, 약 425 pM, 약 450 pM, 약 475 pM, 약 500 pM, 약 525 pM, 약 550 pM, 약 575 pM, 약 600 pM, 약 625 pM, 약 650 pM, 약 675 pM, 약 700 pM, 약 725 pM, 약 750 pM, 약 775 pM, 약 800 pM, 약 825 pM, 약 850 pM, 약 875 pM, 약 900 pM, 약 925 pM, 약 950 pM, 약 975 pM, 약 1 nM, 약 1.1 nM, 약 1.2 nM, 약 1.3 nM, 약 1.4 nM, 약 1.5 nM, 약 1.6 nM, 약 1.7 nM, 약 1.8 nM, 약 1.9 nM, 또는 약 2 nM)의 KD로 결합 인자 D에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 이의 1가 형태로 약 0.5 pM 내지 약 100 pM의 KD 로 인자 D에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 이의 1가 형태로 약 0.5 pM의 KD 로 인자 D에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 이의 1가 형태로 약 10 pM 미만의 KD 로 인자 D에 결합한다.
일부 경우에서, 선행 항-인자 D 항체 결합 인자 D 중 임의의 것은 이의 2가 형태로 약 10 nM 이하의 KD로 (예컨대, IgG 내지 인자 D로서의 항체의 KD로), 인자 D에 결합한다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 항체는 이의 2가 형태로 약 5 nM 이하의 KD로, 인자 D에 결합한다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 항체는 이의 2가 형태로 약 2 nM 이하의 KD로, 인자 D에 결합한다. 예를 들어, 일부 경우에서, 항체는, 이의 2가 형태로, 약 0.5 pM 및 약 2 nM (예컨대, 약 0.5 pM, 약 1 pM, 약 2 pM, 약 3 pM, 약 4 pM, 약 5 pM, 약 6 pM, 약 7 pM, 약 8 pM, 약 9 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 약 25 pM, 약 50 pM, 약 75 pM, 약 100 pM, 약 125 pM, 약 150 pM, 약 175 pM, 약 200 pM, 약 225 pM, 약 250 pM, 약 275 pM, 약 300 pM, 약 325 pM, 약 350 pM, 약 375 pM, 약 400 pM, 약 425 pM, 약 450 pM, 약 475 pM, 약 500 pM, 약 525 pM, 약 550 pM, 약 575 pM, 약 600 pM, 약 625 pM, 약 650 pM, 약 675 pM, 약 700 pM, 약 725 pM, 약 750 pM, 약 775 pM, 약 800 pM, 약 825 pM, 약 850 pM, 약 875 pM, 약 900 pM, 약 925 pM, 약 950 pM, 약 975 pM, 약 1 nM, 약 1.1 nM, 약 1.2 nM, 약 1.3 nM, 약 1.4 nM, 약 1.5 nM, 약 1.6 nM, 약 1.7 nM, 약 1.8 nM, 약 1.9 nM, 또는 약 2 nM)의 KD로 결합 인자 D에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 이의 2가 형태로 약 0.5 pM 내지 약 100 pM의 KD 로 인자 D에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 이의 2가 형태로 약 0.5 pM의 KD 로 인자 D에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 이의 2가 형태로 약 10 pM 미만의 KD 로 인자 D에 결합한다.
추가의 측면에서, 상기 임의의 구현예에 따른 항-인자 D 항체는 하기 섹션 C “항체 특성 및 특징부”의 섹션 1-8에 기재된 바와 같이단독으로 또는 조합적으로 임의의 특징을 혼입할 수 있다.
C. 항체 특성 및 특징
본 명세서에서 기재된 항체 (예를 들면, 상기 기재된 바와 같이, 항-HtrA1 항체 및 항-인자 D 항체, 뿐만 아니라 아래 기재된 항-HtrA1/항-인자 D 항체), 뿐만 아니라 본 명세서에서 기재된 방법에서 사용을 위하여 임의의 항체는 아래 섹션 1-8에 기재된, 임의의 특징을, 단독으로 또는 조합으로 가질 수 있다.
1. 항체 친화도
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 (예컨대, 항-HtrA1 항체, 항-인자 D 항체, 또는 이중특이적 항-HtrA1 항-인자 D 항체)는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM (예컨대, 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 예를 들어, 일부 경우에서, 본원에 제공된 항체는 약 10 nM 이하의 KD로, 인간 HtrA1 (huHtrA1)에 결합한다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 항체는 약 5 nM 이하의 KD로, huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 항체는 약 2 nM 이하의 KD로, huHtrA1에 결합한다. 예를 들어, 일부 경우에서, 항체는 약 25 pM 및 약 2 nM (예컨대, 약 25 pM, 약 50 pM, 약 75 pM, 약 100 pM, 약 125 pM, 약 150 pM, 약 175 pM, 약 200 pM, 약 225 pM, 약 250 pM, 약 275 pM, 약 300 pM, 약 325 pM, 약 350 pM, 약 375 pM, 약 400 pM, 약 425 pM, 약 450 pM, 약 475 pM, 약 500 pM, 약 525 pM, 약 550 pM, 약 575 pM, 약 600 pM, 약 625 pM, 약 650 pM, 약 675 pM, 약 700 pM, 약 725 pM, 약 750 pM, 약 775 pM, 약 800 pM, 약 825 pM, 약 850 pM, 약 875 pM, 약 900 pM, 약 925 pM, 약 950 pM, 약 975 pM, 약 1 nM, 약 1.1 nM, 약 1.2 nM, 약 1.3 nM, 약 1.4 nM, 약 1.5 nM, 약 1.6 nM, 약 1.7 nM, 약 1.8 nM, 약 1.9 nM, 또는 약 2 nM)의 KD로 huHtrA1에 결합한다. 예를 들어, 일부 경우에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 600 pM (예컨대, 약 75 pM, 약 100 pM, 약 125 pM, 약 150 pM, 약 175 pM, 약 200 pM, 약 225 pM, 약 250 pM, 약 275 pM, 약 300 pM, 약 325 pM, 약 350 pM, 약 375 pM, 약 400 pM, 약 425 pM, 약 450 pM, 약 475 pM, 약 500 pM, 약 525 pM, 약 550 pM, 약 575 pM, 약 600 pM)의 KD로 huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 500 pM의 KD 로 huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 400 pM의 KD 로 huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 300 pM의 KD 로 huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 200 pM의 KD 로 huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 150 pM의 KD 로 huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 125 pM의 KD 로 huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 약 75 pM 내지 약 100 pM의 KD 로 huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 약 80 pM의 KD로 huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 약 60 pM의 KD로 huHtrA1에 결합한다. 일부 경우에서, 항체는 약 40 pM의 KD로 huHtrA1에 결합한다.
일 구현예에서, KD 는 방사표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정된다. 일 구현예에서, RIA는 관심의 대상인 항체의 Fab 버젼 및 이의 항원으로 수행된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성은 일련의 적정된 비표지된 항원의 존재하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시키고 이어서 결합된 항원을 항-Fab 항체 코팅된 플레이트로 포획함에 의해 측정된다 (예를 들어, 참고: Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881(1999)). 검정용 조건을 수립하기 위해, MICROTITER® 다중-웰 플레이트 (Thermo Scientific)는 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)에서 포착 항-Fab 항체 (Cappel Labs)의 5 μg/ml로 밤새 코팅되고, 그리고 그 뒤에 2 내지 5 시간동안 실온 (대략 23℃)에서 PBS내 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비-흡착제 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 해당 Fab의 연속 희석으로 혼합된다 (예를 들면, 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치, Presta et al., Cancer Res . 57:4593-4599 (1997)). 그 다음 해당 Fab는 밤새 항온처리되지만; 그러나, 항온처리는 평형이 달성됨을 확인하기 위해 더 오랜 기간 (예를 들면, 약 65 시간)동안 계속할 수 있다. 그 후에, 혼합물은 실온에서 (예를 들면, 1 시간 동안) 항온처리를 위해 포획 플레이트로 이동된다. 이어서, 상기 용액을 제거하고 플레이트는 PBS 중에서 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트가 건조되어 있을 경우, 150 μl/웰의 발광제(scintillant; MICROSCINT-20™; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 10분간 탑카운트 감마(TOPCOUNT™ gamma) 카운터 (Packard) 상에서 카운팅하였다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도가 경쟁 결합 검정에서 사용하기 위해 선택된다.
또 다른 구현예에 따르면, KD 는 BIACORE® 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정을 이용하여 측정된다. 예를 들면, BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용한 검정은 25℃에서 고정화된 항원 CM5 칩으로 ~10 응답 단위(RU)로 수행한다. 일 구현예에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore, Inc. )은 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 pH 4.8, 10 mM 아세트산나트륨으로 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석되고, 그 다음 5 μl/분의 유속으로 주입되어 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)를 달성한다. 항원 주사 후, 1 M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 그룹을 차단시킨다. 역학적 측정을 위해, 2배 연속 희석된 Fab (0.78 nM 내지 500 nM)를 대략 25 μl/min의 유속으로 25℃ 에서 PBS 중에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN®-20) 계면활성제 (PBST)와 함께 사용한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 결합 및 해리 센서그램의 동시 피팅(simultaneously fitting)에 의하여 단순한 일 대 일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (BIACORE® 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 산출하였다. 평형 해리 상수(KD)는 koff/kon 비율로서 산출된다. 예를 들어, 하기를 참고한다: Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999). 만일 가역속도(on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M- 1 s-1 를 초과하면, 분광기, 예컨대 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳을 갖춘 8000-시리즈 SLM-AMINCOTM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 측정된 바와 같이 항원의 증가 농도의 존재하에 25 ℃에서 pH 7.2, PBS내 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 세기 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역통과)에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광성 켄칭 기술을 이용함으로써 가역 속도는 측정될 수 있다. KD는 또한 아래 실시예에서 기재된 바와 같이 BIACORE® SPR 검정을 이용하여 측정될 수 있다.
2. 항체 안정성
본 발명은, 항-HtrA1 항체와 비교하여, 예를 들어, 증진된 안정성을 갖는 항체를 제공한다. 항체의 안정성은 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 분광법 (예컨대, 질량 분광학), 시차 주사 형광측정법 (DSF), 원형 2색성 (CD), 고유 단백질 형광, 시차 주사 열량측정, 광 산란 (예를 들면, 동적 광 산란 (DLS) 및 정적 광 산란 (SLS), 자기-상호작용 크로마토그래피 (SIC)를 이용하여 결정될 수 있다. 항-HtrA1 항체는, 예를 들어, 향상된 용융 온도 (Tm), 응집 온도 (Tagg), 또는 참조 항-HtrA1 항체에 비교된 안정성의 다른 단위를 가질 수 있다.
본 발명은 참조 항-HtrA1 항체에 비교하여 감소된 탈아미드화를 가진 항체를 제공한다. 탈아미드화는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 및/또는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 감소 또는 예방될 수 있다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 참조 항-HtrA1 항체와 비교하여, 감소된 산화 (예컨대, 예를 들어 위치 LC-W91에서의 트립토판 산화)를 갖는 항체를 제공한다. 산화 (예컨대, 트립토판 산화)는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 및/또는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 감소 또는 예방될 수 있다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 참조 항-HtrA1 항체와 비교하여, 감소된 이성질화를 갖는 항체를 제공한다. 이성질체화는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 및/또는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 감소 또는 예방될 수 있다.
3. 항체 단편
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기된 다른 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 다음을 참고한다: Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003). scFv 단편의 검토를 위하여, 예를 들면, 다음을 참고하며: Pluckth
Figure pct00002
n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315, 1994; 또한 다음을 참고한다: WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 검토를 위해서는, 미국 특허 제5,869,046호를 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 참고, 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993). 트리아바디 및 테트라바디가 또한 하기에 기술된다: Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003).
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 참고: 예를 들면, 미국 특허 번호 6,248,516 B1)이다.
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이 무손상 항체의 단백질 가수분해 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예컨대, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술들로 제조될 수 있다.
일부 경우에서, 본 명세서에서 제공된 항체 (예를 들면, 항-HtrA1 항체)는 Fab이다. 일부 구현예에서, 상기 Fab는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역 (예컨대, 상부 힌지) 중 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, Fab 중쇄 불변 영역은 위치 221 (EU 넘버링)에서 종결한다. 일부 구현예에서, 위치 221에서 아미노산 잔기는 아스파르트산 잔기 (D221)이다. 일부 구현예에서, Fab의 중쇄 불변 영역은, 하기의 아미노산 서열, 또는 이의 서열과 어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 156. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열 번호: 160. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열 번호: 159. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열 번호: 160, 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열 번호: 159. 일부 구현예에서, Fab는 IgG1 Fab이다.
일부 경우에서, Fab는 HtrA1에 결합하고, 그리고 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEMH (서열 번호: 7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETEGAAYNQKFKG (서열 번호: 8); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVEFIH (서열 번호: 9); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSNLAS (서열 번호: 10); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWSSAPWT (서열 번호: 11), 또는 하기와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합: 서열 번호: 3 또는 7-11. 일부 경우에서, 상기 Fab는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역 (예컨대, 상부 힌지) 중 절단을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Fab 중쇄 불변 영역은 위치 221 (EU 넘버링)에서 종결한다. 일부 구현예에서, 위치 221에서의 아미노산 잔기는 Asp (D221)이다. 일부 구현예에서, Fab의 중쇄 불변 영역은, 하기의 아미노산 서열, 또는 이의 서열과 어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 156. 일부 경우에서, Fab는 하기 6개 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEMH (서열 번호: 7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETEGAAYNQKFKG (서열 번호: 8); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVEFIH (서열 번호: 9); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSNLAS (서열 번호: 10); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWSSAPWT (서열 번호: 11), 그리고 추가로 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: 서열 번호: 156.
일부 경우에서, Fab는 HtrA1에 결합하고, 그리고 하기를 포함한다: (a) 하기의 서열, 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 21; (b) 하기의 서열, 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열 번호: 22; 및 (c) 중쇄 불변 영역의 힌지 영역 (예컨대, 상부 힌지). 일부 구현예에서, Fab 중쇄 불변 영역은 위치 221 (EU 넘버링)에서 종결한다. 일부 구현예에서, 위치 221에서의 아미노산 잔기는 Asp (D221)이다. 일부 구현예에서, Fab의 중쇄 불변 영역은, 하기의 아미노산 서열, 또는 이의 서열과 어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 156. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열 번호: 160. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열 번호: 159. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄: 서열 번호: 160, 및 하기의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄: 서열 번호: 159.
일부 경우에서, Fab는 HtrA1에 결합하고, 그리고 하기를 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 21; (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열 번호: 22); 및 (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역: 서열 번호: 156.
4. 키메라성 및 인간화 항체
어떤 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라성 항체는, 예를 들면, 하기에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 4,816,567 및 Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984). 일 예시에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 도메인 (예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 유도된 가변 영역)과 인간 불변 도메인을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 서브부류가 친계 항체의 부류로부터 변화된 “부류 스위칭된” 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성이 감소되어 있고 친계 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 보유한다. 일반적으로, 인간화 항체는, HVR, 예를 들면, CDR, (또는 그 일부)가 비인간 항체로부터 유도되고, FR (또는 그 일부)가 인간 항체 서열로부터 유도되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는 비인간 항체 (예를 들면, HVR 잔기가 유도되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선한다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 하기에 고찰되고: Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008), 그리고 추가로 하기에 기재된다: Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc . Nat’l Acad. Sci . USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 그라프팅 기재); Padlan, Mol . Immunol . 28:489-498 (1991) ("재표면화" 기재); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링" 기재); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근법을 기재함).
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: "베스트-피트" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (문헌참조: 예를 들어, Sims et al., J. Immunol . 151:2296 (1993)); 특정 서브그룹의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고: 예를 들어, Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al., J . Immunol ., 151:2623 (1993)); 인간 성숙(체세포적으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예를 들면, 참고: Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008)); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고: 예를 들어, Baca et al., J. Biol . Chem . 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol . Chem . 271:22611-22618 (1996)).
5. 인간 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해기술에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 다음 문헌에 기재되어 있다: van Dijk et al., Curr . Opin . Pharmacol . 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr . Opin . Immunol . 20:450-459 (2008).
인간 항체는 항원 시험(antigenic challenge)에 응답하여 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 무손상 항체를 제조하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 상기 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나 염색체외적으로 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합된 인간 면역글로불린 유전자좌 모두 또는 일부를 함유한다. 상기 유전자전이 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되어 있다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 하기를 참조한다: Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). 또한, 예를 들어, 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호(XENOMOUSETM 기술을 설명함); 미국 특허 제 5,770,429호(HUMAB® 기술을 설명함); 미국 특허 제7,041,870호(K-M MOUSE® 기술을 설명함), 및 미국 특허 출원 공보 번호 US 2007/0061900(VELOCIMOUSE® 기술을 설명함)를 참고한다. 이와 같은 동물에 의해 생성된 무손상 항체의 인간 가변 영역은, 예컨대 상이한 인간 불변영역과 조합함으로써, 추가로 변형될 수 있다. 인간 항체는 또한 혼성세포 기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단클론성 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되었다.
인간 단클론성 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되었다. 인간 단클론성 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되었다. (참고: 예를 들어, Kozbor J. Immunol ., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 제조된 인간 항체가 또한 다음 문헌에 기재되어 있다: Li et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 103:3557-3562 (2006). 추가의 방법은, 예를 들면, 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단클론성 인간 IgM 항체의 생산 기재) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268, 2006 (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology)은 다음 문헌에 기재되어 있다: Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
인간 항체는 또한 인간 유래된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리시킴에 의해 제조될 수 있다. 상기 가변 도메인 서열은 이어서 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기에 기재되어 있다.
6. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 생산하고 목적하는 결합 특징을 갖는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 각종 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 그러한 방법은 하기에 검토되며: Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001), 그리고 추가로 하기에 검토된다: 예를 들어, the McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
일부 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파아지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이후 하기에 기술된 바와 같이 항원-결합 파아지에 대해 스크리닝될 수 있다: Winter et al., Ann. Rev. Immunol ., 12: 433-455 (1994). 파아지는 전형적으로 단일쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 단순 레퍼토리는 (예를 들면, 인간으로부터) 클로닝되어 하기에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비자가 및 또한 자가 항원에 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다: Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). 최종적으로, 순수 라이브러리는 또한 줄기 세포로부터 비재배열된 V-유전자 분절을 클로닝하고 고도의 가변성 CDR3 영역을 암호하고 시험관내 재배열을 성취하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함에 의해 합성적으로 제조될 수 있고, 이는 다음 문헌에 기재된 바와 같다: Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol ., 227: 381-388 (1992). 인간 항체 파아지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는 예를 들어, 다음의 문헌을 포함한다: 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360.
인간 항체 라이브러리에서 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원의 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
7. 다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 최소한 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 HtrA1 의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 HtrA1에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원 (예컨대, 제2 생물학적 분자, 예컨대 인자 D)에 대한 것이다. 따라서, 이중특이적 항체는 HtrA1 및 인자 D에 대하여 결합 특이성을 가질 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 본 명세서에서 기재된 임의의 항-HtrA1 항체는 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 예를 들어 항-HtrA1/항-인자 D 이중특이적 항체를 조작하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 및/또는 당해 분야에 공지된 임의의 항-인자 D 항체는 그와 같은 항-HtrA1/항-인자 D 이중특이적 항체를 조작하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 경우에서, 이중특이적 항-HtrA1 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 초가변 영역 (HVR)을 포함하는 HtrA1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEX1H (서열 번호: 1) (여기서 X1 은 Met 또는 Leu임); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETX1GAAYNQKFKG (서열 번호: 2) (여기서 X1 은 Glu 또는 Asp임); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVX3FIH (서열 번호: 4) (여기서 X3 은 Glu 또는 Asn임); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSX4LAS (서열 번호: 5) (여기서 X4 는 Asn, His 또는 Glu임); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWX5SX6PWT (서열 번호: 6) (여기서 X5 는 Ser 또는 Tyr이며, 그리고 X6 은 Ala 또는 Asn임) 또는 하기 중 임의의 것과 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합: 서열 번호: 1-6 (인자 D에 결합하는 제2 결합 도메인을 가질 수 있음). 인자 D에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인은, 예를 들어, 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 HVR을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYAX1DFKG (서열 번호: 110) (여기서 X1 은 Asp 또는 Glu임); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVX1N (서열 번호: 111) (여기서 X1 는 Asn 또는 Ser임); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTX1IX2X3DMN (서열 번호: 112) (여기서 X1 은 Asp 또는 Ser이고, 그리고 X2 는 Asp 또는 Glu이며, 그리고 X3 은 Asp 또는 Ser임); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSX1SLPYT (서열 번호: 114) (여기서 X1 은 Asp 또는 Glu임) 또는 하기 중 임의의 것과 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합: 서열 번호: 109-114.
예를 들어, 일부 경우에서, 이중특이적 항-HtrA1 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 초가변 영역 (HVR)을 포함하는 HtrA1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEMH (서열 번호: 7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETEGAAYNQKFKG (서열 번호: 8); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVEFIH (서열 번호: 9); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSNLAS (서열 번호: 10); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWSSAPWT (서열 번호: 11), 또는 하기와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합: 서열 번호: 3 또는 7-11 (인자 D에 결합하는 제2 결합 도메인을 가질 수 있음). 인자 D에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인은, 예를 들어, 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 HVR을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYADDFKG (서열 번호: 115); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVNN (서열 번호: 116); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTDIDDDMN (서열 번호: 117); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSDSLPYT (서열 번호: 118), 또는 하기와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 상기 HVR 중 하나 이상 및 하나 이상의 이의 변이체의 조합: 서열 번호: 109, 113, 또는 115-118.
특정 구현예에서, 본 발명은 HtrA1 및 인자 D 둘 모두에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항-HtrA1 항체를 특징으로 하며, 여기서 상기 항체는 하기 6개 HVR을 포함하는 HtrA1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEMH (서열 번호: 7); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETEGAAYNQKFKG (서열 번호: 8); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVEFIH (서열 번호: 9); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSNLAS (서열 번호: 10); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWSSAPWT (서열 번호: 11); 및 하기 6개 HVR을 포함하는 인자 D에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYADDFKG (서열 번호: 115); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVNN (서열 번호: 116); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTDIDDDMN (서열 번호: 117); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSDSLPYT (서열 번호: 118). 일부 경우에서, 제2 결합 도메인은 항-인자 D 항원-결합 항체 단편 람팔리주맙의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 HVR을 포함한다.
일부 경우에서, 이중특이적 항-HtrA1 항체는 하기를 포함한다: 하기를 포함하는 HtrA1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인: (a) 하기의 서열 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 21; (b) 하기의 서열, 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열 번호: 22; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인, 예컨대 APEG.LC3.HC3은, 인자 D에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 가질 수 있다. 인자 D에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인은 예를 들어, 하기를 포함할 수 있다: (a) 하기의 서열, 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인: 서열 번호: 119; (b) 하기의 서열, 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인: 서열 번호: 120; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 경우에서, 인자 D에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인은, 하기를 포함할 수 있다: (a) 항-인자 D 항원-결합 항체 단편 람팔리주맙의 서열, 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 항-인자 D 항원-결합 항체 단편 람팔리주맙의 서열, 또는 이와 적어도 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 비제한적으로 하기를 포함한다: 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (참고: Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), 및 "크놉-인-홀" 가공 (참고: 예를 들면, 미국 특허 번호 5,731,168). 다중 특이적 항체는 또한 다음과 같이 제조될 수 있다: 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과를 가공함에 의해 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교 결합시킴에 의해 (참고: 예를 들면, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 이중특이적 항체를 생산하기 위하여 류신 지퍼(leucine zipper)를 사용함으로써 (참고: 예를 들어, Kostelny et al., J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992)); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술을 사용함으로써 (참고: 예를 들어, Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)); 및 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함에 의해 (참고: 예를 들어, Gruber et al., J. Immunol ., 152:5368 (1994)); 및 다음 문헌에 기재된 바와 같이 3특이적 항체를 제조함에 의해: 예를 들어, Tutt et al., J. Immunol . 147:60 (1991).
"옥토퍼스 항체"를 포함하는, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 가공된 항체는 또한 본원에 포함된다 (참고: 예를 들어 US 2006/0025576A1).
본원에서 항체 또는 단편은 또한 HtrA1 및 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이원 작용 Fab" 또는 "DAF"를 포함한다(문헌참조: 예를 들어 US 2008/0069820).
8. 항체 변이체
특정한 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체 (예를 들면, 1종 이상의 아미노산 잔기 변경을 포함하는 항체 변이체)는 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 적당한 변형을 도입하거나 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열내 잔기들로부터의 결실 및/또는 이들로의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물이 원하는 특징, 예를 들어, 항원-결합을 보유하는 경우, 최종 작제물에 도달하도록 이뤄질 수 있다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이 유발을 위한 목적하는 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환."의 제목하에 표 1에서 보여준다. 보다 실질적 변화는 "예시적 치환"의 표제하에 표 1에 제공되고, 추가로 아미노산 측쇄 부류를 참조로 하기에 기재된 바와 같다. 아미노산 치환이 관심 항체 내로 도입될 수 있고, 원하는 활성, 예를 들어, 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대하여 스크리닝될 수 있다.
표 1
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아미노산은 통상의 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 다른 부류에 대한 이들 부류 중 하나의 구성원을 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환형 변이체의 한 유형은 친계 항체 (예를 들면 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기 및/또는 FR 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로 추가의 연구를 위해 선택된 수득한 변이체(들)은 친계 항체와 비교하여 특정 생물학적 성질 (예를 들어, 증가된 친화도, 증가된 안정성, 증가된 발현, 변경된 pI, 및/또는 감소된 면역원성)에서 변형(예를 들어, 개선)을 갖고/갖거나 상기 친계 항체의 특정 생물학적 성질을 실질적으로 보유한다. 예시적인 치환 변이체는, 예컨대, 본원에 기재된 것과 같은 파아지 디스플레이-기반의 친화도 성숙 기술을 사용하여, 간편하게 생성될 수 있는 친화도 성숙된 항체이다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기는 돌연변이화되고 파아지에서 변이체 항체 표시되고 특정한 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화도)에 대하여 스크리닝된다.
변경(예컨대, 치환)은 HVR에서, 예컨대, 항체 친화도를 개선시키기 위해 이루어질 수 있다. 상기 변경은 HVR "핫스팟," 즉, 체세포 성숙 공정 동안 높은 빈도로 돌연변이화하는 코돈에 의해 암호화된 잔기 (참고: 예를 들면, Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207:179-196 (2008)), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 이루어질 수 있으며, 이때 생성된 변이체 VH 또는 VL가 결합 친화도에 대하여 시험된다. 2차 라이브러리로부터 작제하고 재선택함에 의한 친화성 성숙화가 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다: Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) 친화도 성숙화의 일부 구현예에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류 발생 경향 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이생성)에 의한 성숙화를 위해 선택되는 가변 유전자에 도입된다. 이후 2차 라이브러리가 형성된다. 이후 라이브러리를 스크리닝하여 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 포함하며, 여기서 몇몇 HVR 잔기(예컨대, 한번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는 특히, 예컨대, 알라닌 주사 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis) 또는 모델링을 사용하여 식별할 수 있다. 특히, HVR-H3 및 HVR-L3이 흔히 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변형이 항체가 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변형(예컨대, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)은 HVR에서 이루어질 수 있다. 상기 변경은, 예를 들면, HVR에서 항원 접촉 잔기의 외부일 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR는 변경되지 않거나, 또는 하나 이상, 두 개 또는 세 개의 아미노산 치환을 함유하지 않는다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변형이 항체가 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 FR 내에서 일어날 수 있다. 상기 변경은, 예를 들어, (예를 들면, 증가된 용융 온도에 의해 평가된 바와 같이) 항체 친화성 및/또는 안정성을 개선할 수 있다.
변형하기 위한 프레임워크 영역 잔기 또는 HVR 영역 잔기의 예는 가능한 탈아미드화 부위 (즉, 아스파라긴 (N 또는 Asn)), 산화 부위 (즉, 메티오닌 (M 또는 Met) 또는 트립토판 (W 또는 Trp)) 또는 파이로글루타메이트 전환 부위 (즉, 글루타민 (Q 또는 Gln))을 포함하고, 여기서 상기 부위에서 변형은 탈아미드화 및/또는 산화 및/또는 파이로글루타메이트 전환을, 각각 예방 또는 감소시킨다.
탈아미드화된 변이체의 형성을 예방 또는 감소시키기 위해, 아스파라긴 (N 또는 Asn)은 알라닌 (A 또는 Ala), 글루타민 (Q 또는 Gln) 또는 세린 (S 또는 Ser)로 돌연변이될 수 있다. 산화된 변이체의 형성을 예방 또는 감소시키기 위해, 메티오닌 (Met) 또는 트립토판 (W 또는 Trp)은 류신 (L) 또는 이소류신 (I)로 돌연변이될 수 있다. 파이로글루타메이트 변이체의 형성을 예방 또는 감소시키기 위해, 글루타민 (Q 또는 Gln)은 글루타메이트 (E 또는 Glu)로 돌연변이될 수 있다. 참고: 예컨대, Amphlett et al., Pharm . Biotechnol ., 9:1-140, 1996. 대안적으로, 또는 또한, 프레임워크 영역 잔기의 1종 이상의 변경 (예를 들면, 치환)은 모 항체에서 Fc 영역일 수 있다.
돌연변이생성을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기들 또는 영역들의 식별을 위해 유용한 방법은 다음 문헌에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이생성"로 불리운다: Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. 상기 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들 그룹 (예를 들어, Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu와 같은 하전된 잔기들)은 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 동정되고 대체되어 항체와 항원의 상호작용이 영향받는지를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감도를 입증하는 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항체와 항원 간의 접촉 지점을 식별하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기가 치환을 위한 후보물질로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 목적하는 특성을 함유하는지 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1 잔기 내지 100 이상 잔기를 함유하는 폴리펩타이드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열간 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 또 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소(예컨대, ADEPT에 대한)에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변형된다. 항체에 대한 당화 부위의 부가 또는 결실은 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있어서 하나 또는 그 초과 당화 부위는 제조 또는 제거된다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 여기에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 원상태 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결부에 의해 일반적으로 부착되는 분지형, 바이안테너리 올리고당을 포함한다. 참고, 예를 들면, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산, 뿐만 아니라 2분지형 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 실시될 수 있다.
한 구현예에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 부족한 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 상기 항체에서 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코오스의 양은 예로서, WO 2008/077546에서 설명된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 계측될 때, Asn 297에 부착된 모든 당구조의 총합 (가령, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노오스 구조)에 비하여, Asn297에서 당 사슬 내에 푸코오스의 평균량을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서의 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 배치된 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; 그러나, Asn297은, 항체내 작은 서열 변이로 인해, 위치 297의 약 ± 3 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉, 위치 294 와 300 사이에 또한 배치될 수 있다. 이와 같은 푸코실화 변종은 ADCC 작용을 향상시킬 가능성이 있다. 참고: 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 US 2003/0157108; US 2004/0093621. “탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 공보의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al., J. Mol . Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004). 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 하기를 포함한다: 단백질 푸코실화에서 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al., Arch. Biochem . Biophys . 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (참고: 예를 들면, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004); Kanda et al., Biotechnol . Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107).
항체 변이체는 이등분한 올리고당으로 추가 제공되고, 예를 들면, 여기에서 항체의 Fc 영역에 부착된 2분지형 올리고당은 GlcNAc에 의해 이등분된다. 상기 항체 변이체는 푸코실화를 감소시킬 수 있고/있거나 ADCC 기능을 개선시킬 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들면, 하기에 기술된다: WO 2003/011878; US 특허 번호 6,602,684; 및 US 2005/0123546 (Umana et al.). Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 CDC 기능을 개선시킬 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예를 들면, 하기에 기술된다: WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764.
c) Fc 영역 변이체
특정 구현예에서, 하나 또는 그 초과 아미노산 변형은 본원에 제공된 항체의 Fc 영역속에 도입될 수 있고, 그렇게 함으로써 Fc 영역 변이체를 발생시킨다. Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 잔기 변경 (가령, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (가령, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 생체내 항체의 반감기가 여전히 특정 효과기 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 중요한 적용에 대해 바람직한 후보자에 불필요한 또는 유해하게 하는, 모든 효과기 기능은 아니지만 일부를 보유하는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 경감/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합이 부족하지만 (따라서 유사하게 ADCC 활성 부족), FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 확보하기 위해 수행될 수 있다. ADCC, NK 세포 매개용 1차 세포는 FcγRIII 만을 발현하고, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포상의 FcR 발현은 다음 문헌의 464 페이지 상의 표 3에 요약되어 있다: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-492 (1991). 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비-제한적인 예는 하기에 기재된다: 미국 특허 번호 5,500,362 (참고: 예를 들면, Hellstrom et al., Proc . Nat’l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986) 및 Hellstrom et al., Proc . Nat’l Acad. Sci . USA 82:1499-1502 (1985); 미국 특허 번호 5,821,337; 및 Bruggemann et al., J. Exp . Med . 166:1351-1361 (1987)). 대안적으로, 하기와 같은 비-방사능활성 검정 방법이 사용될 수 있다: 예를 들어, 유동 세포측정을 위한 ACTI™ 비-방사능활성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CYTOTOX 96® 비 방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI). 이러한 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 하기와 같이 생체내 평가된다: 예를 들면, 하기에 기술된 바와 같은 동물 모델: Clynes et al., Proc . Nat ’l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998). C1q 결합 검정은 또한 항체가 C1q를 결합할 수 없음에 따라서 CDC 활성이 부재임을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 참고: 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(참고: 예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn 결합 및 생체내 청소능/반감기 결정은 또한 당해분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (참고: 예를 들면, Petkova et al., Int ’l. Immunol . 18(12):1759-1769 (2006)).
감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 상기 Fc 돌연변이체는, 알라닌에 대해 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 2 또는 그 초과의 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcRs로의 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다. (예를 들어, 하기 참고: 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001)).
특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334에서의 치환(잔기들의 EU 넘버링)을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 Fc 영역에서, 예컨대, 하기에 기술된 바와 같이, 변형된(즉 향상되거나 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보완 의존 세포독성(CDC)을 초래하는 변형이 이루어진다: 미국 특허 번호 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie et al., J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000).
증가된 반감기 및 태아로의 모체 IgG의 이동에 원인으로 작용하는, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)로의 개선된 결합을 갖는 항체 (Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994))가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재된다.　상기 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 그안에 하나 또는 그 초과 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434의 하나 이상에서 치환, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826). Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 하기를 참고한다: Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351.
d) 시스테인 가공된 항체 변이체
특정 구현예에서, 시스테인이 가공된 항체, 예컨대, "thioMAbs"(항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 것임)를 형성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기는 그렇게 함으로써 항체의 접근가능한 부위에 배치되고, 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 중간체에 항체를 콘주게이트하는데 사용되어, 본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 면역콘주게이트를 제조할 수 있다. 특정 양태에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카밧 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 가공된 항체는, 예를 들면, U.S. 특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되어 있고 쉽게 이용 가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화를 위해 적합한 모이어티는 수용성 폴리머를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에톡시화 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 수중 안정성으로 인해 제조시 이점을 가질 수 있다. 폴리머는 임의의 분자량일 수 있고, 그리고 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 상기 항체에 부착된 폴리머 개수는 다양할 수 있는데, 둘 이상의 폴리머가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 폴리머의 수 및/또는 유형은 개선시키고자 하는 항체의 특별한 특성이나 기능, 항체 유도체가 정의된 조건하에서 치료법에서 사용될 것인지 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고려사항들에 기초하여 계측될 수 있다.
항체-폴리머 콘주게이트는 폴리머로 항체의 임의의 적당한 유도체화 기술을 이용하여 실시될 수 있다. 본 발명이 항체 또는 항체 단편과 폴리머 사이 임의의 특정한 유형의 연결을 사용하는 콘주게이트에 제한되지 않는 것이 인정될 것이다.
일 양태에서, 본 발명의 콘주게이트는 폴리머가 친계 항체에서 특이적 부위 또는 특이적 부위들에 공유결합되는 종을 포함한다, 즉, 폴리머 부착은 친계 항체 또는 항체 단편에서 특정한 영역 또는 특정한 아미노산 잔기 또는 잔기들에 표적화된다. 폴리머의 부위 특이적 콘주게이션은 친계 항체 또는 항체 단편에서 시스테인 잔기에 부착에 의해 가장 흔하게 달성된다. 상기 구현예에서, 커플링 화학은, 예를 들어, 친계 항체에서 디설파이드 브릿지가 아닌 시스테인 잔기의 자유 설프하이드릴 기를 사용할 수 있다. 폴리머는 친계 항체에서 자유 설프하이드릴 또는 티올 기(들)과 특이적으로 반응할 수 있는 임의의 작용기, 예컨대 말레이미드, 설프하이드릴, 티올, 트리플레이트, 테실레이트, 아지리딘, 엑시란, 및 5-피리딜 작용기로 활성화될 수 있다. 폴리머는 선택된 커플링 시스템, 예컨대 미국 특허 번호에 기재된 프로토콜 및 시스템의 화학에 적당한 임의의 프로토콜을 이용하여 친계 항체에 커플링될 수 있다. 4,179,337 및 7,122,636; 및 Jevsevar et al., Biotech. J. 5:113-128, 2010.
하나의 구현예에서, 친계 항체에서 천연적으로 존재하는 1종 이상의 시스테인 잔기(들)은 폴리머 콘주게이션용 부착 부위(들)로서 사용된다. 또 다른 구현예에서, 1종 이상의 시스테인 잔기(들)은 폴리머용 특이적 부착 부위 또는 부위들 제공의 목적을 위하여 친계 항체에서 선택된 부위 또는 부위들에 조작된다.
일 양태에서, 본 발명은 항체 단편-폴리머 콘주게이트를 포함하고, 여기서 상기 항체 단편은 Fab이고, 폴리머는 경쇄 및 중쇄를 연결하는 사슬간 디설파이드 결합을 통상적으로 형성할 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄에서 1종 이상의 시스테인 잔기에 부착된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체 단편-폴리머 콘주게이트를 포함하고, 여기서 상기 항체 단편은 Fab'이고, 폴리머 부착은 Fab' 단편의 힌지 영역에 표적화된다. 하나의 구현예에서, 항체 단편의 힌지 영역에서 천연적으로 존재하는 1종 이상의 시스테인 잔기(들)은 폴리머를 부착시키는데 사용된다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 폴리머용 특이적 부착 부위 또는 부위들 제공의 목적을 위하여 Fab’ 단편의 힌지 영역으로 가공된다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 Fab 단편 (예를 들면, 항-HtrA1 Fab 단편, 항-인자 D Fab 단편, 또는 항-HtrA1/항-인자 D Fab 단편)은 폴리머 콘주게이션용 1 부착 부위 제공의 목적으로 C-말단에서 1 시스테인 부가에 의해 변형된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 Fab 단편은 폴리머 콘주게이션용 2 부착 부위 제공의 목적으로 C'-말단 단부에서, 4 추가의 잔기, Cys-Pro-Pro-Cys (서열 번호: 122) 부가에 의해 변형된다.
하나의 통상적으로 사용된 항체 콘주게이션은 PEG화이고, 여기서 1종 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머는 항체의 불변 영역에 공유결합된다. 참고: 미국 특허 번호 4,179,337 및 7,122,636. 상이한 크기 (예를 들면, 약 500 D 내지 약 300,000 D) 및 형상 (예를 들면, 선형 또는 분지형)의 PEG 폴리머는 공지되고 현장에서 널리 사용되어 왔다. 본 발명에 유용한 폴리머는 (예를 들면, Nippon Oil and Fats; Nektar Therapeutics; Creative PEGWorks로부터) 상업적으로 수득될 수 있거나 종래의 화학적 절차를 이용하여 상업적으로-이용가능한 개시 물질로부터 제조될 수 있다. PEG화는 항체 약물의 물리적 및 화학적 특성을 변화시키고, 개선된 약동학적 행동 예컨대 개선된 안정성, 감소된 면역원성, 연장된 순환 주기, 뿐만 아니라 증가된 체류 시간을 초래할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 임의의 항체 (예를 들면, 본 발명의 항-HtrA1 항체)는 하이알루론산 (HA)에 콘주게이션될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 방사선에 노출에 의해 임의로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티 및 항체의 복합체가 제공된다. 하나의 양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장일 수 있으며, 보통의 세포에는 유해하지 않지만 비단백질성 모이어티를 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포가 사멸하는 온도로 가열시키는 파장을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
f) 등전점 변이체
본 발명은 변경된 등전점을 가진 항체 변이체를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은, 예를 들어 참조 항-HtrA1 항체와 비교하여, 감소된 등전점 (pl)을 갖는 항체 변이체를 제공한다. 일부 경우에서, 표면 전하는 생리적 pH에서 감소된다. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 약 8 이하의 pI (예를 들면, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 또는 약 4)을 갖는다. 일부 경우에서, 항체는 약 4 내지 약 8 (예를 들면, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 약 8)의 pI을 갖는다. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 약 5 내지 약 7 (예를 들면, 약 5, 약 6, 또는 약 7)의 pI을 갖는다. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는 약 5 내지 약 6의 pl (예컨대, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 또는 약 6)을 갖는다.
본 발명의 항체는, 예를 들어, 제공된 위치에서 야생형 아미노산 잔기를 더 낮은 pI를 갖는 아미노산으로 치환시킴으로써, 감소된 pI를 갖기 위해 조작될 수 있다. 아미노산의 pI는, 당해 기술에 공지되어 있는, 아민 (-NH2), 카복실산 (-COOH), 및 아미노산의 측쇄의 pKa 값에 기반하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 표면-노출된 아미노산 잔기는 항체의 pI를 감소시키기 위해 치환될 수 있다. 하나의 구현예에서, 표면-노출된 아미노산 잔기는 글루타메이트 (E)로 치환될 수 있다. 일 구현예에서, 표면-노출된 아미노산 잔기는 아스파르테이트 (D)로 치환될 수 있다.
D. 재조합 방법 및 조성물
본 명세서에서 기재된 임의의 항체 (예를 들면, 항-HtrA1 항체)는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이, 재조합 방법 및 조성물을 이용하여 생산될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에서 기재된 항-HtrA1 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예컨대, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)를 암호화할 수 있다. 추가 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 한 상기 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들면, 하기로 변형된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 일 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예컨대, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프모양 세포(예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 구현예에서, 항-HtrA1 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 여기서, 상기 방법은 항체의 발현을 위해 적합한 조건 하에서 상기 제공된 바와 같이 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고 임의로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항-HtrA1 항체의 재조합 생산에 대하여, 예를 들면, 상기에서 기재된 바와 같이, 항체를 암호화하는 핵산은 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 단리 및 삽입된다. 상기 핵산은 통상의 과정들(예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써)을 사용하여 쉽게 단리하고 서열분석할 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 및 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아 중의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해, 예를 들면, 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호 및 제5,840,523호를 참조한다. 또한 하기를 참고한다: Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, (이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기술). 발현 이후, 항체는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 일부 또는 전부 인간 글리코실화된 패턴을 갖는 항체를 생성할 수 있는 진균 및 효모 균주를 포함한 사상균 또는 효모균과 같은 진핵 미생물이 항체-암호화 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참고: Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다중세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루지페르다 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인된다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호 (유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 서스펜션에서 성장하도록 적응되는 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 하기이다: SV40 (COS-7)에 의해 변형된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통 (예를 들면, Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1977)에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 갯과 신장 세포 (MDCK; 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); 예를 들면, Mather et al., Annals N.Y . Acad . Sci. 383:44-68 (1982)에 기재된 바와 같이 TRI 세포); MRC 5 세포; 및 FS4 세포. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함하고, 이는 하기를 포함한다: DHFR- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216, 1980); 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 참고: 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
E. 검정
본원에서 제공된 항-HtrA1 항체 (예컨대, 항-HtrA1 항체 및 항-HtrA1/항-인자 D 항체)는 당해기술에서 공지된 다양한 검정에 의해 그 물리적/화학 특성 및/또는 생물학적 활성으로 확인, 스크리닝, 또는 특징화될 수 있다.
1. 결합 검정 및 기타 검정
일 양태에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, 공지된 방법 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯, 표면 플라스몬 공명 검정 (예컨대, BIACORE®) 등에 의해 그 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
일 양태에서, (예를 들면, KD에 의해 나타낸 바와 같이) 항원 결합 활성은 BIACORE® 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정을 이용하여 측정된다. 예를 들면, BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용한 검정은 25℃에서 고정화된 항원 CM5 칩으로 ~10 응답 단위(RU)로 수행한다. 일 구현예에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore, Inc. )은 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 pH 4.8, 10 mM 아세트산나트륨으로 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석되고, 그 다음 5 μl/분의 유속으로 주입되어 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)를 달성한다. 항원 주사 후, 1 M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 그룹을 차단시킨다. 역학적 측정을 위해, 2배 연속 희석된 Fab (0.78 nM 내지 500 nM)를 대략 25 μl/min의 유속으로 25℃ 에서 PBS 중에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN®-20) 계면활성제 (PBST)와 함께 사용한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 결합 및 해리 센서그램의 동시 피팅(simultaneously fitting)에 의하여 단순한 일 대 일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (BIACORE® 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 산출하였다. 평형 해리 상수(KD)는 koff/kon 비율로서 산출된다. 예를 들어, 하기를 참고한다: Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999). 만일 가역속도(on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M- 1 s-1 를 초과하면, 분광기, 예컨대 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳을 갖춘 8000-시리즈 SLM-AMINCOTM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 측정된 바와 같이 항원의 증가 농도의 존재하에 25 ℃에서 pH 7.2, PBS내 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 세기 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역통과)에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광성 켄칭 기술을 이용함으로써 가역 속도는 측정될 수 있다. KD는 또한 아래 실시예에서 기재된 바와 같이 BIACORE® SPR 검정을 이용하여 측정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 경쟁 검정은 HtrA1에의 결합을 위해 본원에 기술된 항체와 경쟁하는 항체를 식별하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 경쟁 항체는 크레네주맙 또는 본원에 기술된 항체에 의해 결합된 상동한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하기 위한 세부적인 예시적 방법은 다음 문헌에 제공되어 있다: Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
예시적인 경쟁 검정에서, 고정화된 HtrA1은 HtrA1에 결합하는 제1 표지된 항체 및 HtrA1에 결합을 위해 제1 항체와 경쟁하는 그 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 제2 항체는 혼성세포 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 HtrA1은 제2 비표지된 항체가 아닌 제1 표지된 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. HtrA1로의 제1 항체의 결합에 허용된 조건 하에서 항온처리 이후, 과잉의 미결합된 항체는 제거되고, 고정화된 HtrA1에 관련된 표지의 양이 측정된다. 만일 고정화된 HtrA1에 관련된 표지의 양이 대조군 샘플에 비하여 시험 샘플에서 실질적으로 감소되면, 그러면 그것은 제2 항체가 HtrA1에 결합을 위해 제1 항체와 경쟁하는 것을 나타낸다. 참고: Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. 활성 검정
일 측면에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-HtrA1 항체를 식별하기 위해 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어, HtrA1의 1종 이상의 생물학적 활성 억제, 차단, 길항화, 억압, 간섭, 조정 및/또는 감소를 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 상기 생물학적 활성에 대해 시험된다. 특정한 구현예에서, 항-HtrA1 항체는 HtrA1에 결합하고, 예를 들어, 아래 실시예에서 기재된 바와 같은 H2-Opt 기질, α-카세인, β-카세인, 또는 BODIPY® FL 카세인 기질, 또는 임의의 다른 적당한 HtrA1 기질을 포함하는, 1종 이상의 HtrA1 기질에 대하여 이의 세린 프로테아제 활성을 감소 또는 억제시킨다. 특정 구현예에서, 항-HtrA1 항체는 1종 이상의 HtrA1 기질에 대하여 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1 nM, 800 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM 미만, 또는 더 낮은 IC50 을 가진 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제시킨다. 특정한 구현예에서, 항-HtrA1 항체는 분해로부터 광수용체 세포를 보호하거나, 외부 핵 층의 두께를 보호하거나, 안구 질환 모델, 예컨대 U.S. 2013/0129743의 실시예 10에 기재된 일정한 광노출 마우스 모델에서 망막전도 기능성 활성을 보호한다.
항-인자 D 항체, 또는 이들의 변이체 또는 단편 (예를 들면, 항원-결합 단편)이 인자 D에 결합할 수 있고 생물학적 효과, 예를 들어, 대체 경로 용혈의 억제를 발휘할 수 있는지를 결정하기 위해, 그 전체가 참조로 본 명세서에서 편입되는, 미국 특허 번호 8,273,352의 실시예 2에 기재된 것을 포함하는, 토끼 적혈구 (RBCs)를 이용하는 용혈성 억제 검정은 사용될 수 있다. 상기 용혈성 억제는 표준 검정 (Kostavasili et al., J. Immunology 158:1763-72, 1997; Wiesmann et al., Nature 444:159-60, 2006)을 이용하여 결정될 수 있다. 상기 검정에서 보체의 활성화는 혈청 또는 혈장으로 개시될 수 있다. 혈청 또는 혈장내 인자 D의 적절한 농도 (Pascual et al., Kidney International 34:529-536, 1998; Complement Facts Book, Bernard J. Morley and Mark J. Walport, editors, Academic Press (2000); Barnum et al., J. Immunol . Methods, 67: 303-309, 1984)는, 참조문헌 예컨대 Pascual et al., 상기 및 Barnum et al., 상기, 및 미국 특허 번호 8,273,352의 실시예 4에 기재된 것을 포함하는, 당해 분야에 공지된 방법에 따라 일상적으로 결정될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 항-인자 D 항체는 일반적으로 인자 D와 관련된 생물학적 활성을 억제시킬 수 있다. 예를 들어, 18 ㎍/ml의 농도 (혈액에서 인간 인자 D의 몰 농도의 약 1.5 배와 같음; 약 1.5:1의 항-인자 D 항체 대 인자 D의 몰비)에서, 항체에 의한 대안적인 보체 활성의 상당한 억제는 관측될 수 있다 (참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,956,107).
3. 안정성 검정
일 양태에서, 검정은 항-HtrA1 항체의 안정성 (예를 들면, 열안정성) 결정에 제공된다. 예를 들어, 항체의 안정성은 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 시차 주사 형광측정법 (DSF), 원형 2색성 (CD), 고유 단백질 형광, 시차 주사 열량측정, 분광법, 광 산란 (예를 들면, 동적 광 산란 (DLS) 및 정적 광 산란 (SLS), 자기-상호작용 크로마토그래피 (SIC)를 이용하여 결정될 수 있다. 검정의 안정성은 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 예를 들어, AAPH 스트레스 시험 및/또는 열적 스트레스 시험의 문맥에서, 예를 들어, 실시예 4에서, 예를 들어, 기재된 바와 같은 질량 분광분석법을 이용하여 결정될 수 있다.
F. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 임의의 항-HtrA1 항체는 생물학적 샘플에서 HtrA1의 존재 검출에 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 특정한 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 광수용체 세포, 망막 색소 상피 세포, 외부 핵 층의 세포, 내부 핵 층, 물러 세포, 섬모 상피, 또는 망막 조직을 포함하는 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 체액, 예를 들면, 유리체 또는 혈액을 포함한다.
일 구현예에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-HtrA1 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플 중의 HtrA1의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 항-HtrA1 항체의 HtrA1로의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 생물학적 샘플을 본원에 기술된 항-HtrA1 항체와 접촉시키고 복합체가 항-HtrA1 항체와 HtrA1 간에 형성되는지를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일 구현예에서, 예를 들면, HtrA1 이 환자의 선택용 바이오마커인 경우, 항-HtrA1 항체가 항-HtrA1 항체를 이용한 요법에 자격있는 대상체를 선택하는데 사용된다.
특정한 구현예에서, 항-HtrA1 항체로 치료에 적당한 환자는 HtrA1 유전자 또는 HtrA1 대조군 서열에서 1종 이상의 다형성, 예컨대 HtrA1 프로모터 다형성 rs11200638(G/A)를 검출함으로써 확인될 수 있다 (참고 예를 들면, DeWan et al., Science 314: 989-992, 2006 (이의 전체 내용은 본원에 참조로 편입됨).
본 발명의 항체를 이용하여 진단될 수 있는 예시적 장애는, 비제한적으로, HtrA-관련 장애, 안구 장애, 보체-관련 장애, 및 자간전증을 포함한다.일부 경우에서, 안구 장애는 비제한적으로 하기를 포함한다: 예를 들어, 습식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 습식 AMD 포함) 및 건식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예컨대, 지도상항위축 (GA)) 포함)을 포함하는 AMD, 당뇨성 망막병증 (DR), 조숙 (ROP)의 망막병증, 또는 결절 맥락막 혈관병증 (PCV).
일부 구현예에서, 자간전증은 본 발명의 항체를 이용하여 진단될 수 있다. 일부 구현예에서, HtrA1의 참조 수준에 비해 대상체로부터 유래된 샘플에서 HtrA1의 증가된 수준은 대상체가 자간전증을 갖거나, 이에 민감하다는 것을 나타낼 수 있다. 참고: 예컨대, Teoh et al. Placenta 36(9):990-995, 2015. 일부 구현예에서, 혈청 HtrA1 수준은 본 발명의 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 다른 구현예에서, 태반 HtrA1 수준은 본 발명의 항체를 이용하여 검출될 수 있다.
특정 구현예에서, 표지된 항-HtrA1 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(예를 들면, 형광성, 발색성, 전자-밀도, 화학발광성, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예를 들면, 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 표지는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레신 및 그 유도체, 로다민 및 그 유도체, 단실, 엄벨리페론, 루세리페라제, 예를 들면, 반딧불 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 호스래디쉬 페록시다아제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들면, 글루코오스 옥시다제, 갈락토오스 옥시다제, 및 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 염료 전구체 예컨대 HRP를 산화하기 위해 과산화수소를 사용하는 효소로 커플링된, 헤테로사이클릭 옥시다제 예컨대 우리카제 및 잔틴 옥시다제, 락토페록시다아제, 또는 마이크로페록시다아제, 바이오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파아지 표지, 안정한 유리 라디칼, 등.
또 다른 구현예에서, 항체는 표지될 필요가 없으며, 이의 존재는 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 항체는 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대 경쟁적 결합 검정, 직접적인 및 간접적인 샌드위치 검정, 및 면역침강 검정에 이용될 수 있다. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
경쟁적 결합 검정은 항체의 제한된 양으로 결합에 대하여 시험 샘플 분석물로 경쟁하는 표지된 표준의 능력에 좌우된다. 시험 샘플에서 항원의 양은 항체에 결합되는 표준의 양에 반비례한다. 결합되는 표준의 양 결정을 용이하게 하기 위해, 항체는 일반적으로 경쟁 이전 또는 이후 불용화되어, 항체에 결합되는 분석물 및 표준이 미결합된 채로 남아있는 분석물 표준 및 으로부터 편리하게 분리될 수 있도록 한다.
샌드위치 검정은 2 항체의 이용을 포함하고, 각각은 검출되는 단백질의 상이한 면역원성 부분, 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 샌드위치 검정에서, 시험 샘플 피분석물은 고형 지지체에 고정되는 제1 항체에 의해 결합되고, 그 후에 제2 항체는 피분석물에 결합하고, 따라서 불용성 3-부 복합체를 형성한다. 참고: 예를 들면, 미국 특허 번호 4,376,110. 제2 항체는 검출가능한 모이어티로 자체 표지될 수 있거나 (직접적인 샌드위치 검정) 검출가능한 모이어티로 표지되는 항-면역글로불린 항체를 이용하여 측정될 수 있다 (간접적인 샌드위치 검정). 예를 들어, 샌드위치 검정의 하나의 유형은 ELISA 검정이고, 이 경우에 검출가능한 모이어티는 효소이다.
면역조직화학을 위하여, 샘플은 신선하거나 냉동될 수 있거나 파라핀에 포매될 수 있고 보존제 예컨대 포르말린으로, 예를 들어 고정될 수 있다.
G. 진단 키트
편의상, 본 발명의 항체 (예를 들면, 항-HtrA1 항체 또는 항-HtrA1/항-인자 D 항체)는 키트, 즉, 진단 검정 수행용 지침과 예정된 양으로 시약의 패키징된 조합으로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 키트는 효소에 의해 요구된 기질 및 보조인자 (예를 들면, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 다른 첨가제 예컨대 안정화제, 버퍼 (예를 들면, 블록 버퍼 또는 용해 버퍼) 및 동종은 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대량은 검정의 감수성을 실질적으로 최적화하는 시약의 용액에서 농도를 제공하기 위해 널리 다양해질 수 있다. 특히, 시약은, 용해시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.
H. 약제학적 제제
항체 또는 이들의 항체 변이체 (예를 들면, 본 발명의 항-HtrA1 항체 또는 항-HtrA1/항-인자 D 항체)의 치료 제형은 요망된 정도의 순도를 갖는 폴리펩타이드를 당해 분야에서 전형적으로 이용된 선택적인 "약제학적으로-허용가능한" 캐리어, 부형제, 또는 안정화제 (이들 모두는 일명 "부형제"이다)를 혼합시킴으로써 동결건조된 제형 또는 수용액으로서 저장을 위하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장제, 비-이온성 세제, 산화방지제 및 다른 여러 종류 첨가제. 참고: 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed. (1980). 상기 첨가제는 이용된복용량 및 농도에서 수령체에 비독성이어야 한다.
완충제는 생리적 병태에 가까운 범위에서 pH를 유지하도록 돕는다. 이들은 바람직하게는, 약 2 mM 내지 약 50 mM 범위에서 변하는 농도에서 존재한다. 본 발명과 함께 사용을 위하여 적당한 완충제는 하기를 포함한다: 이들의 양쪽 유기 및 무기 산 및 염 예컨대 시트레이트 버퍼 (예를 들면, 모노나트륨 시트레이트-디나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노나트륨 시트레이트 혼합물, 등), 석시네이트 버퍼 (예를 들면, 석신산-모노나트륨 석시네이트 혼합물, 석신산-수산화나트륨 혼합물, 석신산-디나트륨 석시네이트 혼합물, 등), 타르트레이트 버퍼 (예를 들면, 타르타르산-나트륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-칼륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물, 등), 푸마레이트 버퍼 (예를 들면, 푸마르산-모노나트륨 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디나트륨 푸마레이트 혼합물, 모노나트륨 푸마레이트-디나트륨 푸마레이트 혼합물, 등), 글루코네이트 버퍼 (예를 들면, 글루콘산-나트륨 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-칼륨 글리우코네이트 혼합물, 등), 옥살레이트 버퍼 (예를 들면, 옥살산-나트륨 옥살레이트 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-칼륨 옥살레이트 혼합물, 등), 락테이트 버퍼 (예를 들면, 락트산-나트륨 락테이트 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-칼륨 락테이트 혼합물, 등), 및 아세테이트 버퍼 (예를 들면, 아세트산-나트륨 아세테이트 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물, 등). 추가로, 인산염 버퍼, 히스티딘 버퍼 및 트리메틸아민 염 예컨대 Tris가 언급될 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 지체시키기 위해 첨가될 수 있고, 0.2%-1% (w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 본 발명과 함께 사용을 위하여 적당한 보존제는 하기를 포함한다: 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄, 벤즈알코늄 할라이드 (예를 들면, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 및 3-펜타놀.
"안정화제"로서 때때로 공지된, 등장화제는 본 발명의 액체 조성물의 등장성을 확보하기 위해 첨가될 수 있고 다가 당 알코올, 바람직하게는 3가 또는 더 높은 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 및 만니톨을 포함할 수 있다.
안정화제는 치료제를 가용화시키고 변성 또는 용기 벽에 대한 부착을 막도록 돕는 벌크화제로부터 첨가제로 기능이 망라할 수 있는 광범위한 부형제 카테고리를 의미한다. 전형적인 안정제는 하기일 수 있다: 다가 당 알코올 (상기 열거됨); 아미노산, 예컨대 아르기닌, 라이신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등; 유기 당류 또는 당 알코올, 예컨대 락토오스, 트레할로오스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이니시톨(myoinisitol), 갈락티톨, 글리세롤 등 (사이클리톨, 예컨대 이노시톨 포함); 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 폴리머; 황-함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티옥산, 나트륨 티오글라이콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤, 및 나트륨 티오설페이트; 저분자량 폴리펩타이드 (즉, 10 미만(<)의 잔기); 단백질 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐비닐피롤리돈; 모노사카라이드 예컨대 자일로스, 만노스, 푸룩토오스 및 글루코오스; 디사카라이드 예컨대 락토오스, 말토오스 및 수크로오스; 트리사카라이드 예컨대 라피노오스, 및 다당류 예컨대 덱스트란을 포함한다. 안정화제는 활성 단백질 중량부당 0.1 내지 10,000 중량 범위에서 존재할 수 있다.
비이온성 계면활성제 또는 세정제 (“적심제”로서 또한 알려져 있음)가 치료 단백질(예컨대, 항체)을 가용화시킬 뿐만 아니라 교반-유도된 응집에 대항하여 치료적 단백질을 보호하는데 도움을 주기 위해 첨가될 수 있으며, 이것은 또한, 단백질의 변성을 유발하지 않으면서, 제제가 전단 표면 스트레스에 노출되도록 허용한다. 적당한 비-이온성 계면활성제는 하기를 포함한다: 폴리소르베이트 (20, 80, 및 동종), 폴리옥사머 (184, 188, 및 동종), PLURONIC® 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (TWEEN®-20, TWEEN®-80, 및 동종). 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 바람직하게는 약 0.07 mg/mL 내지 약 0.2 mg/mL의 범위에서 존재할 수 있다.
추가의 여러 종류 부형제는 하기를 포함한다: 증량제, (예를 들면, 전분), 킬레이트제 (예를 들면, EDTA), 산화방지제 (예를 들면, 아스코르브산, 메티오닌, 및 비타민 E), 및 보조용매. 본원의 제형은 또한 치료되는 특정 명시를 위해 필요한 것으로서 둘 이상의 활성 화합물(바람직하게는 서로에게 부작용을 일으키지 않는 보완적 활성을 갖는 것)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 제형에서 HtrA1 결합 길항제 (예를 들면, 항-HtrA1 항체) 및 인자 D 결합 길항제 (예를 들면, 항-인자 D 항체)를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 예에서, 요망되지 않는 신생혈관형성과 관련된 안구 장애, 예컨대 습성 AMD 치료를 위하여, 항-혈관신생 요법, 예컨대 VEGF 길항제 요법, 예를 들어, LUCENTIS® (라니비주맙)을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 활성 성분은 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 배합되어 존재한다.
활성 성분은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐, 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로구형체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에 또는 매크로에멀젼에 포집될 수 있다. 그와 같은 기술은 하기에 개시된다: Remington ’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980).
서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체, 또는 이의 항체 변이체 또는 단편 (예컨대, 항원-결합 단편)을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐 형태로 있다. 지속-방출 매트릭스의 예는 하기를 포함한다: 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글라이콜산 코폴리머 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글라이콜산 코폴리머 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성되는 주사가능 마이크로구형체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산. 폴리머 예컨대 에틸렌비닐 아세테이트 및 락트산-글라이콜산이 100 일 넘는 동안 분자의 방출을 가능하게 하는 반면, 특정 하이드로겔은 더 짧은 시간 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 활성 성분이 장시간 신체 내에 남아 있을 때, 37 °C 에서 수분에 노출되면 변성되거나 응집되어, 생물학적 활성이 상실되고 그것의 구조가 변경될 수 있다. 이상적인 전략은 관여된 기작에 의존한 안정화를 위해 창안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-다이설파이드 교환을 통해 분자간 S--S 결합 형성이 되는 것이 발견된 경우, 안정화는 설피드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 적절한 첨가제를 이용해서 수분 함량을 제어하고, 그리고 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
I. 치료 방법 및 조성물
본 명세서에서 제공된 임의의 항-HtrA1 항체 (예를 들면, 항-HtrA1 항체 및 항-HtrA1/항-인자 D 항체)는 치료 방법에서 사용될 수 있다.
일 양태에서, 약제로서 사용을 위한 항-HtrA1 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 본 발명은 HtrA1-관련 장애 치료에서 사용을 위하여 항-HtrA1 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, HtrA1-연관된 장애는 습식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 습식 AMD 포함) 및 건식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예컨대, 지도상항위축 (GA) 포함)을 포함하는 AMD이다. 일부 경우에서, AMD는 진행성 건식 AMD (예를 들면, GA)이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 안구 장애 치료에서 사용을 위하여 항-HtrA1 항체를 제공한다. 일부 경우에서, 안구 장애는 하기이다: (초기, 중간, 및 진전된 습성 AMD를 포함하는) 습성 (삼출성) AMD 및 (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예를 들면, GA)를 포함하는 건조 (비삼출성) AMD를 포함하는, AMD; 당뇨성 망막병증 (DR) 및 다른 허혈-관련된 망막증; 내안구염; 포도막염; 맥락막 혈관신생 (CNV); 조숙증으로 인한 망막병증 (ROP); 결절 맥락막 혈관병증 (PCV); 당뇨병성 황반 부종; 병리적 근시; 폰 힙펠-린도우병; 눈의 히스토플라마증; 망막 중심 정맥 폐색 (CRVO); 각막 신생혈관형성; 또는 망막 신생혈관형성. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD (예컨대, 진행성 건식 AMD (예컨대, GA))이다.
또 다른 양태에서, 치료 방법에서 사용을 위한 항-HtrA1 항체가 제공된다. 특정 경우에서, 본 발명은 HtrA1-연관된 장애를 갖는 대상체의 치료 방법에서 사용하기 위한 항-HtrA1 항체를 제공하며, 이는 항-HtrA1 항체의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, HtrA1-연관된 장애는 습식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 습식 AMD 포함) 및 건식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예컨대, GA 포함)을 포함하는 AMD이다. 일부 경우에서, AMD는 진행성 건식 AMD (예를 들면, GA)이다.
또 다른 경우에서, 본 발명은 안구 장애를 갖는 대상체의 치료 방법에서 사용하기 위한 항-HtrA1 항체를 제공하며, 이는 항-HtrA1 항체의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 안구 장애는 하기이다: (초기, 중간, 및 진전된 습성 AMD를 포함하는) 습성 (삼출성) AMD 및 (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예를 들면, GA)를 포함하는 건조 (비삼출성) AMD를 포함하는, AMD; DR 및 다른 허혈-관련된 망막증; 내안구염; 포도막염; CNV; ROP; PCV; 당뇨병성 황반 부종; 병리적 근시; 폰 힙펠-린도우병; 눈의 히스토플라마증; CRVO; 각막 신생혈관형성; 또는 망막 신생혈관형성. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD (예컨대, 진행성 건식 AMD (예컨대, GA))이다.
일부 경우에서, 본 발명은 대상체에서 망막 또는 광수용체 세포 변성 억제에서 사용을 위하여 항-HtrA1 항체를 제공한다. 기타 경우에서, 본 발명은 대상체의 눈에서 HtrA1 세린 프로테아제 활성을 억제하기 위한 항-HtrA1 항체를 제공한다. 상기 구현예 중의 임의의 것에 따라 "대상체"는 인간일 수 있다.
본 발명은 약제의 제작 또는 제조에서의 항-HtrA1 항체의 용도를 제공한다. 예를 들어, 일 사례에서, 약제는 HtrA1-관련 장애의 치료용이다. 추가 경우에서, 약제는 HtrA1-연관된 장애를 갖는 대상체에게 유효량의 약제를 투여하는 단계를 포함하는, HtrA1-연관된 장애를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 약제의 선행 용도 중 임의의 것에서, 상기 방법은 예를 들어, 하기 기재된 바와 같이 적어도하나의 추가의 치료제의 유효량을 개체에게 투여함을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, HtrA1-연관된 장애는 습식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 습식 AMD 포함) 및 건식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예컨대, GA 포함)을 포함하는 AMD이다. 일부 경우에서, AMD는 진행성 건식 AMD (예를 들면, GA)이다.
또 다른 경우에서, 약제는 안구 장애를 갖는 대상체에게 유효량의 약제를 투여하는 단계를 포함하는, 안구 장애를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 일부 경우에서, 안구 장애는 하기이다: (초기, 중간, 및 진전된 습성 AMD를 포함하는) 습성 (삼출성) AMD 및 (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예를 들면, GA)를 포함하는 건조 (비삼출성) AMD를 포함하는, AMD; DR 및 다른 허혈-관련된 망막증; 내안구염; 포도막염; CNV; ROP; PCV; 당뇨병성 황반 부종; 병리적 근시; 폰 힙펠-린도우병; 눈의 히스토플라마증; CRVO; 각막 신생혈관형성; 또는 망막 신생혈관형성. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD (예컨대, 진행성 건식 AMD (예컨대, GA))이다.
본 발명은 HtrA1-관련 장애의 치료 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 항-HtrA1 항체의 유효량을 HtrA1-연관된 장애를 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, HtrA1-연관된 장애는 습식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 습식 AMD 포함) 및 건식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예컨대, GA 포함)을 포함하는 AMD이다. 일부 경우에서, AMD는 진행성 건식 AMD (예를 들면, GA)이다. 추가 경우에서, 방법은 아래에 기재된 바와 같은 유효량의 적어도 하나의 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법 중의 임의의 것에 따라 "대상체"는 인간일 수 있다.
본 발명은 안구 장애의 치료 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 항-HtrA1 항체의 유효량을 안구 장애를 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 안구 장애는 하기이다: (초기, 중간, 및 진전된 습성 AMD를 포함하는) 습성 (삼출성) AMD 및 (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예를 들면, GA)를 포함하는 건조 (비삼출성) AMD를 포함하는, AMD; DR 및 다른 허혈-관련된 망막증; 내안구염; 포도막염; CNV; ROP; PCV; 당뇨병성 황반 부종; 병리적 근시; 폰 힙펠-린도우병; 눈의 히스토플라마증; CRVO; 각막 신생혈관형성; 또는 망막 신생혈관형성. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD (예컨대, 진행성 건식 AMD (예컨대, GA))이다.
본 발명은 필요로 하는 대상체에서 HtrA1-관련 장애, 안구 장애, 및/또는 보체-관련 장애의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 HtrA1 결합 길항제 및/또는 인자 D 결합 길항제의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, HtrA1-관련 장애 또는 보체-연관된 장애는 안구 장애이다. 일부 구현예에서, 안구 장애는 AMD, 당뇨 망막병증, 맥락막 신생혈관형성 (CNV), 포도막염, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린도우병, 눈의 히스토플라마증, 중심 망막 정맥 폐색, 각막 혈관형성, 및 망막 신생혈관형성으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 경우에서, 안구 장애는 습식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 습식 AMD 포함) 및 건식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예컨대, GA 포함)을 포함하는 AMD이다. 일부 경우에서, AMD는 진행성 건식 AMD (예를 들면, GA)이다. 임의의 선행 구현예에서, HtrA1- 결합 길항제는 항-HtrA1 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 임의의 항-HtrA1 항체 또는 이들의 항원-결합 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-결합 항체 단편은 Fab, Fab’-SH, Fv, scFV, 및 (Fab’)2 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원-결합 항체 단편은 Fab이다. 일부 구현예에서, 상기 Fab는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역 (예컨대, 상부 힌지) 중 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, Fab 중쇄 불변 영역은 위치 221 (EU 넘버링)에서 종결한다. 일부 구현예에서, 위치 221에서 아미노산 잔기는 아스파르트산 잔기이다. 일부 구현예에서, Fab의 중쇄 불변 영역은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 156. 일부 구현예에서, Fab는 IgG1 Fab이다. 일부 경우에서, 인자 D 결합 길항제는 항-인자 D 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 본원에 기술된 항-인자 D 항체 중 임의의 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 HtrA1-연관된 장애, 안구 장애, 및/또는 보체-연관된 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, HtrA1 및 인자 D 또는 이의 항원-결합 항체 단편 둘 모두에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, HtrA1-관련 장애 및/또는 보체-연관된 장애는 안구 장애이다. 일부 경우에서, 안구 장애는 습식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 습식 AMD 포함) 및 건식 AMD (초기, 중간, 및 진행성 건식 AMD (예컨대, GA 포함)을 포함하는 AMD이다. 일부 구현예에서, AMD는 진행성 건식 AMD (예를 들면, GA)이다. 이중특이적 항체는 본 명세서에서 기재된 임의의 항-HtrA1 항체로부터 유래되는 HtrA1에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함할 수 있다. 이중특이적 항체는 본 명세서에서 기재된 임의의 항-인자 D 항체로부터 유래되는 인자 D에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-결합 항체 단편은 Fab 단편 또는 (Fab')2 단편이다.
본 명세서에서 기재된 및/또는 당해 분야에 공지된 임의의 항-인자 D 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 임의의 선행 방법 또는 용도에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서, 항-인자 D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 6개의 HVR을 포함할 수 있다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYAX1DFKG (서열 번호: 110) (여기서 X1 은 Asp 또는 Glu임); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVX1N (서열 번호: 111) (여기서 X1 는 Asn 또는 Ser임); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTX1IX2X3DMN (서열 번호: 112) (여기서 X1 은 Asp 또는 Ser이고, 그리고 X2 는 Asp 또는 Glu이며, 그리고 X3 은 Asp 또는 Ser임); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSX1SLPYT (서열 번호: 114), 여기서 X1 은 Asp 또는 Glu이다. 일부 경우에서, 항-인자 D 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 6개의 HVR을 포함한다: (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: GYTFTNYGMN (서열 번호: 109); (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: WINTYTGETTYADDFKG (서열 번호: 115); (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: EGGVNN (서열 번호: 116); (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: ITSTDIDDDMN (서열 번호: 117); (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: GGNTLRP (서열 번호: 113); 및 (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: LQSDSLPYT (서열 번호: 118). 일부 구현예에서, 항-인자 D 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다: (a) 서열 번호: 119의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열 번호: 120의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 도메인 및 (b)에서와 같은 VL 도메인. 일부 경우에서, VH 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 119. 일부 경우에서, VL 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 120. 일부 경우에서, 항-인자 D 항원-결합 항체 단편은 Cas 레지스트리 번호 1278466-20-8를 갖는 람팔리주맙이다.
본 발명의 항체가 포유동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 하나의 구현예에서, 항체는 전임상 데이터 수득의 목적을 위하여, 예를 들어 비인간 포유동물에 투여된다. 치료받는 예시적 비인간 포유동물은 전임상 연구가 수행되는 비인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 (예를 들면, 마우스 및 랫트) 및 다른 포유동물을 포함한다. 상기 포유동물은 항체로 치료되는 질환용 동물 모델로 확립될 수 있거나 관심 항체의 독성을 연구하는데 사용될 수 있다. 각각의 이들 구현예에서, 용량 단계적 확대 연구는 포유동물에서 수행될 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에서 사용을 위해, 본원에서 제공된 임의의 항-HtrA1 항체를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 약제학적 제형은 본원에서 제공된 임의의 항-HtrA1 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 제형은 본원에서 제공된 임의의 항-HtrA1 항체 및, 예를 들면, 아래에서 기재된 바와 같이 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.
본 명세서에서 기재된 임의의 치료 용도 및 방법에서, 항-HtrA1 항체는 Fab일수 있다. 일부 구현예에서, 상기 Fab는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역 (예컨대, 상부 힌지 영역) 중 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, Fab 중쇄 불변 영역은 위치 221 (EU 넘버링)에서 종결한다. 일부 구현예에서, 위치 221에서 아미노산 잔기는 아스파르트산 잔기이다. 일부 구현예에서, Fab의 중쇄 불변 영역은 하기의 아미노산 서열을 포함한다: 서열 번호: 156. 일부 구현예에서, Fab는 IgG1 Fab이다.
안구 질환 또는 병태의 예방 또는 치료를 위한 본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제)는, 비제한적으로, 예를 들어, 안구, 안구내, 및/또는 초자체내 주사, 및/또는 공막주변 주사, 및/또는 테논낭하 주사, 및/또는 상맥락막 주사, 및/또는 점안제 및/또는 연고의 형태로 국소 투여를 포함하는, 임의의 적당한 수단에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 항체는, 참조문헌 예컨대 Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006)에 기재된 것을 포함하는, 유리체에 화합물의 서방성을 허용하는 디바이스 및/또는 데포로서 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 초자체내로 전달될 수 있다. 하나의 예에서, 디바이스는 시간의 장기적인 기간 동안 화합물을 방출시키는 미니 펌프 및/또는 매트릭스 및/또는 수동 확산시스템 및/또는 캡슐화된 세포의 형태일 수 있다 (Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006). 비제한적으로, 국소, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 비강내, 및 병소내 투여를 포함하는, 투여의 다른 방법은 또한 사용될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.
안구, 안구내, 또는 초자체내 투여용 제형은 당해 분야에 공지된 부형제를 이용하여 그리고 방법에 의해 제조될 수 있다. 효율적인 치료용 중요한 피쳐는 눈을 통한 적절한 침투이다. 약물이 국소적으로 전달될 수 있는, 눈의 앞쪽의 질환과 달리, 망막 질환은 전형적으로 더욱 부위-특이적 접근법에서 유익하다. 점안제 및 연고는 드물게 눈의 뒷쪽을 침투하고, 혈액-안구 장벽은 안구 조직에 전신으로 투여된 약물의 침투를 방해한다. 따라서, 망막 질환, 예컨대 AMD 및 CNV를 치료하기 위한 약물 전달용 선택 방법은 전형적으로 직접적인 초자체내 주사이다. 초자체내 주사는 환자의 병태, 그리고 전달된 약물의 특성 및 반감기에 의존하는 간격에서 일반적으로 반복된다. 안구내 (예를 들면, 초자체내) 침투를 위하여, 일반적으로 더 작은 크기의 분자가 바람직하다.
눈은 안구 약물 전달을 도전적으로 만들 수 있는 많은 생체물리학적 및 해부 특징을 갖는다. 예를 들어, 혈액-안구 장벽은 감염으로부터 눈을 보호하기 위한 방어 메커니즘이지만, 동시에, 특히 눈의 안구 후부에서 질환에 대하여, 약물이 침투하는 것을 어렵게 한다. 결과적으로, 고-용량 투여는 효능을 개선하기 위해 약물의 현장 생체이용률 (예를 들면, 안구 체류 시간)을 달성 및 유지하도록 종종 요망된다. 그 동안에, 눈의 뒷쪽에서 제한된 공간은 전달되는 약물 용적을 제약하여, 차례로 고 농도 제형으로 전달되는 약물을 선호할 수 있다.
안구 장애 (예를 들면, AMD (예를 들면, 지도형 위축증))을 가진 환자는 또한 치료제의 지효성/서방성 전달로부터 유익해질 수 있다. 덜 빈번한 투약은 환자에 개선된 편의를 제공할 것이고, 감소된 감염률의 잠재적인 이점 및 증가된 임상 효능을 가질 것이다. 고용량 약물의 조절 방출은 또한 약물 부작용을 최소화할 수 있다. 지속성 전달용 2 유망한 시스템은 PLGA-기반 고체 이식물 및 이식가능 포트 전달 시스템 (PDS)이다. 양쪽 시스템은 시간의 연장된 기간 동안 0차 근접 방출 동력학을 제공하기 위한 잠재력을 갖는다. PLGA 이식물에 대하여, 단백질 약물은 소수성 폴리머 매트릭스에서 캡슐화되고 약물 방출은 폴리머의 느린 가수분해를 통해 달성된다. 방출 속도는 약물 부하, 폴리머 소수성, 또는 폴리머 분자량 변화에 의해 제어될 수 있다. PDS는 유리체에 방출이 티타늄 프릿을 포함하는 다공성 금속 막에 의해 제어되는 보충가능한 디바이스이다. 저장소가 낮은 용적을 갖기 때문에, 고 단백질 농도는 PDS로 효과적인 전달에 요구된다.
고 농도 및 지효성 전달에 더하여 또는 대신에, 약물의 증가된 생체이용률 (예를 들면, 안구 체류 시간)은 번역후 변형에 의해 달성될 수 있거나 용이하게 될 수 있고, 여기서 단백질 약물은 천연 또는 합성 폴리머 예컨대 폴리시알릴화, HES화 (하이드록시에틸 전분으로 콘주게이션) 및 PEG화와 공유적으로 콘주게이션된다. 참고: 예를 들면, Chen et al., Expert. Opin . Drug Deliv . 8:1221-36, 2011; Kontermann, BioDrugs 23:93-109, 2011. PEG화, 단백질에 폴리머 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공유결합은 항체 단편 치료제의 반감기 연장에 특히 유용한 양호하게-확립된 기술이다. Jevsevar et al., Biotech. J. 5:113-128, 2010.
약물이 노출되는 병태는 사용된 전달 시스템에 의존하여 다양하다. 고체 PLGA 이식물에 편입을 위하여, 동결건조된 또는 분무 건조된 약물은 사용된다. 이식물은 약물이 90℃를 접근하는 온도에 간단히 노출되는 정도로 핫-용융 압출 공정을 이용하여 생산된다. 약물이 방출의 지속기간 동안 고체 상태로 남아있어도, PLGA의 열화는 낮은 pH 환경에 약물을 노출시킬 수 있다. 그에 반해서, PDS로 전달된 약물은 액체 상태에서 고 농도로 유지되고 생리적 이온 강도 및 pH에서 환원성 환경으로서 특성규명되는 유리체에 노출된다.
특정한 안구 장애 또는 병태의 치료에서 효과적일 항체 또는 이들의 항체 변이체의 양은 장애 또는 병태의 성질에 의존할 것이고, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 가능하다면, 시험관내 먼저, 그리고 그 다음 인간에서 시험에 앞서 유용한 동물 모델 시스템에서 본 발명의 약제학적 조성물 및 용량-응답 곡선을 결정하는 것이 바람직하다.
추가의 적당한 투여 수단은 비경구, 폐내, 및 비강내, 그리고 국부 치료를 위하여 요망하는 경우, 병소내 투여를 포함한다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은, 투여가 잠시 또는 만성인지를 부분적으로 의존하여, 임의의 적합한 경로, 예를 들면, 주사로, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사로 될 수 있다. 이로써 제한되는 것은 아니지만, 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투약 스케쥴이 본원에서 시도된다. 일부 경우에서, 항-HtrA1 항체는, 정맥내로, 근육내로, 피내로, 경피로, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개골내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 기관내, 척추강내, 비강내, 질내, 직장내, 국소, 종양내, 복강내, 복막으로, 심실내, 복강내, 피하, 결막하, 소포내, 점막, 심막내, 탯줄내, 안와내, 경구, 국소적으로, 경피로, 흡입에 의해, 주사에 의해, 이식에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 직접 국부 관류욕 표적 세포에 의해, 카테터에 의해, 세정에 의해, 크림으로 또는 지질 조성물로 투여할 수 있다.
안구 장애 (예를 들면, 보체-관련 안구 장애), 예컨대 AMD 또는 CNV의 치료의 효능은 안구내 질환 평가에 통상적으로 사용된 다양한 종점에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 시력 손실은 평가될 수 있다. 시력 손실은, 비제한적으로, 예를 들어, 기준선부터 요망된 시점까지 최상의 정정 시력 (BCVA)에서 평균 변화에 의한 측정 (예를 들면, BCVA가 초기 치료 당뇨 망막병증 연구 (ETDRS) 시력 챠트 및 4 미터의 시험 거리에서 평가에 기반되는 경우), 기준선에 비교된 요망된 시점에서 시력으로 15 문자 미만으로 손실하는 대상체의 비율 측정, 기준선에 비교된 요망된 시점에서 시력으로 15 문자 초과 또는 동등으로 이득하는 대상체의 비율 측정, 요망된 시점에서 20/2000 또는 더 악화된 시력 스넬렌 등가를 가진 대상체의 비율 측정, NEI 시각적 기능 설문 측정, 예를 들면, 플루오레신 혈관조영술, 및 동종에 의해, 요망된 시점에서 CNV의 누출의 양 및 CNV의 크기 측정을 포함하는, 본 명세서에서 기재된 및/또는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 비제한적으로, 예를 들면, 눈 검사 수행, 안구내 압력 측정, 시력 평가, 슬릿램프 압력 측정, 안구내 염증 평가, 및 동종을 포함하는, 안구 평가는, 예를 들면, 실시될 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 용량(단독으로 사용될 때 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 병용하여 사용될 때)은 치료대상 질환의 유형, 항체 유형, 질환의 중증도 및 경과, 상기 항체의 투여가 예방 목적인지 아니면 치료 목적인지 여부, 이전 요법, 상기 환자의 임상 병력 및 상기 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 상기 항체는 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 상기 환자에게 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 항체의 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예컨대, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.8 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 또는 10 mg/kg)은 예를 들어, 하나 이상의 별도의 투여 또는 연속 주입에 의한 것이든 상관 없이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 일부 구현예에서, 사용된 항체는 하기이다: 약 0.01 mg/kg 내지 약 45 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 35 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 0.01 mg/kg 내지 약 1 mg/kg. 한 통상적인 1일 투여량은 상기 지칭한 요인에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 병태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다.
일부 경우에서, 본 발명의 항-HtrA1 항체의 고정 용량은, 예를 들어, 눈에 투여된다. 일부 경우에서, 본 발명의 항-HtrA1 항체의 약 0.1 mg 내지 약 10 mg 또는 약 5-15 mg가, 예컨대, 약 0.1 mg/눈 내지 약 0.5 mg/눈, 약 0.5 mg/눈 내지 약 1 mg/눈, 약 1 mg/눈 내지 약 1.5 mg/눈, 약 1.5 mg/눈 내지 약 2 mg/눈, 약 2 mg/눈 내지 약 2.5 mg/눈, 약 2.5 mg/눈 내지 약 3 mg/눈, 약 3 mg/눈 내지 약 3.5 mg/눈, 약 3.5 mg/눈 내지 약 4 mg/눈, 약 4 mg/눈 내지 약 4.5 mg/눈, 약 4.5 mg/눈 내지 약 5 mg/눈, 약 5 mg/눈 내지 약 5.5 mg/눈, 약 5.5 mg/눈 내지 약 6 mg/눈, 약 6 mg/눈 내지 약 6.5 mg/눈, 약 6.5 mg/눈 내지 약 7 mg/눈, 약 7 mg/눈 내지 약 7.5 mg/눈, 약 7.5 mg/눈 내지 약 8 mg/눈, 약 8 mg/눈 내지 약 8.5 mg/눈, 약 8.5 mg/눈 내지 약 9 mg/눈, 약 9 mg/눈 내지 약 9.5 mg/눈, 또는 약 9.5 mg/눈 내지 약 10 mg/눈으로 눈에 투여된다. 일부 경우에서, 항체는 약 0.1 mg/눈 내지 약 2 mg/눈, 약 0.1 mg/눈 내지 약 3 mg/눈, 약 0.1 mg/눈 내지 약 5 mg/눈, 약 0.1 mg/눈 내지 약 6 mg/눈, 약 0.1 mg/눈 내지 약 7 mg/눈, 약 0.1 mg/눈 내지 약 8 mg/눈, 약 0.1 mg/눈 내지 약 9 mg/눈, 약 0.1 mg/눈 내지 약 10 mg/눈, 약 0.5 mg/눈 내지 약 2 mg/눈, 약 0.5 mg/눈 내지 약 3 mg/눈, 약 1 mg/눈 내지 약 3 mg/눈, 또는 약 2 mg/눈 내지 약 5 mg/눈으로 사용된다. 일부 경우에서, 약 0.5 mg/눈, 약 1 mg/눈, 약 1.5 mg/눈, 약 2 mg/눈, 약 2.5 mg/눈, 약 3 mg/눈, 약 3.5 mg/눈, 약 4 mg/눈, 약 4.5 mg/눈, 약 5 mg/눈, 약 5.5 mg/눈, 약 6 mg/눈, 약 6.5 mg/눈, 약 7 mg/눈, 약 7.5 mg/눈, 약 8 mg/눈, 약 8.5 mg/눈, 약 9 mg/눈, 약 9.5 mg/눈, 약 10 mg/눈, 또는 초과의 항-HtrA1 항체의 고정 용량은 사용된다. 특정 경우에서, 예를 들어, 항-HtrA1 항체의 고정 용량은 약 2 mg/눈으로 투여된다.
일부 구현예에서, 용량은 1주 1회, 매 2주마다 1회, 매 3주마다 1회, 매 4주마다 1회, 매 5주마다 1회, 매 6주마다 1회, 매 7주마다 1회, 매 8주마다 1회, 매 9주마다 1회, 매 10주마다 1회, 매 11주마다 1회, 또는 매 12주마다 1회로 투여될 수 있다.
HtrA1 결합 길항제 (예를 들면, 본 발명의 항-HtrA1 항체)는 단독 또는 적어도 제2 치료 화합물과 조합으로 투여될 수 있다. HtrA1 결합 길항제 (예를 들면, 본 발명의 항-HtrA1 항체) 및 임의의 제2 치료 화합물의 투여는 동시에, 예를 들면, 단일 조성물로서 또는 동일한 또는 상이한 투여 경로를 이용하년 2 이상 구별되는 조성물로서 실시될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로 투여는 순차적으로, 임의의 순서로 실시될 수 있다. 특정한 구현예에서, 분 내지 일부터, 주 내지 개월까지 범위의 간격은 2 이상 조성물의 투여 사이 존재할 수 있다. 예를 들어, HtrA1 결합 길항제 (예를 들면, 본 발명의 항-HtrA1 항체)는 먼저, 그 다음 제2 치료 화합물이 투여될 수 있다. 그러나, HtrA1 결합 길항제 (예를 들면, 본 발명의 항-HtrA1 항체)에 앞서 제2 치료 화합물의 투여 또는 동시 투여는 또한 고려된다. 하나의 예에서, HtrA1 결합 길항제는 항-HtrA1 항체, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 또는 당해 분야에 공지된 임의의 항-HtrA1 항체이다. 하나의 예에서, 제2 치료 화합물은 인자 D 결합 길항제이다. 추가의 예에서, 인자 D 결합 길항제는 항-인자 D 항체, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 또는 당해 분야에 공지된 임의의 항-인자 D 항체이다. 특정 구현예에서, 항-인자 D 항체는 람팔리주맙이다. 추가 구현예에서, 항-인자 D 항체는 1-15 mgs의 용량으로, 예를 들어 10 mgs의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 람팔리주맙은 매 2주 1회, 매 3주 1회, 또는 매 4주 1회 투여된다. 특정한 구현예에서, 추가의 치료제는 눈에서 바람직하지 않은 신생혈관형성과 관련된 안구 장애, 예컨대, 예를 들어, 습성 AMD의 치료에 적당한 치료제이다. 적당한 치료제는, 예를 들어, 하기를 포함한다: 항-혈관신생 요법 예컨대 VEGF 길항제 (예를 들면, 항-VEGF 항체 및 항체 단편, LUCENTIS® (라니비주맙) 포함, 및 항-VEGFR1 항체 및 관련된 분자 (예를 들면, 아플리베르셉트 (VEGF 트랩-아이(Trap-Eye); EYLEA®)); 보체 시스템의 억제제, 예컨대 보체 인자 C2 길항제 (예를 들어, 항-CFC2 항체 포함); 및 항-염증제, 예컨대 IL-6 결합 길항제 (예를 들면, 토실리주맙 (ACTEMRA®) 및 EBI-031 (Eleven Biotherapeutics)). 다른 구현예에서, 바람직하지 않은 안구 신생혈관형성과 관련된 질환 또는 장애는 (예를 들면, MACUGEN™ 또는 VISUDYNE™을 가진) 항-HtrA1 항체 및 광역학적 요법의 조합을 포함할 수 있다.
상기 주지된 이러한 병용 요법은 병용 투여(둘 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제형에 포함되어 있는 경우), 및 별도의 투여를 포함하며, 이 경우, 본 발명의 억제제의 투여는 추가의 치료제 또는 치료제들의 투여 전, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다. 일 구현예에서, HtrA1 결합 길항제 (예컨대, 항-HtrA1 항체)의 투여 및 추가 치료제의 투여는 약 1달 내, 또는 약 1주, 2주 또는 3주 내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 내에 발생한다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법이 항-HtrA1 항체 대신 또는 그 이외에 본 발명의 면역접합체를 이용하여 수행될 수 있음이 이해된다.
J. 제조물품
본 발명의 다른 양상에서, 전술한 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 내포하는 제조 물품이 제시된다. 제조 물품은 용기 및 그 용기에 또는 관련된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적절한 용기에는 예로서, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 상기 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 그것만으로 있거나 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합되고 그리고 멸균된 접근 포트를 가질 수 있는 조성물을 수용한다 (예를 들면 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖춘 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중에 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택되는 병태의 치료에 사용됨을 나타낸다. 게다가, 제조 물품은 (a) 그 내부에 함유된 조성물을 갖는 제1 용기 (여기서 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함한다); 및 (b) 그 내부에 함유된 조성물을 갖는 제2 용기 (여기서 상기 조성물은 추가 세포독성 또는 달리 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 구현예에서 제품은 조성물이 특정 병태를 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 제조물품은 약제학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 정균 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
III.실시예
본 발명의 방법 및 조성물의 예가 하기되어 있다. 상기 제공된 일반적인 설명이 주어지면, 다양한 다른 구현예가 실시될 수 있다.
HtrA1을 결합시키는 안정적인, 고-효력, 고-친화성 항체의 개발
하기 실험의 목표는 HtrA1에 대하여 더 높은 효력 및 더 높은 친화성을 갖는 신규한 항-HtrA1 항체를 발견하는 것이었다.
먼저, mHtrA1 넉아웃 마우스는 생성되었다. HtrA1을 발현시키는 마우스로부터 하이브리도마를 생성하기 위한 초기 노력이 성공적이지 못했기 때문에, 아마 뮤린 및 인간 HtrA1 단백질이 98% 서열 동일성을 공유하기 때문에 넉아웃 마우스를 이용하는 것이 필요하였다.
다음으로, HtrA1 넉아웃 마우스는 mHtrA1의 프로테아제 도메인으로 면역화되었다. 수득한 하이브리도마는 ELISA에 의해 선별되었고 75 ELISA 양성 클론은 확인되었다. 75개 클론이 HtrA1 프로테아제 기질의 절단을 억제하는 능력에 대해 시험되었다. 75 클론 중 10개는 HtrA1 프로테아제 활성을 억제시키는 것으로 나타났다.
이들 클론 중 7개는 프로테아제 활성을 억제시키는, 인간 및 뮤린 HtrA1을 결합시키는, 그리고 muHtrA3 및 muHtrA4에 대해 muHtrA1을 선택적으로 결합시키는 그들의 능력에 기반된 추가 분석을 위하여 선택되었다. 이들 7 클론은 추가 선별을 경험하였고 4개는 대조군 항체 YW505.94와 비교된 경우 HtrA1에 대하여 개선된 효력을 갖는 것으로 밝혀진다. 이들 항체 중 2개, 15H6 및 9B12는, 효력 및 선택성을 포함하는, 그들의 바람직한 분자 프로파일에 기반된 추가 개발을 위하여 선택되었다.
선택된 항체의 초가변 영역은 아래 설명된 바와 같이 인간 프레임워크에 그라프팅되었다. 마우스 경쇄 버니어 참조의 중요성은 이들 잔기의 개별적으로 스와핑 및 인간 및 마우스 HtrA1에 결합 시험에 의해 15H6에 대하여 시험되었다. 1개의 치환은 결합을 폐기하였고, 2개는 결합을 감소시켰고, 2개는 뮤린 HtrA1에 단지 결합에 영향을 미쳤고, 3개는 결합에 상당한 영향을 갖지 않았다. 이들 3 치환은 항체 15H6.v1에 도입되어 항체 15H6.v2를 만들었다
15H6.v2는 그 다음 이의 안정성을 개선하기 위해 조작되었다. 산화 (HVR-L3내 W91), 클립핑 (HVR-LC내 N94 P95), 및 탈아미드화 (HVR-H2내 D55 G56)으로 이어질 수 있는 잠재적으로 불안정한 잔기는 확인되었다. W91의 치환은 실질적으로 결합에 영향을 주었다. 위치 N94에서 4 치환은 시험되었다. 이들 치환 중 2개는 결합에 영향을 주었지만, 2개는 추가의 분석을 위하여 선택되었다. 위치 D55에서 4개 치환을 시험하였다. 이들 치환 중 단 하나는 모 분자에 비교할만한 결합을 보여주었다.
다음 단계는 HtrA1에 h15H6.v2 결합의 친화성을 개선하는 것이었다. 제1 단계로서, 심도 서열분석은 h15H6.v2에 대하여 구조/기능 관계를 조사하는데 사용되었다. 상기 실험에서 시험된 많은 개별 돌연변이 중, 대략 19 개별 돌연변이는 HtrA1에 대하여 친화성을 개선한다고 밝혀졌다. 가장 낮은 오프-레이트를 가진 LC 및 HC 돌연변이의 조합을 함유하는 항체는 설계 및 시험되어, HtrA1에 대하여 개선된 효력 및 친화성을 갖는 변이체 항체의 확인을 초래하였다. 최상의 친화성 및 효력을 갖는 변이체는 또한 상기 기재된 안정화 치환을 도입하도록 조작되었다. 수득한 변이체 중, h15H6.v4는 HtrA1에 대해 최고 효력을 갖는 것으로 밝혀졌다.
HtrA1에 결합된 Fab 포멧내 h15H6.v4의 구조는 X-선 결정학 및 전자 현미경검사에 의해 결정되었다. 상기 구조적 분석은 h15H6.v4 Fab가 HtrA1 단백질의 "LA 루프"에 밀접하게 결합한다는 것을 드러냈다. h15H6.v4에 의해 결합된 에피토프는 대조군 항체 YW505.94에 의해 결합된 것과 구별된다. 본 발명이 임의의 특정한 기전에 의해 결합되는 것이 의도되지 않아도, HtrA1의 LA 루프와 h15H6.v4 사이 밀접한 상호작용이 YW505.94와 비교된 경우 상기 항체의 상당히 개선된 친화성 및 효력을 설명하는 것이 가능하다.
상기 기재된 실험은 아래 더 상세히 설명된다.
실시예 1: 하이브리도마 접근법을 사용한 항- HtrA1 항체의 생성
A. 배지 및 항체
CLONACELL™-HY 배지 B (Cat# 03802), 배지 C (Cat# 03803), 배지 D (Cat# 03804) 및 배지 E (Cat# 03805)는 스템셀 테크놀로지( StemCell Technologies)로부터 유래된 것이다. 전기융합에 사용된 CYTOFUSION® 배지 C (Cat# LCM-C)는 Cyto Pulse Sciences제이었다. 알로피코시아닌 (APC)-표지된 염소 F(ab')2 항-마우스 Ig는 SouthernBiotech (Cat#1012-11)제이었고, 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP)-접합된 염소 항-마우스 IgG Fc 항체는 Sigma제이었다. TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 일 성분 HRP 마이크로웰 기질 (Cat# TMBW-1000-01) 및 TMB 정지 시약 (Cat# BSTP-1000-01)은 BioFx Laboratories제이었다.
B. 마우스의 생체내 면역화
5 HtrA1-넉아웃 마우스 (HtrA1.noneo.BALB.ko.C1-3)은 총 12 부스트, 그 다음 포스페이트-완충된 식염수 (PBS)내 항원을 가진 2 사전-융합 부스트에 대하여 3 내지 4 일 간격으로 발바닥 주사 (2 ㎍/주사/마우스)에 의해 모노포스포릴 지질 A/트레할로오스 디코리노마이콜레이트 아쥬반트에 현탁된 정제된 His-태그된 재조합 뮤린 HtrA1 프로테아제 도메인 (본 명세서에서 muHtrA1-PD-His, 서열 번호: 153으로서 지칭됨; 참고 WO 2013/055998의 실시예 2)로 면역화되었다. 최종 부스트 3일 후에, 면역화된 마우스 비장 및 림프절로부터 림프구는 수확 및 단리되었다. muHtrA1-PD-His는 WO 2013/055998의 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제에 의한 주사를 위하여 제조되었다.
C. 세포 융합, 하이브리도마 선별, 및 서브클로닝
2 마우스 (번호 748 및 749)로부터 단리된 마우스 비장 세포는 Cyto Pulse CEEF-50 장치 (Cyto Pulse Sciences)를 이용하여 SP2/0 골수종 세포 (American Type Culture Collection)와 융합되었다. 간단히, CYTOFUSION® 배지 C로 2회 세정 이후, 단리된 비장 세포 및 SP2/0 세포는 1:1 비로 혼합되었고 그 다음 1천만 세포/ml의 농도로 CYTOFUSION® 배지 C에서 재현탁되었다. 전기 융합은 제조자의 지침에 따라 수행되었다. 융합된 세포는 7% CO2 인큐베이터에서 37℃에 밤새 CLONACELL™-HY 배지 C에서 배양되었다. 다음 날, 융합된 세포는 원심분리되었고 그 다음 10 ml CLONACELL™-HY 배지 C에서 재현탁되었고 그 다음 선택적 시약 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT)를 함유하는 90 ml 메틸셀룰로오스-기반 CLONACELL™-HY 배지 D와 부드럽게 혼합되었다. 세포는 40 x 100 mm 페트리 접시 (Cat#351029, Becton Dickinson)에 플레이팅되었고 7% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 성장하게 하였다. 10 일 인큐베이션 후, 1429 단일 하이브리도마 클론은 CLONEPIX™ 시스템 (Genetix, 영국)을 이용하여 수집되었고 200 ㎕/웰 CLONACELL™-HY 배지 E를 가진 15 x 96-웰 세포 배양 플레이트 (#353075, Becton Dickinson)에 전달되었다. 하이브리도마 배양 배지는 변화되었고, 3 일 후 하이브리도마 상청액은 muHtrA1-PD-His에 결합에 대하여 검정하기 위해 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 선별되었다.
ELISA는 표준 프로토콜에 따라 수행되었다. 간단히, 96-웰 미세적정 ELISA 플레이트 (Greiner, 독일)은 밤새 4℃에 0.05 M 카보네이트 버퍼 (pH 9.6)내 2 ㎍/ml로 100 ㎕/웰 muHtrA1-PD-His 또는 huHtrA1-PD-His (서열 번호: 154)로 코팅되었다. 세정 버퍼 (PBS내 0.05% TWEEN® 20, Sigma)로 3회 세정 후, 플레이트는 BSA와 100 ㎕ ELISA 검정 희석제로 차단되었다. 100 ㎕의 배양된 상청액 또는 희석된 정제 단클론성 항체 (mAbs)는 첨가되었고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 플레이트는 3회 세정되었고 1시간 동안 HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG Fc로 인큐베이션되었다. 3회 세정후, 결합된 효소는 5분 동안 TMB 기질 (BioFX Laboratories)의 100 ㎕/웰의 첨가에 의해 검출되었다. 반응은 중지 시약 (BioFX Laboratories)의 100 ㎕/웰 첨가, 그 다음 흡광도 650 nm (A 650 nm)에서 색상의 검출에 의해 중지되었다. 105 초기 ELISA-양성 상청액은 확인되었다. 3 일 동안 팽창 및 배양 후, 이들 클론은 105 클론 중 75개가 여전히 muHtrA1-PD-His에 결합에 대하여 ELISA-양성인 것을 확인하였던 차후의 ELISA에서 재선별되었다 (도 1a 및 1b). 다수의 이들 75 클론은 또한 인간 HtrA1 프로테아제 도메인에 결합하였다 (도 1a 및 1b).
75개 ELISA-양성 클론을, 하기에 의하여 기질의 절단을 억제하기 위한 하이브리도마 상청액의 능력을 측정하는 시험관내 검정을 사용하여 이후 시험하였다: 인간 HtrA1 프로테아제 도메인 (huHtrA1-PD-His; 서열 번호: 154). ENZCHEK® 녹색 형광 프로테아제 검정 (ThermoFisher Scientific) 검정은 사용되었다. 상기 검정은 기질로서 pH-비감수성 녹색 형광 BODIPY® FL 염료로 무겁게 표지되는 카세인 유도체를 사용한다. BODIPY® FL 염료의 형광은 전장 표지된 기질에서 분자내로 켄칭된다. huHtrA1-PD에 의한 기질의 절단은 형광 BODIPY® FL-표지된 펩타이드를 방출시켜, 형광 신호에서 증가를 초래한다 (도 2a). 간단히, 하이브리도마 상청액 및 HtrA1-PD (20 nM hHtrA1-PD; 40 ㎕ hHtrA1-PD 대 60 ㎕ 상청액)은 37℃에서 20분 동안 200 ㎕의 최종 용적으로 버퍼 (50 mM Tris, 200 mM NaCl, 0.25% CHAPS, pH 8.0)에서 인큐베이션되었다. BODIPY® FL-표지된 기질의 5 μg/ml는 첨가되었고, 형광 (밀리 상대 형광 유닛 (mRFU)/분)은 20분 동안 판독되었다. 상기 차단 검정을 이용하여, 75 클론 중 10개는 인간 HtrA1-PD-매개된 기질 절단을 억제시키는 것으로 밝혀졌다. 2B 및 2C). 도 3a 및 3b는 huHtrA1-PD에 비교된 muHtrA1-PD의 활성을 억제시키기 위해 클론의 서브셋의 능력의 비교를 보여준다.
제한 희석에 의한 단일 세포 서브클로닝의 적어도 2 라운드 후, 다양한 특징을 가진 7 클론 (20E2, 19B12, 12A5, 3A5, 15H6, 15E3, 및 19G10)은 규모확대되었고 상청액은 항체 정제 및 추가 평가를 위하여 수집되었다. 이들 클론은, 부분적으로, 시험관내 HtrA1 활성 및 muHtrA3 (19B12)에 결합을 억제시키는 능력에 기반하여 선택되었다. 7 클론은 또한 면역조직화학에서 muHtrA1을 검출하는 능력에 대하여 뿐만 아니라 (ELISA에 의해 평가된 바와 같이) 뮤린 HtrA3-PD 및 뮤린 HtrA4-PD를 결합시키는 능력에 대하여 시험되었다. 표 2는 이들 7 클론의 정성적 특성의 요약을 보여준다.
표 2: 항체 정제를 위하여 선택된 7 최종 클론의 특성
Figure pct00004
다음 단계는 상기 선택된 7 항체가 FRET 검정에서 측정된 바와 같이 HtrA1-매개된 절단을 억제시켰는지를 결정하는 것이었다.
하이브리도마 상청액은 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 그 다음 멸균된 여과 (0.2 ㎛ 기공 크기, Nalge Nunc International, NY, USA), 및 PBS 중 4℃에서 저장에 의해 정제되었다. 정제된 단클론성 항체는 기능성 검정에서 추가 시험 이전 ELISA 및 FACS에 의해 확인되었다. 정제된 mAbs의 이소형은 ISOSTRIP™ 마우스 단클론성 항체 이소형핑 키트 (Roche Diagnostics Corporation)에 의해 결정되었다.
정제된 항체는 FRET-기반 차단 검정 (예를 들면, H2-Opt 검정)에서 HtrA1의 활성을 억제시키는 능력에 대하여 시험되었다. 상기 검정에서, 형광 공명 에너지 전달 (FRET, 또한 Foerster 공명 에너지 전달로서 지칭됨) 기질의 절단을 억제시키는 항체의 능력은 결정되었다. 1600 Da의 분자량을 갖는, FRET 펩타이드 기질 H2-Opt는 공여체 Mca (7-메톡시쿠마린-4-일-아세틸) 및 수용체 (켄쳐) Dnp (N-2,4-디니트로페닐)을 포함한다. FRET 펩타이드 기질의 전장 서열은 하기이다: (Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK (서열 번호: 152). 온전한 펩타이드 기질에서, 켄칭 모이어티 Dnp는 Mca 공여체의 형광을 켄칭한다. FRET 펩타이드 기질의 단백분해 절단은 형광단 및 켄쳐를 분리시키고, 이로써 Mca 형광의 켄칭을 완화시키고 증가된 형광 신호를 초래한다 (도 4a). 검정은 실시예 3, 섹션 F에서 아래 기재된 H2-Opt 검정 조건을 이용하여 수행되었다. 형광 강도에서 시간-의존적 증가는 기질 가수분해의 정도에 관련된다. 항체는 5 nM, 50 nM, 및 500 nM의 농도에서 시험되었다. 정제된 항-HtrA1 항체 중 5개 (15H6, 19B12, 3A5, 12A5, 및 20E2)는 인간 및 뮤린 HtrA1-PD-매개된 기질 절단을 차단하는 능력을 유지하였다 (도 4b 및 4c).
다음으로, 전장 HtrA1-매개된 기질 절단을 억제시키는 정제된 항체의 능력은 시험되었다. 선행 단락에서 기재된 FRET-기반 차단 검정은 정제된 전장 (FL) muHtrA1 또는 huHtrA1을 이용하여 사용되었다. muHtrA1-FL 및 huHtrA1-FL은 WO 2013/055998의 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제되었다. 15H6 및 19B12를 포함하는, 정제된 항체는 huHtrA1-FL (도 5a-5b) 및 muHtrA1-FL (도 5c-5d)의 활성을 억제시켰다. 상기 검정에서, 클론 15H6은, 양성 대조군 항체 YW505.94의 IC50에 비교하여 대략 2-배 개선된, 0.7 nM의 IC50으로 huHtrA1-FL을 억제시켰다. 15H6은, 양성 대조군 항체 YW505.94와 비교하여 거의 5배 개선된, 1.1 nM의 IC50으로 muHtrA1-FL을 억제시켰다. 클론 19B12는 1.4 nM의 IC50으로 huHtrA1-FL을 억제시켰고 1.0 nM의 IC50으로 muHtrA1-FL을 억제시켰다. 선택된 항체는 섹션 D에서 아래 기재된 바와 같이 서열분석되었다. 이들 5개 항체의 서열이 하기에 나타난다: 도 6a 및 도 6b. 항체 중 2개, 15H6 및 19B12는, 이들의 효력 및 이들의 선택성을 포함하는, 그들의 바람직한 분자 프로파일에 기반된 추가 개발을 위하여 선택되었다. 이들 항체의 재포멧은 섹션 E에서 아래 기재된다,
D. 하이브리도마 클론으로부터 항체 서열분석
i. 96-웰 포멧에서 cDNA 단부의 5'-급속 증폭 (5'-RACE)를 이용하여 하이브리도마 세포로부터 클로닝 가변 영역 유전자 서열
각각의 하이브리도마 클론에 대하여, 약 25 ㎕의 로그-기-성장 세포 (0.5-1.0x106 세포/ml)는 조직 배양 플레이트로부터 96-웰 U-바닥 플레이트의 웰에 전달되었다. 150 ㎕의 차가운 1x PBS는 그 다음 5분 동안 1000 rpm에서 스피닝 다운 이전 세포를 세정하기 위해 첨가되었다. 상청액은 제거되었고 세포 펠렛은 차가운 25 ㎕의 1x PBS에서 재현탁되었다.
ii. 역전사 - 폴리머라제 사슬 반응 (RT- PCR ) 반응
하기로 구성되는 마스터 믹스는 에펜도르프 튜브에서 (50 웰에 대하여) 제조되었다: 2.5 ㎕의 RNASEOUT™ (Invitrogen #10777019), 12.5 ㎕의 10x 합성 버퍼 (5x SUPERSCRIPT® 버퍼), 12.5 ㎕의 디티오트레이톨 (DTT) (0.1M Invitrogen #P/NY00147), 6.25 ㎕의 dNTPs (10 mM Invitrogen #18427-013), 12.5 ㎕의 2.5% 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올 (NP-40), 2 mg/ml로 6.25 ㎕의 소 혈청 알부민 (BSA) (BioLabs #9001S), 25 ㎕의 RACE4muHC 프라이머 (PCR 등급 물에서 1:100) (Race 3 카파 프라이머는 경쇄 (LC) 서열분석을 위하여 치환되었다), 37.5 ㎕의 PCR-등급 물, 및 10 ㎕의 SUPERSCRIPT® 3 효소 (Invitrogen #18080-093). Race4muHC 축중 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 TTT YTT GTC CAC CKT GGT GCT GC (서열 번호: 139)이고, 여기에서 Y는 C 또는 T에 대하여 암호화하고, K는 G 또는 T에 대하여 암호화한다. Race 3 카파 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 GTA GAA GTT GTT CAA GAA G (서열 번호: 140)이다.
마스터 믹스의 2.5 ㎕/웰은 그 다음 96-웰 PCR 반응 플레이트에 전달되었다. 1 ㎕의 세포/웰은 플레이트에 첨가되었고, 플레이트는 간단히 30 초 동안 스피닝되었고, 그 다음 플레이트는 진탕되었다. 플레이트는 PCR 기계에 셋팅되었고 프로그램은 45℃에서 30분 그 다음 50℃에서 30 분으로 셋팅되었다. 플레이트는 플레이트 A로 표지되었다.
iii. 테일링 반응
10x 스톡 테일링 버퍼는 (50 웰에 대하여) 하기 성분으로 만들어졌다: 5 ㎕의 1 M MgCl2, 5 ㎕의 0.1M DTT, 5 ㎕의 1 M Tris pH 7.5, 10 ㎕의 100 mM dGTP, 및 25 ㎕의 PCR-등급 물.
작업 용액은 (50 웰에 대하여) 하기 성분으로 만들어졌다: 50 ㎕의 10x 스톡 테일링 버퍼, 312.5 ㎕의 PCR-등급 물, 및 12.5 ㎕의 300-유닛 말단 데옥시누클레오티딜 전달효소 (TdT) (Promega #M828A/C).
상기 작업 용액은 그 다음 7.5 ㎕/웰로 PCR 반응 플레이트 A에 첨가되었다. 플레이트 A는 그 다음 37℃에서 1시간 그 다음 65℃에서 5분 동안 PCR 기계에 배치되었다. 상기 플레이트를 상기 플레이트의 테일링(tailing)과 구별하기 위하여 플레이트 A/B로서 표지하였다.
iv. 제1 PCR 반응
하기로 구성되는 마스터 믹스는 15-mL 팰콘(Falcon) 튜브에서 (50 웰에 대하여) 제조되었다: 1050 ㎕의 PCR-등급 물, 500 ㎕의 5x GC cDNA PCR 반응 버퍼, 500 ㎕의 GC-용융 시약 (Clontech #S1091), 50 ㎕의 순방향 프라이머 DC5dn, 50 ㎕의 Race7muHC (LC용 Race 2 카파 프라이머), 50 ㎕의 dNTP (10 mM), 및 50 ㎕의 GC ADVANTAGE® 폴리머라제 (Clontech #S1088). Race7muHC 축중 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 하기이다: CAR GTC AMD GTC ACT GRC TCA G (서열 번호: 141), 여기에서 R은 A 또는 G를 암호화하고, M은 A 또는 C를 암호화하며, 그리고 D는 G 또는 A 또는 T를 암호화한다. Race 2 카파 프라이머 뉴클레오티드 서열은 하기이다: GAG GCA CCT CCA GAT GTT AAC (서열 번호: 142).
상기 마스터 믹스의 45 ㎕는 그 다음 신규한 PCR 반응 플레이트의 웰에 전달되었고 플레이트 A/B로부터 템플레이트의 1 ㎕는 그 다음 첨가되었다. 상기 플레이트는 그 다음 PCR 기계에 배치되었고, 아래 열거된 바와 같이, 감소하는 어닐링 온도를 가진 터치다운(Touchdown) PCR 방법하에 운영되었다. 상기 플레이트는 표지된 플레이트 C이었다.
터치다운 PCR 방법:
4분 동안 96°C
3 주기 [96°C (45초 동안), 64°C (30초 동안), 68°C (90초 동안)], 3 주기 [96°C (45초 동안), 61°C (30초 동안), 68°C (90초 동안)], 3 주기 [96°C (45초 동안), 58°C (30초 동안), 68°C (90초 동안)], 3 주기 [96°C (45초 동안), 57°C (30초 동안), 68°C (90초 동안)], 3 주기 [96°C (45초 동안), 55°C (30초 동안), 68°C (90초 동안)]
25 주기 [96°C (45초 동안), 52°C (30초 동안), 68°C (90초 동안)]
5분 동안 68°C, 이후 4°C로 말단 유지.
나중에, 3 ㎕의 PCR 생성물은 2% 에티듐 브로마이드 (EtBr) E-GEL®에서 운영되었고 밴드는 체크되었다. ExoI/새우 알칼리성 포스파타제 (SAP)는 10 ㎕/웰로 첨가되었고 37℃에서 45분 그 다음 85℃에서 15분 동안 PCR 기계에서 배치되었다. ExoI/SAP 마스터 혼합물을 50개 웰에 대해 제조하였다. 2.5 ㎕의 20 유닛/㎕ 엑소뉴클레아제 I (Fermentas #EN0582), 25 ㎕의 SAP (USB #70092Y), 472.5 ㎕의 PCR-등급 물. PCR 생성물의 1:4 희석액은 물에서 만들어졌다. Race7muHC 프라이머는 중쇄 (HC) 서열분석에 사용되었고 Race7.1muLC 프라이머는 LC 서열분석에 사용되었다. Race7.1muLC 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 하기이다: ACT GCT CAC TGG ATG GTG GGA AG (서열 번호: 143).
v. 겔 여과 및 질량 분광분석법 특성규명
겔 여과 분석을 위하여, 10 mL의 정제된 샘플은 이동상으로서 200 mM K2PO4, 250 mM KCl, pH 7.0을 이용하여 0.35 ml/분으로 TSK-GEL® Super SW3000 (4.6 mm 내부 직경 x 30 cm, TOSOH Bioscience)에 주사되었다. 대략 2 mg의 정제된 IgG는 20분 동안 37℃에서 50 mM 디티오레이톨로 환원되었고 PLRP-S 칼럼 (Agilent) 및 아세토니트릴 구배를 이용하는 온라인 역상 분리 이후 비행시간 (TOF) 질량 분광분석법 (Agilent LC/MS 6224)에 의해 분석되었다. 온전한 질량은 MassHunter Qualitative Analysis 소프트웨어 (Agilent)를 이용하여 수집된 m/z 스펙트럼의 최대 엔트로피 디콘볼루션에 의해 결정되었다.
vi. 결과
19B12, 20E2, 3A5, 12A5, 및 15H6에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)의 서열은 하기에서 보여진다: 도 6a. 19B12, 20E2, 3A5, 12A5, 및 15H6에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)의 서열은 하기에서 보여진다: 도 6b. 이들 클론은 특유의 중쇄 및 경쇄를 갖는다. 질량 분광분석법 데이터는 서열 데이터를 확증하였다 (참고 표 3 및 4) (참고: 예컨대, Bos et al. Biotechnol. Bioeng. 112(9): 1832-1842, 2015).
표 3: 질량 분광분석법에 의해 결정된 바와 같은 HC 질량
Figure pct00005
표 4: 질량 분광분석법에 의해 결정된 바와 같은 LC 질량
Figure pct00006
E. 항체 15H6 및 19B12의 재포맷화
i. 항체 15H6 및 19B12의 TOPO ® 클로닝
TOPO® 클로닝은 (상기 기재된) 5'-RACE PCR 생성물의 직접적인 서열분석으로부터 수득된 항체 클론 15H6 및 19B12의 가변 영역 서열을 확인하기 위해 수행되었다. TOPO® TA 클로닝 반응은 서열분석 (Invitrogen K4575-02) 매뉴얼용 pCR™4-TOPO® TA 클로닝 키트에서 기재된 바와 같이 실시되었다. 간단히, 2 ㎕의 PCR 생성물, 2 ㎕의 물, 1 ㎕의 pCR™4-TOPO® 벡터, 및 1 ㎕의 포함된 염 용액은 튜브에서 조합되었고, 혼합되었고 실온에서 5분 동안 인큐베이션되었다. 반응은 그 다음 얼음에서 배치되었고 상기 TOPO® 클로닝 반응의 2 ㎕는 ONE-SHOT® 화학적으로 능숙한 TOP10 에스케리치아 콜리 세포 (Invitrogen K4575-02)의 해동된 바이알에 첨가되었고 피펫팅 없이 혼합되었다. 반응은 얼음에서 5-30 분 동안 인큐베이션되었다. 세포는 그 다음 진탕 없이 42℃에서 30초 동안 열-충격받았다. 튜브는 얼음에 즉시 전달되었다. 실온 SOC 배지의 250 ㎕는 첨가되었다. 튜브는 캡핑되었고 1시간 동안 37℃에서 200 rpm으로 수평으로 진탕되었다. 다음으로, 각각의 전환으로부터 50 ㎕는 50 ㎍/ml의 카르베니실린을 함유하는 사전-가온된 LB 한천 플레이트에 확산되었다. 플레이트는 밤새 37℃에서 인큐베이션되었고, 콜로니는 다음 날 채집되었고, 플라스미드 정제는 수행되었다. 서열은 확인되었고 TOPO® 벡터에서 15H6 VH 및 VL 및 19B12 VH 및 VL 서열 각각을 함유하는 특정한 웰은 무제한 클로닝에서 공급원 벡터로서 사용을 위하여 선택되었다.
ii. mIgG2a에 무제한 클로닝
TOPO® 벡터에서 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 LC에 대하여 하기 방식으로 PCR 혼합물의 셋업에 의해 증폭되었다: 0.5 ㎕의 템플레이트 DNA (미니프렙 공급원 벡터), 4 ㎕의 15H6 VL 순방향 프라이머, 4 ㎕의 15H6 VL 역 프라이머, 2 ㎕의 10 mM dNTPs, 20 ㎕의 5x HF 버퍼, 1 ㎕의 PHUSION® 폴리머라제 (F-549L, Thermo Scientific, 2 U/㎕), 및 68.5 ㎕의 물. HC를 클로닝하기 위한 반응 혼합물을 동일 방식으로 셋업하고, 단, 15H6 VH 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하였다. 19B12 PCR 혼합물은 15H6 혼합물과 동일한 방식으로 셋업되었고 단, 19B12 프라이머는 사용되었다. 프라이머 서열은 아래와 같았다:
15H6 VL 순 프라이머 뉴클레오타이드 서열: GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAA ATT GTT CTC TCC CAG TCT CC (서열 번호: 144).
15H6 VL 역 프라이머 뉴클레오타이드 서열: GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC AGC CCG TTT GAT TTC CAG CTT GG (서열 번호: 145).
15H6 VH 순 프라이머 뉴클레오타이드 서열: GCA ACT GCA ACT GGA GCG TAC GCC CAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GG (서열 번호: 146).
15H6 VH 역 프라이머 뉴클레오타이드 서열: GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACG GTG ACT GAG GTT CCT TGA CCC (서열 번호: 147).
19B12 VL 순 프라이머 뉴클레오타이드 서열: GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA AAC ATT GTG GTG ACC CAA TCT CC (서열 번호: 148).
19B12 VL 역 프라이머 뉴클레오타이드 서열: GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC AGC CCG CTT TAT TTC CAG CTT GG (서열 번호: 149).
19B12 VH 순 프라이머 뉴클레오타이드 서열: GCA ACT GCA ACT GGA GCG TAC GCC GAG GTG AAG CTG GTG GAA TCT GGG GGA GG (서열 번호: 150).
19B12 VH 역 프라이머 뉴클레오타이드 서열: GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACG GTG ACT GCG GTT CCT TGA CCC (서열 번호: 151).
PCR 사이클링 조건은 아래와 같았다:
30초 동안 98°C
35 주기 [98°C (15초 동안), 68°C (30초 동안), 72°C (35초 동안)]
10분 동안 72 °C
증폭된 VH 및 VL은 15H6 LC에 대하여 하기 방식으로 PCR 혼합물 셋업에 의해 템플레이트 DNA를 증폭시키기 위한 프라이머로서 사용되었다: 1.25 ㎕의 템플레이트 mIgG2a PRK 벡터 DNA (미니프렙의 1:10 희석액), 0.5 ㎕의 15H6 VL PCR 생성물 (100-200 ng/㎕), 1 ㎕의 10 mM dNTPs, 10 ㎕의 HF 버퍼 (5x), 1 ㎕의 PHUSION® 폴리머라제, 및 35.75 ㎕의 물. 15H6 HC PCR 혼합물은 동일한 방식으로 셋팅되었고 단, 15H6 VH PCR 생성물이 사용되었다. 19B12 PCR 혼합물을 동일 방식으로 셋업하고, 단, 19B12 PCR 생성물을 사용하였다.
PCR 사이클링 조건은 아래와 같았다:
30초 동안 98°C
25 주기 [98 °C (15초 동안), 68 °C (30초 동안), 72 °C (4초 동안)]
10분 동안 72 °C
PCR 반응의 18 ㎕는 그 다음 신규한 튜브에 전달되었고, 튜브가 주기적으로 스피닝하면서, 37℃에서 2시간 동안 2 ㎕의 DpnI (#RO176L, NEB 20,000 U/ml)로 소화되었다. 30 ㎕의 능숙한 NOVABLUE SINGLES™ 능숙한 세포 (Novagen, 70181)은 제조자의 지침에 따라 1 ㎕의 DpnI 소화로 전환되었다. 간단히, 세포는 해동되었고, DNA는 첨가되었고, 세포는 5분 동안 얼음에서 인큐베이션된 다음 30초 동안 열-충격받았고, 다시 얼음에서 2 분 동안 배치되었고, 그 다음 SOC 배지 첨가되었다. 25 ㎕ 또는 50 ㎕는 50 ㎍/ml 카르베니실린-함유 플레이트에서 플레이팅되었고 밤새 37℃에서 셋팅되었다. 콜로니는 다음 날 채집되었고, 플라스미드 정제는 미니프렙을 통해 수행되었고, 플라스미드는 서열분석되었다.
iii. 항체 정제
293 세포 상청액으로부터 자동화 정제는 500 ml MCA96 헤드를 동반한 Tecan Freedom EVO® 200 액체 취급 시스템에서 수행되었다. 간단히, IgGs는 20 ml MABSELECT SURE™ 수지 (Glygen Corp., Columbia, Maryland & GE Healthcare, Pittsburgh, Pennsylvania)로 맞춤팩화된 팁 칼럼을 이용하여 포착되었다. 1 x PBS pH 7.4로 세정 이후, IgG는 160 ml 의 50 mM 인산 pH 3 속에 용출되었고 12 ml 의 20x PBS pH 11로 중화되었다. MABSELECT SURE™ 팁 칼럼은 0.1 M NaOH에 박리되었고 최대 15회 연속적인 사용을 위하여 1x PBS pH 7.4로 재생되었다. 유사하게, Fabs는 20mL GAMMABIND™ 플러스 수지 (Glygen Corp & GE Healthcare)로 팩킹된 팁 칼럼을 이용하여 포착되었고 그 뒤에 1x PBS pH 7.4로 세정되었다. Fabs는 190 mL의 10 mM 시트레이트, pH 2.9에 용출되었고, 19 ml 0.4 M Tris pH 8.7로 중화되었다. GAMMABIND™ 플러스(Plus) 팁 칼럼은 6 M 구아니딘으로 박리되었고 최대 15회 연속적인 사용을 위하여 1x PBS pH 7.4로 재생되었다.
iv. 재조합 15H6 및 19B12 항체는 최초 차단 활성을 유지시킨다
huHtrA1-FL 활성을 억제시키는 재조합 15H6 및 19B12 항체의 능력은 상기 섹션 C에 기재된 FRET 차단 검정을 이용하여 평가되었다. 양쪽 재조합 항체는 하이브리도마-유래된 항체로부터 결정된 바와 같이 그들의 최초 차단 활성을 유지하였다 (도 7a 및 7b). 재조합 15H6 항체는 대략 0.7 nM의 IC50을 가졌고, 한편 재조합 19B12 항체는, 하이브리도마-유래된 항체의 활성을 반영하였던, 대략 1.2 nM의 IC50을 가졌다 (도 7a 및 7b).
실시예 2: 항- HtrA1 하이브리도마 항체 15H6 및 19B12의 인간화
A. 항- HtrA1 항체 15H6의 인간화
(또한 m15H6으로서 지칭된) 뮤린 15H6 항체의 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH) 서열은 인간 항체 공통 서열로 정렬되었고, 인간 공통 경쇄 카파 I (huκ1) 및 인간 공통 중쇄 하위그룹 I (huVH1)은 가장 가까운 인간 프레임워크로서 확인되었다 (도 8a 및 8b).
m15H6 경쇄 및 중쇄의 초가변 영역 (HVRs)은 항체 클론 h15H6.v1을 생성하기 위해 각각의 초가변 영역에 대하여 별도의 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 Kunkel 돌연변이유발 (참고, 예를 들면, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382, 1987)에 의해, huκI 및 huVH1 공통 수용체 프레임워크, 각각에 그라프팅되었다 (도 8a 및 8b). 이 공정에서, m15H6 VL의 HVR-L1내 위치 24-34, HVR-L2내 50-56 및 HVR-L3내 89-97은 huκI 공통 수용체에 그라프팅되었고, m15H6 VH의 HVR-H1내 위치 26-35, HVR-H2내 49-65, 및 HVR-H3내 95-102는 huGI 공통 수용체에 그라프팅되었다. 풋테 및 윈터(Foote and Winter)가 항체 및 항원 복합 결정 구조를 분석하였고, HVR 구조를 조정할 수 있고 항원에 고정시키기 위해 미세조정할 수 있는, "버니어" 구역으로서 행동하는 프레임워크 잔기의 일부이도록 이들 위치를 찾아내었기 때문에 경쇄 (FR-L2)의 프레임워크 영역 2내 위치 46, 47 및 49, 및 중쇄 (FR-L3)의 프레임워크 영역 3내 위치 67, 69, 71, 및 93은 인간화 공정에서 또한 포함되었다 (Foote et al., J. Mol . Biol . 224:487-499, 1992) (도 8a-8b). 인간 및 뮤린 HrtA1용 Fab 포멧에서 m15H6 및 h15H6.v1의 결합 친화성은 아래 섹션 C의 하위 섹션 ii에 기재된 바와 같이 BIACORE™ 표면 플라스몬 공명 (SPR) 결합 분석에 의해 측정되었다 (도 9a-9d). 표 5는 이 분석의 결과를 요약한다.
표 5: HtrA1으로의 m15H6 또는 h15H6.v1의 동력학적 결합 분석
Figure pct00007
h15H6.v1에서 뮤린 버니어 잔기의 중요성을 추가로 평가하기 위해, 상기 항체는 파아지에서 표시되었고 개별 버니어 뮤린 잔기 (LC: P46, W47, S49; HC: A67, L69, A71 및 T93)은 점 돌연변이 변이체를 생성하기 위해 인간 잔기 (LC: L46, L47, Y49; HC: V67, I69, R71 및 A93)으로 대체되었다. 모든 7 변이체는 결합 친화성을 결정하기 위해 인간 또는 뮤린 HtrA1에 대해 파아지 경쟁 ELISA에 적용되었다 (파아지 IC50에 관하여, 참고 아래 섹션 C의 하위 섹션 i) 결과는 LC-P46L 변이체가 양쪽 인간 및 뮤린 HtrA1에 h15H6.v1 결합을 전적으로 폐기시켰다는 것을 나타냈다. LC-S49Y 변이체는 인간 및 뮤린 HtrA1과의 결합을 약 10-배 감소시켰다 (도 10a 및 10b). HC 변이체 HC-A67V 및 HC-T93A 양쪽은 인간 HtrA1이 아닌 뮤린 HtrA1에 결합에 단지 영향을 미쳤다 (도 10a 및 10b). 다른 변이체, LC-W47L, HC-L69I, 및 HC-A71R은 인간 및 뮤린 HtrA1에 결합에서 임의의 상당한 낙하를 보이지 않았다 (도 10a 및 10b). 따라서, 항체 클론 h15H6.v1은 하기 돌연변이 부가에 의해 추가로 조작되었다: 항체 클론 h15H6.v2를 생성하는 LC-W47L, HC-L69I, 및 HC-A71R (참고: 도 8a 및 8b).
항체 클론 h15H6.v2의 화학적 안정성 분석은 HVRs에서 몇 개의 잠재적으로 불안정한 잔기 또는 잔기 쌍을 확인하였다: HVR-L3내 W91 (산화), HVR-L3내 N94 P95 (클립핑), HVR-H2내 D55 G56 (이성질체화). 참고: 예컨대, 하기 실시예 4. HVR-L3내 W91 산화를 다루기 위해, 2 변이체 (LC-W91Y 및 LC-W91L)은 BIACORE™ SPR 결합 분석용 Fabs로서 생성 및 생산되었다. 아래 표 6에서 요약된, 결과는 위치 LC-W91이 결합 친화성에 중요하고, 치환이 인간 및 뮤린 HtrA1에 결합을 약 20-50 배만큼 영향을 주었다는 것을 나타냈다 (도 11a 및 11b).
표 6: HtrA1에 h15H6.v2 LC-W91 변이체의 동력학 결합 분석
Figure pct00008
HVR-L3의 위치 LC-N94 LC-P95에서 클립핑을 위하여, h15H6.v2의 4 변이체 ((또한 AP로서 지칭된) LC-N94A LC-P95, (또한 EP로서 지칭된) LC-N94E LC-P95, (또한 QP로서 지칭된) LC-N94Q LC-P95, 및 (또한 SP로서 지칭된) LC-N94S LC-P95)는 BIACORE™ 결합 분석용 Fabs로서 생성 및 생산되었다. 결과는 AP 및 EP 변이체가 인간 HtrA1에 유사한 결합 친화성을 보여주었고, QP 및 SP 변이체가 인간 HtrA1에 결합 친화성에서 대략 2-배수 감소를 가졌다는 것을 나타냈다 (도 12a-12b). 상기 분석의 결과를 요약하는 표는 하기에서 보여진다: 도 12b.
HVR-H2의 잔기 HC-D55 HC-G56에서 이성질체화를 위하여, 4 변이체 ((또한 AG로서 지칭된) HC-D55A HC-G56, (또한 EG로서 지칭된) HC-D55E HC-G56, (또한 SG로서 지칭된) HC-D55S HC-G56, 및 (또한 DA로서 지칭된) HC-D55 HC-G56A)는 BIACORE™ 결합 분석용 Fabs로서 생성 및 생산되었다. 결과는 단지 EG 변이체가 인간 HtrA1에 대해 비교할만한 결합 친화성을 보여주었고, 중쇄 위치 55 및/또는 56에서 변이체의 나머지가 인간 HtrA1에 결합 친화성에서 2- 내지 3-배수 감소를 가졌다는 것을 나타냈다 (도 13a 및 13b). 상기 분석의 결과를 요약하는 표는 하기에서 보여진다: 도 13b.
이들 결과에 기반하여, 변이체 AP (HVR-L3) 및 EG (HVR-H2)의 양쪽은 항체 클론 h15H6.v2의 서열에 도입되어 (또한 h15H6.v3 또는 AP_EG로서 지칭된) 항체 클론 h15H6.v2.APEG를 생성하였다 (참고: 도 8a 및 8b). 상기 클론은, (또한 EP_EG로서 지칭된) LC-N94E LC-P95 HC-D55E HC-G56; (또한 QP_EG로서 지칭된) LC-N94Q LC-P95 HC-D55E HC-G56; 및 (또한 SP_EG로서 지칭된) LC-N94S LC-P95 HC-D55E HC-G56을 포함하는, h15H6.v2의 몇 개의 다른 변이체와 또한 비교되었다. BIACORE™ SPR 분석은 h15H6.v2.APEG가 h15H6.v2에 비교할만한 결합 친화성을 유지하였다는 것을 나타냈다 (도 14a 및 14b). 상기 분석의 결과를 요약하는 표는 하기에서 보여진다: 도 14b. HtrA1 활성의 활성을 차단하는 이들 변이체의 능력은 실시예 1에 기재된 FRET-기반 차단 검정을 이용하여 결정되었다 (도 14c 및 14d). Fab 포멧으로 이들 변이체의 pI는 소프트웨어 프로그램 SMACK (참고: 예를 들면, Sharma et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 111: 18601, 2014)를 이용하여 또한 결정되었고 항-VEGF Fab 라니비주맙 (LUCENTIS®)에 비교된 바와 같이 표 7에서 보여진다.
표 7: H15H6.v2 변이체의 pI
Figure pct00009
B. 항- HrtA1 하이브리도마 항체 19B12의 인간화
(또한 m19B12로서 지칭된) 뮤린 항체 19B12의 VL 및 VH의 아미노산 서열은 인간 공통 서열로 정렬되었고, 인간 공통 경쇄 카파 IV (huκ4) 및 인간 공통 중쇄 하위그룹 III (huVH3)은 가장 가까운 인간 프레임워크로서 확인되었다 (도 15a-15b).
m19B12 경쇄 및 중쇄의 초가변 영역은, 본 명세서에서 항체 클론 h19B12.v1로서 지칭되는, 직접적인 HVR-그라프트 변이체를 생성하기 위해 각각의 초가변 영역에 대하여 별도의 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 Kunkel 돌연변이유발에 의해, huκ4 및 huVH3 공통 수용체 프레임워크, 각각으로 그라프팅되었다. 이 공정에서, 19B12 VL의 HVR-L1내 위치 24-34, HVR-L2내 50-56 및 HVR-L3내 89-97은 huκ4 공통 수용체에 그라프팅되었고, 19B12 VH의 HVR-H1내 위치 26-35, HVR-H2내 50-65, 및 HVR-H3내 95-102는 huGIII 공통 수용체에 그라프팅되었다 (도 15a-15b).
(Fab 포멧으로) m19B12 및 h19B12.v1의 결합 친화성은 아래 섹션 C의 하위 섹션 ii에 기재된 접근법을 이용하는 BIACORE™ SPR (도 16a-16d)를 이용하여 결정되었다. 이러한 분석의 결과가 아래 표 8에 요약되어 있다. 인간 HtrA1에 h19B12.v1의 평형 결합 상수 (KD)는 m19B12에 비교된 바와 같이 인간화 (표 8) 이후 대략 2-배 개선하였다.
표 8: HtrA1에 m19B12 또는 h19B12.v1의 동력학 결합 분석
Figure pct00010
C. 물질 및 방법
i. 파아지 IC50을 결정하기 위한 파아지 경쟁 ELISA
MAXISORP™ 미세적정 플레이트는 2시간 동안 PBS내 2 ㎍/ml에서 인간 HtrA1-PD-His로 코팅되었고 그 다음 실온에서 1시간 동안 PBST 버퍼 (PBS내 0.5% BSA 및 0.05% TWEEN®20)으로 차단되었다. 배양 상청액으로부터 정제된 파아지는 1시간 동안 조직-배양 미세적정 플레이트에서 PBST 버퍼내 연속으로-희석된 인간 또는 뮤린 HtrA1로 인큐베이션되었고, 그 후 80 ㎕의 혼합물은 미결합된 파아지를 포착하기 위해 15분 동안 인간 HtrA1-코팅된 웰에 전달되었다. 플레이트는 PBT 버퍼 (PBS내 0.05% TWEEN®20)으로 세정되었고, HRP-콘주게이션된 항-M13 항체 (Amersham Pharmacia Biotech)은 40분 동안 (PBST 버퍼내 1:5000) 첨가되었다. 플레이트는 PBT 버퍼로 세정되었고 테트라메틸벤지딘 기질 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) 첨가에 의해 개발되었다. 450 nm에서 흡광도는 용액내 표적 농도의 함수로서 플롯팅되어 파아지 IC50을 결정하였다. 이것은 파아지의 표면에서 표시된 Fab 클론용 친화성 추정치로서 사용되었다.
ii. BIACORE ™에 의한 항체 친화성 결정
단일-사이클 동력학에 의해 항-HtrA1 Fabs의 결합 친화성을 결정하기 위해, BIACORE™ T100 기기로 (SPR) 측정은 사용되었다. 간단히, 시리즈 S 센서 칩 CM5는 공급자의 지침에 따라 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS) 시약으로 활성화되었고, 스트렙타비딘 (Pierce)는 대략 2500 응답 유닛 (RU)을 달성하기 위해 커플링된 다음, 1 M 에탄올아민으로 비-반응된 그룹을 차단하였다.
동력학 측정을 위하여, 비오틴일화 인간 또는 뮤린 HtrA1-PD-His를 10 μl/min 유속에서 제1 주사하여 대략 150 RU를 3개 상이한 유동 세포 (FC)에서 포획하였고 (단, FC1 (참조로서 수행됨)을 제외하고), 그리고 이후 하한 (0.48 nM) 내지 상한 (300 nM)의 HBS-P 완충제 (0.01M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20) 중 항-HtrA1 Fab의 5-배 일련의 희석액이 주입되었다 (유속: 30 ㎕/분) 주사 사이 재생 없이 동일한 사이클에서 교대로. 센서그램은 기록되었고 참조 및 버퍼 삭감에 적용된 다음 BIACORE™ T100 평가 소프트웨어 (버전 2.0)에 의해 평가되었다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)가 샘플 일-대-일 랑뮤어 결합 모델을 사용하여 산출되었다. 평형 해리 상수 (KD)는 비율 koff/kon 으로서 산출하였다.
실시예 3: 항- HtrA1 항체 클론 h15H6.v2의 친화성 성숙
A. h15H6.v2 친화성 성숙 NNK 라이브러리 작제 및 패닝
항-HtrA1 항체 클론 h15H6.v2의 친화성을 추가로 개선하기 위해, 파아지 라이브러리는 32 코돈을 가진 모든 20 아미노산에 대하여 암호화하는 NNK 축중 코돈을 이용하여 무작위화된 어느 한쪽 경쇄 HVR 잔기 (즉, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3) 또는 중쇄 HVR 잔기 (즉, HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3) 잔기를 가진 1가 Fab 파아지 디스플레이용 Fab-호박색 포멧으로 변이체 h15H6.v2로부터 작제되었다 (참고: 예컨대, Brenner et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89(12): 5381-5383, 1992). 라이브러리는 각각의 3 경쇄 또는 중쇄 HVRs에서 하나의 NNK 돌연변이를 허용하도록 설계되었다. 수득한 라이브러리 DNA는 이. 콜라이 XL1 세포에 전기천공되어, 대략 109 변형체를 수득하였다. 일부 경우에서, 연질 무작위화 라이브러리 및 NNK 상위는 PCT/US2015/055672에 기재된 바와 같이 이용되었다. 파아지 라이브러리는 30분 동안 SUPERBLOCK™ PBS 버퍼 (Pierce)내 750 mM NaCl 및 0.05% TWEEN® 20으로 인큐베이션된 다음 HtrA1과 파아지 사이 비-특이적 충전된 상호작용을 감소시키기 위해 제1 라운드 패닝용 뉴트라비딘-포착된 바이오티닐화된 HtrA1-His 태그에 적용되었다. 선택 엄격성을 증가시키기 위해 용액내 경쟁자로서 1000x 비-바이오티닐화된 HtrA1로 바이오티닐화된 huHtrA1-PD-His 항원의 감소 농도를 이용하는 차후의 2 라운드에서. 참고: 도 17 (패닝 전략의 모식도에 대하여).
B. h15H6.v2 친화성 성숙 라이브러리의 심도 서열분석
심도 서열분석을 위하여, 파아지미드 이중가닥 DNA는 초기 파아지 라이브러리로부터 및 선택의 제3 라운드로부터 파아지미드 벡터를 운반하는 이. 콜라이 XL-1 세포에서 단리되었다. 정제된 DNA는 PHUSION® DNA 폴리머라제 (New England Biolabs)를 이용하는 VL 및 VH 영역의 제한된 사이클 PCR-기반 증폭용 템플레이트로서 사용되었다. PCR 생성물은 아가로스 겔 추출 및 클린업 (Qiagen Gel Extraction Kit)에 의해 정제되었다. 용출된 앰플리콘 DNA는, TRUSEQ™ DNA Sample Prep 키트 (Illumina)를 이용하여, 표준 Illumina 라이브러리 제조 방법으로 심도 서열분석 라이브러리 제조용 기준으로서 사용되었다. 어댑터-결찰된 라이브러리는, 앰플리콘의 전장을 포함하기 위해 적절한 경우 200bp 또는 300bp의 삽입 크기를 가진 쌍으로 된-단부 서열분석을 이용하여, PCR의 단일 사이클에 적용되고 Illumina MISEQ®에서 서열분석되었다.
C. h15H6.v2 친화성 성숙 라이브러리의 심도 서열분석 분석
서열분석 데이터는 통계적인 프로그래밍 언어 R (참고, 예를 들면, R Core Team, R: A language and environment for statistical computing, 2013) 및 ShortRead 패키지 (참고 Morgan et al., Bioinformatics 25(19): 2607-2608, 2009)를 이용하여 분석되었다. 2607-2608, 2009). 품질관리 (QC)는 확인된 HVR 서열에서 수행되었고, 여기에서 각각의 HVR 서열은 정확한 길이에 대하여 체크되었고 최대 1개 NNK 돌연변이 및 0개 비-NNK 돌연변이만을 운반하도록 허용되었다. 위치 중량 매트릭스는 모든 무작위화된 위치의 모든 돌연변이의 빈도를 계산함으로써 생성되었다. 각 돌연변이에 대한 농축은 다음 식을 사용하여 이전에 기재된 바와 같이(하기 참고), 분류된 샘플 중의 소정의 위치에서 소정의 돌연변이의 빈도를 분류되지 않은 샘플 중의 매우 동일한 돌연변이의 빈도로 나눔으로써 산출되었다 (Fowler et al., Nature Methods 7(9): 741-746, 2010). 경쇄 HVR 위치 및 중쇄 HVR 위치에서 각각의 돌연변이에 대하여 존재비를 도시하는 히트맵은 하기에서 보여진다: 도 18a 및 18b, 각각.
높은 존재비를 가진 경쇄 또는 중쇄 라이브러리로부터 단일 돌연변이는 Fab-Flag 태그 융합 단백질을 생성하기 위해 Flag 태그를 함유하는 포유동물 Fab 발현 작제물에 클로닝을 위하여 합성하도록 선택되었다. 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 플라스미드는 30 ml 발현을 위하여 293T 세포로 형질감염되었고 Fabs는 항-Flag 칼럼으로 정제되었다.
단일 돌연변이를 함유하는 정제된 Fabs는 BIACORE™ SPR 분석 (참고 섹션 D 아래)을 이용하여 결합 친화성을 결정하는데 사용되었다. 단일 돌연변이용 친화성 데이터는 표 9에 요약된다. 오프 레이트는, h15H6.v2에 대하여 약 0.0016의 값과 비교된, 약 0.0013 내지 약 0.004 범위이었다. 변이체 LC3 (LC-N31E)는 15H6.v2보다 2- 내지 3-배 오프-레이트를 개선하였다.
표 9: 심도 스캐닝 돌연변이유발에 의해 확인된 h15H6.v2 돌연변이의 결합 친화성
Figure pct00011
D. 추가 친화성 개선을 위한 선택된 변이체의 조합
중쇄 또는 경쇄 NNK 라이브러리로부터 대부분의 단일 돌연변이는 친계 클론 h15H6.v2보다 HtrA1에 결합 친화성을 개선하지 못했다 (표 9). 가장 느린 오프 레이트를 가진 변이체는 조합 돌연변이체를 생성하기 위해 양쪽 경쇄 (LC3, LC4, 및 LC7) 및 중쇄 (HC1, HC2, HC3, 및 HC5) 변이체로부터 선택되었다. 이들 조합 돌연변이체는 양쪽 변이체 경쇄 및 변이체 중쇄를 포함하였다. BIACORE™ 동력학 분석은 조합 돌연변이체를 이용하여 (섹션 C에 아래 기재된 바와 같이) 수행되었다. 조합 돌연변이체 LC3.HC3, LC3.HC1, 및 LC7.HC2는 친계 Fab (h15H6.v2)보다 2-3 배 개선된 친화성 개선을 가졌다 (표 10).
표 10: HtrA1에 결합하는 조합 돌연변이체의 동력학 분석
Figure pct00012
다음으로, LC 돌연변이체 (LC37=LC3_LC7, LC347=LC3_LC4_LC7) 및 HC 돌연변이체 (HC13=HC1_HC3, HC23=HC2_HC3)은 추가로 조합되었다. 이들 돌연변이체는 친화성 동력학 분석용 자기-절단 및 탈-아미드화를 피하기 위해 HVR-L3 N94A 및 HVR-H2 D55E 변이체 (즉, AP_EG, 참고 실시예 2) 편입에 의해 추가로 변형되었다.
APEG.LC3.HC1, APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4), APEG.LC37.HC13, APEG.LC37.HC23, APEG.LC347.HC13, 및 APEG.LC347.HC23은, 평균적으로, h15H6.v2보다 3- 내지 5-배 개선을 가진, 최상부 클론이었다 (도 20). 이들 변이체의 VL 및 VH 아미노산 서열은 하기에서 보여진다: 도 21a 및 21b, 각각. 이들 클론의 서열은 인실리코 분석을 이용하여 HVR-L3 W91에서 산화의 잠재적인 위험에 의해 분석되었다 (Sharma et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 111:18601, 2014). APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4), APEG.LC37.HC13, 및 APEG.LC347.HC13은 h15H6.v3과 동등한 위험으로서 등급화되었다. 다른 것은 h15H6.v2보다 더 높은 위험을 갖는다.
E. BIACORE ® SPR에 의한 Fab 친화성 계측
HtrA1용 선택된 Fab 변이체의 결합 친화성을 계측하기 위해, BIACORE™ T200 기기로 SPR 측정이 수행되었다. 간단히, 시리즈 S 센서 칩 CM5는 공급자의 지침에 따라 1-EDC 및 NHS 시약으로 활성화되었고, 항-His 항체는 200-300 응답 유닛 (RU)을 달성하기 위해 커플링된 다음, 1 M 에탄올아민으로 비-반응된 그룹을 차단하였다. 동력학 측정을 위하여, 대략 5 nM의 huHtrA1-PD-His는 10 ㎕/분 유량으로 먼저 주사되어, (참조로서 작용하였던) FC1을 제외하고, 2 상이한 유동 세포 (FC)에서 대략 100 RU를 포착하였다. 다음으로, 낮은 (0.8 nM) 내지 높은 (50 nM) HBS-P 버퍼 (0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20)내 Fab의 5-배 연속 희석액은 주사되었다 (유속: 30 μl/min). HtrA1에서 결합 반응은 블랭크 유동 세포로부터 RU의 차감에 의해 정정되었다. 센서그램은 기록되었고 참조 및 버퍼 삭감에 적용된 다음 BIACORE® T200 평가 소프트웨어 (버전 2.0)에 의해 평가되었다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)가 샘플 일-대-일 랑뮤어 결합 모델을 사용하여 산출되었다. 평형 해리 상수 (KD)는 비율 koff/kon 으로서 산출하였다.
F. HtrA1 FRET-기반 차단 검정 (H2-Opt 차단 검정)에서 h15H6.v2 변이체의 억제성 활성
선택된 친화성 성숙된 h15H6.v2 변이체는 HtrA1 활성을 억제시키는 능력에 대하여 시험되었다. H2-Opt 기질 ((Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK)를 이용하는 시험관내 FRET-기반 차단 검정은 수행되었다. 간단히, HtrA2용 기질로서 본래 기재된 (참고, 예를 들면, Martins et al., J. H2-Opt 차단 검정을 하기에 기술된 바와 같이 수행하였다: 미국 특허 출원 공보 번호 2013/0129743A1의 실시예 3 (이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 편입됨). 간단히, 펩타이드 H2-Opt (Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK) (서열 번호: 152) (HtrA2에 대한 기질로서 원래 기술됨) (참고: 예컨대, Martins et al., J. Biol . Chem . 278:49417-27, 2003)는 HBTU와 표준 커플링 절차를 이용하여 Fmoc-Lys(Boc)-wang 수지 상에서 합성되었다. Fmoc-Lys(DNP)--OH (Anaspec)는 P5' 위치에서 편입되었다. 펩타이드는 최대 P5 (Mca, 7-메톡시-쿠마린, Aldrich) 합성되었고 그 다음 실온에서 2시간 동안 트리플루오로아세트산, 트리이소프로플리실란 및 물을 이용하여 고형 지지체로부터 절단되었다. 펩타이드는 에틸 에테르로부터 침전되었고, 아세트산, 아세토니트릴, 물로 추출되었고 동결건조되었다. 조물질 표지된 펩타이드는 아세토니트릴/물을 이용하여 분취 역상 C18 칼럼에서 용해 및 정제되었다. 정제된 분획은 풀링되었고, 동결건조되었고, 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법 (PE/Sciex)에 의해 분석되었고 그들의 계산된 질량과 일치하는 것으로 밝혀졌다.
HtrA1은 37℃에서 20분 동안 검정 버퍼 (50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 0.25% CHAPS)에서 연속으로 희석된 항-HtrA1 항체로 96-웰 흑색 광학 하부 플레이트 (Nalge Nunc Int., Rochester, N.Y.)에서 인큐베이션되었다. DMSO내 펩타이드 기질 Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK (서열 번호: 152) (H2-Opt)의 10 mM 모액은 12.5 μM로 물에서 희석되었고, 37℃에서 사전-가온되었고 그 다음 반응 혼합물에 첨가되었다. 형광 신호 (여기 328 nm, 방출 393 nm)의 증가는 SPECTRAMAX® M5 마이크로플레이트 판독기 (분자 장치, Sunnyvale, Calif.)에서 측정되었고 H2-Opt 절단의 선형 속도 (mRFU/분)은 결정되었다.
도 22a는 상기 기재된 바와 같이 본질적으로 수행된 3 독립적인 H2-Opt 검정 실험의 결과의 요약을 보여준다. 대부분의 클론은, h15H6.v2에 대하여 약 0.39 nM에 비교된 경우, 약 0.4 nM 내지 약 0.5 nM의 범위에서 IC50 값을 가졌다. (또한 h15H6.v4로서 지칭된) 항-HtrA1 항체 APEG.LC3.HC3은 상기 검정에서 약 0.386 nM으로 최상의 IC50 값을 보여주었다 (도 22a). 도 22b는 상기 분석으로부터 대표적인 플롯을 보여준다. 일반적으로, 친화성 성숙된 h15H6.v2 변이체는 h15H6.v2에 비교된 HtrA1의 개선된 최대 억제를 보여주었고 (도 22a), 최대 억제 값은 약 78% 내지 약 96% 범위이었다.
FRET-기반 H2-Opt 차단 검정은, HtrA1 활성을 억제시키기 위해, h15H6.v4를 포함하는, h15H6.v2 변이체의 상이한 항체 포맷의 능력을 평가하는데 사용되었다. H2-Opt 검정은 상기 기재된 바와 같이 본질적으로 수행되었고, 단, 상기 검정 조건은 하기이었다: 1 nM huHtrA1-PD 효소, 1.25 μM H2-Opt 기질, 50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 0.25% CHAPS. 결과는 2000 s에서 상대 형광 유닛 (RFU)/초 속도 (50-1000 초) 또는 종점 RFU 값에 기반하여 분석되었다. 도 23a-23h는, huHtrA1-PD의 활성을 억제시키기 위해, IgG 또는 Fab 포맷으로 h15H6.v4와, Fab 포멧으로 h15H6.v2의 능력을 비교하는 예시적 독립적인 실험의 결과를 보여준다. 항-HtrA1 항체 YW505.94a (참고 WO2013/055988)은 양성 대조군으로서 작용하였다. 도 24a 및 24b는, RFU/s 접근법을 이용하여 분석된 3 독립적인 실험의 제1 세트로부터, IC50 및 IC90 결과의 요약을, 각각 보여준다. 도 25a 및 25b는, h15H6.v4 Fab에 대한 RFU 접근법 또는 RFU/s를 사용하여 분석된 3 독립적인 실험의 제2 세트로부터, IC50 및 IC90 결과의 요약을, 각각 보여준다.
G. 질량 분광분석법-기반 활성 검정에서 APEG . LC3.HC3 ( h15H6.v4 )의 차단 능력
온전한 전장 기질 (α-카세인)의 huHtrA1-PD-매개된 절단을 억제시키는 APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4)의 능력은 질량 분광분석법 (MS)-기반 활성 검정을 이용하여 평가되었다. 이 실시예에서, 항-HtrA1 항체 h15H6.v4는, (또한 Omi로서 공지된) HtrA2에 길항제로서 기재된, HtrA 프로테아제의 작은 분자 억제제, ucf-101에 비교되었다 (Cilenti et al., J. Biol . Chem . 278(13):11489-11494, 2003). 탠덤 질량 태그 (TMT) 동중 질량 태깅 표지는 h15H6.v4 또는 ucf-101의 존재하에 HtrA1에 의한 α-카세인 절단의 MS-기반 정량화에 이용되었다. α-카세인은 HtrA1에 의해 절단될 수 있는 3 P1' 잔기를 갖는다: Ser72, Thr95, 및 Ser157.
TMTDUPLEX™ 동중 질량 태깅 시약은 온전한 α-카세인의 정량화를 위하여 α-카세인 표준 및 검정 샘플을 차별적으로 표지하는데 사용되었다. TMTDUPLEX™ 시약은 일차 아민 (-NH2) 기의 공유, 비가역적 표지화를 위하여 NHS-활성화되는 동중 화합물의 세트 (즉, 동일한 질량 및 구조, 또한 동위원소 이성질체로 불림)이다. 각각의 동중 시약은, 샘플 확인 및 상대 정량화를 위한 탠덤 MS/MS 동안 특유의 리포터 질량을 초래하는, 질량 리포터 태그 모이어티에서 무거운 동위원소의 상이한 수를 함유한다.
100 mM 트리에틸암모늄 비카보네이트, 100 nM huHtrA1, 100 μg/mL α-카세인, 및 억제제 (즉, ucf-101 또는 h15H6.v4)는 18시간 동안 (소화된 용액) 37℃에서 인큐베이션되었다 (최종 용적 20 ㎕). 개별적으로, 유사한 용액은 억제제 없이 생성되었고 동일하게 (대조군 용액) 인큐베이션되었다. h15H6.v4 Fab는 3.12 nM 내지 100 nM 범위의 농도에서 시험되었고, 반면 양성 대조군 작은 분자 억제제 ucf-101은 2 nm 내지 250 nM 범위의 농도에서 시험되었다.
탠덤 질량 태그 (TMTDUPLEX™) 모액은 판매인 (Thermo Fisher Scientific)에 의해 권고된 바와 같이 생성되었다. 5 ㎕의 TMT-126은 소화된 용액에 첨가되었고 5 ㎕의 TMT-127은 대조군 용액에 첨가되었다. 실온에서 1 시간 인큐베이션 후, 상기 용액은 동등 용적 기준으로 조합되었다. 샘플은 LC-MS에서 운영되었고 더 높은-에너지 C-트랩 해리 (HCD)를 이용하여 가장 강렬한 이온 피크의 단편화에 의해 정량화되었고; 단편화 후 126/127의 리포터 이온 강도 비는 소화된 용액에서 농도를 결정하는데 사용되었다.
적정 곡선은 검정이 온전한 α-카세인을 정확하게 정량화하였다는 것을 보여주었다 (도 26b). 상기 검정에서, h15H6.v4 Fab는 약 45 nM의 IC50 (IC90 = 약 71 nM)으로 온전한 α-카세인의 huHtrA1-PD-매개된 절단을 억제시켰다. 상기 값은, 77 μM의 IC50을 가졌던, 작은 분자 억제제 ucf-101에 비교하여 현저하게 개선되었다.
H. 내인성 HtrA1 활성 검정에서 h15H6.v2 친화성 성숙된 변이체의 차단 능력
토끼 눈 모델에서 내인성 HtrA1 활성을 억제시키는 h15H6.v2 친화성 성숙된 변이체의 능력은 평가되었다. 내인성 HtrA1 활성 검정을 위하여, HtrA1-분비 세포 (인간 C32 흑색종 세포)로부터 배지는 HtrA1의 공급원으로서 사용되었다. 참고: 예컨대, Ciferri et al. Biochem J. September 18, 2015, DOI: 10.1042/BJ20150601. 내인성 검정에서, 내인성 HtrA1 및 재조합 HtrA1을 이용하는 H2-Opt 검정에서 관측된 상이한 IC50 값을 설명하는 것으로 간주되는, 재조합 HtrA1 H2-Opt 검정에 비교된 HtrA1의 대략 10-배 더 높은 농도가 있다는 것을 언급한다 (참고, 예를 들면, 도 28). 도 27a-27c는 내인성 HtrA1 검정으로부터 결과를 보여준다. 특히, 클론 APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4)는 약 80.1%의 최대 억제로 약 1.125 nM의 IC50을 가졌다 (도 27c).
I. 선택된 h15H6.v2 변이체용 특성의 요약
항-HtrA1 항체 클론 h15H6.v2의 선택된 유도체의 동력학 결합 및 억제성 활성은 BIACORE SPR 분석 및 FRET-기반 H2-Opt 활성 검정을 이용하여 비교되었다. 최대 억제를 결정하기 위해, 양성 및 음성 대조군은 0% 억제율 (효소 단독, 무 억제제) 및 100% 억제율 (무 효소)를 결정하는데 사용되었다. 이러한 비교의 결과는 하기에 요약된다: 도 28.
실시예 4: 항- HtrA1 항체의 분자 평가 분석
항-HtrA1 항체 클론 h15H6.v2, (또한 h15H6.v3으로서 지칭된) h15H6.v2.APEG, 및 (또한 h15H6.v4로서 지칭된) APEG.LC3.HC3은 안정성 특성에 대하여 분자 평가 (MA) 분석에서 시험되었다. 항-HtrA1 항체 클론 h19B12.v1은 또한 시험되었다. 간단히, 항-HtrA1 항체 (1 mg/ml)는 자유 라디칼을 생성하기 위해 공지된 작은 분자인, AAPH (2,2-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드)를 가진 화학적 조건 하에 (참고, 예를 들면,Ji et al., J. Pharm . Sci . 98(12):4485-4500, 2009), 뿐만 아니라 다양한 pH에서 열적 조건 하에 (40℃, pH 5.5에서 2-주 열적 스트레스 시험) (참고, 예를 들면, Zhang et al., J. Chromatography A 1272:56-64, 2013) 스트레스에 대하여 시험되었다.
표 11는 h15H6.v2 및 h15H6.v3에 대하여 MA 분석 결과 사이의 비교를 도시한다. 현저히, HVR-L3내 LC-W91은 양쪽 h15H6.v2 및 h15H6.v3 (약 84.5% 및 약 86.4%, 각각)에서 AAPH 스트레스 이후 산화를 증가시켰다. 표 12는 h15H6.v4에 대하여 MA 분석의 결과를 보여준다. 놀랍게도, h15H6.v4에 대하여 HVR-L3내 LC-W91에서 산화는, h15H6.v2 및 h15H6.v3에 대하여 산화에서 대략 84.5-86.4% 증가율에 비교된 AAPH 스트레스 이후 산화에서 26.5% 증가율 만으로, h15H6.v2 및 h15H6.v3에 비교하여 감소되었다. APEG.LC3.HC3이 h15H6.v3에 비교하여 단지 2 치환, 즉, FR-H1 영역에서 HC-T28K 및 HVR-L1에서 LC-N31E를 갖고, 이 둘 모두가 친화성을 개선하기 위해 도입되었고 이들 중 어느 것도 LC-W91의 산화에 영향을 줄 것으로 기대되지 않았기 때문에 상기 개선은 의외이었다. 상기 MA 분석에서 사용된 h15H6.v4 항체는 단일-칼럼 정제 절차를 이용하여 제조되었다. h15H6.v4용 MA 분석이 2-칼럼 정제 절차를 이용하여 제조된 항체를 이용하여 반복된 경우, LC-W91은 AAPH 스트레스하에 불안정한 것으로 보여졌다. 단일-칼럼 정제된 물질이 AAPH 스트레스 평가를 방해하였던 오염물질을 함유하였기 때문에 2-칼럼 정제를 이용하여 정제된 물질로 수행된 AAPH 스트레스 평가의 결과가 단일-칼럼 정제 절차에 의해 정제된 물질을 이용하여 수득된 결과와 상이하였다고 생각된다.
표 11: h15H6.v2 및 h15H6.v3의 MA 특성
Figure pct00013
표 12: h15H6.v4 ( APEG . LC3.HC3 )의 MA 특성
Figure pct00014
도 13은 항-HtrA1 항체 클론 h19B12.v1에 대한 MA 분석의 결과를 도시한다. HVR-H2내 HC-N52a HC-G53은, 탈아미드화에서 49% 증가율로, 불안정한 것으로 결정되었다. 따라서, h19B12.v1의 이들 HVR-H2 위치에서 치환 (예를 들면, HC-N52aE, HC-N52aS, HC-N52aS, 및 HC-N52a HC-G53A)는 안정성을 개선하는 것으로 기대된다.
표 13: h19B12.v1의 MA 특성
Figure pct00015
실시예 5: HtrA1에 결합된 h15H6.v4 Fab의 구조
HtrA1에 결합된 h15H6.v4 Fab의 구조는 X-선 결정학 및 전자 현미경검사에 의해 결정되었다. 결과는 h15H6.v4 Fab HtrA1 에피토프가 HtrA1의 LA 루프의 선회를 포함하는 아미노산에 의해 주로 형성되는 것을 실증하였다.
펩타이드 합성:
HtrA1 단백질의 영역에 대응하는 펩타이드는 당해 분야에 양호하게 공지된 방법을 이용하여 생성되었다. 예를 들어, 하기를 참고한다: Atherton, E., et al. (1978). J. Chem Soc. Chem. Commun. 13:537-539.
결정화:
0.15M NaCl, 20mM Tris pH 7.5내 10mg/ml로 h15H6.v4 Fab (1mL)는 HtrA1의 LA 루프에서 아미노산을 함유하는 1 mg의 펩타이드 (3 배 몰 과잉의 펩타이드/단백질)로 4℃에서 밤새 인큐베이션되었다. Fab-펩타이드 복합체는 2M 황산암모늄, 0.2M 아세트산칼륨을 이용하여 결정화되었다.
X-선 개량:
h15H6.v4 Fab/HtrA1 펩타이드 결정은 수확되었고 모액에 30% 글리세롤의 첨가 그 다음 액체 질소에 갑작스러운 액침으로부터 만들어진 동결-보호제 용액내 액침에 의해 회절 분석을 위하여 보존되었다. 데이터는 SSRL 빔라인 12-2에서 수집되었고 하기를 이용하여 가공되었다: XDS (Kabasch W (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr . 266:125-32). Fab-펩타이드 복합체용 분자 대체는 CCP4내 조사 프로브로서 Fab 구조를 이용하여 달성되었다 (Winn MD et al. (2011) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr . 67:235-42). 강성 바디 개량 후, Fo-Fc 밀도는 펩타이드에 대하여 보여질 수 있다. 루프 A (RKLPFSKREVPV) (PDB 3TJO)으로부터 HtrA1 프로테아제 도메인 잔기의 한 부분은 그 다음 본질적으로 하기에 기재된 바와 같이 밀도로 적합화되었다: Emsley et al. (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66:125-32.
다수 회의 피닉스(Phenix) 중 정제 (Adams PD et al. (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr . 66:213-21)가 이용되었다. 최종 회의 버스터(Buster) 중 정제 (Bricogne G et al. (2011)는 R 값을 R = 16.8%, Rfree = 19.8% 2.1Å 해상도로 제공하였다.
HtrA1에 결합된 Fab15H6.v4의 전자 현미경검사 ( EM ) 구조
EM 이미지형성을 위하여, 4 ㎕의 HtrA1-hFab15H6.v4 복합체는 새롭게 백열 방전된 연속 탄소 400-메쉬 구리 그리드 (Electron Microscopy Sciences)에서 30초 동안 인큐베이션되었다. 인큐베이션 후, 샘플은 2% (w/v) 우라닐 포르메이트 (SPI Supplies)의 용액을 이용하여 반대로 염색되었다. 과잉의 얼룩 용액은 왓트만 종이로 얼룩 제거되었고 그리드는 공기-건조되었다. HtrA1-Fab15H6.v4 샘플은 LaB6 필라멘트가 구비된 Tecnai-12 BioTween (FEI)에서 분석되었고 저용량 조건 하에 120keV에서 작동되었다. 이미지는 ×62,000 (2.22Å / 픽셀)의 명목 배율로 4k × 4k CCD 카메라 (Gatan Inc.)를 이용하여 수집되었다. 128px의 박스 크기를 갖는, 27346 입자는 EMAN2 분포에 일상적 포함된 e2dogpicker.py하에 이용가능한 스웜 알고리즘을 이용하여 반자동으로 채집되었다 (Tang L et al. (2007) J. Chem . Inf . Model. 47:1438-45). 이들 입자는 그 다음 소프트웨어 스위트 Relion을 이용하여 자유 2D 분류를 참조하게 되었다 (Scheres SH (2012) J. Struct . Biol.180:519-30). HTRA1 삼량체와 결합된 Fabs 사이 가요성이 제공되면, Relion의 3D 분류 알고리즘은 60Å의 해상도로 저역 여과된 HtrA1 삼량체의 결정 구조 (PDB ID 3TJO)를 개시 모델로서 이용하여 5 3D 용적을 생성하는데 사용되었다. 각각의 이들 용적은 Relion내 Refine3D 알고리즘을 이용하여 마지막으로 정제되었다. HTRA1 삼량체의 원자 밀도 및 Fab15H6.v4의 결정 구조는 키메라내 맵 알고리즘에서 적합화를 이용하여 EM 밀도로 적합화되었다 (Pettersen EF et al., 2004). J. Comput. Chem . 25:1605-12 (2004).
알라닌 치환을 이용하여 HtrA1에 결합된 Fab15H6.v4 Fab의 구조의 검증
상기 기재된 구조적 연구는 Fab15H6.v4 Fab가 HtrA1 단백질의 루프 "A"와 밀접하게 상호작용한다는 것을 실증하였다. 이를 확인하기 위해, (넘버링이 전구체 단백질의 넘버링에 대응하는) 인간 HtrA1 서열의 잔기 190-201에 대응하는 펩타이드는 합성되었고 상기 기재된 바와 같이 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 이용하여 h15H6.v4 Fab에 결합에 대하여 시험되었다. 펩타이드 (LA-pep1)은 0.4nM의 KD 값을 갖는 15H6.v4 Fab와 강한 결합 상호작용을 보여주었다. 참고: 표 14.
상기 펩타이드 서열내 알라닌 치환은 (LA-pep2, LA-pep5)를 감소시키거나 15H6.v4 Fab에 (LA-pep3, LA-pep4, LA-pep5) 결합을 완전히 폐기시킨다. 이들 생체물리학적 결과는 상기 및 도 32a 및 32b에 기재된 구조적 연구와 일치하고 15H6.v4용 결합 에피토프가 HtrA1의 LA 루프의 선회를 포함하는 아미노산에 의해 주로 형성되는 것을 입증한다.
그에 반해서, YW505.94 Fab는 LA-pep1에도, 임의의 돌연변이체 형태에도 결합하지 않았다 (표 14).
이것은, YW505.94 Fab 및 h15H6.v4가 HtrA1에 결합하기 위해 서로 경쟁한다는 사실에도 불구하고, 이들 2 Fabs의 에피토프가 구별된다는 것을 나타낸다. YW505.94 Fab 에피토프는 루프 B 및 C에서 집중되고, 반면에 15H6.v4 Fab의 에피토프는 LA 루프의 팁을 주로 포함한다.
본 발명이 임의의 특정한 기전에 의해 결합되는 것이 의도되지 않아도, HtrA1의 LA 루프와 h15H6.v4 사이 밀접한 상호작용이 YW505.94와 비교된 경우 상기 항체의 상당히 개선된 친화성 및 효력을 설명하는 것이 가능하다.
표 14: 15H6.v4 Fab으로의 , 그리고 YW505.94 Fab으로의 HtrA1 루프 A (LA) 펩티드 결합
Figure pct00016
*NB - 최대 1μM 검출된 결합 없음, **친화성 손실 = KD 돌연변이체/KD 야생형.
비록 전술한 발명이 이해의 명확함을 위해 설명 및 실시예로서 일부 상세히 기재되었지만, 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학적 문헌의 개시내용은 명확히 그 전체가 참고로 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. F. Hoffmann-La Roche AG KELLEY, Robert F. KIRCHHOFER, Daniel K. LAI, Joyce LEE, Chingwei V. LIANG, Wei-Ching LIPARI, Michael T. LOYET, Kelly M. SAI, Tao VAN LOOKEREN CAMPAGNE, Menno WU, Yan FUH, Germaine <120> ANTI-HtrA1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> 50474-117WO4 <150> US 62/411,113 <151> 2016-10-21 <150> US 62/345,669 <151> 2016-06-03 <150> US 62/248,871 <151> 2015-10-30 <160> 160 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Met or Leu <400> 1 Asp Ser Glu Xaa His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Glu or Asp <400> 2 Gly Val Asp Pro Glu Thr Xaa Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Gly Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Glu or Asn <400> 4 Arg Ala Ser Ser Ser Val Xaa Phe Ile His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Asn, His or Glu <400> 5 Ala Thr Ser Xaa Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Ser or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ala or Asn <400> 6 Gln Gln Trp Xaa Ser Xaa Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Asp Ser Glu Met His 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Gly Val Asp Pro Glu Thr Glu Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Arg Ala Ser Ser Ser Val Glu Phe Ile His 1 5 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Val Asp Pro Glu Thr Glu Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Glu Phe Ile 20 25 30 His Trp Tyr 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Ile 35 40 45 Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Glu Ser Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 135 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 135 Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Ser Ile Glu Ser Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 136 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 136 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Glu Arg Glu Gly Gly Val Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 137 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 137 Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Ala Asp Phe Val Phe Thr Ile Asp Asn Met Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 138 <400> 138 000 <210> 139 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 139 tttyttgtcc accktggtgc tgc 23 <210> 140 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 140 gtagaagttg ttcaagaag 19 <210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 141 cargtcamdg tcactgrctc ag 22 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 142 gaggcacctc cagatgttaa c 21 <210> 143 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 143 actgctcact ggatggtggg aag 23 <210> 144 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 144 gcaactgcaa ctggagtaca ttcacaaatt gttctctccc agtctcc 47 <210> 145 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 145 ggatacagtt ggtgcagcat cagcccgttt gatttccagc ttgg 44 <210> 146 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 146 gcaactgcaa ctggagcgta cgcccaggtc cagctgcagc agtctgg 47 <210> 147 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 147 gggcccttgg tggaggctga ggagacggtg actgaggttc cttgaccc 48 <210> 148 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 148 gcaactgcaa ctggagtaca ttcaaacatt gtggtgaccc aatctcc 47 <210> 149 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 149 ggatacagtt ggtgcagcat cagcccgctt tatttccagc ttgg 44 <210> 150 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 150 gcaactgcaa ctggagcgta cgccgaggtg aagctggtgg aatctggggg agg 53 <210> 151 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 151 gggcccttgg tggaggctga ggagacggtg actgcggttc cttgaccc 48 <210> 152 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> N-term Mca <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Lys(DNP) <400> 152 Ile Arg Arg Val Ser Tyr Ser Phe Lys Lys 1 5 10 <210> 153 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 153 Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Met His 1 5 10 15 Gln Ser Thr Ala Ala Ala Gly Gln Gly Gln Glu Asp Pro Asn Ser Leu 20 25 30 Arg His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Pro 35 40 45 Ala Val Val His Ile Glu Leu Tyr Arg Lys Leu Pro Phe Ser Lys Arg 50 55 60 Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile Val Ser Glu Asp Gly 65 70 75 80 Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn Lys Asn Arg Val Lys 85 90 95 Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val 100 105 110 Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys 115 120 125 Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu 130 135 140 Phe Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr 145 150 155 160 Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu Gly Leu 165 170 175 Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ile Ile Asn Tyr 180 185 190 Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly 195 200 205 Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser 210 215 220 Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser 225 230 <210> 154 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 154 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys Tyr Asn Phe 20 25 30 Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Pro Ala Val Val His Ile Glu 35 40 45 Leu Phe Arg Lys Leu Pro Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Phe Ile Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala 65 70 75 80 His Val Val Thr Asn Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly 85 90 95 Ala Thr Tyr Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile 100 105 110 Ala Leu Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu 115 120 125 Gly Arg Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly 130 135 140 Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr 145 150 155 160 Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp 165 170 175 Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro 180 185 190 Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val 195 200 205 Thr Ala Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe 210 215 220 Leu Thr Glu Ser 225 <210> 155 <211> 480 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 155 Met Gln Ser Leu Arg Thr Thr Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Pro Ser Leu Ala Leu Pro Ser Gly Thr Gly Arg Ser Ala Pro 20 25 30 Ala Ala Thr Val Cys Pro Glu His Cys Asp Pro Thr Arg Cys Ala Pro 35 40 45 Pro Pro Thr Asp Cys Glu Gly Gly Arg Val Arg Asp Ala Cys Gly Cys 50 55 60 Cys Glu Val Cys Gly Ala Leu Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu 65 70 75 80 Gly Pro Cys Gly Glu Gly Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro 85 90 95 Ala Ser Ala Thr Val Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys 100 105 110 Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Lys Thr Tyr Thr Asn 115 120 125 Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser Glu Lys Leu Arg Gln 130 135 140 Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly Ala Cys Gly Gln Gly Gln Glu 145 150 155 160 Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val 165 170 175 Glu Lys Ile Ala Pro Ala Val Val His Ile Glu Leu Tyr Arg Lys Leu 180 185 190 Pro Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile 195 200 205 Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn 210 215 220 Lys Asn Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala 225 230 235 240 Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ile 245 250 255 Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu 260 265 270 Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu 275 280 285 Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly 290 295 300 Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp 305 310 315 320 Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp 325 330 335 Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser 340 345 350 Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser His 355 360 365 Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ile Gly 370 375 380 Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp 385 390 395 400 Arg His Arg Asp Phe Pro Asp Val Leu Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu 405 410 415 Val Ile Pro Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp 420 425 430 Val Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Thr Ala Asn Asp Val 435 440 445 Ser Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Thr Leu Asn Met Val Val Arg Arg 450 455 460 Gly Asn Glu Asp Ile Val Ile Thr Val Ile Pro Glu Glu Ile Asp Pro 465 470 475 480 <210> 156 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 156 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 100 <210> 157 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 157 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 158 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 <210> 159 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 159 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Glu Phe Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Ser 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ala Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 160 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 160 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Val Asp Pro Glu Thr Glu Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Claims (47)

  1. HtrA1 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 상기 HtrA1 에피토프는 Arg190, Leu192, Pro193, Phe194, 및 Arg197로 이루어진 군으로부터 선택된 HtrA1 단백질의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 단리된 항체.
  2. HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 하기 6개 HVR을 포함하는 결합 도메인을 포함하는, 단리된 항체:
    (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEX1H (서열 번호: 1) (여기서 X1 은 Met 또는 Leu임);
    (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETX2GAAYNQKFKG (서열 번호: 2) (여기서 X2 은 Glu 또는 Asp임);
    (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3);
    (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVX3FIH (서열 번호: 4) (여기서 X3 은 Glu 또는 Asn임);
    (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSX4LAS (서열 번호: 5) (여기서 X4 는 Asn, His 또는 Glu임); 및
    (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWX5SX6PWT (서열 번호: 6), (여기서 X5 는 Ser 또는 Tyr이고 X6 은 Ala 또는 Asn임).
  3. 청구항 2에 있어서, 하기인, 항체:
    (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: DSEMH (서열 번호: 7);
    (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: GVDPETEGAAYNQKFKG (서열 번호: 8);
    (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: GYDYDYALDY (서열 번호: 3);
    (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASSSVEFIH (서열 번호: 9);
    (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: ATSNLAS (서열 번호: 10); 및
    (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQWSSAPWT (서열 번호: 11).
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체: 서열 번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 22의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 상기 VL 도메인은 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  6. HtrA1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 하기 6개 HVR을 포함하는 결합 도메인을 포함하는, 단리된 항체:
    (a) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1: SYIMS (서열 번호: 39);
    (b) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2: YISNGGGTTYYSDTIKG (서열 번호: 40);
    (c) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3: QNFRSDGSSMDY (서열 번호: 41);
    (d) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1: RASESVDSYGKSFMH (서열 번호: 42);
    (e) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2: LASKLES (서열 번호: 43); 및
    (f) 하기의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3: QQNNEDPYT (서열 번호: 44).
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체: 서열 번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 항체: 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론성, 인간화, 또는 키메라성인, 항체.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 HtrA1에 결합하는 항체 단편인, 항체.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab’-SH, Fv, scFV, 및 (Fab’)2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab인, 항체.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 Fab는 상기 중쇄 불변 영역의 상부 힌지에서 절단을 포함하는, 항체.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 위치 221 (EU 넘버링)에서 종결하는, 항체.
  15. 청구항 10 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 하기의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는, 항체: 서열 번호: 160.
  16. 청구항 10 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 159의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  17. 청구항 2 내지 5, 또는 9 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 HtrA1 에피토프에 특이적으로 결합하고, 그리고 상기 HtrA1 에피토프는 Arg190, Leu192, Pro193, Phe194, 및 Arg197로 이루어진 군으로부터 선택된 HtrA1 단백질의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 항체.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HtrA1 에피토프는 Leu192, Pro193, 및 Arg197로 이루어진 군으로부터 선택된 HtrA1 단백질의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 항체.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 HtrA1 에피토프가 상기 HtrA1 아미노산 Leu192, Pro193, 및 Arg197을 포함하는, 항체.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 HtrA1 에피토프가 상기 HtrA1 아미노산 Arg190, Leu192, Pro193, Phe194, 및 Arg197을 포함하는, 항체.
  21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 이중특이적 항체인, 항체.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는, 단리된 핵산.
  23. 항체의 생산 방법으로서,
    청구항 22의 단리된 핵산(isolated nucleic)을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    상기 숙주 세포 또는 상기 숙주 세포 배양 배지로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 청구항 1 내지 23 중 어느 한 항의 항체를 포함하고, 그리고 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 조성물이 동결 건조된 것인, 약제학적 조성물.
  26. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 항체 및 인자 D 길항제를 포함하는 병용 요법으로서, 상기 인자 D 길항제가 항-인자 D 항체인, 병용 요법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 항-인자 D 항체가 람팔리주맙인, 병용 요법.
  28. 청구항 26 또는 27에 있어서, 상기 항-인자 D 길항제가 순차적으로 투여되는, 병용 요법.
  29. 약제로서 사용하기 위한 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 항체.
  30. HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애의 치료에서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 항체.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 HtrA1-관련 장애 또는 상기 안구 장애는 연령-관련된 황반 퇴화 (AMD), 당뇨성 망막병증, 조숙증의 망막병증, 또는 결절 맥락막 혈관병증인, 항체.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 HtrA1-관련 장애 또는 상기 안구 장애는 초기 건식 AMD, 중간 건식 AMD, 또는 진행성 건식 AMD 인, 항체.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 진행성 건식 AMD가 지도형 위축증(geographic atrophy)인, 항체.
  34. HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서의, 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 항체의 용도.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애는 AMD, 당뇨성 망막병증, 조숙증의 망막병증, 또는 결절 맥락막 혈관병증인, 용도.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애는 초기 건식 AMD, 중간 건식 AMD, 또는 진행성 건식 AMD인, 용도.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 진행성 건식 AMD가 지도형 위축증인, 용도.
  38. 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 HtrA1-관련 장애 또는 안구 장애를 치료하는 방법으로서,
    청구항 1 내지 21 중 어느 한 항의 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 HtrA1-관련 장애 또는 상기 안구 장애는 AMD, 당뇨성 망막병증, 조숙증의 망막병증, 또는 결절 맥락막 혈관병증인, 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 HtrA1-관련 장애는 초기 건식 AMD, 중간 건식 AMD, 또는 진행성 건식 AMD인, 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 진행성 건식 AMD가 지도형 위축증인, 방법.
  42. 청구항 38 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, 인자 D 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 인자 D 길항제는 항-인자 D 항체인, 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 항-인자 D 항체가 람팔리주맙인, 방법.
  44. 청구항 34 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 유리체내로, 안구로, 안구내로, 공막주변으로, 테논낭하로, 상맥락막으로, 또는 국소적으로 투여되는, 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 항체가 유리체내로, 주사에 의하여 투여되는, 방법.
  46. 청구항 34 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 지속성(long-acting) 전달 시스템에 의해 투여되는, 방법 또는 용도.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 지속성 전달 시스템은 PLGA-기반 고체 이식물 또는 이식가능한 포트 전달 시스템인, 방법.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL295097A (en) 2015-10-30 2022-09-01 Genentech Inc Anti-htra1 antibodies and methods of using them
AU2016344133A1 (en) * 2015-10-30 2018-05-17 Genentech, Inc. Anti-Factor D antibody formulations
CA3025253A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Orion Ophthalmology LLC Heterocyclic prolinamide derivatives
JP7164521B2 (ja) 2016-06-21 2022-11-01 オリオン・オフサルモロジー・エルエルシー 炭素環式プロリンアミド誘導体
RU2019101298A (ru) 2016-07-01 2020-08-03 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антисмысловые олигонуклеотиды для модулирования экспрессии htra1
CA3085211A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Companion diagnostic for htra1 rna antagonists
WO2020102680A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 Gemini Therapeutics Inc. Antibody-based therapeutics for targeting htra1 and methods of use
CN114729056A (zh) * 2019-06-26 2022-07-08 阿穆尼克斯制药公司 Egfr抗原结合片段和包含它们的组合物
CN115605507A (zh) 2020-03-13 2023-01-13 基因泰克公司（Us） 抗白介素-33抗体及其用途
WO2023125289A1 (zh) * 2021-12-31 2023-07-06 上海宏成药业有限公司 抗pd-1抗体及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013055998A1 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Genentech, Inc. ANTI-HtrA1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE

Family Cites Families (229)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
CA1188246A (en) 1981-08-31 1985-06-04 Jerry L. Gregory Immobilized microbe recycle apparatus
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
IE61148B1 (en) 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2039718C (en) 1989-08-31 2003-02-25 John J. Rossi Chimeric dna-rna catalytic sequences
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
ATE269870T1 (de) 1989-10-24 2004-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte oligonukleotide
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DK0455905T3 (da) 1990-05-11 1998-12-07 Microprobe Corp Dipsticks til nukleinsyrehybridiseringsassays og fremgangsmåde til kovalent immobilisering af oligonukleotider
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
PT98562B (pt) 1990-08-03 1999-01-29 Sanofi Sa Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
WO1992005186A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 Gilead Sciences Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
PL169576B1 (pl) 1990-10-12 1996-08-30 Max Planck Gesellschaft Sposób wytwarzania czasteczki RNA o aktywnosci katalitycznej PL PL
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
US20030206899A1 (en) 1991-03-29 2003-11-06 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）２抗体の産生のための使用
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
AU3144193A (en) 1991-11-21 1993-06-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
ATE295420T1 (de) 1992-02-06 2005-05-15 Chiron Corp Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
BR9207175A (pt) 1992-10-28 1995-12-12 Genentech Inc Composição contendo antagonista de fator de crescimento de célula endotelial vascular sequência aminoácida de anticorpo monoclonal polipeptídeo e método de tratamento de tumor em mamífero
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
WO1994022864A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
HU9501974D0 (en) 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthrop Inc Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
WO1995007330A1 (en) 1993-09-09 1995-03-16 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent with alkoxy or aryloxy amide surfactant
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
WO1995034573A1 (en) 1994-06-03 1995-12-21 Brigham And Women's Hospital Identification of polycystic kidney disease gene, diagnostics and treatment
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
AU6180696A (en) 1995-06-21 1997-01-22 Martek Biosciences Corporation Combinatorial libraries of labeled biochemical compounds and methods for producing same
US5837492A (en) 1995-12-18 1998-11-17 Myriad Genetics, Inc. Chromosome 13-linked breast cancer susceptibility gene
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6274376B1 (en) 1996-02-20 2001-08-14 Smithkline Beecham Corporation ClpL
EP0828003A3 (en) 1996-09-06 2003-01-15 SmithKline Beecham plc Human serine protease
US5800998A (en) 1996-11-12 1998-09-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Assays for diagnosing type II diabetes in a subject
EP0990031B1 (en) 1997-01-14 2006-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor receptor 5
US7122636B1 (en) 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
ES2361267T3 (es) 1997-04-07 2011-06-15 Genentech Inc. Procedimiento para la produccion de anticuerpos humanizados mediante mutagénesis aleatoria.
JP3957765B2 (ja) 1997-04-07 2007-08-15 ジェネンテク・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
EP0994903B1 (en) 1997-06-24 2005-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
AR013269A1 (es) 1997-08-04 2000-12-13 Scras Producto que contiene por lo menos un rna de doble filamento combinado con por lo menos un agente anti-viral, para la utilizacion terapeutica en eltratamiento de una enfermedad viral, en especial de la hepatitis viral
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
PT1034298E (pt) 1997-12-05 2012-02-03 Scripps Research Inst Humanização de anticorpo murino
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6274720B1 (en) 1997-12-31 2001-08-14 Incyte Genomics, Inc. Human preproneurotensin/neuromedin N
US6956107B2 (en) 1998-02-20 2005-10-18 Tanox, Inc. Inhibitors of complement activation
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
AU3669499A (en) 1998-04-28 1999-11-16 Axys Pharmaceuticals, Inc. Novel serine protease capable of selective cleavage of insulin-like growth factor binding protein
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
AU5290499A (en) 1998-08-03 2000-02-28 Novartis Ag Human htra serine protease
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
NZ539776A (en) 1999-01-15 2006-12-22 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
AU776150B2 (en) 1999-01-28 2004-08-26 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for (in vivo) and (in vitro) attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
EP2270148A3 (en) 1999-04-09 2011-06-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
CA2385347C (en) 1999-10-04 2009-12-15 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
AU1086501A (en) 1999-10-15 2001-04-30 Carnegie Institution Of Washington Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
WO2001044463A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
ES2639222T5 (es) 2000-10-06 2023-11-24 Kyowa Kirin Co Ltd Células que producen unas composiciones de anticuerpo
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ES2295228T3 (es) 2000-11-30 2008-04-16 Medarex, Inc. Roedores transcromosomicos transgenicos para la preparacion de anticuerpos humanos.
AUPR670701A0 (en) 2001-07-30 2001-08-23 Prince Henry's Institute Of Medical Research Novel serine protease
CN1555411A (zh) 2001-08-03 2004-12-15 ���迨�����＼���ɷݹ�˾ 抗体-依赖性细胞毒性增大的抗体糖基化变体
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
JP2003135075A (ja) 2001-11-05 2003-05-13 Research Association For Biotechnology 新規な全長ｃＤＮＡ
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US8420353B2 (en) 2002-03-22 2013-04-16 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing same
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
WO2003084569A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition anticorps
PL373256A1 (en) 2002-04-09 2005-08-22 Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd. Cells with modified genome
DE60336548D1 (de) 2002-04-09 2011-05-12 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
AU2003239966B9 (en) 2002-06-03 2010-08-26 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1944320A1 (en) 2002-12-16 2008-07-16 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
RS20181002A1 (sr) 2003-05-30 2018-12-31 Genentech Inc Tretman sa anti-vegf antitelima
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
EP1688439A4 (en) 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk HYBRID PROTEIN COMPOSITION
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
PL1692182T3 (pl) 2003-11-05 2010-09-30 Roche Glycart Ag Przeciwciała CD20 o zwiększonym powinowactwie wiązania z receptorem Fc oraz zwiększonej funkcji efektorowej
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
DK1737891T3 (da) 2004-04-13 2013-03-25 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin-antistoffer
US20060009360A1 (en) 2004-06-25 2006-01-12 Robert Pifer New adjuvant composition
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
CN101065151B (zh) 2004-09-23 2014-12-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
EP2570491A1 (en) 2005-06-08 2013-03-20 University of Pittsburgh of the Commonwealth System of Higher Education Susceptibility genes for age-related maculopathy (ARM) on chromosome 10q26
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AU2007249408A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20100166743A1 (en) 2006-10-06 2010-07-01 University Of Utah Research Foundation Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same
AR063760A1 (es) 2006-11-02 2009-02-18 Genentech Inc Anticuerpos anti-factor d humanizados y usos de los mismos
WO2008094370A2 (en) * 2006-12-22 2008-08-07 University Of Utah Research Foundation Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
TW200846358A (en) 2007-02-16 2008-12-01 Genentech Inc HtrA1-PDZ and HtrA3-PDZ modulators
WO2008103299A2 (en) 2007-02-16 2008-08-28 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Methods and compositions for prognosing, detecting, and treating age-related macular degeneration
AR066660A1 (es) 2007-05-23 2009-09-02 Genentech Inc Prevencion y tratamiento de condiciones del ojo asociadas con su complemento
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
EP2044951A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-08 Merz Pharma GmbH & Co. KGaA The use of substances for the treatment of loss of eyesight in humans with glaucoma and other degenerative eye diseases
WO2009046405A2 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 University Of Utah Research Foundation Antibodies to htra1 and methods of using the same
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
CR20170001A (es) 2008-04-28 2017-08-10 Genentech Inc Anticuerpos anti factor d humanizados
HUE032894T2 (hu) 2008-06-25 2017-11-28 Esbatech Alcon Biomed Res Unit VEGF-gátló, stabilis és oldható antitestek
JP5737721B2 (ja) * 2009-04-20 2015-06-17 国立大学法人 東京大学 Ｈｔｒａ１変異と家族性虚血性脳小血管病との関連
US20140231427A1 (en) 2011-10-13 2014-08-21 Advanced Technology Materials, Inc. Liner-based shipping and dispensing containers for the substantially sterile storage, shipment, and dispense of materials
IL295097A (en) 2015-10-30 2022-09-01 Genentech Inc Anti-htra1 antibodies and methods of using them

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013055998A1 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Genentech, Inc. ANTI-HtrA1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE

Also Published As

Publication number Publication date
JP6750010B2 (ja) 2020-09-02
CA3088612A1 (en) 2017-05-04
PH12018500887A1 (en) 2018-10-29
MX2022002954A (es) 2022-04-06
MX2018004509A (es) 2018-08-01
CN108290957B (zh) 2022-06-17
CL2020002103A1 (es) 2020-10-23
TWI747850B (zh) 2021-12-01
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