TWI787223B

TWI787223B - Gremlin-1結晶結構及抑制抗體

Info

Publication number: TWI787223B
Application number: TW106144629A
Authority: TW
Inventors: 蓋瑞斯查理斯格林德沃戴維斯; 妮莎達迪; 大衛詹姆士麥克米蘭; 布雷達特梅; 麥克約翰萊特
Original assignee: 比利時商Ｕｃｂ生物製藥公司
Priority date: 2016-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2022-12-21
Also published as: CO2019006073A2; WO2018115017A3; MA47669A; EP3555129A2; GB201621635D0; ECSP19051912A; AU2017384471A1; US11807680B2; RU2019122648A; US20210163586A1; JP2020511946A; PH12019501319A1; JP7097364B2; CN110099924B; AR110394A1; ZA201903810B; US20240076365A1; UA126025C2; TW201837052A; CA3045742A1

Abstract

本發明係關於人類Gremlin-1蛋白及與抑制抗體複合之人類Gremlin-1蛋白之結晶。本發明亦關於人類Gremlin-1 (獨自，或與抗體複合)之結構及此等結構在篩檢調節Gremlin-1活性之藥劑中的用途。本發明另外提供結合Gremlin-1上之異位抑制位點之抗體，以及此類抗體之醫藥組合物及醫學用途及藉由篩檢方法鑑別之藥劑。

Description

GREMLIN-1結晶結構及抑制抗體

本發明係關於人類Gremlin-1蛋白及與抑制抗體複合之人類Gremlin-1蛋白之結晶。本發明亦關於人類Gremlin-1 (獨自，或與抗體複合)之結構及此等結構在篩檢調節Gremlin-1活性之藥劑中之用途。本發明另外提供結合Gremlin-1上之異位抑制位點之抗體，以及此類抗體之醫藥組合物及醫學用途及藉由篩檢方法鑑別之藥劑。

Gremlin-1 (亦稱為Drm及CKTSF1B1)係為184個胺基酸的醣蛋白，其形成胱胺酸結分泌蛋白之DAN家族之部分(與Cerberus及Dan及其他一起)。Gremlin結合BMP-2、4及7且抑制BMP-2、4及7之傳信能力以及已證明的可能經由促效VEGFR2達成之促血管生成作用。Gremlin-1之主要作用係在發展期間，其中其在腎臟形成期間及肢芽形成期間至關重要。此等至關重要的作用使gremlin同型組合基因剔除在胚胎小鼠中為致死性的。在成人期，gremlin之升高水準與特發性肺纖維化及肺動脈高壓相關聯，其中BMP-2、4及7傳信降低，與之相關聯地，TGF-β水準升高。在糖尿病及慢性同種移植腎病中，Gremlin-1表現與纖維化程度相關。 gremlin之升高水準亦與硬皮病、糖尿病腎病及結腸直腸癌相關。已顯示Gremlin-1活化癌細胞侵入及增殖，且被認為在子宮頸癌、肺癌、卵巢癌、腎臟癌、乳癌、結腸癌、胰臟癌及肉瘤癌中起作用。迄今，存在若干與Gremlin-1研究相關聯之難題且缺乏關於Gremlin-1 (及其搭配物Gremlin-2)之一般理解。BMP生物學複雜且物種之間存在高同源性。對Gremlin-1之研究相當棘手，且缺乏適合工具及試劑來研究其生物學。製備Gremlin-1亦非一個簡單的過程；半胱胺酸結蛋白以難以產生著稱且Gremlin-1之游離半胱胺酸增加了問題的難度。Gremlin-1難以表現更不必說純化。迄今為止，尚未能獲得結構資訊，且文獻中鮮見關於此蛋白之資訊。

如本發明中所用之術語Gremlin-1通常具有如UniProt條目O60565 (SEQ ID NO:1)中所闡述之序列。術語Gremlin-1亦可指Gremlin-1多肽，其 (a) 包含具有或不具有N端信號肽之SEQ ID NO:1之胺基酸序列或由其組成，亦即可包含如SEQ ID NO:21中所示之成熟肽序列或由其組成；或 (b) 係具有一或多種相對於具有或不具有N端信號肽之SEQ ID NO:1之胺基酸序列(如SEQ ID NO:21中所示)之胺基酸取代、修飾、缺失或插入的衍生物，其保留有Gremlin-1之活性，如SEQ ID NO:20之胺基酸序列。 (c) 其變異體，此類變異體通常保留有與SEQ ID NO:1 (或SEQ ID NO:20或21)之至少約60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%或95%一致性(或甚至約96%、97%、98%或99%一致性)。換言之，此類變異體可以保留與SEQ ID NO:1之約60%至約99%一致性，適合地與SEQ ID NO:1之約80%至約99%一致性，更適合地與SEQ ID NO:1之約90%至約99%一致性且最適合地與SEQ ID NO:1之約95%至約99%一致性。變異體進一步描述如下。如以下進一步論述，殘基數目通常基於SEQ ID NO:1之序列引述。然而，殘基編號可以由熟習此項技術者容易地外推至如上文所論述之衍生或變異序列。其中，在本發明中殘基數目之引述亦涵蓋變異或衍生序列上之殘基。本發明人已結晶化了單獨及以與名為Ab 7326 (Fab片段)之抗體複合的人類Gremlin-1。Gremlin-1之結晶使得BMP結合位點中之推定殘基得以測定。此外，與異位抑制抗體Ab 7326之結晶使得抗體抗原決定基中之殘基得以測定。結合此抗原決定基之抗體具有作為與Gremlin-1相關之疾病之治療中之治療劑的潛能。相應地，本發明提供Gremlin-1之結晶。本發明亦提供藉由如表1中之座標所界定之人類Gremlin-1之結構。另外，本發明提供： · 可機讀資料儲存媒體，其包含編碼有由表1中之Gremlin-1之結構座標或界定該結構之同系物之座標界定之可機讀資料的資料儲存材料。 · 如表1中之座標所界定之Gremlin-1之結構結構作為模型之用途。 · 藉由使用結構模型鑑別之藥劑。 · 篩檢Gremlin-1活性之調節劑之方法，其包含以下步驟： (a) 自表1中之結構座標中鑑別配位體結合位點； (b) 鑑別與至少一部分配位體結合位點相互作用之候選藥劑；且 (c) 獲得或合成該藥劑。 · 藉由篩檢方法鑑別之Gremlin-1調節劑。 · 結合於Gremlin-1上之抗原決定基之抗體，該抗原決定基包含至少一個選自以下之殘基：Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174及Gln175，其中殘基編號係基於SEQ ID NO:1。 · 抗Gremlin-1抗體，其包含SEQ ID NO:10或12之重鏈可變區(heavy chain variable region，HCVR)內所含有之重鏈互補決定區(heavy chain complementarity determining region，HCDR)序列及/或SEQ ID NO:11或13之輕鏈可變區(light chain variable region，LCVR)內所含有之輕鏈互補決定區(light chain complementarity determining region，LCDR)序列。 · 抗Gremlin-1抗體，其包含至少一個選自SEQ ID NO:3、4、5及6之HCDR序列及/或至少一個選自SEQ ID NO:7、8及9之LCDR序列。 · 經分離之編碼該等抗體之多核苷酸。 · 帶有該多核苷酸之表現載體。 · 包含該載體之宿主細胞。 · 製備該抗體之方法，其包含在允許產生該抗體之條件下培養該宿主細胞及回收所產生之抗體。 · 包含抗體之醫藥組合物。 · 抗體或醫藥組合物，其用於藉由療法治療人類或動物體之方法中。 · 治療或預防諸如糖尿病腎病之腎纖維化、特發性肺纖維化、肺動脈高壓、血管生成及/或癌症之方法，其包含向有需要之患者投與治療有效量之抗體或醫藥組合物。

Gremlin - 1 晶體結構 本發明提供人類Gremlin-1之結構座標。完整座標列出於圖1中(表1)。本發明亦提供人類Gremlin-1之結晶，其由單位晶胞尺寸為a=84.55 Å，b=107.22 Å且c=77.09 Å之C2空間群組成。本發明另外提供與抗體，更具體言之，具有SEQ ID NO:18之重鏈及SEQ ID NO:19之輕鏈之Fab複合的Gremlin-1之結晶。本發明另外提供可機讀資料儲存媒體，其包含編碼有由表1中之Gremlin-1之結構座標或界定該結構之同系物之座標界定之可機讀資料的資料儲存材料。本發明提供表1中之結構資料及可機讀資料儲存媒體之用途，其作為Gremlin-1之結構模型。此類結構模型可用於篩檢與Gremlin-1相互作用之藥劑。篩檢可為高通量篩檢。與Gremlin-1相互作用之藥劑通常係結合Gremlin-1之藥劑。與Gremlin-1相互作用之藥劑可以調節Gremlin-1。抑制調節劑可能影響Gremlin-1之任何功能，但通常降低Gremlin-1與BMP (BMP 2/4/7)之結合。Gremlin-1係BMP之負調節劑，因此降低的結合增加經由BMP之傳信。活化調節劑可以增加Gremlin-1與BMP之結合。 BMP結合及傳信可以藉由此項技術中已知之任何方法偵測。舉例而言，本申請案之實例描述SMAD磷酸化分析。SMAD1、5及8在BMP傳信時經磷酸化。SMAD磷酸化之增加可因此用於測定增加的BMP傳信，其可以反映出與Gremlin-1之結合之減少。實例亦描述Id1報導基因分析，其中Id1基因係BMP傳信之目標基因。在此分析中傳信之復原之增加可因此亦用於確定藥劑是否抑制Gremlin-1結合於BMP。如本文中所提及之藥劑可以係可以潛在地與Gremlin-1相互作用之任何分子，但較佳為小分子或抗體。本發明亦提供Gremlin-1活性之調節劑之篩檢方法，其包含以下步驟： (a) 自表1中之結構座標中鑑別配位體結合位點； (b) 鑑別與至少一部分配位體結合位點相互作用之候選藥劑；且 (c) 獲得或合成該藥劑。配位體結合位點可以係Gremlin-1上與蛋白(配位體)相互作用之任何推定位點。配位體結合位點通常係BMP結合位點。如實例中所示，本發明人已鑑別基於Gremlin-1晶體結構之推定BMP結合位點。此結合位點包含以下胺基酸：Trp93、Phe117、Tyr119、Phe125、Tyr126及Phe138，其中殘基編號係基於SEQ ID NO:1。本發明之篩檢方法可因此包含鑑別與此等殘基中之一或多種，較佳此等殘基中之至少2、3、4種或全部6種相互作用之藥劑。藥劑與蛋白殘基之相互作用可以藉由此項技術中已知之任何適當方法測定，諸如殘基與藥劑之間之距離係藉由x射線結晶學測定(通常小於6 Å或小於4 Å)。如以下實例中所論述，可由治療劑標靶之Gremlin-1之區域可包括胺基酸Asp92-Leu99、Arg116-His130、Ser137-Ser142、Cys176-Cys178。此等距Gremlin-1之表面上之突變胺基酸6 Å以內。篩檢方法之步驟(a)及步驟(b)通常電腦模擬進行，且藥劑可以藉由此項技術中已知之任何方法獲得及合成。在一個實施例中，本發明提供一種與Gremlin-1上之抗原決定基結合之抗體，該抗原決定基包含至少一個選自以下之殘基：Trp93、Phe117、Tyr119、Phe125、Tyr126及Phe138，其中殘基編號係根據SEQ ID NO:1。本發明亦提供一種抗體，其結合包含以下全部之抗原決定基：Trp93、Phe117、Tyr119、Phe125、Tyr126及Phe138。本發明亦提供Gremlin-1之此BMP結合區用於生成(潛在抑制)抗體之用途。舉例而言，本發明提供包含至少一個(較佳全部)以上列出之殘基的抗原，其可用於抗體生成。藥劑可異位地作用，而非與Gremlin-1之BMP結合位點相互作用。在此，藥劑相距於正常結合位點地結合但仍能夠調節Gremlin-1之活性，例如經由誘導蛋白中之構形變化。本發明之結構模型及篩檢方法可因此亦用於鑑別Gremlin-1之異位調節劑。已發現本發明之Ab 7326抗體異位地作用。此抗體之抗原決定基包含以下殘基：Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174及Gln175，其中殘基編號係基於SEQ ID NO:1。相應地，本發明之篩檢方法可涉及鑑別與此等殘基中之至少1、2、3、4、5種或全部9種相互作用之藥劑。此類藥劑可隨後例如使用抑制BMP結合之實例中所描述之分析測試。較佳，Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174及Gln175位於Gremlin-1之一個單體上，且Ile131位於Gremlin-1之另一個單體上(Gremlin-1二聚物結合於BMP二聚物)。同樣，本發明亦涵蓋包含用於產生抗Gremlin-1抗體之此等殘基中之至少一個(較佳全部)之抗原。另外，藥劑可以藉由此項技術中已知之任何適當方法鑑別為與此等殘基相互作用。藥劑較佳為小分子或抗體。抗體本發明提供結合Gremlin-1之抗體。如本文中所提及之術語「抗體」包括整個抗體及其任何抗原結合片段(亦即，「抗原結合部分」)或單鏈。抗體係指包含藉由二硫鍵連接之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈之糖蛋白，或其抗原結合部分。各個重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或V_H )及重鏈恆定區。各個輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或V_L )及輕鏈恆定區。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。V_H 及V_L 區可進一步再分為高變區，稱為互補決定區(complementarity determining region，CDR)，穿插有稱為框架區(framework region，FR)之更保守的區域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白結合於宿主組織或因子，包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)。本發明之抗體可為單株抗體或多株抗體，且通常為單株抗體。本發明之抗體可為嵌合抗體、CDR-移植抗體、奈米抗體、人類或人類化抗體或任何其抗原結合部分。對於單株及多株抗體之產生，實驗動物通常係非人類哺乳動物，諸如山羊、兔、大鼠或鼠，但抗體亦在其他物種中產生。多株抗體可藉由常規方法(諸如適合動物之免疫)使用所關注之抗原產生。可隨後自動物中移除血液且純化IgG部分。可得到抗Gremlin-1抗體，其中動物之免疫係必需的，其藉由使用熟知且常規方案(參見例如《實驗免疫學手冊(Handbook of Experimental Immunology)》D. M. Weir (編)，第4卷, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986))向動物，例如非人類動物，投與多肽。可對許多恆溫動物進行免疫，諸如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、駱駝或豬。然而，小鼠、兔、豬及大鼠通常最適合。單株抗體可藉由此項技術中已知之任何方法製備，諸如融合瘤技術(Kohler及Milstein, 1975, Nature, 256:495-497)、三源融合瘤(trioma)技術、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor等人，1983, Immunology Today, 4:72)及EBV融合瘤技術(Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，第77-96頁，Alan R Liss, Inc., 1985)。本發明之抗體亦可使用單淋巴球抗體方法，藉由例如由Babcook, J.等人, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268及WO2004/106377所描述之方法藉由選殖及表現自經選擇用於產生特異性抗體之單淋巴球產生之免疫球蛋白可變區cDNA來產生。本發明之抗體亦可使用此項技術中已知之各種噬菌體呈現方法來產生，且該等方法包括由Brinkman等人(J. Immunol. Methods, 1995,182: 41-50中)、Ames等人(J. Immunol. Methods, 1995,184:177-186)、Kettleborough等人(Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958)、Persic等人(Gene, 1997187 9-18)、Burton等人(Advances in Immunology,1994, 57:191-280)及WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；及US 5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743及5,969,108揭示之方法。全人類抗體係其中重鏈及輕鏈之可變區及恆定區(當存在時)為全人源的或與人源序列基本上一致但未必來自相同抗體的彼等抗體。全人類抗體之實例可包括，例如藉由上文所述之噬菌體呈現方法產生的抗體，及藉由其中鼠免疫球蛋白可變且視情況恆定區基因已經其人類對應物置換之小鼠產生的抗體，例如如 EP 0546073、U5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,661,016、US 5,770,429、EP 0438474及EP 0463151中所概括地描述。替代地，根據本發明抗體可藉由包含：用Gremlin-1免疫原將非人類哺乳動物免疫；獲得自該哺乳動物產生之抗體；自其導出識別Gremlin-1之單株抗體之方法產生。本發明之抗體分子可包含具有全長重鏈及輕鏈之完整抗體分子或其片段或抗原結合部分。術語抗體之「抗原結合部分」係指抗體之一或多種片段，其保留有選擇性結合於抗原之能力。已顯示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來進行。抗體及其片段及抗原結合部分可以係但不限於：Fab、經修飾Fab、Fab'、經修飾Fab'、F(ab')₂ 、Fv、單域抗體(例如VH或VL或VHH)、scFv、二三或四價抗體、雙scFv、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及以上中任一者之抗原決定基結合片段(參見例如Holliger及Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136；Adair及Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217)。用於產生及製造此等抗體片段之方法為此項技術中所熟知(參見例如Verma等人, 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181)。用於本發明之其他抗體片段包括國際專利申請案WO 2005/003169、WO 2005/003170及WO 2005/003171中所描述之Fab及Fab'片段及國際專利申請案WO 2009/040562中所描述之Fab-dAb片段。多價抗體可包含多個特異性或可為單特異性(參見例如WO 92/22853及WO 05/113605)。此等抗體片段可使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且該等片段可經篩檢而以與完整抗體相同之方式進行應用。本發明抗體分子之恆定區域若存在，則可根據抗體分子之建議功能及尤其是可能需要的效應功能來選擇。舉例而言，恆定區域可為人類IgA、IgD、IgE、IgG或IgM域。特定言之，當抗體分子意圖用於治療用途且需要抗體效應功能時，可使用人類IgG恆定區域，尤其是IgG1及IgG3同型。或者，當抗體分子意圖用於達成治療目的且不需要抗體效應功能時，則可使用IgG2及IgG4同型。本發明之抗體可藉由重組手段製備、表現、產生或分離，諸如(a)為得到所關注之免疫球蛋白基因而自轉殖基因或轉殖染色體的動物(例如鼠)或自其製備之融合瘤分離之抗體；(b)自經轉型以表現所關注之抗體之宿主細胞(例如自轉染瘤)分離之抗體；(c)自重組、組合抗體庫分離之抗體；及(d)藉由任何其他涉及編接免疫球蛋白基因序列至其他DNA序列之手段製備、表現、產生或分離之抗體。本發明之抗體可為人類抗體或人類化抗體。術語「人類抗體」，如本文中所使用，意欲包括具有其中框架區及CDR區皆來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區的抗體。另外，若抗體含有恆定區，則恆定區亦來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或定點誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，如本文中所使用，術語「人類抗體」不意欲包括來源於另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植於人類框架序列上的抗體。此類人類抗體可為人類單株抗體。此類人類單株抗體可藉由融合瘤產生，該融合瘤包括與永生化細胞融合之獲自轉殖基因非人類動物(例如轉殖基因小鼠)的B細胞，該轉殖基因非人類動物具有包含人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉殖基因之基因組。人類抗體可藉由活體外免疫人類淋巴細胞，繼而用艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)將淋巴細胞轉型來製備。術語「人類抗體衍生物」係指人類抗體之任何經修飾形式，諸如抗體與另一種藥劑或抗體之結合物。術語「人類化抗體」意欲指其中來源於另一哺乳動物物種(諸如鼠)之生殖系之CDR序列已經移植在人類框架序列上的CDR-移植抗體分子。在人類框架序列中可作出其他框架區修飾。如本文中所使用，術語『CDR-移植抗體分子』係指其中重鏈及/或輕鏈含有一或多種來自供體抗體(例如鼠或大鼠單株抗體)之移植至受體抗體(例如人類抗體)之重鏈及/或輕鏈可變區框架的CDR(包括，必要時，一或多種經修飾CDR)的抗體分子。關於綜述，參見Vaughan等人，Nature Biotechnology,16 , 535-539, 1998。在一個實施例中，僅將來自上文所描述之CDR中之任一者的決定特異性的殘基中之一或多個轉移至人類抗體框架而非轉移整個CDR (參見例如，Kashmiri等人，2005, Methods, 36, 25-34)。在一個實施例中，僅將來自上文所描述之CDR中之一或多個的決定特異性的殘基轉移至人類抗體框架。在另一實施例中，僅將來自上文所描述之各CDR的決定特異性的殘基轉移至人類抗體框架。當移植CDR或決定特異性的殘基時，根據CDR的供體抗體的類別/類型，可使用任何適當受體可變區框架序列，包括小鼠、靈長類及人類框架區。適合地，根據本發明之CDR-移植抗體具有包含人類受體框架區以及上文所描述之CDR或決定特異性的殘基中之一或多個的可變域。因此，在一個實施例中提供中和性CDR-移植抗體，其中可變域包含人類受體框架區及非人類供體CDR。可用於本發明之人類框架之實例為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及POM (Kabat等人，同前文獻)。舉例而言，KOL及NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈且EU、LAY及POM可用於重鏈及輕鏈二者。替代地，可使用人類生殖系序列；此等可獲自，例如http://www.vbase2.org/ (參見Retter等人, Nucl. Acids Res. (2005) 33 (增刊1), D671-D674)。. 在本發明之CDR-移植抗體中，受體重鏈及輕鏈不一定需要來源於同一抗體且必要時可包含具有來源於不同鏈之框架區的複合鏈。在本發明之CDR-移植抗體中，框架區無需具有與受體抗體之序列完全相同的序列。舉例而言，可將不尋常殘基改為用於該受體鏈類別或類型的更常出現的殘基。替代地，可改變在受體框架區中所選擇的殘基以使其對應於在供體抗體中之相同位置出現的殘基(參見Reichmann等人，1998, Nature, 332, 323-324)。此類改變應保持在恢復供體抗體之親和力所必需的最小程度。用於選擇受體框架區中之可能需要改變的殘基的的方案闡述於WO 91/09967中。熟習此項技術者亦將瞭解抗體可經歷各種轉譯後修飾。此等修飾之類型及程度常常視用於表現抗體的宿主細胞株以及培養條件而定。此類修飾可包括在糖基化、甲硫胺酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬胺酸鹽異構化及天冬醯胺脫醯胺方面之變化。常見修飾為由於羧基肽酶作用而損失羧基端鹼性殘基(諸如離胺酸或精胺酸)(如Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995中所描述)。在一個實施例中，抗體重鏈包含CH1域且抗體輕鏈包含CL域，κ或λ。生物分子，諸如抗體或片段，含有酸性及/或鹼性官能基，由此給予分子淨正或負電荷。總體上「觀測到」的電荷之量將視實體之絕對胺基酸序列、3D結構中帶電基團之局部環境及分子之環境條件而定。等電點(pI)係特定分子或表面不帶有淨電荷時的pH。在一個實施例中，根據本發明之抗體或片段之等電點(pI)至少為7。在一個實施例中，抗體或片段之等電點至少為8，諸如8.5、8.6、8.7、8.8或9。在一個實施例中，抗體之pI為8。可使用諸如**ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html_(參見Walker, The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005), 571-607) 之程式預測抗體或片段之等電點。結合於本文中所揭示之抗原決定基的抗體可包含SEQ ID NO:4至6之重鏈CDR序列中之至少一種、至少兩種或全部三種(分別為HCDR1/HCDR2/HCDR3)。此等為如使用Kabat方法論測定之實例之Ab 7326抗體之HCDR1/HCDR2/HCDR3序列。用於測定CDR序列之Kabat方法及Chothia方法為此項技術(以及其他技術)中熟知的。CDR序列可使用任何適當方法測定，且在本發明中，儘管通常採用Kabat方法，但亦可以使用其他技術。在本發明實例中，SEQ ID NO:3展示如使用組合的Chothia及Kabat定義所測定之Ab 7326 HCDR1序列。本發明之抗體可包含SEQ ID NO:7至9之輕鏈CDR序列中之至少一種、至少兩種或全部三種(分別為LCDR1/LCDR2/LCDR3)。此等為使用Kabat方法論之Ab 7326之LCDR1/LCDR2/LCDR3序列。抗體較佳至少包含SEQ ID NO:6之HCDR3序列。典型地，抗體包含選自SEQ ID NO:3至5之至少一種重鏈CDR序列及選自SEQ ID NO 7至9之至少一種輕鏈CDR序列。抗體可包含選自SEQ ID NO:3至5之至少兩種重鏈CDR序列及選自SEQ ID NO:7至9之至少兩種輕鏈CDR序列。抗體典型地包含SEQ ID NO:3至5之全部三種重鏈CDR序列(分別為HCDR1/HCDR2/HCDR3)及SEQ ID NO:7至9之全部三種輕鏈CDR序列(分別為LCDR1/LCDR2/LCDR3)。抗體可為嵌合抗體、人類抗體或人類化抗體。抗體可包含SEQ ID NO:10或12之重鏈可變區(HCVR)序列(Ab 7326變異體1及變異體2之HCVR)。抗體可包含SEQ ID NO:11或13之輕鏈可變區(LCVR)序列(Ab 7326變異體1及變異體2之LCVR)。抗體較佳包含SEQ ID NO:10或12之重鏈可變區序列及SEQ ID NO:11或13之輕鏈可變區序列(尤其SEQ ID NO:10/11或12/13之HCVR/LVCR對)。抗體可包含以下之重鏈(H鏈)序列： SEQ ID NO:14鼠全長IgG1重鏈變異體1，或 SEQ ID NO:28鼠全長IgG1重鏈變異體2，或 SEQ ID NO:30人類全長IgG1重鏈變異體1，或 SEQ ID NO:16人類全長IgG1重鏈變異體2，或 SEQ ID NO: 22人類全長IgG4P重鏈變異體1，或 SEQ ID NO:34人類全長IgG4P重鏈變異體2，或 SEQ ID NO:18 Fab重鏈變異體1，或 SEQ ID NO:32 Fab重鏈變異體2。抗體可包含以下之輕鏈(L鏈)序列： SEQ ID NO:15鼠全長IgG1輕鏈變異體1，或 SEQ ID NO: 29鼠全長IgG1輕鏈變異體2，或 SEQ ID NO:31人類全長IgG1輕鏈變異體1，或 SEQ ID NO:17人類全長IgG1輕鏈變異體2，或 SEQ ID NO:23人類全長IgG4P輕鏈變異體1，或 SEQ ID NO:35人類全長IgG4P輕鏈變異體2，或 SEQ ID NO:19 Fab輕鏈變異體1，或 SEQ ID NO:33 Fab輕鏈變異體2。在一個實例中，抗體包含以下之重鏈/輕鏈序列對： SEQ ID NO:14/15鼠全長IgG1變異體1，或 SEQ ID NO:28/29鼠全長IgG1變異體2，或 SEQ ID NO:30/31人類全長IgG1變異體1，或 SEQ ID NO:16/17人類全長IgG1變異體2，或 SEQ ID NO:22/23人類全長IgG4P變異體1，或 SEQ ID NO:34/35人類全長IgG4P變異體2，或 SEQ ID NO:18/19 Fab輕鏈變異體1，或 SEQ ID NO:32/33 Fab輕鏈變異體2。對應序列之變異體形式可互換。舉例而言，抗體可包含以下之重鏈/輕鏈序列對： SEQ ID NO:14/29鼠全長IgG1重鏈變異體1/輕鏈變異體2，或 SEQ ID NO:28/15鼠全長IgG1重鏈變異體2/輕鏈變異體1，或 SEQ ID NO:30/17人類全長IgG1重鏈變異體1/輕鏈變異體2，或 SEQ ID NO:16/31人類全長IgG1重鏈變異體2/輕鏈變異體1，或 SEQ ID NO:22/35人類全長IgG4P重鏈變異體1/輕鏈變異體2，或 SEQ ID NO:34/23人類全長IgG4P重鏈變異體2/輕鏈變異體1，或 SEQ ID NO:18/33 Fab輕鏈重鏈變異體1/輕鏈變異體2，或 SEQ ID NO:32/19 Fab輕鏈重鏈變異體2/輕鏈變異體1。抗體可為嵌合抗體、人類抗體或人類化抗體。抗體可替代地為或可包含以上所述之特定序列中之一者之變異體。舉例而言，變異體可為以上胺基酸序列中之任一者之取代、缺失或添加變異體。變異體抗體可包含1、2、3、4、5、至多10、至多20或更多種(典型地，至多最大值50種)自上文所論述之特定序列之胺基酸取代及/或缺失。「缺失」變異體可包含缺失個別胺基酸；缺失較小胺基酸組，諸如2、3、4或5個胺基酸；或缺失較大胺基酸區，諸如缺失特定胺基酸域或其他特徵。「取代」變異體通常涉及用相同數目之胺基酸置換一或多個胺基酸及進行保守胺基酸取代。舉例而言，胺基酸可經具有類似特性之替代胺基酸取代，例如另一鹼性胺基酸、另一酸性胺基酸、另一中性胺基酸、另一帶電荷胺基酸、另一親水性胺基酸、另一疏水性胺基酸、另一極性胺基酸、另一芳族胺基酸或另一脂族胺基酸。可用於選擇適合取代基之20種主要胺基酸之一些特性如下：

較佳「衍生物」或「變異體」一般包括其中序列中所呈現之胺基酸並非天然產生之胺基酸而係其結構類似物的彼等衍生物或變異體。用於序列中之胺基酸亦可為經衍生或修飾的(例如經標記)，其限制條件為抗體之功能不受顯著不利影響。如上文所描述之衍生物及變異體可在抗體合成期間或藉由產生後修飾來製備，或在抗體為重組形式時使用定點誘變、隨機誘變、或酶促裂解及/或核酸接合來製備。變異體抗體可具有與本文中所揭示之胺基酸序列(尤其HCVR/LCVR序列及H鏈及L鏈序列)具有大於約60%、或大於約70%，例如75%或80%，典型地大於約85%，例如大於約90%或95%之胺基酸一致性的胺基酸序列。另外，抗體可為與本文中所揭示之HCVR/LCVR序列及H鏈及L鏈序列具有大於約60%、或大於約70%，例如75%或80%，典型地大於約85%，例如大於約90%或95%之胺基酸一致性的變異體，同時保留針對此等序列揭示之確切CDR。同時變異體可保留與本文中所揭示之HCVR/LCVR序列及H鏈及L鏈序列之至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性(在一些情況下同時保留確切CDR)。變異體典型地保留約60%至約99%一致性、約80%至約99%一致性、約90%至約99%一致性或約95%至約99%一致性。此水準之胺基酸一致性跨相關SEQ ID NO序列之全長可見或遍及該序列之一部分可見，諸如跨約20、30、50、75、100、150、200或更多個胺基酸，視全長多肽之大小而定。與胺基酸序列相關，「序列一致性」係指當用以下參數使用ClustalW (Thompson等人, 1994，前述)評估時具有所陳述之值的序列：雙序列比對參數-方法：精確，矩陣：PAM，空位開放罰分：10.00，空位延伸罰分：0.10；多序列對準參數-矩陣：PAM，空位開放罰分：10.00，延遲之一致性%：30，罰分端空位：開啟，空位分隔距離：0，負矩陣：無，空位延伸罰分：0.20，殘基特異性空位罰分：開啟，親水性空位罰分：開啟，親水性殘基：GPSNDQEKR。在特定殘基上之序列一致性意欲包括僅經衍生出之相同殘基。因此提供具有特異性序列之抗體及保持此等鏈之功能或活性之變異體。抗體可以與與上文關於H鏈/L鏈、HCVR/LCVR或CDR序列所定義之抗體相同之抗原決定基競爭結合於Gremlin-1或結合於該抗原決定基。特定言之，抗體可以與與包含SEQ ID NO:4/5/6/7/8/9之HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3序列組合之抗體相同之抗原決定基競爭結合於Gremlin-1或結合於該抗原決定基。抗體可以與與包含SEQ ID NO:10/11或12/13之HCVR及LCVR序列對或SEQ ID NO:14/15或16/17之全長鏈的抗體相同之抗原決定基競爭結合於Gremlin-1或結合於該抗原決定基。術語「抗原決定基」為由抗體所結合之抗原之區域。抗原決定基可定義為結構性或功能性的。功能性抗原決定基通常為結構性抗原決定基之子集且具有彼等直接貢獻於相互作用之親和力的殘基。抗原決定基亦可為構形的，亦即由非線性胺基酸組成。在某些實施例中，抗原決定基可包括作為分子之化學活性表面分組的決定子，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基、或磺醯基，且在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵及/或荷質比特徵。藉由使用此項技術中已知之常規方法，可以容易地確定抗體是否結合於與參考抗體相同之抗原決定基或與相同抗原決定基競爭結合。舉例而言，為確定測試抗體是否結合於與本發明之參考抗體相同之抗原決定基，將參考抗體在飽和條件下與蛋白或肽結合。然後，評估測試抗體結合於蛋白或肽之能力。若在飽和結合參考抗體之後測試抗體能夠結合於蛋白或肽，則可以得出結論，測試抗體結合於與參考抗體不同之抗原決定基。另一方面，若在飽和結合參考抗體之後測試抗體不能夠結合於蛋白或肽，則測試抗體可以結合於與本發明之參考抗體所結合之抗原決定基相同之抗原決定基。為確定抗體是否與參考抗體競爭結合，以兩個定向實施上述結合方法論。在第一定向中，將參考抗體在飽和條件下與蛋白/肽結合，隨後評估測試抗體與蛋白/肽分子之結合。在第二定向中，將測試抗體在飽和條件下與蛋白/肽結合，隨後評估參考抗體與蛋白/肽之結合。在兩個定向中，若僅第一(飽和)抗體能夠結合於蛋白/肽，則得出結論，測試抗體及參考抗體競爭結合於蛋白/肽。如熟習此項技術者將瞭解，與參考抗體競爭結合之抗體未必結合於與參考抗體相同之抗原決定基，但可藉由結合重疊或相鄰抗原決定基而在空間上阻礙參考抗體之結合。兩種抗體結合於相同或重疊抗原決定基，則各自競爭性地抑制(阻斷)另一個結合於抗原。亦即，1、5、10、20或100倍過量之一種抗體抑制另一個之結合達至少50%、75%、90%或甚至99%，如在競爭性結合分析中所量測(參見例如，Junghans等人, Cancer Res, 1990:50:1495-1502)。替代地，若抗原中減少或消除一種抗體之結合的基本上全部胺基酸突變減少或消除了另一抗體之結合，則兩種抗體具有相同抗原決定基。若減少或消除一種抗體之結合的一些胺基酸突變減少或消除另一抗體之結合，則兩種抗體具有重疊抗原決定基。可隨後進行其他常規實驗(例如肽突變及結合分析)，以確認所觀測到之測試抗體之結合缺失事實上是否係由於結合於與參考抗體相同之抗原決定基，或所觀測到之缺乏係空間阻礙(或另一現象)引起的。此種實驗可以使用ELISA、RIA、表面電漿子共振、流式細胞測量術或在此項技術中可用之任何其他定量或定性抗體結合分析進行。可以藉由，例如標準ELISA或西方墨點法(Western blotting)，針對與Gremlin-1之結合對抗體進行測試。ELISA分析亦可用於針對顯示與目標蛋白之正反應性之融合瘤之篩檢。抗體之結合選擇性亦可藉由監測抗體與表現目標蛋白之細胞之結合，例如藉由流式細胞測量術測定。因此，篩檢方法可包含藉由進行ELISA或西方墨點法或藉由流式細胞測量術來鑑別能夠結合Gremlin-1抗體之步驟。抗體可選擇性地(或特異性地)識別Gremlin-1。當抗體或其他化合物以較佳或較高親和力與其所選擇之蛋白結合時，其「選擇性地結合」或「選擇性地識別」蛋白，但不實質上結合其他蛋白，或以低親和力結合其他蛋白。抗體之選擇性可藉由確定抗體是否結合於如上文所論述之其他相關蛋白或其是否對如上文所論述之其他相關蛋白進行區別來進一步研究。本發明之抗體通常識別人類Gremlin-1。抗體亦可具有針對相關蛋白或人類Gremlin-1及來自其他物種之Gremlin-1之交叉反應性。應理解，藉由特異性(或選擇性)，抗體結合於所關注之蛋白而對任何其他分子無顯著交叉反應性。交叉反應性可藉由本文中所描述之任何適合方法評估。若抗體與另一分子之結合係其與所關注之蛋白之結合強度之至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或100%，則可認為抗體之交叉反應性顯著。特異性(或選擇性)抗體可以小於其結合於所關注之蛋白之強度之約90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%或20%的強度結合於另一分子。抗體可以其結合於所關注之蛋白之強度之小於約20%、小於約15%、小於約10%或小於約5%、小於約2%或小於約1%的強度結合於另一分子。適合與本發明一起使用之抗體可具有對(人類) Gremlin-1之高親和力結合。抗體之解離常數(K_D )可小於＜1 nM，且較佳＜500 pM。在一個實例中抗體之解離常數(K_D )小於200 pM。在一個實例中抗體之解離常數(K_D )小於100 pM。如熟習此項技術者已熟知，可使用各種方法測定抗體對其目標抗原之結合親和力，諸如表面電漿子共振分析、飽和分析或諸如ELISA或RIA之免疫分析。用於測定結合親和力之例示性方法為藉由在BIAcore™ 2000儀器(Biacore AB, Freiburg, Germany)上使用CM5感測器晶片之表面電漿子共振分析，如由Krinner等人, (2007) Mol. Immunol. February; 44 (5):916-25 (2006年5月11日電子版發表)所描述。本發明之抗體通常為抑制抗體。Gremlin-1負調節BMP-2、4及7，因此抑制Gremlin-1引起經由BMP之傳信增加。如上文所提及，本申請案之實例描述兩個用於篩檢抗體是否能夠抑制Gremlin 1之功能性分析，即SMAD磷酸化分析及Hek Id1報導基因分析。通常，在Hek Id1報導基因分析中，抑制抗體復原SMAD磷酸化及/或復原BMP之傳信。相比於BMP對照，SMAD磷酸化可復原至至少80%、90%或100%。在Hek Id1報導基因分析中，抑制抗體之IC₅₀ 可小於10 nM，較佳小於5 nM。一旦已鑑別及選擇適合抗體，便可藉由此項技術中已知之方法鑑別抗體之胺基酸序列。編碼抗體之基因可以使用簡併引子選殖。抗體可藉由常規方法重組產生。本發明亦提供編碼本發明之抗體分子之重鏈及/或輕鏈可變區(或全長H鏈及L鏈)之經分離DNA序列。變異體多核苷酸可包含序列表中所給定之序列之1、2、3、4、5、至多10、至多20、至多30、至多40、至多50、至多75或更多種核酸取代及/或缺失。通常，變異體具有1至20、1至50、1至75或1至100種取代及/或缺失。適合變異體可與本文中所揭示之核酸序列中之任一者之多核苷酸至少約70%同源，典型地與其至少約80%或90%且更適合地至少約95%、97%或99%同源。變異體可保留至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。變異體典型地保留約60%至約99%一致性、約80%至約99%一致性、約90%至約99%一致性或約95%至約99%一致性。通常至少關於多核苷酸之編碼區存在此等水準之同源性及一致性。量測同源性之方法為此項技術中熟知，且熟習此項技術者應理解，在本上下文中，基於核酸一致性計算同源性。如此同源性遍及至少約15、至少約30，例如至少約40、60、100、200或更多個連續核苷酸之區域(視長度而定)存在。如此同源性可遍及未經修飾之多核苷酸序列之全部長度存在。量測多核苷酸同源性或一致性之方法在此項技術中已知。例如UWGCG程式包提供可用於計算同源性之BESTFIT程式(例如以其預設設置使用)(Devereux等人(1984) Nucleic Acids Research 12, 第387-395頁)。亦可使用PILEUP算法及BLAST算法計算同源性或排列序列(通常以其預設設置)，例如如Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S, F等人(1990) J Mol Biol 215:403-10中所描述。用於實施BLAST分析之軟體可由國家生物技術資訊中心(National Centre for Biotechnology Information)公開獲得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此算法涉及藉由鑑別查詢序列中之長度W之短字來首先鑑別得高分序列對(high scoring sequence pair，HSP)，該等短字在與資料庫序列中相同長度之字比對時匹配或滿足某些正值臨限值分數T。T稱作鄰域字得分臨限值(Altschul等人，前述)。此等初始鄰域字命中充當用於啟動搜尋之種子以發現含有其之較長HSP。字命中沿各序列以兩個方向延伸，只要累積比對得分可增加即可。在以下情況中字命中在各個方向上之延伸中止：由於一或多個得負分殘基比對之積累，累積比對得分達至零或低於零；或達到任一序列之末端。BLAST算法參數W、T及X決定比對之靈敏度及速度。BLAST程式使用以下作為預設：字長度(w)為11，BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff 及Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919)比對(B)為50，期望值(E)為10，M=5，N=4，及兩股之比較。 BLAST算法進行兩個序列之間相似性之統計分析；參見例如，Karlin及Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787。藉由BLAST算法提供之一種相似性量測係最小總和概率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間之匹配將偶然發生之概率的指示。舉例而言，若第一序列與第二序列相比之最小總和概率為小於約1，典型地小於約0.1，適合地小於約0.01，且最適合地小於約0.001，則認為一序列相似於另一序列。舉例而言，最小總和概率可在約1至約0.001，通常約0.01至約0.001範圍內。同源物可與相關多核苷酸中之序列在小於約3、5、10、15、20或更多種突變上存在不同(其中各者可為取代、缺失或插入)。舉例而言，同源物可相差3至50種突變，通常3至20種突變。此等突變可遍及同源物之至少30，例如至少約40、60或100或更多個連續核苷酸之區域量測。在一個實施例中，變異體序列可借助基因密碼中之冗餘由序列表中所給定之特定序列而變化。DNA編碼具有4種主要核酸殘基(A、T、C及G) 且使用此等來「拼寫」表示編碼在生物體基因中之胺基酸蛋白的三字母密碼子。沿DNA分子之密碼子之線性序列經轉譯成由彼等基因編碼之蛋白中之胺基酸之線性序列。密碼高度簡併，61個密碼子編碼20種天然胺基酸且3個密碼子表示「終止」信號。因此，大多數胺基酸係由多於一個密碼子編碼，事實上有幾種係由四個或更多個不同密碼子編碼。本發明之變異體多核苷酸可因此編碼與本發明之另一多核苷酸相同之多肽序列，但由於使用不同密碼子編碼相同胺基酸而可能具有不同核酸序列。本發明之DNA序列可包含合成DNA (例如藉由化學處理產生的)、cDNA、基因體DNA或其任何組合。編碼本發明之抗體分子的DNA序列可藉由熟習此項技術者所熟知的方法獲得。舉例而言，編碼抗體重鏈及輕鏈之一部分或全部的DNA序列可按需要自確定的DNA序列或根據相應胺基酸序列來合成。可構築載體之一般方法、轉染方法及培養方法為熟習此項技術者所熟知。就此而言，參考「Current Protocols in Molecular Biology」, 1999, F. M. Ausubel (編), Wiley Interscience, New York及由Cold Spring Harbor Publishing出版之Maniatis Manual。亦提供一種宿主細胞，其包含一或多個選殖或表現載體，該一或多個選殖或表現載體包含編碼本發明之抗體的一或多個DNA序列。可使用任何適合宿主細胞/載體系統來表現編碼本發明之抗體分子的DNA序列。可使用細菌，例如大腸桿菌及其他微生物系統，或亦可使用真核(例如哺乳動物的)宿主細胞表現系統。適合哺乳動物宿主細胞包括CHO、骨髓瘤或融合瘤細胞。本發明亦提供一種用於製造根據本發明之抗體分子的方法，其包含在適合於自編碼本發明之抗體分子的DNA表現蛋白質的條件下培養含有本發明之載體的宿主細胞，且分離抗體分子。已鑑別本發明之Ab 7326抗體結合Gremlin-1之以下殘基：Ile110 (131)、Lys126 (147)、Lys127 (148)、Phe128 (149)、Thr129 (150)、Thr130 (151)、Arg148 (169)、Lys153 (174)及Gln154 (175)，其中Lys126 (147)、Lys127 (148)、Phe128 (149)、Thr129 (150)、Thr130 (151)、Arg148 (169)、Lys153 (174)及Gln154 (175)存在於一種Gremlin-1單體上且Ile110 (131)存在於第二Gremlin-1單體上。不在括號中之編號係基於結構檔案(且其與基於結構比對之鼠Gremlin-2之編號相相符)。括號中之數目表示基於SEQ ID NO:1之UniProt條目O60565之殘基。如在實例部分中所論述，此等抗原決定基殘基係使用NCONT分析法以距離Gremlin-1-Ab 7326 Fab複合物4 Å加以鑑別。本發明之抗體可因此結合於包含至少一個選自以下之殘基的抗原決定基：Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174及Gln175(殘基編號基於SEQ ID NO:1)。本發明之抗體可結合包含此等殘基中之2、3、4、5、6、7、8或全部9種(較佳至少5種殘基)的抗原決定基。本發明之抗體亦可識別其中Ile131存在於與其他殘基不同之Gremlin-1單體上的抗原決定基。雖然提供此等殘基用於人類Gremlin-1之特定序列，熟習此項技術者能輕易地使用常規技術推知此等殘基對於其他對應Gremlin序列(例如鼠)之位置。因此亦藉由本發明提供結合於包含此等其他Gremlin序列中之對應殘基的抗原決定基的抗體。為篩檢結合於特定抗原決定基之抗體，可以進行常規交叉阻斷分析，諸如Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)中所描述。其他方法包括丙胺酸掃描突變體、肽墨點法(Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63)或肽裂解分析。另外，可以採用諸如抗原決定基切除、抗原決定基提取及化學修飾抗原之方法(Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496)。此類方法為此項技術中所熟知。抗體抗原決定基亦可藉由x射線結晶學分析來測定。可因此經由抗體結合於Gremlin-1之x射線結晶學分析來評估本發明之抗體。抗原決定基尤其可以此方式藉由測定Gremlin-1上距抗體互補位殘基4Å以內之殘基來鑑別。 醫藥組合物、劑量及劑量方案 可在醫藥組合物中提供本發明之抗體或藉由篩檢方法鑑別之調節Gremlin-1之藥劑。醫藥組合物通常係經滅菌且通常包括醫藥學上可接受之載劑及/或佐劑。本發明之醫藥組合物可另外包含醫藥學上可接受之佐劑及/或載劑。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上可相容之任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似者。載劑可適用於非經腸，例如靜脈內、肌內、皮內、眼內、腹膜內、皮下、脊椎或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。替代地，載劑可適用於非非經腸投與，諸如局部、表皮或黏膜投與途徑。載劑可適用於經口投與。視投藥途徑而定，調節劑可包覆在材料中以保護化合物不受酸及可能使該化合物失活之其他天然條件的作用。本發明之醫藥組合物可包括一或多種醫藥學上可接受之鹽。「醫藥學上可接受之鹽」係指保留母體化合物之所需生物活性且不賦予任何非所需毒理學作用之鹽。此類鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。醫藥學上可接受之載劑包含水性載劑或稀釋劑。可用於本發明之醫藥組合物之適合之水性載劑的實例包括水、緩衝水及生理鹽水。其他載劑之實例包括乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似者)及其適合之混合物、植物油(諸如橄欖油)以及可注射之有機酯(諸如油酸乙酯)。在諸多情況下，組合物中會需要包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。治療組合物在製造及儲存條件下通常必須為無菌且穩定的。組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適合於較高藥物濃度之其他有序結構。本發明之醫藥組合物可包含其他活性成分。包含本發明之抗體或調節劑及使用說明書的套組亦處於本發明之範疇內。套組可另外含有一或多種其他試劑，諸如如上文所論述之其他治療劑或預防劑。可投與本發明之調節劑及/或抗體或其調配物或組合物用於預防性及/或治療性治療。在治療性應用中，已患有如上文所描述之病症或病況之個體以足以治癒、減輕或部分遏止病況或其症狀中之一或多者的量投與化合物。此類治療性治療可導致疾病症狀之嚴重程度降低，或無症狀時期之頻率或持續時間增加。足以實現此之量定義為「治療有效量 」。在預防性應用中，向處於如上文所描述之病症或病況風險下之個體以足以預防或降低病況或其症狀中之一或多者之後續作用的量投與調配物。足以實現此之量定義為「預防有效量 」。用於各目的之有效量將視疾病或損傷之嚴重程度以及個體之重量及一般狀態而定。經投藥個體可為人類或非人類動物。術語「非人類動物 」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。典型的為投與人類。本發明之抗體/調節劑或醫藥組合物可使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者經由一或多種投藥途徑投與。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或模式應視所需結果而變化。本發明之化合物或醫藥組合物之投與途徑的實例包括靜脈內、肌內、皮內、眼內、腹膜內、皮下、脊椎或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。如本文中所使用之片語「非經腸投與 」意謂除腸內及局部投與之外的投與模式，通常藉由注射。替代地，本發明之抗體/調節劑或醫藥組合物可以透過非非經腸途徑投與，諸如局部、表皮或黏膜投與途徑。本發明之抗體/調節劑或醫藥組合物可用於經口投與。本發明之抗體/調節劑或醫藥組合物之適合劑量可由熟練的醫學從業者來確定。本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量含量可變化，以獲得針對特定患者、組合物及投藥模式有效地達成所需治療響應而對患者無毒性的活性成分之量。所選劑量含量將視多種藥物動力學因素而定，該等因素包括所採用之本發明之特定組合物的活性；投與途徑；投與時間；待採用之特定化合物之排泄速率；治療持續時間；與所採用之特定組合物組合使用的其他藥物、化合物及/或材料；待治療之患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史；及醫學技術中熟知之類似因素。適合劑量可例如在待治療之患者之每公斤體重約0.01 µg至約1000 mg、通常每公斤體重約0.1 µg至約100 mg範圍內。舉例而言，適合劑量可為每天每公斤體重約1 µg至約10 mg或約10 μg至約5 mg。可調整劑量方案以提供最優的所需響應(例如治療響應)。舉例而言，可投與單一劑量，可隨時間投與若干分次劑量，或可依治療情況之緊急性所指示按比例減少或增加劑量。如本文所使用之單位劑型係指適合作為單個劑量用於待治療之個體的實體上離散之單位；各單位含有與所需醫藥載劑結合之經計算以產生所需治療效果的預定量之活性化合物。投與可按單個或多個劑量。多個劑量可經由相同或不同途徑且向相同或不同位置投與。替代地，可經由持續釋放調配物給藥，在此情況下需要較不頻繁之投與。劑量及頻率可視拮抗劑在患者中之半衰期及所需治療持續時間而變化。如上文所提及，本發明之調節劑/抗體或醫藥組合物可與一或多種其他治療劑共同投與。兩種或更多種試劑之組合投與可以多種不同方式達成。其均可以單個組合物形式一起投與，或其可以獨立組合物形式作為組合療法之部分來投與。舉例而言，一者可在另一者之前、之後或同時投與。 治療性指示 本發明之抗體或藉由本發明之篩檢方法鑑別之調節劑可用於治療、預防或改善與Gremlin-1活性相關之任何病況。例如，全部或部分地由Gremlin-1之傳信引起的任何病況。換言之，本發明係關於由Gremlin介導或影響之病況之治療、預防或改善。此類病況包括纖維化疾病，其包括腎纖維化(例如糖尿病腎病及慢性同種移植腎病)及特發性肺纖維化、肺動脈高壓、血管生成及癌症(例如結腸直腸癌)。以下實例說明本發明。實例 1 - 蛋白表現、純化、再摺疊及結構測定。 蛋白表現及包涵體製備 將經優化用於在大腸桿菌中表現之編碼序列(SEQ ID NO:20)之截短人類Gremlin-1使用BamHI/XhoI選殖至經修飾pET32a載體(Merck Millipore)，生成編碼具有N端6His-TEV標籤之Gremlin序列(pET-hGremlin1)之載體。表現序列：MGSSHHHHHHSSGENLYFQGS AMPGEEVLESSQEA LHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD；SEQ ID NO:2 (6His-TEV標籤之非Gremlin殘基以斜體顯示)。序列編號基於UniProt O60565及SEQ ID NO:1。 pET-hGremlin1 質體DNA用於轉型BL21(DE3)細胞。自LB/Amp瓊脂板選取單個耐安比西林群落且用於接種100 ml之LB/Amp之起子培養物。在37℃下振盪(200 rpm) 16小時之後，將25 ml起子培養物用於接種500 mL之2xTY/Amp培養基。在37℃振盪(250 rpm)培養物直至達到OD₆₀₀ 為3。隨後，向培養物補充20 mL之MOPS+丙三醇饋料混合物(1M MOPS pH 7.4、40 %丙三醇、0.5 % MgSO₄ 、0.42 % MgCl₂ )，用300 μM IPTG誘導且在17℃ 180 rpm下另外培育16小時。在離心機(4℃下，4,000 g，20分鐘)中收集細胞。將細胞集結粒在4℃下再懸浮於溶胞緩衝液(PBS pH 7.4、0.35 mg/ml溶菌酶、10 μg/ml DNA水解酶及3 mM MgCl₂ )，且藉由在4℃下以3,500 g離心30分鐘來收集不可溶部分。將集結粒化包涵體藉由在洗滌緩衝液(50 mM Tris、500 mM NaCl、0.5 %曲拉通(Triton) X-100，pH 8.0)中再懸浮來洗滌三次，隨後以21,000 g離心15分鐘。使用不含曲拉通X-100之洗滌緩衝液進行另外兩次洗滌。溶解作用 將包涵體再懸浮於變性緩衝液(8 M脲、100 mM Tris、1 mM EDTA、10 mM Na₂ S₄ O₆ 及100 mM Na₂ SO₃ ，pH 8.5)中，在室溫下攪拌16小時且藉由以21,000 g離心15分鐘來澄清。預再摺疊純化 將經溶解包涵體裝載在於8 M脲、50 mM MES、200 mM NaCl、1 mM EDTA (pH 6.0)中平衡之丙烯葡聚糖凝膠(Sephacryl) S-200 26/60管柱(120 mL) 上。將含有Gremlin-1蛋白之溶離份用6 M脲、20 mM MES (pH 6.0)稀釋且裝載在HiTrap Sp HP陽離子交換管柱上及用1 M NaCl梯度以10倍管柱體積(10 CV)溶離。彙集含有經純化、變性hGremlin-1蛋白之溶離份。再摺疊 將經變性純化Gremlin-1蛋白逐滴添加至再摺疊緩衝液(50 mM Tris，pH 8.5、150 mM NaCl、5 mM GSH及5 mM GSSG、0.5 mM半胱胺酸、5 mM EDTA、0.5 M精胺酸)至最終濃度0.1 mg/ml，且在4℃下在恆定攪拌下培育5天。5天之後，將Gremlin-1蛋白針對20 mM HEPES、100 mM NaCl (pH 7.5)透析。在透析之後將蛋白施加於肝素HiTrap管柱且用0至100%肝素溶離緩衝液(20 mM HEPES、1 M NaCl，pH 7.5)之梯度以20 CV溶析。經恰當摺疊之蛋白以1 M NaCl 溶離而任何摺疊異常之蛋白以更低鹽濃度溶離。將以1 M NaCl溶離之蛋白濃縮且在經20 mM Hepes，pH 7.5、1 M NaCl平衡至S75 26/60管柱上進一步純化。將蛋白藉由SDS PAGE (在膠凝中偏移)特徵化，使用液相色譜質譜(LC-MS)展示具有預期分子量及二硫鍵之恰當配置，且在細胞分析中展示活性(ID1報導分析)。Gremlin 1 結構測定 使用懸掛滴入法藉由以1:1比率混合6.6 mg/ml之Gremlin 1溶液與0.1 M檸檬酸(pH 4)、1 M氯化鋰及27%聚乙二醇(PEG) 6000來生長Gremlin 1蛋白結晶。在收集資料之前，藉由向結晶緩衝液中添加20%丙三醇來對結晶進行低溫保護。收集金剛石光源(Diamond Light Source)下之繞射資料且使用XDS (Kabsch, Wolfgang (2010) Acta Crystallographica Section D 66, 125-132)處理。繞射資料統計概述在下表中：表2：繞射資料統計

*括號中之值對應於最高解析度層 **r.m.s.d均方根偏差使用Phaser (McCoy等人, J Appl Cryst (2007), 40, 658-674)藉由分子替代來解決Gremlin-1結構，且Gremlin-1模型可獲自專用Gremlin-1/Fab複合物座標。所得Gremlin-1模型含有組織成兩個二聚物之四個Gremlin 1單體複本。使用Coot (Emsley等人Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 66 (4), 486-501)作出模型校正，且使用Refmac (Murshudov等人REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 2011;67(第4部分):355-367)細化座標。使用Molprobity (Chen等人(2010) MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica D66:12-21)驗證最終座標。模型細化統計之概述顯示於上表2中。實例 2 - Gremlin - 1 上之 BMP 結合殘基 如上文所論述，Gremlin-1屬於骨形態形成蛋白(bone morphogenic protein，BMP)拮抗劑蛋白家族之稱為DAN家族之子群內。在DAN家族中，Gremlin-1與Gremlin-2 (PRDC)享有最大同源性。描述於實例1中之2.7 Å人類Gremlin-1結構與發表之鼠Gremlin-2結構 (Nolan等人(2013), Structure, 21, 1417-1429)享有許多共同特徵。總摺疊極相似，形成反平行非共價二聚體之Gremlin-1之兩個複本以拱形配置。各個單體採用特徵性的手指型-腕型-手指型配置，以胱胺酸結基元朝向腕型末端且對著手指型(圖2)。在兩個結構中之可見序列內，蛋白之間之序列一致性為52%至67%。最高度保守之區域處於延伸的二聚體界面中，其中所有關鍵接觸殘基均為100%保守(圖3)。參與BMP之2、4及7與鼠Gremlin-2 (PRDC)及DAN (NBL1)結合之殘基已使用誘變鑑別(Nolan等人(2013), Structure, 21, 1417-1429及Nolan等人(2014) J. Biol. Chem. 290, 4759-4771)。預測的BMP結合抗原決定基涵蓋二聚體之凸表面上橫跨兩個單體之疏水性區片(圖4及5)。藉由誘變鑑別六種殘基：Trp72、Phe96、Tyr98、Phe104、Tyr105及Phe117 ，且其在人類Gremlin-1中100%保守(編號基於鼠Gremlin-2序列)。同源性程度延伸至在蛋白中採用相同構形之側鏈之定位(圖5)。用於Gremlin PDB檔案中之胺基酸編號與發表之基於結構比對之鼠Gremlin-2結構中之編號相匹配。此實現在描述結構時之胺基酸之同類比較。然而，出於明晰之目的，鑑別為在BMP結合中起作用之關鍵殘基展示如下，其中基於SEQ ID NO:1之PDB檔案及UniProt檔案之編號在括號中： Trp72(93)、Phe96(117)、Tyr98(119)、Phe104(125)、Tyr105(126)及Phe117(138)。在鼠Gremlin -2及人類Gremlin-1中，疏水性BMP結合抗原決定基由各個蛋白之N端殘基形成之α螺旋部分掩埋。已提出BMP結合之模型，其中N端可撓曲，暴露完整BMP結合界面(Nolan等人(2013), Structure, 21, 1417-1429)。在圖4中，在繪製揭示各個蛋白上之BMP結合面之相似性的表面之前已將N端殘基自人類Gremlin-1及鼠Gremlin-2結構中移除。文獻僅描述影響BMP結合之六種殘基之誘變。很可能，實際BMP抗原決定基覆蓋更大表面積，包涵鄰近胺基酸。藉由突出顯示全部殘基，在該等突變之6Å以內，在Gremlin-1之表面上揭示出Gremlin-1之較大區域可以潛在地被治療劑標靶(圖11)。此更大面積的區域涵蓋人類Gremlin-1之以下胺基酸： Asp92-Leu99 Arg116-His130 Ser137-Ser142 Cys176-Cys178 (編號基於SEQ ID NO:1) 藉由組合發表的資訊與人類Gremlin-1之晶體結構資訊，已鑑別出提供自身作為用於治療性干預阻斷其與BMP之相互作用之潛在途徑的人類Gremlin-1之區。實例 3 - Hek Id1 報導基因分析 背景 Hek Id1報導基因分析使用殖株(Clone) 12 Hek293-Id1報導細胞。此細胞株經Id1轉錄因子穩定轉染。Id1係BMP傳信路徑中之轉錄因子。已知Gremlin結合BMP防止結合於其受體而降低來自報導基因之螢光素酶傳信。因此，使用此報導分析，有可能篩檢抗Gremlin抗體且看是否存在任何阻斷Gremlin與BMP之相互作用的抗Gremlin抗體。若存在此相互作用之阻斷，則將在此等細胞中發現螢光素酶傳信之復原。方法在含有10% FCS、1×L-麩醯胺酸及1×NEAA之DMEM中培養殖株12細胞。亦在潮黴素(Hygromycin) B (200 µg/ml) 存在下生長細胞以確保細胞不失去Id1基因表現。在含有0.5% FCS、1×L-麩醯胺酸及1×NEAA之DMEM中分析細胞。細胞在分析中之短時間內不需要潮黴素B。將細胞在PBS中洗滌，使用細胞解離緩衝液移起，旋轉且統計之後以5×104/孔以70 µl接種(密度7.14×10⁵ /ml)。所用板為白色不透明經聚D-離胺酸塗佈之96孔無菌板。細胞放入培育箱中約3至4小時來沈澱下來。將BMP雜二聚體在4 mM HCL中復原至200 µg/ml。使用玻璃瓶將BMP在分析培養基中稀釋至10 µg/ml，得到新處理原料。在聚丙烯板中，將Gremlin-1以1:2稀釋用於8點劑量響應曲線，其中頂部最終劑量為1 μg/ml。每孔添加20 µl培養基之其他體積，且將板在37℃培育45分鐘。將以100倍製備之BMP添加至除僅含有細胞之孔之外的所有孔中。所有孔使用分析培養基組成60 µl且在37℃下另外培育45分鐘。培育後，分析板之每孔轉移30 µl樣品，且在量測發光傳信之前培育20至24小時。預先在室溫下解凍Cell Steady Glo。在添加試劑之前，將分析板冷卻至室溫約10至15分鐘。藉由在室溫下在振盪器上添加cell steady glo試劑(100 µl) 20分鐘偵測到螢光素酶傳信，且在Synergy 2上使用cell titre glo方案量測發光。自含有BMP之孔產生最大值傳信，且自僅含有細胞之孔產生最小傳信。結果在Hek-Id1報導基因分析中測試Gremlin-1全長及截短形式以確認針對BMP4/7之阻斷活性。全長蛋白之結果顯示於圖6A中，且截短蛋白之結果顯示於圖6B中。基於分析中之最大及最小信號計算來自劑量響應分析的抑制百分比且使用4參數邏輯擬合法擬合資料。基於曲線之拐折點計算IC₅₀ 。表3：在Hek-Id1報導基因分析中全長Gremlin-1及截短Gremlin-1之效力結果。

結論在Hek-Id1報導基因分析中Gremlin 1能夠抑制BMP 4/7傳信。實例 4 - 抗 Gremlin - 1 抗體之產生 藉由免疫及庫平移衍生抗Gremlin-1抗體。該庫係未處理人類庫經V區由獻血擴增來內部產生。免疫由第一輪免疫產生26種結合Gremlin-1之相異抗體。將此等抗體按比例擴大及純化用於在篩檢分析中測試。使用來自R&D Systems之重組人類Gremlin自庫中淘選25種人類及鼠交叉反應抗體。選擇10種抗體作為scFv按比例擴大及純化用於在篩檢分析中測試。實例 5 - 抗 Gremlin - 1 抗體之篩檢 使用實例3中所描述之Hek-Id1報導基因分析且藉由量測SMAD磷酸化來篩檢抗體。SMAD1、5及8在BMP傳信時經磷酸化。因此Gremlin-1之抑制劑增加SMAD磷酸化。在A549細胞上或人類肺纖維母細胞上進行SMAD磷酸化分析。使用MSD測定磷酸化水準。結果在Hek-Id1報導基因分析中，無明顯與免疫衍生抗體之命中(10倍過量之抗體針對BMP4/7雜二聚體測試)。結果顯示於圖7中。相比之下，在Hek-Id1報導基因分析中(50倍過量之抗體與50% gremlin劑量)若干庫衍生抗體能夠復原傳信(圖8)。其中，Ab2416及Ab2417含有高水準之內毒素。在10倍過量下Ab7326保持阻斷能力且80%抑制Gremlin-1濃度。其他結果展示於圖9A (人類gremlin)及圖9B (鼠Gremlin)中。此等圖顯示Ab7326 (標記為PB376)至多15 nM之滴定。顯示當由人類(IC₅₀ 為1.3nM)或鼠(IC₅₀ 為0.2nM) Gremlin阻斷時Ab7326復原BMP之傳信。該抗體起到人類及鼠IgG1之作用。鼠及人類IgG1之序列展示如下：因為Ab7326來自未處理人類庫，其中Ab選殖為scFv，為將7326可變區再選殖為全長Ab或Fab，有必要使用引子/簡併引子池進行PCR擴增VH及VK。隨後分解經擴增PCR產物且同時選殖至鼠載體及人類載體中。隨著VH及VK經引子/簡併引子池擴增，得到產物之兩個變異體形式，其不同之處在於在PCR方法期間由細微差別的引子黏著產生之單個胺基酸殘基。重鏈可變區之兩個變異體形式在位置6處之單個胺基酸上不同，且輕鏈可變區之兩個變異體形式在位置7處之單個胺基酸上不同，如下文所示： · 重鏈可變區變異體1在位置6處具有麩胺酸(E)。 · 重鏈可變區變異體2在位置6處具有麩醯胺酸(Q)。 · 輕鏈可變區變異體1在位置7處具有絲胺酸(S)。 · 輕鏈可變區變異體2在位置7處具有蘇胺酸(T)。鼠全長IgG1-重鏈變異體1 (SEQ ID NO:14)

鼠全長IgG1-輕鏈變異體1 (SEQ ID NO:15)

鼠全長IgG1-重鏈變異體2 (SEQ ID NO:28)

鼠全長IgG1-輕鏈變異體2 (SEQ ID NO:29)

人類全長IgG1-重鏈變異體1 (SEQ ID NO:30)

人類全長IgG1-輕鏈變異體1 (SEQ ID NO:31)

人類全長IgG1-重鏈變異體2 (SEQ ID NO:16)

人類全長IgG1-輕鏈變異體2 (SEQ ID NO:17)

使用Kabat方法測定抗體CDR (在以上序列中以粗體突出顯示)。使用Chothia定義之其他HCDR1殘基呈斜體。恆定區序列亦加下劃線。使用抗Gremlin 1抗體之p-SMAD傳信之復原顯示於下表4中。表4：p-SMAD傳信之復原

結果顯示為藉由BMP單獨之SMAD磷酸化之百分比(對照BMP)。使用來自特發性肺纖維化患者之肺纖維母細胞進行實驗。將rhGremlin -1及抗Gremlin-1抗體在室溫下預培育45分鐘。隨後將rhGremlin -1及抗Gremlin-1抗體與BMP添加至細胞中保持30分鐘。表5則顯示SMAD磷酸化分析中之其他結果，其中研究由抗Gremlin-1抗體自Gremlin1-BMP複合物中置換BMP-2或BMP4/7。另外使用來自特發性肺纖維化患者之肺纖維母細胞進行實驗。在室溫下將rhBMP-2或rhBMP 4/7使用rhGremlin-1預培育1小時。將BMP-2-或BMP4/7-Gremlin-1複合物使用不同濃度之抗Gremlin-1抗體在4℃下培育隔夜。抗體濃度表示板上之最終濃度。表5：由抗Gremlin-1抗體自Gremlin 1-BMP複合物中置換BMP-2或BMP4/7

顯示於表5中之結果表明Ab7326可自Gremlin 1-BMP複合物中置換已複合的BMP-2或BMP4/7。相比於抗體2484，Ab7326可以低得多的濃度實現此置換。此提供證據，Ab7326可能以異位方式起作用，與吾人關於Ab7326之結合位點遠離gremlin-1上之已知BMP結合區的發現一致。由此即使當BMP已複合於gremlin-1時Ab7326亦能夠獲得異位結合位點，引起對gremlin活性之抑制顯著提高。實例 6 - 獲得與 7326 Fab 複合之 Gremlin - 1 之晶體結構 與Ab 7326 Fab複合之人類Gremlin-1之晶體結構以2.1 Å之解析度解析。Fab序列展示如下：重鏈：SEQ ID NO:18

輕鏈：SEQ ID NO:19

隨後使用CCP4軟體NCONT鑑別距Gremlin-1與Fab之間4Å之所有接觸點。鑑別出以下殘基：Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174及Gln175(編號基於SEQ ID NO:1之UniProt序列(在鼠Gremlin-2之編號相匹配之結構檔案中編號為Ile110、Lys126、Lys127、Phe128、Thr129、Thr130、Arg148、Lys153及Gln154))。圖10顯示Gremlin-Fab複合物之結構模型，Fab抗原決定基殘基相對於BMP結合區顯示。 Ab 7326為異位地起作用之抑制抗體，亦即其相距於BMP結合區地結合。實例 7 - 抗 Gremlin - 1 抗體 Ab7326 與 Gremlin - 1 之結合之親和力量測。 使用表面電漿子共振進行抗Gremlin-1抗體Ab 7326與Gremlin-1之結合之親和力量測。分析格式：在抗鼠Fc表面上採集抗gremlin mIgG，隨後1至5 nM滴定Gremlin。緩衝液對照：將緩衝液在抗mFc表面上經過，隨後將Gremlin-1在抗mFc表面上經過，以檢查背景結合。緩衝液：HBS-EP，pH 7.4且最終NaCl濃度0.3至1.0 M。結果：發現結合親和力(處理為5次測定之平均K_D 值)低於100 pM。實例 8 - 在小鼠中抗 Gremlin - 1 抗體對長期低氧 / SU5416 - 誘導之肺動脈高壓之作用之活體內評估 概述 TGFβ超家族不平衡已與若干肺病變顯著相關，包括肺動脈高壓(PAH)(Budd及Holmes Pharm Ther 2012)。Gremlin-1已涉及PAH之進展及進程(Thomas等人AJP 2009；Ciuclan等人AJP 2013)。近期研究已表明，在PAH之臨床前低氧/SU5416模型中，抗gremlin-1抗體可以抑制肺動脈高壓之進展(Ciuclan等人AJP 2013)。在此吾人評估在PAH之臨床前低氧/SU5416小鼠模型中抗Gremlin1抗體對血液動力學及血管重構之影響。低氧/SU5416引起右心室收縮壓(RVSP)顯著增加及右心臟肥大(圖12及圖15)。相比於IgG1及PBS對照組，投與抗Gremlin-1引起RVSP顯著減少(P＜0.005)。觀測到抗Gremlin-1對保持在常氧中之動物之RVSP無顯著影響(圖12)。觀測到對系統壓(平均動脈血壓或MABP；圖13)或右心臟肥大(圖14)無影響。總體而言此研究支持gremlin-1在PAH之長期低氧/SU5416模型中肺血管重構之進展及升高的RVSP的作用及抗gremlin-1抗體在其治療中之用途。背景肺高血壓(Pulmonary hypertension，PH)係肺動脈中所量測之壓力升高的血液動力學狀態。臨床上此由平均靜息肺動脈壓(mean resting pulmonary arterial pressure，mPAP) ＞25 mmHg，肺血管阻力(pulmonary vascular resistance，PVR)≥3個Wood單位且肺楔壓≤15 mmHg界定(Badesch等人2009)。PH之病理性特徵為多層面的且包括肺動脈壓、小至中等動脈之血管重構、右心室肥大及最終右心臟衰竭(Faber及Loscalzo 2004)。PH由WHC歸類成五個主要分類，包括組I。第I組代表肺動脈高壓，其包括特發性PAH及可遺傳PAH以及引起與其他併發症(諸如系統性硬化症)結合之關聯PAH (Simonneau等人2009)。已將若干預置突變與可遺傳及特發性PAH患者之PAH之進展聯繫起來，最主要的係向骨成形性蛋白受體BMPR2之突變(Budd及Holmes Pharm Ther 2012)。除BMP中之突變以外，亦報導了患有PAH之患者中之活化下游傳信組分Smad (Budd及Holmes Pharm Ther 2012)。最近，研究已鑑別出在患有之PAH患者中BMP抑制劑gremlin (gremlin-1及2)之水準增加(Cahill等人Circ 2012)。與gremlin-1在PAH之進展中之功能性作用一致，在低氧鼠肺中gremlin-1之單倍體缺失(haplodeficiency)強化BMP傳信且藉由緩解血管重構引起肺血管阻力降低(Cahill等人Circ 2012)。此等觀測結果由Ciuclan及同事(AJP 2013)進一步支持，他們展示在小鼠中抗gremlin-1抗體改善長期低氧/SU5416誘導之肺動脈高壓。近期研究表明，無基因機制可以貢獻於系統性硬化症患者之降低的BMPR2表現且可以貢獻於PAH之進展(Gilbane等人AJRCCM)。總體而言，BMP超家族軸不平衡可以導致諸如PAH之肺病變之進展。本研究之目的係評估在長期低氧/SU5416小鼠模型中抗Gremlin-1對PAH之進展之活體內影響。材料及方法 試劑伊馬替尼： Science Warehouse 1625-1000。 SU5416：R & D Systems 3037。 αSMA抗體：Dako M085129-2。 VWF抗體：Dako A008202-2。經生物素標記之山羊抗兔IgG抗體：Vector Labs BA-1000。經生物素標記之馬抗鼠IgG抗體，大鼠吸附：Vector Labs BA-2001。羧基甲基纖維素：Sigma C5678 419273。吐溫(TWEEN) 80：Sigma P1754。苯甲醇：Sigma 305197；402834。氯化鈉：Sigma S7653；VWR 10241。 VECTASTAIN ABC-AP套組：Vector Labs AK-5000。 VECTASTAIN Elite ABC套組：Vector Labs PK-6100。正常馬血清：Vector Labs，目錄參考S-2000。聚山梨醇酯：Sigma 59924。 實驗方案 動物將C57Bl/6小鼠圈養在無特定病原體設施中，其可以隨意獲取食品及水且暴露於12小時亮/暗週期。此動物研究經英國內政部動物(科學程序)法 1986 (UK Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986)許可。 肺動脈高壓之低氧 / SU5416 小鼠模型 將8至10週齡C57Bl/6雌性小鼠分組(表6)。將所有組稱重且以每公斤20 mg皮下(s.c.)投與100 µl之媒劑(0.5%羧基甲基纖維素(CMC)；0.9%氯化鈉(NaCl)；0.4%聚山梨醇酯80；0.9%苯甲醇/去離子水)中之SU5416，如Ciuclan等人AJRCCM 2013中所描述。視需要，投與第二次皮下注射，如表6中所概述，其含有PBS，30 mg/kg IgG1，或30 mg/kg抗Gremlin-1中任一者。同時對低氧+伊馬替尼組中之小鼠用伊馬替尼進行顎輸注以提供100 mg/kg/天。隨後將低氧鼠組置於常壓性低氧(10% O₂ )室中，同時常氧組中之小鼠在與室相同之房間中在常氧(21% O₂ )條件中圈養。表 6 ： 處理組 ：將C57Bl/6小鼠如所指示地分成處理組。

在第7天及第14天將所有小鼠經稱重且接受皮下另外劑量之20 mg/kg SU5416。視需要，以另外皮下注射PBS，30 mg/kg IgG1；或30 mg/kg抗Gremlin-1來向小鼠投藥(如表6中所概述)。在第21天獲取右心室收縮壓(RVSP)及平均動脈血壓(MABP)且收集組織。 右心室收縮壓及組織收集 在三週低氧暴露及如表6中所概述之相關藥物處理之後自動物獲得RVSP及MABP之血液動力學量測值。將動物用1.5%異氟醚麻醉且仰臥置於恆溫控制在37℃下之加熱毯上。首先，分離右頸靜脈且引入壓力導管(具有1.4F之直徑的Millar鼠SPR-671NR壓力導管，Millar Instruments，UK)且伸進右心室來測定RVSP。其次，藉由分離左共用頸動脈來量測MABP且引入壓力導管。RVSP及MABP均記錄在預校PowerLab系統(ADInstruments，Australia)上。藉由異氟醚過度劑量麻醉來將動物安樂死且收集全血。將全血離心(220×g；2分鐘)，且移除血清且於-80℃下儲存。移除心臟且記錄右心室及左心室重量。用2.5 ml鹽水經由右心室灌注肺。左肺藉由用10%福馬林充氣固定，之後嵌入石蠟且切片。將右肺在液氮中速凍且於-80℃下儲存。 組織學 將載片脫蠟且用二甲苯及濃度梯度之乙醇來再含水。將載片浸沒在0.3% H₂ O₂ /甲醇中30分鐘以取回抗原，在PBS中洗滌3次且在1:30之正常馬血清/PBS中阻斷1小時。將濃度為1:100之抗αSMA初級抗體添加至各個載片中且在4℃下培育隔夜，隨後在PBS中沖洗三次，持續5分鐘。將經生物素標記之馬抗鼠IgG抗體，大鼠吸附之二級抗體1:200稀釋且吸取在各個載片上且培育45分鐘；隨後在PBS中洗滌3次持續5分鐘。按照製造商之說明書，提前30分鐘製備抗生物素蛋白生物素複合鹼性磷酸酶(ABC-AP)且置於各個載片上30分鐘；隨後洗滌3次持續5分鐘。按照套組說明書製備AP受質且吸取在各個載片上且使其發展；隨後洗滌3次持續5分鐘。將濃度為1:100之抗vWF初級抗體添加至各個載片中且在4℃下培育隔夜，隨後在PBS中沖洗三次持續5分鐘。將經生物素標記之山羊抗兔IgG二級抗體1:200稀釋且放置在各個載片上45分鐘；隨後在PBS中洗滌3次持續5分鐘。按照套組說明書提前30分鐘製備ABC且放在各個載片上30分鐘；隨後洗滌3次持續5分鐘。按照套組說明書製備DAB受質且吸取在各個載片上且使其發展約5至10分鐘；隨後洗滌3次持續5分鐘。將載片用蘇木精複染約40秒，脫水且使用pertex安放蓋玻片。使用Hamamatsu NanoZoomer 2.0-HT載片掃描儀(Hamamatsu，Welwyn Garden City，UK)對所有載片進行數位掃描。 資料及統計分析 自各個低氧組隨機採集大於40血管進行肌化程度之評估。由至少四個獨立觀測者來對血管評分：0=無肌化；1=部分肌化；2=完全肌化；且針對各個血管測定模態值。測定血管完全、部分或無肌化之百分比且繪製平均±SEM曲線。進行單因素變異數分析以確定顯著性*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005；****P＜0.001。結果相比於在PBS單獨或IgG1對照組中之21天常氧/SU5416單獨，在暴露於長期常壓性低氧(10% O₂ )之後，投與SU5416 (20mg/kg)引起RVSP顯著(P＜0.01)增加(圖12)。IgG1與PBS處理組之間未觀測到顯著差異。藥物處理對經投與SU5416保持在低氧中之小鼠之升高RVSP之影響：相比於對照組，伊馬替尼引起RVSP顯著(P＜0.001)降低。相比於IgG1及PBS對照組，抗Gremlin 1引起RVSP顯著(P＜0.005)降低。觀測到抗Gremlin 1對保持在常氧中之動物之RVSP無顯著影響(圖12)。在低氧及常氧下評估抗Gremlin 1 (n=4)或IgG1媒劑對照(n=4)對MABP之影響(圖13)。觀測到處理對MABP無顯著影響。測定右心臟肥大(右心室/左心室+隔膜重量)(圖14)。相比於在PBS單獨或IgG1對照組中之21天常氧/SU5416單獨，在暴露於長期常壓性低氧(10% O₂ )之後，投與SU5416 (20 mg/kg)引起右心臟肥大(RV/LV+S)顯著(P＜0.01)增加(圖14)。觀測到藥物處理(伊馬替尼或抗Gremlin 1)對經投與SU5416保持在低氧中之小鼠之升高的RVSP無顯著影響。藉由將嵌入石蠟之肺切片染色來評估血管重構之程度。將血管進行馮威里氏因子(vWF)染色以鑑別內皮細胞及平滑肌肌動蛋白(αSMA)染色以評估肌化程度。藉由Hamamatsu NanoZoomer 2.0-HT載片掃描儀將圖像數位化，且對自常氧IgG1及各個低氧組隨機採集之至少40個血管進行肌化程度之評估。由至少四個獨立觀測者來對血管評分：0=無肌化；1=部分肌化；2=完全肌化；且針對各個血管測定模態值，繪製完全、部分或無肌化血管之百分比曲線(圖15)。在暴露於長期常壓性低氧(10% O₂ )之後投與SU5416 (20 mg/kg)引起完全肌化(P＜0.001)及部分肌化(P＜0.01)之顯著增加，且無肌化(P＜0.001)血管顯著降低。藥物處理對經投與SU5416保持在低氧中之小鼠之升高的RVSP之影響：伊馬替尼引起完全肌化(P＜0.01)血管之顯著(P＜0.001)降低。而且，相比於低氧SU5416 IgG1對照組，抗Gremlin 1引起顯著(分別P＜0.001與P＜0.05)(圖15)。相比於低氧SU5416 IgG1對照組，觀測到藥物處理(伊馬替尼或抗Gremlin1)對部分肌化血管之百分比無顯著影響。相比於低氧SU5416 IgG1對照組，藥物處理(伊馬替尼或抗Gremlin 1)引起無肌化血管之百分比增加，然而此未能達到顯著。討論吾人吾人評估在長期低氧/SU5416模型中抗gremlin-1抗體對PAH之進展之影響。在PAH之低氧/SU5416小鼠模型中抗gremlin-1抗體顯著抑制RVSP (圖12)及血管重構(圖15)，同時展現對系統壓(MABP)(圖13)無影響。吾人觀測到抗gremlin-1抗體對常氧/SU5416處理之小鼠之RVSP無顯著影響。抗gremlin1抗體之影響與由Ciuclan及同事(AJP 2013)所作出之觀測結果一致，在其中他們展示在PAH之長期低氧/SU5416-小鼠模型中與抗gremlin-1抗體之拮抗作用改善升高的RVSP及血管重構(圖12及圖15)。與Ciuclan及同事相反，在此研究中吾人注意到抗gremlin-1抗體對右心臟肥大無顯著影響(圖14)。然而在此研究中吾人注意到對照藥物伊馬替尼對低氧/SU5416小鼠之右心臟肥大之進展無顯著影響。總體而言，此研究支持gremlin-1在PAH之長期低氧/SU5416模型中肺血管重構之進展及升高的RVSP的作用及抗Gremlin-1抗體在其治療中之用途。參考文獻 Badesch DB, Champion HC, Sanchez MA, Hoeper MM, Loyd JE, Manes A, McGoon M, Naeije R, Olschewski H, Oudiz RJ, Torbicki A. Diagnosis and assessment of pulmonary arterial hypertension. J Am Coll Cardiol. 2009 Jun 30;54(1 Suppl):S55-66. doi: 10.1016/ j.jacc.2009.04.011. Review. PMID:19555859. Budd DC, Holmes AM. Targeting TGFβ superfamily ligand accessory proteins as novel therapeutics for chronic lung disorders. Pharmacol Ther. 2012 Sep;135(3):279-91. doi: 10.1016/j.pharmthera. 2012.06.001. Epub 2012 Jun 18. Cahill E, Costello CM, Rowan SC, Harkin S, Howell K, Leonard MO, Southwood M, Cummins EP, Fitzpatrick SF, Taylor CT, Morrell NW, Martin F, McLoughlin P. Gremlin plays a key role in the pathogenesis of pulmonary hypertension. Circulation. 2012 Feb 21;125(7):920-30. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.111.038125. PMID:22247494. Ciuclan L, Sheppard K, Dong L, Sutton D, Duggan N, Hussey M, Simmons J, Morrell NW, Jarai G, Edwards M, Dubois G, Thomas M, Van Heeke G, England K. Treatment with anti-gremlin 1 antibody ameliorates chronic hypoxia/SU5416-induced pulmonary arterial hypertension in mice. Am J Pathol. 2013 Nov;183(5):1461-73. doi: 10.1016/j.ajpath.2013.07.017. PMID:24160323 Ciuclan L, Hussey MJ, Burton V, Good R, Duggan N, Beach S, Jones P, Fox R, Clay I, Bonneau O, Konstantinova I, Pearce A, Rowlands DJ, Jarai G, Westwick J, MacLean MR, Thomas M. Imatinib attenuates hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension pathology via reduction in 5-hydroxytryptamine through inhibition of tryptophan hydroxylase 1 expression. Am J Respir Crit Care Med. 2013 Jan 1;187(1):78-89. doi: 10.1164/rccm.201206-1028OC. PMID:23087024 Farber HW, Loscalzo J. Pulmonary arterial hypertension. N Engl J Med. 2004 Oct 14;351(16):1655-65. Review. PMID:15483284. Gilbane AJ, Derrett-Smith E, Trinder SL, Good RB, Pearce A, Denton CP, Holmes AM. Impaired bone morphogenetic protein receptor II signaling in a transforming growth factor-β-dependent mouse model of pulmonary hypertension and in systemic sclerosis. Am J Respir Crit Care Med. 2015 Mar 15;191(6):665-77. doi: 10.1164/rccm.201408-1464OC. Simonneau G, Robbins IM, Beghetti M, Channick RN, Delcroix M, Denton CP, Elliott CG, Gaine SP, Gladwin MT, Jing ZC, Krowka MJ, Langleben D, Nakanishi N, Souza R. Updated clinical classification of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 2009 Jun 30;54(1 Suppl):S43-54. doi: 10.1016/j.jacc.2009.04.012. Review. PMID: 19555858. Thomas M, Docx C, Holmes AM, Beach S, Duggan N, England K, Leblanc C, Lebret C, Schindler F, Raza F, Walker C, Crosby A, Davies RJ, Morrell NW, Budd DC. Activin-like kinase 5 (ALK5) mediates abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells from patients with familial pulmonary arterial hypertension and is involved in the progression of experimental pulmonary arterial hypertension induced by monocrotaline. Am J Pathol. 2009 Feb;174(2):380-9. doi: 10.2353/ ajpath.2009.080565. Epub 2008 Dec 30.序列表 SEQ ID NO : 1 ( 人類 Gremlin - 1 ；Uniprot ID ：O60565 )

SEQ ID NO:2 ( 用於結晶學中之具有 N 端 標籤之人類截短 Gremlin - 1 )

SEQ ID NO:3 ( 組合有 Kabat 及 Chothia 之 Ab 7326 HCDR1 )

SEQ ID NO:4 (Ab 7326 HCDR1 Kabat)

SEQ ID NO:5 (Ab 7326 HCDR2 Kabat)

SEQ ID NO:6 (Ab 7326 HCDR3 Kabat)

SEQ ID NO:7 (Ab 7326 LCDR1 Kabat)

SEQ ID NO:8 (Ab 7326 LCDR2 Kabat)

SEQ ID NO:9 (Ab 7326 LCDR3 Kabat)

SEQ ID NO:10 (Ab 7326 重鏈可變區變異體 1)

SEQ ID NO:11 (Ab 7326 輕鏈可變區變異體 1)

SEQ ID NO:12 (Ab 7326 重鏈可變區變異體 2)

SEQ ID NO:13 (Ab 7326 輕鏈可變區變異體 2)

SEQ ID NO:14 ( 鼠全長 IgG1 重鏈變異體 1)

SEQ ID NO:15 ( 鼠全長 IgG1 輕鏈變異體 1)

SEQ ID NO:16 ( 人類全長 IgG1 重鏈變異體 2)

SEQ ID NO:17 ( 人類全長 IgG1 輕鏈變異體 2)

SEQ ID NO:18 (Fab 重鏈變異體 1)

SEQ ID NO:19 (Fab 輕鏈變異體 1)

SEQ ID NO:20 ( 用於結晶學中之不含 N 端 標籤之人類截短 Gremlin - 1 )

SEQ ID NO:21 ( SEQ ID NO : 1 之缺少胺基酸 1 - 21 之信號肽的成熟 Gremlin - 1 序列 )

SEQ ID NO:22 ( 人類 IgG4P 重鏈變異體 1)

SEQ ID NO:23 ( 人類 IgG4P 輕鏈變異體 1)

SEQ ID NO:24 ( 人類 IgG1 重鏈 DNA 變異體 1)

SEQ ID NO:25 ( 人類 IgG1 輕鏈 DNA 變異體 1)

SEQ ID NO:26 ( 人類 IgG4P 重鏈 DNA)

SEQ ID NO:27 ( 人類 IgG4P 輕鏈 DNA)

SEQ ID NO:28 ( 鼠全長 IgG1 重鏈變異體 2)

SEQ ID NO:29 ( 鼠全長 IgG1 輕鏈變異體 2)

SEQ ID NO:30 ( 人類全長 IgG1 重鏈變異體 1)

SEQ ID NO:31 ( 人類全長 IgG1 輕鏈變異體 1)

SEQ ID NO:32 (Fab 重鏈變異體 2)

SEQ ID NO:33 (Fab 輕鏈變異體 2)

SEQ ID NO:34 ( 人類 IgG4P 重鏈變異體 2)

SEQ ID NO:35 ( 人類 IgG4P 輕鏈變異體 2)

CK‧‧‧胱胺酸結點F1‧‧‧指型區1F2‧‧‧指型區2W‧‧‧腕型區

圖1 (表1)展示Gremlin-1結晶學之結構資料。圖2顯示人類Gremlin-1之結構。各個單體之帶狀圖像以不同灰度級顯示，標記出指型區1及2 (F1及F2)以及「腕型」區(w)及胱胺酸結點(CK)。形成二硫鍵之半胱胺酸顯示為黑色棒。圖3顯示人類Gremlin-1與鼠Gremlin-2 (PRDC)之序列比對。用星號標記的殘基在BMP結合中很重要，在二聚體界面中形成關鍵接觸之殘基經加框標記出。圖4顯示突出顯示疏水性BMP結合殘基之表面繪製。單體以兩個灰度級顯示，且參與BMP結合之六個關鍵殘基以白色顯示。圖5展示人類Gremlin-1及鼠Gremlin-2之覆蓋圖。上部圖像係比對兩種蛋白的帶狀圖像。下部圖像將參與BMP結合之胺基酸詳細地顯示為棒(鼠Gremlin-2呈白色且人類Gremlin-1呈黑色)。圖6(A)顯示在Hek Id1報導基因分析中全長Gremlin-1之抑制效果之圖像。圖6(B)顯示在Hek Id1報導基因分析中截短Gremlin-1之抑制效果之圖像。圖7顯示在Hek-Id1報導基因分析中免疫衍生抗體之傳信之復原百分比。圖8顯示在Hek-Id1報導基因分析中庫衍生抗體之傳信之復原百分比。圖9顯示Hek-Id1報導基因分析之結果，具有人類Gremlin (圖9A)及鼠Gremlin (圖9B)之滴定及抗體7326 (顯示為抗體PB376)在復原BMP之傳信中之作用。圖10顯示Gremlin-Fab複合物之模型結構，突出顯示了可能的BMP結合區及Fab抗原決定基。圖11顯示表面繪製，其描繪呈兩個灰度級之各個Gremlin-1單體，呈黑色之藉由誘變鑑別之待參與BMP結合之六個關鍵殘基及表面上距該等六個關鍵殘基6 Å以內之所有殘基。圖12右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)之評估。在經常氧及低氧/SU5416處理之C57Bl/6小鼠中評估抗Gremlin 1抗體對RVSP之影響。在經每三天用SU5416 (20 mg/kg)皮下注射隨後暴露於長期常壓性低氧(10% O2)或常氧中21天之雌性C57Bl/6小鼠中測定抗Gremlin 1 (n=8)、IgG1抗體對照(n=6)、PBS (n=2)、伊馬替尼(Imatinib)(n=8)對肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)進展之影響。測定RVSP且繪製平均RVSP±SEM圖。 *P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005；****P＜0.001，藉由單因素變異數分析(one-way ANOVA)。圖13平均動脈系統壓(mean arterial systemic pressure，MABP)之評估。在經抗Gremlin 1 (n=4)、IgG1抗體對照(n=4)、伊馬替尼(n=4)處理之低氧/SU5416 C57Bl/6小鼠及經抗Gremlin 1 (n=4)、IgG1抗體對照(n=4)處理之常氧/SU5416 C57Bl/6小鼠中評估抗Gremlin 1抗體對MABP之影響，且在21天之後繪製MABP±SEM圖。 *P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005；****P＜0.001，藉由單因素變異數分析。圖14右心室肥大之評估。在低氧/SU5416 C57Bl/6小鼠中評估抗Gremlin 1抗體對右心臟肥大(RV/LV+S)之影響。在經每三天用SU5416 (20 mg/kg)皮下注射隨後暴露於長期常壓性低氧(10% 02)或常氧中21天之雌性C57Bl/6小鼠中測定抗Gremlin 1 (n=8)、IgG抗體對照(n=6)、PBS (n=2)、伊馬替尼(n=8)對肺動脈高壓(PAH)進展之影響。測定RVSP且繪製平均RVSP±SEM圖。 *P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005；****P＜0.001，藉由單因素變異數分析。圖15肺血管肌化之組織學評估。評估抗Gremlin 1抗體之影響。將自抗Gremlin 1 (n=6)、IgG抗體對照(n=6)、伊馬替尼(n=6)中任一者分離之肺切片嵌入石蠟，針對平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin，αSMA)染色以評估肌化之程度，且針對馮威里氏因子(Von Willebrand factor，vWF)染色以藉由免疫組織化學鑑別內皮細胞。肺切片藉由Nanozoomer虛擬顯微鏡(Hamamatsu, Welwyn Garden City, UK)數位化，以每組＞40血管藉由獨立盲法觀測者評分為無肌化、部分肌化或完全肌化。繪製每組各個血管之模態分數之平均分數±SEM圖。常氧IgG1；低氧/SU5416 IgG1；低氧/SU5416伊馬替尼；低氧/SU5416抗Gremlin1之針對αSMA及vWF染色之嵌入石蠟之肺切片的代表性圖像。 *P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.005；****P＜0.001，藉由單因素變異數分析。序列表簡單說明 SEQ ID NO:1顯示包括24胺基酸N端信號序列(Uniprot ID O60565)之人類Gremlin-1之序列。 SEQ ID NO:2顯示用於結晶學中之包括N端標籤之截短人類Gremlin-1之序列。 SEQ ID NO:3顯示Ab 7326 HCDR1 (Chothia)。 SEQ ID NO:4顯示Ab 7326 HCDR1 (Kabat)。 SEQ ID NO:5顯示Ab 7326 HCDR2 (Kabat)。 SEQ ID NO:6顯示Ab 7326 HCDR3 (Kabat)。 SEQ ID NO:7顯示Ab 7326 LCDR1 (Kabat)。 SEQ ID NO:8顯示Ab 7326 LCDR2 (Kabat)。 SEQ ID NO:9顯示Ab 7326 LCDR3 (Kabat)。 SEQ ID NO:10顯示Ab 7326重鏈可變區(變異體1)。 SEQ ID NO:11顯示Ab 7326輕鏈可變區(變異體1)。 SEQ ID NO:12顯示Ab 7326重鏈可變區(變異體2)。 SEQ ID NO:13顯示Ab 7326輕鏈可變區(變異體2)。 SEQ ID NO:14顯示鼠Ab 7326全長IgG1重鏈。 SEQ ID NO:15顯示鼠Ab 7326全長IgG1輕鏈。 SEQ ID NO:16顯示人類Ab 7326全長IgG1重鏈(變異體2)。 SEQ ID NO:17顯示人類Ab 7326全長IgG1輕鏈(變異體2)。 SEQ ID NO:18顯示Ab 7326 Fab重鏈(變異體1)。 SEQ ID NO:19顯示Ab 7326 Fab輕鏈(變異體1)。 SEQ ID NO:20顯示用於結晶學中之不含N端標籤之截短人類Gremlin-1之序列。 SEQ ID NO:21顯示成熟Gremlin-1之序列(不含信號肽之SEQ ID NO:1)。 SEQ ID NO: 22顯示人類IgG4P重鏈。 SEQ ID NO:23顯示人類IgG4P輕鏈。 SEQ ID NO:24顯示人類IgG1重鏈DNA (變異體1)。 SEQ ID NO:25顯示人類IgG1輕鏈DNA (變異體1)。 SEQ ID NO:26顯示人類IgG4P重鏈DNA。 SEQ ID NO:27顯示人類IgG4P輕鏈DNA。 SEQ ID NO:28顯示鼠全長IgG1重鏈(變異體2)。 SEQ ID NO:29顯示鼠全長IgG1輕鏈(變異體2)。 SEQ ID NO:30顯示人類全長IgG1重鏈(變異體1)。 SEQ ID NO:31顯示人類全長IgG1輕鏈(變異體1)。 SEQ ID NO:32顯示Fab重鏈(變異體2)。 SEQ ID NO:33顯示Fab輕鏈(變異體2)。 SEQ ID NO:34顯示人類IgG4P重鏈(變異體2)。 SEQ ID NO:35顯示人類IgG4P輕鏈(變異體2)。

<110> 比利時商UCB生物製藥公司(UCB Biopharma SPRL)

<120> GREMLIN-1結晶結構及抑制抗體

<130> PF0045-WO-PCT

<140> 106144629

<141> 2017-12-19

<150> GB 1621635.0

<151> 2016-12-19

<160> 35

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 184

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 1

<210> 2

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 2

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 3

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 4

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 5

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 6

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 7

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 8

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 9

<210> 10

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 10

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 11

<210> 12

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 12

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 13

<210> 14

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 14

<210> 15

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 15

<210> 16

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 16

<210> 17

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 17

<210> 18

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 18

<210> 19

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 19

<210> 20

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 20

<210> 21

<211> 160

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 21

<210> 22

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 22

<210> 23

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 23

<210> 24

<211> 1362

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 24

<210> 25

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 25

<210> 26

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 26

<210> 27

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 27

<210> 28

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 28

<210> 29

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 29

<210> 30

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 30

<210> 31

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 31

<210> 32

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 32

<210> 33

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 33

<210> 34

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 34

<210> 35

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組序列

<400> 35

CK‧‧‧胱胺酸結點

F1‧‧‧指型區1

F2‧‧‧指型區2

W‧‧‧腕型區

Claims

一種抗Gremlin-1抗體，其包含SEQ ID NO：4/5/6/7/8/9或SEQ ID NO：3/5/6/7/8/9之HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3序列組合。
如請求項1之抗體，其包含SEQ ID NO：10或12之重鏈可變區(HCVR)序列及/或SEQ ID NO：11或13之輕鏈可變區(LCVR)序列。
如請求項2之抗體，其包含SEQ ID NO：10/11或12/13之HCVR及LCVR序列對。
如請求項3之抗體，其中HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3序列係由SEQ ID NO：4/5/6/7/8/9或SEQ ID NO：3/5/6/7/8/9組成，且該HCVR及LCVR之其餘部分包含分別與SEQ ID NO：10、11、12及/或13之至少95%一致性。
如請求項2之抗體，其包含SEQ ID NO：14、16、18、22、28、30、32或34之重鏈及SEQ ID NO：15、17、19、23、29、31、33或35之輕鏈。
如請求項5之抗體，其包含SEQ ID NO：14/15、16/17、18/19、22/23、28/29或30/31、32/33、34/35之重鏈及輕鏈對。
如請求項6之抗體，其中HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3序列係由SEQ ID NO：4/5/6/7/8/9或SEQ ID NO：3/5/6/7/8/9組成，且該等重鏈及輕鏈之其餘部分包含分別與SEQ ID NO：14、15、16及/或17之至少95%一致性。
如請求項1之抗體，其為嵌合、人類或人類化抗體。
如請求項1至8中任一項之抗體，其為Fab、經修飾Fab、Fab'、經修飾Fab'、F(ab')₂、Fv、單域抗體或scFv。
一種經分離之多核苷酸，其編碼如請求項1至9中任一項所定義之抗體。
一種表現載體，其帶有如請求項10之多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項11所定義之載體。
一種產生如請求項1至9中任一項所定義之抗體之方法，其包含在允許產生該抗體之條件下培養如請求項12之宿主細胞且回收所產生之該抗體。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項所定義之抗體及醫藥學上可接受之佐劑及/或載劑。
如請求項14之醫藥組合物，其係用於藉由療法治療人類或動物體之方法中。
如請求項15之醫藥組合物，其中糖尿病腎病之腎纖維化、特發性肺纖維化、肺動脈高壓、血管生成及/或癌症係經治療/預防。
如請求項1至8中任一項之抗體，其係用於藉由療法治療人類或動物體之方法中。
如請求項17之抗體，其中糖尿病腎病之腎纖維化、特發性肺纖維化、肺動脈高壓、血管生成及/或癌症係經治療/預防。
一種如請求項1至9之抗體或如請求項14之醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療或預防糖尿病腎病之腎纖維化、特發性肺纖維化、肺動脈高壓、血管生成及/或癌症之藥劑。