KR20190093658A - 그렘린-1 결정 구조 및 억제 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 그렘린-1 단백질의 결정 및 억제 항체와 복합체를 이루는 인간 그렘린-1 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 그렘린-1(그 자체로 또는 항체와의 복합체로서)의 구조 및 그렘린-1 활성을 조절하는 작용제의 스크리닝에서의 상기 구조의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 그렘린-1 상의 알로스테릭 억제 부위에 결합하는 항체, 및 상기 항체 및 스크리닝 방법에 의해 확인된 작용제의 약제학적 조성물 및 의학적 용도를 제공한다.

Description

그렘린-1 결정 구조 및 억제 항체
본 발명은 인간 그렘린(Gremlin)-1 단백질의 결정, 및 억제 항체와 복합체를 형성하는 인간 그렘린-1 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 그렘린-1(그 자체 또는 항체와의 복합체)의 구조 및 그렘린-1 활성을 조절하는 작용제를 스크리닝하는데 있어서 이들 구조의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 그렘린-1 상의 알로스테릭(allosteric) 억제 부위에 결합하는 항체, 및 상기 항체 및 스크리닝 방법에 의해 확인된 작용제의 약제학적 조성물 및 의학적 용도를 제공한다.
그렘린-1(Drm 및 CKTSF1B1로도 알려짐)은 184개 아미노산의 당단백질로서, (특히 세르베루스(Cerberus) 및 Dan과 함께) 시스틴-노트(cystine-knot) 분비 단백질의 DAN 패밀리의 일부를 형성한다. 그렘린은 BMP-2, 4 및 7에 결합하여, 이들이 가능하게는 VEGFR2의 효능 작용(agonism)을 통해 문서로 기록된 혈관 형성 촉진(pro-angiogenic) 역할과 함께 신호를 전달하는 능력을 억제한다. 그렘린-1의 주된 역할은 발생 동안 제시되며, 신장 형성 동안 및 지아(limb bud) 형성 동안 필수적이다. 이러한 중요한 역할로 인해 그렘린 동형접합성 낙아웃체(knock-out)는 배아 마우스에서 치명적이 된다.
성인기에, 증가된 그렘린 수치는 특발성 폐 섬유증 및 폐동맥 고혈압과 연관되며, 여기서 BMP-2, 4 및 7 신호전달은 TGF-β 수준의 상승과 함께 감소한다. 당뇨성 및 만성 동종이식 신병증에서, 그렘린-1 발현은 섬유증 점수와 상관관계가 있다.
그렘린 수준의 증가는 또한 경피증, 당뇨병 신병증 및 결직장암과 관련이 있다. 그렘린-1은 암 세포의 침습 및 증식을 활성화하는 것으로 밝혀졌고, 자궁 경부, 폐, 난소, 신장, 유방, 결장, 췌장 및 육종 암종에서 기능하는 것으로 생각된다.
현재까지, 그렘린-1 연구와 관련된 많은 도전들이 있고, 그렘린-1(및 그의 파트너인 그렘린-2)에 대한 일반적인 이해가 부족한 상태이다. BMP 생물학은 복잡하고, 종 사이의 높은 상동성이 존재한다. 그렘린-1은 작업하기 어려운 단백질이며, 그의 생물학을 연구하기 적합한 도구 및 시약이 부족하다. 그렘린-1을 만드는 것은 또한 간단한 과정이 아니고, 시스테인 노트 단백질의 생산은 어렵기로 악명이 높고, 그렘린-1의 유리 시스테인이 도전에 추가된다. 그렘린-1은 정제는 물론이고 발현시키는 것이 어렵다. 지금까지, 구조적 정보는 이용 가능하지 않으며, 문헌에 이 단백질에 관한 정보는 거의 존재하지 않는다.
발명의 개요
본 발명에서 사용되는 용어 그렘린-1은 전형적으로 UniProt 엔트리 O60565(서열 번호 1)에 제시된 서열을 갖는다. 용어 그렘린-1은 또한 다음과 같은 그렘린-1 폴리펩티드를 지칭할 수도 있다:
(a) N 말단 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 즉, 서열 번호 21에 나타낸 바와 같은 성숙 펩티드 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있는 폴리펩티드; 또는
(b) 그렘린-1의 활성을 보유하는, N 말단 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는(서열 번호 21에 나타낸 바와 같은) 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대하여 하나 이상의 아미노산 치환, 변형, 결실 또는 삽입을 갖는 유도체, 예컨대 서열 번호 20의 아미노산 서열인 폴리펩티드, 또는
(c) 전형적으로 서열 번호 1(또는 서열 번호 20 또는 21)에 대해 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%의 동일성(또는 심지어 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성)을 보유하는 그의 변이체인 폴리펩티드. 즉, 이러한 변이체는 서열 번호 1에 대해 약 60% 내지 약 99%의 동일성, 적합하게는 서열 번호 1에 대해 약 80% 내지 약 99%의 동일성, 보다 적합하게는 서열 번호 1에 대해 약 90% 내지 약 99%의 동일성, 가장 적합하게는 서열 번호 1에 대해 약 95% 내지 약 99%의 동일성을 보유할 수 있다. 변이체는 아래에서 추가로 설명된다.
아래에서 추가로 논의되는 바와 같이, 잔기 번호는 일반적으로 서열 번호 1의 서열에 기초하여 인용된다. 그러나, 잔기 넘버링은 통상의 기술자에 의해 상기 논의된 바와 같은 유도체 또는 변이체 서열로 용이하게 외삽될 수 있다. 잔기 번호가 인용되는 경우, 본 발명은 또한 변이체 또는 유도체 서열 상의 이들 잔기를 포함한다.
본 발명자들은 인간 그렘린-1을 단독으로 및 Ab 7326(Fab 단편)으로 명명된 항체와의 복합체 형태로 결정화였다. 그렘린-1의 결정화로 인해 BMP 결합 부위 내의 추정 잔기가 결정되었다. 또한, 알로스테릭 억제 항체인 Ab 7326과 함께 결정화함으로써 항체 에피토프 내의 잔기를 결정할 수 있었다. 이 에피토프에 결합하는 항체는 그렘린-1과 관련된 질환의 치료에서 치료제로서의 잠재력을 갖는다.
따라서, 본 발명은 그렘린-1의 결정을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1의 좌표에 의해 정의된 인간 그렘린-1의 구조를 제공한다.
또한, 본 발명은 다음을 제공한다:
- 표 1의 그렘린-1의 구조 좌표 또는 구조의 상동체를 정의하는 좌표에 의해 정의되는 기계 판독 가능한 데이터로 코딩된 데이터 저장재를 포함하는 기계 판독 가능한 데이터 저장 매체.
- 구조 모델로서 표 1의 좌표에 의해 정의된 그렘린-1의 구조의 사용.
- 구조 모델을 사용하여 확인된 작용제.
- 그렘린-1 활성의 조절제를 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 표 1의 구조 좌표로부터 리간드 결합 부위를 확인하는 단계;
(b) 리간드 결합 부위의 적어도 일부와 상호작용하는 후보 작용제를 확인하는 단계; 및
(c) 상기 작용제를 수득하거나 합성하는 단계
를 포함하는, 그렘린-1 활성의 조절제를 스크리닝하는 방법.
- 스크리닝 방법에 의해 확인된 그렘린-1 조절제.
- Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 및 Gln175로부터 선택된 적어도 하나의 잔기를 포함하는 그렘린-1 상의 에피토프에 결합하는 항체로서, 상기 잔기 넘버링은 서열 번호 1에 기초하는 것인 항체.
- 서열 번호 10 또는 12의 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 포함된 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 서열 및/또는 서열 번호 11 또는 13의 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 포함된 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 서열을 포함하는 항-그렘린-1 항체.
- 서열 번호 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된 적어도 하나의 HCDR 서열 및/또는 서열 번호 7, 8 및 9로부터 선택된 적어도 하나의 LCDR 서열을 포함하는 항-그렘린-1 항체.
- 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
- 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 항체 생산을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 생산된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법.
- 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 치료에 의해 인간 또는 동물의 신체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항체 또는 약제학적 조성물.
- 신장 섬유증, 예컨대 당뇨성 신병증, 특발성 폐 섬유증, 폐동맥 고혈압, 혈관신생 및/또는 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 치료 유효량의 항체 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
도 1(표 1)은 그렘린-1 결정에 대한 구조 데이터를 제시한다.
도 2는 인간 그렘린-1의 구조를 보여준다. 각각의 단량체의 리본 표시는 상이한 회색 음영으로 제시되어 있으며, 손가락 1 및 2(F1 & F2)는 "손목" 영역(w) 및 시스틴-노트(CK)과 함께 표시된다. 디술파이드 결합을 형성하는 시스테인은 검은색 스틱으로 표시된다.
도 3은 인간 그렘린-1 및 마우스 그렘린-2(PRDC)의 서열 정렬을 보여준다. 별표로 표시된 잔기는 BMP 결합에서 중요하며, 이량체 계면에서 핵심적인 접촉을 형성하는 잔기는 박스로 표시된다.
도 4는 소수성 BMP 결합 잔기를 강조하여 제시하는 표면 렌더링을 도시한 것이다. 단량체는 2개의 회색 음영으로 제시되어 있으며, BMP 결합과 관련된 6개의 핵심 잔기는 흰색으로 표시된다.
도 5는 인간 그렘린-1 및 마우스 그렘린-2의 오버레이를 제시한다. 상측 이미지는 2개의 단백질이 정렬된 리본 표시이다. 하측 이미지는 BMP 결합에 관여하는 아미노산을 막대로서 상세하게 보여준다(마우스 그렘린-2는 흰색, 인간 그렘린-1은 검정임).
도 6a는 Hek Id1 리포터 유전자 분석에서 전장 그렘린-1의 억제 효과를 나타낸다.
도 6b는 Hek Id1 리포터 유전자 분석에서 말단 절단된 그렘린-1의 억제 효과를 나타낸다.
도 7은 Hek-Id1 리포터 유전자 분석에서 면역화 유래 항체에 대한 신호의 복원 백분율을 나타낸다.
도 8은 Hek-Id1 리포터 유전자 분석에서 라이브러리 유래 항체에 대한 신호의 복원 백분율을 나타낸다.
도 9는 인간 그렘린(도 9a) 및 마우스 그렘린(도 9b)의 적정을 사용한 Hek-Id1 리포터 유전자 분석 결과 및 BMP의 신호전달 회복에서 항체 7326(항체 PB376으로 제시됨)의 효과를 보여준다.
도 10은 가능한 BMP 결합 영역 및 Fab 에피토프가 강조 표시된, 그렘린-Fab 복합체의 구조 모델을 보여준다.
도 11은 그렘린-1 단량체를 2개의 회색 음영으로 묘사하고 BMP 결합에 관여하는 돌연변이 유발에 의해 확인된 6개의 핵심 잔기는 검정색으로 나타내며, 표면 상의 모든 잔기는 6개의 핵심 잔기의 6 Å 내에 존재하는 표면 렌더링을 보여준다.
도 12: 우심실 수축기 혈압(RVSP)의 평가. RVSP에 대한 항-그렘린 1 항체의 효과는 정상 산소 및 저산소 상태/SU5416 처리 C57B1/6 마우스에서 평가되었다. 21일 동안 3일마다 SU5416(20 mg/kg)으로 피하 주사한 후, 만성 평압(normobaric) 저산소 상태(10% O2) 또는 정상 산소에 노출된 암컷 C57B1/6 마우스에서 폐동맥 고혈압(PAH) 발생에 대한 항-그렘린 1(n=8), IgG1 항체 대조군(n=6), PBS(n=2), 이마티닙(n=8)의 효과를 결정하였다. RVSP를 결정하고, 평균 RVSP ± SEM을 그래프로 나타내었다.
*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.005; ****일원 분산 분석에 의해 P<0.001.
도 13: 평균 동맥 전신 혈압(MABP)의 평가. 항-그렘린 1 항체가 MABP에 미치는 영향은 항-그렘린 1(n=4), IgG1 항체 대조군(n=4), 이마티닙(n=4)로 처리된 저산소 상태/SU5416 C57B1/6 마우스 및 항-그렘린 1(n=4), IgG1 항체 대조군(n=4)으로 처리된 정상 산소/SU5416 C57B1/6 마우스에서 평가하고, MABP ± SEM을 21일 후에 그래프로 나타내었다.
*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.005; ****일원 분산 분석에 의해 P<0.001.
도 14: 우심실 비대증의 평가. 우측 심장 비대(RV/LV+S)에 대한 항-그렘린 1 항체의 효과를 저산소 상태/SU5416 C57B1/6 마우스에서 평가하였다. 21일 동안 3일마다 SU5416(20 mg/kg)으로 피하 주사한 후, 만성 평압 저산소 상태(10% O2) 또는 정상 산소에 노출된 암컷 C57B1/6 마우스에서 폐동맥 고혈압(PAH)에 대한 항-그렘린 1(n=8), IgG1 항체 대조군(n=6), PBS(n=2), 이마티닙(n=8)의 효과를 결정하였다. RVSP를 결정하고, 평균 RVSP ± SEM을 그래프로 나타내었다.
*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.005; ****일원 분산 분석에 의해 P<0.001.
도 15: 폐 혈관 근육 형성의 조직학적 평가. 항-그렘린 1 항체의 효과를 평가하였다. 항-그렘린 1(n=6), IgG 항체 대조군(n=6), 이마티닙(n=6)으로부터 단리된 파라핀 포매된 폐 절편을 평활근 액틴(αSMA)에 대해 염색하여, 근육 형성의 정도 및 면역 조직화학법에 의해 내피 세포를 확인하기 위한 폰 빌레브란트 인자(vWF: von Willebrand factor)를 평가하였다. 폐 절편을 나노주머(Nanozoomer) 가상 현미경(Hamamatsu, 영국 웰륀 가든 시티 소재)으로 디지털화하고, 군당 40개 초과의 혈관을 독립적인 맹검 관찰자에 의해 비근육 형성, 부분적인 또는 완전한 근육 형성으로 점수화하였다. 각각의 혈관의 모달(modal) 스코어의 각각의 군의 평균 스코어 ± SEM을 그래프로 나타내었다. 정상 산소 IgG1; 저산소증/SU5416 IgG1; 저산소증/SU5416 이마티닙; 저산소증/SU5416 항-그렘린 1의 αSMA 및 vWF에 대해 염색된 파라핀 포매 폐 절편의 대표적인 이미지.
*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.005; ****일원 분산 분석에 의해 P<0.001.
서열 목록에 대한 간략한 설명
서열 번호 1은 24개 아미노산의 N 말단 신호 서열(Uniprot ID O60565)을 포함하는 인간 그렘린-1의 서열을 나타낸다.
서열 번호 2는 N 말단 태그를 포함하는, 결정학에 사용된 말단 절단된 인간 그렘린-1의 서열을 나타낸다.
서열 번호 3은 Ab 7326 HCDR1(코티아(Chothia))를 나타낸다.
서열 번호 4는 Ab 7326 HCDR1(카바트(Kabat))을 나타낸다.
서열 번호 5는 Ab 7326 HCDR2(카바트)를 나타낸다.
서열 번호 6은 Ab 7326 HCDR3(카바트)을 나타낸다.
서열 번호 7은 Ab 7326 LCDR1(카바트)을 나타낸다.
서열 번호 8은 Ab 7326 LCDR2(카바트)를 나타낸다.
서열 번호 9는 Ab 7326 LCDR3(카바트)을 나타낸다.
서열 번호 10은 Ab 7326 중쇄 가변 영역(변이체 1)을 나타낸다.
서열 번호 11은 Ab 7326 경쇄 가변 영역(변이체 1)을 나타낸다.
서열 번호 12는 Ab 7326 중쇄 가변 영역(변이체 2)을 나타낸다.
서열 번호 13은 Ab 7326 경쇄 가변 영역(변이체 2)을 나타낸다.
서열 번호 14는 마우스 Ab 7326 전장 IgG1 중쇄(변이체 1)를 나타낸다.
서열 번호 15는 마우스 Ab 7326 전장 IgG1 경쇄(변이체 1)를 나타낸다.
서열 번호 16은 인간 Ab 7326 전장 IgG1 중쇄(변이체 2)를 나타낸다.
서열 번호 17은 인간 Ab 7326 전장 IgG1 경쇄(변이체 2)를 나타낸다.
서열 번호 18은 Ab 7326 Fab 중쇄(변이체 1)를 나타낸다.
서열 번호 19는 Ab 7326 Fab 경쇄(변이체 1)를 나타낸다.
서열 번호 20은 N 말단 태그가 없는, 결정학에 사용된 말단 절단된 인간 그렘린-1의 서열을 나타낸다.
서열 번호 21은 성숙 그렘린-1(신호 펩티드가 없는 서열 번호 1)의 서열을 나타낸다.
서열 번호 22는 인간 IgG4P 중쇄(변이체 1)를 나타낸다.
서열 번호 23은 인간 IgG4P 경쇄(변이체 1)를 나타낸다.
서열 번호 24는 인간 IgG1 중쇄 DNA(변이체 1)를 나타낸다.
서열 번호 25는 인간 IgG1 경쇄 DNA(변이체 1)를 나타낸다.
서열 번호 26은 인간 IgG4P 중쇄 DNA(변이체 1)를 나타낸다.
서열 번호 27은 인간 IgG4P 경쇄 DNA(변이체 1)를 나타낸다.
서열 번호 28은 마우스 전장 IgG1 중쇄(변이체 2)를 나타낸다.
서열 번호 29는 마우스 전장 IgG1 경쇄(변이체 2)를 나타낸다.
서열 번호 30은 인간 전장 IgG1 중쇄(변이체 1)를 나타낸다.
서열 번호 31은 인간 전장 IgG1 경쇄(변이체 1)를 나타낸다.
서열 번호 32는 Fab 중쇄(변이체 2)를 나타낸다.
서열 번호 33은 Fab 경쇄(변이체 2)를 나타낸다.
서열 번호 34는 인간 IgG4P 중쇄(변이체 2)를 나타낸다.
서열 번호 35는 인간 IgG4P 경쇄(변이체 2)를 나타낸다.
그렘린 -1 결정 구조
본 발명은 인간 그렘린-1의 구조적 좌표를 제공한다. 전체 좌표는 도 1(표 1)에 제시된다.
본 발명은 또한 단위 격자 치수가 a=84.55 Å, b=107.22 Å 및 c=77.09 Å인 C2 공간 군으로 이루어진 인간 그렘린-1의 결정을 제공한다.
본 발명은 항체, 보다 구체적으로는 서열 번호 18의 중쇄 및 서열 번호 19의 경쇄를 갖는 Fab와 복합체를 형성한 그렘린-1의 결정을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 표 1의 그렘린-1의 구조 좌표 또는 구조의 상동체를 정의하는 좌표에 의해 정의되는 기계 판독 가능한 데이터로 코딩된 데이터 저장재를 포함하는 기계 판독 가능한 데이터 저장 매체를 제공한다.
본 발명은 그렘린-1에 대한 구조 모델로서의 표 1의 구조 데이터 및 기계 판독 가능한 데이터 저장 매체의 용도를 제공한다. 이러한 구조 모델은 그렘린-1과 상호작용하는 작용제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 스크리닝은 고효율 스크리닝일 수 있다.
그렘린-1과 상호작용하는 작용제는 전형적으로 그렘린-1에 결합하는 작용제이다. 그렘린-1과 상호작용하는 작용제는 그렘린-1을 조절할 수 있다. 억제성 조절제는 그렘린-1의 임의의 기능에 영향을 줄 수 있지만, 일반적으로 그렘린-1의 BMP(BMP 2/4/7)에 대한 결합을 감소시킨다. 그렘린-1은 BMP의 음성 조절인자이고, 따라서 감소된 결합은 BMP를 통한 신호전달을 증가시킨다. 활성화 조절제는 그렘린-1의 BMP에 대한 결합을 증가시킬 수 있다.
BMP 결합 및 신호전달은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 실시예는 SMAD 인산화 분석을 기술한다. SMAD1, 5 및 8은 BMP 신호전달시 인산화된다. 따라서, SMAD 인산화의 증가는 그렘린-1에 대한 결합의 감소를 반영할 수 있는 증가된 BMP 신호전달을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
실시예는 또한 Id1 유전자가 BMP 신호전달의 표적 유전자인 Id1 리포터 유전자 분석을 기술한다. 따라서, 이 분석에서 신호의 복원의 증가는 또한 작용제가 BMP에 대한 그렘린-1의 결합을 억제하는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 언급되는 작용제는 그렘린-1과 잠재적으로 상호작용할 수 있는 임의의 분자일 수 있지만, 바람직하게는 소분자 또는 항체이다.
본 발명은 또한 그렘린-1 활성의 조절제를 스크리닝하는 방법을 제공하고, 이 방법은
(a) 표 1의 구조 좌표로부터 리간드 결합 부위를 확인하는 단계;
(b) 리간드 결합 부위의 적어도 일부와 상호작용하는 후보 작용제를 확인하는 단계; 및
(c) 상기 작용제를 수득하거나 합성하는 단계
를 포함한다.
리간드 결합 부위는 단백질(리간드)과 상호작용하는 그렘린-1 상의 임의의 추정 부위일 수 있다. 리간드 결합 부위는 전형적으로 BMP 결합 부위이다. 실시예에서 제시되는 바와 같이, 본 발명자들은 그렘린-1 결정 구조에 기초하여 추정 BMP 결합 부위를 확인하였다. 이 결합 부위는 아미노산 Trp93, Phe117, Tyr119, Phe125, Tyr126 및 Phe138을 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 서열 번호 1에 기초한다.
따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 하나 이상의 이들 잔기, 바람직하게는 이들 잔기 중 적어도 2, 3, 4개 또는 6개 전부와 상호작용하는 작용제를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
작용제와 단백질 잔기의 상호작용은 x-선 결정학에 의해 측정된 잔기와 작용제 사이의 거리(전형적으로 6 Å 미만 또는 4 Å 미만)와 같은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다. 하기 실시예에서 논의되는 바와 같이, 치료제에 의해 표적화될 수 있는 그렘린-1의 영역은 아미노산 Asp92-Leu99, Arg116-His130, Ser173-Ser142, Cys176-Cys178을 포함할 수 있다. 이들은 그렘린-1의 표면 상에서 돌연변이된 것의 6 Å 이내에 위치한다.
스크리닝 방법의 단계 (a) 및 (b)는 전형적으로 인 실리코(in silico)로 수행되고, 상기 작용제는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수득되고 합성될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 Trp93, Phe117, Tyr119, Phe125, Tyr126 및 Phe138로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기를 포함하는 그렘린-1 상의 에피토프에 결합하는 항체를 제공하고, 여기서 잔기 넘버링은 서열 번호 1에 따른다. 본 발명은 또한 Trp93, Phe117, Tyr119, Phe125, Tyr126 및 Phe138을 모두 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 (잠재적으로 억제성인) 항체를 생성하기 위해 그렘린-1의 상기 BMP 결합 영역의 사용을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 항체 생성에 사용될 수 있는, 상기 나열된 잔기 중 적어도 하나(바람직하게는 모두)를 포함하는 항원을 제공한다.
그렘린-1의 BMP 결합 부위와 상호작용하는 대신에, 작용제는 알로스테리 방식으로 작용할 수 있다. 여기서, 작용제는 정상 결합 부위로부터 먼 부위에 결합하지만, 예를 들어 단백질의 유도된 입체형태적 변화를 통해 그렘린-1의 활성을 계속 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 구조 모델 및 스크리닝 방법은 또한 그렘린-1의 알로스테릭 조절인자를 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 Ab 7326 항체는 알로스테리 방식으로 작용하는 것으로 밝혀졌다. 이 항체의 에피토프는 다음 잔기를 포함한다: Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 및 Gln175(여기서, 잔기 넘버링은 서열 번호 1에 기초한다). 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 이들 잔기 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 또는 9개 전부와 상호작용하는 작용제를 확인하는 것을 수반할 수 있다. 그런 다음, 이러한 작용제는 예를 들어 BMP 결합의 억제에 대해 실시예에서 설명되는 분석을 사용하여 시험될 수 있다. 바람직하게는, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 및 Gln175는 그렘린-1의 한 단량체 상에 위치하고, Ile131은 그렘린-1의 다른 단량체 상에 위치한다(그렘린-1 이량체는 BMP 이량체에 결합한다).
다시 한번, 본 발명은 항-그렘린-1 항체를 생성하기 위한 이들 잔기 중 적어도 하나(바람직하게는 전부)를 포함하는 항원을 또한 포함한다.
다시, 작용제는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 이들 잔기와 상호작용하는 것으로 확인될 수 있다. 작용제는 바람직하게는 소분자 또는 항체이다.
항체
본 발명은 그렘린-1에 결합하는 항체를 제공한다.
본원에서 언급되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합 부분") 또는 이의 단일쇄를 포함한다. 항체는 디술파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 HCVR 또는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 LCVR 또는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. VH 및 VL 영역은 추가로 프레임워크 영역(FR)으로 명명된 보다 보존된 영역(CDR)에 산재된, 상보성 결정 영역으로 명명된 초가변성 영역으로 다시 세분될 수 있다.
항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명의 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있으며, 전형적으로는 모노클로날 항체일 것이다. 본 발명의 항체는 키메라 항체, CDR 이식 항체, 나노바디, 인간 또는 인간화 항체 또는 이들 중 임의의 것의 항원 결합 부분일 수 있다. 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체 둘 모두의 제조에 있어서, 실험 동물은 전형적으로 염소, 토끼, 래트 또는 마우스와 같은 비인간 포유동물이지만, 항체는 또한 다른 종에서도 유도될 수 있다.
폴리클로날 항체는 관심 항원을 사용하여 적합한 동물의 면역화와 같은 통상적인 방법에 의해 생성될 수 있다. 이어서 혈액을 동물로부터 제거하고, IgG 분획을 정제할 수 있다.
그렘린-1에 대한 항체는 동물의 면역화가 필요한 경우에, 공지된 통상적인 프로토콜을 사용하여 동물, 예를 들어 비인간 동물에게 폴리펩티드를 투여함으로써 수득될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986)] 참조). 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지와 같은 많은 온혈 동물이 면역화될 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 일반적으로 가장 적합하다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 기술(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)과 같은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 예를 들어 문헌 [Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7843-78481]; WO92/02551; WO2004/051268 및 WO2004/106377에 의해 설명된 방법에 의해 특정 항체의 생산을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현시킴으로써 단일 림프구 항체 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 관련 기술 분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있으며, 문헌 [Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995,182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995,184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology,1994, 57:191-280)] 및 WO90/02809; WO91/10737; WO92/01047; WO92/18619; WO93/11236; WO95/15982; WO95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108에 개시된 것을 포함한다.
완전 인간 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역 및 불변 영역(존재하는 경우)이 모두 인간 기원이거나, 또는 인간 기원의 서열과 실질적으로 동일하지만 반드시 동일한 항체로부터 유래된 것은 아닌 항체이다. 완전 인간 항체의 예는 상기 설명된 파지 디스플레이 방법에 의해 생성된 항체 및 뮤린 면역글로불린 가변 및 임의로 불변 영역 유전자가 예를 들어 EP 0546073, U5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,770,429, EP 0438474 및 EP 0463151에서 일반적인 용어로 설명된 바와 같이 그의 인간 대응물로 대체된 마우스에 의해 생성된 항체를 포함할 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 항체는 비인간 포유동물을 그렘린-1 면역원으로 면역화하는 단계; 상기 포유동물로부터 항체 제제를 수득하는 단계; 상기 항체 제제로부터 그렘린-1을 인식하는 모노클로날 항체를 유도하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄 또는 그의 단편 또는 항원 결합 부분을 갖는 완전한 항체 분자를 포함할 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합 부분"은 항원에 선택적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체 및 그의 단편 및 항원 결합 부분은 Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 상기 중 어느 하나의 에피토프 결합 단편일 수 있고, 이로 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌 [Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참조). 이들 항체 단편을 생성하고 제조하는 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌 [Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조). 본 발명에서 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 출원 WO 2005/003169, WO 2005/003170 및 WO 2005/003171에 기재된 Fab 및 Fab' 단편 및 국제 특허 출원 WO 2009/040562에 기재된 Fab-dAb 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성을 포함할 수 있거나, 단일 특이적일 수 있다(예를 들어, WO 92/22853 및 WO 05/113605 참조). 이들 항체 단편은 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득할 수 있으며, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은 존재한다면, 항체 분자의 제안된 기능, 특히 요구될 수 있는 이펙터 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 항체 분자가 치료 용도로 의도되고 항체 이펙터 기능이 요구되는 경우, 특히 IgG1 및 IgG3 이소형의 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료 목적으로 의도되고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않는 경우에는, IgG2 및 IgG4 이소형이 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리될 수 있고, 예를 들어 (a) 관심 있는 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대한 트랜스제닉 또는 염색체 도입 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 관심 있는 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체일 수 있다.
본 발명의 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 모두가 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체 내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
이러한 인간 항체는 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 상기 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 도입유전자 및 경쇄 도입유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성될 수 있다.
인간 항체는 인간 림프구의 시험관 내 면역화, 이어서 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스를 사용한 림프구의 형질전환에 의해 제조될 수 있다.
"인간 항체 유도체"라는 용어는 인간 항체의 임의의 변형된 형태, 예를 들어, 항체와 다른 작용제 또는 항체의 접합체를 의미한다.
"인간화 항체"라는 용어는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 CDR 이식 항체 분자를 의미하는 것의 의도된다. 추가의 프레임워크 영역 변형이 인간 프레임워크 서열 내에서 이루어질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 'CDR 이식 항체 분자'라는 용어는 수용자 항체(예를 들어, 인간 항체)의 중쇄 및/경쇄 가변 영역 프레임워크에 이식된 공여자 항체(예를 들어, 뮤린 또는 래트 모노클로날 항체)로부터의 하나 이상의 CDR(요망되는 경우, 하나 이상의 변형된 CDR을 포함함)을 중쇄 및/또는 경쇄가 함유하는 항체 분자를 의미한다. 개관을 위해 문헌 [Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998]을 참조한다. 한 실시양태에서, 전체 CDR이 옮겨지기보다는, 상기 본원에서 설명된 CDR 중 임의의 하나로부터의 특이성 결정 잔기 중 하나 이상만이 인간 항체 프레임워크로 옮겨진다(예를 들어, 문헌[Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 한 실시양태에서, 상기 본원에서 설명된 CDR 중 하나 이상으로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 옮겨진다. 또 다른 실시양태에서, 상기 본원에서 설명된 각각의 CDR로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 옮겨진다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 이식될 때, 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 비롯하여 CDR이 유래되는 공여자 항체의 종류/유형을 고려하여 임의의 적절한 수용자 가변 영역 프레임워크 서열을 사용할 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 따른 CDR 이식 항체는 인간 수용자 프레임워크 영역뿐만 아니라 상기 설명한 CDR 또는 특이성 결정 잔기 중 하나 이상을 포함하는 가변 도메인을 갖는다. 따라서, 한 실시양태에서 제공되는 것은 가변 도메인이 인간 수용자 프레임워크 영역 및 비인간 공여체 CDR을 포함하는 중화 CDR 이식 항체이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 인간 프레임워크의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이다(Kabat et al., 상기 문헌). 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 사용할 수 있고, REI는 경쇄에 사용할 수 있으며, EU, LAY 및 POM은 중쇄와 경쇄 둘 모두에 사용할 수 있다. 대안적으로, 인간 생식계열 서열이 사용될 수 있고; 이러한 서열은 예를 들어 http://www.vbase2.org/에서 볼 수 있다(문헌 [Retter et al., Nucl. Acids Res. (2005) 33 (supplement 1), D671-D674] 참조).
본 발명의 CDR 이식 항체에서, 수용자 중쇄 및 경쇄가 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없으며, 원한다면 상이한 사슬에서 유래된 프레임워크 영역을 갖는 복합 사슬을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 CDR 이식 항체에서, 프레임워크 영역이 수용자 항체의 프레임워크 영역과 정확히 동일한 서열일 필요는 없다. 예를 들어, 통상적이지 않은 잔기는 그 수용자 사슬 종류 또는 유형에 대해 보다 빈번하게 발생하는 잔기로 변경될 수 있다. 대안적으로, 수용자 프레임워크 영역에서 선택된 잔기들은 이들이 공여자 항체의 동일한 위치에서 발견되는 잔기와 상응하도록 변경될 수 있다(문헌 [Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324] 참조). 이러한 변경은 공여자 항체의 친화도를 회복하는데 필요한 최소한으로 유지하여야 한다. 변경될 필요가 있는 수용자 프레임워크 영역의 잔기를 선택하는 프로토콜은 WO 91/09967호에 제시되어 있다.
또한, 통상의 기술자는 항체가 다양한 번역후 변형을 겪을 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 변형의 유형 및 정도는 종종 항체를 발현시키는데 이용된 숙주 세포주 및 배양 조건에 의해 좌우된다. 그러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변화를 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 카르복시펩티다제의 작용으로 인한 카르복시 말단 염기성 잔기(예컨대, 리신 또는 아르기닌)의 손실이다(문헌 [Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995]에 개시됨).
한 실시양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고, 항체 경쇄는 카파 또는 람다 중 어느 하나의 CL 도메인을 포함한다.
항체 또는 단편과 같은 생물학적 분자는 산성 및/또는 염기성 관능기를 함유하여, 분자에 순 양전하 또는 음전하를 부여한다. "관찰된" 전체 전하의 양은 엔티티의 절대 아미노산 서열, 3D 구조 내의 하전된 기의 국소 환경 및 분자의 환경 조건에 따라 결정될 것이다. 등전점(pI)은 특정 분자 또는 표면이 순 전하를 띄지 않는 pH이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 단편은 적어도 7의 등전점(pI)을 갖는다. 한 실시양태에서, 항체 또는 단편은 적어도 8, 예를 들어 8.5, 8.6, 8.7, 8.8 또는 9의 등전점을 갖는다. 한 실시양태에서, 항체의 pI는 8이다. 항체 또는 단편의 등전점을 예측하기 위해 **ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html(문헌 [Walker, The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005), 571-607)] 참조)과 같은 프로그램을 사용할 수 있다.
본원에서 개시되는 에피토프에 결합하는 항체는 서열 번호 4 내지 6(각각 HCDR1/HCDR2/HCDR3)의 적어도 하나, 적어도 2개 또는 3개 모두의 중쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다. 이들은 카바트 방법을 사용하여 결정된 실시예의 Ab 7326 항체의 HCDR1/HCDR2/HCDR3 서열이다.
CDR 서열을 결정하기 위한 카바트 및 코티아 방법은 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있다(다른 기술들도 있음). CDR 서열은 임의의 적절한 방법을 사용하여 결정될 수 있으며, 본 발명에서는 카바트가 일반적으로 사용되지만, 다른 기술들도 사용될 수 있다. 이 예에서, 서열 번호 3은 조합된 코티아 & 카바트 정의를 사용하여 결정된 Ab 7326 HCDR1 서열을 나타낸다.
본 발명의 항체는 서열 번호 7 내지 9(각각 LCDR1/LCDR2/LCDR3)의 적어도 하나, 적어도 2개 또는 3개 모두의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다. 이들은 카바트 방법을 사용하여 결정된 Ab 7326의 LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열이다.
항체는 바람직하게는 적어도 서열 번호 6의 HCDR3 서열을 포함한다.
전형적으로, 항체는 서열 번호 3 내지 5로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 CDR 서열 및 서열 번호 7 내지 9로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 항체는 서열 번호 3 내지 5로부터 선택된 적어도 2개의 중쇄 CDR 서열 및 서열 번호 7 내지 9로부터 선택된 적어도 2개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다. 항체는 전형적으로 서열 번호 3 내지 5(각각 HCDR1/HCDR2/HCDR3)의 3개 모두의 중쇄 CDR 서열 및 서열 번호 7 내지 9(각각 LCDR1/LCDR2/LCDR3)의 3개 모두의 중쇄 CDR 서열을 포함한다. 항체는 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.
항체는 서열 번호 10 또는 12(Ab 7326 변이체 1 및 2의 HCVR)의 중쇄 가변 영역(HCVR) 서열을 포함할 수 있다. 상기 항체는 서열 번호 11 또는 13(Ab 7326 변이체 1 및 2의 LCVR)의 경쇄 가변 영역(LCVR) 서열을 포함할 수 있다. 항체는 바람직하게는 서열 번호 10 또는 12의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 번호 11 또는 13의 경쇄 가변 영역 서열(특히 서열 번호 10/11 또는 12/13의 HCVR/LVCR 쌍)을 포함한다.
항체는 다음의 중쇄(H-쇄) 서열을 포함할 수 있다:
서열 번호 14 마우스 전장 IgG1 중쇄 변이체 1, 또는
서열 번호 28 마우스 전장 IgG1 중쇄 변이체 2, 또는
서열 번호 30 인간 전장 IgG1 중쇄 변이체 1, 또는
서열 번호 16 인간 전장 IgG1 중쇄 변이체 2, 또는
서열 번호 22 인간 전장 IgG4P 중쇄 변이체 1, 또는
서열 번호 34 인간 전장 IgG4P 중쇄 변이체 2, 또는
서열 번호 18 Fab 중쇄 변이체 1, 또는
서열 번호 32 Fab 중쇄 변이체 2.
항체는 다음의 경쇄(L-쇄) 서열을 포함할 수 있다:
서열 번호 15 마우스 전장 IgG1 경쇄 변이체 1, 또는
서열 번호 29 마우스 전장 IgG1 경쇄 변이체 2, 또는
서열 번호 31 인간 전장 IgG1 경쇄 변이체 1, 또는
서열 번호 17 인간 전장 IgG1 경쇄 변이체 2, 또는
서열 번호 23 인간 전장 IgG4P 경쇄 변이체 1, 또는
서열 번호 35 인간 전장 IgG4P 경쇄 변이체 2, 또는
서열 번호 19 Fab 경쇄 변이체 1, 또는
서열 번호 33 Fab 경쇄 변이체 2.
한 예에서, 항체는 다음의 중쇄/경쇄 서열쌍을 포함한다:
서열 번호 14/15 마우스 전장 IgG1 변이종 1, 또는
서열 번호 28/29 마우스 전장 IgG1 변이체 2, 또는
서열 번호 30/31 인간 전장 IgG1 변이체 1, 또는
서열 번호 16/17 인간 전장 IgG1 변이체 2, 또는
서열 번호 22/23 인간 전장 IgG4P 변이체 1, 또는
서열 번호 34/35 인간 전장 IgG4P 변이체 2, 또는
서열 번호 18/19 Fab 경쇄 변이체 1, 또는
서열 번호 32/33 Fab 경쇄 변이체 2.
대응하는 서열의 변이체 형태는 상호 교환될 수 있다. 예를 들어, 항체는 다음의 중쇄/경쇄 서열쌍을 포함할 수 있다:
서열 번호 14/29 마우스 전장 IgG1 중쇄 변이체 1/경쇄 변이체 2, 또는
서열 번호 28/15 마우스 전장 IgG1 중쇄 변이체 2/경쇄 변이체 1, 또는
서열 번호 30/17 인간 전장 IgG1 중쇄 변이체 1/경쇄 변이체 2, 또는
서열 번호 16/31 인간 전장 IgG1 중쇄 변이체 2/경쇄 변이체 1, 또는
서열 번호 22/35 인간 전장 IgG4P 중쇄 변이체 1/경쇄 변이체 2, 또는
서열 번호 34/23 인간 전장 IgG4P 중쇄 변이체 2/경쇄 변이체 1, 또는
서열 번호 18/33 Fab 경쇄 중쇄 변이체 1/경쇄 변이체 2, 또는
서열 번호 32/19 Fab 경쇄 중쇄 변이체 2/경쇄 변이체 1.
항체는 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.
항체는 선택적으로 상기 언급된 특정 서열 중 하나의 변이체일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체는 임의의 상기 아미노산 서열의 치환, 결실 또는 부가 변이체일 수 있다.
변이체 항체는 상기 논의된 특정 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5개, 10개까지, 20개까지 또는 그 초과(전형적으로 최대 50개까지)의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다. "결실" 변이체는 개개의 아미노산의 결실, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산과 같은 아미노산의 작은 군의 결실, 또는 특정 아미노산 도메인 또는 다른 특징부의 결실과 같은 보다 큰 아미노산 영역의 결실을 포함할 수 있다. "치환" 변이체는 전형적으로 하나 이상의 아미노산을 동일한 수의 아미노산으로 교체하고 보존적 아미노산 치환을 만드는 것을 수반한다. 예를 들어, 아미노산은 유사한 성질을 갖는 대체 아미노산, 예를 들면 또 다른 염기성 아미노산, 또 다른 산성 아미노산, 또 다른 중성 아미노산, 또 다른 하전 아미노산, 또 다른 친수성 아미노산, 또 다른 소수성 아미노산, 또 다른 극성 아미노산, 또 다른 방향족 아미노산 또는 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 적합한 치환체를 선택하기 위해 사용될 수 있는 20개의 주요 아미노산의 몇 가지 특성은 다음과 같다:
Figure pct00001
Figure pct00002
"유도체" 또는 "변이체"는 일반적으로 자연 발생 아미노산 대신에 서열에 나타나는 아미노산이 이의 구조적 유사체인 아미노산을 포함한다. 서열에 사용되는 아미노산은 또한 항체의 기능이 유의하게 해로운 영향을 받지 않는다면, 유도체화되거나 변형, 예를 들면 표지될 수 있다.
상기 설명된 바와 같은 유도체 및 변이체는 항체의 합성 동안 또는 생산 후 변형에 의해, 또는 항체가 재조합 형태로 존재할 때 부위 특이적 돌연변이 유발, 랜덤 돌연변이 유발 또는 핵산의 효소에 의한 절단 및/또는 라이게이션의 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
변이체 항체는 본원에서 개시되는 아미노산 서열(특히 HCVR/LCVR 서열 및 H-쇄 및 L-쇄 서열)에 대해 약 60% 초과, 또는 약 70% 초과, 예를 들어 75 또는 80%, 전형적으로 약 85% 초과, 예를 들어 약 90 또는 95% 초과의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 항체는 본원에서 개시되는 HCVR/LCVR 서열 및 H-쇄 및 L-쇄 서열에 대해 약 60% 초과, 또는 약 70% 초과, 예를 들어 75 또는 80%, 전형적으로 약 85% 초과, 예를 들어 약 90 또는 95% 초과의 아미노산 동일성을 갖고 이들 서열에 대해 개시된 정확한 CDR을 보유하는 변이체일 수 있다. 변이체는 본원에서 개시되는 HCVR/LCVR 서열 및 H-쇄 및 L-쇄 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보유할 수 있다(일부 상황에서 정확한 CDR을 보유하면서).
변이체는 전형적으로 약 60% 내지 약 99% 동일성, 약 80% 내지 약 99% 동일성, 약 90% 내지 약 99% 동일성 또는 약 95% 내지 약 99% 동일성을 보유한다. 이러한 아미노산 동일성 수준은 전장 폴리펩티드의 크기에 따라 관련 서열 번호의 서열의 전장에 걸쳐 또는 약 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200개 또는 그 초과의 아미노산에 걸쳐 관찰될 수 있다.
아미노산 서열과 관련하여, "서열 동일성"은 ClustalW(Thompson et al., 1994, 상기 문헌)를 사용하여 다음 파라미터를 이용하여 평가할 때 언급된 값을 갖는 서열을 의미한다:
쌍 형성 정렬 파라미터 - 방법: 정확함, 매트릭스: PAM, 갭 개방 페널티: 10.00, 갭 연장 페널티: 0.10;
다중 정렬 파라미터 - 매트릭스: PAM, 갭 개방 페널티: 10.00, 지연에 대한 동일성 %: 30, 말단 갭 페널티 부과: on, 갭 분리 거리: 0, 음수 매트릭스: no, 갭 연장 페널티: 0.20, 잔기 특이적 갭 페널티: on, 친수성 갭 페널티: on, 친수성 잔기: GPSNDQEKR. 특정 잔기의 서열 동일성은 단순히 유도체화된 동일한 잔기를 포함하도록 의도된다.
따라서, 이러한 사슬의 기능 또는 활성을 유지하는 특정 서열을 갖는 항체 및 변이체가 제공된다.
항체는 그렘린-1에 대한 결합을 위해 H-쇄/L-쇄, HCVR/LCVR 또는 CDR 서열의 측면에서 상기 정의된 항체와 경쟁하거나, 이 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 특히, 항체는 그렘린-1에 대한 결합을 위해 서열 번호 4/5/6/7/8/9의 HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열 조합을 포함하는 항체와 경쟁하거나, 이 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 항체는 그렘린-1에 대한 결합을 위해 서열 번호 10/11 또는 12/13의 HCVR 및 LCVR 서열쌍 또는 서열 번호 14/15 또는 16/17의 전장 사슬을 포함하는 항체와 경쟁하거나, 이 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
"에피토프"라는 용어는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 하위세트이며, 상호작용의 친화도에 직접 기여하는 잔기를 갖는다. 또한, 에피토프는 비선형 아미노산으로 이루어진 입체형태일 수 있다. 특정 실시양태에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기 또는 술포닐기와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기인 결정인자를 포함할 수 있으며, 특정 실시양태에서는 특정 3차원 구조적 특징 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다.
관련 기술 분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 결합을 위해 참조 항체와 경쟁하는지의 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 발명의 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 참조 항체는 포화 조건 하에 단백질 또는 펩티드에 결합하도록 허용된다. 다음으로, 시험 항체가 단백질 또는 펩티드에 결합하는 능력을 평가한다. 시험 항체가 참조 항체와의 포화 결합 후에 단백질 또는 펩티드에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 참조 항체와는 상이한 에피토프에 결합한다는 결론내릴 수 있다. 다른 한편으로, 시험 항체가 참조 항체와의 포화 결합 후에에 단백질 또는 펩티드에 결합할 수 없는 경우에는, 시험 항체는 본 발명의 참조 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
항체가 참조 항체와 결합을 위해 경쟁하는지를 결정하기 위해, 상기 설명한 결합 방법은 2가지 방향으로 수행된다. 제1 방향에서, 참조 항체를 포화 조건 하에서 단백질/펩티드에 결합시킨 다음, 단백질/펩티드 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 제2 방향에서, 시험 항체는 포화 조건 하에서 단백질/펩티드에 결합시킨 다음, 단백질/펩티드에 대한 참조 항체의 결합을 평가한다. 두 방향 모두에서, 단지 제1(포화) 항체만이 단백질/펩티드에 결합할 수 있다면, 시험 항체 및 참조 항체는 단백질/펩티드에 대한 결합을 위해 경쟁한다고 결론을 내린다. 통상의 기술자가 인식할 수 있는 바와 같이, 참조 항체와 결합을 위해 경쟁하는 항체는 반드시 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합할 필요는 없지만, 중첩 또는 인접 에피토프에 결합함으로써 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
2개의 항체는 그 각각이 항원에 대한 다른 항원의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)한다면 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다. 즉, 1, 5, 10, 20 또는 100배 과량의 하나의 항체는 경쟁적 결합 분석에서 측정시에 다른 하나의 항체의 결합을 적어도 50%, 75%, 90% 또는 심지어 99%까지 억제한다(예를 들어, 문헌 [Junghans et al., Cancer Res, 1990:50: 1495-1502] 참조). 대안적으로, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는, 항원의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거한다면, 2개의 항체는 동일한 에피토프를 갖는다. 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부의 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하면, 두 항체는 중첩된 에피토프를 갖는다.
이어서, 시험 항체에서 결합 관찰의 결여가 실제로 참조 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합 때문인지 또는 입체 차단(또는 또 다른 현상)이 결합 관찰의 결여의 원인인지의 여부를 확인하기 위해 추가의 통상적인 실험(예를 들어, 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행할 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라스몬 공명, 유동 세포 계측법 또는 관련 기술 분야에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 분석을 사용하여 수행될 수 있다.
항체는 예를 들어 표준 ELISA 또는 웨스턴 블로팅에 의해 그렘린-1에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. ELISA 분석은 또한 표적 단백질과의 양성 반응성을 나타내는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 항체의 결합 선택성은 또한 예를 들어 유동 세포 계측법에 의해 표적 단백질을 발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 따라서, 스크리닝 방법은 ELISA 또는 웨스턴 블롯 또는 유동 세포 계측법을 수행함으로써 그렘린-1에 결합할 수 있는 항체를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
항체는 그렘린-1을 선택적으로(또는 특이적으로) 인식할 수 있다. 항체 또는 다른 화합물은 이들이 선택적이지만 다른 단백질에는 실질적으로 결합하지 않거나 낮은 친화도로 결합하는 단백질에 우선적인 또는 높은 친화도로 결합할 때 그 단백질에 대해 "선택적으로 결합하거나" 또는 그 단백질을 "선택적으로 인식한다". 항체의 선택성은 상기 논의된 바와 같이 항체가 다른 관련 단백질에 결합하는지의 여부 또는 이들을 구별하는지의 여부를 결정함으로써 추가로 연구될 수 있다. 본 발명의 항체는 전형적으로 인간 그렘린-1을 인식한다.
항체는 또한 관련 단백질, 또는 인간 그렘린-1 및 다른 종의 그렘린-1에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다.
특이적인(또는 선택적인) 용어를 통해, 항체는 임의의 다른 분자에 대한 유의한 교차 반응성이 없이 관심 있는 단백질에 결합한다는 것이 이해될 것이다. 교차 반응성은 본원에서 설명되는 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 항체의 교차 반응성은 항체가 관심 있는 단백질에 결합하는 것에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 100%의 강도로 다른 분자에 결합할 경우 유의한 것으로 간주될 수 있다. 특이적인(또는 선택적인) 항체는 항체가 관심 있는 단백질에 결합하는 강도의 약 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% 또는 20% 미만의 강도로 또 다른 단백질에 결합할 수 있다. 항체는 항체가 관심 있는 단백질에 결합하는 강도의 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만의 강도로 다른 분자에 결합할 수 있다.
항-그렘린 항체는 예를 들어 이전에 문헌에 기술되어 있고, 예를 들어 WO2014/159010A1(Regeneron)은 25℃에서 625 pM 내지 270 nM 범위의 결합 친화도 KD 값으로 그렘린-1 활성을 억제하는 항-그렘린 항체를 설명하고 있다. 문헌 [Ciuclan et al. (2013)]은 결합 친화도 KD가 5.6 x 10-10 M인 항-그렘린-1 모노클로날 항체를 설명하고 있다.
본 발명의 항-그렘린-1 항체는 그렘린-1 활성의 알로스테릭 억제제이고, BMP 결합 부위로부터 원위에 있는 새로운 에피토프에 결합한다. 항체는 100 pM 미만의 Kd 값으로 극히 높은 친화도로 그렘린-1에 결합한다. 따라서, 본 발명의 항체는 현재 이용 가능한 항체보다 유의한 개선을 나타내며, 그렘린-1 매개 질환의 치료에 특히 유용할 것으로 기대된다.
따라서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 항체는 (인간) 그렘린-1에 대해 높은 결합 친화도를 가질 수 있다. 항체는 1 nM 미만, 바람직하게는 500 pM 미만의 해리 상수(KD)를 가질 수 있다. 한 예에서, 항체는 200 pM 미만의 해리 상수(KD)를 갖는다. 한 예에서, 항체는 100 pM 미만의 해리 상수(KD)를 갖는다. 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 표면 플라스몬 공명 검정, 포화 검정 또는 면역 검정, 예컨대 ELISA 또는 RIA와 같은, 그의 표적 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 예시적인 방법은 문헌 [Krinner et al., (2007) Mol. Immunol. February; 44 (5):916-25. (Epub 2006 May 11)]에 기재된 바와 같이, CM5 센서 칩을 사용하여 BIAcore™ 2000 장비(Biacore AB, 독일 프라이부르크 소재) 상에서 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 수행되는 방법이다.
본 발명의 항체는 전형적으로 억제 항체이다. 그렘린-1은 BMP-2, 4 및 7을 음성적으로 조절하고, 따라서 그렘린-1을 억제하면 BMP를 통한 신호전달이 증가한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 출원의 실시예는 항체가 그렘린 1을 억제할 수 있는지의 여부를 스크리닝하기 위한 두 가지 기능적 분석, 즉 SMAD 인산화 분석 및 Hek Id1 리포터 유전자 분석을 설명한다. 전형적으로, 억제 항체는 SMAD 인산화를 회복시키고/시키거나 Hek Id1 리포터 유전자 분석에서 BMP의 신호전달을 회복시킨다. SMAD 인산화는 BMP 대조군과 비교할 때 적어도 80%, 90% 또는 100% 회복될 수 있다. Hek Id1 리포터 유전자 분석에서, 억제 항체는 10 nM 미만, 바람직하게는 5 nM 미만의 IC50을 가질 수 있다.
적합한 항체가 확인되고 선택되면, 항체의 아미노산 서열은 관련 기술 분야에 공지된 방법으로 확인될 수 있다. 항체를 코딩하는 유전자는 축퇴성(degenerate) 프라이머를 사용하여 클로닝될 수 있다. 항체는 통상적인 방법에 의해 재조합 방식으로 생산될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역(또는 전장 H- 및 L-쇄)을 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다.
변이체 폴리뉴클레오티드는 서열 목록에 제시된 서열로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개까지, 20개까지, 30개까지, 40개까지, 50개까지, 75개까지 또는 그 초과의 핵산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 일반적으로, 변이체는 1-20, 1-50, 1-75 또는 1-100개의 치환 및/또는 결실을 갖는다.
적합한 변이체는 본원에서 개시되는 핵산 서열 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에 적어도 약 70% 상동성이고, 전형적으로는 적어도 약 80 또는 90%, 보다 적절하게는 적어도 약 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다. 변이체는 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보유할 수 있다. 변이체는 전형적으로 약 60% 내지 약 99%의 동일성, 약 80% 내지 약 99%의 동일성, 약 90% 내지 약 99%의 동일성 또는 약 95% 내지 약 99%의 동일성을 보유한다. 이들 수준의 상동성 및 동일성은 적어도 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역에 관해서 일반적으로 존재하는 것이다. 상동성을 측정하는 방법은 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있으며, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본원에서 상동성이 핵산 동일성에 기초하여 계산된다는 것을 이해할 것이다. 이러한 상동성은 적어도 약 15개, 적어도 약 30개, 예를 들어 적어도 약 40개, 60개, 100개, 200개 또는 그 초과의 연속적인 뉴클레오티드의 영역(길이에 따라)에 걸쳐 존재할 수 있다. 이러한 상동성은 변형되지 않은 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 상동성 또는 동일성을 측정하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는 상동성을 계산하기 위해 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램(예를 들어, 그의 디폴트 설정으로 사용되는)을 제공한다(Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395).
또한, 예를 들어 문헌 [Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al. (1990) J Mol Biol 215:403-10]에 기재된 바와 같이, PILEUP 및 BLAST 알고리즘이 상동성을 계산하거나 서열을 정렬하기 위해(일반적으로 그의 디폴트 설정으로) 사용될 수 있다.
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생명공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 일부 양수 값 역치 스코어 T와 일치하거나 이를 충족하는 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 스코어가 높은 서열쌍(HSP)을 먼저 확인하는 것을 수반한다. T는 인접 단어 스코어 역치로 불린다(Altschul et al., 상기 문헌). 이러한 초기 인접 단어 히트(hit)는 해당 단어가 포함된 HSP를 찾기 위해 검색을 개시하기 위한 입력값(seed)으로 작용한다. 단어 히트는 누적 정렬 스코어를 증가시킬 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 각각의 방향의 단어 히트에 대한 확장은 다음 중 하나일 때 중단된다: 누적 정렬 스코어가 하나 이상의 음수 스코어 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하가 되는 경우, 또는 두 서열 중 어느 하나의 끝에 도달하는 경우. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 단어 길이(W) 11, BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌 [Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919] 참조) 정렬(B) 50, 기대치(E)=10, M=5, N=4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 2개 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다(예를 들면, 문헌 [Karlin and Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성 측정값은, 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 가능성을 나타내는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 제2 서열에 대한 제1 서열의 비교에서 최소 합계 확률이 약 1 미만, 전형적으로 약 0.1 미만, 적합하게는 약 0.01 미만, 가장 적합하게는 약 0.001 미만인 경우, 서열은 또 다른 서열과 유사한 것으로 간주된다. 예를 들어, 최소 합계 확률은 약 1 내지 약 0.001, 종종 약 0.01 내지 약 0.001의 범위일 수 있다.
상동체는 약 3, 5, 10, 15, 20개 또는 그 초과의 돌연변이(그 각각은 치환, 결실 또는 삽입일 수 있음)에 의해 관련 폴리뉴클레오티드의 서열과 상이할 수 있다. 예를 들어, 상동체는 3-50개의 돌연변이, 종종 3-20개의 돌연변이에 의해 상이할 수 있다. 이들 돌연변이는 상동체의 적어도 30개, 예를 들어 적어도 약 40, 60 또는 100개 또는 그 초과의 연속적인 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 측정될 수 있다.
한 실시양태에서, 변이체 서열은 유전 코드의 중복으로 인해 서열 목록에 제시된 특정 서열과 상이할 수 있다. DNA 코드는 4개의 1차 핵산 잔기(A, T, C 및 G)를 가지고 있으며, 이를 통해 유기체의 유전자에서 코딩되는 단백질의 아미노산을 나타내는 3개 문자의 코돈을 "형성"한다. DNA 분자를 따른 코돈의 선형 서열은 그 유전자에 의해 코딩되는 단백질(들) 내의 아미노산의 선형 서열로 번역된다. 코드는 20개의 천연 아미노산을 코딩하는 61개의 코돈 및 "정지" 신호를 나타내는 3개의 코돈으로 고도로 축퇴화되어 있다. 따라서, 대부분의 아미노산은 하나 초과의 코돈에 의해 코딩되고, 실제로 몇몇은 4개 이상의 상이한 코돈에 의해 코딩된다. 따라서, 본 발명의 변이체 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 또 다른 폴리뉴클레오티드와 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩할 수 있지만, 동일한 아미노산을 코딩하기 위해 상이한 코돈의 사용으로 인해 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 DNA 서열은 예를 들어 화학적 처리, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합에 의해 제조된 합성 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열은 결정된 DNA 서열로부터 또는 상응하는 아미노산 서열을 기초로 하여 원하는 대로 합성될 수 있다.
벡터를 구축할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이와 관련하여, 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing]을 참조한다.
또한, 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열의 발현에 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 및 기타 미생물 시스템이 사용될 수 있거나 또는 진핵 세포, 예컨대 포유동물 숙주 세포 발현 시스템이 또한 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현 유도에 적합한 조건 하에 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 분자의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 Ab 7326 항체는 그렘린-1의 잔기 Ile110(131), Lys126(147), Lys127(148), Phe128(149), Thr129(150), Thr130(151), Arg148(169), Lys153(174) 및 Gln154(175)에 결합하는 것으로 확인되었고, 여기서 Lys126(147), Lys127(148), Phe128(149), Thr129(150), Thr130(151), Arg148(169), Lys153(174) 및 Gln154(175)는 하나의 그렘린-1 단량체 상에 존재하고, Ile110(131)은 제2 그렘린-1 단량체 상에 존재한다. 괄호 밖의 넘버링은 구조 파일에 기초한다(구조적 정렬에 기초한 마우스 그렘린-2의 넘버링과 일치함). 괄호 안의 숫자는 서열 번호 1의 UniProt 엔트리 O60565에 기초한 잔기를 나타낸다. 실시예 섹션에서 논의되는 바와 같이, 이들 에피토프 잔기는 그렘린-1-Ab 7326 Fab 복합체로부터 4 Å에서 NCONT 분석을 사용하여 확인되었다.
따라서, 본 발명의 항체는 Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 및 Gln175(서열 번호 1에 기초한 잔기 넘버링 사용)로부터 선택된 적어도 하나의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 이들 잔기의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 9개 전부(바람직하게는 적어도 5개의 잔기)를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 Ile131이 다른 잔기와 상이한 그렘린-1 단량체 상에 존재하는 에피토프를 인식할 수 있다.
이들 잔기는 인간 그렘린-1의 특정 서열에 대해 제공되지만, 통상의 기술자는 통상적인 기술을 사용하여 이들 잔기의 위치를 다른 상응하는 그렘린 서열(예를 들어, 마우스)에 대해 쉽게 외삽할 수 있다. 따라서, 상기 다른 그렘린 서열 내의 상응하는 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체가 또한 본 발명에 의해 제공된다.
특정 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)]에 기재된 바와 같은 통상적인 교차 차단 분석을 수행할 수 있다. 다른 방법으로는 알라닌 스캐닝 돌연변이체, 펩티드 블롯(Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63) 또는 펩티드 절단 분석을 포함한다. 또한, 항원의 에피토프 절단, 에피토프 추출 및 화학적 변형과 같은 방법을 이용할 수 있다(Tomer (2000) Protein Science 9:487-496). 이러한 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다.
항체 에피토프는 또한 x-선 결정학에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 그렘린-1에 결합된 항체의 x-선 결정 분석을 통해 평가될 수 있다. 에피토프는 특히 항체 파라토프 잔기의 4 Å 이내의 그렘린-1 상의 잔기를 결정함으로써 상기 방식으로 확인할 수 있다.
약제학적 조성물, 투여량 및 투여 요법
본 발명의 항체, 또는 스크리닝 방법에 의해 확인된 그렘린-1을 조절하는 작용제는 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 약제학적 조성물은 일반적으로 무균일 것이고, 전형적으로는 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 보조제를 포함할 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 보조제 및/또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 비경구, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피내, 안내, 복강내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 적합할 수 있다. 대안적으로, 담체는 비경구 투여, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로에 적합할 수 있다. 담체는 경구 투여에 적합할 수 있다. 투여 경로에 따라, 조절제는 산의 작용 및 화합물을 불활성화할 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하기 위해 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용 가능한 염"은 모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하고 임의의 원하지 않는 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 수성 담체 또는 희석제를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 담체의 예는 물, 완충된 물 및 염수를 포함한다. 다른 담체의 예는 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 및 올레산에틸과 같은 주사 가능 유기 에스테르를 포함한다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 다가알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건 하에서 멸균 상태이고 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 고 약물 농도에 적합한 다른 규칙적인 구조로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 추가의 활성 성분을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 또는 조절제 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 본 발명의 범위 내에 있다. 키트는 추가로 하나 이상의 추가의 시약, 예를 들어 상기 논의된 바와 같은 추가의 치료제 또는 예방제를 함유할 수 있다.
본 발명의 조절제 및/또는 항체 또는 그의 제제 또는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 투여될 수 있다.
치료적 적용에서, 화합물은 병태 또는 그의 하나 이상의 증상을 치료하거나, 완화하거나 또는 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 상기 설명된 바와 같은 장애 또는 병태를 이미 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 이러한 치료적 처치는 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 증상이 없는 기간의 빈도 또는 지속 기간을 증가시킬 수 있다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료 유효량"으로 정의된다.
예방적 적용에서, 제제는 병태 또는 그의 하나 이상의 증상을 예방하거나, 그의 후속 효과를 감소시키기에 충분한 양으로 상기 설명된 바와 같은 장애 또는 병태의 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "예방 유효량"으로 정의된다. 각각의 목적의 유효량은 질환 또는 상해의 중증도뿐만 아니라 환자의 체중 및 일반적인 상태에 따라 결정될 것이다.
투여 대상체는 인간 또는 비인간 동물일 수 있다. "비인간 동물"이란 용어는 모든 인간 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 인간에 대한 투여가 전형적이다.
본 발명의 항체/조절제 또는 약제학적 조성물은 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 통상의 기술자라면 알 수 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 화합물 또는 약제학적 조성물에 대한 투여 경로의 예는 정맥내, 근육내, 피내, 안내, 복강내, 피하, 척추, 또는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에서 사용되는 "비경 구 투여"라는 문구는 장내 및 국소 투여 이외의 다른 투여, 대체로 주사에 의한 투여 방식을 의미한다. 대안적으로, 본 발명의 항체/조절제 또는 약제학적 조성물은 비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 항체/조절제 또는 약제학적 조성물은 경구 투여용일 수 있다.
본 발명의 항체/조절제 또는 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 숙련된 의료인에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성을 제시하지 않으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변화될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속 기간, 사용되는 특정 조성물가 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 상태 및 이전 병력, 및 의료 분야에 잘 알려진 다른 인자에 따라 결정될 것이다.
적합한 용량은 예를 들어 치료되는 환자의 체중 1 kg당 약 0.01 ㎍ 내지 약 1000 mg, 전형적으로는 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 mg의 범위일 수 있다. 예를 들어, 적합한 투여량은 1일당 환자의 체중 1 kg당 약 1 ㎍ 내지 약 10 mg 또는 약 10 ㎍ 내지 약 5 mg일 수 있다.
투여 요법은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 용량이 투여될 수 있고, 여러 분할된 용량이 시간이 지남에 따라 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 본원에서 사용되는 단위 투여 형태는 치료되는 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하고, 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소 정량의 활성 화합물을 함유한다.
투여는 단일 또는 다중 용량일 수 있다. 다중 용량은 동일하거나 상이한 경로를 통해 동일하거나 상이한 위치에 투여될 수 있다. 대안적으로, 투여는 서방성 제형을 통해 이루어질 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서 길항제의 반감기 및 원하는 치료 기간에 따라 달라질 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 조절제/항체 또는 약제학적 조성물은 하나 이상의 다른 치료제와 함께 공동 투여될 수 있다.
2개 이상의 작용제의 조합 투여는 다수의 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 둘 모두 단일 조성물로 함께 투여될 수 있거나, 또는 조합 요법의 일부로서 별도의 조성물로 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나의 작용제는 다른 작용제의 투여 전에, 투여 후에 또는 동시에 투여될 수 있다.
치료 적응증
본 발명의 항체 또는 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 확인된 조절제는 그렘린-1 활성과 관련된 임의의 병태, 예를 들어, 전체적으로 또는 부분적으로 그렘린-1을 통한 신호전달에 의해 발생하는 임의의 병태의 치료, 예방 또는 개선에 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 그렘린에 의해 매개되거나 그렘린에 의한 영향을 받는 병태의 치료, 예방 또는 개선에 관한 것이다. 이러한 병태는 신장 섬유증(예를 들어, 당뇨성 신병증 및 만성 동종이식 신병증) 및 특발성 폐 섬유증을 포함하는 섬유증 질환, 폐동맥 고혈압, 혈관신생 및 암(예를 들어, 결장 직장암)을 포함한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예 1- 단백질 발현, 정제, 재폴딩 및 구조 결정.
단백질 발현 및 봉입체 제조
이. 콜라이에서의 발현을 위해 최적화된, 말단 절단된 인간 그렘린-1 코딩 서열(서열 번호 20)을 BamHI/XhoI를 사용하여 변형된 pET32a 벡터(Merck Millipore)에 클로닝하여, N 말단 6His-TEV 태그와 함께 그렘린 서열을 코딩하는 벡터(pET-hGremlin1)를 생성하였다.
발현된 서열:
Figure pct00003
서열 번호 2(6His-TEV 태그의 비그렘린 잔기는 이탤릭체로 표시됨). UniProt O60565 및 서열 번호 1에 기초한 서열 넘버링.
pET-hGremlin1 플라스미드 DNA를 사용하여 BL21(DE3) 세포를 형질전환시켰다. 단일 암피실린 내성 콜로니를 LB/Amp 한천 플레이트로부터 골라내어 LB/Amp의 100 ml 종균 배양액에 접종하였다. 37℃에서 16시간 동안 진탕한 후(200 rpm), 25 ml의 종균 배양액을 사용하여 500 mL의 2xTY/Amp 배지에 접종하였다. 배양액을 3의 OD600이 달성될 때까지 37℃에서 진탕하였다(250 rpm). 이어서, 배양액에 20 ml의 MOPS + 글리세롤 공급 혼합물( 1M MOPS pH 7.4, 40% 글리세롤, 0.5% MgS04, 0.42% MgCl2)을 보충하고, 300 μΜ IPTG로 유도하고, 17℃, 180 rpm에서 16시간 동안 추가로 인큐베이팅하였다. 세포를 원심분리기(4,000 g, 4℃에서 20분)에서 수거하였다.
세포 펠렛을 4℃에서 용해 완충제(PBS pH 7.4, 0.35 mg/ml 리소자임, 10 ㎍/ml DNase 및 3 mM MgCl2)에 재현탁하고, 불용성 분획을 3,500 g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하여 수거하였다. 펠렛화된 봉입체를 세척 완충제(50 mM 트리스(Tris), 500 mM NaCl, 0.5% 트리톤(Triton) X-100, pH 8.0)에 재현탁하여 3회 세척한 후, 21,000 g에서 15분 동안 원심분리하였다. 트리톤 X-100이 없는 세척 완충제를 사용하여 추가로 2회의 세척을 수행하였다.
가용화
봉입체를 변성 완충제(8 M 우레아, 100 mM 트리스, 1 mM EDTA, 10 mM Na2S4O6 및 100 mM Na2SO3, pH 8.5)에 재현탁하고, 실온에서 16시간 동안 교반하고, 21,000 g에서 15분 동안 원심분리하였다.
사전 재폴딩 정제
가용화된 봉입체를 8 M 우레아, 50 mM MES, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 6.0으로 평형화된 세파크릴 S-200 26/60 컬럼(120 mL) 상에 로딩하였다. 그렘린-1 단백질을 함유하는 분획을 6 M 우레아, 20 mM MES, pH 6.0으로 희석하고, HiTrap SP HP 양이온 교환 컬럼 상에 로딩하고, 10 컬럼 부피(10 CV)에 걸쳐 1 M NaCl 구배로 용리시켰다. 정제된 변성 hGremlin-1 단백질을 함유하는 분획을 모았다.
재폴딩
정제된 변성 그렘린-1 단백질을 재폴딩 완충제(50 mM 트리스, pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM GSH 및 5 mM GSSG, 0.5 mM 시스테인, 5 mM EDTA, 0.5 M 아르기닌)에 0.1 mg/ml의 최종 농도로 적가하고, 4℃에서 5일 동안 지속적으로 교반하면서 인큐베이팅하였다. 5일 후에, 그렘린-1 단백질을 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.5에 대해 투석하였다.
투석 후, 단백질을 헤파린 HiTrap 컬럼에 적용하고, 20 CV 이상의 0-100% 헤파린 용리 완충제(20 mM HEPES, 1M NaCl, pH 7.5)의 구배를 사용하여 용리시켰다. 정확하게 폴딩된 단백질은 1 M NaCl에서 용리되었지만, 임의의 오류 폴딩된 단백질은 보다 낮은 염 농도에서 용리되었다.
1 M NaCl에서 용리된 단백질을 농축하고, 20 mM Hepes, pH 7.5, 1 M NaCl로 평형화된 S75 26/60 컬럼에서 추가로 정제하였다.
단백질은 SDS PAGE(겔 내 이동)에 의해 특징이 결정되고, 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법(LC-MS)을 사용하여 예상 분자량 및 정확한 디술파이드 결합 배열을 갖고 세포 분석(ID1 리포터 분석)에서 활성을 갖는 것으로 입증되었다.
그렘린 1 구조 결정
그렘린 1 단백질 결정은 6.6 mg/ml의 그렘린 1의 용액 및 pH 4의 0.1 M 시트르산, 1 M 염화리튬 및 27% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 6000의 용액을 1:1의 비율로 혼합하여 현적(hanging-drop) 방법을 사용하여 성장시켰다. 데이터 수집 전에, 결정화 완충제에 20% 글리세롤을 첨가하여 결정을 동결 보호하였다. 회절 데이터는 다이아몬드 광원(Diamond Light Source)에서 수집하고, XDS(Kabsch, Wolfgang (2010) Acta Crystallographica Section D 66, 125-132)를 사용하여 처리하였다. 회절 데이터 통계는 아래 표에 요약되어 있다.
표 2: 회절 데이터 통계
Figure pct00004
Figure pct00005
*괄호 내의 값은 가장 높은 해상도 쉘에 상응한다.
**r.m.s.d: 평균 제곱근 편차
그렘린-1 구조는 Phaser(McCoy et al., J Appl Cryst (2007), 40, 658-674) 및 독점적인(proprietary) 그렘린-1/Fab 복합체 좌표에서 얻을 수 있는 그렘린-1 모델을 사용하여 분자를 대체함으로써 해결되었다. 생성된 그렘린-1 모델은 2개의 이량체로 조직화된 4개 카피의 그렘린 1 단량체를 함유하였다. 모델 보정은 쿠트(Coot)(Emsleyet al. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 66 (4), 486-501)를 사용하여 실시하였고, 좌표는 레프맥(Refmac)(Murshudov et al. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 2011;67(Pt 4):355-367)을 사용하여 보정하였다. 최종 좌표는 몰프로비티(Molprobity)(Chen et al. (2010) MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica D66:12-21)를 사용하여 확인하였다. 모델 보정 통계에 대한 요약은 상기 표 2에 제시되어 있다.
실시예 2 - 그렘린 -1 상의 BMP 결합 잔기
상기 논의한 바와 같이, 그렘린-1은 DAN 패밀리로 알려진 하위군 내의 골 형태 형성 단백질(BMP) 길항제 단백질 군에 속한다. DAN 패밀리 내에서, 그렘린-1은 그렘린-2(PRDC)와 가장 큰 상동성을 공유한다.
실시예 1에서 설명된 2.7 Å 인간 그렘린-1 구조는 공개된 마우스 그렘린-2 구조(Nolan et al. (2013), Structure, 21, 1417-1429)와 공통된 많은 특징을 공유한다. 전체적인 폴드는 애우 유사하고, 역평행, 비공유 이량체를 형성하는 2개 카피의 그렘린-1이 아치에 배열된다. 각각의 단량체는 손목 끝을 향한 시스틴-노트 모티브가 손가락 반대편에 있는 특징적인 손가락-손목-손가락 배열을 채택한다(도 2). 단백질 사이의 서열 동일성은 두 구조에서 볼 수 있는 서열 내에서 67%로 52% 상승한다. 가장 고도로 보존된 영역은 모든 핵심적인 접촉 잔기가 100% 보존되는 광범위한 이량체 계면에 존재한다(도 3).
마우스 그렘린-2(PRDC) 및 DAN(NBL1)에 대한 BMP 2, 4 & 7 결합에 관련된 잔기는 돌연변이 유발을 사용하여 확인되었다(Nolan et al. (2013), Structure, 21, 1417-1429 and Nolan et al(2014) J. Biol. Chem. 290, 4759-4771). 예측된 BMP 결합 에피토프는 이량체의 볼록 표면 상의 두 단량체에 걸쳐 이어지는 소수성 패치를 포함한다(도 4 및 도 5). 6개의 잔기, 즉 Trp72, Phe96, Tyr98, Phe104, Tyr105 & Phe117이 돌연변이 유발에 의해 확인되었고, 이들은 인간 그렘린-1(마우스 그렘린-2 서열에 기초한 넘버링)에서 100% 보존된다. 상동성 정도는 두 단백질 모두에서 동일한 입체형태를 취하는 측쇄의 위치까지 확장된다(도 5).
그렘린 PDB 파일에 사용된 아미노산 넘버링은 구조적 정렬에 기초하여 개시된 마우스 그렘린-2 구조의 넘버링과 일치한다. 이것은 구조를 설명할 때 아미노산의 같은 대상끼리의 비교(like for like comparison)를 가능하게 한다. 그러나, 명확성을 위해, BMP 결합에서 역할을 수행하는 것으로 확인된 핵심적인 잔기는 괄호 내에 서열 번호 1의 PDB 파일 및 UniProt 파일에 기초한 넘버링과 함께 아래에 나타내었다:
Trp72(93), Phe96(117), Tyr98(119), Phe104(125), Tyr105(126) & Phe117(138).
마우스 그렘린-2와 인간 그렘린-1 둘 모두에서, 소수성 BMP 결합 에피토프는 각각의 단백질의 N 말단 잔기에 의해 형성된 알파 나선에 의해 부분적으로 묻혀있다. N 말단이 굴곡되어 전체 BMP 결합 계면을 노출시키는 BMP 결합 모델이 제안되었다(Nolan et al. (2013), Structure, 21, 1417-1429). 도 4에서, N 말단 잔기는 각각의 단백질 상의 BMP 결합면의 유사성을 나타내기 위해 표면을 렌더링하기 전에 인간 그렘린-1 및 마우스 그렘린-2 구조로부터 제거되었다.
상기 문헌은 BMP 결합에 영향을 미치는 6개 잔기의 돌연변이 유발에 대해서만 기술하고 있다. 실제 BMP 에피토프가 이웃하는 아미노산을 포함하는 더 큰 표면적을 덮는 것이 가능하다. 그렘린-1의 표면에 돌연변이된 잔기의 6 Å 내의 모든 잔기를 강조함으로써, 그렘린-1의 더 큰 영역이 치료제에 의해 잠재적으로 표적화될 수 있음이 밝혀졌다(도 11). 이러한 보다 광범위한 영역은 인간 그렘린-1의 다음 아미노산을 포함한다:
Asp92-Leu99
Arg116-His130
Ser137-Ser142
Cys176-Cys178
(서열 번호 1에 기초한 넘버링).
공개된 정보를 인간 그렘린-1의 결정 구조 정보와 조합함으로써 BMP와의 상호작용을 차단하는 치료 개입을 위한 잠재적 경로로서 스스로를 제시하는 인간 그렘린-1의 영역이 확인되었다.
실시예 3 - Hek Id1 리포터 유전자 분석
배경
Hek Id1 리포터 유전자 분석은 클론 12 Hek293-Id1 리포터 세포를 사용한다. 이 세포주는 Id1 전사 인자로 안정적으로 형질감염되었다. Id1은 BMP 신호전달 경로의 전사 인자이다. 그렘린은 BMP에 결합하고 BMP가 그의 수용체에 결합하는 것을 억제하여 리포터 유전자로부터의 루시퍼라제 신호를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이 리포터 분석법을 사용하여 항-그렘린 항체를 스크리닝하고 그렘린과 BMP의 상호작용을 차단하는 임의의 물질이 있는지 확인할 수 있다. 이러한 상호작용의 차단이 존재하는 경우, 루시퍼라제 신호의 회복이 상기 세포에서 관찰된다.
방법
클론 12 세포를 10% FCS, 1x L-글루타민 및 1x NEAA를 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 세포는 또한 세포가 Id1 유전자 발현을 상실하지 않도록 히그로마이신 B(200 ㎍/ml)의 존재 하에 성장하였다. 세포를 0.5% FCS, 1x L-글루타민 및 1x NEAA를 함유하는 DMEM에서 분석하였다. 히그로마이신 B는 세포가 분석에 존재하는 짧은 시간 동안 필요하지 않다.
세포를 PBS로 세척하고, 세포 해리 완충제를 사용하여 들어올리고, 회전시키고, 계수한 후, 70 ㎕(밀도: 7.14x105/ml)에 5x104/웰로 파종하였다. 사용된 플레이트는 백색의 멸균된 불투명 폴리-D-리신 코팅 96웰이었다. 세포는 침강시키기 위해 약 3-4시간 동안 인큐베이터에서 넣었다. BMP 이종이량체는 4 mM HCl에서 200 ㎍/ml로 재구성하였다. BMP를 유리 바이알을 사용하여 분석 배지에 10 ㎍/ml로 희석하여 새로운 작업 원액을 제공하였다.
폴리프로필렌 플레이트에서, 그렘린-1은 1 ㎍/ml의 최고 최종 용량으로 8점 용량 반응 곡선에 대해 1:2로 희석되었다.
웰당 20 ㎕ 배지의 추가의 부피를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 45분 동안 인큐베이팅하였다.
100x로 제조된 BMP를 세포만 함유하는 웰을 제외한 모든 웰에 첨가하였다. 모든 웰은 분석 배지를 사용하여 60 ㎕까지 만들고, 37℃에서 추가 45분 동안 인큐베이팅하였다.
인큐베이팅 후에, 분석 플레이트의 웰당 30 ㎕의 샘플을 옮기고, 발광 신호를 측정하기 전에 20-24시간 동안 인큐베이팅하였다.
셀 스테디 글로(Cell Steady Glo)를 미리 실온에서 해동하였다. 분석 플레이트를 시약을 첨가하기 전에 약 10-15분 동안 실온으로 냉각하였다. 루시퍼라제 신호는 실온에서 진탕기 상에서 20분 동안 셀 스테디 글로 시약(100 ㎕)을 첨가하고 시너지(Synergy) 2에서 셀 타이터 글로(Cell Titer Glo) 프로토콜을 사용하여 발광을 측정함으로써 검출하였다.
최대 신호는 BMP를 함유하는 웰로부터 생성되었고, 최소 신호는 세포만 함유하는 웰로부터 생성되었다.
결과
BMP4/7에 대한 차단 활성을 확인하기 위해 Hek-Id1 리포터 유전자 분석에서 그렘린-1 전장 및 말단 절단된 형태를 시험하였다. 전장 단백질에 대한 결과는 도 6a에 나타내었고, 말단 절단된 단백질에 대한 결과는 도 6b에 나타내었다.
용량 반응 검정으로부터 억제 백분율은 분석에서의 최대 및 최소 신호에 기초하여 계산하였고, 데이터는 4 파라미터 로지스틱 피트를 사용하여 피팅하였다. IC50은 곡선의 변곡점에 기초하여 계산되었다.
표 3: Hek-Id1 리포터 유전자 분석에서 전장 그렘린-1 및 말단 절단된 그렘린-1에 대한 효능 결과.
Figure pct00006
결론
그렘린 1은 Hek-Id1 리포터 유전자 분석에서 BMP 4/7 신호전달을 억제할 수 있었다.
실시예 4 - 항- 그렘린 -1 항체의 생산
항-그렘린-1 항체는 면역화 및 라이브러리 패닝에 의해 유도되었다. 라이브러리는 헌혈로부터 증폭된 V 영역을 갖는 나이브(naive) 인간 라이브러리로서 자체 제작하였다.
면역화는 1차 면역화로부터 그렘린-1에 결합하는 26개의 별개의 항체를 생성하였다. 이들 항체를 스크리닝 분석에서 시험하기 위해 규모를 확대하고 정제하였다.
라이브러리로부터의 25개의 인간 및 마우스 교차 반응성 항체를 알&디 시스템즈(R&D Systems)의 재조합 인간 그렘린을 사용하여 패닝하였다. 10개 항체를 규모 확대를 위해 선택하고, 스크리닝 분석에서 시험하기 위한 scFv로서 정제하였다.
실시예 5 - 항- 그렘린 -1 항체의 스크리닝
실시예 3에서 설명된 Hek-Id1 리포터 유전자 분석을 사용하고 SMAD 인산화를 측정함으로써 항체를 스크리닝하였다. SMAD1, 5 및 8은 BMP 신호전달에 따라 인산화된다. 따라서, 그렘린-1의 억제제는 SMAD 인산화를 증가시킨다.
SMAD 인산화 분석은 A549 세포 또는 인간 폐 섬유모세포에서 수행되었다. MSD를 사용하여 인산화 수준을 측정하였다.
결과
Hek-Id1 리포터 유전자 분석에서, 면역화 유래 항체(BMP4/7 이종이량체에 대해 시험된 10배 과량의 항체)를 사용할 때 명백한 히트는 없었다. 결과는 도 7에 제시된다.
이와 대조적으로, 다수의 라이브러리 유래 항체는 Hek-Id1 리포터 유전자 분석(50% 그렘린 용량과 함께 50배 과량의 항체)에서 신호를 복원할 수 있었다(도 8). 이 중, Ab2416 및 Ab2417은 높은 수준의 내독소를 함유하였다. Ab7326은 10배 과량과 및 80% 억제 그렘린-1 농도에서 차단 능력을 유지하였다.
추가의 결과는 도 9a(인간 그렘린) 및 9b(마우스 그렘린)에 제시된다. 이들 도면은 15 nM까지 Ab7326(PB376으로 표지됨)의 적정을 보여준다. Ab7326은 인간(1.3 nM의 IC50) 또는 마우스(0.2 nM 그렘린의 IC50)에 의해 차단될 때 BMP 신호전달을 복원하는 것으로 나타났다. 상기 항체는 인간 및 마우스 IgG1 둘 모두로서 기능한다.
마우스 및 인간 전장 IgG1의 서열을 아래에 나타낸다. 마우스 및 인간 전장 IgG1 단백질을 합성하기 위해, 라이브러리로부터 유래된 Ab7326 가변 영역을 적절한 항체 불변 도메인을 포함하는 벡터로 재클로닝하였다.
Ab7326은 Ab가 scFv로서 클로닝된 나이브 인간 라이브러리로부터 유래되었기 때문에, 7326 가변 영역을 전장 Ab 또는 Fab로서 재클로닝하기 위해서는 프라이머/축퇴성 프라이머의 풀을 사용하여 VH 및 VK를 PCR에 의해 증폭하는 것이 필요하였다. 이어서, 증폭된 PCR 산물을 소화시키고, 동시에 마우스 및 인간 벡터에 클로닝하였다. VH 및 VK가 프라이머/축퇴성 프라이머의 풀에 의해 증폭됨에 따라 2개의 변이체 형태의 생성물이 수득되었고, 이들은 PCR 과정 동안 어닐링되는 미세하게 상이한 프라이머로부터 유래된 단일 아미노산 잔기가 상이하다.
아래에 제시된 바와 같이, 중쇄 가변 영역의 2개의 변이체 형태는 위치 6에서의 단일 아미노산이 상이하고, 경쇄 가변 영역의 2개의 변이체 형태는 위치 7에서의 단일 아미노산이 상이하다:
- 중쇄 가변 영역 변이체 1은 위치 6에 글루탐산(E)을 갖는다.
- 중쇄 가변 영역 변이체 2는 위치 6에 글루타민(Q)을 갖는다.
- 경쇄 가변 영역 변이체 1은 위치 7에 세린(S)을 갖는다.
- 경쇄 가변 영역 변이체 2는 위치 7에 트레오닌(T)을 갖는다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
항체 CDR은 카바트 방법을 사용하여 측정하였다(상기 서열에서 굵게 강조 표시됨). 코티아 정의를 사용하는 추가의 HCDR1 잔기는 이탤릭체로 표시된다. 불변 영역 서열에도 밑줄이 그어져 있다.
항-그렘린 1 항체를 이용한 p-SMAD 신호전달의 복원은 하기 표 4에 제시된다.
표 4: p-SMAD 신호전달의 복원
Figure pct00010
결과는 BMP 단독(대조군 BMP)에 의한 SMAD 인산화의 백분율로 제시된다. 특발성 폐 섬유증 환자의 폐 섬유모세포를 이용하여 실험을 수행하였다. rhGremlin-1 및 항-그렘린-1 항체를 실온에서 45분 동안 예비 인큐베이팅하였다. 이어서, rhGremlin-1 및 항-그렘린-1 항체를 BMP와 함께 30분 동안 세포에 첨가하였다.
표 5는 항-그렘린-1 항체에 의한 그렘린 1-BMP 복합체로부터 BMP-2 또는 BMP4/7의 대체를 조사한 SMAD 인산화 분석에서의 추가의 결과를 보여준다. 특발성 폐 섬유증 환자로부터의 폐 섬유모세포를 사용하여 실험을 다시 수행하였다. rhBMP-2 또는 rhBMP4/7을 rhGremlin-1과 함께 실온에서 1시간 동안 예비 인큐베이팅하였다. BMP-2 또는 BMP4/7-그렘린-1 복합체를 4℃에서 밤새 상이한 농도의 항-그렘린-1 항체와 함께 인큐베이팅하였다. 항체 농도는 플레이트의 최종 농도를 나타낸다.
표 5: 항-그렘린-1 항체에 의한 그렘린 1-BMP 복합체로부터 BMP-2 또는 BMP4/7의 대체
Figure pct00011
표 5에 나타낸 결과는 Ab7326이 그렘린 1-BMP 복합체로부터 이미 복합체화된 BMP-2 또는 BMP4/7을 대체할 수 있음을 입증한다. Ab7326은 비교 항체 2484보다 훨씬 더 낮은 농도에서 이러한 대체를 달성할 수 있다. 이것은 Ab7326이 알로스테릭 억제제임을 입증하고, 이것은 Ab7326에 대한 결합 부위가 그렘린-1 상의 알려진 BMP 결합 영역으로부터 먼 위치에 존재한다는 본 발명자들의 발견과 일치한다. 따라서, Ab7326은 BMP가 그렘린-1과 복합체화할 경우에도 알로스테릭 결합 부위에 접근할 수 있고, 이것은 그렘린 활성을 유의하게 개선된 억제를 유발할 수 있다.
실시예 6 - 7326 Fab와 복합체를 형성한 그렘린 -1의 결정 구조의 획득
Ab 7326 Fab와 복합체를 형성한 인간 그렘린-1의 결정 구조는 2.1 Å의 해상도에서 해결되었다. Fab 서열을 아래에 제시한다:
Figure pct00012
Figure pct00013
이어서, CCP4 소프트웨어 NCONT를 사용하여 그렘린-1과 Fab 사이의 4 Å에서 모든 접촉을 확인하였다. 다음 잔기가 확인되었다: Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 및 Gln175(서열 번호 1의 UniProt 서열에 기초한 넘버링)(마우스 그렘린-2의 넘버링과 일치하는 구조 파일에서 Ile110, Lys126, Lys127, Phe128, Thr129, Thr130, Arg148, Lys153 및 Gln154로서 넘버링됨).
도 10은 Fab 에피토프 잔기가 BMP 결합 영역과 관련하여 제시된 그렘린-Fab 복합체의 구조 모델을 보여준다.
Ab 7326은 알로스테리 방식으로 작용하는 억제 항체이고, 즉, BMP 결합 영역으로부터 멀리 위치한다.
실시예 7 - 그렘린 -1에 대한 항- 그렘린 -1 항체 Ab7326의 결합 친화도의 측정
방법
인간 그렘린 1에 대한 항-그렘린 mIgG의 친화도는 Biacore T200 시스템(GE Healthcare Bio-Sciences AB)에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술을 사용하여 생물분자 상호작용 분석에 의해 결정되었다. 항-그렘린 mIgG는 고정된 항-마우스 Fc 표면에 의해 포획되었고, 그렘린 1은 포획된 mIgG를 통해 적정되었다. 포획 리간드(염소 항-마우스 IgG, Fc 단편 특이적, 115-006-071의 아피퓨어(affinipure) F(ab')2 단편, Jackson ImmunoResearch Inc.)를 600s 활성화 및 불활성화 주입을 사용하여 ~1600 응답 단위(RU)의 수준으로 아민 커플링 화학을 통해 CM4 센서 칩의 유동 셀 2 상에 10 mM NaAc, pH5.0 내에서 50 ㎍/ml로 고정하였다. 이동 완충제로서 HBS-EP+ 완충제(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20)를 10 ㎕/분의 유속으로 사용하였다. 참조 표면은 포획 리간드를 생략한 것을 제외하고 유동 셀 2에서와 같이 표면을 활성화 및 불활성화함으로써 유동 셀 1 상에 준비되었다.
상기 분석 완충제는 HBS-EP+ 및 300 mM + 1% CMD40의 최종 NaCl 농도를 얻기 위한 추가의 150 mM NaCl이었다. 항-그렘린 mIgG(이동 완충제에서 5 ㎍/ml)의 60s 주입을 고정된 항-마우스 IgG, Fc 표면 상에 약 100 RU의 포획 수준을 제공하기 위해 유동 셀 1 및 2에 통과시켰다. 재조합 인간 그렘린 1을 5 nM(2배 희석액을 사용)로부터 이동 완충제로 적정하고, 3분 동안 30 ㎕/분의 유속으로 유동 셀 1 및 2 상에 주입한 후, 5분 동안의 해리 단계를 거쳤다. 완충제 단독 대조군도 포함되었다. 표면은 50 mM HCl의 60s 주입, 5 mM NaOH의 30s 주입 및 50 mM HCl의 30s 주입에 의해 10 ㎕/분의 유속으로 재생되었다.
동역학 데이터는 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 결정되었다.
친화도 측정은 25℃에서 이루어졌다.
결과
5회의 측정에 대한 평균 KD 값으로 결정한 결합 친화도는 100 pM 미만인 것으로 밝혀졌다.
실시예 8 - 마우스에서의 만성 저산소 상태/SU5416 유도 폐동맥 고혈압에 대한 항-그렘린-1 항체의 생체 내 효과 평가
개요
TGFβ 수퍼패밀리의 불균형은 폐동맥 고혈압(PAH)을 포함한 많은 폐 병리학에 강력하게 연관되어 있다(Budd & Holmes Pharm Ther 2012). 그렘린-1은 PAH의 발생 및 진행에 관련된다(Thomas et al. AJP 2009; Ciuclan et al. AJP 2013). 최근 연구에 따르면, 항-그렘린-1 항체는 PAH의 전임상 저산소 상태/SU5416 모델에서 폐동맥 고혈압의 발생을 억제할 수 있음이 입증되었다(Ciuclan et al. AJP 2013). 여기에서, 본 발명자들은 PAH의 전임상 저산소 상태/SU5416 마우스 모델에서 혈류역학 및 혈관 재형성에 대한 항-그렘린 1 항체의 효과를 평가하였다.
저산소 상태/SU5416은 우심실 수축기 압력(RVSP) 및 우심실 비대증에서 유의 한 증가를 유도하였다(도 12 및 15). 항-그렘린-1의 투여로 인해 IgG1 및 PBS 대조군에 비해 RVSP가 유의하게 감소되었다(P<0.005). 정상 산소로 유지되는 동물에서 RVSP에 대한 항-그렘린-1의 유의한 효과는 관찰되지 않았다(도 12). 전신 압력(평균 동맥 혈압 또는 MABP; 도 13), 또는 우심실 비대증(도 14)에서는 어떠한 효과도 관찰되지 않았다. 총괄적으로, 본 연구는 PAH의 만성 저산소 상태/SU5416 모델에서 폐 혈관 재형성의 발생 및 RVSP의 증가에서의 그렘린-1의 역할 및 그의 치료에서 항-그렘린-1 항체의 용도를 지지한다.
배경
폐 고혈압(PH)은 폐동맥에서 측정된 압력이 상승하는 혈류역학 상태이다. 임상적으로 이것은 평균 휴식시 폐동맥압(mPAP) > 25 mmHg, 폐 혈관 저항(PVR) ≥ 3 우드(Wood) 단위 및 폐 쐐기(wedge) 압력 ≤ 15 mmHg로 정의된다(Badesch et al. 2009). PH의 병리학적 특징은 다각적이며, 폐동맥압, 중소 동맥의 혈관 재형성, 우심실 비대증 및 궁극적으로 우심실 부전을 포함한다(Faber & Loscalzo 2004). PH는 WHO에 의해 그룹 I을 포함한 5가지의 주요 범주로 분류된다. 그룹 I은 특발성 PAH 및 유전성 PAH뿐만 아니라 전신 경화증과 같은 다른 합병증을 야기하는 관련 PAH를 포함하는 폐동맥 고혈압을 나타낸다(Simonneau et al. 2009). 다수의 소인적(predisposing) 돌연변이는 유전되는 특발성 PAH 환자에서 PAH의 발생과 관련이 있고, 가장 현저한 돌연변이는 골 형태 형성 단백질 수용체인 BMPR2에 대한 돌연변이이다(Budd & Holmes Pharm Ther 2012). 또한, BMP 활성화된 하류 신호전달 성분 Smad에서의 돌연변이는 PAH가 발생중인 환자에서도 보고되었다(Budd & Holmes Pharm Ther 2012).
보다 최근에, PAH 환자에서 BMP 억제제인 그렘린(그렘린-1 및 2)의 수준이 증가한 것으로 여러 연구에서 밝혀졌다(Cahill et al. Circ 2012). PAH의 발생에 있어서 그렘린-1의 기능적 역할과 일치하게, 그렘린-1의 반수체 결핍(haplodeficiency)은 저산소 상태 마우스 폐에서 BMP 신호전달을 증가시키고, 혈관 재형성을 감소시킴으로써 폐 혈관 저항의 감소를 유발하였다(Cahill et al. Circ 2012). 이러한 관찰은 마우스에서 항-그렘린-1 항체가 만성 저산소 상태/SU5416 유발 폐동맥 고혈압을 개선한다고 입증한 시우클란(Ciuclan)과 동료(AJP 2013)에 의해 추가로 뒷받침되었다. 최근 연구들은 비유전적 메커니즘이 전신 경화증 환자에서 BMPR2의 발현 감소에 기여할 수 있으며 PAH의 발생에 기여할 수 있다고 제안한다(Gilbane et al. AJRCCM). 총괄적으로, BMP 수퍼패밀리 축의 불균형은 폐 병상, 예컨대 PAH의 발생을 유발할 수 있다.
본 연구의 목적은 만성 저산소 상태/SU5416 마우스 모델에서 항-그렘린-1이 PAH의 발생에 미치는 생체 내 효과를 평가하는 것이었다.
재료 및 방법
시약
이마티닙: 사이언스 웨어하우스(Science Warehouse) 1625-1000.
SU5416: 알&디 시스템즈 3037.
αSMA 항체: 다코(Dako) M085129-2.
VWF 항체: 다코 A008202-2.
비오티닐화 염소 항-토끼 IgG 항체: 벡터 랩스(Vector Labs) BA-1000.
비오티닐화 말 항-마우스 IgG 항체, 래트 흡착: 벡터 랩스 BA-2001.
카르복시메틸 셀룰로스: 시그마(Sigma) C5678 419273.
트윈(TWEEN) 80: 시그마 P1754.
벤질 알콜: 시그마 305197; 402834.
염화나트륨: 시그마 S7653; VWR 10241.
벡타스테인(VECTASTAIN) ABC-AP 키트: 벡터 랩스 AK-5000.
벡타스테인 엘리트 ABC 키트: 벡터 랩스 PK-6100.
일반 말 혈청: 벡터 랩스, 카탈로그 참조 S-2000.
폴리소르베이트: 시그마 59924.
실험 프로토콜
동물
C57Bl/6 마우스는 특정 병원체가 없는 시설에 수용되어 음식과 물을 자유롭게 섭취하도록 하고, 12시간의 명암 주기에 노출시켰다. 이 동물 연구는 영국 법률(UK Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986)에 따라 허가되었다.
폐동맥 고혈압의 저산소 상태/SU5416 마우스 모델
8-10주령의 C57Bl/6 암컷 마우스를 군에 할당하였다(표 6). 모든 군의 체중을 측정한 후, 문헌 [Ciuclan et al. AJRCCM 2013]에 기재된 바와 같이 100 ㎕의 비히클(탈이온수 내의 0.5% 카르복시메틸 셀룰로스(CMC), 0.9% 염화나트륨(NaCl), 0.4% 폴리소르베이트 80, 0.9% 벤질 알코올) 내의 20 mg/kg SU5416을 피하(s.c.) 투여하였다. 적절하게, PBS, 30 mg/kg IgG1 또는 30 mg/kg 항-그렘린-1을 함유하는 제2의 s.c. 주사 주입을 표 6에서 요약된 바와 같이 투여하였다. 저산소 상태 + 이마티닙 군의 마우스에게 이마티닙을 주입한 사료를 제공하여 100 mg/kg/일을 전달하였다. 이어서, 저산소 상태 마우스 군을 평압 저산소 상태(10% O2) 챔버에 넣고, 정상 산소 군의 마우스는 상기 챔버와 동일한 방의 정상 산소(21% O2) 조건에 수용하였다.
표 6: 처리군
C57Bl/6 마우스를 나타낸 바와 같이 처리군에 할당하였다.
Figure pct00014
제7일 및 제14일에 모든 마우스의 체중을 측정하고, 추가로 20 mg/kg SU5416을 s.c. 투여하였다. 적절하게, 마우스에게 PBS, 30 mg/kg IgG1 또는 30 mg/kg 항-그렘린-1을 추가의 s.c. 주사에 의해 투여하였다(표 6에 요약된 바와 같이). 이들 연구에 사용된 항-그렘린-1 항체는 실시예 5에서 설명된 바와 같은 Ab7326 마우스 전장 IgG1 포맷, 변이체 1이었다. 제21에, 우심실 수축기 혈압(RVSP) 및 평균 동맥 혈압(MABP)을 측정하고, 조직을 수거하였다.
우심실 수축기 혈압 및 조직 수거
RVSP 및 MABP의 혈류역학 측정은 표 6에 요약된 바와 같이 3주의 저산소 노출 및 관련 약물 치료 후에 동물로부터 수득하였다. 동물을 1.5% 이소플루오란으로 마취하고, 37℃에서 자동 온도 조절된 가열 블랭킷 상에 반듯이 눕혔다. 먼저, 우측 경정맥을 격리하고, RVSP를 결정하기 위해 압력 카테터(직경 1.4F의 밀러(Millar) 마우스 SPR-671NR 압력 카테터, Millar Instruments, 영국 소재)를 우심실에 삽입하고 진행시켰다. 이어서, MABP는 좌측 총경동맥을 격리하고 압력 카테터를 삽입하여 측정하였다. RVSP와 MABP 둘 모두 사전 보정된 파워랩(PowerLab) 시스템(ADInstruments, 호주 소재)의로 기록하였다.
동물은 이소플루오란 마취제 과다투여에 의해 안락사시키고, 전혈을 수집하였다. 전혈을 원심분리하고(220 x g, 2분), 혈청을 제거하고, -80℃에서 보관하였다. 심장을 제거하고, 우측 및 좌측 심실 중량을 기록하였다. 우심실을 통해 2.5 ml의 염수로 폐를 관류하였다. 파라핀 포매 및 절편화하기 전에, 10% 포르말린으로 팽창시켜 좌측 폐를 고정하였다. 우측 폐를 액체 질소에서 급속 냉동시키고, -80℃에서 보관하였다.
조직학
슬라이드를 왁스 제거 처리하고, 자일렌 및 에탄올의 농도 구배를 사용하여 재수화하였다. 슬라이드를 항원을 회수하기 위해 메탄올 내의 0.3% H2O2에 30분 동안 담그고, PBS로 3회 세척한 다음, PBS 중 1:30 일반 말 혈청 내에서 1시간 동안 차단하였다. 1:100의 농도로 항-αSMA 1차 항체를 각각의 슬라이드에 첨가하고, 밤새 4℃에서 인큐베이팅한 다음, PBS로 5분 동안 3회 헹구었다. 비오티닐화된 말 항-마우스 IgG 항체, 래트 흡착 2차 항체를 1:200으로 희석하고, 각각의 슬라이드 상에 피펫팅하고, 45분 동안 인큐베이팅한 후, PBS로 5분 동안 3회 세척하였다. 제조자의 지시에 따라, 아비딘 비오틴 복합 알칼리성 포스파타제(ABC-AP)를 30분 전에 미리 준비하고, 각각의 슬라이드 상에 30분 동안 둔 후, 5분 동안 3회 세척하였다. AP 기질은 키트 설명서에 따라 준비하고, 각각의 슬라이드 상에 피펫팅하고, 전개되도록한 후; 5분 동안 3회 세척하였다. 1:100 농도의 항-vWF 1차 항체를 각각의 슬라이드에 첨가하고, 밤새 4℃에서 인큐베이팅한 후, PBS로 5분 동안 3회 헹구었다. 비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG 2차 항체를 1:200으로 희석하고, 각각의 슬라이드 상에 45분 동안 방치한 후; PBS로 5분간 3회 세척하였다. 키트 설명서에 따라, ABC는 30분 전에 미리 준비하여 30분 동안 각각의 슬라이드 상에 올린 후, 5분 동안 3회 세척하였다. DAB 기질은 키트 설명서에 따라 준비하고, 각각의 슬라이드에 피펫팅하고, ~5-10분 발색하도록 허용한 후; 5분 동안 3회 세척하였다. 슬라이드는 해마톡실린으로 ~40초 동안 역염색하고, 탈수하고, 페어텍스(pertex)를 사용하여 커버슬립을 올려놓았다. 모든 슬라이드는 하마마츠 나노주머(Hamamatsu NanoZoomer) 2.0-HT 슬라이드 스캐너(Hamamatsu, 영국 웰륀 가든 시티 소재)로 디지털 방식으로 스캔하였다.
데이터 및 통계 분석
각각의 저산소 상태 군으로부터 무작위로 추출한 40개 초과의 혈관을 근육 형성의 정도에 대해 평가하였다. 혈관은 적어도 4명의 독립적인 관찰자에 의해 채점되었다: 0 = 비근육 형성; 1 = 부분적인 근육 형성; 2 = 완전한 근육 형성. 각각의 혈관에 대한 모달 값을 결정하였다. 완전한 근육 형성, 부분적인 근육 형성 또는 비근육 형성된 혈관의 비율을 결정하고, 평균 ± SEM을 그래프로 나타내었다. 유의성을 결정하기 위해 일원 분산 분석을 수행하였다: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.005; ****P<0.001.
결과
만성 평압 저산소 상태(10% O2)에 노출된 후 SU5416(20 mg/kg)을 투여하면, PBS 단독 또는 IgG1 대조군 둘 모두에서 21일 동안 정상 산소/SU5416 단독 투여에 비해 RVSP가 유의하게(P<0.01) 증가하였다. IgG1과 PBS 치료 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 저산소 상태에서 유지된 SU5416 투여 마우스에서 RVSP 상승에 대한 약물 처리의 영향: 이마티닙은 대조군에 비해 RVSP의 유의한(P<0.001) 감소를 유발하였다. 항-그렘린 1은 IgG1 및 PBS 대조군에 비해 RVSP의 유의한(P<0.005) 감소를 유발하였다. 정상 산소로 유지되는 동물에서 RVSP에 대한 항-그렘린 1의 유의한 효과는 관찰되지 않았다(도 12).
저산소 상태 및 정상 산소 하에서 항-그렘린 1(n=4) 또는 IgG1 비히클 대조군(n=4)의 MABP에 대한 영향을 평가하였다(도 13). MABP에 대한 처리의 유의한 효과는 관찰되지 않았다.
우심실 비대증(우심실/좌심실 + 중격 중량)을 측정하였다(도 14). 만성 평압 저산소 상태(10% O2)에 노출된 후 SU5416(20 mg/kg)을 투여한 결과, PBS 단독 또는 IgG1 대조군 둘 모두에서 21일 후에 정상 산소/SU5416 단독 요법과 비교하여 우심실 비대증(RV/LV+S)이 유의하게(P<0.01) 증가하였다(도 14). 저산소 상태로 유지된 SU5416 투여 마우스에서 RVSP 상승에 대한 약물 처리(이마티닙 또는 항-그렘린 1)의 유의한 효과는 관찰되지 않았다.
혈관 재형성의 정도는 파라핀 포매 폐 절편을 염색하여 평가하였다. 혈관을 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대해 염색하여, 근육 형성의 정도를 평가하기 위해 내피 세포 및 평활근 액틴(αSMA)을 확인하였다. 이미지는 하마마츠 나노주머 2.0-HT 슬라이드 스캐너로 디지털화되었고, 정상 산소 IgG1로부터 적어도 40개의 혈관을 무작위 추출하고, 각각의 저산소 상태 군을 근육 형성의 정도에 대해 평가하였다. 혈관은 적어도 4명의 독립적인 관찰자에 의해 채점되었다: 0= 비근육 형성; 1= 부분적인 근육 형성; 2= 완전한 근육 형성. 각각의 혈관에 대한 모달 값을 결정하고, 비근육 형성, 부분적인 근육 형성 및 완전한 근육 형성된 혈관의 비율을 그래프로 나타내었다(도 15). 만성 평압 저산소 상태(10% O2)에 노출된 후 SU5416(20 mg/kg)의 투여는 완전한 근육 형성(P<0.001) 및 부분적인 근육 형성(P<0.01)에서 유의한 증가를 유발하였고, 비근육 형성된(P<0.001) 혈관에서는 복합적인 유의한 감소를 유발하였다. 저산소 상태로 유지된 SU5416 투여 마우스에서 RVSP 상승에 대한 약물 처리의 영향: 이마티닙은 완전히 근육 형성된(P<0.01) 혈관의 유의한(P<0.001) 감소를 유발하였다. 또한, 항-그렘린 1은 저산소 상태 SU5416 IgG1 대조군과 비교하여 유의한 결과를 보였다(각각 P<0.001 및 P<0.05)(도 15). 저산소 상태 SU5416 IgG1 대조군과 비교하여 부분적으로 근육 형성된 혈관의 비율에 대한 약물 처리(이마티닙 또는 항-그렘린 1)의 유의한 효과는 관찰되지 않았다. 약물 처리(이마티닙 또는 항-그렘린 1)는 저산소 상태 SU5416 IgG1 대조군과 비교하여 비근육 형성된 혈관의 비율의 증가를 유발하였지만, 이것은 유의한 수준에 도달하지 못하였다.
토론
여기에서 본 발명자들은 만성 저산소 상태/SU5416 모델에서 PAH의 발생에 대한 항-그렘린-1 항체의 효과를 평가하였다. 항-그렘린-1 항체는 PAH의 저산소 상태/SU5416 마우스 모델에서 전신(MABP) 압력에 영향을 미치지 않으면서(도 13), RVSP(도 12) 및 혈관 재형성(도 15)을 유의하게 억제하였다. 본 발명자들은 정상 산소/SU5416 처리 마우스에서 RVSP에 대한 항-그렘린-1 항체의 유의한 효과는 관찰하지 못하였다. 항-그렘린-1 항체의 효과는 항-그렘린-1 항체를 사용한 길항 작용이 PAH의 만성 저산소 상태/SU5416-마우스 모델에서 상승된 RVSP 및 혈관 재형성을 개선함을 입증한 시우클란 및 동료(AJP 2013)의 관찰 결과와 일치한다(도 12 및 15). 시우클란 및 동료의 연구와 달리, 본 발명자들은 본 연구에서 항-그렘린-1 항체에 의한 우심실 비대증에 대한 어떠한 유의한 효과도 관찰하지 못하였다(도 14). 그러나, 본 연구에서 본 발명자들은 저산소 상태/SU5416 마우스에서 우심실 비대증 발생에 대한 제어 약물 이마티닙에 의한 어떠한 유의한 효과도 관찰하지 못하였다. 전체적으로, 본 연구는 PAH의 만성 저산소 상태/SU5416 모델에서 폐 혈관 재형성의 발생 및 RVSP의 증가에서의 그렘린-1의 역할 및 그의 치료에서 항-그렘린-1 항체의 용도를 지지한다.
참고문헌
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
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Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
SEQUENCE LISTING <110> UCB Biopharma SPRL <120> Gremlin-1 crystal structure and inhibitory antibody <130> PF0045-WO-PCT <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 1 Met Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Thr Leu Leu Pro Ala Ala Glu Gly Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala 20 25 30 Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Gln Pro Gly Ser Arg Asn Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg 50 55 60 Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala 65 70 75 80 Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr 85 90 95 Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr 100 105 110 Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro 115 120 125 Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys 130 135 140 Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu 145 150 155 160 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Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 31 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 31 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 32 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys 225 <210> 33 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 33 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 34 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys 450 <210> 35 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant sequence <400> 35 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (54)

  1. Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 및 Gln175로부터 선택된 적어도 하나의 잔기를 포함하는 그렘린-1(Gremlin-1) 상의 에피토프에 결합하는 항체로서, 잔기 넘버링은 서열 번호 1에 따른 것인 항체.
  2. 제1항에 있어서, Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 및 Gln175를 모두 포함하는 에피토프에 결합하는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 및 Gln175가 동일한 그렘린-1 단량체 상에 위치하고, Ile131은 제2 그렘린-1 단량체 상에 위치하는 것인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, x선 결정학에 의해 측정시 항체 파라토프가 그렘린-1 잔기의 4 Å 이내에 위치하면 항체가 그렘린-1 잔기에 결합하는 것인 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Hek-Id1 리포터 유전자 분석에서 신호를 복원하는 항체.
  6. 서열 번호 10 또는 12의 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 포함된 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 서열 및/또는 서열 번호 11 또는 13의 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 포함된 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 서열을 포함하는 항-그렘린-1 항체.
  7. 서열 번호 3, 4, 5 및 6으로부터 선택된 적어도 하나의 HCDR 서열 및/또는 서열 번호 7, 8 및 9로부터 선택된 적어도 하나의 LCDR 서열을 포함하는 항-그렘린-1 항체.
  8. 제7항에 있어서, 서열 번호 6의 HCDR3 서열을 포함하는 항체.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, HCDR1/HCDR2/HCDR3 서열 조합이 서열 번호 4/5/6으로부터 또는 서열 번호 3/5/6으로부터 선택되고/되거나, LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열 조합이 서열 번호 7/8/9로부터 선택되는 것인 항체.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 4/5/6/7/8/9 또는 서열 번호 3/5/6/7/8/9의 HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열 조합을 포함하는 항체.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 10 또는 12의 중쇄 가변 영역(HCVR) 서열 및/또는 서열 번호 11 또는 13의 경쇄 가변 영역(LCVR) 서열, 또는 이들에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 항체.
  12. 제11항에 있어서, 서열 번호 10/11 또는 12/13의 HCVR 및 LCVR 서열쌍 또는 이들에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 항체.
  13. 제12항에 있어서, HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열이 서열 번호 4/5/6/7/8/9 또는 서열 번호 3/5/6/7/8/9로 이루어지고, HCVR 및 LCVR의 나머지는 각각 서열 번호 10, 11, 12 및/또는 13에 대해 적어도 95%의 동일성을 포함하는 것인 항체.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 14, 16, 18, 22, 28, 30, 32 또는 34의 중쇄 및/또는 서열 번호 15, 17, 19, 23, 29, 31, 33 또는 35의 경쇄, 또는 이들에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 항체.
  15. 제14항에 있어서, 서열 번호 14/15, 16/17, 18/19, 22/23, 28/29 또는 30/31, 32/33, 34/35의 중쇄 및 경쇄쌍, 또는 이들에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 항체.
  16. 제15항에 있어서, HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 서열이 서열 번호 4/5/6/7/8/9 또는 서열 번호 3/5/6/7/8/9로 이루어지고, 중쇄 및 경쇄의 나머지는 각각 서열 번호 14, 15, 16 및/또는 17에 대해 적어도 95%의 동일성을 포함하는 것인 항체.
  17. 그렘린-1에 결합하기 위해 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 항체와 경쟁하는 항체.
  18. 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 항체와 동일한 그렘린-1 상의 에피토프에 결합하는 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라, 인간 또는 인간화 항체인 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체 또는 scFv인 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  22. 제21항의 폴리뉴클레오티드를 보유하는 발현 벡터.
  23. 제22항에 정의된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 항체의 생산 방법으로서, 제49항의 숙주 세포를 항체 생산을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계, 및 생산된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법.
  25. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 보조제 및/또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  26. 요법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 항체 또는 제25항에 정의된 약제학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 신장 섬유증, 예컨대 당뇨성 신병증, 특발성 폐 섬유증, 폐동맥 고혈압, 혈관신생 및/또는 암이 치료/예방되는 것인 항체 또는 약제학적 조성물.
  28. 치료 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제25항에 따른 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 신장 섬유증, 예컨대 당뇨성 신병증, 특발성 폐 섬유증, 폐동맥 고혈압, 혈관신생 및/또는 암을 치료하거나 예방하는 방법.
  29. 그렘린-1의 결정.
  30. 제29항에 있어서, 그렘린-1이 인간 그렘린-1인 결정.
  31. 제30항에 있어서, 단위 격자 치수가 a=84.55 Å, b=107.22 Å 및 c=77.09 Å인 C2 공간 군으로 이루어진 결정.
  32. 항체와 복합체를 형성한 인간 그렘린-1의 결정.
  33. 제32항에 있어서, 항체가 서열 번호 18의 중쇄 및 서열 번호 19의 경쇄를 포함하는 것인 결정.
  34. 표 1에 제시된 좌표에 의해 정의되는 인간 그렘린-1의 구조.
  35. 기계 판독 가능한 데이터 저장 매체로서, 표 1에 제시된 그렘린-1의 구조 좌표 또는 구조의 상동체를 정의하는 좌표에 의해 정의되는 기계 판독 가능한 데이터로 코딩된 데이터 저장재를 포함하는 기계 판독 가능한 데이터 저장 매체.
  36. 구조 모델로서의 제34항의 구조의 용도.
  37. 고효율 화학적 스크리닝을 위한 제36항에 따른 구조 모델의 용도.
  38. 그렘린-1과 상호작용하는 하나 이상의 작용제를 확인하기 위한, 제36항 또는 제37항에 따른 구조 모델의 용도.
  39. 제38항에 있어서, 작용제가 그렘린-1의 억제제인 용도.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 작용제가 신장 섬유증, 예컨대 당뇨성 신병증, 특발성 폐 섬유증, 폐동맥 고혈압, 혈관신생 및/또는 암을 치료하기 위한 잠재적인 작용제인 용도.
  41. 제38항, 제39항 또는 제40항의 용도에 의해 확인된 작용제.
  42. (a) 표 1의 구조 좌표로부터 리간드 결합 부위를 확인하는 단계;
    (b) 리간드 결합 부위의 적어도 일부와 상호작용하는 후보 작용제를 확인하는 단계; 및
    (c) 상기 작용제를 수득하거나 합성하는 단계
    를 포함하는, 그렘린-1 활성의 조절제를 스크리닝하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)가 인 실리코(in silico)로 수행되는 것인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 작용제가 그렘린-1 활성의 억제제인 방법.
  45. 제42항, 제43항 또는 제44항에 있어서, 그렘린-1의 다음 잔기:
    - Trp93;
    - Phe117;
    - Tyr119;
    - Phe125;
    - Tyr126 및/또는
    - Phe138
    중 적어도 하나와 상호작용하는 후보 작용제를 확인하는 단계를 포함하고, 잔기 넘버링은 서열 번호 1에 기초하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 작용제가 그렘린-1의 잔기 Trp93, Phe117, Tyr119, Phe125, Tyr126 및 Phe138 전부와 상호작용하는 것인 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 후보 작용제가 x-선 결정학에 의해 측정시에 잔기의 6 Å 이내에 위치하면 상기 작용제는 그렘린-1과 상호작용하는 것인 방법.
  48. 제42항, 제43항 또는 제44항에 있어서, 리간드 결합 부위가 알로스테릭 부위 인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 그렘린-1의 잔기 Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 및 Gln175 중 적어도 하나와 상호작용하는 후보 작용제를 확인하는 단계를 포함하고, 잔기 넘버링은 서열 번호 1에 기초하는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 작용제가 그렘린-1의 잔기 Ile131, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 및 Gln175 전부와 상호작용하는 것인 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, Lys147, Lys148, Phe149, Thr150, Thr151, Arg169, Lys174 및 Gln175가 동일한 그렘린-1 단량체 상에 위치하고, Ile131은 제2 그렘린-1 단량체 상에 위치하는 것인 방법.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 작용제가 x-선 결정학에 의해 측정시에 잔기의 4 Å 이내에 위치하면 상기 작용제는 그렘린-1과 상호작용하는 것인 방법.
  53. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 소분자 또는 항체인 방법.
  54. 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 그렘린-1 조절제.
KR1020197020545A 2016-12-19 2017-12-19 그렘린-1 결정 구조 및 억제 항체 KR102557216B1 (ko)

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