CN1214695A - ErdB3抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种结合ErbB3蛋白并具有以下特性之一项或多项的抗体:在表达ErbB2和ErbB3的细胞内减少heregulin诱导的ErbB2－ErbB3蛋白复合物的形成的能力;提高heregulin对ErbB3蛋白结合亲和性的能力;在表达ErbB2和ErbB3的细胞内减少heregulin诱导的ErbB2活性的特征。

Description

ErbB3抗体
                         发明背景发明领域
本发明主要涉及结合ErbB3受体的抗体。具体地说，本发明涉及这样的抗ErbB3抗体，它显著提高heregulin(HRG)与ErbB3蛋白的结合亲和性，并且/或者降低同时表达ErbB2和ErbB3两种受体的细胞内由HRG诱导的ErbB2-ErbB3蛋白复合物的形成，并且/或者降低这类细胞内heregulin诱导的ErbB2的活性。现有技术
调节细胞生长和分化的信号转导有一部分是由各种细胞蛋白的磷酸化作用来调控的。蛋白酪氨酸激酶是催化该过程的酶。受体蛋白酪氨酸激酶被认为通过对胞内底物的配体刺激性酪氨酸激酶磷酸化作用来指导细胞的生长。Ⅰ类亚族的生长因子受体蛋白酪氨酸激酶包括由erbB1基因编码的170KDa的上皮生长因子受体。erbB1基因被认为是人类恶性肿瘤的病因。具体地说，该基因的过量表达已被发现存在于侵袭性较高的乳房癌、膀胱癌、肺癌和胃癌中。
Ⅰ类亚族的另一成员p185neu最初被认定是来自化疗大鼠成神经细胞瘤的基因的转化产物，neu基因(又称erbB2和HER2)编码185kDa的受体蛋白酪氨酸激酶。人HER2基因的扩增和/或过量表达与乳房癌和卵巢癌的预后差有关(Slamon等，科学(Sience),235；177-182(1987)；Slamon等，科学(Sience),244；707-712(1989))。HER2的过量表达还被发现与其它癌症有关，其中包括胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌和膀胱癌。
另一相关基因，称为erbB3或HER3也已经被发现。参见美国专利5,183,884和5,480,968；Plowman等，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:4905-4909(1990)；Kraus等，美国科学院院报，90:2900-2904(1993)。Kraus等(1989)发现，在某些人乳房肿瘤细胞系中，erbB3mRNA水平显著升高，这表明，erbB3和erbB1和erbB2一样在某些人恶性肿瘤中起一定的作用。以上研究证明了某些人乳房肿瘤细胞系表现出稳态ErbB3酪氨酸磷酸化作用的显著加强，这进一步表明该受体可能在人恶性肿瘤中起一定的作用。由此，Kraus等在美国专利5,183,884和5,480,968中叙述了用结合ErbB3的抗体来进行的诊断性生物分析。
人们已经就erbB3在癌症中的作用进行了广泛的研究。它被发现在乳房癌[(Lemoine等,英国癌症杂志(Br.J.Cancer)66:1116-1121(1992))]，胃肠道癌症[(Poller等，病理学杂志(J.Pathol.)168:275-280(1992),Rajkumer等，病理学杂志，170:271-278(1993)和Sanidas等，世界癌症杂志(Int.J.Cancer)54:935-940(1993))]和胰腺癌[(Lemoine等，病理学杂志，168:269-273(1992)和Friess等，临床癌症研究(Clinical Cancer Research)1:1413-1420(1995))]中过量表达。
ErbB3在ErbB受体族中是独特的，其独特之处在于它甚少或者没有固有酪氨酸激酶活性[(Guy等，美国科学院院报，91:8132-8136(1994)]和Kim等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269:24747-55(1994))。当ErbB3与ErbB2共表达时，形成一活性信号复合物，ErbB2的抗体能够破坏该复合物(Sliwkowski等，生物化学杂志269(20):14661-14665(1994))。此外，当ErbB3与ErbB2共表达时，其与heregulin(HRG)的亲和性也被增加到较高的亲和性状态。有关ErbB2-ErbB3蛋白复合物可参见Levi等，神经科学杂志(Journal of Neuroscience)15:1329-1340(1995)；Morrissey等，美国科学院院报，92:1431-1435(1995)和Lewis等，癌症研究(CancerRes.)56:1457-1465(1996)。
Rajkumar等，英国癌症杂志70(3)459-465(1994)发明了抗ErbB3的单克隆抗体，它对于表达该受体的细胞系的非贴壁依赖性生长具有活化作用。
Ⅰ亚族生长因子受体酪氨酸激酶还进一步包括HER4/p180erbB4受体。参见欧洲专利申请599,274；Plowman等，美国科学院院报90:1746-1750(1993)；和Plowman等，自然(Nature)366:473-475(1993)。Plowman等发现，HER4表达的增加与包括乳腺腺癌在内的某些上皮性起源的癌症密切相关。由此，欧洲专利申请599,274叙述了确定人肿瘤状态(特别是乳腺癌)的诊断方法，即评价HER4的表达。
人们因寻找癌基因HER2的活化剂而发现了一族heregulin多肽。这类蛋白质似乎来自位于人8号染色体短臂上一单基因的不同拼接方式，Lee等，基因学(Genomics)16:790-791(1993)；和Orr-Urtreger等，美国科学院院报90:1867-1871(1993)。
Holmes等分离并克隆了一族HER2受体的多肽活化剂，他们称之为heregulin-α(HRG-α)、heregulin-β1(HRG-β1)、heregulin-β2(HRG-β2)、heregulin-β2样(HRG-β2样)和heregulin-β3(HRG-β3)。参见Holmes等，科学(Science)256:1205-1210(1992)；和WO92/20798。45kDa多肽HRG-α是由MDA-MG-231人乳房癌细胞系的条件培养基纯化得到的。以上研究证明了纯化heregulin多肽在MCF-7乳癌肿瘤细胞内激活HER2受体的酪氨酸磷酸化作用的能力。而且，还证明了heregulin多肽对SK-BR-3细胞(高水平地表达HER2受体)的促有丝分裂活性。和EGF族的其它生长因子一样，可溶性HRG多肽似乎来自膜结合性前体(称前HRG)，后者经蛋白水解后释放出45kDa的可溶性形式。这类前HRG缺少N末端的信号肽。
虽然heregulin的前213个氨基酸残基都是一致的，但是它们仍根据C末端有所差别的两种不同的EGF样功能区(domain)分成两大类，α和β。但是，这些EGF样功能区中含有的6个半胱氨酸残基间的间距(spacing)是一致的。根据氨基酸序列比较，Holmes等发现，在EGF样功能区内的第一至第六半脱氨酸之间，GRG与结合肝素的EGF样生长因子(HB-EGF)的一致性为45％，与双调蛋白(AR)的一致性为35％，与TGF-α的一致性为32％，与EGF的一致性为27％。
Peles等，细胞(Cell)69:205-216(1992)；和Wen等，细胞69:559-572(1992)首次描述了44kDa的Neu分化因子(NDF)，它是人HRG的鼠对应物。和HRG多肽一样，NDF在EGF样功能区之前有一个免疫球蛋白(Ig)同源性功能区，而且缺少N末端的信号肽。此后，Wen等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)14(3):1909-1919(1994)为了扩展NDF族进行了“彻底的克隆”。这项工作发现了6种不同的成纤维性前NDF。采用Holmes等的命名法，NDF根据EGF样功能区的序列被分为α或β多肽。同种型1至4的区别在于可变的并列膜序列段(juxtamembranestretch)(在EGF样功能区和跨膜功能区之间)的碱基。同样，同种型a、b和c被描述成具有长度不等的胞质功能区。以上研究者认为，不同的NDF同种型是由于不同的拼接而产生的，它们行使着不同的组织特异性功能。
Falls等，细胞72:801-815(1993)描述了他们称之为乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)多肽的heregulin族中的另一成员。该鸡源ARIA多肽刺激肌肉乙酰胆碱受体的合成。也见WO94/08007。ARIA是一种β型heregulin，缺少象HRGα和HRGβ1-β3那样位于Ig样功能区和EGF样功能区之间的完整的“糖”间隔区(富含糖基化位点)。
Marchionni等，自然362:312-318(1993)鉴定出了几种他们称之为神经胶质细胞生长因子(GGF)的牛源蛋白质。这些GGF具有与前述heregulin蛋白质相同的Ig样功能区和EGF样功能区，但是具有一个氨基末端的Kringle功能区。GGF一般没有位于Ig样功能区和EGF样功能区之间的完整的“糖”间隔区。GGF中只有GGFII具有N末端的信号肽。
Bacus等，病理模型(Pathology Patterns)102(4)(增刊.1):S13-S24(1994)论述了乳房癌中ErbB2族受体和heregulin多肽的表达。
有关上述受体族，还可参见Alimandi等，癌基因(Oncogene),10:1813-1821(1995)；Beerli等，分子和细胞生物学15:6496-6505(1995)；Karunagaran等，欧洲生物学杂志(EMBO J)15:254-264(1996)；Wallash等，欧洲生物学杂志14:4267-4275(1995)；和Zhang等，生物化学杂志271:3884-3890(1996)。
                        发明概述
本发明提供了结合ErbB3蛋白并且具有下述一项或多项特征的抗体：能够在表达ErbB2和ErbB3的细胞内减少由heregulin诱导的ErbB2-ErbB3蛋白复合物的形成；能够提高heregulin对ErbB3蛋白的结合亲和性；在表达ErbB2和ErbB3的细胞内减少heregulin诱导的ErbB2活性。
本发明还涉及结合ErbB3蛋白并减少heregulin与之结合的抗体。
较好的是结合ErbB3受体胞外功能区内某表位的单克隆抗体。一般说来，目的抗体至少以约10nM的亲和性与ErbB3受体结合，至少约1nM则更好。在有的实施方案中，为了例如受体的亲和性纯化或诊断试验，抗体被固定(例如共价连接)在固相上。
上述抗体可以是组合物的形式，其中含有抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明还提供了：分离出的核酸分子，其编码上述抗体并可能另含有与之可操作性连锁的启动子；表达载体，包含与调控序列可操作性连锁的核酸分子，调控序列是可被用该载体转化的宿主细胞识别的；包含核酸的细胞系(例如杂交瘤细胞系)；和利用编码抗体的核酸分子产生抗体的方法，其中包括培养含有所述核酸的细胞和(可选性地)由细胞培养物，最好是细胞培养基回收抗体。
本发明还提供了治疗哺乳动物的方法，包括给哺乳动物使用治疗有效量的所述抗体，而所述哺乳动物患有需要用所述抗体治疗的疾病。
另一方面，本发明提供了一种体外或体内检测ErbB3的方法，包括令抗体与被怀疑含有ErbB3的细胞接触，检测是否发生结合。所以，本发明提供了一种检测以ErbB3过量表达为特征的肿瘤的方法，包括的步骤有令细胞与所述的抗体接触，检测抗体与细胞结合的程度。用于此类试验的抗体通常要加以标记。所述的试验可以是体外(例如ELISA试验)或体内试验。对于体内肿瘤诊断来说，一般将抗体与放射性同位素结合，然后给哺乳动物服用，然后通过体外对放射性扫描来观察哺乳动物中抗体与组织结合的程度。
                       附图说明
图1显示在各种抗ErbB3单克隆抗体存在下HRG与K562 ErbB3细胞的结合情况。将纯化的抗ErbB3抗体与K562 ErbB3细胞悬液以及125I-HRGβ1(177-244)一起培养。在冰上约18小时后计数结合的细胞。将计数结果以相对无抗体时结合情况(对照)的百分比作图表示。利用过量的非标记HRGβ1(177-244)(HRG)测定非特异性结合。抗ErbB2蛋白(2C4)和HSV(5B6)的抗体被用作阴性对照。
图2显示抗体浓度对HRG结合情况的影响。对3-8D6抗体进行剂量依赖性试验，结果发现HRG结合加强。将K562 ErbB3细胞与固定浓度的125I-HRG共培养，同时提高3-8D6抗体的浓度。试验数据显示为结合细胞数相对抗体浓度所做的图。
图3显示在有或无3-8D6抗体或其Fab片段存在下HRG与K562 ErbB3细胞的结合。在没有(对照)或有100nM的3-8D6或其Fab存在下进行了竞争性配体结合试验。将数据按结合量/总量(B/T)对总HRGβ1(177-244)作图。
                       优选实施方案的详细说明Ⅰ．定义
除非另作说明，“ErbB3”在本文中表示哺乳动物ErbB3蛋白，“erbB3”表示哺乳动物erbB3基因。优选的ErbB3蛋白是位于细胞膜上的人ErbB3蛋白。美国专利5,480,968和Plowman等在美国科学院院报87:4905-4909(1990)中对人erbB3基因进行了描述。
目的抗体不与其它蛋白，例如由erbB1、erbB2和/或erbB4基因编码的蛋白发生明显的交叉反应。在此类实施方案中，经荧光激活细胞分选分析(FACS)或放射性免疫沉淀(RIA)测定，抗体与所述非ErbB3蛋白的结合度(例如与内源性受体的细胞表面结合)低于10％。但是，有时，抗体可能与ErbB4受体交叉反应但是可能不与例如EGFR和/或ErbB2受体交叉反应。
“heregulin”(HGR)在本文中表示激活ErbB2-ErbB3蛋白复合物的多肽(即在与之结合后诱导ErbB2-ErbB3复合物内的酪氨酸残基的磷酸化作用)。该术语所涵盖的各种heregulin多肽都已在前文予以揭示。它还包括天然HRG多肽的生物活性片段和/或变体，例如其EGF样功能区片段(例如HRGβ1(177-244))。
“ErbB2-ErbB3蛋白复合物”是ErbB2受体与ErbB3受体的非共价结合寡聚体。当同时表达上述两种受体的细胞接触HRG时就会形成所述的复合物。如后文实施例所述，该复合物可以通过免疫沉淀来分离，并利用SDS-PAGE进行分析。
“在表达ErbB2和ErbB3的细胞内降低由heregulin诱导的ErbB2-ErbB3蛋白复合物的形成”表示从数据上看，与未处理的(对照)细胞相比，就统计学意义上说抗体能够明显减少接触了抗体和HRG的细胞内形成的ErbB2-ErbB3蛋白复合物的数量。表达ErbB2和ErbB3的细胞可以是天然细胞或细胞系(例如Caov3细胞)，或者可以是通过在宿主细胞内引入编码所述蛋白中每一种的核酸而重组产生的细胞。较好的是，经对复合物Western印迹杂交的反射比扫描光密度测定法(reflectance scanning densitometry)(参见后文实施例)测定，抗体将所述复合物的形成减少至少50％，更好的为至少70％。
“在表达ErbB2和ErbB3的细胞内降低由heregulin诱导的ErbB2活性”的抗体，与未处理的(对照)细胞相比，就统计学意义上说明显降低ErbB2在HRG结合ErbB2-ErbB3蛋白复合物(存在于表达两种受体的细胞的表面)内的ErbB3时产生的酪氨酸磷酸化活性。这可以根据ErbB2-ErbB3复合物与HRG和目的抗体接触后其中的磷酸酪氨酸(phospbotyrosine)水平来确定。表达ErbB2和ErbB3的细胞可以是天然细胞或细胞系(例如Caov3细胞)，或者可以是重组产生的。ErbB2活性可以如后文实施例所述，通过在Western印迹之后用抗磷酸酪氨酸的抗体进行检测来测定。或者，可以利用WO95/14930和Sadick等，分析生物化学(AnaliticalBiochemistry)235:207-214(1996)所述的激酶受体激活试验来定量测定ErbB2活性。较好的是，经对抗磷酸酪氨酸抗体检测复合物用Western印迹杂交的反射比扫描光密度测定法测定(见后文实施例)，抗体将heregulin诱导的ErbB2活性减低至少50％，至少70％则更好。
抗体可能“提高heregulin对ErbB3蛋白的亲和性”。这表示，从数据上看，在抗体存在下(例如100nM抗体)，与对照(无抗体)相比，结合ErbB3(例如存在于天然细胞或细胞系，或者用重组技术引入细胞的内源性ErbB3，见后文实施例)的HRG数量就统计学意义上说明显增加。例如，与对照相比，存在100nM抗体时，HRG结合到如本文所述转染以erbB3的K562细胞系的数量增加至少10％，至少50％更好，至少约100％则最好(参见图1)。
减少与ErbB3蛋白例如在细胞上存在的ErbB3结合的HRG的抗体即干扰ErbB3蛋白上的HRG结合位点，从而从统计学上看明显减少能够与分子上该位点结合的heregulin的数量。此类抗体有例如本文实施例中所述的3-2F9、3-3E9和3-6B9抗体。
“抗体”按其最广的涵义使用，具体包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性(multispecific)抗体(例如双特异性抗体)，以及凡是表现出所需的生物活性的抗体片段。所述抗体可以是例如IgM、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。但是，抗体不宜为IgM抗体。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。所述抗体片段包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；间抗体(diabodies)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单克隆抗体”在此表示由一群基本上同源的抗体(即，除了可能少量存在的天然突变之外，组成该群的各个抗体是完全相同的)获得的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，只针对单一抗原位点。而且，不同于一般包括针对不同决定族(表位)的不同抗体的常规抗体制剂(多克隆抗体)，单克隆抗体只针对抗原上的一个决定族。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点还在于，它们是由杂交瘤培养物产生的，不受其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表示抗体由是得自基本同源的抗体群这一特征，而不应理解成抗体的产生需要任何特定的方法。例如，本发明使用的单克隆抗体可以是利用Kohler等，自然256:495(1975)首次论述的杂交瘤法制备，也可以是利用重组DNA法(参见美国专利4,816,567)制备。“单克隆抗体”还可以是利用例如Clackson等，自然352:624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离得到的。
单克隆抗体在此特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)以及表现出所需的生物活性的此类抗体的片段，其重链和/或轻链的一部分与来自特定种或属于特定抗体类或亚类的抗体内的对应序列一致或同源，而链的其余部分与来自其它种或属于其它抗体类或亚类的抗体内的对应序列一致或同源(美国专利4,816,567；Morrison等，美国科学院院报81:6851-6855(1984))。
非人抗体(例如鼠抗体)的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(例如Fv、Fab、Fab’或抗体的其它抗原结合序列)，含有来自非人免疫球蛋白的基本序列。人源化抗体的绝大部分是人免疫球蛋白(受体的抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被具有所需的特异性、亲和性和能力的但来自例如小鼠、大鼠或兔之类非人种(供体抗体)CDR的残基所取代。有时，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被对应的非人残基取代。而且，人源化抗体可以包含既非在受体抗体内亦非外来CDR或构架序列内的残基。这种修饰作用是为了进一步完善和优化抗体的性能。一般说来，人源化抗体包含基本上完整的至少一个，通常两个可变功能区，功能区中的CDR区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的该区，而FR区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的该区。人源化抗体最好还包括免疫球蛋白通常为人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。有关进一步的具体内容可参见Jones等，自然321:522-525(1986)；Reichmann等，自然332:323-329(1988)；和Presta,(Curr.Op.Struct.Biol.)2:593-596(1992)。人源化抗体包括PrimatizedTM抗体，其中抗体的抗原结合区来自用目的抗原免疫短尾猿猴而产生的抗体。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含存在于单条多肽链内的抗体的VH和VL功能区。一般说来，Fv多肽进一步包含位于VH和VL功能区之间的多肽接头，它能使sFv形成适合抗原结合所需的结构。有关sFv，可参见Pluckthum的“单克隆抗体的的药物学”(Pharmacology of Monoclonal Antibodies)第113卷，Rosenburg和Moore编，Spring-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
“间抗体(diabodies)”指有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中包含在同一多肽链内与轻链可变功能区(VL)连接的重链可变功能区(VH)(VH-VL)。通过使用短至使同一链内两功能区无法配对的接头，功能区被迫与其它链的互补功能区配对，由此形成两个抗体结合位点。例如欧洲专利404,097；WO93/11161；和Hollinger等在美国科学院院报90:6444-6448(1993)中对间抗体有更为全面的论述。
“分离的”抗体是经鉴定的和分离和/或回收自其天然环境中某组份的抗体。其天然环境中的污染组份是指会干扰所述抗体的诊断或治疗性用途的物质，可能包括酶、激素和其它蛋白质类或非蛋白质类溶质。在优选实施方案中，抗体纯化至(1)经Lowry法测定，按其重量计纯度高于95％，最好高于99％，(2)其纯度通过使用转杯式测序仪足以获得至少15个N末端残基或内部氨基酸序列，或者(3)达到用Coomassie蓝或最好用银染色法，经还原或非还原条件下SDS-PAGE测定的均性。分离的抗体包括原位存在于重组细胞内的抗体，因为至少该抗体天然环境的组份之一将不存在。但是，通常，分离抗体还需经至少一步纯化步骤来制备。
“补救受体结合表位”在此指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区内的表位，它负责延长体内IgG分子血清半衰期。
“处理”指治疗性处理和预防或防止措施。那些需要处理的包括已经患有疾病或者需要防止疾病的。
就处理目的而言，“哺乳动物”指任何归类为哺乳动物的动物，包括人、家养和畜牧养的动物，以及观赏动物、比赛用动物或宠物，例如狗、马、猫、牛等。所述哺乳动物最好是人。
“病症”指能因用抗ErbB3抗体处理而好转的任何病症。其中包括慢性或急性病症，或者包含令哺乳动物发生该病症的病理状况的疾病。一般说来，该疾病是一种存在heregulin对ErbB2-ErbB3蛋白复合物过度激活的疾病。本文中有待处理的疾病包括例如良性和恶性肿瘤；白血病和恶性淋巴瘤；神经元性、神经胶质性、星形细胞性、下丘脑性和其它腺体性、巨噬细胞性、上皮性、基质性和囊胚性疾病；以及炎症、血管源性和免疫性疾病。
“癌”和“癌性的”指或表示哺乳动物体内通常以细胞生长失控为特征的生理情况。癌的例子包括但不限于，癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌更特殊的例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳房癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)以及各种脑部和颈部癌症。
“细胞毒剂”在此指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语倾向于包括放射性同位素(例如I、Y、Pr)、化疗剂和例如来自细菌、真菌、植物或动物的酶活毒素或其片段。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂包括例如阿霉素(Adriamycin)、阿霉素(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、塞替派、白消胺、细胞毒素、红豆杉醇、甲氨蝶呤、顺氯铵铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊甙、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞宾、卡铂、替尼泊甙、道诺霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素、Esperamicins(参见美国专利4,675,187)、美法仑以及其它氮芥。
“细胞因子”是由对其它细胞起胞间介体作用的细胞群释放的蛋白质的统称。所述细胞因子例如淋巴因子、单核因子和惯称的多肽激素。包括在细胞因子中的是生长素，例如人生长素、N-甲硫氨酸人生长素和牛生长素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白类激素，例如促滤泡激素(FSH)、促甲状腺素(TSH)、和促黄体素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘促乳素；肿瘤坏死因子α和β；穆勒氏抑制物(mullerian-inhibiting substance)；鼠促性腺素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子Ⅰ和Ⅱ；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒巨噬细胞-CFS(GM-CFS)；和粒细胞-CFS(G-CFS)；白细胞介素(IL)，例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β；以及包括LIF和试剂盒配体(kit ligand(KL))在内的其它多肽因子。在本文中，细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物学活性对等物。
“前药(prodrug)”在此指药学活性物质的前体或衍生形式，其对肿瘤细胞细胞毒性低于亲本药，并且能够被酶激活或转化成较高活性的亲本形式。参见Wilman，“癌症化疗中的前药”(“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”)，生物化学协会学报(Biochemical Society Transaction)14,pp.375-382，第615次会议，Belfast(1986)和Stella等，“前药：定靶药物释放的化学方法”(“Prodrug:A ChemicalApproach to Targeted Drug Delivery”)，受控药物释放(Directed Drug Delivery)，Borchardt等编，pp.247-267,Humana Press(1985)。本发明的前药包括，但不限于，含磷酸的前药、含硫代磷酸的前药、含硫酸的前药、含肽的前药、经D-氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、含β内酰胺的前药、更适宜取代的苯氧基乙酰胺的前药或更适宜取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前药，它们可以转化为细胞毒性更高的游离药。可以衍生成为本发明所用前药形式的细胞毒性药包括例如，但不限于，前文所述的化疗剂。
“标记”在此指直接或间接与抗体偶联的可检测化合物或组合物。标记可以就其自身被检测到(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者，如果是酶标记，它们可催化可检测化合物或组合物底物的化学转变。
“固相”指本发明抗体可吸附于其上的非液态基质。固相的例子在此包括部分或完全由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷构成的固相。在有的实施方案中，根据上下文，固相可能包括测试板的孔；而在其它实施方案中，可能是纯化柱(例如亲和性色谱柱)。该术语还包括分散的颗粒构成的不连续固相，如美国专利4,275,149所述。
“脂质体”是由各种脂类、磷脂和/或表面活性剂构成的，通常被用来向哺乳动物传递药物(例如本文所述的抗ErbB3抗体和优选的化疗剂)的小囊泡。脂质体的组份通常排列成双层结构，与生物膜的脂排列类似。
“分离的”核酸分子是经鉴定的，并且与通常与之相伴存在于该抗体核酸天然来源中的污染核酸分子中至少一种分离的核酸分子。分离的核酸分子不是其天然形式或处于其天然环境中。所以，分离的核酸分子与存在于天然细胞内的核酸分子是不同的。但是，分离的核酸分子包括含于正常表达抗体的细胞内的核酸分子，例如，该核酸分子可以位于上不同于天然细胞内的位置。
表达“调控序列”指在特定的宿主微生物内表达与之可操作性连锁的编码序列所必需的DNA序列。例如，适合原核细胞的调控序列包括启动子，优选的操纵子序列和核糖体结合位置。已知，真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和加强子。
当与另外的核酸序列形成功能关联的时候，核酸是“可操纵性连锁”的。例如，如果表达成参与多肽分泌的前蛋白质，前导序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作性连锁；如果它作用于序列的转录，启动子或加强子与编码序列可操作性连锁；或者，如果它的位置有助于翻译，核糖体结合位置与编码序列可操作性连锁。一般说来，“可操纵性连锁”表示连接的DNA序列是邻接的，而且如果是分泌前导序列，是邻接而且是读码相的。但是，加强子不必是邻接的。连锁可以通过常规限制性位点处的连接作用完成。如果所述的位点不存在，根据常规方法，可以使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
在本文中，“细胞”“细胞系”和“细胞培养物”是互换使用的，而且所有这些名称都包括子代。所以，“转化体”和“转化细胞”包括，不计转化数量，原代所述细胞及由其形成的培养物。还可以理解成，由于特地的或意外的突变，所有子代的内含DNA可能不完全一样。具有相同功能或生物活性的突变子代，例如在最初转化的细胞中筛选到的，也包括在内。如果有不同的命名，通过上下文可以理解清楚。Ⅱ．本发明的实施方案
A．抗体的制备
以下说明所例举的是产生要求保护的抗体的技术。
(ⅰ)多克隆抗体
多克隆抗体通常是通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物体内生成的。它可以用于利用例如马来酰亚氨苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR(其中的R和R1是不同的烷基)的双官能剂或衍生剂将有关抗原与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质偶联，后者例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制物。
例如，将100微克或5微克(分别适合兔或小鼠)蛋白质或偶联物与3体积Freund完全佐剂混合后在多处皮内注射该溶液，如此用抗原、免疫偶联物或衍生物免疫动物。一个月后，通过多处皮下注射以原量1/5至1/10的肽或有Freund完全佐剂偶联物对动物加强免疫。7至14天后，放出动物的血，分析血清的抗体效价。对动物的加强免疫进行至达到稳定效价(titer plateaus)。较好的是，用相同抗原但与不同蛋白和/或通过不同的交联反应剂偶联而成的的偶联物加强免疫。偶联物还可以在重组细胞内制备成融合蛋白的形式。而且，凝聚剂，例如明矾适合用来加强免疫应答。
    (ⅱ)单克隆抗体
单克隆抗体是由一群基本上同源的抗体(即，除了可能存在的少量天然突变之外，构成样群的各抗体是一样的)制得的。所以，修饰语“单克隆”表示抗体不是不同抗体的混合物这一特性。
例如，单克隆抗体可以用Kohler等，自然256:495(1975)首次公开的杂交瘤方法制得，或者利用重组DNA方法制得(美国专利4,816,567)。
在杂交瘤方法中，鼠或其它合适的宿主动物，例如仓鼠，如前文所述接受免疫，以引发产生或能够产生特异性结合免疫所用蛋白的抗体的淋巴细胞。或者，可以体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂，例如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：理论与实践(MonoclonalAntibodies:Principles and Practic)pp.59-103(Academic Press)1986)。
将如此制得的杂交瘤细胞接种并培养在合适的培养基中，培养基中最好含有一种或多种抑制非融合亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤培养基中一般含有次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷这些抑制HGPRT缺陷型细胞生长的物质(HAT培养基)。
优选的骨髓瘤细胞是那些融合效率高、支持选定的抗体生产细胞稳定且高水平地生产抗体、而且对诸如HAT培养基敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如来自MOPC-21和MPC-11鼠肿瘤的(可以由SalkInstitute Cell Distribution Center,San Diego,California USA获得)，和SP-2或X63-Ag8-653细胞(可由美国典型培养物保藏中心，Rockville,Maryland USA获得)。也有用人骨髓瘤细胞和人-鼠异源骨髓瘤细胞系来生产人单克隆抗体的(Kozbor,免疫杂志(J.Immunol.)133:3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications),pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。
分析生长有杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。较好的是，用免疫沉淀法或例如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)的体外结合分析来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
例如，单克隆抗体的结合亲和性可以利用Scatchard分析(Munson等，生物化学年刊(Anal.Biochem.)107:220(1980))来测定。
在杂交瘤细胞经鉴定具有生产所要求的特异性、亲和性和/或活性的抗体后，可以利用限制性稀释过程将克隆亚克隆化并利用标准方法培养(Goding，单克隆抗体：理论与实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)pp.59-103(Academic Press)1986)。就此目的而言，合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以以腹水瘤的形式生长在动物体内。
利用常规免疫球蛋白纯化技术，例如A蛋白-琼脂糖柱(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和性色谱，以合适的方式从培养基、腹水液或血清中分离出由亚克隆分泌的单克隆抗体。
使用常规方法可以方便地分离出编码单克隆抗体的DNA并进行测序(例如，利用能与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是所述DNA的优选来源。分离之后，可以将DNA接入表达载体，表达载体然后被转染到例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或杂交瘤细胞等原本并不产生免疫球蛋白的宿主细胞内，以便在重组宿主细胞内获得生成的单克隆抗体。论述在细菌中重组表达编码抗体的DNA的文章有Skerra等，现代免疫观点(Cur.Opinion in Immunol.)5:256-262(1993)和Pluckthum，免疫学综述(Immunol.Revs.)130:151-188(1992)。
在另一实施方案中，可以从用McCafferty等在自然348:552-554(1990)中所述的技术建立的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等在自然352:624-628(1991)和Marks等在分子生物子杂志222:581-597(1991)中分别叙述了利用噬菌体文库分离鼠和人的抗体。此后的出版物叙述了通过链改组生产高亲和性(nM级)人抗体(Marks等，生物技术(Biol/Technology)10:779-783(1992))，和以重组感染和体内重组作为构建极大噬菌体文库的策略(Waterhouse等，核酸研究(Nuc.Acids.Res.)21:2265-2266(1993))。所以，以上技术是在常规的单克隆抗体杂交瘤技术之外用于分离单克隆抗体的可供选择的方法。
还可以对DNA进行修饰，例如以人重链和轻链恒区的编码序列代替同源的鼠序列(美国专利4,816,567；Morrison等，美国科学院院报81:6851(1984))，或者将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分与免疫球蛋白的编码序列共价连接。
通常，非免疫球蛋白多肽被用以替代抗体的恒区，或者用以替代抗体抗原结合位置之一的变区，由此形成嵌合的二价抗体，其中抗原结合位置之一具有对一抗原的特异性，而另一抗原结合位置则具有对另一不同抗原的特异性。
    (ⅲ)人源化的和人的抗体
人源化非人抗体的方法在本领域是公知的。一般说来，人源化抗体引入有一个或多个非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常被称为“外来”残基，它们通常取自“外来”的可变功能区。人源化可以主要按照Winter及其同事(Jones等，自然321:522-525(1986)；Riechmam等，自然332:323-327(1988)；Verhoeyen等，科学239:1534-1536(1988))的方法，用啮齿动物CDRs或CDR序列代替人抗体的相应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中完整人可变功能区非全部地被非人的相应序列所取代。实际上，人源化的抗体通常是这样的人抗体，即其中部分CDR残基以及可能部分FR残基被来自啮齿动物抗体同样位置的残基所取代。
选择用于制造人源化抗体的人可变功能区，包括重链和轻链，对于降低抗原性是十分重要的。根据所谓的“最适合”的方法，用啮齿动物抗体可变功能区的序列对整个已知人可变功能区序列文库进行筛选。然后以与啮齿动物序列最近似的人序列作为人源化抗体的人构架(FR)(Sims等，免疫学杂志151:2296(1993)；Chothia等，分子生物学杂志196:901(1987))。另一种方法使用来自一特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列作为特定的构架。相同的构架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等，美国科学院院报89:4285(1992)；Presta等，免疫学杂志151:2623(1993))。
在对抗体人源化的同时保留其对抗原的高亲和性和其它优良生物特性也是十分重要的。为了达到上述目的，根据一较好的方法，人源化抗体是用如下方法制备的，即用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的人源化产物。对于本领域一般技术人员来说，三维免疫球蛋白模型是常用而熟悉的。有这样的计算机程序，它说明并显示选定的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构。检视这些显示内容可以对残基在候选免疫球蛋白序列功能中可能的作用进行分析，即，分析可能影响候选免疫球蛋白与抗原结合能力的残基。如此，可以从受体和外来序列中选出FR残基并进行组合，由此获得理想的抗体特性，例如对靶抗原的亲和性提高。通常，CDR残基对于影响与抗原结合具有直接和最重要的关系。
或者，现在可以产生在免疫后能够生产全部人抗体而无内源性免疫球蛋白生成的转基因动物(例如小鼠)。例如，已有报道，在嵌合和种系突变小鼠内抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失造成对内源性抗体生产的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因转移到这样的种系突变小鼠内将在以抗原攻击后生产出人抗体。参见，例如，Jakobovits等，美国科学院院报90:2551(1993)；Jakobovits等，自然362:255-258(1993)；Bruggermann等，免疫学的一年(Year in Immuno)7:33(1993)。人抗体还可以是来自噬菌体显示文库的(Hoogenboon等，分子生物学227:381(1991)；Marks等，分子生物学222:581-597(1991))。
    (ⅳ)抗体片段
已经有了各种方法生产抗体片段。通常，所述片段是通过用蛋白酶消化完整的抗体而得到的(参见Morimoto等，生物化学和生物物理学方法杂志(Journal ofBiochemical and Biophysical Methods)24:107-117(1992)和Brennan等，科学229:81(1985))。但是，现在，抗体片段可以直接由重组宿主细胞产生。例如，抗体片段可以分离自前述抗体噬菌体文库。或者，可以直接从大肠杆菌回收Fab’-SH片段，然后化学偶合成F(ab’)2片段(Carter等，生物技术10:163-167(1992))。根据另一方法，F(ab’)2片段可以从重组宿主细胞培养物中直接分离得到。生产抗体片段的其它方法是本领域一般技术人员众所周知的。
    (ⅴ)双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两个不同的表位具有结合特异性的抗体。例举的双特异性抗体可能与两个不同的ErbB3蛋白表位结合。其它此类抗体可能是将一个ErbB3结合位置与EGFR、ErbB2和/或ErbB4的结合位置组合。或者，抗ErbB3臂可与结合在白细胞表面的触发分子的臂组合，后者例如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)例如FcγRⅠ(CD64)、FcγRⅡ(CD32)和FcγRⅢ(CD16)，以使细胞防御机制主要针对ErbB3表达细胞。双特异性抗体还可以用于将细胞毒剂定位于表达ErbB3的细胞。所述抗体具有结合ErbB3的臂和结合细胞毒剂(例如皂草素、抗α干扰素、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法是本领域公知的。全长双特异性抗体的常规生产方法是基于共表达两对免疫球蛋白重链-轻链对，其中的两链具有不同的特异性(Millstein等，自然305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，杂交瘤(四交瘤(quadromas))可能产生10种不同抗体的混合物，只有其中之一具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化，一般通过亲和色谱进行，十分繁琐，而且产率很低。WO93/08892和Traunecker等在欧洲生物学杂志10:3655-3659(1991)中公开了类似的方法。
根据另一种方法，具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位置)的抗体可变功能区与免疫球蛋白恒定区序列融合。最好是与免疫球蛋白的重链恒定区融合，包含至少部分铰链区、CH2区和CH3区。较好的是，至少融合体之一具有包含轻链结合所必需的第一重链恒定区(CH1)。编码免疫球蛋白重链融合体，以及视需要而定的免疫球蛋白轻链的DNA被插入不同表达载体，共转染到合适的宿主微生物中。当在构建中使用比例不等的三条多肽可得到最佳得率时，这为在实施中调节三条多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。但是，当表达比例相等的至少两条多肽链具有高的得率，或者比例并不特别重要时，可以将两条或全部三条多肽链的编码序列插入在同一表达载体内。
在这种方法较好的实施方案中，双特异性抗体的一条臂上有具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链，另一臂上有杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。现在发现，这种不对称结构有助于将所需的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合分离，因为免疫球蛋白轻链只存在于双特异性分子的一半将方便分离。WO94/04690公开了所述方法。有关产生双特异性抗体的其它细节可参见例如Suresh等，酶学方法(Methods in Enzymology)121:210(1986)。
根据另一种方法，一对抗体分子之间的界面可以经改造使得从重组细胞培养物中回收得到的异源二聚体百分比达到最大。较好的界面包括至少一对抗体恒定区的CH3功能区。在该方法中，第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代。通过以小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链在第二抗体分子的界面形成大小与大侧链近似或相同的补偿“穴”。这提供了一种使得异源二聚体得率高于其它不需要的终产物例如同源二聚体的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联的”抗体。例如，异源偶联体的抗体之一可以与亲和素偶合，另一个与生物素偶合。已经有人提出用这样的抗体令免疫系统细胞有目标地针对不希望其存在的细胞(美国专利4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO91/00360,WO92/200373和EP03089)。异源偶联抗体可以利用任何常规交联法来制备。合适的交联剂是本领域公知的，在美国专利4,676,980中公开了所述的交联剂以及一系列交联技术。
文献中还记述了由抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可以利用化学键来制备双特异性抗体。Brennan等，科学229:81(1985)叙述了一种将完整的抗体蛋白酶解切割成F(ab’)2片段的方法。所述片段在二硫酚络合剂亚砷酸钠存在下被还原，以稳定化连二硫酚和防止形成分子间二硫键。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸(thionitrobenzoate)(NTB)衍生物。然后将Fab’-NTB衍生物之一以巯基乙胺还原成Fab’-硫醇，并与等摩尔量的另一Fab’-NTB衍生物混合以形成双特异性抗体。所形成的抗体可以用作酶的选择性固定化剂。
最新的技术发展方便了直接从大肠杆菌回收可以通过化学偶合形成双特异性抗体的Fab’-SH片段。Shalaby等，实验医学杂志(J.Exp.Med)175:217-225(1992)叙述了完全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的生产。各Fab’片段由大肠杆菌分别分泌，并经受控的体外化学偶合形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合过量表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，并能够触发人细胞毒性淋巴细胞对人乳房癌靶细胞的溶解活性。
各种直接由重组细胞培养物制备和分离双特异性片段的技术也是已知的。例如，已有人用亮氨酸拉链生成了双特异性抗体。Kostelny等，免疫学杂志148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两个不同抗体的Fab’部分连接。该抗体同源二聚体在铰链区被还原成单体，然后从新氧化成抗体异源二聚体。该方法还可以被用来产生抗体同源二聚体。Hollinger等在美国科学院院报90:6444-6448(1993)中所述的“间抗体”技术提供了另一种制造双特异性抗体片段的机制。所述片段包含由一接头将轻链可变功能区(VL)连接的重链可变功能区(VH)，接头很短以致于同一链上的两个功能区之间无法配对。所以，同一片段上的VH和VL功能区被迫与其它片段上的互补性VL和VH功能区配对，由此形成两个抗原结合位置。利用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体的其它方法也已有所报道。参见Gruber等，免疫学杂志152:5368(1994)。
可考虑使用二价以上的抗体。例如抗原制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志147:60(1991)。
    (ⅵ)筛选具有要求特性的抗体
上文叙述了产生抗体的技术。被选出的是具有在此所述的特性的抗体。
为了选择减少HRG诱导的ErbB2-ErbB3蛋白复合物形成的抗体，可以将表达上述两种受体的细胞(例如Caov3细胞)与缓冲液(对照)或抗体预培养，然后用HRG或对照缓冲液处理。然后细胞被裂解，可以将粗裂解液离心以去除不溶性物质。上清液与共价固定于固相的ErbB2特异性抗体一起孵育。洗涤后，通过SDS-PAGE分离出免疫沉淀物。然后用抗ErbB3抗体检测凝胶的Western印迹。显影后，可将印迹杂交揭下并用抗ErbB2抗体再检测。为了定量测定所述抗体对HRG诱导的复合物的形成的影响，可以对凝胶进行反射比扫描光密度测定。由此，可以选出与对照未处理细胞相比降低了ErbB2-ErbB3复合物形成的抗体。参见后文实施例。
为了选择在表达ErbB2和ErbB3受体的细胞内有降低HRG诱导的ErbB2激活作用的抗体，该细胞可与缓冲液(对照)或抗体预培养，然后用HRG或对照缓冲液处理。然后裂解细胞，粗裂解液可经离心去除不溶性物质。如后文实施例所述，通过Western印迹杂交，然后用抗磷酸酪氨酸抗体来测定ErbB2激活作用。ErbB2激活作用可以通过例如对该凝胶的反射比扫描光密度测定法来定量。或者，WO95/14930和Sadick等在分析生物化学235:207-217(1996)中所述的激酶受体激活作用分析法可以用来测定ErbB2激活作用。
如后文实施例所述，抗体对结合ErbB3的HRG的作用可以通过在没有(对照)和有抗ErbB3抗体存在下将表达这些受体的细胞(例如经转染后表达ErbB3的4E9H3细胞)与放射性标记的HRG(例如其EGF样功能区)一起培养来测定。那些提高HRG对ErbB3受体亲和性的抗体可以被选用于进一步的开发。如果要选择的抗体是封闭HRG与ErbB3结合的抗体，在该分析中这样的抗体可以被鉴定出来。
为了筛选与被目的抗体结合的ErbB3上表位结合的抗体(例如封闭3-8B8抗体与ErbB3结合的抗体)，可以进行如《抗体，实验室手册》(Antibodies,A LaboratoryManual),Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane编(1988)中所述的常规交叉封闭分析。
    (ⅶ)效应物功能改造
可能需要就效应物功能对本发明抗体进行修饰，从而加强抗体在例如治疗癌症中的效果。例如，可在Fc区内引入半胱氨酸残基，由此允许在该区形成链间二硫键。由此形成的同源二聚体抗体可以具有改善的内在能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤性和抗体依赖性细胞毒性(ADDC)。参见Caron等，实验医学杂志176:1191-1195(1992)和Shopes,B.,免疫学杂志148:2918-2922(1992)。加强了抗癌活性的同源二聚体抗体还可以如Wolff等在癌症研究(CancerResearch)53:2560-2565(1993)中所述利用异源双功能(heterobifunctional)交联剂来制备。或者，抗体可以经改造后具有两个Fc区，并由此加强其补体裂解性和ADDC能力。参见Stevenson等，抗癌药的设计(Anti-Cancer Drug Design)3:219-230(1989)。
    (ⅷ)免疫偶联物
本发明还涉及包含与细胞毒剂偶联的所述抗体的免疫偶联物，细胞毒剂例如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶联物)。
用于产生所述免疫偶联物的化疗剂已在前文论述过。可以使用的酶活性毒素或其片段包括白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自绿脓杆菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、modeccin A链、α八叠球菌素(αsarcin)、油桐蛋白、dianthin蛋白、美商路(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPⅡ和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制物、gelonin、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢菌素(tricothecenes)。有多种放射性核素可用于生成放射性偶联的抗ErbB3抗体。例如212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
抗体与细胞毒剂的偶联物是用多种双官能蛋白偶合剂制备的，后者例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫代戊环(iminothiolane)(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(例如己二亚氨酸二甲酯盐酸盐)、活泼酯(例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二叠氮基化合物(例如二(对叠氮基苯甲酰)己二胺)、二重氮衍生物(例如二-(对重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和二活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如Vitetta等在科学238:1098(1987)中所述的方法来制备。碳14标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一例用于将放射性核素与抗体偶联的螯合剂。参见WO94/11026。
在另一实施方案中，为了用于肿瘤导向，抗体可以与“受体”(例如链霉亲和素)偶联，此时，给患者使用抗体-受体偶联物，接着用清洗剂去除循环系统中的未被结合的偶联物，然后使用与细胞毒剂(例如放射性核素)偶联的“配体”(例如亲和素)。
      (ⅸ)免疫脂质体
本处所述的抗ErbB3抗体还可以制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体是利用本领域已知方法制备的，例如以下所述：Epstein等，美国科学院院报82:3688(1985)；Hwang等，美国科学院院报77:4030(1980)；和美国专利4,485,045和4,544,545。美国专利5,013,556公开了延长了循环时间的脂质体。
特别有用的脂质体可以通过含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物经反相蒸发生成。将脂质体挤压通过一定孔径的滤器形成具有所需直径的脂质体。如Martin等在生物化学杂志257:286-288(1982)中所述，可通过二硫置换反应将本发明中抗体的Fab’片段与脂质体偶联。脂质体中可以包含化疗剂(例如阿霉素)。参见Gabizon等，国立癌症研究所杂志(J.NationalCancer Inst.)81(19)1481(1989)。
(ⅹ)抗体依赖性酶介导的前药疗法(ADEPT)
通过将抗体与可将前药(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转化成活性抗癌药物的前药激活酶偶联，本发明的抗体还可以用于ADEPT。例如，可参见WO88/07378和美国专利4,975,278。
用于ADEPT的免疫偶联物的酶组份包括任何能以此途径激活前药以使之转为它的更激活、更有细胞毒性的形式的酶。用于ADEPT的免疫偶联物中的酶组份包括，但不限于，用于将含磷酸盐的前药转化成游离药的碱性磷酸酶；将含硫酸盐的前药转化成游离药的芳基硫酸酯酶；将无毒的5-氟胞嘧啶转化成抗癌药5-尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含肽前药转化成游离药的蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧基蛋白酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)；用于转化含D氨基酸取代基的前药的D-丙胺酰基羧基肽酶；用于将糖基化前药转化成游离药的糖切割酶，例如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将β-内酰胺衍生的药物转化成游离药的β-内酰胺酶；和用于分别将在其胺氮原子上带有苯氧基乙酰基或苯基乙酰基基团的药物转化成游离药的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶。或者，可以用具有酶活性的抗体(在本领域中又称“抗体酶”)将本发明的前药转化成游离的活性药(参见Massey，自然328:457-458(1987))。可以如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于向肿瘤细胞群传递抗体酶。
本发明的酶可以利用本领域的公知技术与抗ErbB3抗体共价结合，例如利用前文所述的异源双官能交联剂。或者，利用本领域公知的重组DNA技术构建这样的融合蛋白，包含与本发明酶的至少一个功能性活性位置连接的至少本发明抗体的抗原结合区(参见Neuberger等，自然312:604-608(1984))。
    (ⅹⅰ)抗体-补救受体结合表位融合体
在本发明部分实施方案中，可能宜采用抗体片段而不是完整的抗体来加强对肿瘤的穿透。此时，为了延长它的血清半衰期可能需要对抗体片段加以修饰。这可以通过例如在抗体片段中加入补救受体结合表位来做到(例如，通过抗体片段对应区的突变，或通过将表位加到肽标记中，然后通过例如DNA或肽合成将肽标记融合在抗体片段的两端或中部)。
制备此类体内半衰期延长的抗体变体的合成方法包括数个步骤。首先是鉴定IgG分子Fc区的补救受体结合表位的序列和构象。鉴定了该表位后，对目的抗体的序列进行修饰以包含被鉴定结合表位的序列和构象。在序列突变之后，检测抗体变体，看它的体内半衰期是否比原抗体长。如果抗体变体在测试中的体内半衰期并未延长，其序列进一步被改变以包含被鉴定结合表位的序列和构象。改变后的抗体再就体内半衰期的延长接受测试，该过程持续直至获得表现出体内半衰期延长的分子。
如此加到目的抗体中的补救受体结合表位是任何合适的前文定义的表位，其质性取决于例如被修饰抗体的类型。转移的进行需使目的抗体仍然具有前述活性。
所述表位通常构成这样一个区域，在其中，Fc功能区一个或两个环的一个或多个氨基酸残基被转移到抗体片段的相同位置。更好的是，Fc功能区一个或两个环的三个或更多个残基被转移。还要好的是，表位来自(例如IgG的)Fc区的CH2功能区，被转移到抗体的CH1、CH3或VH区，或一个以上的此类区域。或者，表位来自Fc区的CH2功能区，被转移到抗体片段的CL区或VL区。或C1和VL两个区。
在最好的一种实施方案中，补救受体结合表位包含序列(5’至3’)：PKNSSMISNTP(SEQ ID NO:1)，还可以再包含选自以下组的序列：HQSLGTQ(SEQ ID NO:2)、HQNLSDGK(SEQ ID NO:3)、HQNISDGK(SEQ IDNO:4)或VISSHLGQ(SEQ ID NO:5)，尤其是当抗体片段是Fab或F(ab’)2时。在另一种最好的实施方案中，补救受体结合表位是具有以下序列(5’至3’)的多肽，包含序列HQNLSDGK(SEQ ID NO:3)、HQNISDGK(SEQ ID NO:4)或VISSHLGQ(SEQ ID NO:5)和PKNSSMISNTP(SEQ ID NO:1)。
B．载体、宿主细胞和重组方法
本发明还提供了编码本发明所述抗体的分离的核酸，包含该核酸的载体和宿主细胞，以及用于产生抗体的重组技术。
为了重组产生抗体，其编码核素被分离出来并插入到用于进一步克隆(扩增DNA)或表达的复制载体中。利用常规技术可方便的分离出编码单克隆抗体的DNA并测序(例如使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。有许多载体可以使用。载体的组成通常包括，但不限于，以下之一或几个：信号序列，复制起点，一个或多个标记基因，增强子元件，启动子和转录终止序列。
(ⅰ)信号序列组成
本发明的抗ErbB3抗体不仅可以利用重组法直接制得，也可以是带异源多肽的融合多肽，异源多肽最好是在成熟蛋白或多肽的N末端具有一个特异性切割位置的信号序列或其它多肽。异源信号序列最好是被宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切割)的序列。对不识别和加工天然抗ErbB3抗体的信号序列的原核宿主细胞来说，信号序列被替代成选自以下组的原核信号序列，例如：碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定性肠毒素Ⅱ前导序列。为了能被酵母菌分泌，天然信号肽可以替代以例如酵母转化酶前导序列，α因子前导序列(包括酵母菌属和克鲁维酵母属的α因子前导序列)，或酸性磷酸酶前导序列，C.albicans葡糖淀粉酶前导序列或Wo90/13646所述的信号序列。在哺乳动物的细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列和病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹病毒gD信号序列。
此类前导区的DNA以读码框的形式与编码抗ErbB3抗体的DNA连接。
    (ⅱ)复制起点
表达载体和克隆载体都含有能够使得载体在一种或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。一般说来，克隆载体内的所述序列能够使得载体不依赖于宿主的染色体DNA来复制，它包含复制起点或自主复制序列。多种细菌、酵母和病毒的这类序列是公知的。质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性菌，2μ质粒的复制起点适用于酵母，各种病毒(例如SV40，多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)的复制起点适用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般说来，哺乳动物表达载体不需要复制起点(通常，使用SV40复制起点只是因为它含有早期启动子)。
    (ⅲ)选择基因
表达和克隆载体可能含有选择基因，又称可选择标记。典型的选择基因编码如下蛋白：(a)提供抗生素或毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素)抗性，(b)补足营养缺陷，或者(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养素(例如编码杆菌D丙氨酸消旋酶的基因)。
选择法实例之一使用药物来阻止宿主细胞的生长。用异源基因转化成功的细胞产生提供抗药性的蛋白，因而能够经选择过程而存活。这类主要选择法的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
另一例适合用于哺乳动物细胞的可选择标记是能够鉴定出摄取抗ErbB3抗体核酸的细胞组份，例如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白Ⅰ和Ⅱ，最好是灵长类的金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，用DHFR选择基因转化的细胞通过将所有转化体培养在含氨甲蝶呤(Mtx)的培养基中，进行首次甄别，氨甲蝶呤是DHFR的竞争性拮抗剂。如果使用野生型DHFR，合适的宿主细胞是缺乏DHFR的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，用编码抗ErbB3抗体、野生型DHFR蛋白和例如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)这样的另一可选择标记转化或共转化的生长细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)可以通过将细胞培养在含有针对可选择标记的选择剂(例如氨基糖甙类抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中来选择。参见美国专利4,965,199。
一种适用于酵母菌的选择基因是存在于酵母质粒YRp7(Stinchcomb等，自然282:39(1979))中的trp1基因。trp1基因为酵母突变株(例如ATCC No.44076或EPP41。Jones，遗传(Genetics)85:12(1977))不能在色氨酸中生长而提供了选择标记。所以，酵母宿主细胞基因组内的trp1缺陷为通过在无色氨酸条件下的生长来检测转化作用提供的有效的环境。类似的，leu2缺陷型酵母株(ATCC 20,622或38,626)由已知的含Leu2基因的质粒来补足。
此外，来自1.6微米的环形质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维酵母菌。或者，据报道，可将用于大量生产重组小牛凝乳酶的表达系统用于乳酸克鲁维酵母菌(K.lactis),Van den Berg，生物技术8:135(1990)。用于由克鲁维酵母工业株分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体也已公开。Fleer等，生物技术9:968-975(1991)。
    (ⅳ)启动子
表达和克隆载体通常含有被宿主微生物识别并与抗ErbB3抗体核酸可操作性连锁的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和例如tac启动子这样的杂交启动子。但是，其它已知细菌启动子也是适合的。用于细菌系统的启动子还含有与编码抗ErbB3抗体的DNA可操作性连锁的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
用于真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有的真核基因都含有位于转录起始位置上游约25至30个碱基的一段AT丰富区。在许多基因的转录起始位置上游70至80个碱基处发现的另一段序列是CNCAAT区，其中的N可以是任意核苷酸。大多数真核基因的3’末端是AATAAA序列，这可能是在编码序列3’末端添加聚A尾端的信号。所有以上序列都适合插入真核表达载体中。
适用于酵母菌宿主的合适的启动序列包括例如3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油酸-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。
其它酵母菌启动子，即其优点还在于转录受生长条件控制的诱导型启动子是以下酶的启动区：乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解性酶、金属硫蛋白、甘油酸-3-磷酸脱氢酶、和负责麦芽糖和半乳糖的利用的酶。有关用于酵母菌表达的合适的载体和启动子还可参见EP73,657。较好地，还可以与酵母菌启动子一起使用酵母菌加强子。
在哺乳动物宿主细胞内从载体转录抗ErbB3抗体是受例如以下启动子调控的，例如来自病毒基因组的启动子，病毒例如多瘤病毒、鸟痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、B型肝炎病毒和最好的猴病毒40(SV40)，来自异源哺乳动物的启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)，来自热休克启动子，只要以上提供的启动子与宿主细胞系统具有相容性。
最好，得到的早期和晚期SV40病毒的启动子是另含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段。人巨细胞病毒的立即早期启动子最好是HindⅢ E限制性片段。美国专利4,419,446公开了一种利用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主内表达DNA的系统。美国专利4,601,978对此系统进行了改进。另外，有关在鼠细胞内在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子调控下表达人β干扰素cDNA，可参见Reyes等，自然297:598-601(1982)。或者，Rous肉瘤病毒的长末端重复序列可以用作启动子。
    (ⅴ)增强子元件
由高级真核细胞转录本发明编码抗ErbB3抗体的DNA常会因在载体中插入增强子序列而得以增强。现在已经知道了许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。但是，通常使用的是来自真核细胞病毒的增强子。包括例如位于复制起点晚期侧的SV40增强子(bp100-270)，巨细胞病毒早期启动子的增强子，位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。另外，有关激活原核启动子的增强元件还可参见Yaniv，自然297:17-18(1982)。增强子可以在载体中拼接在抗ErbB3抗体编码序列的5’或3’端，但是最好位于启动子的5’端。
    (ⅵ)转录终止
用在真核宿主细胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的成核细胞)内的表达载体还包含转录终止和稳定mRNA所必需的序列。此种序列一般来自真核或病毒DNA或cDMA的5’，有时是3’的非翻译区。此种区域含有转录成编码抗ErbB3抗体的mRNA非翻译区内聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。可用的转录终止(序列)之一是牛生长激素的聚腺苷酸化区。参见WO94/11026，以及其中公开的表达载体。
    (ⅶ)宿主细胞的选择和转化
用于克隆和表达载体内的DNA的合适宿主细胞是原核细胞、酵母菌、或前述高级真核细胞。适合此目的的原核细胞包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性微生物，例如肠杆菌科，如以大肠埃希氏菌为例的埃希氏杆菌属，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷伯氏杆菌属，变形杆菌属，以鼠伤寒沙门氏菌为例的沙门氏菌属，以粘质(地衣型芽胞杆菌于1989年4月12日出版的DD266710中已公开)沙雷氏菌为例的沙雷氏菌属和志贺氏杆菌属，以及以枯草芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌为例的芽孢杆菌属，(地衣型芽胞杆菌于1989年4月12日出版的DD266710中已公开)以绿脓假单孢菌为例的假单孢菌属，和链霉菌属。优选的大肠杆菌克隆宿主之一是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但是其它菌株例如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATTC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也可使用。以上只是举例，而并不局限于此。
除了原核细胞植物，例如丝状真菌或酵母菌这类真核微生物也是编码抗ErbB3抗体载体的合适的克隆或表达宿主。在低级真核宿主微生物中，酿酒酵母菌或一般面包酵母是最常用的。但是，许多其它属、种和菌株也是常用而且可以用于本发明的，例如栗酒裂殖酵母，以乳酸克鲁维酵母菌、K.fragilis(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母菌(ATCC16,045)、K.wicheramii(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、K.drosophilarum(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母菌和K.marxianus为例的克鲁维酵母属；yarrowia(EP402,226)；巴斯地毕赤酵母(EP183,070)；念珠菌；Trichoderma reesia(EP244,234)；粗糙链孢霉；例如许旺酵母的许旺酵母属；丝状真菌，例如链孢霉属、毒霉菌属、球枝藻属、和以构槽曲霉和黑曲霉为例的曲霉属宿主。
用于表达糖基化抗ErbB3抗体的合适宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞包括例如植物和昆虫细胞。已经鉴定出了多种杆状病毒株及其变体以及对应的来自以下宿主的允许宿主细胞，宿主例如5Podoptera frugiperda(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黄猩猩果蝇(果蝇)和中国桑蚕。许多用于转染的毒株是公开可以得到的，例如Autographa californica NPV的L-1变体和中国桑蚕NPV的Bm-5株，根据本发明，所述的病毒尤其适合用作转染Spodoptera frugiperda细胞的病毒。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
但是，最令人感兴趣的是脊椎动物细胞，而且以培养(组织培养)来增殖脊椎动物细胞已经是常规方法了。可用的哺乳动物宿主细胞系例如经SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(为了在悬浮培养物中生长而被亚克隆的293或293细胞，Graham等，基因病毒杂志(J.GenVirol)36:59(1977))；幼年仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等，美国科学院院报77:4216(1980))；鼠塞尔托利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人子宫癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；狗肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；水牛大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；鼠乳腺癌肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等,纽约科学协会记要(Annals N.Y.Acad.Sci.)383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞和人肝癌细胞系(Hep G2)。
宿主细胞用前述用于生产抗ErbB3抗体的表达或克隆载体转化，然后培养在为了诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因而改变过的常规营养培养基中。
    (ⅷ)培养宿主细胞
用于生产本发明抗ErbB3抗体的宿主细胞可以培养在多种培养基中。商品化的培养基例如Ham氏F10培养基(Sigma)，基本必需培养基(MEM)(Sigma),RPMI-1640(Sigma),和Dulbecco氏改进的Eagle培养基(DMEM)Sigma)适合用于培养所述的宿主细胞。此外，任何一种以下所述的培养基都可以用作培养宿主细胞的培养基：Ham等，酶学方法(Meth.Enz.)58:44(1979),Barnes等，生物化学学报(Anal.Biochem)102:255(1980),美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO90/03430；WO87/00195或美国专利Re.30,985。根据需要,任何上述培养基都可以补充以激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、运铁蛋白、或上皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素(GENTAMYCINTM))、微量元素(即存在时的最终浓度通常为微摩尔级的无机化合物)和葡萄糖或与之相当的能量源。任何其它必需的补偿成份也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括在内。培养条件，例如温度、pH等和过去用于培养选用于表达的宿主细胞时一样，而且对本领域技术人员来说是显而易见的。
    (ⅸ)抗ErbB3抗体的纯化
在使用重组技术时，抗体可以产生在细胞内、壁膜间隙内或直接分泌在培养基中。如果抗体生成在细胞内，第一步是通过例如离心或超滤去除颗粒状碎片(或者是宿主细胞或者是裂解片段)。Cater等在生物技术10:163-167(1992)中叙述了分离分泌在大肠杆菌壁膜间隙内的抗体的方法。简而言之，在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下用约30分钟融解细胞糊。细胞碎片可以通过离心去除。如果抗体分泌在培养基中，通常，首先用购得的蛋白质浓缩滤膜(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)将得自此类表达系统的上清液浓缩。可以在任何前述步骤中加入诸如PMSF这样的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白酶解，并加入抗生素以阻止外来污染菌的生长。
由细胞制得的抗体组合物可以利用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化，其中亲和色谱是最好的纯化技术。A蛋白是否适合用作亲和性配体取决于存在于抗体中的免疫球蛋白Fc功能区的种类和同种型。A蛋白可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)62:1-13(1983))。G蛋白可推荐用于所有的鼠同种型和人γ3(Guss等，欧洲生物学杂志5:1567-1575(1986))。固定亲和性配体的基质最常用的是琼脂糖，但是也可以用其它基质。机械性能稳定的基质例如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可以获得比琼脂糖快的流率和较短的处理时间。如果抗体包含CH3功能区，可以使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Philipshburg,NJ)来纯化。根据回收的抗体，也可以使用其它蛋白质纯化技术，例如在离子交换柱上分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶柱色谱、肝素SepharoseTM上的色谱、阴离子或阳离子交换树脂上的色谱(例如聚天冬氨酸色谱柱)、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何预备纯化步骤之后，可以对包含目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水性色谱，用pH在约2.5-4.5的洗脱缓冲液进行，最好在低盐浓度(例如约0-0.25M的盐)下进行。
C．药物制剂
为了便于保存，可以通过将具有要求纯度的抗体与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合制成冻干制剂或水溶液形式的抗体治疗用制剂(《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol,A.编(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用剂量和浓度对接受者是无毒的，它们包括例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲液；包括维生素C和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；氯化苯甲烃铵；氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲苯酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖或其它糖，其中包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如吐温TM PluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。
本发明制剂还可以包含一种以上治疗特殊状况所需的活性混合物，它们最好具有互补的活性但是不相互产生负影响。例如，在某制剂中可能需要进一步提供与EGFR、ErbB2、ErbB4或血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体。或者，除此之外，组合物还包含化疗剂或细胞因子。所述分子，以适合各自预定目的所需的有效含量相互组合。
活性成份还可以包裹在分别通过凝聚法或界面聚合法制备的例如羟甲基纤维素或明胶胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。亦可在胶态药物释放系统(例如脂质体、白蛋白微珠、微乳液、毫微颗粒和毫微胶囊)或粗滴乳液(macroemulsion)。(《(雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol,A.编(1980))中叙述了此类技术。
用于体内使用的制剂必须是无菌的。通过灭菌滤膜过滤可以方便地做到这一点。
可以制备缓释制剂。合适的缓释制剂包括例如包含所述抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质体，所述的基质体是有形的物体，例如膜形或微胶囊。合适的缓释基质体包括例如聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、非降解性乙烯乙酸乙烯酯、诸如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide acetate组成的可注射微球)之类可降解乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之类聚合物能够使分子释放持续100天以上，有些水凝胶可在较短的时间内释放蛋白质。当胶囊化的抗体在体内保留较长时间时，它们可能会因为在37℃接触水分而变性或凝聚，结果造成生物活性降低并可能造成免疫原性改变。根据有关的机制可以设计出合理的稳定化策略。例如，如果发现凝聚机制是通过硫-二硫键置换反应而形成了分子间的S-S键，稳定化可以是通过修饰巯基残基，低温干燥酸性溶液，控制含水量，使用合适的添加剂和设计特殊的聚合基质组合物而达到。
D．抗体的非治疗性用途
本发明的抗体可以用作亲和纯化试剂。在这种方法中，抗体利用本领域公知的方法固定在例如Sephadex树脂或滤纸的固相上。被固定的抗体与待纯化的含ErbB3蛋白(或其片段)的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤载体，所述的溶剂能够基本上去除样品中除了与固定化抗体结合的ErbB3蛋白之外所有其它物质。最后，用另一种能将ErbB3蛋白从抗体上释放的溶剂洗涤载体，例如pH5.0的甘氨酸缓冲液。
抗ErbB3抗体还可以用作对ErbB3蛋白的诊断性分析中，例如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。这样，该抗体可以用于诊断人恶性肿瘤(参见美国专利5,183,884)。
用于诊断时，抗体通常用一可检测部分标记。有许多标记可以使用，它们可以大致如下分类：
(a)放射性同位素，例如35S、14C、125I、3H和131I。可以利用例如《现代免疫学方法)》(Current Protocols in Immunology)第1和第2卷，Coligen等编，Wiley-Interscience,New York,New York,Pubs.(1991)中所述的方法以放射性同位素来标记抗体，放射性可以利用闪烁计数法来测定。
(b)荧光标记，例如稀土螯合剂(铕螯合剂)或萤光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，丽丝胺，藻红素和德克萨斯红(Texas red)。荧光标记可以利用例如上文《现代免疫学方法》中所述的方法与抗体偶联。荧光可以利用荧光计来定量。
(c)各种酶底物标记，美国专利4,275,149公开了其中部分。所述的酶通常催化可以用各种技术测定的生色底物的化学改变。例如，酶催化底物的颜色变化，这种变化可以用分光光度计来测定。或者，酶改变底物的荧光性或化学发光性。前文已经说明了定量测定荧光变化的技术。化学发光底物因化学反应而被电激发，并由此发光，发出的光可以被测定(例如利用化学光度计)或向荧光受体供能。酶标记包括例如萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利4,737,456)，萤光素，2,3-二氢二氮杂萘二酮(2,3-dihydrophthalazinediones)，苹果酸脱氢酶，脲酶，过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，微过氧化物酶等。O’Sullivan等在“制备用于酶免疫分析的酶-抗体偶联物的方法”，《酶学方法》(“Methods forthe Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for usein Enzyme Immunoassay”(Methods in Enzym.)(J.Langone和H.Van Vunakis编)，Academic press,New York,73:147-166(1981)中描述了酶与抗体偶联的技术。
酶-底物的组合物包括，例如：
(ⅰ)辣根过氧化物酶(HRPO)和作为底物的氢过氧化物酶，其中的氢过氧化物酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或盐酸3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB))；
(ⅱ)碱性磷酸酶(AP)和作为生色底物的对硝基苯磷酸；
(ⅲ)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和生色底物(例如对硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-methylumbelliferyl-β-D-半乳糖苷酶。
对本领域技术人员来说还有许多其它酶-底物组合。对这些组合的可总的参见美国专利4275149t 4318980。有时，标记物与抗体间接偶联。技术人员也知道各种获得所述组合的方法。例如，抗体可以与生物素偶联，上述三大类标记中的任何一种都可以与亲和素偶联，或者正相反。生物素选择性地结合亲和素，标记可以间接方式与抗体偶联。或者，为了将标记与抗体间接偶联，抗体可以与小的半抗原(例如地高辛)偶联，而上述不同类型的标记之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)偶联。这样就获得的标记与抗体的间接偶联。
在本发明另一实施方案中，抗ErbB3抗体不必被标记，其存在可以利用标记过的结合该ErbB3抗体的抗体来检测。
本发明抗体可以用在任一种已知的分析方法中，例如竞争性结合分析，直接或间接夹心分析和免疫沉淀分析。Zola,《单克隆抗体：技术手册》(MonocloneAntibodies:A Manual of Techniques),PP.147-158(CRC Press,Inc.,1987)。
竞争性结合分析依赖于标记过的标准物与被测样品中分析物竞争结合有限量抗体的能力。被测样品中ErbB3蛋白的量与与抗体结合的标准物的量成反比。为了方便测定被结合标准物的量，通常令抗体在竞争前或竞争后不溶解，这样就可以方便地将与抗体结合的标准物和分析物与未结合的标准物和分析物分离。
夹心分析法涉及使用两种抗体，各自结合待测蛋白不同的免疫原性部位或表位。在夹心分析中，被测样品分析物与固定在固体载体上的第一抗体结合，然后第二抗体与分析物结合，由此形成不溶性三部分复合物。参见美国专利4,376,110。第二抗体本身可以是用可检测部分标记过的(直接夹心分析法)，或者利用以可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体来测定(间接夹心分析法)。例如，夹心分析法之一是ELISA，其中的可检测部分是酶。
对于免疫组织化学来说，肿瘤样品可以是新鲜的或者冷冻的或者包在石蜡和以福尔马林之类防腐剂固定的。
抗体还可以用于体内诊断分析。通常，以放射性核素(例如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)标记抗体，使得可以利用免疫闪烁照相术来定位肿瘤。
E．诊断试剂盒
为了方便，本发明抗体可以试剂盒的形式提供，即一定量的反应剂与进行诊断分析的说明书的包装组合。如果抗体是用酶标记的，试剂盒将包含酶所需的底物和辅因子(例如提供可测定的生色团和荧光团的底物前体)。此外，还可能包括其它添加剂，例如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲剂或裂解缓冲剂)等。为了使所提供的试剂浓度能使得分析的灵敏度最高，各种试剂的相对量变化很大。具体地说，试剂可以是干粉，通常是冻干粉末形式的，可包括赋形剂在内，它们一经溶解将形成具有合适浓度的试剂溶液。
F．抗体的治疗用途
本发明的抗ErbB3抗体被认为可以用于治疗这样的病症，即发生了ErbB2-ErbB3复合物的过度激活，尤其是当所述的激活作用是由heregulin多肽介导的。可以用ErbB3抗体治疗的病况和疾病包括例如良性或恶性肿瘤(例如肾的、肝、肾膀胱、乳房、胃的、卵巢、结肠直肠、胰腺的、肺、外阴、甲状腺、肝癌；肉瘤；恶性胶质瘤和各种头颈部肿瘤)；白血病和恶性淋巴瘤；其它疾病例如神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔疾病；和炎症、血管生成性和免疫性疾病。
本发明抗体利用已知方法给哺乳动物，最好是人使用，所述方法例如静脉内的(例如静脉注射浓缩药团(bolus)或在一段时间内连续输注)，肌内，腹膜内，脑脊髓腔内、皮下、动脉内、滑膜腔内、鞘内注射、口服、局部或吸入途径使用。优选的是静脉内给抗体。
其它紧急方案可以与使用本发明抗ErbB3抗体相结合。例如，用本发明抗体治疗的患者可以同时接受放射物治疗。或者，另外给患者使用化疗剂。所述化疗剂的制备和剂量方案可以根据制造商的说明，或者由有经验的技术人员评经验来确定。这类化疗的制备和剂量方案在Chemotherapy Service Ed.,M.C.Perry,Williams和Wilkins,Baltimore,MD(1992)中也叙述了。化疗剂可以在使用抗体之前或之后使用，也可以同时使用。
较好的还可以使用抗其它肿瘤相关性抗原的抗体，例如结合EGFR,ErbB2,ErbB4或血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。可以给患者同时使用两种或两种以上抗ErbB3抗体。或者，还可以再给患者使用一种或多种细胞因子。
对于为了预防或治疗疾病来说，抗体的合适剂量将取决于上述定义的被治疾病的类型、疾病的严重程度和病程、抗体给予是用来预防还是用来治疗、以前的治疗、患者病史和对抗体的应答性，以及主治医师的处方决定。抗体适合一次性或系列地给患者使用。
根据疾病的类型和严重程度，不论是一次或多次分开给药，还是连续输注，1微克/公斤至15毫克/公斤(例如0.1-20毫克/公斤)的抗体是给患者使用的最初候选剂量。典型的日剂量可能在约1微克/公斤至100毫克/公斤或以上，这取决于上述提到的因素。对于几天或更长时间内的重复给药(这取决于病况)来说，治疗需持续至出现疾病症状有所期望的抑制。但是，也可以使用其它给药方案。所述治疗的进展可以方便地利用常规技术和分析方法来监测。
G．产品
本发明另一实施方案提供了一种含有用于治疗上述疾病的材料的产品。该产品包括容器和标签。合适的容器包括例如普通瓶、药瓶、注射器和试管。容器可以用各种材料制成，例如玻璃或塑料。容器中含有治疗疾病的有效组合物，并具有一个无菌的出人口(例如容器可以是具有一个塞子的静脉输液袋或药瓶，该塞子可用皮下注射针头穿透)。该组合物中的有效成份是抗ErbB3抗体。容器上或与容器相联的标签说明组合物是用于治疗特定病症的。产品还可以含有另一个容器，其中包含药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、林格氏(Ringer)溶液和葡萄糖溶液。根据商业上的需要或使用者的需要，它还可以包括其它材料，例如其它缓冲液，稀释剂，滤器，针头，注射管，包装附属品，以及使用说明。
H．材料的保藏
以下杂交瘤细胞系已经在美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,USA(ATCC)保藏：
杂交瘤/抗体名称    ATCC No.    保藏日期
8B8                HB-12070    1996年3月12日
以上保藏是根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定及其有关条款进行的。由此保证培养物在自保藏日起的30年内有活性。根据布达佩斯条约的规定以及Genentech Inc.与ATCC签定的协定，可向ATCC获得所述细胞系，所述协定保证：(a)在本专利授权之前，由有关专员根据37CFR§1.14和35USC§122决定是否可以获得所述培养物，(b)一旦被授予了专利权，有关公众获得被保藏的培养物的所有限制都将从此永远消除。
本申请的受让人同意，如果在适宜的培养条件下，保藏的培养物死亡、丢失或损伤，将在得到通知后立即替换以相同培养物的活性样品。可以获得被保藏的细胞系不应理解成由此可以违反各国政府机关根据其专利法授予的权利来实施本发明。
以上书面说明应该足以使得本领域一般技术人员能够实施本发明。本发明的范围并不局限于被保藏的培养物，因为所保藏的只是本发明内容之一的一个证明，任何功能上与此相当的培养物都在本发明范围之内。此处材料的保藏并不是承认此处的说明书不足以使得本发明的任何内容，包括最佳实施方案得以实施，也不应该将它理解成将权利要求的范围局限于文中具体的说明。实际上，根据前文所述，除了文中所示和所述的之外，本发明的各种修改形式对本领域一般技术人员来说，都将通过前面的描述中变得显而易见，这些都属于本发明权利要求范围之内。
关于欧洲专利申请的指定国，在公告被授予欧洲专利权或申请被驳回或撤回或视为撤回之日前，被保藏微生物的样品只能发放给由样品请求人指定的专家来获得。(EPC第28(4))
以下实施例是对本发明的说明而非限定。在本说明书中引用的所有公开文献都已清楚地表明在此引作参考。
                              实施例
                        抗ErbB3抗体的产生
本实施例说明了具有在此所述特性的抗ErbB3抗体的产生。
                            材料与方法
细胞系。人骨髓性白血病细胞系K562(据Northern印迹杂交分析，缺乏Ⅰ类亚族受体蛋白酪氨酸激酶)和人卵巢癌细胞系Caov3由美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)获得。两者都培养在补充以10％胎牛血清、2mM谷胺酰胺、100单位/毫升青霉素100微克/毫升链霉素和10mM HEPES(“生长培养基”)的RPMI1640培养基中。
K562细胞的稳定转染。转染K562细胞系并挑选出ErbB3表达克隆。简而言之，将erbB3cDNA亚克隆到pcDNA-3哺乳动物细胞表达载体(Invitrogen)中，通过电穿孔(electroporation)引入K562细胞(1180mF,350V)。转染后的细胞培养在含0.8mg/ml G418的生长培养基中。通过有限稀释获得抗性克隆，并利用Western印迹杂交和heregulin(HRG)结合分析测定ErbB3的表达。ErbB3表达克隆4E9H3被用于本报告所述的实验。佛波酯刺激被发现明显加强K562转染子内ErbB3的表达。因此，在用于下文各种分析之前，4E9H3细胞被放在含10纳克/毫升佛波-12-豆蔻酸乙酸酯(PMA)的生长培养基中培养过夜。
抗体。ErbB3蛋白的特异性单克隆抗体是抗以下受体的重组片段产生的，即受体的细胞外功能区(ECD)在其氨基末端与单克隆抗体5B6的Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV Ⅰ)糖蛋白D(gD)表位融合的重组片段。ErbB3信号序列的编码序列被gD多肽内1-53氨基酸的编码序列取代。氨基酸1-25编码gD的信号序列而氨苯酸26-53含有针对单克隆抗体5B6的表位。参见WO95/14776。得到的结构物，gD.ErbB3.ECD利用抗gD抗体亲和色谱柱来纯化。如下进行免疫。雌性Balb/c小鼠(Charles River)先足底注射以100微升RIBI’s TM佐剂(RibiImmunochemResearch,Inc,.Hamilton,MT)中的5微克gD.ErbB3.ECD。每二周用5微克gD.ErbB3.ECD在足底对动物进行加强免疫，共两次，最后，足底注射以5微克gD.ErbB3.ECD。最后一次免疫后的3天，取出淋巴结，制备用于PEC融合的单细胞悬浮液。
纯化单克隆抗体，并通过固相和液相ELISA测定其与ErbB2和ErbB4的交叉反应性。有关固相ELISA，用1微克/毫升ErbB2.ECD,gD.ErbB3.ECD或gD.ErbB4.ECD包被96孔微量滴定板，过夜。加入1微克/毫升的抗ErbB3 Mab，在室温下(RT)孵育1小时，洗涤后加以与HRPO偶联的山羊抗鼠(gam)IgG。进行ELISA，在490纳米处读数。有关液相ELISA，用1微克/毫升gamIgG(Fc特异性)包被96孔微量滴定板，过夜。加入1微克/毫升的抗ErbB3 Mab，在室温下(RT)孵育1小时，洗涤后加以生物素标记的ErbB2.ECD,gD.ErbB3.ECD或gD.ErbB4.ECD。该反应在室温下进行1小时，洗涤后加以HRPO链霉亲和素。进行ELISA，在490纳米处读数。在本分析中，抗ErbB3抗体不与ErbB2或ErbB4交叉反应。
通过木瓜蛋白酶消化产生3-8D6抗体的Fab片段。通过A蛋白亲和性色谱然后凝胶过滤色谱去除未消化的IgG和Fc片段。SDS-PAGE和以Fc特异性抗体为探针的Western印迹杂交未在Fab集合中检测到任何IgG。
HRG结合分析。所有HRG结合实验都使用β1同种型的EGF样功能区，即HRGβ1177-244(Sliwkowski等，生物化学杂志269:14661-5(1994))。在没有(对照)和有100nM ErbB3抗体存在下，将5.0×1044E9H3细胞与100pM 125I-HRG在0℃培养一夜，由此就其对HRG结合的作用筛选ErbB3抗体组。无关IgG被用作阴性对照。在一96孔过滤器(Millipore)中收获细胞并用冰冷的分析用缓冲液(含10mM HEPES的RPMI培养基，pH=7.2)洗涤。然后取出滤器计数。
至于抗体剂量依赖性实验，4E9H3细胞与100pM 125I-HRG在抗体浓度不断增加下一起培养。在没有(对照)或有100nM抗体或Fab片段存在下测定HRG亲和性量度。所述实验是以竞争性抑制的方式进行的，即不断增加未标记HRG而固定125I-HRG浓度不变(35pM)。对于对照实验(无抗体)，对每份样品使用1×105的4E9H3细胞。由于分析的动力学范围限制，在抗体或Fab片段存在下用于结合的4E9H3细胞数量被减少至每份样品2.5×104的。
抗体对HRG刺激的磷酸化作用的减弱。天然表达ErbB2和ErbB3的Caov3细胞在室温下与250nM抗ErbB3抗体3-8D6，该抗体的Fab片段或缓冲液(对照)一起预培养60分钟。已知阻断HRG刺激的ErbB2磷酸化作用的抗ErbB2抗体，2C4(Fendly等，癌症研究50:1550-1558(1990))被用作阳性对照。然后，细胞在室温下接受最终浓度为10nM的HRG刺激8分钟，或者不接受刺激。通过去除上清液并将细胞溶解在SDS样品缓冲液中来终止反应。然后用裂解产物进行SDS-PAGE。用与辣根过氧化物酶偶联的抗磷酸酪氨酸(Transduction Labs)检测凝胶的Western印迹杂交，用化学发光底物(Amersham)来显影印迹。用Holmes等在科学256:1205-1210(1992)中所述的反射比扫描光密度计扫描印迹。
抗体减少ErbB2-ErbB3蛋白复合物形成。Caov3细胞与缓冲液(对照)、250nM抗ErbB3抗体3-8D6或其Fab片段，或抗ErbB2抗体(2C4)在室温下预培养60分钟，然后用10nM HRG或对照缓冲液处理10分钟。在(“裂解缓冲液”)25nMTris,pH=7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,1.0％Triton X-100TM,1.0％CHAPS,10％v/v甘油，并含0.2mM PMSF,50m TU/ml抑蛋白酶肽(aprotinin)和10mM亮抑蛋白酶肽(1eupeptin)中裂解，粗裂解产物经粗略离心去除不溶性物质。将上清液和与不溶性载体(Affi Prep-10TM,Bio-Rad)共价偶联的3E8即ErbB2的特异性单克隆抗体(Fendly等，癌症研究50:1550-1558(1990))一起孵育。孵育在4℃过夜。免疫沉淀物用冰冷的裂解缓冲液洗涤两次，重悬在最小体积的SDS样品缓冲液中，进行SDS-PAGE。然后用多克隆抗ErbB3抗体(Santa CruzBiotech)检测凝胶的Western印迹杂交。如Holmes等在科学256:1205-1210(1992)中所述用反射比扫描光密度计扫描印迹杂交。在用ECL化学发光底物显影后，将印迹剥下再用多克隆抗ErbB2(Santa Cruz Biotech)检测。用抗ErbB2重复进行检测的印迹记图显示，每份样品免疫沉淀出等量的ErbB2。
                            结果
对一组抗ErbB3胞外功能区的单克隆抗体分析了其影响HRG与ErbB3结合的能力。最初的筛选是通过在125I-HRG存在下将最终浓度为100nM的各纯化抗体与4E9H3细胞一起培养来进行的。4E9H3细胞是人骨髓性白血病细胞系K562的ErbB3转染子。K562细胞系不表达内源ErbB受体或HRG。所以，heregulin与4E9H3细胞结合只可能通过ErbB3发生。样品在冰上培养一夜之后，计数结合的细胞数。如图1所示，与对照(无抗体)相比，抗RrbB3单克服抗体中的两种(2F9和3E9)减少了与4E9H3细胞结合的125I-HRG的量。但是，其它几种抗体明显加强了配体的结合。以上结果显示，这些抗ErbB3抗体能够提高HRG结合的亲和性和/或提高HRG结合位置的利用度。为了进一步表述这些抗体对HRG与ErbB3结合的影响，用加强HRG结合的3-8D6抗体进行了剂量依赖性实验。在浓度不断提高的3-8D6抗体存在下将4E9H3细胞与100pM125I-HRG一起培养。在冰上培养一夜后测定结合细胞数。结果以结合细胞数量对抗体浓度作图显示在图2中。HRG结合的加强与抗体浓度的升高之间存在着相关性。heregulin结合在10至100nM IgG之间达到饱和。3-8D6抗体的EC50值为722pM。对于两种抗体，都没有观察到剂量应答曲线在高抗体浓度时的下降。
在所述抗体存在下测定了HRG结合的Scatchard分析，结果列于表1。
                   表1
数据组          Kd         位置/细胞
对照         1.2×10-9     3.6×105
MAb 3-8D6    2.1×10-10    2.4×105
FAb 3-8D6    2.8×10-10    2.9×105
无抗体时，HRG与ErbB3结合的Kd经测定为1200pM，这与过去测得的HRG结合ErbB3的亲和性量度是一致的。每个细胞上的结合位置数量经测定为36,000。在抗体3-8D6存在下，HRG结合的测得结合常数显著升高至210pM。但是，在3-8D6存在下，HRG结合位置数量并没有增加。
为了确定ErbB3配体结合亲和性的升高是否依赖于抗体的二价化，在100nM木瓜蛋白酶消化3-8D6抗体制得的Fab片段存在下进行HRG结合实验。用于所述实验的Fab片段是经A蛋白亲和色谱和凝胶过滤色谱纯化的。在纯化制剂中经SDS-PAGE测定没有完整的IgG。如图3所示，HRG结合在完整抗体或由其产生的Fab片段存在下几乎是一致的。对以上数据的Scatchard分析得出在Fab存在下HRG结合的解离常数为280pM，由该实验测得的每个细胞上的受体个数也与对照基本相同。以上数据与图2所示一致，在图2中，完整抗体的剂量应答曲线在高抗体浓度时表现为平台而不是钟形曲线，此时发生的可能是单价抗体结合。与任何理论无关，以上数据表明，在以上抗体存在下观察到的HRG结合的改变并不需要二价抗体存在。
接着，用共表达ErbB2和ErbB3的卵巢肿瘤细胞系Caov3测定3-8D6抗体在受体酪氨酸磷酸化分析中的作用。细胞在与3-8D6抗体(250nM)或缓冲液(对照)预培养60分钟后接受10nM HRG的刺激。用抗磷酸化酪氨酸检测Western印迹杂交来分析全细胞裂解液。HRG处理没有激发4E9H3细胞内的磷酸化作用。用3-8D6抗体处理4E9H3细胞既不诱导ErbB3本身的磷酸化，对Caov3细胞内的酪氨酸磷酸化也没有作用。在用HRG刺激后，在一分子量约为180kDa的蛋白质上检测到一标记过的酪氨酸磷酸化信号。用ErbB2的特异性抗体2C4处理Caov3细胞能够封闭HRG介导的酪氨酸磷酸化信号。当细胞在用HRG刺激之前用抗ErbB3抗体3-8D6处理时，酪氨酸磷酸化也降低。通过对全细胞裂解产物抗磷酸酪氨酸印迹的扫描光密度观察到，在180至185kDa,3-8D6抑制磷酸化信号达约80％(76％至84％不等)。该信号是由ErbB3和ErbB2两者上的酪氨酸磷酸残基产生的。与对照相比，用由3-8D6抗体制得的Fab片段处理Caov3细胞也降低180kDa条带的HRG激发的磷酸化。但是，Fab的抑制活性略低于完整抗体。
只表达ErbB3的细胞上由3-8D6抗体介导的受体亲和性升高与ErbB2和ErbB3共表达相关的亲和性升高一样。而且，该抗体在表达两种受体的细胞内抑制HRG激发的ErbB2激酶活性。为了测定抗ErbB3抗体是否与ErbB2直接竞争与ErbB3的结合，用Caov3细胞进行了一系列共免疫沉淀实验。细胞与抗体或缓冲液(对照)一起预培养，然后用10nM HRG处理10分钟。然后用抗ErbB2的单克隆抗体进行细胞裂解产物的免疫沉淀。然后通过Western印迹杂交分析沉淀物中是否存在ErbB3。实验结果显示，HRG激发的细胞裂解产物的ErbB2免疫沉淀物中存在ErbB3，但在未激发裂解产物中没有。以上数据表明HRG在Caov3细胞中引发ErbB2-ErbB3复合物的形成。在以抗ErbB2单克隆抗体2C4处理的样品的免疫沉淀物中没有检测到ErbB3。在细胞用HRG激发前用3-8D6抗体或由其制得的Fab片段预培养时，观察到了ErbB3信号的明显减弱。这表明3-8D6抗体抑制HRG处理后ErbB2-ErbB3复合物的形成。对抗ErbB2免疫沉淀物的抗ErbB3Western印迹杂交的扫描光密度测定显示，抗ErbB3信号(表明ErbB2-ErbB3复合物的存在数量)被3-8D6削弱约80％(71％-90％)。用抗ErbB3检测重复印迹时，在每个泳道中都存在对等量的ErbB2。
                                 序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：Genentech,Inc.(ⅱ)发明名称：ErbB3抗体(ⅲ)序列数量：5(ⅳ)联系地址：
 (A)地址：Genentech,Inc.
 (B)街道：460 Point San Bruno Blvd
 (C)城市：South San Francisco
 (D)州：California
 (E)国家：USA
 (F)邮政编码：94080(ⅴ)计算机可读吸收：
 (A)媒质类型：3.5英寸，1.44Mb软盘
 (B)计算机：IBM PC兼容机
 (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
 (D)软件：WinPatin(Genentech)(ⅵ)当前申请信息：
 (A)申请号：
 (B)申请日：
 (C)分类：(ⅷ)律师/代理人信息：
 (A)姓名：Lee,Wendy M.
 (B)注册编号：40,378
 (C)参考/卷宗编号：P1003PCT  (ⅸ)通讯信息：
(A)电话：415/225-1994
(B)传真：415/952-9881
(C)电传：910/371-7168(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：11氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述：Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro1               5                    10  11(2)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：7氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述：His Gln Ser Leu Gly Thr Gln1               5       7(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：
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(D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述：His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys1               5           8(2)SEQ ID NO:5的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：8氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述：Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln1               5           8

Claims (21)

1．一种抗体，它结合ErbB3蛋白，并在表达ErbB2和ErbB3的细胞内减少heregulin诱导的ErbB2-ErbB3蛋白复合物的形成。
2．根据权利要求1所述的抗体，它还提高heregulin对ErbB3蛋白的结合亲和性。
3．根据权利要求1所述的抗体，它还在细胞内降低heregulin诱导的ErbB2活性。
4．根据权利要求1所述的抗体，它是单克隆抗体。
5．根据权利要求1所述的抗体，它是人源化的。
6．根据权利要求1所述的抗体，它是人抗体。
7．根据权利要求1所述的抗体，它是抗体片段。
8．根据权利要求8所述的抗体片段，它是一段Fab片段。
9．根据权利要求1所述的抗体，它是标记过的。
10．根据权利要求1所述的抗体，它被固定化在固相上。
11．一种抗体，它结合ErbB3蛋白并提高heregulin对ErbB3蛋白的结合亲和性。
12．一种抗体，它结合ErbB3蛋白并在表达ErbB2和ErbB3的细胞内降低heregulin诱导的ErbB2活性。
13．一种抗体，它结合ErbB3蛋白并减少heregulin与之的结合。
14．根据权利要求13所述的抗体，它还在表达ErbB2和ErbB3的细胞内降低heregulin诱导的ErbB2活性。
15．根据权利要求1所述的抗体，它结合由8B8抗体结合的表位。
16．根据权利要求1所述的抗体，它具有8B8抗体的互补性决定区。
17．一种组合物，含有权利要求1所述的抗体和药学上可接受的载体。
18．产生权利要求1所述抗体的细胞系。
19．根据权利要求18所述的细胞系，它是产生8B8抗体的杂交瘤细胞系。
20．测定ErbB3蛋白的存在的方法，它包括将被怀疑含有ErbB3蛋白的细胞与权利要求1所述的抗体接触，测定所述抗体与细胞的结合。
21．一种试剂盒，其中包含权利要求1所述的抗体和使用所述抗体检测ErbB3蛋白的说明书。
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