CN1922208A - 用于抑制c－met二聚化及活化的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于调节HGF/c－met信号传导途径的组合物和方法，具体而言，使用能够干扰c－met多聚化的c－met拮抗剂调节c－met二聚化和/或配体与c－met的结合。

Description

用于抑制C-MET二聚化及活化的方法和组合物
相关申请
本申请是按照37 CFR 1.53(b)(1)提交的非-临时申请，请求2003年12月11日提交的申请号为60/528,909的临时申请的优先权，该文献内容在此全文引入作为参考。
技术领域
广义而言，本发明涉及分子生物学及生长因子调控领域。更具体地说，本发明涉及HGF/c-met信号传导途径的调节因子，以及所述调节因子的用途。
背景技术
HGF是一种间充质-衍生的多效性因子，对大量不同细胞类型具有促有丝分裂、动力产生和细胞成形的活性。HGF作用是通过一种特异性酪氨酸激酶c-met来介导的，异常的HGF及c-met表达多见于各种肿瘤。参见，例如，Maulik et al.，Cytokine & Growth Factor Reviews(2002)，13：41-59；Danilkovitch-Miagkova & Zbar，J.Clin.Invest.(2002)，109(7)：863-867。HGF/c-Met信号传导途径的调控与肿瘤发展及转移有关。参见，例如，Trusolino & Comoglio，Nature Rev.(2002)，2：289-300)。
HGF能够与Met受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞外结构域结合，调节各种生物反应，例如细胞分散、增殖及存活。HGF-Met信号传导对于正常的胚胎发育，特别是肌肉祖细胞的迁移以及肝脏和神经系统的发育是必不可少的(Bladt et al.，1995；Hamanoue et al.，1996；Maina et al.，1996；Schmidtet al.，1995；Uehara et al.，1995)。Met敲除与HGF敲除小鼠的发育表型非常相似，表明HGF是Met受体的同源配体(cognate ligand)(Schmidt et al.，1995；Uehara et al.，1995)。另外，HGF-Met还在肝脏再生、脉管生成，和伤口愈合中发挥作用(Bussolino et al.，1992；Matsumoto and Nakamura，1993；Nusratet al.，1994)。Met受体前体经过蛋白水解切割为通过二硫键连接在一起的细胞外α亚单位和跨膜β亚单位(Tempest et al.，1988)。所述的β亚单位含有胞质激酶结构域，在C-末端上含有多-底物锚定位点(docking site)，接头蛋白就是结合于此处启动信号传导(Bardelli et al.，1997；Nguyen et al.，1997；Pelicci et al.，1995；Ponzetto et al.，1994；Weidner et al.，1996)。当HGF结合时，Met的活化分别通过Gab1及Grb2/Sos介导的PI3-激酶和Ras/MAPK活化导致酪氨酸激酶的磷酸化和下游的信号转导，从而驱动细胞的运动和增殖(Furge et al.，2000；Hartmann et al.，1994；Ponzetto et al.，1996；Royal and Park，1995).
Met能够转化致癌物-处理过的骨肉瘤细胞系(Cooper et al.，1984；Parket al.，1986)。在多种人的癌症中发现了Met的过表达或基因-扩增。例如，Met蛋白在结肠直肠癌中过表达了至少5倍，并且在肝转移中是基因扩增的(gene-amplified)(Di Renzo et al.，1995；Liu et al.，1992)。另外还有报道Met蛋白过表达于口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾细胞癌、乳腺癌及肺癌(Jin etal.，1997；Morello et al.，2001；Natali et al.，1996；Olivero et al.，1996；Suzuki etal.，1994)。此外，还发现在肝细胞癌、胃癌，和结肠直肠癌中也有mRNA的过表达(Boix et al.，1994；Kuniyasu et al.，1993；Liu et al.，1992)。
在肾乳头状癌中发现Met的激酶结构域中有大量突变，导致组成型受体活化(Olivero et al.，1999；Schmidt et al.，1997；Schmidt et al.，1999)。这些活化突变赋予组成型Met酪氨酸磷酸化，导致MAPK活化，病灶形成及肿瘤发生(Jeffers et al.，1997)。此外，这些突变加强了细胞移动及侵入(Giordanoet al.，2000；Lorenzato et al.，2002)。转化后的细胞中的HGF-依赖性Met活化能介导加强的运动、分散及迁移，最终导致侵入性的肿瘤生长及转移(Jeffers et al.，1996；Meiners et al.，1998)。
现已发现Met能够与驱动受体活化、转化及侵入的其他蛋白质相互作用。在瘤形成的细胞中，Met能够与α6β4整联蛋白相互作用，加快HGF-依赖性的侵入生长，α6β4整联蛋白是细胞外基质(ECM)成分例如层粘连蛋白的受体(Trusolino et al.，2001)。此外，已经证实所述的Met的细胞外结构域能与semaphorin家族成员plexin B1相互作用，从而加快侵入性生长(Giordano et al.，2002)。另外，还发现：与肿瘤发生及转移有关的CD44v6能够与Met和HGF形成复合体，从而导致Met受体活化(Orian-Rousseau et al.，2002)。
Met是受体酪氨酸激酶(RTKs)亚家族的成员，该家族包括Ron和Sea(Maulik et al.，2002)。Met细胞外结构域的结构测定表明其与semaphorins和plexins之间具有同源性。Met的N-末端含有大约500个氨基酸的Sema结构域，该结构域保守存在于所有的semaphorins和plexins中。所述semaphorins和plexins属于一个大的分泌型及膜结合型蛋白质家族，该家族首先报道了在神经发育中所起的作用(Van Vactor and Lorenz，1999)。但是，更近的研究发现semaphorin过表达与肿瘤侵入及转移有关。发现于plexins、semaphorins和整联蛋白中的富含半胱氨酸的PSI结构域(又称Met相关序列结构域)位于其后接有4个IPT重复单元的Sema结构域的附近，这4个重复单元是在plexins及转录因子中发现的免疫球蛋白-样区域。最近研究表明Met Sema结构域足以结合HGF及肝素(Gherardi et al.，2003)。
Met激酶结构域的作用已经进行了详细地研究，但是Met的细胞外结构域还知之甚少。尽管大家都知道HGF结合Met的细胞外结构域导致受体活化，但是还不清楚，哪个亚-结构域，如果有，参与了受体的二聚化。但是，显然如果能够阐明Met细胞外结构域中的亚-结构域在活化HGF/c-met信号转导轴中的作用(如果有的话)，那么将会为靶向治疗的设计带来明显益处，例如并且尤其是在涉及Met受体本身功能异常的临床情况中。
本申请中引用的所有文献，包括专利申请及公开文本，在此全文引入作为参考。
发明内容
本发明是部分建立在下述试验结果基础上的：肝细胞生长因子受体c-met的二聚化是一个生物/细胞过程，是一个重要且有利的治疗靶标。本申请发现：破坏该过程可有效地抑制与细胞生长有关的细胞信号传导途径的活化，这种活化与许多疾病状态例如癌症中的细胞生长失调有关。本发明还进一步以下述发现为基础：在影响c-met二聚化进而活化HGF/c-met信号转导轴中，必需的和/或发挥重要作用的是c-met蛋白质的某些而非所有的结构域。本发明还提供了以干扰HGF与c-met细胞外部分特异性结构域间结合为基础的组合物和方法。鉴定出c-met二聚化或c-met与同源配体结合中所需的c-met特异性部分，能为更好地优化针对下述病理状况的预防和/或治疗方法提供独一无二且有益的靶标，所述病理状况即与HGF/c-Met途径异常或不良信号传导有关的病理状况。因此，本发明提供了与调节HGF/c-met途径有关的方法、组合物、试剂盒及制品，包括对c-met配体结合、c-met二聚化、活化以及其他与HGF/c-met信号转导有关生物/生理活性的调节。
在一个方面，本发明提供了干扰所述HGF/c-met信号传导途径的c-met拮抗剂。例如，本发明提供了一种能干扰c-met二聚化的c-met拮抗剂。一个实施方案中，本发明所述的c-met拮抗剂能干扰c-met Sema结构域的二聚化功能(即，Sema结构域能够在影响受体二聚化中发挥作用)。一个实施例中，c-met拮抗剂能干扰c-met Sema结构域影响c-met二聚化的能力。干扰可以是直接的或间接的。例如：，c-met拮抗剂可以与所述c-met sema结构域中的一段序列结合，从而抑制所述结合结构域与其结合伴侣(例如另一c-met分子)间的相互作用。另一实施例中，c-met拮抗剂与位于所述c-metsema结构域之外的一段序列结合，但是所述结合能破坏c-met Sema结构域与其结合伴侣(例如另一c-met分子)间的相互作用。一个实施方案中，本发明的拮抗剂能结合c-met(例如，所述细胞外结构域)从而干扰c-met的二聚化。一个实施方案中，本发明的拮抗剂与c-met结合从而干扰c-met Sema结构域影响c-met二聚化的能力。例如，一个实施方案中，本发明提供了一种拮抗剂，该拮抗剂与c-met分子结合时能抑制所述分子的二聚化。一个实施方案中，本发明的c-met拮抗剂能够与c-met Sema结构域中的一段序列特异性地结合。
一个实施方案中，本发明的拮抗剂能干扰c-met的二聚化包括均二聚作用。一个实施方案中，本发明的拮抗剂能干扰c-met的二聚化包括异二聚作用(即，c-met与非-c-met分子间的二聚化)。
在一些情况下，获得一种不妨碍配体(例如HGF)与c-met间结合的c-met拮抗剂是有利的。因此，一些实施方案中，本发明的拮抗剂不能结合c-met上的配体(例如HGF)结合位点。另一个实施方案中，本发明的拮抗剂基本上不能抑制配体(例如，HGF)与c-met的结合。一个实施方案中，本发明的拮抗剂基本上不与配体(例如，HGF)竞争性地结合c-met。一个实施例中，本发明的拮抗剂可用于偶联一种或多种其他拮抗剂，其中所述拮抗剂靶向HGF/c-met轴中的不同过程和/或功能。因此，一个实施方案中，本发明的c-met拮抗剂与c-met上的表位结合，而该表位是与另一种c-met拮抗剂结合的表位不同的表位，例如用保藏号为ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)的杂交瘤细胞系制备的单克隆抗体Fab片段。另一个实施方案中，本发明的c-met拮抗剂不同于(即不是)用保藏号为ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)的杂交瘤细胞系制备的单克隆抗体Fab片段。一个实施方案中，本发明的c-met拮抗剂不含有用保藏号为ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)的杂交瘤细胞系所制备抗体的c-met结合序列。
在一些情况下，具有能干扰c-met二聚化以及配体结合的c-met拮抗剂是有利的。例如：，本发明的拮抗剂还可以进一步包括与HGF竞争性结合c-met的能力。
在本发明c-met拮抗剂的一个实施方案中，拮抗剂与c-met的结合能抑制HGF对c-met的活化。本发明所述c-met拮抗剂的一个实施方案中，所述拮抗剂与细胞中c-met的结合能抑制该细胞的增殖、分散、形态发生(morphogenesis)和/或运动(motility)。
一个实施方案中，本发明的c-met拮抗剂包含肽，该肽含有至少一部分c-met Sema结构域或其变体。一个实施例中，本发明的拮抗剂包含肽，该肽含有选自下列序列中的至少一种序列：LDAQT(SEQ ID NO：1)(例如，c-met中的第269-273位残基)，LTEKRKKRS(SEQ ID NO：2)(例如，c-met中的第300-308位残基)，KPDSAEPM(SEQ ID NO：3)(例如，c-met中的第350-357位残基)和NVRCLQHF(SEQ ID NO：4)(例如，c-met中的第381-388位残基)。另一实施例中，本发明的拮抗剂包含肽，该肽基本上由选自下列序列中的至少一种序列组成：LDAQT(SEQ ID NO：1)、LTEKRKKRS(SEQID NO：2)、KPDSAEPM(SEQ ID NO：3)和NVRCLQHF(SEQ ID NO：4)。一个实施方案中，所述肽含有序列LTEKRKKRS(SEQ ID NO：2)。一个实施方案中，所述肽基本上由LTEKRKKRS(SEQ ID NO：2)组成。一个实施方案中，所述肽含有序列LDAQT(SEQ ID NO：1)。一个实施方案中，所述肽基本上由LDAQT(SEQ ID NO：1)组成。一个实施方案中，所述肽含有序列KPDSAEPM(SEQ ID NO：3)。一个实施方案中，所述肽基本上由KPDSAEPM(SEQ ID NO：3)组成。一个实施方案中，所述肽含有序列NVRCLQHF(SEQ ID NO：4)。一个实施方案中，所述肽基本上由NVRCLQHF(SEQ ID NO：4)组成。一些实施方案中，所述肽是一种变体，其中含有与序列LDAQT(SEQ ID NO：1)，LTEKRKKRS(SEQ ID NO：2)，KPDSAEPM(SEQ ID NO：3)和/或NVRCLQHF(SEQ ID NO：4)具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％序列同一性的氨基酸序列，其中所述变体保留有能与c-met分子形成复合体的能力。一些实施方案中，这些肽中含有增强其抑制和/或治疗作用(包括，例如增强亲和力、提高药物动力学特性(例如半衰期、稳定性、清除率)、减少对受试者的毒性)的修饰。所述修饰包括，例如，涉及糖基化、PEG化(pegylation)、用非天然生成但功能等价的氨基酸、连接基团等取代的修饰。合适的修饰已为本领域所熟知，可以根据需要凭经验来决定。
一些实施方案中，本发明的c-met拮抗剂是或含有小分子(例如，有机分子)、肽(例如，低聚肽)、抗体、抗体片段、适体(aptamer)、寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸)，或其组合。
一些实施方案中，本发明的c-met拮抗剂通过本申请中本发明所述的筛选或鉴定方法获得。
另一方面，本发明提供了用于筛选或鉴定c-met拮抗剂的方法。一个实施例中，所述方法包括：让侯选物与表达c-met的细胞接触，在所述侯选物存在下所述细胞中的c-met二聚化和/或活化被抑制(用众多标准及方法中的任一种，本申请中记载了其中的一些)表明所述物质是c-met拮抗剂。另一实施例中，所述方法包括：让候选物质与其中含有至少一部分c-met Sema结构域的靶分子接触，据此选出能特异性结合所述靶分子的物质(称为c-met拮抗剂)。一些实施方案中，本发明所述的筛选方法进一步还包括：让被选物质与表达c-met的细胞接触，然后对该细胞中c-met二聚化的抑制情况进行测定(例如，对所述细胞中c-met二聚化程度进行检测或测量)。c-met二聚化的抑制情况可以采用本领域已知的众多方法，根据本领域已知的多种标准中的任一标准进行测定(一些在本申请中已详细描述)。例如，c-met二聚化抑制情况可以用c-met活化量的减少显示，也可以用细胞中c-met相关细胞信号转导量显示。细胞信号转导可以使用和依据本领域已知的大量方法及标准测定，其中的一些已在于本申请中描述。例如，HGF/c-met途径申细胞信号转导的发生在生物学上可以显示为所述信号传导途径中靶分子磷酸化的改变。因此，例如，可以对与HGF/c-met途径中一种或多种已知磷酸化靶标有关的蛋白质磷酸化的量进行测量。所述磷酸化靶标的实例包括c-met本身及促有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)。
在一个方面，本发明提供了其中含有本发明所述一种或多种拮抗剂以及载体的组合物。一个实施方案中，所述载体是药物学上可接受的。
在一个方面，本发明提供了编码本发明所述c-met拮抗剂的核酸。一个实施方案中，本发明所述核酸编码c-met拮抗剂，该拮抗剂是一种多肽或其中含有多肽(例如，低聚肽)。一个实施方案中，本发明所述核酸编码c-met拮抗剂，该拮抗剂是或含有抗体或其片段。
在一个方面，本发明提供了含有本发明所述核酸的载体。
在一个方面，本发明提供了含有本发明所述核酸或本发明所述载体的宿主细胞。载体可以是任一类型，例如一种重组载体例如一种表达载体。众多宿主细胞中的任意一种都可使用。一个实施方案中，宿主细胞是一种原核细胞，例如，大肠杆菌。一个实施方案中，宿主细胞是一种真核细胞，例如哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在一个方面，本发明提供了用于制备本发明所述拮抗剂的方法。例如，本发明提供了一种制备本身是或含有抗体(或其片段)的c-met拮抗剂的方法，所述方法包括：在合适的宿主细胞中表达编码所述抗体(或其片段)的重组载体，然后回收所述抗体。另一实施例中，本发明提供了一种制备本身是或含有多肽(例如低聚肽)的c-met拮抗剂的方法，所述方法包括：在合适的宿主细胞中表达编码所述多肽(例如低聚肽)的重组载体，然后回收所述多肽(例如低聚肽)。
一个方面，本发明提供了其中包括容器的制品；以及盛装于该容器中的组合物，其中所述组合物含有一种或多种本发明所述c-met拮抗剂。一个实施方案中，所述组合物含有本发明所述的核酸。一个实施方案中，含拮抗剂的组合物进一步还含有载体，一些实施方案中该载体是药物学可接受的。一个实施方案中，本发明所述的制品进一步还包括用于指导将组合物(例如，所述拮抗剂)施用至受试者的说明书。
在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其中含有第一包装物，该第一包装物其中含有一种或多种本发明所述c-met拮抗剂；以及其中含缓冲液的第二包装物。一个实施方案中，所述缓冲液是药物学上可接受的。一个实施方案中，含拮抗剂的组合物进一步还含有载体，一些实施方案中该载体是药物学可接受的。一个实施方案中，本发明所述的试剂盒进一步还包括用于指导将组合物(例如，所述拮抗剂)施用至受试者的说明书。
在一个方面，本发明提供了本发明所述c-met拮抗剂在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途，例如癌症、肿瘤、细胞增殖病症、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相关病症。所述c-met拮抗剂可以是本申请所述的任一形式，包括抗体、抗体片段、小分子(例如有机分子)、多肽(例如，低聚肽)、核酸(例如，寡核苷酸，如反义寡核苷酸)、适体，或其组合。
在一个方面，本发明提供了本发明所述核酸在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途，例如癌症、肿瘤、细胞增殖病症、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相关病症。
在一个方面，本发明提供了本发明所述表达载体在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途，例如癌症、肿瘤、细胞增殖病症、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相关病症。
在一个方面，本发明提供了本发明所述宿主细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途，例如癌症、肿瘤、细胞增殖病症、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相关病症。
在一个方面，本发明提供了本发明所述制品在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途，例如癌症、肿瘤、细胞增殖病症、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相关病症。
在一个方面，本发明提供了本发明所述试剂盒在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途，例如癌症、肿瘤、细胞增殖病症、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相关病症。
本发明提供了可用于调节与HGF/c-met信号转导轴失调有关的疾病状态的方法及组合物。所述HGF/c-met信号传导途径涉及多种生物学及生理功能，包括，例如，细胞增殖及血管生成。因此，，在一个方面，本发明提供了一种方法，其中包括向受试者施用能调节c-met胞外部分亚-结构域功能的物质/分子，从而调节HGF/c-met信号转导。一个实施方案中，所述亚-结构域包含全部或至少一部分c-met Sema结构域。
在一个方面，本发明提供了一种能抑制c-met活化的细胞增殖的方法，该方法包括：让细胞或组织与有效量的本发明所述c-met拮抗剂接触，从而抑制与c-met活化相关的细胞增殖。
在一个方面，本发明提供了一种治疗受试者与c-met活化失调相关的病理状况的方法，该方法包括：向受试者施用有效量的本发明所述c-met拮抗剂，从而治疗该病理状况。
在一个方面，本发明提供了一种用于抑制表达c-met或肝细胞生长因子或两者的细胞生长的方法，该方法包括：让所述细胞与本发明的c-met拮抗剂接触，从而引发对所述细胞生长的抑制。一个实施方案中，所述细胞与不同细胞所表达的HGF接触(例如，通过旁分泌作用)。
一个方面，本发明提供了一种对哺乳动物进行治疗性处理的方法，该哺乳动物患有含表达c-met或肝细胞生长因子或两者的细胞的癌性肿瘤，所述方法包括：向所述哺乳动物施用有效量的本发明所述c-met拮抗剂，从而有效治疗所述哺乳动物。一个实施方案中，所述细胞与不同细胞所表达的HGF接触(例如，通过旁分泌作用)。
一个方面，本发明提供了一种治疗或防止细胞增殖病症的方法，该细胞增殖病症与c-met表达或活性升高或者肝细胞生长加快或者两者相关，所述方法包括：向受试者施用有效量的本发明所述c-met拮抗剂，从而有效治疗或防止所述细胞增殖病症。一个实施方案中，所述增殖病症是癌症。
一个方面，本发明提供了一种用于抑制细胞生长的方法，其中所述细胞生长至少部分地取决于c-met或肝细胞生长因子或两者的生长加强作用，所述方法包括：让所述细胞与有效量的本发明所述c-met拮抗剂接触，从而抑制所述细胞的生长。一个实施方案中，所述细胞与不同细胞所表达的HGF接触(例如，通过旁分泌作用)。
一种治疗哺乳动物肿瘤的方法，其中所述肿瘤生长至少部分取决于c-met或肝细胞生长因子或两者的生长加强作用，所述方法包括：让所述细胞与有效量的本发明所述c-met拮抗剂接触，从而有效地治疗所述肿瘤。一个实施方案中，所述细胞与不同细胞所表达的HGF接触(例如，通过旁分泌作用)。
本发明所述的方法可用于任一适合的病理状态，例如，与HGF/c-met信号传导途径失调相关的细胞和/或组织。一个实施方案中，本发明所述方法中所靶向的细胞是一种癌细胞。例如：所述癌细胞可以选自：乳腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、乳头状癌细胞(例如，甲状腺)、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、中枢神经系统癌细胞、骨肉瘤细胞、肾脏癌细胞、肝细胞癌细胞、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞、头及颈部鳞状癌细胞、淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞以及血癌细胞。一个实施方案中，本发明所述方法中所靶向的细胞是一种高度增生性的(hyperproliferative)和/或增生性的(hyperplastic)细胞。一个实施方案中，本发明所述方法中所靶向的细胞是一种发育异常的细胞。另一个实施方案中，本发明所述方法中所靶向的细胞是一种转移性的细胞。
本发明所述方法还可以进一步包括补充处理步骤。例如，一个实施方案中，一种方法进一步还包括下述步骤：让靶细胞和/或组织(例如，癌细胞)经历放疗和/或化疗。
如本申请所述，c-met活化是一种重要的生物反应，它的失调会引发许多病理状况。因此，本发明所述方法的一个实施方案中，所靶向的细胞(例如，癌细胞)是具有下述特征的细胞：与相同组织来源的正常细胞相比，其中的c-met活化增强。一个实施方案中，本发明所述方法可引发靶细胞死亡。例如，与本发明的拮抗剂接触可以导致细胞无法通过c-met途径传导信号，因而导致细胞死亡或细胞生长受到抑制。
c-met活化(及因此而导致的信号传导)的失调可以起因于多种细胞变化，包括，例如，HGF(c-met同源配体)和/或c-met本身的过表达。因此，一些实施方案中，本发明所述方法包括以具有下述特征的细胞为靶细胞：与相同组织来源的正常细胞相比，该细胞所表达的c-met或肝细胞生长因子或两者以更高丰度表达。c-met-表达细胞可以受到多种来源的HGF的调节，即以自分泌或旁分泌方式。例如，本发明所述方法的一个实施方案中，靶细胞与不同细胞中表达的或表达出的肝细胞生长因子接触/结合(例如，通过旁分泌作用)。所述不同的细胞可以来自与靶细胞相同或不同的组织来源。一个实施方案中，靶细胞是与靶细胞本身表达的HGF接触/结合(例如，通过自分泌作用/回路)。C-met活化和/或信号转导还可以不依赖配体单独发生。因此，在本发明所述方法的一个实施方案中，靶细胞中的c-met活化不依赖配体单独发生。
附图简述
图1.Met缺失突变体的简图
从N-末端对Met胞外结构域进行了亚-结构域缺失，并在TM区后加了V5/His标签。每一突变体的N-末端都附加了Met信号肽(S.P.)序列。缩写对应含义如下：Sema-semaphorin；PSI-plexin，semaphorin，整联蛋白；plexins中的IPT-免疫球蛋白样区及转录因子；和TM-跨膜。Sema区上的箭头指向Met蛋白水解位点。
图2.Sema结构域是Met交联所必需的
A：将Met缺失突变体转染入293细胞，并与递增浓度的硫代-EGS接触。取10μg裂解物进行4-12％SDS-PAGE电泳分析，然后用V5抗体进行免疫印迹测试。EC-M代表单体EC-WT，EC-D代表二聚体的EC-WT。星号表示有未处理的EC-WT存在。
B：将EC-WT-Flag和EC-WT-V5/His转染入293细胞，然后与递增浓度的硫代-EGS接触，裂解，用V5或Flag抗体免疫沉淀，然后进行8％SDS-PAGE电泳分析。将免疫沉淀样本用Flag或V5抗体作免疫印迹分析。
图3.HGF和抗-Met抗体(本申请中称为“5D5”)结合Met的Sema结构域
A：用指定的加有Met V5/His标签的构建体转染293细胞，用V5抗体免疫沉淀，4-12％SDS-PAGE电泳，用His抗体免疫印迹。
B：将A中得到的免疫沉淀物用5μg HGF孵育。将样本进行4-12％SDS-PAGE电泳，然后用能识别α链的HGF抗体进行免疫印迹分析。加入10ngHGF作为阳性对照。
C：B中的免疫沉淀和免疫印迹都使用scHGF(R494E)进行。作为阳性对照，15ng scHGF(R494E)用样本进行了分析。
D：用指定构建体转染293细胞，4-12％SDS-PAGE电泳，用V5抗体进行免疫印迹分析。
E：将D中的转染裂解物用抗-Met 5D5抗体免疫沉淀，然后用His抗体进行免疫印迹分析。
F：B中的硝酸纤维素膜用Met C-12抗体再探测。
图4.肿瘤细胞系中内源c-Met的交联
向已经经受了血清-饥饿的293，H441，MDA-MB-435和A549细胞加入递增浓度的硫代-EGS。交联前，A549细胞再用100μg/ml HGF孵育。裂解物用Met C-12抗体作免疫印迹分析。带有*的条带表示未经处理的WT-Met。
图5.Met信号传导被rSemar和抗-Met 5D5-Fab抑制。Met的细胞外结构域可减弱Met信号传导
A：将A549细胞维持在无血清的培养基，然后用0、5、10、50或100μg/ml的rSema加10ng/ml HGF处理10分钟，用于磷酸-Met及磷酸-MAPK试验。裂解物用Met C-12抗体免疫沉淀，用磷酸酪氨酸抗体免疫印迹检测磷酸化的Met，然后用Met抗体免疫印迹。H441和MDA-MB-435细胞用0，5，10，或100μg/ml rSema加5或10ng/ml HGF分别处理5分钟。蛋白质用磷酸-MAPK检测，然后用MAPK抗体再探测。带*的条带代表未经处理的WT-Met。
B：对A中的数据用NIH Image软件定量，然后绘制为左侧的柱形图，其中含有每一样本之间磷酸化蛋白相对于非磷酸化蛋白的比例。右侧图表示的是来自另一实验的数据。
C：将A549，H441和MDA-MB-435细胞维持在无血清培养，用10μg/mlrSema或抗-Met 5D5-Fab处理。将这些样本用磷酸酪氨酸、Met、磷酸-MAPK或MAPK抗体进行免疫印迹分析。标*的条带表示未经处理的WT-Met。
D：将C中数据定量后，按照B中方法绘图。
E：用指定构建体转染A549细胞。通过用V5抗体免疫印迹，检测Met变体的表达。标*的条带表示未经处理的EC-WT。
F：(左)E中裂解物用Met C-12抗体免疫沉淀，然后用磷酸-酪氨酸抗体进行免疫印迹分析。印迹膜用Met抗体再探测。(右)裂解物用磷酸-MAPK免疫印迹分析，然后用MAPK再探测。
G：对F中的数据用NIH Image软件定量，然后绘制为左侧的柱形图，其中含有每一样本之间磷酸化蛋白相对于非磷酸化蛋白的比例。右侧图表示的是来自另一实验的数据。每一幅图中的柱形从左至右对应于F中的标出的泳道，分别为“模拟物”，“EC-WT”，“ΔS”，“ΔP”和“TM”。
图6.rSema和抗-Met 5D5-Fab抑制细胞运动
H441细胞划痕，在无血清培养基中用模拟物，rSema，抗-Met 5D5-Fab或HGF处理两天。进行4次相互独立的实验，给出了有代表性的数据。
图7.细胞迁移被rSema和抗-Met 5D5-Fab抑制
将MDA-MB-435细胞种植于每一跨孔上部腔室无血清培养基中，并用模拟物、rSema、或抗-Met 5D5-Fab处理。作为阳性对照，向模拟物-处理孔的下部腔室加入HGF。移动细胞用结晶紫染色。测量洗脱出的细胞的560nm处吸光度。3个独立的移动试验都一式两份平行进行，并给出了代表性图形。
本发明的实施方式
本发明提供了干扰HGF/c-met信号转导轴从而治疗和/或预防与所述轴失调相关病理状况的方法。本发明至少部分地建立在下列发现基础之上：阐明本申请所述c-met内亚结构域/子序列是配体结合和/或c-met受体二聚化(以及由此导致的c-met活化)所必需的。本发明进一步还提供了可用于本发明所述方法的组合物、试剂盒及制品。
本申请还提供了这些方法、组合物、试剂盒及制品的详细描述。
常规技术
本发明的实施，除非另有说明外，都采用本领域技术人员已知的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术。所述技术在多篇文献中有充分的解释，例如，“MolecularCloning：A Laboratory Manual”，second edition(Sambrook et al.，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait，ed.，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney，ed.，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press，Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，andperiodic updates)；“PCR：The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis et al.，ed.，1994)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”(Perbal Bernard V.，1988)。
定义
就一种肽(例如，VDWVCFRDLGCDWEL，LDAQT，LTEKRKKRS，KPDSAEPM，NVRCLQHF)或多肽而言，″氨基酸序列同一性百分比(％)″的定义为在序列对齐以及必要时为实现最大百分比序列同一性而引入缺口(gap)后，候选序列中的与特异性肽或多肽序列之间相同的氨基酸残基所占的百分比。为了测定氨基酸序列同一性百分比的对齐可以通过本领域已知的多种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定适于测量对齐的参数，包括为实现所比较序列全长范围的最大对齐所需的任一算法。但是，对于本申请目的而言，氨基酸序列同一性％数值可以使用序列比较的计算机程序ALIGN-2得到，其中ALIGN-2程序的全部源代码见下表A。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.公司编制，表A中显示的源代码已经在U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559中以用户文件备案，其美国版权登记号为No.TXU510087。ALIGN-2程序公众可以从Genentech，Inc.，South San Francisco，California获取，或者可以用下表A提供的源代码编程。ALIGN-2程序应该编制为可用于UNIX操作系统，优选数字化的UNIX V4.0D。所有序列比较参数都用ALIGN-2程序设定，且不改变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较时，给定的氨基酸序列A与给定的氨基酸序列B之间的氨基酸序列同一性％(也可以表述为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B之间的一定％的氨基酸序列同一性)可以用下列公式计算：
              100乘以X/Y的分数
其中X是在A和B程序对齐结果中被序列对齐程序ALIGN-2评分为完全匹配的氨基酸残基的数目，Y为序列B中的氨基酸残基的总数。应该理解的是：氨基酸序列A的长度并不等于氨基酸序列B的长度，A相对于B的氨基酸序列同一性％不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。
除非另外专门说明，本申请中使用的所有氨基酸序列同一性％数值都是用ALIGN-2电脑程序在前段中描述的方法获得的。
表A
/*

　　 *

　　 * C-C从12升至15

　   * Z为EQ的平均值

　　 * B为ND的平均值

　　 * match with stop is_M;stop-stop=0;J(joker)match=0

　　 */

　　#define_M-8      /* value of a match with a stop */

　　int_day[26][26]={

　　/*          A  B  C  D  E  F  G  H  I  J  K  L  M  N  O  P  Q  R  S  T  U  V
W  X  Y  Z */

　　/*A*/      {2,0,-2,0,0,-4,1,-1,-1,0,-1,-2,-1,0,_M,1,0,-2,1,1,0,0,-6,0,-3,0},

　　/*B*/      {0,3,-4,3,2,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,2,_M,-1,1,0,0,0,0,-2,-5,0,-3,1},

　　/*C*/      {-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2,0,-5,-6,-5,-4,_M,-3,-5,-4,0,-2,0,-2,-8,0,0,-5},

　　/*D*/      {0,3,-5,4,3,-6,1,1,-2,0,0,-4,-3,2,_M,-1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,2},

　　/*E*/      {0,2,-5,3,4,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,1,_M,-1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,3},

　　/*F*/      {-4,-5,-4,-6,-5,9,-5,-2,1,0,-5,2,0,-4,_M,-5,-5,-4,-3,-3,0,-1,0,0,7,-5},

　　/*G*/      {1,0,-3,1,0,-5,5,-2,-3,0,-2,-4,-3,0,_M,-1,-1,-3,1,0,0,-1,-7,0,-5,0},

　　/*H*/      {-1,1,-3,1,1,-2,-2,6,-2,0,0,-2,-2,2,_M,0,3,2,-1,-1,0,-2,-3,0,0,2},

　　/*I*/      {-1,-2,-2,-2,-2,1,-3,-2,5,0,-2,2,2,-2,_M,-2,-2,-2,-1,0,0,4,-5,0,-1,-2},

　　/*J*/      {0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},

　　/*K*/      {-1,0,-5,0,0,-5,-2,0,-2,0,5,-3,0,1,_M,-1,1,3,0,0,0,-2,-3,0,-4,0},

　　/*L*/      {-2,-3,-6,-4,-3,2,-4,-2,2,0,-3,6,4,-3,_M,-3,-2,-3,-3,-1,0,2,-2,0,-1,-2},

　　/*M*/      {-1,-2,-5,-3,-2,0,-3,-2,2,0,0,4,6,-2,_M,-2,-1,0,-2,-1,0,2,-4,0,-2,-1},

　　/*N*/      {0,2,-4,2,1,-4,0,2,-2,0,1,-3,-2,2,_M,-1,1,0,1,0,0,-2,-4,0,-2,1},

　　/*O*/      {_M,_M,_M，_M,_M,_M，_M，_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,
0,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M},

　　/*P*/      {1,-1,-3,-1,-1,-5,-1,0,-2,0,-1,-3,-2,-1,_M,6,0,0,1,0,0,-1,-6,0,-5,0},

　　/*Q*/      {0,1,-5,2,2,-5,-1,3,-2,0,1,-2,-1,1,_M,0,4,1,-1,-1,0,-2,-5,0,-4,3},

　　/*R*/      {-2,0,-4,-1,-1,-4,-3,2,-2,0,3,-3,0,0,_M,0,1,6,0,-1,0,-2,2,0,-4,0},

　　/*S*/      {1,0,0,0,0,-3,1,-1,-1,0,0,-3,-2,1,_M,1,-1,0,2,1,0,-1,-2,0,-3,0},

　　/*T*/      {1,0,-2,0,0,-3,0,-1,0,0,0,-1,-1,0,_M,0,-1,-1,1,3,0,0,-5,0,-3,0},

　　/*U*/      {0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},

　　/*V*/      {0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2,4,0,-2,2,2,-2,_M,-1,-2,-2,-1,0,0,4,-6,0,-2,-2},

　　/*W*/      {-6,-5,-8,-7,-7,0,-7,-3,-5,0,-3,-2,-4,-4,_M,-6,-5,2,-2,-5,0,-6,17,0,0,-6},

　　/*X*/      {0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},
        <!-- SIPO <DP n="15"> -->
        <dp n="d15"/>
　　/*Y*/      {-3,-3,0,-4,-4,7,-5,0,-1,0,-4,-1,-2,-2,_M,-5,-4,-4,-3,-3,0,-2,0,0,10,-4},

　　/*Z*/      {0,1,-5,2,3,-5,0,2,-2,0,0,-2,-1,1,_M,0,3,0,0,0,0,-2,-6,0,-4,4}

　　};

　　/*

　　 */

　　#include＜stdio.h＞

　　#include＜ctype.h＞

　　#defineMAXJMP    16  /* max jumps in a diag */

　　#defineMAXGAP    24  /* don′t continue to penalize gaps larger than this */

　　#defineJMPS      1024  /* max jmps in an path */

　　#defineMX     4  /* save if there′s at least MX-1 bases since last jmp */

　　#defineDMAT      3  /* value of matching bases */

　　#defineDMIS      0  /* penalty for mismatched bases */

　　#defineDINS0     8  /* penalty for a gap */

　　#defineDINS1     1  /* penalty per base */

　　#definePINS0     8  /* penalty for a gap */

　　#definePINS1     4  /* penalty per residue */

　　struct jmp{

　　  short        n[MAXJMP];/* size of jmp(neg for dely) */

　　  unsigned short   x[MAXJMP];/* base no.of jmp in seq x */

　　};                 /* limits seq to 2^16-1 */

　　struct diag{

　　  int      score;     /* score at last jmp */

　　  long     offset;    /* offset of prev block */

　　  short        ijmp;      /* current jmp index */

　　  struct jmp   jp;    /* list of jmps */

　　};

　　struct path{

　　  int spc;     /* number of leading spaces */

　　  short    n[JMPS];/* size of jmp(gap) */

　　  int x[JMPS];/* loc of jmp(last elem before gap) */

　　};
        <!-- SIPO <DP n="16"> -->
        <dp n="d16"/>
　　char      *ofile;          /* output file name */

　　char      *namex[2];       /* seq names:getseqs() */

　　char      *prog;           /* prog name for err msgs */

　　char      *seqx[2];        /* seqs:getseqs() */

　　int    dmax;            /* best diag:nw() */

　　int    dmax0;           /* final diag */

　　int    dna;        /* set if dna:main() */

　　int    endgaps;        /* set if penalizing end gaps */

　　int    gapx,gapy;      /* total gaps in seqs */

　　int    len0,len1;      /* seq lens */

　　int    ngapx,ngapy;    /* total size of gaps */

　　int    smax;           /* max score:nw() */

　　int    *xbm;           /* bitmap for matching */

　　long      offset;          /* current offset in jmp file */

　　struct diag*dx;       /* holds diagonals */

　　struct path pp[2];        /* holds path for seqs */

　　char        *calloc(),*malloc(),*index(),*strcpy();

　　char        *getseq(),*g_calloc();

　　/* Needleman-Wunsch alignment program

　　 *

　　 * usage:progs file1 file2
 *  其中file1和file2是两个dna或两个蛋白质序列。
 *  序列可以大写或小写或者也可以大小写同时使用
 *  用′;′,′>′或′<′开头的任一行都被忽略
 *  最大file length为65535(limited by unsigned short x in the jmp struct)
 *  其1/3或更多的单元为ACGTU的序列判定为DNA
 *  Output is in the file"align.out"

　　 *

　　 * The program may create a tmp file in/tmp to hold info about traceback.

　　 * Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650

　　 */

　　#include"nw.h"

　　#include"day.h"

　　static  _dbval[26]={
        <!-- SIPO <DP n="17"> -->
        <dp n="d17"/>
　　      1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0

　　    };

　　    static  _pbval[26]={

　　      1,2|(1＜＜(′D′-′A′))|(1＜＜(′N′-′A′)),4,8,16,32,64,

　　      128,256,0xFFFFFFF,1＜＜10,1＜＜11,1＜＜12,1＜＜13,1＜＜14,

　　      1＜＜15,1＜＜16,1＜＜17,1＜＜18,1＜＜19,1＜＜20,1＜＜21,1＜＜22,

　　      1＜＜23,1＜＜24,1＜＜25|(1＜＜(′E′-′A′))|(1＜＜(′Q′-′A′))

　　    };

　　    main(ac,av)

　　main

　　      int  ac;

　　      char*av[];

　　    {

　　      prog=av[0];

　　      if(ac!=3){

　　          fprintf(stderr,"usage:%s file1 file2\n",prog);

　　          fprintf(stderr,"where file1 and file2 are two dna or two protein sequences.\n");

　　          fprintf(stderr,"The sequences can be in upper-or lower-case\n");

　　          fprintf(stderr,"Any lines beginning with′;′or′＜′are ignored\n");

　　          fprintf(stderr,"Output is in the file\"align.out\"\n");

　　          exit(1);

　　      }

　　      namex[0]=av[1];

　　      namex[1]=av[2];

　　      seqx[0]=getseq(namex[0],&len0);

　　      seqx[1]=getseq(namex[1],&len1);

　　      xbm=(dna)?_dbval:_pbval;

　　      endgaps=0;          /* 1 to penalize endgaps */

　　      ofile="align.out";  /* output file */

　　      nw();        /* fill in the matrix,get the possible jmps */

　　      readjmps();  /* get the actual jmps */

　　      print();     /* print stats,alignment */

　　      cleanup(0);  /* unlink any tmp files */
        <!-- SIPO <DP n="18"> -->
        <dp n="d18"/>
　　      }

　　      /* do the alignment,return best score:main()

　　       * dna:values in Fitch and Smith,PNAS,80,1382-1386,1983

　　       * pro:PAM 250 values

　　       * When scores are equal,we prefer mismatches to any gap,prefer

　　       * a new gap to extending an ongoing gap,and prefer a gap in seqx

　　       * to a gap in seq y.

　　       */

　　      nw()

　　nw

　　     {

　　       char    *px,*py;     /* seqs and ptrs */

　　       int     *ndely,*dely;/* keep track of dely */

　　       int     ndelx,delx;  /* keep track of delx */

　　       int     *tmp;        /* for swapping row0,row1 */

　　       int     mis;         /* score for each type */

　　       int     ins0,ins1;   /* insertion penalties */

　　       register     id;     /* diagonal index*/

　　       register     ij;     /* jmp index */

　　       register     *col0,*col1; /* score for curr,last row */

　　       register     xx,yy;       /* index into seqs */

　　       dx=(struct diag*)g_calloc("to get diags",len0+len1+1,sizeof(struct diag));

　　       ndely=(int*)g_calloc("to get ndely",len1+1,sizeof(int));

　　       dely=(int*)g_calloc("to get dely",len1+1,sizeof(int));

　　       col0=(int*)g_calloc("to get col0",len1+1,sizeof(int));

　　       col1=(int*)g_calloc("to get col1",len1+1,sizeof(int));

　　       ins0=(dna)?DINS0:PINS0;

　　       ins1=(dna)?DINS1:PINS1;

　　       smax=-10000;

　　       if(endgaps){

　　           for(col0[0]=dely[0]=-ins0,yy=1;yy＜=len1;yy++){

　　               col0[yy]=dely[yy]=col0[yy-1]-ins1;

　　               ndely[yy]=yy;

　　           }
        <!-- SIPO <DP n="19"> -->
        <dp n="d19"/>
　　    col0[0]=0;  /* Waterman Bull Math Biol 84 */

　　}

　　else

　　    for(yy=1;yy＜=len1;yy++)

　　        dely[yy]=-ins0;

　　/* fill in match matrix

　　 */

　　for(px=seqx[0],xx=1;xx＜=len0;px++,xx++){

　　    /* initialize first entry in col

　　     */

    if(endgaps){

　　        if(xx==1)

　　            col1[0]=delx=-(ins0+ins1);

　　        else

　　            col1[0]=delx=col0[0]-ins1;

　　        ndelx=xx;

　　    }

    else{

　　        col1[0]=0;

　　        delx=-ins0;

　　        ndelx=0;

　　    }

　　                                                 ...nw

    for(py=seqx[1],yy=1;yy＜=len1;py++,yy++){

　　        mis=col0[yy-1];

　　        if(dna)

　　            mis+=(xbm[*px-′A′]&xbm[*py-′A′])?DMAT:DMIS;

　　        else

　　            mis+=_day[*px-′A′][*py-′A′];

　　        /* update penalty for del in x seq;

　　         * favor new del over ongong del

　　         * ignore MAXGAP if weighting endgaps

　　         */
        <!-- SIPO <DP n="20"> -->
        <dp n="d20"/>
　　if(endgaps||ndely[yy]＜MAXGAP){

　　    if(col0[yy]-ins0＞=dely[yy]){

　　        dely[yy]=col0[yy]-(ins0+ins1);

　　        ndely[yy]=1;

　　    }else{

　　        dely[yy]-=ins1;

　　        ndely[yy]++;

　　    }

　　}else{

　　    if(col0[yy]-(ins0+ins1)＞=dely[yy]){

　　        dely[yy]=col0[yy]-(ins0+ins1);

　　        ndely[yy]=1;

　　    }else

　　        ndely[yy]++;

　　}

　　/*update penalty for del in y seq;

　　 *favor new del over ongong del

　　 */

　　if(endgaps||ndelx＜MAXGAP){

　　    if(col1[yy-1]-ins0＞=delx){

　　        delx=col1[yy-1]-(ins0+ins1);

　　        ndelx=1;

　　    }else{

　　        delx-=ins1;

　　        ndelx++;

　　    }

　　}else{

　　    if(col1[yy-1]-(ins0+ins1)＞=delx){

　　        delx=col1[yy-1]-(ins0+ins1);

　　        ndelx=1;

　　    }else

　　        ndelx++;

　　}

　　/* pick the maximum score;we′re favoring

　　 * mis over any del and delx over dely

　　 */
        <!-- SIPO <DP n="21"> -->
        <dp n="d21"/>
　　                                                        ...nw

　　        id=xx-yy+len1-1;

　　        if(mis＞=delx && mis＞=dely[yy])

　　            col1[yy]=mis;

　　        else if(delx＞=dely[yy]){

　　            col1[yy]=delx;

　　            ij=dx[id].ijmp;

　　            if(dx[id].jp.n[0]&&(!dna||(ndelx＞=MAXJMP
　　            &&xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)||mis＞dx[id].score+DINS0)){

　　                dx[id].ijmp++;

　　                if(++ij＞=MAXJMP){

　　                    writejmps(id);

　　                    ij=dx[id].ijmp=0;

　　                    dx[id].offset=offset;

　　                    offset+=sizeof(struct jmp)+sizeof(offset);

　　                }

　　            }

　　            dx[id].jp.n[ij]=ndelx;

　　            dx[id].jp.x[ij]=xx;

　　            dx[id].score=delx;

　　        }

　　        else{

　　            col1[yy]=dely[yy];

　　            ij=dx[id].ijmp;

　　if(dx[id].jp.n[0]&&(!dna||(ndely[yy]＞=MAXJMP

　　            && xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)||mis＞dx[id].score+DINS0)){

　　                dx[id].ijmp++;

　　                if(++ij＞=MAXJMP){

　　                    writejmps(id);

　　                    ij=dx[id].ijmp=0;

　　                    dx[id].offset=offset;

　　                    offset+=sizeof(struct jmp)+sizeof(offset);

　　                }

　　            }

　　            dx[id].jp.n[ij]=-ndely[yy];
        <!-- SIPO <DP n="22"> -->
        <dp n="d22"/>
　　                dx[id].jp.x[ij]=xx;

　　                dx[id].score=dely[yy];

　　            }

　　            if(xx==len0 && yy＜len1){

　　                /* last col

　　                 */

　　                if(endgaps)

　　                    col1[yy]-=ins0+ins1*(len1-yy);

　　                if(col1[yy]>smax){

　　                    smax=col1[yy];

　　                    dmax=id;

　　                }

　　           }

　　       }

　　       if(endgaps && xx＜len0)

　　           col1[yy-1]-=ins0+ins1*(len0-xx);

　　       if(col1[yy-1]＞smax){

　　           smax=col1[yy-1];

　　           dmax=id;

　　       }

　　       tmp=col0;col0=col1;col1=tmp;

　　   }

　　   (void)free((char*)ndely);

　　   (void)free((char*)dely);

　　   (void)free((char*)col0);

　　 (void)free((char*)col1);            }

　　/*

　　 *

　　 * print()--only routine visible outside this module

　　 *

　　 * static:

　　 * getmat()--trace back best path,count matches:print()

　　 * pr_align()--print alignment of described in array p[]:print()

　　 * dumpblock()--dump a block of lines with numbers,stars:pr_align()

　　 * nums()--put out a number line:dumpblock()

　　 * putline()--put out a line(name,[num],seq,[num]):dumpblock()

　　 * stars()--put a line of stars:dumpblock()
        <!-- SIPO <DP n="23"> -->
        <dp n="d23"/>
　　    * stripname()--strip any path and prefix from a seqname

　　    */

　　    #include"nw.h"

　　    #define SPC3

　　    #define P_LINE 256 /* maximum output line */

　　    #define P_SPC  3   /*space between name or num and seq */

　　    extern_day[26][26];

　　    intolen;  /* set output line length */

　　    FILE  *fx;     /* output file */

　　    print()

　　print

　　    {

　　      int lx,ly,firstgap,lastgap;/* overlap */

　　      if((fx=fopen(ofile,"w"))==0){

　　          fprintf(stderr,"%s:can′t write %s\n",prog,ofile);

　　          cleanup(1);

　　      }

　　      fprintf(fx,"＜first sequence:%s(length=%d)\n",namex[0],len0);

　　      fprintf(fx,"＜second sequence:%s(length=%d)\n",namex[1],len1);

　　      olen=60;

　　      lx=len0;

　　      ly=len1;

　　      firstgap=lastgap=0;

　　      if(dmax＜len1-1){/* leading gap in x */

　　          pp[0].spc=firstgap=len1-dmax-1;

　　          ly-=pp[0].spc;

　　      }

　　      else if(dmax＞len1-1){/* leadingg gap in y */

　　          pp[1].spc=firstgap=dmax-(len1-1);

　　          lx-=pp[1].spc;

　　      }

　　      if(dmax0＜len0-1){  /* trailing gap in x */

　　          lastgap=len0-dmax0-1;
        <!-- SIPO <DP n="24"> -->
        <dp n="d24"/>
　　          lx-=lastgap;

　　      }

　　      else if(dmax0＞len0-1){  /* trailing gap in y */

　　          lastgap=dmax0-(len0-1);

　　          ly-=lastgap;

　　      }

　　      getmat(lx,ly,firstgap,lastgap);

　　      pr_align();

　　    }

　　    /*

　　     * trace back the best path,count matches

　　     */

　　    static

　　    getmat(lx,ly,firstgap,lastgap)

　　getmat

　　      int  lx,ly;            /*"core"(minus endgaps) */

　　      int  firstgap,lastgap;     /*leading trailing overlap */

　　    {

　　      int       nm,i0,i1,siz0,siz1;

　　      char      outx[32];

　　      double        pct;

　　      register      n0,n1;

　　      register char *p0,*p1;

　　      /* get total matches,score

　　       */

　　      i0=i1=siz0=siz1=0;

　　      p0=seqx[0]+pp[1].spc;

　　      p1=seqx[1]+pp[0].spc;

　　      n0=pp[1].spc+1;

　　      n1=pp[0].spc+1;

　　      nm=0;

　　      while(*p0 && *p1){

　　          if(siz0){

　　              p1++;

　　              n1++;
        <!-- SIPO <DP n="25"> -->
        <dp n="d25"/>
　　        siz0--;

　　    }

　　    else if(siz1){

　　        p0++;

　　        n0++;

　　        siz1--;

　　    }

　　    else{

　　        if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′])

　　            nm++;

　　        if(n0++==pp[0].x[i0])

　　            siz0=pp[0].n[i0++];

　　        if(n1++==pp[1].x[i1])

　　            siz1=pp[1].n[i1++];

　　        p0++;

　　        p1++;

　　    }

　　}

　　/* pcthomology:

　　 * if penalizing endgaps,base is the shorter seq

　　 * else,knock off overhangs and take shorter core

　　 */

　　if(endgaps)

　　    lx=(len0＜len1)?len0:len1;

　　else

　　    lx=(lx＜ly)?lx:ly;

　　pct=100.*(double)nm/(double)lx;

　　fprintf(fx,"\n");

　　fprintf(fx,"＜%d match%s in an overlap of %d:%.2f percent similarity\n",

　　    nm,(nm==1)?"":"es",lx,pct);

　　fprintf(fx,"＜gaps in first sequence:%d",
gapx);                                                          ...getmat

　　if(gapx){

　　    (void)sprintf(outx,"(%d %s%s)",

　　        ngapx,(dna)?"base":"residue",(ngapx==1)?"":"s");
        <!-- SIPO <DP n="26"> -->
        <dp n="d26"/>
　　     fprintf(fx,"%s",outx);

　　 fprintf(fx,",gaps in second sequence:%d",gapy);

　　 if(gapy){

　　     (void)sprintf(outx,"(%d %s%s)",

　　         ngapy,(dna)?"base":"residue",(ngapy==1)?"":"s");

　　     fprintf(fx,"%s",outx);

　　 }

　　 if(dna)

　　     fprintf(fx,

　　     "\n＜score:%d(match=%d,mismatch=%d,gap penalty=%d+%d per base)\n",

　　     smax,DMAT,DMIS,DINS0,DINS1);

　　 else

　　     fprintf(fx,

　　     "\n＜score:%d(Dayhoff PAM 250 matrix,gap penalty=%d+%d per residue)\n",

　　     smax,PINS0,PINS1);

　　 if(endgaps)

　　     fprintf(fx,

　　     "＜endgaps penalized.left endgap:%d %s%s,right endgap:%d %s%s\n",

　　     firstgap,(dna)?"base":"residue",(firstgap==1)?"":"s",

　　     lastgap,(dna)?"base":"residue",(lastgap==1)?"":"s");

　　 else

　　     fprintf(fx,"＜endgaps not penalized\n");

　　}

　　 static    nm;     /* matches in core--for chec king */

　　 static    lmax;       /* lengths of stripped file names */

　　 static    ij[2];  /* jmp index for a path */

　　 static    nc[2];      /* number at start of current line */

　　 static    ni[2];      /* current elem number--for gapping */

　　 static    siz[2];

　　 static char*ps[2];    /* ptr to current element */

　　 static char*po[2];    /* ptr to next output char slot */

　　 static char out[2][P_LINE];  /* output line */

　　 static char star[P_LINE];  /* set by stars() */

　　/*

　　 * print alignment of described in struct path pp[]
        <!-- SIPO <DP n="27"> -->
        <dp n="d27"/>
　　     */

　　    static

　　    pr_align()

　　pr_align

　　    {

　　      int      nn; /* char count */

　　      int      more;

　　      register    i;

　　      for(i=0,1max=0;i＜2;i++){

　　          nn=stripname(namex[i]);

　　          if(nn＞lmax)

　　              lmax=nn;

　　          nc[i]=1;

　　          ni[i]=1;

　　          siz[i]=ij[i]=0;

　　          ps[i]=seqx[i];

　　            po[i]=out[i];        }

　　for(nn=nm=0,more=1;more;)

　　{                                                ...pr_align

　　          for(i=more=0;i＜2;i++){

　　            /*

　　             * do we have more of this sequence?

　　             */

　　            if(!*ps[i])

　 　               continue;

　　            more++;

　　            if(pp[i].spc){    /*leading space */

　　                *po[i]++=′′;

　　                pp[i].spc--;

　　            }

　　            else if(siz[i]){/* in a gap */

　　                *po[i]++=′-′;
        <!-- SIPO <DP n="28"> -->
        <dp n="d28"/>
　　            siz[i]--;

　　        }

　　        else{      /*we′re putting a seq element

　　                */

　　            *po[i]=*ps[i];

　　            if(islower(*ps[i]))

　　                *ps[i]=toupper(*ps[i]);

　　            po[i]++;

　　            ps[i]++;

　　            /*

　　             * are we at next gap for this seq?

　　             */

　　            if(ni[i]==pp[i].x[ij[i]]){

　　                /*

　　                 * we need to merge all gaps

　　                 * at this location

　　                 */

　　                siz[i]=pp[i].n[ij[i]++];

　　                while(ni[i]==pp[i].x[ij[i]])

　　                    siz[i]+=pp[i].n[ij[i]++];

　　              }

                ni[i]++;

　　          }
　      　}

　　      if(++nn==olen||!more && nn){

　　          dumpblock();

　　          for(i=0;i＜2;i++)

　　              po[i]=out[i];

　　          nn=0;

　　      }

　　  }

　　}

　　/*

　　 *dump a block of lines,including numbers,stars:pr_align()

　　 */

　　static
        <!-- SIPO <DP n="29"> -->
        <dp n="d29"/>
　　    dumpblock()

　　dumpblock

　　    {

　　      register  i;

　　      for(i=0;i＜2;i++)

　　          *po[i]--=′\0′;

　　                                            ...dumpblock

　　      (void)putc(′\n′,fx);

　　      for(i=0;i＜2;i++){

　　          if(*out[i]&&(*out[i]！=′′||*(po[i])！=′′)){

　　              if(i==0)

　　                  nums(i);

　　              if(i==0 && *out[1])

　　                  stars();

　　              putline(i);

　　              if(i==0 && *out[1])

　　                  fprintf(fx,star);

　　              if(i==1)

　　                  nums(i);

　　            }

　　        }
　　    }

　　    /*

　　     * put out a number line:dumpblock()

　　     */

　　    static

　　    nums(ix)

　　nums

　　      int  ix;/ *index in out[]holding seq line */

　　    {

　　      char    nline[P_LINE];

　　      register      i,j;

　　      register char *pn,*px,*py;
        <!-- SIPO <DP n="30"> -->
        <dp n="d30"/>
　　      for(pn=nline,i=0;i＜1max+P_SPC;i++,pn++)

　　          *pn=′′;

　　      for(i=nc[ix],py=out[ix];*py;py++,pn++){

　　          if(*py==′′||*py==′-′)

　　              *pn=′′;

　　          else{

　　              if(i%10==0||(i==1 && nc[ix]!=1)){

　　                  j=(i＜0)?-i:i;

　　                  for(px=pn;j;j/=10,px--)

　　                      *px=j%10+′0′;

　　                  if(i＜0)

　　                      *px=′-′;

　　              }

　　              else

　　                  *pn=′′;

　　              i++;

　　          }

　　      }

　　      *pn=′\0′;

　　      nc[ix]=i;

　　      for(pn=nline;*pn;pn++)

　　          (void)putc(*pn,fx);

　　      (void)putc(′\n′,fx);

　　    }

　 　   /*

　　     * put out a line(name,[num],seq,[num]):dumpblock()

　　     */

　　    static

　　    putline(ix)

　　putline

　　    int    ix;                         {

　　                                                       ...putline

　　    int      i;

　　    register char *px;
        <!-- SIPO <DP n="31"> -->
        <dp n="d31"/>
　　      for(px=namex[ix],i=0;*px&&*px!=′:′;px++,i++)

　　          (void)putc(*px,fx);

　　      for(;i＜lmax+P_SPC;i++)

　　          (void)putc(′′,fx);

　　      /* these count from 1:

　　       * ni[]is current element(from 1)

　　       * nc[]is number at start of current line

　　       */

　　      for(px=out[ix];*px;px++)

　　          (void)putc(*px&0x7F,fx);

　　      (void)putc(′\n′,fx);

　　    }

　　    /*

　　     * put a line of stars(seqs always in out[0],out[1]):dumpblock()

　　     */

　　    static

　　    stars()

　　stars

　　    {

　　      int      i;

　　      register char *p0,*p1,cx,*px;

　　      if(!*out[0]||(*out[0]==′′&&*(po[0])==′′)||

　　          !*out[1]||(*out[1]==′′&&*(po[1])==′′))

　　          return;

　　      px=star;

　　      for(i=lmax+P_SPC;i;i--)

　　          *px++=′′;

　　      for(p0=out[0],p1=out[1];*p0 && *p1;p0++,p1++){

　　          if(isalpha(*p0)&& isalpha(*p1)){

　　             if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′]){

　　                 cx=′*′;

　 　                nm++;
        <!-- SIPO <DP n="32"> -->
        <dp n="d32"/>
　　              }

　　              else if(!dna &&_day[*p0-′A′][*p1-′A′]＞0)

　　                  cx=′.′;

　　              else

　　                  cx=′′;

　　          }

　　          else

　　              cx=′′;

　　          *px++=cx;

　　    }

　　      *px++=′\n′;

　　      *px=′\0′;

　　    }

　　    /*

　　     * strip path or prefix from pn,return len:pr_align()

　　     */

　　    static

　　    stripname(pn)

　　stripname

　　      char*pn;/* file name(may be path) */

　　    {

　　      register char *px,*py;

　　      py=0;

　　      for(px=pn;*px;px++)

　　          if(*px==′/′)

　　              py=px+1;

　　      if(py)

　　          (void)strcpy(pn,py);

　　      return(strlen(pn));

　　    }

　　    /*

　　     *cleanup()--cleanup any tmp file
        <!-- SIPO <DP n="33"> -->
        <dp n="d33"/>
　　     * getseq()--read in seq,set dna,len,maxlen

　　     * g_calloc()--calloc()with error checkin

　　     * readjmps()--get the good jmps,from tmp file if necessary

　　     * writejmps()--write a filled array of jmps to a tmp file:nw()

　　     */

　　    #include"nw.h"

　　    #include＜sys/file.h＞

　　    char   *jname="/tmp/homgXXXXXX";    /* tmp file for jmps */

　　    FILE   *fj;

　　    intcleanup();            /* cleanup tmp file */

　　    long   lseek();

　　    /*

　　     * remove any tmp file if we blow

　　     */

　　    cleanup(i)

　　cleanup

　　      int  i;

　　    {

　　      if(fj)

　　          (void)unlink(jname);

　　      exit(i);

　　    }

　　    /*

　　     * read,return ptr to seq,set dna,len,maxlen

　　     * skip lines starting with′;′,′＜′,or′＞′

　　     * seq in upper or lower case

　　     */

　　    char  *

　　    getseq(file,                                                len)

　　getseq

　　      char*file;   /* file name */

　　      int*len;/* seq len */

　　    {

　　      char    line[1024],*pseq;
        <!-- SIPO <DP n="34"> -->
        <dp n="d34"/>
　　register char *px,*py;

　　int      natgc,tlen;

　　FILE          *fp;

　　if((fp=fopen(file,"r"))==0){

　　    fprintf(stderr,"%s:can′t read %s\n",prog,file);

　　    exit(1);

　　}

　　tlen=natgc=0;

　　while(fgets(line,1024,fp)){

　　    if(*line==′;′||*line==′＜′||*line==′＞′)

　　        continue;

　　    for(px=line;*px!=′\n′;px++)

　　        if(isupper(*px)||islower(*px))

　　            tlen++;

　　}

　　if((pseq=malloc((unsigned)(tlen+6)))==0){

　　    fprintf(stderr,"%s:malloc()failed to get %d bytes for %s\n",prog,tlen+6,file);

　　    exit(1);

　　}

　　pseq[0]=pseq[1]=pseq[2]=pseq[3]=′\0′;

　　                                                      ...getseq

　　py=pseq+4;

　　*len=tlen;

　　rewind(fp);

　　while(fgets(line,1024,fp)){
　    if(*line==′;′||*line==′＜′||*line==′＞′)

　　        continue;

　　    for(px=line;*px!=′\n′;px++){

　　        if(isupper(*px))

　　            *py++=*px;

　　        else if(islower(*px))

　　            *py++=toupper(*px);

　　        if(index("ATGCU",*(py-1)))

　　            natgc++;
        <!-- SIPO <DP n="35"> -->
        <dp n="d35"/>
　　          }

　　      }

　　      *py++=′\0′;

　　      *py=′\0′;

　　      (void)fclose(fp);

　　      dna=natgc＞(tlen/3);

　　      return(pseq+4);

　　    }

　　    char  *

　　    g_calloc(msg,nx,sz)

　　g_calloc

　　       char*msg;       /* program,calling routine */

　　       int  nx,sz;     /* number and size of elements */

　　    {

　　       char    *px,*calloc();

　　       if((px=calloc((unsigned)nx,(unsigned)sz))==0){

　　           if(*msg){

　　               fprintf(stderr,"%s:g_calloc()failed %s(n=%d,sz=%d)\n",prog,msg,nx,sz);

　　               exit(1);

　　           }

　　       }

　　       return(px);

　　    }

　　    /*

　　     * get final jmps from dx[]or tmp file,set pp[],reset dmax:main()

　　     */

　　    readjmps()

　　readjmps

　　    {

　　      int      fd=-1;

　　      int      siz,i0,i1;

　　      register i,j,xx;

　　      if(fj){

　　          (void)fclose(fj);
        <!-- SIPO <DP n="36"> -->
        <dp n="d36"/>
　　    if((fd=open(jname,O_RDONLY,0))＜0){

　　        fprintf(stderr,"%s:can′t open()%s\n",prog,jname);

　　        cleanup(1);

　　    }

　　}

　　for(i=i0=i1=0,dmax0=dmax,xx=len0;;i++){

　　    while(1){

　　        for(j=dx[dmax].ijmp;j＞=0 && dx[dmax].jp.x[j]＞=xx;j--)

　　            ;

　　                                                ...readjmps

　　        if(j＜0 && dx[dmax].offset && fj){

　　            (void)lseek(fd,dx[dmax].offset,0);

　　            (void)read(fd,(char*)&dx[dmax].jp,sizeof(struct jmp));

　　            (void)read(fd,(char*)&dx[dmax].offset,sizeof(dx[dmax].offset));

　　            dx[dmax].ijmp=MAXJMP-1;

　　        }

　　        else

　　            break;

　　    }

　　    if(i＞=JMPS){

　　        fprintf(stderr,"%s:too many gaps in alignment\n",prog);

　　        cleanup(1);

　　    }

　　    if(j＞=0){

　　        siz=dx[dmax].jp.n[j];
　　        xx=dx[dmax].jp.x[j];

　　        dmax+=siz;

　　        if(siz＜0){     /*gap in second seq*/

　　            pp[1].n[i1]=-siz;

　　            xx+=siz;

　　            /*id=xx-yy+len1-1

　　             */

　　            pp[1].x[i1]=xx-dmax+len1-1'

　　            gapy++;

　　            ngapy-=siz;

　　/*ignore MAXGAP when doing endgaps*/
        <!-- SIPO <DP n="37"> -->
        <dp n="d37"/>
　　              siz=(-siz＜MAXGAP||endgaps)?-siz:MAXGAP;

　　              i1++;

　　          }

　　          else if(siz＞0){  /* gap in first seq */

　　              pp[0].n[i0]=siz;

　　              pp[0].x[i0]=xx;

　　              gapx++;

　　              ngapx+=siz;

　　/*ignore MAXGAP when doing endgaps*/

　　              siz=(siz＜MAXGAP||endgaps)?siz:MAXGAP;

　　              i0++;

　　          }

　　      }

　　      else

　　          break;

　　 }

　　 /* reverse the order of jmps

　　  */

　　 for(j=0,i0--;j＜i0;j++,i0--){

　　      i=pp[0].n[j];pp[0].n[j]=pp[0].n[i0];pp[0].n[i0]=i;

　　      i=pp[0].x[j];pp[0].x[j]=pp[0].x[i0];pp[0].x[i0]=i;

　　 }

　　 for(j=0,i1--;j＜i1;j++,i1--){

　　      i=pp[1].n[j];pp[1].n[j]=pp[1].n[i1];pp[1].n[i1]=i;

　　      i=pp[1].x[j];pp[1].x[j]=pp[1].x[i1];pp[1].x[i1]=i;

　　 }

　　 if(fd＞=0)

　　      (void)close(fd);

　　 if(fj){

　　     (void)unlink(jname);

　　     fj=0;

　     offset=0;

　　 }                          }

　　/*

　　 * write a filled jmp struct offset of the prev one(if any):nw()
        <!-- SIPO <DP n="38"> -->
        <dp n="d38"/>
　　    */

　　    writejmps(ix)

　　writejmps

　　      int ix;

　　    {

　　      char*mktemp();

　　      if(!fj){

　　          if(mktemp(jname)＜0){

　　              fprintf(stderr,"%s:can′t mktemp()%s\n",prog,jname);

　　              cleanup(1);

　　          }

　　          if((fj=fopen(jname,"w"))==0){

　　              fprintf(stderr,"%s:can′t write %s\n",prog,jname);

　　              exit(1);

　　          }

　　      }

　　      (void)fwrite((char*)&dx[ix].jp,sizeof(struct jmp),1,fj);

　　      (void)fwrite((char*)&dx[ix].offset,sizeof(dx[ix].offset),1,fj);
在本申请中术语″载体″，是指一种能够输送与其连接在一起的另一种核酸的核酸分子。载体的一种类型是″质粒″，是指一种可以接入其他DNA节段的环状双股脱氧核糖核酸环。另一类型载体是噬菌体载体。另一类型载体是一种病毒载体，其中可以将其他的脱氧核糖核酸连接入该病毒的基因组。一些载体能够在其所导入的宿主细胞内自动复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离的哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离的哺乳动物载体)当导入所述宿主细胞时可以整合入宿主细胞的基因组中，从而随宿主基因组一同复制。另外，一些载体能指导可操作地连接于其上的基因的表达。本申请中所述的载体可称为″重组表达载体″(或简称″重组载体″)。一般而言，重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒形式。本申请中，“质粒”和“载体”可以交互使用，因为质粒是载体的最常见形式。
“多核苷酸”和“核酸”在本申请中可以交互使用，是指任一长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应引入聚合物的任一取代物。多核苷酸可以包括经过修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在所述聚合物装配之前或之后加入。所述核苷酸序列可以被非-核苷酸组分阻断。多核苷酸还可以在合成后修饰，例如通过与标记物偶联。其他类型的修饰包括，例如，″帽子″，将一个或多个天然生成核苷酸用类似物取代，核苷酸之间修饰例如，含不带电连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidates)，氨基甲酸酯，等)和含带电连接(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，等)的修饰，含有附加基元，例如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-赖氨酸，等)的修饰，带有嵌入剂(例如，吖啶，补骨脂素，等)的修饰，含有螯合剂(例如，金属，放射性金属，硼，氧化的金属等)的修饰，含有烷化剂(alkylators)的修饰，带有经修饰连接(例如，α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)，等)的修饰，以及未经修饰形式的多核苷酸。另外，通常出现于糖类的任一羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团取代，用常见保护基保护，或者经过活化制备与其他核苷酸间的其他连接，或者可以偶联至固相或半固相支持物。5′和3′末端的OH可以用长度为1-20个碳原子的胺或有机封端基团(organic capping group)磷酸化或取代。另外还可以将其他羟基衍生至常规的保护基。多核苷酸还可以含有本领域普遍已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式，包括，例如，2′-氧-甲基，2′-氧-烯丙基，2′-烯丙基-，2′-氟-或2′-叠氮基核糖，碳环形的糖类似物，α-端基异构糖，差向立体异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，非环形的类似物以及脱碱基的核苷类似物例如甲基核糖核苷。可以用其他连接基团替代一个或多个磷酸二酯键。这些其他的连接基团包括但不限于这样的实例，其中磷酸酯基被P(O)S(″硫代酸酯基(thioate)″)，P(S)S(″二硫代酸酯基(dithioate)″)，″(O)NR2(″酰胺基团(amidate)″)，P(O)R，P(O)OR′，COCH2(″formacetal″)替代，其中R或R′各自独立地为H或者取代或未被取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)键、芳香基、链烯基、环烷基、环烯基(cycloalkenyl)或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。上述描述适用于所有本申请所述多核苷酸，包括RNA及DNA。
在本申请中“寡核苷酸”通常是指单链，一般为合成的多核苷酸，其长度往往但非一定小于约200个核苷酸。术语″寡核苷酸″和″多核苷酸″互不排斥。上述对多核苷酸的描述同样且完全适合于寡核苷酸。
在本申请中，除非另有特别说明或者据上下文明显看出外，术语“肝细胞生长因子”或“HGF”是指任一天然的或变体(其中包括天然生成的或合成的)HGF多肽，其能在允许该反应发生的条件下活化HGF/c-met信号传导途径。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”广义上可以交互使用，包括单克隆抗体(例如，全长或者完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，迄今为止能表现预期生物活性的双特异性抗体)以及抗体片段。抗体可以是人抗体、人源化抗体和/或亲和力成熟(affinitymatured)抗体。
“抗体片段”只含有完整抗体的一部分，其中所述的部分优选保留了当其正常情况下存在于完整抗体时与其相关功能中的至少一种，优选多种或全部。一个实施方案中，抗体片段含有完整抗体的抗原结合位点，因此保留了结合抗原的能力。另一个实施方案中，抗体片段，例如其中含有Fc区的抗体片段，保留了当正常情况下存在于完整抗体中的与Fc区相关生物学功能中的至少一种，例如与FcRn结合，抗体半衰期调节，ADCC功能及补体结合功能。
在本申请中术语″单克隆抗体″是指获自基本均一的抗体群体的抗体，即，除了可能有的极少量天然发生的突变外，组成所述群的抗体个体都完全相同。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一的抗原。另外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每一种单克隆抗体都只针对所述抗原上的单一决定簇。
本申请中所述的单克隆抗体具体性地包括″嵌合″抗体，其中重链和/或轻链中的一部分与源自一个特定物种或者属于一个特定抗体类或亚类的抗体的对应序列等同或同源，其中重链和/或轻链中的其余部分与源自另一特定物种或者属于另一特定抗体类或亚类的抗体的对应序列等同或同源，以及所述抗体的片段，只要它们具有预期的生物活性即可(美国专利No.4,816,567；和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
非-人(例如，鼠的)抗体的“人源化”形式是含有最小限度的源自非-人免疫球蛋白序列的嵌合抗体。大部分来说，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受抗体)，其中该接受抗体的高变区被来自非-人物种的高变区(供体抗体)的残基所取代，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类，所述来自非-人物种的高变区具有期望的特异性、亲和力、和能力(capacity)。在一些情况下，人免疫球蛋白的骨架区(FR)残基用相应的非-人残基替代。另外，人源化抗体还可以包含在接受抗体或提供抗体中都未发现的残基。这些修饰进一步地优化了抗体的性能。通常，所述人源化抗体都基本上包含至少一个，通常为两个可变区，其中的全部或者基本上全部的高变环出自非-人免疫球蛋白，而全部或基本上全部的骨架区(FR)为人免疫球蛋白序列。另外，所述人源化抗体还任选包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白恒定区。详细内容，参见Jones et al.，Nature321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；andPresta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。另外还可参见下列综述及本申请中所引参考文献：Vaswani and Hamilton，Ann.Allergy，Asthma &Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。
“人的抗体”是指这样的抗体，其具有的氨基酸序列对应于：通过人制备的和/或使用本申请中公开的用于制备人抗体的任一技术制备的抗体。人的抗体这一定义专门将含有非-人抗原-结合残基的人源化抗体排除出去。
“亲和力成熟”抗体是指一个或多个CDRs中有一处或多处变化的抗体，变化导致该抗体的抗原亲和力提高，与不含这些变化的亲本抗体相比。优选的亲和力成熟抗体具有纳摩尔或者甚至皮摩尔的目标抗原亲和力。亲和力成熟抗体可以用本领域已知的方法制备。Marks et al.Bio/Technology 10：779-783(1992)描述了通过VH及VL结构域改组(shuffling)的亲和力成熟。CDR和/或骨架残基的随机诱变的描述见：Barbas et al.Proc Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.Gene169：147-155(1995)；Yelton et al.J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jacksonet al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；and Hawkins et al，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
术语“拮抗剂”在本申请中取其最广含义，包括能部分或完全封闭、抑制或中和其靶标(例如，c-met)的一种或多种生物学活性的任一分子。例如：，“封闭”抗体或“拮抗剂”抗体是指能抑制或减弱其所结合抗原(例如，c-met)的生物活性的抗体。
“病症”是指能从使用本发明所述物质/分子或方法的治疗中受益的任一状况。其中包括慢性和急性的病症或疾病，包括预先让所述哺乳动物患所述病症的那些病理学情况。本申请中所治疗病症的非限制性实例包括恶性及良性肿瘤；非-血癌及淋巴的恶性肿瘤；神经元的、神经胶质的、星形胶质细胞的、下丘脑的以及其他腺体的，巨噬细胞的，上皮的，间质的和囊胚腔的病症；以及炎症的、免疫学的及其他的血管生成-相关病症。
所述术语″癌症″和″癌性的″是指或者用来描述通常以无限制的细胞生长/增殖为特征的哺乳动物生理状态。癌症的实例包括但不限于，癌、淋巴瘤、胚细胞瘤(blastoma)、肉瘤和血癌(leukemia)。所述癌症的更具体的实例包括：鳞状细胞癌、小-细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、阴道癌、甲状腺癌、肝细胞癌和各种头颈癌。
本申请中的“自体免疫病”是指以自体组织作为攻击目标引发的非-恶性疾病或病症。本申请中所述自体免疫疾病专门将恶性的或癌性的疾病或状况排除在外，尤其要排除B细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多毛细胞白血病和慢性成髓细胞白血病。自体免疫疾病或病症的实例包括，但不限于，炎性反应例如炎性皮肤疾病包括牛皮癣和皮炎(例如特应性皮炎)；系统性硬皮病和硬化症；炎症性肠病(例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)相关反应；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征；ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；血管球性肾炎；过敏情况例如湿疹和哮喘及涉及T细胞浸润和慢性炎性反应的其他情况；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；类风湿关节炎；全身性红斑狼疮(系统性红斑狼疮)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病mellitis)；多发性硬化；Reynaud′s综合征；自体免疫甲状腺炎；变态反应性脑脊髓炎；Sjorgen′s综合征；青少年型糖尿病；常见于肺结核、结节病、多肌炎、肉芽肿病和脉管炎的与细胞因子或T-淋巴细胞介导的急性及迟发性过敏反应相关的免疫应答；恶性贫血(Addison’s病)；白细胞渗出疾病；中枢神经系统(CNS)炎性病症；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症或Coombs阳性贫血)；重症肌无力；抗原抗体复合物介导疾病；抗-肾小球基底膜疾病；抗磷脂综合征；过敏性神经炎；Graves’疾病；Lambert-Eaton类重症肌无力综合征；pemphigoid bullous；天疱疮；自体免疫多(种)内分泌腺病；Reiter’s疾病；全身肌强直综合征(stiff-mansyndrome)；Behcet病；巨细胞性动脉炎；免疫复合物性肾炎；IgA肾病；IgM多神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自体免疫血小板减少等等。
在本申请中，“治疗”是指临床介入以求改变所治疗个体或细胞的天然过程，并且可以用于预防或临床病理学过程中。治疗的预期效果包括防止疾病的发生或再发生，减轻症状，消除任一疾病的直接或间接病理结果，防止转移，延缓病症发展速度，改善或缓和疾病状态，减轻或改善预后。一些实施方案中，本发明所述拮抗剂可用于延缓疾病或病症发展。
″有效量″是指在一次或一段时间内服用的实现预期治疗或预防效果所需的量。本发明所述拮抗剂的治疗有效量随疾病状况、年龄、性别和个体重量以及拮抗剂激发个体目的反应的能力等因素不同而变化。另外治疗有效量还指所述拮抗剂的治疗有益效果超过其任一毒性或有害影响的量。″预防有效量″是指以一种或多种剂量方式或在一种段时间内施用的实现预期预防效果所需的量。通常但非一定，由于预防剂量是用于疾病早期的受试者，因此预防有效量小于治疗有效量。
载体构建
编码本申请所述多肽的多核苷酸序列可以使用常规重组技术获得。目的多核苷酸序列可以从合适来源的细胞中分离并测序。抗体的来源细胞包括抗体产生细胞例如杂交瘤细胞。替代地，多核苷酸可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成。一旦获得，将编码所述多肽的序列插入能够在宿主细胞中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。本领域可获得的和已知的许多载体可用于本发明。合适载体的选择主要取决于插入载体中核酸的大小以及该载体预转化的特定宿主细胞。每一载体可含有不同元件，取决于其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或者同时扩增和表达)以及其所要驻留的特定宿主细胞的兼容性。所述载体元件通常包括，但不限于：复制起点(特别是当所述载体插入原核细胞时)，筛选标记基因，启动子，核糖体结合位点(RBS)，信号序列，所插入的异源核酸以及转录终止序列。
通常，含有复制子和源自于与宿主细胞相容的调控序列的质粒载体用于这些所述宿主。所述载体通常带有复制位点，以及能在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，大肠杆菌通常用pBR322，一种源自大肠杆菌的质粒转化。pBR322含有编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，因此能提供用于鉴定转化细胞的简易方式。pBR322及其衍生物或者其他微生物质粒或噬菌体还可以含有或者经过修饰后含有能够被用于表达内源蛋白的微生物使用的启动子。
此外，还可以使用含与宿主微生物相容的复制子及调控序列的噬菌体载体作为这些宿主的转化载体。例如，噬菌体例如λGEM.TM.-11可用于制备能用于转化敏感宿主细胞例如大肠杆菌LE392的重组载体。
组成型或诱导型启动子都可用于本发明，本领域技术人员可以根据具体情况需要选择。被多种有效宿主细胞识别的大量启动子都已为大家所熟知。可以通过下述操作将所选启动子可操作地连接于编码本申请所述多肽的顺反子DNA：通过限制性内切酶消化切除来源于DNA源的启动子，将分离的启动子序列插入所选载体。天然启动子序列和多种异源启动子都可用于直接扩增和/或表达靶基因。但是，优选异源启动子，因为与天然目标多肽启动子相比，异源启动子通常能提供更高的转录和表达量。
适合于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-galactamase及乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统以及杂合启动子例如tac或trc启动子。但是，其他能够在细菌中发挥功能的启动子(例如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经公开，因此本领域技术人员能够使用接头或衔接子提供任一所需限制酶切位点，将其与编码目标轻链和重链的顺反子可操作地连接在一起(Siebenlist et al.(1980)Cell 20：269)。
一些实施方案中，重组载体中的每一顺反子都含有分泌信号序列元件，指导表达多肽的跨膜易位。通常，所述信号序列可以是所述载体的元件，或者也可以是插入载体的目标多肽DNA的一部分。本发明选用的信号序列应该是能够被宿主细胞识别并加工(即，被信号肽酶切割)。由于原核宿主细胞不能识别并处理异源多肽的天然信号序列，所以应将该信号序列用例如选自下列的原核信号序列取代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定性肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。
适于表达多肽的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用的细菌的实例包括埃希氏菌属(例如，大肠埃希氏菌)，芽胞杆菌属(例如，枯草芽胞杆菌)，肠细菌属，假单胞菌各个种类(例如，绿脓杆菌)，鼠伤寒沙门氏菌，Serratia marcescans，克雷伯氏杆菌属，变形杆菌属，志贺氏菌属，根瘤菌属，vitreoscilla属，或副球菌属。优选地，使用革兰氏阴性细胞。优选地，所述宿主细胞应该分泌最小量蛋白水解酶，并且也可以根据需要向细胞培养物引入其他的蛋白酶抑制因子。
多肽产物
用上述表达载体转化或转染宿主细胞，然后培养于常规营养培养基，培养基根据诱导启动子、筛选转化子或扩增编码目的序列的基因的需要作适应性调整。
转染是指表达载体被宿主细胞摄入，而不论任一编码序列实际上是否表达。许多转染方法已经为本领域技术人员所熟知，例如，CaPO4沉淀和电穿孔。通常，当指征该载体运行的任一信号在宿主细胞中发生时，可以识别出成功的转染。
转化是指将DNA作为染色体外元件或者通过染色体整合体导入原核宿主，从而使得该DNA能够复制。根据所使用的宿主细胞，采用适合该细胞的常规方法进行转化。使用氯化钙的钙处理方法通常用于基本上含有细胞壁屏障的菌体细胞。用于转化的另一方法可以使用聚乙二醇/DMSO。另外可以使用的技术为电穿孔。
原核宿主细胞可以培养于适合于培养所选宿主细胞的任一本领域已知培养基。合适的培养基的实例包括添加了必需营养添加剂的luria肉汤(LB)。所述培养基另外还可以含有筛选因子从而选择性地保证含有表达载体的原核细胞的生长，筛选因子根据表达载体的构成加以选择。例如：用添加了氨苄青霉素的培养基培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞。
另外，还可以引入合适浓度的除碳源、氮源和无机磷酸盐源之外的任一必需添加物，单独或者以与另外的添加剂或培养基的混合物的形式引入，所述混合物例如氮源混合物。所述培养基可以任选含有一种或多种选自下列的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基醋酸盐、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
所述原核宿主细胞适温培养。例如，对于大肠杆菌的培养而言，优选的温度范围为约20℃-约39℃，更优选约25℃-约37℃，甚至更优选约30℃。培养基的pH值可以是约5-约9范围内的任一pH，根据宿主而定。对于大肠杆菌而言，所述pH优选约6.8-约7.4，更优选约7.0。
如果表达载体使用的是诱导型启动子，那么应该在适于活化该启动子的条件下诱导蛋白质表达。例如，如果使用PhoA启动子调控转录，那么可以将转化后的宿主细胞培养于诱导用的磷酸盐-限制性培养基。多种其他诱导物也可使用，根据使用的载体构建体而定，如本领域所知。
微生物表达多肽可以分泌入宿主细胞的周质然后从中回收。蛋白质的回收通常包括裂解微生物，通常通过渗透休克、超声处理或裂解等方式。一旦细胞被裂解，可以通过离心或过滤除去细胞碎片或全细胞。可以通过例如亲合树脂层析对蛋白质进一步纯化。替代地，可以将蛋白质运载入培养基，然后从中分离。除去培养物中的细胞，然后过滤并浓缩培养物上清用于所制备蛋白质的进一步纯化。表达多肽可以使用通常已知方法进一步分离鉴定，例如免疫亲合或离子交换柱进行分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；硅石或DEAE等阳离子交换树脂层析；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；疏水亲合树脂，使用固定于基质上的合适抗原的配体亲合以及Western印迹分析。
除原核宿主细胞之外，真核宿主细胞系统也已为本领域所熟知。参见，例如，美国专利Nos.4,816,567。合适的宿主包括哺乳动物细胞系例如CHO，以及昆虫细胞例如下文所述。
多肽的纯化
可以通过纯化获得所制备多肽的基本上均质的制剂用于进一步的试验和用途。可以使用本领域已知的常规蛋白质纯化方法。下列方法是合适的纯化方法的举例：免疫亲合或离子交换柱分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；硅石或DEAE等阳离子交换树脂层析；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
本发明的方法
本申请发现用所述结构域干扰能调节HGF/c-met活性。
各种物质或分子(包括肽/多肽、抗体等)都可以用作治疗剂。这些物质或分子可以根据已知方法配制成药物学上有用的组合物，其产物可以与药物学可接受的载体介质合并为混合物。可以将具有要求纯度的活性成分与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制备出治疗用制剂( Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))，以冻干剂型或水溶液形式贮存备用。可接受的载体，赋形剂或稳定剂在使用剂量和浓度对于接受者是无毒的，并包括缓冲液例如磷酸盐，柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其他碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨醇；成盐(salt-forming)反离子例如钠；和/或非离子型表面活性剂例如TWEENTM，PLURONICSTM或PEG。
用于体内给药的剂型必须经过灭菌。这在冻干或重配之前或之后通过用过滤除菌膜过滤很容易实现。
本申请中治疗组合物通常置于一带有灭菌入口的容器内，例如，静脉内用溶液包(intravenous solution bag)或者带有皮下注射针可穿透的塞子的药瓶中。
施用途径采用已知方法，例如，注射或静脉内输注，腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内或病变部位内(intralesional)途径，表面给药，或者通过缓释系统。
本发明所述药物组合物的剂量及预期浓度随具体用途而定。合适剂量或给药途径的确定普通医生可以适当掌握。动物试验为确定人治疗用有效剂量提供了可靠指导。可以根据下列文献记载的原理进行有效剂量的种间调整：Mordenti，J.and Chappell，W.″The use of interspecies scaling intoxicokinetics″In Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi et al.，Eds.，Pergamon Press，New York 1989，pp.42-96。
当体内施用本发明的拮抗剂时，常规的剂量为约每天10ng/kg-100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选约1μg/kg/天-10mg/kg/天，根据施用途径而定。具体剂量及递送方法的指导文献中有提供；参见，例如，美国专利Nos.4,657,760；5,206,344；或5,225,212。可以想到的是，不同的剂型对于不同的治疗化合物及不同的病症来说是有效的，靶向一种器官或组织的施用可能需要以与另一器官或组织所不同的方式递送。
当治疗需要一种物质或分子的任一疾病或病症的剂型需要以缓慢释放的方式施用时，可以考虑使用该物质或分子的微胶囊。用于缓慢释放的重组蛋白质的微胶囊已经在下列物质成功实现：人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白细胞介素-2和MN rgp120。Johnson et al.， Nat.Med.，2：795-799(1996)；Yasuda， Biomed.Ther.，27：1221-1223(1993)；Hora et al.，Bio/Technology，8：755-758(1990)；Cleland，″Design and Production of SingleImmunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems，″in  Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach，Powell和Newman，eds，(Plenum Press：New York，1995)，pp.439-462；WO 97/03692，WO96/40072，WO 96/07399；和U.S.Pat.No.5,654,010。
因其生物相容性及大范围的生物可降解特性，这些蛋白质的缓释剂型都采用聚-乳酸-聚乙醇酸(PLGA)(poly-lactic coglycolic acid)聚合物。PLGA、乳酸和羟基乙酸的降解产物可以很快地从人体清除。而且，该聚合物的可降解性可以根据其分子量及组成从数月调整至数年。Lewis，″Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer，″in：M.Chasin and R.Langer(Eds.)， Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker：New York，1990)，pp.1-41。
本发明还提供了筛选下述用途的化合物的方法：鉴定能够通过干扰c-met Sema结构域功能(例如，c-met二聚化、配体结合)抑制HGF/c-met信号转导的物质。筛选试验设计为用于鉴定具有下列特征的化合物：能与c-met Sema序列结合或复合，或者能干扰c-met Sema结构域与其他细胞蛋白质之间相互作用。所述筛选试验包括高通量筛选化学物质/化合物文库的试验，使其特别适于鉴定药物侯选物(例如，肽/多肽，小分子，抗体，等)。
该试验可以多种方式完成，包括蛋白-蛋白结合测定、生物化学筛选试验、免疫测定和细胞为基础的试验，这些都已为本领域熟知。
拮抗剂的全部试验都是常规的，因为它们都要求药物侯选物与c-metSema结构域在足以保证c-met(Sema结构域)与其结合伴侣间相互作用的条件和时间下接触。
结合试验中，所述相互作用是结合，所述形成的复合体可以从反应混合物中分离或检测。一个具体的实施方案中，侯选物物质或分子被固定于固体基质上，例如，固定于微量滴定板，通过共价或非-共价连接。非-共价连接通常伴有下述操作：用该物质/分子的溶液包被所述物质表面，然后使其干燥。替代地，可以使用一种固定的亲合分子将其锚定至一固体表面，例如特异性针对该物质/分子的抗体，如单克隆抗体。所述试验可以通过下述操作完成：将非-固定成分加至固定成分，例如含有锚定成分的包被表面，非-固定成分可用可检测标记物标记。当所述反应完成时，通过例如洗涤去除未-反应的成分，然后对锚定在固体表面的复合体进行检测。当最初的非-固定成分带有可检测标记物时，检测到标记物固定在表面上说明发生了复合反应。当非-固定成分不带标记物时，可以通过例如使用能特异性地结合固定的复合体的标记抗体对复合反应进行检测。
如果候选化合物与c-met sema结构域相互作用但不结合，那么其与该结构域间的相互作用可用熟知用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法进行检测。所述试验包括常规方法，例如，交联，共-免测沉淀法，以及通过梯度或层析柱共-纯化。此外，蛋白质-蛋白质相互作用还可以通过使用酵母为基础建立的遗传系统进行监测，该系统的描述见Fields and co-workers(Fields and Song， Nature(London)，340：245-246(1989)；Chien et al.， Proc. Natl.Acad.Sci.USA，88：9578-9582(1991))as disclosed by Chevray andNathans， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5789-5793(1991)。许多转录活化因子，例如酵母GAL4都由两个空间上独立的模块结构域(modular domains)组成，其中的一个作为DNA-结合结构域，另一个为转录-活化结构域。上述出版物描述的酵母表达系统(通常称为″二元-杂合系统″)利用了这一特性，使用了两种杂合蛋白，其中目标蛋白融合于GAL4的DNA-结合结构域，侯选活化蛋白质融合于活化结构域。在GAL4-活化启动子调控下的GAL1-lacZ报道基因的表达取决于通过蛋白质-蛋白质相互作用的GAL4活性重构。含有相互作用多肽的菌落可以使用β-半乳糖苷酶显色底物进行检测。使用二元-杂合技术鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的成套试剂盒(MATCHMAKERTM)可购自Clontech。该系统还可以扩展用于参与特定蛋白质相互作用的蛋白结构域的作图，以及精确定位(pinpoint)对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。
干扰c-met Sema结构域与其伴侣间相互作用的化合物可以用下述操作测试：通常，在足以实现这两产物间相互作用及结合的条件和时间下，制备含有c-met Sema序列或其部分与结合伴侣(例如，含有Sema，例如c-met胞外结构域的另一多肽)的反应混合物。为了测试侯选化合物抑制结合的能力，在有及无测试化合物存在条件下进行反应。此外，向第三反应混合物加入安慰剂作为阳性对照。混合物中出现的测试化合物与c-met Sema序列间的结合(复合物形成)用上述方法监测。对照反应中形成复合物而含测试化合物的反应混合物中没有形成，这表明该测试化合物能够干扰c-metSema结构域与其结合伴侣间的相互作用。
为了测定抑制因子(例如拮抗剂)，可以让表达c-met的细胞与所筛查的是否具有与c-met Sema结构域功能相关的特定活性的化合物接触，如果该化合物能够抑制所述活性，表明该化合物是Sema结构域(或其亚-结构域)的拮抗剂，特性可以通过测定是否与c-met Sema结构域而不与无关分子特异性相互作用来进一步证实。
有效拮抗剂的其他具体实例包括能与c-met Sema结构域结合的寡核苷酸(可以是aptamer)，特别是抗体，包括但不限于，多-及单克隆抗体和抗体片段，单-链抗体，抗-独特型抗体，以及所述抗体或片段的嵌合或人源化形式，以及人的抗体及抗体片段。替代地，一种有效拮抗剂可以是一种密切相关蛋白质，例如能竞争性抑制野生型c-met作用的c-met Sema结构域突变形式。
有效拮抗剂包括具有下述特征的小分子：能与c-met Sema结构域和/或其结合伴侣上的c-met Sema结合位点结合，从而封闭c-met Sema结构域的正常生物活性。小分子的实例包括，但不限于，肽或肽-样分子，优选可溶性的肽，和合成的非-肽酰的有机或无机化合物。这些小分子可以上述任一筛选试验和/或本领域技术人员熟知的任一筛选技术进行鉴定。
如本申请所述，本发明的拮抗剂可以是一种肽或多肽。获取所述肽或多肽的方法已为本领域所熟知，包括从肽或多肽文库筛选合适目标抗原的结合剂。一个实施方案中，合适的目标抗原含有至少一部分c-met Sema结构域。肽和多肽文库已为本领域所熟知，还可以根据本领域方法制备。参见，例如，Clark et al.，U.S.Pat.No.6,121,416；Bass et al.，U.S.Pat.No.5,688,666。融合于一种异源蛋白成分的肽或多肽文库，例如噬菌体外壳蛋白，已为本领域所熟知，例如，描述见Clark et al.，Bass et al.，同上。一个实施方案中，能够封闭c-met Sema结构域功能的肽含有氨基酸序列LDAQT(SEQ ID NO：1)，LTEKRKKRS(SEQ ID NO：2)，KPDSAEPM(SEQID NO：3)和/或NVRCLQHF(SEQ ID NO：4)，或其变体。一个实施方案中，能封闭c-met sema结构域功能的多肽含有全部或基本上全部的c-met sema结构域。第一肽或多肽结合物的变体可以通过下述方法制备：筛选肽或多肽变体获得目的特征(例如，加强目标亲和力，加强药物动力学，减少毒性，提高治疗指数，等)。诱变技术已为本领域所熟知。另外，扫描(scanning)诱变技术(例如以丙氨酸扫描为基础)特别有助于对肽或多肽各个氨基酸残基的结构和/或功能重要性进行测评。
对本发明的候选物质/分子调节HGF/c-met信号转导和/或与所述信号转导相关的生物学活性的能力进行测定，该测定可通过体内或体外试验测试所述物质/分子的调节能力来完成，这些已为本领域熟知，例如，描述见Okigaki et al.，Biochemistry(1992)，31：9555-9561；Matsumoto et al.，J.Biol.Chem.(1998)，273：22913-22920；Date et al.，FEBS Let.(1997)，420：1-6；Lokker et al.，EMBO J.(1992)，11：2503-2510；Hartman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1992)，89：11574-11578。
抗体
本发明进一步还提供了包括使用抗体干扰c-met活化所需的一种或多种反应的方法，例如c-met二聚化和/或配体与c-met的结合。列举的抗体包括多克隆、单克隆、人源化、双特异性及异源偶联抗体。
1.多克隆抗体
本发明所述抗体包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法已为本领域技术人员所知。多克隆抗体可以通过向哺乳动物注射一种或多种免疫剂制备而得，如果需要再加上佐剂。通常，所述免疫剂和/或佐剂通过皮下或腹膜内多点注射。所述免疫剂含有c-met Sema结构域(或其部分)或其融合蛋白。可以采用将所述免疫剂偶联至已知对于所免疫动物来说具有免疫原性的蛋白质。这类免疫原性蛋白质的实例包括但不限于匙孔-血蓝蛋白，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白，和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A，合成的海藻糖dicorynomycolate)。免疫方案本领域技术人员无需过度试验即可选定。
2.单克隆抗体
替代地，本发明所述的抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，例如文献Kohler and Milstein， Nature， 256：495(1975)中描述的方法。杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其他合适宿主动物的激发产生或能产生可特异性结合所述免疫剂的抗体的淋巴细胞。替代地，所述淋巴细胞可以体外免疫。
所述免疫剂通常含有c-met Semthe结构域(或其部分)或其融合蛋白。通常，如果期望是人源细胞时，则使用外周血单个核细胞(″PBLs″)，或者如果期望是非人源细胞时，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用合适的融合剂，例如聚乙二醇，将所述淋巴细胞与无限增殖细胞系融合形成杂交瘤细胞[Goding， Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，(1986)pp.59-103]。无限增殖细胞系通常是转化后的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可以将所述杂交瘤细胞培养于一合适的培养基，优选含有一种或多种能抑制未融合的无限增殖细生长或存活的物质。例如，如果所述亲代细胞不含次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么杂交瘤的培养基通常含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT”培养基)，这些物质阻止了HGPRT-缺陷细胞的生长。
优选地，无限增殖细胞系能高效融合，通过所选的抗体-产生细胞支持抗体的稳定高水平表达，并且对于HAT培养基等培养基是敏感的。更优选地，无限增殖细胞系是鼠骨髓瘤系，可以获自，例如，the Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California and the American Type CultureCollection，Manassas，Virginia。另外还公开了使用人骨髓瘤和小鼠-人杂交瘤细胞系制备人单克隆抗体[Kozbor， J.Immunol.， 133：3001(1984)；Brodeuret al.， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，MarcelDekker，Inc.，New York，(1987)pp.51-63].
然后测定生长着杂交瘤细胞的培养基中是否存在抗c-met Sema结构域的单克隆抗体。优选地，所述通过杂交瘤细胞制备的结合特异性单克隆抗体可以通过免测沉淀法或通过体外结合试验测定，例如放射性同位素(RIA，或酶联免疫吸附测定)(ELISA)。这类技术及测定试验本领域都已知。单克隆抗体的结合亲和力可以通过例如下述方法测定：the Scatchard analysis ofMunson and Pollard， Anal.Biochem.， 107：220(1980).
在鉴定出所需杂交瘤细胞后，可以对所述克隆进行限制稀释处理，常规方法培养[Goding， 同上]。用于该目的的合适培养基包括，例如，Dulbecco′s Modified Eagle′s培养基和RPMI-1640培养基。替代地，所述杂交瘤细胞可以作为哺乳动物腹水体内培养。
可以用常规免疫球蛋白纯化方法，从培养基或腹水液中分离或纯化出通过亚克隆筛选到的单克隆抗体，例如，蛋白质A-Sepharose，羟磷灰石层析，凝胶电泳，渗透，或亲和层析法。
所述单克隆抗体还可用重组DNA方法制备，例如美国专利No.4,816,567中描述的方法。编码单克隆抗体的DNA可以很容易地分离和测序，使用常规方法(例如，使用能与编码鼠抗体重链及轻链特异性结合的寡核苷酸探针)。表达本发明所述的抗体的杂交瘤细胞是所述DNA的合适来源。一旦分离后，将所述DNA插入表达载体，然后转染入不经转染不能产生免疫球蛋白的宿主细胞，例如猿猴(Simian)COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和骨髓瘤细胞，在该重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成。另外还可以对所述DNA进行修饰，例如，通过用人重及轻链恒定区的编码序列取代同源鼠的序列[(美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，同上]或者将免疫球蛋白编码序列全长或部分共价连接于非-免疫球蛋白多肽。所述非免疫球蛋白多肽可以取代本发明所述的抗体的恒定区，或者也可以取代本发明所述抗体的抗原-结合位点的可变区，制备出嵌合的二价抗体。
所述抗体可以是单价的抗体。用于制备单价抗体的方法已为本领域所熟知。例如，一种包括重组表达免疫球蛋白轻链及经修饰的重链的方法。通常在Fc区中的任一点上截短重链从而阻止重链交联。替代地，也可以将有关的半胱氨酸残基用另一氨基酸残基取代或者删除从而阻止交联。
体外方法也适合用于制备单价抗体。可以使用本领域已知常规技术消化抗体制备其片段，尤其是Fab片段。
另外还可以通过下述方法制备抗体：从噬菌体展示文库筛选能以合适/期望亲和力结合的抗体或抗体片段。所述技术已为本领域所熟知，例如，公开于美国专利Nos.5,750,373；5,780,279；5,821,047；6,040,136；5,427,908；5,580,717，及其中的参考文献。
3.人及人源化抗体
本发明所述的抗体还可以进一步包括人源化抗体或人的抗体。非-人(例如，鼠的)抗体的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)2或抗体的其他的抗原-结合子序列)其中含有最低限度的源自非人免疫球蛋白的序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(接受抗体)，其中该接受抗体互补决定区(CDR)的残基被来自非-人物种的CDR所取代，例如小鼠、大鼠、和兔，所述来自非-人物种的CDR具有期望的特异性、亲和力和其它能力(capacity)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv骨架残基用相应的非-人的残基替代。人源化抗体还可以包含既非接受抗体也非输入的CDR或骨架序列中的残基。通常，所述人源化抗体都基本上包含至少一个，通常为两个可变区，其中全部或者基本上全部的CDR区对应于出自非-人免疫球蛋白的CDR区，而全部或基本上全部的FR区(FR)为人免疫球蛋白共有序列。另外，所述人源化抗体还最好包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白恒定区[Jones et al.， Nature， 321：522-525(1986)；Riechmann et al.， Nature，332：323-329(1988)；和Presta， Curr.Op.Struct.Biol.， 2：593-596(1992)]。
用于将非人抗体人源化的方法已为本领域所熟知。通常，人源化抗体具有一个或多个导入其中的来自非-人的氨基酸残基。这些非人的氨基酸残基通常称为″输入″残基，通常取自“输入”可变区。人源化可以基本上按照Winter及其同事的方法进行[Jones et al.， Nature， 321：522-525(1986)；Riechmann et al.， Nature， 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.， Science，239：1534-1536(1988)]，用啮齿动物的CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序列。因此，所述“人源化”抗体是嵌合的抗体(U.S.Patent No.4,816,567)，基本上其中小于整个人可变区的部分已经被来自非人物种的相应序列所取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，只不过是其中一些CDR残基以及可能还有一些FR残基被来自啮齿动物抗体类似位点的残基所取代。
人抗体还可以使用各种本领域已知技术制备，包括噬菌体展示文库[Hoogenboom and Winter， J.Mol.Biol.， 227：381(1991)；Marks et al.， J.Mol. Biol.， 222：581(1991)]。Cole等和Boerner等描述的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole et al.， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，AlanR.Liss，p.77(1985)and Boerner et al.， J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)]。类似地，可以通过下述方法制备人抗体：将人免疫球蛋白基因座(loci)导入转基因动物，例如，其中内源免疫球蛋白基因已经被部分或全部灭活的小鼠。当攻击时，发现有人抗体产生，这在各个方面都与人体内观察到的十分类似，包括基因重排、装配和抗体的所有组成成员。该方法描述参见，例如美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，以及下列科技出版物：Marks et al.， Bio/Technology  10，779-783(1992)；Lonberg et al.， Nature  368 856-859(1994)；Morrison， Nature 368，812-13(1994)；Fishwild et al.， Nature Biotechnology  14，845-51(1996)；Neuberger， Nature Biotechnology  14，826(1996)；Lonberg and Huszar， Intern. Rev.Immunol.  13 65-93(1995)。
另外还可以使用上述已知的筛选和/或诱变方法，使抗体亲和力成熟(affinity matured)。优选的亲和力成熟抗体具有比制备该亲和力成熟抗体所用起始抗体(通常为鼠的、人源化或人的)高5倍，优选10倍，更优选20或30倍的亲和力。
4.双特异性抗体
双特异性抗体是具有针对至少两种不同抗原的结合特异性的单克隆抗体，优选是人的或人源化的抗体。本发明中，其中的一种结合特异性针对c-met Sema结构域，另一种针对任一其他抗原。
用于制造双特异性抗体的方法已为本领域所知。通常，双特异性抗体的重组制备是以2个免疫球蛋白重-链/轻-链对的共表达为基础的，其中所述的2个重链具有不同的特异性[Milstein and Cuello， Nature， 305：537-539(1983)]。因为是免疫球蛋白重链和轻链随机组合，所以这些杂交瘤(四体杂交瘤(quadromas))生产出10种不同抗体分子的有效(potential)混合物，其中只有1种具有正确的双特异性结构。这种正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤完成。类似方法的描述见WO 93/08829，公开于1993年5月，和Traunecker et al.， EMBO J.， 10：3655-3659(1991)。
可以将具有目的结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合部位)融合于免疫球蛋白恒定结构域序列。优选地，所述融合是与免疫球蛋白重链恒定结构域融合，其中含有至少部分铰链区、CH2和CH3区。优选地，具有其中含有轻链结合必需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少一种所述融合中。将编码所述免疫球蛋白重链融合体以及如果需要还有免疫球蛋白轻链的DNAs插入不同的表达载体，然后共转染入合适的宿主有机体。关于制备双特异性抗体的进一步详细描述参见，例如，Suresh et al.， Methods in Enzymology， 121：210(1986)。
根据WO96/27011中描述的另一种方法，构建一对抗体分子之间的接触面，以使从重组细胞培养物中回收的杂二聚体百分比最大化。优选的接触面至少含有抗体恒定区中CH3区的一部分。这种方法中，将来自第一抗体分子接触面的一个或多个小的氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)。通过将较大的氨基酸侧链取代为较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)，在第二抗体分子接触面上制造出与较大侧链相同或类似大小的互补性“腔(cavities)”。这就为提高杂二聚体产量超过其它不想要的终末副产品例如同二聚体提供了一种方法。
双特异性抗体可以是制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。从抗体片段制备双特异性抗体的技术已经公开于文献。例如，双特异性抗体可以使用化学键制备。Brennan et al.， Science 229：81(1985)公开了一种方法，其中通过蛋白水解切割完整抗体产生F(ab’)2片段。为了稳定邻位二硫基化合物，阻止分子间二硫化物形成，将这些片段在二巯基化物复合剂(dithiol complexing agent)亚砷酸钠存在下还原。然后，将制备的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸盐(酯)(TNB)衍生物。然后，通过用半胱胺还原将其中之一的Fab’-TNB衍生物复原为Fab’-硫醇，然后与等摩尔量的另一种Fab’-TNB衍生物混合形成所述双特异性抗体。制备的双特异性抗体可用作试剂用于酶的选择性固定。
可以直接从大肠杆菌回收Fab’片段，然后化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby et al.， J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的制备方法。每一Fab’片段都从大肠杆菌单独分泌，然后体外进行直接化学偶联形成双特异性抗体。因此，形成的双特异性抗体能够与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，以及能够激发人细胞毒性淋巴细胞对人乳腺肿瘤目标的裂解活性。
直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已经公开。例如，使用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny et al.， J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992).通过基因融合将取自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸锌拉链连接至两种不同抗体的Fab′部分。在绞链区将抗体同源二聚体还原形成单体，然后再氧化生成抗体异源二聚体。该方法还可以用于制备抗体同源二聚体。Hollinger et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)公开的“双抗体(diabody)”技术提供了另外一种制备双特异性抗体的机制。所述片段含有借助接头连接在一起的重-链可变区(VH)和轻-链可变区(VL)，该接头太短因而不同能允许同一链上两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域不得不与互补的VL及VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。另外还公开了另一种策略，利用单-链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段。参见Gruber et al.， J.Immunol.152：5368(1994)。
2价以上的抗体也在本发明范围内。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt et al.， J.Immunol.147：60(1991).
范例性的双特异性抗体能够与单一c-met Sema结构域上的两个不同表位结合，或者与c-met Sema结构域上的表位和另一多肽上的表位结合。
5.异源偶联(Heteroconjugate)抗体
异源偶联抗体也在本发明范围之内。异源偶联抗体由共价联结的两个抗体组成。这类抗体已经被计划用于，例如，将免疫系统细胞靶向至不想要的细胞[(美国专利No.4,676,980]，及用于治疗HIV感染[WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089]。可以体外使用已知的合成蛋白化学方法制备所述抗体，包括涉及交联剂的方法。例如，可以使用二硫化物(disulfide)交换反应或者通过生成硫醚键，构建免疫毒素。适于该目的的试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(酯)和甲基-4-巯基丁亚氨酸酯(mercaptobutyrimidate)以及美国专利No.4,676,980中公开的试剂。
6.效应子作用(Effector Function)构建
可以期望在效应子作用方面对本发明所述的抗体进行修饰，从而提高，例如，抗体治疗癌症的效力。例如，可以将半胱氨酸残基导入Fc区，从而允许该区内链间二硫键的形成。如此制备的同源二聚抗体提高内化能力和/或增强补体-介导细胞杀伤以及抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.， J.Exp Med.， 176：1191-1195(1992)和以及Shopes， J.Immunol.，148：2918-2922(1992)。抗肿瘤活性增强的同源二聚抗体也可以使用异源双功能交联物制备，描述见Wolff et al. Cancer Research， 53：2560-2565(1993)。替代地，可以构建具有双Fc区因而提高补体溶解及ADCC能力的抗体。参见Stevenson et al.， Anti-Cancer Drug Design，3：219-230(1989)。
7.免疫偶联物
本发明还涉及免疫偶联物，它包含与细胞毒制剂偶联的本文所述抗体，所述细胞毒制剂例如化疗剂，毒素(例如细菌，真菌，植物或动物源性的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即放射偶联物)。
上文已描述了用于产生此类免疫偶联物的化疗剂。可以应用的酶活性毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。多种放射性核素可用于制备放射性偶联的抗体，实例包括212Bi，131I，131In，90Y和186Re。
抗体和细胞毒制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚胺基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚胺酸酯的双功能衍生物(如盐酸二甲基己二酸亚氨酯)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glu tareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至抗体的偶联剂之一。见WO94/11026。
另一个实施方案中，将抗体偶联于一种″受体″(例如链霉亲和素)用于肿瘤预靶向(pretargeting)，其中将所述抗体-受体偶联物施用给患者，然后使用澄清剂(clearing agent)除去循环系统中的未结合偶联物，之后施用″配体″(例如，亲和素)，该“配体”偶联于细胞毒性物质(例如，放射性同位素)。
8.免疫脂质体
另外还可将本申请公开的抗体配制成免疫脂质体。可以用本领域已知的方法制备含抗体的脂质体，例如下列文献中描述的方法：Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 82：3688(1985)；Hwang et al.， Proc.Natl Acad. Sci.USA， 77：4030(1980)；和美国专利Nos.4,485,045及4,544,545。增加循环时间的脂质体的描述见美国专利No.5,013,556。
特别有用的脂质体可以通过反-相蒸发法制备，使用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物。用规定大小孔径的滤器挤出脂质体得到具有预期直径的脂质体。可以通过二硫化物-交换反应，将本发明所述抗体Fab′片段偶联至Martin et al.， J.Biol.Chem.， 257：286-288(1982)中描述的脂质体。可以任选地在脂质体中含有化疗剂(例如阿霉素)。参见Gabizon et al.， J.National Cancer Inst.， 81(19)：1484(1989)。
9.抗体的药物组合物
上文所述筛选试验鉴定出的抗体及其他分子可以药物组合物形式施用，用于治疗各种病症。
如果用完整抗体作为抑制因子，那么优选使用具有内化的抗体。但是，脂转染物或脂质体还可用于将本发明所述物质/分子递送入目的细胞。当使用抗体片段时，优选使用较小的抑制性片段。例如，可以根据抗体的可变区序列，设计出符合下列要求的肽分子：即保留了结合c-met Sema结构域和/或干扰c-met Sema结构域与其结合伴侣间相互作用的能力。这类肽可以化学合成和/或通过DNA重组技术制备。参见，例如，，Marasco et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90：7889-7893(1993)。本发明所述剂型还可含有一种以上的所治疗特定症状必需的活性化合物，优选不会彼此抵触具有互补活性的化合物。替代地，或者另外地，所述组合物可以含有能增强其功能的物质，例如，细胞毒性物质、细胞因子、化疗剂或生长-抑制剂。这类分子适合以对预定目标有效的量联合出现。
还可以将活性成分包埋在制备的微胶囊中，例如，通过凝聚技术或通过界面聚合，例如，羟甲基纤维素或明胶-微胶囊及聚甲基异丁烯酸酯微胶囊中，胶体药物发送系统(例如，脂质体，白蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒，和纳米胶囊)中或者巨乳剂(macroemulsions)中。所述技术描述见Remington′s  Pharmaceutical Sciences，同上。
用于体内给药的剂型必须经过灭菌。这一点通过用无菌过滤膜过滤很容易实现。
可以制备缓慢释放制剂。缓慢释放制剂的合适的实例包括内含抗体的固态疏水聚合物半透性基质，该基质为有形物体，例如，薄层，或微胶囊。缓慢释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利No.3,773,919)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物与醋酸亮丙瑞林(leuprolide)组成的可注射微球体)，和聚-D-(-)-3-羟丁酸。尽管乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸等聚合物可使分子释放时间在100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间则较短。当包封抗体在体内长时间存在时，在37℃湿润环境它们会变性或聚集，引起生物活性的损失和免疫原性的改变。可以根据选择机理的不同制定合理策略进行稳定化处理。例如，如果聚集机理是由于硫代-二硫化物互换而形成分子间S-S键，可以通过下述操作实现稳定化：修饰巯基残基，从酸性溶液冻干，控制湿度，使用合适添加剂，和开发特异性聚合物基质组合物(polymer matrix composition)。
制品
本发明的另一方面，提供了含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症材料的制品。所述制品包含容器以及该容器上的或连接到该容器之上的标签或包装插页。合适的容器包括，例如，瓶，小药瓶，注射器，等。所述容器可以各种材料制成的，例如玻璃或塑料。所述容器装有自身或与其他组合物联用时能有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物，带有一灭菌入口(例如，所述容器可以是一种静脉内用溶液包(intravenous solution bag)或者带有皮下注射针可穿透的塞子的药瓶)。所述组合物中至少一种活性物质是本发明的拮抗剂。所述标签或包装插页标明所述组合物可用于选择治疗的病症，例如癌症。而且，所述制品可以包含：(a)其中装有组合物的第一容器；该组合物含有本发明的拮抗剂；和(b)其中装有组合物的第二容器；该组合物含有其他细胞毒性剂。本发明这种实施方案中的制品还可以进一步包含一包装说明书，标明所述第一和第二组合物可用于治疗特定的病症，例如癌症。替代地，或另外地，所述制品还可以进一步包含第二(或第三)容器，其中装有药物学-可接受的缓冲液，例如灭菌剂注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。进一步还可以包括根据商业需要及用户需求而定的其他物质，包括其他缓冲液，稀释剂，滤膜，针，和注射器。
下面是本发明所述方法和组合物的实施例。当然，根据上文提供的一般说明，还可以实施各种其他实施方案。
实施例
材料&方法
构建体和重组蛋白质
使用常规PCR方法构建胞外亚-结构域缺失的c-met。使用的引物为含有Sema起始部分、PSI、第一IPT或第四IPT结构域、侧面带有KpnI位点的N-末端引物，和直至第959位Met残基且侧翼带有StuI位点的C-末端引物。用c-Met作为模板，使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)，按照厂商建议，将每一克隆的PCR片段插入pCR-Blunt II-TOPO载体。通过DNA测序对所述克隆进行验证。然后通过KpnI和EcoRV在C-末端添加一标签将构建体亚克隆入pcDNA3.1 V5/His载体(Invitrogen)。通过HindIII和KpnI位点在每一克隆的N-末端都添加上Met的信号肽。用HindIII和EcoRV消化每一克隆，然后通过HindIII和PmeI亚克隆入pRK5TKneo载体。对EC-WT Flag和EC-WT V5/His克隆而言，含HindIII位点的N-末端引物与至Met第595位残基侧翼带有StuI位点的C-末端引物配对使用。将EC-WT V5/His通过HindIII/StuI亚克隆入pcDNA3.1 V5/His的HindIII/EcoRV位点，然后亚克隆入pRK5Tkneo，如上所述。对EC-WT Flag而言，将PCR片段连接入pCR-Blunt II-TOPO载体。将含Flag标签的寡核苷酸序列插入StuI和KpnI之间。然后通过HindIII和EcoRV/ScaI将EC-WT Flag亚克隆入pRK5Tkneo。R.Schwall(Genentech)提供了重组的HGF和抗-Met5D5-Fab。用哺乳动物细胞制备scHGF，此前已有描述(Peek等，2002)。
为了获得重组Sema和PSI结构域，在编码MET受体第25-567位残基的区域上进行PCR扩增。在C-末端添加8x His标签和NotI位点，将N-末端直接融合至昆虫细胞分泌信号pAcGP67A(BD Biosciences)的C-末端。PCR产物用SpeI和NotI消化后亚克隆入pAcGP67A。将纯化后的质粒DNA(pAcGP67A加MET sema和PSI结构域)转染入Sf9昆虫细胞，按照厂商提供的方法(BD Biosciences)。就表达而言，以5×105个细胞/mL密度培养于ESF 921培养基(Protein Expression，LLC)中的1L的Hi5昆虫细胞用10mL病毒原液转染，27℃孵育72小时。然后3000g离心15分钟除去上清中的细胞。向上清中加入1mM NiCl2、5mM CaCl2和50mM Tris pH8.0。过滤上清，通过重力自流动向2mL Ni-NTA柱(Qiagen)上样，然后用20mL洗涤缓冲液(50mM Tris pH8.0，500mM NaCl，5mM咪唑)洗涤。蛋白质用含有50mM Tris 8.0、300mM NaCl、250mM咪唑的缓冲液洗脱。单独制备重组Sema结构域的尝试没有得到此前报道的蛋白质Sema 3A(Antipenko等，2003)。
免测沉淀和Western印迹分析
细胞系获自美国典型微生物保藏中心(ATCC)。将293细胞维持培养于添加了10％FBS(Sigma)、青霉素/链霉素(GIBCO)和谷氨酰胺的DMEM中。A549、H441和MDA-MB-435细胞维持培养于添加了10％FBS、青霉素/链霉素(GIBCO)和谷氨酰胺的50∶50DMEM/F12(Cellgro)中。按照厂商提供的说明书，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用1-12μg指定构建体转染细胞。24小时后，收获细胞，用含完全蛋白酶抑制剂鸡尾片(Completeprotease inhibitor cocktail tablet)和磷酸酶抑制剂鸡尾(cocktail)2(分别购自Roche和Sigma)1％NP40裂解缓冲液。对于Met酪氨酸磷酸化和MAPK磷酸化试验而言，用0.5％BSA让细胞血清-饥饿2小时。用10μg/ml抗-Met5D5-Fab或rSema处理后的细胞在裂解前再继续孵育1小时。离心除去细胞碎片，上清用Protein A Sepharose(Sigma)或Protein G-Plus琼脂糖微珠(Santa Cruz)预澄清1小时。然后取500μg裂解物用10μg 5D5抗体(Genentech)或35μl Met(C-28)琼脂糖偶联物(Santa Cruz)进行免疫沉淀，4℃振荡过夜。对于HGF结合试验而言，取500μg裂解物用5μg scHGF或HGF孵育，然后用1μg V5抗体免疫沉淀。加入蛋白A或G微珠再过2小时后，免疫沉淀物用1％NP40裂解缓冲液洗涤3遍。加入含10mM DTT的2X加样缓冲液后，将样品进行4-12％Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)电泳。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶或BSA封闭1小时，然后4℃下振动过夜，用下列物质进行探测：1∶5000V5(Invitrogen)，1∶10000C-末端Met(C-12)(Santa Cruz)，1∶1000MAPK(Cell Signaling)，1∶500HGF-α(145)(Santa Cruz)，1∶1000P-MAPK(Cell Signaling)，1∶1000His(Cell Signaling)，或1∶1000磷酸酪氨酸4G10(Upstate)抗体。抗小鼠或兔IgG二抗(Amersham)按1∶5000稀释使用。通过加强的化学发光(ECL-Plus，Amersham)对蛋白质进行了检测。
共价亲和力交联分析
对此前公开方法(Blechman等，1995)调整后进行交联试验。A549，H441，MDA-MB-435，和293细胞用0.5％BSA血清饥饿两小时。除去培养基代之以PBS。按照厂商提供的说明书，用递增浓度的交联剂硫代-EGS(Pierce)对细胞进行处理。类似地，将293细胞置于6-孔平板，然后用0.1-4μg指定构建体进行转染，使用Lipofectamine 2000(invitrogen)。24时后，用PBS替换培养基，用硫代-EGS进行细胞交联。然后，用含蛋白酶和磷酸酶抑制因子的1％NP40裂解缓冲液裂解细胞。然后将溶于还原性加样缓冲液中的10μg裂解物立即进行8％或4-12％Tris-甘氨酸凝胶电泳分析，转移至硝酸纤维素膜，用5％奶封闭1小时。用1∶1000Met C-12(Santa Cruz)或1∶5000 V5抗体对膜进行探测，4℃振动过夜。用1∶5000的二抗孵育后，用ECL-Plus对蛋白质进行检测。用EC-WT-Flag和EC-WT-V5/His共转染，然后同上所述进行交联。取500μg交联后的裂解物用V5或Flag抗体免疫沉淀，8％Tris-甘氨酸凝胶电泳分析，转移至硝酸纤维素膜，并用1∶5000 V5或1∶1000 Flag(Sigma)抗体免疫沉淀。蛋白质用ECL-Plus检测。
划痕(Scrape)试验
将H441细胞以4.5×104个细胞/孔的密度种植于装有含10％FBS的50∶50 DMEM/F12的96-孔平板内。次日，在每一孔汇合的单层上作单一划痕，按照此前描述方法(Lorenzato et al.，2002)。然后用含0.5％BSA的培养基孵育孔，然后用模拟物、10μg/ml 5D5，10μg/ml Sema或100ng/ml HGF处理。对划痕进行监测，每天拍照。代表性的结果显示2天。
迁移试验
对此前公开方法(Coltella et al.，2003)调整进行跨孔(transwell)移动试验。将含0.5％BSA的培养基中的1.2×105个MDA-MB-435细胞种植于事先用10μg/ml IV型胶原纤维(Sigma)包被过的每一跨孔(Costar)的上部腔室。向上部腔室加入模拟物、10μg/ml抗-Met 5D5-Fab，或10μg/ml Sema。作为阳性对照，另外向模拟物-处理孔的下部腔室添加100ng/ml HGF。次日，这些孔用4％多聚甲醛固定，用0.5％龙胆紫染色。已经移动到下部腔室的细胞用10％乙酸溶解，用微量培养板阅读仪测量560nm处的吸光度。
结果
Sema结构域是Met受体交联所必需的
为了测定Met胞外结构域在受体二聚化及活化中所起的作用，制备了亚-结构域缺失的Met，如图1所示。每一缺失突变体都在N-末端侧翼带有信号肽(S.P.)，C-末端跨膜区带有V5/His标签。使用硫代-EGS单个测定Met缺失突变体的交联能力。将用递增浓度sulfo-EGS处理过的加V5/His标签的缺失突变体的转染体进行裂解，转染体裂解后用4-12％SDS-PAGE电泳分析。在未经sulfo-EGS处理的样本中，EC-WT-V5/His表现为处理后的单体(EC-M，～90kD)和未经处理的(*，～120kD)蛋白质。检测到了EC-WT交联，表现为从较低(EC-M，～90kD)变为了较高的迁移二聚体(EC-D，～180kD)，如图2A所示。不含Sema结构域的Met变体没有出现类似移动。值得注意的是，正如所料，未经处理的EC-WT(*)Met没有出现交联，因为硫代-EGS是细胞膜不透性的。当出现在细胞表面上时，胞内的Met单-链前体受到蛋白水解切割(Giordano et al.，1989)。因为硫代-EGS有限的通透性，所以选择其作为交联剂，对交联的膜-插入处理后的Met受体的效力进行了测定。
为了查明膜-结合胞外Met是否形成同型二聚体，用EC-WT-V5/His与EC-WT-Flag共转染细胞，然后用硫代-EGS交联。裂解细胞，用V5抗体免疫沉淀，8％SDS-PAGE凝胶电泳分析，然后用Flag或V5抗体进行免疫印迹试验。免疫印迹结果显示含有EC-WT-Flag和EC-WT-V5/His的较高的移动形式(EC-D，～180kD)，说明两种形式的EC-WT都发生了交联及共免疫沉淀。使用Flag抗体的反相免测沉淀得到类似结果(图2B)。另外在V5免疫沉淀物中检测到了剩余的未交联的EC-WT Flag(EC-M)，但是随着加入的硫代-EGS的增加变为较高的移动形式(图2B)。总之，交联试验表明当sema结构域存在时形成了胞外的膜-结合Met同源二聚体。
HGF和scHGF(R494E)结合Sema结构域
HGF以非活性单-链前体的形式分泌，被细胞外蛋白酶切割为α和β链(Naka et al.，1992)。切割得到的二硫键连接的HGF的α和β链能以高亲和力结合Met受体(Bottaro et al.，1991；Naldini et al.，1991)。对Met缺失突变体的结合HGF的能力进行了测试。用EC-WT，ΔS，ΔP，ΔIPT3，TM或模拟物转染细胞(图3A)，与HGF孵育细胞裂解物。用V5抗体免疫沉淀，然后4-12％SDS-PAGE电泳分析，α链-HGF抗体检测发现HGF只与EC-WT结合(图3B)。HGF不结合其它Met缺失突变体的结果说明：Sema结构域是HGF结合所必需的。
含有R494E突变的单链HGF[scHGF(R494E)]能够结合并抑制Met受体的活化(Lokker et al.，1992)。另外还对scHGF(R494E)结合Met胞外结构域进行了测试。裂解转染后的Met缺失突变体，用scHGF(R494E)孵育，按照上述方法进行分析。数据显示scHGF(R494E)只结合EC-WT，而不结合Sema缺失变体(图3C)。这些结果与共免疫沉淀试验相互印证，其中HGF和scHGF(R494E)都能与重组EC-Met和Sema结构域蛋白结合(数据未给出)。因此，这些数据与观察结果是一致的，Met的Sema结构域是HGF的相互作用位点(Gherardi et al.，2003)。这些数据还表明Met的Sema结构域也是scHGF(R494E)结合的相互作用位点。
5D5单克隆抗体能结合Met的Sema结构域
现已发现抗-Met 5D5的Fab片段(抗-Met 5D5-Fab)能抑制HGF/c-met信号转导。参见，例如，美国专利Nos.5,686,292；5,646,036；6,207,152 &6,214,344。通过与抗-Met 5D5的共-免测沉淀试验，对Met缺失构建体进行测试。如前所述用Met缺失构建体或模拟物转染细胞。这些细胞裂解物用抗-Met 5D5免疫沉淀，然后用His抗体进行免疫印迹测试。如图3E所示，只有含Sema的EC-WT才结合抗-Met 5D5。裂解物中检测到了全部的转染蛋白质(图3D)，内源Met被抗-Met 5D5免疫沉淀(图3F)。因此，所述数据表明抗-Met 5D5能结合Met的Sema结构域。由于抗-Met 5D5-Fab可作为拮抗剂，所以可用作下列功能研究中的对照。
肿瘤细胞系中的内源Met交联
由于这些数据表明Sema结构域与两种功能有关，即结合HGF和受体二聚化，所以对Met Sema结构域在排除了HGF结合的二聚化方面的作用进行检测。除非另有说明，后面的所有试验都在HGF存在条件下进行。通过RT-PCR和Western印迹，对HGF在293(胚肾)、H441(肺腺癌)、A549(肺癌)和MDA-MB-435(乳腺癌)细胞系中的表达水平进行了测定。MDA-MB-435和H441细胞没有可检测的HGF RNA或蛋白质，尽管A549和293细胞表达HGF RNA并且在裂解物和条件培养基中有少量可检测的HGF蛋白(数据未给出)。为了测定各种肿瘤细胞系表达的Met在无HGF存在下能否交联，在试验过程中将这些细胞维持在含0.5％BSA的无血清培养基中。如前所述用硫代-EGS交联这些细胞系，裂解物用4-12％SDS-PAGE电泳分析，然后用Met抗体进行免疫印迹分析。在无交联剂存在时，Met表现为处理后的(Met-M)和未经处理的(*)蛋白质，这与此前EC-WT交联试验中观察到的一样(图2A)。每一细胞系中，甚至在只有0.1mM硫代-EGS存在下，也都出现了Met-M向较高的移动形式(Met-D)的变动(图4)。随着交联剂浓度的升高，由Met-M到Met D形式的变动增加。与我们此前观察到的一致，细胞内的未经处理的Met在硫代-EGS处理时并非发生交联。相反，用100ng/ml HGF孵育A549细胞，出现了如前所述的交联。Met免疫印迹试验发现：HGF存在时，与无HGF存在时看到的Met-D相比出现了更高的移动形式(图4)。这些数据表明：在无HGF存在时已经形成了交联的Met二聚体，由于与HGF结合而进一步变动。
用rSema和抗-Met 5D5-Fab抑制肿瘤细胞中的Met信号传导
由于这些数据表明Sema结构域是Met二聚化所必需的，制备含Met受体Sema和PSI结构域的重组Sema(rSema)蛋白(参见材料和方法部分)，测试其对Met信号传导的功能性影响。用递增浓度的rSema处理人肿瘤细胞，对HGF刺激时的Met酪氨酸磷酸化及促有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的下游活化进行测试。对A549细胞实施血清饥饿，在HGF存在下用递增浓度的rSema孵育。回收细胞裂解物，用C-末端Met抗体免疫沉淀，然后用磷酸-酪氨酸抗体进行免疫印迹分析。与HGF单独刺激相比，在HGF存在下加以递增量的rSema处理，出现了Met磷酸化减少(图5A和5B)。类似地，配体存在下用递增量的rSema处理时，MAPK磷酸化也减少。另外以类似方式用rSema和HGF处理H441和MDA-MB-435细胞系，发现磷酸-MAPK呈现剂量依赖性减少(图5A和5B)。
此外，还对无HGF存在时rSema抑制Met活化进行了测试。作为对比，在功能试验中使用了能作为Met受体拮抗体的抗-Met 5D5-Fab。将A549细胞经受血清-饥饿，然后用抗-Met 5D5-Fab或rSema进行处理。与模拟物处理的对照相比，用rSema或抗-Met 5D5-Fab处理导致配体非依赖性的Met磷酸化及磷酸-MAPK水平的抑制(图5C和5D)。类似地，H441和MDA-MB-435细胞系另外还在无HGF存在下用抗-Met 5D5-Fab和rSema处理；MAPK磷酸化减少所遵循的趋势与此前在A549细胞上观察到的类似。这些结果表明rSema不仅能抑制配体依赖性及非依赖性的Met磷酸化，而且还能影响下游的MAPK信号转导。
另外还对Met缺失突变体减弱内源Met信号传导的能力进行了测定。用所述Met缺失突变体转染细胞(图5E)；裂解物用C-末端Met抗体免疫沉淀，然后用磷酸-酪氨酸抗体作免疫印迹分析。与模拟物处理的对照相比，EC-WT转染子表现出Met酪氨酸磷酸化和磷酸-MAPK的减少(图5F和5G)。Sema缺失的转染子尽管表现出了磷酸-Met一定程度的减少，但是并没有出现下游的MAPK磷酸化的减少(图5F和5G)。综合来看，这些结果证实了Sema结构域是Met活化所必需的，进一步验证了此前的rSema抑制Met信号转导的试验结果(图5A-D)。
细胞移动被rSema和抗-Met 5D5-Fab抑制
用H441细胞进行划痕(Scrape)试验，测量Met介导的细胞运动力(Lorenzato et al.，2002)。在第0天对每一孔中高密度培养的H441细胞进行划痕，试验过程细胞维持在含0.5％BSA的无血清培养基中(图6)。细胞用10μg/ml rSema或5D5或100ng/ml HGF处理作为阳性对照或者模拟物处理。第2天时，模拟物处理孔的裂隙完全闭合，而rSema处理的细胞中的裂隙仍然存在(图6)。抗-Met 5D5 Fab处理的细胞中的裂隙变小，但仍然可见。HGF处理后的细胞到第1天时闭合了裂隙，在第2天仍然如此。这些观察结果在4个独立试验中都一致。这些数据表明：没有HGF存在，rSema和抗-Met 5D5-Fab都抑制内源性Met活化介导的细胞运动力。
为了测试无配体存在下rSema对细胞运动力的影响，用0，0.1，0.5，或52μg/ml rSema加20ng/ml HGF处理细胞。单用HGF处理后的细胞第1天时裂隙完全闭合。相反，在HGF存在时用rSema处理的细胞呈剂量依赖性方式保持裂隙(数据未给出)。这些数据表明：在HGF存在下，rSema抑制Met介导的细胞运动。
用MDA-MB-435细胞检测Met趋动的细胞迁移的跨孔实验(transwellassay)。无HGF存在时，模拟物处理后细胞的移动情况如图7所示。这种移动随着rSema，和抗-Met5D5-Fab的加入程度变小。向这些细胞加入HGF导致移动增加了3倍。这些数据与H441细胞系的划痕(Scrape)试验结果相关。另外，还用细胞运动力及移动试验对H441和MDA-MB-435细胞中Akt的活化进行了测试。试验发现：在HGF存在下，随着rSema浓度的增大，Akt磷酸化呈剂量依赖性减少。这些数据与下列结果相关：在配体存在下，rSema能够抑制Met-介导的细胞运动力。总之，这些试验结果都支持了下述结论：Sema结构域拮抗剂，例如含Sema序列的重组多肽不仅能够抑制Met活化，而且在配体依赖及非依赖环境下都能阻断细胞运动力及移动的下游反应。
讨论
Sema结构域位于semaphorins及其配体plexins的胞外区，充当受体/配体识别位点(Tamagnone et al.，1999)。近期出版的Sema 3A和Sema 4D的晶体结构表明：这些Sema结构域形成7叶片的(seven-bladed)β-螺旋(propeller)结构，该结构对于同源二聚化很重要(Antipenko et al.，2003；Love et al.，2003)。本申请提供的体外及体内试验证据有力的支持了Sema结构域在Met受体二聚化中的作用。
数据表明Met交联只发生在Sema结构域存在的条件下，说明Sema结构域在受体二聚化中发挥着必不可少的作用。此外，无HGF存在时出现的Met交联表明：这些肿瘤细胞系中的Met受体在无配体刺激时也能二聚化。
Sema3A晶体结构表明：Sema结构域中的4个相互作用的“环”对于建立Sema3A二聚体之间的接触面发挥重要作用(Antipenko et al.，2003)。Sema3A序列与Met对齐结果显示：其中的1个“环”位置靠近Met Sema结构域中R307和S308之间的蛋白水解切割位点，这表明了它在Met二聚化中的重要性。
本申请提供的细胞试验表明：无HGF存在时，Sema结构域介导Met受体的同嗜的相互作用。值得注意的是，此前的报道认为Met还可与CD44v6，α6β4整联蛋白和plexin B1相互作用(Giordano et al.，2002；Orian-Rousseau etal.，2002；Trusolino et al.，2001)。本申请所述结果为下列观点提供了支持：Met通过这些高度保守的Sema结构域与plexin B1结合在一起。此外，Met和semaphorins的过表达已发现于癌症和侵入性转移，因而可以进一步推定任一有效的相互作用都能由Sema结构域介导。但是，这些分子的作用以及这些病理环境中介导异聚相互作用的机制得益于进一步的研究。CD44v6和α6β4有无包含Sema结构域还不得而知。因此，通过Sema和/或PSI或IPT结构域与其他蛋白基序间的相互作用可能对于启动特异性生物反应很重要(Bertotti and Comoglio，2003)，因此不能作为一种可能性被排除。
对于RTKs例如成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)和RET，每一受体胞外结构域中半胱氨酸间的二硫键都与受体二聚化有关(Robertson etal.，2000)。对于Met受体，本申请提供的数据表明：无论是富含半胱氨酸PSI结构域还是四个IPT结构域在无Sema结构域时都没有出现交联，表明这些区域并非是Met二聚化所必需的。另外，尽管Met的PSI结构域缺失，Met与plexin B1间的相互作用都不改变(Giordano et al.，2002)。尽管本申请的功能试验中使用的rSema含有Sema和PSI结构域(参看材料和方法)，本申请的交联试验和报道的plexin B1中PSI结构域缺失(Giordano et al.，2002)有力证明：无PSI结构域时，Sema结构域在这些相互作用中发挥着主要作用。值得注意的是，制备内在PSI或IPT缺失的尝试导致本发明试验未使用的未-处理的Met的表达，因此，在Met二聚体形成或一些其他机制中，例如报道的EGFR二聚化自动抑制中，PSI和IPT结构域是否发挥作用还有待明确(Ferguson et al.，2003)。胞外Met晶体结构的解析将有助于更进一步了解这些复合体相互作用。
RTKs的配体-受体复合体结晶图研究已经提供了几种框架性的观点(structural insights)。Flt-1和TrkA都利用配体的二聚化达到受体的二聚化和活化(Wiesmann et al.，1997；Wiesmann et al.，1999)。对于FGFR，与FGF配体结合的肝素能驱动受体二聚化(Plotnikov et al.，1999)。相反，EGF:EGFR(表皮生长因子受体)复合体通过受体同源二聚化，与配体-配体间相互作用无关(Garrett et al.，2002；Ogiso et al.，2002)。Met与HGF的相互作用不甚清晰，尽管近期报道提出Met、HGF及肝素以1∶1∶1复合体存在(Gherardi et al.，2003)。我们的细胞试验与报道的这些体外试验结果不同，由于细胞成分例如细胞外基质(ECM)存在于我们的实验中，可能对体内受体二聚化有一定影响。由于ECM含有层粘连蛋白及其他参与细胞相互作用的成分(Giancotti and Ruoslahti，1999)，因此很可能所有促进Met二聚化的蛋白还没有得以鉴定。
本发明证明，Sema结构域对于与HGF的相互作用已足够，这与先前的观察(Gherardi等，2003)一致，并且rSema能抑制配体驱动的Met活化。因此，很可能rSema可以通过结合HGF有效地抑制HGF-依赖性的Met活化。另外，还发现HGF依赖的Met过表达肿瘤会成为rSema的靶标，方式与Ron Sema结构域介导的配体-依赖性受体活化相似(Angeloni et al.，2003)。本申请提供的数据表明Sema-HGF相互作用位点不同于Met二聚化界面，因为交联试验表明配体-非依赖性的Met二聚体当与HGF结合时进一步移动(图4)。这些数据说明二聚化界面与HGF相互作用位点是不-重叠的。
此外，本申请还发现Sema结构域对于已知c-met拮抗剂抗体，抗-Met5D5-Fab的结合是必需的。由于抗-Met 5D5-Fab还能抑制配体-非依赖性的受体活化，如本申请试验显示那样，所以除HGF竞争之外，抗-Met 5D5-Fab可以通过空间位阻阻断受体二聚化。同样地，rSema也能抑制配体非依赖性及依赖性的Met活性，表明rSema可以用作有效的Met抑制剂。类似的抑制活性对c-kit受体已有报道(Lev et al.，1992)。在本试验提供的配体非依赖环境中，Met Sema结构域在二聚化中的作用不同于Ron sema结构域的作用。尽管Ron Sema结构域能够竞争结合MSP抑制Ron活性，但是它不能抑制Ron受体的二聚化(Angeloni et al.，2003)。本申请的功能性试验是在有或无HGF存在下进行的，说明Met Sema结构域对配体依赖性和配体非依赖性的受体活化都能抑制。这些数据表明：尽管Met与Ron的结构基元及结合相互作用类似，体内环境可能确定了不同的同嗜的相互作用。
本申请证明Met Sema结构域不仅是配体依赖性Met受体活化的强效抑制剂，而且也是配体非依赖性Met受体活化的强效抑制剂。本申请的数据表明Met的Sema结构域能阻止肿瘤细胞中的受体活化，从而抑制MAPK磷酸化、细胞运动力及迁移。这些试验结果提供了通过定向Met的Sema结构域作用治疗与HGF/c-met信号转导轴失调相关肿瘤的可能性，包括但不限于使用Sema结构域自身作为生物治疗药物。
部分参考文献列表
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Claims (55)

1.一种能干扰c-met二聚化的c-met拮抗剂。
2.权利要求1所述的c-met拮抗剂，其能干扰c-met Sema结构域的二聚化功能。
3.权利要求1所述的c-met拮抗剂，其能结合c-met从而干扰c-met二聚化。
4.权利要求1所述的c-met拮抗剂，其结合c-met从而干扰c-metSema结构域影响c-met二聚化的能力。
5.一种c-met拮抗剂，其能与c-met Sema结构域中的序列特异性结合。
6.权利要求1或5所述的拮抗剂，当与c-met分子结合时，其能抑制所述分子的二聚化。
7.权利要求6所述的拮抗剂，其中所述的二聚化包括同源二聚化。
8.权利要求1-7中任一项所述的拮抗剂，其不能与c-met上的HGF结合位点结合。
9.权利要求1-8中任一项所述的拮抗剂，其基本上不能与肝细胞生长因子(HGF)竞争性结合c-met。
10.权利要求1-9中任一项所述的拮抗剂，其基本上不能抑制肝细胞生长因子与c-met间的结合。
11.权利要求1-8中任一项所述的拮抗剂，其能与HGF竞争性结合c-met。
12.权利要求1-11中任一项所述的拮抗剂，其能与c-met上的表位结合，该表位不同于美国典型培养物保藏中心保藏号为ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)杂交瘤制备的单克隆抗体所结合的表位。
13.权利要求1-11中任一项所述的拮抗剂，其不是美国典型培养物保藏中心保藏号为ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)的杂交瘤细胞系制备的单克隆抗体。
14.权利要求1-13中任一项所述的拮抗剂，其是一种抗体或其片段、肽，或其组合。
15.权利要求1-14中任一项所述的拮抗剂，其中该拮抗剂与c-met的结合能抑制HGF依赖性或非依赖性的c-met活化。
16.权利要求1-15中任一项所述的拮抗剂，其中该拮抗剂与细胞内c-met的结合能抑制该细胞的增殖，分散，形态发生和/或运动。
17.权利要求1-16中任一项所述的拮抗剂，其中该拮抗剂包含其中含有至少一部分c-met Sema结构域或其变体的肽。
18.权利要求17所述的拮抗剂，其中所述肽含有至少一种选自下列的序列：LDAQT(SEQ ID NO：1)，LTEKRKKRS(SEQ ID NO：2)，KPDSAEPM(SEQ ID NO：3)和NVRCLQHF(SEQ ID NO：4)。
19.权利要求17所述的拮抗剂，其中所述肽基本上由至少一种选自下列的序列组成：LDAQT(SEQ ID NO：1)，LTEKRKKRS(SEQ ID NO：2)，KPDSAEPM(SEQ ID NO：3)和NVRCLQHF(SEQ ID NO：4)。
20.权利要求17所述的拮抗剂，其中所述肽含有序列LTEKRKKRS(SEQ ID NO：2)。
21.权利要求17所述的拮抗剂，其中所述肽基本上由LTEKRKKRS(SEQ ID NO：2)组成。
22.一种组合物，其中含有权利要求1-21任一项所述拮抗剂和载体。
23.权利要求22所述的组合物，其中所述载体是药物学上可接受的。
24.一种编码权利要求1-21任一项所述拮抗剂的核酸，其中所述拮抗剂包括多肽。
25.权利要求24所述的核酸，其中所述拮抗剂包括抗体或其片段。
26.一种载体，其中含有权利要求24或25所述的核酸。
27.一种宿主细胞，其中含有权利要求26所述的载体。
28.一种制品，其中包含：
一种容器；及
装在所述容器中的组合物，其中所述组合物含有权利要求1-21中任一项所述的拮抗剂。
29.权利要求28所述制品，其中还包含用于指导向受试者施用所述拮抗剂的说明书。
30.一种试剂盒，其中包含：
第一容器，其中装有含权利要求1-21中任一项所述拮抗剂的组合物；及
第二容器，其中含有缓冲液。
31.权利要求30所述的试剂盒，其中所述缓冲液是药物学上可接受的。
32.权利要求30所述的试剂盒，其中还包含用于指导向受试者施用所述拮抗剂的说明书。
33.一种筛选或鉴定c-met拮抗剂的方法，该方法包括：
让侯选物质与一种其中含有至少一部分c-met Sema结构域的靶分子接触，
从而将能特异性地结合所述靶分子的物质选定为c-met拮抗剂。
34.权利要求33所述的方法，其中让所选物质与表达c-met的细胞接触，对所述细胞中c-met二聚化的抑制情况进行检测或定量。
35.权利要求34所述的方法，其中c-met二聚化的抑制用c-met活化量的减少指示。
36.权利要求35所述的方法，其中c-met的活化量用c-met相关细胞信号转导的量指示。
37.权利要求36所述的方法，其中所述细胞信号转导用蛋白质磷酸化指示。
38.一种调节受试者体内c-met活化的方法，该方法包括：向受试者施用c-met Sema结构域调节物，从而调节c-met活性。
39.一种能抑制c-met活化的细胞增殖的方法，该方法包括：让细胞或组织与权利要求1-21中任一项所述拮抗剂接触，从而抑制与c-met活化相关的细胞增殖。
40.一种治疗受试者与c-met活化失调相关病理状况的方法，该方法包括：向所述受试者施用权利要求1-21中任一项所述的拮抗剂，从而抑制c-met活化。
41.一种用于抑制表达c-met或肝细胞生长因子或两者的细胞生长的方法，该方法包括：让所述细胞与权利要求1-21中任一项所述拮抗剂接触，从而引发对所述细胞生长的抑制。
42.一种对患有含表达c-met或肝细胞生长因子或两者的细胞的癌性肿瘤的哺乳动物进行治疗性处理的方法，该方法包括：向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1-21中任一项所述拮抗剂，从而有效治疗所述哺乳动物。
43.一种治疗或防止细胞增殖病症的方法，该细胞增殖病症与c-met表达或活性升高或者肝细胞生长加快或者两者相关，所述方法包括：向确实需要治疗的受试者施用有效量的权利要求1-21任一项所述c-met拮抗剂，从而有效治疗或防止所述细胞增殖病症。
44.权利要求43所述的方法，其中所述的增殖病症是癌症。
45.一种用于抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生长至少部分取决于c-met或肝细胞生长因子或两者的生长加强作用，所述方法包括：让所述细胞与权利要求1-21中任一项所述拮抗剂接触，从而有效地抑制所述细胞的生长。
46.一种治疗哺乳动物肿瘤的方法，其中所述肿瘤生长至少部分取决于c-met或肝细胞生长因子或两者的生长加强作用，所述方法包括：让所述细胞与权利要求1-21中任一项所述拮抗剂接触，从而有效地治疗所述肿瘤。
47.权利要求46所述的方法，其中所述的细胞是癌细胞。
48.权利要求47所述的方法，其中所述癌细胞还进一步接受放疗或化疗。
49.权利要求47所述的方法，其中所述癌细胞选自：乳腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、乳头状癌细胞、前列腺癌细胞、淋巴瘤细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、中枢神经系统癌细胞、骨肉瘤细胞、肾癌细胞、肝细胞癌细胞、膀胱癌细胞、胃癌细胞、头及颈部鳞状癌细胞、黑色素瘤细胞以及血癌细胞。
50.权利要求47所述的方法，其中与相同组织来源的正常细胞相比，所述癌细胞以更高丰度表达c-met或肝细胞生长因子或者两者。
51.权利要求46所述的方法，其中所述肝细胞生长因子表达于不同的细胞。
52.权利要求47所述的方法，其中与相同组织来源的正常细胞相比，所述癌细胞中的c-met活化增强。
53.权利要求47所述的方法，该方法能引发所述细胞的死亡。
54.权利要求40-53中任一项所述的方法，其中在无所述拮抗剂存在时c-met活化的发生不依赖于配体的存在。
55.权利要求40-53中任一项所述的方法，其中在无所述拮抗剂存在时c-met的活化是配体依赖性的。
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