KR20060113941A - Ｃ－ｍｅｔ 이량체화 및 활성화를 억제하는 방법 및조성물 - Google Patents

Ｃ－ｍｅｔ 이량체화 및 활성화를 억제하는 방법 및조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 특히 c-met 다량체화를 방해하는 c-met 길항제를 사용하여 c-met 이량체화 및/또는 리간드의 c-met에의 결합을 조절함으로써, HGF/c-met 시그널화 경로를 조절하는 방법 및 조성물을 제공한다.
c-met 길항제, 이량체화, 암

Description

Ｃ－ＭＥＴ 이량체화 및 활성화를 억제하는 방법 및 조성물{Methods and compositions for inhibiting C-MET dimerization and activation}
연관 출원
본원은 2003년 12월 11일자로 출원된 가출원 번호 제60/528,909호 (이의 내용이 모두 본원에 참조로 삽입됨)에 대한 우선권을 주장하면서 37 CFR 1.53(b)(1) 하에 출원된 정식출원이다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 성장 인자 조절 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 HGF/c-met 시그널화 경로에 대한 조절자 및 이러한 조절자의 이용에 관한 것이다.
간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor: HGF)는 많은 상이한 세포 유형에 대한 미토겐성 (mitogenic), 모토겐성 (motogenic) 및 모포겐성 (morphogenic) 활성을 갖는 간충직-유도된 다면발현성 인자이다. HGF 효과는 특정 티로신 키나제, c-met 및 이상형 (aberrant) HGF를 통해 매개되며, c-met 발현이 종종 다양한 종양에서 관측된다 [Maulik et al., Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59; Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7):863-867]. HGF/c-met 시그널화 경로의 조절이 종양 진행 및 전이에 연루된다 [Trusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300].
HGF는 Met 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 세포외 도메인을 결합하며 세포 분산, 증식 및 생존과 같은 다양한 생물학적 과정을 조절한다. HGF-Met 시그널화는 특히 근육 전구 세포의 이동에서 초기 성장 및 간 및 신경계의 성장에 필수적이다 [Bladt et al., 1995; Hamanoue et al., 1996; Maina et al., 1996; Schmidt et al., 1995; Uehara et al., 1995]. Met 및 HGF 넉아웃 마우스의 발달 표현형이 매우 유사하며 HGF가 Met 수용체에 대한 동족의 (cognate) 리간드라는 것을 제시한다 [Schmidt et al., 1995; Uehara et al., 1995]. 또한, HGF-Met는 간 재생, 혈관형성 및 상처 치유에 역할을 한다 [Bussolino et al., 1992; Matsumoto and Nakamura, 1993; Nusrat et al., 1994]. 전구체 Met 수용체는 디설파이드 결합으로 연결되는 세포외 α 서브유니트 및 막에 걸친 β 서브유니트로 단백질 가수분해된다 [Tempest et al., 1988]. β 서브유니트는 세포질 키나제 도메인을 포함하며 C-말단에 어댑터 단백질이 결합하고 시그널화를 개시하는 다수-기질 도킹 부위를 갖는다 [Bardelli et al., 1997; Nguyen et al., 1997; Pelicci et al., 1995; Ponzetto et al., 1994; Weidner et al., 1996]. HGF 결합 시, Met의 활성화는 각각 Gab1 및 Grb2/Sos 매개된 PI3-키나제 및 Ras/MAPK 활성화를 통해 티로신 포스포릴화 및 다운스트림 시그널화를 이끌어, 세포 운동성 및 증식을 유도한다 [Furge et al., 2000; Hartmann et al., 1994; Ponzetto et al., 1996; Royal and Park, 1995].
Met는 발암물질-처리된 골육종 세포주에서 형질전환을 일으키는 것으로 밝혀졌다 [Cooper et al., 1984; Park et al., 1986]. Met 과발현 또는 유전자-증폭이 다양한 사람 암에서 관측되었다. 예를 들어, Met 단백질은 대장암에서 적어도 5배 과발현되며, 간 전이에서 유전자-증폭되는 것으로 보고되었다 [Di Renzo et al., 1995; Liu et al., 1992]. 또한, Met 단백질은 구강 편평세포암, 간세포암, 신장세포암, 유방암 및 폐암에서 과발현되는 것으로 보고되었다 [Jin et al., 1997; Morello et al., 2001; Natali et al., 1996; Olivero et al., 1996; Suzuki et al., 1994]. 또한, mRNA의 과발현이 간세포암, 위암 및 대장암에서 관측되었다 [Boix et al., 1994; Kuniyasu et al., 1993; Liu et al., 1992].
Met의 키나제 도메인에서의 많은 돌연변이가 구성적 (constitutive) 수용체 활성화를 이끄는 신유두암에서 발견되었다 [Olivero et al., 1999; Schmidt et al., 1997; Schmidt et al., 1999]. 이러한 활성화 돌연변이는 구성적 Met 티로신포스포릴화를 부여하고 MAPK 활성화, 병소 형성 및 종양형성을 이끈다 [Jeffers et al., 1997]. 또한, 이러한 돌연변이는 세포 운동성 및 침습을 증가시킨다 [Giordano et al., 2000; Lorenzato et al., 2002]. 형질전환된 세포에서 HGF-의존적 Met 활성화는 운동성, 분산 및 이동을 증가시켜, 결국 침습적 종양 성장 및 전이를 이끈다 [Jeffers et al., 1996; Meiners et al., 1998].
Met는 수용체 활성화, 형질전환 및 침습을 이끄는 다른 단백질과 상호작용하 는 것으로 밝혀졌다. 신생물 세포에서, Met는 α6β4 인테그린 (라미닌과 같은 세포외 기질 (ECM) 성분에 대한 수용체)과 상호작용하여 HGF-의존적 침습적 성장을 촉진하는 것으로 보고되었다 [Trusolino et al., 2001]. 또한, Met의 세포외 도메인은 세마포린 패밀리의 일원인 플렉신 B1과 상호작용하고 침습적 성장을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 [Giordano et al., 2002]. 또한, 종양형성 및 전이에 연루되었던 CD44v6가 Met 및 HGF와 컴플렉스를 형성하고 Met 수용체를 활성화시키는 것으로 보고되었다 [Orian-Rousseau et al., 2002].
Met는 Ron 및 Sea를 포함하는 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 슈퍼패밀리의 일원이다 [Maulik et al., 2002]. Met의 세포외 도메인 구조에 대한 예측은 세마포린 및 플렉신과 공유되는 상동성을 제시한다. Met의 N-말단은 모든 세마포린 및 플렉신에서 보존되는 약 500개 아미노산의 Sema 도메인을 포함한다. 세마포린 및 플렉신은 신경 발달에서 이의 역할에 대해 처음으로 기술된 바 있는 큰 부류의 분비 및 막-결합 단백질에 속한다 [Van Vactor and Lorenz, 1999]. 그러나, 보다 최근에, 세마포린 과발현은 종양 침습 및 전이에 관련되었다. 플렉신, 세마포린 및 인테그린에서 발견되는 시스테인-풍부 PSI 도메인 (또한 Met 관련된 서열 도메인이라고도 언급됨)이 Sema 도메인에 인접하고 플렉신 및 전사 인자에서 발견되는 면역글로불린-유사 영역인 4개의 IPT 반복물이 뒤따른다. 최근의 연구에서는 Met 도메인이 HGF 및 헤파린 결합을 위해 충분하다고 제시하고 있다 [Gherardi et al., 2003].
Met 키나제 도메인의 역할이 상세히 조사되었으나, Met의 세포외 도메인은 충분히 특징분석되지 않았다. HGF가 Met의 세포외 도메인에 결합하여 수용체를 활성화시킨다는 것은 공지되었지만, 기여한다면, 어떤 서브-도메인(들)이 수용체 이량체화에 기여하는지는 불명하다. 그럼에도 불구하고, 기여한다면, HGF/c-met 시그널화 축 (axis)의 활성화에 대한 Met 세포외 도메인 내의 서브-도메인의 기여에 대한 설명이, 예를 들어 특히 Met 수용체 자체의 기능에서 이상을 수반하는 임상적 시나리오에서 목적한 치료법을 고안하는데 상당히 유리하다는 것은 분명하다.
특허 출원 및 공개문을 포함한 본원에 인용된 모든 참조문은 전부 참조로 삽입된다.
본 발명의 기술
본 발명은, 부분적으로는, 간세포 성장 인자 (HGF)의 수용체인 c-met의 이량체화가 중요하고 유리한 치료 표적물로서 나타나는 생물학적/세포적 과정이라는 것을 입증하는 것에 기초한다. 본원에서는 이러한 과정의 방해 (disrupt)가 암과 같은 많은 질병 상태에서 세포 성장의 조절이상 (dysreglation)과 관련된 세포 시그널화 경로의 활성화를 효과적으로 억제한다는 것을 입증한다. 또한, 본 발명은 c-met 단백질 내의 특정 도메인 (전체가 아님)이 c-met 이량체화에 필수적이고/이거나 중요한 역할을 하여 HGF/c-met 시그널화 축을 활성화시킨다는 것을 발견한 것에 기초한다. 또한, 본 발명은 c-met의 세포외 부분의 특정 도메인에 대한 HGF 결합을 간섭 (interfere)하는 것에 기초하는 조성물 및 방법을 제공한다. c-met 이량체화 또는 c-met에 대한 동족의 리간드 결합에 필요한 것으로서 c-met의 특정 부 분(들)의 확인은, HGF/c-met 경로의 비정상적 또는 목적하지 않는 시그널화와 관련된 병적 상태에 대한 예방적 및/또는 치료적 접근을 고안하는데 있어 보다 뛰어난 미세 조정을 위한 독특하고 유리한 표적물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 c-met 리간드 결합, c-met 이량체화, 활성화 및 HGF/c-met 시그널화와 관련된 다른 생물학적/생리학적 활성의 조절을 포함한 HGF/c-met 경로를 조절하는 것과 관련된 방법, 조성물, 키트 및 제조 물품을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 HGF/c-met 시그널화 경로를 방해하는 c-met 길항제를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 c-met 이량체화를 방해하는 c-met 길항제를 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 c-met Sema 도메인의 이량체화 기능 (즉, Sema 도메인이 수용체를 이량체화하는데 기능하는 능력)을 방해한다. 하나의 양태에서, c-met 길항제는 c-met Sema 도메인이 c-met를 이량체화하는 능력을 간섭한다. 간섭은 직접적 또는 간접적일 수 있다. 예를 들어, c-met 길항제는 c-met Sema 도메인 내의 서열에 결합하여 결합된 도메인과 이의 결합 파트너 (예: 또 다른 c-met 분자)와의 상호작용을 억제할 수 있다. 또 다른 양태에서, c-met 길항제는 c-met Sema 도메인 내에 있지 않은 서열에 결합할 수 있으며, 이러한 결합은 c-met Sema 도메인이 이의 결합 파트너 (예: 또 다른 c-met 분자)와 상호작용하는 능력을 방해한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 길항제는 c-met 이량체화가 방해되도록 c-met (예: 세포외 도메인)에 결합한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 길항제는 c-met를 이량체화하는 c-met Sema 도메인의 능력을 방해하도록 c-met에 결합한다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 본 발명은 c-met 분자에 결합 시 상기 분자의 이량체화를 억제하는 길항제를 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 c-met Sema 도메인의 서열에 특이적으로 결합한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 길항제는 호모이량체화를 포함하는 c-met 이량체화를 방해한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 길항제는 헤테로이량체화 (c-met의 비-c-met 분자와의 이량체화)을 포함하는 c-met 이량체화를 방해한다.
일부 예에서, c-met에 대한 리간드 (예: HGF)의 결합을 간섭하지 않는 c-met 길항제를 갖는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명의 길항제는 c-met 상의 리간드 (예; HGF) 결합 부위를 결합하지 않는다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 길항제는 c-met에 대한 리간드 (예: HGF) 결합을 실질적으로 억제하지 않는다. 하나의 양태에서, 본 발명의 길항제는 c-met에 대한 결합에 있어 리간드 (예: HGF)와 실질적으로 경쟁하지 않는다. 하나의 예에서, 본 발명의 길항제는 HGF/c-met 축 내의 상이한 과정 및/또는 기능을 표적하는 하나 이상의 다른 길항제와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 또 다른 c-met 길항제, 예를 들어 ATCC (American Type Culture Collection)에 수탁 번호 제HB-11894호 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 제HB-11895호 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체의 Fab 단편이 결합하는 에피토프와 다른 c-met의 에피토프에 결합한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 ATCC 수탁번호 제HB-11894호 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 제HB-11895호 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체의 Fab 단편과는 상이하다 (즉, 아니다). 하나의 양태에 서, 본 발명의 c-met 길항제는 ATCC 수탁번호 제HB-11894호 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 제HB-11895호 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 항체의 c-met 결합 서열을 포함하지 않는다.
일부 예에서, c-met 이량체화 및 리간드 결합 모두를 방해하는 c-met 길항제를 갖는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 길항제는 c-met에 대해 결합하는데 있어 HGF와 경쟁할 능력을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 c-met 길항제에 대한 하나의 양태에서, c-met에 대한 길항제의 결합은 HGF의 c-met 활성화를 억제한다. 본 발명의 c-met 길항제에 대한 하나의 양태에서, 세포에서 c-met에 대한 길항제의 결합은 세포의 증식, 분산, 형태 형성 및/또는 운동성을 억제한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 c-met Sema 도메인 또는 이의 변이체의 적어도 일부를 포함하는 펩티드를 포함한다. 하나의 예에서, 본 발명의 길항제는 LDAQT (서열: 1) (예: c-met의 잔기 269-273), LTEKRKKRS (서열: 2) (예: c-met의 잔기 300-308), KPDSAEPM (서열: 3) (예: c-met의 잔기 350-357) 및 NVRCLQHF (서열: 4) (예: c-met의 잔기 381-388)로 이루어진 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 이상을 포함하는 펩티드를 포함한다. 또 다른 예에서, 본 발명의 길항제는 LDAQT (서열: 1), LTEKRKKRS (서열: 2), KPDSAEPM (서열: 3) 및 NVRCLQHF (서열: 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 이상으로 필수적으로 이루어진 펩티드를 포함한다. 하나의 예에서, 상기 펩티드는 서열 LTEKRKKRS (서열: 2)를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 펩티드는 LTEKRKKRS (서열: 2)로 필수적으 로 이루어진다. 하나의 양태에서 상기 펩티드는 서열 LDAQT (서열: 1)를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 펩티드는 LDAQT (서열: 1)로 필수적으로 이루어진다. 하나의 양태에서, 상기 펩티드는 서열 KPDSAEPM (서열: 3)를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 펩티드는 KPDSAEPM (서열: 3)로 필수적으로 이루어진다. 하나의 양태에서, 상기 펩티드는 서열 NVRCLQHF (서열: 4)를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 펩티드는 NVRCLQHF (서열: 4)로 필수적으로 이루어진다. 일부 양태에서, 펩티드는 서열 LDAQT (서열: 1), LTEKRKKRS (서열: 2), KPDSAEPM (서열: 3) 및/또는 NVRCLQHF (서열: 4)과 적어도 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, c-met 분자와 컴플렉스를 형성할 능력을 보유하는 변이체이다. 일부 양태에서, 이들 펩티드는 이들의 억제 및/또는 치료 효과 (예를 들어 향상된 친화성, 개선된 약력학적 특성 (예: 반감기, 안정성, 제거율), 피검물에 대한 감소된 독성을 포함)를 향상시키는 변형을 포함한다. 이러한 변형은, 예를 들어 글리코실화, 페길화, 비천연적으로 발생하나 기능적으로는 동일한 아미노산으로의 치환, 연결 그룹 등을 수반하는 변형을 포함한다. 적합한 변형이 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 나아가, 필요한 경우 경험적으로 결정될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 소분자 (예: 유기 분자), 펩티드 (예: 올리고펩티드), 항체, 항체 단편, 압타머 (aptamer), 올리고뉴클레오티드 (예: 안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 이의 배합물이거나 이를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 c-met 길항제는 본원에 기술되는 바와 같이 본 발 명의 스크리닝 또는 확인 방법에 의해 수득된다.
또 다른 양상으로, 본 발명은 c-met 길항제를 스크리닝하거나 확인하는 방법을 제공한다. 하나의 예에서, 상기 방법은 후보 물질을 c-met를 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 이로써 상기 후보 물질의 존재 하에 (다양한 기준 및 방법 (이중 일부가 본원에 기술됨)으로 평가되는 바와 같이) 상기 세포에서의 c-met 이량체화 및/또는 활성화 억제는 상기 물질이 c-met 길항제임을 나타낸다. 또 다른 예에서, 상기 방법은 후보 물질을 c-met Sema 도메인의 적어도 일부를 포함하는 표적 분자와 접촉시키는 것을 포함하며, 이로써 상기 표적 분자를 특이적으로 결합하는 물질이 (c-met 길항제로서) 선택된다. 일부 양태에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 추가로 선별된 물질을 c-met를 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 이때 상기 세포에서 c-met 이량체화의 억제가 평가된다 (예를 들어, 상기 세포에서의 c-met 이량체화의 정도가 검출되거나 정량된다). c-met 이량체화의 억제는 당 기술 분야에 공지된 다양한 방법으로 평가될 수 있으며, 당 기술 분야에 공지된 다양한 기준에 근거하여 이중 일부가 본원에 보다 상세히 기술된다. 예를 들어, c-met 이량체화의 억제는 c-met 활성화의 양의 감소로 나타내어질 수 있으며, 이어서 이는 예를 들어 세포 내에서 c-met 관련된 세포의 시그널화의 양으로 나타내어질 수 있다. 세포 시그널화는 당 기술 분야에서 공지된 다양한 방법 및 다양한 기준 (이의 일부가 본원에 기술된다)에 기초하여 평가될 수 있다. 예를 들어, HGF/c-met 경로에서 세포 시그널화의 발생은 시그널화 경로에서 표적 분자의 포스포릴화의 변화 형태로 생물학적으로 나타날 수 있다. 따라서, 예를 들어 HGF/c- met 경로에서 하나 이상의 공지된 포스포릴화 표적물과 관련된 단백질의 포스포릴화 양이 측정될 수 있다. 이러한 포스포릴화 표적물은 예는 c-met 자체 및 미토겐 활성화된 단백질 키나제 (MAPK)를 포함한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 길항제 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 양태에서, 담체는 제약학적으로 허용된다.
하나의 양상으로, 본 발명은 본 발명의 c-met 길항제를 코딩하는 핵산을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 핵산은 폴리펩티드 (예: 올리고펩티드)인 또는 이를 포함하는 c-met 길항제를 암호화한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 핵산은 항체 또는 이의 단편인 또는 이를 포함하는 c-met 길항제를 암호화한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 벡터는, 예를 들어 발현 벡터와 같은 모든 유형의 재조합 벡터일 수 있다. 모든 다양한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli)이다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 포유동물 세포이다.
하나의 양상으로, 본 발명은 본 발명의 길항제를 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 적합한 숙주 세포에서 항체 (또는 이의 단편)를 암호화하는 본 발명의 재조합 벡터를 발현시키고 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항체 (또는 항체 단편)인 또는 이를 포함하는 c-met 길항제를 제조하는 방법을 제공한 다. 또 다른 예에서, 본 발명은 적합한 숙주 세포에서 폴리펩티드 (예: 올리고펩티드)를 암호화하는 본 발명의 벡터를 발현시키고 상기 폴리펩티드 (예: 올리고펩티드)를 회수하는 것을 포함하는, 폴리펩티드 (예: 올리고펩티드)인 또는 이를 포함하는 c-met 길항제를 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 용기; 및 이 용기에 포함되는 본 발명의 하나 이상의 c-met 길항제를 포함하는 조성물을 포함하는 제조 물품을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 조성물은 본 발명의 핵산을 포함한다. 하나의 양태에서, 길항제를 포함하는 조성물은 담체 (일부 양태에서 제약학적으로 허용되는 담체이다)를 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 제조 물품은 상기 조성물 (예: 길항제)을 피검물에 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 c-met 길항제를 갖는 조성물을 포함하는 제 1 용기; 및 완충제를 갖는 제 2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 완충제는 제약학적으로 허용된다. 하나의 양태에서, 길항제를 포함하는 조성물은 담체 (일부 양태에서, 제약학적으로 허용된다)를 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 키트는 상기 조성물 (예: 길항제)를 피검물에 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 질환, 예를 들어 암, 종양, 세포 증식 장애, 면역 (예: 자가면역) 장애 및/또는 혈관형성-관련 장애의 치료 및/또는 예방 치료를 위한 의약의 제조에 있어 본 발명의 c-met 길항제의 용도를 제공한다. c-met 길항제는 항체, 항체 단편, 소분자 (예: 유기 분자), 폴리펩티드 (예: 올리고펩티드), 핵산 (예: 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 올리고뉴클레오티드), 압타머 또는 이들의 배합물을 포함한, 본원에 기술된 모든 형태일 수 있다.
하나의 양상으로, 본 발명은 질환, 예를 들어 암, 종양, 세포 증식 장애, 면역 (예: 자가면역) 장애 및/또는 혈관형성-관련 장애의 치료 및/또는 예방 치료를 위한 의약의 제조에 있어 본 발명의 핵산의 용도를 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 질환, 예를 들어 암, 종양, 세포 증식 장애, 면역 (예: 자가면역) 장애 및/또는 혈관형성-관련 장애의 치료 및/또는 예방 치료를 위한 의약의 제조에 있어 본 발명의 발현 벡터의 용도를 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 질환, 예를 들어 암, 종양, 세포 증식 장애, 면역 (예: 자가면역) 장애 및/또는 혈관형성-관련 장애의 치료 및/또는 예방 치료를 위한 의약의 제조에 있어 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 질환, 예를 들어 암, 종양, 세포 증식 장애, 면역 (예: 자가면역) 장애 및/또는 혈관형성-관련 장애의 치료 및/또는 예방 치료를 위한 의약의 제조에 있어 본 발명의 제조 물품의 용도를 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 질환, 예를 들어 암, 종양, 세포 증식 장애, 면역 (예: 자가면역) 장애 및/또는 혈관형성-관련 장애의 치료 및/또는 예방 치료를 위한 의약의 제조에 있어 본 발명의 키트의 용도를 제공한다.
본 발명은 HGF/c-met 시그널화 축의 조절이상과 관련된 질환 상태의 조절에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. HGF/c-met 시그널화 경로는, 예를 들어 세포 증식 및 혈관형성을 포함한, 다수의 생물학적 및 생리학적 기능에 수반된다. 따라 서, 하나의 양상으로, 본 발명은 c-met의 세포외 부분의 서브-도메인의 기능을 조절하는 물질/분자를 피검물에 투여하여 HGF/c-met 시그널화를 조절하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 서브-도메인은 c-met Sema 도메인의 전부 또는 적어도 일부를 포함한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 세포 또는 조직을 유효량의 본 발명의 c-met 길항제와 접촉시켜 c-met 활성화와 관련된 세포 증식을 억제하는 것을 포함하여, c-met 활성화된 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 c-met 길항제를 피검물에 투여하여 c-met 활성화의 조절이상과 관련된 병적 상태를 치료하는 것을 포함하여, 피검물에서 상기 병적 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 양상으로, 본 발명은 본 발명의 c-met 길항제를 c-met, HGF 또는 이 둘 모두를 발현시키는 세포의 성장을 억제하는 것을 포함하여, 상기 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 세포는 상이한 세포에 의해 발현되는 HGF에 의해 (예: 파라크린 효과를 통해) 접촉된다.
하나의 양상으로, 본 발명은 유효량의 본 발명의 c-met 길항제를 c-met, HGF 또는 이 둘 모두를 발현하는 세포를 포함하는 암성 종양을 갖는 포유동물에 투여하여 상기 포유동물을 효과적으로 치료하는 것을 포함하여, 상기 포유동물을 치료학적으로 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 세포는 상이한 세포에 의해 발현되는 HGF에 의해 (예: 파라크린 효과를 통해) 접촉된다.
하나의 양상으로, 본 발명은 유효량의 본 발명의 c-met 길항제를 피검물에 투여하여 c-met, HGF 또는 이 둘 모두의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 세포 증식 장애를 효과적으로 치료 또는 예방함을 포함하는, 상기 세포 증식 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 증식 장애는 암이다.
하나의 양상으로, 본 발명은 세포의 성장이 적어도 부분적으로 c-met, HGF 또는 이 둘 모두의 성장 증진 효과에 의존적인 세포를 유효량의 c-met 길항제와 접촉시켜 상기 세포의 성장을 억제하는 것을 포함하여, 상기 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 세포는 상이한 세포에 의해 발현되는 HGF에 의해 (예: 파라크린 효과를 통해) 접촉된다.
하나의 양상으로, 본 발명은 종양의 성장이 적어도 부분적으로 c-met, HGF 또는 이 둘 모두의 성장 증진 효과에 의존적인 포유동물의 세포를 유효량의 본 발명의 c-met 길항제와 접촉시켜 종양을 효과적으로 치료하는 것을 포함하여, 상기 포유동물에서 종양을 치료학적으로 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 세포는 상이한 세포에 의해 발현되는 HGF에 의해 (예: 파라크린 효과를 통해) 접촉된다.
본 발명의 방법은 모든 적합한 병적 상태, 예를 들어 HGF/c-met 시그널화 경로의 조절이상과 관련된 세포 및/또는 조직에 영향을 끼치는데 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 표적되는 세포는 암세포이다. 예를 들어, 암세포는 유방암 세포, 대장암 세포, 폐암 세포, 유두암 세포 (예: 갑상선의 유두암 세포), 결장암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 경부암 세포, 중추신경계암 세포, 골육종 세포, 신장암 세포, 간세포암 세포, 방광암 세포, 전립선암 세포, 위암 세포, 두경부 편평세포암 세포, 림프종 세포, 흑색종 세포 및 백혈병 세포로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 표적되는 세포는 과잉증식 (hyperproliferative 및/또는 hyperplastic) 세포이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법에서 표적되는 세포는 이형성 세포이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법에서 표적되는 세포는 전이 세포이다.
또한, 본 발명의 방법은 추가의 처리 단계를 포함한다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 표적 세포 및/또는 조직 (예: 암세포)이 방사선 처리 및/또는 화학처리제에 노출되는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, c-met 활성화는 이의 조절이상이 많은 병적 상태를 이끌 수 있는 중요한 생물학적 과정이다. 따라서, 본 발명의 하나의 양태에서, 표적되는 세포 (예: 암세포)는 동일한 조직 기원의 정상 세포와 비교하여 c-met의 활성화가 증진된 세포이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 표적된 세포의 죽음을 야기한다. 예를 들어, 본 발명의 길항제와의 접촉으로 세포가 c-met 경로를 통해 시그널을 보낼 수 없어 세포가 죽거나 세포 성장이 억제된다.
c-met 활성화 (및 따라서 시그널화)의 조절이상은, 예를 들어 HGF (c-met의 동족 리간드) 및/또는 c-met 자체의 과발현을 포함한, 많은 세포성 변화로부터 생길 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명의 방법은, 동일 조직 기원의 정상 세포와 비교하여, c-met, HGF 또는 이 둘 모두가 상기 세포 (예: 암세포)에 의해 과다하게 발현되는 세포를 표적하는 것을 포함한다. c-met 발현 세포는 다양한 공급원으로부터의 HGF에 의해, 즉 오토크린 (autocrine) 또는 파라크린 방식으로 조 절될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나의 양태에서, 표적 세포는 상이한 세포에/에 의해 발현되는 HGF에 의해 (예: 파라크린 효과를 통해) 접촉/결합된다. 상기한 상이한 세포는 표적된 세포에 대해 동일하거나 상이한 조직 기원일 수 있다. 하나의 양태에서, 표적된 세포는 표적된 세포 자체에 의해 발현되는 HGF에 의해 (예: 오토크린 효과/루프를 통해) 접촉/결합된다. 또한, c-met 활성화 및/또는 시그널화는 리간드에 대해 독립적으로 발생할 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 양태에서, 표적된 세포에서의 c-met 활성화는 리간드에 대해 독립적으로 발생할 수 있다.
도 1은 Met 결실 변이체에 대해 도시적 표시이다.
Met 세포외 도메인의 서브-도메인 결실이 N-말단으로부터 만들어지고 TM 영역 뒤에 V5/His로 태깅되었다. Met 시그널 펩티드 (S.P.)가 각각의 돌연변이체의 N-말단에 부착되었다. 약어는 다음과 같다: Sema-세마포린; PSI-플렉신, 세마포린, 인테그린; IPT-플렉신 및 전사 인자의 면역글로불린-유사 영역; 및 TM-트랜스막. Sema 영역에 있는 화살표는 Met 단백질 가수분해 부위를 가리킨다.
도 2는 Sema 도메인이 Met 가교결합에 필수적임을 나타낸다.
A: Met 결실 돌연변이체를 293 세포에 트랜스펙션시키고, 증가하는 농도의 설포-EGS에 노출시켰다. 용해물 10 μg를 4-12 % SDS-PAGE에서 분석하고, V5 항체로 면역블롯팅하였다. EC-M은 단량체적 EC-WT를 나타내고, EC-D는 이량체적 EC-WT 를 나타낸다. 별표 (*)는 비처리된 EC-WT의 존재를 나타낸다.
B: EC-WT-Flag 및 EC-WT-V5/His를 293 세포에 공동트랜스펙션시키고, 증가하는 농도의 설포-EGS에 노출시키며, 용해시킨 후, V5 또는 Flag 항체로 면역침전시키고 8 % SDS-PAGE로 분석하였다. 면역침전된 샘플을 Flag 또는 V5 항체로 블롯팅하였다.
도 3은 HGF 및 항-Met 항체 (본원에서 "5D5"로 언급됨)가 Met의 Sema 도메인에 결합한다는 것을 나타낸다.
A: 293 세포를 지시된 Met V5/His 태깅된 제작물로 트랜스펙션시키고, V5 항체로 면역침전시킨 후, 4-12 % SDS-PAGE로 분석하고, His 항체로 면역블롯팅하였다.
B: A로부터의 면역침전물을 HGF 5 μg과 인큐베이션하였다. 샘플을 4-12 % SDS-PAGE로 분석하고 α 쇄를 인지하는 HGF 항체로 면역블롯팅하였다. 투입 HGF 10 ng이 양성 대조군으로 사용되었다.
C: 면역침전 및 면역블롯팅을 scHGF (R494E)을 사용하여 B에서와 같이 수행하였다. 양성 대조군으로서, scHGF (R494E) 15 ng을 샘플과 함께 분석하였다.
D: 293 세포를 지시된 제작물로 트랜스펙션하고, 4-12 % SDS-PAGE로 분석하며, V5 항체로 면역블롯팅하였다.
E: D로부터의 트랜스펙션된 용해물을 항-Met 5D5 항체로 면역침전시키고, His 항체로 면역블롯팅하였다.
F: B로부터의 니트로셀룰로즈 막을 Met C-12 항체로 재탐침하였다.
도 4는 내생적 c-met가 종양 세포주에서 가교결합한다는 것을 나타낸다.
증가하는 농도의 설포-EGS를 혈청-제거된 293, H441, MDA-MB-435, 및 A549 세포에 가하였다. 또한, A549 세포는 가교결합 전에 HGF 100 μg/ml과 함께 인큐베이션하였다. 용해물을 Met C-12 항체로 면역블롯팅하였다. 별표 (*)로 나타낸 밴드는 비처리된 WT-Met를 나타낸다.
도 5는 Met 시그널 트랜스덕션이 rSema 및 항-Met 5D5-Fab에 의해 억제되며 Met의 세포외 도메인이 Met 시그널 트랜스덕션을 약화시킨다는 것을 나타낸다.
A: A549 세포를 혈청-비함유 상태로 유지시키고, 포스포-Met 및 포스포-MAPK 분석을 위해 10 분 동안 10 ng/ml HGF와 함께 rSema 0, 5, 10, 50 또는 100 μg/ml로 처리하였다. 용해물을 Met C-12 항체로 면역침전시키고, 포스포릴화된 Met를 검출하기 위해 포스포티로신 항체로 면역블롯팅한 후, Met 항체로 면역블롯팅하였다. H441 및 MDA-MB435 세포를 5분 동안 각각 rSema 0, 5, 10 또는 100 μg/ml 및 HGF 5 또는 10 ng/ml로 처리하였다. 단백질을 포스포-MAPK로 검출하고 MAPK 항체로 재탐침하였다. 별표 (*)로 나타낸 밴드는 비처리된 WT-Met를 나타낸다.
B: A에서의 자료를 NIH Image 소프트웨어를 사용하여 정량하고, 각각의 샘플 사이의 포스포릴화된 단백질 대 비포스포릴화된 단백질의 비를 비교하여 좌측 패널에 막대 그래프로 나타내었다. 우측 패널은 또 다른 실험으로부터의 자료를 나타낸다.
C: A549, H441 및 MDA-MB-435 세포를 혈청-비함유 상태로 유지시키고, rSema 또는 항-Met 5D5-Fab 10 μg/ml로 처리하였다. 샘플을 포스포티로신, Met, 포스포 -MAPK 또는 MAPK 항체로 면역블롯팅하였다. 별표 (*)로 나타낸 밴드는 비처리된 WT-Met를 나타낸다.
D: C에 있는 자료를 정량하고 B에서와 같이 나타내었다.
E: A549 세포를 지시된 제작물로 트랜스펙션하였다. Met 돌연변이체의 발현을 V5 항체로 면역블롯팅하여 검출하였다. 별표 (*)로 나타낸 밴드는 비처리된 ㄸEC-WT를 나타낸다.
F: (좌측) E로부터의 용해물을 Met C-12 항체로 면역침전시키고 포스포-티로신 항체로 면역블롯팅하였다. 막을 Met 항체로 재탐침하였다. (우측) 용해물을 포스포-MAPK로 면역블롯팅한 후, MAPK로 재탐침하였다.
G: F에서의 자료를 NIH Image 소트트웨어를 사용하여 정량하고, 각각의 샘플에 대해 포스포릴화된 단백질 대 비포스포릴화된 단백질을 비교하여 좌측 패널에 막대 그래프로 나타내었다. 우측 패널을 또 다른 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 각각의 그래프에서의 막대는, 좌측부터 우측으로, 각각 "Mock", "EC-WT", "ΔS", "ΔP" 및 "TM"로서 F에서 표시된 레인에 상응한다.
도 6은 rSema 및 항-Met 5D5-Fab가 새포 운동성을 억제한다는 것을 나타낸다.
H441 세포를 스크레이핑 (scraping)하고, 2일에 걸쳐 혈청-비함유 배지에서 mock, rSema, 항-Met 5D5-Fab, 또는 HGF로 처리하였다. 4개의 독립적인 실험을 수행하고, 대표적인 자료 세트를 나타내었다.
도 7은 세포 이동이 rSema 및 항-Met 5D5-Fab에 의해 억제된다는 것을 나타 낸다.
MDA-MB-435 세포를 혈청-비함유 배지 중의 각각의 트랜스웰의 상단 챔버에 시딩하고, mock, rSema, 또는 항-Met 5D5-Fab으로 처리하였다. 양성 대조군으로서, HGF를 mock 처리된 웰의 하단 챔버에 가하였다. 이동 세포를 크리스탈-바이올렛 (crystal-violet)으로 염색하고, 용출된 세포의 흡광도는 560 nm에서 측정하였다. 3개의 독립적인 이동 조사를 이중으로 수행하고, 대표적인 그래프를 나타내었다.
본 발명은 HGF/c-met 시그널화 축의 조절이상과 관련된 병적 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해 HGF/c-met 시그널화 축을 간섭하는 방법을 제공한다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, 본원에서 리간드 결합 및/또는 c-met 수용체 이량체화 (및 따라서 c-met 활성화)에 필수적인 것으로 입증되는 c-met 내의 서브도메인/서브서열의 설명에 기초한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 유용한 조성물, 키트 및 제조 물품을 제공한다.
이들 방법, 조성물, 키트 및 제조 물품에 대한 상세한 설명이 본원에 제공된다.
일반적 기술
본 발명의 실시는, 달리 지시가 없는 한, 당 기술 분야에 속하는 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학에 대한 통상의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명된다 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)].
정의
펩티드 (예: VDWVCFRDLGCDWEL, LDAQT, LTEKRKKRS, KPDSAEPM, NVRCLQHF) 또는 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 동일성 (identity) (%)"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 (%)을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않으면서, 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율 (%)로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개된 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당 기술 분야에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 알로리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적합한 변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적상, 아미노산 동일성 값 (%)은, ALIGN-2 프로그램을 위한 완전한 공급 코드가 하기 표 A에 제공되는 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 얻어진다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 만들어졌으며, 하기 표 A에 나타낸 공급 코드는 U.S. Copyright Office (Washington D.C., 20559) (등록 번호 제TXU510087호로 등록됨)에 사용자 매뉴얼과 함께 신청되었다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California)를 통해 입수하거나, 하기 표 A에 제공된 공급 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동 시스템, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.OD.에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 고정되며, 변화하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 지정된 아미노산 서열 B에대한, 이를 상대로 한 또는 이와 비교한 지정된 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%) (이는 달리 지정된 아미노산 서열 B에 대해, 이를 상대로 또는 이와 비교하여 특정 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 지정된 아미노산 서열 A로 표현될 수 있다)이 하기와 같이 계산된다:
100 x (X/Y)
상기 식에서, X는 A 및 B에 대한 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일 상대로서 평가되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, A 대 B의 아미노산 동일성 (%)은 B 대 A의 아미노산 동일성 (%)과 일치하지 않을 것이라는 것을 알 수 있다.
달리 특별히 언급이 없는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 값 (%)은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞선 단락에서 기술된 바와 같이 수득된다.
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본원에 사용된 용어 "벡터"는 핵산 분자가 또 다른 핵산 분자에 연결되어 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 언급하고자 한다. 하나의 유형의 벡터가 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 단편이 연결될 수 있는 둥근 이중쇄 DNA 루프를 언급한다. 또 다른 유형의 벡터는 파아지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기에서 추가의 DNA 단편은 바이러스 게놈으로 연결될 수 있다. 특정 벡터 (예: 세균성 복제 기원을 갖는 세균성 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)는 이들이 도입된 숙주 세포에서 독자적으로 복제할 수 있다. 다른 벡터 (예: 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "재조합 벡터")로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용성을 갖는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태인 한, 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 모든 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 언급하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 동족체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체로 삽입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화된 뉴클레오티드 및 이들의 동족체를 포함할 수 있다. 변형되는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 차단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후, 예를 들어 라벨과 접합시켜 더욱 변형시킬 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡", 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드를 동족체로 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어 비하전된 연결 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등)을 갖는 것 및 하전된 연결 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 펜던트 잔기, 예를 들어 단백질 (예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩티드, ply-L-리신 등)을 갖는 것, 삽입물 (예: 아크리딘, 프로랄렌 등)을 갖는 것, 킬레이터 (예: 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)을 갖는 것, 알킬화제를 포함하는 것, 변형된 연결 (예: 알파 아노머릭 (anomeric) 핵산 등)을 갖는 것, 및 비현형된 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 또한, 슈가에 통상 존재하는 모든 히드록실기가, 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 대체되거나 표준 보호기로 보호되거나 추가의 뉴클레오티드에 추가의 연결을 만들기 위해 활성화되거나, 고형 또는 반고형 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH가 포스포릴화되거나 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑기 또는 아민으로 치환될 수 있다. 또한, 다른 히드록실은 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보즈, 카보사이클릭 슈가 동족체, α-아노머릭 슈가, 에피머릭 슈가, 예를 들어 아라비노즈, 자일로즈 또는 릭소즈 (lyxose), 피라노즈 슈가, 푸라노즈 슈가, 세도헵툴로즈, 비사이클릭 동족체 및 비염기성 뉴클레오시드 동족체, 예를 들어 메틸 리보사이드를 포함한, 당 분야에 일반적으로 공지된 리보즈 또는 데옥시리보즈 슈가의 동족체 형태를 포함할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결은 선택적 연결기로 대체될 수 있다. 이들 선택적 연결기는, 이로 제한됨이 없이, 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기에서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20 C.) (임으로 에테르 (--O--) 연결을 포함), 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아랄딜이다)로 대체되는 양태를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 있는 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 앞서의 기술을 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용한다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 짧은, 일반적으로 단일쇄인, 일반적으로 합성인 폴리뉴클레오티드를 언급하며, 일반적으로 길이가 약 200개 미만의 뉴클레오티드이며, 반드시 이러한 길이인 것은 아니다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 서로 배척적인 것이 아니다. 폴리뉴클레오티드에 대해 상기한 기술이 올리고뉴클레오티드에도 동일하게 완전히 적용가능하다.
본원에 사용된 용어 "간세포 성장 인자" 또는 "HGF"는, 달리 특정하게 또는 문맥상으로 지시되지 않는 한, HGF/c-met 시그널화 경로의 활성화가 일어나게 하는 조건 하에 상기 경로를 활성화시킬 수 있는 모든 자연형 또는 변이형 (자연/천연 발생적 또는 합성적) HGF 폴리펩티드를 언급한다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 광범위한 의미로 상호교환적으로 사용되며, 단일클론 항체 (예: 완전한 길이 또는 온전한 단일클론 항체), 폴리클론 항체, 일가 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예: 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이특이적 항체) 및 항체 단편을 포함한다. 항체는 사람, 사람화 및/또는 성숙된 친화성을 갖는 항체일 수 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 단지 일부를 포함하며, 여기서 일부는 온전한 항체로 존재할 때 이 부분과 통상적으로 관련되는 기능 중 적어도 하나, 바람직하게는 대부분 또는 모든 기능을 보유하는 것이 바람직하다. 하나의 양태에서, 항체 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위를 포함하며, 따라서 항원을 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 단편은 온전한 항체로 존재할 때 Fc 영역과 통상적으로 관련된 생물학적 기능 (예: FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합) 중 적어도 하나를 보유한다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동일한 항체의 집단으로부터 수득되는 항체, 즉 상기 집단의 개개의 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 항체를 언급한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원에 대해 지시된다. 또한, 통상적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
본원에서 단일클론 항체는 구체적으로 "키메릭" 항체 (여기에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체에 있는 상응 서열과 동일하거나 상동이고, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유도되거나 또 다른 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체에 있는 상응 서열과 동일하거나 상동이다), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편을 포함한다 [U.S. 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)].
비-사람 (예: 뮤린) 항체의 "사람화" 형태는 비-사람 면역글로불린으로부터 유도되는 최소 서열을 포함하는 키메릭 항체이다. 대체로, 사람화된 항체는 수용체의 과가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 수용력을 갖는 비-사람종 (공여체 항체) (예: 마우스, 래트, 래비트 또는 비사람 영장류)의 과가변 영역으로부터의 잔기로 대체되는 사람 면역글로불린 (수용체 항체)이다. 일부 예에서, 사람 면역글로불린의 골격 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-사람 잔기로 대체된다. 또한, 사람화된 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 사람화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 통상적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기에서 모든 또는 실질적으로 모든 과가변 루프는 바사람 면역글로불린의 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 사람 면역글로불린 서열의 FR이다. 또한, 사람화된 항체는 임의로 통상적으로 사람 면역글로불린 불변 영역 (Fc)인 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 자세한 설명은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 하기 검토 논문 및 이에 인용된 참조문을 참조한다 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
"사람 항체"는 사람에 의해 생성되는 항체의 아미노산 서열에 상응하고/하거나 본원에 기술된 바와 같이 사람 항체를 만들기 위한 모든 기술을 이용하여 만들었던 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 사람 항체에 대한 이러한 정의는 구체적으로 비-사람 항원-결합 잔기를 포함하는 사람화된 항체를 배제시킨다.
"성숙된 친화성을 갖는 (affinity matured)" 항체는 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 변화를 가져 이러한 변화(들)을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화성이 개선된 항체이다. 바람직한 성숙된 친화성을 갖는 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어는 피코몰 친화성을 가질 것이다. 성숙된 친화성을 갖는 항체는 당 기술 분야에서 공지된 절차에 따라 생성된다. 마르크스 등 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화성 성숙을 기술한다. CDR 및/또는 골격 잔기의 무작위 돌연변이유발이 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schieret al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다.
용어 "길항제"는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되며, 표적물 (예: c-met)의 생물학적 활성 중 하나 이상을 부분적으로나 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 포함한다. 예를 들어, "차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 항체가 결합하는 항원 (예: c-met)의 생물학적 활성을 억제시키거나 감소시키는 항체이다.
"장애"는 본 발명의 물질/분자 또는 방법을 이용한 처리로부터 이익을 얻는 모든 상태이다. 이는 포유동물을 문제의 장애에 걸리게 하는 병적 상태를 포함한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 처리되는 장애의 비제한적 예는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프성 악성종양; 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 기타 선, 대식구, 상피, 간질 및 블라스토코엘릭 (blastocoelic) 장애; 및 염증, 면역 및 기타 혈광형성-관련 장애를 포함한다.
용어 "암" 및 "암성"은 통상적으로 비조절된 세포 성장/증식으로 특징지워지는 생리학적 상태를 기술하기 위해 언급된다. 암의 예는, 이로 제한됨이 없이, 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함한다. 이러한 암에 대한 보다 특정한 예는 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 간세포암 (hepatocellular cancer), 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양 (hepatoma), 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
본원에서 "자가면역 질환'은 개체의 자신의 조직으로부터 발생하고 이에 대해 지시되는 비-악성 질환 또는 장애이다. 본원에서 자가면역 질환은 구체적으로 악성 또는 암성 질환 또는 상태, 특히 B 세포 림프종, 급성 림프성 백혈병 (ALL), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 모양 세포성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 배제시킨다. 자가면역 질환 또는 상태의 예는, 이로 제한됨이 없이, 염증 반응, 예를 들어 건선 및 피부염 (예: 아토피성 피부염)을 포함한 염증성 피부 질환; 전신성 경피증 및 경화증; 염증성 장 질환 (예: 크론 질환 및 궤양성 대장염)과 관련된 반응; 호흡 장애 증후군 (성인 호흡 장애 증후군 (ARDS)을 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 사구체신염; 알레르기 상태, 예를 들어 습진 및 천식 및 T세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 기타 상태; 아테롬성 동맥경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스성 관절염; 전신 홍반성 낭창 (SLE); 진성 당뇨병 (예: 제 I형 진성 당뇨병 또는 인슐린 의존적 진성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노이드 증후군 (Reynaud's syndrome); 자가면역 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 조르겐 증후군 (Sjorgen's syndrome); 연소자형 당뇨병; 및 결핵, 유육종증, 다발성근염, 육아종증 및 혈관염에서 통상적으로 발견되는 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연 과민증과 관련된 면역 반응; 악성빈혈 (애디슨병); 백혈구 누출을 수반하는 질환; 중추신경계 (CNS) 염증 장애; 다발성 기관 손상 증후근; 용혈성 빈혈 (이로 제한됨이 없이, 크라이오글로빈 혈증 (cryoglobinemia) 또는 쿰브스 양성 빈혈 (Coombs positive anemia); 중증 근무력증; 항원-항체 컴플렉스 매개된 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후근; 알러지성 신경염; 그레이브스 질환 (Graves' disease); 람버트-이튼 근무력증 증후군 (Lambert-Eaton myasthenic syndrome); 수포성유천포창 (pemphigoid bullous); 천포창 (pemphigus); 자가면역 다중내분비병증 (autoimmune polyendocrinopathies); 라이터 질환 (Reiter's disease); 강직인간 증후군(Stiff-man syndrome); 베체트 질환 (Behcet disease); 거세포동맥염 (giant cell arteritis); 면역 복합체 신장염; IgA 신장병; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판 감소성 자반증 (immune thrombocytopenic purpura: ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 처리되는 개체 또는 세포의 천연 과정을 변화시키기 위한 시도의 임상적 중재를 언급하며 임상적 병리의 예방을 위해 또는 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발을 예방, 증후근의 경감, 질환에 대한 직접적 또는 간접적 병적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 소강 또는 개선된 에후를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 길항제는 질환 또는 장애의 지연 전개에 사용된다.
"유효량"은 목적하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해, 필요한 기간 동안 투약량에서, 유효한 양을 언급한다. 본 발명의 길항제의 "치료학적 유효량"은 개체의 질환 상태, 나이, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도할 길항제의 능력과 같은 요인에 따라 다양할 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 길항제의 독성 또는 유해 효과보다 치료학적으로 유리한 효과가 큰 양이다. "예방학적 유효량"은 목적하는 예방적 결과를 달성하기 위해, 필요한 기간 동안 투약량에서, 유효한 양을 언급한다. 통상적으로 (반드시는 아님), 예방적 용량은 질환의 발병 전 또는 초기 상태에서 피검물에 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
벡터 제작
본원에 기술된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 이용해 수득될 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열은 적합한 공급 세포로부터 분리되고 서열분석될 수 있다. 항체를 위한 공급 세포는 하이브리도마와 같은 항체 생성 세포를 포함할 것이다. 달리, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 이 서열은 숙주 세포에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터로 삽입된다. 당 기술 분야에서 이용가능하고 공지된 많은 벡터가 본 발명의 목적에 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 선별은 주로 벡터에 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환될 특정 숙주 세포에 의존할 것이다. 각각의 벡터는, 기능 (이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 이둘 모두) 및 벡터가 거주하는 특정 숙주 세포와의 적합성에 따라, 다양한 성분을 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로, 이로 제한됨이 없이, 복제 기원 (특히 벡터가 원핵생물 세포로 삽입되는 경우), 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보좀 결합 부위 (RBS), 시그널 서열, 이종 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함한다.
일반적으로, 숙주 세포와 양립할 수 있는 종으로부터 유도되는 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 연관지어 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위 및 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 표시 서열을 갖는다. 예를 들어, 이. 콜라이는 통상적으로 이. 콜라이 종으로부터 유도되는 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성물을 암호화하는 유전자를 포함하여 형질전화된 세포를 확인하는 손쉬운 수단을 제공한다. 또한, pBR322, 이의 유도체 또는 기타 미생물성 플라스미드 또는 박테리오파아지는 내생적 (endogeneous) 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 포함하거나 이를 포함하도록 변형될 수 있다.
또한, 숙주 미생물과 양립할 수 있는 레플리콘 및 조절 서열을 포함하는 파아지 벡터가 이들 숙주와 연관지어 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, λGEMTM-11와 같은 박테이오파아지가 이. 콜라이 LE392와 같은 민감한 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 재조합 벡터를 제조하는데 사용될 수 있다.
특정 상황에서 필요에 따라, 구성적 또는 유도적 프로모터가 본 발명에 사용될 수 있으며, 이는 당업자에 의해 확인될 수 있다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인지되는 많은 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선별된 프로모터는 제한 효소 분해에 의해 공급 DNA로부터 프로모터를 떼어내고 분리된 프로모터 서열을 선택된 벡터에 삽입함으로써 본원에 기술된 폴리펩티드를 암호화하는 시스트론 DNA에 작동적으로 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터가 표적 유전자의 직접적 증폭 및/또는 발현에 사용될 수 있다. 그러나, 천연 표적 폴리펩티드 프로모터와 비교하여 이종 프로모터는 일반적으로 발현되는 표적 유전자에 대해 보다 우수한 전사 및 보다 높은 수율을 가능하게 하기 때문에, 이종 프로모터가 바람직하다.
원핵생물 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토즈 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균에서 기능하는 다른 프로모터 (예: 다른 공지된 세균 또는 파아지 프로모터)도 또한 적합하다. 이들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있으며, 따라서 기술자라면 모든 필요한 제한 부위를 공급하기 위한 어댑터 또는 링커를 사용하여 표적 경쇄 및 중쇄 [Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269]를 암호화하는 시스트론에 이들을 작동적으로 연결할 수 있다.
일부 양태에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 막을 통해 발현되는 폴리펩티드의 전위를 지시하는 분비 시그널 서열을 포함한다. 일반적으로, 시그널 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 벡터로 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택되는 시그널 서열은 숙주 세포에 의해 인지되고 프로세싱되는 (즉, 시그널 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 고유한 시그널 서열을 인지 및 프로세싱하지 않는 원핵생물 숙주 세포에 대해서, 시그널 서열은, 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, Ipp 또는 열-안정 엔테로톡신 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군 중에서 선택되는 원핵생물의 시그널 서열로 치환된다.
폴리펩티드를 발현하는데 적합한 원핵생물 숙주세포는 아르캐박테리아 (Archaebacteria) 및 유박테리아 (Eubacteria), 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 세균의 예는 에쉐리키아 (Escherichia) (예: 이. 콜라이), 바실루스 (Bacillus) (예: 비. 서브틸리스 (B. subtilis)), 엔테로박테리 아 (Enterobacteria), 슈도모나즈 종 (Pseudomonas species) (예: 피. 아에루기노 사 (P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마 르세칸스 (Serratia marcescans), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 쉬겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla), 또는 파라코쿠스 (Paracoccus)를 포함한다. 바람직하게는, 그람-음성 세포가 사용된다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비해야 하며, 바람직하게는 추가의 프로테아제 억제제가 세포 배양물에 혼입될 수 있다.
폴리펩티드 생산
숙주 세포는 상술된 발현 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션되고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선별하거나 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키는데 적합하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다.
트랜스펙션은 어떠한 코딩 서열이 실제로 발현되든지 간에 숙주 세포에 의해 발현 벡터를 취하는 것을 언급한다. 많은 트랜스펙션 방법, 예를 들어 CaPO4 침전법 및 전기천공법이 당업자에게 공지되어 있다. 성공적인 트랜스펙션은 일반적으로 이러한 벡터의 작동에 대한 표시가 숙주 세포에서 나타날 때 인지된다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 구성물에 의해서 복제되도록 원핵생물 숙주로 도입되는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 대해 적합한 표준 기술을 이용해 수행된다. 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리가 실질적인 세포-벽 장애물을 포함하는 세균 세포에 대해 일반적으로 사용된다. 형질전환을 위한 또 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 이용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
원핵생물 숙주 세포는 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 당 기술 분야에서 공지된 어떠한 배지에서도 성장될 수 있다. 적합한 배지의 예는 루리아 브로스 (luria broth: LB) + 필수 영양 보충물을 포함한다. 또한, 배지는 발현 벡터를 포함하는 원핵생물 세포의 선택적인 성장을 가능하게 하도록 발현 벡터의 제작물에 기초하여 선택된 선별제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 암피실린이 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 배지에 가해진다.
또한, 탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원을 제외한, 모든 필요한 보충물이 적합한 농도로 포함될 수 있으며, 단독으로 도입되거나 복합 질소 공급원과 같이 또 다른 보충물 또는 배지와 함께 혼합물로서 도입된다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이사의 환원제를 포함할 수 있다
원핵생물 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양된다. 이. 콜라이에 대해서, 예를 들어 바람직한 온도는 약 20 ℃ 내지 약 39 ℃, 바람직하게는 약 25 ℃ 내지 약 37 ℃, 보다 더 바람직하게는 약 30 ℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9의 범위일 수 있다. 이. 콜라이에 대해, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 보다 바람직하게는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 발현 벡터에 사용되는 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에서 유도된다. 예를 들어, PhoA 프로모터가 전사를 조절하는데 사용되는 경우, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위해 포스페이트-제한 배지에서 배양될 수 있다. 당 기술 분야에 기술된 바와 같이, 사용되는 벡터 제작물에 따라, 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
미생물에서 발현되는 폴리펩티드는 숙주 세포의 페리플라즘으로 분비되고 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 통상적으로, 삼투 쇽, 초음파 분해 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 파괴시키는 것을 수반한다. 세포를 파괴시킨 후, 세포 파편 또는 전체 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은, 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 더욱 정제될 수 있다. 달리, 단백질은 배양 배지로 이동되어 이로부터 분리될 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거시키고, 배양 상등액을 여과시키며, 생산된 단백질의 추가 정제를 위해 농축시킬 수 있다. 발현된 폴리펩티드는 면역친화 또는 이온-교환 컬럼 상에서의 분별; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어 Sephadex G-75를 사용한 겔 여과; 소수성 친화성 수지, 매트릭스에 고정화된 적합한 항원을 사용하는 리간드 친화성 및 웨스턴 블롯 검정과 같은 일반적으로 공지된 방법을 이용하여 더욱 분리 및 확인될 수 있다.
원핵생물 숙주 세포 외에, 진핵생물 숙주 세포 시스템도 당 기술 분야에서 널리 확립되어 있다 [U.S. 특허 제4,816,567호]. 적합한 숙주는 CHO와 같은 포유동물 세포주 및 후술되는 바와 같은 곤충 세포를 포함한다.
폴리펩티드 정제
생산되는 폴리펩티드는 추가의 검정 및 사용에 대해 실질적으로 균질한 제제를 수득하기 위해 정제될 수 있다. 당 기술 분야에서 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차에 대한 예이다: 면역친화 또는 이온-교환 컬럼에서 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 및 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 Sephadex G-75를 사용한 겔 여과.
본 발명의 방법
본 발명은 HGF/c-met 시그널화 경로의 활성화에 중요한 c-met에 있는 도메인의 확인에 기초하여 다양한 방법을 제공한다. 이러한 도메인과의 간섭이 HGF/c-met 활성화를 조절한다는 것이 입증된다.
다양한 물질 또는 분자 (펩티드/폴리펩티드, 항체 등을 포함)가 치료제로서 사용될 수 있다. 이들 물질 또는 분자는 제약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위해 공지된 방법에 따라 제형화되어 이의 제품은 제약학적으로 허용되는 담채 비히클과 함께 혼합될 수 있다. 치료 제형물은 저장을 위해 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분을 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 적합한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수령자에게 무독성이며, 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 슈가 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 카운터이온, 예를 들어 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 PEG를 포함한다.
생체 내 투여를 위해 사용될 제형은 멸균성이어야 한다. 이는 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 쉽게 달성된다.
본원에서 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하주사 바늘로 꿰뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥 내 용액 백 또는 바이알에 놓인다.
투여의 경로는 공지된 방법, 예를 들어 정맥 내, 복강 내, 뇌 내, 근육 내, 안 내, 동맥 내 또는 병소 내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여 또는 지연 방출 시스템에 따른다
본 발명의 제약학적 조성물의 투여량 및 목적하는 약물 농도는 고려되는 특정 이용에 따라 달라질 수 있다. 적합한 투여량 또는 경로의 결정은 일반적인 의사의 기술 범위 내에 속한다. 동물 실험은 사람 치료를 위한 유효 용량의 결정을 위한 신뢰성 있는 지침을 제공한다. 유효 용량에 대한 종간 비율은 문헌 [Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96]에 규정된 윈칙에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 길항제의 생체 내 투여가 이용되는 경우, 일반적인 투여량은 투여 경로에 따라 약 10 ng/kg (포유동물의 체중)/일 내지 100 mg/kg/일, 바람직하게는 약 1 μg/kg/일 내지 10 mg/kg/일로 다양할 수 있다. 특정 투여량 및 투여 방법에 대한 안내가 예를 들어 문헌 [U.S. 특허 제4,657,760호; 제5,206,344호; 또는 제5,225,212호]에서 제공된다. 상이한 제형이 상이한 치료 화합물 및 상이한 장애에 효과적일 수 있으며, 예를 들어 하나의 기관 또는 조직을 표적한 투여는 또 다른 기관 또는 조직을 표적한 투여와는 상이한 방식으로 전달하는 것을 필요로 할 수 있는 것으로 예상된다.
물질 또는 분자의 지연-방출 투여가 이의 투여를 필요로 하는 질환 또는 장애의 치료에 적합한 방출 특성을 갖는 제형에 필요한 경우, 상기한 물질 또는 분자의 마이크로캡슐화가 고려된다. 지연 방출을 위한 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 사람 성장 호르몬 (rhGH), 인터페론-(rhIFN-), 인터루킨-2 및 MN rgp120으로 성공적으로 수행되었다 [Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439462; 국제 특허 공보 제WO 97/03692호, 제WO 96/40072호, 제WO 96/07399호; 및 U.S. 특허 제5,654,010호].
이들 단백질의 지연-방출 제형은 이의 생물적합성 및 다양한 생분해성 특성에 의해 폴리-락트산-코글리콜산 (poly-lactic-coglycolic acid: PLGA)을 사용하여 개발되었다. PLGA, 락트산 및 글리콜산의 분해 산물은 인체 내애서 빠르게 제거될 수 있다. 또한, 이들 중합체의 분해능은 이의 분자량 및 조성에 따라 수개월 내지 수년으로 조절될 수 있다 [Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41].
본 발명은 c-met Sema 도메인 기능(들) (예: c-met 이량체화, 리간드 결합)을 간섭하여 HGF/c-met 시그널화를 억제하는 화합물을 확인하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 스크리닝 검정은 c-met Sema 서열을 결합하거나 이와 컴플렉스를 형성하거나, c-met Sema 도메인과 다른 세포성 단백질과의 상호작용을 간섭하는 화합물을 확인하도록 고안된다. 이러한 스크리닝 검정은 화학적/화합물 라이브러리를 고속 (high-throughput) 스크리닝하고 약물 후보물 (예: 펩티드/폴리펩티드, 소분자, 항체 등)을 확인하는데 특히 적합하도록 수정될 수 있는 검정을 포함할 것이다.
상기 검정은, 당 기술 분야에서 널리 알려진, 단백질-단백질 결합 검정, 생화학적 스크리닝 검정, 면역검정 및 세포-기초 검정을 포함한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
길항제를 위한 모든 검정은, c-met (Sema 도메인)가 이의 결합 파트너와 상호작용하기에 충분한 시간 동안 조건 하에 약물 후보물을 c-met Sema 도메인과 접촉시키는 것을 필요로 한다는 점에서는 공통적이다.
결합 검정에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 컴플렉스는 반응 혼합물 중에서 분리되거나 검출될 수 있다. 특정 양태에서, 후보 물질 또는 분자는 고체상, 예를 들어 마이크로역가 평판에 공유 또는 비공유 접착에 의해 고정화된다. 비-공유 접착은 일반적으로 고체 표면을 물질/분자의 용액으로 코팅하고 건조시켜 수행된다. 달리, 고정화된 친화성 분자, 예를 들어 고정화될 물질/분자에 특이적인 항체 (예: 단일클론 항체)가 고체 표면에 이를 고정 (anchoring)하는데 사용될 수 있다. 상기 검정은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비-고정화된 성분을 고정화된 성분, 예를 들어 고정된 성분을 포함하는 코팅된 표면에 가함으로써 수행된다. 반응이 완결되면, 비-반응된 성분은, 예를 들어 세척에 의해 제거되고, 고체 표면에 고정된 컴플렉스가 검출된다. 초기에 비-고정화된 성분이 검출가능한 표지를 갖는 경우, 표면에 고정화된 표지의 검출은 컴플렉스화가 발생했다는 것을 나타낸다. 초기에 비-고정화된 성분이 표지를 갖지 않는 경우, 컴플렉스화는, 예를 들어 고정화된 컴플렉스를 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용함으로써 검출될 수 있다.
후보 화합물이 c-met Sema 도메인과 상호작용은 하나 이에 결합하지 않는 경우, 이 도메인과의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위한 널리 공지된 방법으로 검정될 수 있다. 이러한 검정은 통상의 접근법, 예를 들어 가교결합, 공동-면역침전 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공동-정제를 포함한다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991)]에 기술된 바와 같이 문헌 [Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)]에 기술된 효모계 유전자 시스템을 사용하여 모니터링될 수 있다. 많은 전사 활성화제, 예를 들어 효모 GAL4는 2개의 물리적으로 구별되는 모듈 도메인 (하나는 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 다른 하나는 전사-활성화 도메인으로 기능)으로 구성된다. 상기 공개문에 기재된 효모 발현 시스템 (일반적으로 "투-하이브리드 시스템"으로 언급됨)은 이러한 특성을 이용하며, 2개의 하이브리드 단백질 (표적 단백질이 GAL5의 DNA-결합 도메인에 융합되는 하나의 단백질, 및 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 융합되는 또 다른 단백질)을 사용한다. GAL4-활성화된 프로모터의 조절 하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 의존한다. 상호작용 폴리펩티드를 포함하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색성 기질로 검출된다. 투-하이브리드 기술을 이용하는 2개의 특이적 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완전한 키트 (MATCHMAKERTM)가 Clontech으로부터 시판된다. 또한, 이 시스템은 특정 단백질 상호작용에 수반되는 단백질 도메인을 맵핑하고 이들 상호작용에 중요한 아미노산 잔기를 특정하기 위해 확장될 수 있다.
c-met Sema 도메인의 이의 파트너와의 상호작용을 간섭하는 화합물은 하기와 같이 시험될 수 있다: 통상적으로, c-met Sema 서열 또는 이의 부분 및 결합 파트너 (예: Sema를 포함하는 또 다른 폴리펩티드, 예를 들어 c-met의 세포외 도메인)을 포함하는 반응 혼합물을 2개의 생성물의 상호작용 및 결합을 가능하게 하는 시간 동안 및 조건 하에 제조한다. 후보 화합물이 결합을 억제하는 능력을 시험하기 위해, 반응은 시험 화합물의 부재 및 존재 하에 수행된다. 또한, 양성 대조군으로 사용하기 위해 위약이 제 3 반응 혼합물에 가해질 수 있다. 시험 화합물과 혼합물에 존재하는 c-met Sema 서열 사이의 결합 (컴플렉스 형성)은 상술된 바와 같이 모니터링된다. (시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물에서가 아닌) 대조 반응물(들)에서의 컴플렉스의 형성은 시험 화합물이 c-met Sema 도메인과 이의 결합 파트너의 상호작용을 간섭하는 것을 나타낸다.
억제제 (예: 길항제)를 검정하기 위해서, c-met 발현 세포를 c-met Sema 도메인의 기능과 관련된 특정 활성에 대해 스크리닝될 화합물과 접촉시킬 수 있으며, 활성을 억제하는 화합물의 능력은 이 화합물이 Sema 도메인 (또는 이의 서브-도메인)에 대한 길항제일 수 있다는 것을 나타내며, 이의 특성은 c-met Sema 도메인과는 특이적으로 결합하거나 상호작용하지만 비관련 분자와는 그러하지 않는 이들의 능력을 측정함으로써 추가로 확인될 수 있다.
잠재적인 길항제에 대한 다른 특정 예는 c-met Sema 도메인에 결합하는 올리고뉴클레오티드 (이는 압타머일 수 있다) 및, 특히, 이로 제한됨이 없이, 다중클론 항체 및 단일클론 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항이디오타입 항체, 및 이러한 항체 또는 단편의 키메릭 또는 사람화된 항체, 및 사람 항체 및 항체 단편을 포함한 항체를 포함한다. 달리, 잠재적인 길항제는 밀접히 관련된 단백질, 예를 들어 야생형 c-met의 작용을 경쟁적으로 억제하는 c-met Sema 도메인의 돌연변이된 형태일 수 있다.
잠재적인 길항제는 c-met Sema 도메인 및/또는 이의 결합 파트너 상에 있는 c-met Sema의 결합 부위에 결합하여 c-met Sema 도메인의 통상의 생물학적 활성을 차단하는 소분자를 포함한다. 소분자의 예는, 이로 제한됨이 없이, 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비-펩티드성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 이들 소분자는 상술된 스크리닝 검정 중 하나 이상 및/또는 당업자에게 널리 공지된 기타 스크리닝 기술에 의해 확인될 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같이, 본 발명의 길항제는 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드를 수득하는 방법은 당 기술 분야에서 널리 공지되어 있으며, 적합한 표적 항원에 대한 결합체를 위한 펩티드 또는 폴리펩티드 라이브러리의 스크리닝을 포함한다. 하나의 양태에서, 적합한 표적 항원은 c-met Sema 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 펩티드 및 폴리펩티드의 라이브러리는 당 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 또한 문헌 [Clark et al., U.S. 특허 제6,121,416호; Bass et al., U.S. 특허 제5,688,666호]의 방법에 따라 제조될 수 있다. 이종 단백질 성분, 예를 들어 파아지 코트 단백질에 융합된 펩티드 또는 폴리펩티드의 라이브러리가 문헌 [Clark et al., Bass et al., 상기 참조]에 기술되어 있는 바와 같이 당 기술 분야에서 널리 공지되어 있다. 하나의 양태에서, c-met Sema 도메인 기능을 차단하는 능력을 갖는 펩티드는 아미노산 서열 LDAQT (서열: 1), LTEKRKKRS (서열: 2), KPDSAEPM (서열: 3) and/or NVRCLQHF (서열: 4), 또는 이의 변이체를 포함한다. 하나의 양태에서, c-met Sema 도메인 기능을 차단하는 능력을 갖는 폴리펩티드는 모든 또는 실질적으로 모든 c-met Sema 도메인을 포함한다. 제 1 펩티드 또는 폴리펩티드 결합체의 변이체가 목적하는 특징 (예: 표적물 결합 친화성 향상, 향상된 약력학, 감소된 독성, 개선된 치료 지수 등)을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드의 돌연변이체를 스크리닝함으로써 생성될 수 있다. 돌연변이유발 기술은 당 기술 분야에서 널리 공지되어 있다. 또한, 스캐닝 돌연변이유발 기술 (예: 알라닌 스캐닝에 기초한 기술)이 펩티드 또는 폴리펩티드 내의 각각의 아미노산 잔기의 구조적 및/또는 기능적 중요성을 평가하는데 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 후보 물질/분자의 HGF/c-met 시그널화 및/또는 상기 시그널화와 관련된 생물학적 활성을 조절하는 능력의 측정은, 예를 들어 문헌 [Okigaki et al., Biochemistry (1992), 31:9555-9561; Matsumoto et al., J. Biol. Chem. (1998), 273:22913-22920; Date et al., FEBS Let. (1997), 420:1-6; Lokker et al., EMBO J. (1992), 11:2503-2510; Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1992), 89:11574-11578]에 기술된 바와 같이, 당 기술 분야에서 널리 확립된 시험관 내 또는 생체 내 검정으로 물질/분자의 조절 능력을 시험함으로써 수행될 수 있다.
항체
또한, 본 발명은 c-met 활성화에 필요한 하나 이상의 과정, 예를 들어 c-met 이량체화 및/또는 리간드의 c-met에의 결합을 간섭하는 항체의 사용을 포함하는 방법을 제공한다. 예시적 항체는 다중클론, 단일클론, 사람화, 이특이적 및 헤테로접합체 (heteroconjugate) 항체를 포함한다.
1. 다중클론 항체
본 발명의 항체는 다중클론 항체를 포함할 수 있다. 다중클론 항체를 제조하는 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 다중클론 항체는 포유동물에, 예를 들어 면역화제 및, 필요한 경우, 아주방트를 1회 이상 주사하여 증가시킬 수 있다. 통상적으로, 면역화제 및/또는 아주방트는 포유동물에 다수의 피하 또는 복강 내 주사로 주입될 것이다. 면역화제는 c-met Sema 도메인 (또는 이의 일부) 또는 이의 융합 단백질을 포함한다. 면역화제를 면역화될 포유동물에서 면역원성인 것으로 공지된 단백질에 결합시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 면역원성 단백질의 예는, 이로 제한됨이 없이, KLH (키홀 림펫 헤모시아닌: keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 콩 트립신 억제제를 포함한다. 사용될 수 있는 아주방트의 예는 프로인트의 완전 아주방트 및 MPL-TDM 아주방트 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로즈 디코리노미콜레이트: monophosphoryl Lipid A, synthetic trehalose dicorynomycolate)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다.
2. 단일클론 항체
달리, 본 발명의 항체는 단일클론 항체일 수 있다. 단일클론 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기술된 바와 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적합한 숙주 동물은 통상적으로 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화제로 면역처리된다. 달리, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다.
면역화제는 통상적으로 c-met Sema 도메인 (또는 이의 일부) 또는 이의 융합 단백질을 포함한다. 일반적으로, 말초혈 림프구 ("PBL")는 사람 기원의 세포가 바람직한 경우 사용되며, 비장 세포 또는 림프절 세포는 비-사람 기원의 세포가 바람직한 경우 사용된다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화된 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1 986) pp. 59-103]. 불멸화된 세포주는 통상 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류 동물, 소 및 사람 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화된 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모세포가 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 통상적으로 HGPRT-결여 세포의 성장을 억제하는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이다.
바람직한 불멸화된 세포주는 효과적으로 융합하고, 선별된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 발현을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 대해 민감한 세포주이다. 보다 바람직한 불멸화된 세포주는 뮤린 골수종 세포주이며, 이는 예를 들어 SICDC (Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.) 및 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, Va.)로부터 입수될 수 있다. 또한, 사람 골수종 및 마우스-사람 헤테로골수종 세포주가 사람 단일클론 항체의 생성에 대해 기술된 바 있다 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
이어서, 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 c-met Sema 도메인에 대해 지시되는 단일클론 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의하거나 시험관 내 결합 검정, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 이러한 기술 및 검정은 당 기술 분야에 공지되어 있다. 단일클론 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 측정될 수 있다.
목적하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝되고 표준 방법 [Goding, 상기 참조]으로 성장시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 듈베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 달리, 하이브리도마 세포는 포유동물의 복수에서와 같이 생체 내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 단일클론 항체는 통상의 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-Sepharose, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수로부터 분리 또는 정제될 수 있다.
또한, 단일클론 항체는 문헌 [U.S. 특허 제4,816,567호]에 기술된 바와 같이 재조합 DNA 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체를 암호화하는 DNA는 통상의 절차를 이용하여 (예를 들어 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 분리 및 서열분석될 수 있다. 본 발명의 항체를 발현하는 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 적합한 공급원일 것이다. DNA를 분리한 후, 발현 벡터에 삽입하고, 이어서, 달리는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는, 시미안 COS 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 트랜스펙션시켜 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성물을 수득할 수 있다. 또한, 상동성 뮤린 서열 대신에 사람 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 대한 코딩 서열을 치환하거나 [U.S. 특허 제4,816,567호; Morrison et al., 상기 참조] 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 암호화 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유적으로 결합시켜 DNA를 변형시킬 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대신 치환되거나 본 발명의 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인 대신 치환되어 키메릭 이가 항체를 생성할 수 있다.
항체는 일가 항체일 수 있다. 일가 항체를 제조하는 방법이 당 기술 분야에서 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 수반한다. 중쇄는 일반적으로 중쇄 가교결합을 방지하도록 Fc 영역에 있는 위치에서 절단된다. 달리, 관련 시스테인 잔기는 가교결합을 방지하도록 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.
또한, 시험관 내 방법이 일가 항체를 제조하는데 적합하다. 항체의 단편, 특히 Fab 단편을 생성하기 위한 분해를 당 기술 분야에서 공지된 통상의 기술을 이용하여 수행할 수 있다.
또한, 항체는 적합한/목적하는 친화성을 갖고 결합하는 항체 또는 항체 단편을 위해 파아지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 생성될 수 있다. 이러한 기술은 당 기술 분야에서 널리 공지되어 있다 [U.S. 특허 제5,750,373호; 제5,780,279호; 제5,821,047호; 제6,040,136호; 제5,427,908호; 제5,580,717호 및 이에 인용된 문헌].
3. 사람 및 사람화된 항체
본 발명의 항체는 사람화된 항체 또는 사람 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비-사람 (예: 뮤린)의 사람화된 항체는 비-사람 면역글로불린으로부터 유도되는 최소 서열을 포함하는 키메릭 면역글로불린, 면여글로불린 쇄 또는 이의 단편 (예: Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합 서브서열)이다. 사람화된 항체는, 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-사람 종 (공여체 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 래비트의 CDR로부터의 잔기로 대체되는, 사람 면역글로불린 (수용체 항체)를 포함한다. 일부 예에서, 사람 면역글로불린의 Fv 골격 잔기가 상응하는 비-사람 잔기에 의해 대체된다. 또한, 사람화된 항체는 수용체 항체나 도입된 (imported) CDR 또는 골격 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함한다. 일반적으로, 사람화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 통상적으로 2개의 가변 도메인을 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-사람 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 사람 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 또한, 사람화된 항체는 최적으로는 적어도 일부분의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 통상적으로 사람 면역글로불린의 Fc를 포함할 것이다 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
비-사람 항체를 사람화시키는 방법이 당 기술 분야에서 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 사람화된 항체는 비-사람인 공급원으로부터 이로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비-사람 아미노산 잔기는 종종 "도입 (import)" 잔기로 언급되며, 통상적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 사람화는 필수적으로 설취류 동물의 CDR 또는 CDR 서열을 사람 항체의 상응하는 서열 대신 치환시킴으로써 윈터 (Winter) 및 공동-연구자의 방법 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "사람화" 항체는 키메릭 항체 (U.S. 특허 제4,816,567호)이며, 실질적으로 온전한 사람 가변 도메인보다 적은 도메인이 비-사람 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된다. 실제로, 사람화된 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설취류 동물의 항체에 있는 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 사람 항체이다.
또한, 사람 항체는 파아지 디스플레이 라이브러리를 포함한 당 기술 분야의 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]의 기술이 사람 단일클론 항체의 제조에 이용가능하다. 유사하게, 사람 항체는 유전자이식 동물, 예를 들어 내생적 면역글로불린 유전자가 부분적으로나 완전히 불활성화된 마우스로 사람 면역글로불린 유전자 자리 (locus)를 도입함으로서 제조될 수 있다. 챌린지 시, 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 포함한 모든 면에서 사람에서 보여지는 바와 밀접하게 닮은 사람 항체의 생산이 관측된다. 이러한 접근법은, 예를 들어 문헌 [U.S. 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호; Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)]에 기술되어 있다.
또한, 항체는 상기된 바와 같이 공지된 선별 및/또는 돌연변이유발 방법을 이용하여 친화성이 성숙된 항체일 수 있다. 바람직한 친화성이 성숙된 항체는, 성숙된 항체가 제조되는 출발 항체 (일반적으로 뮤린, 사람화된 또는 사람) 보다 5배, 보다 바람직하게는 10배, 보다 더 바람직하게는 20 내지 30배 큰 친화성을 갖는다.
4. 이특이적 항체
이특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 단일클론, 바람직하게는 사람 또는 사람화된 항체이다. 본 경우에서, 결합 특이성 중의 하나는 c-met Sema 도메인에 대한 것이고, 다른 하나는 다른 항원에 대한 것이다.
이특이적 항체를 제조하는 방법은 당 기술 분야에서 공지되어 있다. 통상적으로, 이특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 중쇄가 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현에 기초한다 [Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿼드로마스: quadromas)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하며, 이중 단지 하나만이 바른 이특이적 구조를 갖는다. 바른 분자의 정제는 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 달성된다. 유사한 절차가 문헌 [1993년 5월 13일에 공개된 국제 특허 공개 제WO 93/08829호; 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기술되어 있다.
목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 함께 한다. 적어도 하나의 융합물에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제 1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및, 필요한 경우, 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA가 분리된 발현 벡터에 삽입되며, 적합한 숙주 유기체에 공동-트랜스펙션된다. 이특이적 항체를 생성하는 것에 대한 보다 자세한 설명을 위해 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]를 참조한다.
국제 특허 공보 제WO 96/27011호에 기술된 또 다른 접근법에 따라, 한쌍의 항체 분자 사이의 경계면이 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로이량체의 비율 (%)을 최대화하도록 조작될 수 있다. 바람직한 경계면은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제 1 항체 분자의 경계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 보다 큰 측쇄 (예: 티로신 또는 트립토판)으로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예: 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "구멍 (cavity)"이 제 2 항체 분자의 경계면에 생긴다. 이는 호모이량체와 같은 다른 목적하지 않는 최종-생성물에 비해 헤테로이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.
이특이적 항체는 전체 길이의 항체 또는 항체 단편 (예: F(ab')2 이특이적 항체)로 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이특이적 항체를 생성하기 위한 기술이 문헌에 기술되었다. 예를 들어, 이특이적 항체는 화학적 연결물을 사용해 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]은 온전한 항체가 단백질 분해적으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기술한다. 이들 단편은 디티올 컴플렉스화제인 나트륨 아르세나이트의 존재 하에서 환원되어 인접한 디티올을 안정화시키고 분자 내 디설파이드 형성을 막는다. 이어서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, 하나의 Fab'-TNB 유도체가 머캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환된 후, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이특이적 항체를 형성한다. 생성된 이특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로 사용될 수 있다.
Fab' 단편은 직접적으로 이. 콜라이로부터 회수되고, 화학적으로 커플링되어 이특이적 항체를 형성할 수 있다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]은 완전히 사람화된 이특이적 항체 F(ab')2 분자의 생성을 기술한다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도로 분비되며 시험관 내에서 화학적 커플링되어 이특이적 항체를 형성한다. 이렇게 형성된 이특이적 항체는 ErbB2 수용체 및 정상적인 사람 T 세포를 과발현하는 세포에 결합하고 사람 유방암 표적물에 대한 사람 세포독성 림프구의 분해 활성을 촉발시킬 수 있다.
또한, 재조합 세포 배양으로부터 직접적으로 이특이적 항체 단편을 제조 및 분리하기 위한 다양한 기술이 기술되었다. 예를 들어, 이특이적 항체는 루이신 지퍼를 사용하여 생산되었다 [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 루이신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 호모이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 후 재산화되어 항체 헤테로이량체를 형성하였다. 또한, 이러한 방법은 항체 호모이량체를 생성하는데도 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디 (diabody)" 기술이 이특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 메카니즘을 제공하였다. 이 단편은 너무 짧아 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 이루지는 못하는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결되는 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루게 되어 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 또한, 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 문헌 [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)]에 보고되었다.
2개 이상의 결합가를 갖는 항체가 고려될 수 있다. 예를 들어, 삼특이적 항체가 제조될 수 있다 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
예시적인 이특이적 항체는 단일 c-met Sema 도메인 상의 2개의 상이한 에피토프 또는 c-met Sema 도메인 상의 하나의 에피토프 및 또 다른 폴리펩티드 상의 하나의 에피토르에 결합할 수 있다.
5. 헤테로접합체 항체
또한, 헤테로접합체 항체도 본 발명의 범위에 속한다. 헤테로접합체 항체는 2개의 공유적으로 결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어 HIV 감염의 치료를 위해 [국제 특허 공보 제WO 91/00360호; 국제 특허 공보 제WO 92/200373호; EP 제03089호] 면역계 세포가 불필요한 세포를 표적하도록 제기되었다 [U.S. 특허 제4,676,980호]. 항체는 가교결합제를 수반하는 것을 포함하여 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용하여 시험관 내에서 제조될 수 있다고 예상된다. 예를 들어 디설파이드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성함으로써 면역독소가 제작될 수 있다. 이러한 목적을 위한 적합한 시약에 대한 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및 예를 들어 U.S. 특허 제4,676,980호에 기술된 것을 포함한다.
6. 이펙터 기능 조작 ( engineering )
예를 들어 암을 치료하는데 있어 항체의 유효성을 향상시키기 위해, 이펙터 기능과 관련하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여 이 영역에 쇄간 디설파이드 결합을 형성할 수 있다. 이렇게 생성된 호모이량체 항체는 개선된 내화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)를 가질 수 있다 [Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)]. 또한, 향상된 항-종양 활성을 갖는 호모이량체 항체가 문헌 [Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)]에 기술된 바와 같이 헤테로이작용성 가교-링커를 사용하여 제조될 수 있다. 달리, 항체는 이중 Fc 영역을 가져 향상된 보체 용해 및 ADCC 능력을 갖도록 조작될 수 있다 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)].
7. 면역접합체
또한, 본 발명은 세포독성제, 예를 들어 화학치료제, 독소 (예: 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학치료제는 상기 기술하였다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나즈 아에루기노사로부터) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테세네스를 포함한다. 다양한 방사성 핵종이 방사결합된 항체의 생성에 이용가능하다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다. 항체 및 세포독성제의 접합은 다양한 이작용성 단백질-커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예: 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루카르알데히드), 비스-이지도 화합물 (예: 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 토일렌 2,6-디이소시아네이트) 및 이-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 수행된다.. 예를 들어, 리신 면역독소가 문헌 [Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)는 방사성 뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다 [국제 특허 공보 제WO 94/11026호].
또 다른 양태에서, 항체는 종양 예비표적화에 사용하기 위해 "수용체 (예: 스트렙트아비딘)"에 접합될 수 있으며, 이 경우 항체-수용체 접합체가 환자에게 투여되고, 결합되지 않은 접합체는 제거제를 사용하여 제거되며, 이어서 세포독성제 (예: 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예: 아비딘)가 투여된다.
8. 면역리포좀
또한, 본원에 기술된 항체는 면역리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은, 예를 들어 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 및 U.S. 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호]에 기술된 바와 같이, 당 기술 분야에서 공지된 방법으로 제조된다. 향상된 순환을 갖는 리포좀이 문헌 [U.S. 특허 제5,013,556호]에 기술되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀은 규정된 세공 크기의 필터를 통해 압출시켜 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)]에 기술된 바와 같이 리포좀에 접합될 수 있다. 화학치료제 (예: 독소루비신)가 임의로 리포좀 내에 포함된다 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)].
9. 항체의 제약학적 조성물
항체 및 전술된 스크리닝 검정으로 확인된 다른 분자가 제약학적 조성물의 형태로 다양한 장애의 치료를 위해 투여될 수 있다.
전체 항체가 억제제로서 사용되는 경우, 내화 항체가 바람직하다. 그러나, 리포펙션 또는 리포좀도 본 발명의 물질/분자를 세포에 전달하는데 사용될 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 가장 작은 억제 단편을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열에 기초하여, c-met Sema 도메인을 결합 및/또는 c-met Sema 도메인과 이의 결합 파트너 사이의 상호작용을 간섭하는 능력을 보유하는 펩티드 분자가 디자인될 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고/되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)]. 또한, 제형물은 치료되는 특정 증상에 대해 필요한 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 서로 불리하게 작용하지 않는 보완적 활성을 갖는 화합물을 포함할 수 있다. 달리 또는 추가로, 상기 조성물은 이의 기능을 향상시키는 작용제, 예를 들어 세포독성제, 사이토킨, 화학치료제 또는 성장-억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도하는 목적에 대해 유효한 양으로 배합물로 존재한다.
또한, 활성 성분은, 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의하거나 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로즈 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 콜로이드성 약물 수송 시스템 (예: 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에 포함될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 참조]에 기술되어 있다.
생체 내 투여를 위해 사용되는 제형물은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
지연-방출 제제가 제조될 수 있다. 지연-방출 제제의 적합한 예는 항체를 포함하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형된 제품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지연-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예: 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜), 폴리락타이드 (U.S. 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOTTM (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어) 및 폴리-D-(-)-3-히록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 아세트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 이상에 걸쳐 분자를 방출시킬 수 있으며, 특정한 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 오랫동안 체내에 머물수 있지만, 이들은 37 ℃에서 습기에의 노출 결과 변성하거나 응집하여, 생물학적 활성을 상실하고 면역원성이 변화될 수 있다. 수반되는 메카니즘에 따른 안정화를 위한 합리적인 방법이 계획될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디설파이드 교체를 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지는 경우, 안정화는 설프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 함습량 조절, 적합한 첨가제 사용 및 특정 중합체 매트릭스 조성의 개발에 의해 달성될 수 있다.
제조 물품
본 발명의 또 다른 양상으로, 상술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질들을 포함하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품을 용기 및 이러한 용기 상의 또는 용기와 관련된 라벨 및 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 상기 용기는 그 자체의 조성물 또는 다른 조성물과 배합되는 경우 상태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 조성물을 보유하며 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥 내 용액 백이거나 피하 주사 바늘로 꿰뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 하나의 활성제가 본 발명의 길항제이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 암과 같은 선택적 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 본 발명의 길항제를 포함하는 조성물이 담기는 제 1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제를 포함하는 조성물이 담기는 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에서 제조 물품은, 제 1 및 제 2 조성물이 특정 상태, 예로 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 달리 또는 추가로, 제조 물품은 제약학적으로 허용되는 완충제, 예로 제균작용 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거 용액 및 덱스트로즈 용액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 또한 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 시판 및 사용자 견지에서 바람직한 다른 물질들을 포함할 수 있다.
하기는 본 발명의 방법 및 조성물에 대한 실시예이다. 상기한 일반적 기술을 고려할 때, 다양한 다른 양태가 실시될 수 있다는 것을 알 수 있다.
재료 및 방법
제작물 및 재조합 단백질
c-met의 세포외 서브-도메인을 통상의 PCR 방법을 이용하여 제작하였다. KpnI 부위가 플랭킹된 Sema, PSI, 제 1 IPT 또는 제 4 IPT 도메인의 출발물을 포함하는 N-말단 프라이머를 StuI 부위가 플랭킹된 Met 잔기 959까지의 C-말단 프라이머와 쌍을 이루었다. c-met는 주형으로 사용하고, 각각의 클론에 대한 PCR 단편을 Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트 (Invitrogen)을 사용하여 제작자의 지시에 따라 pCR-Blunt II-TOPO 벡터로 삽입하였다. 상기 클론을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 이어서, 상기 제작물을 C-말단에 태그를 첨가하기 위해 KpnI 및 EcoRV를 통해 pcDNA3.1 V5/His 벡터 (Invitrogen)로 서브클로닝하였다. Met에 대한 시그널 펩티드는 각각의 클론의 N-말단에서 HindIII 및 KpnI 부위를 통해 첨가하였다. 각각의 클론을 HindIII 및 EcoRV로 분해하고, HindIII 및 PmeI를 통해 pRK5TKneo 벡터에 서브클로닝하였다. EC-WT Flag 및 EC-WT V5/His 클론을 위해, HindIII 부위를 포함하는 N-말단 프라이머를 StuI 부위가 플랭킨된 Met 잔기 595까지의 C-말단 프라이머와 쌍을 이루었다. EC-WT V5/His를 상술한 바와 같이 HindIII/StuI를 통해 pRKSTKneo로 서브클로닝하였다. EC-WT Flag를 위해, PCR 단편을 pCR-Blunt II-TOPO 벡터에 결합시켰다. Flag 태그 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 StuI와 KpnI 사이에 삽입하였다. 이어서, EC-WT Flag를 HindIII 및 EcoRV/ScaI를 통해 pRK5TKneo로 서브클로닝하였다. 재조합 HGF 및 항-Met 5D5-Fab는 R. Schwall (Genentech)의해 제공되었다. scHGF는 문헌 [Peek et al., 2002]에서 기술된 바와 같이 포유동물 세포에서 생성되었다.
재조합 Sema 및 PSI 도메인을 수득하기 위해, MET 수용체의 잔기 25-567를 암호화하는 영역에 대해 PCR을 수행하였다. 8xHis 태그 및 NotI 부위를 C-말단에 첨가하고, N-말단을 pAcGP67A (BD Biosciences)의 곤충 세포 분비 시그널의 C-말단에 직접적으로 융합시켰다. PCR 생성물을 SpeI 및 NotI로 분해시키고, pAcGP67A로 서브클로닝하였다. 정제된 플라스미드 DNA (pAcGP67A + MET sema 및 PSI 도메인)를 제작자의 프로토콜 (BD Biosciences)에 따라 Sf9 곤충 세포로 트랜스펙션하였다. 발현을 위해, ESF 921 배지 (Protein Expression, LLC)에서 5x105개 세포/mL의 밀도로 성장하는 HiS 곤충 세포 1 L을 72시간 동안 27 ℃에서 인큐베이션된 바이러스 스톡 10 mL로 감염시켰다. 이어서, 15분 동안 3000 g에서 원심분리시켜 상등액으로부터 세포를 제거하였다. 1 mM의 NiCl2, 5 mM의 CaCl2 및 50 mM Tris pH 8.0을 상등액에 가하였다. 상등액을 여과시키고, 중력 유동에 의해 2 mL Ni-NTA 컬럼 (Qiagen)에 적용하고, 이어서 세척 완충액 (50 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 mM 이미다졸) 20 mL을 적용하였다. 단백질을 50 mM Tris 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸을 포함하는 완충액으로 용출시켰다. 재조합 Sema 도메인만을 제조하려는 시도는 Sema 3A에 대해 이전에 보고된 바와 같이 [Antipenko et al., 2003] 단백질을 생성하지 못하였다.
면역침전 및 웨스턴 블롯 분석
세포주는 ATCC로부터 입수하였다. 293 세포를 10 % FBS (Sigma), 페니실린/스트렙토마이신 (GIBCO) 및 글루타민으로 보충된 DMEM에서 유지시켰다. A549, H441 및 MDA-MB435 세포를 10 % FBS, 페니실린/스트렙토마이신 및 글루타민으로 보 충된 50:50 DMEM/F12 (Cellgro)에 유지시켰다. 세포를 제작자의 지시에 따라 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 지시된 제작물 1-12 μg으로 트랜스펙션하였다. 24시간 후, 세포를 완전 프로테아제 억제제 칵테일 타블렛 및 포스파타제 억제제 칵테일 2 (각각 Roche 및 Sigma)을 포함하는 1 % NP40 용해 완충액으로 수거하였다. Met 티로신 포스포릴화 및 MAPK 포스포릴화 조사를 위해, 세포를 2시간 동안 0.5 % BSA로 혈청-제한하였다. 10 μg/ml 항-Met 5D5-Fab 또는 rSema로 처리된 세포를 용해 전에 추가의 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 파편을 원심분리시키고, 상등액을 1시간 동안 Protein A Sepharose (Sigma) 또는 Protein G-Plus 아가로즈 비드 (Santa Cruz)로 예비제거시켰다. 이어서, 용해물 500 μg을 4 ℃에서 회전시키면서 밤새 5D5 항체 (Genentech) 10 μg 또는 Met (C-28) 아가로즈 접합체 (Santa Cruz) 35 μl로 면역침전시켰다. HGF 결합 조사를 위해, 용해물 500 μg을 scHGF 또는 HGF 5 μg과 인큐베이션한 후, V5 항체 1 μg으로 면역침전시켰다. Protein A 또는 G 비드를 추가의 2시간 동안 가하고, 면역침전물을 1 % NP40 용해 완충액으로 3회 세척하였다. 10 mM DTT와 함께 2x 샘플 완충액을 첨가한 후, 샘플을 4-12 % 트리스-글리신 겔 (Invitrogen) 상에서 처리하였다. 단백질을 니트로셀룰로즈 막에 옮기고, 1시간 동안 5 % 탈지 우유 또는 BSA로 차단시킨 후, 밤새 4 ℃에서 진동시키면서 1:5000 V5 (Invitrogen), 1:10000 C-말단 Met (C-12) (Santa Cruz), 1:1000 MAPK (Cell Signaling), 1:500 HGF-α (145) (Santa Cruz), 1:1000 P-MAPK (Cell Signaling), 1:1000 His (Cell Signaling), 또는 1:1000 포스포티로신 4G10 (Upstate) 항체로 탐침하였다. 마우스 또는 래비트 IgG 에 대한 제 2 항체를 1:5000 희석물 (Amersham)로 사용하였다. 단백질을 증진된 화학발광 (ECL-Plus, Amersham)으로 검출하였다.
공유결합적 친화성 가교결합 분석
가교결합 조사는 변형과 함께 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 [Blechman et al., 1995]. A549, H441, MDA-MB435, 및 293 세포를 2시간 동안 0.5 % BSA로 혈청-제한하였다. 배지를 제거하고, PBS로 대체하였다. 이어서, 세포를 제작자의 지시에 따라 증가하는 농도의 가교결합제 설포-EGS (Pierce)로 처리하였다. 유사하게, 293 세포를 6-웰 평판에 도말하고, Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하면서 지시된 제작물 0.1-4 μg로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후, 배지를 PBS로 대체하고, 세포를 설포-EGS로 가교결합시켰다. 이어서, 세포를 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 갖는 1 % NP40 용해 완충액으로 용해시켰다. 이어서, 환원 샘플 완충액 중의 용해물 10 μg을 8 % 또는 4-12 % Tris-글리신 겔 상에서 즉시 분석하고, 니트로셀룰로즈 막에 옮긴 후, 1시간 동안 5 % 우유로 차단시켰다. 막을 밤새 4 ℃에서 진동시키면서 1:1000 Met C-12 (Santa Cruz) 또는 1:5000 V5 항체로 탐침하였다. 1:5000 제 2 항체의 인큐베이션 후, 단백질을 ECL-Plus로 검출하였다. EC-WT-Flag 및 EC-WT-V5/His 제작물을 앞에서와 같이 공동-트랜스펙션하고 가교결합하였다. 가교결합된 용해물 500 μg을 V5 또는 Flag 항체로 면역침전시키고, 8 % Tris-글리신 겔에서 분석한 후, 니트로셀룰로즈 막에 옮기고, 1:5000 V5 또는 1:1000 Flag (Sigma) 항체로 면역블롯팅하였다. 단백질을 ECL- Plus로 검출하였다.
스크레이프 검정
H441 세포를 50:50 DMEM/F12 중의 10 % FBS를 갖는 96-웰 평판에 4.5x104개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 다음날, 단일 스크레이프를 이전에 기술된 바와 같이 [Lorenzato et al., 2002] 각각의 웰의 컨플루언트 (confluent) 단층에 수행하였다. 이어서, 세포를 0.5 % BSA를 포함하는 배지와 함께 인큐베이션하고, mock, 10 μg/ml 5D5, 10 μg/ml Sema 또는 100 ng/ml HGF로 처리하였다. 스크레이프를 모니터링하고 매일 사진을 찍었다. 2일째의 대표적인 결과를 나타낸다.
이동 검정
트랜스웰 이동 검정은 변형과 함께 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 [Coltella et al., 2003]. MDA-MB435 세포를 10 ug/ml 콜라겐 타입 IV (Sigma)로 이전에 코팅된 각각의 트랜스웰 (Costar)의 상단 챔버에 0.5 % BSA를 포함하는 배지 중의 1.2x105개 세포로 시딩하였다. mock, 10 μg/ml 항-Met 5D5-Fab 또는 10 μg/ml Sema를 상단 챔버에 가하였다. 양성 대조군으로서, 100 ng/ml HGF를 mock-처리된 웰의 하단 챔버에 가하였다. 다음날, 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정시키고, 0.5 % 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 하단 챔버로 이동된 세포를 10 % 아세트산으로 가용화시키고, 흡광도를 마이크로평판 판독기로 560 nm에서 측 정하였다.
결과
Met 수용체 가교결합에 Sema 도메인의 필요성
Met의 세포외 도메인에 의한 수용체 이량체화 및 활성화에 대한 관여를 측정하기 위해, Met의 서브 도메인 결실체를 도 1에 나타난 바와 같이 제조하였다. 각각의 결실 돌연변이체는 N-말단의 시그널 펩티드 (S.P.) 및 V5/His 태그를 갖는 C-말단 트랜스막 영역으로 플랭킹된다. Met 결실 돌연변이체를 설포-EGS를 사용하여 가교결합하는 능력에 대해 개별적으로 시험하였다. 증가하는 농도의 설포-EGS로 처리된 V5/His-태그 결실 돌연변이체로 트랜스펙션된 세포를 용해시키고, 4-12 % SDS-PAGE 상에서 분석하였다. 설포-EGS로 처리되지 않은 샘플에서, EC-WT-V5/His는 프로세싱된 단량체 (EC-M, 약 90 kD) 및 프로세싱되지 않은 (*, 약 120 kD) 단백질로 나타났다. EC-WT 가교결합은 도 2A에 나타난 바와 같이, 하단으로부터 (EC-M, 약 90 kD) 상단 이동 이량체로 (EC-D, 약 180 kD) 위치 변동에 의해 검출되었다. Sema 도메인이 결여된 Met 돌연변이체는 유사한 위치 변동을 나타내지 않았다. 예상되는 바와 같이, 프로세싱되지 않은 EC-WT (*) Met는 설포-EGS가 세포 막 불투과이므로 가교결합을 나타내지 않았다는 것이 주목된다. Met의 세포내 단일쇄 전구체는 세포 표면에 존재하는 경우 단백질분해적으로 절단된다 [Giordano et al., 1989]. 설포-EGS는 이의 제한된 투과성 때문에 가교결합제로서 선택되었으며, 막-삽입된 프로세싱된 Met 수용체를 가교결합하는 효과가 조사되었다.
막-결합된 세포외 Met가 호모이량체를 형성하는지를 검토하기 위해, 세포를 EC-WT-V5/His 및 EC-WT-Flag로 공동트랜스펙션시키고, 설포-EGS로 가교결합시켰다. 세포를 용해시키고, V5 항체로 면역침전시킨 후, 8 % SDS-PAGE에서 분석하고, Flag 또는 V5 항체로 면역블롯팅하였다. 면역블롯은 EC-WT-Flag 및 EC-WT-V5/His을 포함하는 상단 이동 형태 (EC-D, 약 180 kD)를 보였으며 (도 2B), 이는 EC-WT의 두가지 형태 모두가 가교결합되고 공동면역침전된다는 것을 나타낸다. Flag 항체를 사용하는 역 면역침전도 유사한 결과 (도 2B)를 나타내었다. 또한, 나머지 비-가교결합된 EC-WT Flag (EC-M)도 V5 면역침전에서 검출되었으며, 증가량의 설포-EGS 첨가로 상단 이동 형태로 위치가 바뀌었다 (도 2B). 정리하면, 가교결합 조사 결과 Sema 도메인이 존재하는 경우 세포외 막-결합된 Met 호모이량체가 형성된다는 것이 관측되었다.
HGF 및 scHGF ( R494E )의 Sema 도메인에의 결합
HGF는 불활성 단일쇄 전구체로서 분비되며, 세포외 프로테아제에 의해 α 및 β쇄로 절단된다 [Naka et al., 1992]. 절단된 디설파이드 연결된 HGF의 α 및 β쇄는 Met 수용체를 고친화적으로 결합한다 [Bottaro et al., 1991; Naldini et al., 1991]. Met 결실 돌연변이체를 HGF를 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 세포를 C-WT, ΔS, ΔP, ΔIPT3, TM 또는 mock로 트랜스펙션시키고 (도 3A), 세포 용해물을 HGF와 인큐베이션하였다. V5 항체로 면역침전시킨 후, 4-12 % SDS-PAGE 하 고, α쇄-HGF 항체로 검출한 결과, HGF는 EC-WT와만 결합하였다 (도 3B). HGF가 나머지 Met 결실 돌연변이체를 결합하지 않는다는 관측은, Sema 도메인이 HGF 결합에 필요하다는 것을 나타낸다.
R494E 돌연변이를 포함하는 단일쇄 HGF [scHGF (R494E)]는 Met 수용체를 결합하고 이의 활성화를 억제한다 [Lokker et al., 1992]. 또한, scHGF (R494E)를 Met 세포외 도메인에 대한 결합에 대해 시험하였다. 트랜스펙션된 Met 결실 돌연변이체를 용해시키고, scHGF (R494E)와 함께 인큐베이션한 후, 상기한 바와 같이 분석하였다. 그 결과, scHGF (R494E)는 단지 EC-WT만을 결합하며, Sema 결실된 돌연변이체는 결합하지 않았다 (도 3C). 이러한 관측은, HGF 및 scHGF (R494E) 모두 재조합 EC-Met 및 Sema 도메인 단백질에 결합하는 공동면역침전 실험으로 확인되었다 (자료 나타내지 않음). 따라서, 상기 자료는 Met의 Sema 도메인이 HGF 상호작용 부위라는 관측과 일치한다 [Gherardi et al., 2003]. 또한, 상기 자료는 Met의 Sema 도메인이 scHGF (R494E) 결합의 상호작용 부위라는 것을 나타낸다.
5 D5 단일클론 항체의 Met 의 Sema 도메인 결합
항-Met 5D5의 Fab 단편 (항-Met 5D5-Fab)은 HGF/c-met 시그널화를 억제하는 것으로 밝혀졌다 [U.S. 특허 제5,686,292호; 제5,646,036호; 제6,207,152호; 및 제6,214,344호]. Met 결실 제작물을 항-Met SD5와의 공동-면역침전 실험에서 시험하였다. 세포를 앞에서와 같이 Met 결실 제작물로 트랜스펙션하거나 mock-트랜스펙션하였다. 이들 세포 용해물을 항-Met 5D5로 면역침전시키고, His 항체로 면역블 롯팅하였다. 도 3E에 나타난 바와 같이, 단지 Sema-포함 EC-WT 만이 항-Met 5D5에 결합하였다. 모든 트랜스펙션된 단백질이 용해물에서 검출되었으며 (도 3D), 내생적 Met가 항-Met 5D5에 의해 면역침전되었다 (도 3F). 따라서, 상기 자료는 항-Met 5D5가 Met의 Sema 도메인을 결합한다는 것을 나타낸다. 항-Met 5D5-Fab가 길항제로서 작용하기 때문에, 하기 기능 연구에서 대조군으로 사용되었다.
종양 세포주에서 내생적 Met 의 가교결합
상기 자료는 Sema 도메인이 2개의 기능,즉 HGF 결합 및 수용체 이량체화와 관련된다는 것을 나타내기 때문에, HGF 결합을 수반하는 것을 제외한 이량체화에서 Met Sema 도메인의 역할을 조사하였다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 후속 조사는 HGF의 부재 하에서 수행되었다. 293 (배아 신장), H441 (폐 선암), A549 (폐 암종), 및 MDA-MB-435 (유방 암종) 세포주에서 발현되는 HGF의 수준을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다. MDA-MB-435 및 H441 세포는 검출가능한 HGF RNA 또는 단백질을 갖지 않으나, A549 및 293 세포는 HGF RNA를 발현하였고 용해물 및 조건 조절된 배지에 검출가능한 단백질을 거의 갖지 않았다 (자료 나타내지 않음). 다양한 종양 세포주에서 발현되는 Met가 HGF의 부재 하에서 가교결합할 수 있는지를 측정하기 위해, 세포를 실험 동안 0.5 % BSA를 포함하는 혈청-비함유 배지에서 유지시켰다. 이들 세포주는 앞에서와 같이 설포-EGS로 가교결합하였으며, 용해물을 4-12 % SDS-PAGE로 분석한 후, Met 항체로 면역블롯팅하였다. 가교결합제의 부재 하에서, Met는 EC-WT로의 가교결합 조사 (도 2A)에서 앞에서 나타난 바와 같이 프로세싱된 (Met-M) 및 프로세싱되지 않은 (*) 단백질로서 나타났다. 각각의 세포주에서, 0.1 mM 설포-EGS에서 조차, Met-M으로부터 상단 이동 형태 (Met-D)로의 위치 변동이 관측되었다 (도 4). 증가되는 농도의 가교결합제는 Met-M으로부터 Met D 형태로의 위치 변동을 증진시켰다. 앞에서의 관측과 일치하게, 세포내 프로세싱되지 않은 Met는 설포-EGS 처리 시 가교결합하지 않았다. 비교를 위해, A549 세포를 앞에서와 같이 100 ng/ml HGF와 함께 인큐베이션하고 가교결합하였다. Met에 대한 면역블롯팅은 HGF의 부재 하에서 보여진 Met-D와 비교 시 HGF의 존재 하에서 보다 높은 이동 형태를 나타내었다 (도 4). 상기 자료는 가교결합된 Met 이량체가 HGF의 부재 하에서 형성되며 HGF 결합에 의해 더욱 위치 변동된다는 것을 나타내었다.
종양 세포에서 rSema 및 항- Met 5 D5 - Fab 로 Met 시그널화 억제
상기 자료는 Sema 도메인이 Met 이량체화에 필요하다는 것을 나타내기 때문에, Met 수용체의 Sema 및 PSI 도메인을 포함하는 재조합 Sema (rSema) 단백질 (상기 재료 및 방법 단락 참조)을 제조하고, Met 시그널화에서 기능적 중요성을 조사하였다. 사람 종양 세포를 증가하는 농도의 rSema로 처리하고, HGF 자극 시의 미토겐 활성화된 단백질 키나제 (MAPK)의 하향 활성화 및 Met 티로신 포스포릴화에 대해 분석하였다. A549 세포는 혈청-제한되었으며, HGF의 존재 하에서 증가하는 농도의 rSema와 함께 인큐베이션하였다. 세포 용해물을 수거하고, C-말단 Met 항체로 면역침전시킨 후, 포스포-티로신 항체로 면역블롯팅하였다. HGF 자극 단독과 비교하여, Met 포스포릴화의 감소가 HGF의 존재 하에서 증가량의 rSema와 함께 관측되었다 (도 5A 및 5B). 유사하게, MAPK의 포스포릴화가 리간드의 존재 하에서 증가하는 농도의 rSema로 처리 시 감소하였다. 또한, H441 및 MDA-MB-435 세포주를 유사한 방식으로 rSema 및 HGF로 처리하였으며, 포스포-MAPK에 있어 용량 의존적 감소가 관측되었다 (도 5A 및 도 5B).
또한, HGF의 부재 하에서 rSema에 의한 Met 활성화의 억제가 조사되었다. 비교를 위해, Met 수용체 길항제로서 작용하는 항-Met 5D5-Fab를 기능 조사에 사용하였다. A549 세포를 혈청-제한시켰으며, 항-Met 5D5-Fab 또는 rSema로 처리하였다. rSema 또는 항-Met 5D5-Fab로의 처리가 리간드-비의존적 Met 포스포릴화를 억제시켰으며, 포스포-MAPK 수준이 mock-처리된 대조군과 비교되었다 (도 5C 및 도 5D). 유사하게, H441 및 MDA-MB435 세포주를 HGF의 부재 하에서 항-Met 5D5-Fab 및 rSema로 처리하였으며 (도 5C 및 도 5D), MAPK 포스포릴화의 감소는 A549 세포에서의 이전 관측과 유사한 경향을 따랐다. 이러한 결과는 rSema가 리간드 의존적 및 독립적인 Met 포스포릴화를 억제할 뿐만 아니라 하향 MAPK 시그널화에도 영향을 미친다는 것을 제시하였다.
또한, Met 결실 돌연변이체로 내생적 Met 시그널 전환을 약화시키는 능력에 대해 조사하였다. 세포를 Met 결실 돌연변이체 (도 5E)로 트랜스펙션시키고, 용해물을 C-말단 Met 항체로 면역침전시키며, 포스포-티로신 항체로 면역블롯팅하였다. EC-WT 트랜스펙턴트는 Met 티로신 포스포릴화의 약화를 나타내었으며, 포스포-MAPK는 mock-처리된 대조군과 비교되었다 (도 5F 및 5G). Sema 결실된 트랜스펙턴트는 포스포-Met에 대해서는 약간의 약화를 나타내었지만 하향 MAPK 포스포릴화의 감소는 나타내지 않았다 (도 5F 및 5G). 이를 종합할 때, 이들 관측은 Sema 도메인이 Met 활성화에 필요하다는 것을 확인시키며, Met 시그널화의 rSema 억제에 대한 이전 결과를 뒷받침한다 (도 5A-D).
rSema 및 항- Met 5 D5 - Fab 에 의한 세포 이동의 억제
H441 세포를 Met 매개된 세포 이동의 측정물로 스크레이프 검정에 사용하였다 [Lorenzato et al., 2002]. 고밀도로 성장된 H441 세포를 0일에 각각의 웰에 스크레이핑하고, 실험 동안 0.5 % BSA를 포함하는 혈청-비함유 배지에서 유지하였다 (도 6). 세포를 양성 대조군으로서 10 μg/ml rSema 또는 5D5 또는 100 ng/ml HGF로 처리하거나 mock-처리하였다. 2일째, mock-처리된 웰에서의 갭은 완전히 닫히는 반면, rSema 처리된 세포에서는 갭이 남아있었다 (도 6). 또한, 항-Met 5D5 Fab 처리된 세포에서의 갭도 낮은 정도로 볼 수 있게 남아있었다. HGF 처리된 세포는 1일째에 갭이 닫히고 2일째 그러한 상태로 남아있었다. 이러한 관측은 4개의 별개의 실험에서 일치하였다. 상기 자료는 내생적 Met 활성화에 의해 매개되는 세포 운동성이 HGF의 부재 하에서 rSema 및 항-Met 5D5-Fab에 의해 억제된다는 것을 제시하였다.
리간드의 존재 하에서 세포 운동성에 대한 rSema의 영향을 조사하기 위해서, 세포를 0, 0.1, 0.5, 또는 5 μg/ml rSema + 20 ng/ml HGF로 처리하였다. HGF 단독으로 처리된 세포는 1일째에 갭이 완전히 닫혔다. 이와 비교하여, HGF의 존재 하에서 rSema로 처리된 세포는 용량 의존적 방식으로 갭이 남아있었다 (자료 나타내지 않음). 상기 자료는 rSema가 HGF의 존재 하에서 Met-매개된 세포 운동성을 억제한다는 것을 제시하였다.
MDA-MB-435 세포를 사용한 트랜스웰 검정을 이용하여 Met 유도된 세포 이동을 측정하였다 [Coltella et al., 2003]. HGF의 부재 하에서, mock-처리된 세포는 도 7에 나타난 바와 같이 이동하였다. 이러한 이동은 rSema 및 항-Met 5D5-Fab의 첨가에 의해 보다 낮은 정도로 일정하게 감소되었다. 이들 세포에 HGF를 첨가한 결과, 이동이 약 3배 증가하였다. 상기 자료는 H441 세포주에서의 스크레이프 검정 결과와 관련되었다. 또한, Akt의 활성화를 세포 운동성 및 이동 검정에 사용된 H441 및 MDA-MB-435 세포에서 조사하였다. HGF의 존재 하에서 증가하는 농도의 rSema에 의해 Akt 포스포릴화의 용량 의존적 감소가 관측되었다 (자료 나타내지 않음). 상기 자료는 rSema가 리간드의 존재 하에서 세포 운동성을 억제할 수 있다는 관측과 관련되었다. 이상의 자료를 종합할 때, 이들 관측은 Sema 도메인 길항제, 예를 들어 Sema 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드가 Met 활성화를 억제할 뿐만 아니라 리간드 의존적 및 독립적 방식으로 세포 운동성 및 이동에 대한 하향 효과를 차단할 수 있다는 것을 지지한다.
논의
Sema 도메인은 세마포린 및 이의 수용체인 플렉신의 세포외 영역에 존재하며, 수용체/리간드 인식 부위로서 작용한다 [Tamagnone et al., 1999]. Sema 3A 및 Sema 4D의 결정 구조에 대한 최근의 공개문에서는 이들 Sema 도메인이 호모이량체화에 중요한 7-날개 (seven-bladed) β-프로펠라 구조를 형성한다고 제시한다 [Antipenko et al., 2003; Love et al., 2003]. 본원에 기술된 시험관 내 및 생체 내 실험 증거가 Met 수용체 이량체화에 있어 Sema 도메인에 대한 역할을 강력하게 지지한다.
상기 자료는 Met의 가교결합이 Sema 도메인의 존재 하에서만 일어난다는 것을 보이며, 이는 수용체 이량체화에 있어 Sema 도메인에 대한 필수 역할을 제시한다. 또한, Met의 가교결합은 HGF의 부재하에서도 관측되었으며, 이는 이들 종양 세포주에서의 Met 수용체가 리간드 자극 없이 이량체화할 수 있다는 것을 나타낸다.
Sema3A의 결정 구조는 Sema 도메인 내의 4개의 상호작용 "루프"가 Sema3A 이량체 사이의 경계면을 확립하는데 중요하다는 것을 제시한다 [Antipenko et al., 2003]. Sema3A 서열과 Met와의 정렬은 하나의 "루프"가 Met Sema 도메인의 R307과 S308 사이의 단백질 분해 절단 부위에 인접하다는 것을 보이며, 이는 Met 이량체화에 있어 이의 중요성을 제시할 수 있다.
본원에 기술되는 세포-기초 조사는 HGF의 부재 하에서 Met 수용체의 Sema 도메인 매개된 친동종 (homophilic) 상호작용을 보인다. 특히, 이전의 보고는 Met가 CD44v6, α6β4 인테그린 및 플렉신 B1과도 상호작용한다고 제시한다 [Giordano et al., 2002; Orian-Rousseau et al., 2002; Trusolino et al., 2001]. 본원에 기술된 결과는, 플렉신 B1과의 Met 화합이 이러한 고도로 보전된 Sema 도메인을 통해 일어날 수 있다는 생각을 뒷받침한다. 또한, Met 및 세마포린 모두의 과발현이 암 및 침습적 전이에서 기술된 바 있었으며, 잠재적 상호작용이 Sema 도메인을 통해 매개될 수 있다고 추론하게 할 수 있다. 그러나, 이들 분자의 역할 및 이들 병적 상태에서 헤테로이량체 상호작용을 매개하는 메카니즘은 추가의 조사가 필요하였다. CD44v6 및 α6β4가 Sema 도메인을 포함한다고는 알려지지 않았다. 따라서, Sema 및/또는 PSI 또는 IPT 도메인을 통해 매개되는 다른 단백질 모티프와의 상호작용이 특정한 생물학적 반응을 개시하는데 중요할 수 있으며 [Bertotti and Comoglio, 2003], 가능성으로 배제될 수 없다.
RTK, 예를 들어 섬유아세포 성장 인자 수용체 2 (FGFR2) 및 RET에서, 각각의 수용체의 세포외 도메인 내 시스테인 사이의 디설파이드 결합은 수용체 이량체화에 연루되었다 [Robertson et al., 2000]. Met 수용체에서, 본원에 기술된 자료는 시스테인-풍부 PSI 도메인 및 4개의 IPT 도메인 모두 Sema 도메인의 부재 하에서 가교결합을 나타내지 않는다는 것을 나타내며, 이는 이들 영역이 Met 이량체화에 필요하지 않을 수 있다는 것을 제시한다. 또한, 플렉신 B1과의 Met 상호작용은 Met의 PSI 도메인의 결실에도 불구하고 변화하지 않았다 [Giordano et al., 2002]. 본원에 기술된 기능 조사에서 사용된 rSema가 Sema 및 PSI 도메인 (재료 및 방법 단락 참조)을 포함하지만, 본원에 기술된 가교결합 조사 및 플렉신 B1에서의 보고된 PSI 도메인의 결실 [Giordano et al., 2002]은 Sema 도메인이 PSI 도메인의 부재 하에서 이들 상호작용에 주요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 내부 PSI 또는 IPT 결실물을 제조하고자 시도한 결과 본 조사에서 사용될 수 없는 프로세싱되지 않은 Met가 발현되었으므로, PSI 및 IPT 도메인이 Met 이량체 형성 또는 일부 다른 메카니즘, 예를 들어 EGFR에 대해 보고된 바와 같이 [Ferguson et al., 2003] 이량체화에 대한 자가-억제에 대해 역할을 하는지가 명확하게 밝혀져야 할 것이라는 것이 주목된다. 세포외 Met의 결정 구조에 대한 분석이 이러한 컴플렉스 상호작용에 보다 많은 사실 발견을 제공할 것이다.
RTK의 리간드-수용체 컴플렉스의 결정학적 조사 결과, 수개의 구조적 면모를 보였다. Flt-1 및 TrkA 모두 수용체 이량체화 및 활성화를 위한 리간드의 이량체화를 이용한다 [Wiesmann et al., 1997; Wiesmann et al., 1999]. FGFR에서, 헤파린 결합된 FGF 리간드는 수용체 이량체화를 이끈다 [Plotnikov et al., 1999]. 이와는 대조적으로, EGF:EGFR (표피 성장 인자 수용체) 컴플렉스는 리간드-리간드 상호작용과는 독립적으로 수용체를 통해 호모이량체화한다 [Garrett et al., 2002; Ogiso et al., 2002]. 최근의 보고에 따르면 Met, HGF 및 헤파린이 1:1:1 컴플렉스로 존재한다고 제시하지만, Met와 HGF의 상호작용은 분명하지 않다 [Gherardi et al., 2003]. 세포외 기질 (ECM)과 같은 세포성 성분이 본 조사에 존재하고 생체 내에서 수용체 이량체화에 상당한 영향을 가질 수 있기 때문에, 본 발명의 세포-기초 연구는 이러한 보고된 시험관 내 관측과는 상이하다. ECM은 라미닌 및 세포 상호작용에 관여하는 다른 성분들을 포함하므로 [Giancotti and Ruoslahti, 1999], Met 이량체화를 촉진하는 모든 단백질이 아직 확인될 수 없는 듯하다.
본원에서 입증되는 바와 같이, Sema 도메인은, 이전의 관측과 일치하게 [Gherardi et al., 2003], HGF와 상호작용하기에 충분하며, rSema는 리간드 유도된 Met 활성화를 억제할 수 있다. 따라서, rSema는 HGF를 결합함으로써 HGF-의존적 Met 활성화를 효과적으로 억제시킬 수 있다. 또한, HGF 의존적 Met 과발현 종양이 리간드-의존적 수용체 활성화에 대한 Ron Sema 도메인 매개된 억제와 유사한 방식으로 rSema에 의해 표적될 수 있다는 것을 제시한다 [Angeloni et al., 2003]. 본원에 기술된 자료는, 가교결합 조사 결과 리간드-독립적 Met 이량체가 HGF에 결합되는 경우 더 멀리 위치를 이동하는 것으로 보이므로, Sema-HGF 상호작용 부위가 Met 이량체화 경계면과 다르다는 것을 나타낸다. 이들 자료는 이량체화 경계면과 HGF 상호작용 부위가 서로 중첩되지 않는다는 것을 의미한다.
또한, 본원에서는 Sema 도메인이 공지된 c-met 길항제 항체, 항-Met 5D5-Fab의 결합에 필요하다는 것이 입증된다. 항-Met 5D5-Fab는 또한 본원에서 기술된 발견에서 관측되는 바와 같이 리간드-독립적 수용체 활성화를 억제하므로, HGF 경쟁에 추가하여 항-Met 5D5-Fab가 입체 장애에 의해 수용체 이량체화를 차단할 수 있는 가능성이 있다. 마찬가지로, rSema는 또한 리간드 독립적 및 의존적 Met 활성을 억제하므로, 효과적인 Met 억제제로서의 rSema의 역할을 나타낸다. 유사한 억제 활성이 c-kit 수용체에 대해 기술되었다 [Lev et al., 1992]. 본 조사에서 다룬 리간드 독립적 방식으로의 이량체화에 있어 Met Sema 도메인의 역할은 Ron sema 도메인의 역할과는 상이하다. Ron Sema 도메인은 Ron 활성을 억제하기 위해 MSP와이 결합에 대해 경쟁하는 한편, Ron 수용체 이량체화를 억제하지 않는다 [Angeloni et al., 2003]. 본원에 기술된 기능 조사는 HGF의 존재 또는 부재 하에 수행되었으며, Met Sema 도메인이 리간드 의존적 및 독립적 수용체 활성화 모두를 억제한다 는 것을 입증한다. 이러한 자료는, Met와 Ron의 구조적 모티프 및 결합 상호작용이 유사할 수는 있으나, 생체 내 상황이 친동종 상호작용을 상이하게 하는 것에 특성을 부여할 수 있다는 것을 제시한다.
본원에서는 Met Sema 도메인이 리간드 의존적 및 리간드-비의존적 Met 수용체 활성화에 대한 잠재적 억제제임이 입증된다. 본원에 기술된 자료는 Met의 Sema 도메인이 종양 세포에서 수용체 활성화를 차단하여 MAPK 포스포릴화, 세포 운동성 및 이동이 억제된다는 것을 나타낸다. 이들 관측은, 이로 제한됨이 없이, 생물치료제로서 Sema 도메인 자체를 사용하는 것을 포함하여, Met의 Sema 도메인의 기능을 표적함으로써 HGF/c-met 시그널화 축의 조절이상과 관련된 종양의 치료 가능성을 나타낸다.
부분 참조 목록
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Claims (55)

  1. c-met 이량체화를 방해하는 c-met 길항제.
  2. 제 1항에 있어서, c-met Sema 도메인의 이량체화 기능을 방해하는 길항제.
  3. 제 1항에 있어서, c-met 이량체화가 방해되도록 c-met에 결합하는 길항제.
  4. 제 1항에 있어서, c-met을 이량체화하는 c-met Sema의 능력을 방해하도록 c-met에 결합하는 길항제.
  5. c-met Sema 도메인에 있는 서열을 특이적으로 결합하는 c-met 길항제
  6. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, c-met 분자에 결합 시 상기 분자의 이량체화를 억제하는 길항제.
  7. 제 6항에 있어서, 이량체화가 호모이량체화를 포함하는 길항제.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, c-met의 간세포 성장 인자 (HGF) 결합 부위를 결합하지 않는 길항제.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, c-met에 결합하는데 있어 HGF와 실질적으로 경쟁하지 않는 길항제.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, HGF가 c-met에 결합하는 것을 실질적으로 억제하지 않는 길항제.
  11. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, c-met에 결합하는데 있어 HGF와 경쟁하는 길항제.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, ATCC 수탁 번호 제HB-11894호 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 제HB-11895호 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체가 결합하는 c-met의 에피토프와는 다른 c-met의 에피토프에 결합하는 길항제.
  13. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, ATCC에 수탁 번호 제HB-11894호 (하이브리도마 1A3.3.13) 또는 제HB-11895호 (하이브리도마 5D5.11.6)로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체가 아닌 길항제.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 단편, 펩티 드, 또는 이들의 배합물인 길항제.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, c-met에 대한 길항제의 결합이 HGF 의존적 또는 독립적 c-met 활성화를 억제하는 길항제.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서 c-met에 대한 길항제의 결합이 세포의 증식, 분산, 형태 형성 및/또는 운동성을 억제하는 길항제.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 c-met Sema 도메인 또는 이의 변이체의 적어도 일부를 갖는 펩티드를 포함하는 길항제.
  18. 제 17항에 있어서, 펩티드가 LDAQT (서열: 1), LTEKRKKRS (서열: 2), KPDSAEPM (서열: 3) 및 NVRCLQHF (서열: 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 이상을 포함하는 길항제.
  19. 제 17항에 있어서, 펩티드가 필수적으로 LDAQT (서열: 1), LTEKRKKRS (서열: 2), KPDSAEPM (서열: 3) 및 NVRCLQHF (서열: 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 이상으로 이루어지는 길항제.
  20. 제 17항에 있어서, 펩티드가 서열 LTEKRKKRS (서열: 2)를 포함하는 길항제.
  21. 제 17항에 있어서, 펩티드가 필수적으로 LTEKRKKRS (서열: 2)로 이루어지는 길항제.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 길항제 및 담체를 포함하는 조성물.
  23. 제 22항에 있어서, 담체가 제약학적으로 허용되는 담체인 조성물.
  24. 폴리펩티드를 포함하는 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 길항제를 암호화하는 핵산.
  25. 제 24항에 있어서, 길항제가 항체 또는 이의 단편을 포함하는 핵산.
  26. 제 24항 또는 제 25항의 핵산을 포함하는 벡터.
  27. 제 26항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. 용기; 및 용기 내에 포함되는 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 길항제를 포함하는 조성물을 포함하는 제조 물품.
  29. 제 28항에 있어서, 길항제를 피검물에 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함하는 제조 물품.
  30. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 길항제를 포함하는 조성물을 포함하는 제 1 용기; 및 완충제를 포함하는 제 2 용기를 포함하는 키트.
  31. 제 30항에 있어서, 완충제가 제약학적으로 허용되는 완충제인 키트.
  32. 제 30항에 있어서, 길항제를 피검물에 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
  33. 후보 물질을 c-met Sema 도메인의 적어도 일부를 포함하는 표적 분자와 접촉시켜 표적 분자를 특이적으로 결합하는 물질을 c-met 길항체로 선별함을 포함하여, c-met 길항제를 스크리닝 또는 확인하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 선별된 물질을 c-met를 발현하는 세포와 접촉시키고, 상기 세포에서 c-met 이량체화의 억제를 검출 또는 정량하는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, c-met 이량체화의 억제가 c-met 활성화의 양의 감소로 표시되는 방법.
  36. 제 36항에 있어서, c-met 활성화의 양이 c-met 관련 세포 시그널화의 양으로 표시되는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 세포 시그널화가 단백질 포스포릴화로 표시되는 방법.
  38. c-met Sema 도메인 조절자를 피검물에 투여하여 c-met 활성을 조절함을 포함하여, 피검물에서 c-met 활성화를 조절하는 방법.
  39. 세포 또는 조직을 제 1항 내지 제 21항 중 어느 항의 길항제와 접촉시켜 c-met 활성화와 관련된 세포 증식을 억제함을 포함하여, c-met 활성화된 세포 증식을 억제하는 방법.
  40. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 길항제를 c-met 활성화의 이상조절과 관련된 병적 상태를 갖는 피검물에 투여하여 c-met 활성화를 억제함을 포함하여, 상기 피검물에서 상기 병적 상태를 치료하는 방법.
  41. c-met, HGF 또는 이 둘 모두를 발현하는 세포를 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 길항제와 접촉시켜 상기 세포의 성장을 억제함을 포함하여, 상기 세포의 성장을 억제하는 방법.
  42. c-met, HGF 또는 이 둘 모두를 발현하는 세포를 포함하는 암성 종양을 갖는 포유동물에 치료학적 유효량의 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 길항제를 투여하여 상기 포유동물을 효과적으로 치료함을 포함하여, 상기 포유동물을 치료학적으로 치료하는 방법.
  43. c-met, HGF 또는 이 둘 모두의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 세포 증식 장애의 처리가 필요한 피검물에 유효량의 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 길항제를 투여하여 세포 증식 장애를 효과적으로 치료 또는 예방함을 포함하여, 상기 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 상기 증식 장애가 암인 방법.
  45. 세포의 성장이 적어도 부분적으로 c-met, HGF 또는 이 둘 모두의 성장 증진 효과에 의존적인 세포를 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 길항제와 접촉시켜 상기 세포의 성장을 억제함을 포함하여, 상기 세포의 성장을 억제하는 방법.
  46. 종양의 성장이 적어도 부분적으로 c-met, HGF 또는 이 둘 모두의 성장 증진 효과에 의존적인 종양의 세포를 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 길항제와 접촉시켜 상기 종양을 효과적으로 치료함을 포함하여, 포유동물에서 종양을 치료학적 으로 치료하는 방법.
  47. 제 46항에 있어서, 세포가 암 세포인 방법.
  48. 제 47항에 있어서, 암 세포를 방사선 치료 또는 화학치료제에 추가로 노출시키는 방법.
  49. 제 47항에 있어서, 암 세포가 유방암 세포, 대장암 세포, 폐암 세포, 유두암 세포, 전립선암 세포, 림프종 세포, 결장암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 경부암 세포, 중추신경계암 세포, 골육종 세포, 신장암 세포, 간세포암 세포, 방광암 세포, 위암 세포, 두경부 편평세포암 세포, 흑색종 세포 및 백혈병 세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  50. 제 47항에 있어서, c-met, HGF 또는 이 둘 모두가 동일한 조직 기원의 정상 세포와 비교하여 암 세포에 의해 다량으로 발현되는 방법.
  51. 제 46항에 있어서, HGF가 상이한 세포에서 발현되는 방법.
  52. 제 47항에 있어서, c-met의 활성화가 동일한 조직 기원의 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 증가되는 방법.
  53. 제 47항에 있어서, 세포의 죽음을 유도하는 방법.
  54. 제 40항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제의 부재 하에 c-met 활성화가 리간드와는 독립적으로 발생하는 방법.
  55. 제 40항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제의 부재 하에 c-met 활성화가 리간드에 의존적인 방법.
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