CN103509112A - 抑制c-MET二聚化的新型抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抑制c-MET二聚化的新型抗体及其用途。具体地,本发明涉及选择能够抑制c-Met的配体依赖性和配体非依赖性激活的抗c-Met抗体的方法。更具体地,所述的方法基于对c-Met二聚化的抑制。另一方面,本发明涉及用于制备治疗恶性肿瘤的药物的这种抗体和包含这种抗体的组合物。诊断方法和试剂盒也是本发明的一部分。
Description
本申请是申请号为200880024368.4,申请日为2008年7月10日,发明名称为“抑制c-MET二聚化的新型抗体及其用途”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及能够特异性结合人c-Met受体和/或能够特异性抑制所述受体的酪氨酸激酶活性的新型抗体,特别是鼠的,嵌合的和人源化来源的单克隆抗体,以及编码这些抗体的氨基酸和核苷酸序列。更具体而言,本发明所述的抗体能够抑制c-Met二聚化。本发明也包含这些抗体作为药物在预防性和/或治疗性处理恶性肿瘤或与所述受体过表达有关的任何病变中的用途,以及在诊断与c-Met过表达有关的疾病的过程中和试剂盒中的用途。本发明最后包含含有所述抗体联合针对在肿瘤进展或转移中涉及的其他生长因子的其他抗体和/或化学化合物,和/或化合物和/或抗恶性肿瘤制剂或与毒素结合的制剂的产品和/或组合物,以及它们在预防和/或治疗某些恶性肿瘤中的用途。
背景技术
已经显示,受体酪氨酸激酶(RTK)靶向剂如曲妥单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、伊马替尼和吉非替尼抑制剂有利于以该蛋白质类为靶标用于治疗选定的恶性肿瘤。
c-Met是RTK亚家族的原型成员,该亚家族也包括RON和SEA。c-Met RTK家族与其他RTK家族在结构上有区别并且是肝细胞生长因子(HGF,也称离散因子,SF)的唯一已知的高亲和性受体[D.P.Bottaro et al,Science1991,251:802-804;L.Naldini et al,Eur.Mol.Biol.Org.J.1991,10:2867-2878]。c-Met和HGF在多种组织中广泛表达,它们的表达一般分别限定于上皮和间充质来源的细胞[M.F.DiRenzo et al.,Oncogene1991,6:1997-2003;E.Sonnenberg et al.,J.Cell.Biol.1993,123:223-235]。两者对于正常的哺乳动物的发育都是必需的,并且已经表明它们在细胞迁移、形态分化和三维管状结构的组织以及生长和血管发生中特别重要[F.Baldt et al.,Nature1995,376:768-771;C.Schmidt et al.,Nature.1995:373:699-702;Tsarfaty et al.,Science1994,263:98-101]。已经表明,c-Met和HGF受控制的调节在哺乳动物发育、组织保持和修复中是重要的[Nagayama T,Nagayama M,Kohara S,Kamiguchi H,Shibuya M,Katoh Y,Itoh J,Shinohara Y.,Brain Res.2004,5;999(2):155-66;Tahara Y,Ido A,Yamamoto S,Miyata Y,Uto H,Hori T,Hayashi K,TsubouchiH.,J Pharmacol Exp Ther.2003,307(1):146-51],它们的失调涉及到恶性肿瘤的进展。
c-Met的不适当的激活导致的异常信号传导是在人的恶性肿瘤中观察到的最常见的改变之一,在肿瘤发生和转移中起关键作用[Birchmeier et al.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2003,4:915-925;L.Trusolino和Comoglio P.M.,Nat Rev.Cancer.2002,2(4):289-300]。
不适当的c-Met激活可通过配体依赖性和非依赖性机制(包括c-Met过表达,和/或旁分泌或自分泌激活)发生,或通过获得性功能突变发生[J.G.Christensen,Burrows J.and Salgia R.,Cancer Latters.2005,226:1-26]。然而,在配体存在或不存在情况下的c-Met受体的寡聚化在调节激酶对ATP和含酪氨酸的肽底物的结合亲和力和结合动力学中是必需的[Hays JL,Watowich SJ,Biochemistry,2004Aug17,43:10570-8]。激活的c-Met募集信号传导效应物到它位于胞质区中的多停泊位点(multidocking site),导致几个关键的信号传导途径的激活,这些信号传导途径包括Ras-MAPK、PI3K、Src和Stat3[Gao CF,Vande Woude GF,Cell Res.2005,15(1):49-51;Furge KA,Zhang YW,Vande Woude GF,Oncogene.2000,19(49):5582-9]。这些途径对于肿瘤细胞的增殖、浸润和血管生成和对于逃避细胞凋亡是必需的[Furge KA,Zhang YW,Vande Woude GF,Oncogene,2000,19(49):5582-9;Gu H,NeelBG,Trends Cell Biol.2003Mar,13(3):122-30;Fan S,Ma YX,Wang JA,Yuan RQ,Meng Q,Cao Y,Laterra JJ,Goldberg ID,Rosen EM,Oncogene.2000Apr27,19(18):2212-23]。此外,相对于其他RTK,c-Met信号传导的独特之处在于已经报道的它与粘着斑复合物和非激酶结合伙伴如α6β4整合素[Trusolino L,Bertotti A,ComoglioPM,Cell.2001,107:643-54],CD44v6[Van der Voort R,Taher TE,Wielenga VJ,Spaargaren M,Prevo R,Smit L,David G,Hartmann G,Gherardi E,Pals ST,J BiolChem.1999,274(10):6499-506],Plexin B1或信号素(semaphorin)[Giordano S,CorsoS,Conrotto P,Artigiani S,Gilestro G,Barberis D,Tamagnone L,Comoglio PM,NatCell Biol.2002,4(9):720-4;Conrotto P,Valdembri D,Corso S,Serini G,Tamagnone L,Comoglio PM,Bussolino F,Giordano S,Blood.2005,105(11):4321-9;Conrotto P,Corso S,Gamberini S,Comoglio PM,Giordano S,Oncogene.2004,23:5131-7]之间的相互作用,这可进一步增加了这一受体调节细胞功能的复杂性。最后,近期的数据证明,c-Met可能涉及肿瘤对吉非替尼和埃罗替尼的抵抗,这提示联合靶向EGFR和c-Met两者的化合物可能有重要意义[Engelman JA at al.,Science,2007,316:1039-43]。
在过去几年中,已开发出许多不同策略用来减弱恶性肿瘤细胞系中的c-Met信号传导。这些策略包括i)抗c-Met或HGF/SF的中和抗体[Cao B,Su Y,OskarssonM,Zhao P,Kort EJ,Fisher RJ,Wang LM,Vande Woude GF,Proc Natl Acad Sci U S A.2001,98(13):7443-8;Martens T,Schmidt NO,Eckerich C,Fillbrandt R,Merchant M,Schwall R,Westphal M,Lamszus K,Clin Cancer Res.2006,12(20):6144-52]或使用HGF/SF的拮抗剂NK4来阻止配体结合c-Met[Kuba K,Matsumoto K,Date K,Shimura H,Tanaka M,Nakamura T,Cancer Res.,2000,60:6737-43];ii)c-Met的小ATP结合位点抑制剂来阻断激酶活性[Christensen JG,Schreck R,Burrows J,Kuruganti P,Chan E,Le P,Chen J,Wang X,Ruslim L,Blake R,Lipson KE,Ramphal J,Do S,Cui JJ,Cherrington JM,Mendel DB,Cancer Res.2003,63:7345-55];iii)影响通向多停泊位点的工程化的SH2区多肽,和降低受体或配体表达的RNAi或核酶。这些方法中的大部分表现出c-Met的选择性抑制,从而导致肿瘤的抑制,并且表明c-Met在恶性肿瘤的治疗性干预中可能是令人感兴趣的。
所产生的靶向c-Met的分子中,有些是抗体。
最广泛描述的是Genentech[WO96/38557]生产的抗c-Met5D5抗体,其在多种模型中单独加入时作为强力激动剂起作用,当用作Fab片段时作为拮抗剂起作用。这一抗体的单价的工程化的形式被描述为单臂5D5(OA5D5),在大肠杆菌中作为重组蛋白质而产生,这也是Genentech专利申请[WO2006/015371]的主题。然而,这一分子由于它特定的支架(scarfold)而不能被认为是抗体,它也表现出能产生对于人具有免疫原性的突变。在活性方面,这一未糖基化的分子不具有效应物的功能,并且最后没有清楚的数据证明,OA5D5抑制c-Met的二聚化。此外,当在G55体内模型(表达c-Met但不表达HGF mRNA和蛋白质的成胶质细胞瘤细胞系,其不依赖于配体而生长)中试验时,单臂抗c-Met对G55肿瘤生长无显著效应,这提示OA5D5主要通过阻断HGF结合起作用,并且不能够靶向不依赖于HGF而激活的肿瘤[Martens T.et al,Clin.Cancer Res.,2006,12(20):6144-6152]。
Pfizer描述的另一个靶向c-Met的抗体是通过“主要作为c-Met拮抗剂,并且在有些情况下作为c-Met激动剂”起作用的抗体[WO2005/016382]。该申请没有描述显示Pfizer抗体对c-Met二聚化的任何效应的数据。
本发明的一个新的方面是产生没有内在的激动活性并且抑制c-Met二聚化的鼠单克隆抗体。除了靶向配体依赖性肿瘤外,该方法也破坏由于c-Met过表达或细胞内区突变的配体非依赖性c-Met激活,这种激活依旧依赖于寡聚化以进行细胞信号传导。这种抗体活性的另一方面可能是对c-Met和其伙伴之间的相互作用的产生空间位阻从而破坏c-Met的功能。除了与特异性阻断c-Met受体有关的功能之外,优选地这些抗体是人源化的和工程化的作为人IgG1以获得效应物功能如ADCC和CDC,但不限于此。
发明内容
令人惊讶地,发明人第一次设法产生了能够结合c-Met也能够抑制c-Met二聚化的抗体。在现有技术中,有时候提示能够抑制c-Met与其伙伴二聚化的抗体可能是令人感兴趣的抗体,如果这是真的话,也从来没有公开过,或清楚的提示有抗体能够做到这一点。此外,关于抗体的特异性,成功产生这种活性抗体根本是不明显的。
第一方面,本发明的主题是产生和选择本发明所述的抗体的方法。
更具体地,本发明涉及选择能够抑制配体依赖性和配体非依赖性c-Met激活的抗c-Met抗体或其功能片段之一或衍生物的方法,所述的方法包含下述步骤:
i)筛选所产生的抗体,选择能够特异性结合c-Met的抗体;
ii)体外评价步骤i)中选定的抗体,并且选择能够至少50%,优选至少60%,70%或80%地抑制至少一种肿瘤类型的肿瘤细胞增殖的抗体;
iii)试验步骤ii)中选定的抗体,选择能够抑制c-Met二聚化的抗体。
如前面所解释的,由于这种抗体对于更大人群的病人具有实际的意义,抑制c-Met二聚化是本发明的首要方面。不仅配体依赖性激活的c-Met恶性肿瘤(正如直到本发明的情况),而且配体非依赖性激活的c-Met恶性肿瘤也能通过本发明所述的方法产生的抗体进行治疗。
抗体的产生可通过本领域技术人员已知的任何方法来实现,例如,将骨髓瘤细胞与从免疫小鼠或任何其他与选定的骨髓瘤细胞相容的物种获得的脾细胞融合[Kohler & Milstein,1975,Nature,256:495-497]。免疫动物可包括带有人免疫球蛋白质位点的转基因鼠,其然后能直接产生人抗体。其他可能的具体实施方式可能在于使用噬菌体显示技术以筛选文库。
筛选步骤i)可通过本领域技术人员已知的任何方法或过程来实现。作为非限制性例子,可以提及的是ELISA、BIAcore、免疫组化、FACS分析和功能性筛选。优选的方法在于通过ELISA对c-Met重组蛋白质进行筛选,并且然后通过FACS分析至少一种肿瘤细胞系,以确定所产生的抗体也能够识别肿瘤细胞上天然的受体。这一方法将在下述的实施例中进行更精确的描述。
同样,步骤ii)也可通过已知的方法或过程来经典地实现,例如使用3H-胸腺嘧啶或任何其他DNA染色剂、MTT、ATP评价等。本发明中优选的肿瘤细胞模型可为BxPC3模型。
通过抑制c-Met二聚化,必须理解它优选地为c-Met同二聚化。
在本发明所述的选择方法的步骤iii)的优选具体实施方式中,所述的步骤iii)在于通过BRET分析表达c-Met-RLuc/c-Met-YFP两者的细胞来评价抗体,并且选择能够至少30%,优选35%、40%、45%、50%、55%或最优选60%地抑制BRET信号的抗体。
BRET技术为已知技术,其是蛋白质二聚化的代表性技术[Angers et al,PNAS,2000,97:3684-89]。
在该方法的步骤iii)中使用的BRET技术是本领域技术人员熟知的,并且将会在下述实施例中进行详细描述。更具体地,BRET(生物发光共振能量转移)是发生在生物发光供体(海肾荧光素酶(Renilla Luciferase,Rluc))和荧光受体,GFP(绿色荧光蛋白质)或YFP(黄色荧光蛋白质)的突变体之间的非放射性能量转移。在本案中使用了EYFP(增强型黄色荧光蛋白质)。转移的效率依赖于供体和受体之间的方向和距离。因此,只有当两个分子临近(1-10nm)时才可能发生能量转移。这一属性用来进行蛋白质-蛋白质相互作用分析。实际上,为研究两个伙伴间的相互作用,第一个通过基因工程使其融合到海肾荧光素酶中,并且第二个融合到GFP的黄色突变体中。融合蛋白质一般但不是一定在哺乳动物细胞中表达。在其膜具有通透性的底物(腔肠素(coelenterazine))存在条件下,Rluc发射蓝光。如果GFP突变体与Rluc接近大于10nm,可发生能量转移,并且可检测到另外的黄色信号。测量的BRET信号为受体发射的光和供体发射的光的比率。因此,当使两个融合蛋白接近或如果构象变化使Rluc和GFP突变体更近时,BRET信号将会增加。
如果BRET分析是一个优选的具体实施方式的话,本领域技术人员已知的任何方法可用来测量c-Met二聚化。非限制性地,下述技术可被提及:FRET(荧光共振能量转移),HTRF(均相时间分辨荧光),FLIM(荧光寿命成像显微镜)或SW-FCCS((单波长荧光相关光谱法(single wavelength fluorescence cross-correlationspectroscopy))。
也可使用其他经典的技术,如免疫共沉淀,α筛选,化学交联,双杂交,亲和层析,ELISA或远端western印迹(Far western blot)。
第二方面,本发明的主题为通过所述的方法获得的分离的抗体或其功能片段之一或衍生物。所述的抗体或其所述的功能片段之一或衍生物能够特异性结合到人c-Met,并且,如果必要,优选地还能够抑制其配体HGF的天然结合和/或能够特异性抑制所述c-Met的酪氨酸激酶活性,所述的抗体也能够抑制c-Met的二聚化。更具体地,所述的抗体能够抑制c-Met的配体依赖性和配体非依赖性激活。
“功能性片段和衍生物”的表述此后会在本说明书中进行详细的限定。
在此必须理解,本发明不涉及天然形式的抗体,也就是说,这些抗体不是在其天然的环境中,而是它们能够从天然来源中通过纯化被分离或获得,或还可通过基因重组获得,或通过化学合成获得,因此,它们含有非天然氨基酸,这一点会进一步描述。
更具体地,根据本发明所述的另一方面,其要求保护抗体或其功能片段之一或衍生物,所述的抗体的特征在于其包含至少一个互补决定区CDR,所述CDR选自包含氨基酸序列SEQ ID No.1至17和56至61的CDR。
含有至少一个CDR,该CDR的序列在与序列SEQ ID No.1至17和56至61进行优化比对后,至少具有80%的同一性,优选地85%、90%、95%或98%的同一性的任何抗体或片段或衍生物,都应理解为本发明的等同物,因此,也是本发明的一部分。
CDR区或CDR的意思是指IMGT限定的免疫球蛋白质的重链和轻链的高变区。
IMGT特有编号(IMGT unique numbering)被限定用来比较可变区,而不论抗原受体、链的类型或物种[Lefranc M.-P.,Immunology Today18,509(1997)/LefrancM.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommie,C,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,Dev.Comp.Immunol,27,55-77(2003)]。在IMGT特有编号中,保守氨基酸总是具有相同的位置,例如半胱氨酸23(第1-CYS),色氨酸41(保守-TRP(CONSERVED-TRP)),疏水氨基酸89,半胱氨酸104(第2-CYS),苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT特有编号提供了对框架区(FRl-IMGT:位置1至26,FR2-IMGT:39至55、FR3-IMGT:66至104和FR4-IMGT:118至128)和其互补决定区:CDR1-IMGT:27至38、CDR2-IMGT:56至65和CDR3-IMGT:105至117的标准限定。由于缺口代表未占据的位置,CDR-IMGT的长度(在括号中显示用并点分开,例如[8.8.13])是重要的信息。IMGT特有编号用2D图表示,称为IMGT Colliers de Perles[Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.andLefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)],并且在IMGT/3D结构-DB[Kaas,Q.,Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,T cell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]中用3D结构表示。
存在3个重链CDR和3个轻链CDR。根据情况的不同,此处使用的术语CDR或多个CDR用于表示这些区(含有大部分负责抗体对抗原或其识别的表位的亲和性结合的氨基酸残基的区)中的一个或几个,或甚至全部。
本发明意义上的两条核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分数”是指将要比较的两个序列之间的核苷酸或同样的氨基酸残基的百分数,该百分数在进行最优比对(优化比对)后获得,这一百分数是纯粹统计上的,并且两个序列间的差异随机分布并在全长上分布。传统上,对两个核酸或氨基酸序列的比较是通过将他们以优化的方式比对后进行比较,所述的比较可通过区段或“比较窗口”进行。除了手工方式之外,进行比较的序列的优化比对可通过Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2:482]的局部同源性算法,Neddleman和Wunsch(1970)[J.Mol.Biol.48:443]的局部同源性算法,Pearson和Lipman(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444)的相似性检索法,通过使用这些算法的计算机软件(威斯康辛遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,遗传学计算机组(Genetics Computer Group),575Science Dr.,Madison,WI,或通过BLAST N或BLAST P比较软件的别的方式)的方式进行。
两条核酸或氨基酸序列之间的同一性百分数通过以优化方式比较这两个序列来确定,并且其中进行比较的核酸或氨基酸序列可包含相对于参考序列的加入序列或删除序列,该参考序列用于在这两条序列之间进行优化比对。同一性百分数的计算是通过确定两个序列间相同核苷酸或氨基酸残基的同样位置的数目,将这一同样位置的数目除以所比较窗口的总位置数目,将所获得的结果乘以100,从而获得这两条个序列间的同一性百分数。
例如,可能使用BLAST程序对2个序列进行BLAST(Tatusova et al,"Blast2sequences-a new tool for comparing protein和nucleotide sequences",FEMSMicrobiol Lett.174:247-250),该程序可在网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上获得,使用那些缺省给定的参数(特别是参数“开放空缺罚分(opengap penalty)”:5,和“扩展空缺罚分(extension gap penalty)”:2;选择作为矩阵,例如该程序建议的“BLOSUM62”矩阵),将要比较的两条序列的同一性百分数直接通过该程序计算得出。
相对于参考氨基酸序列具有至少80%,优选85%、90%、95%或98%的同一性的氨基酸序列,那些相对于参考序列具有某些修饰,特别是删除、加入或替换了至少一个氨基酸,截短或延长是优选的。在替换一个或多个连续或不连续氨基酸的情况下,该替换优选为所替换的氨基酸被“等同”氨基酸所替换。“等同氨基酸”(equivalent amino acids)的表述在此处的目的是表示任何能够多个氨基酸之一所替换的任何氨基酸,替换上去的氨基酸具有相应抗体的基本结构却不会对其生物活性进行实质上修饰,并且这些氨基酸将在以后限定,特别是在实施例中限定。这些等同氨基酸的确定可基于它们与被它们替换的氨基酸的结构同源性,或基于能够进行的不同抗体间生物活性的比较性试验。
通过举例的方式提及能够进行的可能的替换,该替换不导致相应的修饰抗体的生物活性的较大修饰。
作为非限制性的例子,下述表1给出了考虑到保持修饰抗体的生物活性的可能的替换。在同样条件下,相反的替换当然也是可能的。
表1
原始残基 | 替换 |
Ala(A) | Val,Cly,Pro |
Arg(R) | Lys,His |
Asn(N) | Gln |
Asp(D) | Glu |
Cys(C) | Ser |
Gln(Q) | Asn |
Glu(G) | Asp |
Gly(G) | Ala |
His(H) | Arg |
Ile(I) | Leu |
Leu(L) | Ile,Val,Met |
Lys(K) | Arg |
Met(M) | Leu |
Phe(F) | Tyr |
Pro(P) | Ala |
Ser(S) | Thr,Cys |
Thr(T) | Ser |
Trp(W) | Tyr |
Tyr(Y) | Phe,Trp |
Val(V) | Leu,Ala |
此处必须理解本发明不涉及天然形式的抗体,也就是说它们不是在它们的天然环境中,而是它们能够从天然来源中通过纯化被分离或获得,或通过基因重组获得,或通过化学合成获得,并且它们可因此含有非天然的氨基酸,这一点将会进一步描述。
根据第一种方式,抗体将通过其重链序列进行限定。更具体地,本发明所述的抗体或其功能片段之一或衍生物的特征在于其包含重链,所述的重链包含至少一个CDR,所述的CDR选自含有氨基酸序列SEQ ID No.1至9和56至58的CDR。
所提及的序列为下述序列:
SEQ ID No.1:GYIFTAYT
SEQ ID No.2:IKPNNGLA
SEQ ID No.3:ARSEITTEFDY
SEQ ID No.4:GYSFTDYT
SEQ ID No.5:INPYNGGT
SEQ ID No.6:AREEITKDFDF
SEQ ID No.7:GYTFTDYN
SEQ ID No.8:INPNNGGT
SEQ ID No.9:ARGRYVGYYYAMDY
SEQ ID No.56:GYTFTSYW
SEQ ID No.57:INPTTGST
SEQ ID No.58:AIGGYGSWFAY
重链的CDR可在前述的序列即SEQ ID No.1至9和56至58中随机选择。
根据优选的方面,本发明所述的抗体或其功能片段之一或衍生物包含重链,所述的重链包含至少一个选自CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR,其中:
-CDR-H1包含氨基酸序列SEQ ID No.1、4、7或56,
-CDR-H2包含氨基酸序列SEQ ID No.2、5、8或57,和
-CDR-H3包含氨基酸序列SEQ ID No.3、6、9或58。
根据所述的方面的第一具体实施方式,本发明所述的抗体或其功能片段之一或衍生物包含重链,所述的重链包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,其中CDR-H1包含氨基酸序列SEQ ID No.1,CDR-H2包含氨基酸序列SEQ ID No.2,并且CDR-H3包含氨基酸序列SEQ ID No.3。
更具体地,根据第一具体实施方式,所述的抗体或其功能片段之一或衍生物包含重链,所述的重链的序列包含SEQ ID No.18。
SEQ ID No.18:EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYIFTAYTMHWVRQSLGESLDWIGGIKPNNGLANYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYY CARSEITTEFDYWGQGTALTVSS
根据所述的方面的第二具体实施方式,本发明所述的抗体或其功能片段之一或衍生物包含重链,所述的重链包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,其中CDR-H1包含氨基酸序列SEQ ID No.4,CDR-H2包含氨基酸序列SEQ ID No.5并且CDR-H3包含氨基酸序列SEQ ID No.6。
根据所述的第二具体实施方式,该抗体或其功能片段之一或衍生物优选地包含重链,所述的重链的序列包含氨基酸序列SEQ ID No.19。
SEQ ID No.19:EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYTLNWVKQSHGKTLEWIGLINPYNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCAREEITKDFDFWGQGTTLTVSS
根据所述的方面的第三具体实施方式,本发明所述的抗体或其功能片段之一或衍生物包含重链,所述的重链包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,其中CDR-H1包含氨基酸序列SEQ ID No.7,CDR-H2包含氨基酸序列SEQ ID No.8并且CDR-H3包含氨基酸序列SEQ ID No.9。
根据所述的第三具体实施方式,抗体或其功能片段之一或衍生物优选包含重链,所述的重链的序列包含氨基酸序列SEQ ID No.20。
SEQ ID No.20:EVLLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGMSLEWIGDINPNNGGTIFNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARGRYVGYYYAMDYWGQGTSVTVSS
根据所述的方面的第四具体实施方式,本发明所述的抗体或其功能片段之一或衍生物包含重链,所述的重链包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,其中CDR-H1包含氨基酸序列SEQ ID No.56,CDR-H2包含氨基酸序列SEQ ID No.57并且CDR-H3包含氨基酸序列SEQ ID No.58。
根据所述的第四具体实施方式,抗体或其功能片段之一或衍生物优选包含重链,所述的重链的序列包含氨基酸序列SEQ ID No.62。
SEQ ID No.62:
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGYINPTTGSTDYNQKLKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAIGGYGSWFAYWGQGTLVTVSA
在第二种方式中,现在抗体将通过其轻链序列进行限定。更具体地,根据本发明的第二个特别的方面,抗体或其功能片段之一或衍生物的特征在于其包含轻链,所述的轻链包含至少一个CDR,所述的CDR选自包含氨基酸序列SEQ ID No.10至17和59至61的CDR。
所提及的序列为下述序列:
SEQ ID No.10:ESVDSYANSF
SEQ ID No.11:RAS
SEQ ID No.12:QQSKEDPLT
SEQ ID No.13:ESIDTYGNSF
SEQ ID No.14:QQSNEDPFT
SEQ ID No.15:ENIYSN
SEQ ID No.16:AAT
SEQ ID No.17:QHFWGPPYT
SEQ ID No.59:SSVSSTY
SEQ ID No.60:TTS
SEQ ID No.61:HQWSSYPFT
轻链的CDR可在前述的序列即SEQ ID No.10至17和59至61中随机选择。
根据另一个优选的方面,本发明所述的抗体或其功能片段之一或衍生物包含轻链,所述的轻链包含至少一个CDR,所述的CDR选自CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,其中:
-CDR-L1包含氨基酸序列SEQ ID No.10、13、15或59,
-CDR-L2包含氨基酸序列SEQ ID No.11、16或60,以及
-CDR-L3包含氨基酸序列SEQ ID No.12、14、17或61。
根据所述的另一个方面的第一具体实施方式,本发明所述的抗体或其功能片段之一或衍生物包含轻链,所述的轻链包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,其中CDR-L1包含氨基酸序列SEQ ID No.10,CDR-L2包含氨基酸序列SEQ ID No.11和CDR-L3包含氨基酸序列SEQ ID No.12。
更具体地,根据这一第一具体实施方式,所述的抗体或其功能片段之一或衍生物包含轻链,所述的轻链的序列包含氨基酸序列SEQ ID No.21。
SEQ ID No.21:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSKEDPLTFGSGTKLEMK
根据所述的另一个方面的第二具体实施方式,本发明所述的抗体或其功能片段之一或衍生物包含轻链,所述的轻链包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,其中CDR-L1包含氨基酸序列SEQ ID No.13,CDR-L2包含氨基酸序列SEQ ID No.11和CDR-L3包含氨基酸序列SEQ ID No.14。
根据所述的第二具体实施方式,所述的抗体或其功能片段之一或衍生物优选地包含轻链,所述的轻链的序列包含氨基酸序列SEQ ID No.22。
SEQ ID No.22:GIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRVSESIDTYGNSFIHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDSATYYCQQSNEDPF TFGSGTKLEMK
根据所述的另一个方面的第三具体实施方式,本发明所述的抗体或其功能片段之一或衍生物包含轻链,所述的轻链包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,其中CDR-L1包含氨基酸序列SEQ ID No.15,CDR-L2包含氨基酸序列SEQ ID No.16和CDR-L3包含氨基酸序列SEQ ID No.17。
根据所述的第三具体实施方式,抗体或其功能片段之一或衍生物优选地包含轻链,所述的轻链的序列包含氨基酸序列SEQ ID No.23。
SEQ ID No.23:DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLVDGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGPPYTFGGGTKLEIK
根据所述的另一个方面的第四具体实施方式,本发明所述的抗体或其功能片段之一或衍生物包含轻链,所述的轻链包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,其中CDR-L1包含氨基酸序列SEQ ID No.59,CDR-L2包含氨基酸序列SEQ ID No.60和CDR-L3包含氨基酸序列SEQ ID No.61。
根据所述的第三具体实施方式,抗体或其功能片段之一或衍生物优选地包含轻链,所述的轻链的序列包含氨基酸序列SEQ ID No.63。
SEQ ID No.63:QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSTYLYWYQQKPGSSPKLWIYTTSILASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAASYFCHQWSSYPFTFGSGTKLDIK
根据第三种方式,现在抗体将通过其轻链序列和其重链序列来限定。本发明所述的抗体或其功能片段之一或衍生物的特征在于其包含重链和轻链,所述的重链包含氨基酸序列SEQ ID No.18、19、20或62,并且所述的轻链包含氨基酸序列SEQ ID No.21、22、23或63。
更具体地,根据本发明,命名为224G11的优选的抗体或其功能片段之一或衍生物包含重链和轻链,所述的重链包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,其分别包含氨基酸序列SEQ ID No.1、2和3,并且所述的轻链包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,其分别包含氨基酸序列SEQ ID No.10、11和12。
在另一个方面,抗体224G11包含重链和轻链,所述的重链包含氨基酸序列SEQ ID No.18,所述的轻链包含氨基酸序列SEQ ID No.21。
根据本发明,命名为227H1的另一个优选的抗体或其功能片段之一或衍生物包含重链和轻链,所述的重链包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,其分别包含氨基酸序列SEQ ID No.4、5和6;所述的轻链包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,其分别包含氨基酸序列SEQ ID No.13、11和14。
在另一个方面,抗体227H1包含重链和轻链,所述的重链包含氨基酸序列SEQID No.19,所述的轻链包含氨基酸序列SEQ ID No.22。
命名为223C4的另一个优选抗体或其功能片段之一或衍生物,包含重链和轻链,所述的重链包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,其分别包含氨基酸序列SEQID No.7、8和9;所述的轻链包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,其分别包含氨基酸序列SEQ ID No.15、16和17。
在另一个方面,抗体223C4包含重链和轻链,所述的重链包含氨基酸序列SEQID No.20,所述的轻链包含氨基酸序列SEQ ID No.23。
命名为11E1的另一个优选的抗体或其功能片段之一或衍生物包含重链和轻链,所述的重链包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,其分别包含氨基酸序列SEQID No.56、57和58;所述的轻链包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3,其分别包含氨基酸序列SEQ ID No.59、60和61。
在另一个方面,抗体11E1包含重链和轻链,所述的重链包含氨基酸序列SEQID No.62,所述的轻链包含氨基酸序列SEQ ID No.63。
根据另一个方面,本发明涉及能够分泌本发明所述的单克隆抗体的鼠杂交瘤,特别是如保藏在Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM,National Collection of Microorganism Cultures)(Institut Pasteur,Paris,France)的鼠源性杂交瘤。
本发明所述的单克隆抗体或其功能性片段之一或衍生物的特征在于所述的抗体由于03/14/2007保藏在CNCM保藏号为CNCM I-3724(对应于11E1),I-3731(对应于224G11),I-3732(对应于227H1)和于07/06/2007保藏的保藏号为I-3786(对应于223C4)的杂交瘤所分泌。这些杂交瘤为鼠杂交瘤,由免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系(Sp20Ag14)的细胞融合而成。
下述表2对涉及优选的抗体的元件(element)进行了重新组合。
表2
表2清楚地显示抗体227H1和224G11的CDR-L2是相似的。这一例子清楚地支持本申请的权利要求,其覆盖了包含至少一个随机选自所描述的CDR序列的CDR的抗体。
根据优选的具体实施方式,本发明涉及单克隆抗体。
术语“单克隆抗体”或根据其通常含义而使用的是指从基本上同源的抗体群中获得的抗体,即除了少量可能自然发生的突变之外,包含在该群中的各个抗体是相同的。换句话说,单克隆抗体为来自于单一细胞克隆(例如杂交瘤细胞,转染编码同源性抗体DNA的真核宿主细胞,转化编码同源性抗体DNA的原核宿主细胞等)增殖的同源性抗体,并且其一般的特征是重链为单一类别或亚类,轻链为单一类型。单克隆抗体是高度特异性的,针对单一抗原。另外,与一般包括针对不同确定簇或表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相比,每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
在本发明中,与抗体化合物或其序列相关的术语多肽、多肽序列、氨基酸序列、肽和蛋白质是可互换的。
根据一个同样的特别的方面,本发明涉及嵌合抗体或其功能片段之一,根据本发明,其特征在于所述的抗体另外包含来自于与鼠异源的物种(特别是人)的抗体的轻链和重链恒定区,并且在优选的方式中,其特征在于来自于人抗体的轻链和重链恒定区分别是κ和γ-1、γ-2或γ-4区。
在本申请中,IgG1优选地获得效应物功能,并且最优选地为ADCC和CDC。
技术人员将会认识到效应物功能包括,例如结合C1q;补体依赖性细胞毒性(CDC);结合Fc受体;抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬;以及下调细胞表面受体(例如B细胞受体;BCR)。
本发明所述的抗体优选为特异性单克隆抗体,特别是鼠的,嵌合的或人源化来源的抗体,这些抗体可根据本领域技术人员熟知的标准方法获得。
一般而言,为制备单克隆抗体或其功能片段或衍生物,特别是鼠源的,可能参照特别是在手册“抗体”(Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp.726,1988)中描述的技术,或参照Kohler和Milstein描述的从杂交瘤中制备的技术(Nature,256:495-497,1975)。
可获得本发明所述的单克隆抗体,例如自针对c-Met或含有本发明所述的单克隆抗体特异性识别表位的c-Met片段之一而进行免疫的动物细胞中获得。所述的c-Met或其所述的片段之一,可特别是根据通常的工作方法,通过从含有编码c-Met的cDNA序列的核苷酸序列开始的基因重组,或通过从c-Met的肽序列中包含的氨基酸序列开始的肽合成来产生。
本发明所述的单克隆抗体可以,例如在亲和柱上纯化,已经将c-Met或含有本发明所述的单克隆抗体特异性识别表位的c-Met的片段之一预先固定在该亲和柱上。更具体地,所述的单克隆抗体可通过在蛋白A和/或G上层析纯化,其后进行或不进行离子交换层析,其目的在于去除残余的蛋白质污染物和DNA和LPS,其本身之后可进行或不进行SepharoseTM胶上的排阻层析以去除由于二聚体或其他多聚体的存在而产生的可能的聚集物。在甚至更优选的方式中,这些技术可全部同时或相继使用。
嵌合或人源化的抗体同样包含于本发明所述的抗体中。
嵌合抗体的意思是指一种抗体,其含有来自于指定物种的抗体的天然可变(轻链和重链)区,还含有与所述指定物种(例如小鼠、马、兔、犬、牛、鸡等)异源的物种的抗体的轻链和重链恒定区。
本发明所述的嵌合类型的抗体或其片段可通过使用基因重组技术制备。例如,嵌合抗体可通过克隆含有启动子和编码非人(特别是鼠)的本发明所述的单克隆抗体的可变区的序列和编码人抗体恒定区的序列的重组DNA而制备。通过所述重组基因编码的本发明的嵌合抗体将是,例如,鼠-人嵌合体,该抗体的特异性由来自于鼠DNA的可变区决定,并且其同种型由来自人DNA的恒定区决定。对于制备嵌合抗体的方法,可能参考,例如,Verhoeyn等人(BioEssays,8:74,1988)、Morrison等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:6851-6855,1984)ou Ie brevet US4,816,567的文献。
人源化抗体的意思是指一种抗体,其含有来自于非人抗体的CDR区,抗体分子的其他部分来自于一种(或几种)人抗体。另外,骨架(称为FR)的区段的有些残基可被修饰以保持结合亲和力(Jones et al.,Nature,321:522-525,1986;Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536,1988;Riechmann et al.,Nature,332:323-327,1988)。
本发明所述的人源化抗体或其片段可通过本领域技术人员已知的技术制备(例如,Singer et al.,J.Immun.150:2844-2857,1992;Mountain et al.,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.,10:1-142,1992;或Bebbington et al.,Bio/Technology,10:169-175,1992的文献所描述的)。
其他人源化的方法是本领域技术人员已知的,例如“CDR移植”法,该方法见于Protein Design Lab(PDL)在专利申请EP0 451261、EP0 682 040、EP0 9127、EP0 566 647或US5,530,101、US6,180,370、US5,585,089和US5,693,761中描述。下述专利申请也可以被提及:US5,639,641;US6,054,297;US5,886,152和US5,877,293。
本发明所述的抗体的“功能性片段”的意思特别是指抗体片段,如Fv、scFv(sc表示单链)、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc片段或双体(diabodies),或其半衰期可通过化学修饰或加入脂质体而增加的任何片段,所述的化学修饰如加入聚(烯基)二醇如聚乙二醇(“PEG化”)(PEG化的片段称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab')2-PEG或Fab'-PEG)(“PEG”代表聚乙二醇),所述的片段具有至少一个特征性CDR,所述的特征性CDR的序列为本发明所述的序列SEQ ID No.1至17和56至61,并且,特别是它能够以一般的方式表现出部分的它所来源的抗体的活性,特别是如能够识别和结合c-Met的能力,以及如果必要,抑制c-Met活性的能力。
优选地,所述的功能性片段由它们所来源的抗体的重或轻可变链的部分序列组成,或包含它们所来源的抗体的重或轻可变链的部分序列,所述的部分序列足够保持与它所来源的抗体对于c-Met的同样的结合特异性和足够的亲和力,优选地至少等于1/100,在更有选的方式中至少1/10的它所来源的抗体。这种功能性片段含有它所来源的抗体序列的最少5个氨基酸,优选地6、7、8、9、10、12、15、25、50和100个连续氨基酸。
优选地,这些功能性片段是Fv、scFv、Fab、F(ab')2、F(ab')、scFv-Fc型片段或双体,其一般与它们所来源的抗体具有相同的结合特异性。在本发明的更优选的具体实施方式中,这些片段选自二价片段如F(ab')2片段。根据本发明,本发明所述的抗体片段可通过如酶消化(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或化学还原切割二硫键的方法从以上所描述的抗体获得。在另一个方式中,本发明中包含的抗体片段可通过本领域技术人员同样熟知的基因重组的技术获得或使用例如自动肽合成仪(如Applied Biosystems等供应的)的方式通过肽合成获得。
关于“二价片段”,必须理解是指包含两个臂的任何抗体片段,更具体地,是指F(ab')2片段。
更具体地,本发明包含抗体或它们的功能性片段,根据本发明,特别是通过基因重组或化学合成获得的嵌合或人源化的抗体。
本发明所述的抗体的“衍生物”的意思是一种结合蛋白,其包含蛋白支架和至少一个选自原始抗体的CDR以保持结合能力。这种化合物是本领域技术人员熟知的,并且将在下述的说明书中进行更详细的描述。
更具体地,根据本发明,抗体或其功能片段之一或衍生物的特征在于所述的衍生物为包含支架的结合蛋白,所述的支架上已经移植了至少一个CDR以保持原始抗体(original antibody)原位旁(paratopic)识别属性。
本发明中描述的6条CDR序列中的一个或几个序列可放置在蛋白支架上。在这种情况下,该蛋白支架再现了移植的一个CDR或多个CDR序列发生适当折叠的蛋白骨架,从而允许它(或它们)保持它们抗原原位旁识别属性。
本领域技术人员知道怎样选择其上可以从原始抗体移植至少一个CDR的蛋白支架。更具体地,已经知道的是,为了被选定,这种支架应该表现出下述几个特征(Skerra A.,J.Mol.Recogn.,13,2000,167-187):
-系统发生上良好的保守性,
-带有熟知的三维分子组织(例如,晶体学或NMR)的强壮的结构,
-尺寸小,
-没有或仅有低程度的翻译后修饰,
-易于产生、表达和纯化。
这种蛋白支架可以是,但不限于,其结构选自纤维结合素,并且优选选自第十纤维结合素类型III结构域(FNfn10)、脂质运载(lipocalin)、抗运载蛋白(anticalin,Skerra A.,J.Biotechnol,2001,74(4):257-75)、衍生自葡萄球菌蛋白A的结构域B的蛋白质Z、硫氧还蛋白A或任何带有重复结构域的蛋白(如“锚蛋白重复结构”(Kohlet al.,PNAS,2003,vol.100,No.4,1700-1705),犰狳重复结构(armadillo repeat),“富含亮氨酸重复结构”或“三四氨基酸重复结构(tetra tri copeptide repeat)”)。
也可以被提及的是衍生自毒素(例如,蝎子、昆虫、植物或软体动物毒素)或烟胺比林氮氧合酶(neuronal nitric oxyde synthase)的蛋白抑制剂(PIN)的支架。
作为这种杂合构建体的非限制性例子,可以提及的是抗CD4抗体(即13B8.2抗体)的CDR-H1(重链)插入到PIN的一个暴露的环中。所获得的蛋白质的结合属性与原始抗体保持相似(Bes et al.,BBRC343,2006,334-344)。也可以提及的是抗溶菌酶VHH抗体的CDR-H3(重链)移植到新制癌菌素(neocarzinostatine)的环上(Nicaise et al.,2004)。
本发明的情况下,非限制性地,要保留的感兴趣的CDR可以是CDR-L2,因为它在本发明所述的两个鉴定抗体(即227H1和224G11)中是保守的。
如上所述,这种蛋白支架可包含来自于原始抗体的1至6个CDR。在优选的具体实施方式中,不含任何限制地,本领域技术人员选择至少一个重链的CDR,已知所述的重链特别地涉及抗体的特异性。用已知的方法选择目的CDR(s)对本领域技术人员来说是明显的(BES et al,FEBS letters508,2001,67-74)。
作为证据,这些例子是非限制性的,并且任何已知的或描述的其他支架也一定包含于本说明书中。
根据一个新的方面,本发明涉及分离的核酸,其特征在于其选自下述的核酸:
a)编码本发明所述的抗体或其功能性价片段之一或“衍生物”的核酸,DNA或RNA;
b)包含选自下述DNA序列的核酸:
-包含序列SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26和序列SEQ ID No.33、SEQ ID No.34和SEQ ID No.35的核序列;
-包含序列SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29和序列SEQ ID No.36、SEQ ID No.34和SEQ ID No.37的核序列;
-包含序列SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32和序列SEQ ID No.38、SEQ ID No.39和SEQ ID No.40的核序列;以及
-包含序列SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66和序列SEQ ID No.67、SEQ ID No.68和SEQ ID No.69的核序列;
c)包含选自下述DNA序列的核酸:
-包含序列SEQ ID No.41和SEQ ID No.44的核序列;
-包含序列SEQ ID No.42和SEQ ID No.45的核序列;
-包含序列SEQ ID No.43和SEQ ID No.46的核序列;
-包含序列SEQ ID No.70和SEQ ID No.71的核序列;
d)b)或c)中限定的核酸相对应的RNA核酸;
e)a),b)和c)中限定的核酸的互补核酸;以及
f)能够在高度严紧条件下与至少一个序列为SEQ ID No.24至40和64至69的CDR杂交的至少18个核苷酸的核酸。
在本发明中不加区分的使用的术语核酸、核或核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸序列、核苷酸序列,其意思是指核苷酸的精确连接,其被修饰或未被修饰,允许核酸的片段或区被限定,含有或不含非天然核苷酸,并且也能够对应于双链DNA,单链DNA和所述DNA的转录产物。
也必须理解本发明不涉及在其天然染色体环境中(也就是说在天然状态下)的核苷酸序列。本发明涉及已经被分离和/或纯化的,也就是说这些核苷酸序列已经被直接或间接选定,例如通过拷贝,它们的环境已经至少部分地被修饰。因此,此处同样也是指通过例如宿主细胞的方式进行的基因重组或通过化学合成而获得的分离核酸。
在高度严紧条件下的杂交是指以一种方式选择温度条件和离子强度条件,该方式允许杂交在两条互补DNA片段间进行。以举例的方式来说,为限定上述多核苷酸片段的目的,杂交步骤的高度严紧性条件有利地是下述条件。
DNA-DNA或DNA-RNA杂交在两个步骤中进行:(1)在磷酸盐缓冲液(20mM,pH7.5)中42℃预杂交3小时,所述磷酸盐缓冲液含有5x SSC(1x SSC相当于0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠溶液),50%甲酰胺,7%十二烷基磺酸钠(SDS),10xDenhardt's,5%硫酸葡聚糖和1%鲑精DNA;(2)实际杂交20小时,杂交温度根据探针大小确定(即:对于探针大小>100核苷酸,42℃),然后,在2x SSC+2%的SDS中20℃下20分钟洗涤两次,在0.1x SSC+0.1%的SDS中20℃下20分钟洗涤一次。对于探针大小>100核苷酸,最后一次洗涤在60℃下0.1x SSC+0.1%的SDS中进行30分钟。对于更大或更小的寡核苷酸,本领域技术人员可根据Sambrook et al.(1989,Molecular cloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold SpringHarbor)的教导调整上述的对于限定大小的多核苷酸的高度严紧的杂交条件。
本发明同样涉及包含本发明所述的核酸的载体。
本发明的目的特别地是含有本发明所述的核苷酸序列的克隆和/或表达载体。
本发明所述的载体优选地含有在确定的允许宿主细胞表达和/或分泌核苷酸序列的元件。因此,载体必须含有启动子、翻译的起始信号和终止信号、以及适当的转录调节区。它必须能够以稳定的方式保持在宿主细胞中,并且可可选地具有指导所翻译的蛋白质分泌的特定信号。本领域技术人员可选择和优化不同的元件,作为所使用的宿主细胞的功能。为了这种效果,本发明所述的核苷酸序列可插入到选定宿主中的自主复制载体中,或为选定的宿主的整合载体。
这种载体通过本领域技术人员目前已经使用的方法制备,并且所产生的克隆可通过标准的方法(如脂转染、电穿孔、热休克或化学方法)引入适当的宿主中。
本发明所述的载体是,例如,质粒或病毒来源的载体。它们可用于转化宿主细胞从而克隆或表达本发明所述的核苷酸序列。
本发明同样包含通过本发明的载体转化或包含本发明所述的载体的宿主细胞。
宿主细胞可选自原核或真核系统,例如细菌细胞,同样地酵母细胞或动物细胞,特别是哺乳动物细胞。同样可能使用昆虫细胞或植物细胞。
本发明同样涉及包含至少一种根据本发明所述的转化的细胞的动物,除了人以外。
根据另一个方面,本发明的主题是产生本发明所述的抗体或其功能性片段之一的方法,其特征在于其包含下述的阶段:
a)在培养基中和适当的培养条件下培养本发明的细胞;以及
b)收获由此从所述的培养基或所述的培养细胞中产生的所述抗体或其功能性片段之一。
本发明所述的转化细胞可在制备本发明所述的重组多肽的方法中使用。本发明所述的重组形式的多肽的制备方法的特征在于它们使用本发明的载体和/或本发明所述的载体转化的细胞,这些方法本身包含于本发明中。优选地,本发明所述的载体转化的细胞在允许所述的多肽表达的条件下培养,并收获所述的重组多肽。
如已经说明的,宿主细胞可选自原核或真核系统。特别地,在这种原核或真核系统中,可能鉴定本发明所述的核苷酸序列,并使其易于分泌。因此带有这种序列的本发明所述的载体可有利地用于产生期望其分泌的重组蛋白质。实际上,这些感兴趣的重组蛋白质存在于细胞培养物的上清而不是宿主细胞内部的事实,将有助于它们的纯化。
同样也可能可以通过化学合成制备本发明所述的多肽。这种制备方法也同样是本发明的主题。本领域技术人员知道化学合成的方法,例如使用固相的技术[Steward et al,1984,Solid phase peptide synthesis,Pierce Chem.Company,Rockford,111,2nd ed.,(1984)]或使用部分固相的技术,通过浓缩片段或通过溶液中进行经典地合成。通过化学合成获得并能够包含相应的非天然氨基酸的多肽同样包含于本发明中。
能够通过本发明所述的方法获得的抗体或其功能性片段之一或衍生物同样包含于本发明中。
本发明也涉及作为药物的本发明所述的抗体。
本发明也涉及一种药物组合物,所述药物组合物以有效要素(active principle)的方式包含由本发明所述的抗体或其功能性片段之一组成的化合物,所述药物组合物优选地与赋形剂和/或药学上可接受的载体混合。
本发明的另一个补充性具体实施方式在于一种组合物,如上述的组合物,其另外包含作为组合产品的以同时、分别或相继使用的抗肿瘤抗体。
最优选地,所述的第二抗肿瘤抗体可选自抗IGF-IR、抗EGFR、抗HER2/neu、抗VEGFR、抗VEGF等,抗体或其它任何本领域技术人员已知的抗肿瘤抗体。明显地,上述提到的抗体的功能性片段或衍生物作为第二抗体的用途是本发明的一部分。
选择抗EGFR抗体例如抗体C225(Erbitux)作为最优选的抗体。
“同时使用”的意思理解为以单一和相同的剂型给予本发明所述的组合物中的两种化合物。
“分别使用”的意思理解为以不同的剂型在同一时间给予本发明所述的组合物中的两种化合物。
“相继使用”的意思理解为连续给予本发明所述的组合物中的两种化合物,每种化合物都是不同的剂型。
以一般的方式,本发明所述的组合物相当大地增加了治疗恶性肿瘤的效果。换句话说,通过给予细胞毒性剂,本发明所述的抗c-Met抗体的治疗效果以意料不到的方式增强了。由本发明所述的组合物所产生的另一个主要的后续的优点涉及使用有效要素的更低有效剂量的可能性,这就避免或降低了出现副作用的风险,特别是细胞毒性剂的效应。
此外,本发明所述的组合物可更快地达到预期的治疗效果。
本发明所述的组合物的特征也在于,其另外包含作为组合产物的以同时、分别或相继使用的细胞毒性剂/细胞抑制剂。
“抗恶性肿瘤治疗剂”或“细胞毒性剂/细胞抑制剂”的意思是一种这种物质,当给予受试者这种物质时,治疗或预防恶性肿瘤在该受试者体内的发展。作为这种制剂的非限制性例子,可提及的是烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素或免疫调节剂。
这种制剂,例如,在VIDAL(2001版)指向关于癌学和血液学栏“细胞毒素”的化合物的页面中引用的,在该文献中引用的这些细胞毒性化合物在此引用作为优选的细胞毒性剂。
更具体地,根据本发明,下述制剂是优选的。
“烷化剂”是指任何能够交联或烷基化细胞中任何分子(优选核酸,例如DNA)的物质。烷化剂的例子包括氮芥如双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥(chlorambucol)、苯丙氨酸氮芥、苯胺化盐酸(chlorydrate)、溴丙哌嗪、松龙苯芥、磷酸二钠盐或磷雌氮芥;oxazophorins如环磷酰胺、六甲密胺、氯乙环磷酰胺、sulfofosfamide或异磷酰胺;氮丙啶或亚胺乙烯如三胺硫磷、三乙烯或六甲蜜胺(altetramine);亚硝(基)脲如卡氮芥、链唑霉素、福替目丁或环己亚硝脲;烷撑磺酸盐类如白消安、苏消安或英丙舒凡;三氮烯如氮烯咪胺;或铂复合物如顺铂、奥沙利铂和卡铂。
“抗代谢物”是指通过影响某些活动,通常是DNA合成来阻断细胞生长和/或代谢的物质。抗代谢物的例子包括甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶、氟苷、5-氟脱氧尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-巯基鸟嘌呤(6-TG)、2-氯脱氧腺苷(chlorodesoxyadenosine)、5-氮杂胞苷、2,2-二氟脱氧胞嘧啶核苷、克拉屈滨、脱氧柯福霉素和喷司他丁。
“抗肿瘤抗生素”是指可以阻止或抑制DNA、RNA和/或蛋白质合成的化合物。抗肿瘤抗生素的例子包括阿霉素、柔红霉素、去甲氧正定霉素、戊柔比星、盐酸米托蒽醌、更生霉素、光辉霉素、光神霉素、丝裂霉素C、博来霉素和甲基苄肼。
“有丝分裂抑制剂”阻止细胞周期和有丝分裂的正常进程。一般而言,微管抑制剂或紫杉烷(如紫杉醇和紫杉萜)能够抑制有丝分裂。长春花生物碱(如长春碱、长春新碱、长春酰胺和长春瑞滨)也能够抑制有丝分裂。
“染色质功能抑制剂”或“拓扑异构酶抑制剂”是指抑制染色质建模蛋白质(如拓扑异构酶I或拓扑异构酶II)的正常功能的物质。染色质功能抑制剂的例子包括,对于拓扑异构酶I是喜树碱和其衍生物如托泊替康或依立替康,对于拓扑异构酶II是依托扑沙、磷酸依托扑沙和鬼臼噻吩甙。
“抗血管生成剂”是指抑制血管生长的任何药物、化合物、物质或制剂。示例性抗血管生成剂包括但不以任何方式限制于丙亚胺、马马司他、巴马司他、普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、CGS-27023A、溴氯哌喹酮、COL-3、新伐司他、BMS-275291、沙立度胺、CDC501、DMXAA、L-651582、角鲨胺、内皮他丁、SU5416、SU6668、α-干扰素、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁和vitaxin。
“抗雌激素”或“抗雌激素剂”是指降低/拮抗或抑制雌激素作用的任何物质。抗雌激素剂的例子是它莫西芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、奥多昔芬(iodoxyfene)、阿纳托唑、来曲唑和依西美坦。
“抗雄激素”或“抗雄激素剂”是指降低、拮抗或抑制雄激素作用的任何物质。抗雄激素的例子是氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、安体舒通(sprironolactone)、醋酸环丙氯地孕酮、非那司提和西咪替丁。
“免疫调节剂”是刺激免疫系统的物质。
免疫调节剂的例子包括干扰素、白介素如阿地白介素(aldesleukine)、OCT-43、地尼白介素(denileukin diflitox)和白介素-2、肿瘤坏死因子如他索纳明(tasonermine)或其他免疫调节剂如蘑菇多糖、西佐糖、罗喹美克、匹多莫特、甲氧聚乙二醇琥珀酰胺腺甙脱氨酶、胸腺肽制剂、poly I:C或左旋咪唑结合5-氟尿嘧啶。
对于更多的细节,本领域技术人员可参考"Association Francaise des Enseignantsde Chimie Therapeutique"编辑的名称为《traite de chimie therapeutique,vol.6,Medicaments antitumoraux et perspectives dans Ie traitement des cancers》(TEC&DOC版,2003)的手册。
作为化学剂或细胞毒性剂也可提及的是所有激酶抑制剂,例如,吉非替尼(gefitinib)或埃罗替尼(erlotinib)。
在特别优选的具体实施方式中,所述的作为本发明所述的组合产品的组合物的特征在于所述的细胞毒性剂与所述抗体化学偶联起来以同时使用。
为了使所述的细胞毒性剂和本发明所述的抗体易于进行偶联,特别地,可以在将要偶联的两个化合物之间引入间隔子(spacer)分子,如聚(烯基)二醇象聚乙二醇或其他氨基酸,或在另一个具体实施方式中,使用所述的细胞毒性剂的活性衍生物,其中已经引入了能够与本发明所述的抗体反应的功能。这些偶联技术是本领域技术人员熟知的,在本说明书中不再展开。
在另一个方面,本发明涉及一种组合物,该组合物的特征在于至少一种所述抗体或其功能性片段之一或衍生物与细胞毒素和/或放射性元素结合。
优选地,所述的毒素或所述的放射性元素能够抑制至少一种表达c-Met细胞的细胞活性,以更优选的方式能够阻止所述的细胞的生长或增殖,特别是完全灭活所述的细胞。
同样优选地,所述的毒素是细菌肠毒素(enterobacterial toxin),特别是假单胞菌外毒素A。
优选的结合到用于治疗的抗体上的放射性元素(或放射性同位素)是发射γ射线的放射性同位素,优选碘131、钇90、金199、钯100、铜67、铋217和锑211。发射β和α射线的放射性同位素同样可用于治疗。
通过毒素或放射性元素结合至至少一种抗体或其功能性片段之一,根据本发明,其意思是指任何允许所述的毒素或所述的放射性元素结合至所述的至少一种抗体的方式,特别是通过两个化合物之间通过共价交联,引入或不引入连接分子。
在允许化学(共价)、静电、非共价的方式结合所有或部分结合物的成分的制剂中,可特别提及的是苯醌、碳化二亚胺和更特别的是EDC(1-ethyl-3-[3-dimethyl-aminopropyl]-carbodiimide hydrochloride,1-乙基-3-[3-二甲基-氨丙基]-碳化二亚胺盐酸)、双马来酰亚胺(dimaleimide)、二硫代二硝基苯甲酸(dithiobis-nitrobenzoic acid(DTNB))、N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫酯(N-succinimidyl S-acetylthio-acetate(SATA))、连接剂具有一个或更多与紫外线(U.V.)反应的叠氮苯基团,优选地N-[-4-(叠氮基水杨基氨基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)-丙酰胺(APDP)(N-[-4-(azidosalicylamino)butyl]-3'-(2'-pyridyldithio)-propionamide)、N-丁二酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)(N-succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate)、6-肼基烟酰胺(HYNIC)(6-hydrazino-nicotinamide)。
另一种偶联形式,特别是对于放射性元素,在于使用双功能离子螯合剂。
在这些螯合剂中,可能提及的螯合剂来自于EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸)或来自于DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid,二乙烯三胺五乙酸),两者被开发用于结合金属,特别是结合放射性金属,和免疫球蛋白。因此,DTPA及其衍生物可在碳链上被不同基团取代来增加配体-金属复合物的稳定性和刚度(Krejcarek et al.(1977);Brechbiel et al.(1991);Gansow(1991);美国专利4,831,175)。
例如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)及其衍生物已经在医学和生物学中长期广泛应用(无论是以自由形式,还是以与金属离子形成的复合物的形式),它们具有与金属离子形成稳定螯合物以及与具有治疗性或诊断意义的蛋白质(如抗体)形成稳定螯合物的显著特征,用于开发恶性肿瘤治疗中的放射性免疫结合物(radioimmunoconjugate)(Meases et.al.,(1984);Gansow et.al.,(1990))。
同样优选地,形成本发明的所述的结合物的所述的至少一个抗体选自其功能性片段,特别是去除它们的Fc成分的片段如scFv片段。
如已经提及的,在本发明的具体实施方式中,所述的细胞毒性剂/细胞抑制剂或所述的毒素和/或放射性元素化学偶联至所述的组合物的至少一种成分上以同时使用。
本发明包括作为药物的所描述的组合物。
此外,本发明包括本发明所述的组合物在制备药物中的用途。
在另一个方面,本发明涉及上述的抗体或其功能性片段之一或衍生物,和/或组合物在制备用于抑制肿瘤细胞生长和/或增殖的药物中的用途。
本发明的另一个方面在于上述的抗体或其功能性片段之一或衍生物和/或组合物,或上述的用途,在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
本发明也包括抑制患者中肿瘤细胞的生长和/或增殖的方法,该方法包括给予有此需要的患者本发明所述的抗体或其功能性片段之一或衍生物,本发明所述的杂交瘤产生的抗体或本发明所述的组合物。
本发明进一步包括预防或治疗有此需要的患者中恶性肿瘤的方法,该方法包括给予该患者本发明所述的抗体或其功能性片段之一或衍生物,本发明所述的杂交瘤产生的抗体或本发明所述的组合物。
在特别优选的方面,所述的恶性肿瘤为选自前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌、成胶质细胞瘤或结肠癌的恶性肿瘤。
如前面所解释的,本发明的一个优点是允许治疗HGF依赖性和非依赖性Met激活相关的恶性肿瘤。
本发明的另一个方面包括从怀疑c-Met受体异常存在的生物样品开始的体外诊断由c-Met受体过表达或表达不足诱导的疾病的方法,所述的方法的特征在于该方法包含所述的生物样品与本发明所述的抗体接触的步骤,如果必要,对所述的抗体可能进行标记。
优选地,所述的诊断方法中与c-Met受体异常存在相关的疾病是恶性肿瘤。
所述的抗体或其功能性片段之一可以免疫结合物(immunoconjugate)或标记的抗体的形式存在以获得可检测的和/或可定量的信号。
本发明所述的标记抗体或其功能性片段包括,例如,称为免疫结合物的抗体,该抗体可以与,例如,酶(如过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或6-磷酸葡萄糖脱氢酶)结合,或通过分子(如生物素、digoxygenin或5-溴脱氧尿苷)结合。荧光标记同样可与本发明所述的抗体或其功能性片段结合,并且特别是包括荧光素及其衍生物、荧光染料(fluorochrome)、若丹明及其衍生物、GFP(GFP代表绿色荧光蛋白)、丹酰、伞形酮等。在这种结合物中,本发明所述的抗体或其功能性片段可通过本领域技术人员已知的方法制备。它们可以直接偶联至酶或荧光标记上,或通过中间的间隔子基团或连接基团如多醛(polyaldehyde)如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA),或在偶联剂(如上面所提及的用于治疗性结合物的那些)存在下偶联至酶或荧光标记上。含有荧光素类型的标记可通过与异硫氰酸酯反应而制备。
其他结合物同样可包括化学发光标记,如鲁米诺和二环氧丙烷(dioxetanes),生物发光标记如荧光素酶和荧光素,或其他放射性标记如碘123、碘125、碘126、碘133、溴77、锝99m、铟11、铟113m、镓67、镓68、钌95、钌97、钌103、钌105、汞107、汞203、铼99m、铼101、铼105、钪47、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、氟18、钇199、碘131。本领域技术人员已知的现有的用于直接或通过螯合剂如上述的EDTA、DTPA将治疗性放射性同位素偶联至抗体的方法可用于可在诊断中使用的放射性元素。同样可能提及的是,通过氯胺-T方法[Hunter W.M.andGreenwood F.C.(1962)Nature194:495]用Na[I125]标记,或别的用Crockford et al.(美国专利4,424,200)的技术用锝99m标记,或如Hnatowich(美国专利4,479,930)描述的通过DTPA加上标记。
因此,本发明所述的抗体或其功能性片段可在检测和/或定量生物样品中c-Met受体的过表达或表达不足(优选过表达)的方法中使用,其特征在于其包含下述步骤:
a)所述的生物样品与本发明所述的抗体或其功能性片段之一接触;
b)证明可能形成的c-Met/抗体复合物。
在特定具体实施方式中,本发明所述的抗体或其功能性片段可在检测和/或定量生物样品中的c-Met受体的方法中使用,用来监测c-Met依赖性恶性肿瘤的预防性和/或治疗性处理的效果。
更一般地,本发明所述的抗体或其功能性片段可有利地在任何c-Met受体的表达必须以定性和/或定量的方式观察的情况中使用。
优选地,生物样品由生物流体,如血清、全血、细胞、组织样品或人来源的活组织形成。
可以使用任何程序或常规试验以实施这种检测和/或用药(dosage)。所述的的试验可以是竞争性或夹心试验,或任何本领域技术人员已知的依赖于抗原抗体免疫复合物形成类型的任何试验。本发明所述的应用之后,抗体或其功能性片段之一可被固定或标记。这种固定可在本领域技术人员已知的许多支持物上进行。这些支持物可特别地包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙或天然或修饰的细胞。这些支持物可以是可溶的或不可溶的。
以举例的方式,进行免疫酶方法的优选的方法根据ELISA技术,通过免疫荧光或放射性免疫测定(RIA)技术或等同技术。
因此,本发明同样包含试剂盒或套件(set),其用于实施c-Met受体过表达或表达不足诱导的疾病的诊断方法,或用于实施生物样品中c-Met受体的过表达或表达不足(优选为所述的受体过表达)的检测和/或定量方法,其特征在于所述的试剂盒或套件包含下述成分:
a)本发明所述的抗体或其功能性片段之一;
b)可选地,用于形成有助于免疫反应的介质的试剂;
c)可选地,该试剂可以证明该免疫反应产生的c-Met/抗体复合物。
本发明的主题同样是本发明所述的抗体或组合物在制备将生物活性化合物特异性靶向表达或过表达c-Met受体的细胞的药物中的用途。
此处生物活性化合物的意思是指任何能够调节,特别是抑制细胞活性,特别是其生长、其增殖、转录或基因翻译的化合物。
本发明的主题也是一种体内诊断试剂,及其在医学成像中的用途,特别是为了检测与细胞表达或过表达c-Met受体相关的恶性肿瘤的医学成像中的用途,该诊断制剂包含本发明所述的抗体或其功能性片段之一(优选为标记的,特别是放射性标记的抗体或其功能性片段之一)。
本发明同样涉及作为药物的本发明所述的作为组合产品的组合物或涉及抗c-Met/毒素结合物或放射性元素。
优选地,所述的组合物作为产品或根据本发明所述的结合物与赋形剂和/或药学上可接受的载体混合。
在本说明书中,药学上可接受的载体是指化合物或化合物的组合,其进入药物组合物而不引发副反应,并使得,例如,有助于给予活性化合物、增加其在体内的寿命和/或其效应、增加其在溶液中的可溶性或改善其保存。这些药学上可接受的载体是本领域技术人员熟知并可根据所选定的活性化合物的性质和给予方式进行调整的。
优选地,这些化合物通过全身途径,特别是通过静脉内途径、肌内、皮内、腹膜内或皮下途径或通过经口途径给予。在一个更优选的方式中,含有本发明所述的抗体的组合物以连续的方式给予数次。
它们的给予方式、剂量和优化剂型可根据在确定适于患者的治疗方法中一般需要考虑的标准(例如,患者年龄或体重、他/她一般情况的严重性、对治疗方法的耐受和观察到的副作用)来确定。
附图说明
本发明的其他特征和优点在本说明书的实施例和附图中继续说明,其中:
图1:选定的抗c-Met抗体的FACS图谱的例子;
图2A和2B:靶向c-Met的抗体体外抑制BXPC3的增殖;
图3:c-Met二聚化的抑制;
图4:抗c-Met抗体识别的蛋白质;
图5A和5B:通过BIAcore分析进行的11E1和5D5的“表位作图”;
图6A和6B:Mab对c-Met磷酸化的效应;
图7A和7B:放射标记的HGF被抗c-Met抗体取代;
图8:抗c-Met抗体抑制浸润[在该图中,SVF表示胎牛血清(FCS)];
图9:抗c-Met抗体对创伤愈合的效应;
图10A和10B:散射测定;
图11:三维管腔样结构形成(tubulogenesis)测定;
图12A和12B:抗体对球状体形成的效应;
图13:抗c-Met Mab在U87MG异种移植物模型中的体内活性;
图14:一组肿瘤细胞系的HGF表达;
图15A和15B:NCI-H441细胞系的特征;图15A对应于定量RT-PCR分析,并且图15B对应于FACS分析;
图16:抗c-Met抗体对NCI-H441异种移植物模型的体内活性;
图17A:224G11VL与鼠IGKV3-5*01胚系基因的比对;
图17B:224G11VL与鼠IGKJ4*01胚系基因的比对;
图18A:224G11VL与人IGKV3-l l*01和IGKV4-1*01胚系基因的比对;
图18B:224G11VL与人IGKJ4*02胚系基因的比对;
图19A:具有提及的突变的224G11VL的基于IGKV3-l l*01的人源化版本;
图19B:具有提及的突变的224G11VL的基于IGKV4-l*01的人源化版本;
图20A:224G11VH与鼠IGHV1-18*01胚系基因的比对;
图20B:224G11VH与鼠IGHD2-4*01胚系基因的比对;
图20C:224G11VH与鼠IGHJ2*01胚系基因的比对;
图21A:224G11VH与人IGHV1-2*02胚系基因的比对;
图21B:224G11VH与人IGHJ4*01胚系基因的比对;
图22:具有提及的突变的人源化的224G11VH;
图23A:227H1VL与鼠IGKV3-5*01胚系基因的比对;
图23B:227H1VL与鼠IGKJ4*01胚系基因的比对;
图24A:227H1VL与人IGKV3-11*01和IGKV4-l*01胚系基因的比对;
图24B:227H1VL与人IGKJ4*02胚系基因的比对;
图25A:具有提及的突变的227H1VL的基于IGKV3-11*01的人源化版本;
图25B:具有提及的突变的227H1VL的基于IGKV4-l*01的人源化版本;
图26A:227H1VH与鼠IGHV1-18*01胚系基因的比对;
图26B:227H1VH与鼠IGHD1-1*02胚系基因的比对;
图26C:227H1VH与鼠IGHJ2*01胚系基因的比对;
图27A:227H1VH与人IGHV1-2*02胚系基因的比对;
图27B:227H1VH与人IGHJ4*01胚系基因的比对;
图28:具有提及的突变的人源化的227H1VH;
图29A:223C4VL与鼠IGKV12-46*01胚系基因的比对;
图29B:223C4VL与鼠IGKJ2*01胚系基因的比对;
图30A:223C4VL与人IGKVl-NLl*01胚系基因的比对;
图30B:223C4VL与人IGKJ2*01胚系基因的比对;
图31:具有提及的突变的人源化的223C4VL;
图32A:223C4VH与鼠IGHVl-18*01胚系基因的比对;
图32B:223C4VH与鼠IGHD6-3*01胚系基因的比对;
图32C:223C4VH与鼠IGHJ4*01胚系基因的比对;
图33A:223C4VH与人IGHV1-2*02胚系基因的比对;
图33B:223C4VH与人IGHD1-26*01胚系基因的比对;
图33C:223C4VH与人IGHJ6*01胚系基因的比对;和
图34:具有提及的突变的人源化的223C4VH;
图36:抗c-Met Mab对HUVEC增殖的评价;
图37:抗c-Met Mab对HUVEC管腔样结构形成的评价;
图38A:11E1VL与鼠IGKV4-79*01胚系基因的比对;
图38B:11E1VL与鼠IGKJ4*01胚系基因的比对;
图39A:11E1VL与人IGKV3D-7*01胚系基因的比对;
图39B:11E1VL与人IGKJ4*02胚系基因的比对;
图40:具有提及的突变的11E1VL的人源化版本;
图41A:11E1VH与鼠IGHV1-7*01胚系基因的比对;
图41B:11E1VH与鼠IGHD4-l*01胚系基因的比对;
图41C:11E1VH与鼠IGHJ3*01胚系基因的比对;
图42A:11E1VH与人IGHV1-2*02和IGHV1-46*01胚系基因的比对;
图42B:11E1VH与人IGHJ4*03胚系基因的比对;
图43:具有提及的突变的人源化的11E1VH;
图44A和44B:A549细胞中的c-Met磷酸化测定。在缺乏或存在HGF时,对30μg/ml(图44A)或为确定EC50值的0.0015至30μg/ml的剂量范围内(图44B)的11E1和224G11纯化的Mab的评价;
图46:在NSCLC NCI-H441异种移植物模型中,体内联合使用224G11Mab和多柔比星;
图47:在NSCLC NCI-H441异种移植物模型中,体内联合使用224G11Mab和多西他赛;
图48:在NSCLC NCI-H441异种移植物模型中,体内联合使用224G11Mab和替莫唑胺;
图49A,49B,49C和49D:抗c-Met Mab对U87-MG球状体生长的效应;
图50A和50B:在磷酸-c-Met测定中嵌合的和人源化的形式的224G11的体外活性;
图51:Biacore分析装置;
图52:224G11对于无胸腺裸鼠的与作为人HGF来源的MRC5细胞共植入的MDA-MB-231细胞的体内活性;
图53:对Fc-cMet的基于ELISA的结合测定。抗-Fc-c-Met结合活性在基于ELISA的测定中被测量,此处抗鼠Fc结合物被用于检测纯化的鼠单克隆抗体11E1,224G11和227H1。剂量依赖的与塑料包被的重组Fc-cMet的结合活性在450nm测量;
图54:HGF-cMet的竞争测定。在该基于ELISA的测定中,在纯化的鼠单克隆抗体11E1、224G11和227H1存在下,结合到塑料包被的HGF上的重组Fc-cMET残质用抗鼠Fc结合物进行检测,并在450nm测量;
图55:227H1来源的重组VH区的氨基酸序列比对。227H1VH氨基酸序列与所选的人接受框架序列(human receiving framework sequence)进行比对,仅具有提及的被发现与鼠227H1VH序列不同的氨基酸。227H1HZl,HZ2和HZ3VH序列相当于227H1鼠VH区的完成的人源化版本,具有剩余的以粗体表示的鼠残基。在HZ3,10个残基(*)被自动地改变为它们的人的相应部分。在HZ2,对来自第三组(3)的七个残基进行了研究。在HZlVH,来自第二组(2)的九个残基被突变成其人的相应部分,仅来自第一组(1)的六个残基仍是鼠的;
图56:对重组227H1抗体的Fc-cMet进行的基于ELISA的结合测定。抗Fc-cMet结合活性在基于ELISA测定中进行测量,此处抗人Fc结合物被用于检测嵌合的和人源化的227H1来源的重组抗体。人源化的VH区来源的227H1抗体的与塑料包被的重组Fc-cMet的剂量依赖结合活性在450nm测量,并且然后与那些亲本/参照嵌合抗体进行比较;
图57:重组227H1来源的抗体的Fc-cMet的基于ELISA的结合测定。抗Fc-cMet结合活性在基于ELISA测定中进行测量,此处抗人Fc结合物被用于检测嵌合的和人源化的227H1来源的重组抗体。人源化的HZ4VH来源的227H1抗体的塑料包被的重组Fc-cMet的剂量依赖结合活性在450nm测量然后与那些亲本的/参照嵌合抗体进行比较;
图58:227H1的鼠和重组抗体的HGF-cMet竞争测定。在这个基于ELISA测定中,在227H1抗体的不同形式存在下,结合到塑料包被的HGF上的重组Fc-cMet残质用生物素化的不相关抗cMet抗体进行检测。试验纯化的鼠227H1单克隆抗体,嵌合的和HZ4VH来源的人源化的227H1来源的重组抗体,并且当在450nm测量时比较它们与HGF-cMet结合竞争的能力;
图59:227H1-HZ VH人源化的可变域序列。*,对应于实际上被改变为其人相应部分的氨基酸;!,对应于在HZ3至HZl完成期间被人源化的氨基酸;§,对应于最终在227H1-HZ VH序列中被人源化的氨基酸;
图60:11E1来源的重组VH区的氨基酸序列比对。11E1VH氨基酸序列与所选的人接受框架序列进行比对,仅具有提及的被发现与鼠11E1VH序列不同的氨基酸。11E1HZ VHl,VH2和VH3序列相当于11E1鼠VH区的完成的人源化版本,具有剩余的以粗体表示的鼠残基。在HZ VH3,七个残基(*)被自动地改变为其人的相应部分。在HZ VH2,对来自第三组(3)的七个残基进行了研究。在HZ VHl,来自第二组(2)的五个残基被突变成其人的相应部分,仅来自第一组(1)的五个残基仍是鼠的;
图61:对重组11E1抗体的Fc-cMet的基于ELISA的结合测定。抗Fc-cMet结合活性在基于ELISA测定中进行测量,此处抗人Fc结合物被用于检测嵌合的和人源化的11E1来源的重组抗体。人源化的VH区来源的11E1抗体的与塑料包被的重组Fc-cMet的剂量依赖结合活性在450nm测量,并且然后与那些亲本的/参照嵌合抗体进行比较;
图62:11E1来源的重组VL区的氨基酸序列比对。11E1VL氨基酸序列与所选的人接受框架序列进行比对,仅具有提及的被发现与鼠11E1VL序列不同的氨基酸。11E1HZ VLl,VL2和VL3序列对应于11E1鼠VL区的完成的人源化版本,具有剩余的以粗体表示的鼠残基。在HZ VL3,十个残基(*)被自动地改变为其人的相应部分。在HZ VL2,对来自第三组(3)的八个残基进行了研究。在HZ VLl,来自第二组(2)的八个残基被突变成其人的相应部分,仅来自第一组(1)的四个残基仍是鼠的;
图63:对重组11E1抗体的Fc-cMet的基于ELISA的结合测定。抗Fc-cMet结合活性在基于ELISA测定中进行测量,此处抗人Fc结合物被用于检测嵌合的和人源化的11E1来源的重组抗体。人源化的VL区来源的11E1抗体的与塑料包被的重组Fc-cMet的剂量依赖结合活性在450nm测量,并且然后与那些亲本的/参照嵌合抗体进行比较;
图64:对重组11E1抗体的Fc-cMet的基于ELISA的结合测定。抗Fc-cMet结合活性在基于ELISA测定中进行测量,此处抗人Fc结合物被用于检测嵌合的和人源化的11E1来源的重组抗体。单一或双重的人源化区来源的11E1抗体的与塑料包被的重组Fc-cMet的剂量依赖结合活性在450nm测量,并且然后与那些亲本的/参照嵌合抗体进行比较;
图65:224G11VH区序列的氨基酸序列比对。224G11VH氨基酸序列与227H1VH序列(下划线的是非同源的残基)和所选的人接受框架序列进行比对,仅具有提及的被发现与鼠224G11VH序列不同的氨基酸。224G11HZ VH0序列对应于224G11鼠VH区的“基于227H1/完全IMGT”(“227H1-based/full-IMGT”)的人源化版本。在这个序列内,非外部-IMGT-CDR(no outside-IMGT-CDR)残基仍是鼠的。
图66:对重组224G11抗体的Fc-cMet的基于ELISA的结合测定。抗Fc-cMet结合活性在基于ELISA测定中进行测量,此处抗人Fc结合物被用于检测嵌合的和HZVH0来源的人源化的224G11来源的重组抗体。HZVH0“完全IMGT”人源化的VH区来源的224G11抗体的与塑料包被的重组Fc-cMet的剂量依赖结合活性在450nm测量,并且然后与那些亲本的/参照嵌合抗体进行比较;
图67:224G11鼠和重组抗体的HGF-cMet竞争测定。在这个基于ELISA的测定中,在224G11抗体的不同形式存在下,结合到塑料包被的HGF的重组Fc-cMet残质用生物素化的不相关抗cMet抗体进行检测。纯化的鼠224G11单克隆抗体,嵌合的和HZVH0来源的人源化的224G11来源的重组抗体被试验,并且当在450nm测量时比较它们与HGF-cMet结合竞争的能力;
图68:224G11VL区序列的氨基酸序列比对。224G11VL氨基酸序列与两个所选的人接受框架序列进行比对,仅具有提及的被发现与鼠224G11VL序列不同的氨基酸。224G11HZ VL3序列相当于224G11鼠VH区的“更短CDR1”的人源化版本,而HZ VL6相当于“更长CDR1”版本,具有剩余的以粗体表示的鼠残基。对于两个基本的人源化版本,对剩余鼠残基进行评级以进行进一步人源化过程,此处*相当于在基本版本中被人源化的氨基酸,并且3,2和1对应于为应用的人源化版本设计的残基基团;
图69:对重组224G11抗体的Fc-cMet的基于ELISA的结合测定。抗Fc-cMet结合活性在基于ELISA测定中进行测量,此处抗人Fc结合物被用于检测嵌合的和人源化的22G11来源的重组抗体。人源化的VL3和VL6区来源的224G11抗体的与塑料包被的重组Fc-cMet的剂量依赖结合活性在450nm测量,并且然后与那些亲本的/参照嵌合抗体进行比较;
图70:对重组224G11抗体的Fc-cMet的基于ELISA的结合测定。抗Fc-cMet结合活性在基于ELISA测定中进行测量,此处抗人Fc结合物被用于检测嵌合的和人源化的224G11来源的重组抗体。人源化的VL区来源的224G11抗体的与塑料包被的重组Fc-cMet的剂量依赖结合活性在450nm测量,并且然后与那些亲本的/参照嵌合抗体进行比较;
图71:224G11鼠和重组抗体的HGF-cMet竞争测定。在这个基于ELISA测定中,在224G11抗体的不同形式存在下结合到塑料包被的HGF的重组Fc-cMet残质用生物素化的不相关抗cMet抗体进行检测。纯化的鼠224G11单克隆抗体,嵌合的和HZ VL4来源的人源化的224G11来源的重组抗体被试验,并且当在450nm测量时比较它们与HGF-cMet结合竞争的能力;
图72:VL4人源化的224G11VL区序列的氨基酸序列比对。*,对应于在基本HZ VL6版本中实际上被改变为其人相应部分的氨基酸;!,对应于在HZ VL6至HZ VL4完成期间被人源化的氨基酸;§,对应于在224G11-HZ VL4序列中仍是鼠的氨基酸;
图73:对重组224G11抗体的Fc-cMet的基于ELISA的结合测定。抗Fc-cMet结合活性在基于ELISA测定中进行测量,此处抗人Fc结合物被用于检测嵌合的和人源化的22G11来源的重组抗体。单一或双重的人源化结构域来源的224G11抗体的塑料包被的重组Fc-cMet的剂量依赖结合活性在450nm测量,并且然后与那些亲本的/参照嵌合抗体进行比较;
图74:224G11鼠和重组抗体的HGF-cMet竞争测定。在这个基于ELISA测定中,在224G11抗体的不同形式存在下结合到塑料包被的HGF的重组Fc-cMet残质用生物素化的不相关抗cMet抗体进行检测。纯化的鼠224G11单克隆抗体,嵌合的和完全人源化的224G11来源的重组抗体被试验,并且当在450nm测量时比较它们与HGF-cMet结合竞争的能力;
图75:对重组224G11抗体的Fc-cMet的基于ELISA的结合测定。抗Fc-cMet结合活性在基于ELISA测定中进行测量,此处抗人Fc结合物被用于检测嵌合的和人源化的22G11来源的重组抗体。VL4来源的完全人源化的224G11抗体的单一突变体的塑料包被的重组Fc-cMet的剂量依赖结合活性在450nm测量,并且然后与那些亲本的/参照嵌合抗体进行比较;
图76:对重组224G11抗体的Fc-cMet的基于ELISA的结合测定。抗Fc-cMet结合活性在基于ELISA测定中进行测量,此处抗人Fc结合物被用于检测嵌合的和人源化的22G11来源的重组抗体。VL4来源的完全人源化的224G11抗体的单一和多个突变体的塑料包被的重组Fc-cMet的剂量依赖结合活性在450nm测量,并且然后与那些亲本的/参照嵌合抗体进行比较;和
图77:224G11鼠和重组抗体的HGF-cMet竞争测定。在这个基于ELISA测定中,在224G11抗体的不同形式存在下结合到塑料包被的HGF的重组Fc-cMet残质用生物素化的不相关抗cMet抗体进行检测。纯化的鼠224G11单克隆抗体,嵌合的和VL4来源的完全人源化的224G11重组抗体的单一或多个突变体被试验,并且当在450nm测量时比较它们与HGF-cMet结合竞争的能力;
具体实施方式
实施例1:抗c-Met抗体的产生
为了产生抗c-Met抗体,8周龄BALB/c小鼠用CHO转染的细胞系皮下免疫3至5次(20×106个细胞/剂量/小鼠),该细胞系在其细胞膜上表达c-Met,或用c-Met胞外域融合蛋白质(10-15μg/剂量/小鼠)(R&D Systems,Catalog#358MT),或用混合了弗罗因德佐剂的该重组蛋白质的片段进行免疫2至3次,第一次免疫接种使用完全弗罗因德佐剂,后续接种使用不完全弗罗因德佐剂。也进行了鼠接受CHO-cMet细胞和重组蛋白质接种的混合方案。细胞融合前的三天,小鼠用重组蛋白或片段通过腹腔注射或静脉注射追加剂量。然后小鼠脾脏被收集,并将其与SP2/0-Agl4骨髓瘤细胞(ATCC)融合,并且进行HAT选择。进行了四次融合。一般而言,对于单克隆抗体或它们的功能片段的制备,尤其是鼠来源的,可能会参考手册《抗体》(Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp.726,1988)中特别提及的技术或Kohler和Milstein(Nature,256:495-497,1975)所描述的杂交瘤的制备技术。
获得的杂交瘤最初用ELISA筛选c-Met重组蛋白,并且然后用FACS分析筛选A549NSCLC、BxPC3胰脏的、和U87-MG成胶质细胞瘤细胞系(代表性的图谱见图1)以确信生产的抗体也能识别肿瘤细胞上的天然受体。在这两个试验中,阳性反应者被扩增,克隆,并且发现,纯化和筛选了一组杂交瘤的体外抑制BxPC3模型中细胞的增殖能力。
为此,将50000BxPC3细胞在RPMI培养基,2mM L.谷氨酰胺,不含SVF中平铺于96孔板中。平铺后24小时,在加入100ng/ml的hHGF前60分钟,将待测抗体以终浓度范围为0.0097至40μg/ml加入。3天后,细胞用0.5μCi的[3H]胸腺嘧啶进行脉冲16个小时。结合到不溶于三氯乙酸的DNA上的[3H]胸腺嘧啶的数量用液体闪烁计数进行定量。结果以原始数据表达,从而真正的评价每个Mab的内在拮抗效应(图2A和2B)。
然后用BRET分析c-Met转染细胞上清,评价至少抑制50%细胞增殖的抗体。为了该目的,产生表达C-Met-Rluc或C-Met-Rluc和C-Met-K1100A-YFP的CHO稳定细胞系。在BRET实验前一或两天,将细胞接种在含有DMEM-F12/FBS5%培养基的白色的96孔板中。为了使细胞贴到培养板上,细胞先在37℃的5%CO2中培养。然后用200μl的DMEM/孔使细胞饥饿过夜。就在该实验前,去除DMEM并用PBS快速洗细胞。在50μl的终体积中在加入含有或不含有HGF的coelenterazine之前,将细胞在存在或不存在待测抗体或参考化合物的PBS中在37℃孵育10分钟。在37℃再孵育10分钟后,在485nm和530nm获得的光发射用Mithras发光计(Berthold)(1s/波长/孔,重复15次)启动(initiate)。
先前定义BRET比率[Angers et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97:3684-3689]如下:[(530nm发射光)-(485nm发射光)X Cf]/(485nm发射光),此处Cf对应于相同条件下仅表达Rluc融合蛋白的细胞的(530nm发射光)/(485nm发射光)。简化该方程式表明BRET比率相当于当两个伴侣存在时获得的530/485nm比率,以相同实验条件下当在该分析中只有融合到R.reniformis萤光素酶的伴侣存在时获得的530/485nm比率进行校正。由于可读性的原因,结果以milliBRET单位(mBU)表达;mBU相当于BRET比率乘以1000。
在这第二个体外试验以后,选出4个抗体,这些抗体i)在增殖的功能性试验中作为整个分子没有内在活性,ii)显著抑制BxPC3增殖(图2A和2B)和iii)抑制c-Met二聚化(图3)。这3个IgGlκ同种型的抗体被描述为11E1、224G11、223C4和227H1.在实验中,5D5Mab,由Genentech生产,并在ATCC可得到,作为内在拮抗活性的对照而加入。
图2A和2B表明,与5D5相反,11El、224G11、223C4和227H1没有任何的激动剂活性,而5D5在配体缺乏时诱导细胞增殖的剂量依赖性刺激效应。4个被选择的抗体均观察到对细胞增殖的显著抑制。在该实验中5D5对HGF-诱导的细胞增殖没有作用。
当评价阻断二聚化时,观察到224G11、223C4、11E1和227H1对抑制二聚化具有显著效应,分别达到32、55、69和52%。与各自实验中的基础信号相比,5D5抗体在该二聚化模型中没有作用。
实施例2:通过抗-c-Met抗体的蛋白质识别
为表现3个被选抗体的识别模式的特征,用重组的c-Met蛋白质,它的单体片段(通过剪切重组c-Met-Fc蛋白质和重组SEMA结构域获得)建立了3个ELISA。
图4中呈现的结果表明,4个抗体识别二聚的和单体的蛋白质。为了完成这些ELISA,将人二聚的c-Met蛋白(R&D sytems,cat#358MT)在PBS中以0.7μg/ml的浓度4℃包被过夜。在将培养板(Costar#3690)以0.5%明胶溶液在37℃饱和2小时后,将杂交瘤上清在37℃孵育1小时。一经PBS冲洗,将抗小鼠HRP抗体(Jackson ImmunoResearch,catalog#115-035-164)在ELISA缓冲液(在PBS中0.1%明胶/0.05%吐温20)中以1/5000稀释加入到每个孔,并将培养板在37℃孵育1小时。在PBS冲洗3次后,过氧化物酶的活性通过加入50μl的TMB底物(Uptima)显示出来。反应在室温中持续5分钟。反应通过加入50μl/孔的1M H2SO4溶液而终止,并在读板机上在450nm读取。在单体的c-Met和SEMA结构域上进行相同的方案,但是在该情况中蛋白质分别以5和3μg/ml包被。
作为阳性对照被引进的5D5Mab正如预期的那样识别SEMA蛋白。224G11、227H1和223C4并不结合SEMA结构域。11E1能结合SEMA。
为确定是否11E1和5D5,两者为竞争重叠表位都能识别SEMA结构域,进行了BIAcore分析。以表面细胞质基因组共振现象为根据的BIAcore系统通过实时监测结合事件来传输数据。然后在所谓的“表位作图”实验中用于将抗体分组。不能同时结合到抗原分子上的几个抗体被分类到相同组中(相同的或邻近的结合位点)。相反地,当它们各自的结合位点远得足以允许两个抗体同时结合时,后者被分成两个不同的组。在这种实验中,抗原通常被用作配体(固化在传感器芯片上),并且无任何标记的抗体用作分析物(溶液相)。
所有上述的实验在BIAcore X仪器(GE Healthcare Europe GmbH)上进行。被鼠的抗六组氨酸标签的Mab(R&D System ref.MAB050)激活的CM5传感器芯片(BIAcore)按照厂商的技术说明书通过使用胺耦合试剂盒(BIAcore)进行准备。电泳缓冲液(HBS-EP)和再生缓冲液(Glycine,HCl)来自BIAcore。作为嵌合分子c-Met-Fc-六组氨酸标签生产的人HGF受体的重组可溶版本来自R&D系统(ref.358-MT-CF)。实验在25℃以30μl/min的流速完成。电泳缓冲液中c-Met的10μg/ml溶液在一分钟的期间在流动细胞2(fc2)上有代表性地被注入270RU的c-Met可溶性形式被捕获。流动细胞1(fcl)作为参照被用于检查抗体与传感器芯片基质之间的非特异性结合。
进行了将被试验的抗体的连续注射。抗体在2分钟内在流动细胞上被注入。然后在相同的条件下第二个抗体(或相同)被注入。如果没有观察到显著的结合用另一个抗体进行第三次注射。然后传感器芯片通过再生缓冲液的单次30s注射得到再生。任何一个抗体和c-Met-Fc在该阶段被丢弃。
结果的分析:
抗体“A”阻断抗体“B”的结合的能力通过比率BIA/C=(R2A/B/R1B)x100来计算:此处R2A/B是相当于当它在Mab“A”之后被注入时MAb“B”的结合的反应,且RlB相当于当它首先被注入时MAb“B”的结合的反应。A BIA/C低于20%表示A能够阻断B的结合,因此A和B有毗邻的结合位点。
用2个Mab,11E1和5D5,进行了表位作图。
表3
通过2分钟依次注射的10μg/ml浓度的Mab5D5(第一)、5D5(第二)和11E1(第三)所捕获的c-Met-Fc在270RU附近的结合显像都表明,5D5和11E1清楚地结合到两个远隔的位点(图5A)。这个观察通过抗体的交互序列得到证实(图5B)。
表3总结了用这2个抗体的不同序列获得的计算比率。黑色值(超过75%)意味着Mab A不阻断Mab B的结合。粗体/斜体值(低于20%)意味着两个抗体(A和B)的结合位点是相同的或足够近地不能同时结合。
实施例3:Mab对c-Met磷酸化的作用
为确定抗c-Met抗体对c-Met磷酸化的活性,安排了磷光体c-Met ELISA测定。将大约500000个A549细胞接种在含有F12K培养基+10%FCS的6孔板的每个孔中。在加入HGF(100ng/ml)之前的16小时,使细胞饥饿,并且在配体刺激前的15分钟以30μg/ml的终浓度加入每个将被试验的抗体。加入后的15分钟,加入冷的溶解缓冲液,将细胞刮掉并将细胞溶胞产物收集起来,并在4℃13000rpm离心10分钟。上清用BCA试剂盒(Pierce)进行定量,并储存于-20℃。对于ELISA测定,将羊抗c-Met抗体(R&D ref.AF276)用作捕获抗体(在4℃包被过夜),并在用TBS-BSA5%缓冲液饱和步骤(于RT饱和1小时)之后,将来自不同细胞溶胞产物的25μg蛋白质加入到96孔板中的每个孔中。室温孵育90分钟后,洗板四次,并加入抗磷酸-c-Met抗体(兔抗-pY1230-1234-1235c-Met)。再孵育1小时,并四次洗涤后,在室温加入抗兔HRP(Biosource)1小时,并接着加入鲁米诺底物,然后用Mithras装置评价发光。图6B的结果证明与显示了,与对c-Met磷酸化(42%)的具有更弱抑制作用的5D5Mab相比,11E1、224G11、223C4和227H1分别68、54、80和65%地抑制c-Met磷酸化。在这个试验中,用4个候选抗体(图6A)观察到了弱的基础效应(少于20%)。正如本专利提出的各种实施例中所描述的,这种弱的基础效应对其他体外和体内试验中抗体的活性没有影响。用作对照的5D5在该试验中显示了显著的基础效应。
实施例4:用抗c-Met抗体取代放射标记的HGF
为确定抗c-Met抗体是否能够取代HGF,安排了结合实验。简而言之,将蛋白A闪光培养板(FlashPlate)96孔微孔板(Perkin Elmer)在加入作为包被蛋白的重组c-Met-Fc(R&D Systems)之前用于PBS中的0.5%明胶(200μl/孔,室温2小时)饱和。在每个孔中加入2000μl于PBS中的1μg/ml c-Met-Fc溶液。然后将培养板在4℃孵育过夜。游离的剩余蛋白A位点用非相关hIgG(PBS中0.5μg/孔)室温进一步饱和2小时。每个步骤后用PBS洗板。
对于竞争分析,在存在PBS pH7.4中的范围为0.1pM至1μM的各种浓度的抗c-Met单克隆抗体11E1、224G11、223C4、227H1或HGF(R&D Systems)的情况下,测定200pM[125I]-HGF(特异活性~2,000Ci/mmol)与固化的c-Met的结合。培养板在室温孵育6h,然后用Packard Top Count微量培养板闪烁计数器计数。在存在1μM HGF时,确定非特异性结合。单克隆抗体9G4,其不是针对c-Met但却特异性地识别大肠杆菌蛋白质,将其用作鼠IgG1同种型对照。
[125I]-HGF特异性结合的总的百分数在半对数图上作为配体浓度的函数进行绘图。抑制50%(IC50)放射配体结合所需的各种抑制剂的浓度从获得的S型竞争曲线中进行确定(图7A和7B)。
正如所期望的,非放射性标记的HGF能够完全取代结合到固化的c-Met上的[125I]-HGF,然而对照抗体9G4并不显示任何HGF阻断活性(图7A和7B)。单克隆抗c-Met抗体11E1、224G11、223C4和227H1能够分别以20nM、3nM、2.7nM和5.8nM的IC50值抑制[125I]-HGF结合到固化的c-Met上。将已确定的抗体224G11、223C4和227H1的IC50值与已确定的非放射标记的HGF的IC50值(其被包含在3和5nM之间)进行比较,然而抗体11E1显示更高的IC50值。
实施例5:抗c-Met抗体抑制浸润
为评价抗c-Met抗体对浸润过程的抑制效应,将A549细胞平铺(plated)在BD BioCoatTMMatrigelTM浸润室(6.5mm直径的孔上有8μm大小(pre size)聚碳酸酯膜)的上层室中。在进行浸润测定之前,使A459细胞饥饿24小时。然后将500000个在趋化性缓冲液(DMEM培养基,0.1%BSA,12mM Hepes)中的A549细胞被平铺在每个室的上面孔中的包被或没有包被待测抗体(Mab终浓度10μg/ml)的基质胶上。培养板在37℃5%CO2孵育1小时后,使下层室充满含有400ng/ml的rhHGF的生长培养基或仅充满生长培养基。将浸润室在37℃5%CO2再孵育48小时。在这次孵育时间结束时,将仍在滤膜上表面的细胞用棉头拭子轻轻地移开,将移行到滤膜的下表面的细胞裂解,用CyQuant GR染料缓冲液(Invitrogen)染色并用荧光阅读器Berthold Mithras LB940计数。所有条件重复三次进行试验。
正如所预期的,与引入10%FCS作为阳性对照所观察到的浸润相比,HGF可显著诱导肿瘤细胞的浸润(图8)。当与不含IgG而平铺的细胞相比较时,作为同种型的对照而引入的鼠IgG19G4对基础的或HGF-诱导的浸润没有显著的效应。当单独加入时注意到11El、224G11、223C4和227H1没有激动剂效应,而用3个Mab时则观察到显著的和具有可比性的对HGF-诱导的浸润的抑制作用。
实施例6:抗c-Met抗体抑制创伤愈合
HGF刺激移动。为确定抗HGF抗体是否能抑制迁移,NCI-H441细胞生长到高密度,并用P200吸管端使其产生间隙。然后,在存在或缺乏11E1的情况下,用HGF(100ng/ml)刺激细胞移行过间隙。对仅有11E1的孔也进行了评价。每个试验条件进行了重复六次的评价,并进行了3次独立的实验。孵育过夜后,用AxioVision Camera(物镜x4)观察细胞。
HGF诱导显著的迁移导致一夜之内间隙完全闭合(图9)。用作同种型对照的9G4无关IgG1对细胞迁移没有任何效应。正如所预期的,当单独加入5D5时观察到激动剂效应,但是在HGF存在下用这个抗体却观察到细胞迁移的显著抑制,部分间隙仍然敞开。当单独加入5D5的Fab片段时,没有任何激动剂效应。然而,在HGF存在下,观察到这个片段没有活性。正如用同种型对照9G4所观察的,当单独加入MAb11E1时,没有激动剂效应,而在HGF存在时却成为完全拮抗剂。
实施例7:散射测定
将SK-HEP-1细胞以低密度接种(1.104细胞/孔)接种在含有10%FCS的DMEM的24孔板中,使其生长24小时后同时加入HGF(100ng/ml)和待测抗体(10μg/ml)。孵育72小时后,固定克隆并用于甲醇中的0.2%结晶紫染色,并进行散射可见光的评价。每个试验条件被进行三次重复试验,并进行3次独立实验。
HGF加入到SK-HEP-1细胞诱导显著的细胞散射(图10A和10B)。作为同种型对照而引入的9G4抗体在单独存在或HGF存在时均无效应。正如所预期的,当单独加入5D5抗体显示出显著的激动剂效应,但当与HGF一同加入时却无抑制效应(图10A)。单独加入11E1(图10A)或224G11(图10B)没有观察到激动剂效应。证明在HGF存在时,这些抗体具有非常显著的抑制效应(图10A和10B)。
实施例8:三维管腔样结构形成(tubulogenesis)测定
将SK-HEP-1细胞以1.104细胞/孔接种在含有10%FCS/基质胶(50/50)的DMEM的24孔板中,并孵育30分钟,之后同时加入HGF(100ng/ml)和待测抗体(10μg/ml)。孵育7天后,评价细胞可见的管腔样结构形成。每个试验条件进行3次重复试验,并进行3次独立实验。
HGF的加入显著诱导SK-HEP-1管腔样结构形成(图11)。作为同种型对照而引入的抗体9G4在单独加入或在HGF存在时加入均无效应。正如所期望的,当单独加入时,5D5显示出显著的激动剂效应而其与HGF一同加入时无抑制效应。单独加入11E1,223C4和224G11没有观察到激动剂效应,而证明在存在HGF时11E1和223C4具有完全的抑制效应。224G11Mab观察到部分的却是显著的抑制作用。
实施例9:球状体形成
为评价抗c-Met抗体抑制体外肿瘤生长的能力,在更接近于体内情况的模型中,产生U-87MG,人成胶质细胞瘤细胞(ATCC#HTB-14)球状体。单层生长的细胞用胰蛋白酶-EDTA进行分离,并在加入了10%FBS的完全细胞培养基(DMEM)中重悬。通过在DMEM-10%FCS中将625个细胞接种到96孔板底部单个圆形孔中启动球形体的形成。为防止细胞粘附到基质上,培养板用于95%乙醇中的聚甲基丙烯酸羟乙基酯(polyHEMA)进行预包被,并使其在室温空气干燥。将培养板在37℃,5%CO2增湿的孵箱中在标准的细胞培养条件下孵育。在球形体培养的3和7天后加入纯化的单克隆抗体(10μg/ml)。一旦培养4天后,加入HGF(400ng/ml)。至少将球形体培养10天。然后,用axio可视软件的自动测量模块通过测量球形体的面积来监测球形体的生长。面积以μm2表达。每种条件评价8-16个球形体。
图12A和12B说明,在10%FCS存在时,HGF加入到完全培养基时,观察到没有刺激作用。正如所期望的9G4同种型对照对球形体生长没有效应。在HGF存在和缺乏时,11E1和223C4都显著地减少球形体生长。加入5D5Fab片段观察到没有效应。
实施例10:抗c-Met Mab在U87MG异种移植物模型中的体内活性
六至八周龄无胸腺鼠住在无菌的顶部加滤膜的笼子中,饲养在无菌条件下并根据法国和欧洲指导方针(French and European guideline)处理。选择U87-MG,成胶质细胞瘤细胞系,表达c-Met和自分泌配体HGF进行体内评价。将5x106细胞皮下注射到小鼠。然后,在细胞移植后六天,测量肿瘤(大约100mm3),将肿瘤大小具有可比性的动物分组,每组6只小鼠,并用每种待测抗体以1mg/剂量一周处理两次。接着,观察小鼠的异种移植物生长速度和体重改变。肿瘤体积通过公式来计算:π(Pi)/6×长×宽×高。
图13总结获得的结果,并且证明所有测定抗体显著地抑制U87-MG细胞的体内生长。在A组中中和的抗IGF-lR抗体(IgG1)的使用证明,观察到的体内抑制作用与HGF-cMet轴的调节特异性相关。
实施例11:抗c-Met Mab在NCI-H441异种移植物模型中的体内活性
NCI-H441来源于乳头状肺腺癌,表达高水平的c-Met,并证明存在c-Met RTK的组成性磷酸化作用。
为确定这个细胞系是否表达高水平的c-Met和能够产生HGF,进行了定量RT-PCR和FACS或ELISA(Quantikine HGF;R&D systems)。对于定量RT-PCR,细胞系中总的HGF或cMet转录本表达水平通过使用标准的TaqManTM技术的定量PCR来进行评价。HGF或c-Met转录本水平以管家基因核糖体蛋白,大的,P0(RPL0)进行标准化,并且结果以标准化后的表达值(2-ddCT方法)来表达。
RPL0的引物/探针组是:正向,5'-gaaactctgcattctcgcttcctg-3'(SEQ ID No.47);反向,5'-aggactcgtttgtacccgttga-3'(SEQ ID No.48);和探针,5'-(FAM)-tgcagattggctacccaactgttgca-(TAMRA)-3'(SEQ ID No.49)。HGF的引物/探针组是正向,5'-aacaatgcctctggttcc-3'(SEQ ID No.50);反向,5'-cttgtagctgcgtcctttac-3'(SEQ ID No.51);并且探针,5'-(FAM)-ccttcaatagcatgtcaagtggagtga-(TAMRA)-3'(SEQ ID No.52)。cMet的引物/探针组是:正向,5'-cattaaaggagacctcaccatagctaat-3'(SEQ ID No.53);反向,5'-cctgatcgagaaaccacaacct-3'(SEQ ID No.54);和探针,5'-(FAM)-catgaagcgaccctctgatgtccca-(TAMRA)-3'(SEQ ID No.55)。热循环方案由50℃解链2分钟,95℃10分钟,接着进行40个循环的95℃15秒和62℃1分钟组成。
在NCI-H441(图14)中没有发现HGF的mRNA,并且在NCI-H441上清中通过ELISA检测不到HGF。在这些实验中,将U87-MG,已知为HGF的自分泌细胞系的成胶质细胞瘤细胞系作为阳性对照引入。RT-PCR分析显示,在U87-MG中检测到显著水平的HGF mRNA,并且在U87-MG细胞的上清中检测到HGF为1.9ng/百万细胞。定量RT-PCRs和FACS分析(图15A和15B)均证明,正如所预期的,NCI-H441细胞显著地过表达c-Met,并且证明该表达引人注目地高于在U87-MG细胞所观察到的表达水平。在这个实验中,将MCF-7细胞系作为阴性对照引入。总之,NCI-H441似乎是非自分泌组成性激活的细胞系,其能够不依赖于HGF配体生长,其中c-met的配体非依赖性二聚化是受体过表达的结果。
抗c-met抗体对这个非自分泌细胞系的体内活性的评价能够加深人们对它们影响c-met二聚化的效能的理解。
图16证明,224G11,11E1和227H1显著抑制NCI-H441的体内生长提示除了配体依赖的抑制,能够抑制二聚化的这些抗体还能靶向c-met的配体非依赖性抑制。正如在本说明书中如上说明的,由于后一属性,表明224G11、11E1和227H1与5D5单臂(OA-5D5)抗c-Met抗体是不同的。
实施例12:抗体224G11的CDR移植的人源化过程
I-轻链可变区的人源化
224G11VL的核苷酸序列与鼠胚系基因的比较
作为开始步骤,224G11VL的核苷酸序列与IMGT数据库(http://imgt.cines.fr)中的鼠胚系基因部分进行比较。.
已经分别鉴定出鼠IGKV3-5*01和IGKJ4*01胚系基因的V区的序列同一性为99.31%,其J区的序列同一性为94.28%。关于获得的同一性,决定直接使用查找人同源序列的224G11VL序列。
这些比对在图17A(V基因)和17B(J基因)中表示。
224G11VL的核苷酸序列与人胚系基因的比较
为鉴定进行CDR移植的最佳的人的候选序列,已经检索出与224G11VL显示最佳同一性的人胚系基因。为此目的,将224G11VL的核苷酸序列与IMGT数据库中的人胚系基因序列部分进行比对。为优化选择,进行蛋白质序列间的比对以检索更好的同源序列。
这两种互补的方法导致鉴定出两种可能的对于鼠224G11VL CDR的接受的人V序列。核苷酸比对给出的人IGKV3-11*01胚系基因的序列同一性为75.99%,蛋白质序列比对给出的人IGKV4-1*01胚系基因的序列同一性为67.30%。值得注意的是在两种情况下,两个最接近的胚系基因和分析的序列显示出不同的CDR1氨基酸长度(在224G11VL中10个氨基酸;在IGKV3-11*01中6个氨基酸;在IGKV4-1*01中12个氨基酸)。
对于J区,最佳的同源性得分首先从人中获得,人IGKJ3*01显示出的序列同一性为80%。但更高数目的连续相同的核苷酸和更好的氨基酸匹配在与人IGKJ4*02胚系基因的比对中发现(序列同一性为77.14%)。因此,IGKJ4*02胚系基因被选为鼠11E1VL CDR的接受人J区。
比对表示在图18A(V区)和18B(J区)中。
224G11VL的人源化版本
考虑到对于鼠224G11VL CDR的两个可能的接受的人V区,将描述两个224G11VL区的人源化版本。第一个相当于带有更短的CDR1长度(IGKV3-11*01)的人框架(human framework)的最初试验,第二个有更长的CDR1长度(IGKV4-1*01)。
a)基于IGKV3-11*01的224G11VL的人源化版本
下述人源化过程中的步骤在于将选定的胚系基因序列IGKV3-11*01和IGKJ4*02还有鼠224G11VL的CDR连接到这些胚系基因序列的框架上。
如图19A所描述的,224G11VL序列中粗体的残基相当于所发现的224G11VL区和选定的人框架(人FR,即IGKV3-11*01和IGKJ4*02)之间不同的25个氨基酸。
参考(regarding)几个标准,如已知其参与VH/VL界面的、参与抗原结合或CDR结构、鼠和人残基之间的氨基酸类别变化、该残基在可变区的3D结构中的定位,25个不同残基中的3个被鉴定出来进行最后的突变。在它们人的相应部分这三个最重要的限定的残基和突变是鼠M39变为人的L,H40变为A和R84变为G。这些被评为一级的残基以加粗的残基显示在图19A中的仍然是鼠的224G11HZ1VL序列中。
当然,待测的上述的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。
借助于分子模型,其他突变可被鉴定出来。可以提及下述评级为二级的残基,即残基15(L/P)、49(P/A)、67(L/R)、68(E/A)、93(P/S)和99(V/F),在另一个优选的具体实施方式中也可设想在这些残基上进行突变。
当然,上述的将进行最后试验的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。在另一个优选的具体实施方式中,在25个不同氨基酸中所有16个其他评级为三级的残基可以进行重新考虑。
所有上述突变将以分别或根据不同组合进行试验。
图19A表示实施的基于IGKV3-11*01的上述的突变清楚地鉴定了的人源化224G11VL。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的评级。
b)基于IGKV4-1*01的224G11VL的人源化版本
下述人源化过程中的步骤在于连接选定的胚系基因序列IGKV4-1*01和IGKJ4*02和鼠224G11VL的CDR到这些胚系基因序列的框架上。
如图19B所描述的,224G11VL序列中粗体的残基对应于所发现的224G11VL区和选定的人框架(人FR,即IGKV4-1*01和IGKJ4*02)之间不同的22个氨基酸。
参考几个标准,如已知其参与VH/VL界面的、参与抗原结合或CDR结构、鼠和人残基之间的氨基酸类别变化、该残基在可变区的3D结构中的定位,22个不同残基中的4个被鉴定出来进行最后的突变。在它们人的相应部分这四个最重要的限定的残基和突变是:鼠L4变为人的M,M39变为L,H40变为A和R84变为G。这些被评级为一级的残基作为加粗的残基显示在图19B中仍然为鼠的224G11HZ2VL序列中。
当然,待测的上述的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。
借助于分子模型,其他突变可被鉴定出来。可以提及下述评级为二级的残基,即残基25(A/S),66(N/T),67(L/R)和93(P/S),在另一个优选的具体实施方式中也可设想在这些残基上进行突变。
当然,上述的将进行最后试验的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。在另一个优选的具体实施方式中,在22个不同氨基酸中所有14个其他评级为三级的残基可以进行重新考虑。
所有上述的突变将以分别或根据不同组合进行试验。
图19B表示所实施的上述的突变鉴定清楚的基于IGKV4-1*01的人源化224G11VL。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的评级。
II–重链可变区的人源化
224G11VH的核苷酸序列与鼠胚系基因的比较
作为开始步骤,224G11VH的核苷酸序列与IMGT数据库(http://imgt.cines.fr)的鼠胚系基因部分进行比较。
已经鉴定出了鼠IGHV1-18*01、IGHD2-4*01和IGHJ2*01胚系基因,对于V区序列同一性92.70%,对于D区75.00%,和对于J区89.36%。关于获得的同一性,决定直接使用224G11VH序列来查找人同源序列。
这些比对表示在图20A(对于V基因),20B(对于D基因)和20C(对于J基因)。
224G11VH的核苷酸序列与人胚系基因的比较
为了鉴定进行CDR移植最佳的人候选序列,已经检索了表现出与224G11VH最佳同一性的人胚系基因。为此目的,224G11VH的核苷酸序列与IMGT数据库的人胚系基因序列部分进行比对。为优化选择,进行蛋白质序列间的比对以检索更好的同源序列。
这两种互补的方法导致鉴定出相同的对于鼠224G11VH CDR的接受的人IGHV1-2*02V序列,核苷酸水平的序列同一性为75.00%,蛋白质水平为64.30%。
值得注意的是D区严格地属于VH区中的CDR3区。人源化过程基于《CDR移植》(《CDR-grafting》)方式。在这一策略中分析最接近的人D基因是无用的。
对于J区的同源序列的查找鉴定出了人IGHJ4*04胚系基因,序列同一性为78.72%。
因此,选定人IGHV1-2*02V胚系基因和人IGHJ4*01J胚系基因作为对于鼠224G11VH CDR的接受的人序列。
比对表示在图21A(V区)和21B(J区)。
224G11VH的人源化版本
下述人源化过程中的步骤在于连接选定的胚系基因序列IGHV1-2*02和IGHJ4*01和鼠224G11VH的CDR到这些胚系基因序列的框架上。
如图22所描述的,224G11VH序列中粗体的残基相当于所发现的224G11VH区和选定的人框架(人FR,即IGHV1-2*02和IGHJ4*01)之间不同的30个氨基酸。
参考几个标准,如已知其参与VH/VL界面的、参与抗原结合或CDR结构、鼠和人残基之间的氨基酸类别变化、该残基在可变区的3D结构中的定位,30个不同残基中的4个被鉴定出来进行最后的突变。在它们人的相应部分这4个最重要的限定的残基和突变是鼠D51变为人的E,G55变为W,V80变为R和K82变为T。这些被评级为一级的残基作为加粗的残基显示在图22的仍然为鼠的224G11HZVH序列中。
当然,上述提及的待测的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。
借助于分子模型,其他突变可被鉴定出来。可以提及下述评级为二级的残基,即残基25(T/A)、48(E/Q)、49(S/G)、53(I/M)、76(A/V)、78(L/M)和90(D/E),在另一个优选的具体实施方式中也可设想在这些残基上进行突变。
当然,上述的将进行最后试验的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。在另一个优选的具体实施方式中,在30个不同氨基酸中所有19个其他评级为三级的残基可以进行重新考虑。
所有上述突变将以分别或根据不同组合进行试验。
图22表示上述的突变清楚地鉴定的人源化224G11VH。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的评级。
实施例13:通过抗体227H1的CDR移植的人源化过程
I-轻链可变区的人源化
227H1VL的核苷酸序列与鼠胚系基因的比较
作为开始步骤,227H1VL的核苷酸序列与IMGT数据库(http://imgt.cines.fr)的鼠胚系基因部分进行比较。.
已经鉴定出了鼠IGKV3-5*01和IGKJ4*01胚系基因,分别为对于V区序列同一性96.90%,对于J区97.29%。关于获得的同一性,决定直接使用227H1VL序列来查找人同源序列。
这些比对表示在图23A(对于V基因)和23B(对于J基因)。
227H1VL的核苷酸序列与人胚系基因的比较
为了鉴定进行CDR移植最佳的人候选序列,已经检索了表现出与227H1VL最佳同一性的人胚系基因。为此目的,227H1VL的核苷酸序列与IMGT数据库的人胚系基因序列部分进行比对。为优化选择,进行蛋白质序列间的比对以检索更好的同源序列。
这两种互补的方法导致鉴定出两种可能的对于鼠227H1VL CDR的接受的人V序列。核苷酸比对给出的人IGKV3-11*01胚系基因的序列同一性为74.91%,蛋白质序列比对给出的人IGKV4-1*01胚系基因的序列同一性为64.00%。值得注意的是在两种情况下,两个最接近的胚系基因和分析的序列显示出不同的CDR1氨基酸长度(在227H1VL中10个氨基酸;在IGKV3-11*01中6个氨基酸;在IGKV4-1*01中12个氨基酸)。
对于J区,最佳的同源性得分首先从人中获得,人IGKJ3*01显示出的序列同一性为78.38%。但更高数目的连续相同核苷酸和更好的氨基酸匹配在人IGKJ4*02胚系基因的比对中发现(序列同一性为75.68%)。因此IGKJ4*02胚系基因被选为对于鼠227H1VL CDR的接受的人J区。
比对表示在图24A(V区)和24B(J区)。
224G11VL的人源化版本
考虑到对于鼠227H1VL CDR的两个可能的接受的人V区,将描述227H1VL区的两个人源化版本。第一个版本相当于带有更短的CDR1长度(IGKV3-11*01)的人框架(human framework)的最初试验,第二个有更长的CDR1长度(IGKV4-1*01)。
a)基于IGKV3-11*01的227H1VL的人源化版本
下述人源化过程中的步骤在于连接选定的胚系基因序列IGKV3-11*01和IGKJ4*02和鼠227H1VL的CDR到这些胚系基因序列的框架上。
如图25A所描述的,227H1VL序列中粗体的残基对应于所发现的227H1VL区和选定的人框架(人FR,即IGKV3-11*01和IGKJ4*02)之间不同的26个氨基酸。
参考几个标准,如已知其参与VH/VL界面的、参与抗原结合或CDR结构、鼠和人残基之间的氨基酸类别变化、该残基在可变区的3D结构中的定位,26个不同残基中的3个被鉴定出来进行最后的突变。在它们人的相应部分这3个最重要的限定的残基和突变是:鼠I39变为人的L,H40变为A和R84变为G。这些被评级为一级的残基作为加粗的残基显示在图25A的仍然为鼠的227H1HZ1VL序列中。
当然,上述待测残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。
借助于分子模型,其他突变可被鉴定出来。可以提及下述评级为二级的残基,即残基15(L/P)、25(V/A)、49(P/A)、67(L/R)、68(E/A)、93(P/S)和99(S/F),在另一个优选的具体实施方式中也可设想在这些残基上进行突变。
当然,上述的将进行最后试验的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。在另一个优选的具体实施方式中,在25个不同氨基酸中所有16个其他评级为三级的残基可以进行重新考虑。
所有上述突变将分别或根据不同组合进行试验。
图25A表示所实施的基于IGKV3-11*01的上述突变鉴定清楚的人源化227H1VL。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的评级。
b)基于IGKV4-1*01的227H1VL的人源化版本
下述人源化过程中的步骤在于连接选定的胚系基因序列IGKV4-1*01和IGKJ4*02和鼠227H1VL的CDR到这些胚系基因序列的框架上。
如图25B所描述的,227H1VL序列中粗体的残基对应于所发现的227H1VL区和选定的人框架(人FR,即IGKV4-1*01和IGKJ4*02)之间不同的24个氨基酸。
参考几个标准,如已知其参与VH/VL界面的、参与抗原结合或CDR结构、鼠和人残基之间的氨基酸类别变化、该残基在可变区的3D结构中的定位,24个不同残基中的4个被鉴定出来进行最后的突变。在它们人的相应部分这4个最重要的限定的残基和突变是:鼠L4变为人的M,I39变为L,H40变为A和R84变为G。这些被评级为一级的残基作为加粗的残基显示在图25B中仍然为鼠的227H1HZ2VL序列中。
当然,上述的将进行试验的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。
借助于分子模型,其他突变可被鉴定出来。可以提及下述评级为二级的残基,即残基25(A/S),66(N/T),67(L/R)和93(P/S),在另一个优选的具体实施方式中也可设想在这些残基上进行突变。
当然,上述的将进行最后试验的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。在另一个优选的具体实施方式中,在22个不同氨基酸中所有16个其他评级为三级的残基可以进行重新考虑。
所有上述突变将分别或根据不同组合进行试验。
图25B表示所实施的基于IGKV4-1*01的上述的突变鉴定清楚的人源化227H1VL。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的评级。
II–重链可变区的人源化
227H1VH的核苷酸序列与鼠胚系基因的比较
作为开始步骤,227H1VH的核苷酸序列与IMGT数据库(http://imgt.cines.fr)的鼠胚系基因部分进行比较。
已经鉴定出了鼠IGHV1-18*01、IGHD1-1*02和IGHJ2*01胚系基因,分别是对于V区序列同一性92.70%,对于D区63.63%,和对于J区91.48%。关于获得的同一性,决定直接使用227H1VH序列来查找人同源序列。
这些比对表示在图26A(对于V基因),26B(对于D基因)和26C(对于J基因)中。
227H1VH的核苷酸序列与人胚系基因的比较
为了鉴定进行CDR移植最佳的人候选序列,已经检索了表现出与224G11VH最佳同一性的人胚系基因。为此目的,227H1VH的核苷酸序列与IMGT数据库的人胚系基因序列部分进行比对。从而鉴定出对于鼠224G11VH CDR的接受的人IGHV1-2*02V序列,序列同一性为72.92%。
值得注意的是D区严格地属于VH区中的CDR3区。人源化过程基于《CDR移植》方法。在这一策略中,分析最接近的人D基因是无用的。
对于J区的同源序列的查找鉴定出了人IGHJ4*04胚系基因,序列同一性为78.72%。
因此,选定人IGHV1-2*02V胚系基因和人IGHJ4*01J胚系基因作为对于鼠227H1VH CDR的接受的人序列。
比对表示在图27A(V区)和27B(J区)中。
为优化选择,本领域技术人员也可以在蛋白质序列间进行比对以帮助其进行选择。
227H1VH的人源化版本
下述人源化过程中的步骤在于连接选定的胚系基因序列IGHV1-2*02和IGHJ4*01和鼠227H1VH的CDR到这些胚系基因序列的框架上。
如图28所描述的,227H1VH序列中粗体的残基相当于所发现的227H1VH区和选定的人框架(人FR,即IGHV1-2*02和IGHJ4*01)之间不同的32个氨基酸。
参考几个标准,如已知其参与VH/VL界面的、参与抗原结合或CDR结构、鼠和人残基之间的氨基酸类别变化、该残基在可变区的3D结构中的定位,32个不同残基中的6个被鉴定出来进行最后的突变。在它们人的相应部分这6个最重要的限定的残基和突变是鼠L39变为人的M,N40变为H,L55变为W,T66变为N,V80变为R和K82变为T。这些被评级为一级的残基作为加粗的残基显示在图28的仍然为鼠的227H1HZVH序列中。
当然,上述的将进行试验的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。
借助于分子模型,其他突变可被鉴定出来。可以提及下述评级为二级的残基,即残基48(K/Q)、49(T/G)、53(I/M)、76(A/V)和78(L/M),在另一个优选的具体实施方式中也可设想在这些残基上进行突变。
当然,上述的将进行最后试验的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。在另一个优选的具体实施方式中,在30个不同氨基酸中所有21个其他评级为三级的残基可以进行重新考虑。
所有上述突变将分别或根据不同组合进行试验。
图28表示上述的突变鉴定清楚的人源化227H1VH。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的评级。
实施例14:通过抗体223C4的CDR移植的人源化过程
I-轻链可变区的人源化
223C4VL的核苷酸序列与鼠胚系基因的比较
作为开始步骤,223C4VL的核苷酸序列与IMGT数据库(http://imgt.cines.fr)的鼠胚系基因部分进行比较。.
已经鉴定出了鼠IGKV12-46*01和IGKJ2*01胚系基因,分别是对于V区序列同一性99.64%,对于J区94.59%。关于获得的同一性,决定直接使用223C4VL序列来查找人同源序列。
这些比对表示在图29A(对于V基因)和29B(对于J基因)。
223C4VL的核苷酸序列与人胚系基因的比较
为了鉴定进行CDR移植最佳的人候选序列,已经检索了表现出与223C4VL最佳同一性的人胚系基因。为此目的,223C4VL的核苷酸序列与IMGT数据库的人胚系基因序列部分进行比对。
已经鉴定出了人IGKV1-NL1*01和IGKJ2*01胚系基因,对于V区序列同一性78.49%,对于J区81.08%。因此,选定人IGKV1-NL1*01胚系基因(V区)和IGKJ2*01胚系基因(J区)作为对于鼠223C4VL CDR的接受的人序列。
比对表示在图30A(V区)和30B(J区)。
为了优化选择,本领域技术人员也能进行蛋白质序列之间的比对以帮助其选择。
223C4VL的人源化版本
下述人源化过程中的步骤在于连接选定的胚系基因序列IGKV1-NL1*01和IGKJ4*02和鼠223C4VL的CDR到这些胚系基因序列的框架上。
在这一阶段,可开发223C4鼠Fv区的分子模型,并将其用于根据它们在保持该分子三维结构或在抗原结合位点和功能中的作用选择要保留的鼠的残基。更具体地,已经鉴定出9个将要最后突变的残基。
在第一步中,将测定包含在CDR锚定或结构中的残基。这些残基为残基66(R/N)和残基68(E/V)。
在第二步中,也将测定暴露于溶剂(solvant)中并因此可能具有免疫原性的残基。它们是残基49(A/S)、51(K/Q)、69(S/D)、86(D/Q)和92(S/N)。
然后,在第三步中,也可突变包含在可变区的结构/折叠中的残基。这些残基是46(P/Q)和残基96(P/S)。
当然,上述待测残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。
借助于分子模型,其他突变可被鉴定出来。可以提及下述残基,即残基9(S/A)、13(A/V)、17(D/E)、18(R/T)、54(L/V)、88(T/S)、90(T/K)、100(A/G)和101(T/S),在另一个优选的具体实施方式中也可设想在这些残基上进行突变。
所有上述突变将分别或根据不同组合进行试验。
图31表示上述的突变鉴定清楚的人源化223C4VL。每个建议的突变下的数字对应于将要进行的所述的突变的评级。
II–重链可变区的人源化
223C4VH的核苷酸序列与鼠胚系基因的比较
作为开始步骤,223C4VH的核苷酸序列与IMGT数据库(http://imgt.cines.fr)的鼠胚系基因部分进行比较。
已经鉴定出了鼠IGHV1-18*01、IGHD6-3*01和IGHJ6*01胚系基因,分别是对于V区序列同一性98.95%,对于D区72.72%,和对于J区98.11%。关于获得的同一性,决定直接使用223C4VH序列来查找人的同源序列。
这些比对表示在图32A(对于V基因),32B(对于D基因)和32C(对于J基因)中。
223C4VH的核苷酸序列与人胚系基因的比较
为了鉴定进行CDR移植的最佳的人候选序列,已经检索了表现出与223C4VH最佳同一性的人胚系基因。为此目的,223C4VH的核苷酸序列与IMGT数据库的人胚系基因序列部分进行比对。
鉴定出人IGHV1-2*02、IGHD1-26*01和IGHJ6*01胚系基因,分别是对于V区序列同一性是76.38%,对于D区是75.00%,和对于J区是77.41%。因此,选定人IGHV1-2*02胚系基因(V区)和人IGHJ6*01胚系基因(J区)作为对于鼠223C4VH CDR的接受的人序列。
比对表示在图33A(V区),33B(对于D区)和33C(J区)。
为优化选择,本领域技术人员也可以在蛋白质序列间进行比对来帮助其进行选择。
223C4VH的人源化版本
人源化过程中的下述步骤在于连接选定的胚系基因序列IGHV1-2*02和IGHJ6*01和鼠223C4VH的CDR到这些胚系基因序列的框架上。
在该过程的这一阶段,可开发223C4鼠Fv区的分子模型,并将其用于根据它们在保持该分子三维结构或在抗原结合位点和功能中的作用选择要保留的鼠的残基。更具体地,已经鉴定出14个将要最后突变的残基。
在第一步中,将测定包含在CDR锚定或结构中的残基。这些残基为残基40(H/D)、45(A/S)、55(W/D)、66(N/I)和67(Y/F)。
在第二步中,也将测定暴露于溶剂(solvant)中并因此可能具有免疫原性的残基。它们是残基1(Q/E)、3(Q/L)、5(V/Q)、48(Q/M)和80(R/V)。
然后,在第三步中,也可突变包含在可变区的结构/折叠中的残基。它们是残基9(A/P)、13(K/V)、22(S/P)和46(P/H)。
当然,上述待测残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。
借助于分子模型,其他突变可被鉴定出来。可以提及下述残基,即残基12(V/L)、21(V/I)、43(R/K)、49(G/S)、53(M/I)、68(A/N)、72(Q/K)、75(R/K)、76(V/A)、78(M/L)、82(T/K)、84(I/S)、92(S/R)、93(R/S)、95(R/T)和97(D/E),在另一个优选的具体实施方式中也可设想在这些残基上进行突变。
所有上述突变将分别或根据不同组合进行试验。
图34表示上述的突变鉴定清楚的人源化223C4VH。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的评级。
成功的化学治疗方法部分依赖于细胞对凋亡诱导剂的反应和细胞内促凋亡和抗凋亡途径之间的平衡。文献中记载了激活的c-Met对细胞存活的保护性效应。该效应主要来自于由PI3-K介导的信号传导导致的抗凋亡的Bcl-xl和Bcl-2蛋白质的表达增加,其反过来又抑制线粒体依赖性的凋亡(半胱天冬酶(caspase)9)。实际上,可以想象对凋亡过程具有显著调节作用的HGF/c-Met系统也能影响恶性肿瘤细胞的化学敏感性。这一假说已经通过进行试验,是用于肺癌治疗的市场化的化学治疗剂(Aapro et al,Crit.Rev.Oncol.Hematol.2001,40:251-263;Curran et al,Drugs Aging.2002,19:695-697)。异种移植物NCI-H441NSCLC模型根据以前的描述使用,这一细胞系对诺维本(Kraus-Berthier et al.,Clin.Cancer Res.,2000;6:297-304)和靶向c-Met的治疗(Zou H.T.et al.,Cancer Res.2007,67:4408-4417)都敏感。
简而言之,来自ATCC的NCI-H441细胞在RPMI1640培养基,10%FCS和1%L-谷氨酰胺中进行常规培养。在植入前两天,传代细胞以使它们处于指数生长期。于PBS中的一千万的NCI-H441细胞植入到7周龄的Swiss裸鼠体内。植入后三天,测量肿瘤,并将肿瘤大小具有可比性动物的分成4组,每组6只小鼠。i.p.处理小鼠,加载剂量为2mg的224G11/小鼠,然后以1mg抗体/小鼠,一周两次,43天。9G4Mab用作同种型对照。
i.p.注射给予,剂量为8mg/kg,在细胞注射后第5、12、19天给予。对于224G11和都使用的联合治疗,这两种化合物分别给予。在本实验中,两种化合物以最佳剂量使用。每周两次测量肿瘤体积,并通过公式:p/6×长×宽×高来计算。
实施例16:C-Met抑制剂和血管发生
除了其在调节各种肿瘤细胞功能中的直接作用,c-met的激活还参与了肿瘤血管发生。内皮细胞表达c-Met,且HGF刺激内皮细胞的生长,浸润和移动(NakamuraY.et al.,Biochem.Biophys.Res.,Commun.1995,215:483-488;Bussolino F.et al.,J.Cell Biol.1992,119:629-641)。已证明,HGF/c-Met在血管内皮细胞中生长,浸润和移动的协同调节作用导致体外3D毛细管内皮细胞管腔样结构的形成(Rosen E.M.et al.,Supplementum to Experientia1991,59:76-88)。
为确定抗c-Met Mab对HGF诱导的血管发生的可能影响,进行的了两组实验,其包括i)Mab对HUVEC增殖的影响的评价,和ii)Mab对HUVEC管腔样结构形成的试验。
对于增殖实验,7500个HUVEC被平铺在事先用层粘连蛋白包被的96孔板的每个孔中。细胞在加入了0.5%FBS和肝素的EMB-2分析培养基中生长24小时。然后,加入待测Mab(0.15至40μg/ml)1小时,接着加入20ng/ml的HGF。再过24小时后,细胞用0.5μCi的[3H]胸腺嘧啶进行脉冲。掺入[3H]的胸腺嘧啶的量值通过液体闪烁计数进行定量。在这个实验中,9G4Mab是一个被作为IgG1同种型对照使用的无关抗体。
在图36中以原始数据表示的结果证明,正如所预期的,HGF是HUVEC细胞生长的有力诱导剂。无论测定的剂量如何,在缺乏HGF时评价的抗体并不显示对于HUVEC的任何激动剂的增殖性活性。在HGF存在时,观察到11E1和224G11Mab均具有显著的剂量依赖性抑制作用。
为了评价HUVEC管腔样结构的形成,将与待测抗体孵育30分钟的25000个细胞被平铺在用基质胶包被的48孔板中。然后加入50ng/mlHGF,并将培养板在37℃孵育。然后收集培养基,并在用显微镜观察前15分钟加入5μM CMFDA。
在图37中显示的结果证明,正如所预期的,HGF诱导显著的管腔样结构形成。作为IgG1同种型对照引入的9G4抗体对HGF诱导的管腔样结构形成没有任何效应,然而11E1和224G11均显著抑制管腔样结构的形成。
实施例17:通过抗体11E1的CDR移植的人源化过程
I-轻链可变区的人源化
11E1VL的核苷酸序列与鼠胚系基因的比较
作为开始步骤,11E1VL的核苷酸序列与IMGT数据库(http://imgt.cines.fr)的鼠胚系基因部分进行比较。
已经鉴定出了鼠IGKV4-79*01和IGKJ4*01胚系基因,分别是对于V区序列同一性98.58%,对于J区97.22%。关于获得的同一性,决定直接使用11E1VL序列来查找人同源序列。
这些比对表示在图38A(对于V基因)和38B(对于J基因)。
11E1VL的核苷酸序列与人胚系基因的比较
为了鉴定进行CDR移植最佳的人候选序列,已经检索了表现出与11E1VL最佳同一性的人胚系基因。为此目的,11E1VL的核苷酸序列与IMGT数据库的人胚系基因序列部分进行比对。
已经鉴定出了人IGKV3-7*02和IGKV3D-7*01,对于V区序列同一性,两条胚系基因都是69.86%。IGKV3-7*02人胚系基因在IMGT数据库中为“ORF”,其意思是这一序列在人基因组中发现,但可能存在某些重组问题导致产生来自于天然抗体的无功能的IGKV3-7*02。因此,选定IGKV3D-7*01胚系基因作为鼠11E1VLCDR的接受的人V区。
对于J区,最佳的同源性得分首先从人中获得,人IGKJ3*01显示出的序列同一性为78.38%。但在人IGKJ4*02胚系基因的比对中发现更高数目的连续相同核苷酸和更好的氨基酸匹配(序列同一性为75.68%)。因此IGKJ4*02胚系基因被选为鼠11E1VL CDR的接受的人J区。
比对表示在图39A(V区)和39B(J区)。
为优化选择,本领域技术人员也可以在蛋白质序列间进行比对来帮助其进行选择。
11E1VL的人源化版本
下述人源化过程中的步骤在于连接选定的胚系基因序列IGKV3D-7*01和IGKJ4*02和鼠11E1VL的CDR到这些胚系基因序列的框架上。
如图40所描述的,11E1VL序列中粗体的残基对应于所发现的11E1VL区和选定的人框架(人FR,即IGKV3D-7*01和IGKJ4*02)之间不同的30个氨基酸。
参考几个标准,如已知其参与VH/VL界面的、参与抗原结合或CDR结构、鼠和人残基之间的氨基酸类别变化、该残基在可变区的3D结构中的定位,30个不同残基中的4个被鉴定出来进行最后的突变。在它们人的相应部分这4个最重要的限定的残基和突变是:鼠L4变为人的M,Y40变为S,Y87变为F和T96变为P。这些被评级为一级的残基作为加粗的残基显示在图40的仍然为鼠的11E1HZVL序列中。
当然,上述的将进行最后试验的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。
借助于分子模型,其他突变可被鉴定出来。可以提及下述评级为二级的残基,即残基24(S/R)、53(W/L)、66(I/T)、67(L/R)、86(S/D)、95(Q/E)、99(A/F)或121(E/D),在另一个优选的具体实施方式中也可设想在这些残基上进行突变。
当然,上述的将进行最后试验的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。在另一个优选的具体实施方式中,在30个不同氨基酸中所有18个其他评级为三级的残基可以进行重新考虑。
所有上述突变将分别或根据不同组合进行试验。
图40表示所实施的上述的突变鉴定清楚的人源化11E1VL。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的评级。
II–重链可变区的人源化
11E1VH的核苷酸序列与鼠胚系基因的比较
作为开始步骤,11E1VH的核苷酸序列与IMGT数据库(http://imgt.cines.fr)的鼠胚系基因部分进行比较。
已经鉴定出了鼠IGHV1-7*01、IGHD4-l*01和IGHJ3*01胚系基因,分别是对于V区序列同一性94.10%,对于D区66.67%,和对于J区100%。关于获得的同一性,决定直接使用11E1VH序列来查找人同源序列。
这些比对表示在图41A(对于V基因),41B(对于D基因)和41C(对于J基因)。
11E1VH的核苷酸序列与人胚系基因的比较
为了鉴定进行CDR移植最佳的人候选序列,已经检索了表现出与11E1VH最佳同一性的人胚系基因。为此目的,11E1VH的核苷酸序列与IMGT数据库的人胚系基因序列部分进行比对。为优化选择,进行蛋白质序列间的比对以检索更好的同源序列。
这两种互补的方法导致鉴定出两种可能的对于鼠11E1VH CDR的接受的人V序列。核苷酸比对给出的人IGHV1-2*02胚系基因的序列同一性为75.69%,而蛋白质序列比对给出的人IGHV1-46*01胚系基因的序列同一性为71.10%。
值得注意的是,D区严格地属于VH区中的CDR3区。人源化过程基于《CDR移植》(《CDR-grafting》)方法。在这一策略中分析最接近的人D基因是无用的。
对于J区的同源序列的查找鉴定出了人IGHJ4*03胚系基因,其序列同一性为80.85%。
考虑到整体的相似性和序列比对,因此选定人IGHV1-46*01V胚系基因和人IGHJ4*03J胚系基因作为对于鼠11E1VH CDR的接受的人序列。
比对表示在图42A(V区)和42B(J区)。
11E1VH的人源化版本
下述人源化过程中的步骤在于连接选定的胚系基因序列IGHV1-46*01和IGHJ4*03和鼠11E1VH的CDR到这些胚系基因序列的框架上。
如图43所描述的,11E1VH序列中粗体的残基对应于所发现的11E1VH区和选定的人框架(人FR,即IGHV1-46*01和IGHJ4*03)之间不同的26个氨基酸。
参考几个标准,如已知其参与VH/VL界面的、参与抗原结合或CDR结构、鼠和人残基之间的氨基酸类别变化、该残基在可变区的3D结构中的定位,26个不同残基中的5个被鉴定出来进行最后的突变。在它们人的相应部分这5个最重要的限定的残基和突变是鼠N40变为人的H,Y55变为I,D66变为S,A80变为R和K82变为T。这些被评级为一级的残基作为加粗的残基显示在图43的仍然为鼠的11E1HZVH序列中。
当然,上述的将进行试验的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。
借助于分子模型,其他突变可被鉴定出来。可以提及下述评级为二级的残基,即残基53(I/M)、71(L/F)、76(A/V)、78(L/M)和87(A/V),在另一个优选的具体实施方式中也可设想在这些残基上进行突变。
当然,上述的将进行最后试验的残基不是限制性的,但必须考虑为优选的突变。在另一个优选的具体实施方式中,在26个不同氨基酸中所有16个其他评级为三级的残基可以进行重新考虑。
所有上述突变将分别或根据不同组合进行试验。
图43表示所实施的上述的突变鉴定清楚的的人源化11E1VH。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的评级。
实施例18:纯化的Mab对c-met磷酸化的效应
在实施例3中,抗c-Met Mab对磷酸化的效应用每个待评价的杂交瘤的剂量上清进行评价。再用纯化的11E1和224G11Mab进行了试验,其中Mab以30μg/ml(200nM)的终浓度或0.0015至30μg/ml(0.01-200nM)的剂量范围进行评价以便确定每个抗体的IC50。所用的方案与实施例3中所描述的相同。
3个独立实验的结果显示在图44中,并证明当单独加入到A549细胞中,曾经(once)纯化的11E1和224G11显示没有激动剂效应,而在HGF存在时,显示出分别为87%和75%拮抗剂效应。正如所预期的,作为激动剂阳性对照而引入的5D5Mab当单独加入时显示显著的(58%)激动剂效应,而在HGF存在时只有中等拮抗剂效应(39%)。关于EC50的计算,11E1和224G11的IC50都是纳摩尔级的。
来自ATCC的NCI-H441细胞在RPMI1640培养基,10%FCS,1%L-谷氨酰胺中进行常规培养。在植入前两天传代细胞,使它们在植入时处于指数生长期。一千万的NCI-H441细胞植入到无胸腺的裸鼠中。植入后5天,测量肿瘤,并将肿瘤大小具有可比性的动物分成6只小鼠的组。i.p.处理小鼠,载药剂量为2mg的224G11Mab/小鼠然后使用1mg抗体/小鼠,一周两次,直至38天,或以8mg/kg注射3次(D5、D12、D19)。也包括给予联合处理的第三组。i.p.注射给予。每周两次测量肿瘤体积,并通过公式:π/6×长×宽×高来计算,在 处理期间,每天监测动物重量。在每次测量时间使用t检验或Mann-Whitney检验进行统计学分析。在这个实验中,单一方式处理组的平均肿瘤体积在首次注射后的41天对于224G11、以及+224G11分别下降了72%、76%和99.8%。在第41天,与单一疗法处理相比,联合疗法显著地改善肿瘤生长(在第41天,与单独使用相比p≤0.041,并且与单独使用224G11相比p≤0.002),在联合治疗组6只小鼠中的4只无肿瘤。结果表示在图45中。
在处理结束的50天(D88)后证实了这些结果,其中接受联合治疗的66%的小鼠仍然没有肿瘤。
实施例20:在NCI-H441异种移植物模型中体内联合使用224G11和多柔比星
来自ATCC的NCI-H441细胞在RPMI1640培养基,10%FCS,1%L-谷氨酰胺中进行常规培养。在植入前两天传代细胞,使其在植入时处于指数生长期。一千万的NCI-H441细胞植入到无胸腺的裸鼠中。植入后5天,测量肿瘤,并将肿瘤大小具有可比性的动物分组,每组6只小鼠。i.p.处理小鼠,载药剂量为2mg的224G11Mab/小鼠然后使用1mg抗体/小鼠,一周两次,或以5mg/kg4次注射多柔比星(D5,D12,D19,D26)。也包括给予联合治疗的第三组。多柔比星i.p.注射给予。每周两次测量肿瘤体积并通过公式:π/6×长×宽×高来计算,并在多柔比星处理期间,每天监测动物重量。在每次测量的时间使用t检验或Mann-Whitney检验进行统计学分析。与对照组相比单一疗法和联合治疗均显示显著的抗肿瘤活性(从D11至D39p≤0.002)。结果表示在图46中。
在D11和D39期间与单一方式治疗相比,联合治疗还显示了显著的抗肿瘤生长活性,这表明联合使用抗c-Met与多柔比星是有益处的。
实施例21:在NCI-H441异种移植物模型中体内联合使用224G11和多西他赛
来自ATCC的NCI-H441细胞在RPMI1640培养基,10%FCS,1%L-谷氨酰胺中进行常规培养。在植入前两天传代细胞,使其在植入时处于指数生长期。九百万的NCI-H441细胞植入到无胸腺的裸鼠中。植入后5天,测量肿瘤,将肿瘤大小具有可比性的动物分组,每组6只小鼠。i.p.处理鼠,载药剂量为2mg的224G11Mab/小鼠,然后使用1mg抗体/小鼠,一周两次,或以7.5mg/kg注射4次多西他赛(D5,D12,D19,D26)。也包括给予联合治疗的第三组。多西他赛i.p.注射给予。每周两次测量肿瘤体积并通过公式:π/6×长×宽×高来计算,在多西他赛处理期间,每天监测动物重量。在每次测量的时间使用t检验或Mann-Whitney检验进行统计学分析。与对照组相比,单一疗法和联合治疗均显示显著的抗肿瘤活性(从D11至D35p≤0.002)。结果表示在图47中。
在D18和D35期间,与单一方式治疗相比,联合治疗还显示了显著的抗肿瘤生长活性,这表明联合使用抗c-Met和多西他赛中是有益处的。
实施例22:在U87MG异种移植物模型中体内联合使用224G11和替莫唑胺
来自ATCC的U87-MG细胞在DMEM培养基,10%FCS,1%L-谷氨酰胺中进行常规培养。在植入前两天传代细胞,使其在植入时处于指数生长期。五百万的U87-MG细胞植入到无胸腺的裸鼠中。植入后十九天,测量肿瘤并将肿瘤大小具有可比性的动物分成6只鼠的组。i.p.处理鼠,载药剂量为2mg的224G11Mab/小鼠,然后使用1mg抗体/小鼠,一周两次,或以5mg/kg注射3次替莫唑胺(D19,D26,D33)。也包括给予联合治疗的第三组。替莫唑胺i.p.注射给予。每周两次测量肿瘤体积并通过公式:π/6×长×宽×高来计算,在替莫唑胺处理期间,每天监测动物重量。在每次测量的时间使用t检验或Mann-Whitney检验进行统计学分析。与对照组相比,单一疗法和联合治疗均显示显著的抗肿瘤活性(从D22至D32p≤0.002(其中对照小鼠由于伦理的原因实施安乐死))。结果表示在图48中。
与单一方式治疗相比,联合治疗也显示了显著的抗肿瘤生长活性(P≤0.002,从22天至43天(其中对照小鼠由于伦理的原因实施安乐死)),所述的单一方式治疗是单独使用替莫唑胺,和从29天至53天(治疗的最后一天)单独使用224G11。总之,这些数据表明,联合使用抗c-Met和替莫唑胺处理是有益处的。
实施例23:球状体形成
正如已经在实施例9中所描述的其他Mab,我们评价了224G11Mab在U87-MG球状体模型中抑制体外肿瘤生长的能力。出于此目的,用胰蛋白酶-EDTA分离单层生长的U-87MG细胞,并使其在完全细胞培养基中重悬。通过在DMEM-2.5%FCS中将625个细胞接种到96孔板圆形底部的单一孔中启动球形体的形成。为防止细胞粘附到基质上,培养板用于95%乙醇中的聚甲基丙烯酸羟乙基酯(polyHEMA)进行预包被,并使其在室温下空气干燥。培养板在37℃,5%CO2增湿(humidified)的孵箱中在标准的细胞培养条件下孵育。在球形体培养的4和10天后加入纯化的单克隆抗体(10μg/ml)。将球形体培养17天。然后,用axiovision软件的自动测量模块通过测量球形体的面积监测球形体的生长。面积以μm2表达。每种条件评价8-16个球形体。在培养10天后和培养17天后加入抗体前,测量球形体的大小。
在这些条件下,获得同种的球形体,并且在加入抗体前观察到无统计学差异(图49A)。
正如在图49B-49D所示的,同种型对照,在培养10或17天后9G4并不影响球形体的生长。虽然加入5D5对球形体大小没有主要的影响,但是加入224G11和11E1显著地抑制肿瘤生长。
实施例24:在磷酸化-c-Met测定中,224G11的嵌合的和人源化形式的体外活性
在功能测定中,为了比较鼠、嵌合和人源化形式的体外效能,如在实施例3中所描述的,来自224G11杂交瘤,和HEK293转染的细胞的培养上清给药(dose)和试验。如已经在图6B所描述的,总结在图50中的数据显示了未纯化鼠抗体的预期结果。嵌合的和人源化的未纯化抗体在单独加入时(图50A)或在HGF存在时孵育(图50B)时都显示了可比较的活性。
实施例25:通过Biacore分析确定抗c-Met抗体的亲和常数(KD)
纯化的11E1和224G11抗体的结合亲和力通过BIAcore X进行研究,其中将重组的与人IgG1Fc区(R&D Systems)融合的c-Met-胞外区(ECD)用作抗原(MW=129kDa)。由于c-Met-Fc融合蛋白和抗体都是二价化合物,因此Mab11E1和224G11的Fab片段(MW=50kDa)通过木瓜蛋白酶剪切产生,纯化和在这个测定中使用以避免影响亲和力参数。对于这个测定,将抗-组氨酸标签捕获抗体包被在CM5传感器芯片上。电泳缓冲液是HBS-EP,流速是30μl/min,并且试验在25℃进行。可溶的c-Met(ECD_M1)2-Fc-(HHHHHH)2抗原在传感器芯片上被捕获(大约270RU),并将待测抗体在溶液中被用作被分析物。传感器芯片的再生使用甘氨酸,HCl pH1.5缓冲液在两个流动池上放置半分钟。
图51显示了这个分析的原理。产生的动力参数被总结在下面的表4中。它们表明11El和224G11抗c-Met抗体都以具有可比性的大约40pM范围的亲和力结合重组的c-Met-Fc融合蛋白。
表4
实施例26:224G11的MDA-MB-231与作为人HGF来源的MRC5细胞共移植的无胸腺裸鼠的体内活性
来自ATCC的MDA-MB-213和MRC5细胞均在DMEM培养基,10%FCS,1%L-谷氨酰胺中进行培养。在植入前两天传代细胞,使其在植入时处于指数生长期。五百万的MDA-MB-231细胞和500000MRC5细胞经s.c.共注射到无胸腺的裸鼠中。植入后十二天,测量肿瘤,将肿瘤大小具有可比性动物分组,每组6只小鼠。i.p.处理小鼠,载药剂量为2mg的224G11Mab/小鼠,然后使用1mg抗体/小鼠,一周两次。每周两次测量肿瘤体积并通过公式:π/6×长×宽×高来计算。
描述在图52中的结果显示,与一组对照组相比,用224G11处理的小鼠在中位肿瘤生长方面具有显著性差异。
实施例27:抗体227H1、11E1和224G11人源化的补充成分
一般程序
抗c-Met抗体的人源化,考虑每个可变区的分析的氨基酸,每条链独立并依次进行。对人源化过程评价的第一个尝试是基于ELISA的对重组Fc-cMet的结合测定;人源化抗体的结合活性与重组嵌合抗体相比较。在第二个尝试中,评价抗c-Met抗体取代Fc-cMet结合至塑料包被的重组HGF上的能力;这一竞争性测定允许直接比较鼠的、嵌合的和人源化版本的抗c-Met抗体。
图53和54示例性说明了227H1、11E1和224G11鼠单克隆抗体的典型的抗c-Met结合活性。
图53显示,检测的纯化的鼠抗体的抗c-Met直接结合活性。在这一测定中,鼠单克隆抗c-Met抗体显示不同但仍然是剂量依赖性的抗c-Met结合活性。
图54显示,纯化的鼠抗体的HGF-cMet结合竞争性活性。竞争性测定显示,这些抗c-Met单克隆抗体间可靠的差异,对于11E1单克隆抗体为中度不完全但可靠的竞争性活性,而鼠224G11和227H1表现出相似的竞争性活性模式,其在高抗体浓度下有100%最大HGF结合取代。224G11单克隆抗体表现出最佳的IC50值。
值得注意的是,鼠抗体的直接结合活性不反应它们内在的HGF结合竞争性属性。
使用这两个测定来表征鼠抗c-Met抗体的重组嵌合和人源化版本。为此目的,简而言之,将抗cMet可变区,无论是鼠的还是人源化的,克隆到LONZA'SpCONplus表达载体系列,并使重组的IgG1/κ来源的抗体在CHO细胞中表达。浓缩表达培养物上清,并用PBS广泛透析,并然后调整为用于表达的抗体浓度的剂量,并直接用于评定相应的抗c-Met结合活性。对直接结合和HGF竞争性测定都进行评定,以更好的表征重组嵌合的或人源化的版本。
实施例27-1:227H1重链可变区的人源化
为了鉴定进行CDR移植最佳的人候选序列,已经检索了表现出与227H1VH最佳同一性的人胚系基因。在IMGT数据库的帮助下,选定人IGHV1-2*02V胚系基因和人IGHJ4*01J胚系基因作为对于鼠227H1VH CDR的接受的人序列。
图55表示鼠227H1VH区与选定的人框架的氨基酸比对。在人FR条带中,仅描述了所发现的与227H1鼠VH区不同的氨基酸。HZ3VH,HZ2VH和HZ1VH行相当于所实施的227H1VH区的人源化版本,上述的(“变化位于”行)突变清楚地鉴定出来。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的评级。
在第一个系列的实验中,我们构建和分析了当与227H1嵌合轻链联合表达时,227H1鼠VH区的三个第一人源化版本的抗c-Met的结合活性。抗c-Met直接结合测定获得的结果显示在图56中。在这一实验中,没有观察到所试验的227H1来源的嵌合或部分人源化的重组抗体结合能力的差异。在此,发现32个氨基酸中26个在鼠227H1VH区和选定的人框架中是不同的,并对它们进行分析发现当与嵌合的轻链联合时,227H1人源化VH区的抗c-Met结合活性与它们无关。
结合227H1VH区的HZ1VH的人源化版本中最后六个鼠残基的位点特异性突变分析,我们构建了原始的HZ4VH的“完全IMGT人源化的”版本,并测定其抗c-Met结合属性。直接结合测定的结果在图57中给出,HGF结合竞争性测定的结果在图58中给出。值得注意的是重组嵌合和人源化的227H1版本都显示出比亲本(parental)鼠抗体更好的竞争活性。
然而,考虑到关于“完全IMGT”人源化的227H1VH区的抗c-Met结合属性所获得的实验数据,选定图59中描述的所得到的氨基酸序列,并进行生物信息学分析,来评价所谓的227H1-HZ VH人源化的可变区的“人化”(”humaness”)水平。
为此目的,使用IMGT工具对框架序列和人数据库进行简单比较。考虑到在这一过程中我们达到的人源化水平,89个分析的相当于框架的残基中,89个被发现有可靠的人来源。仅发现CDR的残基有差异,如果是这样,与相应的人胚系基因有差异,并明显地是在高变位点。基于IMGT编码系统和同源性分析工具,我们首次完全人源化了鼠源抗体的可变区。
实施例27-2:11E1单克隆抗体的人源化
I-11E1重链可变区的人源化
为了鉴定进行CDR移植最佳的人候选序列,已经检索了表现出与11E1VH鼠序列最佳同一性的人胚系基因。在IMGT数据库的帮助下,选定人IGHV1-46*01V胚系基因和人IGHJ4*03J胚系基因作为对于鼠11E1VH CDR的接受的人序列。
图60表示鼠11E1VH区与选定的人框架的氨基酸比对。在人FR条带中,仅描述了所发现的与11E1鼠VH区不同的氨基酸。HZ VH3,HZ VH2和HZ VH1行对应于所实施的11E1VH区的人源化版本,上述的(“变化位于”行)突变清楚地鉴定出来。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的评级。
在第一个系列的实验中,我们构建和分析了当与11E1嵌合轻链联合表达时,11E1鼠VH区的三个第一人源化版本。抗c-Met直接结合测定获得的结果显示在图61中。在这一实验中,观察到所试验的11E1来源的嵌合或部分人源化的重组抗体的相似的结合能力。在此,发现24个氨基酸中的19个在鼠11E1VH区和选定的人框架中是不同的,对它们进行分析发现当与嵌合的轻链联合时,11E1人源化VH区的抗c-Met结合活性与它们无关。
II–11E1轻链可变区的人源化
为了鉴定进行CDR移植最佳的人候选序列,已经检索了表现出与11E1VL鼠序列最佳同一性的人胚系基因。在IMGT数据库的帮助下,选定人IGKV3D-7*01V胚系基因和人IGKJ4*01J胚系基因作为对于鼠11E1VL CDR的接受的人序列。
图62表示鼠11E1VL区与选定的人框架的氨基酸比对。在人FR条带中,仅描述了所发现的与11E1鼠VL区不同的氨基酸。HZ VL3,HZ VL2和HZ VL1行对应于所实施的11E1VL区的人源化版本,上述的(“变化位于”行)突变清楚鉴定出来。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的评级。
在第一个系列的实验中,我们构建和分析了当与11E1嵌合重链联合表达时,11E1鼠VL区的三个第一人源化版本。抗c-Met直接结合测定获得的结果显示在图63中。在这一实验中,我们观察到所试验的11E1来源的嵌合或部分人源化的重组抗体的相似的结合能力。在此,发现30个氨基酸中的26个在鼠11E1VL区和选定的人框架中是不同的,并对它们进行分析发现当与嵌合的重链联合时,11E1人源化VL区的抗c-Met结合活性与它们无关。
III-11E1抗体的人源化
在11E1单克隆抗体人源化的这一阶段,理论上产生的人源化抗体序列含有仅5个来自于亲本鼠VH区的外部CDR残基(outside-CDR residue)和4个来自于亲本鼠VL序列的外部CDR残基(见图60,HZ VH1行和图62,HZ VL1行)。然后确定马上表征所产的的重链和轻链联合的11El的人源化版本。抗c-Met直接结合测定的结果在图64中给出。
在这一实验中,对于所试验的11E1来源的嵌合或人源化的重组抗体观察到相似的结合能力。对HGF结合竞争性属性的分析和对剩余的9个鼠残基作用的位点指导的突变分析在这一选定的11E1单克隆抗体的VH1/VL1“预人源化的(pre-humanized)”版本中独立进行或联合进行。
实施例27-3:224G11单克隆抗体的人源化
I–224G11重链可变区的人源化
为了鉴定进行CDR移植最佳的人候选序列,已经检索了表现出与224G11VH鼠序列最佳同一性的人胚系基因。
考虑到224G11和227H1VH区序列的高的序列同源性,并且这一点已经被使用IMGT数据库的工具所证实,因而选定同样的人IGHV1-2*02V胚系基因和人IGHJ4*01J胚系基因作为对于鼠224G11VH CDR的接受的人序列。
在这一高同源性的基础上,决定直接转移(transfert)从227H1VH区人源化获得的人源化信息(见实施例27),然后我们设计了如图65所描述的“完全IMGT”人源化版本,其表示了鼠227H1和224G11VH区与选定的人框架的氨基酸比对。在人FR行中,仅描述了所发现的与224G11鼠VH区不同的氨基酸。HZVH0行对应于224G11VH区的《完全IMGT》人源化版本,如从“完全IMGT”227H1-HZVH区获得的。
然后已经构建了224G11鼠VH区的《完全IMGT》的人源化版本并对其与224G11嵌合轻链联合表达时的抗c-Met结合活性进行分析。抗c-Met直接结合测定获得的结果显示在图66中,而图67显示了HGF结合竞争性测定。考虑到关于“完全IMGT”人源化的224G11VH区的抗c-Met结合属性获得的实验数据,选定图65中描述的所得氨基酸序列,并进行生物信息学分析,来评价所谓的224G11-HZ VH0区的“人化”(“humanness”)水平。
考虑到此处使用的人源化策略,需要参考实施例27对224G11HZ VH0序列进行人化分析。如已经对227H1VH区的人源化进行的描述,我们证实了IMGT编码系统和同源性分析工具的可靠性,并且还证明了在它们内在同源性的限制下人源化策略的抗体间转移的可能性。
II–224G11轻链可变区的人源化
为了鉴定进行CDR移植最佳的人候选序列,已经检索了表现出与224G11VL鼠序列最佳同一性的人胚系基因。在IMGT数据库的帮助下,鉴定出两种可能的对于鼠224G11VL CDR的接受的人V区。对于224G11VL区,计划了两个人源化策略。第一个相当于带有更短的CDR1长度(IGKV3-11*01)的人框架的最初试验,第二个有更长的CDR1长度(IGKV4-1*01)。
图68表示,鼠224G11VL区与两个选定的人框架的氨基酸比对。在更短和更长的Hu-FR FR行中,仅描述了所发现的与224G11鼠VL区不同的氨基酸。HZ VL3,HZ VL6行相当于224G11VL区的基本的人源化版本,上述的(“级”行)突变清楚地鉴定出来。每个建议的突变下的数字对应于将要进行所述的突变的级,无论选定的是基本的“较短”或“较长”的CDR1框架。
在第一套实验中,构建了224G11鼠VL区的两种基本的人源化版本,并分析了它们当与224G11嵌合重链联合表达时的抗c-Met结合活性。抗c-Met直接结合测定获得的结果显示在图69中。在这一实验中,观察到嵌合的和HZ VL6(“较长的CDR1”))版本相似的抗c-Met结合能力,而对于HZ VL3(“较短的CDR1”)重组的224G11来源的抗体,几乎没有检测到结合。
在第二套实验中,我们构建和分析了当与224G11嵌合重链联合表达时,HZVL6-来源的224G11VH区的实施的人源化版本的抗c-Met结合活性。分析了两个另外的人源化形式;在HZ VL5版本中,第三组的七个残基(3级)进行了人源化,在HZ VL4版本中,仅第一组四个剩余的残基(评级为1级的残基)仍然为鼠的。抗c-Met直接结合测定获得的结果显示在图70中。在这一实验中,没有观察到所试验的224G11来源的嵌合或部分人源化的重组抗体之间结合能力的差异。在此,22个氨基酸中的18个在鼠224G11VL区和选定的“较长CDR1”人框架中发现是不同的,对它们进行分析发现当与嵌合的重链联合时,224G11人源化VL区的抗c-Met结合活性与它们无关。
然后在HGF结合竞争性测定中试验了224G11VL区的HZ VL4的人源化版本。如图71所示,所获得的结果证明鼠的和重组嵌合的和HZ VL4人源化的224G11来源的抗体的竞争性活性相似。
在224G11VL区人源化的这一阶段,所得的序列含有仅4个来自于鼠亲本序列的外部CDR残基。如图72所示,这4个§标记的残基是L4、M39、H40和R84。
基于IMGT编码系统和同源性分析工具,我们证明在CDR长度方面表现出结构差异的人框架在人源化过程中仍然是适当的。然后决定表征所得的224G11抗体的重链和轻链人源化版本。然后对保留的4个鼠残基当与重链的VH0人源化版本联合表达时的作用进行位点指导的突变分析。
III-224G11抗体的人源化
在第一个系列的实验中,我们构建和分析了224G11抗体的完全人源化的版本的抗c-Met结合活性。这一重组版本分别包括VH0和VL4都人源化的VH和VL区。抗c-Met直接结合测定获得的结果显示在图73中。在这一实验中,发现完全人224G11的抗c-Met结合活性与“单链”人源化的和嵌合重组的224G11版本相似。
然后在HGF结合竞争性测定中试验224G11VL区的完全人源化版本。获得的结果显示在图74中,其证明亲本鼠的和重组嵌合的和完全人源化的224G11来源的抗体的竞争性活性相似。
在224G11抗体人源化的这一阶段,所得序列含有仅4个来自于鼠亲本轻链可变区序列的外部CDR残基。然后我们分析了当与VH0重链的人源化版本联合表达时VL4人源化的VL区的位点指导的突变的单一变体。对于直接结合测定如图75所示,我们在4个试验中鉴定出了可能的相关残基,即M39和H40。
决定分析当与HZ VH0人源化的224G11VH区联合表达时HZ VL4人源化的224G11VL区的多个突变体。对于直接结合测定如图76所示,并且对于HGF结合竞争性测定如图77,对VL4区的多氨基酸突变体进行分析以鉴定最佳的人源化组合。在单突变体分析的基础上,集中于可以表现出最佳抗c-Met活性的双或三突变体。VH0/VL4-2x突变体相当于与HZ VL4224G11人源化的VL区(带有L4M/R84G双突变)一同表达的HZ VH0224G11人源化的VH区。VH0/VL4-3x突变体相当于与HZ VL4224G11人源化的VL区(带有L4M/M39L/R84G三突变)一同表达的HZ VH0224G11人源化的VH区。
考虑到关于完全人源化224G11抗体的抗c-Met结合属性所获得的实验数据,然后对重链和轻链可变区序列两者都进行生物信息学分析以评价VH0/VL4-2x和VH0/VL4-3x最佳人源化版本的“人化”水平。已经在前面证明了VH0224G11VH区的“完全IMGT”人源化。关于VL4-2x和-3x224G11人源化的VL区版本的人化水平,它们仅含有鼠残基M39和/或H40。这两个可能的关键残基位于CDR1末端,M39是N末端CDR锚定物(anchor)。考虑到在224G11VL区人源化中我们面临的CDR长度的问题,并且考虑到那些作为VL CDR1的Kabat定义的部分的位置,完全人源化224G11抗体的人化水平由于具有最少的保守的鼠残基而应表现出强烈诱导的免疫原性。
Claims (28)
1.一种分离的抗体或其功能性二价片段之一,其特征在于其包含重链和轻链,所述的重链包含氨基酸序列分别为SEQ ID No.4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;所述的轻链包含氨基酸序列分别为SEQ ID No.13、11和14的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性二价片段之一,其特征在于其包含氨基酸序列SEQ ID No.19的重链和氨基酸序列SEQ ID No.22的轻链。
3.一种能够分泌如权利要求1所述的抗体的鼠杂交瘤,其特征在于所述杂交瘤是于2007年3月14日保藏在巴黎巴斯德研究所CNCM,保藏号为I-3732的鼠杂交瘤。
4.根据权利要求1和2任一项所述的抗体或其功能性二价片段之一,其特征在于其是单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的抗体或其功能性二价片段之一,其特征在于所述的抗体为嵌合抗体,其中轻链和重链恒定区来自于与小鼠异源的物种的抗体。
6.根据权利要求5的嵌合抗体或其功能性二价片段之一,其特征在于所述异源的物种是人。
7.根据权利要求6的人源化抗体或其功能性二价片段之一,其特征在于源自人抗体的轻链和重链恒定区分别是轻链κ区和重链γ-1、γ-2或γ-4区。
8.根据权利要求1、2和4-7任一项所述的抗体,其中抗体能够抑制配体依赖的和配体非依赖的c-Met激活。
9.根据权利要求8所述的抗体,其中抗体能够特异地结合c-Met。
10.根据权利要求9所述的抗体,其中抗体能够抑制至少一个肿瘤类型的至少50%肿瘤细胞增殖。
11.根据权利要求10所述的抗体,其中抗体能够抑制c-Met二聚化。
12.根据权利要求1、2和4-11任一项所述的抗体,其中抗体是二价的。
13.一种分离的核酸,其特征在于其选自下述核酸:
a)编码如权利要求1、2和4-12之一所述的抗体或其功能性二价片段之一的核酸;
b)序列SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29和序列SEQ ID No.36、SEQ ID No.34和SEQ ID No.37的DNA核酸序列;
c)DNA核酸,其包括
包含序列SEQ ID No.42和SEQ ID No.45的核酸序列;
d)b)或c)中限定的核酸相对应的RNA核酸;和
e)a),b)和c)中限定的核酸的互补核酸。
14.一种包含如权利要求13的a)、b)和c)部分所述的DNA核酸的载体。
15.一种包含如权利要求14所述的载体的宿主细胞。
16.一种产生如权利要求1、2和4-12之一所述的抗体或其功能性二价片段之一的方法,其特征在于其包含下述阶段:
a)在培养基中和在适当的培养条件下培养如权利要求14所述的细胞;以及
b)从培养基或所述的培养细胞中收获产生的所述抗体或其功能性二价片段之一。
17.如权利要求1、2和4-12所述的或通过权利要求16所述的方法获得的抗体或其功能性二价片段之一用于制备预防或治疗c-Met激活相关的恶性肿瘤的药物的用途。
18.一种包含化合物作为有效成分的组合物,所述的化合物由如权利要求1、2和4-12之一所述的,或通过如权利要求16所述的方法获得的,抗体或其功能性二价片段之一组成。
19.根据权利要求17所述的组合物,其特征在于其进一步包含作为组合产品以同时、分别或相继使用的一种制剂,其中所述制剂是抗肿瘤抗体。
20.根据权利要求18或19所述的组合物,其特征在于其进一步包含作为组合产物以同时、分别或相继使用的至少一种制剂,其中所述制剂是细胞毒性剂/细胞抑制剂。
21.根据权利要求20所述的组合物,其中所述的细胞毒性剂/细胞抑制剂化学偶联至所述抗体或所述二价功能性片段或其衍生物用于同时使用。
22.根据权利要求21所述的组合物,其中所述的细胞毒性剂/细胞抑制剂选自烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素或免疫调节剂。
23.根据权利要求22所述的组合物,其中所述的细胞毒性剂/细胞抑制剂是有丝分裂抑制剂。
24.根据权利要求18或19所述的组合物,其特征在于至少一种所述的抗体或其功能性二价片段之一与细胞毒素和/或放射性元素结合。
25.如权利要求18-23之一所述的组合物用于制备预防或治疗c-Met激活相关的恶性肿瘤的药物的用途。
26.如权利要求1、2和4-12之一所述的,或通过如权利要求16的方法获得的抗体或其功能性二价片段之一,或如权利要求18-24之一所述的组合物,在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
27.根据权利要求26所述的用途,其特征在于所述的恶性肿瘤选自前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌、成胶质细胞瘤或结肠癌。
28.根据权利要求25、26或27所述的用途,其特征在于所述恶性肿瘤是cMet激活相关的恶性肿瘤,其选自HGF依赖性和/或非依赖性的恶性肿瘤。
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