ES2692379T3

ES2692379T3 - Anticuerpos anti-HER3 y composiciones

Info

Publication number: ES2692379T3
Application number: ES11837656.5T
Authority: ES
Inventors: Mikkel Wandahl Pedersen; Helle Jacobsen; Klaus Koefoed
Original assignee: Symphogen AS
Current assignee: Symphogen AS
Priority date: 2010-11-01
Filing date: 2011-10-31
Publication date: 2018-12-03
Anticipated expiration: 2031-10-31
Also published as: AU2011324871B2; MX2013004897A; MX347981B; US9217039B2; KR20140026337A; EP3156421B1; JP2014503188A; AU2011324870B2; JP6033783B2; MX2013004899A; EP2635604A2; CA2816519A1; ES2616961T3; PL2635604T3; WO2012059857A2; IL225953A0; WO2012059857A3; TW201231066A; AU2011324870A1; CA2816520A1

Abstract

Una composición de anticuerpos que comprende al menos una primera y una segunda molécula de anticuerpo anti-HER3 humano que se unen a distintos epítopos de HER3, en la que: a) dicha primera molécula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende CDR1-3 de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 48, 57, y 58, respectivamente, y CDR1-3 de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, YTS, y SEQ ID NO: 77, respectivamente; y b) dicha segunda molécula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende CDR1-3 de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 54, 55, y 56, respectivamente, y CDR1-3 de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, HTS, y SEQ ID NO: 75, respectivamente.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos anti-HER3 y composiciones Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a nuevos anticuerpos recombinantes que se dirigen al receptor HER3, y a las composiciones que comprenden dos o mas de estos anticuerpos para su uso en la terapia contra el cancer humano.

Antecedentes de la invencion

Familia de los receptores EGFR

La familia de receptores del factor de crecimiento epidermico (EGFR) (tambien conocida como la familia de ErbB) es un subgrupo de las tirosina cinasas receptoras (RTKs) y consiste en cuatro miembros: HER1/EGFR/ErbB, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3 y HER4/ErbB4. Los miembros de la familia de EGFR son glucoproteinas modulares de cadena sencilla estrechamente relacionadas con una region de union al ligando extracelular, un unico dominio transmembranico y una tirosina cinasa intracelular (revisado en Ferguson (2008) Annu Rev Biophys. 37: 353-373). En ambientes fisiologicos normales, la familia de ErbB regula los eventos clave en la coordinacion del crecimiento, diferenciacion y migracion celulares Citri et al. (2006) Nat Rev Mol Cell Biol. 7: 505-516). Se cree que EGFR, HER2 y HER3 juegan papeles cruciales en la transformacion maligna de las celulas normales y en el crecimiento continuo de las celulas cancerosas (via de pro-supervivencia). Se ha encontrado que EGFR y HER2 son sobreexpresados por muchos canceres epiteliales (Slamon et al. (1987) Science, 235: 177-182; Arteaga (2002) Oncologist 7 Supl. 4: 3139; Bodey et al. (1997) Anticancer Res. 17: 1319-1330; Rajkumar et al. (1996) J Pathol. 179: 381-385). La sobreexpresion de EGFR y HER2 ha estado vinculada ademas a la progresion de la enfermedad, a supervivencia reducida, pobre respuesta y resistencia a la quimioterapia en varios canceres epiteliales humanos (Slamon et al. (1987) mas arriba; Baselga et al. (2002) Oncologist 7 Supl 4: 2-8).

Estructura de HER3

El tercer miembro de la familia de ErbB, conocido como el receptor 3 del factor de crecimiento epidermico humano (HER3, ErbB3), fue identificado en 1989 por Kraus et al. (Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 9193-9197). El gen HER3 codifica una proteina de 1342 aminoacidos con sorprendentes similitudes estructurales con EGFR y HER2. Las caracteristicas tales como el tamano completo, cuatro subdominios extracelulares (I-IV) con dos grupos de cisteina (dominios II y IV), y un dominio de tirosina cinasa, muestran similitudes estructurales con EGFR y HER2 (Cho y Leahy (2002) Science, 297: 1330-1333). El dominio de tirosina cinasa de HER3 muestra 59% de homologia secuencial con el dominio de tirosina cinasa de EGFR (Brennan et al. (2000) Oncogene, 19: 6093-6101).

Regulacion de la activacion de HER3

El factor de diferenciacion neu (NDF), la herregulina (HRG) y neurregulina 1 (NRG1) son sinonimos para la glucoproteina que es un ligando para HeR3 (Peles et al. (1992) Cell, 69: 205-216; Wen et al. (1992) Cell, 69: 559572). Al menos 15 isoformas de la proteina NRG1 han sido identificadas. Las isoformas son producidas a partir del unico gen NRG1 a traves de ayuste y multiples promotores (Falls et al. (2003) Exp Cell Res, 284: 14-30). Tres caracteristicas estructurales se aplican para las diferencias funcionales de las isoformas. Estas caracteristicas estructurales son el tipo de dominio similar de EGF (a o b), la secuencia N-terminal (tipo I, II o III), y si la isoforma es

0 no inicialmente sintetizada como una proteina transmembranica o no membranica (Falls et al. (2003) mas arriba). El subgrupo del tipo I de las isoformas de NRG1 tienen una secuencia N-terminal unica seguida de un dominio similar a la inmunoglobulina y luego un dominio similar a EGF. Las variantes de tipo II contienen una secuencia similar a kringle N-terminal, el dominio de inmunoglobulina y el dominio similar a EGF. Las variantes de tipo III contienen un dominio hidrofobo N-terminal dentro de una region rica en cisteina, omiten el dominio de inmunoglobulina, y luego continuan dentro del dominio similar a EGF y diversos exones alternativos con direccion 3’. En direccion 3’ desde el dominio similar a EGF, la isoforma de NRG1 puede contener una secuencia enlazadora, un dominio transmembranico y una cola citoplasmica (Falls et al. (2003) mas arriba). Algunas de las isoformas de NRG1 son sometidas a glucosilacion en la region espaciadora entre el dominio similar a inmunoglobulina y el dominio similar a EGF (Hayes et al. (2008) J Mammary Gland Biol Neoplasia, 13: 205-214).

Como es el caso para EGFR, HER3 existe en una conformacion trabada y en una conformacion extendida. En la conformacion trabada, el brazo de dimerizacion es enterrado por interacciones con dominio IV, dejando los dominios

1 y III demasiado separados para la union eficiente del ligando (Cho y Leahy et al. (2002) mas arriba). La union del ligando a los dominios extracelulares I y III ocurre en la conformacion extendida de HER3 y conduce a la heterodimerizacion con otros miembros de la familia de ErbB (u otros miembros de RTK, por ejemplo MET), heterodimerizandose preferentemente la molecula de HER3 extendida y unida al ligando con HER2 (Pinkas- Kramarski et al. (1996) EMBO J, 15: 2452-2467). No se forman homodimeros de HER3 despues de la union del ligando (Ferguson et al. (2000) eMbO J, 19: 4632-4643).

En contraste con EGFR y HER2, la tirosina cinasa de HER3 tiene actividad catalitica deteriorada, insuficiente para cualquier respuesta biologica detectable Pinkas-Kramarski et al. (1996) mas arriba; Guy et al. (1994) Proc Natl Acad

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Sci USA, 91: 8132-8136). Dos restos de aminoacidos que estan altamente conservados en los dominios cataliticos de las proteina cinasas (Hanks et al. (1988) Science, 241: 42-52) estan alterados en el dominio catalitico de HER3. Estos son la sustitucion de la asparagina por acido aspartico en el resto 815 y la sustitucion de la histamina por glutamato en el resto 740. Las dos sustituciones de aminoacidos pueden ser la razon por la que HER3 carece de actividad catalitica de su dominio de tirosina cinasa (Plowman et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA, 87: 4905-4909). Debido a la actividad de cinasa intrinseca deteriorada de HER3, el receptor necesita heterodimerizarse con otro miembro de la familia de ErbB con el fin de responder a su propia union del ligando (Berger et al. (2004) FEBS Lett, 569: 332-336).

Terminacion de la senalizacion de HER3

Se sabe poco respecto a la endocitosis de HER3. Ademas, diferentes estudios han sugerido que HER3 tiene endocitosis deteriorada en el mismo grado que HER2 (Baulida et al. (1996) J Biol Chem, 271: 5251-5257). En concordancia con esto, se encontro que el complejo de HER3-NRG1 es internalizado menos eficiente y mas lentamente que el complejo de EGFR-EGF, apoyando que HER3 no es sometido a endocitosis tan eficientemente como EGFR (Baulida et al. (1997) Exp Cell Res, 232: 167-172; Waterman et al. (1999) EMBO J, 18: 3348-3358). Sin embargo, cuando la cola C-terminal de EGFR fue reemplazada por la cola C-terminal de HER3, EGFR sufrio endocitosis deteriorada, sugiriendo que una region en el termino C de HER3 protege al receptor contra internalizacion (Waterman et al. (1999) mas arriba). Se ha sugerido tambien que NRG1 no se dirige eficientemente a HER3 para la degradacion debido a la disociacion de los complejos ligando-receptor en los endosomas, como se observa cuando EGF es activado por TGFa (Waterman et al. (1999) mas arriba).

Expresion y papel fisiologico de HER3

Se ha mostrado que HER3, al igual que EGFR y HER2, es importante en el desarrollo de la glandula mamaria (Schroeder et al. (1998) Cell Growth Differ, 9: 451-464). Mientras que EGFR y HER2 son expresados de forma importante y estan colocalizados en la glandula mamaria de raton pubescente, HER3 solamente es expresado en niveles bajos en glandulas mamarias postpubescentes de ratones virgenes, pero es expresado en niveles mas elevados durante el embarazo y lactancia (Schroeder et al. (1998) mas arriba). Los mayores niveles de expresion de HER3 durante el embarazo y la lactancia implican la importancia de HER3 en las etapas tardias del desarrollo y diferenciacion de las glandulas mamarias (Jackson-Fisher et al. (2008) Breast Cancer Res, 10: R96). Estudios con ratones deficientes en HER3 indicaron ademas el papel regulador de HER3 en la morfogenesis del epitelio mamario a traves de la ruta de senalizacion de PI3K/AKT (Jackson-Fisher et al. (2008) mas arriba). Otros estudios mostraron niveles elevados de expresion de HER3 por celulas epiteliales ductales en ratas hacia el dia 14-16 de embarazo, demostrando tambien el papel regulador de HER3 en la morfogenesis del epitelio mamario (Darcy et al. (2000) J Histochem Cytochem, 48: 63-80).

La supresion dirigida del gen HER3 en ratones dio como resultado letalidad embrionaria en el dia 13,5, debido a que las valvulas cardiacas subdesarrolladas fueron incapaces de soportar la funcion cardiaca apropiada debido a reflujo sanguineo (Erickson et al. (1997) Development, 124: 4999-5011). Otros defectos incluyen anomalias en el desarrollo cerebral, especialmente en la region mesencefalica, incluyendo el cerebelo, y defectos graves en las celulas de Schwann de axones perifericos de neuronas sensoriales y motoras (Erickson et al. (1997) mas arriba; Riethmacher et al. (1997) Nature, 389: 725-730).

Estudios in vitro tambien han implicado a HER3, en combinacion con HER2, en el desarrollo de queratinocitos (Marikovsky et al. (1995) Oncogene, 10: 1403-1411), precursores de celulas de Schwann (Syroid et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, 93: 9229-9234), oligodendrocitos (Vartanian et al. (1997) J Cell Biol, 137: 211-220) y la sinapsis neuromuscular (Zhu et al. (1995) EMBO J, 14: 5842-5848).

La distribucion tisular de HER3 no es muy diferente de la de EGFR (
www.proteinatlas.org). A pesar de la actividad alterada de cinasa de HER3, el receptor desempena un papel esencial en la red de ErbB a traves de la senalizacion de PI3K/AKT (Citri et al. (2003) Exp Cell Res, 284: 54-65). Debido al requisito de heterodimerizacion para el inicio de la senalizacion, el papel fisiologico de HER3 puede asemejarse en conjunto a los identificados para EGFR y HER2. El papel preciso de HER3 en los adultos humanos es desconocido, sin embargo, debido a la letalidad embrionaria de la supresion de HER3 en ratones y a los escasos datos sobre la inhibicion de HER3.

HER3 y cancer

HER3 es unico en su capacidad para canalizar la senalizacion de ErbB hacia la ruta de senalizacion de PI3K/AKT, lo que favorece el crecimiento y progresion tumorales (Prigent et al. (1994) EMBO J, 13: 2831 -2841). El papel critico de HER3 en la regulacion del crecimiento tumoral tambien esta apoyado por la observacion de que la sobreexpresion de HER2 en cancer de mama humano esta asociada a menudo con mayores niveles de expresion de HER3 (Naidu et al. (1998) Br J Cancer, 78: 1385-1390). Ademas, la sobreexpresion de HRG da como resultado mayor transformacion y tumorigenicidad (Atlas et al. (2003) Mol Cancer Res, 1: 165-175), mientras que el bloqueo de nRg inhibe la tumorigenicidad y metastasis (Tsai et al. (2003) Oncogene, 22: 761-768), indicando la importancia de la presencia de un ligando de HER3 para el desarrollo del cancer.

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La presencia de homodimeros de HER2 en la superficie celular, y de ese modo la exageracion de la senalizacion de HER2, causa transformacion de celulas epiteliales (revisado en Yarden y Sliwkowski (2001) Nat Rev Mol Cell Biol, 2: 127-137). Sin embargo, el dimero de HER2-HER3 tiene la capacidad para inducir transduccion de senales a traves tanto de la ruta de proteina cinasas activadas por mitogenos (MAPK) como de AKT. La activacion tanto de la ruta de MAPK como de la ruta de AKT implica el potencial oncogenico adicional de heterodimero de HER2-HER3 en comparacion con el homodimero de HER2 (revisado en Citri et al. (2003) mas arriba).

Se encuentra expresion elevada de HER3 en muchos de los mismos tipos de tumores que sobreexpresan HER2, incluyendo cancer de vejiga y colorrectal, ademas del cancer de mama (Bodey et al. (1997) Anticancer Res, 17: 1319-1330; Rajkumar et al. (1996) J Pathol, 179: 381-385; Lemoine et al. (1992) Br J Cancer, 66: 1116-1121; Maurer et al. (1998) Hum Pathol, 29: 771-777). Aunque son necesarios mas estudios para establecer la asociacion entre la sobreexpresion de HER3 y el resultado clinico, las indicaciones clinicas apoyan los resultados de los estudios in vitro de que ni HER2 ni HER3 pueden ser considerados como receptores independientes en relacion con el cancer.

Anticuerpos anti-HER3

En la bibliografia se ha descrito un numero de anticuerpos anti-HER3. Veanse, por ejemplo, los documentos WO 2011/060206, WO 2011/044311, WO 2011/022727, WO 2010/127181, WO 2008/100624, WO 2007/077028, WO 03/013602 y WO 97/35885.

AMG 888 (Amgen/Dallchi Sankyo) es un anticuerpo monoclonal totalmente humano que se afirma que inhibe la senalizacion oncogenica de HER3 humano. AMG 888 esta siendo actualmente investigado en ensayos clinicos para el tratamiento del cancer.

MM-121 (Merrimack Pharmaceuticals) es un anticuerpo anti-HER3 que se afirma que bloquea la union de heregulina a, y por tanto la activacion de, HER3; veanse el documento WO 2010/019952 y Schoeberl et al., Cancer Res. 70(6):2485-94, marzo 2010. MM-121 esta siendo tambien actualmente investigado en ensayos clinicos para el tratamiento del cancer.

Pertuzumab es un anticuerpo anti-HER2 que funciona como un inhibidor de la dimerizacion de HER, que inhibe la dimerizacion de HER2 a HER3 y a los otros receptores de EGFR. Franklin et al. (Cancer Cell 2004, 5(4):317-28) describen que pertuzumab une HER2 cerca del centro del dominio II, bloqueando estericamente un bolsillo de union necesario para la heterodimerizacion y senalizacion de HER2-HER3. La secuencia de aminoacidos de pertuzumab se describe en los documentos WO 2006/033700 y US 2006/0121044 A1.

A pesar del hecho de que se conocen ciertos anticuerpos anti-HER3, y en algunos casos estan siendo investigados en ensayos clinicos, actualmente no hay anticuerpos anti-HER3 aprobados para uso terapeutico. En vista del papel critico de HER3 en la regulacion del crecimiento tumoral como se esquematiza anteriormente, existe por lo tanto la necesidad de nuevos anticuerpos dirigidos contra el receptor HER3, asi como mezclas de tales anticuerpos anti- HER3.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona una composicion de anticuerpos que comprende al menos una primera y una segunda molecula de anticuerpo anti-HER3 humano que se unen a distintos epitopos de HER3, en la que:

a) dicha primera molecula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende CDR1-3 de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NOs: 48, 57, y 58, respectivamente, y CDR1-3 de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 76, YTS, y SEQ ID NO: 77, respectivamente; y

b) dicha segunda molecula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende CDR1-3 de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NOs: 54, 55, y 56, respectivamente, y CDR1-3 de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 71, HTS, y SEQ ID NO: 75, respectivamente.

En una realizacion, la composicion de anticuerpos comprende al menos una primera y una segunda molecula de anticuerpo anti-HER3 humano que se unen a distintos epitopos de HER3, en la que:

a) la primera molecula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 18, y una cadena ligera que comprende el dominio variable de cadena ligera en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20; o una variante humanizada de los mismos; y

b) la segunda molecula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14, y una cadena ligera que comprende el dominio variable de cadena ligera en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16; o una variante humanizada de los mismos.

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En una realizacion adicional, la composicion de anticuerpos comprende al menos una primera y una segunda molecula de anticuerpo anti-HER3 humano que se unen a distintos epftopos de HER3, en la que:

a) la primera molecula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende una cadena pesada que comprende un dominio variable que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio constante que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 44, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20; o una variante humanizada de los mismos; y

b) la segunda molecula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende una cadena pesada que comprende un dominio variable que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio constante que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 44, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16; o una variante humanizada de los mismos.

En una realizacion, la composicion de anticuerpos comprende ademas una tercera molecula de anticuerpo anti- HER3 humano, distinta de las moleculas de anticuerpo primera y segunda.

En una realizacion, al menos una molecula de anticuerpo anti-HER3 humano en dicha composicion es un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-HER3 humano conjugado a un agente contra el cancer.

Se proporciona ademas una molecula de union biespecffica que se une a HER3, que comprende las CDR1-3 de cadena pesada y ligera de las moleculas de anticuerpo primera y segunda de la composicion de anticuerpos de la invencion.

Tambien se proporciona una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia nucleotfdica que codifica la secuencia de aminoacidos del dominio variable de cadena pesada y la secuencia de aminoacidos del dominio variable de cadena ligera de una molecula de anticuerpo de la composicion proporcionada. La invencion tambien se refiere a un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico.

En una realizacion, la invencion se refiere a una estirpe celular policlonal capaz de expresar la composicion de anticuerpos de la invencion, en la que dicha estirpe celular policlonal comprende celulas hospedantes capaces cada una de expresar un anticuerpo anti-HER3 humano de la composicion.

Tambien se proporciona un metodo para producir una composicion de anticuerpos que comprende al menos dos moleculas de anticuerpo recombinante anti-HER3 humano, comprendiendo el metodo:

a) proporcionar al menos una primera celula hospedante y una segunda celula hospedante, en el que la primera celula hospedante es capaz de expresar la primera molecula de anticuerpo anti-HER3 humano de la composicion de la invencion, y la segunda celula hospedante es capaz de expresar la segunda molecula de anticuerpo anti-HER3 humano de la composicion de la invencion;

b) cultivar dichas celulas hospedantes en condiciones adecuadas para la expresion de las moleculas de anticuerpo; y

c) aislar las moleculas de anticuerpo.

En una realizacion, las celulas hospedantes se cultivan en un solo biorreactor.

Se proporcionan ademas composiciones farmaceuticas que comprenden la composicion de la invencion o la molecula biespecffica de la invencion y un diluyente, vehfculo o excipiente farmaceuticamente aceptable. Tambien se proporciona la composicion farmaceutica para uso en la prevencion, tratamiento o mejora de uno o mas sfntomas asociados con cancer en un paciente humano, para uso en el tratamiento de cancer o un trastorno caracterizado por la expresion de HER3 en un paciente humano, y para uso en el tratamiento de cancer caracterizado por la sobreexpresion de HER3 en un paciente humano.

La presente invencion se refiere a nuevos anticuerpos recombinantes dirigidos contra el receptor HER3, asf como composiciones que comprenden dos o mas de estos anticuerpos, y a los anticuerpos y composiciones de la invencion para uso en terapia contra el cancer humano, por ejemplo para el tratamiento de cancer de mama, cancer ovarico, cancer gastrico u otros canceres que expresan o sobreexpresan HER3, o que tienen una signatura de activacion de la ruta de HER3 (por ejemplo NSCLC, glioblastoma). En comparacion con los tratamientos actualmente disponibles para tales canceres, incluyendo anticuerpos monoclonales disponibles dirigidos contra otros receptores de la familia de EGFR, se contempla que los anticuerpos de la invencion pueden proporcionar una respuesta clfnica superior ya sea solos o, preferiblemente, en una composicion que comprende dos o mas de tales anticuerpos, y opcionalmente en combinacion con otros tratamientos tales como quimioterapia.

Se discuten ademas nuevos anticuerpos recombinantes anti-HER3 basados en los anticuerpos citados aquf como los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 y 5259, asf como sus variantes humanizadas y/o maduradas por afinidad. Tambien se describe una molecula de anticuerpo recombinante anti-HER3 que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada de uno cualquiera de los anticuerpos citados aquf como los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101,5106, 5143, 5144 y 5259.

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Se describe ademas una molecula de anticuerpo recombinante anti-HER3 que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia de CDR3 de cadena ligera de uno cualquiera de los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 y 5259, y que compite por la union con dicho anticuerpo; una molecula de anticuerpo recombinante anti-HER3 que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de uno cualquiera de estos anticuerpos; y un anticuerpo recombinante anti-HER3 que comprende la secuencia de la region variable de cadena pesada y la secuencia de la region variable de cadena ligera de uno cualquiera de estos anticuerpos, o que comprende una secuencia de la region variable de cadena pesada y una secuencia de la region variable de cadena ligera que tiene cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia, con las secuencias de la region variable de cadena pesada y de la region variable de cadena ligera, respectivamente, de uno cualquiera de estos anticuerpos, y que compite por la union con dicho anticuerpo.

Tambien se describe una composicion de anticuerpos recombinantes, que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3, en la que los anticuerpos primero y segundo se unen a distintos epitopos de HER3, y en la que uno o ambos de los anticuerpos primero y segundo se seleccionan del grupo de los anticuerpos resumidos anteriormente.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo recombinante anti-HER3 de la invencion conjugado a un agente contra el cancer. Un aspecto relacionado se refiere a composiciones que comprenden al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3 de la invencion, en las que al menos un anticuerpo anti-HER3 en dicha composicion es un inmunoconjugado.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a una molecula de acido nucleico que tiene una secuencia nucleotidica que codifica un anticuerpo anti-HER3 de la invencion, asi como vectores de expresion que comprenden tal polinucleotido, y a celulas hospedantes que se han transfectado con tal vector de expresion.

Todavia un aspecto adicional de la invencion se refiere a metodos para producir anticuerpos y composiciones de anticuerpos policlonales de la invencion.

Todavia un aspecto adicional de la invencion se refiere a anticuerpos y composiciones para uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto humano o animal, en particular el tratamiento de cancer en seres humanos, administrando un anticuerpo anti-HER3 o una composicion de la invencion a dicho sujeto. Tambien se describe el uso de uno o mas anticuerpos anti-HER3 de la invencion para la preparacion de un medicamento para uso en el tratamiento de una enfermedad en un ser humano o animal, en particular para el tratamiento de cancer en seres humanos.

Tambien se describe un metodo para inducir la internalizacion de HER3 en la superficie de celulas que expresan o sobreexpresan HER3, comprendiendo el metodo poner en contacto las celulas con un anticuerpo recombinante anti- HER3 o un inmunoconjugado o una composicion de anticuerpos recombinantes anti-HER3 de la invencion.

Aspectos adicionales de la invencion y realizaciones particulares seran manifiestos a partir de la descripcion y ejemplos que siguen.

Descripcion de los dibujos

Las Figuras 1-10 muestran la actividad metabolica de celulas MDA-MB-175 tratadas con diferentes concentraciones de los anticuerpos anti-HER3 indicados, durante 96 horas.

La Figura 11 muestra los resultados de los analisis de transferencia western de niveles de fosfo-HER3 en las estirpes celulares MDA-MB-175 y MCF7 tras 1 hora de pretratamiento con los anticuerpos indicados, seguido de la estimulacion con 10 nM de heregulina beta.

Las Figuras 12-15 muestran la actividad metabolica de mezclas seleccionadas de dos anticuerpos anti-HER3 en cuatro estirpes de celulas cancerosas.

Las Figuras 16-19 muestran la actividad metabolica de mezclas seleccionadas de tres anticuerpos anti-HER3 en cuatro estirpes de celulas cancerosas.

Las Figuras 20 y 21 muestran la actividad inhibidora del crecimiento de dos mezclas diferentes de dos anticuerpos anti-HER3, comparada con los anticuerpos individuales en las dos mezclas, en la estirpe de celulas cancerosas MDA-MB-175.

Las Figuras 22 y 23 muestran la actividad inhibidora del crecimiento de una mezcla de dos anticuerpos anti- HER3 de la invencion comparada con los anticuerpos de referencia MM-121 (anti-HER3) y pertuzumab (anti- HER2), en las dos estirpes de celulas cancerosas MDA-MB-175 y MCF7.

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La Figura 24 es una transferencia western que muestra los niveles de HER3 a diversos tiempos en lisados de celulas completas de celulas OVCAR-8 tratadas con los anticuerpos anti-HER3 individuales 5082 o 5038, o una mezcla de los dos anticuerpos.

La Figura 25 es una transferencia western llevada a cabo sobre lisados de celulas completas de celulas MDA-MB-175, que muestra la inhibicion de la fosforilacion de HER3 y AKT a diversos tiempos por los anticuerpos anti-HER3 individuales 5082 o 5038, o una mezcla de los dos anticuerpos.

La Figura 26 muestra la eficacia in vivo de los anticuerpos anti-HER3 individuales 5038 y 5082, y de la mezcla de 5038+5082, en el modelo de xenoinjerto de cancer de pulmon A549.

Las Figura 27-32 muestran los resultados de un cartografiado de los dominios de anticuerpos anti-HER3 mediante titulacion de los anticuerpos y controles negativos frente a antigenos de HER3 revestidos.

La Figura 33 muestra una tabla con los resultados de clasificacion de epitopos de anticuerpos anti-HER3 mediante analisis de competicion cruzada de anticuerpos.

La Figura 34 es una ilustracion grafica de la relacion entre clasificaciones asignadas de epitopos para anticuerpos anti-HER3, en la que los circulos que solapan representan anticuerpos con epitopos que solapan.

La Figura 35 muestra la eficacia in vivo de los anticuerpos monoclonales anti-HER3 5038 y 5082 y la mezcla de 5038+5082 en el modelo de xenoinjerto de cancer pancreatico BxPC3, expresada como volumen tumoral.

La Figura 36 muestra la eficacia in vivo de los anticuerpos monoclonales anti-HER3 5038 y 5082, y la mezcla de 5038+5082 en el modelo de xenoinjerto de cancer pancreatico BxPC3, expresada como porcentaje de supervivencia.

Descripcion detallada de la invencion Definiciones

El termino “anticuerpo” o “molecula de anticuerpo” describe un componente funcional del suero y es a menudo denominado ya sea como una coleccion de moleculas (anticuerpos o inmunoglobulina) o como una molecula (la molecula de anticuerpo o la molecula de inmunoglobulina). Un anticuerpo es capaz de unirse a o reaccionar con un determinante antigenico especifico (el antigeno o el epitopo antigenico), el cual a su vez puede conducir a la induccion de los mecanismos efectores inmunologicos. Un anticuerpo individual es usualmente considerado como monoespecifico, y una composicion de anticuerpos puede ser monoclonal (es decir, que consiste en moleculas de anticuerpos identicas) o policlonal (por ejemplo, que consiste en dos o mas anticuerpos diferentes que reaccionan con el mismo o diferentes epitopos sobre el mismo antigeno, o incluso sobre distintos y diferentes antigenos). Cada anticuerpo tiene una estructura unica que hace posible que este se una especificamente a su antigeno correspondiente, y todos los anticuerpos naturales tienen la misma estructura basica general de dos cadenas ligeras identicas y dos cadenas pesadas identicas. Los anticuerpos son tambien conocidos colectivamente como inmunoglobulinas.

Los terminos “anticuerpo” o “anticuerpos”, como se utilizan en la presente, estan tambien destinados a incluir los anticuerpos quimericos y de cadena sencilla, asi como los fragmentos de union de los anticuerpos, tales como los fragmentos Fab, Fv o los fragmentos de Fv de cadena sencilla (scFv), asi como las formas multimericas tales como las moleculas de IgA dimericas o IgM pentavalente. Un anticuerpo puede ser de origen humano o no humano, por ejemplo un anticuerpo murino o derivado de otro roedor, o un anticuerpo quimerico, humanizado o reconformado basado, por ejemplo, en un anticuerpo murino.

Cada cadena pesada de un anticuerpo incluye tipicamente una region variable de cadena pesada (VH) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada incluye tipicamente tres dominios, denominados CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera de anticuerpo incluye tipicamente una region variable de cadena ligera (VL) y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera incluye tipicamente un unico dominio, denominado CL. Las regiones VH y VL pueden ser ademas subdivididas en regiones de hipervariabilidad (“regiones hipervariables”, las cuales pueden ser hipervariables en secuencia y/o en bucles estructuralmente definidos). Estas son tambien denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), las cuales estan intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones estructurales (FRs). Cada VH y VL incluye tipicamente tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el termino amino hasta el termino carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, Fr2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Los restos de aminoacidos en las regiones variables son a menudo numerados utilizando un metodo de numeracion estandarizado conocido como el esquema de numeracion de (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

En el listado de secuencias anexo, el ADN de cadena ligera (LC) y las secuencias de aminoacidos incluyen la secuencia de la region variable de cadena ligera (VL) y la secuencia de la region constante kappa humana. Como se menciona mas adelante en el Ejemplo 1, la region constante kappa humana comienza con los aminoacidos -TVAAP-

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(Thr Val Ala Ala Pro) y termina en el C-terminal con los aminoacidos - NRGEC (Asn Arg Gly Glu Cys). Por lo tanto, como se utiliza en la presente, los terminos “secuencia de la region variable de cadena ligera” o “VL” se entienden que se refieren a la parte N-terminal de una secuencia de cadena ligera en el listado de secuencias antes del inicio de la region constante kappa humana (es decir, antes de los aminoacidos TVAAP).

Los numeros de anticuerpos utilizados en la presente en el contexto de los anticuerpos completos, por ejemplo “anticuerpos 5082”, se refieren a los anticuerpos especificos descritos en los ejemplos y definidos en el listado de secuencias anexo. Por ejemplo, el anticuerpo 5082 es un anticuerpo con una cadena pesada que comprende la secuencia de la region variable de cadena pesada descrita en la SEQ ID NO: 18 y la secuencia de la region constante de cadena pesada de IGHG1 descrita en la SEQ ID NO: 44, y una cadena ligera con la secuencia de aminoacido descrita en la SEQ ID NO: 20, en la que la secuencia de cadena ligera como se explico anteriormente incluye la secuencia de la region variable de cadena ligera (restos 1-108 en la SEQ ID NO: 20) y la secuencia de la region constante kappa humana (restos 109-214 en la SEQ ID NO: 20).

La descripcion tambien proporciona anticuerpos que “derivan de” o “se basan en” un anticuerpo especifico descrito en la presente, en el que tal anticuerpo comprende, dependiendo del contexto particular, una de las siguientes: la secuencia de CDR3 de cadena pesada de dicho anticuerpo especificado; la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia de CDR3 de cadena ligera de dicho anticuerpo especificado; las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de dicho anticuerpo especificado; o la secuencia de la region variable de cadena pesada y la secuencia de la region variable de cadena ligera de dicho anticuerpo especificado, o una variante humanizada y/o con madurez de la afinidad de dicha secuencia de la region variable de cadena pesada y/o secuencia de la region variable de cadena ligera, o una secuencia de la region variable de cadena pesada y/o de cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia, con las secuencias de la region variable de cadena pesada y de la region variable de cadena ligera. Un anticuerpo que es derivado de o basado en un anticuerpo especificado descrito en la presente en general se unira al mismo epitopo de HER3 como anticuerpo especificado, y mostrara preferentemente sustancialmente la misma actividad que el anticuerpo especificado. Se considera que un anticuerpo se une al mismo epitopo de HER3 que el anticuerpo especificado si este compite por la union con dicho anticuerpo especificado.

La especificidad de una interaccion del anticuerpo con un antigeno diana radica principalmente en los restos de aminoacidos localizados en las seis CDRs de la cadena pesada y ligera. Las secuencias de aminoacidos dentro de las CDRs son por lo tanto mucho mas variables entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDRs. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoria de las interacciones anticuerpo- antigeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de un anticuerpo de origen natural especifico, o mas en general cualquier anticuerpo especifico con una secuencia de aminoacidos dada, construyendo vectores de expresion que expresan las secuencias de CDR provenientes del anticuerpo especifico injertadas dentro de las secuencias estructurales provenientes de un anticuerpo diferente. Como resultado, es posible “humanizar” un anticuerpo no humano y todavia mantener sustancialmente la especificidad y la afinidad de union del anticuerpo original. Una discusion mas detallada de la humanizacion es proporcionada mas adelante.

Un “anticuerpo quimerico” se refiere en su sentido mas amplio a un anticuerpo que contiene una o mas regiones de un anticuerpo y una o mas regiones provenientes de uno o mas de otros anticuerpos. Como se utiliza en la presente, un “anticuerpo quimerico” es en general un anticuerpo que es parcialmente de origen humano y parcialmente de origen no humano, es decir, derivado en parte de un animal no humano, por ejemplo un raton u otro roedor, o un ave tal como un pollo. Los anticuerpos quimericos son preferidos sobre los anticuerpos no humanos con el fin de reducir el riesgo de una respuesta anti-anticuerpo humana, por ejemplo una respuesta humana anti-anticuerpo de raton en el caso de un anticuerpo murino. Un ejemplo de un anticuerpo quimerico tipico es aquel en el que las secuencias de la region variable son secuencias murinas derivadas de la inmunizacion de un raton, mientras que las secuencias de la region constante son humanas. En el caso de un anticuerpo quimerico, las partes no humanas, es decir, tipicamente las regiones estructurales de las secuencias de la region variable, pueden ser sometidas a alteracion adicional con el fin de humanizar el anticuerpo.

El termino “humanizar” se refiere al hecho de que cuando un anticuerpo es total o parcialmente de origen no humano, por ejemplo un anticuerpo murino obtenido a partir de la inmunizacion de ratones con un antigeno de interes, o un anticuerpo quimerico basado en tal anticuerpo murino, es posible sustituir ciertos aminoacidos, en particular en las regiones estructurales y dominios constantes de las cadenas pesada y ligera, a fin de evitar o minimizar una respuesta inmune en seres humanos. Se sabe que todos los anticuerpos tienen el potencial para provocar una respuesta humana anti-anticuerpo, que se correlaciona en cierto grado con el grado de “humanidad” del anticuerpo en cuestion. Aunque no es posible predecir de forma precisa la inmunogenicidad, y de ese modo la respuesta humana anti-anticuerpo de un anticuerpo particular, los anticuerpos no humanos tienden a ser mas inmunogenos que los anticuerpos humanos. Los anticuerpos quimericos, en los que las regiones constantes extranas (habitualmente de roedor) se han sustituido por secuencias de origen humano, han mostrado ser generalmente menos inmunogenos que los anticuerpos de origen totalmente extrano, y la tendencia en anticuerpos terapeuticos es hacia los anticuerpos humanizados o totalmente humanos. Para anticuerpos quimericos u otros anticuerpos de origen no humano, se prefiere por lo tanto que se humanicen para reducir el riesgo de una respuesta humana anti-anticuerpo.

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Para anticuerpos quimericos, la humanizacion implica tipicamente modificar las regiones estructurales de las secuencias de las regiones variables. Los restos de aminoacidos que son parte de una region determinante de la complementariedad (CDR) tipicamente no se alteraran en relacion con la humanizacion, aunque en ciertos casos puede ser deseable alterar restos de aminoacidos de la CDR individuales, por ejemplo eliminar un sitio de glucosilacion, un sitio desamidacion, o un resto de cisteina indeseado. La glicosilacion enlazada a traves de N se produce mediante union de una cadena de oligosacarido a un resto de asparagina en la secuencia tripeptidica Asn- X-Ser o Asn-X-Thr, en la que X puede ser cualquier aminoacido excepto Pro. La eliminacion de un sitio de N- glicosilacion se puede lograr mutando el resto Asn o el Ser/Thr por un resto diferente, preferiblemente por medio de sustitucion conservativa. La desamidacion de los restos de asparagina y glutamina puede producirse dependiendo de factores tales como pH y exposicion de la superficie. Los restos de asparagina son particularmente susceptibles a la desamidacion, principalmente cuando estan presentes en la secuencia Asn-Gly, y en menor grado en otras secuencias dipeptidicas tales como Asn-Ala. Cuando tal sitio de desamidacion, en particular Asn-Gly, esta presente en una secuencia de CDR, es deseable por lo tanto eliminar el sitio, tipicamente mediante sustitucion conservativa, para eliminar uno de los restos implicados.

En la tecnica se conocen numerosos metodos para la humanizacion de una secuencia de anticuerpo; vease, por ejemplo, el repaso de Almagro y Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633. Un metodo usado habitualmente es el injerto de CDR, que, por ejemplo para un anticuerpo quimerico derivado de murino, implica identificar contrapartes del gen de linea germinal humano con respecto a los genes de la region variable murinos, e injertar las secuencias de CDR murinas en la region estructural. El injerto de CDR se puede basar en las definiciones de CDR de Kabat, aunque una publicacion reciente (Magdelaine-Beuzelin et al. (2007) Crit Rev. Oncol Hematol. 64: 210-225) ha sugerido que la definicion de IMGT (
www.imgt.org) puede mejorar el resultado de la humanizacion. Puesto que el injerto de CDR puede reducir la especificidad y afinidad de union, y de este modo la actividad biologica, de un anticuerpo no humano con CDR injertada, se pueden introducir retromutaciones en posiciones seleccionadas del anticuerpo con CDR injertada, a fin de retener la especificidad y afinidad de union del anticuerpo progenitor. La identificacion de posiciones para posibles retromutaciones se puede llevar a cabo usando informacion disponible en la bibliografia y en bases de datos de anticuerpos. Los restos de aminoacidos que son candidatos para las retromutaciones son tipicamente aquellos que estan situados en la superficie de una molecula de anticuerpo, mientras que los restos que estan enterrados o que tienen un grado bajo de exposicion en la superficie no se alteraran normalmente. Una tecnica de humanizacion alternativa al injerto de CDR y la retromutacion es la reconformacion de la superficie, en la que se retienen los restos de origen no humano no expuestos en la superficie, mientras que los restos en la superficie se alteran a restos humanos.

En ciertos casos, tambien puede ser deseable alterar uno o mas restos de aminoacidos de la CDR a fin de mejorar la afinidad de union por el epitopo diana. Esto es conocido como “maduracion de la afinidad” y opcionalmente se puede llevar a cabo en relacion con la humanizacion, por ejemplo en situaciones en las que la humanizacion de un anticuerpo conduce a especificidad o afinidad de union reducidas y no es posible mejorar suficientemente la especificidad o afinidad de union mediante retromutaciones solas. En la tecnica se conocen diversos metodos de maduracion de la afinidad, por ejemplo el metodo de mutagenesis por saturacion por barrido in vitro descrito por Burks et al. (1997) PNAS USA, vol. 94, p. 412-417, y el metodo de maduracion de la afinidad in vitro por etapas de Wu et al. (1998) PNAS USA, vol. 95, p. 6037-6042.

Como se senala anteriormente, la presente invencion engloba anticuerpos humanizados, es decir, anticuerpos como se describen de otro modo que se han sometido a humanizacion. Estos tambien se pueden denominar como “variantes humanizadas” de un anticuerpo de la invencion. En particular, las expresiones “secuencia de la region variable de cadena pesada” y “secuencia de la region variable de cadena ligera”, como se usan aqui con referencia a cualquier secuencia de aminoacidos especifica, pretenden englobar no solo esa secuencia especifica, sino tambien cualquier variante humanizada de la misma. Las variantes con madurez de la afinidad de los anticuerpos anti-HER3 descritos aqui tambien estan destinadas a estar englobadas por la presente invencion.

Como se usa aqui, una referencia a una secuencia de la region variable de cadena pesada o una secuencia de la region variable de cadena ligera con un nivel minimo particular de identidad de secuencia en comparacion con una secuencia especifica de la region variable de cadena pesada o de la region variable de cadena ligera, por ejemplo que tiene al menos 90% o al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia, pretende incluir, pero no se limita a, variantes humanizadas y/o con madurez de la afinidad de tal secuencia de referencia.

La expresion “anticuerpo recombinante” se refiere a un anticuerpo que es expresado a partir de una celula o estirpe celular transfectada con un vector de expresion (o posiblemente mas de un vector de expresion, tipicamente dos vectores de expresion) que comprende la secuencia codificante del anticuerpo, en el que dicha secuencia codificante no esta asociada de forma natural con la celula.

El termino “vector” se refiere a una molecula de acido nucleico en la que se puede insertar una secuencia de acido nucleico para el transporte entre diferentes entornos geneticos, y/o para la expresion en una celula hospedante. Un vector que porta elementos reguladores para la transcripcion de la secuencia de acido nucleico (al menos un promotor adecuado) se denomina como un “vector de expresion”. Los terminos “plasmido” y “vector” se pueden usar

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de forma intercambiable. Los vectores de expresion usados en el contexto de la presente invencion pueden ser de cualquier tipo adecuado conocido en la tecnica, por ejemplo un plasmido o un vector virico.

Las expresiones “anticuerpo policlonal” o “mezcla de anticuerpos [monoclonales]” se refieren a una composicion de dos o mas moleculas de anticuerpo diferentes que son capaces de unirse a o de reaccionar con determinantes antigenicos especificos diferentes en los mismos antigenos o en antigenos diferentes. En el contexto de la presente invencion, los anticuerpos individuales de un anticuerpo policlonal se unen a determinantes antigenicos diferentes de HER3. Preferiblemente, los anticuerpos individuales de un anticuerpo policlonal de la invencion se unen a diferentes epitopos de HER3, mas preferiblemente epitopos distintos y sustancialmente que no solapan. Generalmente se piensa que la variabilidad de un anticuerpo policlonal esta situada en las regiones variables de las moleculas del anticuerpo. Una “composicion de anticuerpos policlonales recombinantes anti-HER3” es una composicion que comprende una mezcla de dos o mas anticuerpos monoclonales recombinantes que se unen a HER3.

Es bien conocido en la tecnica que los anticuerpos existen como isotipos diferentes, tales como los isotipos humanos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, o los isotipos murinos IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA. Un anticuerpo de la invencion puede ser de cualquier isotipo. Aunque es posible que los anticuerpos individuales de una composicion de anticuerpos policlonales de la invencion incluyan anticuerpos de mas de un isotipo, preferiblemente todos son del mismo isotipo.

Una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende “al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3” comprendera al menos dos de los anticuerpos especificos, pero puede incluir mas de dos de los anticuerpos anti-HER3 descritos aqui. En ciertos casos, tal composicion de anticuerpos recombinantes puede incluir un numero relativamente grande de anticuerpos anti-HER3 individuales, por ejemplo hasta 10 o mas, tal como hasta 15 o 20, pero normalmente incluira menos de 10 anticuerpos anti-HER3 diferentes, es decir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 anticuerpos. Las composiciones de anticuerpos recombinantes de la invencion incluiran mas tipicamente no mas de alrededor de 6 anticuerpos anti-HER3 diferentes, y en muchos casos incluiran no mas de 4 anticuerpos anti- HER3 diferentes. En realizaciones preferidas, una composicion de anticuerpos recombinantes de la invencion incluira por lo tanto 2, 3 o 4 anticuerpos anti-HER3 diferentes, tipicamente 2 o 3 anticuerpos anti-HER3 diferentes.

El termino “CDR” o “region determinante de la complementariedad” se refiere a las regiones “hipervariables” encontradas en los dominios variables de un anticuerpo que son responsables principalmente de determinar la especificidad de union del anticuerpo. Vease la definicion en Lefranc et al (2003), IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, Dev. Comp Immunol. 27, 55-77. Cada una de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo contiene tres regiones CDR, denominadas CDR1, CDR2 y CDR3, de las cuales CDR3 muestra la variabilidad mas grande.

El termino “epitopo” se usa para describir una parte de una molecula mas grande (por ejemplo, antigeno o sitio

antigenico) que tiene actividad antigenica o inmunogenica en un animal. Un epitopo que tiene actividad

inmunogenica es una porcion de una molecula mas grande que provoca una respuesta de anticuerpo en un animal. Un epitopo que tiene actividad antigenica es una porcion de una molecula mas grande a la que se une

inmunoespecificamente un anticuerpo segun se determina mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Los

epitopos antigenicos no son necesariamente inmunogenicos. Un antigeno es una sustancia a la que se une inmunoespecificamente un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, por ejemplo una toxina, virus, bacteria, proteina o ADN. A menudo, un antigeno o sitio antigenico tiene mas de un epitopo, excepto que sea muy pequeno, y a menudo es capaz de estimular una respuesta inmune. Los epitopos pueden ser lineales o conformacionales. Un epitopo lineal consiste generalmente en alrededor de 6 a 10 aminoacidos adyacentes en una molecula proteica que son reconocidos por un anticuerpo. Por el contrario, un epitopo conformacional consiste en aminoacidos que no estan dispuestos secuencialmente, pero en el que un anticuerpo reconoce una estructura tridimensional particular. Cuando una molecula proteica se pliega en una estructura tridimensional, los aminoacidos que forman el epitopo se yuxtaponen, permitiendo al anticuerpo reconocer el epitopo conformacional. En una proteina desnaturalizada, solamente se reconocen los epitopos lineales. Por definicion, un epitopo conformacional, debe estar fuera de la proteina plegada.

La expresion “epitopos distintos” se refiere al hecho de que cuando dos anticuerpos diferentes de la invencion se unen a epitopos distintos, hay menos de 100% de competicion por la union al antigeno, preferiblemente menos de 80% de competicion por la union al antigeno, mas preferiblemente menos de 50% de competicion por la union al antigeno, y lo mas preferible tan poca competicion como sea posible, tal como menos de alrededor de 25% de competicion por la union al antigeno. Los anticuerpos capaces de competir entre si por la union al mismo antigeno se pueden unir a los mismos epitopos o epitopos que solapan, o pueden tener un sitio de union en la vecindad proxima entre si, de manera que la competicion esta provocada principalmente por impedimento esterico. Un analisis para “epitopos distintos” de pares de anticuerpos se puede llevar a cabo mediante metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo por medio de experimentos de union en condiciones de anticuerpos saturantes usando FACS (clasificacion celular activada por fluorescencia) u otro analisis de citometria de flujo sobre celulas que expresan HER3 y anticuerpos marcados fluorescentemente individuales, o mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando el antigeno de HER3 capturado o conjugado a una superficie de la celula que fluye. En el Ejemplo 12 mas abajo se describe un metodo para determinar la competicion entre anticuerpos usando SPR.

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Los epitopos distintos preferiblemente “no solapan”, en el sentido de que dos anticuerpos anti-HER3 diferentes en una composicion de la invencion tienen una competicion suficientemente baja por la union al antigeno de manera que los dos anticuerpos son capaces de unirse simultaneamente a sus epitopos respectivos. Se entendera por personas expertas en la tecnica que puede haber grados diferentes de solapamiento, y que epitopos distintos pueden ser considerados como “no solapantes” a pesar de la presencia de cierto grado de solapamiento, en tanto que los anticuerpos respectivos sean capaces de unirse sustancialmente a sus epitopos. Esto se considera generalmente que es el caso cuando la competicion por la union al antigeno entre los dos anticuerpos es menor que alrededor de 50%.

De forma similar, un anticuerpo que “compite por la union” con un anticuerpo anti-HER3 de la invencion se puede definir como aquel que exhibe competicion por la union al antigeno de alrededor de 50% o mas.

Los anticuerpos que se unen a diferentes epitopos en el mismo antigeno pueden tener efectos variables sobre la actividad del antigeno al que se unen, dependiendo de la localizacion del epitopo. Un anticuerpo que se une a un epitopo en un sitio activo del antigeno puede bloquear completamente la funcion del antigeno, mientras que otro anticuerpo que se une en un epitopo diferente puede no tener efecto o tener un efecto pequeno sobre la actividad del antigeno solo. Sin embargo, tales anticuerpos pueden todavia activar el complemento y de ese modo dar como resultado la eliminacion del antigeno, y pueden dar como resultado efectos sinergicos cuando se combinan con uno o mas anticuerpos que se unen a diferentes epitopos en el mismo antigeno. En el contexto de la presente invencion, el epitopo es preferiblemente una porcion del dominio extracelular de HER3. Los antigenos de la presente invencion son preferiblemente proteinas, polipeptidos o sus fragmentos de HER3 de dominio extracelular, a los que se une inmunoespecificamente un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Un antigeno asociado a HER3 tambien puede ser un analogo o derivado del dominio extracelular del polipeptido o su fragmento de HER3, al que se une inmunoespecificamente un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

El termino “inmunoglobulina” se usa normalmente como una designacion colectiva de la mezcla de anticuerpos encontrada en sangre o suero, pero tambien se puede usar para designar una mezcla de anticuerpos derivada de otras fuentes.

La expresion “par codificante de Vh y Vl cognado” describe un par original de secuencias codificantes de Vh y Vl contenidas en o derivadas de la misma celula productora de anticuerpos. De este modo, un par cognado de Vh y Vl representa el emparejamiento de Vh y Vl originalmente presente en el donante del que deriva tal celula. La expresion “un anticuerpo expresado a partir de un par codificante de Vh y Vl” indica que un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo se produce a partir de un vector, plasmido u otro polinucleotido que contiene la secuencia codificante de Vh y Vl. Cuando un par codificante de Vh y Vl cognado se expresa, ya sea como un anticuerpo completo o como un fragmento estable del mismo, conservan la afinidad y especificidad de union del anticuerpo expresado originalmente a partir de la celula de la que derivan. Una biblioteca de pares cognados tambien se denomina un repertorio o coleccion de pares cognados, y se puede mantener individualmente o reunido.

Por “proteina” o “polipeptido” se quiere decir cualquier cadena de aminoacidos, independientemente de la longitud o modificacion post-traduccional. Las proteinas pueden existir como monomeros o multimeros, que comprenden dos o mas cadenas polipeptidicas ensambladas, fragmentos de proteinas, polipeptidos, oligopeptidos, o peptidos.

La expresion “promotores de cabeza a cabeza” (tambien conocidos como “promotores bidireccionales”) se refiere a un par de promotores que se colocan de forma muy proxima de manera que la transcripcion de dos fragmentos genicos conducida por los promotores se produce en direcciones opuestas.

“Transfeccion” se usa aqui como un termino amplio para introducir ADN extrano en una celula. El termino tambien pretende cubrir otros metodos equivalentes funcionales para introducir ADN extrano en una celula, tales como, por ejemplo, transformacion, infeccion, transduccion o fusion de una celula donante y una celula aceptora.

El termino “HER3” (tambien conocido como ErbB-3) representa el “receptor 3 del factor de crecimiento epidermico humano”, como se describe en la seccion “Antecedentes de la invencion”. Como se usa aqui, pretende incluir variantes, isoformas y homologos de especies de HER3. Preferiblemente, la union de un anticuerpo de la invencion a HER3 inhibe el crecimiento de celulas que expresan HER3 (es decir, tipicamente celulas tumorales) al inhibir la formacion de complejos heteromericos entre HER3 y otros miembros de la familia de ErbB, por ejemplo heterodimerizacion con HER2.

Como se usa aqui, la expresion “inhibe el crecimiento” (por ejemplo, referido a las celulas) esta destinada a incluir cualquier disminucion medible en la proliferacion (incremento en el numero de celulas) o metabolismo de una celula cuando se pone en contacto con un anticuerpo anti-HER3, en comparacion con el crecimiento de las mismas celulas en ausencia de un anticuerpo anti-HER3, por ejemplo inhibicion del crecimiento de un cultivo celular en al menos alrededor de 10%, y preferiblemente mas, tal como al menos alrededor de 20% o 30%, mas preferiblemente al menos alrededor de 40% o 50%, tal como al menos alrededor de 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, o incluso 100%. La inhibicion del crecimiento se puede determinar, por ejemplo, en estirpes de celulas cancerosas relevantes, como se describe en los ejemplos mas abajo.

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Como se usan aqui, las expresiones “inhibe la dimerizacion” o “inhibe la formacion de dimeros” se refieren a cualquier reduccion medible en la capacidad de HER3 para formar dimeros con otros receptores, en particular HER2, pero tambien EGFR o HER4, como resultado de la union de un anticuerpo anti-HER3, en comparacion con la formacion de dimeros en ausencia de un anticuerpo anti-HER3.

El termino “tratamiento”, como se usa aqui, se refiere a la administracion de un anticuerpo o composicion de anticuerpos anti-HER3 de la invencion en una cantidad suficiente para suavizar, reducir, mejorar o erradicar (curar) sintomas o estados morbidos. La administracion de dos o mas anticuerpos anti-HER3 de la invencion sera generalmente por medio de la administracion simultanea de los anticuerpos, preferiblemente en forma de una composicion que contiene todos los anticuerpos anti-HER3 a usar para el tratamiento. Sin embargo, tambien es posible administrar dos o mas anticuerpos anti-HER3 de la invencion de forma separada. Las referencias aqui a, por ejemplo, la administracion de una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos dos anticuerpos anti-HER3 se deberia entender por lo tanto que engloba no solo la administracion de una composicion que comprende los al menos dos anticuerpos como tales, sino tambien la administracion separada de los anticuerpos. De este modo, se pueden administrar simultanea, secuencial o separadamente combinaciones de dos o mas anticuerpos anti-HER3 de la invencion.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias, por ejemplo, secuencias de la region variable, se refiere al numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (calculado como n° de posiciones identicas/n2 total de posiciones x 100), teniendo en cuenta espacios que se deben introducir para el alineamiento optimo de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando software facilmente disponible. Existen programas de software adecuados de distintas fuentes, tanto para uso en linea como para descargarlos, y para el alineamiento tanto de secuencias proteicas como nucleotidicas. Un programa adecuado es ClustalW (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 11; 22(22):4673-80), disponible de
www.clustal.org, o como alternativa, por ejemplo, del European Bioinformatics Institute (
www.ebi.ac.uk), que tambien proporciona otras diversas herramientas informaticas proteicas y nucleotidicas.

Realizaciones particulares

Un aspecto de la invencion se refiere a diversos nuevos anticuerpos anti-HER3.

Tambien se describe aqui un anticuerpo recombinante anti-HER3 que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada de uno cualquiera de los anticuerpos citados aqui como anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 y 5259.

Se describe aqui un anticuerpo recombinante anti-HER3 que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia CDR3 de cadena ligera de uno cualquiera de los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 y 5259..

Se describe aqui un anticuerpo recombinante anti-HER3 que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de uno cualquiera de los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101,5106, 5143, 5144 y 5259.

Se describe aqui un anticuerpo recombinante anti-HER3 que comprende la secuencia de la region variable de cadena pesada y la secuencia de la region variable de cadena ligera de uno cualquiera de los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 y 5259, o que comprende una variante humanizada y/o con madurez de la afinidad de dicha secuencia de la region variable de cadena pesada y/o de cadena ligera, o que comprende una secuencia de la region variable de cadena pesada y una secuencia de la region variable de cadena ligera que tiene cada una al menos 90%, o al menos 95%, de identidad de secuencia con dichas secuencias de la region variable de cadena pesada y de la region variable de cadena ligera, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con dichas secuencias, y que compiten por la union con dicho anticuerpo.

Se describe aqui un anticuerpo recombinante anti-HER3 que se une al mismo epitopo que y que compite por la union con cualquiera de los anticuerpos definidos anteriormente, asi como composiciones de anticuerpos que comprenden uno o mas de tales anticuerpos, preferiblemente que comprenden al menos dos de tales anticuerpos, por ejemplo dos o tres de tales anticuerpos como se describe en cualquier otra parte aqui.

La Tabla 1 a continuacion muestra los numeros de ID de secuencia, como se expone en el listado de secuencias anejo, para las secuencias de ADN y de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada (VH) y de las cadenas ligeras (LC) de los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 y 5259, (en los que, como se explica anteriormente, la secuencia de cadena ligera incluye tanto la secuencia de la region variable de cadena ligera (VL) como la secuencia de la region constante kappa humana).

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Tabla 1: Numeros de ID de secuencia para las secuencias de ADN y de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada y las cadenas ligeras de anticuerpos anti-HER3 seleccionados

N2 de anticuerpo: Sec. de ADN de VH Sec. de proteina de VH Sec. de ADN de LC Sec. de proteina de LC

4785: 1 2 3 4

4889: 5 6 7 8

4935: 9 10 11 12

5038: 13 14 15 16

5082: 17 18 19 20

5101: 21 22 23 24

5106: 25 26 27 28

5143: 29 30 31 32

5144: 33 34 35 36

5259: 37 38 39 40

Se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3, en la que los anticuerpos primero y segundo se unen a distintos epitopos de HER3, y en la que al menos uno de los anticuerpos primero y segundo se selecciona del grupo de anticuerpos explicados anteriormente, por ejemplo en la que ambos o todos los anticuerpos anti-HER3 en la composicion se seleccionan del grupo de anticuerpos explicados anteriormente.

Se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3, en la que los anticuerpos primero y segundo se unen a distintos epitopos de HER3, y en la que cada uno de los anticuerpos primero y segundo comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101,5106, 5143, 5144 y 5259.

Se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3, en la que los anticuerpos primero y segundo se unen a distintos epitopos de HER3, y en la que cada uno de los anticuerpos primero y segundo comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101,5106, 5143, 5144 y 5259.

Se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3, en la que los anticuerpos primero y segundo se unen a distintos epitopos de HER3, y en la que cada uno de los anticuerpos primero y segundo comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101,5106, 5143, 5144 y 5259.

Tambien se describe una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3, en la que los anticuerpos primero y segundo se unen a distintos epitopos de HER3, y en la que cada uno de los anticuerpos primero y segundo comprende la secuencia de la region variable de cadena pesada o una variante humanizada y/o con maduracion de la afinidad de la misma, y la secuencia de la region variable de cadena ligera o una variante humanizada y/o con maduracion de la afinidad de la misma, de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 y 5259; o en la que cada uno de los anticuerpos primero y segundo comprende una secuencia de la region variable de cadena pesada y una secuencia de la region variable de cadena ligera, que tienen cada una al menos 90% de identidad secuencia, preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia, con las secuencias de la region variable de cadena pesada y de la region variable de cadena ligera, respectivamente, de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 y 5259, y en la que los anticuerpos primero y segundo compiten por la union con los anticuerpos respectivos a partir de los que derivan.

Tambien se describe aqui una composicion de anticuerpos que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3 que se unen a distintos epitopos de HER3; en la que

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a) el primer anticuerpo recombinante comprende una secuencia de la region variable de cadena pesada y una secuencia de la region variable de cadena ligera que tienen al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia, con las secuencias de la region variable de cadena pesada y de la region variable de cadena ligera, respectivamente, de un anticuerpo de referencia cualquiera seleccionado de los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101,5106, 5143, 5144 y 5259, y en la que el primer anticuerpo recombinante se une al mismo epitopo que y compite por la union con dicho anticuerpo de referencia; y

b) el segundo anticuerpo recombinante comprende una secuencia de la region variable de cadena pesada y una secuencia de la region variable de cadena ligera que tienen al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia, con las secuencias de la region variable de cadena pesada y de la region variable de cadena ligera, respectivamente, de un anticuerpo de referencia cualquiera seleccionado de los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 y 5259, en la que dicho anticuerpo de referencia es diferente del anticuerpo de referencia de a), y en la que el segundo anticuerpo recombinante se une al mismo epitopo que y compite por la union con dicho anticuerpo de referencia.

Una realizacion aun adicional de este aspecto de la invencion es una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primero y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3, en la que los anticuerpos primero y segundo se unen a distintos epitopos de HER3, y en la que los anticuerpos primero y segundo son los anticuerpos 5038 y 5082, o sus variantes humanizadas, como se define en las reivindicaciones. Tambien se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3, en la que los anticuerpos primero y segundo se unen a distintos epitopos de HER3, y en la que los anticuerpos primero y segundo se seleccionan del grupo que consiste en los anticuerpos que se unen al mismo epitopo que y compiten por la union con los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 y 5259.

Se describe aqui una composicion de anticuerpos que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3, que se unen a distintos epitopos de HER3, en la que al menos uno de dichos anticuerpos se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia de CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 4785;

(b) un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia de CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 4889;

(C) un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia de CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 4935;

(d) un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia de CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 5038;

(e) un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia de CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 5082;

(f) un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia de CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 5101;

(g) un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia de CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 5106;

(h) un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia de CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 5143;

(i) un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia de CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 5144; y

(j) un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada y la secuencia de CDR3 de cadena ligera del anticuerpo 5259.

Preferiblemente, tanto dicho primer como dicho segundo anticuerpo recombinante anti-HER3 se seleccionan de los anticuerpos (a)-(j) expuestos anteriormente. La composicion tambien puede comprender al menos un tercer anticuerpo recombinante anti-HER3, preferiblemente un anticuerpo seleccionado de los anticuerpos (a)-(j) anteriores. La composicion de anticuerpos puede comprender al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3 que se unen a distintos epitopos de HER3, en la que cada uno de dichos anticuerpos

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primero y segundo se unen al mismo epitopo que y compiten por la union con uno de los anticuerpos (a)-(j) expuestos anteriormente.

Tambien se describe una composicion de anticuerpos que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3 que se unen a distintos epitopos de HER3, en la que al menos unos de dichos anticuerpos se selecciona del grupo que consiste en:

(A) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena ligera del anticuerpo 4785;

(B) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena ligera del anticuerpo 4889;

(C) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena ligera del anticuerpo 4935;

(i) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena ligera del anticuerpo 5038; y

(ii) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena ligera del anticuerpo 5082.

(F) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena ligera del anticuerpo 5101;

(G) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena ligera del anticuerpo 5106;

(H) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena ligera del anticuerpo 5143;

(I) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena ligera del anticuerpo 5144; y

(J) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la region variable de cadena ligera del anticuerpo 5259.

Tanto dicho primer como dicho segundo anticuerpo recombinante anti-HER3 se pueden seleccionar de los anticuerpos (A)-(J) expuestos anteriormente. La composicion tambien puede comprender al menos un tercer anticuerpo recombinante anti-HER3, preferiblemente un anticuerpo seleccionado de los anticuerpos (A)-(J) anteriores. La composicion de anticuerpos puede comprender al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3 que se unen a distintos epitopos de HER3, en la que cada uno de dichos anticuerpos primero y segundo se une al mismo epitopo que y compite por la union con uno de los anticuerpos (A)-(J) expuestos anteriormente.

Se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3, en la que los anticuerpos primero y segundos compiten por la union con los anticuerpos 5082 y 5106, respectivamente, y son:

• anticuerpos 5082 y 5106, o variantes humanizadas y/o con maduracion de la afinidad de los mismos;

• un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 5106;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5106;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5106;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5106; o

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, teniendo cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y

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ligera que tienen cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 5106.

Se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante, en la que los anticuerpos primero y segundos compiten por la union con los anticuerpos 5082 y 4785, respectivamente, y son:

• anticuerpos 5082 y 4785, o variantes humanizadas y/o con maduracion de la afinidad de los mismos;

• un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 4785;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4785;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4785;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4785; o

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, teniendo cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera que tienen cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 4785.

Se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante, en la que los anticuerpos primero y segundos compiten por la union con los anticuerpos 5082 y 5038, respectivamente, y son:

• anticuerpos 5082 y 5038, o variantes humanizadas y/o con maduracion de la afinidad de los mismos;

• un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 5038;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5038;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5038;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5038; o

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, teniendo cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera que tienen cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 5038.

Se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante, en la que los anticuerpos primero y segundos compiten por la union con los anticuerpos 5082 y 5144, respectivamente, y son:

• anticuerpos 5082 y 5144, o variantes humanizadas y/o con maduracion de la afinidad de los mismos;

• un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 5144;

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• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5144;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5144;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5144; o

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, teniendo cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 5082, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera que tienen cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 5144.

Se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante, en la que los anticuerpos primero y segundos compiten por la union con los anticuerpos 4889 y 5143, respectivamente, y son:

• anticuerpos 4889 y 5143, o variantes humanizadas y/o con maduracion de la afinidad de los mismos;

• un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 4889, y un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 5143;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4889, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5143;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4889, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5143;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4889, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5143; o

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, teniendo cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 4889, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera que tienen cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 5143.

Se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante, en la que los anticuerpos primero y segundos compiten por la union con los anticuerpos 4785 y 5038, respectivamente, y son:

• anticuerpos 4785 y 5038, o variantes humanizadas y/o con maduracion de la afinidad de los mismos;

• un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 4785, y un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 5038;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4785, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5038;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4785, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5038;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4785, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5038; o

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, teniendo cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de

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identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 4785, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera que tienen cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 5038.

Se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante, en la que los anticuerpos primero y segundos compiten por la union con los anticuerpos 4785 y 5259, respectivamente, y son:

• anticuerpos 4785 y 5259, o variantes humanizadas y/o con maduracion de la afinidad de los mismos;

• un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 4785, y un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 5259;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4785, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5259;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4785, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5259;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4785, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5259; o

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, teniendo cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 4785, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera que tienen cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 5259.

Se describe aqui una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante, en la que los anticuerpos primero y segundos compiten por la union con los anticuerpos 5106 y 4889, respectivamente, y son:

• anticuerpos 5106 y 4889, o variantes humanizadas y/o con maduracion de la afinidad de los mismos;

• un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 5106, y un anticuerpo que comprende la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 4889;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5106, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4889;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5106, y un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4889;

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5106, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 4889; o

• un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, teniendo cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 5106, y un anticuerpo que comprende las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera que tienen cada una al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de la region variable de cadena pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo 4889.

Las tablas 2 y 3 a continuacion muestran las secuencias de aminoacidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada (Tabla 2) y de la cadena ligera (Tabla 3) de diversos anticuerpos anti-HER3. Las secuencias de aminoacidos de la region variable de cadena pesada y de la cadena ligera, incluyendo la region variable de cadena ligera, de estos anticuerpos, asi como las secuencias codificantes de ADN (optimizadas para la expresion en celulas CHO) se proporcionan en el listado de secuencias anexo. Vease la Tabla 1 anterior para un resumen de los numeros de SEQ ID para estas secuencias.

Tabla 2: Secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de anticuerpos anti-HER3 seleccionados

Numero de anticuerpo: CDR1 de H CDR2 de H CDR3 de H SEQ ID NOs (CDR1/2/3)

4785: GYSFTSYY IYPGSGHT CARPPYYSNYADVW 45-47

4889: GYSITSAYY VSYDGSN CAREGDYGYSDYW 48-50

4935: GYTFTSYY IYPGNVHT CVRRYGYDGDWFAYW 51-53

5038: GYSITSGFY ISYDGSN CARGGGYYGNLFDYW 54-56

5082: GYSITSAYY IGYDGRN CSREGDYGYSDYW 48, 57-58

5101: GFTFSSYG IRDGGGYT CARGILDYW 59-61

5106: GFTFSSFA ISDGGSHL CARGILDYW 62-63, 61

5143: GYSFTSYY IYPGSGHT CARPPYYS NYADVW 45-47

5144: GFSLSRYS IWGGGST CVRKGITTTGFDYW 64-66

5259: GFSLSRYT IWGGGST CARKGITTTGFDYW 67, 65, 68

Tabla 3: Secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de anticuerpos anti-HER3 seleccionados

Numero de anticuerpo: CDR1 de L CDR2 de L CDR3 de L SEQ ID NOs (CDR1/3)

4785: QSLLNSGNQKNY WAS CQSDYSYPYTF 69, 70

4889: QDISNY YTS CQQSNTLPWTF 71,72

4935: ESVDSYGNTF RAS CQQSNEDPWTF 73, 74

5038: QDISNY HTS CQQGITLPWTF 71,75

5082: QDINNY YTS CQQSETLPWTF 76, 77

5101: QDISNY YTS CQQGNTLPYTF 71,78

5106: QDINNY YTS CQQYSRIPYTF 76, 79

5143: QSLLNSGNQKNY WAS CQNDYSYPYTF 69, 80

5144: SSVSY DTS CQQLSSYPPTF 81,82

5259: SSVSY DTS CQQLNSYPPTF 81,83

5 Tambien se describen moleculas de acidos nucleicos que comprenden una secuencia nucleotidica que codifica un anticuerpo, es decir, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 y 5259, o una variante humanizada y/o con madurez de la afinidad de los mismos; o que codifica una secuencia de la region variable de cadena pesada y/o ligera de tal anticuerpo, o una secuencia de cadena pesada y/o ligera que tiene al menos 90% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95% de 10 identidad de secuencia, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia, con tal secuencia de la region variable de cadena pesada y/o ligera.

La molecula de acido nucleico puede comprender una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37 o 39, o secuencias que codifican la misma secuencia de aminoacidos que una cualquiera de dichas secuencias nucleotidicas.

15 Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un vector de expresion que comprende una molecula de acido nucleico como se define anteriormente. Como se senala anteriormente, los vectores de expresion para uso en el contexto de la presente invencion pueden ser de cualquier tipo adecuado conocido en la tecnica, por ejemplo un vector plasmidico o virico.

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Todavia un aspecto adicional de la invencion se refiere a una celula hospedante que comprende una molecula de acido nucleico como se define anteriormente, en la que dicha celula hospedante es capaz de expresar un anticuerpo anti-HER3 codificado por dicha molecula de acido nucleico.

En un aspecto adicional, las especificidades de union de dos cualesquiera anticuerpos individuales descritos aqui se pueden combinar en una molecula de union biespecifica. Tal molecula de union biespecifica comprende preferiblemente las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera de los dos anticuerpos seleccionados. La molecula de union biespecifica puede ser un anticuerpo de dominio variable dual, es decir, en el que los dos brazos del anticuerpo comprenden dos dominios variables diferentes, o puede estar en forma de un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab biespecifico o un scFv biespecifico.

Produccion de anticuerpos anti-HER3 y composiciones de anticuerpos

Tambien se describen metodos para producir un anticuerpo anti-HER3 o una mezcla de anticuerpos anti-HER3 de la invencion. Tambien se describe un metodo para producir un anticuerpo anti-HER3 como se define aqui, que comprende proporcionar una celula hospedante como se define anteriormente capaz de expresar un anticuerpo anti- HER3, cultivar dicha celula hospedante en condiciones adecuadas para la expresion del anticuerpo, y aislar el anticuerpo resultante.

En una realizacion, la invencion se refiere a un metodo para producir una mezcla de anticuerpos recombinantes anti- HER3 de la invencion, que comprende al menos un primer y un segundo anticuerpo recombinante anti-HER3 como se describen aqui, comprendiendo el metodo proporcionar al menos una primera celula hospedante y una segunda celula hospedante, en el que las celulas hospedantes primera y segunda son capaces cada una de expresar un anticuerpo recombinante anti-HER3, cultivar las celulas hospedantes primera y segunda en condiciones adecuadas para la expresion de los anticuerpos primero y segundo, y aislar los anticuerpos primero y segundo resultantes.

Un anticuerpo o una composicion de anticuerpos de la presente invencion se puede producir mediante metodos generalmente conocidos en la tecnica para la produccion de anticuerpos recombinantes monoclonales o policlonales.

De este modo, en el caso de producir un unico anticuerpo de la invencion, se puede usar cualquier metodo conocido en la tecnica para producir anticuerpos monoclonales recombinantes. Para la produccion de una composicion de anticuerpos que comprende dos o mas anticuerpos anti-HER3 de la invencion, los anticuerpos individuales se pueden producir de forma separada, es decir, produciendose cada anticuerpo en un biorreactor separado, o los anticuerpos individuales se pueden producir juntos en un unico biorreactor. Cuando el numero de anticuerpos diferentes en una composicion es mayor que, por ejemplo, dos o tres, generalmente sera preferiblemente por razones de eficacia de coste producir los anticuerpos juntos en un unico biorreactor. Por otro lado, cuando la composicion contiene solamente un numero pequeno de diferentes anticuerpos, por ejemplo dos, tres o posiblemente cuatro anticuerpos diferentes, la decision de producirlos separadamente en diferentes biorreactores, o juntos en un unico biorreactor, se tendra que tomar basandose en circunstancias individuales. Si la composicion de anticuerpos se produce en mas de un biorreactor, la composicion de anticuerpos anti-HER3 purificada se puede obtener reuniendo los anticuerpos obtenidos a partir de sobrenadantes purificados individualmente procedentes de cada biorreactor. En el documento WO 2009/129814 se describen diversos enfoques para producir una composicion de anticuerpos policlonales en multiples biorreactores, en los que las estirpes celulares o preparaciones de anticuerpos se combinan en un punto posterior aguas arriba o antes de o durante el procesamiento aguas abajo.

En el caso de producir dos o mas anticuerpos individuales en un unico biorreactor, esto se puede llevar a cabo, por ejemplo como se describe en los documentos WO 2004/061104 o WO 2008/145133. El metodo descrito en el documento WO 2004/061104 se basa en la integracion especifica del sitio de la secuencia codificante del anticuerpo en el genoma de las celulas hospedantes individuales, asegurandose de que las cadenas proteicas de Vh y Vl se mantienen en su emparejamiento original durante la produccion. Ademas, la integracion especifica del sitio minimiza efectos de posicion, y por lo tanto se espera que el crecimiento y propiedades de expresion de las celulas individuales en la estirpe celular policlonal sean muy similares. En general, el metodo implica lo siguiente: I) una celula hospedante con uno o mas sitios de reconocimiento de recombinasa; II) un vector de expresion con al menos un sitio de reconocimiento de recombinasa compatible con el de la celula hospedante; III) la generacion de una coleccion de vectores de expresion transfiriendo los pares codificantes de Vh y Vl seleccionados desde el vector de cribado hacia un vector de expresion de manera que un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de anticuerpo se pueda expresar a partir del vector (tal transferencia puede no ser necesaria si el vector de cribado es identico al vector de expresion); IV) la transfeccion de la celula hospedante con la coleccion de vectores de expresion y un vector que codifica una recombinasa capaz de combinar los sitios de reconocimiento de recombinasa en el genoma de la celula hospedante con aquel en el vector; V) obtener/generar una estirpe celular policlonal a partir de la celula hospedante transfectada, y VI) expresar y recoger la composicion de anticuerpos a partir de la estirpe celular policlonal.

El documento WO 2008/145133 describe un enfoque alternativo para la produccion de dos o mas anticuerpos diferentes en un unico biorreactor. Este metodo implica la generacion de una estirpe celular policlonal capaz de expresar un anticuerpo policlonal u otra proteina policlonal que comprende dos o mas miembros distintos a)

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proporcionando un conjunto de vectores de expresion, en el que cada uno de dichos vectores comprende al menos una copia de un acido nucleico distinto que codifica un miembro distinto de la proteina policlonal, transfectando de forma separada celulas hospedantes con cada uno de los vectores de expresion en condiciones que eviten la integracion especifica del sitio de los vectores de expresion en el genoma de las celulas, obteniendo de ese modo dos o mas composiciones de celulas, expresando cada composicion un miembro distinto de la proteina policlonal, y c) mezclando las al menos dos composiciones de celulas para obtener una estirpe celular policlonal. Los metodos de los documentos WO 2004/061104 y WO 2008/145133 tienen ambos la ventaja de permitir que todos los miembros que constituyen el anticuerpo policlonal recombinante se produzcan en un unico biorreactor y se purifiquen en un unico proceso, evitando de ese modo la necesidad de procesos de produccion y purificacion distintos para cada anticuerpo, mientras que al mismo tiempo da como resultado una produccion sorprendentemente uniforme de los diferentes anticuerpos. El metodo del documento WO 2008/145133 tiene la ventaja adicional de proporcionar un mayor rendimiento, puesto que cada celula de produccion puede portar multiples copias del polinucleotido que codifica un anticuerpo particular.

Los anticuerpos de la invencion se pueden producir en diversos tipos de celulas, incluyendo celulas de mamiferos asi como celulas eucariotas o procariotas no de mamiferos, tales como celulas vegetales, celulas de insectos, celulas de levaduras, hongos, E. coli, etc. Sin embargo, los anticuerpos se producen preferiblemente en celulas de mamiferos, por ejemplo celulas CHO, celulas COS, celulas BHK, celulas de mieloma (por ejemplo celulas Sp2/0 o NSO), fibroblastos tales como NIH 3T3, o celulas humanas inmortalizadas tales como celulas HeLa, celulas HEK 293 o celulas PER.C6.

Los metodos para transfectar una secuencia de acido nucleico en una celula hospedante son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a edicion, 2001). Para la integracion especifica del sitio, por ejemplo como se describe en el documento WO 2004/061104, una celula hospedante adecuada comprendera uno o mas sitios de reconocimiento de recombinasa en su genoma. En este caso, un vector de expresion adecuado comprende un sitio de reconocimiento de recombinacion que coincide con el sitio o sitios de reconocimiento de recombinasa de la celula hospedante. En el documento WO 2004/061104 se pueden encontrar mas detalles con respecto a, por ejemplo, la transferencia de pares codificantes de VH y VL seleccionados a partir de un vector de cribado usando el enfoque de integracion especifica del sitio.

Cuando una composicion de anticuerpos de la invencion que comprende dos o mas anticuerpos anti-HER3 se va a producir en un unico biorreactor, se pueden seleccionar estirpes celulares con velocidades de proliferacion similares, y preferiblemente niveles de expresion de anticuerpos similares, para generar una estirpe celular policlonal. La estirpe celular policlonal se genera entonces mezclando las estirpes celulares individuales en una relacion predefinida. Veanse los documentos WO 2009/129814, WO 2004/061104 y WO 2008/145133 para mayor informacion y ejemplos relacionados con la generacion de estirpes celulares policlonales que expresan anticuerpos policlonales, asi como la produccion de anticuerpos policlonales usando tales estirpes celulares.

Una realizacion de la presente invencion es asi una estirpe celular policlonal capaz de expresar dos o mas anticuerpos anti-HER3 de la presente invencion. Una realizacion adicional es una estirpe celular policlonal en la que cada celula individual es capaz de expresar un unico par de Vh y Vl, y la estirpe celular policlonal como un todo es capaz de expresar una coleccion de pares de VH y VL, en la que cada par de VH y VL codifica un anticuerpo anti- HER3.

Una composicion de anticuerpos recombinantes de la presente invencion se puede fabricar en un unico biorreactor cultivando una ampolla procedente de un banco de celulas de trabajo policlonales (pWCB) en un medio apropiado durante un periodo de tiempo para permitir un nivel suficiente de expresion de los anticuerpos a la vez que mantiene una uniformidad sustancial en los niveles de expresion relativos de los anticuerpos individuales expresados por la estirpe celular policlonal. Normalmente sera adecuado un tiempo de produccion de entre aproximadamente 15 y 50 dias. Se pueden usar metodos de cultivo conocidos en la tecnica, tales como cultivo por lote alimentado o cultivo por perfusion. El medio de cultivo es preferiblemente un medio libre de suero, mas preferiblemente un medio libre de suero y libre de proteinas, por ejemplo un medio quimicamente definido. Tales medios de cultivo se disenan tipicamente para el crecimiento del tipo celular particular que se use para la produccion, y hay comercialmente disponibles numerosas formulaciones de medios adecuadas.

La composicion de anticuerpos recombinantes se obtiene a partir del medio de cultivo y se purifica mediante tecnicas de purificacion convencionales. Estas pueden incluir, por ejemplo, cromatografia de afinidad combinada con etapas subsiguientes de purificacion tales como cromatografia de intercambio ionico, cromatografia de interaccion hidrofoba y filtracion en gel, puesto que estas tecnicas de purificacion se han usado frecuentemente para la purificacion de anticuerpos recombinantes. Cuando dos o mas anticuerpos son producidos por una estirpe celular policlonal en un unico biorreactor, la presencia de todos los miembros individuales en la composicion de anticuerpos policlonales se evalua tipicamente tras la purificacion, por ejemplo mediante cromatografia de intercambio ionico. La caracterizacion de una composicion de anticuerpos policlonales se puede realizar, por ejemplo, como se describe en los documentos WO 2006/007853, WO 2009/065414, WO 2011/042024 y WO 2011/042027.

Composiciones Terapeuticas

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Otro aspecto de la invencion es una composicion farmaceutica que comprende como ingrediente activo al menos dos anticuerpos anti-HER3 de la invencion, o una composicion de Fab recombinante anti-HER3 u otra composicion de fragmentos de anticuerpos recombinantes anti-HER3. Preferiblemente, el ingrediente activo de tal composicion farmaceutica es una composicion de anticuerpos recombinantes anti-HER3 como se describe anteriormente, que comprende dos o mas anticuerpos anti-HER3. Tales composiciones estan destinadas a mejorar, prevenir y/o tratar el cancer. La composicion farmaceutica se puede administrar a un ser humano o a un animal domestico o mascota, pero tipicamente se administrara a seres humanos.

La relacion entre los anticuerpos individuales en la composicion terapeutica de la invencion, o, en el caso de anticuerpos individuales de la invencion que se administren simultanea, secuencial o separadamente, la relacion entre los anticuerpos a administrar, a menudo sera tal que los anticuerpos se administren en cantidades iguales, pero este no necesariamente tiene que ser el caso. De este modo, una composicion de la invencion que comprende dos anticuerpos anti-HER3 a menudo los contendra en una relacion 1:1, y una composicion que comprende tres anticuerpos anti-HER3 a menudo los contendra en una relacion 1:1:1. Dependiendo de las caracteristicas de los anticuerpos individuales, sin embargo, puede ser deseable usar cantidades no iguales de los diferentes anticuerpos. Las relaciones adecuadas para los diferentes anticuerpos anti-HER3 en las composiciones de la invencion se pueden determinar como se describe en el documento WO 2010/040356, que describe metodos para identificar y seleccionar la relacion estequiometrica optima entre entidades quimicas en un producto farmaceutico combinatorio, por ejemplo una composicion de anticuerpos policlonales, para obtener un farmaco combinatorio con potencia y eficacia optimas.

Ademas de al menos un anticuerpo de la invencion, o fragmento del mismo, la composicion farmaceutica comprendera adicionalmente al menos un diluyente, vehiculo o excipiente farmaceuticamente aceptable. Estos pueden incluir, por ejemplo, conservantes, estabilizantes, tensioactivos/agentes humectantes, agentes emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presion osmotica, y/o amortiguadores. Las disoluciones o suspensiones pueden comprender ademas sustancias que incrementan la viscosidad, tales como carboximetilcelulosa sodica, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilpirrolidona, o gelatina. Un valor de pH adecuado para la composicion farmaceutica estara generalmente en el intervalo de alrededor de 5,5 a 8,5, tal como alrededor de 6 a 8, por ejemplo alrededor de 7, mantenido, cuando sea apropiado, mediante el uso de un amortiguador.

Se puede emplear la practica farmaceutica convencional para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas para administrar, por ejemplo, a pacientes con cancer. La administracion sera tipicamente terapeutica, queriendo decir que se administra despues de que se ha diagnosticado una patologia cancerosa. Se puede emplear cualquier via apropiada de administracion, por ejemplo la administracion parenteral, intravenosa, intraarterial, subcutanea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, en aerosol, en supositorio u oral. Las composiciones farmaceuticas de la invencion se administraran tipicamente en forma de disoluciones o suspensiones liquidas, mas tipicamente disoluciones o suspensiones acuosas, en particular disoluciones o suspensiones acuosas isotonicas.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion se preparan de manera conocida per se, por ejemplo por medio de procedimientos de disolucion, liofilizacion, mezclamiento, granulacion o confeccion convencionales. Las composiciones farmaceuticas se pueden formular segun la practica farmaceutica convencional (vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21s edicion), ed. A.R. Gennaro, 2005, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA; y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, ed. J. Swarbrick, 3a edicion, 2006, Informa Healthcare, New York, NY, USA).

Como alternativa a una formulacion liquida, las composiciones de la invencion se pueden preparar en forma liofilizada que comprende el al menos un anticuerpo, solo o junto con un vehiculo, por ejemplo manitol, en cuyo caso la composicion se reconstituye con un liquido, tal como agua esteril, antes del uso.

Las composiciones farmaceuticas comprenden de aproximadamente 1% a aproximadamente 95%, preferiblemente de aproximadamente 20% a aproximadamente 90%, de ingrediente activo. Las composiciones farmaceuticas segun la invencion se pueden producir, por ejemplo, en forma de dosis unitaria, tal como en forma de ampollas, viales, supositorios, comprimidos, o capsulas. Las formulaciones se pueden administrar a individuos humanos en cantidades terapeutica o profilacticamente eficaces (por ejemplo, cantidades que previenen, eliminan, o reducen una patologia) para proporcionar terapia para una enfermedad cancerosa u otra afeccion. La dosificacion preferida del agente terapeutico a administrar probablemente depende de variables tales como la gravedad del cancer, el estado global de salud del paciente particular, la formulacion de los excipientes del compuesto, y la via de administracion.

Usos terapeuticos de anticuerpos y composiciones segun la invencion

Los anticuerpos anti-HER3 y las composiciones farmaceuticas segun la presente invencion son para uso en el tratamiento o mejora de una enfermedad en un mamifero, en particular el tratamiento de cancer en seres humanos. Una realizacion de la invencion se refiere a anticuerpos y composiciones para uso en la prevencion, tratamiento o mejora de uno o mas sintomas asociados con el cancer en un ser humano u otro mamifero, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composicion de anticuerpos recombinantes anti-HER3 de la presente invencion a dicho mamifero.

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Una realizacion particular se refiere a anticuerpos y composiciones para uso en el tratamiento de un paciente humano con un trastorno caracterizado por la expresion de HER3, en particular cancer, que comprende administrar a dicho paciente un anticuerpo recombinante anti-HER3 como se define aqui, o preferiblemente una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos dos anticuerpos anti-HER3 como se define aqui.

Tambien se describe un metodo para reducir la formacion de heterodimeros entre HER3 y otros receptores de la familia de ErbB en celulas que expresan HER3, comprendiendo el metodo poner en contacto dichas celulas con un anticuerpo recombinante anti-HER3 como se define aqui, o preferiblemente con una composicion de anticuerpos recombinantes que comprende al menos dos anticuerpos anti-HER3 como se define aqui.

Una realizacion adicional de la presente invencion es el anticuerpo recombinante anti-HER3 o la composicion de anticuerpos de la presente invencion para uso en el tratamiento, mejora o prevencion de uno o mas sintomas asociados con cancer en un ser humano u otro mamifero, por ejemplo para el tratamiento de un paciente humano con un trastorno caracterizado por la expresion de HER3.

Basandonos en un numero de factores, incluyendo los niveles de expresion de HER3, los siguientes tipos de tumores en particular pueden estar indicados para el tratamiento con la composicion de anticuerpos de la invencion: cancer de mama, ovarico, gastrico, de colon, de recto, de prostata, de vejiga, de pancreas, de cabeza y cuello, y de pulmon no microcitico. Se contempla que las composiciones de anticuerpos de la invencion son particularmente aplicables al tratamiento de canceres que expresan HER3, por ejemplo ciertos canceres epiteliales tales como muchos canceres de mama, canceres ovaricos y canceres gastricos (de estomago).

En relacion con cada una de estas indicaciones, se contemplan dos rutas clinicas principales, a saber, 1) terapia adyuvante en relacion con al menos un tratamiento terapeutico adicional, o 2) como una monoterapia. Estas dos opciones se explican brevemente a continuacion.

1) Terapia adyuvante: En terapia adyuvante, tambien conocida como terapia de combinacion, los pacientes se trataran con anticuerpos de la presente invencion en combinacion con al menos un tratamiento terapeutico adicional, tipicamente un agente quimioterapeutico o antineoplasico y/o terapia de radiacion. Como alternativa, o adicionalmente, los anticuerpos anti-HER3 y composiciones de la invencion tambien se pueden usar en combinacion con un anticuerpo contra el cancer diferente, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra EGFR o VEGF. Las dianas de canceres primarios enumeradas anteriormente se pueden tratar asi mediante administracion de un anticuerpo o composicion de la invencion, ademas de una terapia estandar de primera linea y de segunda linea. Los disenos de protocolo abordaran la efectividad segun se evalua, por ejemplo, mediante la reduccion en la masa tumoral, asi como la capacidad para reducir las dosis habituales de la quimioterapia estandar. Tales reducciones de las dosis permitiran una terapia adicional y/o prolongada reduciendo la toxicidad del agente quimioterapeutico relacionada con la dosis.

Al combinar las composiciones de anticuerpos de la invencion con agentes que se sabe inducen diferenciacion terminal de celulas cancerosas, el efecto se puede mejorar aun mas. Tales compuestos se pueden seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en acido retinoico, acidos trans-retinoicos, acidos cis-retinoicos, butirato de fenilo, factor de crecimiento de nervios, dimetilsulfoxido, forma activa de la vitamina D3, receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas, 13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol, hexametilen-bis-acetamida, factor beta de crecimiento transformante, acido butirico, AMP ciclico, y vesnarinona. Preferiblemente, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en acido retinoico, butirato de fenilo, acido todo-trans-retinoico, forma activa de la vitamina D.

Los articulos farmaceuticos que comprenden una composicion de anticuerpos de la invencion y al menos un compuesto quimioterapeutico o antineoplasico se pueden usar como tratamiento de combinacion para la administracion simultanea, separada o sucesiva en terapia contra el cancer. El compuesto quimioterapeutico puede ser cualquier agente quimioterapeutico adecuado para el tratamiento del cancer particular en cuestion, por ejemplo un agente seleccionado del grupo que consiste en agentes alquilantes, por ejemplo derivados del platino, tales como cisplatino, carboplatino u oxaliplatino; alcaloides vegetales, por ejemplo paclitaxel, docetaxel o irinotecan; antibioticos antitumorales, por ejemplo doxorrubicina (adriamicina); inhibidores de topoisomerasas, tales como topotecan; y antimetabolitos, por ejemplo fluorouracilo u otras fluoropirimidinas.

Tambien se contempla que los anticuerpos de la invencion se pueden usar en terapia adyuvante en relacion con inhibidores de tirosina cinasas (TKIs). Estos son moleculas sinteticas de bajo peso molecular, principalmente derivadas de quinazolina, que interaccionan con el dominio de tirosina cinasa intracelular de los receptores e inhiben la fosforilacion del receptor inducida por ligandos, al competir por el sitio de union a Mg-ATP intracelular. Actualmente estan en desarrollo clinico varios inhibidores de tirosina cinasas que bloquean receptores de la familia de EGFR. Para un repaso de estos TKIs, vease Spector et al. (2007) Breast Cancer Res. 9(2): 205. Los articulos farmaceuticos que comprenden una composicion de anticuerpos de la invencion y al menos un TKI dirigido contra HER3 tambien se pueden usar de este modo como un tratamiento de combinacion para la administracion simultanea, separada o sucesiva en terapia contra el cancer.

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En otras realizaciones, las composiciones de anticuerpos de la presente invencion se pueden usar en combinacion con otras terapias de anticuerpos. Los ejemplos de estos incluyen, por ejemplo, anticuerpos contra EGFR (Erbitux® o Vectibix®) o VEGF (Avastin®), asi como otros anticuerpos anti-RTK, por ejemplo uno o mas anticuerpos contra una o mas dianas de RTK tales como HER2 o MET. En todavia otras realizaciones, las composiciones de anticuerpos de la presente invencion se pueden usar en combinacion con un agente que se sabe que estimula las celulas del sistema inmune, conduciendo tal tratamiento de combinacion a una mejora potenciada mediada por el sistema inmune de la eficacia de las composiciones de anticuerpos de la invencion. Los ejemplos de tales agentes que estimulan el sistema inmune incluyen interleucinas recombinantes (por ejemplo, IL-21 e IL-2).

2) Monoterapia: En relacion con el uso de los anticuerpos segun la presente invencion en monoterapia de tumores, los anticuerpos se pueden administrar a pacientes sin el uso concurrente de un agente quimioterapeutico o antineoplasico, es decir, como una terapia autonoma.

Inmunoconjugados

Otra opcion para uso terapeutico de los anticuerpos y composiciones de la invencion es en forma de inmunoconjugados, es decir, anticuerpos conjugados a uno o mas agentes contra el cancer. En particular, en el caso de composiciones que comprenden dos o mas anticuerpos individuales de la invencion que se unen a distintos epitopos de HER3, se contempla que esto puede generar una red reticulada de anticuerpo-receptor en la superficie celular, dando potencialmente de ese modo como resultado un mayor nivel de internacionalizacion del receptor en comparacion con el uso de un solo anticuerpo monoclonal. La conjugacion de uno o mas de los anticuerpos individuales de tal composicion a uno o mas agentes contra el cancer tiene por lo tanto el potencial de suministrar especifica y eficazmente los agentes contra el cancer conjugados hacia interior de las celulas tumorales, aumentando de ese modo el efecto de los anticuerpos anti-HER3 de la invencion para proporcionar una actividad de exterminio de celulas tumorales mejorada.

Diversos tipos de agentes contra el cancer se pueden conjugar a los anticuerpos de la invencion, incluyendo agentes citotoxicos (incluyendo agentes quimioterapeuticos convencionales y otros farmacos anticancerosos de tipo pequena molecula), citocinas (en cuyo caso el conjugado se puede denominar una “inmunocitocina”), toxinas (en cuyo caso el conjugado se puede denominar una “inmunotoxina”) y radionuclidos, y ya se han aprobado para uso clinico unos pocos inmunoconjugados. Estos incluyen Zevalin® (un anticuerpo murino anti-CD20 conjugado con 90Y), Bexxar® (un anticuerpo murino anti-CD20 conjugado con 131I) y Mylotarg® (un anticuerpo humanizado anti-CD33 conjugado con caliqueamicina). Otros inmunoconjugados que se han estudiado en ensayos clinicos incluyen anticuerpos conjugados con, por ejemplo, doxorrubicina o un compuesto de maitansinoide. Las inmunotoxinas que se han estudiado en ensayos clinicos incluyen varios anticuerpos conjugados con una enterotoxina A de Pseudomonas truncada. Tambien se ha ensayado una inmunocitocina que comprende un anticuerpo humanizado anti-EpCAM conjugado con IL-2.

En el caso de anticuerpos de la invencion conjugados con agentes citotoxicos, estos pueden pertenecer, por ejemplo, a cualquiera de las clases principales de farmacos quimioterapeuticos, incluyendo agentes alquilantes (por ejemplo carboplatino, cisplatino, oxaliplatino), antimetabolitos (por ejemplo metotrexato, capecitabina, gemcitabina), antraciclinas (por ejemplo bleomicina, doxorrubicina, mitomicina-C), y alcaloides vegetales (por ejemplo taxanos tales como docetaxel y paclitaxel, y alcaloides de vinca tales como vinblastina, vincristina y vinorrelbina). Puesto que el uso de los inmunoconjugados dirige especificamente el agente anticanceroso contra los tumores, y en particular hacia el interior de las celulas tumorales tras la internalizacion, los inmunoconjugados basados en los anticuerpos anti-HER3 de la invencion se pueden basar ventajosamente en agentes muy citotoxicos tales como caliqueamicina o derivados de maitansina, o basados en toxinas tales como toxinas bacterianas (por ejemplo exotoxina A de Pseudomonas, toxina de la difteria) o toxinas vegetales (por ejemplo ricina).

El agente anticanceroso conjugado en un inmunoconjugado esta enlazado generalmente al anticuerpo por medio de un enlazador labil que es relativamente estable en suero, pero que permite la liberacion del agente cuando el inmunoconjugado se internaliza en la celula diana. Los enlazadores adecuados incluyen, por ejemplo, enlazadores quimicos, que son estables a pH neutro en suero pero que se someten a hidrolisis acida en condiciones levemente acidas en los lisosomas tras la internalizacion, los enlazadores de disulfuro, que se escinden mediante tioles intracelulares, y los enlazadores peptidicos, que son estables en suero pero que se someten a escision enzimatica en compartimientos intracelulares.

En las composiciones que contienen dos o mas anticuerpos de la invencion se pueden idear diversas disposiciones de la conjugacion. Por ejemplo, con dos anticuerpos, seria posible conjugar los anticuerpos a dos o mas farmacos anticancerosos diferentes, o conjugar un anticuerpo a un profarmaco que se activa mediante un agente tal como una enzima conjugada al otro anticuerpo.

El concepto general de terapia con profarmacos dirigidos contra complejos de anticuerpos unidos a enzimas (ADEPT) se ha descrito para anticuerpos monoclonales, en el que un profarmaco es activado por una enzima dirigida hacia el tumor mediante un conjugado de mAB-enzima, pero la presente invencion puede proporcionar la

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oportunidad de personalizar este enfoque a condiciones particulares. De este modo, puede ser posible incrementar especificamente la muerte de celulas tumorales a la vez que se economiza o se reduce el dano a tejidos normales.

Para informacion adicional sobre inmunoconjugados anti-cancerosos, vease Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146; Schrama et al. (2006) Nature Reviews/Drug Discovery 5:147-159; y Rohrer (2009) chimica oggi/Chemistry Today 27(5):56-60.

Dosis y via de administracion

Los anticuerpos y composiciones de la invencion se administraran en una cantidad eficaz para el tratamiento de la afeccion en cuestion, es decir, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios para lograr un resultado deseado. Una cantidad terapeuticamente eficaz puede variar segun factores tales como la afeccion particular que se este tratando, la edad, sexo y peso del paciente, y si los anticuerpos anti-HER3 son administrados como un tratamiento autonomo o en combinacion con uno o mas tratamientos contra el cancer adicionales.

Una cantidad eficaz para la terapia tumoral se puede medir mediante su capacidad para estabilizar la progresion de la enfermedad y/o mejorar los sintomas en un paciente, y preferiblemente para invertir la progresion de la enfermedad, por ejemplo reduciendo el tamano del tumor. La capacidad de un anticuerpo o composicion de la invencion para inhibir el cancer se puede evaluar mediante ensayos in vitro, por ejemplo como se describe en los ejemplos, asi como en modelos de animales adecuados que predicen la eficacia en tumores humanos. Se seleccionaran regimenes de dosificacion adecuados a fin de proporcionar una respuesta terapeutica optima en cada situacion particular, por ejemplo administrada como un unico bolo o como una infusion continua, y con ajuste posible de la dosis segun se indique por las exigencias de cada caso.

Aunque no se ha determinado todavia la dosificacion especifica para anticuerpos segun la invencion, se pueden determinar ciertas consideraciones de la dosificacion a traves de la comparacion con un producto similar (por ejemplo un anticuerpo monoclonal dirigido contra HER2 o EGFR) que ha sido aprobado para uso terapeutico. De este modo, se contempla que una dosis apropiada de una composicion de anticuerpos de la invencion sera similar a la dosis recomendada para el anticuerpo monoclonal anti-HER2 trastuzumab (Herceptin®) o el anticuerpo monoclonal anti-EGFR panitumumab (Vectibix®). Dependiendo de la afeccion particular, Herceptin® se administra (por medio de infusion) para el tratamiento de cancer de mama a una dosis inicial de 4 mg/kg y dosis semanales subsiguientes de 2 mg/kg, o una dosis inicial de 8 mg/kg, y dosis subsiguientes de 6 mg/kg cada tres semanas, mientras que Vectibix® se administra a una dosis de 6 mg/kg cada 14 dias.

Se contempla que una dosis adecuada de una composicion de anticuerpos de la invencion estara en el intervalo de 0,1-100 mg/kg, tal como alrededor de 0,5-50 mg/kg, por ejemplo alrededor de 1-20 mg/kg. Las composiciones de anticuerpos se pueden administrar, por ejemplo, en una dosis de al menos 0,25 mg/kg, por ejemplo al menos 0,5 mg/kg, tal como al menos 1 mg/kg, por ejemplo al menos 1,5 mg/kg, tal como al menos 2 mg/kg, por ejemplo al menos 3 mg/kg, tal como al menos 4 mg/kg, por ejemplo al menos 5 mg/kg; y por ejemplo hasta como maximo 50 mg/kg, tal como hasta como maximo 30 mg/kg, por ejemplo hasta como maximo 20 mg/kg, tal como hasta como maximo 15 mg/kg. La administracion se repetira normalmente a intervalos adecuados, por ejemplo una vez cada semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o una vez cada cuatro semanas, y durante un tiempo tan prolongado como se considere apropiado por el medico responsable, quien puede incrementar o disminuir opcionalmente la dosificacion segun sea necesario.

Para el suministro de los anticuerpos de la invencion se contemplan tres enfoques de suministro distintos. El suministro intravenoso convencional sera presumiblemente la tecnica de suministro estandar para la mayoria de tumores. Sin embargo, en relacion con tumores en la cavidad peritoneal, tales como tumores de los ovarios, conducto biliar, otros conductos, y similares, la administracion intraperitoneal puede probar ser favorable para obtener una dosis elevada de anticuerpo en el tumor y minimizar el aclaramiento del anticuerpo. De forma similar, ciertos tumores solidos poseen una vasculatura que es apropiada para la perfusion regional. La perfusion regional puede permitir obtener una dosis elevada del anticuerpo en el sitio de un tumor y minimizar el aclaramiento a corto plazo del anticuerpo.

Al igual que con cualquier producto terapeutico basado en infusion de proteinas o de anticuerpos, los problemas de seguridad estan relacionados principalmente con (i) sindrome de liberacion de citocinas, es decir, hipotension, fiebre, temblores, escalofrios, (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogena contra la proteina (es decir, desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente contra el producto de anticuerpo recombinante), y (iii) toxicidad contra celulas normales que expresan el receptor de HER3. Para monitorizar cualesquiera de tales problemas de seguridad, se utilizan ensayos estandar y procedimientos de seguimiento.

La invencion se describira adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Clonacion de anticuerpos anti-HER3

Inmunizacion

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Para las inmunizaciones, se usaron tres ratones hembra, un raton BALB/cJ, un raton C57BL/6, y un raton C3H (8-10 semanas). Los ratones se inmunizaron con la protefna HER3 comercialmente disponible (R&D Systems n° de catalogo 348-RB). Para las primeras cuatro inmunizaciones, la protefna HER3 se diluyo en PBS y se mezclo 1:1 (v/v) con adyuvante de Freund. Las inmunizaciones quinta y final se administraron sin adyuvante con la protefna HER3 en PBS.

El adyuvante se usa para potenciar y modular la respuesta inmune. En la primera inmunizacion se uso adyuvante completo de Freund (CFA), mientras que para la segunda, tercera y cuarta inmunizacion se uso adyuvante incompleto de Freund (IFA). IFA es una emulsion de aceite en agua compuesta de aceites minerales, y CFA es IFA con las especies anadidas de Mycobacterium deshidratadas, destruidas por calor. Ambos adyuvantes tienen un efecto de deposito. La micobacteria en CFA da como resultado una fuerte activacion del sistema inmune, lo que conduce a una persistencia a largo plazo de la respuesta inmune. Solamente se administraron a los ratones emulsiones estables.

Se usaron diez mg de protefna HER3 recombinante para cada inmunizacion. En total, los ratones recibieron cinco inyecciones. Todos los ratones se inyectaron subcutaneamente (s.c.) con 200 ml de emulsion de antfgeno-adyuvante para las primeras cuatro inyecciones, e intraperitonealmente (i.p.) con 100 ml de antfgeno en PBS para la quinta inyeccion. En la Tabla 4 se encuentra un resumen de las inmunizaciones, adyuvantes, vfas de inyeccion, etc.

Los ratones se sacrificaron mediante dislocacion cervical, y se recogieron los bazos y los ganglios linfaticos inguinales. Se prepararon suspensiones monocelulares macerando a traves de un filtro celular de 70 mm (Falcon, BD Biosciences, n° de catalogo 352350). Las celulas procedentes de los tres ratones se reunieron, se resuspendieron en RPMI-1640 frfo con 10% de FBS, y se centrifugaron.

Tabla 4: Resumen de inmunizaciones.

Di'a: Inmunizacion Adyuvante Anti'geno mg/dosis Conc. de anti'geno mg/ml Volumen de la dosis Via de administracion

0: 1s CFA 10 50 200 ml s.c.

21: 2s IFA 10 50 200 ml s.c.

42: 3s IFA 10 50 200 ml s.c.

69: 4s IFA 10 50 200 ml s.c.

86: 5s PBS 10 100 100 ml i.p.

89: Recogida de organos

Clasificacion mediante FACS de celulas plasmaticas murinas

Para eliminar los globulos rojos, la suspension celular reunida se liso en NH4CI 0,17 M. Despues de la lisis, las celulas se lavaron dos veces en FBS 2%/PBS. Las celulas se resuspendieron en 1 ml de FBS 2%/PBS, se incubaron con Fc-block (anti-CD16/CD32 de raton, BD Biosciences, n° de cat. 553141), y se lavaron una vez. Despues de la resuspension en FBS 2%/PBS, las celulas se tineron con anti-CD43 de raton-FITC (BD Biosciences, n° de cat. 553270), anti-CD138 de raton-PE (BD Biosciences, n° de cat. 553714), anti-lgM de raton-Horizon (BD Biosciences, n° de cat. 560575), anti-lgG 1 de raton-APC (BD Biosciences, n° de cat. 550874), anti-MHC II (l-A/l-Ed) de raton- biotina (BD Biosciences, n° de cat. 553622) y anti-B220/CD45R de raton-PerCP (bD Biosciences, n° de cat. 553093) durante 20 minutos en la oscuridad. Las celulas se lavaron, se incubaron con Estreptavidina-APC-Cy7 (BD Biosciencies, n° de cat. 554063) durante 20 minutos, y se lavaron. Las celulas se clasificaron mediante FACS en un clasificador de celulas FACSAria™. Las celulas que fueron B220lowMHCIIintCD43+CD138+lgM- se clasificaron como monocelulas en placas de microtitulacion de 384 pocillos que contenfan amortiguador de reaccion de PCR. Las placas se centrifugaron, se congelaron y se almacenaron a -80°C.

Enlace de pares de Vh y Vl similares

El enlazamiento de las secuencias codificantes de Vh y Vl se realizo en las celulas individuales acotadas como celulas plasmaticas, facilitando el apareamiento similar de las secuencias codificantes de Vh y Vl. El procedimiento utilizo un procedimiento de PCR de dos etapas basado en una RT-PCR de extension del solapamiento multiple de una sola etapa, seguido de una PCR anidada. Las mezclas de cebadores usadas en el presente ejemplo unicamente amplifican las cadenas ligeras kappa. Sin embargo, si se desea, se podrfan anadir cebadores capaces de amplificar las cadenas ligeras lambda a la mezcla de cebadores multiples y a la mezcla de cebadores de PCR anidada. Si se anaden cebadores lambda, el procedimiento de clasificacion debe ser adaptado de tal forma que las

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celulas lambda positivas no se excluyen. El principio para el enlazamiento de las secuencias Vh y Vl similares se describe con detalle en el documento WO 2005/042774 y en Meijer et al. (2006) J Mol Biol. 358(3):764-72.

Se descongelaron placas de PCR de 96 pocillos, y las celulas clasificadas sirvieron como molde para la RT-PCR de extension del solapamiento multiple. El amortiguador de clasificacion anadido a cada pocillo antes de la clasificacion de las celulas individuales contenia amortiguador de reaccion (amortiguador OneStep RT-PCR; Qiagen), cebadores para RT-PCR, e inhibidor de ARNasa (RNasin, Promega). Los cebadores usados para la RT-PCR de extension del solapamiento, asi como las concentraciones de cebador, fueron las mismas que las mostradas en la Tabla 3 del documento WO 2008/104183. Esto se suplemento con la mezcla OneStep RT-PCR5Enzyme (dilucion 25x; Qiagen) y la mezcla de dNTP (200 pM cada uno) para obtener la concentracion final dada, en un volumen de reaccion de 20 ml. Las placas se incubaron durante 30 minutos a 55°C para permitir la transcripcion inversa (RT) del ARN de cada celula. Despues de la RT, las placas se sometieron al siguiente ciclo de PCR: 10 minutos a 94°C, 35x (40 segundos a 94°C, 40 segundos a 60°C, 5 minutos a 72°C), 10 minutos a 72°C.

Las reacciones de PCR fueron realizadas en un ciclador termico H20BIT con una Canasta de Sello Desprendible para 24 placas de 96 pocillos (ABgene), para facilitar un alto rendimiento. Las placas de PCR se almacenaron a - 20°C despues del ciclo.

Para la etapa de la PCR anidada, se prepararon placas de PCR de 96 pocillos con la siguiente mezcla en cada pocillo (reacciones de 20 pl) para obtener la concentracion final dada: amortiguador FastStart (Roche) 1x, mezcla de dNTP (200 pM cada uno), mezcla de cebadores anidados, ADN-polimerasa Phusion (0,08 U; Finnzymes), y la Mezcla de Enzimas de Alta Fidelidad FastStart (0,8 U; Roche). Los cebadores usados para la PCR anidada, asi como las concentraciones de los cebadores, fueron las mismas que las mostradas en la Tabla 4 del documento WO 2008/104183. Como molde para la PCR anidada, se transfirio 1 pl de las reacciones de PCR multiple de extension del solapamiento. Las placas de PCR anidada se sometieron al siguiente ciclo termico: 35x (30 segundos a 95°C, 30 segundos a 60°C, 90 segundos a 72°C), 10 minutos a 72°C. Las reacciones aleatoriamente seleccionadas se analizaron sobre un gel de agarosa al 1% para verificar la presencia de un fragmento de de extension del solapamiento de aproximadamente 890 pares de bases (pb). Las placas se almacenaron a -20°C hasta el procesamiento posterior de los fragmentos de PCR.

Los reportorios de los pares codificantes de Vh y Vl enlazados procedentes de la PCR anidada se combinaron, sin mezclar los pares de diferentes donantes, y se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, preparativa. La secuencia codificante de la cadena ligera constante kappa humana se ayusto mediante extension del solapamiento a la region codificante de Vl de los productos de PCR combinados de los pares codificantes Vh y Vl enlazados, como se describe en el documento WO 2008/104183. La secuencia codificante de la cadena ligera constante kappa humana se amplifico a partir de un plasmido que contenia la secuencia codificante de un anticuerpo humano con una cadena ligera kappa en una reaccion que contenia: Enzima Phusion (2 U; Finnzymes), amortiguador Phusion 1x, mezcla de dNTP (200 pM cada uno), cebador hKCforw-v2, y el cebador Kappa3’ (veanse en la Tabla 5 del documento WO 2008/104183 los cebadores y las concentraciones empleadas), y el molde de plasmido pLL138 (10 ng/pl) en un volumen total de 50 pl. La reaccion se sometio al siguiente ciclo termico: 25x (30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C, 45 segundos a 72°C), 10 minutos a 72°C. El fragmento de la PCR resultante se purifico mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% preparativa.

Los fragmentos de la PCR combinados purificados, procedentes de cada repertorio, se ayustaron al fragmento de PCR amplificado y purificado de la region codificante constante kappa humana (SEQ ID NO: 42) mediante el siguiente ayuste por PCR de extension del solapamiento (50 pl de volumen total) que contenia: el fragmento de la region codificante constante kappa humana (1,4 ng/pl), el fragmento de PCR combinado purificado (1,4 ng/pl), ADN- polimerasa Phusion (0,5 U; Finnzymes), y la Mezcla Enzimatica de Alta Fidelidad FastStart (0,2 U; Roche), amortiguador FastStart (Roche) 1x, mezcla de dNTP (200 pM cada uno), el cebador mhKCrev, y los cebadores del conjunto mJH (vease la Tabla 5 del documento WO 2008/104183 para los cebadores y las concentraciones empleadas). La reaccion se sometio al siguiente ciclo termico: 2 minutos a 95°C, 25x (30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C, 1 minuto a 72°C), 10 min a 72°C. El fragmento de la PCR resultante (aproximadamente 4518 pb) se purifico mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% preparativa.

Insercion de los pares codificantes de Vh y Vl similares en un vector de cribado

Con el fin de identificar los anticuerpos con especificidad de union por HER3, las secuencias codificantes de Vh y Vl obtenidas se expresaron como anticuerpos de longitud completa. Esto implico la insercion del reportorio de los pares codificantes de Vh y Vl dentro de un vector de expresion, y la transfeccion en una celula hospedante.

Se empleo un procedimiento de clonacion de dos etapas para generar un repertorio de vectores de expresion que contenian los pares codificantes de Vh y Vl enlazados. Estadisticamente, si el repertorio de vectores de expresion contiene diez veces tantos plasmidos recombinantes como el numero de productos de PCR de Vh y Vl apareados similares usados para la generacion del repertorio de cribado, existe una probabilidad del 99% de que esten representados todos los pares de genes unicos. De este modo, si se obtuvieron 400 fragmentos del gen V de la extension del solapamiento, se generaria un repertorio de al menos 4000 clones para que el cribado tenga una probabilidad del 99% de obtener todos los pares de genes unicos.

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De forma breve, los productos de la PCR purificados de los repertorios de los pares codificantes de Vh y Vl enlazados, ayustados a la region codificante constante kappa humana, se escindieron con las endonucleasas de ADN XhoI y Noll en los sitios de reconocimiento introducidos en los extremos de los productos de la PCR. Los fragmentos escindidos y purificados se ligaron en un vector de expresion de IgG de mamifero digerido con XhoI/Notl, 00-VP-002 (descrito en el documento WO 2008/104183), mediante procedimientos convencionales de ligacion. La mezcla de ligacion se sometio a electroforesis en E. coli, y se anadio a placas 2xYT que contenian el antibiotico apropiado, y se incubaron a 37°C toda la noche. El repertorio amplificado de vectores se purifico a partir de las celulas recuperadas de las placas usando los metodos de purificacion de ADN convencionales (Qiagen). Los plasmidos se prepararon para la insercion de los fragmentos del promotor lider mediante escision usando las endonucleasas AscI y Nhel. Los sitios de restriccion para estas enzimas estaban localizados entre los pares de genes codificantes de Vh y Vl. Despues de la purificacion del vector, se inserto un fragmento del promotor lider de mamifero, bidireccional, digerido con AscI-NheI, en los sitios de restriccion de AscI y Nhel mediante procedimientos de ligacion convencionales. El vector ligado se amplifico en E. coli, y el plasmido se purifico usando metodos convencionales. El repertorio generado de vectores de cribado se transformo en E. coli mediante procedimientos convencionales. Las colonias obtenidas se consolidaron en placas maestras de 384 pocillos, y se almacenaron.

Para la amplificacion de los plasmidos de expresion de mamifero, se empleo un procedimiento de dos etapas. En primer lugar, las bacterias se sometieron a lisis, y el ADN se desnaturalizo por incubacion en hidroxido de sodio. Posteriormente, se realizo la amplificacion TempliPhi (GE Amersham). Este metodo utiliza la ADN polimerasa del bacteriofago F29 para amplificar exponencialmente los moldes de ADN circulares bicatenarios mediante amplificacion de circulo rodante. Para la expresion del anticuerpo en celulas de mamifero, se aplico el sistema de expresion 293Freestyle™ (Invitrogen), usando las condiciones de transfeccion estandar segun las recomienda el fabricante. Las celulas se suplementaron con valproato hasta 50 mM antes de la transfeccion, y al dia siguiente se anadio Tryptone N1 hasta una concentracion final de 1,5% (p/v) del volumen de transfeccion. Los sobrenadantes que contenian los anticuerpos se cosecharon seis dias despues de la transfeccion. Los niveles de expresion se estimaron con ELISA anti-lgG estandar.

Cribado para determinar la union a la proteina HER3 recombinante (ELISA)

La especificidad del anticuerpo se determino mediante ELISA usando como antigeno la proteina HER3 recombinante.

En resumen, se revistieron placas Nunc Maxisorb (n° de cat. 464718) con 1 mg/ml de proteina HER3 (R&D Systems, n° de cat. 348-RB), diluida con PBS a 4°C toda la noche. Antes del bloqueo en 50 ml de leche al 2%-PBS + Tween 20 al 0,05%, las placas se lavaron una vez con PBS-T. Las placas se lavaron una vez con PBS-T y 20 ml de leche al 2%-PBS-T, y se anadieron 10 ml de sobrenadantes de los transfectantes FreeStyle293, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, despues de lo cual las placas se lavaron una vez con PBS-T, 20 ml por pocillo. Se anadio anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti-cadena ligera kappa humana-HRP, Serotec, n° de cat. STAR 100P), diluido 1:25000 en leche al 2%-PBS-T, para detectar los anticuerpos unidos a los pocillos, y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez en PBS-T antes de la adicion de 25 ml del sustrato (Kem-En-Tec Diagnostics, n° de cat. 4518), que se incubo durante 5 minutos. Se anadieron 25 ml de acido sulfurico 1M despues de la incubacion, para detener la reaccion. La senal especifica se detecto en un lector de ELISA a 450 nm. A partir de los datos de ELISA, se identificaron 480 clones de anticuerpos positivos, y se seleccionaron para el analisis de secuencias y validacion de la union a HER3.

Analisis de secuencias y seleccion de clones

Los clones identificados como unidos a HER3 mediante ELISA se recuperaron a partir de las placas maestras originales (formato de 384 pocillos) y se rayaron sobre placas de agar para generar colonias individuales, las cuales se llevaron despues a cultivos de medio LB y se incubaron a 37°C toda la noche con agitacion vigorosa. El ADN plasmidico se aislo de los clones utilizando el kit Qiaprep 96 turbo miniprep (Qiagen, n° de cat. 27193), y se sometio a secuenciacion del ADN de los genes V. Las secuencias se alinearon, y se seleccionaron todos los clones unicos. Multiples alineaciones de las secuencias obtenidas revelaron el caracter unico de cada clon particular, y permitieron la identificacion de los anticuerpos unicos. Tras el analisis de las secuencias de los clones secuenciados, se identificaron 33 agrupamientos de secuencias relacionadas con dos hasta alrededor de 40 miembros, asi como alrededor de 20 clonotipos que estaban representados solamente una vez. Cada agrupamiento de secuencias relacionadas derivo probablemente a traves de hipermutaciones somaticas de un clon precursor comun. En general, para la validacion de la secuencia y la especificidad, se escogieron uno a dos clones procedentes de cada agrupamiento. Basandose en el analisis de agrupamientos, se seleccionaron 119 clones para la expresion a pequena escala y la caracterizacion posterior. Las secuencias de las regiones variables de los anticuerpos seleccionados se muestran en el listado de secuencias anexo. Como se explica anteriormente, las secuencias de la cadena ligera mostradas en el listado de secuencias incluyen todas ellas la misma region constante kappa humana, que comienza con los aminoacidos -TVAAP- y termina en el -NRGEC C-terminal. Con el fin de validar los clones que codifican el anticuerpo, se preparo plasmido de ADN, y se realizo la transfeccion de las celulas CHO-S FreeStyle (Invitrogen) a escala de 2 ml para la expresion. Los sobrenadantes se cosecharon 6 dias despues de la transfeccion. Los niveles de expresion se estimaron con ELISA estandar anti-lgG, y la especificidad se determino por ELISA

especifico de HER3, como se describe anteriormente en “Cribado para determinar la union a la proteina HER3 recombinante” y mediante microscopia confocal de cribado de alto rendimiento de la union del anticuerpo a celulas que sobreexpresan HER3 (vease mas adelante).

Cribado para determinar la union a celulas que sobreexpresan HER3 (OPERA)

5 Los 119 clones se cribaron para determinar la union a la estirpe de celulas cancerosas de mama que sobreexpresan HER3 (MCF-7) usando microscopia confocal. Se sembraron 10.000 celulas MCF-7 en cada pocillo de placas portadoras de celulas de 384 pocillos (Perkin Elmer, n° de cat. 6007439), y se dejaron adherir toda la noche. Los medios se desecharon nuevamente, y las celulas se lavaron y se fijaron con disolucion de formaldehido al 2% (Aldrich, n° de cat. 533998). Despues del lavado, se transfirieron 40 ml del sobrenadante de anticuerpos a cada 10 pocillo, y las placas se incubaron durante 2 horas, despues de lo cual el medio en los pocillos se desecho y se anadieron a cada pocillo 30 ml del nuevo medio que contenia 2 mg/ml de anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con Alexa-488 (H+L, Invitrogen, n° de cat. A11013), 2 mg/ml de Azul CellMask (Invitrogen, n° de cat. H34558) y Hoechst 33342 1 mM (Invitrogen, n° de cat. H3570), y las placas se incubaron durante otros 30 minutos. El nivel de fluorescencia se midio a continuacion usando un microscopio confocal de alto rendimiento OPERA 15 (Perkin Elmer).

A partir de los datos de union obtenidos mediante los cribados de validacion de ELISA y OPERA, se seleccionaron 64 clones para la expresion a escala media.

Ejemplo 2: Caracterizacion funcional de anticuerpos anti-HER3 seleccionados

Se seleccionaron 67 anticuerpos unicos para el ensayo funcional usando un ensayo de viabilidad. El dano celular 20 dara inevitablemente como resultado la capacidad de las perdidas para mantener y proporcionar energia para la funcion celular metabolica y el crecimiento. Los ensayos de actividad metabolica se basan en esta premisa, midiendo habitualmente la actividad mitocondrial. El reactivo de proliferacion celular WST-1 (Roche, n° de cat. 11 644 807 001) es un sustrato listo para el uso que mide la actividad metabolica de celulas viables. En este ejemplo, se uso el ensayo de WST-1 para medir el numero de celulas metabolicamente activas tras el tratamiento de celulas 25 cancerosas con 2 mg/ml de diferentes anticuerpos anti-HER3 durante 96 horas.

Las estirpes de celulas cancerosas MDA-MB-175 (ATCC n° de cat. HTB-25), A431NS (ATCC n° de cat. CRL-2592), MCF-7 (ATCC n° de cat. HTB-22) y MDA-MB-453 (ATCC n° de cat. HTB-130) se sembraron en placas de 96 pocillos a una concentracion de 1000 celulas/pocillo en medio que contiene 2 mg/ml de anticuerpo anti-HER3. Las placas se incubaron durante 4 dias en una incubadora humidificada a 37°C. Entonces se anadieron 20 ml de reactivo WST-1 30 por pocillo, y las placas se incubaron durante una hora a 37°C. Las placas se transfirieron entonces a un agitador de placas orbital, y se dejaron otra hora. La absorbancia se midio a 450 nm y 620 nm (longitud de onda de referencia) en un lector de ELISA. La diferencia en los niveles de celulas metabolicamente activas (MAC) se calculo como porcentaje de los sobrenadantes del control como sigue:

(

%MAC =

1 -

V

(ODexp. - ODmedio) (ODsintrat. - ODmedio)

x100

35 Se supone que la actividad metabolica se correlaciona con el numero de celulas viables: un menor %MAC corresponde a un mayor nivel de inhibicion del crecimiento celular por los anticuerpos.

Los resultados de este analisis para anticuerpos selectos se muestran en la Tabla 5 a continuacion, en la que se proporciona el dato para las estirpes de celulas cancerosas individuales asi como el nivel de la mediana de la inhibicion a lo largo de las cuatro estirpes celulares. A partir de estos resultados, es evidente que se han identificado 40 anticuerpos anti-HER3 con un intervalo de actividades funcionales, y que los anticuerpos en el repertorio exhiben un efecto inhibidor en todas o en casi todas las estirpes de celulas cancerosas ensayadas.

Tabla 5. Porcentaje de celulas metabolicamente activas (MAC) en presencia de anticuerpos anti-HER3

N° de anticuerpo: MDA-MB-175 MCF-7 + 1 nM de Heregulina MDA-453 A431 NS Mediana

4785: 60 80 53 70 65

4889: 50 76 52 80 64

4935: 74 95 67 86 80

5038: 78 76 65 83 77

5082: 43 60 66 67 63

5

10

15

20

25

30

35

40

45

5101: 65 88 80 82 81

5106: 57 87 78 87 82

5143: 73 87 69 78 75

5144: 79 89 73 79 79

5259: 72 90 81 77 79

Se generaron curvas de respuesta frente a la dosis para los diez anticuerpos en la Tabla 5 usando la estirpe celular MDA-MB-175, que es la mas sensible a la inhibicion de HER3; veanse las Figuras 1-10, que muestran la actividad metabolica de las celulas MDA-MB-175 tratadas con diferentes concentraciones de los anticuerpos indicados durante 96 horas. Todos los anticuerpos ensayados bloquean la proliferacion de celulas MDA-MB-175, pero en base a los datos in vivo mostrados en las Figuras 1-10, los anticuerpos 5101 y 5106 parecen ser los mas eficaces.

Ejemplo 3: Inhibicion de la fosforilacion de HER3 por anticuerpos anti-HER3

Este ejemplo demuestra que los anticuerpos anti-HER3 son capaces de inhibir la fosforilacion de HER3 inducida por ligandos.

Metodos

A fin de investigar el nivel de fosforilacion de HER3 en estirpes celulares tratadas con anticuerpos anti-HER3, se llevaron a cabo analisis de transferencia western sobre lisados de celulas completas de celulas MDA-MB-175 y MCF7 que se pretrataron con los anticuerpos durante 1 hora y despues se estimularon con 10 nM de heregulina beta. Las celulas se hicieron crecer en matraces de cultivo T-75, y a una confluencia de 80%, los medios de cultivo se retiraron, y las celulas se lavaron en 1xPBS y se trataron con 10 mg/ml de los anticuerpos diluidos en 5 ml de medio que contiene 0,5% de FBS. Las celulas se trataron durante una hora, tras lo cual se prepararon lisados de celulas completas usando amortiguador de RIPA estandar. Se determino en cada muestra la concentracion de proteina total, y se analizaron 10 mg de proteina mediante transferencia western usando anticuerpo primario frente a HER3 fosforilada (pHER3).

Resultados

En la Figura 11 se muestran los resultados de los analisis de transferencia western de los niveles de fosfo-HER3 en las estirpes celulares MDA-MB-175 y MCF7 tras 1 hora de pretratamiento con los anticuerpos indicados, seguido de la estimulacion con 10 nM de heregulina beta. Los diferentes anticuerpos anti-HER3 inhibieron en diversos grados la fosforilacion de HER3 inducida por ligandos, siendo los mejores anticuerpos en este ensayo 5101, 5106, 5259 y 4889. Los anticuerpos 5038 y 5143 tuvieron solamente un efecto limitado sobre los niveles de HER3 fosforilada en estas estirpes celulares.

Ejemplo 4: Caracterizacion funcional de mezclas de dos anticuerpos anti-HER3

Este ejemplo describe el ensayo in vitro de todas las posibles mezclas de dos anticuerpos entre diez anticuerpos anti-HER3 seleccionados de la invencion con union confirmada a HER3 humana. Las mezclas de anticuerpos se evaluaron para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento de cuatro estirpes de celulas cancerosas diferentes: MDA-MB-175, MCF7 (+ 1 nM heregulina beta), H1437 (+ 1 nM heregulina beta) y A431NS (1 mg/ml de mezcla 992+1024 anti-EGFR). La mezcla 992+1024 anti-EGFR contiene cantidades iguales de los dos anticuerpos anti-EGFR denominados 992 y 1024, como se describe en el documento 2008/104183.

Metodos

Los anticuerpos 4785, 4889, 4935, 5038, 5082, 5101, 5106, 5143, 5144 y 5259, cada uno de los cuales tenia confirmada la union al receptor de HER3 humano, se ensayaron en todas las posibles mezclas de dos anticuerpos a fin de identificar mezclas de anticuerpos con eficacia optima. Los metodos usados, por ejemplo para preparar las diferentes combinaciones de anticuerpos en las placas de 384 pocillos, fueron los descritos generalmente en el documento WO 2010/040356. Mas abajo se proporcionan detalles adicionales.

Mezclas de dos anticuerpos

Los diez anticuerpos se diluyeron hasta una concentracion de 25 mg/ml en 1xPBS, y se anadieron 100 ml de disolucion de anticuerpos a los pocillos de placas alimentadoras de 384 pocillos, para uso en la preparacion de mezclas de dos anticuerpos para el ensayo.

Para cada una de las cuatro estirpes celulares ensayadas, se usaron dos placas de 384 pocillos separadas, anadiendose a los pocillos 46 ml de medio que contiene celulas. Se uso una estacion de trabajo automatizada de

5

10

15

20

25

30

35

40

laboratorio Biomek 3000 (Beckman Coulter) para anadir 2 pi de cada uno de los dos anticuerpos diferentes procedentes de las placas alimentadoras a los pocillos de las placas de 384 pocillos que contienen medio + celulas, de tal manera que estaban representadas todas las combinaciones de dos anticuerpos diferentes. Ademas, las placas incluyeron pocillos de control con medio (50 pl de medio IxPBS; sin celulas), pocillos de control no tratados (50 pl de medio IxPBS + celulas; sin anticuerpos), y pocillos que contienen (ademas de 46 pl de medio + celulas) 4 pl de medio con solamente uno de los diez anticuerpos de la invencion como control adicional.

Las placas con los pocillos que contienen mezclas de dos anticuerpos, asi como los pocillos de control con medio y sin tratar, o un solo anticuerpo de la invencion, se incubaron durante 4 dias en una incubadora humidificada a 37°C, despues de lo cual se anadieron a todos los pocillos relevantes en las placas 5 pl del reactivo de proliferacion celular WST-1 diluido 1:1 en IxPBS. Las placas se incubaron entonces durante 1 hora a 37°C, y se transfirieron subsiguientemente a agitadores orbitales y se incubaron durante otra hora. La absorbancia se midio a 450 nm y 620 nm (longitud de onda de referencia) en un lector de ELISA. La cantidad de celulas metabolicamente activas (MAC) se calculo como se describio en el Ejemplo 2.

Se generaron curvas de respuesta frente a la dosis para las mezclas seleccionadas (destacadas en negrita en la Tabla 6 a continuacion) usando las estirpes celulares MDA-MB-175 y MCF-7. Antes de llevar a cabo el ensayo de WST-1, los anticuerpos apropiados y las mezclas de anticuerpos se diluyeron hasta una concentracion total final de anticuerpos de 100 pg/ml en medio apropiado suplementado con 2% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), produciendo una concentracion total final de anticuerpos de 50 pg/ml en el pocillo que contiene la concentracion mas elevada de anticuerpos. Entonces se llevo a cabo una dilucion en serie de dos veces de los anticuerpos. Entonces se anadieron los numeros relevantes de celulas a los pocillos experimentales en una placa de 384 pocillos. Las placas se incubaron durante 4 dias en una incubadora humidificada a 37°C. La cantidad de celulas metabolicamente activas (MAC) se calculo como el porcentaje del control no tratado como se describe en el Ejemplo 2.

Resultados

Los anticuerpos individuales y las mezclas de dos anticuerpos se clasificaron segun su efecto de la mediana sobre el crecimiento celular, calculado como %MAC. Los resultados se muestran mas abajo en la Tabla 6.

Los resultados muestran que el nivel de inhibicion del crecimiento por las diversas mezclas varia considerablemente entre las diferentes estirpes celulares, mientras que la diferencia en el %MAC de la mediana es menos pronunciada. Se encontro que el anticuerpo monoclonal 5082 tiene el nivel mas elevado de inhibicion del crecimiento de la mediana (%MAC mas bajo), mientras que varias mezclas de anticuerpos son superiores inhibiendo la estirpe celular MDA-MB-175. Se deberia observar que aunque los anticuerpos y mezclas de anticuerpos en la Tabla 6 se clasifican basandose en el %MAC de la mediana para las cuatro estirpes celulares, se contempla que pueden ser de interes mezclas de anticuerpos individuales basado en el efecto demostrado en una cualquiera o mas estirpes celulares, y que un nivel elevado de inhibicion (%MAC bajo) en justamente una sola estirpe celular se puede traducir en una combinacion de anticuerpos muy util in vivo frente a ciertos tipos de canceres.

Se generaron curvas de respuesta frente a la dosis para mezclas de dos anticuerpos que se unen a epitopos no solapantes de HER3 y combinaciones de agrupamientos de epitopos unicas (destacadas en negrita). Los resultados muestran que todas las muestras inhiben las cuatro estirpes celulares, aunque con diferente potencia.

Tabla 6. Nivel de inhibicion del crecimiento de celulas cancerosas mediante mezclas de dos anticuerpos anti-HER3 en las cuatro estirpes de celulas cancerosas MDA-MB-175, MCF7, H1437 y A431 NS. El nivel de inhibicion se muestra como % de celulas metabolicamente activas (%MAC).

: MDA-MB-175 MCF7 +1 nM de Heregulina beta H1437 + 1 nM de Heregulina beta A431 NS + 1 pg/ml de Sym004* Mediana

: %MAC SD %MAC SD %MAC SD %MAC SD %MAC

5082: 42,7 4,6 55,2 3,5 69,4 5,2 74,5 5,1 62,3

5082+5106: 37,1 5,9 55,2 0,9 77,1 3,9 82,9 6,1 66,1

5082+4889: 47,5 7,3 65,8 4,4 72,3 4,7 77,7 6,7 69,0

5082+5101: 43,7 11,3 61,6 7,7 76,8 9,8 84,4 8,3 69,2

5082+5259: 52,7 3,2 59,3 10,4 79,1 4,5 90,0 8,4 69,2

5082+4935: 45,9 5,1 58,7 7,8 79,8 7,2 90,0 8,8 69,2

5082+4785: 45,5 10,9 61,9 8,6 77,1 8,5 87,7 10,3 69,5

: MDA-MB-175 MCF7 +1 nM de Heregulina beta H1437 + 1 nM de Heregulina beta A431 NS + 1 mg/ml de Sym004* Mediana

: %MAC SD %MAC SD %MAC SD %MAC SD %MAC

5082+5143: 51,5 4,3 65,4 10,3 75,1 4,2 84,2 5,0 70,2

5082+5144: 49,3 5,1 60,8 9,8 80,0 4,2 86,1 6,6 70,4

5082+5038: 32,2 7,7 62,7 11,2 79,0 5,6 90,2 8,8 70,9

5038+4889: 39,9 6,9 69,2 8,6 77,2 10,2 90,4 13,1 73,2

4785+4889: 37,0 1,0 65,2 2,4 81,8 5,1 96,5 14,4 73,5

4935+4889: 47,2 9,9 73,3 6,4 82,7 7,3 86,6 11,8 78,0

4889+5143: 44,5 2,3 76,1 1,9 82,3 2,4 89,9 8,1 79,2

5038+5143: 67,3 6,5 75,3 2,7 84,0 6,4 90,1 9,5 79,6

4889+5259: 53,6 4,9 78,2 2,7 81,2 4,3 87,0 8,3 79,7

4785+5038: 47,9 6,0 74,2 10,8 86,7 4,8 100,4 2,3 80,5

4785+5259: 63,1 10,6 77,1 9,6 83,9 11,3 98,9 4,2 80,5

5106+4889: 47,1 3,0 78,4 3,5 83,7 4,6 90,0 8,0 81,1

5101+4889: 51,3 5,2 82,3 5,7 84,7 6,0 82,3 14,1 82,3

5038+5259: 61,8 5,1 77,7 7,5 86,9 2,9 104,0 5,2 82,3

4785+5106: 52,3 6,7 80,9 11,1 84,0 3,2 92,5 7,1 82,4

4889: 54,0 18,1 90,8 7,4 83,3 4,2 82,7 5,5 83,0

5143+5259: 74,2 9,5 79,6 3,8 87,7 4,7 96,9 3,3 83,6

5101: 54,6 6,6 83,7 6,6 100,7 2,5 84,6 8,5 84,1

4785: 60,7 11,1 81,2 7,8 88,3 11,1 91,4 6,5 84,8

5259: 69,2 10,8 79,4 6,5 90,3 4,2 96,0 7,4 84,8

5038: 80,3 19,1 86,3 9,6 84,1 8,9 93,4 2,8 85,2

5144+4889: 58,1 5,4 87,0 5,4 86,2 5,4 89,7 11,8 86,6

5038+4935: 63,9 4,6 87,7 5,2 85,8 8,6 103,4 7,3 86,8

5038+5101: 63,8 8,8 87,9 2,9 86,0 4,4 89,5 8,7 86,9

4785+5143: 72,1 11,6 92,3 4,5 82,8 5,1 92,5 5,6 87,6

5038+5106: 65,3 4,0 90,7 8,2 84,9 5,2 94,6 7,6 87,8

5101+5106: 59,3 4,2 84,6 4,6 102,8 5,5 91,2 6,9 87,9

5143: 69,0 13,9 92,7 7,7 84,0 3,8 93,8 3,3 88,4

5101+5259: 61,6 12,1 85,0 5,1 99,5 8,8 92,2 4,0 88,6

4935+5259: 74,9 10,5 88,4 6,7 89,2 0,7 102,0 2,9 88,8

5038+5144: 73,6 9,7 85,1 7,1 93,3 5,2 97,0 6,5 89,2

4785+5101: 64,7 13,8 87,8 7,9 91,1 5,1 92,3 7,3 89,5

4785+5144: 69,5 6,9 87,1 2,0 93,8 7,2 97,8 3,9 90,5

: %MAC SD %MAC SD %MAC SD %MAC SD %MAC

5106: 47,6 10,7 84,3 14,0 97,8 4,9 98,1 3,4 91,0

5106+5143: 70,8 5,2 91,0 5,6 91,7 6,4 94,5 3,7 91,4

5101+5143: 66,2 10,0 93,0 7,6 93,1 6,3 89,9 5,4 91,4

4785+4935: 72,2 6,8 90,6 3,8 93,2 6,8 102,7 5,5 91,9

5106+5259: 63,1 4,0 87,9 2,4 98,6 4,4 99,2 3,4 93,2

4935+5106: 65,6 5,6 95,3 14,7 92,1 6,3 99,7 11,1 93,7

5144+5143: 80,0 11,1 91,8 5,0 96,2 10,5 98,9 7,5 94,0

4935: 78,1 15,0 98,6 12,8 91,1 6,7 99,6 15,0 94,8

4935+5143: 87,3 6,4 101,6 11,3 91,6 9,7 99,6 9,4 95,6

5144+5106: 62,2 10,4 92,0 3,9 100,1 7,6 101,3 5,4 96,0

4935+5101: 72,8 14,8 96,3 5,7 96,2 7,1 100,6 11,3 96,3

5144: 72,6 16,4 94,8 11,5 99,2 8,9 99,0 10,9 96,9

5144+5101: 62,6 9,9 98,6 1,7 105,6 2,3 97,8 5,1 98,2

5144+5259: 79,0 2,0 98,0 7,1 98,8 3,5 102,4 5,4 98,4

4935+5144: 81,4 4,8 104,6 16,3 99,5 5,4 99,5 8,7 99,5

*Sym004 es una mezcla de dos anticuerpos recombinantes anti-EGFR dirigidos contra epitopos de EGFR no solapantes; veanse el documento WO 2008/104183 y Pedersen et al. (2010) Cancer Res. 70(2):588-597.

Las Figuras 12-15 muestran la actividad metabolica de mezclas seleccionadas de anticuerpos anti-HER3 (las mezclas destacadas en negrita en la tabla anterior) en las cuatro estirpes celulares diferentes. La Figura 12 muestra la actividad metabolica en la estirpe celular MDA-MB-175, la Figura 13 muestra la actividad en la estirpe celular 5 A431NS en presencia de 1 mg/ml de Sym004, la Figura 14 muestra la actividad en la estirpe celular MCF7 en

presencia de nM de heregulina beta, y la Figura 15 muestra la actividad en la estirpe celular H1437 en presencia de 1 nM de heregulina beta.

Ejemplo 5: Caracterizacion funcional de mezclas de tres anticuerpos anti-HER3

Este ejemplo describe el ensayo in vitro de mezclas de tres anticuerpos con epitopos no solapantes y 10 combinaciones de agrupamientos unicas entre anticuerpos seleccionados anti-HER3 de la invencion con union

confirmada a HER3 humano. Las mezclas de anticuerpos se evaluaron para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento de cuatro estirpes de celulas cancerosas diferentes: MDA-MB-175, MCF7 (+ 1 nM heregulina beta), H1437 ((+ 1 nM heregulina beta) y A431 NS (1 mg/ml de mezcla 992+1024 anti-EGFR).

Metodos

15 Los anticuerpos 4785, 4889, 5038, 5082, 5106, 5143 y 5259, cada uno de los cuales tenia confirmada la union al receptor de HER3 humano, se ensayaron en mezclas de tres anticuerpos a fin de identificar mezclas de anticuerpos con eficacia optima. Los anticuerpos seleccionados y las mezclas de anticuerpos se ensayaron para determinar la capacidad para inhibir el crecimiento y proliferacion de las estirpes de celulas cancerosas MDA-MB-175, MCF7 (+ 1 nM heregulina beta), H1437 (+ 1 nM heregulina beta) y A431NS (1 mg/ml de mezcla 992+1024 anti-EGFR) usando el 20 ensayo de viabilidad de WST-1 como se describe en el Ejemplo 4.

Resultados

Se encontro que todas las mezclas ensayadas de tres anticuerpos inhiben las cuatro estirpes celulares, aunque con diferente potencia.

Las Figuras 16-19 muestran la actividad metabolica de diferentes mezclas de tres anticuerpos anti-HER3 en las cuatro estirpes de celulas cancerosas. La Figura 16 muestra la actividad metabolica en la estirpe celular MDA-MB- 175, la Figura 17 muestra la actividad en la estirpe celular A431NS en presencia de 1 mg/ml de Sym004, la Figura 18 muestra la actividad en la estirpe celular MCF7 en presencia de nM de heregulina beta, y la Figura 19 muestra la 5 actividad en la estirpe celular H1437 en presencia de 1 nM de heregulina beta.

Ejemplo 6: Inhibicion sinergica del crecimiento del cancer mediante 2 mezclas anti-HER3

Este ejemplo demuestra que ciertas mezclas de anticuerpos anti-HER3 inhiben sinergicamente el crecimiento de celulas cancerosas.

Metodos

10 Los anticuerpos 5038, 5082 y 5144, cada uno de los cuales habia confirmado la union al receptor de HER3 humano, se ensayaron como mezclas de dos anticuerpos, 5038+5082 y 5082+5144, comparando en cada caso la mezcla de los dos anticuerpos con los dos anticuerpos individuales en la mezcla, a fin de investigar la inhibicion sinergica del crecimiento celular. Los anticuerpos seleccionados y mezclas de anticuerpos se ensayaron para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento y proliferacion de la estirpe de celulas cancerosas MDA-MB-175 usando el 15 ensayo de viabilidad de WST-1 como se describe en el Ejemplo 4.

Resultados

Los resultados muestran que una mezcla de anticuerpos 5038+5082 o 5082+5144 inhibe sinergicamente el crecimiento de la estirpe de celulas cancerosas MDA-MB-175 (Figuras 20 y 21).

Ejemplo 7: Comparacion de mezclas de anticuerpos anti-HER3 y anticuerpos monoclonales de referencia

20 Este ejemplo describe una comparacion in vitro de una mezcla de anticuerpos anti-HER3 (5038+5082) y analogos de los anticuerpos de referencia pertuzumab y MM-121 en las estirpes celulares MDA-MB-175 y MCF-7. Pertuzumab es un anticuerpo anti-HER2 que se une al brazo de dimerizacion de HER2 y bloquea la heterodimerizacion de HER2/HER3. El analogo de pertuzumab tiene las secuencias de aminoacidos de la cadena ligera y de la cadena pesada de pertuzumab como se describe en los documentos WO 2006/033700 y US 2006/0121044 A1. MM-121 es 25 un anticuerpo anti-HER3 que bloquea la union de heregulina a, y por tanto la activacion de, HER3 (veanse el documento WO 2010/019952 y Schoeberl et al., Cancer Res. 70(6):2485-94, Marzo 2010).

Metodos

Se generaron curvas de respuesta frente a la dosis como se describe en el Ejemplo 4. Se generaron analogos del 30 anticuerpo monoclonal de referencia anti-HER3 MM-121 (Merrimack; secuencia descrita en el documento WO 2008/100624) y el anticuerpo de referencia anti-HER2 pertuzumab (tambien conocido como Omnitarg™, 2C4 y R- 1273; secuencia descrita en el documento US 2006/121044 A1) sintetizando la cadena ligera lambda completa (MM- 121) o la cadena ligera kappa (pertuzumab) de los anticuerpos respectivos sin el peptido senal, anadiendo sitios de restriccion de Nhel y Notl de flanqueo, y clonando en un vector de expresion para la expresion transitoria en celulas 35 HEK 293. Las regiones VH de cadena pesada de los anticuerpos respectivos se sintetizaron sin el peptido senal, tras lo cual se anadieron los sitios Ascl y Xhol, y las secuencias resultantes se clonaron en los mismos vectores de expresion usados para la expresion de la cadena ligera, que tambien contenian secuencias que codifican los tres dominios constantes CH1, CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG. Los vectores incluyeron un par de promotores del CMV, en una orientacion de cabeza a cabeza, para la expresion de las dos cadenas de cada anticuerpo.

40 Resultados

Los resultados muestran que la mezcla de anticuerpos 5038+5082 es superior al anticuerpo de referencia MM-121 inhibiendo el crecimiento de las dos estirpes de celulas cancerosas MDA-MB-175 y MCF7. Usando estas estirpes celulares, no se encontro ninguna superioridad aparente de 5038+5082 con respecto a pertuzumab. En la Figura 22 se muestra la actividad metabolica en celulas MDA-MB-175, y en la Figura 23 se muestra la actividad metabolica en 45 celulas MCF7 en presencia de 1 nm de heregulina beta.

Ejemplo 8: La mezcla de anticuerpos anti-HER3 induce degradacion de HER3

Este ejemplo demuestra que una mezcla de dos anticuerpos anti-HER3 es capaz de inducir una degradacion mas eficaz de HER3 en comparacion con los anticuerpos anti-HER3 individuales. En este estudio tambien se evaluo un analogo de pertuzumab.

50 Metodos

A fin de investigar los niveles de HER3 en estirpes celulares tratadas con anticuerpos anti-HER3, se llevaron a cabo analisis de transferencia western en lisados de celulas completas de celulas OVCAR-8 tratadas con anticuerpos en

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10

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20

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45

50

diversos momentos. Las celulas se hicieron crecer en matraces de cultivo T-75, y a una confluencia de 80%, el medio de cultivo se elimino, las celulas se lavaron en IxPBS y se trataron con 20 mg/ml de los anticuerpos diluidos en 5 ml de medio que contiene 0,5% de FBS. Las celulas se trataron durante 1, 2, 4, 16 o 48 horas, tras lo cual se prepararon lisados de celulas completas usando el amortiguador de RIPA estandar. Se determino en cada muestra la concentracion total de proteina, y se analizaron 10 mg de proteina mediante transferencia western usando anticuerpo primario contra HER3.

Resultados

Los resultados de la investigacion de los niveles de HER3 (Figura 24) demostraron que tanto los anticuerpos individuales como la mezcla indujeron degradacion rapida de HER3. Sin embargo, la mezcla anti-HER3 indujo un mayor nivel de degradacion de HER3 en comparacion con los anticuerpos individuales. El analogo de pertuzumab no fue capaz de inducir degradacion de HER3, que era lo que se esperaba, dado que se une a HER2 y no a HER3.

Ejemplo 9: La mezcla de anticuerpos anti-HER3 inhibe la senalizacion de HER3

Este ejemplo demuestra que una mezcla de dos anticuerpos anti-HER3 es capaz de inducir una supresion mas eficaz de la fosforilacion y senalizacion aguas abajo de HER3 que los anticuerpos individuales.

Metodos

A fin de investigar los niveles de fosforilacion y senalizacion aguas abajo de HER3, se trataron estirpes celulares con anticuerpos anti-HER3 durante diversos momentos, y se llevaron a cabo analisis de transferencia western sobre lisados de celulas completas. Se hicieron crecer celulas MDA-MB-175 en matraces de cultivo T-75, y a una confluencia de 80%, el medio de cultivo se elimino, tras lo cual las celulas se lavaron en 1xPBS y se trataron con 10 mg/ml de los anticuerpos diluidos en 5 ml de medio que contiene 0,5% de FBS. Las celulas se trataron durante 2, 4, 16 o 48 horas, despues de lo cual se prepararon lisados de celulas completas usando amortiguador de RIPA estandar. La concentracion de proteina total se determino en cada muestra, y se analizaron 10 mg de proteina mediante transferencia western usando anticuerpos primarios contra pHER3, pAKT(Ser465), AKT y actina, respectivamente.

Resultados

Los resultados de la investigacion de la senalizacion de HER3 (Figura 25) demostraron que tanto los anticuerpos individuales como la mezcla indujeron inhibicion rapida de la fosforilacion de HER3 y AKT. Sin embargo, la mezcla anti-HER3 fue superior a los anticuerpos individuales inhibiendo la fosforilacion de HER3 y AKT.

Ejemplo 10: Eficacia in vivode mezclas anti-HER3

Para evaluar la eficacia in vivo de los anticuerpos monoclonales anti-HER3 5038 y 5082 y la mezcla de 5038+5082, los compuestos se estudiaron en el modelo de xenoinjerto de cancer de pulmon A549.

Metodos

Se inocularon subcutaneamente 2x106 celulas A549 en el flanco derecho de ratones atimicos hembra de ocho a diez semanas. Los tumores se midieron dos veces por semana con calibres, y el volumen tumoral, en mm3, se calculo segun la formula: (anchura)2 x longitud x 0,5. A un tamano tumoral promedio de 115 mm3, los ratones se distribuyeron al azar, y se inicio el tratamiento. Los ratones se trataron con inyecciones intraperitoneales dos veces por semana de 50 mg/kg de 5038, 5082 o 5038+5082, durante cinco semanas (10 inyecciones en total), seguido de un periodo de observacion. El experimento incluyo el anticuerpo monoclonal anti-EGFR cetuximab (como un control de isotipo) y un control de vehiculo, que se dosificaron cada uno y administraron siguiendo el mismo programa que para los anticuerpos anti-HER3.

Resultados

Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 26, en la que se observa que, en ratones tratados con 5038 o la combinacion de 5038+5082, el crecimiento tumoral se controlo en respuesta al tratamiento desde el dia 26 (comienzo del tratamiento) hasta el dia 37. Tras este punto, los tumores en los dos grupos comenzaron a crecer, aunque el crecimiento fue mas lento en comparacion con los tumores en los grupos de cetuximab o de control de vehiculo. Aunque los resultados tras este punto no son estadisticamente significativos, hay una clara tendencia de que los tumores en los grupos tratados con 5038 y 5038+5082 crecen de forma mas lenta en comparacion con los tumores en el grupo de control asi como en los grupos que reciben cetuximab o 5082. Los ratones tratados con 5082 solo o con cetuximab no respondieron al tratamiento, y mostraron una cinetica del crecimiento tumoral similar al grupo del control de vehiculo.

En resumen, los resultados sugieren que 5038 y la combinacion de 5038+5082 fueron mejores controlando el crecimiento de los xenoinjertos de tumor A549 en comparacion con el tratamiento con 5082 solo, cetuximab, o el control de vehiculo.

5

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Ejemplo 11: Cartografiado de los anticuerpos anti-HER3 contra los dominios de HER3 individuales

Este ejemplo demuestra que el panel generado de anticuerpos anti-HER3 con actividad funcional esta dirigido contra el dominio I o dominio II del dominio extracelular (ECD) de HER3, como se muestra por el perfil de union a constructos de receptores quimericos humanos/de raton.

Metodos

Debido a que el panel de anticuerpos anti-HER3 se provoco en ratones, no se espera que los anticuerpos reconozcan epitopos presentes en HER3 murino, debido al concepto de “autotolerancia”. En consecuencia, los constructos de receptores quimericos en los que las secuencias humanas que codifican dominios individuales se sustituyen por secuencias murinas se pueden emplear para fines de cartografiado epitopico, puesto que no se espera que los anticuerpos se unan a la secuencia murina insertada en el constructo de HER3 humano. Las secuencias de ARNm de HER3 humano y murino (numero de acceso M29366 y NM_010153.1, respectivamente) se descargaron de NCBI, y los dominios I-IV extracelulares se asignaron como se describe por Kani et al. (J. Biol. Chem. (2005) 280:8238-8247). Las variantes de intercambio de dominios quimericos humanos/murinos, en los que cada uno de los cuatro dominios de HER3 extracelulares humanos se sustituyeron por la secuencia de ADN murino respectiva, se proporcionaron con una etiqueta de histidina N-terminal, se genosintetizaron y se expresaron transitoriamente en celulas Hek 293. Como controles positivo y negativo, respectivamente, se usaron un constructo de ECD completamente humano y uno murino. Los sobrenadantes procedentes de los constructos de los receptores expresados transitoriamente se purificaron mediante cromatografia de afinidad de la etiqueta de histidina usando columnas de niquel NTA, y las proteinas purificadas se revistieron en placas de ELISA a 1 mg/ml en amortiguador de carbonato toda la noche. Al dia siguiente, los pocillos se bloquearon con 1% de BSA/PBS-T, y se anadieron las titulaciones de anticuerpos diluidos en amortiguador de bloqueo. Finalmente, los pocillos se lavaron, y el ELISA se desarrollo por adicion de FC de raton anti-IgG humana conjugado a HRP, seguido del lavado y adicion del sustrato TMB.

Resultados

Se encontro que los anticuerpos 5101 y 5106 tienen tolerancia discontinua en el transcurso de la inmunizacion, y reaccionaron contra HER3 murino (Figuras 27-32). Pero debido a que 5101 y 5106 tienen valores de densidad optica (OD) de ELISA en el constructo de HER3 de DI murino-DII-IV humano (es decir, un constructo con un dominio I murino y los dominios II-IV humanos) menores que en otros constructos quimericos en los que el dominio I tiene una secuencia humana, se puede concluir que estos dos anticuerpos se unen a epitopos situados en el dominio I (DI) de HER3 humano. Los anticuerpos 5144 y 5259 no reconocieron DI murino, y se unieron debilmente a las variantes de intercambio de DII murino. Estos dos anticuerpos estan en consecuencia dirigidos contra epitopos que se solapan con el dominio I y II en HER3 humano. El resto de los anticuerpos no reconocen la variante de intercambio de DI murino, pero si se unieron a las otras variantes, y por lo tanto estan dirigidos contra epitopos en el dominio I de HER3 humano.

En las Figuras 27-32 se muestra el cartografiado de dominios de los anticuerpos anti-HER3, que es una titulacion de los anticuerpos anti-HER3 y controles negativos contra antigenos de HER3 revestidos. El anticuerpo unido se detecto con un anticuerpo anti-Fc humano. Se observa un fondo elevado contra Fc anti-HER3 humano, debido a reactividad cruzada entre el conjugado anti-Fc y la proteina de fusion de HER3 Fc. Sin embargo, los controles negativos demuestran claramente la diferencia entre la union especifica y la no especifica. La Tabla 7 a continuacion proporciona un resumen de los dominios de HER3 seleccionados como diana por los diferentes anticuerpos anti- HER3.

Tabla 7: Dominios seleccionados como dianas por diferentes anticuerpos anti-HER3

mAb: Dominio de HER3

4785: DI

4889: DI

4935: DI

5038: DI

5082: DI

5101*: DI

5106*: DI

5143: DI

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mAb: Dominio de HER3

5144: DI/DII

5259: DI/DII

*Anticuerpos que reaccionan de forma cruzada entre ECD de HER3 humano y de raton

Ejemplo 12: Agrupamiento epitopico de anticuerpos anti-HER3 mediante resonancia de plasmones superficiales

Este ejemplo demuestra como pares de anticuerpos anti-HER3 con actividad funcional se dirigen contra al menos cinco agrupamientos epitopicos no solapantes en el dominio I o II del ECD de HER3.

Metodos

Se llevo a cabo el analisis de competicion cruzada de anticuerpos evaluando pares de anticuerpos con analisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare, Dinamarca). Un chip sensor CM5 (GE Healthcare, Dinamarca) se conjugo con 10.000 unidades de resonancia (RU) de un anticuerpo anti- tetrahistidina (Qiagen, Alemania), segun las instrucciones del fabricante. La proteina de fusion HER3-Fc etiquetada con histidina (R&D Systems) se diluyo en amortiguador de HBS y se capturo en una superficie anti-histidina a un caudal de 5 pl/minuto. Las combinaciones de anticuerpos se evaluaron en experimentos de union competitiva a una concentracion saturante de 40 pg/ml registrando los niveles de respuesta maxima con y sin competicion. La superficie del chip se regenero mediante inyeccion de 10 mM de glicina-HCl, pH 2.

Resultados

Se encontro que los 10 anticuerpos anti-HER3 se agrupan frente a 5 agrupamientos epitopicos no solapantes diferentes (Figuras 33+34). El agrupamiento epitopico 1 contenia los tres anticuerpos 4785, 4935 y 5143. El agrupamiento epitopico II contenia los anticuerpos 5082 y 4889, de los cuales se encontro que mAb 5082 tambien compite de forma cruzada con mAb 5143 del agrupamiento epitopico 1. El agrupamiento epitopico III fue unico, y contenia solamente mAb 5038. El agrupamiento epitopico IV contenia los mAbs 5101 y 5106, que tambien reaccionaron de forma cruzada con la proteina HER3 de raton (Ejemplo 11). Finalmente, el agrupamiento epitopico V contenia los anticuerpos 5144 y 5259, que se encontro que se unen a epitopos similares presentes tanto en DI como DII (Ejemplo 11).

La Figura 33 muestra una tabla con los resultados del agrupamiento epitopico mediante analisis de competicion cruzada de anticuerpos. El analisis se llevo a cabo saturando en primer lugar el antigeno HER3 con los anticuerpos enumerados en la parte superior, seguido de la inyeccion de los anticuerpos enumerados en la izquierda. Los numeros en las celulas se refieren al porcentaje de competicion, calculado como:

(1-(respuesta maxima con competicion/respuesta maxima sin competicion) x 100

Las celulas recuadradas representan pares de anticuerpos que se inhiben entre si en al menos 50%. Los anticuerpos se asignan en agrupamientos epitopicos segun el perfil de competicion; vease la Figura 34, que proporciona una ilustracion grafica de la relacion entre los agrupamientos epitopicos asignados, en los que los circulos solapantes representan anticuerpos con epitopos solapantes.

Ejemplo 13: Eficacia in vivode mezclas anti-HER3

Para evaluar la eficacia in vivo de los anticuerpos monoclonales 5038 y 5082 anti-HER3 y la mezcla de 5038+5082, se estudiaron los compuestos en el modelo de xenoinjerto de cancer pancreatico BxPC3.

Metodos

Se inocularon subcutaneamente 5x106 celulas BxPC3 en el flanco izquierdo de ratones atimicos hembra de ocho a diez semanas. Los tumores se midieron dos veces por semana con calibres, y el volumen tumoral, en mm3, se calculo segun la formula: (anchura)2 x longitud x 0,5. A un tamano tumoral promedio de 165 mm3, los ratones se distribuyeron al azar, y se inicio el tratamiento. Los ratones se trataron con inyecciones intraperitoneales dos veces por semana de 50 mg/kg de 5038, 5082, o una mezcla de 5038+5082, durante 3 semanas (6 inyecciones en total), seguido de un periodo de observacion. El experimento incluyo un control de vehiculo, que se dosifico y administro siguiendo el mismo calendario como se describe para los anticuerpos anti-HER3 anteriores.

Resultados

En los ratones tratados con 5038 o la combinacion de 5038+5082, el crecimiento tumoral se inhibio significativamente mejor en comparacion con los ratones en el grupo del control de vehiculo (Figura 35). En los

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10

15

20

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30

35

ratones tratados con 5038+5082, se observo una diferencia significativa en comparacion con el grupo del control de vehfculo tan temprano como cinco dfas despues del primer tratamiento, y duro a lo largo de todo el perfodo de estudio. Los ratones tratados con 5038 fueron significativamente mejores a la hora de controlar el crecimiento tumoral en comparacion con los animales tratados con el control de vehfculo a partir del dfa 57, y, con la excepcion de un dfa (dfa 64), esto se observo a lo largo de todo el perfodo de estudio.

La inhibicion eficaz del crecimiento tumoral por 5038 y la combinacion de 5038+5082 tambien se pudo observar atendiendo a la supervivencia. Ambos de estos tratamientos fueron significativamente mejores en comparacion con el grupo del control de vehfculo segun se calculo mediante una prueba de logaritmo de rangos (Mantel Cox) con un valor de p de 0,003 para 5038 y de 0,001 para 5038+5082 (Figura 36).

En resumen, 5038 y la combinacion de 5038+5082 fueron significativamente mejores inhibiendo el crecimiento tumoral y mejoran la supervivencia de los animales con xenoinjertos de tumores BxPC3, en comparacion con el control de vehfculo.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Symphogen A/S

<120> Anticuerpos anti-HER3 y combinaciones <130> P142PC00 <160> 83

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 354

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 4785 VH ADN <400> 1

60 120 180 240 300 354

<210>2

<211 > 118

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 4785 VH <400> 2

gaggtccaac tgcaacagtc tggaccagaa ctggtgatgc ctggggcttc agtgaagata tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca agctactatg tacactgggt gaagcagagg cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttatcctg gaagtggtca tactaagtac aatgagaagt tcaaggacaa ggccacactg acggcagaca catcctccag cactgcctac atgcaactca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagacccccc

tactatagta actacgccga tgtctggggc acagggacca cggtcaccgt ctcg

imagen1

5

10

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Pro Pro Tyr Tyr Ser Asn Tyr Ala Asp Val Trp Gly Thr Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser 115

<210>3

<211> 667

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa

<223> Ab 4785 LC ADN

<400>3

gacattgtga

atgagctgca

tggtaccagc

gaatctgggg

atcagcagtg

ccgtacacgt

gtcttcatct

ctgctgaata

caatcgggta

ctcagcagca

gaagtcaccc

taataag

tgactcagtc tccatcctcc ctgactgtga agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg tgcaggctga agacctggca gtttattact tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga

cagcaggaga: gaaggtcact 60

atcaaaagaa: ctacttgacc 120

tctactgggc: atccacaagg 180

gaacagattt: cactctcacc 240

gtcagagtga: ttatagttat 300

gaactgtggc: tgcaccatct 360

gaactgcctc: tgttgtgtgc 420

ggaaggtgga: taacgccctc 480

gcaaggacag: cacctacagc 540

aacacaaagt: ctacgcctgc 600

gcttcaacag: gggagagtgt 660


: 667

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 4785 LC <400> 4

imagen2

<210>5 <211>351

Ala Gly 15

Asn Ser Gly Gin Gly Val

Leu Thr 80

Gin Ser 95

Glu lie

Ser Asp

Asn Asn

Ala Leu 160

Lys Asp 175

Asp Tyr

Leu Ser

10

15

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 4889 VH ADN

<400>5

gaagtgcagc acctgctctg tttccaggaa aacccatctc ctgaagttga gactatggtt <210>6

ttgtggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc tcactggcta ctccatcacc agtgcttatt actggaactg gatccggcag acaaactgga atggatgggc tacgtaagct acgatggtag caatacctac tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc tttctctgac tactgaggac accgccacat attactgtgc aagagagggg attctgacta ttggggccaa ggcaccactc tcacagtctc g

<211> 117 <212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa

<223> Ab 4889 VH <400> 6

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Ala 20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45

Met Gly Tyr Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe 65 70 75 80

Leu Lys Leu lie Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Gly Tyr Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser 115

60

120

180

240

300

351

10

15

<211> 649

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa

<223> Ab 4889 LC ADN <400>7

gatattgtga gtcagttgca gatggaacta aggttcagtg gaagatattg ggcaccaagc tctgatgage cccagagagg gagagtgtca ctgagcaaag ctgagctcgc <210>8 <211 > 214 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 4889 LC <400> 8

Asp He Val Met Thr Gin Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

tgacgcagtc: tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

gggcaagtca: ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

ttaaactcct: gatctactac acatcaagat tacattcagg agtcccatca 180

gcagtgggtc: tggaacagat tattetetea ccattagcaa cctggaccaa 240

ccacttactt: ttgccaacag agtaataege ttccgtggac gttcggtgga 300

tggaaatcaa: acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

agttgaaatc: tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taaettetat 420

ccaaagtaca: gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

cagagcagga: cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

cagactacga: gaaacacaaa gtctacgcct gegaagteae ccatcagggc 600

ccgtcacaaa: gagcttcaac aggggagagt gttaataag 649

Asp Arg Val Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr lie Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Asp Gin

65

70

75

80

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210>9

<211> 357

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 4935 VH ADN <400>9

cagatccagt tcctgcaagg cctggacagg actgagaagt atgcacctca ggttacgacg <210> 10 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus

tggtgcagtc: tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaggata 60

cttctggcta: caccttcaca agctactata tacactgggt gaagcagagg 120

gacttgagtg: gattggatgg atttatcctg gaaatgttca tactaagtac 180

tcaagggcaa: agccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

gcagcctgac: ctctgaggac tctgcggtct atttctgtgt aagacgatat 300

gggactggtt: tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctcg 357

5

10

<223> Ab 4935 VH <400> 10

imagen3

<210> 11 <211 > 661 <212> ADN

<213> Mus musculus <220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 4935 LC ADN <400> 11

gatatccaga tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atacttttat gcactggtac 120

cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180

gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240

5

cctgtggagg: ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcage aaagtaatga ggatccgtgg 300

acgttcggtg: gaggcaccaa gctggaaatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc: catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct: atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataaege cctccaatcg 480

ggtaactccc: aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga: cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtetaege ctgcgaagtc 600

acccatcagg: gcctgagctc gcccgtcaca aagagettea acaggggaga gtgttaataa 660

g: 661

<210> 12

<211 > 218

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 4935 LC <400> 12

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140

5

10

15

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 13

<211> 357

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5038 VH ADN <400> 13

gaggtgaagc tggttgagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60

acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttttt actggacctg gatccggcag 120

tttccaggca acaaattgga atggatgggc ttcataagct acgatggtag caataactac 180

aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240

ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagaggcgga 300

ggctactatg gtaacctctt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcg 357

<210> 14

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5038 VH <400> 14

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Gly

20

25

30

Phe Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45

Met Gly Phe lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe 65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

10

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 115

<210> 15

<211> 649

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5038 LC ADN <400> 15

gatattgtga atcagttgca ggtggaactg aggttcagtg gaagatattg ggcaccaagc tctgatgage cccagagagg gagagtgtca ctgagcaaag ctgagctcgc <210> 16 <211 > 214 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

tgactcaaac: tacatcctcc ctgtccgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

ggccaagtca: ggacattagc aattatgtaa actggtttca gcagaaacca 120

ttaagctcct: gatcttccac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

gcagtgggtc: tggaacagat tattetetea ccattagcac cctggaacag 240

ccatttactt: ttgccaacag ggtattaege ttccgtggac gttcggtggc 300

tggaaataaa: acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

agttgaaatc: tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taaettetat 420

ccaaagtaca: gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

cagagcagga: cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

cagactacga: gaaacacaaa gtctacgcct gegaagteae ccatcagggc 600

ccgtcacaaa: gagcttcaac aggggagagt gttaataag 649

5

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5038 LC <400> 16

Asp He Val Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Pro Ser Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30

Val Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gly Thr Val Lys Leu Leu lie 35 40 45

Phe His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Thr Leu Glu Gin 65 70 75 80

Glu Asp lie Ala lie Tyr Phe Cys Gin Gin Gly lie Thr Leu Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

5

imagen4

<210> 17 <211> 351 <212> ADN

10 <213> Mus musculus

5

10

<221 > caracterfstica diversa

<223> Ab 5082 VH ADN <400> 17

gaggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60

acctgctctg tcaccggcta ctccatcacc agtgcttatt actggaactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaagtgga atggatgggc tacataggct acgatggtcg taatacctac 180

aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240

ctgaaattga attctctgac tactgaggac acagccacat attattgttc aagagagggg 300

gactacggtt actctgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc g 351

<210> 18 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5082 VH <400> 18

Glu Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Ala 20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Val Glu Trp 35 40 45

Met Gly Tyr lie Gly Tyr Asp Gly Arg Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe

65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Glu Gly Asp Tyr Gly Tyr Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser 115

<210> 19 <211> 649 <212> ADN

10

15

<213> Mus musculus <220>

<221 > caracterfstica diversa

<223> Ab 5082 LC ADN <400> 19

gatattgtga gtcagttgca gatggaactg aggttcagtg gaagattttg ggcaccaagc tctgatgage cccagagagg gagagtgtca ctgagcaaag ctgagctcgc

tgacgcaagc: tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

gggcaagtca: ggacattaac aattatttaa attggtatca gcagaagcca 120

ttaaactcct: gatctactac acatcaagat tacagtcagg agtcccatca 180

gcagtgggtc: tggaatagat tattetetea ccattagcaa cctggagcag 240

teaettaett: ttgccaacag agtgaaacgc ttccgtggac gttcggtgga 300

tggagctgaa: acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

agttgaaatc: tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taaettetat 420

ccaaagtaca: gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

cagagcagga: cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

cagactacga: gaaacacaaa gtctacgcct gegaagteae ccatcagggc 600

ccgtcacaaa: gagcttcaac aggggagagt gttaataag 649

<210> 20 <211 > 214 <212> PRT

<213> Mus musculus <220>

<221 > caracterfstica diversa

<223> Ab 5082 LC <400> 20

Asp He Val Met Thr Gin Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Asn Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie

35

40

45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly lie Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Glu Gin 65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Glu Thr Leu Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu 165: Gin Asp Ser Lys Asp 170 Ser Thr Tyr Ser Leu 175 Ser

Leu: Ser Lys Ala Asp 185 Tyr Glu Lys His Lys 190 Val Tyr

Thr: His Gin Gly 200 Leu Ser Ser Pro Val 205 Thr Lys Ser

Glu: Cys

Glu Ser Val Thr

Ser Thr Leu Thr 180

Ala Cys Glu Val 195

Phe Asn Arg Gly 210

<210> 21 <211> 339 <212> ADN

5 <213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5101 VH ADN <400> 21

gaagtgaagc ttgttgagtc tgggggaggc ctagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccagact 10 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attcgtgatg gtggaggtta cacctactat

60

120

5

10

tcagacaatg taaagggccg attcaccatc tccagggaca atgcccagaa caatctgtat 240

ttgcaaatga gccatctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagaggtata 300

ttggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcg 339

<210> 22

<211 > 113

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5101 VH <400> 22

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr lie Arg Asp Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Gin Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gin Met Ser His Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly lie Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110

Ser

<210> 23

<211> 649

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5101 LC ADN <400> 23

caaattgttc atcagttgca gatggaactg aggttcagtg gaagatattg gggaccaagc tctgatgage cccagagagg gagagtgtca ctgagcaaag ctgagctcgc <210> 24 <211 > 214 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5101 LC <400> 24

Gin lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

tgacccagtc: tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

gggcaagtca: ggacattagc aattatttaa actggtttca gcagagacca 120

ttaaactcct: gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

gcagtgggtc: tggaacagat tattetetea ccattagcaa cctggagcaa 240

ccacttactt: ttgccaacag ggtaataege ttccgtacac gttcggaggg 300

tggagctgaa: acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

agttgaaatc: tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taaettetat 420

ccaaagtaca: gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

cagagcagga: cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

cagactacga: gaaacacaaa gtctacgcct gegaagteae ccatcagggc 600

ccgtcacaaa: gagcttcaac aggggagagt gttaataag 649

Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Phe Gin Gin Arg Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Glu Gin 65 70 75 80

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95

10

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

5

10

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 25

<211> 339

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5106 VH ADN <400> 25

gaagtgaagc tggttgagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagagtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttgcca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggaaaaga ggctggaatg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtca tctttactat 180

ccggacaatg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa taacctgtac 240

ctgcagatga gccatctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagaggtatt 300

ttggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcg 339

<210> 26 <211 > 113 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5106 VH <400> 26

5

10

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr lie Ser Asp Gly Gly Ser His Leu Tyr Tyr Pro Asp Asn Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gin Met Ser His Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly lie Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110

Ser

<210> 27

<211> 649

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa

<223> Ab 5106 LC ADN <400> 27

gatattgtga tgactcaagc tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gtgcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaacta ttaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240

gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtagga ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaataag 649

<210> 28 <211 > 214

5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5106 LC <400> 28

Asp He Val Met Thr Gin Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10

Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Ala Ser Gin Asp lie Asn 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr lie Lys Leu 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu 65 70 75

Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Arg He 85 90

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Thr Val 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn 145 150 155

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 29

<211> 354

<212> ADN

Leu Gly 15

Asn Tyr Leu lie Ser Gly

Glu Pro 80

Pro Tyr 95

Ala Ala

Ser Gly

Glu Ala

Ser Gin 160

Leu Ser 175

Val Tyr

Lys Ser

<213> Mus musculus <220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5143 VH ADN 5 <400> 29

caggtccaac tgcaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggcta cagcttcaca agctaetata tacattgggt gaageagagg 120

cctggacagg gaettgagtg gattggatgg atttatcctg gaagtggtca tactaagtac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg acggcagaca catcctccag cactgcctac 240

atgeagetea gcagcctaac atetgaggae tctgcggtct attactgtgc aagacctccc 300

tactatagta actacgccga tgtctggggc acagggacca cggtcaccgt ctcg 354

<210> 30 <211> 118 <212> PRT

10 <213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5143 VH <400> 30

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr lie His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Trp lie Tyr Pro Gly Ser Gly His Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

15 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Pro Pro Tyr Tyr Ser Asn Tyr Ala Asp Val Trp Gly Thr Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser 115

<210> 31 <211 > 667

5

10

15

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa

<223> Ab 5143 LC ADN <400> 31

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacatgacc 120

tggtatcagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacgggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gagctgaaac gaactgtggc tgcaccatct 360

gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420

ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480

caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540

ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600

gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660

taataag 667

<210> 32 <211> 220 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5143 LC <400> 32

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5: 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys 20: Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 25 30

Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Met Thr 35 40: Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 45

Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp 50 55: Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 65 70: Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 75 80

lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp 85: Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe 100: Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 115 120: Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 125

Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 130 135: Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 145 150: Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 155 160

Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser 165: Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 180: Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 195 200: Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 210 215 <210> 33 <211> 351 <212> ADN 5 <213> Mus musculus <220> <221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5144 VH ADN <400> 33: Arg Gly Glu Cys 220

5

10

caggtgcagc ttaaggagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag cctgtccatc 60

acatgcactg tctctgggtt ctcattatcc agatatagtg tacactgggt tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaagcac agactataat 180

tcagctctca aatccagact gaacatcaac aaggacaact ccaagagcca agtttttttt 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgtcag aaaagggatt 300

acgacgacgg ggtttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc g 351

<210> 34

<211 > 117

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5144 VH <400> 34

Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr 20 25 30

Ser Val His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Met lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Asn lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Lys Gly lie Thr Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser 115

<210> 35

<211> 646

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5144 LC ADN

5

10

<400> 35

cacattgtgc tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcat atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa gatgctgcca cttattactg ccagcagttg agtagttacc

aCCaa^Ct^ d^Cu^doaC^ daCt^t^Ct ^CdCCduCt^

gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt

<210> 36

<211 > 213

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5144 LC <400> 36

His He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met 15 10

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser 20 25

Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Arg Ser Ser Pro 35 40

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val 50 55

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser 65 70 75

ctccagggga gaaggtcacc ggtaccaaca gaagccacga cttctggagt ccctgttcgc tcagccgaat ggaggctgac cacccacgtt cggagggggg

tgctgaataa cttctatccc aatcgggtaa ctcccaggag tcagcagcac cctgacgctg aagtcaccca tcagggcctg aataag

Ser Ala Ser Pro Gly 15

Ser Val Ser Tyr Met 30

Arg Leu Leu lie Tyr 45

Arg Phe Ser Gly Ser 60

Arg Met Glu Ala Asp 80

120

180

240

300

360

420

480

540

600

646

5

10

Asp: Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu Ser Ser Tyr Pro Pro Thr




: 85 90 95

Phe: Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro



: 100 105 110

Ser: Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr


: 115 120 125

Ala: Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

: 130 135 140

Val: Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu

145: 150 155 160

Ser: Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
Ser
Ser




: 165 170 175

Thr: Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala



: 180 185 190

Cys: Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe


: 195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 37

<211 > 351

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa

<223> Ab 5259 VH ADN <400> 37

gaggtgcagc

acatgcactg

ccaggaaagg

tcagctctca

aaaatgaaca

acgacgacgg

ttgtggagtc aggacctggc tctctgggtt ctcattatcc gtctggagtg gctgggaatg aatccagact gagcatcagc gtctgcagac tgatgacaca ggtttgacta ctggggccaa

ctggtggcac cctcacagag agatatacta tccactgggt atatggggtg gtggaagcac aaggacaact ccaagagcca gccatttact actgtgccag ggcaccactc tcacagtctc

cctgtccatc: 60

tcgccagcct: 120

agactataat: 180

acttttctta: 240

aaaagggatt: 300

g: 351

<210> 38 <211 > 117 <212> PRT

<213> Mus musculus <220>

<221 > caracterfstica diversa

5

10

<223> Ab 5259 VH <400> 38

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr 20 25 30

Thr lie His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Met lie Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Leu Phe Leu 65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Lys Gly lie Thr Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser 115

<210> 39

<211> 646

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5259 LC ADN <400> 39

aacattgtgc tgacacagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgttct ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagttg aatagttatc cacccacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360

tgaaatctgg: aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420

aagtacagtg: gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480

agcaggacag: caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540

actacgagaa: acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600

tcacaaagag: cttcaacagg ggagagtgtt aataag 646

gatgagcagt agagaggcca agtgtcacag agcaaagcag agctcgcccg <210> 40 <211 > 213 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221 > caracterfstica diversa <223> Ab 5259 LC <400> 40

Asn lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu lie Tyr 35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Sei 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95

Phe Gly Gly

Ser Val Phe 115

Ala Ser Val 130

Val Gin Trp 145

Gly: Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala

100: 105 110

He: Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser




: 120 125

Val: Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu



: 135 140

Lys: Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser


: 150 155

Ala Pro

Gly Thr

Ala Lys

Gin Glu 160

5

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205

10

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 41

<211> 320

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > caracterfstica diversa <223> ADN kappa de Ig humana <220>

<221 > exon <222> (3)..(320)

<400> 41

ga act gtg get gca cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet gat gag Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15

ctg ctg aat aac ttc Leu Leu Asn Asn Phe 30

gat aac gee etc caa Asp Asn Ala Leu Gin 45

gac age aag gac age Asp Ser Lys Asp Ser 60

aaa gca gac tac gag Lys Ala Asp Tyr Glu 75

cag ggc ctg age teg Gin Gly Leu Ser Ser 95

cag: ttg aaa tet gga act gcc tet gtt gtg tgc

Gin: Leu Lys Ser Gly 20 Thr Ala Ser Val Val 25 Cys

tat: ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg

Tyr: Pro Arg Glu 35 Ala Lys Val Gin Trp 40 Lys Val

teg: ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag

Ser: Gly Asn 50 Ser Gin Glu Ser Val 55 Thr Glu Gin

ace: tac age etc age age acc ctg aeg ctg age

Thr: Tyr 65 Ser Leu Ser Ser Thr 70 Leu Thr Leu Ser

aaa: cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat

Lys 80: His Lys Val Tyr Ala 85 Cys Glu Val Thr His 90

ccc: gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt

Pro: Val Thr Lys Ser 100 Phe Asn Arg Gly Glu 105 Cys

<210> 42

15 <211 >106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

47

95

143

191

239

287

5

<221 > Region constante kappa de Ig humana <222> (1 )..(106)

<400> 42

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 15 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 35 40 45

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 5 100 105

<210> 43

<211 > 1602

<212> ADN

<213> Homo sapiens

10 <220>

<221 > caracterfstica diversa

<223> Secuencia genomica del dominio constante de IGHG1 humana <220>

<221 > exon 15 <222> (1 )..(298)

<220>

<221 > exon <222> (690)..(734)

<220>

20 <221 > exon

<222> (853)..(1182)

<220>

<221 > exon

<222> (1280)..(1602)

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Una composicion de anticuerpos que comprende al menos una primera y una segunda molecula de anticuerpo anti-HER3 humano que se unen a distintos epftopos de HER3, en la que:

a) dicha primera molecula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende CDR1-3 de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NOs: 48, 57, y 58, respectivamente, y CDR1-3 de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 76, YTS, y SEQ ID NO: 77, respectivamente; y

b) dicha segunda molecula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende CDR1-3 de cadena pesada que comprenden las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NOs: 54, 55, y 56, respectivamente, y CDR1-3 de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 71, HTS, y SEQ ID NO: 75, respectivamente.
2. La composicion de anticuerpos de la reivindicacion 1, en la que:

a) la primera molecula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 18, y una cadena ligera que comprende el dominio variable de cadena ligera en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20; o una variante humanizada de los mismos; y

b) la segunda molecula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14, y una cadena ligera que comprende el dominio variable de cadena ligera en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16; o una variante humanizada de los mismos.
3. La composicion de anticuerpos de la reivindicacion 2, en la que:

a) la primera molecula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende una cadena pesada que comprende un dominio variable que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 18 y un dominio constante que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 44, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20; o una variante humanizada de los mismos; y

b) la segunda molecula de anticuerpo anti-HER3 humano comprende una cadena pesada que comprende un dominio variable que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14 y un dominio constante que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 44, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16; o una variante humanizada de los mismos.
4. La composicion de anticuerpos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende ademas una tercera molecula de anticuerpo anti-HER3 humano, distinta de las moleculas de anticuerpo primera y segunda.
5. La composicion de anticuerpos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en la que al menos una molecula de anticuerpo anti-HER3 humano en dicha composicion es un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti- HER3 humano conjugado a un agente contra el cancer.
6. Una molecula de union biespecffica que se une a HER3, que comprende las CDR1-3 de cadena pesada y ligera de las moleculas de anticuerpo primera y segunda de la composicion de anticuerpos de la reivindicacion 1.
7. Una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia nucleotfdica que codifica la secuencia de aminoacidos del dominio variable de cadena pesada y la secuencia de aminoacidos del dominio variable de cadena ligera de una molecula de anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3.
8. Un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 7.
9. Una estirpe celular policlonal capaz de expresar la composicion de anticuerpos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha estirpe celular policlonal comprende celulas hospedantes capaces cada una de expresar un anticuerpo anti-HER3 humano de la composicion.
10. Un metodo para producir una composicion de anticuerpos que comprende al menos dos moleculas de anticuerpo recombinante anti-HER3 humano, comprendiendo el metodo:

a) proporcionar al menos una primera celula hospedante y una segunda celula hospedante, en el que la primera celula hospedante es capaz de expresar la primera molecula de anticuerpo anti-HER3 humano como se define en la reivindicacion 1, y la segunda celula hospedante es capaz de expresar la segunda molecula de anticuerpo anti-HER3 humano como se define en la reivindicacion 1;

b) cultivar dichas celulas hospedantes en condiciones adecuadas para la expresion de las moleculas de anticuerpo; y

c) aislar las moleculas de anticuerpo.
11. El metodo de la reivindicacion 10, en el que las celulas hospedantes se cultivan en un solo biorreactor.
12. Una composicion farmaceutica que comprende la composicion de anticuerpos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la molecula de union biespecifica de la reivindicacion 6, y un diluyente, vehiculo o excipiente

5 farmaceuticamente aceptable.
13. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 12, para uso en la prevencion, tratamiento o mejora de uno o mas sintomas asociados con cancer en un paciente humano
14. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 12, para uso en el tratamiento de cancer o un trastorno caracterizado por la expresion de HER3 en un paciente humano.

10 15. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 14, para uso en el tratamiento de cancer caracterizado por la

sobreexpresion de HER3 en un paciente humano.

imagen1

8E0S

imagen2

imagen3

o

125-, 4935

.0001 0.01 1 100 Concentration de anticuerpo [pg/ml]

ta

s

3

Actividad metabolica como porcentaje de celulas control no tratadas

imagen4

T1

(Q

C

3

w

imagen5

o

901-5 lszv

Concentration de anticuerpo [ng/rn I]

imagen6

imagen7

Concentration de anticuerpo [|jg/ml]

31

m'

c

3

00

Actividad metabolica como porcentaje c

de celulas control no tratadas 3

imagen8

00

Actividad metabolica como porcentaje de celulas control no Iratadas

imagen9

125-1 5259

Concentration de anticuerpo [Mg/ml]

31

<5'

ca

o

imagen10

3

00

00

imagen11

ro g.

3'

^ Q> CD

O

3

5082

5038

5106

4785

4935

5143

4889

Pertuzumab

o

imagen12

Q.

C

a>

CD

TJ

<5‘

c

CJl

i

3

S

E «

Q i?

tL (5 O 4=

E o

8 £

Ji

2 8

<g v)

(D jo

E =

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<

125-1

100-

75-

50-

25-

imagen13

mAb Control

6082+5106

5082+5038

5082+4785

5082+5144

4889+5143

4889+5106

4785+5038

4785+5259
0.0001 0.01 1

Concentracibn de anticuerpo (M9/mt]

100

Figura 13

(0

eg

g -3

O CO

Q- 75 o 4= E o 8'=

8 £

= cz

2 8 eg o> <0 J2 E ^

"S *8 -§ 0) >

t;

<

125-1

100-

75-

50-

25-

imagen14
0.0001

mAb Control 5082+5106 5082+5038 5082+4785 5082+5144 4889+5143 -a- 4889+5106 -A- 4785+5038 -0- 4785+5259
0.01

100

Concentracibn de anticuerpo [Mg/^i]

125-1

cn

TO

§ CO t£ -o R -S 100

TO

O 0=

E o

c

8 8

m o 75H

.Q

c

o o eg v>

a; i2 E .2

"O Q> > ^ t3 <

50-

25

imagen15

-+- mAb Control 5082+5106 5082+5038 5082+4785 ■*■ 5082+5144 -©- 4809+5143 -B- 4883+5106 -0i- 4785+5038 -6- 4785+5259
0.000001 0.0001 0.01 1 Concentracion de anticuerpo [ug/mi]

100

Figura 15

125i

TO

I »

O TO

E "D O TO

Q- "(5 o i=

E o

8 5

Jf

S 8

TO 00

© J2 E .5

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T3

<

100- -

75-

50-

imagen16

♦- roAb Control * 5082+5106 5082+5038 5082+4705 5082+5144 -e- 4889+5143 -B- 4889+5106 -A- 4785+5036 -B- 4785+5259
0.001 0.01 ' 0,1 1 10

Concentracion de anticuerpo [pg/mi]

100

Actividad metabolica oomo

imagen17

Figure 17

imagen18

Concentracion de anticuerpo [|ig/mi]

Actividad metabolica como porcentaje

imagen19

Figura 19

imagen20

imagen21

Figura 21

O

CO

120-1

s

100-

80-

«

03 T3 O 03 Q. “Jo O

E O

o c

H 60H

S 8

ra w

03 i?

E 3

"O 03 ■5 ^

tJ <

40-

20'

imagen22

5144

5082+5144

0,0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100

Concentracion cfe anticuerpo [ng/m I]

imagen23

125

100

mAb Control

analogo de Pertuzumab

analogo de MM-121

503845082

-cr
0.0001
0.01

100

Concentracion de anticuerpo ftig/mi]

Figure 23

125n

100

mAb Control

analogo de Pertuzumab

analogo de MM-121

-a-

5038+5082
0.0001
0.01

100

Concentracion de anticuerpo [pg/ml]

imagen24

>

>

"D ~a

Tv > X

H 7s m

Qi

—1 Z3 to

tratado

jjg/mi mAb control 48 h tratado

Mg/nni 5082 2 h Mg/mi 5082 4h Mg/mi 5082 16 h Mg/mi 5082 48 h tratado

Mg/mi 5038 2 h- Mg/mi 5038 4h Mg/mi 5038 16 h gg/mi 5038 48 h tratado

Mg/mi5082+5038 2 h Mg/mi 5082+5038 4h Mg/mi 5082+5038 16 h Mg/mi 5082+5038 48 h tratado

No

10

No

10

10

10

10

No

10

10

10

10

No

10

10

10

10

No

Figura 25

>

o_

3'

0)

mi.

m-

3C

m

~Q

CO

No tratado

20 Mg/mi 5082 1b 20 Mg/mi 5082 2b 20 Mg/mi 5082.4h 20 pg/ml 5082 16h 20 Mg/mi 5.082 48h 20 Mg/mi 5038 1b 20 Mg/mi 5038 2h.

20 Mg/mi 5038 4b 20 Mg/mf 5038.16h 20 pg/ml 5038 48h 20 Mg/mi 5038+5082 1h 20 pg/mi5038+5082 2h 20 pg/m! 5038+5082 4h 20 pg/mf 5038+6082 16h 20 pg/mi 5038+5082 48h 20 pg/mi Periuztmnab 1 h 20 pg/m! Pertuziirnab 2h 20 pg/ml Pertuzumab 4b 20 pg/mi Pertuzumab 16h 20 pg/mi Pertuzumab 48h No tratado

<5‘

C

NJ

Volumen tumoral (mm3)

A549

1250-1

Periodo de tratamiento

1000-

imagen25

Dias despues de la inoculacion del tumor

Control de Vetifculo N=8 ^

Cetuximab, N=7 5038, N=8 '

-A- 5082, N=8 -B- 5038+5082, N=8

* p<0.05 5038+5082 vs. cetuximab 9 p<0.05 5038 vs. cetuximab 7,6 etc. indican el numero de animates que quedan en el grupo

imagen26

imagen27

ECD de Her3 Dll murino, Dl

DIII-IV humanos

4785

4889

4935

5038

5082

1.5-

5106

D

O 1.0-

5143

TJjfc

5144
0.5-

5259

Ctrl, neg

Q.Q0Q1 0.001
0.01

PBS-T

100

[IgG] nM

Figura 30

ECD de Her3 Dill murino. DI-II-IV humanos

4785 4889 4935 5038 5082 -O- 5101 -H- 5106 -A- 5143 -9- 5144 -O- 5259
2.6-1
2.0-

*4

1,5-

Q

O 10-
0.5
0.0001
0.001
0.01

[IgGl nM

imagen28

ECD de Her3 DIV murino, Dl

humanos

4785

4889

4935

5038

5082

o

1.5-

-©• 5101

%

-Hh 5106

5143

-V- 5144
0.5

5259

Ctrl, neg
0.0001 0.001 0.01

PBS-T

100

[igGl nM

Figura 32

ECD de Her3 murino

4785

4889
2.5-1

4935

5038
2.0-

5082

O

15-

-O- 5101

V)

--O

&

O- 5106

Q

O 10-

Ha

~ifir 5143

“4F- 5144
0.5-

5259

Ctrl, neg
0.0001 0.001 0.01

100

PBS-T

[IgG] nfVI

100

478S

4935

5143

5082

4889

5038

5101

5106

5144 5259

Dominio I

Agrupamiento epitopico I

4785

4935 5143

96

97 98

96

97 99

93

95 97

23

5 1 63 |

23

3 21

0

5

0

30

28 27

6

6

8

-4

-1 ■8

-4

-1 -5

Agrupamiento epitopico I

5082 8 5

62

Agrupamiento epitopico

4889 5038

-1 3

0 3

-3 -1

99 99

96 98

0

-1

28

30

8

1 •

14

9

15

10

-1

0

96

28

7

-8

-5

Dominio 1 / Her3 Murino

III Agrupamiento epitopico IV

5101

5106

1

1

0

0

-1

-1

-1

0

0

1

1

1

92

90

93

91

6

5

7

9

Dominio 1 / II

Agrupamiento epitopico V

5144

5259

O

O

0

-1

-1

-4

0

0

2

1

0

0

28

24

8

2

81

80

84

84

Agrupamiento I

imagen29

imagen30

Volumen tumoral (mm3)

BxPC3

imagen31

Vehiculo, N=7 5038, N=8

-A- 5082, N=8

-B- 5038+5082, N=8

p<0.05 5038+5082 vs. vehiculo desde este punto de tiempo en adelante

# p<0.05 5038 vs. vehiculo en los puntos de tiempo indicados

7, 6 etc indican el niimero de animales ^ que quedan en el grupo

Porcentaje de supervivencia

BxPC3

Primera mediada del tumor >1000mm3

imagen32

Vehiculo, N=7 5038, N=8 ~6r 5082, N=8 H3- 5038+5082, N=8 ,

Prueba de rango log {Mantel Cox): p = 0.003, 5038 vs. vehiculo y - 0.001 5038+5082 vs. vehiculo