TW201231066A - Pan-HER antibody composition - Google Patents

Description

201231066 ‘ 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於靶向表皮生長因子受體（EGFR )家族之 新穎重組抗體及用於人類癌症療法之包含兩種或兩種以上 此等抗體之組成物。 【先前技術】 表皮生長因子受體家族（EGFR或ErbB/HER家族）為 受體酪胺酸激酶（RTK )之子群且由以下四個成員組成： EGFR/ErbB、HER2/ErbB2、HER3/ErbB3 及 HER4/E]:bB4。 EGFR家族之成員為緊密相關之單鏈模組醣蛋白，其具有細 胞外配體結合區、單一跨膜域及細胞内酪胺酸激酶。在正 常生理學環境中，ErbB家族調節細胞生長、分化及遷移之 協調中之關鍵事件。咸信EGFR、HER2及HER3在正常細 胞惡性轉型及癌細胞持續生長中發揮關鍵作用。已發現 EGFR及HER2由許多上皮癌症過表現。EGFR及HER2之 過表現另外與若干人類上皮癌症中之疾病進展、存活率降 低、反應不良及化學療法抗性有關。HER4在惡性轉型及癌 症進展中之作用尚存爭議且在本文中將不再進一步討論。 EGFR及HER2為得到確認之癌症目標且其酪胺酸激酶 之單株抗體與小分子抑制劑均已獲准用於治療各種癌症。 目前探索HER3作為潛在治療目標。然而，最初對此等療法 有反應之患者通常因發展出後天抗性而復發。臨床前研究 指出在抗性發展中涉及未靶向受體中之一或兩者。因此， 201231066

ErbB $冑似乎具有彼此替&以維持生長刺淺欠性信號傳導及 心！生表型之能力。同時靶向兩種或所有三種受體因此可為 抑制具有ErbB家族依賴性之癌細胞的更有效方法。 EGFR為由1186個胺基酸殘基之單一多肽鏈組成之ι7〇 kDa細胞表面醣蛋白，最初藉由對來自人類陰門癌細胞系之 人類cDNA進行選殖及定序而得到確定及描述。EGFR含有 二個主要結構域：細胞外域、跨膜域及含有酪胺酸激酶之 細胞内域。EGFR之催化活性存在於酪胺酸激酶域（殘基 685-953 )中且在配體結合時活化。 EGFR以兩種不同構形，亦即繫鏈構形（封閉）及延伸 構形（開放）存在。受體在兩種構形之間轉換。在繫鏈構 形中，EGFR之細胞外區的結構域π與IV相互作用使得 受體處於自體抑制狀態。此外，結構域ΙΠ保持與域丨相距 顯著距離，藉此使EGF不可能同時結合於兩個結構域。在 EGFR之延伸構形中，結構域！ ' π及ΙΠ在空間上排列為c 形’從而給予EGF結合以空間。此外’構形變化誘導結構 域II中由20個殘基區組成之召-髮夾序列（亦稱為「二聚 化臂（dimerization arm)」）暴露。自EGFR之結構域π 延伸的二聚化臂與另一 EGFR之結構域Π廣泛接觸，藉此 形成EGFR均二聚體。 二聚化使得受體之活性細胞質酪胺酸激酶域足夠接近 以便將受體之調節區中之酪胺酸殘基磷酸化。此外，兩個 受體之近膜區（juxtamembrane region )形成反平行二聚體， 已發現s玄反平行一聚體在穩定化路胺酸激酶二聚體中為重 201231066 、 要的。與「配體介導」之二聚化為更常見特徵之其他酪胺 酸激酶受體相比，「受體介導」之二聚化機制為ErbB家族 所獨有的。 已提出EGFR之細胞内酪胺酸激酶域的許多活化模 式。不同於其他受體酪胺酸激酶，EGFR酪胺酸激酶域默認 採用通常僅在磷酸化及活化激酶中觀察到之構形。此表明 EGFR之激酶域具有組成性活性。調節組成性酪胺酸激酶因 此將經由傳遞二聚化搭配物之c端調節區以便進行反式磷 酸化來進行。另一可能性為酪胺酸激酶域之活化涉及替代 在結晶學研究中尚未觀測到之抑制性相互作用。然而，eGFr 之近膜及酪胺酸激酶之晶體結構分析已揭示在兩個EGFr 二聚化時形成之酪胺酸激酶之不對稱二聚體對於調節酪胺 酸激酶活性為重要的。在此不對稱均二聚體中，一個酪胺 .酸激酶充當接受體，而另一酪胺酸激酶充當供體。僅接受 體激酶域具有催化活性且對受體c端尾部中之酪胺酸殘基 進行磷酸化（無論為順式抑或反式，或兩者均為未知）。 網格蛋白（clathrin )介導之内飲作用為EGFR下調之 最重要機制。EGFR之命運取決於配體_受體複合物之穩定 性。在EGF結合於EGFR時，EGFR均二聚體快速靶向至網 格蛋白包覆之凹穴且經由配體誘導之内飲作用而内化。同 時EGFR籍由連接單泛素與多泛素而高度泛素化。泛素連接 酶Cbl負g EGFR之泛素化。cbl直接或經由接附子蛋白（諸 如Grb2)間接結合於位於EGFR之調節區的磷酸化酪胺酸 殘基。Cbl經由Grb2結合於EGFR對於受體内化為必需的。 201231066

Espl5亦在EGFR内化中起作用。然而Espl5之確切作用仍 有爭論。在EGFR之内飲下調及EGFR内體分選至溶酶體中 涉及泛素化。泛素鏈由轉運所需之内體分選複合物 (endosomal sorting complex required for transport； ESCRT ) 及Hrs/STAM識別，其保留早期内體之膜中之泛素化蛋白 質，藉此阻礙EGFR再循環。隨後，EGFR被分選至内腔小 泡（intra luminal vesicles ; ILV )中，從而使得 EGFR 傳遞 至晚期内體中且最終在溶酶體中降解。 與EGFR當結合於EGF時降解相反，TGF- α結合允許 受體再循環。在早期内體中，由於酸性環境，TGF- α配體 自EGFR快速解離，使得受體去磷酸化、去泛素化且藉此使 受體再循環返回至細胞表面。EPR結合於EGFR對EGFR之 内飲分選具有與TGF- 〇:相同之作用。HB-EGF與BTC均靶 向所有EGFR以便進行溶酶體降解，而AR引起快速以及緩 慢之EGFR再循環。

Schechter等人於1984年首次描述人類表皮生長因子受 體 2 ( HER2、ErbB2 或 Neu) 。HER2 由 1234 個胺基酸組 成且結構類似於具有由四個子結構域I-IV (跨膜域、近膜 域、細胞内細胞質酪胺酸激酶及調節性C端域）組成之細 胞外域的EGFR。 在HER2中不存在限制繫鏈EGFR中結構域排列之結構 域II-IV接觸。對於未活化EGFR中之繫鏈穩定化重要的七 個保守殘基中之三者在HER2中不同。因此，HER2類似於 呈延伸（開放）形式之EGFR，其中二聚化臂暴露且明顯趨 201231066 Ί %ι 、 向推動受體-受體相互作用。不存在繫鏈HER2構形表明受 體缺乏自體抑制，如對於ErbB家族之其他成員所見。子結 構域I-III之穩定界面似乎使HER2保持於類似於EGFR-EGF 複合物之延伸組態的延伸組態。結構域I與III之間的相互 作用涉及對應於EGFR之結構域I及III中配體結合位點之 區，從而在空間上未為配體留下空間，使得HER2不能結合 配體。結構域II及IV形成兩個不同界面，其使HER2及 ErbB家族之另一成員穩定形成異二聚體。 生物物理學研究未能在溶液或晶體中偵測到顯著 HER2均二聚作用。EGFR與HER2之結構域II之殘基類似。 然而，位於二聚體界面上之Arg285在EGFR與HER2之間 不保守。在HER2中，殘基285為Leu。突變研究表明在此 位置之Leu為溶液中不存在HER2均二聚體之部分原因。完 整HER2之活體内二聚化可能需要HER2之跨膜域中其他位 點相互作用。 HER2為ErbB家族中不結合已知配體之唯一成員。 HER2實際上經由與其他ErbB家族成員形成異質複合物來 活化，且藉此受EFGR及HER3配體間接調節。HER2為三 種其他ErbB受體之較佳異二聚化搭配物。HER2藉由減緩 配體-受體複合物之解離速率來增強其他ErbB受體對於其 配體之親和力，由此HER2增強且延長信號傳導。HER2增 強其他ErbB受體之配體親和力的能力可反映HER2作為異 二聚化搭配物之混雜特性。HER2及ErbB家族之另一配體 結合受體的異二聚化誘導交叉磷酸化，使得C端酪胺酸殘 201231066 基磷酸化。最具活性之HER2異二聚體為HER2-HER3複合 物。HER2藉由提供活性激酶來補充激酶缺陷型HER3。 與EGFR相反，HER2當過表現時具有内化抗性。已進 一步報導HER2過表現會抑制其他ErbB家族成員之内飲作 用。已提出HER2逃脫溶酶體降解且藉此保留於質膜上之兩 種機制。HER2避免内化或其變得自内體有效再循環返回至 質膜。使用經標記抗體進行之研究已顯示HER2恆定地内化 及再循環。相反，其他研究未能在用已知抑制再循環之化 合物處理之細胞中鑑別出細胞内HER2。 已提出HER2之羧基端不具有内化所需之所有信號或 其含有對網格蛋白介導之内飲作用而言必不可少之抑制信 .號。另外，研究已表明HER2異二聚體不傳遞至内體。亦已 在HER2 ( Y1112)上鑑別出Cbl對接位點（如EGFR上所 見之Cbl對接位點）。由此Cbl可募集至HER2，導致HER2 泛素化，但Cbl之實際結合效率尚不清楚。已提出HER2由 於與膜突起締合而具有内化抗性。最終，其他研究已巔示 HER2-EGFR異二聚體之内飲作用抗性與EGF誘導經網格蛋 白包覆之凹穴之形成的效率低下相關。

Kraus Μ. H.等人於1989年鑑別出稱為人類表皮生長因 子受體3( HER3、ErbB3 )之ErbB家族之第三個成員。HER3 基因編碼與EGFR及HER2具有驚人結構相似性之1342個 胺基酸之蛋白質。諸如以下之特徵：總體尺寸、四個具有 兩個半胱胺酸叢集（結構域II及IV)之細胞外子結構域 (I-IV )及酪胺酸激酶域，顯示與EGFR及HER2之結構類 201231066 ^ 似。HER3之酪胺酸激酶域顯示與EGFR之酪胺酸激酶域具 有59%序列同源性。 正如EGFR，HER3以繫鏈構形及延伸構形存在。在繫 鏈構形中，二聚化臂藉由與結構域IV相互作用而嵌埋，使 得結構域I與III分開太遠而不能有效結合配體。配體結合 於細胞外域I及III在HER3之延伸構形中發生且引起與 ErbB家族之其他成員之異二聚化。在配體結合時未形成 HER3均二聚體。延伸且配體結合之HER3分子優先與HER2 異二聚。 與EGFR及HER2相反，HER3之酪胺酸激酶之催化活 t性降低而不足引發任何可偵測之生物反應。在蛋白質激酶 之催化域中高度保守之兩個胺基酸殘基在HER3之催化域 中改變。其為天冬酸胺（aspargine )取代殘基8 1 5處之天冬 .胺酸及組織胺取代殘基740處之麩胺酸。兩個胺基酸取代 可能為HER3缺乏其酪胺酸激酶域之催化活性的原因。因為 HER3之固有激酶活性降低，所以受體需要與另一 ErbB家 族成員異二聚以應答其自身之配體結合。 對於HER3之内飲作用知之甚少。此外，不同研究已表 明HER3之内飲作用具有與HER2相同程度之降低。與此相 符，發現HER3-NRG1複合物與EGFR-EGF複合物相比内化 效率較低且較慢，從而支持HER3之内飲效率不如EGFR之 觀點。然而，當EGFR之C端尾部以HER3之C端尾部替 代時，EGFR之内飲作用降低，表明HER3之C端中之區域 保護受體免於内化。亦已表明由於内體中配體-受體複合物 201231066 之解離（如在EGF受TGFa活化時所觀察到）致使NRGl 不能有效把向HER3以進行降解。 在近十年來，已深入研究靶向ErbB家族作為癌症治療 策略。已探索了不同治療模態，諸如酪胺酸激酶抑制劑 (TKI)、單株抗體（mAb)及配體阱（iigand_trap)。單 株杬體用於治療癌症之有利之處在於目標特異性，從而確 保與習知細胞毒性癌症化學療法相比較低之毒性。單株抗 姐已獲准用於，α療具有異常高含量EGFR或HER2之實體腫 瘤’ ^眾多乾向EGFR< HERkmAb處於臨床試驗中。 TKI藉由結合於EGFR及HER2之酪胺酸激酶域中之ATP 結合位點來抑制受體信號傳導。埃羅替尼（Erl〇tinib ) /Τ3Γ_⑧抑制EGFR之路胺酸激酶，而拉帕替尼（lapatinib ) /Tykerb®抑制EGFR與HER2兩者之絡胺酸激酶。埃羅替尼 與拉帕替尼均為FDA批准分別用於治療非小細胞肺癌 (麵-smaH lung eaneer; nsclc)及過表現職2之轉移 性乳癌的TKI。 然而’儘管單株抗體療法及TKI在臨床上有用，Μ 治療之後天抗性的發展日益成為問題。mAb 性化學療法之組合療法為一種 η禋進仃以k尚治療功效之力 法。此外，正探索若干策 k尚早株抗體之功效，包相 增強效應功能，及利用访鉍u 射性核種或毒素對抗體進行 及間接武裝。另一策略為針 $仃直接 蚵對不同目標之mAb之組合。

ErbB受體之雙重抑制 丨列曰7村學基本原理建立在 刖試管内及活體内研究上 °°床 所九上该專研究已利用雙重ErbB方法 10 201231066 « ' ❿非單一受體靶向產生了優良的抗腫瘤活性。已在試管内 及/舌肚内也月利用單株抗體混合物同時乾向及her2 上之夕個抗原决疋基優於mAb( Friedman等人， 102:1915_2<〕）且在攜帶過表現醜2之乳癌細胞之異種移 植腫瘤的小鼠中，與任何單一藥劑相比，τκι吉非替尼 (gefitinib)與兩種mAb曲妥珠單抗㈠⑻加㈣此）及帕 妥珠單抗（pertUZUmab)之間的組合提供顯著改良之抗腫瘤 功效（Arpino 等人，JNatlCancerInst2〇〇7 99:694 7〇5)。 已觀察到在試管内致癌轉型期間出現ErbB受體家族中 之受體酪胺酸激酶共活化之能力，且該能力似乎在人類原 發性腫瘤之發展及進展中起重要作用。ErbB家族成員之協 同作用此外已得到試管内及活體内研究之支持該等研究 證明過表現ErbB之癌細胞中對mAb及TKI的抗性與其他 ErbB家族成員之活性增強相關。RTK共活化使癌細胞能夠 同時活化兩種或兩種以上RTK以獲得網路穩固性且提高信 號傳導結果之多樣性。RTK共活化已於多種癌症類型中重 /¾ ’尤其在對τκι之後天抗性的情形中，表明rtk共活化 所致之致癌基因轉換可能為癌細胞經由下游信號傳導分子 之持續活性來達成化學抗性之通用機制。已在PiUay等人

Neplasia 2009; 1 1: 448-58, 2之研究中進一步描述rtK共活 化’該研究證明活化型受體酪胺酸激酶之階層，因此允許 在主要RTK不活化之後快速補償二級二級RTK之共 活化可經由自分泌-旁分泌生長因子分泌、由主要RTK進行 之直接轉磷酸化作用、經由信號傳導中間物（諸如Src)進 201231066 行之間接磷酸化作用、或轉錄調節來發生。主要RTK之實 例包括EGFR及HER2，而二級RTK可包括HER3。 克服對用於治療具有高含量ErbB家族受體之癌症的 mAb及TKI之抗性的潛在策略可包括同時靶向多種ErbB受 體以阻斷致癌RTK信號傳導及克服補償機制。此種策略將 在穩固ErbB信號傳導網路中誘導不尋常之擾動，並由此有 望克服抗性之發展。 【發明内容】 本發明係關於針對HER家族内之受體的改良之治療 劑，其更廣泛地干擾HER家族之多個成員（泛-HER抑制）。 更特定言之，本發明係關於抗體組成物用於人類癌症療 法，例如用於治療乳癌、卵巢癌、胃癌、肺癌及對於受體 EGFR、HER2及HER3中之一或多者具有依賴性之其他癌症 的用途。相較於用於此等癌症之現有治療，包括針對HER 家族受體之可用單株抗體及抗體組合以及小分子，預期本 發明之抗體組成物可單獨或視情況與其他治療（諸如化學 療法）組合提供優良臨床反應。 在一個態樣中，本發明係關於一種重組抗體組成物， 其中至少一種不同抗HER抗體分子結合第一 HER家族受體 之抗原且至少一種不同抗HER抗體分子結合第二HER家族 受體之抗原。 在另一態樣中，本發明係關於一種重組抗體組成物， 其中至少一種不同抗HER抗體分子結合第一 HER家族受體 12 201231066 - 之抗原且至少一種不同抗her抗體分子結合第二her家族 受體之抗原，且至少一種不同抗her抗體分子結合第三 her家族受體之抗原。 本發明較佳係關於一種重組抗體組成物，其中該組成 物包含至少一種具有來自1254、1277或1565之CDR或能 夠抑制1254、1277或1565之結合及/或與1254、1277或 1565結合相同抗原決定基的抗EGFR抗體；至少一種具有 來自43 84、43 85、4517或4518之CDR或能夠抑制4384、 4385'45 17 或 4518 之結合及/或與 4384、4385、4517 或 4518 結合相同抗原決定基的抗HER2抗體；及至少一種具有來自 503 8或5082之CDR或能夠抑制503 8或5082之結合及/或 與5038或5082結合相同抗原決定基的抗HER3抗體。在本 發明之一特定較佳具體實例中，抗體組成物包含具有抗體 1277+1565 + 4384+45 17 + 5038 + 5082 之 CDR 的抗體，或能夠 抑制該等抗體之結合及/或與該等抗體結合相同抗原決定基 的抗體。 已證明本發明之代表性抗體組成物有效抑制代表性癌 細胞系之增殖，其指示可在活體内用於治療癌症。此等指 示性結果已在小鼠中人類癌症之異種移植模型中得到確 認。 在另一態樣中’本發明係關於一種免疫結合物，其包 含本發明之重組抗體組成物結合於抗癌劑。 在另一態樣中，本發明係關於編碼本發明抗體之核酸 分子、包含該等核酸之表現載體及包含該等核酸或表現載 13 201231066 體之宿主細胞。 在另匕、樣中，本發明係關於一種製造本發明之抗體 組成物的方法。 在其他態樣中，本發明係關於—種醫藥組成物，其包 含本發明之抗體組成物及醫藥學上可接受之載劑。 此外，本發明係關於一種治療人類或其他哺乳動物之 癌症的方法，纟包含向有需要之個體投予治療有效量之本 發明之抗體組成物。 在又一態樣中，本發明係關於一種本發明之抗體組成 物’其係用作醫藥品，用於治療癌症及/或用於治療人類或 其他哺乳動物之對利用抗體及，或TKI治療具有後天抗性之 癌症。 在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥製品，其包含 呈組合形式之本發明抗體組成物與至少一種化學治療性或 抗贅生性化合物用於在癌症療法中同時、分開或連續投 予。本發明之抗體組成物可能可用於第二線治療（sec〇nd line treatment)’亦即在使用習知化學治療劑或抗贅生劑進 行治療之後或同時’或在輻射療法及/或手術之後或同時用 於治療。 【實施方式】 定義 術語「抗體（antibody )」或「抗體分子（antib〇dy molecule )」描述血清之功能性組分且常稱作分子集合（抗 14 201231066 蛋白）或-種分子（抗體分子或免疫球蛋白分 1能夠結合特定抗原決定子（抗原或抗原性抗原 、其反應’該特定抗原決定子又可誘導免疫效 抶 體常視作具有單特異性，且抗體之組成物 ㈣ 亦即由相同抗體分子組成）或多株（亦即由兩 …種以上與相同抗原上或甚至明顯不同抗原上之相同 二 原決定基反應的不同抗體組成）抗體。各抗體具 有使其成夠特里松^人# 然抗體均具有包含的㈣結構，且所有天 3 “相同輕鏈及兩條相同重鏈之相同總 土本結構。抗體亦統稱為免疫球蛋白。 人如本文所用，術語「抗體（antibody)」亦意欲包括嵌 &及單鏈抗體；以及抗體之結合片段，諸如Fab、Fv片段 或早鏈FV(SCFV)片段；以及多聚形式，諸如二聚IgA分 子或五h IgM。亦包括抗體模擬物。抗體可具有人類或非人 類來源’例如鼠類或其他齧齒動物來源的抗體，或基於例 如鼠類抗體之嵌合、人類化或再成形（reshaped)抗體。抗 肚之各重鏈典型地包括重鏈可變區（vh)及重鏈恆定區。 重鍵值定區典型地包括稱作cm、⑽及CH3之三個結構 域。各抗體輕鏈典型地包括輕鏈可變區（VL)及輕鏈怪定 區。輕鏈性定區典型地包括稱作CL之單-結構域。VH及 VL區可進一步再分為具有高變性之區域（「高變區 (hypervai.lable reglon)」，其序列及/或結構確定之環可 具高變性）。此等高變區亦稱為互補決定區（CDR)，立間 穿插有稱作構架區（FR)之較保守區域。各VM VL典型 15 201231066 •地包括三個CDR及四個FR，自胺基端至羧基端按以下順序 排歹|J : FR1 、 CDR1 、FR2、CDR2、FR3 、CDR3 、FR4。可 變區中之胺基酸殘基通常使用稱為Kabat編號方案之標準 化編號法進行編號（Kabat等人，（1991) Sequences of

Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)。 當將抗體稱為「來源於（derived from )」或「基於（based on)」本文所述之指定抗體時，此意謂「所產生之（derived)」 抗體視特定情形而定包含以下中之一者：該指定抗體之重 鏈CDR3序列；該指定抗體之重鏈CDR3序列及輕鏈CDR3 序列；該指定抗體之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列及輕 鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；或該指定抗體之重鏈可變 區序列及輕鏈可變區序列’或該重鏈可變區序列及/或輕鏈 可變區序列之人類化及/或親和力成熟變異體，或與各別重 鏈及輕鏈可變區序列具有至少80% ' 85%、90%或95%序列 一致性（諸如至少96%、97%、98%或99%序列一致性）之 重鏈及/或輕鏈可變區序列。來源於或基於本文所述之指定 抗體的抗體一般將與該指定抗體結合相同抗原決定基且將 較佳顯示與該指定抗體實質上相同之活性。若抗體與該指 定抗體競爭結合，則將該抗體視為與指定抗體結合相同 HER抗原決定基。 抗體與目標抗原才目互作用之特異性主要㈣位於重鍵 及輕鏈之六個CDR中的胺基酸殘基。個別抗體之間CDR内 之胺基酸序列的可變性因此比CDR以外之序列大得多。由 16 201231066 磉 於CDR序列負貝大部分抗體-抗原相互作用，所以有可能表 現模擬天然產生之特定抗體或更一般而言具有指定胺基酸 序列之任何特定抗體之性質的重組抗體，此係藉由建構表 現來自特定抗體且移植至來自不同抗體之構架序列中的 CDR序列 < 表現載體來達成。因此，可「人類化」非人類 抗體且仍實質上維持原始抗體之結合特異性及親和力。下 文提供對人類化之更詳細論述。 「嵌合抗體（chimeric antibody )」在其最廣泛意義上 係札含有來自一種抗體之一或多個區域以及來自一或多種 其他抗體之一或多個區域的抗體。如本文所用，「嵌合抗 體」一般為部分源於人類且部分源於非人類（亦即部分來 源於非人類動物，例如小鼠或其他齧齒動物，或禽類，諸 如雞）的抗體。嵌合抗體優於非人類抗體，以便降低人類 抗抗體反應（例如在鼠類抗體之情況下的人類抗小鼠抗體 反應）之風險。典型嵌合抗體之一實例為可變區序列為藉 由免疫小鼠獲得之鼠類序列而恆定區序列為人類序列的抗 體。在嵌合抗體之情況下，可對非人類部分（亦即，典型 地為可變區序列之構架區）進行進一步改變以對抗體進ία類化。 订 術語「人類化（humanize )」係指以下事實：當抗體* 全或部分源於非人類（例如藉由用所關注抗原免疫小鼠所 獲得之鼠類抗體，或基於此種鼠類抗體之嵌合抗體）時， 可置換尤其重鏈及輕鏈之構架區及恆定域中之某些胺基萨 以避免人類之免疫反應或使反應減至最小。已知所有抗2 17 201231066 均有引發人類抗抗體反應之潛力，其在某種程度上與所討 論之抗體的「人類性（humanness )」程度有關。儘管不可 能精確預測特定抗體之免疫原性且由此不可能精確預測人 類抗抗體反應’但非人類抗體之免疫原性傾向於比人類抗 體強。外來（通常為齧齒動物）恆定區已置換為人類來源 之序列的嵌合抗體已顯示一般具有低於完全外來來源之抗 體的免疫原性，且治療性抗體趨向於為人類化抗體或完全 人類抗體》 對於非人類來源之嵌合抗體或其他抗體，其因此較佳 經人類化以降低人類抗抗體反應之風險。對於嵌合抗體， 人類化典型地涉及修飾可變區序列之構架區。作為互補決 疋區（CDR )之一部分的胺基酸殘基典型地將不結合人類化 進行改變’但在某些情況下，可能需要改變個別Cdr胺基 酸殘基，例如以移除糖基化位點、去醯胺化位點或不需要 之半胱胺酸殘基^ N-連接型糖基化藉由將寡醣鏈連接至三 肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr中之天冬醯胺殘基來進行， 其中X可為除Pro以外之任何胺基酸。移除N_糖基化位點 可藉由較佳藉助於保守性取代使Asn或Ser/Thr殘基突變為 不同殘基來達成《天冬醯胺及麩醢胺酸殘基之去醯胺化可 視諸如pH值及表面暴露之因素而進行。天冬醯胺殘基主要 當存在於序列Asn_Gly中時特別易於去醯胺化，而在其他二 狀序列（諸如Asn-Ala)中時去醯胺化程度較低。當此種去 醯胺化位點（特疋§之為Asn-Gly )存在於序列中時， 因此可品要典型地藉由保守性取代以移除一個所牽涉之 18 201231066 . 殘基來移除該位點。本發明亦意欲涵蓋在CDR序列中進行 取代以移除一個所牽涉之殘基。 此項技術中已知抗體序列之眾多人類化方法；參看例 如 Almagro 及 Fransson (2〇〇8) Fr〇nt 則…以 i3 i6i9 i6w 之回顧…種常时法為CDR移植，其對於例如鼠類來源 之嵌合抗體而言涉及鑑別鼠類可變區基因之人類生殖系基 因對應物及將鼠類CDR序列移植至此構架中eCDR移植$ 基於Kabat CDR定義，但近期出版物（如 等人，（2007) Crit Rev.〇ncol Hemat〇1 64: 21〇 225 )已提出 IMGT定義（www.imgt.org)可改良人類化之結果。因為咖 .移植可能會降低CDR移植非人類抗體的結合特異性及親和 2，且因此降低其生物活性，所以可在⑽移植抗體之選 疋位置處引入回復突變以保持親本抗體之結合特異性及親 和=。可使用在文獻及抗體資料庫中可獲得之資訊來鑑別 可能回復突變之位置。作為回復突變之候選者的胺基酸殘 基典型地為位於抗體分子表面之胺基酸殘基，而通常不會 改變嵌埋或具有低表面暴露度之殘基。⑽移植及回復突 變之替代性人類化技術為表面重塑（π·—)，其中保 ^非人類來源之非表面暴露殘基，而將表面殘基改變為人 類殘基。 在某些情況下，亦可能需要改變一或多個cdr胺基酸 以改良對目標抗原決定基之結合親和力。此稱為「親 二人成熟（affinity maturation )」且例如在抗體人類化引起 特異！生或親和力降低且僅藉由回復突變不可能充分改 19 201231066 良結合特異性或親和力之情況下，可能視情況結合人類化 來進行。此項技術中已知各種親和力成熟方法，例如Burks 等人，（1997) PNAS USA，第94卷，第412-417頁所述之試 管内掃描飽和突變誘發方法’及Wu等人，（1998) PNAS USA, 第95卷，第603 7-6042頁之逐步試管内親和力成熟方法。 如上所述，本發明涵蓋人類化抗體’亦即已進行人類 化的另外描述之抗體。其亦可為稱作本發明抗體之「人類 化變異體（humanized variant )」。特定言之，如本文中關 於任何特定胺基酸序列所用之術語「重鏈可變區序列（heavy chain variable region sequence)」及「輕鏈可變區序列（light chain variable region sequence)」意欲不僅涵蓋該特定序 列，而且亦涵蓋其任何人類化變異體，本發明亦意欲涵蓋 本文所述之抗HER抗體的親和力成熟變異體。 如本文所用，提及相較於指定重鏈或輕鏈可變區序列 具有特疋最低程度之序列一致性，例如與參考序列具有至 少90%或95%序列一致性（諸如至少96%、97%、98%或99% 序列一致性）的重鏈可變區序列或輕鏈可變區序列意欲包 括（但不限於）此參考序列之人類化及/或親和力成熟變異 體。 ..... 術语「重組抗體（recombinant antib〇dy)」係指由經 包含抗體編碼序列之表現載體（或可能為一種以上表現載 體’典型地為兩種表現載體）轉染之細胞或細胞系表現的 抗體，其中該編碼序列與該細胞在天然環境中不相關。 術語「載體（vector )」係指可供核酸序列插入以便在 20 201231066 不同遺傳環境之間傳輪片 , 或於宿主細胞中表現的核酸分 子。攜帶用於轉錄核酿皮 ㈣^序列之調節元件（至少一個適合啟 動子）的載體稱作「表現載體（expression vector)」。術 s吾「質體（plasmid),^「番 a* J」與载體」可互換使用。在本發明 上下文中使用之表現載體可為此項技術中已知之任何適合 類型，例如質體或病毒載體。 σ 術語「多株抗體（Polyclonal antibody)」或「[單株 抗體之混合物|得；@ + _ ^ 心兩種或兩種以上能夠結合相同或不同 抗原上之不同特疋抗原決定子或與其反應之不同抗體分子 的組成物。在本發明之上下文中，多株抗體之個別抗體社 合職家族之不同抗原決定子。本發明之多株抗體的個： 抗體較佳結合HER家族之不同抗 且實質上不重疊之抗原決定基。一般認為多株抗體：= 性位於抗體分子之可變區中。 在此項技術中熟知抗體以不同同型存在，諸如人類同 型 IgGl、lgG2、IgG3、IgG4、IgA1 及 IgA2，或鼠類同型 IgGl IgG2a IgG2b、lgG3及igA。本發明抗體可為任何 同型。儘官本發明之多株抗體組成物之個別抗體可包括一 種以上同型之抗體，但其較佳均屬於同一同型。 術語「HER依賴性（HER dependency)」係指癌細胞 依賴於一或多種HER家族受體以便維持惡性性質，諸如增 殖、生長 '運動性、侵入、存活及/或化學抗性。依賴性可 由受體過表現、受體突變、自分泌生長因子產生及/或與其 他受體系統之串音（cross-talk)引起。 21 201231066 術語「泛-HER ( pan-HER )」或「泛-HER抗體組成物」 係指能夠結合至少兩種HER家族受體上之至少兩種不同抗 原之抗體分子的組成物。在本發明之上下文中，抗體組成 物之個別抗體結合HER家族之不同抗原決定子《抗體組成 物之個別抗體較佳分別結合EGFR及HER2、EGFR及 HER3 ' HER2 及 HER3，或 EGFR、HER2 及 HER3。 術s吾「HER」表示如上文在「先前技術（Background of the invention )」章節中所述之「人類表皮生長因子受體」 且可與術語「ErbB」互換使用以特性化由四個成員 EGFR/ErbB、HER2/ErbB2、HER3/ErbB3 及 HER4/ErbB4 組 成之受體酪胺酸激酶（RTK )之子群。總而言之，此四種受 體構成「HER家族」受體。如本文所用，其意欲包括her 之變異體、同功異型物及物種同源物。 術語「CDR」或「互補決定區」係指抗體可變域中所見 之「高變」區’其主要負責決定抗體之結合特異性。參看 以下中之定義：Lefranc 等人，（2003)，IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, Dev. Comp Immunol. 27, 55-77。抗體之重鏈及輕鏈各自含有三個CDR 區，稱作CDR1、CDR2及CDR3，其中CDR3顯示最’大可 十生0 術5吾「抗原決定基（e p i t 〇 p e )」用於描述較大分子（例 如抗原或抗原位點）中在動物中具有抗原或免疫原性活性 之部分。具有免疫原性活性之抗原決定基為較大分子中在 22 201231066 動物中引發抗體反應之部分。且女> = 具有抗原活性之抗原決定美 為如藉由此項技術中已知之^壬相· 士 ^ 饤方法所確定，較大分子中 由抗體免疫特異性結合之部分。，β ^ w τ 刀抗原決定基不一定具有务 疫原性。抗原為抗體或抗體片段免疫特異性結合之物質， 例如毒素、病毒、細菌、蛋白質或DNA。抗原或抗 除非極小否則通常具有—個以上抗原決定基，且通常能夠 刺激免疫反應。抗原決定基可Aw ^ 了為線性或構形抗原決定基。 線性抗原決定基一般由抗體所識別之蛋白質分子上約6 1〇個相鄰胺基酸組成。相比之下，構形抗原決定基由並^ 連續排列之胺基酸組成，但其+抗體識別特定三維結構。 田蛋白質分子摺疊成：維結構時，形成抗原決定基之胺臭 酸相鄰，使得抗體能夠識別構形抗原決定基。在變性蛋= 中，僅識別線性抗原決定基。構形抗原決定基根據定 處於摺疊蛋白質外部。 一術語「不同抗原決定基（distinetepit〇pe)」係指如下 事實：當本發明之兩種不同抗體結合不同抗原決定基時， 存在小於⑽％之抗原結合競爭，較佳小於嶋 競爭，更佳小☆观之抗原結合競爭，且最佳存在=；； ,之競爭，諸如小於約25%之抗原結合競爭。能夠彼此競 ’結合相同抗原之抗體可結合相同或重疊之抗原決定基， 或可具有彼此緊鄰之結合位點’以使競爭主要由位阻引 起二對於抗體對之「不同抗原決定基」之分析可藉由此項 技命中已知之方法進行，例如藉助於在飽和抗體條件下使 用FACS (螢光活化細胞分選）或其他流動式細胞量測分析 23 201231066 對表現HER家族及個別榮光標記抗體之細胞進行結合實 驗’或藉由使用捕捉或結合於流動細胞表面之舰家族抗 原進行表面電聚子共振（S P R )來進行。使用s p r測定抗: 間之競爭的方法描述於實施例中。 不同抗原決定基較佳在以下意義上為「不重疊的」： 本發明組成物中之兩種不同抗HER抗體具有足夠低之抗原 結合競爭’使得兩種抗體能夠同時結合其各別抗原決定 基。熟習此項技術者應瞭解，可存在不同程度之重疊且 儘管存在某種程度之重4,但仍可認為不同抗原決定基「不 重疊」’只要各別抗體能夠實質上結合其抗原決定基即可。 當兩種抗體之間的抗原結合競爭小於約5〇%時，則一般視 為此種情況。

類似地，與本發明拍艘「#|u A r ^ ^ ^奴爭結合」之抗體可定義為 顯示約50%或50%以上抗原結合競爭之抗體。 結合相同抗原上之不同抗原決定基的抗體可對其所结 合之抗原之活性具有不同影響，此視抗原決定基之位置而 定。結合抗原活性位點中之抗原決定基的抗體可能完全阻 斷抗原功能，而結合不同抗原決定基之另—抗體可能對抗 原活性無影響或僅有極小影響。然而，此等抗體仍可活化 補體且藉此消除抗原，且在與—或多種結合於同一抗原上 之不同抗原決定基的抗體組合時可產生協同效應。在本發 明之上下文中，抗原決定基較佳為腿家族之細胞外域之 -部分。本發明之抗原較佳為抗體或抗體片段所免疫特里 性結合之細胞外域職家族蛋白質、多狀或其片段。刪 24 201231066 • 家族相關抗原亦可為抗體或抗體片段所免疫特異性結合之 her多肽或其片段之細胞外域的類似物或衍生物。 術免疫球蛋白（immunoglobulin )」常用作見於血 液或血清中之抗體之混合物的總稱，但亦可用於指示來源 於其他來源之抗體的混合物。 術#「同源VH與VL編碼對」描述含於相同抗體產生 細胞内或來源於相同抗體產生細胞之Vh與八編碼序列的 原始對。因此’同源¥11與Vl對表示最初存在於獲得此種 細胞之供體中的VH與VL配對。術語「自Vh與Vl編碼對 表現之抗體」指示抗體或抗體片段由含有VH及VL編碼序 列之載體、質體或其他聚核苷酸產生。當同源Vh與編 碼對表現為完全抗體或其穩定片段時，其保留最初自獲得 5玄編碼對之細胞表現之抗體的結合親和力及特異性。同源 對之文庫亦稱作同源對之譜系或集合，且可個別地保存或 彙集。 蛋白吳（protein)」或「多肽（polypeptide)」意謂 任何胺基蜓鏈，而不論長度或轉譯後修飾如何。蛋白質可 以單體或包含兩個或兩個以上組裝之多肽鏈的多聚體、蛋 白質片段、多肽 '寡肽或肽形式存在。 術語「頭對頭啟動子（head_t〇_headpr〇m〇ter)」係指 緊鄰安置以使兩個基因片段由啟動子驅動之轉錄在相反方 向上進行的啟動子對。頭對頭啟動子亦稱作雙向啟動子。 術s吾「轉染（transfecti〇n)」在本文中用作將外來dNA 引入細胞中之廣泛術語。該術語亦意欲涵蓋用於將外來 25 201231066 腦引人細胞中的其他功能等效方法，諸如轉型、感染 轉導或供體細胞與接受體細胞融合。 ' 如本文所用，術語「衣岳丨吐且 町。抑制生長」（例如在提及細胞時） 意欲包括細胞當與本發明之抗體组成物接觸時，相較於在 無該抗體組成物存在下相同細胞之生丨，增殖（細胞數目 增加）或代謝之任何可量測降低，例如將細胞培養物之生 長抑制至少約1〇%，及較佳10%以上，諸如至少約2〇%或 3〇〇/〇，更佳至少約40%或5〇%，諸如至少約6〇%、鳩㈣、 90%、99%或甚至 ι00%。 如本文所用，術語「治療」係指投予足量本發明之抗 體組成物以緩和”咸少、改善或根除（治癒）症狀或疾病 病況。投予兩種或兩種以上本發明抗體—般藉助於同時投 予該等抗冑，較佳以含有所有用於治療之抗體之組成物的 形式來達成。然而’亦可能分開投予兩種或兩種以上本發 月抗姐因此，本文中提及例如投予包含至少兩種抗體之 重組抗體組成物應理解為不僅涵蓋按原樣投予包含至少兩 種抗體之組成物，而且亦涵蓋分開投予抗體。兩種或兩種 以上本發明抗體之組合因此可同時、依序或分開投予。 兩個序列（例如可變區序列）之間的一致性百分比係 指考慮到必須引入以獲得兩個序列之最佳比對的間隙序 列所共有之相同位置的數目（計算為相同位置數目/位置總 數X 1 00 )。兩個序列之間的序列比較及一致性百分比確定 可使用可輕易獲得之軟體實現。供線上使用及供下載及用 於比對蛋白質與核苷酸序列的適合軟體程式可自各種來源 26 201231066 獲得。一種適合程式為可獲自www.clustal.org，或者例如 可獲自歐洲生物資訊研究所（European Bioinformatics Institute ) ( www.ebi.ac.uk)(其亦提供各種其他蛋白質及 核苷酸資訊學工具）之Clustalw(Th〇mps〇n等人，（1994) Nucleic Acids Res. 1 1 ;22(22):4673-80 )。 當在本文中提及特定抗egfr抗體（例如稱作992、 1024、1030、1254及1277之抗體）時，此等抗體編號一般 指WO 2008/104183中所述之抗EGFR抗體。 當在本文中提及特定抗HER2抗體（例如稱作4382、 4384、4385及4518之抗體）時，此等抗體編號一般指w〇 2 01 1/107957 A1中所述之抗HER2抗體。 當在本文中提及特定抗HER3抗體（例如稱作4785、 5038、5082及5096之抗體）時’此等抗體編號一般指具有 序列表巾提供之DNA及胺基酸序列之抗MR3抗體。 抗體混合物 杜-個具體實例中，本發明係關於_種重組抗體組成 :二即-種組成物’纟中至少一種不同抗舰抗體分子 :^—祖家族受體之抗原且至少一種不同抗酿抗體 :i 口合第。臟家族受體之抗原。在—較佳具體實例 發明係關於一種重組抗體組成物，亦即一種組成物， 種不同抗舰抗體分子結合第—刪家族受體 几^至少-種不同抗咖抗體分子結合第：酿家族 且至少—種不同抗HER抗體分子結合第三 夫又體之抗原。在另一較佳具體實例中，抗體組成 27 201231066 物包含至少一種能夠結合第一 HER家族受體之抗原的不同 抗HER抗體分子，及至少兩種能夠結合第二HER家族受體 之抗原的不同抗HER抗體分子。在另一較佳具體實例中， 抗體組成物包含至少兩種能夠結合第一 HER家族受體之抗 原的不同抗HER抗體分子，及至少兩種能夠結合第二HER 家族受體之抗原的不同抗HER抗體分子。在另一較佳具體 實例中，抗體組成物包含至少一種能夠結合第一 HER家族 受體之抗原的不同抗HER抗體分子、至少一種能夠結合第 二HER家族受體之抗原的不同抗HER抗體分子，及至少兩 種結合第三HER家族受體之抗原的不同抗HER抗體分子。 在另一較佳具體實例中，抗體組成物包含至少一種能夠結 合第一 HER家族受體之抗原的不同抗HER抗體分子、至少 兩種能夠結合第二HER家族受體之抗原的不同抗HER抗體 分子，及至少兩種結合第三HER家族受體之抗原的不同抗 HER抗體分子。在又一較佳具體實例中，抗體組成物包含 至少兩種能夠結合第一 HER家族受體之抗原的不同抗HER 抗體分子、至少兩種能夠結合第二HER家族受體之抗原的 不同抗HER抗體分子，及至少兩種能夠結合第三HER家族 受體之抗原的不同抗HER抗體分子。 第一及第二HER家族受體較佳分別為EGFR及HER2、 HER2 及 EGFR、EGFR 及 HER3、HER3 及 EGFR、HER2 及 HER3、HER3及HER2。在抗體分子結合HER家族之三種 不同受體之具體實例中，第一、第二及第三HER家族受體 較佳分別為EGFR及HER2及HER3、EGFR及HER3及 28 201231066 « HER2、HER2 及 EGFR 及 HER3、HER2 及 HER3 及 EGFR、 HER3 及 EGFR 及 HER2、HER3 及 HER2 及 EGFR。 不同抗HER抗體結合受體上之不重疊抗原決定基。 抗體之不重疊性質較佳在用表現HER之細胞進行之 FACS分析中使用經不同標記之抗體或藉由使用表面電漿 子共振使用捕捉或結合於流動細胞表面之HER抗原來測 定。由於結合不重疊抗原決定基之組成物相較於把向一或 兩個抗原決定基之單株抗體的組成物可能不太易受HER構 形差異影響且不太易受突變影響，因此可將結合不重疊抗 原決定基之組成物用於更廣泛之HER依賴性癌症類型。此 外，相較於向較少抗原決定基之組成物，結合不重疊抗 原決定基之抗體組成物可提供優良功效。特定言之，抗體 組成物可在活體内提供針對癌細胞活體内隊中分化之優良 功效。 儘管本發明之抗體組成物中較佳包括至少兩種結合第 一 HER家族受體之抗原的不同抗HER抗體分子及至少兩種 結合第二HER家族受體之抗原的不同抗HER抗體分子，但 能夠結合HER家族之至少三種不同受體的抗體組成物更 佳。下文更詳細描述此等較佳組成物以及關於如何設計本 發明之抗體組成物之指導原則。 組成物之抗體可為具有非人類可變鏈及人類恆定鏈之 嵌合抗體。非人類可變鏈可來自小鼠、大鼠、綿羊、豬、 雞、非人類靈長類動物或其他適合動物。為獲得完全人類 抗體，可在具有人類抗體基因之轉殖基因動物中產生該等 29 201231066 抗體。抗體亦可為如上文所述之人類化抗體，其中非人類 CDR序列已移植至人類構架序列中。 人類恆定鏈較佳為IgGl或IgG2同型。組成物中之所 有抗體更佳具有相同同型以便於製造。然而，在一些情況 下可能有利的是，組成物中包括具有不同同型之抗體。 本發明之抗體組成物較佳包含能夠結合選自由以下組 成之群的HER家族受體之抗體：人類EGFR、HER2及 HER3、突變型人類EGFR、HER2及HER3，及人類EGFR、 HER2及HER3之缺失變異體。抗體較佳能夠結合人類與非 人類靈長類動物EGFR、HER2及/或HER3，以使其可在臨 床實驗之前於相關毒物學研究中進行測試。非人類靈長類 動物較佳為食蟹狼（cynomolgus monkey )(長尾猴（Macaca fascicularis) ) 〇 利用癌細胞系A43 INS及MCF7獲得之結果（實施例3 ) 已顯示抗EGFR混合物與抗HER3或抗HER2混合物之組合 引起對癌細胞生長之抑制協同增強且針對所有三種受體之 混合物的組合優於個別混合物且優於針對兩種受體之混合 物的組合。 將針對所有三種受體之混合物的組合與市售單株抗體 西妥昔單抗（抗EGFR)及曲妥珠單抗（抗HER2 )及此兩 種抗體之混合物相比較。結果顯示在不同細胞系中，針對 三種受體EGFR、HER2及HER3之抗體混合物之組合優於 西妥昔單抗與曲妥珠單抗兩者且亦優於此兩種抗體之混合 物。 30 201231066 « . 總而言之，結果已顯示藉由組合針對各受體之抗體的 混合物來獲得對一種以上HER家族受體之最佳靶向，且靶 向三種受體優於乾向兩種受體。 用細胞系 MCF7、HCC202、BT474、NCI-N87、 MDA-MB-175、A431NS、HN5、H292、DU145 及 MDA-MB-468 獲得之結果（實施例4 )亦已顯示抗EGFR混合物與抗HER2 混合物之組合抑制所有所測試之細胞系。靶向此等受體中 之僅一者使得依賴於該特定受體之細胞系受到抑制。總而 言之，此等結果顯示針對EGFR及HER2之抗體之混合物之 組合得到寬得多的抑制特徵且因此可最終用以治療腫瘤依 賴於任一受體之患者。 西方墨點法（Western Blot)研究之結果（實施例5及 7 )顯示針對單一受體（EGFR、HER2及HER3 )之抗體混 合物誘導其各別目標降解且針對各目標之抗體混合物之組 合能夠誘導所有三種受體同時有效降解。 用癌細胞系 A431NS、H358、HC202、0E19 及 H820 獲 得之結果（實施例6)顯示儘管抗體混合物及個別抗體之作 用在不同細胞系之間變化，但含有針對三種受體EGFR、 HER2及HER3中每一者之抗體的抗體混合物一般有效抑制 細胞生長及增殖。含有六種抗體（亦即兩種抗體針對三種 受體中每一者）之混合物一般在不同細胞系中最有效。 實施例8之結果顯示儘管抗體混合物及個別抗體之作 用在不同細胞系之間變化，但包含三、四或六種針對三種 受體EGFR、HER2及HER3之抗體的抗體混合物一般對於 31 201231066 抑制癌細胞生長及增殖極其有效。 實施例9之結果證明藉由組合針對各受體之抗體混合 物可獲得對HER家族中一種以上受體之最佳靶向，靶向三 種受體優於靶向兩種受體，且利用抗體混合物靶向各受體 優於利用單一抗體靶向各受體。 最終，活體内功效實驗之結果（實施例10 )顯示，相 較於用針對個別目標EGFR、HER2及HER3之單株抗體及 抗體混合物，或針對EGFR+HER2或HER2 + HER3之單株抗 體及抗體混合物之組合靶向腫瘤，用針對EGFR+HER3或 EGFR+HER2 + HER3 之抗體或抗體混合物之組合治療 A43 1NS腫瘤異種移植物更有效。 由此等實驗顯而易知，本發明之發明者所提供的抗體 之組合針對極寬範圍之癌細胞系均顯示功效。 在一較佳具體實例中，本發明之抗體組成物包含至少 兩種選自由以下組成之群的不同抗EGFR抗體分子：能夠抑 制具有以下抗體之CDR之抗體的結合及/或與具有以下抗 體之CDR之抗體結合相同抗原決定基的抗體：992、1024、 1030 、 1254 、 1277 及 1565 ° 在另一較佳具體實例中，抗體組成物包含至少兩種選 自由具有以下抗體之CDR的抗體組成之組合之群的不同抗 EGFR 抗體分子：992 + 1030、992 + 1024、1024+1030、 1030+1254、 1030+1277、 1030+1565、 1254+1277、 1254+1565 及1277+1 5 65。在一特定具體實例中，抗EGFR抗體具有抗 體 1277+1565 或 1254+1565 之 CDR。 32 201231066 . 在另一較佳具體實例中，抗體組成物包含至少兩種選 自由以下組成之群的不同抗HER2抗體分子：能夠抑制具有 以下抗體之CDR之抗體的結合及/或與具有以下抗體之 CDR之抗體結合相同抗原決定基的抗體：4382、4384、 4385 、 4517 及 4518 ° 在另一較佳具體實例中，抗體組成物包含至少兩種選 自由具有以下抗體之CDR的抗體組成之組合之群的不同抗 HER2 抗體分子：4382 + 4384、43 82 + 43 8 5、43 82+45 1 7、 43 82+4.5 1 8，. 43 84 + 43 85、43 84+45 17、43 84+45 18、45 17 + 45 18 及43 8 5 + 45 1 8。在一特定具體實例中，抗HER2抗體具有抗 體 4384 + 45 17 或 4385 + 45 18 之 CDR。 在另一較佳具體實例中，抗體組成物包含至少兩種選 自由以下組成之群的不同抗HER3抗體分子：能夠抑制具有 以下抗體之CDR之抗體的結合及/或與具有以下抗體之 CDR之抗體結合相同抗原決定基的抗體：4785、503 8、5082 及 5096 。 在另一·較佳具體實例中，抗體組成物包含至少兩種選 自由具有以下抗體之CDR的抗體組成之組合之群的不同抗 HER3 抗體分子：4785 + 5038、4785 + 5082、4785 + 5096、 5038 + 5082、5038 + 5096 及 5082 + 5096。在一特定具體實例 中，抗HER3抗體具有抗體5038 + 5082之CDR。 在另一較佳具體實例中，抗體組成物選自由具有以下 抗體之 CDR 的抗體組成之組合之群 ： 992+1024+4785+5082 、 992+1024+4382+4385+4518 、 33 201231066 992+1024+4382+4385+4518+4785+5082 、 4382+4385+4518+4785+5082 、 1565+4517+5082 、 1277+4517+5082 、 1277+4384+5038 、 1277+4384+5082 、 1277+1565+5038+5082 、 1277+1565+4384+4517 、 4384+4517+5038+5082 、 1277+4384+4517+5082 、 1277+4384+4517+5038 > 1277+1565+4384+4517+5038+5082 及 1277+1565+4385+4518+5038+5082。 本發明之一較佳具體實例包括一種重組抗體組成物， 其包含如所定義之抗體分子，其中重鏈可變區序列及輕鏈 可變區序列各自與任一此等抗體之重鏈可變區及輕鏈可變 區序列分別具有至少90%序列一致性，較佳至少95❶/❶序列 一致性’諸如至少96%、至少97%、至少98%或至少99% 序列一致性，且其與該抗體競爭結合。 在一特定具體實例中’本發明之抗體組成物包含至少 一種具有來自1254、1277或1565之CDR或能夠抑制1254、 1277或1565之結合及/或與1254、1277或1565結合相同 抗原決定基的抗EGFR抗體；至少一種具有來自4384、 4385、4517 或 4518 之 CDR 或能夠抑制 4384、4385、4517 或45 18之結合及/或與4384、4385、45 17或45 18結合相同 抗原决疋基的抗HER2抗體；及至少一種具有來自5038或 50 82之CDR或能夠抑制5038或5〇82之結合及/或與5038 或5 082結合相同抗原決定基的抗her3抗體。 在一較佳具體實例中’抗體組成物包含兩種針對 EGFR、HER2及HER3各自之抗體，其中抗EGFR抗體具有 34 201231066 * • 來自1277 + 1565或1254+1565之CDR，或能夠抑制 1277 + 1565 或 1254+1565 之結合及/或與 1277+1565 或 1254 + 1 5 65結合相同抗原決定基；抗HER2抗體具有來自 4384 + 4517 或 4385 + 45 1 8 之 CDR，或能夠抑制 4384+4517 或4385+45 18之結合及/或與4384+45 17或4385 + 45 18結合 相同抗原決定基；且抗HER3抗體具有來自5038 + 5082之 CDR，或此夠抑制5038 + 5082之結合及/或與5038 + 5082結 合相同抗原決定基。 在另一較佳具體實例中，抗體組成物包含具有抗體 1277+1565 + 43 84+4517 + 5038 + 5082 之 CDR 的抗體，或能夠 抑制該等抗體之結合及/或與該等抗體結合相同抗原決定基 的抗體。 在另一較佳具體實例中，抗體組成物包含具有抗體 1277+1565-卜4385+4518 + 5038 + 5〇82 之 CDR 的抗體，或能夠 抑制该等抗體之結合及/或與該等抗體結合相同抗原決定基 的抗體。 下表1展示如隨附序列表中所述之抗體992、1〇24、 1030、【254、1277、1565、4382、4384 ' 4385、4517 4518、 4785、5038、5082及5096之重鏈可變區（VH)及輕鍵（⑹ 之DNA及胺基酸序列的序列ID編號。 35 201231066 表1 :所選抗HER抗體之重鏈可變區及輕鏈之DNA及胺基 酸序列的序列1D編號 抗體編號 VHDNA序列 VH蛋白質序列 LCDNA序列 LC蛋白質序列 992 1 2 3 4 1024 5 6 7 8 1030 9 10 11 12 1254 13 14 15 16 1277 17 18 19 20 1565 21 22 23 24 4382 25 26 27 28 4384 29 30 31 32 4385 33 34 35 36 4517 37 38 39 40 4518 41 42 43 44 4785 45 46 47 48 5038 49 50 51 52 5082 53 54 55 56 5096 57 58 59 60 下表2及表3展示本發明之各種抗HER抗體的重鏈（表 2)及輕鏈（表3)之CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列。 此等抗體之重鏈可變區及輕鏈（包括輕鏈可變區）之胺基 酸序列以及編碼DNA序列（經最佳化以供在CHO細胞中 表現）提供於隨附序列表中。關於此等序列之SEQ ID編號 之概述請參看上表1。 36 201231066 表2 :所選M HER抗體之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列 抗體 編號 H CDR1 HCDR2 HCDR3 SEQ IN NO (CDR1/2/3) 992 GYTFTSYW IYPGSRST CTRNGDYYVSSGDAMDYW 61-63 1024 GYTFTSHW INPSSGRN CVRYYGYDEAMDYW 64-66 1030 GFTFSSYA ISGVGST CARGSDGYFYAMDYW 67-69 1254 GFAYSTYD ISSGGDAA CARSRYGNYGDAMDYW 70-72 1277 GFAFSYSD MSSAGDVT CVRHRDVAMDYW 73-75 1565 GYTFTSYW INPSNGGT CARDGGLYDGYYFDFW 76-78 4382 GYTFTDYY INPNNGGT CVPGGLRSYFDYW 79-81 4384 GYTFTSHW INPSNGGT CARAYYDFSWFVYW 82-84 4385 GYTFTGYW ILPGSGST ARWGDGSFAY 85-87 4517 GFTFSSYG ISGGGSYT CARKGNYGNYGKLAYW 88-90 4518 GFNIKDIF IDPANDNP CAGGPAYFDYW 91-93 4785 GYSFTSYY 1YPGSGHT CARPPYYSNYADVW 94-96 5038 GYSITSGFY ISYDGSN CARGGGYYGNLFDYW 97-99 5082 GYSITSAYY IGYDGRN CSREGDYGYSDYW 100-102 5096 GYTFTSYL INPYNDGA CAREGDYVRYYGMDYW 103-105 表3 :所選抗HER抗體之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列 抗體編號 L CDR1 LCDR2 LCDR3 SEQ ID NO (CDR1/2/3) 992 QDIGNY YTS CQHYNTVPPTF 106-108 1024 KSLLHSNGITY QMS CAQNLELPYTF 109-111 1030 KSVSTSGYSF LAS CQHSREFPLTF 112-114 1254 QSLVHSNGNTY KVS CSONTHVYTF 115-117 1277 QSLVHSNGNTY KVS CSQSTHVPTF 118-120 1565 QDVDTA WAS CQQYSSYPLTF 121-123 4382 QDVSAA WAS COQHYTTPPTF 124-126 4384 QDISNY YIS CQOGNTLPLTF 127-129 4385 QNVGTA STS COQYRSYPFTF 130-132 4517 ENIYSN AAT CQHFWGTPWTF 133-135 4518 QDVIAA WAS CQOHYSTPWTF 136-138 4785 QSLLNSGNQKNY WAS CQSDYSYPYTF 139-141 5038 QDISNY HTS CQOGITLPWTF 142-144 5082 QDINNY YTS CQQSETLPWTF 145-147 5096 QSVLYISNERNY WAS CHQHLSSYTF 148-150 此外·為能夠在非人類靈長類動物_進行毒物學研 究，組成物中之所有抗體較佳均結合人類以及至少一種其 他靈長類動物ErbB家族受體，諸如黑猩獲（chimpanzee ) 37 201231066 (黑猩猩（p一。g/咖））、恆河猴（Rhesus_key) (怪河獼狼（Μπ⑽則/心））、食蟹猴（長尾猴）或其 他狼子之ErbB。食蟹猴為相對較小之動物且極適用於毒物 學研究。因此’其他靈長類動物ErbB家族受體較佳為食蟹 猴ErbB。杬體較佳以大致相同之親和力結合人類及非人類 靈長類動物ErbB » 組成物之抗體的另一較佳特徵為蛋白質均質性，以使 抗體可輕易純化。對於個別抗體成員，具有一個不同峰之 離子交換層析曲線對於便於特性化而言較佳。清晰離子交 換層析曲線對於便於特性化最終抗體組成物而言亦較佳。 當組合可使用離子交換層析對其進行區分之抗體時亦較 佳’以使具有所有抗體之組成物可在一次操作中特性化。 抗體可具有任何來源，諸如人類、鼠類、兔、雞、豬、 駱馬（lama )、綿羊及路駝。使用此項技術中所述之熟知方 法，抗體亦可為如實例中所述之嵌合抗體或可為其人類 化、超人類化或再成形型式。 抗體可在一個容器中調配以供投予。然而，其可個別 地製造、純化及特性化且在作為分裝部分之套組的分開之 容器中提供’各容器中具有一種抗體。因此其可同時、依 序或分開投予。 本發明之另一態樣係關於核酸分子，該等核酸分子包 含編碼本發明抗體之核苷酸序列，該本發明抗體亦即為選 自由以下組成之群的抗體：抗體992、1024、1 030、1254、 1277、1565、43 82、43 84、43 85、4517、4518、4785、5038、 38 201231066 « 5082及5096 ’或其人類化變異體；或編碼此種抗體之重鏈 及/或輕鏈可變區序列’或與參考序列具有至少9〇%或95% 序列一致性’諸如與此種重鏈及/或輕鏈可變區序列具有至 少96%、97%、98%或99%序列一致性之重鏈及/或輕鏈序列 的核苷酸序列。 本發明之另一態樣係關於一種表現载體，其包含如上 文所定義之核酸分子。如上所述，本發明上下文_所用之 表現載體可為此項技術中已知之任何適合類型，例如質體 或病毒載體。 本發明之又一態樣係關於一種包含如上文所定義之核 酸分子的宿主細胞’其中該宿主細胞能夠表現由該核酸分 子編碼之抗體。 製造本發明之抗體及抗體組成物 本發明之另一態樣係關於製造靶向表皮生長因子受體 (HER)家族之重組抗體的方法，及包含本發明抗體之組成 物。本發明之此態樣的一個具體實例係關於一種製造如本 文所定義之抗體的方法，其包含提供能夠表現抗體之如上 文所定義之宿主細胞、在適於表現該抗體之條件下培養节 宿主細胞，及分離所產生之抗體。 在另一具體實例中’本發明係關於製造包含如本文所 述之重組抗HER抗體之重組抗體組成物的方法，該方法包 含提供許多細胞（其中各細胞能夠表現重組抗heR抗體）、 在適於表現組成物之抗體的條件下培養細胞，及分離所產 生之抗體。 39 201231066 本發明之抗體或抗體組成物可藉由此項技術中一般已 知用於製造重組單株或多株抗體之方法來製造。因此，在 製造本發明之單-抗體的情況下，可使用此項技術中已知 用於製造重組單株抗體之任何方法。為製造本發明之抗體 組成物’個別抗體可分別製造，Φ即各抗體在分開之生物 反應器中製造，或個別抗體可在單—生物反應器中一起製 造。若抗體組成物在一個以上生物反應器中製造，則純化 之抗HER抗體組成物可藉由彙集自各生物反應器之個別純 化之上清液獲得的抗體來獲得。在多個生物反應器中製造 多株抗體組成物之各種方法（其中細胞系或抗體製劑在上 游較後點或在下游處理之前或期間組合）描述於w〇 2009/129814中（以引用的方式併入）。 在於單一生物反應器中製造個別抗體之情況下，此舉 可例如如WO 2004/061 104或WO 2008/145133 (其兩者均 以引用的方式併入本文中）中所述來進行。w〇 2〇〇4/〇61 1〇4 中所述之方法基於將抗體編碼序列位點特異性整合至個別 宿主細胞之基因組中，從而確保在製造期間Vh與蛋白 質鏈維持其原始配對。此外’位點特異性整合使位置影響 減至最小’且因此預期多株細胞系中個別細胞之生長及表 現性質極為類似。一般而言，該方法涉及以下：i )具有一 或多個重組酶識別位點之宿主細胞；ϋ )具有至少一個與宿 主細胞重組酶識別位點相容之重組酶識別位點的表現載 體；iii )如下產生表現載體集合：將所選VH與VL編碼對 自篩選載體轉移至表現載體，以使得全長抗體或抗體片段 40 201231066 可自載驵表現（若篩選載體與表現載體相同，則可不必需 έ種轉移）’ 1V)用表現载體與編碼能夠組合宿主細胞基 ^組中之重組酶識別位點與載體中之重組酶識別位點的ί :之集σ轉染宿主細胞；ν)自轉染之宿主細胞獲得/產生多 系及V1)自多株細胞系表現及收集抗體組成物。 〇 2〇〇8/145133描述在單一生物反應器中製造抗體之 替代性方法。此方法涉及如下產生能夠表現包含兩種或兩 種以上不曰同成員之多株抗體或其他多株蛋白質的多株細胞 系a)提供一組表現載體，纟中該等載體各自包含至少一 個’.扁碼夕株蛋白質之不同成員之不同核酸的複本，在避免 表載肢位點特異性整合至細胞基因組中之條件下用各表 現載體分別轉染宿主細月包，由此獲得兩種或兩種以上細胞 :成物各組成物表現多株蛋白質之-個不同成員，及c ) 犯合至少兩種細胞組成物以獲得多株細胞系。 2刚/061 104 A w〇 2〇〇8/145 133之方法均具有以下優勢： 允《午構成重組多株^體之所有成員在單—生物反應器中製 泣且在單過程中純化，由此避免對於各抗體而言各別製 造及純化過程的需要，@同時使不同抗體之產生驚人地均 一。W〇2_/145 133之方法具有如下其他優勢：因各生產 細胞可攜帶編糾定抗體之聚核㈣的多個複本而提供提 高之產率。 本發明之抗體可在各種類型之細胞（包括哺乳動物細 胞以及非哺乳動物真核或原核細胞，諸如植物細胞、昆蟲 細胞、酵母細胞、真菌、大腸桿菌（£ c〇/〇等）中產生。 41 201231066 然而，抗體較佳在以下中產生：哺乳動物細胞，例如CHO 細胞、COS細胞、BHK細胞、骨髓瘤細胞（例如Sp2/0或 NS0細胞）、纖維母細胞（諸如NIH 3T3 )，或不朽化人類 細胞，諸如海拉細胞（HeLa cell )、HEK 293細胞或PER.C6 細胞。 在此項技術中熟知將核酸序列轉染至宿主細胞中之方 法（參看例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第3版，2001 )。對於例如如w〇 2004/061 104中所述之位 點特異性整合’適合宿主細胞在其基因組中包含一或多個 重組識別位點。在此情況下，適合表現載體包含匹配宿 主細胞之重組酶識別位點的重組識別位點。關於例如使用 位點特異性整合方法自篩選載體轉移所選VH與VL編碼對 之其他詳情可見於WO 2 0 04/00104中。 本發明之重組抗體組成物可在單一生物反應器中藉由 在適當培養基中培養來自多株工作細胞庫（P〇iyci〇nal working ceU bank ; pWCB )之一個安瓿一段時間以允許表 現足量抗體，同時維持由多株細胞系表現之個別抗體的相 對表現量實質上均一來製造。❸15日與5〇日之間的製造 時間通常為適合的。可使用此項技術中已知之培養方法， 諸如刀批進料或灌注培養。培養基較佳為無血清培養基， 更佳為無血π且無蛋白質之培養基，例如化學合成培養 基。此等培養基典型地設計用於培翻於製造之特定細胞 類型，且眾多適合培養基調配物可購得。 42 201231066 參 • 重組抗體組成物獲自培養基且藉由習知純化技術純 匕等技術可包括例如親和層析與諸如以下之後續純化 步驟，，且二.離子交換層析、疏水性相互作用層析及凝勝過 慮此等屯化技術亦頻繁用於純化重組抗體。當在單一生 物反應器中利用多株細胞系產生兩種或兩種以上抗體時， 典型地在例如藉由離子交換層析純化之後評估多株抗體組 成物中所有個別成員的存在。可例如如w〇 2〇〇6/〇〇7853及 WO 2009/065414 (以引用的方式併入本文中）中所述對多 株抗體組成物進行特性化。 治療性組成物 本發明之另一態樣為一種醫藥組成物，其包含本發明 之抗體組成物，或重組Fab或另一重組抗體片段組成物作 為活性成分。此等組成物意欲改善、預防及/或治療癌症。 醫藥組成物可投予人類或家畜或寵物，但典型地將投予人 類。 本發明之治療組成物中個別抗體之間的比率，或在本 發明之個別抗體同時、依序或分開投予之情況下，將通常 使得抗體可以等量投予，但不一定需要如此。因此，包含 兩種抗HER抗體之本發明組成物將通常含有η丨比率的該 等抗體’且包含三種抗HER抗體之組成物將通常含有1: j, j 比率的該等抗體。然而，視個別抗體之特徵而定，可能需 要使用不等量之不同抗體。適用於本發明組成物中之不同 抗HER2抗體的比率可如WO 2010/040356 (以引用的方式 併入本文中）中所述來確定，該文獻描述鑑別及選擇組合 43 201231066 藥品（例如多株抗體組成物） 算量比率以獲得且有^化予實體間的最佳化學計 筏侍具有最纽能及功 除本發明之抗體組成物或D樂物的方法。 -步包含至少一種醫藥學上:接藥組成物將進 劑》此等藥劑可例如包括防腐齊卜 载劑=形 =!r、增溶劑、調節滲透壓… 強物f，諸如”基纖維 uif: 聚乙缔…酮或明膠。 適用於醫朱、.且成物之PH值一般處於約55至85， …範圍内’例如為約7’適當時藉由使用緩衝劑來維持。 可私用習知醫藥實踐來提供適於投予例如癌症患者之 調配物或組成物。投藥典型地為治療性投藥，意謂其在已 診斷出癌症病狀後投予。可採用任何適當投藥途徑，例如 非經腸、靜脈内、動脈内、皮下、肌肉内、腹膜内、鼻内、 氣霧劑、栓劑或經口投予。本發明之醫藥組成物典型地以 液體溶液或懸浮液之形式，更典型地以水性溶液或懸浮 液’尤其等張水性溶液或懸浮液之形式投予。 本發明之醫藥組成物以本身已知之方式製備，例如藉 助於習知溶解、凍乾、混合、成粒或調製（c〇nfecti〇ning) 方法來製備。醫藥組成物可根據習知醫藥實踐來調配（參 看例如 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (第 21 版），A.R_ Gennaro 編，2005，Lippincott Williams &

Wilkins, Philadelphia，PA，USA ;及 Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, J. Swarbrick 編，第 3 版，2006, 44 201231066

Informa Healthcare, New York, NY, USA) ° 作為液體調配物之替代物，本發明之組成物可製備成 康乾形式，其包含單獨至少—種抗體或連同載劑，例如甘 露糖醇，在該情況下，在使用前用諸如無菌水之液體復原 組成物。 、 醫藥組成物包含約1%至約95%，較佳約2〇%至約9〇% 活性成分。本發明之醫藥組成物可製造為例如單位劑型，° 諸如安瓶、小瓶、栓劑、鍵劑或膠囊形式。調配物可以治 療或預防有效量（例如預防、消除或減少病理學病狀之量） =予人類個體以提供用於癌症疾病或其他病狀之療法。所 投予治療劑之較佳劑量可能取決於以下變數：諸如癌症嚴 重程度、特定患者之總體健康狀況、化合物賦形劑：調配 物及其投藥途徑。 本發明之抗體組成物之治療用途 本發明之醫藥組成物可用於治療或改善哺乳動物之疾 j ’特定言之；台療人類之癌症。本發明之—個具體實例為 :種預防、治療或改善人類或其他哺乳動物之與癌症相關 或夕種症狀的方法，JL句令南兮者；*丨知 ”匕3向5亥哺礼動物投予有效量 <本發明之醫藥抗體組成物。 …體貫例係關於一種治療患有特徵在於任何 汉家族成員之過表現或依賴性的病症（料言之為癌症: 類患者的方法，該方法包含向該宰者 缸予如本文所定 我之重組抗體組成物。 在另—具體實例中，本發明你關於一接v \月係關於種治療對用抗體 45 201231066 及/或TKI治療具有後天抗性之人類或其他哺乳動物之癌症 的方法，該方法包含向該哺乳動物投予有效量之如本文所 定義之抗體組成物。 基於許多因素，以下腫瘤類型尤其可指定以本發明之 抗體組成物治療：乳癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、 月1J列腺癌 '膀胱癌、膜腺癌、黑色素瘤、頭頸癌及非小細 胞肺癌。預期本發明之抗體組成物尤其適用於治療過表現 EGFR或HER2之癌症，例如某些上皮癌，諸如許多乳癌、 卵巢癌及胃（gastric ; stomach )癌。 ^關於此等適應症中之每一者，涵蓋兩種主要臨床路 徑，亦即1)與至少-種其他；台療性處理結合之輔助療法， 或）作為早一療法。下文簡要論述此兩種選擇。 1 )輔助療法：在辅助療法（亦稱為組合療法）中，將 =本發明之抗體肖至少一種其他治療性處王里（典㉟地為化 學治療劑或抗贅生劑及/或輻射療法）組合來治療患者。或 者或另外’本發明之組成物亦可與不同抗癌抗體（例如乾 向VEGF之抗體）組合使用。以上所列之原發性癌症目^ 因此可藉由除標準第一線及第二線療法以外 " .. 』4又丁本發明 炙抗祖或組成物來治療。方案設計將針對有效性如生 例如腫瘤質量降低以及減少標準化學療法之常用劑旦=由 ::評估。此等劑量減少可因降低化學治療劑之劑 生’性而允許其他及/或延長之療法。 關 藉由將本發明之抗體組成物與已知誘導癌細 分化之毕劑細人 -T、佐 jk . * 、.匕之終末 夂枭萬丨組合，可進一步改良效果。此 寸。物可例如 46 201231066 φ • 選自由以下組成之群：視黃酸、反式視黃酸、順式視黃酸、 苯基丁酸鹽、神經生長因子、二甲亞碾、活性形式維生素 D3、過氧化體增殖物活化受體γ、12_〇_十四醯基佛波醇 乙酸酯、六亞甲基-雙乙醯胺、轉型生長因子·冷、丁酸、環 狀AMP及維司力農（vesnarin〇ne )。化合物較佳選自由以 下組成之群：視黃酸、苯基丁酸鹽、全反式視黃酸及活性 形式維生素D。 包含本發明抗體組成物及至少一種化學治療性或抗贅 生性化合物之醫藥製品可以組合治療形式使用以便在癌症 療法中同時、分開或連續投予。化學治療性化合物可為適 於治療所討論之特定癌症的任何化學治療劑，例如為選自 由以下組成之群的藥劑：烷基化劑，例如鉑衍生物，諸如 順鉑（cisplatin )、卡鉑（carbopUtin )及/或奧赛力鉑 (oxaliplatin );植物生物鹼，例如太平洋紫杉醇 (paclitaxel )、多西他赛（d〇cetaxel )及/或伊立替康 (irinotecan);抗腫瘤抗生素，例如小紅莓（d〇x〇rubicin) (阿德力黴素（adriamycin ))、道諾黴素（d_〇rubicin )、 表柔比星（epirubicin )、伊達比星米托蒽醌（idarubicin mitoxantrone )、更生徽素（dactinomyCin )、博萊黴素 (bleomycin )、放線菌素（actinomycin )、藤黃黴素 (luteomycin)及/或絲裂黴素（mit〇myCin);拓撲異構酶 抑制劑，諸如拓朴替康（top〇tecan);及/或抗代謝物，例 如氟尿嘧啶及/或其他氟嘧咬。 亦預期本發明之抗體組成物可與酪胺酸激酶抑制劑 201231066 (ΤΚΙ )結合用於輔助療法中。此等酪胺酸激酶抑制劑為主 要衍生自喹》坐啭之合成低分子量分子，其與受體之細胞内 酪胺酸激酶域相互作用且藉由競爭細胞内Mg-ATP結合位 點來抑制配體誘導之受體磷酸化。若干阻斷HER2激酶之路 胺酸激酶抑制劑目前處於臨床研發中。其中一些亦把向 EGFR或其他EGFR家族受體。關於此等TKI之回顧，請參 看 Spector 等人，（2007) Cancer /^.9(2): 205。包含 本發明抗體組成物及至少一種靶向HER2之TKI的醫藥製 品因此亦以組合治療形式使用以便在癌症療法中同時分 開或連續投予。 在其他具體實例中，本發明之抗體組成物可與其他抗 體治療劑組合使用。此等抗體治療劑之實例包括例如針對 EGFR ( Erbitux® 或 Vectibix®)或 VEGF ( Avastin® )之抗 體。在其他具體實例中，本發明之抗體組成物可與已知刺 激免疫系統之細胞的藥劑組合使用，此組合治療會增強免 疫介導之本發明抗體組成物之功效增強。此等免疫刺激劑 之實例包括重組介白素（例如IL-21及IL-2 )。 2 )單一療法：與本發明之抗if組成物在腫瘤單一療法 中之用途有關，抗體組成物可在未並行使用化學治療劑或 抗贅生劑之情況下投予患者，亦即作為獨立療法。 免疫結合物 本發明組成物之治療用途的另一選擇呈免疫結合物形 式，亦即抗體結合於一或多種抗癌劑。特定言之在本發明 組成物結合不同抗原決定基的情況下，預期此舉可在細胞 48 201231066 參 . 表面上產生交聯抗體·受體晶格，由此可能使得受體内化程 度與使用單一單株抗體相比較高。此種組成物之一或多種 個別抗體結合於一或多種抗癌劑因此具有將結合之抗癌劑 特異性且有效地傳遞至腫瘤細胞内部之潛能，由此增強本 發明抗體組成物之作用以提供改良之腫瘤細胞殺滅活性。 各種類型之抗癌劑可結合於本發明之抗體，包括細胞 毒性劑（包括習知化學治療劑及其他小分子抗癌藥物）、 細胞激素（在該情況下，結合物可稱作「免疫細胞激素」）、 毒素（在該情況下，結合物可稱作「免疫毒素」）及放射 性核種’且數種免疫結合物已獲准用於臨床使用。此等免 疫結合物包括Zevalin® (—種結合於9<)γ之鼠類抗CD20 t 體）、Bexxar® (—種結合於1311之鼠類抗CD2〇抗體）及 Myiotarg® ( —種結合於刺孢黴素（calicheamicin)之人類 化抗CD33抗體）。已在臨床試驗中測試之其他免疫結合物 包括結合於例如小紅莓或類美登素（maytansin〇id )化合物 之抗體。已在臨床試驗中測試之免疫毒素包括若干結合於 截短假單胞菌（)外毒素a的抗體。亦已測試 包含人類化EpCAM抗體結合於IL_2之免疫細胞激素。 在本發明抗體結合於細胞毒性劑之情況下，其可例如 屬於任何主要化學治療藥物類別，包括烷基化劑（例如卡 鉑、順鉑、奥賽力鉑）、抗代謝物（例如曱胺喋呤 (methotrexate)、卡培他濱（capecitabine)、吉西他濱 (gemcitabine ))、蒽環黴素（例如博萊黴素（bu〇mycin )、 小紅每、絲裂黴素-C )及植物生物鹼（例如紫杉燒 49 201231066 (taxanes )，諸如多西他赛及太平洋紫杉醇，及長春花生 物驗’遠如長春驗（vinblastine)、長春新驗（vincristine) 及長春瑞濱（vinorelbine ))。因為使用免疫結合物會將抗 癌劑特異性引導至腫瘤’且特定言之在内化後引導至腫瘤 細胞内部’所以基於本發明抗體之免疫結合物可有利地基 於高度細胞毒性劑’諸如刺孢黴素或美登素（maytansine ) 衍生物’或基於毒素’諸如細菌毒素（例如假單胞菌外毒 素A、白喉毒素（diphtheria toxin ))或植物毒素（例如蓖 麻毒素（ricin))。 免疫結合物中所結合之抗癌劑一般藉助於在血清中相 對穩疋但當免疫結合物内化至目標細胞中時允許釋放藥劑 之不穩定連接子連接至抗體^適合連接子包括例如在血清 中於中性pH值下穩定但在内化後於溶酶體中之適度酸性條 件下經歷酸水解的化學連接子、由細胞内硫醇裂解之二硫 化物連接子，及在血清中穩定但在細胞内代謝區中經歷酶 促裂解的肽連接子。 在含有兩種或兩種以上本發明抗體之組成物中可設想 各種結合配置。舉例而言，在兩種抗體下，將可能使抗體 結合於兩種或兩種以上不同抗癌藥物或使一種抗體結合於 可由諸如酶之藥劑活化之前藥，該藥劑結合於另一抗體。 抗體引導之酶前藥療法（antib〇dy_directed enzyme pr〇drug therapy，ADEPT ) t 一般概念已關於單株抗體進行描述， 其中前樂由利用mAB-酶結合物靶向至腫瘤之酶活化，而本 發月可提供針對特定條件調整此方法的機會。目此可能特 50 201231066 » • 異性增強腫瘤細胞殺滅，同時避免或降低對正常組織之損 傷。 關於抗癌免疫結合物之其他資訊，請參看Wu等人， (2005) iVaiMre 23(9):1 137-1 146 ; Schrama 等 人，（2006) iVafwre Z)z_icover_y 5:147-159 ;及

Rohrer (2009) chimica oggi/Chemistry Today 27(5):56-60 0 投藥之劑量及途徑 本發明之抗體組成物將以有效量投予以便治療所討論 之病狀，亦即以達成所需結果所必需之劑量及時段投予。 治療有效量可根據以下因素而變化：諸如所治療之特定病 狀、患者之年齡、性別及體重’及抗體作為獨立治療來投 予抑或與一或多種其他抗癌治療組合投予。 用於腫瘤療法之有效量可依據其在患者中穩定疾病進 .展及/或改善症狀’及較佳逆轉疾病進展之能力，例如依據 減小腫瘤尺寸進行量測。本發明之抗體或組成物抑制癌症 之能力可藉由例如實施例中所述之試管内分析以及在預測 對人類腫瘤之功效的適合動物模型中進行評估。選擇適合 給藥方案以便在各特定情況（例如以單次快速給藥或以連 續輸注形式投予）下且在如由各病例之緊急性所指示可能 對劑量進行調整下提供最佳治療反應。 儘管本發明抗體之特定給藥尚未確定，但某些給藥考 慮因素可經由與已獲准用於治療用途之類似產品（例如針 對HER2或EGFR之單株抗體）相比較來確定。因此，預期 本發明之抗體組成物的適當劑量將類似於抗HER2翠株^ 51 201231066 體曲妥珠單抗（Herceptin®)或抗EGFR單株抗體帕尼單抗 (panitUmumab ) ( Vectibix® )之推薦劑量。視特定病狀而 定，以4 mg/kg之初始劑量及2 mg/kg之後續每週劑量，或 8 mg/kg之初始劑量及每三週6 mg/kg之後續劑量投予 Herceptin® (藉助於輸注）用於治療乳癌，而vectibjx⑧係 以每14曰6 mg/kg之劑量投予。 預期本發明之抗體組成物的適合劑量將在〇 ι·ι〇〇 mg/kg，諸如約〇.5_5〇mg/kg’例如約之範圍内。 抗體組成物可例如以以下劑量投予：至少〇 25mg/kg，例如 至少0.5 mg/kg ’諸如至少丨mg/kg，例如至少丨$， 諸如至少2mg/kg，例如至少3mg/kg，諸如至少4^^， 例如至少5 mg/kg;及例如至多5〇 mg/kg，諸如至多3〇 mg/kg’例如至多2〇mg/kg，諸如至多15叫¥通常將以 適合時間間隔（例如每週一次、每兩週一次、每三週一次 或每四週一次）重複投予，且歷時負責醫生認為適當之時 間，該醫生必要時可視情況增大或減小劑量。 ^涵蓋三種不同傳遞方法用於傳遞本發明之抗體。習知 靜脈内傳遞可能將為用於大部分腫瘤之標準傳遞技術。然 ::關於腹腔内之腫瘤，諸如印巢腫廇、膽管腫瘤、其他 管道腫瘤及其類似腫瘤’腹膜内投藥可證明有利於在廬瘤 處獲得高劑量抗體且使抗體清除率降至最低。類似地，某 些實體腫瘤具有適於區域性灌注之血管結構。區域性灌注 :允許在腫瘤部位獲得高劑量之抗體且使抗體之 率降至最低。 52 201231066 正如任何基於蛋白質或抗體輸注之治療產。；，安全性 問通主要與以τ相關：（i)細胞激素釋放症候群，亦即低 :星、發熱、顏抖、寒戰’·⑻對蛋白質產生免疫原性反 怎（亦即患者產生針對重組抗體產品之人類抗體），及（出） :表現臟家族受體之正常細胞’例如多種上皮細胞的毒 性。利用標準測試及追縱程序來監測任何此等安全性問題。 本申請案中所引用之所有專利及非專利參考文獻均以 全文引用的方式併入本文中。 將在以下非限制性實施例中進一步描述本發明。 實施例 以下實施例中所用之輕向EGFmHER2之抗體均已根 據 WO 2008/104183 A2 及 WO 2011/1〇7957 A1 (以引用的 方式併人本文t )巾所述之方法進行鑑別。在實施例中用 作對照mAb之單株抗體為Synagis (帕利珠單抗 (Palivizumab))。在所有實施例中，χ軸上之濃度均為總 抗體濃度，亦即在兩種抗體之混合物中，各個別抗體構成 總體之1/2 ;在三種抗體之混合物中，各個別抗體構成總體 之1/3，等等。 實施例1 :選殖抗HER3抗體 免疫 免疫使用三隻雌性小鼠，一隻BALB/cJ，一隻C57BL/6 小鼠及一隻C3H ( 8-10週齡）。用市售HER3蛋白（R&D Systems目錄號348-RB )免疫小鼠。對於前四次免疫，將 HER3蛋白稀釋於PBS中且與傳氏佐劑（Freund's adjuvant) 53 201231066 以1:1 ( v/v )混合。第五次免疫及最終免疫係在無佐劑下於 PBS中給予HER3蛋白。 使用佐劑來增強及調節免疫反應。在第一次免疫時， 使用完全傳氏佐劑（Complete Freund's adjuvant ; CFA )， 而第二次、第三次及第四次免疫使用不完全傳氏佐劑 (Incomplete Freimdis adjuvant ; IFA)。IFA 為由礦物油構 成之水包油乳液，且CFA為含有經熱殺滅、乾燥之分枝桿 菌物種之IFAe兩種佐劑均具有儲槽效 應（depot effect) 。CFA中之分枝桿菌引起免疫系統強活 化，從而產生免疫反應之長期持久性。僅向小鼠投予穩定 乳液。 各免疫使用10 μ g重組HER3蛋白。小鼠總共接受五 次注射。前四次注射時對所有小鼠皮下（s c )注射2〇〇 # 1抗原-佐劑乳液，且在第五次注射時腹膜内（ip )注射1〇〇 μ 1柷原之PBS溶液。免疫 '佐劑、注射途徑等之概述見於 表4中。 藉由頸部脫臼來處死小鼠，且收集脾及腹股溝淋巴 結。藉由經 70 /zm 細胞過濾器（Faic〇n，BDBi〇scienees，g 錄號3 5 2 3 5 0 )進行離析來製備單細胞懸浮液。彙集來自三 隻小鼠之細胞，再懸浮於含10%FBS之冷RPMI 1640中且 短暫離心。 54 201231066 表4:免疫概述。 曰 免疫 佐劑 抗原微克/劑量 抗原濃度# g/mL 劑量體積 投藥途徑 0 第1次 CFA 10 50 200 μ\ s.c. 21 第2次 IFA 10 50 200 β\ s.c. 42 第3次 IFA 10 50 200 β\ s.c. 69 第4次 IFA 10 50 200 β\ s.c. 86 第5次 PBS 10 100 100 β\ i.p,, 89 器官收集 - - - - 鼠類漿細胞之FACS分選 為移除紅血球，在0.17 M NH4C1中溶解彙集之細胞懸 浮液。溶解後，在2% FBS/PBS中洗滌細胞兩次。將細胞再 懸浮於 1 m] 2% FBS/PBS 中，與 Fc-block(抗小鼠 CD16/CD32, BD Biosciences，目錄號553141 ) —起培育且洗滌一次。再 懸浮於2% FBS/PBS中後，在黑暗中用以下對細胞染色20 分鐘：抗小鼠 CD43-FITC ( BD Biosciences，目錄號 553270 )、抗小鼠 CD138-PE ( BD Biosciences，目錄號 553 714 )、抗小鼠 IgM-Horizon ( BD Bio sciences,目錄號 560575 )、抗小鼠 IgGl-APC ( BD Biosciences，目錄號 550874 )、抗小鼠 MHC II (I-A/I-Ed)-生物素（BD Biosciences， 目錄號 553622 )及抗小鼠 B220/CD45R-PerCP ( BD Biosciences,目錄號553093 )。洗條細胞，與抗生蛋白鏈 菌素- APC-Cy7 ( BD Biosciences，目錄號 554063) — 起培育 20分鐘且洗蘇。在FACSAria細胞分選器上對細胞進行 FACS 分選。將 BlSO—MHCIlWCDAS + CDlSS+IgM·細胞單細 胞分選至含有PCR反應緩衝液之3 84孔微量滴定盤中。將 55 201231066 盤離心’冷凍且在_80°C下儲存。 同源VH及VL對之連接 對經閘控為漿細胞之單細胞進行VH與vL編碼序列的 連接’從而有助於VH與Vl編碼序列之同源配對。該程序 利用基於一步多工重疊延伸RT-PCR繼而巢式PCR之兩步 PCR程序。本實施例中所用之引子混合物僅擴增κ輕鏈。 然而，必要時，可將能夠擴增；1輕鏈之引子添加至多工引 子混合物及巢式PCR引子混合物十。若添加λ引子則應 改適分選程序以便λ陽性細胞不被排除。同源vh與序 列之連接原理詳述於W0 2005/〇42774及Meijer等人，（2〇〇6) J Mol Biol. 35S[3)_.764-72 中。 將96孔PCR盤解/東且分選之細胞用作多工重曼延伸 RT-PCR之模板。單細胞分選前添加至各孔中之分選緩衝液 含有反應緩衝液（OneStep RT-PCR緩衝液；Qiagen )、用 於 RT-PCR 之引子及 RNase 抑制劑（RNasin，Pr〇mega )。 用於重疊延伸RT-PCR之引子以及引子濃度與w〇 2008/104183之表3中所列相同。向其中補充〇neStep RT-PCR5酶混合物（25倍稀釋度；Qiagen)及dNTp混合 物（各自2 0 0 # Μ )以獲得2 0 // 1反應體積中之指定最終 濃度。在55°C下培育該等盤30分鐘以允許rNA自各細胞 反轉錄（RT)。在RT之後’對盤進行以下pCR循環：94 °C下1〇分鐘、35x ( 94°C下40分鐘、6〇它下4〇分鐘、72 °C下5分鐘）、72°C下1 〇分鐘。 在具有用於24個96孔盤之剝落密封籃（peei Seal 56 201231066 歸⑷（ABgen〇的H2贿熱循環器中進行PCR反應 以有助於高產量。循環之後在，。c下儲存⑽盤。 對於巢式PCR步驟，尤夂文丨山 ，驟在各孔中用以下混合物（20 #1 反應液）製備96孔PCR盤以獲得指定最終濃度]χ—⑻此 緩衝液㈤he)、dNTp混合物（各自2m)、巢式 引子混合物、Ρ— DNA聚合酶（〇·〇8 U ; Finnzymes ) 及高保真度酶摻合物（FastStart High Fidelity EnzymeBknd) (0.8u;R〇che)。用於巢式 之引子 Μ引子濃度與_2_/1()4183之表4中所列相同。作為 巢式PCR之模板，自客丁舌f7丄 自夕工重疊延伸PCR反應液轉移1 M卜 對巢式PCR盤進行以下熱猶環：35X( 95t下30秒、60t :30秒、72t下9〇秒）、饥下ι〇分鐘。在ι%璦脂糖 凝膠上为析隨機選擇之反應液以驗證約89〇個鹼基對（bp ) 之重疊延伸片段之存在。在·2()<t下儲存該等盤直至進一步 處理PCR片段。 彙集來自巢式PCR之連接Vh與Vl編碼對的譜系，但 不犯〇來自不同供體之對，且藉由製備型1%瓊脂糖凝膠電 泳進行純化。如W0 2008/1〇4183中所述，藉由重憂延伸將 人類/C恆定輕鏈編碼序列剪接至經連接Vh與Vl編碼對之 彙集PLR產物的VL編碼區。在含有以下之反應中自含有具 有/c fe鍵之人類抗體之編碼序列的質體擴增人類&恆定輕 鍵編碼序列：Phusion 酶（2 u; Finnzymes)、lxPhusi〇nd ，友衝液、dNTP混合物（各自200 " μ )、hKCforw-v2引 子及/c 3’引子（關於所用之引子及濃度，請參看w〇 57 201231066 200 8/104183 之表 5)及質體模板 pLL138 ( 10 ng/μ 1)，總 體積為50 #1。對反應進行以下熱循環^5x(95〇Ct 3〇 秒、55 C下30秒、72°C下45秒）、72。(：下10分鐘。藉由 製備型1 °/〇璦脂糖凝膠電泳純化所產生之p C R片段。 藉由以下剪接’藉由含有以下之重疊延伸PCr(5〇仁 1總體積）將來自各譜系之經純化之彙集PCR片段剪接至人 類/C怪定編碼區（SEQ ID NO: 41 )的經擴增及純化之Pcr 片段：人類/c恆定編碼區片段（1-4 ng/以1)、經純化之彙 集 PCR 片段（1.4 ng/# 1) 、Phusi〇n DNA 聚合酶（〇 5 u ; Fmnzymes)及 FastStart 高保真度酶摻合物（〇 2 u; R〇che)、 lxFastStart 緩衝液（Roche) 、dNTp 混合物（各自 2〇〇 " Μ) 、mhKCrev引子及mJH組引子（關於所用之引子及濃 度，請參看WO 2008/104183之表5)。對反應進行以下熱 循環：95t下2分鐘、25x ( 95°C下30秒、55°C下30秒、 72 C下1为鐘）、了2 C下10分鐘。藉由製備型i0/〇瓊脂糖 凝膠電泳純化所產生之PCr片段（約45 i 8 bp )。 將同源V η與V l編碼對插入筛選載體中 為鑑別對HER3具有結合特異性之抗體，將所獲得之 VH及VL編碼序列表現為全長抗體。此舉涉及將與& 編碼對之譜系插入表現載體中且轉染至宿主細胞中。 採用兩步驟選殖程序來產生含有連接之^與八編碼 ，的表現載體譜系。在統計學上，若表現載體之譜系含有 多達用於產生篩選譜系之同源配對％與％ pCR產物數目 的十倍之重組質體’則存在99%可能性呈現所有獨特基因 58 201231066 * - 對。因此，若獲得400個重疊延伸V基因片段，則將產生 至少4000個純系之譜系供篩選以具有99%可能性獲得所有 獨特基因對。 簡§之，用烈〇/及DNA核酸内切酶在引入pCR 產物末端之識別位點處裂解剪接至人類^恆定編碼區的連 接之VH與VL編碼對之譜系的經純化PCR產物。藉由標準 連接程序將裂解及純化之片段連接至經χ/ζ〇Ι/ΛΓ〇ίΙ消化之哺 乳動物IgG表現載體〇〇_νρ·〇〇2( W0 2008/104183中所述） 中。將連接混合物電穿孔至大腸桿菌中且添加至含有適當 抗生素之2χΥΤ盤中且在37。(：下培育隔夜。使用標準DNa 純化方法（Qiagen )由自盤回收之細胞純化載體之擴增譜 系。製備質體以便藉由使用心cI及膽eI核酸内切酶進行裂 解來插入啟動子-前導序列片段。此等酶之限制性位點位於 Vh與VL編碼基因對之間。在載體純化後，藉由標準連接程 序將經消化之雙向哺乳動物啟動子-前導序列片 段插入hCI及限制性位點中。在大腸桿菌中擴增連接 之載體且使用標準方法純化質體。藉由習知程序將篩選載 體之所產生谱系轉型至大腸桿菌中。將所獲得之菌落合併 至384孔母盤中且儲存。 採用兩步驟程序來擴增哺乳動物表現質體。溶解第— 細菌且藉由在氫氧化鈉中培育使DNA變性。隨後，進行 TemphPhi擴增（GE Amersham)。此方法利用噬菌體φ 29 DNA聚合酶以藉由滾圓擴增來指數擴增雙股環狀dna模 板。為在哺乳動物細胞中進行抗體表現，使用如製造商所 59 201231066 推薦之標準轉染條件來應用293Freestyle ™表現系統 (Invitrogen )。該等細胞在轉染前補充5〇 mM之丙戊酸鹽， 且次曰添加膝化蛋白N1至最終濃度為轉染體積之1.5 % (w/v)。在轉染後六曰收集含有抗體之上清液。用標準抗 IgG ELISA評估表現量。 針對與重組HER3蛋白之結合進行篩選（ELISA ) 藉由ELISA，使用重組HER3蛋白作為抗原來測定抗體 特異性。 簡言之’在4°C下以於PBS中稀釋之1以g/mi HER3 蛋白（R&D Systems 目錄號 348-RB)塗佈 Nunc Maxisorb 盤（目錄號 464718 )隔夜》在 50 /z 1 2。/。乳汁-PBS + 0.05〇/〇

Tween 20中阻斷之前，用PBS_t洗滌該等盤一次。用pBS_T 及20 " 1 2%乳汁-PBS-T洗滌盤一次，且添加1〇 " 1來自 FreeStyle293轉染物之上清液，且在室溫下培育i小時之 後用PBS-T (每孔20以〇洗滌盤一次。添加在2%乳汁 -PBS-T中以1:25 000稀釋之二次抗體（HRp_山羊抗人類凡 輕鏈，Serotec，目錄號STAR 100P)以偵測結合於孔之抗 體且在室溫下培育1小時。在PBS-Τ中洗滌盤一次，隨後 添加 25 μ 1 受質（Kern-En-Tec Diagnostics，目錄號 45 i 8 ) 培育5分鐘。在培育後添加25 β 1 1 μ硫酸以停止反應。 在ELISA讀取器上於450 nm下偵測特異性信號。自Eusa 資料’鑑別出480個陽性抗體純系且選擇用於進行序八 析及驗證與HER3之結合。 序列分析及純系選擇 60 201231066 自原始母盤（384孔格式）再取出藉由ELIS A鏗別為 與HER3結合之純系’且在瓊脂盤上劃線以產生單一菌落， 將其挑選至LB培養基培養物中且在劇烈震盪下在37«»c下 培育隔夜。使用Qiaprep 96快速微量製備套組（Qiaprep 96 turbo mini-prep kit) (Qiagen，目錄號 27193 )自純系分離 質體DNA ’且提交用於進行v基因之〇ΝΑ定序。比對序列 且選擇所有獨特純系。所得序列之多種比對揭示各特定純 系之獨特性且允許鑑別獨特抗體。在對經定序純系進行序 列分析之後’鑑別出具有2個至超過40個成員以及超過2〇 種純系型（僅呈現一次）之33個相關序列叢集。各相關序 列叢集可能經由常見前駆純系之體細胞超突變而產生。總 而s之’自各叢集中選擇一至兩個純系用於驗證序列及特 異性。基於叢集分析，選擇丨丨9個純系用於小規模表現及 進一步特性化。所選抗體可變區之序列展示於序列表中。 序列表中所示之輕鏈序列均包括相同人類&恆定區，其以 胺基酸-TVAAP-起始且以c端_NRGEC結束。為驗證抗體編 碼純糸，製備DNA質體且以2 ml規模對Freestyie CH0-S 細胞（Invitrogen)進行轉染以用於表現。在轉染後6曰收 集上清液。用標準抗IgG ELISA評估表現量，且藉由如上 文「釺對輿重纽孖五及3蛋白之，结合遠行锣選」中所述之her3 特異性ELISA及結合HER3過表現細胞之抗體之高產量筛 選共焦顯微術（參看下文）來測定特異性。 針對與HER3過表現細胞之結合進行篩選（〇pERA ) 使用共焦顯微術針對與HER3過表現乳癌細胞系 61 201231066 (MCF-7 )之結合來篩選！ 19個純系。將ι〇,〇〇〇個MCF-7 細胞接種於384孔細胞載盤（Perkin Elmer，目錄號 6007439 )之各孔中且使其附著隔夜。再次丟棄培養基且洗 蘇細胞，且用20/〇甲醛溶液（Aldrich，目錄號533998 )固定。 洗滌後，將40 v 1抗體上清液轉移至各孔中且將盤培育2 小時，之後丟棄孔中之培養基且將3〇 “丨含有2 # g/ml

Alexa 488 1 5己山羊抗人類 igG ( h+L，Invitrogen 目錄號 A11013 ) 2 " g/ml CellMask Blue ( Invitrogen 目錄號 H34558 )及 1 " M Hoechst 33342( Invhr〇gen 目錄號 H357〇) 之新培養基添加至各孔中，且將盤再培育3〇分鐘。接著使 用OPERA尚產量共焦顯微鏡（perkin Eimer )量測螢光量。 根據藉由ELISA及〇pERA驗證篩選獲得之結合資料， 選擇64個純系用於中等規模表現。 實施例2 :選擇分別針對EGFR、HER2及HER3之最 佳抗體混合物 此實施例證明針對各個別HER家族受體（EGFR、HER2 及HER3 )之抗體之混合物優於個別抗體。 方法 .選擇針對各受體之三種單株抗體用於此研究（表5)。 士藉由表面電毁子共振分析（Surfaee Plasmon Resonance analyse)所確認對各受體之抗體結合不重疊抗原決定 62 201231066 表5 :研究中所用之抗體 目標 抗體 EGFR 992 嵌合 IgGl EGFR 1024 嵌合 IgGl EGFR 1030 嵌合 IgGl HER2 4382 嵌合 IgGl HER2 4385 嵌合 IgGl HER2 4518 嵌合 IgGl HER3 4785 嵌合 IgGl HER3 5082 嵌合 IgGl HER3 5096 嵌合 IgGl 使用活力分析（viability assay )測試所選抗體及抗體 混合物抑制癌細胞系A431NS ( EGFR) 、NCI-N8 7 ( HER2) 及以10 nM:和瑞古林/3 ( heregulin beta )刺激之MCF-7細 胞（HER3 )之生長及增殖的能力。細胞損傷將不可避免地 引起細胞維持及為代謝性細胞功能及生長提供能量之能力 喪失。代謝活性分析係基於此前提且其通常量測粒線體活 性。細胞增殖試劑WST-1 ( Roche目錄號1 1 644 807 001 ) 為即用型受質，其量測活細胞之代謝活性。假定代謝活性 與活細胞數目有關。在此實施例中，使用WST-1分析來量 測在以不同濃度之抗體處理癌細胞96小時後代謝活性細胞 之數目。 . 在進行WST-1分析之前，將適當抗體及抗體混合物在 補充有2% FBS及1% P/S之適當培養基中稀釋至100 // g/ml之最終總抗體濃度，得到在含有最高抗體濃度之孔中 50 // g/ml之最終總抗體濃度。接著對抗體進行三倍連續稀 釋。接著將相關數目之細胞添加至3 84孔盤中之實驗孔中。 該等盤在含濕氣恆溫箱中在37°C下培育4曰。接著將WST-1 63 201231066 試劑添加至盤中且該等盤在37°C下培育一小時。將盤轉移 至迴轉盤震盪器中一小時，且使用ELISA讀取器在45〇nm 及620 nm (參考波長）下量測吸光度。如下將代謝活性細 胞（MAC )之量計算為未處理對照之百分比：

三種抗EGFR抗體及其所有可能混合物對細胞系 A431NS的滴定結果展示於圖1A中。顯而易知，抗體混合 物優於個別抗體❶由992及1〇24組成之抗體混合物因為其 具有最高功效及效能而得到選擇。三種抗HER2抗體及其所 有可能混合物對細胞系NCI-N87的滴定結果展示於圖iB 中。抗體混合物再次優於個別抗體。由4382、4385及4518 組成之抗體混合物因為其具有最高功效及效能而得到選 擇。三種抗HER3抗體及其所有可能混合物對以1〇 ηΜ和 瑞古林/3刺激之細胞系MCF7的滴定結果展示於圖i c中。 難以區分最佳單株抗體5082與最佳抗體混合物 4785 + 5082。然而，存在混合物較佳之些微趨勢，且因此選

實施例3 ·泛-HER抗體混合物之癌症抑制活性 此貫鈀例證明藉由組合針對各受體之抗體的混合物可 獲得對一種以上HER家族受體之最佳靶向，且靶向三種受 64 201231066 0 9 _ 體優於靶向兩種受體。 方法 使用類似於實施例2中所述之活力分析的活力分析來 測試針對三種受體之最佳化混合物992+1024 ( EGFR )、 43 82+43 8 5+4518 ( HER2 )及 478 5 + 5 082 ( HER3 )以及其所 有可能混合物抑制癌細胞系A43 INS ( EGFR ) 、NCI-N87 (HER2 )及以10 nM和瑞古林/5刺激之MCF-7細胞（HER3 ) 之生長及增殖的能力。 結果 三種抗體混合物及其所有可能混合物對細胞系 A4 3 INS、MCF7及NCI-N87的滴定結果分別展示於圖2、3 及4中。在A431NS細胞中，EGFR混合物與HER3或HER2 混合物之組合使得對癌細胞生長之抑制協同增強（圖2 )。 針對HER2及HER3之混合物組合對A431NS細胞不具有抑 制作用。然而，針對所有三種受體之混合物組合優於個別 混合物且優於針對兩種受體之混合物組合。 類似結果見於MCF7細胞系中（圖3 ) 。EGFR混合物 與HER3或HER2混合物與HER2及HER3混合物之組合使 得對癌細胞生長之抑制協同增強。針對所有三種受體之混 合物組合優於個別混合物且優於針對兩種受體之混合物組 合。 在NCI-N87細胞系中，藉由組合有效抗HER2混合物 與抗EGFR混合物或抗HER3混合物，未獲得效能或功效之 增強（圖4)。針對EGFR及HER3之混合物組合對NCI-N87 65 201231066 細胞不具有抑制作用。針對所有三種受體之混合物組合具 有與抗HER2混合物類似之效能及功效。 將針對所有三種受體之混合物組合與市售單株抗體西 妥昔單抗（EGFR)及曲妥珠單抗（HER2)及此兩種抗體之 混合物相比較（圖5)。結果證明在所有三種細胞系中，泛 -HER混合物均優於西妥昔單抗與曲妥珠單抗，而且亦優於 此兩種抗體之混合物。 總而言之，此實施例之結果證明藉由組合針對各受體 之抗體的混合物可獲得對一種以上HER家族受體之最佳靶 向，且靶向三種受體優於靶向兩種受體。 實施例4 :利用抗體混合物之組合同時靶向兩種HER 家族受體EGFR及HER2之抑制特徵 此實施例證明抗EGFR混合物與HER2混合物之組合抑 制癌細月包系 MCF7 、 HCC202 、 BT474 、 NCI-N87 、 MDA-MB-175 、A431NS 、HN5 、H292 、DU145 及 MDA-MB-468。 方法 研究抗EGFR混合物（ 992 + 1024 )、抗HER2混合物 (43 82 + 43 8 5 + 45 1 8 )及此兩種混合物之組合抑制十種具有 EGFR或HER2依賴性之人類癌細胞系之生長的能力。包括 市售單株抗體西妥昔單抗及曲妥珠單抗作為對照。 將癌細胞系 MCF7、HCC202、BT474、NCI-N87、 MDA-MB-175、A431NS、HN5、H292、DU145 及 MDA-MB-468 以1000個細胞/孔之濃度於含有2 // g/ml抗HER2抗體之 66 201231066 . 培養基中接種於96孔盤中。該等盤在含濕氣恆溫箱中在37 °C下培育4曰。接著每孔添加20 # 1 WST-1試劑且該等盤 在37°C下培育一小時。接著將盤轉移至迴轉盤震盪器中且 再保持一小時。在ELISA讀取器上在450 nm及620 nm (參 考波長）下量測吸光度。生長抑制程度計算為未處理對照 細胞之百分比。 、结果 細胞生長抑制之研究結果可見於圖6中且顯示抗EGFR 混合物與HER2混合物之組合抑制所有所測試之細胞系。靶 向僅一個受體使得依賴於該受體之細胞系受到抑制。總而 言之，此等结果顯示針對EGFR及HER2之抗體混合物之組 合得到寬得多的抑制特徵且因此可最終用以治療腫瘤依賴 於任一受體之患者。 實施例5 :用抗體混合物之組合降解EGFR、HER2及 HER3 此實施例證明抗體混合物誘導其目標（EGFR、HER2 或HER3 )降解，且針對所有三種目標之混合物組合可誘導 所有受體同時降解。 方法 為研究由抗體混合，物及混合物組合誘導之EGFR、HER2 及HER3降解之程度，對以抗體處理48小時之HN5、N87 及MCF7細胞之全細胞溶解產物進行西方墨點分析。使細 胞在T-75培養瓶中生長且當匯合度為5 0°/。時移除培養基， 在lxPBS中洗滌細胞且以稀釋於5 ml含有0.5% FBS之培 67 201231066 養基中之20 # g/ml抗體處理。處理細胞48小時，之後使 用標準RIPA缓衝液製備全細胞溶解產物。測定各樣品中之 總蛋白質濃度且藉由西方墨點法，使用針對EGFR、HER2 或HER3之一次抗體分析1-10 β g蛋白質。使用針對/5 -肌動蛋白之抗體作為内參考物（loading control )。 結果 西方墨點研究之結果（圖7 )顯示針對單一受體 (EGFR、HER2或HER3 )之抗體混合物誘導其相應目標降 解且由針對各目標之抗體混合物之組合組成的泛-HER混合 物能夠誘導所有三種受體同時有效降解。 實施例6 :泛-HER抗體混合物之癌症抑制活性 使用實施例3中所述之方法，測試抗體混合物Sym004 (含有 W0 2008/1041 83中所述之兩種抗 EGFR抗體 992+1024 )、1277+1565(抗 EGFR)、1254+1565(抗 EGFR)、 4385 + 43 18 (抗 HER2)、4384+45 17 (抗 HER2)、5038 + 5082 (抗 HER3 )、泛-HER 抗體混合物 1565+45 17 + 5082 及 1277 + 4 3 84 + 5 082 ( —種抗體針對 EGFR、HER2 及 HER3 中 之每一者）及 1277+1565+4384+4517+5038+5082 及 12 77+1 5 65 + 43 8 5 + 45 1 8 + 5 03 8 + 5 0 82 (兩種抗體針對 EGFR、 HER2及HER3中之每一者）、參考抗體西妥昔單抗（抗 EGFR)、曲妥珠單抗（抗HER2)、873 6 ( MM-121類似物； 抗HER3 )及三種參考抗體之混合物以及陰性對照抗體抑制 22 種依賴於 EGFR 或 HER2、EGFR/HER2、HER2/HER3 或 EGFR/HER2/HER3之癌細胞系之生長及增殖的能力。上列 68 201231066 . 抗體混合物及抗體針對五種細胞系A431NS( EGFR)、H358 (EGFR)、HCC202( HER2 )、OE19( HER2 )及 H82 0( EGFR) 之滴定結果展示於圖8-1 2中。 結果 自圖8-12之結果可見，儘管抗體混合物及個別抗體之 作用在不同細胞系之間不同，但含有針對三種受體EGFR、 HER2及HER3中每一者之抗體的泛-HER抗體混合物一般 有效抑制細胞生長及增殖。含有六種抗體（亦即兩種抗體 針對三種受體中之每一者）之泛-HER混合物一般在不同細 胞系中均最有效。 實施例7 :用抗體混合物之組合降解EGFR、HER2及 HER3 此實施例證明抗體混合物誘導其目標（EGFR、HER2 或HER3 )降解，且針對所有三種目標之混合物組合可誘導 所有受體同時降解。 方法 為研究由抗體混合物及混合物組合誘導之EGFR、HER2 及HER3降解之程度，對以抗體處理48小時之H292及 OVCAR-8細胞之全細胞溶解產物進行西方墨點分析。使細 胞在T-75培養瓶中生長且當匯合度為50%時移除培養基， 在lxPBS中洗滌細胞且以稀釋於5 ml含有0.5% FBS之培 養基中之20 g g/ml抗體處理。處理細胞48小時，之後使 用標準RIP A緩衝液製備全細胞溶解產物。測定各樣品中之 總蛋白質濃度且藉由西方墨點法，使用針對EGFR、HER2 69 201231066 或HER3之一次抗體分析1 -1 0 // g蛋白質。使用針對冷- 肌動蛋白之抗體作為内參考物。 結果 西方墨點研究之結果（圖13 )顯示針對單一受體 (EGFR、HER2及HER3 )之抗體混合物誘導其相應目標降 解且由針對各目標之抗體混合物之組合組成的泛-HER混合 物能夠誘導所有三種受體同時有效降解。 在H292細胞系中，可在以抗EGFR抗體1277、1565 處理之細胞中，且在由一種針對EGFR、HER2及HER3中 之每一者之抗體組成之泛-HER混合物（1277 + 4384 + 5082 ) 中，而非在以抗EGFR比較抗體西妥昔單抗處理之細胞中觀 察到總EGFR少量減少。1277+1 565混合物使得EGFR有效 降解，且對由兩種針對各目標之抗體組成之泛-HER混合物 (1277+1565+4384+45 17 + 5038 + 5082 )亦觀察到該種降解。 單獨時 與作為 泛 -HER 混 合 物 1277+15 65+43 84+45 17 + 5 03 8 + 5 082 之部分時，抗 HER2 抗體 組合（43 84 + 45 17 )均誘導HER2降解。 如同在H292中，在以個別抗體1277及1 565及泛-HER 混合物1277 + 4384 + 5082處理之細胞中觀察到0VCAR-8溶 解產物中總EGFR少量減少。組合1277+ 1565及泛-HER混 合物 1277 + 15 65 + 4384 + 4 5 1 7 + 5 038 + 5082 誘導 EGFR 極有效 降解。抗HER2單株抗體對總HER2具有微小作用，而針對 HER2之抗體組合（43 84+45 17 )使得受體有效降解。針對 HER3之抗體及抗體混合物均使0VCAR-8細胞中之受體降 70 201231066 _ 解。 在H292細胞中，可觀察到回應於以針對EGFR之個別 抗體（西妥昔單抗、1277及1 565 )或抗體混合物（1277+1565 ) 處理細胞，HER2上調。因為EGFR、HER2及HER3均在此 環境中同時降解，所以此現象在以由兩種針對各目標之抗 體 組成之 泛 -HER 抗 體 混 合 物 (1277 + 15 65 + 43 84+45 17 + 5 03 8 + 5082 )處理的細胞中未觀察 到。在OVCAR-8細胞中，可見到以針對HER3之抗體或抗 體混合物處理之細胞中之HER2上調。此外，由於受體同時 降解，因此此現象在以由兩種針對各目標之抗體組成之泛 -HER 抗體混合物(1277+1565+4384 + 4517 + 5038 + 5082 )處 理的細胞中未觀察到。在以泛-HER抗體混合物 (1277 + 4384 + 5082 )處理之細胞中均亦未觀察到受體上 調。因此，因為所有三種受體（EGFR、HER2及HER3 )在 以泛-HER抗體混合物處理時均降解，所以用泛-HER混合 物處理細胞潛在地防止出現由受體上調所致之抗性。 實施例8 :泛-HER抗體混合物之癌症抑制活性 此實施例描述由一種針對目標EGFR、HER2及HER3 中每一者之抗體組成之泛-HER抗體混合物（亦即含有一種 針對各目標之抗體之泛-HER混合物）、含有一種針對兩種 目標（EGFR及HER3 )之抗體及兩種針對一種目標（HER2 ) 之抗體之泛-HER混合物，及由兩種針對各受體（亦即 EGFR、HER2及HER3 )之抗體組成之泛-HER混合物的優 良癌症抑制活性。 71 201231066 方法 使用實施例3中所述之方法，測試針對各受體之抗體 混合物 1277+15 65 (抗 EGFR)、43 84 + 45 1 7 (抗 HER2 )及 5038 + 5082 (抗HER3)、具有兩種針對各受體之抗體的泛 -HER 混合物（ 1277+1565+4384+4517 + 5038 + 5082 )、包括 一種針對EGFR之抗體、兩種針對HER2之抗體及一種針對 HER3 之抗體的泛-HER 混合物（1277+4384+45 17 + 5038 或 1277 + 4384 + 45 1 7 + 5082 )、由一種針對各受體之抗體組成的 泛-HER 混合物（ 1277 + 4384 + 5038 及 1277+4384 + 5082 )、 參考抗體西妥昔單抗（抗EGFR )、曲妥珠單抗（抗HER2 )、 MM-121類似物（抗HER3)、三種參考抗體之混合物及陰 性對照抗體抑制1 1種依賴於EGFR或HER2、EGFR/HER2、 EGFR/HER3、HER2/HER3 或 EGFR/HER2/HER3 之癌細胞系 之生長及增殖的能力。上列抗體混合物及抗體在七種細胞 系 A431NS、N87、A549、OE19、BT474、MDA-MB-175 VII 及HCC202中之滴定結果展示於圖14-20中。 結果 圖1 4-20中呈現之結果顯示儘管抗體混合物及個別抗 體之作用在不同細胞系之間不同，但包含三種、四種或六 種針對三種受體EGFR、HER2及HER3之抗體的泛-HER抗 體混合物一般極有效地抑制癌細胞生長及增殖。如實施例5 中所述’含有六種抗體（亦即兩種抗體針對三種受體中之 母一者）之泛-HER混合物一般在所測試之細胞系中均最有 效。 72 201231066 * 實施例9 :泛-HER抗體混合物之癌症抑制活性 此實施例描述與同時靶向兩種 HER 家族受體 (EGFR/HER2、EGFR/HER3 或 HER2/HER3 )或僅靶向三種 受體中之任一者相比，利用抗體混合物之組合同時靶向三 種HER家族受體（EGFR/HER2/HER3 )產生較寬抑制特徵。 方法 使用實施例3中所述之方法，測試針對各受體之抗體 混合物 127 7+1565 (抗 EGFR)、4384+45 17 (抗 HER2)及 5038 + 5082 (抗 HER3 ) 、其 所有可 能之 排列， 亦 即 1277+1565+4384+4517 ( 抗 EGFR+ 抗 HER2 ) 、 1277+1565+5038+5082 ( 抗 EGFR+ 抗 HER2 ) 及 4384 + 45 17 + 5038 + 5082 (抗 HER2 +抗 HER3 )、具有兩種針 對各受 體之抗體之泛 -HER 混合物 (1277+1565+43 84+45 17 + 5 03 8 + 5 082 )、由一種針對各受體 之抗體組成之泛-HER 混合物 （1277+4384 + 5038 及 1277 + 4384 + 5082 )、參考抗體西妥昔單抗（抗EGFR)、曲 妥珠單抗（抗HER2 ) 、MM-121類似物（抗HER3 )、三 種參考抗體之混合物及陰性對照抗體抑制11種依賴於 EGFR 或 HER2、EGFR/HER2、EGFR/HER3、HER2/HER3 或EGFR/HER2/HER3之癌細胞系之生長及增殖的能力。上 列抗體混合物及抗體針對五種細胞系 A43 INS、AU565、 H358、H197 5及HCC2 02中之滴定結果展示於圖21-25中。 結果 在 A431NS 中，針對 EGFR 及 HER2 或 EGFR 及 HER3 73 201231066 之混合物的組合使得對癌細胞生長之抑制協同增強，與實 施例3中所述之結果一致。靶向HER2及HER3之混合物的 組合對A431NS細胞不具有抑制作用。針對EGFR、HER2 及HER3之抗體混合物的組合優於個別混合物且優於僅具 有一種針對三種受體中每一者之抗體的抗體混合物，且與 針對兩種受體之混合物的組合同樣有效。 用H1975細胞系獲得類似結果。此外，針對EGFR及 HER2或EGFR及HER3之抗體混合物的組合顯示抑制作用 協同增強。針對EGFR、HER2及HER3之抗體混合物的組 合優於個別混合物且優於僅具有一種針對三種受體中每一 者之抗體的抗體混合物，且與針對兩種受體之混合物的組 合同樣有效。 在HCC202細胞系中，針對HER2及EGFR或HER2及 HER3之混合物的組合對癌細胞生長及增殖具有增強之抑 制作用。針對EGFR及HER3之抗體混合物的組合對HCC202 細胞不具有抑制作用。針對EGFR、HER2及HER3之抗體 混合物的組合優於個別混合物、優於針對兩種受體之混合 物的組合，且優於僅具有一種針對三種受體中每一者之抗 體的抗體混合物。 類似結果見於AU565細胞系中。針對HER2及EGFR 或HER2及HER3之混合物的組合對癌細胞生長及增殖具有 增強之抑制作用。針對EGFR及HER3之抗體混合物的組合 對AU565細胞不具有抑制作用。針對EGFR、HER2及HER3 之抗體混合物的組合優於個別混合物、優於針對兩種受體 74 201231066 m 之混合物的組合，且優於僅具有一種針對三種受體中每一 者之抗體的抗體混合物。 在H358細胞系中，與僅靶向EGFR相比，針對EGFR 及HER3或EGFR及HER2之混合物的組合使得抑制作用有 少量增強。混合物組合靶向HER2及HER3對癌細胞生長及 增殖產生適度抑制作用，與僅靶向HER3相當。然而，針對 所有三種受體之混合物的組合使得對細胞生長及增殖之抑 制增強，其優於個別混合物、優於針對兩種受體之混合物 的組合且優於僅具有一種針對三種受體中每一者之抗體的 抗體混合物。 總而言之，此實施例中呈現之結果證明藉由組合針對 各受體之抗體混合物可獲得對HER家族中一種以上受體之 最佳靶向，靶向三種受體優於靶向兩種受體，且利用抗體 混合物靶向各受體優於利用單一抗體靶向各受體。 實施例10:泛-HER抗體混合物在人類A431NS腫瘤異 種移植模型中之活體内功效 為評估抗體混合物針對EGFR、HER2、HER3及三種受 體之組合的活體内功效，吾人在A43 1NS人類腫瘤異種移植 模型中測試抗體及混合物。當在試管内及活體内測試新穎 抗EGFR化合物之生長抑制作用時，廣泛使用過表現EGFR 之人類表皮癌細胞系A43 1。在本文呈現之活體内研究中， 吾人使用親本A43 1細胞系之更具侵襲性之生長變異體 A4 3 INS ( ATCC編號CRL-2 592 )。結果展示於圖26中。 方法 75 201231066 將2x1 〇6個A431NS細胞皮下接種於八週齡雌性無胸腺 裸小鼠之左脅中。每週兩次用測徑規量測腫瘤且根據下式 計算腫瘤體積（mm3):(寬度）2χ長度χ〇5。在平均腫瘤 尺寸為1 75 mm3時，將小鼠隨機化且起始處理。如下處理 小鼠：每週兩次腹膜内注射50毫克/公斤/目標持續2 5週（總 共注射5次），接著為觀察期。因此，乾向一種受體引起 投予50 mg/kg，而以靶向二種或三種受體之抗體組合處理 之小鼠分別給予100 mg/kg或150 mg/kg。實驗中包括以下 抗體組合：1277+1565 (抗 EGFR)、4384+4517(抗 HER2)、 5038 + 5082 (抗 HER3)、1277 + 1565+4384 + 45 17 (抗 EGFR+ 抗 HER2 )、1277 + 1565 + 5038 + 5082 (抗 EGFR+抗 HER3 )、 4384+45 17 + 5038 + 5082 (抗 HER2+ 抗 HER3 )、 1277+4384 + 5038 (抗 EGFR+ 抗 HER2+ 抗 HER3 )及 1277+1 565 + 4384 + 45 17 + 5038 + 5082 (抗 EGFR+抗 HER2 +抗 HER3 )。實驗亦包括抗EGFR單株抗體西妥昔單抗及抗 HER2單株抗體曲妥珠單抗，其如對於上述抗體混合物所述 進行給藥及投藥。 結果 在接種後第12日’在平均腫瘤尺寸為i75mm3時，將 小鼠隨機化至11個組（每組8隻動物）中且起始處理。以 靶向 EGFR+HER3 之抗體（1277+1565 + 5038 + 5082 )及乾向 EGFR+HER2+HER3 之抗體（泛-HER 混合物： 1277 + 4384 + 5038 及 泛 -HER 混 合 物 ： 1277+1 5 65 + 4 3 84 + 45 17 + 5 03 8 + 5 082 )處理之動物極有效地控 76 201231066 . 制腫瘤生長。在處理期中，在以抗EGFR+抗HER3 (1277+1565 + 5038 + 5082 )及抗 EGFR+抗 HER2 +抗 HER3(泛 -HER 混合物：1277+4384 + 5038 及泛-HER混合物： 1277+1 5 65+43 84 + 45 17 + 5 03 8 + 5 082 )處理之組中幾乎未觀察 到腫瘤尺寸增大。以針對EGFR之抗體（1277 + 1565 )或針 對HER3之抗體（5038 + 5082 )或靶向GFR+HER2之組合 (1277 + 1565 + 4384 + 45 17 )及靶向 HER2+HER3 之組合 (43 84 + 4 5 17 + 5 03 8 + 5 0 82 )處理的動物在處理期中均具有持 續腫瘤生長，但腫瘤生長速率慢於媒劑對照組。與媒劑對 照組相比，以抗HER3及抗HER2 +抗HER3抗體組合處理 之動物具有僅稍小之腫瘤。以抗EGFR ( 1277+1565 )或抗 EGFR+抗 HER2 ( 1277+1565 + 4384 + 45 17 )處理之組顯示腫 瘤抑制且生長速率慢於媒劑對照組。 在觀察期中，以抗HER3、抗EGFR+抗HER2、抗HER2 + 抗HER3及西妥昔單抗處理之組均具有持續腫瘤生長，但速 度慢於媒劑對照組。一般而言，以抗EGFR抗體及包括針對 EGFR之抗體組合的混合物處理之組的腫瘤生長速率慢於 以針對HER3之抗體混合物或針對HER2+HER3之混合物的 組合處理之組。 以靶向EGFR+HER3及EGFR+HER2 + HER3之抗體混合 物之組合（泛-HER 6-混合物）及一種針對三種受體中每一 者之抗體之組合（泛HER 3-混合物）處理的組均在整個實 驗中維持對腫瘤生長之控制。 在A43 1NS腫瘤異種移植模型中同時靶向EGFR及 77 201231066 HER3之增強之功效反映此細胞系的據試管内實驗（實施例 2 )已知之ErbB受體依賴性。儘管主要依賴於EGFR信號 傳導，但A43 1NS細胞系亦依賴於EGFR與HER3之間的串 音且以某種程度依賴於EGFR與HER2之間的串音，不過在 當前活體内實驗中未觀察到EGFR與HER2之間的串音。 總而言之，此實驗中呈現之結果顯示，相較於用針對 個別目標EGFR、HER2及HER3之單株抗體及抗體混合物， 或針對EGFR+HER2或HER2 + HER3之單株抗體及抗體混合 物之組合靶向腫瘤，用針對 EGFR+HER3 或 EGFR+HER2 + HER3 之抗體或抗體混合物之組合處理 A4 3 1NS腫瘤異種移植物更有效。 【圖式簡單說明】 圖1 : A )以不同濃度之指定抗體及抗體混合物處理96 小時之A43 1NS細胞的代謝活性。B )以不同濃度之指定抗 體及抗體混合物處理96小時之NCI-N87細胞的代謝活性。 C )在1 0 nM和瑞古林召（heregulin beta )存在下以不同濃 度之指定抗體及抗體混合物處理96小時之MCF7細胞的代 謝活性。 圖2 :以不同濃度之指定混合物處理96小時之A43 1NS 細胞的代謝活性。 圖3 :以不同濃度之指定抗體混合物處理96小時之 MCF7細胞的代謝活性。 圖4 :在1 0 nM和瑞古林/3存在下以不同濃度之指定抗 體混合物處理96小時之NCI-N87細胞的代謝活性。 78 201231066 圖5 :以下細胞之代謝活性：以不同濃度之指定抗體混 « 合物及參考單株抗體西妥昔單抗及曲妥珠單抗處理96小時 之A43 1NS細胞、以不同濃度之指定抗體混合物及參考單株 抗體西妥昔單抗及曲妥珠單抗處理96小時之NCI-N87細 胞，及在1 0 nM和瑞古林yS存在下以不同濃度之指定抗體 混合物及參考單株抗體西妥昔單抗及曲妥珠單抗處理96小 日茅之MCF7細胞。 圖6 :以2 # g/ml指定抗體及抗體混合物處理96小時 之指定細胞系的最大生長抑制程度。 圊7 :在以指定抗體及抗體混合物處理隔夜後細胞系 HN5、NCI..N87 及 MCF7 中 EGFR、HER2 及 HER3 含量的 西方墨點分析。 圖 8-12 :顯示不同抗體混合物及抗體對癌細胞系 A431NS(EGFR 依賴性）、H358 (EGFR 依賴性）、HCC202 (HER2 依賴性）、OE19 ( HER2 依賴性）及 H820 ( EGFR 依賴性）之生長及增殖之作用的滴定。 圊1 3 :在以指定抗體及抗體混合物處理隔夜後細胞系 H292及OVCAR-8中EGFR、HER2及HER3含量的西方墨 點分析。 圖14-20 :顯示不同抗體混合物及抗體對癌細胞系 OE19、BT474、MDA-MB-175-VII、HCC202、N87、A431NS 及A 5 4 9之生長及增殖之作用的滴定。 圖2 ], -25 :顯示不同抗體混合物及抗體對癌細胞系 A431NS、H1975、HCC202、AU5 65 及 H358 之生長及增殖 79 201231066 之作用的滴定。 圖26 :不同抗體混合物及抗體在A43 1NS人類腫瘤異 種移植模型中之生長抑制作用。 【主要元件符號說明】 無 80 201231066 序列表 <110> 賽門弗鎭公司 <120> 泛-腿抗體混合物 <130> P141PC00 <150> <151〉 PA 2010 00988 2010-11-01 <150> <151> PA 2011 00672 2011-09-05 <150> <151> US 61/408,782 2010-11-01 <150> <151> US 61/531,407 2011-09-06 <160> 150 <170> Patentln第3.5版 <210> <211> <212> <213> 1 372 DNA 小家鼠 <400> 1 cgcgccgagg tccaactgca gcaacctggg tctgagctgg tgaggcctgg agcttcagtg 60 aagctgtcct gcaaggcttc tggctacaca ttcaccagct actggatgca ctgggtgaag 120 cagaggcctg gacaaggcct tgagtggatt gggaatattt atcctggtag tcgtagtact 180 aactacgatg agaagttcaa gagcaaggcc acactgactg tagacacatc ctccagcaca 240 gcctacatgc agctcagcag cctgacatct gaggactctg cggtctatta ctgtacaaga 300 aatggggatt actacgttag tagcggggat gctatggact actggggtca aggaacctca 360 gtcaccgtct eg 372 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 2

Arg Ala Glu Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro 15 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Asn lie Tyr Pro Gly Ser Arg Ser Thr Asn Tyr Asp Glu 1 201231066 50 55 60

Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80

Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asn Gly Asp Tyr Tyr Val Ser Ser Gly Asp Ala Met 100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 115 120 <210> 3 <211> 648 <212> DNA <213> 小家鼠 <400> 3 ctagccgaca ttcagatgac tcagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga gtcaccatca gttgcaggac aagtcaggac attggcaatt atttaaactg gtatcagcag aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc tactacacat caagattaca ctcaggagtc ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattttt ctctcaccat taacaacgtg gagcaagagg atgttgccac ttacttttgc caacactata atacggttcc tccgacgttc ggtggaggca ccaagctgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt <210> 4 <211> 216 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 4

Leu Ala Asp lie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15

Leu Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Thr Ser Gin Asp lie Gly 20 25 30

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 35 40 45 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 648 201231066

Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr lie Asn Asn Val 65 70 75 80

Glu Gin Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gin His Tyr Asn Thr Val 85 90 95

Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Thr Val 100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys 115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140

Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn 145 150 155 160

Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn ?\rg Gly Glu Cys 210 215 <210> 5 <211〉 360 <212> DNA <213> 小家鼠 <400> 5 cgcgcccagg tccaactgca gcagcctggg gctgaactgg tggagcctgg gggttcagtg 60 aagctgtcct gcaaq；gcttc tggctacacc ttcaccagtc actggatgca ctgggtgaag 120 cagaggcctg gacaaggcct tgagtggata ggtgagatta atcctagcag cggtcgtaat 180 aactacaatg agaaqfttcaa gagtaaggcc acactgactg tagacaaatc ctccagcaca 240 gcctacatgc aattcagcag cctgacatct gaggactctg cggtctatta ttgtgtaaga 300 tactatggtt acgacgaagc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcg 360 3 201231066 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 6

Arg Ala Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro 15 10 15

Gly Gly Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser His Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu 35 40 45

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Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80

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Tyr Cys Val Arg Tyr Tyr Gly Tyr Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 115 120 <210> 7 <211> 663 <212> DMA <213>小家鼠 <400> 7 ctagccgaca tcgtgatgac acaagctgca ttctccaatc cagtcactct tggaacatca 60 gcttccatct cctgcaggtc tagtaagagt ctcctacata gtaatggcat cacttatttg 120 tattggtatc tgcagaagcc aggccagtct cctcagctcc tgatttatca gatgtccaac 180 cttgcctcag gagtcccaga caggttcagt agcagtgggt caggaactga tttcacactg 240 agaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggtgtttatt actgtgctca aaatctagaa 300 cttccgtaca cgttcggagg ggggaccaag ctggaaataa aacgaactgt ggctgcacca 360 tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 420 tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 480 ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 54〇 agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 600 4 660 201231066 663 tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgt <210> 8 <211> 221 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 8

Leu Ala Asp lie Val Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr 15 10 15

Leu Gly Thr Ser Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu 20 25 30

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Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly 50 55 60

Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80

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Gin Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser 115 120 125

Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 130 135 140

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Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys 165 170 175

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Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu 195 200 205

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 5 201231066 210 215 220 <210> 9 <211> 360 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 9 cgcgccgaag tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttag tgaagcctgg agggtccctg 60 aaactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtagtt atgccctgtc ttgggttcgc 120 cagactccag agaggaggct ggagtgggtc gcatccatta gtggtgttgg tagcacctac 180 tttccagaca gtgtgaaggg ccgtttcacc atgtccagag ataatgccag gaacatcctg 240 tacctccaaa tgagcagtct gaggtctgag gacacggcca tgtattactg tgcaagaggt 300 tctgatgqtt acttctatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcg 360 鼠 u-^ o T家 o 2 R κι 1 p /* <210〉 <211> <212> <213〉 <400> 10

Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro 15 10 15

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Ala Leu Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu 35 40 45

Trp Val Ala Ser lie Ser Gly Val Gly Ser Thr Tyr Phe Pro Asp Ser 50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn lie Leu 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Gly Ser Asp Gly Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 115 120 <210> 11 <211> 660 <212> DNA <213> 小家鼠 6 201231066 <400> 11 ctagccgaca ttgtgctgac tcagtctcct gcttccttag ctgtatctct ggggcagagg 60 gccaccattt catgcagggc cagcaaaagt gtcagtacat ctggctatag ttttatgcac 120 tggtaccaac tgaaaccagg acagccaccc aaactcctca tctatcttgc atccaaccta 180 gaatctgggg tccctqfccag gttcagtggc agtgggtctg ggacagactt caccctcaac 240 atccatcctg tiggaac^agga ggatgctgca acctattact gtcagcacag tagggagttt 300 ccgttaacgt tcggaqgggg gaccaagctg gaaataaaac gaactgtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 <210> 12 <211> 220 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 12

Leu Ala Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser 15 10 15

Leu Gly Gin. Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser 20 25 30

Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Leu Lys Pro Gly Gin 35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn 65 70 75 80 lie His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His 85 90 95

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Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125

Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 201231066 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 鼠 6A家 3 6 N、 1 3 D ^ <210> <211> <212> <213> <400> 13 cgcgccgaag tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttag tgaagcctgg agggtccctg 60 aaactctcct gt'gcagcctc tggattcgct tacagtacct atgacatgtc ttgggttcgc 120 cagactccgg agaagaggct ggagtgggtc gcatacatta gtagtggtgg tgatgccgcc 180 tactatcccg acactgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaatgc caaaaacacc 240 ctatacctgc aaatgagcag tctgaagtct gaggacacag ccatgtatta ctgtgcgagg 300 tctcgctatg gaaactacgg ggacgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360 gtctcg 366 鼠 2 T家 4 2 R N 1 1 p <210> <211〉 <212〉 <213〉 <400> 14

Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro 15 10 15

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Tyr Ser 20 25 30

Thr Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu 35 40 45

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Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr £5 90 95 Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Tyr Gly Asn Tyr Gly Asp Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 115 120 <210〉 15 <211> 660 <212> DNA <213> 小家鼠 <400> 15 ctagccgatg ttgtgatgac acagactcca ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa 60 gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc cttgtacaca gtaatggtaa cacctattta 120 cattggtacc tgcagaagcc aggccagtct ccaaagctcc tgctctacaa agtttccaac 180 cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 240 aagatcagca gagtggagtc tgaggatctg ggagtttatt tctgctctca aaatacacat 300 gtgtacacgt tcggaggggg gacaaagttg gaaataaaac gaactgtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 <210〉 16 <211〉 220 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 16

Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser 1 5 10 15

Leu Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val 20 25 30

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Gin Ser Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 50 55 60

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Lys lie Ser Arg Val Glu Ser Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser 85 90 95

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Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140

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Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 17 <211> 354 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 17 cgcgccgaag tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttag tgaagcctgg agagtccttg 60 aaactctcct gtgcagcctc tggattcgct ttcagttact ctgacatgtc ttgggttcgc 120 cagactccgg agaagaggct ggagtgggtc gcatacatga gtagtgctgg tgatgtcacc 180 ttctattcag acactgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaatgc caagaacacc 240 ctgtatctgc aagtgagcag tctgaagtct gaggacacag ccatatatta ctgtgtaaga 300 caccgggacg tggctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcg 354 <210〉 18 10 201231066 <211> 118 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 18

Arg Ala Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro 15 10 15

Gly Glu Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser 20 25 30

Tyr Ser Asp Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu 35 40 45

Trp Val Ala Tyr Met Ser Ser Ala Gly Asp Val Thr Phe Tyr Ser Asp 50 55 60

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Leu Tyr Leu Gin Val Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala lie Tyr 35 90 95

Tyr Cys Val Arg His Arg Asp Val Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser 115 <210> 19 <211> 660 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 19 ctagccgatg ttgtgatgac ccagactcca ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa 60 gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc cttgtacaca gtaatggaaa cacctattta 120 cattggtacc tgcagaagcc aggccagtct ccaaagctcc tgatctacaa agtttccaac 180 cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 240 aagatcagca gagtqjgaggc tgaggatctg ggagtttatt tctgctctca aagtacacat 300 gttccgacgt tcggt:ggagg caccaagctg gaaatcaaac gaactgtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctqacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcct’gc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 11 201231066 <210> 20 <211〉 220 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 20

Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser 5 10 15

Leu Ala Asp Val 1

Leu Gly Asp Gin 20

Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val 25 30

His Ser Asn Gly 35

Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 40 45

Gin Ser Pro Lys 50

Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 55 60

Val Pro Asp Arg 65

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ί0 75 80

Lys lie Ser Arg

Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser 85 90 95

Gin Ser Thr His 100

Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 105 110

Lys Arg Thr Val 115

Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 120 125

Glu Gin Leu Lys 130

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Phe Tyr Pro Arg 145

Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 150 155 160

Gin Ser Gly Asn

Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 165 170 175

Ser Thr Tyr Ser 180

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 185 190

Glu Lys His Lys 195

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 200 205

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Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 220 12 201231066 <210> 21 <211> 370 <212> DNA <213> 小家鼠 ,<400> 21 ggcgcgccga ggtccaactg caacagtctg ggactgaatt ggtgaagcct ggggcttcag 60 tgatactgtc ctgtaaggcc tctggctaca ccttcaccag ctactggatg cagtgggtga 120 agcagaggcc tggacaaggc cttgagtgga ttggaaatat taatcctagc aatggtggaa 180 ctagtttcaa tgaggagttc aagagtaggg ccacactgac tgtagacaaa tcctccagta 240 cagcctacat gcaactcagc agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat tattgtgcaa 3〇〇 gagacggggg cctttacgac ggatactact ttgacttctg gggccaaggc accactctca 350 cagtctcgag 37〇 <210> 22 <211> 122 <212> PRT <213> 小家鼠 <_> 22

Arg Ala Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro 15 10 15

Gly Ala Ser Val lie Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Trp Met Gin Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Asn lie Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Phe Asn Glu 50 55 60

Glu Phe Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 7 5 80

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Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Leu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 115 120 <210> 23 <211〉 663 <212> DNA <213>小家鼠 13 201231066 <400> 23 gctagccaac attgtgatga cacagtctca caaattcatg tccacattaa taggagccag 60 ggtctccatc acctgcaagg ccagtcagga tgtggatacg gctgtagcct ggtatcaaca 120 gaaaccaggt caatctccta aattattaat ttattgggca tccacccggc acactggagt 180 ccctgatcgc ttcacaggca gtggatctgg gacagatttc tctctcaccg ttagcaatgt 240 gcagtctgag gacttaacag attatttctg tcagcaatat agcagctatc ctctcacgtt 300 cggtgctggg accaagctgg agctgaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt 360 cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa 420 cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa 480 ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac 540 cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca 600 tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aataagcggc 660 cgc 663 <210> 24 <211> 216 <212> PRT <213> 小家鼠 <_> 24

Leu Ala Asn lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Leu 15 10 15 lie Gly Ala Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Asp 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60

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Gin Ser Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr 85 90 95

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Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys 115 120 125 14 201231066

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140

Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn 145 150 155 160

Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 25 <211> 351 <212> DNA <213> 小家鼠 <400> 25 gaagtgcagc tgcagcagtc tggccccgag ctggtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatc 60 tcctgcaccg cctccggcta caccttcacc gactactaca tgaactgggt gaaacagtcc 120 cacggaaagt ccctggaatg gatcggagac atcaacccca acaacggcgg caccaactac 180 aaccagaagt ggaagggcaa ggccaccctg accatccaca agtcctccag caccgcctac 240 atggaactgc ggtccctgac ctccgaggac tccgccgtgt acttctgtgt gcctggcggc 300 ctgcggtcct acttcgatta ctggggccag ggcaccaccc tgacagtctc g 351 鼠 7 h家 6 1 R K-2 1 p 6 2 <210> <211〉 <212> <213> <400>

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys lie Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

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Gly Asp lie Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Trp 50 55 60 15 201231066

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr lie His Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser 115 <210〉 27 <211> 642 <212> DNA <213> 小家鼠 <_> 27 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 642 gacatcgtga tgacccagtc cctgaagttc atgtccgcct ccgtgggcga ccgggtgtcc atcacatgca aggcctccca ggatgtgtct gccgccgtgg cctggtatca gcagaagcct ggccagtccc ccgagctgct gatctactgg gcctctaccc ggcacaccgg cgtgcccgac agattcaccg gctctggctc cggcaccgac tacaccctga ccatctccag cgtgcaggcc gaggacctgg ccctgtacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggcgga ggcaccaagc tggaaatcaa gcggaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc <210> 28 <211〉 214 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 28

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Leu Lys Phe Met Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser Ala Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Glu Leu Leu lie 35 40 45 16 201231066

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Val Gin Ala 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro B5 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 29 <211> 354 <212> DNA <213> 小家鼠 <400〉 29 caggtgcagc tgcagcagcc tggcacagag ctggtgaaac ctggcgcctc cgtgaagctg 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc tcccactgga tgcactgggt gaaacagcgg 120 cctggacagg gcctggaatg gatcggcaac atcaacccct ccaacggcgg caccaactac 180 aacgagaagt tcaagtcccg ggccaccctg accgtggaca aggcctcctc caccgcctac 240 atgcagctgt cctccctgac ctccgaggac tccgccgtgt actactgcgc cagagcctac 300 tacgacttca gttggttcgt gtactggggc cagggcaccc tggtgacagt ctcg 354 <210〉 30 <211> 118 17 201231066 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 30

Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Asn lie Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ala Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Asp Phe Ser Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 31 <211> 639 <212> DNA <213>小家鼠 <_> 31 gatatccaga tgacccagac ctcctccagc ctgtccgcct ccctgggcga cagagtgacc 60 atctcctgcc ggtcctccca ggacatctcc aactacctga actggtatca gcagaaaccc 120 gacggcaccg tgaagctgct gatgtacatc tcccggctgc actccggcgt gccctccaga 180 ttctccggct ctggctccgg caccgagtac tccctgacca tcagcaacct ggaacaggaa 240 gatatcgcta cctacttctg tcagcagggc aacaccctgc ccctgacctt cggcgctggc 300 accaagctgg aactgaagcg gaccgtggcc gctccctccg tgttcatctt cccaccctcc 360 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420 cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa 480 tccgtgaccg agcaggactc caaggacagc acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 540 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 600 tccagccccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgc 639 18 201231066 <210> 32 <211> 213 <212> PRT <213>小家鼠 <_> 32

Thr Gin Thr Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 5 10 15

Asp lie Gin Met 1

Asp Arg Val Thr 20 lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asp lie Ser Asn Tyr 25 30

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Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Met 40 45

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Glu Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Glu Gin Glu 70 75 80

Asp lie Ala Thr

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Phe Gly Ala Gly 100

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Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

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Asp lie Val Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30

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Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

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Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 15 10 15

Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn lie Tyr Ser Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Glu Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 35 40 45

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Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

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Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 41 <211> 345 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 41 gaagtgcagc tgcagcagtc tggcgccgac ctggtgaaac ctggcgcctc cgtgaagctg 60 tcctgcacca cctccggctt caacatcaag gacatcttca tccactgggt gaaagagcgg 120 cccgagcagg gcctggaatg gatcggacgg atcgaccccg ccaacgacaa ccctaagtac 180 gaccccaagt tccagggcaa ggccaccatc tccgccgaca cctccagcaa caccgcctac 240 ctgcggctgt cctccctgac ctctgaggac accgccgtgt actactgcgc tggcggccct 300 gcctacttcg actattgggg ccagggcacc accctgacag tctcg 345 <210> <211> <212> <213〉 <400> 42 24 201231066

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp lie 20 25 30

Phe lie His Trp Val Lys Glu Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Arg lie Asp Pro Ala Asn Asp Asn Pro Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Lys Ala Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

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Ala Gly Gly Pro Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu 100 105 110

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Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Ser lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val lie Ala Ala 20 25 30

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Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

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Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 45 <211> 361 <212> DNA <213> 小家鼠 <400> 45 26 201231066 cgcgccgagg tccaactgca acagtctgga ccagaactgg tgatgcctgg ggcttcagtg 60 aagatatcct gcaagccttc tggctacagc ttcacaagct actatgtaca ctgggtgaag 120 cagaggcctg gacagggact tgagtggatt ggatggattt atcctggaag tggtcatact 180 aagtacaatg agaagttcaa ggacaaggcc acactgacgg cagacacatc ctccagcact 240 gcctacatgc aactcagcag cctaacatct gaggactctg cggtctatta ctgtgcaaga 300 cccccctact atagtiiacta cgccgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcg 360 a 361 <210> 46 <211> 120 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 46

Arg Ala Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Met Pro 15 10 15

Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30

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Tyr Cys Ala Arg Pro Pro Tyr Tyr Ser Asn Tyr Ala Asp Val Trp Gly 100 105 110

Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 47 <211> 678 <212> DNA <213> 小家鼠 <400> 47 ctagccgaca ttgtgatgac tcagtctcca tcctccctga ctgtgacagc aggagagaag 60 gtcactatga gctgcaagtc cagtcagagt ctgttaaaca gtggaaatca aaagaactac 120 ttgacctggt accagcagaa accagggcag cctcctaaac tgttgatcta ctgggcatcc 180 27 201231066 acaagggaat ctggggtccc tgatcgcttc acaggcagtg gatctggaac agatttcact 240 ctcaccatca gcagtgtgca ggctgaagac ctggcagttt attactgtca gagtgattat 300 agttatccgt acacgttcgg aggggggacc aagctggaaa taaaacgaac tgtggctgca 360 ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt 420 gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac 480 gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc 540 tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac 600 gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga 660 gagtgttaat aagcggcc 678 <210> 48 <211> 222 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 48

Leu Ala Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr 1 5 10 15

Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30

Asn Ser Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 45

Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 80

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Gin Ser Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100 105 110

Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 115 120 125

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 160 28 201231066

Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 165 170 175

Lys Asp Ser ThrTyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly 195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 49 <211> 364 <212> DNA <213> 小家鼠 <400〉 49 60 120 180 240 300 360 364 cgcgccgagg tgaagctggt tgagtcagga cctggcctcg tgaaaccttc tcagtctctg tctctcacct gctctgtcac tggctactcc atcaccagtg gtttttactg gacctggatc cggcagtttc caggcaacaa attggaatgg atgggcttca taagctacga tggtagcaat aactacaacc catctctcaa aaatcgaatc tccatcactc gtgacacatc taagaaccag tttttcctga agttgaattc tgtgactact gaggacacag ccacatatta ctgtgcaaga ggcggaggct actatggtaa cctctttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcga <210〉 50 <211> 121 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 50

Arg Ala Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro 15 10 15

Ser Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 30

Ser Gly Phe Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Phe lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Leu Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin 65 70 75 80 29 201231066

Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Leu Phe Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 115 120 <210> 51 <211> 660 <212> DNA <213> 小家鼠 <400> 51 ctagccgata ttgtgatgac tcaaactaca tcctccctgt ccgcctctct gggagacaga 60 gtcaccatca gttgcaggcc aagtcaggac attagcaatt atgtaaactg gtttcagcag 120 aaaccaggtg gaactgttaa gctcctgatc ttccacacat caagattaca ctcaggagtc 180 ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaccctg 240 gaacaggaag atattgccat ttacttttgc caacagggta ttacgcttcc gtggacgttc 300 ggtggcggca ccaagctgga aataaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta ataagcggcc 660 鼠 6 T家 2 1 R \ 5 2 p ^ <210> <211> <212> <213〉 <_> 52

Leu Ala Asp lie Val Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 15 10 15

Leu Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Pro Ser Gin Asp lie Ser 20 25 30

Asn Tyr Val Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gly Thr Val Lys Leu 35 40 45

Leu lie Phe His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 30 201231066

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Thr Leu 65 70 75 80

Glu Gin Glu Asp lie Ala lie Tyr Phe Cys Gin Gin Gly lie Thr Leu 85 90 95

Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val 100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys 115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140

Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn 145 150 155 160

Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 r 215 <210> 53 <211> 358 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 53 cgcgccgagg tgcacfctgaa ggagtcagga cctggcctcg tgaaaccttc tcagtctctg 60 tctctcacct gctctgtcac cggctactcc atcaccagtg cttattactg gaactggatc 120 cggcagtttc caggaaacaa agtggaatgg atgggctaca taggctacga tggtcgtaat 180 acctacaacc catctctcaa aaatcgaatc tccatcactc gtgacacatc taagaaccag 240 tttttcctga aattgaattc tctgactact gaggacacag ccacatatta ttgttcaaga 300 gagggggact acgg-：tactc tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcga 358 <210> 54 <211〉 119 <212> PRT <213>小家鼠 54 <400> 31 201231066

Arg Ala Glu Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro 1 5 10 15

Ser Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr 20 25 30

Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Val 35 40 45

Glu Trp Met Gly Tyr lie Gly Tyr Asp Gly Arg Asn Thr Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Leu Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin 65 70 75 80

Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ser Arg Glu Gly Asp Tyr Gly Tyr Ser Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 115 <210〉 55 <211> 660 <212> DNA <213> 小家鼠 <400> 55 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 ctagccgata ttgtgatgac gcaagctaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga gtcaccgtca gttgcagggc aagtcaggac attaacaatt atttaaattg gtatcagcag aagccagatg gaactgttaa actcctgatc tactacacat caagattaca gtcaggagtc ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga atagattatt ctctcaccat tagcaacctg gagcaggaag attttgtcac ttacttttgc caacagagtg aaacgcttcc gtggacgttc ggtggaggca ccaagctgga gctgaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta ataagcggcc <210> 56

<211> 216 <212> PRT 32 660 201231066 <213>小家鼠 <400> 56

Leu Ala Asp lie Val Met Thr Gin Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15

Leu Gly Asp Arg Val Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Asn 20 25 30

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 35 40 45

Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly lie Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu 65 70 75 80

Glu Gin Glu Asp Phe Val Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Glu Thr Leu 85 90 95

Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val 100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys 115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140

Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn 145 150 155 160

Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 57 <211> 367 <212> DNA <213>小家鼠 33 201231066 <400> 57 cgcgccgagg tgcagctgca gcagtctgga cctgaactgg taaagcctgg ggcttcagtg 60 aagatgtcct gcaaggcttc tggatacaca ttcactagct atcttttgca ctgggtgaag 120 cagaagcctg ggcagggcct tgagtggatt ggatatatta atccttacaa tgatggtgct 180 aagtataatg agaagttgaa aggcaaggcc acactgactt cagacaaatc ctccagcaca 240 gcctacatgg aggtcagcag cctgacctct gaggactctg cggtctatta ctgtgcaaga 300 gagggtgatt acgtgaggta ctatggtatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360 gtctcga 367 <210> 58 <211> 122 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 58

Arg Ala Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro 15 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Leu Leu His Trp Val Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ala Lys Tyr Asn Glu 50 55 60

Lys Leu Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Val Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Val Arg Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 115 120 <210> 59 <211> 675 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 59 ctagccgaca ttgtgctgac tcagtcgcca tcatctctgg ctgtgtctgc aggagaaaag 60 gtcactatga gctgtaagtc cagtcaaagt gttttataca tttcaaatga gaggaattac 120 34 201231066 ttggcctggt accagcagaa accagggcag tctcctaaac tactgatcta ctgggcatcc 180 actaggaaat ctggtgtccc tgatcgcttc acaggcagtg gatctgggac agattttact 240 cttaccatca gcagtgtaaa agctgaagac ctggcagttt attactgtca tcaacacctc 300 tcctcgtaca cgttcggagg ggggaccaag ctggaaatca aacgaactgt ggctgcacca 360 tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 420 tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 480 ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 540 agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 600 tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 660 tgttaataag cggcc 675 <210> 60 <211> 221 <212> PRT <213〉 小家鼠 <400> 60

Leu Ala Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser 15 10 15

Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Val Leu 20 25 30

Tyr lie Ser Asn Glu Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 45

Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser 50 55 60

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70- 75 80

Leu Thr lie Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

His Gin His Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 no lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser 115 120 125

Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 130 135 140

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala 35 201231066 145 150 155 160 Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys 165 170 17 5 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 180 185 190 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu 195 200 205 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210〉 61 <211> 8 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 61

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> 小家鼠 <400〉 62 lie Tyr Pro Gly Ser Arg Ser Thr 1 5 鼠 T家 3 8 R \ 6 1 p <210> <211> <212〉 <213> <400> 63

Cys Thr Arg Asn Gly Asp Tyr Tyr Val Ser Ser Gly Asp Ala Met Asp 15 10 15

Tyr Trp <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 64

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His Trp 1 5 36 201231066 <210> <211> <212> <213> 65 8 PRT 小家鼠 <400> 65 lie Asn Pro Ser Ser Gly Arg Asn 1 5 <210> <211> <212〉 <213> 66 14 PRT 小家鼠 <400> 66

Cys Val Arg Tyr Tyr Gly Tyr Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp 1 5 10 <210〉 <211〉 <212> <213> 67 8 PRT 小家鼠 <400> 67

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> <211> 68 7 <212> <213> PRT 小家鼠 <400> 68 lie Ser Gly Val Gly Ser Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 69 15 PRT 小家鼠 ·· <400> 69

Cys Ala Arg Gly Ser Asp Gly Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 1 5 10 15 <210〉 <211> <212> <213> 70 8 PRT 小家鼠 <400> 70

Gly Phe Ala Tyr Ser Thr Tyr Asp 37 201231066 1 5 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 71 lie Ser Ser Gly Gly Asp Ala Ala 1 5 <210〉 72 <211> 16 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 72

Cys Ala Arg Ser Arg Tyr Gly Asn Tyr Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp 15 10 15 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 73

Gly Phe Ala Phe Ser Tyr Ser Asp 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 74

Met Ser Ser Ala Gly Asp Val Thr 1 5 鼠 T家 5 2 R KJ 7 1 p ^ <210〉 <211〉 <212> <213> <400> Ί5

Cys Val Arg His Arg Asp Val Ala Met Asp Tyr Trp 15 10 <210> 76 <211〉 8 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 76 38 201231066

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 77 lie Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr 1 5 <210〉 78 <211> 16 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 78

Cys Ala Arg Asp Gly Gly Leu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp 15 10 15 <210> 79 <211> 8 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 79

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr 1 5 <210〉 80 <211> 8 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 80 lie Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr 1 5 鼠 T家 1 3 R \ 8 1 p Jo <210〉 <211> <212> <213〉 <400> 81

Cys Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp 15 10 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 82 39 201231066

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His Trp 1 5 <210> 83 <211〉 8 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 83 lie Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr 1 5 氣 tl^ T家 4 4 R \ 8 1 p <210> <211> <212〉 <213> <400> 84

Cys Ala Arg Ala Tyr Tyr Asp Phe Ser Trp Phe Val Tyr Trp 15 10 <210> 85 <211> 8 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 85

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Trp 1 5 <210> 86 <211〉 8 <212> PRT <213>小家鼠 <_> 86 lie Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 87

Ala Arg Trp Gly Asp Gly Ser Phe Ala Tyr 15 10 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> 小家鼠 40 201231066 <400> 88

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 89 <211〉 8 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 89 lie Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr 1 5 鼠 T家 o 6 R K. t—IP/ <210> <211> <212> <213> <400> 90

Cys Ala Arg Lys Gly Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Lys Leu Ala Tyr Trp 1 !5 10 15 <210> 91 <211> 8 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 91

Gly Phe Asn lie Lys Asp lie Phe 1 5 <210> 92 <211> 8 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 92 lie Asp Pro Ala Asn Asp Asn Pro 1 5 <210〉 <211〉

<212〉 <213> <400> 93

Cys Ala Gly Gly Pro Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp 15 10 <210〉 94 <211> 8 <212> PRT <213>小家鼠 41 201231066 <400> 94

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 95 <211> 8 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 95 lie Tyr Pro Gly Ser Gly His Thr 1 5 <210> 96 <211> 14 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 96

Cys Ala Arg Pro Pro Tyr Tyr Ser Asn Tyr Ala Asp Val Trp 15 10 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 97

Gly Tyr Ser lie Thr Ser Gly Phe Tyr 1 5 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 98 lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn 1 5 鼠 T家 9 5 R 、 9 1 p d <210> <211> <212> <213> <400> 99

Cys Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Leu Phe Asp Tyr Trp 15 10 15 <210〉 100 <211> 9

<212> PRT 42 201231066 <213>小家鼠 <400> 100

Gly Tyr Ser lie Thr Ser Ala Tyr Tyr 1 5 <210> <211> 101 7 <212> <213> PRT 小家鼠 <400> 101 lie Gly Tyr Asp Gly Arg Asn 1 5 <210> <211> <212> <213> 102 13 PRT 小家鼠 <400> 102

Cys Ser Arg Glu Gly Asp Tyr Gly Tyr Ser Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 103 8 PRT 小家鼠 <400> 103

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Leu 1 5 <210〉 <211> 104 8 <212> <213> PRT 小家鼠 <400> 104 lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ala 1 5 <210> <211> <212> <213> 105 16 PRT 小家鼠 <400> 105

Cys Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Val Arg Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp 15 10 15 <210> 106 <211> 6 43 201231066 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 106

Gin Asp lie Gly Asn Tyr 1 5 <210> 107 <211> <212> <213> 3 PRT 小家鼠 <A00> 107

Tyr Thr Ser 1 <210> <211> <212> <213> 108 11 PRT 小家鼠 <400> 108

Cys Gin His Tyr Asn Thr Val Pro Pro Thr Phe 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 109 11 PRT 小家鼠 <400> 109

Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly lie Thr Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 110 3 PRT 小家鼠 <400> 110

Gin Met Ser 1 <210> <211> <212> <213> 111 11 PRT 小家鼠 <400> 111

Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe 15 10 <210> 112 44 201231066 <211> 10 . <212> <213> PRT 小家鼠 <400> 112

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 113 3 PRT 小家鼠 <400> 113

Leu Ala Ser 1 <210> <211> <212> <213> 114 11 PRT 小家鼠 <400> 114

Cys Gin His Ser Arg Glu Phe Pro Leu Thr Phe 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 115 11 PRT 小家鼠 <400> 115

Gin Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 116 3 PRT 小家鼠 <400> 116

Lys Val Ser 1 <210> <211> <212> <213> 117 10 PRT 小家鼠 <400> 117

Cys Ser Gin Asn Thr His Val Tyr Thr Phe 15 10 45 201231066 氣 t1g 8 T家 1 1 R 、 1 t—IP/ <210〉 <211> <212> <213> <400> 118

Gin Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 15 10 <210> 119 <211〉 3 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 119

Lys Val Ser 1 鼠 0 T家 2 o R \ 1 <—I Cu /* <210> <211> <212> <213〉 <400> 120

Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Thr Phe 15 10 <210〉 121 <211> 6 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 121

Gin Asp Val Asp Thr Ala 1 5 <210〉 122 <211〉 3 <212> PRT <213> 小家鼠 <400〉 122

Trp Ala Ser 1

<210> <211> <212> <213> <400>

Cys G 46 201231066 <210> 124 <211> 6 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 124

Gin Asp Val Ser Ala Ala 1 5 <210> 125 <211> 3 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 125

Trp Ala Ser 1 <210> 126 <211> 11 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 126

Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe 15 10 <210> 127 <211> 6 <212> PRT <213> 小家鼠 <400〉 127

Gin Asp lie Ser Asn Tyr 1 5 <210> 128 <211> 3 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 128

Tyr lie Ser 1 <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 129

Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Leu Thr Phe 15 10 47 201231066 <210> 130 <211〉 6 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400> 130 Gin Asn i Val Gly Thr Ala 1 5

<210> 131 <211> 3 <212> PRT <213> 小家鼠 <_> 131

Ser Thr Ser 1 <210> 132 <211> 11 <212〉 PRT <213> 小家鼠 <400> 132

Cys Gin Gin Tyr Arg Ser Tyr Pro Phe Thr Phe 15 10 <210> 133 <211> 6 <212> PRT <213〉 小家鼠 <400> 133 Glu Asn l He Tyr Ser Asn 1 5 <210〉 134 <211> 3 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 134 Ala Ala 1 Thr <210> 135 <211> 11 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 135

Cys Gin His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr Phe 201231066 1 5 <210> 136 <211> 6 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 136 Gin Asp Val lie Ala Ala 1 5

<210> 137 <211> 3 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 137

Trp Ala Ser 1 <210> 138 <211> 11 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 138

Cys Gin Gin His 1 <210〉 139 <211> 12 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 139

Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe 5 10

Gin Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 140 <211> 3 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 140

Trp Ala Ser 1 <210> 141 <211> 11 <212> PRT <213> 小家鼠 <400〉 141 49 201231066 1 5 <210> 142 <211〉 6 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 142 Gin Asp * lie Ser Asn Tyr 1 5

Cys Gin Ser Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe

<210> 143 <211> 3 <212> PRT <213>小家鼠 <_> 143

His Thr Ser 1 <210> 144 <211> 11 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 144

Cys Gin Gin Gly lie Thr Leu Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 145 <211> 6 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 145 Gin Asp 〉lie Asn Asn Tyr 1 5 <210> 146 <211> 3 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 146 Tyr Thr 1 • Ser <210> 147 <211> 11 <212〉 PRT <213> 小家鼠 <400〉 147 50 201231066 - Cys Gin Gin Ser Glu Thr Leu Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 148 12 PRT 小家鼠 <400> 148

Gin Ser Val Leu Tyr lie Ser Asn Glu Arg Asn Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 149 3 PRT 小家鼠 <400> 149

Trp Ala Ser 1 <210> 150 <211〉 <212> <213> 10 PRT 小家鼠 <400> 150

Cys His Gin His Leu Ser Ser Tyr Thr Phe 15 10 51

Claims (1)

1. 201231066 - 七、申請專利範圍： 1. 一種重組抗體組成物，其中至少一種不同抗HER抗 體分子結合第一 HER家族受體之抗原且至少一種不同抗 HER抗體分子結合第二HER家族受體之抗原。 2. 如申請專利範圍第1項之抗體組成物，其中至少一種 不同抗HER抗體分子結合第三HER家族受體之抗原。 3. 如申請專利範圍第1項之抗體組成物，其中至少一種 不同抗HER抗體分子結合第一 HER家族受體之抗原且至少 兩種不同抗HER抗體分子結合第二HER家族受體之抗原。 4. 如申請專利範圍第1及3項之抗體組成物，其中至少 兩種不同抗HER抗體分子結合第一 HER家族受體之抗原且 至少兩種不同抗HER抗體分子結合第二HER家族受體之抗 原。 5. 如申請專利範圍第1及3至4項中任一項之抗體組成 物，其中該第一及第二HER家族受體為EGFR及HER2或 反之亦然。 6. 如申請專利範圍第1及3至4項中任一項之抗體組成 物，其中該第一及該第二HER家族受體為EGFR及HER3 或反之亦然。 7. 如申請專利範圍第1及3至4項中任一項之抗體組成 物，其中該第一及該第二HER家族受體為HER2及HER3 或反之亦然。 8. 如申請專利範圍第2項之抗體組成物，其中至少一種 不同抗HE‘:R抗體分子結合第一 HER家族受體之抗原，至少 201231066 一種不同抗HER抗體分子結合第二HER家族受體之抗原， 且至少兩種不同抗HER抗體分子結合第三HER家族受體之 抗原。 9.如申請專利範圍第8項之抗體組成物，其中至少一種 不同抗HER抗體分子結合第一 HER家族受體之抗原，至少 兩種不同抗HER抗體分子結合第二HER家族受體之抗原， 且至少兩種不同抗HER抗體分子結合第三HER家族受體之 抗原。 1 0.如申請專利範圍第9項之抗體組成物，其中至少兩 種不同抗HER抗體分子結合第一 HER家族受體之抗原，至 少兩種不同抗HER抗體分子結合第二HER家族受體之抗 原，且至少兩種不同抗HER抗體分子結合第三HER家族受 體之抗原。 1 1.如申請專利範圍第2項之抗體組成物，其中該第 一、第二及第三HER家族受體為EGFR及HER2及HER3、 EGFR 及 HER3 及 HER2、HER2 及 EGFR 及 HER3、HER2 及 HER3 及 EGFR、HER3 及 EGFR 及 HER2、或 HER3 及 HER2 及 EGFR。 12.如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體組成 物，其中該等不同抗HER抗體分子結合該等受體上之不重 疊抗原決定基。 1 3 .如申請專利範圍第1至1 2項中任一項之抗體組成 物，其中該等抗體分子為具有鼠類可變鏈及人類恆定鏈之 嵌合抗體。 201231066 . I4·如申請專利範圍第13項之抗體組成物，其中該等人 類怪疋鍵為IgGl或igG2。 15. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之抗體組成 物’其中至少一種抗體分子為人類化抗體。 16. 如申請專利範圍帛i至12項中任_項之抗體組成 物’其中至少一種抗體分子為人類抗體。 17. 如申請專利範圍第丨至16項中任—項之抗體組成 物，其中該至少兩種不同抗EGFR抗體分子選自由能夠抑制 具有以下抗體之CDR之抗體的結合及/或與具有以下抗體 之CDR之抗體結合相同抗原決定基的抗體組成之群：992、 1024 、 1030 、 1254 、 1277 及 1565 。 1 8.如申請專利範圍第1 7項之抗體組成物，其中該至少 兩種不同抗EGFR抗體分子選自由具有以下抗體之cdr之 抗體組成的組合之群：992+1030、992+1024、1024 + 1030、 1030+1254、 1030+1277、 1030+1565、 1254+1277、 1254+1565 及 1277+1565 。 19. 如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體組成 物，其中該至少兩種不同抗HER2抗體分子選自由能夠抑制 具有以下抗體之CDR之抗體的結合及/或與具有以下抗體 之CDR之抗體結合相同抗原決定基的抗體組成之群： 4382 、 4384 、 4385 、 4517 及 4518 。 20. 如申請專利範圍第19項之抗體組成物，其中該至少 兩種不同抗HER2抗體分子選自由具有以下抗體之CDR之 抗體組成的組合之群：4382+4384、4382 + 4385、4382+45 17、 201231066 43 82 + 45 1 8、43 84 + 43 85、43 84+4517' 43 84+4518、43 85 + 45 17 及 4385+4518 » 2 1.如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體組成 物，其中該至少兩種不同抗HER3抗體分子選自由能夠抑制 具有以下抗體之CDR之抗體的結合及/或與具有以下抗體 之CDR之抗體結合相同抗原決定基的抗體組成之群： 4785 、 5038 ' 5082 及 5096 〇 22·如申請專利範圍第2 1項之抗體組成物，其中該至少 兩種不同抗HER3抗體分子選自由具有以下抗體之CDR之 抗體組成的組合之群：4785 + 5038、4785 + 5082、4785 + 5096、 5038+5082 、 5038+5096 及 5082+5096 。 23. 如申請專利範圍第1至22項中任一項之抗體組成 物，其中該抗體組成物選自由具有以下抗體之CDR之抗體 組 成的組合之群 ：992+1024+4785+5082 、 992+1024+4382+4385+4518 、 992+1024+4382+4385+4518+4785+5082 、 4382+4385+4518+4785+5082 、 1565+4517+5082 、 1277+4517+5082 、 1277+4384+5038 、 1277+4384+5082 、 1277+1565+5038+5082 、 1277+1565+4384+4517 、 4384+4517+5038+5082 、 1277+4384+4517+5082 、 1277+4384+4517+5038 、 1277+1565+4384+4517+5038+5082 、 及 1277+1565+4385+4518+5038+5082 ° 24. 如申請專利範圍第1至16項中任一項之抗體組成 201231066 » - 物’其中該組成物包含至少一種具有來自1254、1277或1565 之CDR或能夠抑制1254、1277或1565之結合及/或與 1254、1277或1 565結合相同抗原決定基的抗EGFr抗體； 至少一種具有來自4384、4385、4517或4518之CDR或能 夠抑制4384、4385、4517或4518之結合及/或與4384、4385、 4517或4518結合相同抗原決定基的抗HER2.抗體；及至少 一種具有來自5038或5082之CDR或能夠抑制5038或5〇82 之結合及/或與503 8或5 082結合相同抗原決定基的抗HER3 抗體。 2 5 .如4 β月專利範圍第2 4項之抗體組成物，其中該抗體 組成物包含兩種針對EGFR、HER2及HER3中每一者之抗 體，其中該等抗EGFR抗體具有來自1277 + 1565或 1254+1565 之 CDR，或能夠抑制 1277+1565 或 1254 + 1565 之釔合及/或與1277+1565或1254+15 65結合相同抗原決定 基；該等抗HER2抗體具有來自4384 + 45 17或4385+4518 之CDR，或能夠抑制43 84+4517或4385+45 18之結合及/或 與4384 + 4517或4385+4518結合相同抗原決定基；且該等 抗HER3抗體具有來自5〇38 + 5〇82之CDr，或能夠抑制 5038 + 5082之結合及/或與5〇38 + 5()82結合相同抗原決定基。 26. 如_請專利範圍第25項之抗體組成物，其中該抗體 組成物包含具有抗體1277+1565+4384 + 45 17 + 5〇38 + 5〇82之 CDR的抗體’或能夠抑制該等抗體之結合及/或與該等抗體 結合相同抗原決定基的抗體。 27. 如申請專利範圍第25項之抗體組成物，其中該抗體 201231066 組成物包含具有抗體1277+1565+4385 + 4518 + 5038 + 5082之 CDR的抗體’或能夠抑制該等抗體之結合及/或與該等抗體 結合相同抗原決定基的抗體。 28. 如申請專利範圍第丨至27項中任一項之抗體組成 物’其中該4不同抗體分子製備成用於同時、連續或分開 投予。 29. 如申請專利範圍第i至28項中任一項之抗體組成 物’其中向人類或其他哺乳動物個體投予該組成物引起受 體内化。 30. 如申請專利範圍第丨至29項中任一項之抗體組成 物’其中該組成物能夠抑制癌細胞系A43 INS、NCI-N87、 MCF7、HCC202 ' BT474、MDA-MB-175、HN5、NCI-H292、 DU145、MDA-MB-468、SKRB-3、H358、OE19、H82 0、A549、 OVCAR-8及H1975之生長及增殖。 3 1. —種免疫結合物，其包含如申請專利範圍第}至3〇 項中任一項之重組抗體組成物結合於抗癌劑。 32. 如申請專利範圍第3丨項之免疫結合物，其中該抗癌 劑選自由細胞毒性劑、細胞激素、毒素及放射性核種組成 之群。 33. —種核酸分子，其包含編碼如申請專利範圍第丨至 30項中任一項之組成物中之抗體分子的核苷酸序列。 34. —種表現載體，其包含如申請專利範圍第33項之核 酸分子。 35·—種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第33項之核 201231066 酸分子或如中請專利範圍第 細胞能夠表現由該核酸分子 36·—種製造抗體之方法 關注抗體之如申請專利範圍彳

   如申請專利範圍第 第34項之表現載體，其中該宿主 子編碼之抗體。 法’其包含提供許多能夠表現所 圍第35項之宿主細胞，在適於表 下培養該等宿主細胞，及分離所 36項之方法’其中在分開之生物

   反應器中培養該等宿主細 3 8.如申請專利範圍第 應器中培養該等宿主細胞。 39.—種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第:1至30 項中任項之抗體組成物或如申請專利範圍第Η項或第Μ 項之免疫結合物，及醫藥學上可接受之載劑。 40·一種治療人類或其他嗜乳動物之癌症的方法，該方 法。3向Α哺乳動物投予有效量之如申請專利範圍第1至

   41. 一種治療對用抗體及/或TKI治療具有後天抗性之 人類或其他哺乳動物之癌症的方法，該方法包含向該哺乳 動物投予有效量之如申請專利範圍第丨至30項之抗體組成 物或如申請專利範圍第31項或第32項之免疫結合物或如 申請專利範圍第39項之醫藥組成物。 42. 一種用作醫藥品的如申請專利範圍第1至30項中任 一項之抗體組成物或如申請專利範圍第3 1項或第32項之 201231066 免疫結合物或如中請專利範圍第39項之醫藥組成物。 43. 種用於治療癌症的如申請專利範圍第丄至項中 任-項之抗體組成物或如申請專利範圍第31項或第32項 之免疫結合物或如巾請專利範圍第39項之醫藥組成物。 44. -種用於治療特徵在於腿依賴性之病症的如申請 專利la圍第1至3G項中任—項之抗體組成物或如_請專利 範圍第31項或第32項之免疫結合物或如中請專利範圍第 39項之醫藥組成物。 45·-種用於治療對用抗體及/或m治療具有後天抗 性之人類或其他哺乳動物之癌症的如申請專利範圍帛】至 3 0項中任一項之抗體組成物或如申請專利範 32項之免疫結合物或如申請專利範圍第刊 物。 圍第3 1項或第 項之醫藥組成 “·-種如申請專利範圍第㈣項中任一項之抗體組 成物或如申請專利範圍第31項或第32項之免疫結合物或 如申請專㈣圍第39項之醫藥組成物的用途，其係用於製 造用於治療癌症之醫藥品。 47.-種如巾請專利範圍第i至3()項中任—項之抗體組 成物或如中請專利範圍第31項或第32項之免疫結合物或 士申。月專利範圍第39項之醫藥組成物的用途，豆係用於製 造用於治療特徵在於HER依賴性之病症之醫華、 级-種醫藥製品，其包含呈用於在癌症療法中同時、 :開或連續投予的組合之如申請專利範圍第項中任 一項之抗體組成物或如申請專利範圍帛3ι項或第Μ項之 201231066 » '免疫結合物或如中請專利範圍帛39項之醫藥組成物及至少 一種化學治療性或抗贅生性化合物。 49. 如申請專利範圍第48項之醫藥製品，其中該抗贅生 性化合物選自由視黃酸、苯基丁酸鹽、全反式視黃酸及活 性形式維生素D組成之群。 50. 如申請專利範圍第48項之醫藥製品，其中該化學治 療性化合物選自由以下組成之群：烷基化劑，例如鉑衍生 物諸如順翻（cisplatin )、卡链（carb〇piatin )及/或奥賽 力鉑（oxahplatin );植物生物鹼，例如太平洋紫杉醇 (pachtaxel )、多西他賽（d〇cetaxel )及/或伊立替康 (lrinotecan );抗腫瘤抗生素，例如小紅莓（d〇x〇ruMcin ) (阿德力黴素（adriamycin ))、道諾黴素（daunorubicin )、 表柔比星（epirubicin )、伊達比星米托蒽醌（idarubicin mitoxantrone )、更生徽素（dactinomycin )、博萊黴素 (bleomycin )、放線菌素（actinomycin )、藤黃徽素 (luteomycin )及/或絲裂黴素（mitomycin ):拓撲異構酶 抑制劑’諸如拓朴替康（topotecan);及/或抗代謝物，例 如氟尿嘧啶及/或其他氟嘧啶。 八、圖式： (如次頁）