BR112013010718A2 - composição de anticorpo pan-her, composição farmacêutica, método para produção e uso da referida composição - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO PAN-HER. A presente invenção é dirigida para terapêuticos melhorados contra receptores dentro da família EGFR/ErbB/HER que mais amplamente interfere com múltiplos membro da família HER (inibição de pan-HER). Mais particularmente, a invenção é dirigida para uso de composição de anticorpos para terapia de câncer de ser humano. Estudos in vitro mostraram que a composição de anticorpos da invenção alvejando múltiplos receptores da família HERs são superiores à composição de anticorpos alvejando somente um receptor da família HER.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÃO DE ANTICORPO PAN-HER, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉ- TODO PARA PRODUÇÃO E USO DA REFERIDA COMPOSIÇÃO".

CAMPO DA INVENÇÃO 5 A presente invenção refere-se a novos anticorpos recombinantes visando a família de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) e composições compreendendo dois ou mais desses anticorpos para uso em terapia de câncer de ser humano.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A família do receptor de fator de crescimento epidérmico (família EGFR ou ErbB/HER) é um subgrupo do receptor tirosina quinases (RTKs) e consiste de quatro elementos: EGFR/ErbB, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3 e HER4/ErbB4. Os elementos da família EGFR são glicoproteínas de cadeia modular intimamente relacionada com uma região de ligação de ligante ex- tracelular, um domínio único de transmembrana e uma tirosina quinase in- tracelular. Em configurações fisiológicas normais, a família ErbB regula os eventos chave em coordenação de crescimento de célula, diferenciação e migração. Acredita-se que EGFR, HER2 e HER3 desempenham papéis cru- ciais na transformação malígna de células normais e no crescimento contí- nuo de células de câncer. Descobriu-se que EGFR e HER2 são sobre ex- pressados por muitos cânceres epiteliais. A sobre-expressão de EGFR e HER2 tem além do mais sido ligada ao progresso da doença, sobrevivência reduzida, resposta deficiente e resistência à quimioterapia em diversos cân- ceres epiteliais de ser humano. O papel de HER4 em transformação malígna e progresso do câncer é controvertido e não será mais discutido aqui. EGFR e HER2 são alvos de câncer válidos e ambos, anticorpos monoclonais e inibidores de moléculas pequenas da tirosina quinase delas, têm sido aprovados para o tratamento de vários cânceres. HER3 está atual- mente sendo explorado como um alvo terapêutico em potencial. Entretanto, pacientes que inicialmente respondem a essas terapias muitas vezes têm recaída devido ao desdobramento da resistência adquirida. Pontos de pes- quisa pré-clínica para o envolvimento de um ou ambos os receptores não alvejados no desenvolvimento de resistência. Desse modo, parece que os receptores de ErbB têm a capacidade de substituir um ao outro, a fim de manter a sinalização estimuladora do crescimento e um fenótipo maligno.

Alvejando simultaneamente dois ou todos os três receptores poderá desta maneira ser uma maneira mais eficiente de inibir células de câncer com de- 5 pendência da família ErbB.

EGFR é uma glicoproteína de superfície da célula de 170 kDa consistindo em uma cadeia de polipeptídeo única de 1186 resíduos de ami- noácido como originalmente determinado e descrito por clonagem e sequen- ciamento de cDNAs de ser humano de uma linha de células de carcinoma vulvar de ser humano.

EGFR contem três domínios principais: um domínio extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio intracelular con- tendo a tirosina quinase.

A atividade catalítica de EGFR reside no domínio de tirosina quinase (resíduo 685-953) e é ativada mediante ligação de ligan- te. 0 EGFR existe em duas conformações diferentes, a saber uma conformação amarrada (fechada) e uma conformação prolongada (aberta). 0 receptor se desloca entre as duas conformações.

No domínio de confor- mação amarrada ll e IV da região extracelular de EGFR interage, deixando o receptor em um estado autoinibido.

Além disso, o domínio III é mantido em uma distância significativa do domínio I, dessa maneira ligar EGF a ambos os domínios, simultaneamente, é impossível.

Na conformação prolongada de EGFR, os domínios I, II e Ill estão estericamente dispostos em uma forma de C , dando espaço para a ligação EGF.

Além do mais, as mudanças confor- macionais induzem a exposição de um 1 3 -hairpin consistindo em uma região de resíduo 20 no domínio II, também conhecida como o "braço de dimeriza- cão". O braço de dimerização de estende do domínio II do EGFR faz conta- tos extensos com o domínio II de outro EGFR, desta maneira formando um homodímero de EGFR.

Dimerização traz os domínios de tirosina quinase citoplásmica ativos dos receptores perto o suficiente para fosforilação dos resíduos de tirosina nas regiões reguladoras dos receptores.

Além do mais, as regiões de justamembrana dos dois receptores formam um dímero antiparalelo que foi descobertoser importantena estabilizaçãodo dímero de tirosina quinase.

O mecanismode dimerização"mediada por receptor"é único para a família ErbB em comparaçãoa outros receptoresde tirosina quinase em que dime- rização "mediadapor ligante"é o tema mais comum. 5 U m número de modos de ativação do domínio de tirosina quina- se intracelularde EG FR, tem sido sugerido.Ao contrário de outros recepto- res de tirosinas quinases,o domínio de tirosina quinase de EGFR como pa- drão adota um a conformaçãonormalmenteobservadasomenteem quinases fosforiladas e ativadas.

Isto indica que o domínio de quinase de EGFR é constitutivamenteativo.

Regulagemde um a tirosina quinase constitutivade- veria, assim, ocorrer através da distribuiçãode uma região de reguladorde terminal C de parceiro de dimerizaçãopara trans-fosforilação.Outra possibi- lidade é que a ativação do domínio de tirosina quinase envolve deslocamen- to de interações inibidorasque não foram visualizadasem estudos cristalo- gráficos.

Entretanto,as análises da estrutura de cristal da juxtamembranae tirosina quinase de EGFR têm reveladoque um dímero assimétricode tirosi- nas quinases formado mediante dimerização de dois EGFRs é importante para a regulagem da atividade de tirosina quinase.

Nesse homodimeroas- simétrico um a das tirosinas quinases desempenhao papel do receptor en- quanto a outra tirosina quinase desempenhao do doador.

Somenteo recep- tor do domínio de quinase tem atividade catalítica e prosseguepara os resí- duos de tirosina fosforiladosna cauda do terminal C do receptor(quer em cis ou trans, ou ambos são descohecidos). A endocitose mediada por clatrina 6 . o mais importante meca- nismo de regulagem negativa de EG FR.

O destino de EGFR depende da estabilidadedo complexo ligante-receptor.Após a ligação de EG F ao EGFR o homodímeroEGFR é direcionado rapidamentepara poços revestidospor clatrina e internalizadopor endocitoseinduzida pelo ligante.

Simultaneamen- te, EGFR é fortementeubiquitinadopela anexaçãode ambos monoubiquitina e poliubiquitina.A ubiquitina ligase C bl 6 . responsávelpela ubiquitinaçãodo EG FR.

C bl se liga, direta ou indiretamenteatravés de um a proteína adapta- dora, como Grb2 aos resíduos de tirosina fosforilados na região reguladora do EGFR.

A ligação de Cbl a EGFR por meio de Grb2 é necessária para a internalização do receptor.

Esp15 também desempenha um papel na inter- nalização de EGFR.

O papel exato de Esp15, entretanto, é ainda controver- so.

A ubiquitinação está envolvida na regulação negativa endocitática do 5 EGFR e classificação endossomal de EGFR para os lisossomas.

As cadeias de ubiquitina são reconhecidas pelo complexo de classificação endossomal requerido para transporte (ESCRT) e os Hrs/Stam, que retém proteínas ubi- quitinadas na membrana de endossomos iniciais, impedindo assim a recicla- gem do EGFR.

Subsequentemente, EGFR é classificada em vesículas intra- luminais (ILVS) que leva a entrega de EGFR para o endossomo tardio e, finalmente, degradação nos lisossomos.

Em contraste com a degradação do EGFR quando ligados a EGF, a ligação TGF-a permite a reciclagem do receptor.

Os ligantes TGF-a dissociam-se rapidamente de EGFR no endossomo inicial devido ao ambien- te ácido, levando A defosforilação do receptor, de-ubiquitinação e, assim, a reciclagem do receptor de volta para a superfície da célula.

Ligação EPR a EGFR tem o mesmo efeito sobre a classificação endocitótica do EGFR como o TGF-a.

HB-EGF e BTC ambos visam todos os EGFRs para a degradação lisossomal enquanto AR causa reciclagem rápida bem como lenta de EGFR.

Receptor de Fator de Crescimento epidérmico humano 2 (HER2, ErbB2 ou Neu) foi descrito, pela primeira vez, em 1984 por Schechter et al.

HER2 consiste de 1234 aminoácidos e é estruturalmente semelhante a EG- FR com um domínio extracelular consistindo de quatro subdomínios I-IV, um domínio de transmembrana, um domínio de juxtamembrana, uma tirosina quinase citoplasmática intracelular, e um domínio regulador de terminal C . O contacto de domínio II-IV, que restringe o arranjo de domínio no EGFR amarrado está ausente em HER2. Três dos sete resíduos conser- vados, importantes para estabilizar a corrente no EGFR inativado, são dife- rentes em HER2. HER2, portanto, se assemelha a EGFR em sua forma es- tendida (aberta) com o braço de dimerização exposto e aparentemente pron- to para conduzir interações receptor-receptor.

A ausência de uma conforma- cão de HER2 amarrada indica que o receptor não tem autoinibição como visto para os outros elementos da família ErbB.

Uma interface estável de subdominio I-Ill parece manter HER2 na configuração estendida semelhante à configuração estendida do complexo de EGFR-EGF.

A interação entre os domínios I e Ill envolve regiões correspondentes aos locais de ligação de 5 ligantes em domínios I e Ill do EGFR, não deixando qualquer espaço esteri- camente para ligantes, tornando HER2 incapaz de ligação de ligantes.

Do- mínios II e IV formam duas interfaces distintas que estabilizam a formação de heterodímeros de HER2 e outro elemento da família ErbB.

Estudos biofísicos falharam em detectar a homodimerização de HER2 significativa em solução ou em cristais.

Os resíduos de domínio ll de EGFR e HER2 são semelhantes.

Entretanto, Arg285 na interface do dímero não é conservado entre EGFR e HER2. Em HER2 resíduo 285 é Leu.

Estu- dos de mutação indicam que Leu nesta posição é parcialmente responsável pela ausência de homodimeros HER2 em solução.

A dimerização de HER2 intacto in vivo pode necessitar de interações adicionais de locais no domínio de transmembrana de HER2. HER2 é o único elemento da família ErbB que não liga ligantes conhecidos.

HER2 é, ao contrário, ativado através da formação de comple- xos heteroméricos com outros elementos da família ErbB e, assim, indireta- mente, regulados por ligantes EFGR e HER3. HER2 é o parceiro de hetero- dimerização preferencial dos três outros receptores ErbB.

HER2 aumenta a afinidade dos outros receptores ErbB para os seus ligantes, diminuindo a taxa de dissociação de complexo ligante-receptor, em que HER2 aumenta e prolonga sinalização.

A capacidade de HER2 de aumentar a afinidade de ligante de outros receptores ErbB podem refletir o comportamento promís- cuo de HER2 como um parceiro de heterodimerização.

Heterodimerização de HER2 e outro receptor de ligado por ligante da família ErbB induz fosfori- lação cruzada, conduzindo A fosforilação dos resíduos de tirosina do termi- nal-C.

O heterodímero HER2 mais ativo é o complexo HER2-HER3. HER2 complementa HER3 deficiente em quinase fornecendo uma quinase ativa.

Em contraste com EGFR, HER2 é resistente à internalização quando sobrexpressado.

A sobre-expressão de HER2 foi ainda relatada por inibir a endocitose dos outros elementos da família ErbB.

Dois mecanismos pelos quais HER2 escapa a degradação lisossomal e deste modo permane- ce na membrana de plasma têm sido sugeridos.

Ou HER2 evita internaliza- ção ou torna-se eficiente reciclado de endossomos de volta para a membra- 5 na plasmática.

Estudos que utilizam anticorpos rotulados revelaram que HER2 está constantemente internalizado e reciclado.

Outros estudos em contraste não conseguiram identificar HER2 intracelulares em células trata- das com compostos que inibem a reciclagem.

Tem sido proposto que o terminal carboxila de HER2 não possui todos os sinais necessários para a internalização ou que contém um sinal inibidor essencial para a endocitose mediada por clatrina.

Adicionalmente, estudos têm demonstrado que heterodímeros HER2 não são liberados aos endossomas.

Um local de encaixe de Cbl como o encontrado em EGFR foi também identificado em HER2 (Y1112). Assim, Cbl pode ser recrutado para HER2, levando 6 ubiquitinação de HER2, mas a eficiência de ligação real de Cbl não é clara.

Tem sido proposto que HER2 é resistente A internalização devido á sua associação com saliências de membrana.

Finalmente, outros estudos mostraram que a resistência à endocitose de heterodímeros HER2- EGFR está associada com a formação ineficiente, induzida por EGF, de po- ços revestidos com clatrina.

O terceiro elemento da família ErbB, conhecido como receptor humano de fator de crescimento epidérmico 3 (HER3, ErbB3) foi identificado em 1989 por Kraus M . H . etal.

O gene HER3 codifica uma proteína de 1342 aminoácidos com semelhanças estruturais notáveis com EGFR e HER2. Re- cursos como tamanho total, quatro subdomínios extracelulares (I-IV), com dois grupos de cisteína (domínios ll e IV), e um domínio de tirosina quinase mostram semelhanças estruturais a EGFR e HER2. O domínio de tirosina quinase de HER3 mostra 59% de homologia de sequência com domínio de tirosina quinase de EGFR.

Assim como EGFR, HER3 existe em uma conformação amarra- da e em uma conformação estendida.

Na conformação amarrada o braço de dimerização é enterrado por interações com domínio IV, deixando os domí-

nios I e Ill muito longe para ligação eficiente do ligante. Ligação de ligante aos domínios extracelulares I e Ill, ocorre na conformação estendida de HER3 e conduz à heterodimerização com outros elementos da família ErbB. Nenhum homodímeros HER3 é formados por ligação de ligante. A molécula 5 de HER3 estendida e ligada por ligante, preferivelmente, heterodimeriza com HER2. Ao contrário de EGFR e HER2, a tirosina quinase de HER3 pre- judicou a atividade catalítica insuficiente para qualquer resposta biológica detectável. Dois resíduos de aminoácidos, que são altamente conservados nos domínios catalíticas de quinases de proteína, são alterados no domínio catalítico de HER3. Estes são a substituição de asparagina por ácido aspár- tico no resíduo 815 e substituição de histamina por de glutamato no resíduo

740. As duas substituições de aminoácidos podem ser o motivo por que HER3 carece de atividade catalítica de seu domínio de tirosina quinase. De- vido A atividade de quinase intrínseca diminuída de HER3 o receptor precisa heterodimerizar com outro elemento da família ErbB de modo a responder à sua própria ligação de ligante. Pouco se sabe sobre a endocitose de HER3. Além disso, dife- rentes estudos sugeriram que HER3 é endocitose prejudicada na mesma extensão como HER2. De acordo com isto, foi descoberto que o complexo HER3-NRG1 é internalizado com menos eficiência e mais lentamente do que o complexo EGFR-EGF, apoiando a ideia de que HER3 não está sujeita a endocitose tão eficientemente como EGFR. Entretanto, quando a cauda do terminal C do EGFR foi substituída com a cauda do terminal C de HER3, EGFR tornou endocitose prejudicada, sugerindo que a região do terminal C de HER3 protege o receptor contra internalização. Também tem sido sugeri- do que NRG1 não eficientemente mira HER3 à degradação devido A disso- ciação dos complexos ligante-receptor em endossomos, como é observado quando EGF é ativado por TGFa. Visar a família ErbB tem sido intensamente perseguido na última década como uma estratégia de tratamento de câncer. Diferentes modalida- des de tratamento têm sido explorados tais como inibidores de tirosina qui-

nase (TKI), anticorpos monoclonais (mAbs) e armadilhas de ligantes.

Uma vantagem de anticorpos monoclonais para tratamento de câncer é a especi- ficidade do alvo, garantindo uma baixa toxicidade em comparação com qui- mioterapia citotóxica convencional do câncer.

Anticorpos monoclonais foram 5 aprovados para o tratamento de tumores sólidos com níveis anormalmente elevados de EGFR e HER2, e numerosos mAbs visando EGFR HER2 estão em ensaios clínicos.

Receptores de inibidores TKI sinalizam através da liga- cão ao local de ligação do ATP no domínio da tirosina quinase de EGFR e HER2. Erlotinib/Tarceva ® inibe a tirosina quinase de EGFR, enquanto lapa- tinibffykerb 0 inibe tirosinas quinases, tanto de EGFR e HER2. Ambos erlo- tinib e laptinib são TKIs aprovados pela FDA para uso no tratamento de cân- cer de pulmão não pequenos (NSCLC) e câncer de mama metastático com superexpressão de HER2, respectivamente.

Entretanto, apesar da utilidade clínica da terapêutica de anticor- po monoclonal e inibidores de tirosina quinase (TKIs), o desenvolvimento de resistência adquirida ao tratamento é um problema crescente.

Terapia com- binatória de mAbs e quimioterapia citotóxica convencional é uma das abor- dagens que estão sendo realizadas a fim de aumentar a eficácia do trata- mento.

Além disso, várias estratégias estão sendo exploradas para aumen- tar a eficácia dos anticorpos monoclonais, incluindo o reforço das funções efetoras e armamento direto e indireto dos anticorpos com radionuclídeos ou toxinas.

Outra estratégia é combinações de Acms contra diferentes alvos.

A justificativa científica para a dupla inibição dos receptores ErbB é construída sobre uma série de estudos pré-clínicos in vitro e in vivo que resultaram em atividade antitumoral superior, utilizando uma abordagem ErbB dupla ao invés de visar um receptor único.

Direcionamento simultâneo de múltiplos epítopos de EGFR e HER2 por misturas de anticorpos mono- clonais provou ser superior a mAbs in vitro e in vivo (Friedman et al., PNAS 2005, 102:1915-20), e a combinação entre a TKI gefitinib, e os dois mAbs trastuzumab e pertuzumab forneceram eficácia antitumoral significativamen- te melhorada em comparação com qualquer agente único em camundongos portadores de tumores de xenoenxerto de células de câncer de mama com superexpressão de HER2 (Alpino et ai., J Natl Cancer Inst 2007, 99:694- 705). A capacidade de coativação dos receptores de tirosina quinases na família de receptores ErbB foi observada ocorrer durante a transformação 5 oncogênica in vitro e parece desempenhar um papel essencial no desenvol- vimento e progressão de tumores humanos primários.

O papel cooperativo dos elementos da família ErbB foi ainda apoiada por estudos in vitro e in vivo que demonstram que a resistência a mAbs e TKIs em células cancerosas de superexpressão de ErbB está associada com o aumento da atividade de ou- tros elementos da família ErbB.

A co-ativação de RTK permite que as células cancerosas ativem simultaneamente dois ou mais RTKs, a fim de alcançar robustez de rede e aumentar a diversidade do resultado de sinalização.

A coativação de RTK foi recapitulada em vários tipos de câncer, particularmen- te no contexto da resistência adquirida aos inibidores da tirosina quinase (TKIs), sugerindo que a interrupção da oncogene como resultado de coativa- ção de RTK pode ser um mecanismo geral pelo qual as células cancerosas atingem quimioresistência mediante atividade continua a jusante de molécu- las sinalizadoras.

A coativação de RTK foi descrita mais adiante em um es- tudo realizado por Pillay et al, Neplasia 2009; 11: 448-58, 2 demonstrando uma hierarquia de receptores de tirosina quinases ativados, permitindo as- sim uma rápida compensação de RTKs secundários após a inativação do RTK dominante.

A coativação de RTKs secundários pode ocorrer por meio de secreção de fator de crescimento autócrino-parácrina, transfosforilação direta pelo RTK dominante, fosforilação indireta através de uma sinalização intermédia, tal como Src, ou regulação transcripcional.

Exemplos de RTKs dominantes incluem EGFR e HER2, enquanto RTKs secundários podem incluir HER3. Uma estratégia potencial para superar a resistência a mAbs e TKIs utilizados para o tratamento de câncer com altos níveis de receptores da família ErbB podem incluir mira simultânea de múltiplos receptores ErbB, a fim de encerrar sinalização RTK oncogênica e superar o mecanismo com- pensatório.

Tal estratégia induziria perturbações incomuns na robusta rede de sinalização ErbB e, dessa forma, espera-se superar o desenvolvimento de resistência.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é voltada para a melhoria das terapias con- 5 tra receptores dentro da família HER que mais amplamente interferem com vários elementos da família HER (inibição pan-HER). Mais particularmente, a invenção é dirigida para a utilização de composições de anticorpo para a terapia de câncer em seres humanos, p.ex. para o tratamento de câncer de mama, câncer de ovário, câncer gástrico, câncer de pulmão e outros tipos de câncer, com dependência de um ou mais dos receptores EGFR, HER2 e HER3. Comparado com os tratamentos atualmente disponíveis para tais ti- pos de câncer, incluindo monoclonal e combinações de anticorpos, bem co- mo pequenas moléculas dirigidas contra receptores da família HER, é con- templado que a composição de anticorpo da invenção pode fornecer uma resposta clínica superior isoladamente ou opcionalmente em combinação com outros tratamentos tais como a quimioterapia. Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição de an- ticorpo recombinante, em que pelo menos uma molécula de anticorpo anti- HER distinta se liga a um antígeno de um primeiro receptor da família HER e pelo menos uma molécula de anticorpo anti-HER distinta se liga a um antí- geno de um segundo receptor da família HER. Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição de anticorpo recombinante, em que pelo menos uma molécula de anticorpo anti-HER distinta se liga a um antígeno de um primeiro receptor da família HER e pelo menos uma molécula de anticorpo anti-HER distinta se liga a um antigeno de um segundo receptor da família HER, e pelo menos uma molé- cula de anticorpo anti-HER distinta se liga a um antígeno de um terceiro re- ceptor da família HER. De preferência, a invenção refere-se a uma composição de anti- corpo recombinante, em que a composição compreende pelo menos um an- ticorpo anti-EGFR com CDRs de, ou que 6 . capaz de inibir a ligação e/ou que se liga ao mesmo epítopo, em 1254, 1277 ou 1565, pelo menos, um anticor-

po anti-HER2, com CDRs de, ou que é capaz de inibir a ligação e/ou que se liga ao mesmo epítopo como, 4384, 4385, 4517 ou 4518 e pelo menos um anticorpo anti-HER3 com CDRs de, ou que é capaz de inibir a ligação e/ou que se liga ao mesmo epítopo como, 5038 ou 5082. Em uma modalidade 5 preferida particular da invenção, a composição de anticorpo compreende anticorpos com CDRs de anticorpos 1277+1565+4384+4517+5038+5082, ou anticorpos que são capazes de inibir a ligação e/ou se ligar ao mesmo epíto- po que os referidos anticorpos.

Composições de anticorpos representativas da invenção têm se mostrado eficazes na inibição da proliferação de linhas celulares de câncer representativo, o que é indicativo de uma utilização in vivo no tratamento de câncer.

Estes resultados indicativos foram confirmados em um modelo de xenoenxerto de câncer humano em camundongos.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um imunoconjuga- do compreendendo uma composição de anticorpo recombinante da invenção conjugada a um agente anticâncer.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos da invenção, vetores de expressão compreendendo os referidos ácidos nucleicos e células hospedeiras com- preendendo os referidos ácidos nucleicos ou vetores de expressão.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para a produção de uma composição de anticorpo da invenção.

Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se a um produto farmacêutico compreendendo um composição de anticorpo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Além disso, a invenção refere-se a um método para o tratamento de cancer em um ser humano ou outro mamífero compreendendo a adminis- tração a um sujeito com essa necessidade de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de uma composição de anticorpo da invenção.

Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se a uma compo- sição de anticorpos da invenção para uso como um medicamento, para uso em tratamento de câncer, e/ou para utilização em tratamento de cancer em um ser humano ou outro mamífero que tenha adquirido resistência ao trata- mento com anticorpos e/ou inibidores da tirosina quinase (TKIs). Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um artigo farma- cêutico compreendendo uma composição de anticorpos da invenção e pelo 5 menos um composto quimioterapêutico ou anti-eoplásico como uma combi- nação para a administração simultânea, separada ou sucessiva em terapia de cancer. É provável que a composição de anticorpos da invenção possa ser usada para uma segunda linha de tratamento, isto é, após ou simultane- amente com tratamento utilizando agentes quimioterapêuticos ou antineo- plásicos convencionais, ou depois, ou simultaneamente com a terapia de radiação e/ou cirurgia.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1 : A) Atividade metabólica de células A431NS tratadas com diferentes concentrações dos anticorpos indicados e misturas de anti- corpos durante 96 horas. B) Atividade metabólica de células NCI-N87 trata- das com diferentes concentrações dos anticorpos indicados e misturas de anticorpos durante 96 horas. C) Atividade metabólica de células MCF-7 tra- tadas com diferentes concentrações de anticorpos indicados e misturas de anticorpos, na presença de 10 nM de beta heregulina durante 96 horas. Figura 2: Atividade metabólica das células A431NS tratadas com diferentes concentrações das misturas de anticorpo indicadas durante 96 horas. Figura 3: Atividade metabólica de células MCF-7 tratadas com as misturas de diferentes concentrações anticorpo indicados durante 96 ho- ias. Figura 4: Atividade metabólica de células NCI-N87 tratadas com diferentes concentrações de misturas de anticorpo indicadas na presença de 10 nM de beta heregulina durante 96 horas. Figura 5: Atividade metabólica das células A431NS tratadas com diferentes concentrações das misturas indicadas de anticorpo e referência de anticorpos monoclonais cetuximab e trastuzumab por 96 horas, células NC1-N87 tratadas com diferentes concentrações das misturas de anticorpo indicadas e referência de anticorpos monoclonais cetuximab e trastuzumab por 96 horas e células MCF-7 tratadas com diferentes concentrações das misturas de anticorpo indicados e referência monoclonal de anticorpos cetu- ximab e trastuzumab na presença de 10 nM heregulina beta por 96 horas. 5 Figura 6: Nível máximo de inibição do crescimento das linhas ce- lulares indicadas tratadas durante 96 horas com 2 pg/ml dos anticorpos indi- cados e misturas de anticorpo. Figura 7: análises de Western blot de níveis de EGFR, HER2 e HER3 nas linhas de celulares HN5, NCI-N87 e MCF7 após tratamento du- rante a noite com os anticorpos indicados e misturas de anticorpo. Figuras 8-12: titulações que mostram o efeito de diferentes mis- turas de anticorpo e anticorpos no crescimento e proliferação das linhas de células de câncer A431NS (dependente de EGFR), H358 (dependente de EGFR), HCC202 (dependente de HER2), 0E19 (dependente de HER2) e H820 (dependente de EGFR). Figura 13: análises de Western blot de níveis de EGFR, HER2 e HER3 nas linhas de celulares H292 e OVCAR-8 após tratamento durante a noite com os anticorpos indicados e misturas de anticorpo. Figuras 14-20: titulações que mostram o efeito de diferentes mis- turas de anticorpo e anticorpos no crescimento e proliferação das linhas de células de câncer 0E19, BT474, MDA-MB-175-VII, HCC202, N87, A431NS e A549. Figuras 21-25: titulações que mostram o efeito de diferentes mis- turas de anticorpo e anticorpos no crescimento e proliferação das linhas de células cancerígenas A431NS, H1975, HCC202, AU565 e H358. Figura 26: Efeito inibidor do crescimento de diferentes misturas de anticorpo e anticorpos em modelo de xenoenxerto de tumor humano A431NS.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições O termo "anticorpo" ou "molécula de anticorpo", descreve um componente funcional de soro e é muitas vezes referido como uma coleção de moléculas(anticorposou imunoglobulinas)ou como um a molécula(a mo- lécula de anticorpo ou uma molécula de imunoglobulina).U m anticorpo ca- paz de se ligar ou reagir com um determinanteantigênicoespecífico(o antí- geno ou o epítopo antigênico),que por sua vez pode levar A indução de m e- 5 canismos efetores imunológicos.U m anticorpo individualé consideradoge- ralmente como monoespecífico,e um a composiçãode anticorpos pode ser monoclonal (ou seja, consistindo em moléculas de anticorpo idênticas) ou policlonal (isto 6 . , consistindo dois ou mais diferentes anticorpos reagindo com o mesmo ou diferentesepítopos no mesma antígeno ou mesmo em di- ferentes antigenos, distintos). Cada anticorpo tem uma estrutura única que lhe permite ligar-se especificamenteao seu antígeno correspondente,e to- dos os anticorposnaturais têm a mesma estrutura básica geral de duas ca- deias leves idênticase duas cadeias pesadas idênticas.Anticorpossão tam- bém conhecidoscoletivamentecomo imunoglobulinas.

O s termos "anticorpo"ou "anticorpos",como aqui utilizadostam- bém são destinados a incluir anticorpos quiméricos e de cadeia simples, bem como fragmentosde ligação de anticorpos,tais como fragmentos Fab, Fv ou Fv de cadeia simples (scFv), bem como formas multiméricas,tais co- m o moléculasde IgA diméricasou IgM pentavalentes.Também estão incluí- dos miméticosde anticorpos.

U m anticorpo pode ser de origem humana ou não humana, como por exemplo, um anticorpo de murino ou derivado de outro roedor, ou por exemplo um anticorpoquimérico,humanizadoou remo- delado com base em um anticorpo de murino.

Cada cadeia pesada de um anticorpo tipicamente inclui uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada.

A região constante da cadeia pe- sada geralmenteinclui três domínios, referidos como C H 1, CH2 e CH3. Ca- da cadeia leve de anticorpotipicamenteinclui uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve.

A região constante de ca- deia leve, tipicamenteinclui um único domínio, referido como C L.

As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade ("regiões hipervariáveis",que podem ser hiper-variáveisem sequência e/ou em laços estruturalmentedefinidos).Estas também são referidascomo regi-

ões determinantes de complementaridade (CDRs), que são intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL, tipicamente, inclui três CDRs e quatro FRs, dispostos a partir do terminal amino para o terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, 5 FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Os resíduos de aminoácidos nas regiões va- riáveis frequentemente são numerados utilizando um método padronizado de numeração conhecido como o esquema de numeração de Kabat (Kabat etal. (1991) Sequences of Proteins de Immunological Interest, 5th Ed.

Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). Quando um anticorpo é dito ser "derivado de", ou "baseado em" um anticorpo específico aqui descrito, isto significa que o anticorpo "deriva- do" compreende, dependendo do contexto em particular, uma das seguintes: a sequência de cadeia pesada CDR3 do referido anticorpo especificado, a sequência de cadeia pesada CDR3 e a sequência de cadeia leve CDR3 do referido anticorpo especificado, as sequências de cadeia pesada CDR1, CDR2 e RDC3 e sequências de cadeia leve CDR1, CDR2 e RDC3 do referi- do anticorpo especificado, ou a sequência de região variável da cadeia pe- sada e a sequência da região variável de cadeia leve do referido anticorpo especificado ou uma variante humanizada e/ou maturada por afinidade da referida sequência de região variável de cadeia pesada e/ou sequência de região variável de cadeia leve, ou uma sequência de região variável de ca- deia pesada e/ou de cadeia leve que tenha pelo menos, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência, tal como, pelo menos, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, com as respectivas sequências de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve.

Um anticorpo que é derivado de ou baseado em um anticorpo específico aqui descrito geralmente se ligam ao mesmo epítopo, como o referido anticorpo especificado e prefeivelmente exibirá substancialmente a mesma atividade do referido anticorpo especifi- cado.

Um anticorpo é considerado ligar o mesmo epítopo HER, como o anti- corpo especificado, se ele compete pela ligação com o dito anticorpo especi- ficado.

A especificidade da interação de um anticorpo com um antigeno alvo reside essencialmente nos resíduos de aminoácidos localizados nos seis CDR de cadeia pesada e leve.

As sequências de aminoácidos dentro de CDRs por isso são muito mais variáveis entre anticorpos individuais do que as sequências fora dos CDRs.

Como sequências de CDR são responsáveis 5 pela maioria das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anti- corpos recombinantes que imitam as propriedades de um anticorpo específi- co que ocorre naturalmente, ou, mais geralmente, qualquer anticorpo especí- fico com uma determinada sequência de aminoácidos, através da constru- ção de vetores de expressão que expressam sequências CDR do anticorpo específico enxertado em sequências de estrruturas de um anticorpo diferen- te.

Como resultado, é possível "humanizar" um anticorpo não humano e ain- da manter substancialmente a especificidade de ligação e afinidade do anti- corpo original.

Uma discussão mais detalhada de humanização 6 . provida abaixo.

Um "anticorpo quimérico" refere-se, em seu sentido mais amplo, a um anticorpo que contém uma ou mais regiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de um ou mais outros anticorpos.

Tal como aqui utilizado, um "anticorpo quimérico" é geralmente um anticorpo que é parcialmente de ori- gem humana e, parcialmente, de origem não humana, isto é, derivado, em parte, a partir de um animal não humano, por exemplo, um ratinho ou outro roedor, ou uma ave tal como uma galinha.

Anticorpos quiméricos são prefe- ríveis aos anticorpos não humanos, a fim de reduzir o risco de uma resposta anti-anticorpo humano, por exemplo, uma resposta de anticorpo humano anticamundongo no caso de um anticorpo de murino.

Um exemplo de um anticorpo quimérico típico é aquele em que as sequências de regiões variá- veis são sequências de murino derivadas a partir da imunização de um rato, enquanto que as sequências de região constante são humanas.

No caso de um anticorpo quimérico, as partes não humanas, ou seja, tipicamente as re- giões estruturais das sequências de regiões variáveis, podem ser submeti- das a outras alterações a fim de humanizar o anticorpo.

O termo "humanizar" refere-se ao fato de que, quando um anti- corpo é total ou parcialmente de origem não humana, por exemplo, um anti-

corpo de murino obtido a partir da imunização de camundongos com um an- tígeno de interesse, ou um anticorpo quimérico baseado em um tal anticorpo de murino, é possível substituir alguns aminoácidos, em particular nas regi- ões de estrutura e domínios constantes das cadeias pesadas e leves, a fim 5 de evitar ou minimizar uma resposta imune em seres humanos.

Sabe-se que todos os anticorpos têm o potencial para induzir uma resposta antianticorpo humano, que se correlaciona em certa medida com o grau de "humanidade" do anticorpo em questão.

Embora não seja possível prever com precisão a imunogenicidade e, assim, a resposta antianticorpo humano de um anticorpo em particular, anticorpos não humanos tendem a ser mais imunogenicos do que os anticorpos humanos.

Anticorpos quiméricos, em que as regiões cons- tantes estrangeiras (geralmente de roedores) foram substituídas com se- quências de origem humana, têm mostrado ser geralmente menos imunogê- nicas do que anticorpos de origem totalmente externa, e a tendência em an- ticorpos terapêuticos é no sentido de anticorpos humanizados ou inteiramen- te humanos.

Para anticorpos quiméricos ou outros anticorpos de origem não humana, é, portanto, preferido que eles sejam humanizados para reduzir o risco de uma resposta anti-anticorpo humano.

Para anticorpos quiméricos, a humanização tipicamente envolve modificação das regiões de estrutura das sequências da região variável.

Os resíduos de aminoácidos que fazem parte de uma região determinante de complementaridade (CDR), normalmente não serão alterados em relação com a humanização, embora em certos ca- sos, pode ser desejável alterar resíduos de aminoácidos CDR individuais, por exemplo, para remover um local de glicosilação, um local de desamida- ção ou um resíduo de cisteína indesejada.

Glicosilação N-ligada ocorre por ligação de uma cadeia de oligossacarídeo com um resíduo de asparagina na sequência de tripeptídeo Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto Pro.

Remoção de um local de N-glicosilação podem ser obtida através da mutação, quer de resíduo de Asn ou de Ser/Thr para um diferente resíduo, de preferência por meio de substituição conservativa.

De- saminação de resíduos de asparagina e glutamina pode ocorrer, dependen-

do de fatores como pH e exposição da superfície.

Resíduos de asparagina são particularmente susceptíveis a desamidação, principalmente quando presente na sequência Asn-Gli, e em menor grau em outras sequências de dipeptídeos tais como Asn-Ala.

Quando um tal local de desamidação, em 5 particular Asn-Gli, está presente em uma sequência CDR, pode, portanto, ser desejável remover o local, tipicamente por substituição conservativa para remover um dos resíduos envolvidos.

Substituição em uma sequência CDR para remover um dos resíduos implicados também se destina a ser engloba- do pela presente invenção.

Numerosos métodos para a humanização de uma sequência de anticorpo são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, a revisão por Alma- gro e Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633. Um método normalmen- te utilizado é enxerto de CDR, em que, por exemplo, um anticorpo quimérico murino derivado de murino envolve a identificação de vias gênicas germina- tivas humanas para os genes da região variável murina e enxerto das se- quências CDR murinas para esta estrutura.

Enxerto de CDR pode basear-se nas definições CDR de Kabat, apesar de uma publicação recente (Magdelai- ne-Beuzelin etal. (2007) Crit Rev.Oncol Hematol 64:.. 210-225) tenha suge- rido que a definição IMGT (www.imgt.orq) pode melhorar o resultado da hu- manização.

Uma vez que enxerto de CDR pode reduzir a especificidade de ligação e afinidade, e, assim, a atividade biológica, de um anticorpo não hu- mano enxertado com CDR, mutações regressivas podem ser introduzidas em posições selecionadas do anticorpo enxertado com CDR, a fim de reter a especificidade de ligação e afinidade do anticorpo pai.

A identificação de po- sições de possíveis mutações regressivas pode ser realizada utilizando a informação disponível na literatura e em bancos de dados de anticorpos.

Os resíduos de aminoácidos que são candidatos para mutações regressivas são tipicamente aqueles que estão localizados na superfície de uma molécula de anticorpo, enquanto os resíduos que estão enterrados, ou que têm um baixo grau de exposição de superfície, normalmente não vão ser alterados.

Uma técnica de humanização alternativa para enxerto de CDR e mutação regres- siva é renovação de desgaste, na qual os resíduos de superfície não expos-

ta de origem não humana são retidos, enquanto que os resíduos superficiais são alterados para resíduos humanos.

Em certos casos, pode também ser desejável alterar um ou mais resíduos de aminoácidos CDR, a fim de melhorar a afinidade de ligação para 5 o epítopo alvo.

Isto 6 . conhecido como "amadurecimento de afinidade" e po- de, opcionalmente, ser realizado em conexão com a humanização, por e- xemplo, em situações onde a humanização de um anticorpo leva ã redução da especificidade ou afinidade de ligação e não é possível melhorar suficien- temente a especificidade ou afinidade de ligação apenas por mutações re- 10 gressivas.

Vários métodos de maturação de afinidade são conhecidos na técnica, por exemplo, o método de mutagênese de saturação de varredura in vitro descrito por Burks et a L (1997), PNAS EUA, vol. 94, pp. 412-417 e o etapa a etapa do método de maturação de afinidade in vitro de Wu et al. (1998), PNAS EUA, vol. 95, pp 6037-6042. - 15 Como observado acima, a presente invenção abrange anticor- pos humanizados, ou seja, anticorpos como descrito de outro modo, que tenham sido submetidos A humanização.

Estas também podem ser referidas como "variantes humanizadas" de um anticorpo da invenção.

Em particular, os termos "sequência da região variável da cadeia pesada" e "sequência da 20 região variável de cadeia leve", tal como aqui utilizado com referência a uma sequência específica de aminoácidos têm a intenção de abranger não só que a sequência específica, mas também qualquer variante humanizada da mesma.

Variantes de afinidade amadurecida dos anticorpos anti-HER aqui descritos destinam-se também a ser abrangidas pela presente invenção. 25 Como aqui utilizado, uma referência a uma sequência da região variável de cadeia pesada ou uma sequência da região variável de cadeia leve, com um nível mínimo particular de identidade de sequência comparati- vamente a uma sequência da região de cadeia pesada ou de cadeia leve especificadas, por exemplo, tendo pelo menos 90% ou 95% de identidade de 30 sequência com a sequência de referência, tal como, pelo menos, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, destina-se a incluir, mas não se limitando a, variantes amadurecidas humanizadas e/ou de afinidade de tal sequência de referência.

O termo "recombinante anticorpo" refere-se a um anticorpo que é expresso a partir de uma célula ou linha celular transfectada com um vetor de expressão (ou possivelmente mais do que um vetor de expressão, tipi- 5 camente dois vetores de expressão) compreendendo a sequência de codifi- cação do anticorpo, onde a referida sequência de codificação não está natu- ralmente associada com a célula.

O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico em que uma sequência de ácido nucleico pode ser inserida para o transporte entre os ambientes genéticos diferentes e/ou para expressão em uma célula hospedeira.

Um vetor que transporta elementos reguladores para a transcri- ção da sequência de ácido nucleico (pelo menos um promotor adequado) é referido como um "vetor de expressão". Os termos "plasmídeo" e "vetor" po- dem ser usados indistintamente.

Os vetores de expressão usados no contex- to da presente invenção podem ser de qualquer tipo apropriado conhecido na técnica, por exemplo, um plasmídeo ou um vetor viral.

Os termos "anticorpo policlonal" ou "mistura de anticorpos [mo- noclonaisj" referem-se a uma composição de dois ou mais diferentes molé- culas de anticorpos que são capazes de se ligar ou reagir com diferentes determinantes antigênicos específicos no mesmo ou em diferentes antíge- nos.

No contexto da presente invenção, os anticorpos individuais de um anti- corpo policlonal ligam a diferentes determinantes antigênicos da família HER.

De preferência, os anticorpos individuais de um anticorpo policlonal da invenção se liga a diferentes epítopos da família HER, mais preferivelmente epítopos distintos e substancialmente não sobrepostos.

A variabilidade de um anticorpo policlonal é geralmente considerada ser localizada nas regiões variáveis das moléculas de anticorpo.

É bem conhecido na técnica que existem anticorpos como dife- rentes isotipos tais como os isotipos humanos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, ou os isotipos de murinos IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA.

Um anti- corpo da invenção pode ser de qualquer isotipo.

Embora seja possível para os anticorpos individuais de uma composição de anticorpo policlonal da in-

venção incluir anticorpos com mais do que um isotipo, eles são de preferên- cia todos do mesmo isótipo.

O termo "dependência HER" refere-se a uma célula cancerosa com dependência de um ou mais dos receptores da família HER para man- 5 ter as propriedades malignas como proliferação, crescimento, motilidade, invasão, sobrevivência e/ou resistência à quimioterapia.

Dependência pode ser causada por superexpressão do receptor, mutações do receptor, produ- ção de fator de crescimento autócrino e/ou conversa cruzada com outros sistemas receptores. 0 termo "pan-HER" ou "composição de anticorpo pan-HER" refe- re-se a uma composição de moléculas de anticorpos que são capazes de se ligar a pelo menos dois diferentes antígenos em pelo menos dois receptores da família HER.

No contexto da presente invenção, os anticorpos individuais de uma composição de anticorpos se ligam a diferentes determinantes anti- gênicos da família HER.

De preferência, os anticorpos individuais da compo- sição de anticorpos se ligam a EGFR e HER2, HER3 e EGFR, HER2 e HER3, ou EGFR, HER2 e HER3, respectivamente.

O termo "HER" significa "Receptor do fator de crescimento epi- dérmico humano", como descrito acima na seção "Antecedentes da inven- ção" e 6 . usado de forma intercambiável com o termo "ErbB" para caracteri- zar o subgrupo do receptor de tirosina quinase (RTKs) consistindo dos qua- tro elementos EGFR/ErbB, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3 e HER4/ErbB4. Jun- tos, estes quatro receptores constituem os receptores da família "HER". Co- mo usado aqui, pretende-se incluir variantes, isoformas e espécies homólo- gas dela.

O termo "CDR" ou "região determinante de complementaridade" refere-se às regiões "hipervariáveis" encontradas nos domínios variáveis de um anticorpo que são os principais responsáveis por determinar a especifici- dade de ligação do anticorpo.

Veja a definição em Lefranc et al. (2003), nu- meração única !MGT para imunoglobulina e domínios variáveis do receptor de células T e domínios tipo V de superfamília Ig, Dev.

Comp lmmunol. 27, 55-77. Cada uma das cadeias pesada e leve de um anticorpo contém três regiões CDR, referidas como CDR1, CDR2 e CDR3, das quais CDR3 apre- senta a maior variabilidade.

O termo "epítopo" é utilizado para descrever uma parte de uma molécula maior (por exemplo, antígeno ou local antigênico) tendo atividade 5 antigenica ou imunogenica em um animal.

Um epítopo que possui atividade imunogenica é uma porção de uma molécula maior, que provoca uma res- posta de anticorpo em um animal.

Um epítopo que possui atividade antigeni- ca é uma porção de uma molécula maior a qual imuno-especificamente se liga um anticorpo como determinado por qualquer método conhecido na téc- nica.

Epitopos antigênicos não são necessariamente imunogênicos.

Um an- tígeno é uma substancia A qual um anticorpo ou fragmento de anticorpo i- muno-especificamente se liga, por exemplo, uma toxina, vírus, bactérias, proteína ou DNA.

Um antígeno ou local antigênico, geralmente, tem mais do que um epítopo, a menos que seja muito pequeno, e muitas vezes é capaz de estimular uma resposta imune.

Os epítopos podem ser lineares ou con- formacionais.

Um epítopo linear geralmente consiste de cerca de 6 a 10 a- minoácidos adjacentes em uma molécula de proteína que são reconhecidos por um anticorpo.

Em contraste, um epítopo conformacional consiste de a- minoácidos que não estão dispostos em sequência, mas onde um anticorpo reconhece uma estrutura tridimensional, em particular.

Quando uma molécu- la de proteina dobra em uma estrutura tridimensional, os aminoácidos que constituem o epítopo são justapostos, permitindo que o anticorpo reconheça o epítopo conformacional.

Em uma proteína desnaturada apenas epítopos lineares são reconhecidos.

Um epítopo conformacional, por definição, deve estar na parte externa da proteína dobrada.

O termo "epítopos diferentes" refere-se ao fato de que quando dois diferentes anticorpos da invenção ligam epítopos distintos, há menos do que 100% de competição para a ligação ao antégeno, de preferência menos de 80% de competição para ligação ao antígeno, com maior preferência me- nos de 50% de competição para ligação ao antígeno, e mais preferivelmente menos concorrência quanto possível, tal como menos do que cerca de 25% de competição de ligação ao antégeno.

Anticorpos capazes de competir um com o outro para a ligação com o mesmo antígeno podem ligar-se os mes- mos ou sobrepor epítopos ou podem ter um local de ligação na vizinhança próxima um do outro, de modo que a competição 6 . causada principalmente Por impedimento estérico.

Uma análise para "epítopos diferentes" de pares 5 de anticorpos pode ser realizada por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de experiências de ligação em condições de saturação de anticorpo utilizando ou FACS (classificação de células ativadas por fluores- cência) ou outra análise de citometria de fluxo em células expressando famí- lias HER e anticorpos marcados fluorescentes individuais, ou por ressonãn- cia plasmonica de superfície (SPR), utilizando antígeno da família HER cap- turado ou conjugado a uma superfície de célula de fluxo.

Um método para determinar a competição entre os anticorpos utilizando SPR está descrito nos exemplos.

Os epítopos diferentes são, de preferência "não sobrepostos" no sentido que dois diferentes anticorpos anti-HER em um composição da in- venção tem um nível suficientemente baixo para de competição para ligação ao antígeno que os dois anticorpos são capazes de se ligar aos seus respec- tivos epítopos simultaneamente.

Será entendido por pessoas versadas que pode haver diferentes graus de sobreposição, e que os epítopos distintos podem ser considerados como "não sobreposição", apesar da presença de um certo grau de sobreposição, enquanto os respectivos anticorpos são ca- pazes de se ligar substancialmente aos seus epítopos.

Isto é geralmente considerado como sendo o caso quando a competição para a ligação ao an- tígeno entre dois anticorpos é menos do que cerca de 50%. Da mesma forma, um anticorpo que "compete para a ligação" com um anticorpo da invenção pode ser definido como aquele que apresenta competição para a ligação ao antígeno de cerca de 50% ou mais.

Anticorpos que se ligam a diferentes epítopos no mesmo antíge- no podem ter efeitos variáveis sobre a atividade do antígeno ao qual se li- gam, dependendo da localização do epítopo.

Uma ligação de anticorpo a um epítopo em um local ativo do antígeno pode bloquear a função do antígeno completamente, a etapa que uma outra ligação de anticorpo a um epítopo diferente pode ter pouco ou nenhum efeito sobre a atividade do antígeno sozinho.

Tais anticorpos podem, entretanto, ativar ainda o complemento e, assim, resultar na eliminação do antígeno, e podem resultar em efeitos si- nérgicos quando combinados com um ou mais anticorpos ligando a epítopos 5 diferentes sobre o mesmo antígeno.

No contexto da presente invenção, o epítopo é preferivelmente uma porção do domínio extracelular da família HER.

Antígenos da presente invenção estão preferivelmente no domínio ex- tracelular de proteínas da família HER, polipeptídeos ou fragmentos dos mesmos aos quais um anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga imuno- especificamente.

Um antígeno associado 6 família HER pode também ser um análogo ou derivado do domínio extracelular de polipeptídeo HER ou fragmento do mesmo ao qual um anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga imunoespecificamente.

O termo "imunoglobulina" é normalmente usado como designa- cão coletiva da mistura de anticorpos encontrados em sangue ou no soro, mas também pode ser usado para designar uma mistura de anticorpos deri- vados de outras fontes.

O termo "pares de codificação de cognato V H e V L", descrevem um par original de sequências de codificação V H e V L , contidas dentro ou derivadas da mesma célula produtora de anticorpo.

Assim, um par cognato de V H e V L representa o emparelhamento V H e V L originalmente presente no doador a partir do qual tal célula é derivada.

O termo "um anticorpo expresso a partir de um par de codificação V H e VL" indica que um anticorpo ou um fragmento de anticorpo é produzido a partir de um vetor, plasmídeo ou outro polinucleotídeo contendo a sequência de codificação V H e V L.

Quando um par codificante de cognato V H e V L é expresso, como um anticorpo completo ou como um fragmento estável do mesmo, eles preservam a afinidade de ligação e especificidade do anticorpo originalmente expresso a partir da célu- la de que são derivados.

Uma biblioteca de pares cognatos também é de- nominada um repertório ou coleção de pares cognatos, e pode ser mantida individualmente ou misturada.

Por "proteína" ou "polipeptídeo" entende-se qualquer cadeia de aminoácidos, independentemente do comprimento ou modificação Os- translacional.

Proteínas podem existir como monõmeros ou multímeros, compreendendo duas ou mais cadeias de polipeptídeo montadas, fragmen- tos de proteínas, polipeptídeos, oligopeptídeos ou peptídeos. 5 0 termo "promotores de cabeça-a-cabeça" refere-se a um par promotor sendo colocado na proximidade imediata de modo que a transcri- cão de dois fragmentos de genes conduzida pelos promotores ocorre em direções opostas.

Promotores de cabeça-a-cabeça também são conhecidos como promotores bidirecionais.

O termo "transfeção" é aqui utilizado como um termo genérico para a introdução de DNA estranho em uma célula.

O termo também preten- de cobrir também outros métodos equivalentes funcionais para a introdução de DNA estranho em uma célula, tal como, por exemplo, transformação, in- fecção, transdução ou fusão de uma célula doadora e uma célula receptora.

Tal como aqui usado, o termo "inibe o crescimento" (por exem- plo, referindo-se às células) destina-se a incluir qualquer diminuição mensu- rável na proliferação (aumento do número de células) ou metabolismo de uma célula, quando em contacto com a composição de anticorpos da inven- ção, em comparação ao crescimento das mesmas células na ausência da referida composição de anticorpos, por exemplo, a inibição do crescimento de uma cultura de células pelo menos em cerca de 10%, e de preferência mais, tal como pelo menos cerca de 20% ou 30%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 40% ou 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, 70% , 80%, 90%, 99% ou mesmo 100%. 0 termo "tratamento", tal como aqui utilizado refere-se à admi- nistração de uma composição de anticorpos da invenção, em uma quantida- de suficiente para aliviar, reduzir, melhorar ou eliminar (curar) sintomas ou estados de doença.

A administração de dois ou ais anticorpos da invenção será geralmente por meio de administração simultânea dos anticorpos, de preferência sob a forma de uma composição contendo todos os anticorpos a serem utilizados para tratamento.

Entretanto, também é possível administrar dois ou mais anticorpos da invenção separadamente.

As referências aqui feitas, por exemplo, a administração de uma composição de anticorpo re- combinante compreendendo pelo menos dois anticorpos, por conseguinte, deve ser compreendida como abrangendo não só a administração de uma composição compreendendo pelo menos dois anticorpos como tal, mas 5 também a administração separada dos anticorpos.

Combinações de dois ou mais anticorpos da invenção pode, assim, ser administradas simultaneamen- te, sequencialmente ou separadamente.

Um percentual de identidade entre duas sequências, por exem- plo, sequências da região variável, refere-se ao número de posições idênti- cas partilhadas pelas sequências (calculado como o n° de posições idênti- cas/n° total de posições x 100), tendo em conta as lacunas que devem ser introduzidas para um alinhamento ótimo das duas sequências.

A compara- ção de sequências e determinação do percentual de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando software pronto disponível no merca- do.

Programas adequados estão disponíveis a partir de diversas fontes, tan- to para uso online e para download, e para o alinhamento de ambos, proteí- nas e sequências de nucleotídeos.

Um programa adequado é o programa ClustalW (Thompson et al (1994) Nucleic Acids Res. 11, 22(22):4673-80), disponível a partir de www.clustal.org, ou, alternativamente, por exemplo, do European Bioinformatics Institute (vvww.ebi.ac.uk), que também fornece vá- rios outras ferramentas informáticas voltadas para proteínas e nucleotídeos.

Quando anticorpos específicos anti-EGFR são aqui menciona- dos, por exemplo, anticorpos referidos como 992, 1024, 1030, 1254 e 1277, estes números de anticorpos geralmente referem-se aos anticorpos anti- EGFR descritos em WO 2008/104183. Quando anticorpos anti-HER2 específicos são aqui menciona- dos, por exemplo, anticorpos referidos como 4382, 4384, 4385 e 4518, es- ses números de anticorpos referem-se aos anticorpos anti-HER2 descritos em WO 2011/107957 Al.

Quando anticorpos anti-HER3 específicos são aqui menciona- dos, por exemplo, anticorpos referidos como 4785, 5038, 5082 e 5096, es- ses números de anticorpos referem-se aos anticorpos anti-HER3 com as sequências de DNA e aminoácidos fornecidas na listagem de sequências.

Misturas de Anticorpos Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma composição de anticorpo recombinante, ou seja, uma composição em que pelo menos uma 5 molécula de anticorpo anti-HER distinta se liga a um antígeno de um primei- ro receptor da família HER e pelo menos uma molécula de anticorpo anti- HER distinta se liga a um antígeno de um segundo receptor da família HER.

Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a uma composição de anticorpo recombinante, ou seja, uma composição em que pelo menos uma molécula de anticorpo anti-HER distinta se liga a um antígeno de um primei- ro receptor da família HER, pelo menos, uma molécula de anticorpo anti- HER distinta se liga a um antígeno de um segundo receptor da família HER e, pelo menos uma molécula de anticorpo anti-HER distinta se liga a um an- tígeno de um terceiro receptor da família HER.

Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticorpos compreende pelo menos uma molé- cula de anticorpo anti-HER distinta capaz de se ligar a um antígeno de um primeiro receptor da família HER e, pelo menos, duas moléculas de anticor- po anti-HER distintas capazes de se ligar a um antígeno de um segundo re- ceptor da família HER.

Em outra modalidade preferida, a composição de an- ticorpos compreende pelo menos duas moléculas de anticorpo anti-HER dis- tintas capazes de se ligar a um antígeno de um primeiro receptor da família HER e, pelo menos, duas moléculas de anticorpo anti-HER distintas capazes de se ligar a um antígeno de um segundo receptor da família HER.

Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticorpos compreende pelo menos uma molécula de anticorpo anti-HER distinta capaz de se ligar a um antígeno de um primeiro receptor da família HER, pelo menos, uma molécu- la de anticorpo anti-HER distinta capazes de se ligar a um antígeno de um segundo receptor da família HER e pelo menos duas moléculas de anticorpo anti-HER distintas ligando a um antígeno de um terceiro receptor da família HER.

Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticorpos compreende pelo menos uma molécula de anticorpo anti-HER distinta capaz de se ligar a um antígeno de um primeiro receptor da família HER, pelo me-

nos, duas moléculas de anticorpo anti-HER distintas capazes de se ligar a um antígeno de um segundo receptor da família HER e pelo menos duas moléculas de anticorpo anti-HER distintas ligando a um antígeno de um ter- ceiro receptor da família HER.

Em uma modalidade ainda mais preferida, a 5 composição de anticorpos compreende pelo menos duas moléculas de anti- corpo anti-HER distintas capazes de se ligar a um antígeno de um primeiro receptor da família HER, pelo menos, duas moléculas de anticorpo anti-HER distintas capazes de se ligar a um antígeno de um segundo receptor da fa- mília HER e, pelo menos, duas moléculas de anticorpo anti-HER distintas capazes de se ligar a um antígeno de um terceiro receptor da família HER.

Os primeiro e segundo receptores da família HER são preferi- velmente EGFR e HER2, HER2 e EGFR, EGFR e HER3, HER3 e EGFR, HER2 e HER3, HER3 e HER2, respectivamente.

Na modalidade onde as moléculas de anticorpo se ligam a três receptores diferentes da família HER, o primeiro, segundo e terceiro receptores da família HER são preferivelmen- te EGFR e HER2 e HER3, EGFR e HER3 e HER2, HER2 e EGFR e HER3, HER2 e HER3 e EGFR, HER3 e EGFR e HER2, HER3 e HER2 e EGFR, respectivamente.

Os anticorpos anti-HER distintos se ligam a epítopos não sobre- postos sobre os receptores.

A natureza de não sobreposição dos anticorpos é preferivelmen- te determinada utilizando anticorpos marcados de forma diferente em uma análise FACS com células que expressam HER ou usando Ressonância Plasmõnica de Superfície usando antígeno capturado ou conjugado a uma superfície de célula de fluxo.

A composição de ligação de epítopos não so- brepostos pode ser usada contra uma ampla gama de tipos de câncer de- pendentes de HER, pois ela pode ser menos vulnerável a diferenças na con- formação de HER e menos vulnerável a mutações em comparação com composições de anticorpos monoclonais alvejando um ou dois epítopos.

A- lém disso, a composição de anticorpos ligada a epítopos que não se sobre- põem pode prover uma eficácia superior em relação a composições alvejan- do menos epítopos.

Em particular, a composição de anticorpos pode prover uma eficácia superior em relação ã diferenciação terminal de células cance- rosas in vivo.

Embora seja preferível incluir em uma composição de anticorpos da invenção, pelo menos, duas moléculas de anticorpo anti-HER distintas, 5 que se ligam a um antígeno de um primeiro receptor da família HER e, pelo menos, duas moléculas de anticorpo anti-HER distintas, que se ligam a um antígeno de um segundo receptor da família HER, composições de anticor- pos capazes de se ligar a pelo menos três receptores diferentes da família HER são mais preferido.

Estas composições preferidas estão descritas em mais detalhes a seguir em conjunto com a orientação relativa a forma de conceber composições de anticorpos da invenção.

Os anticorpos da composição podem ser anticorpos quiméricos com cadeias variáveis não humanas e cadeias constantes humanas.

As ca- deias variáveis não humanas podem ser de um camundongo, rato, ovelha, porco, galinha, primata não humano ou de outro animal adequado.

A fim de obter anticorpos totalmente humanos, os anticorpos podem ser gerados em um animal transgênico com genes de anticorpos humanos.

Os anticorpos também podem ser anticorpos humanizados, tal como descrito acima, onde as sequências CDR não humanas foram enxertadas com sequências de es- trutura humanas.

De preferência, a cadeia constante humana é do isótipo IgG1 ou IgG2. Mais preferivelmente todos os anticorpos na composição têm o mes- mo isotipo para facilidade de fabricação.

Entretanto, pode em alguns casos ser vantajoso incluir na composição anticorpos com isotipos diferentes.

De preferência, as composições de anticorpos da invenção compreendem anticorpos capazes de se ligar a um receptor da família HER selecionado do grupo consistindo de EGFR, HER2 e HER3 humano, EGFR, HER2 e HER3 humano mutado, e variantes de deleção de EGFR HER2 e HER3 humano.

Preferivelmente, os anticorpos são capazes de se ligare tan- to a EGFR, HER2 e/ou HER3 humanos, e de primata não humano, de modo que eles podem ser testados em estudos toxicológicos relevantes antes das experiências clínicas.

De preferência, o primata não humano é um macaco cinomolgo (Macaca fascicularis). Os resultados obtidos com linhas celulares cancerosas A431NS e MCF7 (Exemplo 3) e que demonstraram que as combinações de misturas de anti-EGFR e misturas anti-HER3 ou anti-HER2 dá origem a aumentos 5 sinérgicos na inibição do crescimento de células cancerosas e que uma combinação de misturas de encontro a todos os três receptores é superior às misturas individuais e combinações de misturas contra dois receptores.

A combinação de misturas contra todos os três receptores foi comparada com anticorpos monoclonais comerciais cetuximab (anti-EGFR) e trastuzumab (anti-HER2) e uma mistura destes dois anticorpos.

Os resul- tados mostram que a combinação de misturas de anticorpos contra os três receptores EGFR, HER2 e HER3 é superior a ambos cetuximab e trastuzu- mab, e também a uma mistura destes dois anticorpos em diferentes linhas de células.

Em geral, os resultados demonstraram que a mira ótima de mais do que um dos receptores da família HER é obtida pela combinação de mis- turas de anticorpos contra cada um dos receptores e que mirar três recepto- res é superior a mirar dois receptores.

Os resultados obtidos com linhas celulares MCF7, BT474, HCC202, NCI-N87, MDA-MB-175, A431NS, HN5, H292, DU145 e MDA-MB- 468 (Exemplo 4), também têm demonstrado que a combinação da mistura de anti-EGFR e a mistura de anti-HER2 inibe todas as linhas de células tes- tadas.

Alvejando apenas um destes receptores resulta na inibição das linhas de células que são dependentes desse receptor em particular.

No geral, es- tes resultados mostram que a combina;ão de misturas de anticorpos contra EGFR e HER2 provê um perfil de inibição muito mais amplo e pode assim vir a ser usado para tratar pacientes cujos tumores são dependentes de qual- quer um dos receptores.

Os resultados da investigação de Western Blot (Exemplos 5 e 7) mostram que misturas de anticorpos contra um único receptor (EGFR, HER2 e HER3) induzem a degradação dos seus respectivos alvos e que uma com- binação de misturas de anticorpo contra cada alvo é capaz de induzir eficien-

te degradação de todos os três receptores simultãneamente.

Os resultados obtidos com linhas celulares cancerosas A431NS, H358, HC202, 0E19, e H820 (Exemplo 6) mostram que, apesar de o efeito das misturas de anticorpo e anticorpos individuais variar entre as linhas de 5 células diferentes, as misturas de anticorpos contendo anticorpos contra ca- da um dos três receptores EGFR , HER2 e HER3 são geralmente eficazes na inibição do crescimento e proliferaçáo celular.

As misturas contendo seis anticorpos, ou seja, dois anticorpos contra cada um dos três receptores, são, em geral, os mais eficazes entre as linhas de células diferentes.

Os resultados do Exemplo 8 mostram que, apesar de o efeito das misturas de anticorpo e anticorpos individuais variam entre as linhas de células diferentes, as misturas de anticorpos compostas de três, quatro ou seis anticorpos contra os três receptores EGFR, HER2 e HER3 são geral- mente muito eficazes na inibição do crescimento e proliferação de células cancerosas.

Os resultados do Exemplo 9 demonstram que a mira ótima de mais do que um receptor na família HER é obtida através da combinação de misturas de anticorpos contra cada urn dos receptores, que a mira de três receptores é superior a mira de dois receptores e que a mira de cada recep- tor com uma mistura de anticorpos é superior a mira de cada receptor com um único anticorpo.

Finalmente, os resultados do ensaio de eficácia in vivo (Exemplo 10) mostram que o tratamento de xenoenxertos de tumores A431NS com uma combinação de misturas de ar ticorpos ou anticorpos contra EG- FR+HER3 ou EGFR+HER2+HER3 é mais eficaz em comparação com mirar os tumores com anticorpos monoclonais e misturas de anticorpos contra al- vos individuais EGFR, HER2 e HER3, ou combinações de anticorpos mono- clonais e misturas de anticorpos contra EGFR+HER2 e HER2+HER3. O que é evidente a partir destas experiências é que combine- ções de anticorpos fornecidos pelos presentes inventores exibem eficácia contra uma muito larga faixa de linhas celulares cancerosas.

Em uma modalidade preferida, a composição de anticorpos da invenção compreende pelo menos duas moléculas distintas de anticorpos anti-EGFR selecionados do grupo consistindo de anticorpos capazes de ini- bir a ligação e/ou que se ligam ao mesmo epítopo, como um anticorpo pos- suindo as CDRs de anticorpos: 992, 1024, 1030, 1254, 1277 e 1565. 5 Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticor- pos compreende pelo menos duas moléculas distintas de anticorpos anti- EGFR selecionadas do grupo de combinações consistindo de anticorpos com os CDRs de anticorpos: 992+1030, 992+1024, 1024+1030, 1030+1254, 1030+1277, 1030+1565, 1254+1277, 1254+1565 e 1277+1565. Em uma modalidade particular, os anticorpos anti-EGFR tem as CDRs de anticorpos 1277+1565 ou 1254+1565. Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticor- pos compreende pelo menos duas moléculas distintas de anticorpos anti- HER2 selecionados do grupo consistindo de anticorpos capazes de inibir a ligação e/ou que se ligam ao mesmo epítopo, como um anticorpo possuindo as CDRs de anticorpos: 4382, 4384, 4385, 4517 e 4518. Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticor- pos compreende pelo menos duas moléculas distintas de anticorpos anti- HER2 selecionados do grupo de combinações consistindo de anticorpos com as CDRs de anticorpos: 4382+4384, 4382+4385, 4382+4517, 4382+4518, 4384+4385, 4384+4517, 4384+4518, 4517+4518, e 4385+4518. Em uma modalidade particular, os anticorpos anti-HER2 tem as CDRs de anticorpos 4384+4517 ou 4385+4518. Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticor- pos compreende pelo menos duas moléculas distintas de anticorpos anti- HER3 selecionados do grupo consistindo de anticorpos capazes de inibir a ligação e/ou que se ligam ao mesmo epítopo, como um anticorpo possuindo as CDRs de anticorpos: 4785, 5038, 5082, e 5096. Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticor- pos compreende pelo menos duas moléculas distintas de anticorpos anti- HER3 selecionados do grupo consistindo de combinações de anticorpos com as CDRs de anticorpos: 4785+5038, 4785+5082, 4785+5096, 5038+5082,

5038+5096, e 5082+5096. Em uma modalidade particular, os anticorpos an- ti-HER3 têm as CDRs de anticorpos 5038+5082. Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticor- pos é selecionada do grupo consistindo de combinações de anticorpos com 5 as CDRs de anticorpos: 992+1024+4785+5082, 992+1024+4382+4385+4518, 992+1024+4382+4385+4518+4785+5082, 4382+4385+4518+4785+5082, 1565+4517+5082, 1277+4517+5082, 1277+4384+5038, 1277+4384+5082, 1277+1565+5038+5082, 1277+1565+4384+4517, 4384+4517+5038+5082, 1277+4384+4517+5082, 1277+4384+4517+5038, 1277+1565+4384+4517+5038+5082, e 1277+1565+4385+4518+5038+5082. Uma modalidade preferida da invenção inclui uma composição de anticorpos recombinante compreendendo moléculas de anticorpo tal co- mo definido em que a sequência da região variável de cadeia pesada e de sequência da região variável de cadeia leve tendo cada uma pelo menos 90% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 95% de identi- dade de sequência, tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência, com a região variável de cadeia pesada e as sequências da região variável da cadeia leve, respec- tivamente, de qualquer um desses anticorpos, e que compete para a ligação com o referido anticorpo.

Em uma modalidade particular, a composição de anticorpos da invenção compreende pelo menos um anticorpo anti-EGFR com CDRs, ou que é capaz de inibir a ligação e/ou que se liga ao mesmo epítopo, como 1254, 1277 ou 1565, pelo menos um anticorpo anti-HER2, com CDRs de, ou que é capaz de inibir a ligação e/ou que se liga ao mesmo epítopo como, 4384, 4385, 4517 ou 4518 e pelo menos um anticorpo anti-HER3 com CDRs de, ou que é capaz de inibir a ligação de e/ou que se liga ao mesmo epítopo como, 5038 ou 5082. Em uma modalidade preferida, a composição de anticorpos compreende dois anticorpos dirigidos contra cada um de EGFR, HER2 e HER3, em que os anticorpos anti-EGFR tem as CDR de, ou são capazes de inibir a ligação e/ou se ligar o mesmo epítopo como, 1277+1565 ou

1254+1565, os anticorpos anti-HER2 tem as CDRs de, ou são capazes de inibir a ligação e/ou se ligar ao mesmo epítopo, como, 4384+4517 ou 4385+4518, e os anticorpos anti-HER3 têm os CDRs de, ou são capazes de inibir a ligação e/ou se ligar o mesmo epítopo, como, 5038+5082. 5 Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticor- pos compreende anticorpos com as RDCs de anticorpos 1277+1565+4384+ 4517+5038+5082, ou anticorpos que são capazes de inibir a ligação de e/ou se ligar ao mesmo epítopo como os referidos anticorpos.

Em uma outra modalidade preferida, a composição de anticor- pos compreende anticorpos com as RDCs de anticorpos 1277+1565+ 4385+4518+5038+5082, ou anticorpos que são capazes de inibir a ligação de e/ou ligar o mesmo epítopo que os referidos anticorpos.

A Tabela 1 abaixo mostra os números de identificação de se- quência, tal como estabelecido na listagem de sequências anexa, para as sequencias de DNA e de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesa- da (V H ) e de cadeias leves (CL) de anticorpos 992, 1024, 1030, 1254, 1277, 1565, 4382, 4384, 4385, 4517, 4518,4785, 5038, 5082 e 5096. Tabela 1 : Os números de identificação de sequência de sequên- cias de DNA e aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeias leves de anticorpos anti-HER selecionados Número do seq.

DNA VH seq. proteína VH seq.

DNA LC seq. proteína LC Anticorpo 992 1 2 3 4 1024 5 6 7 8 1030 9 10 11 12 1254 13 14 15 16 1277 17 18 19 20 1565 21 22 23 24 4382 25 26 27 28 4384 29 30 31 32 4385 33 34 35 36 4517 37 38 39 40 4518 41 42 43 44 4785 45 46 47 48 5038 49 50 51 52 5082 53 54 55 56 5096 57 58 59 60

As Tabelas 2 e 3 abaixo mostram as sequências de aminoácidos da cadeia pesada (Tabela 2) e da cadeia leve (Tabela 3) CDR1, CDR2 e

CDR3 de vários anticorpos anti-HER de acordo com a invenção.

As sequên- cias de aminoácidos da região variável da cadeia pesada e de cadeia leve, incluindo a região variável de cadeia leve, desses anticorpos, bem como as sequências de codificação de DNA (otimizada para a expressão em células CHO) são fornecidas na listagem de sequências anexa.

Ver Tabela 1 acima para uma visão geral dos números de identificação de SEQ para essas se- quências.

Tabela 2 : Sequencias de cadeia pesada CDR1, CDR2 and C- DR3 de anticorpos anti-HER selecionados.

Núm erode CDR1H CDR2 H CDR3 H SEQ E M N O s Anticorpo (CDR1/2/3) 992 GYTFTSYVV IYPGSRST CTRNGDYYVSSGDAMDYW 61-63 1024 GYTFTSHW INPSSGRN CVRYYGYDEAMDYVV 64-66 1030 GFTFSSYA ISGVGST CARGSDGYFYAMDYVV 67-69 1254 GFAYSTYD ISSGGDAA CARSRYGNYGDAMDYVV 70-72 1277 GFAFSYSD MSSAGDVT CVRHRDVAMDYVV 73-75 1565 GYTFTSYVV INPSNGGT CARDGGLYDGYYFDFW 76-78 4382 GYTFTDYY INPNNGGT CVPGGLRSYFDYVV 79-81 4384 GYTFTSHW INPSNGGT CARAYYDFSWFVYVV 82-84 4385 GYTFTGYVV ILPGSGST ARWGDGSFAY 85-87 4517 GFTFSSYG ISGGGSYT CARKGNYGNYGKLAYVV 88-90 4518 GFNIKDIF IDPANDNP CAGGPAYFDYVV 91-93 4785 GYSFTSYY IYPGSGHT CARPPYYSNYADVVV 94-96 5038 GYSITSGFY ISYDGSN CARGGGYYGNLFDYVV 97-99 5082 GYSITSAYY IGYDGRN CSREGDYGYSDYVV 100-102 5096 GYTFTSYL INPYNDGA CAREGDYVRYYGMDYVV 103-105

Tabela 3 : Sequencias de cadeia leve CDR1, CDR2 and CDR3 de anticorpos anti-HER selecionados.

Anticorpo L CDR1 L CDR2 L CDR3 SEQ ID NOs Number (CDR1/2/3) 992 QDIGNY YTS CQHYNTVPPTF 106-108 1024 KSLLHSNGITY QMS CAQNLELPYTF 109-111 1030 KSVSTSGYSF LAS CQHSREFPLTF 112-114 1254 QSLVHSNGNTY KVS CSQNTHVYTF 115-117 1277 QSLVHSNGNTY KVS CSQSTHVPTF 118-120 1565 QDVDTA WAS CQQYSSYPLTF 121-123 4382 QDVSAA WAS CQQHYTTPPTF 124-126 4384 QDISNY YIS CQQGNTLPLTF 127-129 4385 QNVGTA STS CQQYRSYPFTF 130-132 4517 ENIYSN MT CQHFWGTPVVTF 133-135 4518 QDVIAA WAS CQQHYSTPVVTF 136-138 4785 QSLLNSGNQKNY WAS CQSDYSYPYTF 139-141 5038 QDISNY HTS CQQGITLPVVTF 142-144 5082 QDINNY YTS CQQSETLPVVTF 145-147 5096 QSVLYISNERNY WAS CHQHLSSYTF 148-150

Além disso, a fim de ser capaz de realizar um estudo de toxico- logia em um primata não humano, é preferível que todos os anticorpos na composição se liguem a humano bem como a, pelo menos, um receptor da família ErbB de outro primata, tal como ErbB de chimpanzés (Pan troglodi- 5 tas), macaco Rhesus (Macaca mulatta), macaco cinomolgo (Macaca fascicu- laris) ou outros macacos.

Macaco cinomolgo é um animal relativamente pe- queno e muito bem adaptado para estudos toxicológicos.

Portanto, o recep- tor da família ErbB de outro primata é, de preferência da família ErbB Cyno- molgus.

De preferência, os anticorpos se ligam com aproximadamente a mesma afinidade a ErbB humanos e de primatas não humanos.

Uma outra característica preferida das composições dos anticor- pos é a homogeneidade de proteína, de modo que os anticorpos podem ser purificados facilmente.

Para os elementos de anticorpo individuais, um perfil de cromatografia de permuta iônica com um pico distinto é a preferida para facilidade de caracterização.

Um claro perfil de cromatografia de troca iônica também é o preferido para facilitar a caracterização da composição de anti- corpo final.

Também é preferível quando se combinam os anticorpos que podem ser distinguidos utilizando cromatografia de permuta iônica, de modo que a composição com todos os anticorpos pode ser caracterizada em uma execução.

Os anticorpos podem ser de qualquer origem, tais como huma- no, murino, coelho, galinha, porco, lhama, ovelhas e camelos.

Os anticorpos também podem ser quiméricos, como descrito nos exemplos, ou podem ser versões humanizadas, superhumanizados ou reformuladas do mesmo, utili- zando métodos bem conhecidos descritos na técnica.

Os anticorpos podem ser formulados em um recipiente para a administração.

Entretanto, eles podem ser fabricados, purificados e caracte- rizados individualmente e ser fornecidos em recipientes separados, como um kit de partes, com um anticorpo em cada recipiente.

Como tal, eles podem ser administrados simultaneamente, sucessivamente ou separadamente.

Outro aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucle- ico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um anti-

corpo da invenção, ou seja, um anticorpo selecionado do grupo consistindo de anticorpos 992, 1024, 1030, 1254, 1277, 1565, 4382, 4384, 4385, 4517, 4518, 4785, 5038, 5082, e 5096, ou uma sua variante humanizada, ou que codifica uma sequência da região variável de cadeia pesada e/ou leve de um 5 tal anticorpo, ou uma sequência de cadeia pesada e/ou leve tendo, pelo me- nos, tendo pelo menos, 90% ou 95% de identidade de sequência com a se- quência de referência, tal como, pelo menos, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com tal sequência da região variável de cadeia pe- sada e/ou leve.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um vetor de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico tal como defini- do acima.

Como mencionado acima, vetores de expressão para utilização no contexto da presente invenção podem ser de qualquer tipo apropriado co- nhecido na técnica, por exemplo, um plasmídeo ou um vetor viral.

Ainda um outro aspecto da invenção refere-se a uma célula hos- pedeira compreendendo uma molécula de ácido nucleico tal como definido acima, em que a referida célula hospedeira é capaz de expressar um anti- corpo codificado pela referida molécula de ácido nucleico.

Produção de anticorpos da invenção e composições de anticorpo Um aspecto adicional da invenção refere-se a métodos para a produção de anticorpos recombinantes visando a familia do receptor de fator de crescimento epidérmico (HER) e composições compreendendo os anti- corpos da invenção.

Uma modalidade deste aspecto da invenção refere-se a um método para a produção dos anticorpos, tal como aqui definido, compre- endendo prover uma célula hospedeira como acima definido capaz de ex- pressar um anticorpo, cultivando a referida célula hospedeira sob condições adequadas para a expressão do anticorpo, e isolando o anticorpo resultante.

Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um método para a produção de composição de anticorpos recombinantes compreen- dendo anticorpos anti-HER recombinantes tal como aqui descritos, o método compreendendo prover um conjunto de células, em que cada célula é capaz de expressar um anticorpo anti-HER recombinante, cultivando células em condições adequadas para a expressão dos anticorpos da composição, e isolando os anticorpos resultantes.

Um anticorpo ou composição de anticorpo da presente invenção pode ser produzido por métodos geralmente conhecidos na técnica para a 5 produção de anticorpos monoclonais ou policlonais recombinantes.

Assim, no caso da produção de um único anticorpo da invenção, qualquer método conhecido na técnica para a produção de anticorpos monoclonais recombi- nantes pode ser utilizado.

Para a produção de uma composição de anticor- pos da invenção, os anticorpos individuais podem ser produzidos separada- mente, ou seja, cada anticorpo sendo produzido em um bioreator em sepa- rado, ou os anticorpos individuais podem ser produzidos em conjunto em biorreator único.

Se a composição de anticorpos é produzida em mais de um biorreator, a composição de anticorpos anti-HER purificada pode ser ob- tida por conjugação dos anticorpos obtidos de sobrenadantes individualmen- te purificados a partir de cada biorreator.

Várias abordagens para-a produção de uma composição de anticorpo policlonal em múltiplos biorreatores, em que as linhas de células ou preparações de anticorpo são combinadas em um momento posterior, a montante ou antes ou durante o processamento a jusante, estão descritos em WO 2009/129814 (incorporada por referência). No caso da produção de anticorpos individuais em um biorreator único, isto pode ser realizado, por exemplo, como descrito no documento WO 2004/061104 ou WO 2008/145133 (ambos os quais estão aqui incorpo- rados por referência). O método descrito no documento WO 2004/061104 é baseado em uma integração específica de local da sequência codificadora de anticorpo no genoma das células hospedeiras individuais, assegurando que as cadeias de proteina V H e V L são mantidas no seu emparelhamento original durante a produção.

Além disso, a integração específica de local mi- nimiza os efeitos da posição, e, por conseguinte, as propriedades de cresci- mento e de expressão das células individuais na linha celular policlonal são esperadas ser muito semelhantes.

Geralmente, o método envolve o seguin- te: i) uma célula hospedeira com um ou mais locais de reconhecimento de recombinase, ii) um vetor de expressão com pelo menos um local de reco-

nhecimento de recombinase compatível com aquele da célula hospedeira, iii) geração de um conjunto de vetores de expressão transferindo os pares de codificação V H e VL selecionado a partir do vetor de triagem para um vetor de expressão tal que um anticorpo de comprimento completo ou um frag- 5 mento de anticorpo pode ser expresso a partir do vetor (tal transferência po- de não ser necessário, se o vetor de triagem é idêntico ao vetor de expres- são), iv) transfeção da célula hospedeira com a coleção de vetores de ex- pressão e um vetor que codifica para uma recombinase capaz de combinar os locais de reconhecimento de recombinase no genoma da célula hospe- deira com aquele no vetor, v) obtenção/geração de uma linha celular policlo- nal a partir da célula hospedeira transfectada e vi) expressar e recolher a composição de anticorpos da linha de células policlonal.

O documento WO 2008/1 451 33 descreve uma abordagem alter- nativa para a produção de anticorpos em um único biorreator.

Este método envolve a geração de uma linha celular policlonal, capaz de expressar um anticorpo policlonal ou outra proteina policlonal, compreendendo dois ou mais elementos distintos através de a) fornecimento de um conjunto de veto- res de expressão, em que cada um dos referidos vetores compreende pelo menos uma cópia de um ácido nucleic° distinto que codifica um elemento distinto de proteína policlonal, separadamente transfectando células hospe- deiras com cada um dos vetores de expressão sob condições evitando a integração específica de local dos vetores de expressão no genoma das cé- lulas, obtendo-se assim duas ou mais composições de células, cada compo- sição expressando um elemento distinto da proteína policlonal, e c) misturar as pelo menos duas composições de células para obter uma linha celular policlonal.

Os métodos de WO 2004/061104 e WO 2008/145133, ambos, têm a vantagem de permitir que todos os elementos que constituem o anti- corpo policlonal recombinante sejam produzidos em um biorreator e ser puri- ficados em um processo único, evitando assim a necessidade de produção separada e os processos de purificação para cada anticorpo, enquanto, ao mesmo tempo que resultam numa produção surpreendentemente uniforme dos diferentes anticorpos.

O método de WO 2008/145133 tem a vantagem adicional de prover um aumento do rendimento, uma vez que a produção de cada célula pode realizar múltiplas cópias do polinucleotídeo que codificam um determinado anticorpo.

Os anticorpos da invenção podem ser produzidos em vários ti- 5 pos de células, incluindo células de mamíferos, assim como células eucarió- ticas ou procarióticas de não mamíferos, tais como células vegetais, células de insetos, células de levedura, fungos, E . coli, etc.

Entretanto, os anticorpos são, de preferência, produzidos em células de mamíferos, por exemplo célu- las CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, célu- Ias Sp2/0 e NSO ), fibroblastos, tais como NIH 3T3, ou células humanas imor- talizadas, tais como células HeLa, células HEK 293 ou células PER.C6. Métodos para a transfeção de uma sequência de ácido nucleic° para uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica (vide, por e- xemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Edition, 2001). Para a integração espe- cífica de local, por exemplo, como descrito no documento WO 2004/061104, uma célula hospedeira adequada irá compreender um ou mais locais de re- conhecimento de recombinase no seu genoma.

Neste caso, um vetor de ex- pressão adequado compreende um local de reconhecimento de recombina- cão correspondente a local(is) de reconhecimento de recombinase da célula hospedeira.

Mais detalhes sobre, por exemplo, transferência de pares de codificação V H e V I_ selecionado de um vetor de triagem utilizando a aborda- gem de integração específica de local podem ser encontrados no documento WO 2004/061104. Uma composição de anticorpo recombinante da presente inven- ção pode ser preparada em um único biorreator por cultura de uma ampola a partir de um banco de células de trabalho policlonais (pWCB) em um meio apropriado durante um período de tempo para permitir um nível suficiente de expressão de anticorpo mantendo uniformidade substancial nos níveis de expressão relativos dos anticorpos individuais expressos pela linha de célu- las policlonal.

Um tempo de produção de aproximadamente entre 15 e 50 dias será normalmente adequado.

Podem ser utilizados métodos de cultivo conhecidos na técnica, tais como a cultura de lote alimentada ou perfusão.

O meio de cultura é de preferência um meio isento de soro, mais de preferên- cia, um meio isento de soro e isento de proteína, por exemplo, um meio qui- micamente definido.

Tais meios de cultura são normalmente projetados para 5 o crescimento do tipo de célula particular sendo utilizado para a produção, e numerosas formulações de meios adequados estão disponíveis comercial- mente.

A composição de anticorpo recombinante é obtida a partir do meio de cultura e purificada por técnicas de purificação convencionais.

Estes podem incluir, por exemplo, cromatografia de afinidade combinado com eta- pas de purificação subsequentes, tais como cromatografia de permuta iõni- ca, cromatografia de interação hidrofóbica e filtração em gel, tal como as técnicas de purificação têm sido frequentemente utilizados para a purificação de anticorpos recombinantes.

Quando dois ou mais anticorpos são produzi- dos por uma linha celular policlonal num biorreator único, a presença de to- dos os elementos individuais na composição de anticorpo policlonal é tipi- camente avaliada após a purificação, por exemplo, por cromatografia de permuta iônica.

Caracterização de uma composição de anticorpo policlonal pode ser realizada, por exemplo, como descrito no documento WO 2006/007853 e WO 2009/065414 (aqui incorporado por referência). Composições terapêuticas Outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo como um ingrediente ativo uma composição de anticorpos da invenção, ou um Fab recombinante ou outra composição de fragmento de anticorpo recombinante.

Tais composições são destinadas para melhoria, prevenção e/ou tratamento de cancer.

A composição farmacêutica pode ser administrada a um ser humano ou a um animal doméstico ou de estimação, mas normalmente sera administrado a seres humanos.

A relação entre os anticorpos individuais de uma composição te- rapêutica da invenção, ou, no caso de anticorpos individuais da invenção sendo administrados simultaneamente, sequencialmente ou separadamente, serão frequentemente de tal modo que os anticorpos são administrados em quantidades iguais, mas isso não precisa ser necessariamente o caso.

As- sim, uma composição da invenção compreendendo dois anticorpos anti-HER frequentemente irão contê-los em uma proporção de 1:1, e uma composição compreendendo três anticorpos anti-HER frequentemente irão contê-los em 5 uma relação 1:1:1. Dependendo das características dos anticorpos individu- ais, entretanto, pode ser desejável utilizar quantidades não iguais dos dife- rentes anticorpos.

Proporções adequadas para os diferentes anticorpos anti- HER em composições da invenção podem ser determinadas como descrito no documento WO 2010/040356 (aqui incorporado por referência), que des- creve métodos para identificar e selecionar a relação estequiométrica ótima entre entidades químicas em um produto fármaco combinatório, por exem- plo, uma composição de anticorpo policlonal, para se obter um fármaco combinatório com potência e eficácia ótima.

Além do composição de anticorpos da invenção, ou fragmentos da mesma, a composição farmacêutica irá ainda compreender pelo menos um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Estes po- dem incluir, por exemplo conservantes, estabilizantes, agentes tensioati- vos/molhantes, agentes emulsionantes, solubilizantes, sais para regulação da pressão osmótica e/ou tampões.

Soluções ou suspensões podem com- preender ainda substância para o aumento da viscosidade, tais como carbo- ximetilcelulose de sódio, carboximetilcelulose, dextrano, polivinilpirrolidona ou gelatina.

Um valor de pH adequado para a composição farmacêutica es- tará geralmente na faixa de cerca de 5,5 a 8,5, tal como cerca de 6 a 8, por exemplo, cerca de 7, mantido, se necessário, através da utilização de um tampão.

A prática farmacêutica convencional pode ser empregue para prover formulações ou composições adequadas para administrar, por exem- plo, pacientes com câncer.

A administração será tipicamente terapêutica, significando que é administrado após uma condição de câncer ser diagnosti- cada.

Qualquer via de administração apropriada pode ser empregue, por exemplo, parentérica, intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, aerossol, supositório ou administração oral.

Com-

posições farmacêuticas da invenção serão tipicamente administradas sob a forma de soluções ou suspensões líquidas, mais tipicamente soluções aquo- sas ou suspensões, em especial soluções ou suspensões aquosas isotõni- cas. 5 As composições farmacêuticas da invenção são preparadas de uma maneira conhecida per se, por exemplo, por meio de dissolução, liofili- zação, mistura, granulação ou processos de confecção convencionais.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional (vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21st edition), ed.

A.

R . Gennaro, 2005, Lippincott Wil- liams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA, e Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, ed.

J.

Swarbrick, 3 a edição, 2006, Informa Healthcare, New York, NY, EUA). Como uma alternativa para uma formulação líquida, as composi- ções da invenção podem ser preparadas na forma liofilizada compreendendo pelo menos um anticorpo sozinho ou juntamente com um veículo, por exem- plo manitol, caso em que a composição é reconstituída com um líquido tal como água estéril antes da utilização.

As composições farmacêuticas compreendem desde aproxima- damente 1% a aproximadamente 95%, de preferência desde aproximada- mente 20% a aproximadamente 90%, de ingrediente ativo.

Composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem, por exemplo, ser produzi- das na forma de dose unitária, tal como na forma de ampolas, frascos, supo- sitórios, comprimidos ou cápsulas.

As formulações podem ser administradas a indivíduos humanos em quantidades terapeuticamente ou profilaticamente eficazes (por exemplo, quantidades que previnem, eliminam ou reduzem a condição patológica) para prover uma terapia para uma doença cancerosa ou outra condição.

A dosagem preferida de agente terapêutico a ser admi- nistrado depende provavelmente de variáveis tais como a gravidade do can- cer, o estado geral de saúde do paciente em particular, a formulação dos excipientes do composto, e da sua rota de administração.

As utilizações terapêuticas de composições de anticorpos de a-

cordo com a invenção As composições farmacêuticas de acordo com a presente inven- cão podem ser utilizadas para o tratamento ou a melhoria de uma doença em um mamífero, em particular, tratamento de câncer em seres humanos. 5 Uma modalidade da invenção é um método de prevenção, tratamento ou melhoria de um ou mais sintomas associados com o câncer em um ser hu- mano ou outro mamífero, compreendendo a administração de uma quanti- dade efetiva da composição farmacêutico de anticorpos da presente inven- cão ao referido mamífero.

Uma modalidade particular refere-se a um método para o trata- mento de um paciente humano com uma doença caracterizada pela sobre- expressão ou a dependência de qualquer dos elementos da familiar HER, em particular cancer, o método compreendendo a administração ao referido paciente de uma composição de anticorpos recombinante como aqui defini- do.

Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um método para o tratamento de câncer em um ser humano ou outro mamífero tendo adquiriram resistência ao tratamento com anticorpos e/ou inibidores da tiro- sina quinase (TKIs), o método compreendendo a administração ao referido mamífero de uma quantidade eficaz de um composição de anticorpos tal como aqui definida.

Com base numa série de fatores, os seguintes tipos de tumores, em particular, podem ser indicados para tratamento com uma composição de anticorpos da invenção: da mama, do ovário, gástrico, do cólon, recto, próstata, bexiga, pâncreas, melanoma, cabeça e pescoço, e câncer de pul- mão de células não pequenas.

Composições de anticorpos da invenção es- tão contempladas para ser particularmente aplicáveis para tratamento de cancer que sobre-expressa EGFR ou HER2, por exemplo, certos tipos de câncer epitelial, tais como muitos tipos de câncer de mama, câncer de ovário e cânceres gástricos (estômago). Em conexão com cada uma destas indicações, dois percursos clínicos principais são contemplados, nomeadamente, 1 ) terapêutica adju-

vante em relação a pelo menos um tratamento terapêutico adicional ou 2) como uma monoterapia.

Estas duas opções estão brevemente discutidas abaixo. 1 ) Terapia adjuvante: Na terapia adjuvante, também conhecida 5 como terapia de combinação, pacientes serão tratados com anticorpos da presente invenção em combinação com, pelo menos, um tratamento tera- pêutico adicional, tipicamente um agente quimioterapêutico ou anti- neoplásico e/ou terapia de radiação.

Alternativamente ou adicionalmente, a composição da invenção também pode ser utilizada em combinação com um diferente anticorpo anticâncer, por exemplo, um anticorpo alvejando VEGF.

Os alvos de câncer primários listados acima podem, assim, ser tratados pela administração de um anticorpo ou composição da invenção em adição A te- rapia de primeira linha padrão e terapia de segunda linha.

Projetos de proto- colo irão abordar a eficácia como, por exemplo, avaliada por redução da massa do tumor, bem como a capacidade para reduzir as doses habituais da quimioterapia convencional.

Estas reduções de dosagem podem permitir terapia adicional e/ou prolongada, reduzindo a toxicidade relacionada com a dose do agente quimioterapêutico.

Ao combinar as composições de anticorpos da invenção com agentes conhecidos que induzem a diferenciação das células cancerosas, o efeito pode ser melhorado ainda mais.

Tais compostos podem, por exemplo, ser selecionados do grupo consistindo de ácido retinoico, ácidos trans- retinoico, ácidos cis-retinoicos, fenilbutirato, fator de crescimento de nervos, dimetilsulfóxido, a forma ativa de vitamina D3, receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma, 13-acetato de 12-0-tetradecanolforbol, hexa- metileno-bis-acetamida, fator beta de crescimento transformante, ácido butí- rico, AMP cíclico, e vesnarinona.

De preferência, o composto é selecionado do grupo consistindo de ácido retinoico, fenilbutirato, ácido all-trans-retinoico, e forma ativa de vitamina D . Artigos farmacêuticos compreendendo uma composição de anti- corpos da invenção e pelo menos um composto quimioterapêutico, ou anti- neoplásico pode ser utilizado como um tratamento de combinação para a administração simultânea, separada ou sucessiva em terapia de câncer.

O composto quimioterapêutico pode, por qualquer agente quimioterapêutico adequado para tratamento do câncer particular em causa, por exemplo, um agente selecionado do grupo que consiste de agentes de alquilação, por e- 5 xemplo, derivados de platina, tais como cisplatina, carboplatina e/ou oxalipla- tina; alcoides de plantas, por exemplo, paclitaxel, docetaxel, e/ou irinoteca- no; antibióticos antitumorais, por exemplo, doxorrubicina (adriamicina), dau- norubicina, epirubicina, idarubicina mitoxantrona, dactinomicina, bleomicina, actinomicina, luteomicina, e/ou mitomicina; inibidores da topoisomerase, tais como o topotecano, e/ou antimetabólitos, por exemplo, fluorouracil e/ou ou- tros fluoropirimidinas.

É também considerado que as composições de anticorpos da in- venção pode ser utilizada em terapia adjuvante em conexão com inibidores de tirosina quinase (TKI). Estas são moléculas sintéticas, principalmente de- rivadas de quinazolina, de baixo peso molecular que interagem com o domí- nio de tirosina quinase intracelular de receptores e inibindo a fosforilação do receptor induzida pelo ligante competindo pelo local de ligação Mg-ATP in- tracelular.

Vários inibidores de tirosina quinase que bloqueiam quinase HER2 estão atualmente em desenvolvimento clínico.

Algumas delas também visam EGFR ou outros receptores da família EGFR.

Para uma revisão des- tes TKIs ver Spector et a L (2007) Breast Cancer Res. 9(2):205. Artigos far- macêuticos compreendendo uma composição de anticorpos da invenção e pelo menos um inibidor da tirosina quinase alvejando HER2 pode assim ser também utilizado como um tratamento de combinação para a administração simultânea, separada ou sucessiva em terapia de câncer.

Em outras modalidades, as composições de anticorpos da pre- sente invenção podem ser utilizadas em combinação com outras terapias de anticorpo.

Exemplos destas incluem, por exemplo, anticorpos contra EGFR (Erbitux ® ou Vectibix ®) ou VEGF (Avastin ®). Ainda em outras modalida- des, as composições de anticorpos da presente invenção podem ser utiliza- das em combinação com um agente conhecido para estimular células do sistema imune, tal tratamento de combinação levando a um aumento da efi-

cácia imuno mediada aumentada das composições de anticorpos da inven- ção.

Exemplos de tais agentes imunoestimulantes incluem interleucinas re- combinantes (por exemplo, IL-21 e 1 L -2 ). 2) Monoterapia: Em ligação com o uso do composição de anti- 5 corpos de acordo com a presente invenção em monoterapia de tumores, a composição de anticorpos podem ser administrada a pacientes sem a utili- zação simultânea de um agente quimioterapêutico, ou antineoplásico, ou seja, como uma terapia isolada. lmunoconiugados Outra opção para o uso terapêutico das composições da inven- cão é sob a forma de imunoconjugados, ou seja, anticorpos conjugados com um ou mais agentes anticancer.

Em particular, no caso de composições da invenção que se ligam a epítopos diferentes, está contemplado que pode gerar uma grade anticorpo-receptor reticulada na superfície da célula, deste modo potencialmente resultando em um aumento do nível de internalização do receptor em comparação com a utilização anticorpo de um único anticor- po monoclonal.

Conjugação de um ou mais dos anticorpos individuais de tal composição a um ou mais agentes anticancer, por conseguinte, tem o po- tencial de fornecer eficazmente e especificamente os agentes anticancer conjugados para o interior das células tumorais, aumentando assim o efeito da composição de anticorpos da invenção para prover uma melhor atividade de matar células de tumor.

Vários tipos de agentes anticancer podem ser conjugados com os anticorpos da invenção, incluindo os agentes citotóxicos (incluindo os a- gentes de quimioterapia convencionais, e outras pequenas moléculas de fármacos anti-cancer), citocinas (em cujo caso, o conjugado pode ser desig- nado como uma "imunocitocina"), toxinas (caso em que o conjugado pode ser designado como uma "imunotoxina") e radionuclídeos, e alguns imuno- conjugados já foram aprovados para uso clínico.

Estes incluem Zevalin 0 (um anticorpo anti-CD20 de murino conjugado com 9 0 Y ),Bexxar ® (anticorpo anti-CD20 de murino conjugado com 1 3 1 1 e) Mylotarg e (um anticorpo anti- CD33 humanizado conjugado com caliqueamicina). Outros imunoconjugados que foram testados em ensaios clínicos incluem anticorpos conjugados, por exemplo, a doxorrubicina ou um composto de maitansinoide.

As imunotoxi- nas que foram testadas em vários ensaios clínicos incluem diversos anticor- pos conjugados a uma exotoxina A de Pseudomonas truncada.

Uma imuno- 5 citocina compreendendo um anticorpo EpCAM humanizado conjugado com IL-2 também foi testada.

No caso de anticorpos da invenção conjugado a agentes citotó- xicos, por exemplo, estes podem pertencer a qualquer uma das classes principais de fármacos de quimioterapia, incluindo agentes alquilantes (por exemplo, carboplatina, cisplatina, oxaliplatina), antimetabólitos (p. ex., meto- trexato, capecitabina, gemcitabina), antraciclinas (por exemplo, bleomicina, doxorubicina, mitomicina-C) e alcaloides vegetais (por exemplo, taxanos tais como docetaxel e paclitaxel, e alcaloides vinca tais como vinblastina, vincris- tina e vinorelbina). Uma vez que a utilização de imunoconjugados dirige es- pecificamente o agente anticancer para os tumores, e em particular para o interior das células tumorais subsequentes à internalização, imunoconjuga- dos com base nos anticorpos da invenção pode vantajosamente basear-se em agentes altamente citotóxicos tais como caliqueamicina ou derivados de maitansina, ou sobre toxinas tais como toxinas bacterianas (por exemplo, exotoxina A de Pseudomonas, toxina da difteria) ou toxinas de plantas (por exemplo, ricina). O agente anticâncer conjugado em um imunoconjugado está ge- ralmente ligado ao anticorpo através de um ligante lábil que é relativamente estável no soro, mas que permite a liberação do agente quando o imunocon- jugado é internalizado na célula-alvo.

Os ligantes adequados incluem, por exemplo, ligantes químicos que são estáveis a pH neutro no soro, mas estão sujeitos a hidrólise ácida em condições moderadamente ácidas dentro dos lisossomas subsequentes à internalização, ligantes de dissulfureto que são clivadas por tióis intracelulares, e ligantes peptídicos que são estáveis em soro, mas que são sujeitos a clivagem enzimática em compartimentos intra- celulares.

Vários arranjos de conjugação podem ser vislumbrados em composições contendo dois ou mais anticorpos da invenção.

Por exemplo, com dois anticorpos seria possível conjugar os anticorpos a dois ou mais diferentes fármacos anticancer ou conjugar um anticorpo para um pró- fármaco que é ativado por um agente tal como uma enzima conjugada com 5 o outro anticorpo.

O conceito geral de terapia de pró-fármaco enzima dirigida a anticorpo (ADEPT) foi descrito para anticorpos monoclonais, onde um pró- fármaco é ativado por uma enzima voltada para o tumor por um conjugado mAB-enzima, mas a presente invenção pode fornecer uma oportunidade para adaptar esta abordagem As condições particulares.

Assim, pode ser possível aumentar especificamente a morte da célula do tumor, poupando ou reduzir os danos causados aos tecidos normais.

Para mais informações sobre imunoconjugados anti-câncer, ver Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Schrama et al. (2006)/Nature Reviews/Drug Discovery 5:147-159, e Rohrer (2009) chimica oggi/Chemistry Today 27(5):56-60. Dose e rota de administração As composições de anticorpos da invenção sera administrada em uma quantidade eficaz para tratamento da condição em questão, ou se- ja, em dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar o resul- tado desejado.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de a- cordo com fatores tais como a condição particular a ser tratada, a idade, se- xo e peso do pacienteo, e se os anticorpos estão sendo administrados como um tratamento isolado ou em combinação com um ou mais tratamentos anti- câncer adicionais.

Uma quantidade eficaz para a terapia de tumores pode ser me- dida pela sua capacidade para estabilizar a progressão da doença e/ou me- lhorar os sintomas de um paciente e, de preferência, inverter a progressão da doença, por exemplo, por redução do tamanho do tumor.

A capacidade de um anticorpo ou composição da invenção para inibir o câncer pode ser avaliada por ensaios in vitro, por exemplo, como descrito nos exemplos, bem como em modelos animais adequados que sejam preditivos da eficácia em tumores humanos.

Os regimes de dosagem adequados serão selecionados de modo a prover uma resposta terapêutica ótima em cada situação particu- lar, por exemplo, administrados em um bolus único, ou como infusão conti- nua, e com a possibilidade de ajuste da dose, tal como indicado pelas exi- gências de cada caso. 5 Embora a dosagem específica para anticorpos de acordo com a invenção ainda não tenha sido determinada, certas considerações de dosa- gem podem ser determinadas através de comparação com um produto simi- lar (por exemplo, um anticorpo monoclonal dirigido contra HER2 ou EGFR), que foi aprovado para uso terapêutico.

É assim contemplado que uma dosa- gem apropriada de uma composição de anticorpos da invenção será similar a dose recomendada para o anticorpo monoclonal anti-HER2 trastuzumab (Herceptin 0) ou o anticorpo monoclonal anti-EGFR panitumumab (Vectibix ®). Dependendo da condição particular, Herceptin ® é administrado (por meio de infusão) para tratamento do câncer de mama em uma dose inicial de 4 mg/kg e doses semanais subsequentes de 2 mg/kg, ou seja uma dose inicial de 8 mg/kg e doses subsequentes de 6 mg/kg de três em três sema- nas, enquanto Vectibix ® é administrado em uma dose de 6 mg/kg a cada 14 dias.

É contemplado que uma dose adequada de uma composição de anticorpos da invenção estará no intervalo de 0,1 - 100 mg/kg, tal como cer- ca de 0,5 - 50 mg/kg, por exemplo, cerca de 1 - 20 mg/kg.

A composição de anticorpos pode por exemplo ser administrada em uma dosagem de pelo menos 0,25 mg/kg, por exemplo, pelo menos 0,5 mg/kg, tal como pelo me- nos 1 mg/kg, por exemplo, pelo menos 1,5 mg/kg, tal como pelo menos 2 mg/kg, por exemplo, pelo menos, 3 mg/kg, tal como pelo menos 4 mg/kg, por exemplo, pelo menos 5 mg/kg e, por exemplo, até, no máximo, 50 mg/kg, tal como até no máximo 30 mg/kg, por exemplo, até no máximo 20 mg/kg, tal como até no máximo 15 mg/kg.

A administração irá normalmente ser repeti- da em intervalos apropriados, por exemplo, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, ou uma vez a cada qua- tro semanas, e durante o tempo que for considerado adequado pelo médico responsável, que pode, opcionalmente, aumentar ou diminuir a dose con-

forme o necessário. Três abordagens distintas de entrega são contempladas para a entrega dos anticorpos da invenção. Administração intravenosa convencio- nal será presumivelmente a técnica padrão de entrega para a maioria dos 5 tumores. Entretanto, em ligação com os tumores na cavidade peritoneal, tais como os tumores dos ovários, do duto biliar, de outros dutos e similares, a administração intraperitoneal pode ser favorável para a obtenção de uma elevada dose de anticorpos para o tumor e para minimizar a depuração do anticorpo. Da mesma forma, certos tumores sólidos possuem vasculatura que é apropriada para a perfusão regional. Perfusão regional pode permitir a obtenção de uma elevada dose do anticorpo ao local de um tumor e minimi- zar a depuração de curto prazo do anticorpo. Tal como qualquer produto terapêutico baseado em infusão de proteína ou anticorpo, preocupações de segurança estão principalmente re- lacionadas com (i) síndrome de liberação de citocinas, isto é, hipotensão, febre, tremores, arrepios, (ii) o desenvolvimento de uma resposta imunogé- nica à proteína (isto é, o desenvolvimento de anticorpos humanos por parte do paciente para o produto de anticorpo recombinante), e (iii) toxicidade para as células normais que expressam os receptores da família HER, por exem- plo, muitas células epiteliais. Testes padrões e procedimentos de acompa- nhamento são utilizados para monitorar quaisquer preocupações de segu- rança. Todas as referências de patentes e de não patentes citadas no presente pedido estão aqui incorporados por referência na sua totalidade. A invenção será ainda descrita nos seguintes exemplos não limi- tantes.

EXEMPLOS Os anticorpos alvejando EGFR e HER2 utilizados nos exemplos seguintes foram todos identificados de acordo com os métodos descritos no documento WO 2008/104183 A2 e WO 2011/107957 Al, que estão aqui in- corporados por referência. O anticorpo monoclonal utilizado como controle mAb nos exemplos é Synagis (Palivizumab). Em todos os Exemplos, a con-

centração no eixo dos x é a concentração total de anticorpo, ou seja, em misturas de dois anticorpos, cada um anticorpo individual compreende 1/2 do total, em misturas de três anticorpos, cada anticorpo individual compre- ende 1/3 do total, e assim por diante. 5 Exemplo 1: Clonagem de anticorpos anti-HER3 Imunização Três fêmeas de camundongo, um BALB/cJ, um camundongo C57BL/6 e um C3H (8-10 semanas de idade), foram utilizados para as imu- nizações.

Os camundongos foram imunizados com proteína HER3 disponí- vel comercialmente (R & D Systems cat. # 348-RB). Para os primeiros quatro imunizações, a proteína HER3 foi diluída em PBS e misturada a 1 :1 (v/v) com adjuvante de Freund.

A quinta e última imunização foi administrada sem adjuvante com a proteína HER3 em PBS.

Adjuvante é utilizado para aumentar e modular a resposta imu- ne.

Na primeira imunização foi utilizado o adjuvante completo de Freund (CFA), ao etapa que o adjuvante incompleto de Freund (IFA) foi utilizado para a segunda, terceira e quarta imunização.

IFA 6 . uma emulsão de óleo em água constituída por óleos minerais, e CFA é IFA contendo as espécies de Mycobacterium secas, mortas por calor.

Ambos os adjuvantes têm um efeito de depósito.

A micobactéria em CFA resulta numa forte ativação do sistema imune, que conduz a persistência de longo prazo da resposta imu- ne.

Só emulsões estáveis foram administradas aos camundongos.

Dez pg de proteína HER3 recombinante foram utilizados para cada imunização.

No total, os camundongos receberam cinco injeções.

To- dos os camundongos foram injetados por via subcutânea (s.c.) com 200 pl de emulsão adjuvante de antígeno, as primeiras quatro injeções e intraperi- tonealmente (i.p.) com 100 pl de antígeno em PBS para a quinta injeção.

Um resumo das imunizações, adjuvantes, vias de injecção, etc., encontra-se na Tabela 4. Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e os baços e os nódulos linfáticos inguinais foram colhidos.

Suspensões de células individuais foram preparadas por maceração através de um filtro de células de 70 pm (Falcon, BD Biosciences, Cat. No.352350). As células dos três camundongos foram reunidas, ressuspensas em RPMI-1640 frio com 10% de FBS e centrifugadas. Tabela 4: Resumo de Imunização. Dia Imunização Adjuvante pg/dose de conc. de anti- Volume Rota de ad- antigen° geno pg/mL da dose ministração O 1' CFA 10 50 200 pl s.c. 21 2. IFA 10 50 200 pl S .C . 42 3 `. IFA 10 50 200 pl s.c. 69 4" IFA 10 50 200 pl s.c. 86 5. PBS 10 100 100 pl i.p. 89 Colheita de - - órgãos 5 Classificação FACS de células plasmáticas de murino Para remover as células vermelhas de sangue a suspensão de células agrupadas foram lisadas em 0,17 M de NH4CI.Após a lise, as células foram lavadas duas vezes com FBS/PBS a 2%. As células foram ressuspen- sas em 1 mL de FBS/PBS a 2%, incubadas com Fc-bloco (anti-camundongo CD16/CD32, BD Biosciences, cat. No. 553141) e lavados uma vez. Após ressuspensão em FBS/PBS a 2%, as células foram marcadas com CD43- FITC anti-camundongo (BD Biosciences, Cat. No.553270), CD138-PE anti- rato (BD Biosciences, Cat. No. 553.714), IgM-Horizon anti-rato (BD Biosci- ences, Cat. No. 560.575), IgG1-APC anti-rato (BD Biosciences, Cat. No.

550.874), MHC II anti-rato (1A/I-Ed)-biotina (BD Biosciences, Cat. No. 553622) e B220/CD45R-PerCP anti-rato (BD Biosciences, Cat. No. 553093) por 20 minutos no escuro. As células foram lavadas, incubadas com estrep- tavidina-APC-Cy7 (BD Biosciences, cat. No. 554063) durante 20 minutos e lavadas. As células foram classificadas FACS em um classificador de células foram FACSAria. As células que foram B220bai'MHCIli11tCD43+CD138+IgM- classificadas em uma única célula em placas de micro titulação de 384 po- ços contendo tampão de reação de PCR. As placas foram centrifugadas, congeladas e armazenadas a -80° C . Ligação de pares de cognato V H e V L Ligação de sequências codificantes V H e V L foi realizada sobre as células individuais fechadas como células de plasma, o que facilita o em-

parelhamento de cognatos sequênciais codificadores de V H e V L . O proce- dimento utilizou uma rotina PCR de duas etapas baseado em um multiplex de uma etapa de extensão de sobreposição de RT-PCR seguido por uma PCR aninhada.

As misturas de iniciador usadas no exemplo presente ape- 5 nas amplificam as cadeias leves kappa.

Os iniciadores capazes de amplificar as cadeias leves lambda poderiam, no entanto, ser adicionados ã mistura de iniciador multiplex e mistura de iniciadores de PCR aninhado, se desejado.

Se iniciadores lambda são adicionados, o processo de classificação deve ser adaptado de tal forma que as células positivas lambda não são excluídas.

O princípio para a ligação de sequências do cognato de sequencias VH e VL está descrito em detalhe em WO 2005/042774 e em Meijer et al. (2006) J.

Moi.

Biol. 358(3):764-72. Placas de PCR de 96 poços foram descongeladas e as células classificadas servidas como modelo para RT-PCR de sobreposição- extensão multiplex.

O tampão de triagem adicionada para cada poço antes da classificação de célula única contendo tampão de reação (OneStep RT- PCR Buffer; Qiagen), iniciadores para RT-PCR e inibidor de RNase (RNasin, Promega). ). Os iniciadores utilizados para a extensão de sobreposição de RT-PCR, assim como as concentrações de iniciadores foram os mesmos que os indicados na Tabela 3 do documento WO 2008/104183. Isto foi su- plementado com mistura OneStep RT-PCR5Enzyme (diluição 25x, Qiagen) e mistura de dNTP (200 pM cada) para se obter a concentração final determi- nada em um volume de reação de 20 pl.

As placas foram incubadas durante 30 min a 55° C para permitir a transcrição reversa (RT) do RNA a partir de cada célula.

Após a RT, as placas foram submetidas ao seguinte ciclo de PCR: 10 min a 94°C, 35x (40 seg a 94°C, 40 seg a 60°C, 5 min a 72°C), 10 min a 72°C.

As reações de PCR foram realizadas em um termociclador H2OBIT com um cesto para a selagem separável de 24 placas de 96 poços (ABgene) para facilitar um elevado rendimento.

As placas de PCR foram ar- mazenadas a -20°C após o ciclismo.

Para a etapa de PCR aninhada, placas de 96 poços de PCR fo-

ram preparadas com a seguinte mistura em cada cavidade (reações de 20 pl), para se obter uma dada concentração final: 1 x tampão FastStart (Ro- che), mistura de dNTPs (200 pM cada), mistura de iniciadores aninhados, Phusion DNA Polimerase (0,08 U ; Finnzymes) e FastStart High Fidelity 5 Enzyme Blend (0,8 L ; Roche). Os iniciadores utilizados para a PCR aninha- da, bem como as concentrações de iniciadores foram os mesmos que as indicadas na Tabela 4 do documento WO 2008/104183. Como molde para a PCR aninhada, foi transferido 1 pL de reações de PCR de sobreposição- extensão multiplex.

As placas de PCR aninhadas foram submetidas ao se- guinte termociclo: 35x (30 seg a 95°C, 30 seg a 60°C, 90 seg a 72°C), 10 min a 72°C.

Reações selecionadas aleatoriamente foram analisadas num gel de agarose a 1% para verificar a presença de um fragmento de extensão de sobreposição de aproximadamente 890 pares de bases (pb). As placas fo- ram armazenadas a -20°C até processamento adicional dos fragmentos de PCR.

Os repertórios de pares de codificação V H e VL ligadas de PCR aninhada foram reunidas, sem mistura de pares de diferentes doadores, e foram purificados por eletroforese preparativa em gel de agarose a 1%. A sequência de codificação de cadeia leve constante Kappa humana foi dividi- da por extensão de sobreposição para a região codificadora de VL dos pro- dutos de PCR reunidos de pares de codificação de V H e VL ligados como descrito em WO 2008/104183. A sequência de codificação de cadeia leve constante Kappa humana foi amplificada a partir de um plasmídeo contendo a sequência de codificação de um anticorpo humano com uma cadeia leve kappa numa reação contendo: enzima Phusion (2 U ; Finnzymes), lx tampão Phusion, mistura de dNTPs (200 pM cada), iniciador hKCforw-v2 e iniciador Kappa3' (vide Tabela 5 do documento WO 2008/104183 para iniciadores e as concentrações utilizadas), e o plasmídeo modelo pLL138 (10 ng/pL) em um volume total de 50 pl.

A reação foi submetida ao seguinte termociclo: 25x (30 seg a 95°C, 30 seg a 55°C, 45 seg a 72°C), 10 min a 72°C.

O fragmento de PCR resultante foi purificado por eletroforese preparativa em gel de aga- rose a 1%.

Os fragmentos de PCR agrupados purificados obtidos a partir de cada repertório foram divididos para o fragmento PCR amplificado e purifica- do da região de codificação constante kappa humana (SEQ ID NO: 41) com a seguinte divisão por extensão de sobreposição PCR (volume total de 50 5 pl) contendo: fragmento da região de codificação constante kappa humana (1,4 ng/pL), fragmento de PCR purificadas reunidas (1,4 ng/pL), Phusion DNA polimerase (0,5 U ; Finnzymes) e FastStart High Fidelity Enzyme Blend (0,2 U ; Roche), tampão FastStart lx (Roche), mix dNTP (200 pM cada), ini- ciador mhKCrev e conjunto de primers MJH (vide Tabela 5 de WO 2008/104183 para primers e concentrações utilizadas). A reação foi subme- tida ao seguinte termociclo: 2 min a 95°C, 25x (30 seg a 95°C, 30 seg a 55°C, 1 min a 72°C), 10 min a 72°C. 0 fragmento de PCR resultante (cerca de 4518 pb) foi purificado por eletroforese preparativa em gel de agarose a 1%. Inserção de cognato de pares de codificação V H e V L em um vetor de tria- gem Para identificar anticorpos com especificidade de ligação para HER3, as sequências de codificação V H e VL obtidas foram expressas como anticorpos de comprimento completo.

Esta inserção envolveu o repertório de pares de codificação V H e VL em um vetor de expressão e transfecção numa célula hospedeira.

Um procedimento de clonagem em duas etapas foi utilizado para a geração de um repertório de vetores de expressão que contêm pares de codificação V H e VL ligados.

Estatisticamente, se o repertório de vetores de expressão contém dez vezes mais plasmídeos recombinantes como o núme- ro de pares cognatos de produtos de PCR V H e VL utilizados para a geração do repertório de triagem, existe uma probabilidade de 99% que todos os pa- res de genes únicos estão representados.

Assim, se 400 fragmentos de ge- nes-V de sobreposição-extensão foram obtidos, um repertório de, pelo me- nos, 4.000 clones seria gerado para a triagem para ter uma probabilidade de 99% de obtenção de todos os pares de genes únicos.

Resumidamente, o produto de PCR purificado dos repertórios pares de codificação de VH e VL ligados, emendados A região de codifica- ção constante kappa humana, foram clivados com endonucleases de DNA Xhol e Notl aos locais de reconhecimento introduzidos nos terminais de pro- dutos de PCR.

Os fragmentos clivados e purificados foram ligados em um 5 vetor de expressão de mamífero IgG digerido Xhol/Notl, 00 -VP-002 (descri- to no documento WO 2008/104183), por meio de procedimentos de ligação padrão.

A mistura de ligação foi eletroporada em E . coli e adicionada a 2x YT placas contendo o antibiótico apropriado e incubada a 37 ° C durante a noite.

O repertório de vetores amplificado foi purificado a partir de células recuperadas das placas, utilizando métodos padrão de purificação de DNA (Qiagen). Os plasmídeos foram preparados para a inserção de fragmentos de promotor-líder por clivagem utilizando endonucleases Ascl e Nhel.

Os locais de restrição para estas enzimas foram localizados entre os pares de genes de codificação VH e VL.

Após a purificação do vetor, um fragmento do promotor-líder de mamífero bidirecional digerido Ascl-Nhel foi inserido nos locais de restrição Asei e Nhel, através de procedimentos de ligação padrão.

O vetor ligado foi amplificado em E. coli e o plasmideo foi purificado usando métodos padrões.

O repertório gerado de vetores de triagem foi transforma- do em E . coil através de procedimentos convencionais.

Colônias obtidas fo- ram consolidadas em placas mestres de 384 poços e armazenadas.

Um procedimento em duas etapas foi utilizado para a amplifica- ção de plasmídeos de expressão de mamíferos.

Primeiras bactérias foram lisadas e o DNA desnaturado por incubação em hidróxido de sódio.

Subse- quentemente, a amplificação TempliPhi foi realizada (GE Amersham). Este método utiliza bacteriófago F29 DNA polimerase para amplificar exponenci- almente modelos circulares de DNA de fita dupla por amplificação de círculo rolante.

Para expressão de anticorpos em células de mamífero, o sistema de expressão 293FreestyleTM (lnvitrogen), foi aplicado, utilizando condições de transfecção padrão, tal como recomendado pelo fabricante.

As células foram suplementadas com valproato de 50mM antes da transfecção, e no dia se- guinte triptona Ni foi adicionada a uma concentração final de 1,5% (ply) do volume de transfecção.

Os sobrenadantes contendo anticorpos foram colhi-

dos seis dias após a transfecção.O s níveis de expressãoforam estimados P or ELISA anti-IgG normal.

Triagempara a ligação com proteína HER3 recombinante(ELISA) A especificidadede anticorpofoi determinadapor ELISA usando 5 proteína-HER3recombinantecomo antígeno.

Resumidamente,placas Nunc Maxisorb (C at. # 464718) foram revestidascom 1 pg/ml de proteína HER3 (R & D Systems. cat # 348-LD), diluido em PBS a 4° C durante a noite.

Antes de bloqueioem 50 pl leite-PBS a 2% + 0,05% de Tween 20, as placas foram lavadas um a vez com PBS-T . As placas foram lavadas um a vez com PBS-T e 20 p l de leite-PBS-T a 2% e 1 0 p l de sobrenadantesde transfectantesFreeStyle293foram adicionadose incubados durante 1 hora à temperatura ambiente, após o que as placas foram lavadas um a vez com PBS-T , 20 p l por poço.

Anticorpo secundário (cadeia leve kapa HRP de cabra anti-humano,Serotec, cat. # STAR 100P) diluído 1:25000em leite-PBS-T a 2% foi adicionadopara detectar anticorpos ligados aos poços e incubado durante 1 hora A temperatura ambiente.

As placas foram lavadas uma vez em PBS-T, antes da adição de 25 p l de subs- trato (Kem-En-TecDiagnostics,cat. # 4518) que foi incubadodurante 5 m in. 25 p l de ácido sulfúrico 1 M foram adicionadosapós a incubaçãopara parar a reação.

Sinal específicofoi detectadoem um leitor ELISA a 450 nm . A partir dos dados de ELISA 480 clones positivos de anticorpo foram identificadose selecionadospara análise de sequênciae validaçãoe de ligaçãoa HER3. Análise de sequênciae seleção de clones O s clones identificadospor ELISA como se ligando a HER3 fo- ram recuperadosdas placas mestres originais (formato de 384 poços) e se- meadas em placas de agar para gerar colônias individuais,as quais foram colhidas às culturas de meio LB e incubadasa 37° C O N com agitaçãovigo- rosa.

O DNA de plasmídeofoi isolado a partir dos clones utilizando kit Qia- prep Turbo 96 m ini- prep (Qiagen,cat. # 27193) e submetidoa sequenciação de DNA dos genes V.

As sequênciasforam alinhadase todos os clones úni- cos foram selecionados.Múltiplosalinhamentosde sequênciasobtidas reve- laram a especificidadede cada clone particulare permitiu a identificaçãodos anticorpos únicos.

Após análise da sequência dos clones sequenciados, 33 conjuntos de sequências relacionadas com dois a mais de quarenta elemen- tos, bem como mais de 20 clonotipos que só foram representados uma vez foram identificados.

Cada grupo de sequências relacionadas provavelmente 5 foi derivada através hipermutações somáticas de um clone precursor co- mum.

Em geral, um a dois clones de cada grupo foram escolhidos para vali- dação da sequência e especificidade.

Com base na análise de grupo, 119 clones foram selecionados para a expressão em pequena escala e uma me- lhor caracterização.

As sequências das regiões variáveis de anticorpo sele- cionadas estão mostradas na listagem de sequências.

As sequências da cadeia leve mostradas na listagem de sequências incluem, todas, a mesma região constante kappa humana, que se inicia com amino-ácidos TVAAP e termina na extremidade C-terminal NRGEC.

A fim de validar os clones que codificam anticorpo, o plasmídeo de DNA foi preparado e a transfecção de células CHO-S FreeStyle (Invitrogen) em escala de 2 ml foi realizada quanto à expressão.

Os sobrenadantes foram colhidos 6 dias após a transfecção.

Os níveis de expressão foram estimados com ELISA anti-IgG padrão, e a especificidade foi determinada por ELISA específico para HER3 como des- crito acima em "Triagem para a ligação a proteína HER3 recombinante e triagem de alto rendimento de microscopia confocal de ligação de anticorpo a células com sobre-expressão de HER3 (vide abaixo). Triagempara a liqação com células com sobre-expressão de HER3 (OPERA) Os 119 clones foram rastreados para a ligação a linha celular de câncer da mama de sobre-expressão de HER (MCF-7) utilizando microsco- pia confocal. 10.000 células MCF-7 foram semeadas em cada poço de pla- cas de suporte de células de 384 poços (Perkin Elmer, cat. # 6007439) e deixadas para ligar durante a noite.

O meio foi de novo descartado e as célu- las foram lavadas e fixadas com solução de formaldeido a 2% (Aldrich cat. # 533998). Após a lavagem, 40 pl de sobrenadante de anticorpos foram trans- feridos para cada poço e as placas foram incubadas durante 2 horas, após o que os meios nos poços foram descartados e 30 pl de novos meios conten- do 2 pg/mL de Alexa-488 marcado com IgG anti-humano de cabra (H+L, In-

vitrogen cat. # A11013), 2 pg/ml de CellMask Blue (Invitrogen cat. # H34558) e 1 pM de Hoechst 33342 (Invitrogen cat. # H3570) foram adicionados a ca- da poço e as placas foram incubadas durante mais 30 minutos.

O nível de fluorescência foi então medido utilizando um microscópio confocal de alto 5 rendimento OPERA (Perkin Elmer). A partir dos dados de ligação obtidos por telas de validação ELI- SA e OPERA, 64 clones foram selecionados para a expressão de media es- cala.

Exemplo 2: Seleção de uma mistura ótima de anticorpo con - tra EGFR, HER2 e HER3 respectivamente Este exemplo demonstra que as misturas de anticorpos contra cada um dos receptores da família HER (EGFR, HER2 e HER3) são superio- res aos anticorpos individuais.

Métodos Foram selecionados três anticorpos monoclonais contra cada um dos receptores para este estudo (Tabela 5). Os anticorpos contra os recepto- res se ligam a epítopos não sobrepostos como foi confirmado por análises de Ressonância Plasmonica de Superfície.

Tabela 5: Anticorpos usados no estudo Alvo Anticorpo EGFR 992 quimérico Ig G 1 EGFR 1024 quimérico Ig G 1 EGFR 1030 quimérico Ig G 1 HER2 4382 quimérico Ig G 1 HER2 4385 quimérico Ig G 1 HER2 4518 quimérico Ig G 1 HER3 4785 quiméricoIg G 1 HER3 5082 quimérico Ig G 1 HER3 5096 quimérico Ig G 1

Os anticorpos selecionados e misturas de anticorpos foram tes- tados em relação à capacidade de inibir o crescimento e a proliferação de linhas de células de câncer A431NS (EGFR), NCI-N87 (HER2) e células MCF-7 estimuladas com 10 nM de heregulina beta (HER3), utilizando um ensaio de viabilidade.

Danos celulares inevitavelmente resultarão na perda da capacidade da célula para manter e fornecer energia para a função me-

tabólica e o crescimento de células.

Ensaios de atividade metabólica são baseados nesta premissa e , geralmente,eles medem a atividade mitocon- drial.

O Reagentede ProliferaçãoCelularW ST-1 (Roche N ° C at. 1 1 644 807 001) é um substrato pronto para usar, que mede a atividade metabólicadas 5 células viáveis.

Assume-se que a atividade metabólica correlaciona-secom o número de células viáveis.

Neste exemplo, o ensaio W ST-1 foi utilizado para medir o número de células metabolicamenteativas após tratamentode células cancerosascom diferentes concentraçõesde anticorpospara 96 ho- ras.

Antes de realizar o ensaio WST-1, os anticorpos apropriadose misturas de anticorposforam diluídas para uma concentraçãototal final de anticorpo de 100 pg/ml em meio adequado suplementadocom FBS a 2% e P/S a 1 % originandouma concentraçãode anticorpostotal final de 50 pg/ml no poço que contém a mais alta concentraçãode anticorpos.Um a série de diluição de três vezes dos anticorposfoi então realizada.

Números relevan- tes de células foram então adicionados aos poços experimentaisem um a placa de 384 poços.

As placas foram incubadasdurante 4 dias numa incu- badora umidificadaa 37° C . ReagenteW ST-1 foi então adicionadoàs placas e as placas foram incubadas durante um a hora a 37° C . As placas foram transferidas para um agitador de placa orbital durante um a hora e a absor- vãncia foi medida a 450 e 620 nm (comprimentode onda de referência),uti- lizando um leitor ELISA.

A quantidade de células metabolicamenteativas (MAC) é calculada como um a percentagemdo controle não tratado como se segue: ( (OD exp . - 0Dmedia) %MAC= x 100 (ODuntreat.—0Dmedia))

Resultados O s resultadosdas titulaçõesdos três anticorposanti-EGFRe to- das as misturas possíveis destes nas linhas celulares A431NS estão mos- trados na Figura 1 A . É evidente que as misturas de anticorpossão superio- res aos anticorpos individuais.A mistura de anticorpo consistindode 992 e 1024 foi selecionada como tido a maior eficácia e potência.

O s resultados das titulações dos três anticorpos anti-HER2 e todas as misturas possíveis destes na linha celular N C I-N87 estão mostrados na Figura 1 B . Novamente misturas de anticorposforam superioresaos anticorpos individuais.A mistu- ra de anticorpo consistindode 4382, 4385 e 4518 foi selecionadacomo tido 5 a maior eficácia e potência.

O s resultadosdas titulações dos três anticorpos anti-HER3 e todas as misturas possíveis destes sobre a linha de células MCF-7 estimuladascom 1 0 nM de heregulinabeta estão mostradosna Figu- ra 1 C . Foi difícil distinguirentre o melhor anticorpo monoclonal5082 e a m e- lhor mistura de anticorpo 4785+5082.Entretanto,houve um a ligeira tenclên- cia de que a mistura foi melhor e , portanto, ela foi selecionadapara o teste de misturaspan-HER.

Exemplo 3: atividade inibitória de câncer de misturas de an- ticorpos pan-HER Este exemplo demonstra que a mira ótima de mais do que um dos receptoresda família HER é obtida pela combinaçãode misturas de an- ticorpos contra cada um dos receptorese que mirar três receptoresé superi- or a mirar dois receptores.

Métodos As misturas otimizadas contra os três receptores, 992+1024 (EGFR), 4382+4385+4518(HER2) e 4785+5082 (HER3), bem como todas as misturas possíveisdestes foram testadas quanto a capacidadede inibir o crescimentoe proliferaçãodas linhas de células de câncer A431NS (EGFR), N C I-N87 (HER2) e células MCF-7 estimuladas com 1 0 nM de heregulina beta (HER3) utilizando um ensaio de viabilidade semelhanteao descrito no Exemplo2 . Resultados O s resultados das titulações das três misturas de anticorpos e todas as misturas possíveisdestes nas linhas de celularesA431NS, MCF7 e N C I-N87 estão mostradosnas Figuras 2 , 3 e 4 , respectivamente.E m combi- nações de células A431NS de misturas EGFR e HER3 ou misturas HER2 deram origem a aumentossinérgicosna inibição do crescimentodas células do câncer (Figura 2). Um a combinaçãode misturas contra HER2 e HER3 não teve nenhum efeito inibitório sobre as células A431NS.

Entretanto,uma combinaçãode misturas contra todos os três receptoresfoi superior às mis- turas individuaise a combinaçõesde misturascontra dois receptores.

Resultados semelhantes foram observados na linha celular 5 MCF7 (Figura 3). Combinações de misturas EGFR e misturas HER3 ou HER2 e misturas HER2 e HER3 deram origem a aumentos sinérgicos na inibição do crescimentodas células cancerosas.A combinaçãode misturas contra todos os três receptoresfoi superior às misturas individuaise a com- binaçõesde misturascontra dois receptores.

N a linha celular N C I-N87 nenhum aumento em potência ou efi- cácia foi obtido através da combinação da mistura de anti-HER2 eficiente tanto com um a mistura anti-EGFR, ou uma mistura anti-HER3 (Figura 4). Um a combinaçãode misturas contra EGFR e HER3 não teve nenhum efeito inibitório sobre as células N C I-N87. A combinaçãode misturas contra todos os três receptoresteve potência e eficácia semelhantesa mistura de anti- HER2. A combinação de misturas contra todos os três receptores foi comparada com aos anticorpos monoclonais cetuximab comercializados (EGFR)e trastuzumab(HER2) e um a mistura destes dois anticorpos(Figura 5 ). O s resultados demonstramque a mistura pan-HER é superior a ambos cetuximab e trastuzumab,e também à um a mistura destes dois anticorpos em todas as três linhas de células.

E m geral, os resultadosdeste exemplo demonstramque a mira ótima de mais do que um dos receptoresda família HER é obtida pela com- binação de misturas de anticorpos contra cada um dos receptorese que al- vejar três receptoresé superior a alvejar dois receptores.

Exemplo 4: Perfil Inibitório alvejando os dois receptores da família HER, EGFR e HER2, simultaneamente, com uma combinação de misturas de anticorpos Este exemplo demonstra que a combinação da mistura anti- EGFR e a mistura HER2 inibe as linhas de células de câncer MCF-7, HCC202, BT474, N C I-N87, MDA-MB-175,A431NS, H N 5, H292, DU145 e

MDA-MB-468. Métodos A mistura de anti-EGFR (992+1024), a mistura anti-HER2 (4382+4385+4518) e a combinação destas duas misturas foram investigadas 5 quanto á capacidade de inibir o crescimento de dez linhas celulares cance- rosas humanas com dependência de EGFR ou HER2. Os anticorpos mono- clonais cetuximab e trastuzumab comercializados foram incluídos como con- troles.

As linhas de células de câncer MCF-7, HCC202, BT474, NCI- N87, MDA-MB-175, A431NS, HN5, H292, DU145 e MDA-MB-468 foram se- meadas em placas de 96 poços a uma concentração de 1000 célu- las/cavidade em meios contendo 2 pg/ml de anticorpo anti-HER2. As placas foram incubadas durante 4 dias numa incubadora umidificada a 37° C . Em seguida, 20 pl de reagente WST-1 foram adicionados por poço e as placas incubadas durante uma hora a 37° C . As placas foram então transferidas para um agitador de placas orbital e deixado durante mais uma hora.

A ab- sorvância foi medida a 450 e 620 nm (comprimento de onda de referência) num leitor ELISA.

Os níveis de inibição de crescimento foram calculados como percentagem das células de controle não tratadas.

Resultados Os resultados da investigação da inibição do crescimento celular podem ser vistos na Figura 6 e mostram que a combinação da mistura de anti-EGFR e a mistura HER2 inibe de todas as linhas celulares testadas.

Alvejando apenas um dos receptores resulta na inibição das linhas de célu- Ias que são dependentes desse receptor.

Globalmente, estes resultados mostram que a combinação de misturas de anticorpos contra EGFR e HER2 provê um perfil de inibição muito mais amplo e, consequentemente, em últi- ma análise, pode ser utilizado para tratar pacientes cujos tumores são de- pendentes de qualquer um dos receptores.

Exemplo 5: Degradação do EGFR, HER2 e HER3, com uma combinação de misturas de anticorpos Este exemplo demonstra que as misturas de anticorpos induzem a degradação do seu alvo (EGFR, HER2 ou HER3), e que as combinações de misturas contra todos os três alvos pode induzir a degradação de todos os receptores simultaneamente.

Métodos 5 A fim de investigar o nível de degradação de EGFR, HER2 e HER3 induzida por misturas de anticorpos e combinações de misturas, aná- lises de Western blot foram realizadas em lisados de células inteiras de HN5, N87 e células MCF-7 tratadas com anticorpo durante 48 horas.

As células foram cultivadas em frascos de cultura T-75, e quando 50% confluentes os meios de cultura foram removidos, as células foram lavadas em lx PBS e tratadas com 20 pg/ml de anticorpos diluídos em 5 ml de meio contendo FBS a 0,5%. As células foram tratadas durante 48 horas, após o que os lisados de células inteiras foram preparados usando tampão RIPA padrão.

A con- centração de proteína total foi determinada em cada amostra e 1-10 pg de proteína analisadas por western blotting utilizando anticorpos primários con- tra o EGFR, HER2 ou HER3. Um anticorpo contra I3-actina foi utilizado como controle de carregamento.

Resultados Os resultados da investigação de Western Blot (Figura 7) mostra que misturas de anticorpos contra um único receptor (EGFR, HER2 ou HER3) induz a degradação do seu respectivo alvo e que uma mistura pan- HER consistindo de uma combinação de misturas de anticorpos contra cada alvo é capaz de induzir a degradação eficiente de todos os três receptores simultaneamente.

Exemplo 6: atividade inibitória de câncer de misturas de an- ticorpos pan-HER Utilizando os métodos descritos no Exemplo 3, as misturas de anticorpos Sym004 (contendo os dois anticorpos anti-EGFR 992+1024 des- critas em WO 2008/104183), 1277+1565 (anti-EGFR), 1254+1565 (anti- EGFR), 4385+4318 (anti-HER2), 4384+4517 (anti-HER2), 5038+5082 (anti- HER3), as misturas de anticorpos pan-HER 1565+4517+5082 e 1277+ 4384+5082 (um anticorpo contra cada um de EGFR , HER2 e HER3), e

1277+1565+4384+4517+5038+5082 e 1277+1565+4385+4518+5038+5082 (dois anticorpos contra cada um de EGFR, HER2 e HER3), os anticorpos cetuximab de referência (anti- EGFR), trastuzumab (anti-HER2), 8736 (aná- logo MM-121; anti-HER3), e uma mistura de três anticorpos de referência, 5 juntamente com um anticorpo de controle negativo, foram testados quanto A sua capacidade para inibir o crescimento e proliferação de 22 linhas de célu- las cancerosas que são dependentes de EGFR ou HER2, EGFR/HER2, HER2/HER3 ou EGFR/HER2/HER3. Os resultados da titulação das misturas de anticorpos e anticorpos listados acima contra as cinco linhas de células A431NS (EGFR), H358 (EGFR), HCC202 (HER2), 0E19 (HER2) e H820 (EGFR) estão mostrados nas Figuras 8-12. Resultados Pode ser visto a partir dos resultados nas Figuras 8-12 que, em- bora o efeito das misturas de anticorpos e anticorpos individuais varie entre as diferentes linhas de células, as misturas de anticorpos pan-HER contendo anticorpos contra cada um dos três receptores EGFR, HER2 e HER3 são geralmente eficazes na inibição do crescimento e proliferação celular.

As misturas pan-HER contendo seis anticorpos, ou seja, dois anticorpos contra cada um dos três receptores, são, em geral, o mais eficaz entre as diferentes linhas de células.

Exemplo 7: Degradação de EGFR, HER2 e HER3, com uma combinação de misturas de anticorpos Este exemplo demonstra que as misturas de anticorpos induzem a degradação do seu alvo (EGFR, HER2 ou HER3), e que as combinações de misturas contra todos os três alvos podem induzir degradação de todos os receptores simultaneamente.

Métodos Para investigar o nível de degradação de EGFR, HER2 e HER3 induzida por misturas de anticorpos e combinações de misturas, análises de Western blot foram realizadas em lisados de células inteiras de H292 e célu- las OVCAR-8 tratadas com anticorpo durante 48 horas.

As células foram cultivadas em frascos de cultura T-75, e quando 50% confluentes os meios de cultura foram removidos, as células foram lavadas em lx PBS e tratadas com 20 pg/ml de anticorpos diluídos em 5 ml de meio contendo FBS a 0,5%. As células foram tratadas durante 48 horas, após o que os lisados de células inteiras foram preparados usando tampão RIPA padrão.

A concentração de 5 proteína total foi determinada em cada amostra e 1-10 pg de proteína anali- sados por western blotting utilizando anticorpos primários contra EGFR, HER2 ou HER3. Um anticorpo contra 13-actinafoi utilizado como controle de carregamento.

Resultados Os resultados da investigação de Western Blot (Figura 13) mos- tram que misturas de anticorpos contra um único receptor (EGFR, HER2 e HER3) induz a degradação dos seus respectivos alvos e que uma mistura pan-HER consistindo de uma combinação de misturas de anticorpos contra cada alvo é capaz de induzir a degradação eficiente de todos os três recep- tores simultaneamente.

Na linhagem de células H292 uma pequena diminuição no EG- FR total pode ser observada nas células tratadas com anticorpos anti-EGFR, 1277, 1565 e na mistura pan-HER consistindo de um anticorpo contra cada um de EGFR, HER2 e HER3 (1277+4384+5082), mas não em células trata- das com o anticorpo anti-EGFR comparador cetuximab.

Uma mistura de 1277+1565 resulta em degradação eficiente de EGFR, o que também é ob- servado com a mistura pan-HER consistindo de dois anticorpos contra cada alvo (1277+1565+4384+4517+5038+5082). Uma combinação de anticorpos anti-HER2 (4384+4517) induziu a degradação de HER2 sozinho e como par- te da mistura pan-HER 1277+1565+4384+4517+5038+5082. Como em H292, uma pequena diminuição na EGFR total nos li- sados OVCAR-8 é observada em células tratadas com os anticorpos indivi- duais 1277 e 1565 e a mistura pan-HER 1277+4384+5082. A combinação 1277+1565 e a mistura pan-HER 1277+1565+4384+4517+5038+5082 indu- ziu degradação muito eficiente de EGFR.

Anticorpos monoclonais anti-HER2 tiveram um efeito rápido em HER2 total enquanto combinações de anticor- pos contra HER2 (4384+4517) resultaram na degradação eficiente do recep-

tor.

Anticorpos e misturas de anticorpos contra HER3, todos, resultou em degradação do receptor em células OVCAR-8. Em células H292, uma sobrerregulação de HER2 pode ser ob- servado em resposta ao tratamento das células com anticorpos específicos 5 (cetuximab, 1277 e 1565) ou uma mistura de anticorpos (1277+1565) contra EGFR.

Isso não é observado em células tratadas com a mistura de anticor- pos pan-HER consistindo de dois anticorpos contra cada alvo (1277+ 1565+4384+4517+5038+5082) como o EGFR, HER2 e HER3 são todos si- multaneamente degradada neste cenário.

Em células OVCAR-8, um aumen- to da regulação de HER2 em células tratadas com anticorpos ou de misturas de anticorpos contra HER3 pode ser visto.

Novamente, isto não é observado em células tratadas com a mistura de anticorpos pan-HER consistindo de dois anticorpos contra cada alvo (1277+1565+4384+4517+5038+5082) devi- do à degradação receptor simultânea.

Aumento da regulação do receptor também não foi observado em células tratadas com a mistura de anticorpos pan-HER (1277+4384+5082). Assim, o tratamento das células com uma mis- tura pan-HER potencialmente previne o aparecimento de resistência, como resultado de uma sobrerregulação do receptor dado que os três receptores (EGFR, HER2 e HER3) são degradados pelo tratamento com a mistura de anticorpos pan-HER.

Exemplo 8: atividade inibitória de câncer de misturas de an- ticorpos pan -HER Este exemplo descreve a atividade inibitória de câncer superior de misturas de anticorpos pan-HER consistindo de um anticorpo contra cada um dos alvos EGFR, HER2 e HER3, ou seja, um mistura pan-HER contendo um anticorpo contra cada alvo, de misturas pan-HER contendo um anticorpo contra dois alvos (EGFR e HER3) e dois anticorpos contra um alvo (HER2) e de uma mistura pan-HER consistindo de dois anticorpos contra cada recep- tor, ou seja, EGFR, HER2 e HER3. Métodos Usando os métodos descritos no Exemplo 3, as misturas de an- ticorpos contra cada receptor 1277+1565 (anti-EGFR), 4384+4517 (anti-

HER2) e 5038+5082 (anti-HER3), uma mistura pan-HER com dois anticor- pos contra cada receptor (1277+1565+4384+4517+5038+5082), misturas pan-HER incluindo um anticorpo contra EGFR, dois anticorpos contra HER2 e um anticorpo contra HER3 (1277+4384+4517+5038 ou 1277+4384+ 5 4517+5082), misturas pan-HER consistindo de um anticorpo contra cada receptor (1277+4384+5038 e 1277+4384+5082), os anticorpos de referência cetuximab (anti-EGFR), trastuzumab (anti-HER2), análogo de MM-121 (anti- HER3), uma mistura de três anticorpos de referência e um anticorpo de con- trole negativo foram testados quanto â capacidade de inibir o crescimento e proliferação de 1 1 linhas de células de câncer que são dependentes de EG- FR, ou HER2, EGFR/HER2, EGFR/HER3, HER2/HER3 ou EGFR/HER2/ HER3. Os resultados da titulação de misturas anticorpos e anticorpos lista- dos acima nas sete linhas celulares A431NS, N87, A549, BT474, 0E19, MDA-MB-175 e VII HCC202 estão mostrados nas Figuras 14-20. Resultados Os resultados apresentados nas Figuras 14-20 mostram que, apesar de o efeito das misturas de anticorpos e anticorpos individuais varia- rem entre as diferentes linhas de células, as misturas pan-HER de anticor- pos composta de três, quatro ou seis anticorpos contra os três receptores EGFR, HER2 e HER3 são geralmente muito eficazes em inibir o crescimento e proliferação de células de câncer.

Como descrito no Exemplo 5, a mistura pan-HER contendo seis anticorpos, ou seja, dois anticorpos contra cada um dos três receptores é geralmente o mais eficaz entre as linhas de células testadas.

Exemplo 9: atividade inibitória de câncer de misturas de an- ticorpos pan-HER Este exemplo descreve que alvejando três receptores da familia HER (EGFR/HER2/HER3) simultaneamente com uma combinação de mistu- ras de anticorpos resultados em um perfil inibitório mais amplo em compara- cão com alvejar de dois receptores da família HER (EGFR/HER2, EG- FR/HER3 ou HER2/HER3) ao mesmo tempo ou alvejar qualquer dos três receptores sozinho.

Métodos Usando os métodos descritos no Exemplo 3, misturas de anti- corpos contra cada receptor 1277+1565 (anti-EGFR), 4384+4517 (anti- HER2) e 5038+5082 (anti-HER3), todas as permutações possíveis destes, 5 ou seja 1277+1565+4384+4517 (anti-EGFR+anti-HER2), 1277+1565+5038+ 5082 (anti-EGFR + anti-HER2) 4384+4517+5038+5082 (anti-HER2 + anti- HER3), uma mistura pan-HER com dois anticorpos contra cada receptor (1277+1565+4384+4517+5038+5082), misturas pan-HER consistindo de um anticorpo contra cada receptor (1277+4384+5038 e 1277+4384+5082), os anticorpos de referência cetuximab ( anti-EGFR), trastuzumab (anti-HER2), análogo MM-121 (anti-HER3), uma mistura de três anticorpos de referência e um anticorpo de controle negativo foram testados quanto A sua capacidade para inibir o crescimento e proliferação de 1 1 linhas de células de cancer que são dependentes de EGFR ou HER2, EGFR/HER2, EGFR/HER3, HER2/HER3 ou EGFR/HER2/HER3. Os resultados da titulação dos anticor- pos e as misturas de anticorpos listados acima contra as cinco linhas celula- res A431NS, AU565, H358, H1975 e HCC202 estão mostrados nas Figuras 21-25. Resultados Em A431NS combinações de misturas contra EGFR e HER2 ou EGFR e HER3 resultaram em um aumento sinérgico na inibição do cresci- mento de células de cancer concorrente com os resultados descritos no E- xemplo 3. Uma combinação de misturas alvejando HER2 e HER3 não teve nenhum efeito inibitório sobre as células A431NS.

Uma combinação de mis- turas de anticorpos contra EGFR, HER2 e HER3 foi superior A s misturas individuais e a misturas de anticorpos com apenas um anticorpo contra cada um dos três receptores e tão eficaz quanto as combinações de misturas con- tra dois receptores.

Foram obtidos resultados semelhantes com a linha celular H1975. Novamente, as combinações de misturas de anticorpos contra EGFR e HER2 ou EGFR e HER3 mostrou um aumento sinérgico no efeito inibitório.

Uma combinação de misturas de anticorpos contra EGFR, HER2 e HER3 foi superior As misturas individuais e a misturas de anticorpos com apenas um anticorpo contra cada um dos três receptores e tão eficaz quanto as combi- nações de misturas contra dois receptores.

Nas linhas celulares HCC202 combinações de misturas contra 5 HER2 e EGFR ou HER2 e HER3 teve um efeito inibitório maior sobre o crescimento e proliferação de células de câncer.

Uma combinação de mistu- ras de anticorpos contra EGFR e HER3 não teve nenhum efeito inibitório sobre as células HCC202. Uma combinação de misturas de anticorpos con- tra EGFR, HER2 e HER3 foi superior A s misturas individuais, a combinações de misturas contra dois receptores e a misturas de anticorpos com apenas um anticorpo contra cada um dos três receptores.

Resultados semelhantes foram encontrados na linhagem celular AU565. Combinações de misturas contra HER2 e EGFR ou HER2 e HER3 tiveram um efeito inibitório maior sobre o crescimento e proliferação de célu- Ias de câncer.

Uma combinação de misturas de anticorpos contra EGFR e HER3 não teve nenhum efeito inibitório sobre as células AU565. Uma com- binação de misturas de anticorpos contra EGFR, HER2 e HER3 foi superior A s misturas individuais, a combinações de misturas contra dois receptores e a misturas de anticorpos com apenas um anticorpo contra cada um dos três receptores.

Nas linhas celulares H358 combinações de misturas contra EG- FR e HER3 ou EGFR e HER2 resultaram em um pequeno aumento no efeito inibitório em comparação com alvejar EGFR sozinho.

Alvejando HER2 HER3 com uma combinação de misturas resultou num efeito inibitório modesto no crescimento e proliferação de células de cancer comparável à alvejar HER3 sozinho.

Entretanto, as combinações de misturas contra todos os três recep- tores resultou num aumento da inibição do crescimento e proliferação celu- lar, que foi superior às misturas individuais, a combinações de misturas con- tra dois receptores e a misturas de anticorpos com apenas um anticorpo contra cada um dos três receptores.

Em resumo, os resultados apresentados neste exemplo demons- tram que a mira ótima de mais do que um receptor na família HER é obtida através da combinação de misturas de anticorpos contra cada um dos recep- tores, que alvejando três receptores é superior a alvejar dois receptores, e que alvejando cada receptor com uma mistura de anticorpos é superior a alvejar cada receptor com um único anticorpo. 5 Exemplo 10: Eficácia in vivo de misturas de anticorpos pan- HER no modelo de xenoenxerto de tumor humano A431 NS Para avaliar a eficácia in vivo das misturas de anticorpos contra EGFR, HER2, HER3 e combinações dos três receptores, testamos os anti- corpos e misturas no modelo de xenoenxerto de tumor humano A431NS.

A linha celular de carcinoma epidérmico humano A431 que sobre-exprime EG- FR é amplamente utilizado ao testar os efeitos inibidores do crescimento de novos compostos anti-EGFR, tanto in vitro como in vivo.

Nos estudos in vivo aqui apresentados usamos uma variante mais agressivamente crescente, A431NS (ATCC n . CRL-2592), da linha celular A431-mãe.

Os resultados estão mostrados na Figura 26. Método 2x106 células A431NS foram inoculadas subcutaneamente no flanco esquerdo de camundongos fêmeas atímicos, nús, de oito semanas de idade.

Os tumores foram medidos duas vezes por semana com cometapas e o volume do tumor em mm3 foi calculado de acordo com a fórmula: (largu- ra)2 x comprimento x 0,5. Em um tamanho médio de tumor de 175 mm3 os camundongos foram distribuídos aleatoriamente e o tratamento iniciado.

Os camundongos foram tratados com injecções intraperitoneais duas vezes por semana de 50 mg/kg/alvo durante 2,5 semanas (total de 5 injecções), segui- do por um período de observação.

Assim, a mira de um receptor resultou na administração de 50 mg/kg, enquanto que os camundongos tratados com uma combinação de anticorpos alvejando dois ou três receptores foram do- sados com 100 ou 150 mg/kg, respectivamente.

As seguintes combinações de anticorpos foram incluídas na experiência: 1277+1565 (anti-EGFR), 4384+4517 (anti-HER2), 5038+5082 (anti-HER3), 1277+1565+4384+4517 (anti-EGFR + anti-HER2), 1277+1565+5038+5082 (anti-EGFR + anti-HER3), 4384+4517+5038+5082 (anti-HER2 + anti-HER3), 1277+4384+5038 (anti-

EGFR + anti-HER2 + anti-HER3) e 1277+1565+4384+4517+5038+5082 (an- ti-EGFR + anti-HER2 + anti-HER3). A experiência incluiu também o anticor- po monoclonal anti-EGFR cetuximab e anticorpo monoclonal anti-HER2 tras- tuzumab, que foram dosados e administrados como descrito para as mistu- 5 ras de anticorpo acima.

Resultados No dia 12 pós-inoculação a um tamanho médio de tumor de 175 MM3 os camundongos foram distribuídos aleatoriamente em 1 1 grupos de oito animais e o tratamento foi iniciado.

Os animais tratados com anticorpos alvejando EGFR + HER3 (1277+1565+5038+5082) e EGFR+HER2+HER3 (mistura Pan-HER: 1277+4384+5038 e mistura Pan-HER: 1277+1565+ 4384+4517+5038+5082) foram muito eficientes no controle do crescimento tumoral.

Quase nenhum ganho no tamanho do tumor foi observado durante o período de tratamento em grupos tratados com o anti-EGFR + anti-HER3 (1277+1565+5038+5082) e anti-EGFR+anti-HER2+anti-HER3 (mistura Pan- HER: 1277+4384+5038 e mistura Pan-HER: 1277+1565+4384+4517+5038+ 5082). Os animais tratados com anticorpos voltados para EGFR (1277+1565) ou HER3 (5038+5082) ou combinações alvejando EGFR+ HER2 (1277+1565+4384+4517) e HER2+HER3 (4384+4517+5038+5082) tiveram todos crescimento de tumor continuado no período de tratamento embora os tumores cresceram a uma taxa mais lenta em comparação com o controle de veículo.

Os animais tratados com combinações de anticorpos anti-HER3 e anti-HER2+anti-HER3 tiveram tumores apenas marginalmente menores em comparação com o grupo de controle de veículo.

Os grupos tratados com o anti-EGFR (1277+1565) ou anti-EGFR + anti-HER2 (1277+1565+4384+4517) mostraram inibição do tumor e uma taxa de cres- cimento menor em comparação com o controle de veículo.

No período de observação, grupos tratados com anti-HER3, anti- EGFR + anti-HER2, anti-HER2 + anti-HER3 e cetuximab todos tiveram con- tinuado crescimento do tumor, embora a um ritmo mais lento em compara- ção com o grupo de controle de veículo.

Em geral, os grupos tratados com anticorpos anti-EGFR e misturas incluindo combinações de anticorpos contra

EGFR tiveram uma taxa de crescimento tumoral mais lenta em comparação com os grupos tratados com as misturas de anticorpos contra HER3 ou combinações de misturas contra HER2+HER3. Grupos tratados com combinações de misturas de anticorpos al- 5 vejando EGFR+HER3 e EGFR+HER2+HER3 (mistura de 6 pan-HER), e uma combinação de um anticorpo contra cada um dos três receptores (mis- tura de 3 Pan-HER) todos mantiveram controle do crescimento de tumores durante todo o experimento.

A eficácia aumentada da mira simultânea de EGFR e HER3 no modelo de xenoenxertos do tumor A431NS reflete as dependências de re- ceptores ErbB conhecidas para esta linha de células a partir de experiências in vitro (Exemplo 2). Embora primariamente dependente da sinalização de EGFR, a linha celular A431NS também é dependente da conversa cruzada entre o EGFR e HER3 e até certo ponto entre EGFR e HER2, embora este último não tenha sido observado na presente experiência in vivo.

Em resumo, os resultados apresentados nesta experiência mos- tram que o tratamento de xenoenxertos de tumores A431NS com uma com- binação de misturas de anticorpos ou anticorpos contra o EGFR+HER3 ou EGFR+HER2+HER3 é mais eficaz em comparação com alvejar os tumores com anticorpos monoclonais e misturas de anticorpos contra alvos individu- ais de EGFR, HER2 e HER3, ou combinações de anticorpos monoclonais e misturas de anticorpos contra EGFR+HER2 ou HER2+HER3.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição de anticorpo farmacêutica, caracterizada pelo fa- to de que compreende: a) uma ou duas moléculas de anticorpo anti-EGFR distintas; 5 b) uma ou duas moléculas de anticorpo anti-HER2 distintas; e c) uma ou duas moléculas de anticorpo anti-HER3 distintas.

2. Composição de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que duas moléculas de anticorpo distintas ligam a pelo menos um dentre EGFR, HER2 ou HER3, em que as referidas duas moléculas ligam a epítopos de não sobreposição nos receptores.

3. Composição de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que: a) uma ou duas moléculas de anticorpo anti-EGFR distintas ca- pazes de inibir a ligação de e/ou ligar ao mesmo epítopo como anticorpo se- lecionado dentre 1254, 1277 e 1565; b) uma ou duas moléculas de anticorpo anti-HER2 distintas ca- pazes de inibir a ligação de e/ou ligar ao mesmo epítopo como anticorpo se- lecionado dentre 4384, 4385, 4517 e 4518; e c) uma ou duas moléculas de anticorpo anti-HER3 distintas ca- pazed de inibir a ligação de e/ou ligar ao mesmo epítopo como anticorpo selecionado dentre 5038 e 5082.

4. Composição de anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a compreende a) duas moléculas de anticorpo anti-EGFR distintas que são ca- pazes de inibir a ligação de e/ou ligar ao mesmo epítopo como anticorpos 1277 e 1565, respectivamente; b) duas moléculas de anticorpo anti-HER2 distintas que são ca- pazes de inibir a ligação de e/ou ligar ao mesmo epítopo como anticorpos 4384 e 4517, respectivamente; e c) duas moléculas de anticorpo anti-HER3 distintas que são ca- pazes de inibir a ligação de e/ou ligar ao mesmo epítopo como anticorpos 5038 e 5082, respectivamente.

5. Composição de anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a compreende: a) duas moléculas de anticorpo anti-EGFR distintas que são ca- pazes de inibir a ligação de e/ou ligar ao mesmo epítopo como anticorpos 5 1277 e 1565, respectivamente; b) duas moléculas de anticorpo anti-HER2 distintas que são ca- pazes de inibir a ligação e/ou ligar ao mesmo epítopo como anticorpos 4385 e 4518, respectivamente; e c) duas moléculas de anticorpo anti-HER3 distintas que são ca- pazes de inibir a ligação de e/ou ligar ao mesmo epítopo como anticorpos 5038 e 5082, respectivamente.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma ou duas moléculas de anticorpo anti-EGFR distintas, ca- da uma compreendendo as sequências CDR1-3 de cadeia leve e pesada de um anticorpo selecionado dentre 1277, 1565 e 1254; b) uma ou duas moléculas de anticorpo anti-HER2 distintas, ca- da uma compreendendo as sequências CDR1-3 de cadeia leve e pesada de um anticorpo selecionado dentre 4384, 4385, 4517 e 4518; e c) uma ou duas moléculas de anticorpo anti-HER3 distintas, ca- da uma compreendendo as sequências CDR1-3 de cadeia leve e pesada de um anticorpo selecionado dentre 5038 e 5082.

7. Composição de anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende: a) duas moléculas de anticorpo anti-EGFR distintas compreen- dendo as sequências CDR1-3 de cadeia leve e pesada de 1277 e 1565, res- pectivamente; b) duas moléculas de anticorpo anti-HER2 distintas compreen- dendo as sequências CDR1-3 de 4384 e 4517, respectivamente; c) duas moléculas de anticorpo anti-HER3 distintas compreen- dendo as sequências CDR1-3 de cadeia leve e pesada de 5038 e 5082, res- pectivamente.

8. Composição de anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma ou duas moléculas de anticorpo anti-EGFR distintas compreendendo as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anti- 5 corpo selecionado dentre 1277 e 1565; b) uma ou duas moléculas de anticorpo anti-HER2 distintas compreendendo as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anti- corpo selecionado dentre 4384 e 4517; e c) uma ou duas moléculas de anticorpo anti-HER3 distintas compreendendo as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anti- corpo selecionado dentre 5038 e 5082.

9. Composição de anticorpo de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende: a) duas moléculas de anticorpo anti-EGFR distintas compreen- dendo as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de 1277 e 1565, respec- tivamente; b) duas moléculas de anticorpo anti-HER2 distintas compreen- dendo as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de 4384 e 4517, respec- tivamente; e c) duas moléculas de anticorpo anti-HER3 distintas compreen- dendo as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo sele- cionado dentre 5038 e 5082, respectivamente.

10. Composição de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma das moléculas de anticorpo é: a) um anticorpo quimérico, em que o referido anticorpo opcio- nalmente compreende uma região constante IgG1 ou IgG2; b) um anticorpo humanizado; ou c) um anticorpo humano.

11. Composição de anticorpo, caracterizada pelo fato de que compreende 1277, 1565, 4384, 4517, 5038 e 5082.

12. Composição de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma das moléculas de anticorpo é um imunoconjugado compreendendo um anticorpo conjugado a um agente anti-câncer.

13. Método para produzir uma composição de anticorpo como 5 definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende prover células hospedeiras capazes de expressar uma molécula de anticorpo da composição, cultivar as ditas células hospedeiras sob condições apropriadas para a expressão das moléculas de anticorpo e isolar as moléculas de anticorpos resultantes.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe- lo fato de que as células hospedeiras são cultivas em um único biorreator.

15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

16. Uso da composição de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou da composição farmacêutica como defini- da na reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo.

17. Uso da composição de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou da composição farmacêutica como defini- da na reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratamento de câncer em um indivíduo.

18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido câncer tenha adquirido resistência ao tratamento com um anticorpo anti-HER ou inibidor de tirosina cinase.

19. Uso de composição de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou da composição farmacêutica como defini- da na reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratamento de distúrbio definido por dependência de HER em um indivíduo.

20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano.

21. Invenção, caracterizada pelo fato de que é em qualquer for- ma de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindi- cação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso englobadas pela ma- téria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.