JP2017508726A - 改善されたプロテインＡ結合を有するＦｃ領域バリアント - Google Patents

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Abstract

N末端からC末端への方向に、1個以上のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分と、免疫グロブリンCH2ドメインと、免疫グロブリンCH3ドメインとを各々含む第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含むポリペプチドであって、第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第1および第2のポリペプチドが変異Y436A（EUインデックスによるナンバリング）を含むものが、本明細書において報告される。

Description

精製特性に関して修飾されたIgG Fc領域が本明細書において報告される。
発明の背景
対費用効果の高い作製過程の需要のため、1個以上のアフィニティクロマトグラフィ工程を含む下流精製の最適化が必要とされている。より大きい処理体積および定置洗浄（CIP）プロトコルのためのより厳しい必要条件が、解決する必要のある特色の一部である（Hober,S.,J.Chrom.B.848(2007)40-47）。
選択的なFc領域アフィニティリガンドによるモノクローナル抗体の精製は、治療用モノクローナル抗体の大規模作製のための最も有望な方法論である。実際、この手法は、抗体の抗原特異的部分、即ち、Fabドメインとの相互作用を確立することを必要とせず、従って、Fabドメインは完全なまま残され、その特性を保持することができる（Salvalaglio,M.,et al.,J.Chrom.A 1216(2009)8678-8686を参照すること）。
その選択性のため、アフィニティ精製工程を一連の精製の初期に利用し、それによって、連続する単位作業の数を低下させることができる（Hober（前記）；MacLennan,J.,Biotechnol.13(1995)1180；Harakas,N.K.,Bioprocess Technol.18(1994)259を参照すること）。
IgGに選択的に結合するために最も採用されているリガンドは、Fc領域のCH2ドメインとCH3ドメインとの間のヒンジ領域に位置する「コンセンサス結合部位」（CBS）（DeLano,W.L.,et al.,Science 287(2000)1279）として公知の領域において、大部分のIgGのFc領域と高度に選択的な相互作用を確立することができるブドウ球菌のプロテインAおよびプロテインGである。
ブドウ球菌プロテインA（SPA）は、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の表面上に露出した細胞壁会合タンパク質ドメインである。SPAは、様々な種に由来するIgG、例えば、ヒト、ウサギ、およびモルモットのIgGに対して高い親和性を有するが、ウシおよびマウスのIgGとは弱い相互作用しか有しない（以下の表を参照すること）（Hober（前記）；Duhamel,R.C.,et al.,J.Immunol.Methods 31(1979)211；Bjork,L.and Kronvall,G.,Immunol.J.133(1984)969；Richman,D.D.,et al.,J.Immunol.128(1982)2300；Amersham Pharmacia Biotech,Handbook,Antibody Purification(2000)を参照すること）。
Figure 2017508726
++：強い結合／+：中程度の結合／-：弱い相互作用または相互作用しない
IgGのCH2ドメインとCH3ドメインとの間の重鎖ヒンジ領域は、新生児型Fc受容体（FcRn）などの、プロテインA以外の数種のタンパク質に結合することができる（DeLano and Salvalaglio（前記）を参照すること）。
SPA CBSは、抗体の表面上の疎水性ポケットを包含する。IgG CBSを構成する残基は、Ile 253、Ser 254、Met 252、Met 423、Tyr 326、His 435、Asn 434、His 433、Arg 255、およびGlu 380（カバットEUインデックスナンバリングシステムによるIgG重鎖残基のナンバリング）である。電荷を有するアミノ酸（Arg 255、Glu 380）が、Ile 253およびSer 254によって形成された疎水性ノブの周囲に位置している。これは、極性相互作用および親水性相互作用の確立をもたらす（ことができる）（Salvalaglio（前記）を参照すること）。
一般に、プロテインA-IgG相互作用は、2個の主な結合部位を使用して記載され得る：第1は、重鎖CH2ドメインに位置し、（プロテインAの）Phe 132、Leu 136、Ile 150と、Ile 253およびSer 254によって構成されたIgG疎水性ノブとの間の疎水性相互作用、およびLys 154（プロテインA）とThr 256（IgG）との間の静電的相互作用を特徴とする。第2の部位は、重鎖CH3ドメインに位置し、Gln 129およびTyr 133（プロテインA）と、His 433、Asn 434、およびHis 435（IgG）との間の静電的相互作用によって支配される（Salvalaglio（前記）を参照すること）。
Lindhofer,H.ら（J.Immunol.155(1995)219-225）は、ラット／マウスクアドローマにおける優先的な種制限された重鎖／軽鎖対合を報告している。
Jedenberg,L.ら（J.Immunol.Meth.201(1997)25-34）は、2種のFcバリアント（それぞれ他のアイソタイプに由来するアイソタイプジペプチド置換を各々含有しているFc13およびFc31）のSPA結合分析が、Fc1およびFc31がSPAと相互作用し、Fc3およびFc13が検出可能なSPA結合を欠くことを示したと報告した。Fc領域バリアントFc31の与えられたSPA結合は、導入されたジペプチド置換R435HおよびF436Yに起因すると結論付けられる。
今日、治療用モノクローナル抗体に関しては、2種以上の標的（抗原）に特異的に結合する二重特異性抗体またはさらには多重特異性抗体の生成および使用に焦点が置かれている。
1種の発現細胞株において、4本の抗体鎖（2本の異なる重鎖および2本の異なる軽鎖）から、多重特異性ヘテロ二量体IgG抗体を生成する際の基本的課題は、いわゆる鎖会合問題である（Klein,C.,et al.,mAbs 4(2012)653-663を参照すること）。多重特異性抗体の左アームおよび右アームとしての異なる鎖の使用が必要とされるため、1種の細胞における発現によって抗体混合物が生じる：2本の重鎖は、（理論上）4種の異なる組み合わせ（そのうち2種は同一である）で会合することができ、それらの各々が、軽鎖と確率論的に会合することができるため、24（=全部で16）の理論上可能な鎖の組み合わせをもたらす。16の理論上可能な組み合わせのうち、10が見出され、そのうちの1個のみが、所望の機能的な二重特異性抗体に相当する（De Lau,W.B.,et al.,J.Immunol.146(1991)906-914）。複雑な混合物の中からこの所望の二重特異性抗体を単離することの困難さおよび理論上最大で12.5％という固有の不十分な収率のため、1種の発現細胞株における二重特異性抗体の作製は極めて難題である。
鎖会合問題を克服し、2本の異なる重鎖の正確な会合を強化するため、1990年代後期に、GenentechのCarterらが、「ノブ・イントゥ・ホール」（KiH）と名付けられたアプローチを発明した（Carter,P.,J.Immunol.Meth.248(2001)7-15；Merchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；Zhu,Z.,et al.,Prot.Sci.6(1997)781-788；Ridgway,J.B.,et al.,Prot.Eng.9(1996)617-621；Atwell,S.,et al.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35；および米国特許第7,183,076号を参照すること）。基本的に、その概念は、大部分の相互作用が起こる抗体の2本の重鎖の2個のCH3ドメインの間の界面の修飾に頼る。かさの大きい残基が、一方の抗体重鎖のCH3ドメインへ導入され、鍵（「ノブ」）に類似した作用をする。他方の重鎖には、鍵穴を模倣して、このかさの大きい残基を収容することができる「ホール」が形成される。得られたヘテロ二量体Fc領域は、人工ジスルフィド架橋の導入／形成によってさらに安定化され得る。注目すべきことに、KiH変異は、全て、CH3ドメイン内に埋め込まれており、免疫系に対しては「見えない」。さらに、（熱）安定性、FcγR結合、およびエフェクター機能（例えば、ADCC、FcRn結合）、および薬物動態学的（PK）挙動などの、KiH変異を有する抗体の特性は、影響されない。
97％を超えるヘテロ二量体化収率による正確な重鎖会合は、6個の変異：「ノブ」重鎖におけるS354C、T366W、および「ホール」重鎖におけるY349C、T366S、L368A、Y407Vを導入することによって達成され得る（Carter（前記）参照；カバットEUインデックスナンバリングシステムによる残基のナンバリング）。ホール-ホールホモ二量体は存在する可能性があるが、ノブ-ノブホモ二量体は典型的には観察されない。選択的な精製手法または以下に概説されるような手法のいずれかによって、ホール-ホール二量体を枯渇させることができる。
ランダムな重鎖会合の問題は取り組まれているが、正確な軽鎖会合も確実にされなければならない。KiH CH3ドメインアプローチに類似して、完全な二重特異性IgGに最終的に至ることができる非対称の軽鎖-重鎖相互作用を調査する努力がなされている。
Rocheは、最近、KiHテクノロジーと組み合わせた時に、二重特異性ヘテロ二量体IgG抗体における正確な軽鎖対合を強化する可能性として、CrossMabアプローチを開発した（Klein（前記）；Schaefer.W.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)11187-11192；Cain,C.,SciBX 4(2011)1-4を参照すること）。これは、一般的な様式で二重特異性抗体またはさらには多重特異性抗体の生成を可能にする。このフォーマットにおいては、意図された二重特異性抗体の1本のアームは不変のままにされる。第2のアームにおいて、Fab領域全体またはVH-VLドメインもしくはCH1-CLドメインが、重鎖と軽鎖との間のドメインクロスオーバーによって交換される。結果として、新たに形成された「クロス型」軽鎖は、もはや、二重特異性抗体の他のアームの（通常の、即ち、非クロス型の）重鎖Fab領域とは会合しない。従って、ドメイン配置のこの最小の変化によって、正確な「軽鎖」会合が強化され得る（Schaefer（前記）を参照すること）。
Zhuらは、ジアボディ（diabody）バリアントの2個のVL/VH界面に、数個の立体的に相補的な変異およびジスルフィド架橋を導入した。変異VL Y87A/F98MおよびVH V37F/L45Wが、抗p185HER2 VL/VH界面へ導入された時、ヘテロ二量体ジアボディは、親ジアボディと比較して、全収率および親和性を維持しながら、＞90％の収率で回収された（Zhu（前記）を参照すること）。
Chugaiの研究者らは、同様に、正確な軽鎖会合を促すため、VH-VL界面への変異の導入（主として、VH内のQ39およびVL内のQ38の電荷を有する残基への変換）によって、二重特異性ジアボディを設計した（WO 2006/106905；Igawa,T.,et al.,Prot.Eng.Des.Sel.23(2010)667-677）。
WO2011097603には、共通軽鎖マウスが報告されている。
WO2010151792には、CH3ドメインにおいてディファレンシャルに修飾された、即ち、ヘテロ二量体である免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む、単離の容易さを提供する二重特異性抗体フォーマットが提供されている。CH3修飾に関するディファレンシャルな修飾は、非免疫原性または実質的に非免疫原性であり、修飾のうちの少なくとも1個は、プロテインAなどのアフィニティ試薬に対する二重特異性抗体のディファレンシャルな親和性をもたらし、二重特異性抗体は、プロテインAに対する親和性に基づき、破壊された細胞から、培地から、または抗体の混合物から単離可能である。
新生児型Fc受容体（FcRn）は、インビボのIgGクラスの抗体の代謝的運命にとって重要である。FcRnは、リソソーム分解経路からIgGを救出し、クリアランスの低下および半減期の増加をもたらすよう機能する。それは、2種のポリペプチド：50kDaのクラスI主要組織適合複合体様タンパク質（αFcRn）および15kDaのβ2ミクログロブリン（β2m）からなるヘテロ二量体タンパク質である。FcRnは、クラスIgGの抗体のFc領域のCH2-CH3部分に高い親和性で結合する。クラスIgGの抗体とFcRnとの間の相互作用は、pH依存性であり、1：2化学量論で起こる。即ち、1個のIgG抗体分子が、その2個の重鎖Fc領域ポリペプチドを介して、2個のFcRn分子と相互作用することができる（例えば、Huber,A.H.,et al.,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083を参照すること）。
従って、IgGのインビトロのFcRn結合特性／特徴は、血液循環におけるインビボの薬物動態学的特性を示す。
FcRnと、IgGクラスの抗体のFc領域との間の相互作用には、重鎖のCH2ドメインおよびCH3ドメインの種々のアミノ酸残基が関係している。
FcRn結合に影響を及ぼし、それと共に、血液循環における半減期にも影響を及ぼす種々の変異が公知である。マウスFc領域-マウスFcRn相互作用にとって重大なFc領域残基は、部位特異的変異誘発によって同定されている（例えば、Dall'Acqua,W.F.,et al.J.Immunol 169(2002)5171-5180を参照すること）。残基I253、H310、H433、N434、およびH435（カバットEUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）が、相互作用に関与している（Medesan,C.,et al.,Eur.J.Immunol.26(1996)2533-2536；Firan,M.,et al.,Int.Immunol.13(2001)993-1002；Kim,J.K.,et al.,Eur.J.Immunol.24(1994)542-548）。残基I253、H310、およびH435は、ヒトFc領域のマウスFcRnとの相互作用にとって重大であることが見出された（Kim,J.K.,et al.,Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2885）。
Fc領域（および同様にIgG）のFcRnとの結合を増加させる方法は、Fc領域の様々なアミノ酸残基：Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433、およびAsn 434を変異させることによって実施されている（Kuo,T.T.,et al.,J.Clin.Immunol.30(2010)777-789；Ropeenian,D.C.,et al.,Nat.Rev.Immunol.7(2007)715-725を参照すること）。
変異M252Y、S254T、T256Eの組み合わせが、FcRn結合を改善することが、タンパク質間相互作用研究によって、Dall'Acquaらによって記載された（Dall'Acqua,W.F.,et al.J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524）。ヒトFc領域-ヒトFcRn複合体の研究は、残基I253、S254、H435、およびY436が相互作用にとって重大であることを示した（Firan,M.,et al.,Int.Immunol.13(2001)993-1002；Shields,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604）。Yeung,Y.A.ら（J.Immunol.182(2009)7667-7671）に、残基248〜259および301〜317および376〜382および424〜437の様々な変異体が報告され調査されている。
WO 2014/006217には、三重変異を有する二量体タンパク質が報告されている。pH依存性結合の機序に関して、FcRn/ヘテロ二量体Fc複合体の2.8オングストロームでの結晶構造が、Martin,W.ら（Mol.Cell.7(2001)867-877）によって報告された。US 6,277,375には、増加した半減期を有する免疫グロブリン様ドメインが、WO 2013/004842に報告されている。Shields,R.L.らは、FcγRI、FcγRII、FcγRIII、およびFcRnのヒトIgG1上の結合部位の高分解能マッピング、ならびに改善されたFcγRとの結合を有するIgG1バリアントの設計を報告した（Biochem.Mol.Biol.276(2001)6591-6604）。マウスIgG1の経細胞輸送および異化に関与するアミノ酸残基の描写は、Medesan,C.ら（J.Immunol.158(1997)2211-2217）によって報告された。US 2010/0272720には、修飾されたFcRn結合部位を有する抗体融合タンパク質が報告されている。ヘテロ二量体タンパク質の作製は、WO 2013/060867に報告されている。Qiao,S.-W.らは、抗体によって媒介される抗原提示のFcRnへの依存性を報告した（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105(2008)9337-9342）。
ブドウ球菌プロテインAに特異的に結合し、ヒトFcRnに結合しないバリアントFc領域が、本明細書において報告される。これらのバリアントFc領域は、CH2ドメインおよびCH3ドメインに特定のアミノ酸変異を含有している。これらの変異は、ヘテロ二量体Fc領域のホール鎖またはノブ鎖のいずれかにおいて使用された時、ヘテロ二量体Fc領域の精製、即ち、ヘテロ二量体Fc領域のホモ二量体Fc領域からの分離を可能にすることが見出された。
本明細書において報告される一つの局面は、（二量体）Fc領域ポリペプチドのプロテインAとの結合を増加させるための変異Y436Aの使用である。
本明細書において報告される一つの局面は、N末端からC末端への方向に、1個以上のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインを含む第1のポリペプチドと、N末端からC末端への方向に、1個以上のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインを含む第2のポリペプチドとを含む（二量体）ポリペプチドであって、第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第1および第2のポリペプチドが変異Y436A（カバットEUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）を含み、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとが、免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分において1個以上のジルスフィド架橋によって接続されているものである。
一つの態様において、第1および第2のポリペプチドは、変異Y436Aを含む。
一つの態様において、（二量体）ポリペプチドは、ヒトFcRnに特異的に結合せず、ブドウ球菌プロテインAに特異的に結合する。
一つの態様において、（二量体）ポリペプチドは、ホモ二量体ポリペプチドである。
一つの態様において、（二量体）ポリペプチドは、ヘテロ二量体ポリペプチドである。
一つの態様において、第1のポリペプチドは変異Y349C、T366S、L368A、およびY407V（「ホール」）をさらに含み、かつ第2のポリペプチドは変異S354CおよびT366W（「ノブ」）を含む。
一つの態様において、第1のポリペプチドは変異S354C、T366S、L368A、およびY407V（「ホール」）をさらに含み、第2のポリペプチドは変異Y349CおよびT366W（「ノブ」）を含む。
一つの態様において、
（i）第1および第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを各々含むか、または
（ii）第1および第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを各々さらに含むか、または
（iii）第1および第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを各々さらに含むか、または
（iv）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（v）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（vi）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含む。
一つの態様において、第1および第2のポリペプチドの免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインは、ヒトIgG1サブクラスのものである。一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、変異L234AおよびL235Aを各々さらに含む。一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、変異P329Gを各々さらに含む。一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、変異L234A、L235A、およびP329Gを各々さらに含む。
一つの態様において、第1および第2のポリペプチドの免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインは、ヒトIgG2サブクラスのものである。一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、変異H268Q、V309L、A330S、およびP331Sを各々さらに含む。
一つの態様において、第1および第2のポリペプチドの免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインは、ヒトIgG2サブクラスのものである。一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、変異V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、およびP331Sを各々さらに含む。
一つの態様において、第1および第2のポリペプチドの免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインは、ヒトIgG4サブクラスのものである。一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、変異S228PおよびL235EAを各々さらに含む。一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、変異P329Gを各々さらに含む。一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、変異S228P、L235E、およびP329Gを各々さらに含む。
一つの態様において、第1および第2のポリペプチドの免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインは、ヒトIgG4サブクラスのものである。一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、変異S228P、L234A、およびL235Aを各々さらに含む。一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、変異P329Gを各々さらに含む。一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、変異S228P、L234A、L235A、およびP329Gを各々さらに含む。
一つの態様において、（二量体）ポリペプチドはFc領域融合ポリペプチドである。
一つの態様において、（二量体）ポリペプチドは（全長）抗体である。
一つの態様において、（全長）抗体は単一特異性抗体である。一つの態様において、単一特異性抗体は、一価の単一特異性抗体である。一つの態様において、単一特異性抗体は、二価の単一特異性抗体である。
一つの態様において、（全長）抗体は二重特異性抗体である。一つの態様において、二重特異性抗体は、二価の二重特異性抗体である。一つの態様において、二重特異性抗体は、四価の二重特異性抗体である。
一つの態様において、（全長）抗体は三重特異性抗体である。一つの態様において、三重特異性抗体は、三価の三重特異性抗体である。一つの態様において、三重特異性抗体は、四価の三重特異性抗体である。
本明細書において報告される一つの局面は、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体を、そのような処置を必要とする患者へ投与することによる、眼血管疾患に罹患している患者の処置の方法である。
本明細書において報告される一つの局面は、硝子体内適用のための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体である。
本明細書において報告される一つの局面は、医薬として使用するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体である。
本明細書において報告される一つの局面は、血管性眼疾患の処置のための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体である。
本明細書において報告される一つの局面は、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体と、任意で、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤である。
眼のみならず身体の他の部分にも存在する抗原を標的とする／に結合する抗体を使用するためには、全身副作用を回避するため、眼から血液へと血液眼関門を通過した後の短い全身半減期が有益である。
さらに、受容体のリガンドに特異的に結合する抗体は、抗体-抗原複合体が眼から除去される場合、即ち、抗体が受容体リガンドの眼からの輸送媒体として機能し、それによって、受容体シグナリングを阻害する場合、眼疾患の処置においてのみ有効である。
ヒト新生児型Fc受容体に結合しないFc領域を含む抗体、即ち、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドは、血液眼関門を越えて輸送されることが、本発明者らによって見出された。血液眼関門を越える輸送にはFcRnとの結合が必要とされると考えられているが、本抗体はヒトFcRnに結合しないため、これは驚くべきことである。
本明細書において報告される一つの局面は、可溶性受容体リガンドの眼から血液眼関門を越えて血液循環への輸送のための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体の使用である。
本明細書において報告される一つの局面は、1種以上の可溶性受容体リガンドの眼からの除去のための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体の使用である。
本明細書において報告される一つの局面は、眼疾患、特に、眼血管疾患の処置のための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体の使用である。
本明細書において報告される一つの局面は、1種以上の可溶性受容体リガンドの硝子体内空間からの血液循環への輸送のための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体の使用である。
本明細書において報告される一つの局面は、眼疾患の処置において使用するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体である。
本明細書において報告される一つの局面は、可溶性受容体リガンドの眼から血液眼関門を越えて血液循環への輸送において使用するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体である。
本明細書において報告される一つの局面は、1種以上の可溶性受容体リガンドの眼からの除去において使用するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体である。
本明細書において報告される一つの局面は、眼疾患、特に、眼血管疾患の処置において使用するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体である。
本明細書において報告される一つの局面は、1種以上の可溶性受容体リガンドの硝子体内空間からの血液循環への輸送において使用するための、本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体である。
本明細書において報告される一つの局面は、有効量の本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体を個体へ投与する工程を含む、眼血管疾患を有する個体を処置する方法である。
本明細書において報告される一つの局面は、可溶性受容体リガンドを眼から血液眼関門を越えて血液循環へ輸送するために有効な量の本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体を個体へ投与する工程を含む、個体において可溶性受容体リガンドを眼から血液眼関門を越えて血液循環へ輸送する方法である。
本明細書において報告される一つの局面は、1種以上の可溶性受容体リガンドを眼から除去するために有効な量の本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体を個体へ投与する工程を含む、個体において1種以上の可溶性受容体リガンドを眼から除去する方法である。
本明細書において報告される一つの局面は、1種以上の可溶性受容体リガンドを硝子体内空間から血液循環へ輸送するために有効な量の本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体を個体へ投与する工程を含む、個体において1種以上の可溶性受容体リガンドを硝子体内空間から血液循環へ輸送する方法である。
本明細書において報告される一つの局面は、可溶性受容体リガンドを眼から血液眼関門を越えて血液循環へ輸送するために有効な量の本明細書において報告される（二量体）ポリペプチドまたは抗体を個体へ投与する工程を含む、個体において可溶性受容体リガンドを硝子体内空間または眼から血液眼関門を越えて血液循環へ輸送する方法である。
一つの態様において、（二量体）ポリペプチドは、二重特異性抗体である。一つの態様において、二重特異性抗体は、二価の二重特異性抗体である。一つの態様において、二重特異性抗体は、四価の二重特異性抗体である。
一つの態様において、（二量体）ポリペプチドは、三重特異性抗体である。一つの態様において、三重特異性抗体は、三価の三重特異性抗体である。一つの態様において、三重特異性抗体は、四価の三重特異性抗体である。
一つの態様において、第1のポリペプチドは変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vをさらに含み、かつ第2のポリペプチドは変異S354CおよびT366Wをさらに含む。
一つの態様において、第1のポリペプチドは変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vをさらに含み、かつ第2のポリペプチドは変異Y349CおよびT366Wをさらに含む。
一つの態様において
（i）第1および第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（ii）第1および第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dをさらに含むか、または
（iii）第1および第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sをさらに含むか、または
（iv）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（v）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aをさらに含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dをさらに含むか、または
（vi）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aをさらに含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sをさらに含む。
一つの態様において、（二量体）ポリペプチドは、CrossMabである。
一つの態様において、（二量体）ポリペプチドは、Fc領域融合ポリペプチドである。
一つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、サブクラスIgG1のものである。一つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、変異L234AおよびL235Aをさらに含む。一つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、変異P329Gをさらに含む。
一つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、サブクラスIgG2のものである。一つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、変異V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、およびP331Sをさらに含む。
一つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、サブクラスIgG4のものである。一つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、変異S228PおよびL235Eをさらに含む。一つの態様において、抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、変異P329Gをさらに含む。
IHH-AAA変異（変異I253A、H310A、およびH435A（カバットEUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）の組み合わせ）を有する、IgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの抗VEGF/ANG2抗体の概念のスキームおよび利点。 小規模なDLSに基づく粘度測定：200mMアルギニン／コハク酸緩衝液（pH5.5）中150mg/mLにおける外挿された粘度（（IHH-AAA変異を有する）抗VEGF/ANG2抗体VEGF/ANG2-0016の（そのようなIHH-AAA変異を有しない）参照抗体VEGF/ANG2-0015との比較）。 20mMヒスチジン緩衝液、140mM NaCl（pH6.0）における（DLS凝集開始温度を含む）温度に依存するDLS凝集（本明細書において報告される抗VEGF/ANG2抗体（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016の（そのようなIHH-AAA変異を有しない）参照抗体VEGF/ANG2-0015との比較）。 100mg/mLでの40℃での7日間の保管（メインピークの減少および高分子量（HMW）の増加）（より低い凝集を示した本明細書において報告される抗VEGF/ANG2抗体（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016の（そのようなIHH-AAA変異を有しない）参照抗体VEGF/ANG2-0015との比較）。 （IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015のFcRn定常状態親和性。 （IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016のFcRn定常状態親和性。 IHH-AAA変異を有しないVEGF/ANG2-0015およびIHH-AAA変異を有するVEGF/ANG2-0016（いずれも、IgG1サブクラスであり、P329G LALA変異を有する；対照として、IgG1サブクラスの抗ジゴキシゲニン抗体（抗Dig抗体）およびIgG4に基づく抗体が使用された）のFcγRIIIa相互作用測定。 血清中および全眼溶解物中の抗VEGF/ANG2抗体の濃度の決定のための薬物動態学的（PK）ELISAアッセイ原理の図解。 静脈内（i.v.）適用後の血清濃度：IHH-AAA変異を有しないVEGF/ANG2-0015とIHH-AAA変異を有するVEGF/ANG2-0016との比較。 硝子体内適用後の血清濃度：IHH-AAA変異を有しないVEGF/ANG2-0015とIHH-AAA変異を有するVEGF/ANG2-0016との比較。 （静脈内適用と比較した、右眼のみへの硝子体内適用後の）左右の眼における（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016の眼溶解物濃度：（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016の低い血清半減期のため、硝子体内適用後には、右眼にのみ有意な濃度を検出することができ；静脈内適用後には、眼溶解物中の濃度は検出不可能である。 （静脈内適用と比較した、右眼のみへの硝子体内適用後の）左右の眼における（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015の眼溶解物濃度：硝子体内適用後には、右眼に（ある程度、左眼にも）、VEGF/ANG2-0015の濃度を検出することができた；これは、右眼から血清、血清から左眼への拡散を示し、（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015の長い半減期によって説明され得る；静脈内適用後にも、血清安定的な（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015の眼へ拡散のため、両方の眼の眼溶解物中に有意な濃度を検出することができた。 FcRnに結合する能力に関して操作された抗体は、延長された（YTE変異）または短縮された（IHH-AAA変異）インビボ半減期、SPR分析における参照野生型（wt）抗体と比較して増強された（YTE変異）または低下した（IHH-AAA変異）結合、ならびにFcRnカラムクロマトグラフィにおける増強されたまたは低下した保持時間を示す；（a）huFcRnトランスジェニック雄C57BL/6Jマウス+/-276への10mg/kgの単回i.v.ボーラス適用後のPKデータ：wt IgGならびにYTE Fc領域修飾型IgGおよびIHH-AAA Fc領域修飾型IgGについてのAUCデータ；野生型抗IGF-1R抗体（参照）、抗IGF-1R抗体のYTE変異体、抗IGF-1R抗体のIHH-AAA変異体。 FcRnに結合する能力に関して操作された抗体は、延長された（YTE変異）または短縮された（IHH-AAA変異）インビボ半減期、SPR分析における参照野生型（wt）抗体と比較して増強された（YTE変異）または低下した（IHH-AAA変異）結合、ならびにFcRnカラムクロマトグラフィにおける増強されたまたは低下した保持時間を示す；（b）BIAcoreセンサーグラム；野生型抗IGF-1R抗体（参照）、抗IGF-1R抗体のYTE変異体、抗IGF-1R抗体のIHH-AAA変異体。 FcRnに結合する能力に関して操作された抗体は、延長された（YTE変異）または短縮された（IHH-AAA変異）インビボ半減期、SPR分析における参照野生型（wt）抗体と比較して増強された（YTE変異）または低下した（IHH-AAA変異）結合、ならびにFcRnカラムクロマトグラフィにおける増強されたまたは低下した保持時間を示す；（c）FcRnアフィニティカラム溶出；野生型抗IGF-1R抗体（参照）、抗IGF-1R抗体のYTE変異体、抗IGF-1R抗体のIHH-AAA変異体。 Fc領域へ導入された変異の数に依る、FcRnアフィニティクロマトグラフィにおける保持時間の変化。 Fc領域へ導入された変異の非対称分布に依るFcRn結合の変化。 2個の連続するプロテインAアフィニティクロマトグラフィカラムからの、両方の重鎖に変異H310A、H433A、およびY436Aの組み合わせを有する二重特異性抗VEGF/ANG2抗体（VEGF/ANG2-0121）の溶出クロマトグラム。 両方の重鎖に変異H310A、H433A、およびY436Aを有する抗IGF-1R抗体（IGF-1R-0045）のプロテインAアフィニティクロマトグラフィカラムからの溶出クロマトグラム。 CM5チップ上の固定化されたプロテインAへのIgG Fc領域修飾型抗VEGF/ANG2抗体の結合。 異なる抗VEGF/ANG2抗体のFcRnアフィニティカラムにおける溶出クロマトグラム。 異なる融合ポリペプチドのブドウ球菌プロテインAとの結合（SPR）。 異なる抗VEGF/ANG2抗体および抗IGF-1R抗体の変異体の固定化されたプロテインAへの結合（SPR）。 抗体IGF-1R 0033、0035、および0045の静脈内適用後の血清濃度の比較。 抗体IGF-1R 0033の硝子体内適用および静脈内適用の後の眼溶解物濃度の比較。 抗体IGF-1R 0035の硝子体内適用および静脈内適用の後の眼溶解物濃度の比較。 抗体IGF-1R 0045の硝子体内適用および静脈内適用の後の眼溶解物濃度の比較。
発明の態様の詳細な説明
I.定義
「約」という用語は、その後に続く数値の+/-20％の範囲を示す。一つの態様において、約という用語は、その後に続く数値の+/-10％の範囲を示す。一つの態様において、約という用語は、その後に続く数値の+/-5％の範囲を示す。
「アクセプターヒトフレームワーク」とは、本明細書における目的のため、以下に定義されるヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（VL）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（VH）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでいてもよいし、またはアミノ酸配列改変を含有していてもよい。いくつかの態様において、アミノ酸改変の数は、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、または2個以下である。いくつかの態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「親和性成熟」抗体とは、そのような改変を保有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす、1個以上の改変を1個以上の超可変領域（HVR）に有する抗体をさす。
「改変」という用語は、親抗体または親融合ポリペプチド、例えば、Fc領域のFcRn結合部分を少なくとも含む融合ポリペプチドの、修飾型抗体または修飾型融合ポリペプチドを入手するための、1個以上のアミノ酸残基の変異（置換）、挿入（付加）、または欠失を示す。「変異」という用語は、指定されたアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基の代わりに用いられることを示す。例えば、変異L234Aとは、抗体Fc領域（ポリペプチド）の234位のアミノ酸残基リジンがアミノ酸残基アラニンに置換されていること（リジンのアラニンへの置換）（カバットEUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）を示す。
本明細書において使用されるように、重鎖および軽鎖の全ての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)に記載されており、本明細書において「カバットによるナンバリング」と呼ばれるカバットナンバリングシステムによってナンバリングされる。具体的には、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)のカバットナンバリングシステム（647〜660頁を参照すること）が、κアイソタイプおよびλアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLのために使用され、カバットEUインデックスナンバリングシステム（661〜723頁を参照すること）が、定常重鎖ドメイン（CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）のために使用される。
「天然に存在するアミノ酸残基」とは、アラニン（3文字コード：Ala、1文字コード：A）、アルギニン（Arg、R）、アスパラギン（Asn、N）、アスパラギン酸（Asp、D）、システイン（Cys、C）、グルタミン（Gln、Q）、グルタミン酸（Glu、E）、グリシン（Gly、G）、ヒスチジン（His、H）、イソロイシン（Ile、I）、ロイシン（Leu、L）、リジン（Lys、K）、メチオニン（Met、M）、フェニルアラニン（Phe、F）、プロリン（Pro、P）、セリン（Ser、S）、トレオニン（Thr、T）、トリプトファン（Trp、W）、チロシン（Tyr、Y）、およびバリン（Val、V）からなる群からのアミノ酸残基を示す。
「アミノ酸変異」という用語は、少なくとも1個の既存のアミノ酸残基のもう1個の異なるアミノ酸残基（＝置換アミノ酸残基）への置換を示す。置換アミノ酸残基は、「天然に存在するアミノ酸残基」であってよく、アラニン（3文字コード：ala、1文字コード：A）、アルギニン（arg、R）、アスパラギン（asn、N）、アスパラギン酸（asp、D）、システイン（cys、C）、グルタミン（gln、Q）、グルタミン酸（glu、E）、グリシン（gly、G）、ヒスチジン（his、H）、イソロイシン（ile、I）、ロイシン（leu、L）、リジン（lys、K）、メチオニン（met、M）、フェニルアラニン（phe、F）、プロリン（pro、P）、セリン（ser、S）、トレオニン（thr、T）、トリプトファン（trp、W）、チロシン（tyr、Y）、およびバリン（val、V）からなる群より選択され得る。置換アミノ酸残基は、「天然に存在しないアミノ酸残基」であってもよい。例えば、（全て、参照によって本明細書に完全に組み入れられる）US 6,586,207、WO 98/48032、WO 03/073238、US 2004/0214988、WO 2005/35727、WO 2005/74524、Chin,J.W.,et al.,J.Am.Chem.Soc.124(2002)9026-9027；Chin,J.W.and Schultz,P.G.,ChemBioChem 11(2002)1135-1137；Chin,J.W.,et al.,PICAS United States of America 99(2002)11020-11024；およびWang,L.and Schultz,P.G.,Chem.(2002)1-10を参照すること。
「アミノ酸挿入」という用語は、アミノ酸配列内の予定された位置における少なくとも1個のアミノ酸残基の（付加的な）組み入れを示す。一つの態様において、挿入は、1個または2個のアミノ酸残基の挿入であろう。挿入されるアミノ酸残基は、天然に存在するかまたは天然に存在しない任意のアミノ酸残基であり得る。
「アミノ酸欠失」という用語は、アミノ酸配列内の予定された位置における少なくとも1個のアミノ酸残基の除去を示す。
「ANG-2」という用語は、本明細書において使用されるように、例えば、Maisonpierre,P.C.,et al,Science 277(1997)55-60およびCheung,A.H.,et al.,Genomics 48(1998)389-91に記載されているヒトアンジオポエチン-2（ANG-2）（あるいはANGPT2またはANG2と略される）（SEQ ID NO:31）をさす。アンジオポエチン-1（SEQ ID NO:32）およびアンジオポエチン-2は、血管内皮内に選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリーTieのリガンドとして発見された（Yancopoulos,G.D.,et al.,Nature 407(2000)242-248）。現在、アンジオポエチンファミリーの4種の確定的なメンバーが存在する。アンジオポエチン-3およびアンジオポエチン-4（ANG-3およびANG-4）は、マウスおよびヒトにおける同一の遺伝子座の広く分岐したカウンターパートを表す可能性がある（Kim,I.,et al.,FEBS Let,443(1999)353-356；Kim,I.,et al.,J.Biol.Chem.274(1999)26523-26528）。ANG-1およびANG-2は、それぞれ、アゴニストおよびアンタゴニストとして、組織培養実験において最初に同定された（ANG-1については：Davis,S.,et al.,Cell 87(1996)1161-1169；ANG-2については：Maisonpierre,P.C.,et al.,Science 277(1997)55-60を参照すること）。公知のアンジオポエチンは、全て、主としてTie2（SEQ ID NO:33）に結合し、ANG-1およびANG-2は、いずれも、3nM（Kd）の親和性でTie2に結合する（Maisonpierre,P.C.,et al.,Science 277(1997)55-60）。
「抗体」という用語は、最も広義に本明細書において使用され、抗原および／またはプロテインAおよび／またはFcRnとの所望の結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体）、および抗体断片を含むが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
「非対称のFc領域」という用語は、カバットEUインデックスナンバリングシステムによる対応する位置に異なるアミノ酸残基を有しているFc領域ポリペプチドの対を示す。
「FcRn結合に関して非対称のFc領域」という用語は、カバットEUインデックスナンバリングシステムによって決定される対応する位置に、Fc領域のヒト新生児型Fc受容体（FcRn）との結合に影響を与える異なるアミノ酸残基を有する2本のポリペプチド鎖からなるFc領域を示す。本明細書における目的のため、「FcRn結合に関して非対称のFc領域」におけるFc領域の2本のポリペプチド鎖の間の差違に、例えば、二重特異性抗体の作製のため、ヘテロ二量体Fc領域の形成を容易にするために導入された差違は含まれない。これらの差違も非対称であり得る。即ち、2本の鎖が、カバットEUインデックスナンバリングシステムによる非対応アミノ酸残基に差違を有していてもよい。これらの差違は、ヘテロ二量体化を容易にし、ホモ二量体化を低下させる。そのような差違の例は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」置換である（例えば、US 7,695,936、US 2003/0078385を参照すること）。サブクラスIgG1のIgG抗体のFc領域の個々のポリペプチド鎖における以下のノブ置換およびホール置換：（1）一方の鎖のY407Tおよび他方の鎖のT366Y；（2）一方の鎖のY407Aおよび他方の鎖のT366W；（3）一方の鎖のF405Aおよび他方の鎖のT394W；（4）一方の鎖のF405Wおよび他方の鎖のT394S；（5）一方の鎖のY407Tおよび他方の鎖のT366Y；（6）一方の鎖のT366YおよびF405A、ならびに他方の鎖のT394WおよびY407T；（7）一方の鎖のT366WおよびF405W、ならびに他方の鎖のT394SおよびY407A；（8）一方の鎖のF405WおよびY407A、ならびに他方の鎖のT366WおよびT394S；ならびに（9）一方の鎖のT366W、ならびに他方の鎖のT366S、L368A、およびY407Vが、ヘテロ二量体形成を増加させることが見出されており、最後に挙げられたものが特に適している。さらに、2本のFc領域ポリペプチド鎖の間に新しいジスルフィド架橋を作出する変化は、ヘテロ二量体形成を容易にする（例えば、US 2003/0078385を参照すること）。サブクラスIgG1のIgG抗体のFc領域の個々のポリペプチド鎖における新しい鎖内ジスルフィド結合の形成のための適切な間隔のシステイン残基をもたらす以下の置換：一方の鎖のY349Cおよび他方のS354C；一方の鎖のY349Cおよび他方のE356C；一方の鎖のY349Cおよび他方のE357C；一方の鎖のL351Cおよび他方のS354C；一方の鎖のT394Cおよび他方のE397C；または一方の鎖のD399Cおよび他方のK392Cは、ヘテロ二量体形成を増加させることが見出されている。アミノ酸変化を容易にするヘテロ二量体化のさらなる例は、いわゆる「電荷対置換」である（例えば、WO 2009/089004を参照すること）。サブクラスIgG1のIgG抗体のFc領域の個々のポリペプチド鎖における以下の電荷対置換：（1）一方の鎖のK409DまたはK409E、および他方の鎖のD399KまたはD399R；（2）一方の鎖のK392DまたはK392E、および他方の鎖のD399KまたはD399R；（3）一方の鎖のK439DまたはK439E、および他方の鎖のE356KまたはE356R；（4）一方の鎖のK370DまたはK370E、および他方の鎖のE357KまたはE357R；（5）一方の鎖のK409DおよびK360D＋他方の鎖のD399KおよびE356K；（6）一方の鎖のK409DおよびK370D＋他方の鎖のD399KおよびE357K；（7）一方の鎖のK409DおよびK392D＋他方の鎖のD399K、E356K、およびE357K；（8）一方の鎖のK409DおよびK392D、ならびに他方の鎖のD399K；（9）一方の鎖のK409DおよびK392D、ならびに他方の鎖のD399KおよびE356K；（10）一方の鎖のK409DおよびK392D、ならびに他方の鎖のD399KおよびD357K；（11）一方の鎖のK409DおよびK370D、ならびに他方の鎖のD399KおよびD357K；（12）一方の鎖のD399K、ならびに他方の鎖のK409DおよびK360D；ならびに（13）一方の鎖のK409DおよびK439D、ならびに他方のD399KおよびE356Kが、ヘテロ二量体形成を増加させることが見出されている。
「（抗原との）結合」という用語は、インビトロアッセイ、一つの態様において、抗体が表面に結合しており、抗原の抗体への結合が表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定される結合アッセイにおける、抗体の抗原との結合を示す。結合とは、10-8M以下、いくつかの態様において、10-13〜10-8M、いくつかの態様において、10-13〜10-9Mの結合親和性（KD）を意味する。
結合は、BIAcoreアッセイ（GE Healthcare Biosensor AB,Uppsala,Sweden）によって調査され得る。結合の親和性は、ka（抗体／抗原複合体の会合についての速度定数）、kd（解離定数）、およびKD（kd/ka）という用語によって定義される。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の起源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる起源または種に由来する抗体をさす。
「CH2ドメイン」という用語は、およそEU 231位からEU 340位までに及ぶ（カバットによるEUナンバリングシステム）抗体重鎖ポリペプチドの部分を示す。一つの態様において、CH2ドメインは、
Figure 2017508726
のアミノ酸配列を有する。
「CH3ドメイン」という用語は、およそEU 341位からEU 446位までに及ぶ抗体重鎖ポリペプチドの部分を示す。一つの態様において、CH3ドメインは、
Figure 2017508726
のアミノ酸配列を有する。
抗体の「クラス」とは、その重鎖が保有している定常ドメインまたは定常領域のタイプをさす。抗体の5種の主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2へさらに分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
「比較可能な長さ」という用語は、2種のポリペプチドが同一の数のアミノ酸残基を含むか、または1アミノ酸残基以上、高々10アミノ酸残基まで、長さが異なっていてもよいことを示す。一つの態様において、（Fc領域）ポリペプチドは、同一の数のアミノ酸残基を含むか、または1〜10アミノ酸残基の数だけ異なっている。一つの態様において、（Fc領域）ポリペプチドは、同一の数のアミノ酸残基を含むか、または1〜5アミノ酸残基の数だけ異なっている。一つの態様において、（Fc領域）ポリペプチドは、同一の数のアミノ酸残基を含むか、または1〜3アミノ酸残基の数だけ異なっている。
「エフェクター機能」とは、抗体のFc領域に起因し得る生物学的活性をさし、それは抗体クラスによって変動する。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）；Fc受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ADCC）；貪食；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）のダウンレギュレーション；ならびにB細胞活性化：が含まれる。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的または予防的な結果を達成するため、必要な投薬量および期間で、有効な量をさす。
「Fc融合ポリペプチド」という用語は、結合ドメイン（例えば、単鎖抗体などの抗原結合ドメイン、または受容体のリガンドなどのポリペプチド）の、標的、プロテインA、およびFcRnとの所望の結合活性を示す抗体Fc領域との融合物を示す。
「ヒト起源のFc領域」という用語は、ヒンジ領域の少なくとも一部、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含有しているヒト起源の免疫グロブリン重鎖のC末端領域を示す。一つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226またはPro230から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。一つの態様において、Fc領域は、SEQ ID NO:60のアミノ酸配列を有する。しかしながら、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は存在してもよいしまたは存在しなくてもよい。
「FcRn」という用語は、ヒト新生児型Fc受容体を意味する。FcRnは、リソソーム分解経路からIgGを救出し、クリアランスの低下および半減期の増加をもたらすよう機能する。FcRnは、2種のポリペプチド：50kDaのクラスI主要組織適合複合体様タンパク質（αFcRn）および15kDaのβ2ミクログロブリン（β2m）からなるヘテロ二量体タンパク質である。FcRnは、IgGのFc領域のCH2-CH3部分に高い親和性で結合する。IgGとFcRnとの間の相互作用は、厳密にpH依存性であり、1：2化学量論で起こり、1個のIgG抗体分子が、その2本の重鎖を介して2個のFcRn分子に結合する（例えば、Huber,A.H.,et al.,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083を参照すること）。FcRn結合が酸性pH（pH＜6.5）でエンドソームにおいて起こり、IgGが中性の細胞表面（約7.4のpH）に放出される。相互作用のpH感受性は、エンドソームの酸性環境内の受容体との結合による、細胞へ飲作用によって取り込まれたIgGの細胞内分解からのFcRnによって媒介される防御を容易にする。次いで、FcRnは、IgGの細胞表面へのリサイクリングおよびその後のFcRn-IgG複合体の細胞外中性pH環境への曝露による血液循環への放出を容易にする。
「Fc領域のFcRn結合部分」という用語は、およそEU 243位〜EU 261位、およびおよそEU275位〜EU293位、およびおよそEU302位〜EU319位、およびおよそEU336位〜EU348位、およびおよそEU367位〜EU393位、およびEU408位、およびおよそEU424位〜EU440位に及ぶ抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。一つの態様において、カバットのEUナンバリングによる以下のアミノ酸残基F243、P244、P245 P、K246、P247、K248、 D249、T250、L251、M252、I253、S254、R255、T256、P257、E258、V259、T260、C261、F275、N276、W277、Y278、V279、D280、V282、E283、V284、H285、N286、A287、K288、T289、K290、P291、R292、E293、V302、V303、S304、V305、L306、T307、V308、L309、H310、Q311、D312、W313、L314、N315、G316、K317、E318、Y319、I336、S337、K338、A339、K340、G341、Q342、P343、R344、E345、P346、Q347、V348、C367、V369、F372、Y373、P374、S375、D376、I377、A378、V379、E380、W381、E382、S383、N384、G385、Q386、P387、E388、N389、Y391、T393、S408、S424、C425、S426、V427、M428、H429、E430、A431、L432、H433、N434、H435、Y436、T437、Q438、K439、およびS440（EUナンバリング）のうちの1個以上が改変される。
「フレームワーク」または「FR」とは、超可変領域（HVR）残基以外の可変ドメイン残基をさす。可変ドメインのFRは、一般に、4個のFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。従って、HVRおよびFRの配列が、VH（またはVL）において、一般に、以下の順序で出現する：FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。
「全長抗体」という用語は、4個のポリペプチドを含むかまたは本明細書において定義されるFc領域を含有している重鎖を有するネイティブ抗体構造に実質的に類似している構造を有する抗体を示す。全長抗体は、例えば、全長抗体の鎖のうちの1本以上にコンジュゲートされたscFvまたはscFabなどのさらなるドメインを含んでいてもよい。これらのコンジュゲートも、全長抗体という用語に包含される。
「二量体ポリペプチド」という用語は、共有結合で会合した少なくとも2個のポリペプチドを含む複合体を示す。複合体は、他のポリペプチドと共有結合でまたは非共有結合で会合したさらなるポリペプチドを含んでいてもよい。一つの態様において、二量体ポリペプチドは、2個または4個のポリペプチドを含む。
「ヘテロ二量体」または「ヘテロ二量体の」という用語は、カバットEUインデックスナンバリングシステムによって決定される対応する位置に少なくとも1個の異なるアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する（例えば、比較可能な長さの）2個のポリペプチドを含む分子を意味する。
「ホモ二量体」または「ホモ二量体の」という用語は、カバットEUインデックスナンバリングシステムによって決定される対応する位置に同一のアミノ酸配列を有する比較可能な長さの2個のポリペプチドを含む分子を示す。
本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、ホモ二量体またはヘテロ二量体であり得、それは、注目している変異または特性に関して決定される。例えば、FcRnおよび／またはプロテインAとの結合（即ち、注目された特性）に関して、二量体ポリペプチドは、変異H310A、H433A、およびY436A（これらの変異は、二量体ポリペプチドのFcRnおよび／またはプロテインAとの結合特性に関して注目されている）に関してホモ二量体である（即ち、二量体ポリペプチドの両方のポリペプチドがこれらの変異を有する）が、同時に、変異Y349C、T366S、L368A、およびY407V（これらの変異は、二量体ポリペプチドのヘテロ二量体化のためのものであって、FcRnおよび／またはプロテインAとの結合特性のためのものではないため、注目されていない）、ならびに変異S354CおよびT366Wに関してはそれぞれヘテロ二量体である（第1のセットは第1のポリペプチドにのみ含まれ、第2のセットは第2のポリペプチドにのみ含まれる）。さらに、例えば、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、変異I253A、H310A、H433A、H435A、およびY436Aに関してヘテロ二量体であり得る（即ち、これらの変異は全て二量体ポリペプチドのFcRnおよび／またはプロテインAとの結合特性のためのものである）。即ち、一方のポリペプチドが、変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、他方のポリペプチドが、変異H310A、H433A、およびY436Aを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外来性核酸が導入された細胞をさし、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、初代形質転換細胞および継代回数に関わらないそれに由来する子孫を含む「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、親細胞と核酸内容が完全に同一でなくてもよく、変異を含有していてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたまたは選択されたのと同一の機能または生物学的活性を有する変異体子孫が、本明細書に含まれる。
「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくはその他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト起源に由来する抗体のものに相当するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンのVLまたはVHのフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンのVLまたはVHの配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般に、配列のサブグループは、Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Bethesda MD(1991),NIH Publication 91-3242,Vols.1-3にあるようなサブグループである。一つの態様において、VLについて、サブグループは、Kabatら（前記）にあるようなサブグループκIである。一つの態様において、VHについて、サブグループは、Kabatら（前記）にあるようなサブグループIIIである。
「に由来する」という用語は、あるアミノ酸配列が、少なくとも1個の位置に改変を導入することによって、親アミノ酸配列に由来することを示す。従って、由来するアミノ酸配列は、少なくとも1個の対応する位置（抗体Fc領域のためのカバットEUインデックスによるナンバリング）において対応する親アミノ酸配列と異なる。一つの態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において1〜15アミノ酸残基だけ異なる。一つの態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において1〜10アミノ酸残基だけ異なる。一つの態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において1〜6アミノ酸残基だけ異なる。同様に、由来するアミノ酸配列は、その親アミノ酸配列との高いアミノ酸配列同一性を有する。一つの態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、80％以上のアミノ酸配列同一性を有する。一つの態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、90％以上のアミノ酸配列同一性を有する。一つの態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、95％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
「ヒトFc領域ポリペプチド」という用語は、「ネイティブの」または「野生型の」ヒトFc領域ポリペプチドと同一であるアミノ酸配列を示す。「バリアント（ヒト）Fc領域ポリペプチド」という用語は、少なくとも1個の「アミノ酸改変」によって「ネイティブの」または「野生型の」ヒトFc領域ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を示す。「ヒトFc領域」は、2個のヒトFc領域ポリペプチドからなっている。「バリアント（ヒト）Fc領域」は、2個のFc領域ポリペプチドからなっており、両方がバリアント（ヒト）Fc領域ポリペプチドであってもよいし、または一方がヒトFc領域ポリペプチドであって、他方がバリアント（ヒト）Fc領域ポリペプチドである。
一つの態様において、ヒトFc領域ポリペプチドは、本明細書において報告される変異を有する、SEQ ID NO:60のヒトIgG1 Fc領域ポリペプチド、またはSEQ ID NO:61のヒトIgG2 Fc領域ポリペプチド、またはSEQ ID NO:63のヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。一つの態様において、バリアント（ヒト）Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO:60または61または63のFc領域ポリペプチドに由来し、SEQ ID NO:60または61または63のFc領域ポリペプチドと比較して少なくとも1個のアミノ酸変異を有する。一つの態様において、バリアント（ヒト）Fc領域ポリペプチドは、約1〜約10個のアミノ酸変異、一つの態様において、約1〜約5個のアミノ酸変異を含む／有する。一つの態様において、バリアント（ヒト）Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO:60または61または63のヒトFc領域ポリペプチドとの少なくとも約80％の相同性を有する。一つの態様において、バリアント（ヒト）Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO:60または61または63のヒトFc領域ポリペプチドとの少なくとも約90％の相同性を有する。一つの態様において、バリアント（ヒト）Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO:60または61または63のヒトFc領域ポリペプチドとの少なくとも約95％の相同性を有する。
SEQ ID NO:60または61または63のヒトFc領域ポリペプチドに由来するバリアント（ヒト）Fc領域ポリペプチドは、含有されているアミノ酸改変によって定義される。従って、例えば、P329Gという用語は、SEQ ID NO:60または61または63のヒトFc領域ポリペプチドと比べてアミノ酸329位におけるプロリンのグリシンへの変異によってヒトFc領域ポリペプチドに由来するバリアント（ヒト）Fc領域ポリペプチドを示す。
本発明において議論される全ての位置について、ナンバリングは、カバットEUインデックスナンバリングシステムによる。
ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
変異L234A、L235Aを有するヒトIgG1 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
Y349C、T366S、L368A、およびY407V変異を有するヒトIgG1 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
S354C、T366W変異を有するヒトIgG1 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
L234A、L235A変異、およびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を有するヒトIgG1 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
L234A、L235AおよびS354C、T366W変異を有するヒトIgG1 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
P329G変異を有するヒトIgG1 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
L234A、L235A変異、およびP329G変異を有するヒトIgG1 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
P239G変異、およびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を有するヒトIgG1 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
P329G変異、およびS354C、T366W変異を有するヒトIgG1 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
L234A、L235A、P329GおよびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を有するヒトIgG1 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
L234A、L235A、P329G変異、およびS354C、T366W変異を有するヒトIgG1 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
S228PおよびL235E変異を有するヒトIgG4 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
S228P、L235E変異、およびP329G変異を有するヒトIgG4 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
S354C、T366W変異を有するヒトIgG4 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
Y349C、T366S、L368A、Y407V変異を有するヒトIgG4 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
S228P、L235EおよびS354C、T366W変異を有するヒトIgG4 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
S228P、L235EおよびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を有するヒトIgG4 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
P329G変異を有するヒトIgG4 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
P239GおよびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を有するヒトIgG4 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
P329GおよびS354C、T366W変異を有するヒトIgG4 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
S228P、L235E、P329GおよびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を有するヒトIgG4 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
S228P、L235E、P329GおよびS354C、T366W変異を有するヒトIgG4 Fc領域由来Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2017508726
異なるヒトFc領域のアライメントは、以下に示される（カバットEUインデックスナンバリングシステム）：
Figure 2017508726
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRに由来するアミノ酸残基と、ヒトFRに由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体をさす。ある種の態様において、ヒト化抗体は、HVR（例えばCDR）の全部または実質的に全部が非ヒト抗体のものに相当し、FRの全部または実質的に全部がヒト抗体のものに相当する、少なくとも1個、典型的には2個の可変ドメインの実質的に全部を含むであろう。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体をさす。
「超可変領域」または「HVR」という用語は、本明細書において使用されるように、配列が超可変性であり（「相補性決定領域」または「CDR」）、構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／または抗原と接触する残基（「抗原接触部」）を含有している抗体可変ドメインの領域の各々をさす。一般に、抗体は、6個のHVRを含み；VHに3個（H1、H2、H3）、VLに3個（L1、L2、L3）を含む。本明細書に示されるHVRは、以下のものを含む。
（a）アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3）に存在する超可変ループ（Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917）；
（b）アミノ酸残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、89〜97（L3）、31〜35b（H1）、50〜65（H2）、および95〜102（H3）に存在するCDR（Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242.）；
（c）アミノ酸残基27c〜36（L1）、46〜55（L2）、89〜96（L3）、30〜35b（H1）、47〜58（H2）、および93〜101（H3）に存在する抗原接触部（MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996)）；ならびに
（d）HVRアミノ酸残基46〜56（L2）、47〜56（L2）、48〜56（L2）、49〜56（L2）、26〜35（H1）、26〜35b（H1）、49〜65（H2）、93〜102（H3）、および94〜102（H3）を含む、（a）、（b）、および／または（c）の組み合わせ。
他に示されない限り、HVR残基および可変ドメインのその他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書において、カバットEUインデックスナンバリングシステム（Kabat et al.（前記））によってナンバリングされる。
「IGF-1R」という用語は、本明細書において使用されるように、他に示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）ならびに齧歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物起源に由来するネイティブIGF-1Rをさす。その用語には、プロセシングを受けていない「全長」IGF-1Rも包含されるし、細胞内でのプロセシングに起因するIGF-1Rの型も包含される。その用語には、IGF-1Rの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含される。ヒトIGF-1Rのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:11に示される。
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、飼育された動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある種の態様において、個体または対象はヒトである。
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換もしくは逆相HPLC）によって決定されるような95％または99％を越える純度にまで精製される。抗体純度の査定の方法の概説については、例えば、Flatman,S.et al.,J.Chrom.B 848(2007)79-87を参照すること。
「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子をさす。単離された核酸には、核酸分子を通常含有している細胞に含有されているが、染色体外または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が含まれる。
「抗IGF-1R抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体の重鎖および軽鎖をコードする1種以上の核酸分子（またはその断片）をさし、単一のベクターまたは別々のベクターの中のそのような核酸分子、および宿主細胞内の1個以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、実質的に均質の抗体の集団から入手された抗体をさす。即ち、例えば、天然に存在する変異を含有しているか、またはモノクローナル抗体調製物の作製の間に発生する可能性のあるバリアント抗体を除き、集団を構成する個々の抗体が、同一でありかつ／または同一のエピトープに結合する。そのようなバリアントは、一般に、微量に存在する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質の集団から入手されるという抗体の特質を示すものであって、具体的な方法による抗体の作製を必要とするものと解釈されてはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有しているトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない、多様な技術によって作成され得、そのような方法およびモノクローナル抗体を作成するためのその他の例示的な方法は、本明細書に記載される。
「ネイティブ抗体」とは、変動する構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子をさす。例えば、ネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合した2本の同一の軽鎖および2本の同一の重鎖から構成された、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端へ、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VH）を有し、その後に、3個の定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）を有する。同様に、N末端からC末端へ、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VL）を有し、その後に、定常軽鎖（CL）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる二つのタイプのうちの一つに割り当てられ得る。
「パッケージインサート」という用語は、治療用生成物の適応症、使用法、投薬量、投与、組み合わせ治療、禁忌、および／または使用上の注意に関する情報を含有している治療用生成物の商業的パッケージに慣習的に含まれる説明書をさすために使用される。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを達成するため、必要であれば、ギャップを導入した後、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義され、保存的置換は配列同一性の一部として考慮されない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内にある様々な方式で達成され得る。当業者は、比較されている配列の全長において最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のため、アミノ酸配列同一性％値は配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech,Inc.によって作成されたものであり、ソースコードは、U.S.Copyright Office（Washington D.C.,20559）にユーザードキュメンテーションと共に提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech,Inc.（South San Francisco,California）から公に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ALIGN-2プログラムは、ディジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステムにおいて使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータが、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。
ALIGN-2がアミノ酸配列比較のために利用される状況において、所定のアミノ酸配列Bに対する所定のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所定のアミノ酸配列Bに対するあるアミノ酸配列同一性％を有するかまたは含む所定のアミノ酸配列Aとも表現され得る）は、以下のように計算される：
100 x 分率X/Y
式中、Xは、そのプログラムのAおよびBのアライメントにおいて配列アライメントプログラムALIGN-2によって同一マッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B内のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さが、アミノ酸配列Bの長さと等しくない場合には、AのBとのアミノ酸配列同一性％が、BのAとのアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解されるであろう。他に特記されない限り、本明細書において使用されるアミノ酸配列同一性％値は、全て、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して、直前のパラグラフに記載されたように入手される。
「薬学的製剤」という用語は、そこに含有されている活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態にあり、その製剤が投与される対象に対して許容されないほどに毒性である付加的な成分を含有していない調製物をさす。
「薬学的に許容される担体」とは、対象に対して非毒性である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分をさす。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
「ペプチドリンカー」という用語は、本明細書において使用されるように、一つの態様において、合成起源のものである、アミノ酸配列を有するペプチドを示す。ペプチドリンカーは、一つの態様において、少なくとも30アミノ酸の長さを有し、一つの態様において、32〜50アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を有するペプチドである。一つの態様において、ペプチドリンカーは、32〜40アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を有するペプチドである。一つの態様において、ペプチドリンカーは、(GxS)n［G＝グリシン、S＝セリン、（x＝3、n＝8、9、もしくは10）または（x＝4、n＝6、7、もしくは8）、一つの態様において、x＝4、n＝6もしくは7、一つの態様において、x＝4、n＝7］である。一つの態様において、ペプチドリンカーは(G4S)6G2である。
「組換え抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、組換え手段によって調製され、発現され、作出され、または単離された全ての抗体（キメラ、ヒト化、およびヒト）を示す。これには、NS0細胞もしくはCHO細胞などの宿主細胞、もしくはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックの動物（例えば、マウス）から単離された抗体、または宿主細胞へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体が含まれる。そのような組換え抗体は、再編成された形態で可変領域および定常領域を有する。組換え抗体はインビボ体細胞変異に供されてもよい。従って、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH配列およびVL配列に由来し、それらに関連しているが、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
本明細書において使用されるように、「処置」（ならびに「処置する」または「処置すること」といったその文法上の変動）は、処置されている個体の自然経過を改変する試みにおける臨床的介入をさし、予防のために実施されてもよいし、または臨床病理の経過中に実施されてもよい。処置の望ましい効果には、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の直接または間接の病理学的結果の縮小、転移の防止、疾患進行の速度の減少、疾患状態の寛解または緩和、および緩解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、本明細書において報告される抗体またはFc領域融合ポリペプチドは、疾患の発症を遅延させるかまたは疾患の進行を遅くするために使用される。
「価」という用語は、本願において使用されるように、明示された数の結合部位が（抗体）分子に存在することを示す。従って、「二価」、「四価」、および「六価」という用語は、それぞれ、2個の結合部位、4個の結合部位、および6個の結合部位が（抗体）分子に存在することを示す。本明細書において報告される二重特異性抗体は、一つの好ましい態様において、「二価」である。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原との結合に関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインをさす。抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、VHおよびVL）は、一般に、類似した構造を有しており、各ドメインが、4個のフレームワーク領域（FR）および3個の超可変領域（HVR）を含む（例えば、Kindt,T.J.et al.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),page 91を参照すること）。単一のVHドメインまたはVLドメインが抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、それぞれ、相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリをスクリーニングするため、抗原に結合する抗体に由来するVHドメインまたはVLドメインを使用して単離され得る（例えば、Portolano,S.et al.,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.et al.,Nature 352(1991)624-628を参照すること）。
「眼血管疾患」という用語には、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、未熟児網膜症、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞、網膜中心静脈閉塞、黄斑変性、加齢性黄斑変性、色素性網膜炎、網膜血管腫増殖、黄斑毛細血管拡張症、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、および網膜変性などの眼内新生血管症候群が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Garner,A.,Vascular diseases,In:Pathobiology of ocular disease,A dynamic approach,Garner,A.,and Klintworth,G.K.,（eds.）,2nd edition,Marcel Dekker,New York(1994),pp.1625-1710を参照すること）。
「ベクター」という用語は、本明細書において使用されるように、連結されたもう一つの核酸を繁殖させることができる核酸分子をさす。その用語には、自己複製性の核酸構造としてのベクターが含まれ、それが導入された宿主細胞のゲノムへ組み込まれたベクターも含まれる。ある種のベクターは、機能的に連結された核酸の発現を指図することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
「VEGF」という用語は、本明細書において使用されるように、ヒト血管内皮増殖因子（VEGF/VEGF-A）、165アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子（ヒトVEGF165の前駆配列：SEQ ID NO:30のアミノ酸27〜191；アミノ酸1〜26はシグナルペプチドを表す）、ならびにLeung,D.W.,et al.,Science 246(1989)1306-1309；Houck et al.,Mol.Endocrin.5(1991)1806-1814；Keck,P.J.,et al.,Science 246(1989)1309-1312、およびConnolly,D.T.,et al.,J.Biol.Chem.264(1989)20017-20024によって記載されるような、関連する121、189、および206の血管内皮細胞増殖因子アイソフォームを、それらの増殖因子の天然に存在する対立遺伝子およびプロセシングされた型と共にさす。VEGFは、腫瘍および眼内障害に関連した正常および異常な血管新生および新血管新生の制御に関与する（Ferrara,N.,et al.,Endocrin.Rev.18(1997)4-25；Berkman,R.A.,et al.,J.Clin.Invest.91(1993)153-159；Brown,L.F.,et al.,Human Pathol.26(1995)86-91；Brown,L.F.,et al.,Cancer Res.53(1993)4727-4735；Mattern,J.,et al.,Brit.J.Cancer.73(1996)931-934；およびDvorak,H.F.,et al.,Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039）。VEGFは、いくつかの起源から単離されているホモ二量体糖タンパク質であり、いくつかのアイソフォームを含む。VEGFは、内皮細胞のための高度に特異的な細胞分裂促進活性を示す。
「変異IHH-AAAを有する」という用語は、本明細書において使用されるように、IgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの定常重鎖領域における変異I253A（Ile253Ala）、H310A（His310Ala）、およびH435A（His435Ala）の組み合わせをさし、「変異HHY-AAAを有する」という用語は、本明細書において使用されるように、変異H310A（His310Ala）、H433A（His433Ala）、およびY436A（Tyr436Ala）の組み合わせをさし、「変異YTEを有する」という用語は、本明細書において使用されるように、変異M252Y（Met252Tyr）、S254T（Ser254Thr）、およびT256E（Thr256Glu）の組み合わせをさす（ナンバリングはカバットEUインデックスナンバリングシステムによる）。
「変異P329G LALAを有する」という用語は、本明細書において使用されるように、IgG1サブクラスの定常重鎖領域における変異L234A（Leu235Ala）、L235A（Leu234Ala）、およびP329G（Pro329Gly）の組み合わせをさす（ナンバリングはカバットEUインデックスナンバリングシステムによる）。「変異SPLEを有する」という用語は、本明細書において使用されるように、IgG4サブクラスの定常重鎖領域における変異S228P（Ser228Pro）およびL235E（Leu235Glu）の組み合わせをさす（ナンバリングはカバットEUインデックスナンバリングシステムによる）。「変異SPLEおよびP329Gを有する」という用語は、本明細書において使用されるように、IgG4サブクラスの定常重鎖領域における変異S228P（Ser228Pro）、L235E（Leu235Glu）、およびP329G（Pro329Gly）の組み合わせをさす（ナンバリングはカバットEUインデックスナンバリングシステムによる）。
II.組成物および方法
一つの局面において、本発明は、Fc領域の一方または両方のFc領域ポリペプチドへの変異Y436Aの導入が、Fc領域のブドウ球菌プロテインAとの結合を増加させ得るという所見に一部分基づく。
一つの局面において、本発明は、免疫グロブリンFc領域の新生児型Fc受容体（FcRn）との結合に影響を及ぼす、即ち、Fc領域のFcRnとの結合を低下させるかまたはさらには排除する特定の変異または変異の組み合わせが、Fc領域のブドウ球菌プロテインAとの結合を同時に排除することはないという所見に一部分基づく。このことは、例えば、κ軽鎖を含む抗体にのみ結合するKappaSelectなどの特異的な種限定的なアフィニティクロマトグラフィ材料が必要とされないため、例えば、利用され得る精製過程に対して甚大な効果を及ぼす。従って、本明細書において報告される変異の組み合わせによって、ブドウ球菌プロテインAとの結合を維持しながら、同時に、FcRnとの結合を低下させるかまたはさらには排除することが可能である。
一つ局面において、本発明は、例えば、二重特異性抗体などのヘテロ二量体分子の各重鎖のFc領域において異なる変異を使用することによって、一方では低下したまたはさらには排除されたFcRnとの結合を有するが、他方ではブドウ球菌プロテインAと結合する能力を維持するものが提供され得るという所見に一部分基づく。このブドウ球菌プロテインAとの結合は、ホモ二量体副生成物からヘテロ二量体分子を分離するために使用され得る。例えば、ノブ・イントゥ・ホールアプローチを使用して、一方の重鎖Fc領域における変異I253A、H310A、およびH435Aを、他方の重鎖Fc領域における変異H310A、H433A、およびY436Aと組み合わせることによって、一方ではFcRnに結合しないが（両方の変異のセットがヒトFcRnに関してサイレントである）、ブドウ球菌プロテインAとの結合を維持するヘテロ二量体Fc領域を入手することができる（変異I253A、H310A、およびH435Aを有する重鎖Fc領域は、FcRnに結合せず、ブドウ球菌プロテインAに結合せず、変異H310A、H433A、およびY436Aを有する重鎖Fc領域は、FcRnに結合しないが、ブドウ球菌プロテインAには結合する）。従って、ホモ二量体ホール・ホール副生成物は、もはやブドウ球菌プロテインAに結合しないため、ホモ二量体ホール・ホール副生成物を除去するために標準的なプロテインAアフィニティクロマトグラフィを使用することができる。従って、ノブ・イントゥ・ホールアプローチを、ホール鎖における変異I253A、H310A、およびH435A、ならびにノブ鎖における変異H310A、H433A、およびY436Aと組み合わせることによって、ホモ二量体ホール・ホール副生成物からのヘテロ二量体ノブ・イントゥ・ホール生成物の精製／分離を容易にすることができる。
一つの局面において、本発明は、FcRn結合を有しない抗体は、血液網膜関門を通過することができ、眼においては実質的に延長された半減期または短縮された半減期を有しておらず、血液循環から迅速に除去され、眼外では全身性副作用を有しないかまたは極めて限定された全身性副作用を有するため、硝子体内適用のために有益であるという所見に一部分基づく。本発明の抗体は、例えば、眼血管疾患の診断または処置のために有用である。
本発明は、Fc領域のFc領域ポリペプチドの各々において異なる変異を使用することによって、特別に調整されたFcRn結合を有する、例えば、二重特異性抗体などのヘテロ二量体分子を提供することができ、それと共に、特別に調整された全身半減期を有する抗体を提供することができるという所見に少なくとも一部分基づく。
変異I253A、H310A、H435A、またはL251D、L314D、L432D、またはL251S、L314S、L432Sの組み合わせは、プロテインAとの結合の喪失をもたらし、変異I253A、H310A、H435A、またはH310A、H433A、Y436A、またはL251D、L314D、L432Dの組み合わせは、ヒト新生児型Fc受容体との結合の喪失をもたらす。
以下の表は、相互作用に関与するか、または相互作用を修飾するために変化させられた、Fc領域のアミノ酸残基の例示的な概要を提示する。
Figure 2017508726
Figure 2017508726
Figure 2017508726
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変異Y436Aと組み合わせて使用され得る、本明細書において報告される修飾は、ヒトFcRnなどの1種以上のFc受容体に対する結合特異性を改変する。同時に、ヒトFcRnとの結合を改変する変異のうちのいくつかは、ブドウ球菌プロテインAとの結合も改変する。付加的な変異Y436Aを使用することによって、ブドウ球菌プロテインAとの結合のこの低下を、低下させるかまたはさらには克服することができる。
一つの態様において、本明細書において報告される変異の組み合わせは、この変異の組み合わせを欠く対応する二量体ポリペプチドと比較して、二量体ポリペプチドの血清半減期を改変するかまたは実質的に改変する。一つの態様において、変異の組み合わせは、さらに、この変異の組み合わせを欠く対応する二量体ポリペプチドと比較して、二量体ポリペプチドのブドウ球菌プロテインAとの結合を改変しないかまたは実質的に改変しない。
A.新生児型Fc受容体（FcRn）
新生児型Fc受容体（FcRn）は、インビボのIgGクラスの抗体の代謝的運命にとって重要である。FcRnは、リソソーム分解経路から野生型IgGを救出し、クリアランスの低下および半減期の増加をもたらすよう機能する。それは、2種のポリペプチド：50kDaのクラスI主要組織適合性複合体様タンパク質（αFcRn）および15kDaのβ2ミクログロブリン（β2m）からなるヘテロ二量体タンパク質である。FcRnは、クラスIgGの抗体のFc領域のCH2-CH3部分に高い親和性で結合する。クラスIgGの抗体とFcRnとの間の相互作用は、pH依存性であり、1：2化学量論で起こる。即ち、1個のIgG抗体分子が、その2個の重鎖Fc領域ポリペプチドを介して2個のFcRn分子と相互作用することができる（例えば、Huber,A.H.,et al.,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083を参照すること）。
従って、IgGのインビトロのFcRn結合特性／特徴は、血液循環におけるインビボの薬物動態学的特性を示す。
FcRnとIgGクラスの抗体のFc領域との間の相互作用には、重鎖のCH2ドメインおよびCH3ドメインの異なるアミノ酸残基が関係している。FcRnと相互作用するアミノ酸残基は、およそEU 243位〜EU 261位、およそEU 275位〜EU 293位、およそEU 302位〜EU 319位、およそEU 336位〜EU 348位、およそEU 367位〜EU 393位、およそEU 408位、およびおよそEU 424位〜EU 440位に位置する。より具体的には、カバットのEUナンバリングによる以下のアミノ酸残基が、Fc領域とFcRnとの間の相互作用に関与している：F243、P244、P245 P、K246、P247、K248、D249、T250、L251、M252、I253、S254、R255、T256、P257、E258、V259、T260、C261、F275、N276、W277、Y278、V279、D280、V282、E283、V284、H285、N286、A287、K288、T289、K290、P291、R292、E293、V302、V303、S304、V305、L306、T307、V308、L309、H310、Q311、D312、W313、L314、N315、G316、K317、E318、Y319、I336、S337、K338、A339、K340、G341、Q342、P343、R344、E345、P346、Q347、V348、C367、V369、F372、Y373、P374、S375、D376、I377、A378、V379、E380、W381、E382、S383、N384、G385、Q386、P387、E388、N389、Y391、T393、S408、S424、C425、S426、V427、M428、H429、E430、A431、L432、H433、N434、H435、Y436、T437、Q438、K439、およびS440。
部位特異的変異誘発研究によって、IgGのFc領域におけるFcRnのための重大な結合部位が、ヒスチジン310、ヒスチジン435、およびイソロイシン253であり、より少ない程度に、ヒスチジン433およびチロシン436であることが判明した（例えば、Kim,J.K.,et al.,Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2825；Raghavan,M.,et al.,Biochem.34(1995)14649-14657；Medesan,C.,et al.,J Immunol.158(1997)2211-2217を参照すること）。
IgGのFcRnとの結合を増加させる方法は、様々なアミノ酸残基においてIgGを変異させることによって実施されている：トレオニン250、メチオニン252、セリン254、トレオニン256、トレオニン307、グルタミン酸380、メチオニン428、ヒスチジン433、およびアスパラギン434（Kuo,T.T.,et al.,J.Clin.Immunol.30(2010)777-789を参照すること）。
いくつかのケースにおいて、血液循環における低下した半減期を有する抗体が望まれる。例えば、硝子体内適用のための薬物は、患者の眼において長い半減期を有し、血液循環において短い半減期を有するべきである。そのような抗体は、疾患部位、例えば、眼における曝露の増加という利点を有する。
FcRn結合に影響を及ぼし、それと共に、血液循環中の半減期に影響を及ぼす種々の変異が公知である。マウスFc領域-マウスFcRn相互作用にとって重大なFc領域残基が、部位特異的変異誘発によって同定されている（例えば、Dall'Acqua,W.F.,et al.J.Immunol 169(2002)5171-5180を参照すること）。残基I253、H310、H433、N434、およびH435（カバットによるEUナンバリング）が、相互作用に関与する（Medesan,C.,et al.,Eur.J.Immunol.26(1996)2533-2536；Firan,M.,et al.,Int.Immunol.13(2001)993-1002；Kim,J.K.,et al.,Eur.J.Immunol.24(1994)542-548）。残基I253、H310、およびH435は、ヒトFcのマウスFcRnとの相互作用のために重大であることが見出された（Kim,J.K.,et al.,Eur.J.Immunol.29(1999)2819-2855）。残基M252Y、S254T、T256Eは、FcRn結合を改善することが、タンパク質間相互作用研究によって、Dall'Acquaらによって記載されている（Dall'Acqua,W.F.,et al.J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524）。ヒトFc-ヒトFcRn複合体の研究は、残基I253、S254、H435、およびY436が相互作用のために重大であることを示した（Firan,M.,et al.,Int.Immunol.13(2001)993-1002；Shields,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604）。Yeung,Y.A.,et al.（J.Immunol.182(2009)7667-7671）には、残基248〜259および301〜317および376〜382および424〜437の様々な変異体が、報告され調査されている。例示的な変異およびFcRn結合に対するそれらの効果は、以下の表にリストされる。
表
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一方のFc領域ポリペプチドにおける片側の1個の変異が、結合を有意に弱めるのに十分であることが見出された。Fc領域へ導入される変異が多くなるほど、FcRnとの結合が弱くなる。しかし、片側の非対称の変異は、FcRn結合を完全に阻害するのには十分でない。FcRn結合を完全に阻害するには、両側の変異が必要である。
FcRn結合に影響を及ぼすためのIgG1 Fc領域の対称的な操作の結果が、以下の表に示される（変異のアライメントおよびFcRnアフィニティクロマトグラフィカラムにおける保持時間）。
表
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3分未満の保持時間は、物質がフロースルー中にあるため、非結合に相当する（ボイドピーク）。
単一の変異H310Aは、FcRn結合を欠失させるための最もサイレントの対称的変異である。
対称的な単一の変異I253AおよびH435Aは、0.3〜0.4分の保持時間の相対的なシフトをもたらす。これは、一般に、検出不能の結合と見なされ得る。
単一の変異Y436Aは、FcRnアフィニティカラムへの検出可能な相互作用の強さをもたらす。この理論に拘束はされないが、この変異は、I253A、H310A、およびH435A変異の組み合わせ（IHH-AAA変異）などのゼロ相互作用と区別され得る、インビボのFcRnによって媒介される半減期に対する効果を有し得る。
対称的に修飾された抗HER2抗体で入手された結果は、以下の表に提示される（参考のため、WO 2006/031370も参照すること）。
表
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非対称のFcRn結合に影響する変異のFc領域への導入の効果は、ノブ・イントゥ・ホールテクノロジーを使用して組み立てられた二重特異性抗体で例示されている（例えば、US 7,695,936、US 2003/0078385を参照すること；「ホール鎖」変異：S354C/T366W、「ノブ鎖」変異：Y349C/T366S/L368A/Y407V）。非対称的に導入された変異のFcRn結合に対する効果は、FcRnアフィニティクロマトグラフィ法を使用して、容易に決定され得る（図9および以下の表を参照すること）。FcRnアフィニティカラムからのより遅い溶出を有する、即ち、FcRnアフィニティカラムにおけるより長い保持時間を有する抗体は、より長いインビボ半減期を有し、その逆も同様である。
表
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非対称のFcRn結合に影響する変異のFc領域への導入の効果は、非対称の変異の導入を可能にするため、ノブ・イントゥ・ホールテクノロジーを使用して組み立てられた単一特異性抗IGF-1R抗体でさらに例示されている（例えば、US 7,695,936、US 2003/0078385を参照すること；「ホール鎖」変異：S354C/T366W、「ノブ鎖」変異：Y349C/T366S/L368A/Y407V）。非対称的に導入された変異のFcRn結合に対する効果は、FcRnアフィニティクロマトグラフィ法を使用して、容易に決定され得る（以下の表を参照すること）。FcRnアフィニティカラムからのより遅い溶出を有する、即ち、FcRnアフィニティカラムにおけるより長い保持時間を有する抗体は、より長いインビボ半減期を有し、その逆も同様である。
表
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非対称のIHH-AAA変異およびLLL-DDD変異（LLL-DDD変異＝変異L251D、L314D、およびL432Dの組み合わせ）は、対応する親抗体または野生型抗体より弱い結合を示す。
対称のHHY-AAA変異（＝変異H310A、H433A、およびY436Aの組み合わせ）は、ヒトFcRnにもはや結合しないFc領域をもたらすが、プロテインAとの結合は維持される（図11、12、13、および14を参照すること）。
非対称のFcRn結合に影響する変異のFc領域への導入の効果は、非対称の変異の導入を可能にするため、ノブ・イントゥ・ホールテクノロジーを使用して組み立てられた、単一特異性抗IGF-1R抗体（IGF-1R）、二重特異性抗VEGF/ANG2抗体（VEGF/ANG2）、および両方の重鎖のC末端への融合を有する全長抗体（融合物）でさらに例示された（例えば、US 7,695,936、US 2003/0078385を参照すること；「ホール鎖」変異：S354C/T366W、「ノブ鎖」変異：Y349C/T366S/L368A/Y407V）。導入された変異のFcRn結合およびプロテインA結合に対する効果は、FcRnアフィニティクロマトグラフィ法、プロテインAアフィニティクロマトグラフィ法、およびSPRに基づく方法を使用して、容易に決定され得る（以下の表を参照すること）。
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本明細書において報告される一つの局面は、本明細書において報告されるバリアントヒトIgGクラスFc領域を含む抗体またはFc領域融合ポリペプチドである。
本明細書において報告されるFc領域（二量体ポリペプチド）は、Fc領域融合ポリペプチドまたは全長抗体に含有されている時、上記の特徴を分子に付与する。融合パートナーは、インビボ半減期が低下または増加させられるべきであり、即ち、インビボ半減期が明白に定義され、その意図された適用のために特別に調整されるべきである、生物学的活性を有する任意の分子であり得る。
Fc領域融合ポリペプチドは、例えば、TNFR-Fc領域融合ポリペプチド（TNFR＝ヒト腫瘍壊死因子受容体）またはIL-1R-Fc領域融合ポリペプチド（IL-1R＝ヒトインターロイキン1受容体）またはVEGFR-Fc領域融合ポリペプチド（VEGFR＝ヒト血管内皮増殖因子受容体）、またはANG2R-Fc領域融合ポリペプチド（ANG2R＝ヒトアンジオポエチン2受容体）のように、例えば、本明細書において報告されるバリアント（ヒト）IgGクラスFc領域と、リガンドを含む標的に結合する受容体タンパク質とを含み得る。
Fc領域融合ポリペプチドは、例えば、本明細書において報告されるバリアント（ヒト）IgGクラスFc領域と、例えば、抗体Fab断片、scFv（例えば、Nat.Biotechnol.23(2005)1126-1136を参照すること）、またはドメイン抗体（dAb）（例えば、WO 2004/058821、WO 2003/002609を参照すること）を含む、標的に結合する抗体断片とを含み得る。
Fc領域融合ポリペプチドは、例えば、本明細書において報告されるバリアント（ヒト）ヒトIgGクラスFc領域と、受容体リガンド（天然に存在するかまたは人工的なもの）とを含み得る。
抗体、例えば、全長抗体またはCrossMabは、本明細書において報告されるバリアント（ヒト）ヒトIgGクラスFc領域を含み得る。
B.眼血管疾患
眼血管疾患は、新しい血管の改変されたまたは制御されない増殖、および網膜または角膜などの眼組織の構造への浸潤を特徴とする病理学的状態である。
一つの態様において、眼血管疾患は、滲出型加齢黄斑変性（滲出型AMD）、萎縮型加齢黄斑変性（萎縮型AMD）、糖尿病性黄斑浮腫（DME）、嚢胞性黄斑浮腫（CME）、非増殖性糖尿病性網膜症（NPDR）、増殖性糖尿病性網膜症（PDR）、嚢胞性黄斑浮腫、血管炎（例えば、網膜中心静脈閉塞）、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎、葡萄膜炎、脈絡膜炎、多発性脈絡膜炎、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ（シェーグレン病）、およびその他の眼科疾患からなる群より選択され、眼の疾患または障害は、眼血管新生、血管漏出、および／または網膜浮腫に関連している。
本明細書において報告される二量体ポリペプチドを含む抗体は、滲出型AMD、萎縮型AMD、CME、DME、NPDR、PDR、眼瞼炎、ドライアイ、および葡萄膜炎、一つの好ましい態様において、滲出型AMD、萎縮型AMD、眼瞼炎、およびドライアイの防止および処置において有用であり、一つの好ましい態様において、CME、DME、NPDR、およびPDRの防止および処置においても有用であり、一つの好ましい態様において、眼瞼炎およびドライアイ、特に、滲出型AMDおよび萎縮型AMD、特に、滲出型AMDの防止および処置においても有用である。
いくつかの態様において、眼血管疾患は、滲出型加齢黄斑変性（滲出型AMD）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、および糖尿病性網膜症からなる群より選択される。
角膜血管新生に関連したその他の疾患には、流行性角結膜炎、ビタミンA欠乏症、コンタクトレンズ過剰装用、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン病、酒さ性ざ瘡、フリクテン症、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、原生動物感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン周辺変性、周辺角質溶解、慢性関節リウマチ、全身性ループス、多発動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンス・ジョンソン病、類天疱瘡、放射状角膜切開、および角膜移植片拒絶が含まれるが、これらに限定されない。
網膜／脈絡膜血管新生に関連した疾患には、糖尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、網膜色素変性症、網膜浮腫（黄斑浮腫を含む）、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎を引き起こす感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、視神経乳頭小窩、シュタルガルト病、毛様体扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷合併症、およびレーザー後合併症が含まれるが、これらに限定されない。
他の疾患には、ルベオーシス（隅角の血管新生）に関連した疾患、および増殖性硝子体網膜症の全ての型を含む、血管結合組織または線維組織の異常増殖によって引き起こされた疾患が含まれるが、これらに限定されない。
未熟児網膜症（ROP）は、未熟児に影響する眼の疾患である。それは、瘢痕および網膜剥離をもたらす網膜血管の無秩序な成長によって引き起こされると考えられている。ROPは、軽症であり得、自然に消散する場合もあるが、重篤な症例においては失明に至ることもある。そのため、全ての未熟児がROPのリスクを有しており、極低出生体重は、付加的なリスクファクターである。酸素毒性および相対低酸素の両方が、ROPの発症に寄与し得る。
黄斑変性は、網膜の黄斑部として公知の眼の内側の裏打ちの中心が、薄くなり、萎縮し、いくつかの症例においては、出血する、高齢の成人において主に見出される医学的状態である。これは、中心視の喪失をもたらすことができ、それは、細かい細部を見る能力、読む能力、または顔を認識する能力の喪失を伴う。American Academy of Ophthalmologyによると、それは、今日、米国において、50歳を超える者についての中心視喪失（盲目）の主要な原因である。より若い個体に影響するいくつかの黄斑ジストロフィーは、時に黄斑変性と呼ばれるが、この用語は、一般に、加齢黄斑変性（AMDまたはARMD）をさす。
加齢黄斑変性は、黄斑（中心窩と呼ばれる詳細な中心視を提供する網膜の中央部）における網膜色素上皮とその下にある脈絡膜との間のドルーゼンと呼ばれる特徴的な黄色沈着物から開始する。（加齢黄斑症と呼ばれる）これらの初期変化を有する大部分の人々は良好な視覚を有する。ドルーゼンを有する人々は、続いて進行AMDを発症する場合がある。ドルーゼンが大きく、多数であり、黄斑下の色素細胞層の妨害に関連している場合、リスクは相当に高くなる。大きく柔らかいドルーゼンは、コレステロール沈着上昇に関連しており、コレステロール低下剤またはレオ手技（Rheo Procedure）に応答する場合がある。
重度の失明の原因となる進行AMDは、二つの型：萎縮型および滲出型を有する。中心の地図状萎縮、萎縮型の進行AMDは、眼の中央部における光受容体（桿体および錐体）の喪失を通して失明を引き起こす、網膜下の網膜色素上皮層への萎縮に起因する。この状態のために利用可能な処置は存在しないが、高用量の抗酸化剤、ルテイン、およびゼアキサンチンを含むビタミンサプリメントが、萎縮型黄斑変性の進行を遅くし、一部の患者においては、視力を改善することが、National Eye Instituteおよびその他によって証明されている。
色素性網膜炎（RP）は、遺伝性の眼状態の群である。RPの症状の進行においては、一般に、夜盲症が、数年またはさらには数十年、トンネル状視野に先行する。RPを有する多くの人々が、40代または50代までは法的盲にならず、一生、ある程度の視界を保持する。RPから全盲となる者もおり、いくつかの症例においては、早くも小児期にそれが起こる。RPの進行は、各症例において異なる。RPは、網膜の光受容体（桿体および錐体）または網膜色素上皮（RPE）の異常が進行性の失明に至る遺伝性障害の群、遺伝性網膜ジストロフィーの1種である。影響された個体は、まず、暗順応の欠陥または夜盲（夜盲症）を経験し、続いて、（トンネル状視野として公知の）末梢視野の低下、時には、疾患の経過の後期に中心視の喪失を経験する。
黄斑浮腫は、網膜の黄色の中心部である眼の黄斑の上下に液体およびタンパク質の沈着物が蓄積し、肥厚および腫脹が引き起こされた時に起こる。黄斑は、眼球の後ろの網膜の中心に近いため、腫脹は中心視を歪めることがある。この部分は、人間が直接視線内にある形、色、および詳細を見ることを可能にするため、鮮明な明瞭な中心視を提供する密に充填された錐体を保持している。嚢胞性黄斑浮腫は、嚢胞形成を含む黄斑浮腫の1種である。
C.ブドウ球菌プロテインAアフィニティクロマトグラフィカラムによる抗体精製
一つの局面において、N末端からC末端の方向に、1個以上のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分と、免疫グロブリンCH2ドメインと、免疫グロブリンCH3ドメインとを各々含む第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む二量体ポリペプチドであって、第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第1および第2のポリペプチドが、変異Y436A（カバットEUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）を含むものが提供される。
この二量体ポリペプチドは、変異のため、ブドウ球菌プロテインAに対する改善された結合の特性を有する。
従って、これらの抗体は、MabSelectSureなどの従来のプロテインAアフィニティ材料を使用することによって、不要の副生成物から精製、即ち、分離され得る。例えば、κサブクラスの軽鎖を含む抗体でのみ使用可能であるKappaSelectなどの、高度に精巧であるが種限定的なアフィニティ材料を使用することは、必要とされない。さらに、軽鎖サブクラスの修飾／交換がなされた場合に、精製法を適応させることは、必要とされない（それぞれ図11および12を参照すること）。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、本明細書において報告される二量体ポリペプチドを作製する方法である：
（a）本明細書において報告される二量体ポリペプチドをコードする1種以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程、
（b）培養培地から二量体ポリペプチドを回収する工程、および
（c）プロテインAアフィニティクロマトグラフィによって二量体ポリペプチドを精製し、それによって、二量体ポリペプチドを作製する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、二量体Fc領域ポリペプチドのプロテインAとの結合を増加させるための変異Y436Aの使用である。
変異Y436Aを導入することによって、ブドウ球菌プロテインA（SPA）との結合が増加し得ることが見出された。これは、例えば、I253AおよびH310AまたはH310AおよびH435AなどのSPAとの結合を低下させる付加的な変異が導入される場合、例えば、有利である（図15を参照すること）。
本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、組換え手段によって作製される。従って、本発明の一つの局面は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドをコードする核酸であり、さらなる局面は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞である。組換え作製の方法は、当技術分野の到達水準において広く公知であり、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現、その後の二量体ポリペプチドの単離を含み、一般的には、薬学的に許容される純度への精製を含む。宿主細胞における前記のような二量体ポリペプチドの発現のため、それぞれ第1および第2のポリペプチドをコードする核酸を、標準的な方法によって、発現ベクターへ挿入する。発現は、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母、または大腸菌（E.coli）細胞などの適切な原核生物または真核生物の宿主細胞において実施され、二量体ポリペプチドが細胞（培養上清または溶解後の細胞）から回収される。
抗体の組換え作製のための一般法は、当技術分野において周知であり、例えば、Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.,et al.,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-160；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880の概説論文に記載されている。
従って、本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、本明細書において報告される二量体ポリペプチドの作製の方法である。
（a）本明細書において報告される二量体ポリペプチドをコードする核酸分子を含む1種以上のベクターによって宿主細胞を形質転換する工程、
（b）二量体ポリペプチドの合成を可能にする条件の下で宿主細胞を培養する工程、および
（c）培養物から二量体ポリペプチドを回収し、それによって、二量体ポリペプチドを作製する工程。
一つの態様において、（c）の回収工程は、免疫グロブリンFc領域に特異的なキャプチャー試薬の使用を含む。一つの態様において、このFc領域に特異的なキャプチャー試薬は、結合・溶出モードで使用される。そのようなFc領域に特異的なキャプチャー試薬の例は、例えば、大きい規模で、高い流速および低い背圧を可能にする高度に頑強なアガロースベースマトリックスに基づく、ブドウ球菌プロテインAに基づくアフィニティクロマトグラフィカラムである。それらは、二量体ポリペプチド、即ち、そのFc領域に結合するリガンドを特色とする。リガンドは、標的分子との結合に容易に利用可能であるよう、長い親水性スペーサーアームを介してマトリックスに付着させられる。
本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、例えば、プロテインAセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィなどの従来の免疫グロブリン精製手法によって、培養培地から適当に分離される。B細胞またはハイブリドーマ細胞は、二量体ポリペプチドをコードするDNAおよびRNAの起源として役立つことができる。モノクローナル抗体をコードするDNAおよびRNAは、従来の手法を使用して容易に単離され配列決定される。単離された後、DNAは、発現ベクターへ挿入され得、次いで、それが、宿主細胞における組換えモノクローナル二量体ポリペプチドの合成を入手するため、そうでなければ二量体ポリペプチドを産生しないHEK 293細胞、CHO細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞へトランスフェクトされる。
抗体の精製は、アルカリ／SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知のその他のものを含む標準的な技術によって、細胞成分またはその他の汚染物質、例えば、他の細胞の核酸またはタンパク質を排除するために実施される（Ausubel,F.,et al.,ed.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)を参照すること）。微生物タンパク質によるアフィニティクロマトグラフィ（例えば、プロテインAアフィニティクロマトグラフィまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィ）、イオン交換クロマトグラフィ（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、および混合型交換）、（例えば、βメルカプトエタノールおよびその他のSHリガンドによる）チオフィリック（thiophilic）吸着、（例えば、フェニルセファロース、アザアレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸による）疎水性相互作用クロマトグラフィまたは芳香族吸着クロマトグラフィ、（例えば、Ni(II)アフィニティ材料およびCu(II)アフィニティ材料による）金属キレートアフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ならびに（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などの）電気泳動法（Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102）などの種々の方法が十分に確立され、タンパク質精製のために広範に使用されている。
本発明の一つの局面は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは抗体を含む薬学的製剤である。本発明のもう一つの局面は、薬学的製剤の製造のための、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは抗体の使用である。本発明のさらなる局面は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは抗体を含む薬学的製剤の製造の方法である。もう一つの局面において、本発明は、薬学的担体と共に製剤化された、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは抗体を含有している製剤、例えば、薬学的製剤を提供する。
本明細書において報告される製剤は、当技術分野において公知の多様な方法によって投与され得る。当業者によって理解されるように、投与のルートおよび／またはモードは、所望の結果に依って変動するであろう。ある種の投与ルートによって本発明の化合物を投与するためには、不活化を防止する材料によって化合物をコーティングするか、または不活化を防止する材料と化合物を共投与することが必要であり得る。例えば、化合物は、適切な担体、例えば、リポソームまたは希釈剤で対象へ投与され得る。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝溶液が含まれる。薬学的担体には、無菌の水性の溶液または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末が含まれる。薬学的活性を有する物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において公知である。
眼内適用または局所適用を含むが、これらに限定されない、多くの可能な送達モードが使用され得る。一つの態様において、適用は、眼内であり、結膜下注射、前眼房内注射、側頭縁（termporai limbus）を介した前眼房への注射、角膜実質内注射、角膜内注射、網膜下注射、眼房水注射、テノン嚢下注射、または持続性送達装置、硝子体内注射（例えば、硝子体の前部、中間部、または後部への注射）を含むが、これらに限定されない。一つの態様において、適用は、局所であり、角膜への点眼剤を含むが、これに限定されない。
一つの態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは本明細書において報告される薬学的製剤は、硝子体内適用を介して、例えば、硝子体内注射を介して投与される。これは、当技術分野において公知の標準的な手法に従って実施され得る（例えば、Ritter et al.,J.Clin.Invest.116(2006)3266-3276；Russelakis-Carneiro et al.,Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206；およびWray et al.,Arch.Neurol.33(1976)183-185を参照すること）。
いくつかの態様において、本発明の治療用キットは、本明細書に記載される薬学的製剤の中に存在する1用量以上の本明細書において報告される二量体ポリペプチド、薬学的製剤の硝子体内注射のための適当な装置、ならびに注射を実施するための適当な対象およびプロトコルを詳述する説明書を含有することができる。これらの態様において、製剤は、典型的には、硝子体内注射を介して、処置を必要とする対象へ投与される。これは、当技術分野において公知の標準的な手法に従って実施され得る。例えば、Ritter et al.,J.Clin.Invest.116(2006)3266-3276；Russelakis-Carneiro et al.,Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206；およびWray et al.,Arch.Neurol.33(1976)183-185を参照すること。
製剤は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの佐剤も含有することができる。微生物の存在の防止は、前記の滅菌手法、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の包含の両方によって確実にされ得る。糖、塩化ナトリウム等のような等張剤を製剤に含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な薬学的形態の長期的な吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤の包含によってもたらされ得る。
選択された投与ルートに関わらず、適当な水和物の形態で使用され得る本明細書において報告される化合物、および／または本明細書において報告される薬学的製剤は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形へ製剤化される。
本明細書において報告される薬学的製剤における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与のモードについて所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を入手するため、変動し得る。選択される投薬量レベルは、利用される本発明の特定の組成物の活性、投与のルート、投与の時間、利用される特定の化合物の排泄の速度、処置の期間、利用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態、および過去の病歴等の医学分野において周知の因子を含む多様な薬物動態学的因子に依るであろう。
製剤は、無菌であって、かつ製剤が注射器によって送達可能である程度に流動性でなければならない。水に加えて、一つの好ましい態様において、担体は、等張緩衝生理食塩水溶液である。
適度の流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散物の場合、必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを、組成物に含めることが好ましい。
製剤には、結膜下投与のための、活性薬剤を含む眼デポ剤が含まれ得る。眼デポ剤は、本質的に純粋な活性薬剤、例えば、本明細書において報告される二量体ポリペプチドの微粒子を含む。本明細書において報告される二量体ポリペプチドを含む微粒子は、生体適合性の薬学的に許容されるポリマーまたは脂質封入剤に包埋され得る。デポ剤は、長期間にわたって活性材料の全部または実質的に全部を放出するために適応していてもよい。ポリマーまたは脂質マトリックスは、存在する場合、全部または実質的に全部の活性薬剤の放出の後、投与の部位から輸送されるよう、十分に分解に適応していてもよい。デポ剤は、薬学的に許容されるポリマーと溶解または分散した活性薬剤とを含む液状の製剤であってもよい。注射後、ポリマーは、ゲル化または沈殿によって注射部位においてデポを形成する。
本発明のもう一つの局面は、眼血管疾患の処置において使用するための、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは抗体である。
本発明の一つの態様は、眼血管疾患の処置において使用するための、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは抗体である。
本発明のもう一つの局面は、眼血管疾患の処置において使用するための薬学的製剤である。
本発明のもう一つの局面は、眼血管疾患の処置のための医薬の製造のための、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは抗体の使用である。
本発明のもう一つの局面は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは抗体を、そのような処置を必要とする患者へ投与することによる、眼血管疾患に罹患した患者の処置の方法である。
ここで、「含む」という用語は、本明細書において使用されるように、「からなる」という用語を含むことが明示される。従って、「含む」という用語を含有している全ての局面および態様は、「からなる」という用語によって同様に開示される。
D.修飾
さらなる局面において、上記の態様のいずれかによる二量体ポリペプチドに、以下のセクション1〜6に記載されるような特色のいずれかが、単独でまたは組み合わせて、組み入れられていてもよい。
1.抗体親和性
一つの態様において、Kdは、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、BIACORE（登録商標）-2000またはBIACORE（登録商標）-3000（GE Healthcare Inc.,Piscataway,NJ）を使用したアッセイが、およそ10レスポンスユニット（RU）で固定化された結合パートナーCM5チップによって25℃で実施される。一つの態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5,GE Healthcare Inc.）を、供給元の説明書に従い、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）によって活性化する。結合パートナーを、10mM酢酸ナトリウム（pH4.8）で5μg/mL（およそ0.2μM）に希釈した後、およそ10レスポンスユニット（RU）のカップリングされた結合パートナーを達成するため、5μl/分の流速で注入する。結合パートナーの注入後、未反応基をブロックするため、1Mエタノールアミンを注入する。動態測定のため、二量体ポリペプチドを含有している融合ポリペプチドまたは抗体の2倍段階希釈物（0.78nM〜500nM）を、およそ25μl/分の流速で25℃で0.05％ポリソルベート20（TWEEN-20（商標））界面活性剤を含むPBS（PBST）で注入する。会合速度（kon）および解離速度（koff）を、会合センサーグラムおよび解離センサーグラムの同時フィッティングによって、単純な1対1ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）Evaluation Softwareバージョン3.2）を使用して計算する。平衡解離定数（Kd）を、比koff/konとして計算する（例えば、Chen,Y.et al.,J.Mol.Biol.293(1999)865-881を参照すること）。オン速度が上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって106M-1s-1を越える場合、オン速度は、ストップフローが装備された分光光度計（Aviv Instruments）または撹拌キュベットを含む8000シリーズSLM-AMINCO（商標）分光光度計（ThermoSpectronic）などの分光計において測定される、増加する濃度の抗原の存在下でのPBS（pH7.2）中の20nM抗抗原抗体（Fab型）の25℃での蛍光放射強度（励起＝295nm；放射＝340nm、16nmバンドパス）の増加または減少を測定する蛍光クエンチング技術を使用することによって決定され得る。
2.キメラ抗体およびヒト化抗体
ある種の態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、キメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、US 4,816,567；およびMorrison,S.L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、それらの抗原結合断片が含まれる。
ある種の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるため、非ヒト抗体がヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、HVR、例えば、CDR（またはその一部分）が非ヒト抗体に由来し、FR（またはその一部分）がヒト抗体配列に由来する1個以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含むであろう。いくつかの態様において、ヒト化抗体の中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復させるかまたは改善するため、非ヒト抗体（例えば、HVR残基が由来した抗体）に由来する対応する残基に置換される。
ヒト化抗体およびそれらを作成する方法は、例えば、Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633に概説されており、例えば、Riechmann,I.,et al.,Nature 332(1988)323-329；Queen,C.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321、およびUS 7,087,409；（特異性決定領域（SDR）グラフティングを記載している）Kashmiri,S.V.,et al.,Methods 36(2005)25-34；（「リサーフェイシング（resurfacing）を記載している）Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498；（「FRシャッフリング（shuffling）」を記載している）Dall'Acqua,W.F.et al.,Methods 36(2005)43-60；Osbourn,J.et al.,Methods 36(2005)61-68；ならびに（FRシャッフリングのための「ガイディッド・セレクション（guided selection）」アプローチを記載している）Klimka,A.et al.,Br.J.Cancer 83(2000)252-260にさらに記載されている。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法（例えば、Sims,M.J.,et al.,J.Immunol.151(1993)2296-2308を参照すること）を使用して選択されたフレームワーク領域；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；およびPresta,L.G.,et al.,J.Immunol.151(1993)2623-2632を参照すること）；ヒト成熟（体細胞変異型）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633を参照すること）；ならびにFRライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Baca,M.et al.,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684およびRosok,M.J.et al.,J.Biol.Chem.271(19969 22611-22618)を参照すること）が含まれるが、これらに限定されない。
3.ヒト抗体
ある種の態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を使用して作製され得る。ヒト抗体は、van Dijk,M.A.and van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374 およびLonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459に一般に記載されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して完全ヒト抗体またはヒト可変領域を有する完全抗体を産生するよう修飾されたトランスジェニック動物へ免疫原を投与することによって調製され得る。そのような動物は、典型的には、内在性の免疫グロブリン遺伝子座に取って代わっているか、染色体外に存在するか、または動物の染色体へランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含有している。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内在性の免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を入手する方法の概説については、Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125を参照すること。例えば、XENOMOUSE（商標）テクノロジーを記載しているUS 6,075,181およびUS 6,150,584；HUMAB（登録商標）テクノロジーを記載しているUS 5,770,429；K-M MOUSE（登録商標）テクノロジーを記載しているUS 7,041,870、およびVELOCIMOUSE（登録商標）テクノロジーを記載しているUS 2007/0061900も参照すること。そのような動物によって生成された完全抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾されてもよい。
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によっても作成され得る。ヒトモノクローナル抗体の作製のためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている（例えば、Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.,et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),pp.51-63；およびBoerner,P.,et al.,J.Immunol.147(1991)86-95を参照すること）。ヒトB細胞ハイブリドーマテクノロジーを介して生成されたヒト抗体も、Li,J.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562に記載されている。付加的な方法には、例えば、（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の作製を記載している）US 7,189,826、および（ヒト-ヒトハイブリドーマを記載している）Ni,J.,Xiandai Mianyixue 26(2006)265-268に記載されたものが含まれる。ヒトハイブリドーマテクノロジー（トリオーマテクノロジー）も、Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20(2005)927-937およびVollmers,H.P.and Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(2005)185-191に記載されている。
ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されたFvクローン可変ドメイン配列を単離することによっても、ヒト抗体を生成することができる。次いで、そのような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わることができる。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術は、以下に記載される。
4.ライブラリ由来抗体
ある種の態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、ライブラリ由来抗体である。ライブラリ由来抗体は、所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特徴を保有する抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための多様な方法が、当技術分野において公知である。そのような方法は、例えば、Hoogenboom,H.R.et al.,Methods in Molecular Biology 178(2001)1-37に概説され、例えば、McCafferty,J.et al.,Nature348(1990)552-554；Clackson,T.et al.,Nature 352(1991)624-628；Marks,J.D.et al.,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.and Bradbury,A.,Methods in Molecular Biology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S.et al.,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.et al.,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；およびLee,C.V.et al.,J.Immunol.Methods 284(2004)119-132にさらに記載されている。
ある種のファージディスプレイ法において、Winter,G.,et al.,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455に記載されるように、VH遺伝子およびVL遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって別々にクローニングし、ファージライブラリにおいてランダムに組換え、次いで、それを抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、単鎖Fv（scFv）断片またはFab断片のいずれかとして抗体断片をディスプレイする。免疫感作された起源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths,A.D.,et al.,EMBO J.12(1993)725-734によって記載されるように、免疫感作なしに、広範囲の非自己抗原および自己抗原に対する抗体の単一の起源を提供するため、未感作レパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングすることができる。最後に、Hoogenboom,H.R.and Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388によって記載されるように、幹細胞から再編成されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変性のCDR3領域をコードし、インビトロで再編成を達成するため、ランダム配列を含有しているPCRプライマーを使用することによって、未感作ライブラリを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリを記載している特許刊行物には、例えば：US 5,750,373、ならびにUS 2005/0079574、US 2005/0119455、US 2005/0266000、US 2007/0117126、US 2007/0160598、US 2007/0237764、US 2007/0292936、およびUS 2009/0002360が含まれる。
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書において、ヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
5.多重特異性抗体
ある種の態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2種の異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の態様において、結合特異性の一方は、第1の抗原に対するものであり、他方は、異なる第2の抗原に対するものである。ある種の態様において、二重特異性抗体は、同一の抗原の2種の異なるエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体は、抗原のうちの少なくとも1種を発現する細胞へ細胞傷害性薬剤を局在化するために使用され得る。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。
多重特異性抗体を作成するための技術には、異なる特異性を有する2種の免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現（Milstein,C.and Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540、WO 93/08829、およびTraunecker,A.,et al.,EMBO J.10(1991)3655-3659を参照すること）、および「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、US 5,731,168を参照すること）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、抗体Fcヘテロ二量体分子を作成するための静電気ステアリング効果の操作（WO 2009/089004）；2種以上の抗体または断片の架橋（例えば、US 4,676,980およびBrennan,M.et al.,Science229(1985)81-83を参照すること）；二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーの使用（例えば、Kostelny,S.A.,et al.,J.Immunol.148(1992)1547-1553を参照すること）；二重特異性抗体断片を作成するための「ジアボディ」テクノロジーの使用（例えば、Holliger,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448を参照すること）；および単鎖Fv（scFv）二量体の使用（例えば、Gruber,M et al.,J.Immunol.152(1994)5368-5374を参照すること）；および、例えば、Tutt,A.et al.,J.Immunol.147(1991)60-69に記載されたような三重特異性抗体の調製によっても作成され得る。
「オクトパス（Octopus）抗体」を含む、3個以上の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、US 2006/0025576を参照すること）。
抗体または断片には、本明細書において、「二重作用性（Dual Acting）Fab」または「DAF」（例えば、US 2008/0069820を参照すること）が含まれる。
抗体または断片には、本明細書において、WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792、およびWO 2010/145793に記載された多重特異性抗体も含まれる。
6.抗体バリアント
ある種の態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、抗体である。さらなる態様において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性および／またはその他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列へ適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって、調製され得る。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合を保有するのであれば、最終構築物に到達するため、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを作成することができる。
（a）置換バリアント、挿入バリアント、および欠失バリアント
ある種の態様において、1個以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発のための関心対象の部位には、HVRおよびFRが含まれる。保存的置換は、「好ましい置換」という見出しで以下の表に示される。より実質的な変化は、「例示的な置換」とう見出しで以下の表に提供され、アミノ酸側鎖クラスに関してさらに以下に記載される。アミノ酸置換を関心対象の抗体へ導入し、生成物を、所望の活性、例えば、保持された／改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたADCCもしくはCDCについてスクリーニングすることができる。
表
Figure 2017508726
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ化され得る：
（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
（3）酸性：Asp、Glu；
（4）塩基性：His、Lys、Arg；
（5）鎖方向に影響を及ぼす残基：Gly、Pro；
（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーのもう一つのクラスへの交換を含むであろう。
置換バリアントの一つのタイプは、親抗体の1個以上の超可変領域残基の置換を含む（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）。一般に、さらなる研究のために選択される得られたバリアントは、親抗体と比べてある種の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、増加した親和性、低下した免疫原性）を有し、かつ／または親抗体の実質的に保持されたある種の生物学的特性を有するであろう。例示的な置換バリアントは、例えば、本明細書において記載されたものなどのファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して便利に生成され得る親和性成熟抗体である。簡単に説明すると、1個以上のHVR残基を変異させ、バリアント抗体をファージ上にディスプレイさせ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
改変（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するため、HVRにおいてなされ得る。そのような改変は、HVR「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟過程の間に高頻度に変異を受けるコドンによってコードされた残基（例えば、Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196を参照すること）および／または抗原と接触する残基においてなされ得、得られたバリアントVHまたはバリアントVLが、結合親和性について試験される。二次ライブラリの構築および再選択による親和性成熟は、例えば、Hoogenboom,H.R.et al.in Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの態様において、多様な方法（例えば、エラープローンPCR、チェーンシャッフリング、またはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子へ多様性を導入する。次いで、二次ライブラリを作出する。次いで、所望の親和性を有する抗体バリアントを同定するため、ライブラリをスクリーニングする。多様性を導入するもう一つの方法は、数個のHVR残基（例えば、一度に4〜6個の残基）がランダム化される、HVR特異的アプローチを含む。抗原結合に関与するHVR残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、具体的に同定され得る。具体的には、CDR-H3およびCDR-L3が、しばしば標的とされる。
ある種の態様において、そのような改変が、抗体の抗原に結合する能力を実質的に低下させない限り、置換、挿入、または欠失が1個以上のHVRに存在してもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書に提供されるような保存的置換）が、HVRにおいてなされてもよい。そのような改変は、例えば、HVR内の抗原接触残基の外部にあり得る。上述のバリアントVH配列およびバリアントVL配列のある種の態様において、各HVRは、未改変であるか、または1個以下、2個以下、もしくは3個以下のアミノ酸置換を含有している。
変異誘発の標的とされ得る抗体の残基または領域の同定のための有用な方法は、Cunningham,B.C.and Wells,J.A.,Science 244(1989)1081-1085によって記載されるように「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法においては、残基または標的残基の群（例えば、Arg、Asp、His、Lys、およびGluなどの電荷を有する残基）を同定し、抗体の抗原との相互作用が影響を受けるか否かを決定するため、中性のまたは負の電荷を有するアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置換する。さらなる置換を、最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入することができる。代替的にまたは付加的に、抗体と抗原との間の接触点を同定するため、抗原-抗体複合体の結晶構造を使用することができる。そのような接触残基および近隣の残基を、置換のための候補として標的とするかまたは排除することができる。バリアントを、所望の特性を含有するか否かを決定するため、スクリーニングすることができる。
アミノ酸配列挿入には、1個の残基から100残基以上を含有しているポリペプチドまでの長さに及ぶアミノ末端および／またはカルボキシル末端における融合、ならびに単一のアミノ酸残基または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子のその他の挿入バリアントには、（例えば、ADEPTのための）酵素、または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドの、抗体のN末端またはC末端への融合が含まれる。
（b）グリコシル化バリアント
ある種の態様において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加させるかまたは減少させるために改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1個以上のグリコシル化部位が作出されるかまたは除去されるようアミノ酸配列を改変することによって便利に達成され得る。
抗体がFc領域を含む場合、それに付着している炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、典型的には、N結合によってFc領域のCH2ドメインのAsn297に一般に付着している分岐型二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright,A.and Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32を参照すること。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」内のGlcNAcに付着したフコースを含み得る。いくつかの態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、ある種の改善された特性を有する抗体バリアントを作出するため、なされ得る。
一つの態様において、Fc領域に（直接または間接的に）付着したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントが、提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％、または20％〜40％であり得る。フコースの量は、例えば、WO 2008/077546に記載されるように、MALDI-TOF質量分析によって測定されるような、Asn297に付着した全ての糖構造（例えば、複合型、ハイブリッド型、および高マンノース型の構造）の合計と比べた、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297とは、Fc領域の約297位（Fc領域残基のEUナンバリング）に位置するアスパラギン残基をさす；しかしながら、Asn297は、抗体の軽微な配列変動のため、297位の約±3アミノ酸上流または下流、即ち、294〜300位に位置していてもよい。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、US 2003/0157108；US 2004/0093621を参照すること。「脱フコシル」または「フコース欠損」抗体バリアントに関係する刊行物の例には、以下のものが含まれる：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki,A.et al.,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.et al.,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。脱フコシル抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化欠損Lec13 CHO細胞（Ripka,J.,et al.,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；およびWO 2004/056312、特に、実施例11）、およびα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞などのノックアウト細胞株が含まれる（例えば、Yamane-Ohnuki,N.,et al.,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.,et al.,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；およびWO 2003/085107を参照すること）。
例えば、抗体のFc領域に付着した二分岐オリゴ糖がバイセクティングGlcNAcを有する、バイセクティッド（bisected）オリゴ糖を有する抗体バリアントが、さらに提供される。そのような抗体バリアントは、低下したフコシル化および／または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、WO 2003/011878；US 6,602,684；およびUS 2005/0123546に記載されている。Fc領域に付着したオリゴ糖の中に少なくとも1個のガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、WO 1997/30087；WO 1998/58964；およびWO 1999/22764に記載されている。
（c）Fc領域バリアント
ある種の態様において、1個以上のさらなるアミノ酸修飾を本明細書において報告される二量体ポリペプチドに導入し、それによって、Fc領域バリアントを生成することができる。Fc領域バリアントは、1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換／変異）を含むヒトFc領域配列（例えば、ヒトのIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域）を含み得る。
ある種の態様において、本発明は、二量体ポリペプチドのインビボ半減期が重要であり、（CDCおよびADCCなどの）ある種のエフェクター機能は不要であるかまたは有害である適用のために望ましい候補である、いくつかのエフェクター機能を保有しているが、全ては保有していない二量体ポリペプチドを、企図する。CDC活性および／またはADCC活性の低下／枯渇を確認するため、インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害アッセイを実施することができる。例えば、二量体ポリペプチド抗体がFcγR結合を欠く（従って、ADCC活性を欠く可能性が高い）が、FcRn結合能力を保持することを確実にするため、Fc受容体（FcR）結合アッセイを実施することができる。ADCCを媒介するための主要な細胞、NK細胞は、FcγRIIIのみを発現し、単球は、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492の464頁の表3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を査定するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、US 5,500,362（例えば、Hellstrom,I.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；およびHellstrom,I.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502を参照すること）；US 5,821,337（Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361を参照すること）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を利用することができる（例えば、フローサイトメトリーのためのACTI（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（CellTechnology,Inc.Mountain View,CA）；およびCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Promega,Madison,WI）を参照すること）。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。代替的にまたは付加的に、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynes,R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656に開示されたものなどの動物モデルにおいて査定され得る。二量体ポリペプチドがC1qに結合することができず、従って、CDC活性を欠くことを確認するため、C1q結合アッセイを実施することもできる。例えば、WO 2006/029879およびWO 2005/100402のC1q結合ELISAおよびC3c結合ELISAを参照すること。補体活性化を査定するため、CDCアッセイを実施することができる（例えば、Gazzano-Santoro,H.et al.,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.et al.,Blood 101(2003)1045-1052；およびCragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743を参照すること）。FcRn結合およびインビボクリアランス／半減期決定も、当技術分野において公知の方法を使用して実施され得る（例えば、Petkova,S.B.et al.,Int.Immunol.18(2006)1759-1769を参照すること）。
低下したエフェクター機能を有する二量体ポリペプチドには、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329のうちの1個以上の置換を有するものが含まれる（US 6,737,056）。そのようなFc領域バリアントには、アミノ酸位置265、269、270、297、および327のうちの2個以上に置換を有するFc領域が含まれ、残基265および297のアラニンへの置換を有するいわゆる「DANA」Fc領域変異体が含まれる（US 7,332,581）。
FcRとの改善されたまたは減少した結合を有するある種の抗体バリアントが記載されている（例えば、US 6,737,056；WO 2004/056312、およびShields,R.L.et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604を参照すること）。
ある種の態様において、二量体ポリペプチドバリアントは、ADCCを改善する1個以上のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の298位、333位、および／または334位（残基のEUナンバリング）の置換を有するFc領域を含む。
いくつかの態様において、例えば、US 6,194,551、WO 99/51642、およびIdusogie,E.E.et al.,J.Immunol.164(2000)4178-4184に記載されるように、改変された（即ち、改善されたまたは減少した）C1q結合および／または補体依存性細胞傷害（CDC）をもたらす改変が、Fc領域においてなされる。
増加した半減期、および母性IgGの胎児への移行を担う新生児型Fc受容体（FcRn）（Guyer,R.L.et al.,J.Immunol.117(1976)587-593およびKim,J.K.et al.,J.Immunol.24(1994)2429-2434）との改善された結合を有する抗体が、US 2005/0014934に記載されている。それらの抗体は、Fc領域のFcRnとの結合を改善する1個以上の置換を有するFc領域を含む。そのようなFc領域バリアントには、Fc領域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434のうちの1個以上の置換、例えば、Fc領域残基434の置換（US 7,371,826）を有するものが含まれる。
Fc領域バリアントのその他の例に関しては、Duncan,A.R.and Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；およびWO 94/29351も参照すること。
（d）システイン操作型抗体バリアント
ある種の態様において、例えば、抗体の1個以上の残基がシステイン残基に置換されている「チオMAb」に類似した、システイン操作型二量体ポリペプチドを作出することが望ましい場合がある。具体的な態様において、置換される残基は、二量体ポリペプチドのアクセス可能な部位に存在する。それらの残基をシステインに置換することによって、反応性チオール基が、二量体ポリペプチドのアクセス可能な部位に位置付けられ、本明細書にさらに記載されるようなイムノコンジュゲートを作出するため、薬物モエティまたはリンカー-薬物モエティなどの他のモエティと二量体ポリペプチドをコンジュゲートするために使用され得る。ある種の態様において、以下の残基のうちの1個以上がシステインに置換され得る：軽鎖のV205（カバットナンバリング）；重鎖のA118（EUナンバリング）；および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン操作型二量体ポリペプチドは、例えば、US 7,521,541に記載されるように生成され得る。
（e）誘導体
ある種の態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、当技術分野において公知であり、容易に入手可能な付加的な非タンパク質性モエティを含有するようさらに修飾されてもよい。二量体ポリペプチドの誘導体化のために適当なモエティには、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（PEG）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のため、製造上の利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量であり得、分岐型または非分岐型であり得る。二量体ポリペプチドに付着したポリマーの数は変動してもよく、複数個のポリマーが付着させられる場合、それらは同一の分子であってもよいしまたは異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／またはタイプは、改善すべき二量体ポリペプチドの特定の特性または機能、二量体ポリペプチド誘導体が定義された条件の下で治療において使用されるか否か等を含むが、これらに限定されない考慮に基づき、決定され得る。
もう一つの態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドと、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク質性モエティとのコンジュゲートが、提供される。一つの態様において、非タンパク質性モエティは、カーボンナノチューブ（Kam,N.W.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605）である。放射線は、任意の波長であり得、通常の細胞には害を与えないが、二量体ポリペプチド-非タンパク質性モエティの近位の細胞が死滅する温度へ非タンパク質性モエティを加熱する波長が含まれるが、これらに限定されない。
（f）ヘテロ二量体化
ヘテロ二量体化を強化するためのCH3修飾のためのいくつかのアプローチが存在し、例えば、WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291に十分に記載されている。典型的には、全てのそのようアプローチにおいて、各CH3ドメイン（またはそれを含む重鎖）がもはやそれ自体とホモ二量体化することができず、相補的に操作された他方のCH3ドメインとヘテロ二量体化するよう強制される（その結果、第1のCH3ドメインと第2のCH3ドメインがヘテロ二量体化し、2個の第1のCH3ドメインまたは2個の第2のCH3ドメインの間のホモ二量体は形成されない）よう、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインの両方が相補的に操作される。改善された重鎖ヘテロ二量体化のためのこれらの異なるアプローチは、軽鎖誤対合ベンスジョーンズ型副生成物を低下させる本発明による多重特異性抗体における重鎖-軽鎖修飾（一方の結合アームにおけるVHおよびVLの交換／置換、ならびにCH1/CL界面への反対の電荷を有するアミノ酸の置換の導入）と組み合わせて、異なる代替法として企図される。
本発明の一つの好ましい態様（多重特異性抗体が重鎖にCH3ドメインを含む場合）において、本発明による多重特異性抗体のCH3ドメインは、例えば、WO 96/027011、Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng.9(1996)617-621；およびMerchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；WO 98/ 050431にいくつかの例と共に詳細に記載されている「ノブ・イントゥ・ホール」テクノロジーによって改変され得る。この方法においては、2個のCH3ドメインの相互作用表面が、これらの2個のCH3ドメインを含有している両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させるために改変される。（2本の重鎖の）2個のCH3ドメインの各々が「ノブ」であり得、他方が「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.,et al.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35）、収量を増加させる。
従って、本発明の一つの態様において、多重特異性抗体は、（各重鎖にCH3ドメインを含み）、さらに、以下のことを特徴とする。
（a）抗体の第1の重鎖の第1のCH3ドメインと（b）抗体の第2の重鎖の第2のCH3ドメインが、各々、抗体CH3ドメインの間の最初の界面を含む界面で出会い、
界面は、多重特異性抗体の形成を促進するため、以下のことを特徴とする改変を受けている：
（i）多重特異性抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの最初の界面に出会う一方の重鎖のCH3ドメインの最初の界面において、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それによって、他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の腔に位置付けられ得る突起が一方の重鎖のCH3ドメインの界面内に生成されるよう、一方の重鎖のCH3ドメインが改変され、かつ
（ii）多重特異性抗体内の第1のCH3ドメインの最初の界面に出会う第2のCH3ドメインの最初の界面において、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それによって、第1のCH3ドメインの界面内の突起が位置付けられ得る腔が第2のCH3ドメインの界面内に生成されるよう、他方の重鎖のCH3ドメインが改変される。
好ましくは、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）からなる群より選択される。
好ましくは、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、バリン（V）からなる群より選択される。
本発明の一つの局面において、両方のCH3ドメインの間にジスルフィド架橋が形成され得るよう、各CH3ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（C）の導入によって、両方のCH3ドメインがさらに改変される。
一つの好ましい態様において、多重特異性抗体は、「ノブ鎖」の第1のCH3ドメインにアミノ酸T366W変異を含み、かつ「ホール鎖」の第2のCH3ドメインにアミノ酸T366S、L368A、Y407V変異を含む。例えば、「ホール鎖」のCH3ドメインへアミノ酸Y349C変異を導入し、「ノブ鎖」のCH3ドメインへアミノ酸E356C変異またはアミノ酸S354C変異を導入することによって、CH3ドメイン間の付加的な鎖間ジスルフィド架橋も使用され得る（Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681）。
一つの好ましい態様において、（各重鎖にCH3ドメインを含む）多重特異性抗体は、2個のCH3ドメインの一方にアミノ酸S354C、T366W変異を含み、かつ2個のCH3ドメインの他方にアミノ酸Y349C、T366S、L368A、Y407V変異を含む（一方のCH3ドメインへの付加的なアミノ酸S354C変異、および他方のCH3ドメインへの付加的なアミノ酸Y349C変異は、鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（カバットによるナンバリング）。
ヘテロ二量体化を強化するためのCH3修飾のためのその他の技術は、本発明の代替法として企図され、例えば、WO 96/27011、WO 98/050431、EP1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291に記載されている。
一つの態様において、EP 1 870 459 A1に記載されたヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用することができる。このアプローチは、両方の重鎖の間のCH3/CH3ドメイン界面における、特定のアミノ酸位置における、反対の電荷を有するアミノ酸の置換／変異の導入に基づく。多重特異性抗体についての一つの好ましい態様は、（多重特異性抗体の）第1のCH3ドメインにおけるアミノ酸R409D；K370E変異および多重特異性抗体の第2のCH3ドメインにおけるアミノ酸D399K；E357K変異（カバットによるナンバリング）である。
もう一つの態様において、多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメインにアミノ酸T366W変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメインにアミノ酸T366S、L368A、Y407V変異を含み、さらに、「ノブ鎖」のCH3ドメインにアミノ酸R409D；K370E変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメインにアミノ酸D399K；E357K変異を含む。
もう一つの態様において、多重特異性抗体は、2個のCH3ドメインの一方にアミノ酸S354C、T366W変異を含み、かつ2個のCH3ドメインの他方にアミノ酸Y349C、T366S、L368A、Y407V変異を含むか、または多重特異性抗体は、2個のCH3ドメインの一方にアミノ酸Y349C、T366W変異を含み、かつ2個のCH3ドメインの他方にアミノ酸S354C、T366S、L368A、Y407V変異を含み、さらに、「ノブ鎖」のCH3ドメインにアミノ酸R409D；K370E変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメインにアミノ酸D399K；E357K変異を含む。
一つの態様において、WO2013/157953に記載されたヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用することができる。一つの態様において、第1のCH3ドメインは、アミノ酸T366K変異を含み、かつ第2のCH3ドメインポリペプチドは、アミノ酸L351D変異を含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインは、さらなるアミノ酸L351K変異を含む。さらなる態様において、第2のCH3ドメインは、Y349E、Y349D、およびL368Eより選択されるさらなるアミノ酸変異（好ましくは、L368E）を含む。
一つの態様において、WO2012/058768に記載されたヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用することができる。一つの態様において、第1のCH3ドメインは、アミノ酸L351Y、Y407A変異を含み、かつ第2のCH3ドメインは、アミノ酸T366A、K409F変異を含む。さらなる態様において、第2のCH3ドメインは、例えば、（a）T411 N、T411 R、T411Q、T411 K、T411D、T411E、またはT411W、（b）D399R、D399W、D399Y、またはD399K、（c）S400E、S400D、S400R、またはS400K、F405I、F405M、F405T、F405S、F405V、またはF405W、N390R、N390K、またはN390D、K392V、K392M、K392R、K392L、K392F、またはK392Eより選択される、T411位、D399位、S400位、F405位、N390位、またはK392位におけるさらなるアミノ酸変異を含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインは、アミノ酸L351Y、Y407A変異を含み、かつ第2のCH3ドメインは、アミノ酸T366V、K409F変異を含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインは、アミノ酸Y407A変異を含み、かつ第2のCH3ドメインは、アミノ酸T366A、K409F変異を含む。さらなる態様において、第2のCH3ドメインは、さらなるアミノ酸K392E、T411E、D399R、およびS400R変異を含む。
一つの態様において、例えば、368および409からなる群より選択される位置におけるアミノ酸修飾による、WO2011/143545に記載されたヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用することができる。
一つの態様において、上記のノブ・イントゥ・ホールテクノロジーをやはり使用する、WO2011/090762に記載されたヘテロ二量体化アプローチを、代替的に使用することができる。一つの態様において、第1のCH3ドメインは、アミノ酸T366W変異を含み、かつ第2のCH3ドメインは、アミノ酸Y407A変異を含む。一つの態様において、第1のCH3ドメインは、アミノ酸T366Y変異を含み、かつ第2のCH3ドメインは、アミノ酸Y407T変異を含む。
一つの態様において、多重特異性抗体はIgG2アイソタイプのものであり、WO2010/129304に記載されたヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用することができる。
一つの態様において、WO2009/089004に記載されたヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用することができる。一つの態様において、第1のCH3ドメインは、K392またはN392の負の電荷を有するアミノ酸（例えば、グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）、好ましくは、K392DまたはN392D）へのアミノ酸置換を含み、かつ第2のCH3ドメインは、D399、E356、D356、またはE357の正の電荷を有するアミノ酸（例えば、リジン（K）またはアルギニン（R）、好ましくは、D399K、E356K、D356K、またはE357K、より好ましくは、D399KおよびE356K）へのアミノ酸置換を含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインは、K409またはR409の負の電荷を有するアミノ酸（例えば、グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）、好ましくは、K409DまたはR409D）へのアミノ酸置換をさらに含む。さらなる態様において、第1のCH3ドメインは、K439および／またはK370の負の電荷を有するアミノ酸（例えば、グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D））へのアミノ酸置換をさらにまたは代替的に含む。
一つの態様において、WO 2007/147901に記載されたヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用することができる。一つの態様において、第1のCH3ドメインは、アミノ酸K253E、D282K、およびK322D変異を含み、かつ第2のCH3ドメインは、アミノ酸D239K、E240K、およびK292D変異を含む。
一つの態様において、WO2007/110205に記載されたヘテロ二量体化アプローチを代替的に使用することができる。
E.組換えの方法および組成物
抗体は、例えば、US 4,816,567に記載されるような組換えの方法および組成物を使用して作製され得る。一つの態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、二量体ポリペプチドの第1のポリペプチドを含むアミノ酸配列および／または第2のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードしていてよい。さらなる態様において、そのような核酸を含む1種以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一つのそのような態様において、宿主細胞は、以下のものを含む（例えば、以下のものによって形質転換されている）：（1）二量体ポリペプチドの第1のポリペプチドを含むアミノ酸配列および二量体ポリペプチドの第2のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（2）二量体ポリペプチドの第1のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび二量体ポリペプチドの第2のポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター。一つの態様において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Y0、NS0、Sp20細胞）である。一つの態様において、上述の二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、二量体ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で培養する工程を含み、任意で、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収する工程を含む、本明細書において報告される二量体ポリペプチドを作成する方法が提供される。
本明細書において報告される二量体ポリペプチドの組換え作製のためには、例えば、上記のような二量体ポリペプチドをコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のため、1種以上のベクターへ挿入する。そのような核酸は、従来の手法を使用して（例えば、抗体のバリアントFc領域ポリペプチドおよび重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され配列決定され得る。
二量体ポリペプチドをコードするベクターのクローニングまたは発現のために適当な宿主細胞には、本明細書に記載された原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特に、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない時、二量体ポリペプチドは細菌において作製されてもよい。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、US 5,648,237、US 5,789,199、およびUS 5,840,523を参照すること（大腸菌における抗体断片の発現を記載しているCharlton,K.A.,In：Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2003),pp.245-254も参照すること）。発現の後、二量体ポリペプチドは、可溶性画分に細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的にまたは完全にヒトのグリコシル化パターンを有する二量体ポリペプチドの作製をもたらす、真菌および酵母株を含む、糸状菌または酵母などの真核微生物も、二量体ポリペプチドをコードするベクターのための適当なクローニング宿主または発現宿主である。Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；およびLi,H.et al.,Nat.Biotech.24(2006)210-215を参照すること。
グリコシル化二量体ポリペプチドの発現のための適当な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来してもよい。無脊椎細胞の例には、植物および昆虫の細胞が含まれる。特に、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのため、昆虫細胞と共に使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も宿主として利用され得る。例えば、（トランスジェニック植物において抗体を作製するためのPLANTIBODIES（商標）テクノロジーを記載している）US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978、およびUS 6,417,429を参照すること。
脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁培養に適応している哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株のその他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）；ヒト胎児由来腎臓株（例えば、Graham,F.L.,et al.,J.Gen Virol.36(1977)59-74に記載されているようなHEK293細胞または293細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252に記載されているようなTM4細胞）；サル腎臓細胞（CV1）；アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76）；ヒト子宮頚癌細胞（HELA）；イヌ腎臓細胞（MDCK）；バッファローラット肝細胞（BRL 3A）；ヒト肺細胞（W138）；ヒト肝細胞（Hep G2）；マウス乳房腫瘍（MMT 060562）；例えば、Mather,J.P.,et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68に記載されているようなTRI細胞；MRC 5細胞；およびFS4細胞である。その他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR-CHO細胞（Urlaub,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞；ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体作製のために適当なある種の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki,P.and Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2004),pp.255-268を参照すること。
F.組み合わせ処置
ある種の態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは本明細書において報告される薬学的製剤は、本明細書に記載された1種以上の眼血管疾患の処置のため、単独で（付加的な治療剤なしに）投与される。
他の態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチド抗体または薬学的製剤は、本明細書に記載された1種以上の血管性眼疾患の処置のため、1種以上の付加的な治療剤または治療法と組み合わせて投与される。
他の態様において、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは薬学的製剤は、本明細書に記載された1種以上の血管性眼疾患の処置のため、1種以上の付加的な治療剤と組み合わせて製剤化され、投与される。
ある種の態様において、本明細書に提供される組み合わせ処置は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは薬学的製剤が、本明細書に記載された1種以上の眼血管疾患の処置のため、1種以上の付加的な治療剤と連続的に投与されることを含む。
付加的な治療剤には、トリプトファニルtRNA合成酵素（TrpRS）、EyeOOl（抗VEGF PEG化アプタマー）、スクアラミン、RETAANE（商標）（デポ懸濁液のためのアネコルタブ酢酸エステル；Alcon,Inc.）、コンブレタスタチンA4プロドラッグ（CA4P）、MACUGEN（商標）、MIFEPREX（商標）（ミフェプリストン-ru486）、テノン嚢下トリアムシノロンアセトニド、硝子体内結晶トリアムシノロンアセトニド、プリノマスタット（AG3340−合成マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、Pfizer）、フルオシノロンアセトニド（フルオシノロン眼内インプラント、Bausch & Lomb/Control Delivery Systemsを含む）、VEGFR阻害剤（Sugen）、VEGFトラップ（Regeneron/Aventis）、4-(4-ブロモ-2-フルオロアニリノ)-6-メトキシ-7-(l-メチルピペリジン-4-イルメトキシ)キナゾリン（ZD6474）などのVEGF受容体チロシンキナーゼ阻害剤、4-(4-フルオロ-2-メチルインドール-5-イルオキシ)-6-メトキシ-7-(3-ピロリジン-1-イルプロポキシ)キナゾリン（AZD2171）、バタラニブ（PTK787）およびSU11248（スニチニブ）、リノマイド（linomide）、およびインテグリンvβ3機能の阻害剤、およびアンジオスタチンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは薬学的製剤と組み合わせて使用され得るその他の薬学的治療には、ノンサーマルレーザーの使用によるVISUDYNE（商標）、PKC 412、Endovion（NeuroSearch A/S）、神経栄養因子、例えば、グリア由来神経栄養因子および毛様体神経栄養因子、ジアタゼム（diatazem）、ドルゾラミド、フォトトロプ（Phototrop）、9-シス-レチナール、ホスホリンヨウ化物またはエコチオパートまたは炭酸脱水酵素阻害剤を含む眼薬物治療（エコー治療を含む）、AE-941（AEterna Laboratories,Inc.）、Sirna-027（Sima Therapeutics,Inc.）、ペガプタニブ（NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences）、ニューロトロフィン（例に過ぎないが、NT-4/5,Genentechを含む）、Cand5（Acuity Pharmaceuticals）、INS-37217（Inspire Pharmaceuticals）、インテグリンアンタゴニスト（Jerini AGおよびAbbott Laboratoriesのものを含む）、EG-3306（Ark Therapeutics Ltd.）、BDM-E（BioDiem Ltd.）、（例えば、EntreMed,Inc.によって使用されるような）サリドマイド、カルジオトロフィン1（Genentech）、2-メトキシエストラジオール（Allergan/Oculex）、DL-8234（Toray Industries）、NTC-200（Neurotech）、テトラチオモリブデン酸（University of Michigan）、LYN-002（Lynkeus Biotech）、微細藻類化合物（Aquasearch/Albany、Mera Pharmaceuticals）、D-9120（Celltech Group plc.）、ATX-S10（Hamamatsu Photonics）、TGFβ2（Genzyme/Celtrix）、チロシンキナーゼ阻害剤（Allergan、SUGEN、Pfizer）、NX-278-L（NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences）、Opt-24（OPTIS France SA）、網膜細胞神経節保護薬（Cogent Neurosciences）、N-ニトロピラゾール誘導体（Texas A&M University System）、KP-102（Krenitsky Pharmaceuticals）、シクロスポリンA、限局性網膜移動術、光線力学療法（例に過ぎないが、受容体標的型PDT（Bristol-Myers Squibb,Co.）；PDTによる注射のためのポルフィマーナトリウム；ベルテポルフィン（QLT Inc.）；PDTによるロスタポルフィン（Miravent Medical Technologies）；PDTによるタラポルフィンナトリウム（Nippon Petroleum）；モテクサフィンルテチウム（Pharmacyclics,Inc.）を含む）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、Novagali Pharma SAによって試験された生成物およびISIS-13650（Isis Parmaceuticalsを含む）、レーザー光凝固、ドルーゼンレーザー法、黄斑円孔手術、黄斑移動術、埋め込み型微小望遠鏡、ファイモーション血管造影法（Phi-Motion Angiography）（マイクロレーザー治療（Micro-Laser Therapy）および支持血管処置（Feeder Vessel Treatment）としても公知）、陽子線治療、微小刺激治療、網膜剥離および硝子体手術、強膜バックル、黄斑下手術、経瞳孔温熱療法、光化学系I治療、RNA干渉（RNAi）の使用、体外レオフェレシス（rheopheresis）（メンブレンディファレンシャルフィルトレーション（membrane differential filtration）およびレオセラピー（Rheotherapy）としても公知）、マイクロチップ埋め込み、幹細胞治療、遺伝子置換治療、リボザイム遺伝子治療（低酸素応答因子のための遺伝子治療（Oxford Biomedica）；Lentipak（Genetix）；PDEF遺伝子治療（GenVec）を含む）、視細胞／網膜細胞移植（移植可能網膜上皮細胞（Diacrin,Inc）；網膜細胞移植（Cell Genesys,Inc.）を含む）、ならびに鍼が含まれるが、これらに限定されない。
CarmelietおよびJain（Nature 407(2000)249-257）によってリストされたものを含むが、それらに限定されない、抗血管新生剤も、本明細書において報告される二量体ポリペプチドまたは薬学的製剤と組み合わせて使用され得る。ある種の態様において、抗血管新生剤は、VEGFバリアント、可溶性VEGF受容体断片、VEGFまたはVEGFRを阻止することができるアプタマー、中和抗VEGFR抗体、VEGFRチロシンキナーゼの低分子量阻害剤、およびそれらの任意の組み合わせなどの、もう一つのVEGFアンタゴニストまたはVEGF受容体アンタゴニストであり、これらには、抗VEGFアプタマー（例えば、ペガプタニブ）、可溶性組換えデコイ受容体（例えば、VEGFトラップ）が含まれる。ある種の態様において、抗血管新生剤には、副腎皮質ステロイド、血管新生抑制ステロイド、アネコルタブ酢酸エステル、アンジオスタチン、エンドスタチン、VEGFRまたはVEGFリガンドの発現を減少させる低分子干渉RNA、チロシンキナーゼ阻害剤によるポストVEGFR阻止、MMP阻害剤、IGFBP3、SDF-1ブロッカー、PEDF、γセクレターゼ、δ様リガンド4、インテグリンアンタゴニスト、HIF-1α阻止、プロテインキナーゼCK2阻止、ならびに血管内皮カドヘリン（CD-144）およびストロマ由来因子（SDF）-I抗体を使用した血管新生部位への幹細胞（即ち、内皮前駆細胞）ホーミングの阻害が含まれる。PTK787を含むVEGF受容体を標的とする低分子RTK阻害剤も使用され得る。必ずしも抗VEGF化合物でない、血管新生に対する活性を有する薬剤も使用され得、抗炎症薬、m-Tor阻害剤、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、シクロスポリン、抗TNF剤、抗補体剤、および非ステロイド性抗炎症剤を含む。「神経ステロイド」と呼ばれる薬物クラスなどの、神経保護性であり萎縮型黄斑変性の進行を低下させる可能性のある薬剤も、使用され得る。これらには、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）（商品名：Prastera（登録商標）およびFidelin（登録商標））、デヒドロエピアンドロステロン硫酸、およびプレグネノロン硫酸などの薬物が含まれる。PDTと組み合わせられたベルテポルフィン、ペガプタニブナトリウム、亜鉛、または抗酸化剤を含むが、これらに限定されない、AMD（加齢黄斑変性）治療剤が、単独で、または組み合わせられて、本明細書に報告される二量体ポリペプチドまたは薬学的製剤と組み合わせて使用され得る。
G.薬学的製剤
本明細書において報告される二量体ポリペプチドの薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような二量体ポリペプチドを、1種以上の任意の薬学的に許容される担体と混合することによって、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.(ed.)(1980)）。薬学的に許容される担体は、一般に、利用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、およびその他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコール、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなどの）保存剤；低分子量（約10残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリ(ビニルピロリドン)などの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、およびその他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属複合体（例えば、Zn-タンパク質複合体）；および／またはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書において、例示的な薬学的に許容される担体には、可溶性中性活性型ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）などの間質薬物分散剤、例えば、rhuPH20（HYLENEX（登録商標）、Baxter International,Inc.）などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質がさらに含まれる。rhuPH20を含む、ある種の例示的なsHASEGPおよび使用法は、US 2005/0260186およびUS 2006/0104968に記載されている。一つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1種以上の付加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、US 6,267,958に記載されている。水性抗体製剤には、US 6,171,586およびWO 2006/044908に記載されたものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン酢酸緩衝液を含む。
本明細書における製剤は、処置されている特定の適応症のために必要な活性成分、好ましくは、相互に悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを、複数種、含有していてもよい。そのような活性成分は、意図された目的のために有効な量で組み合わせられて適当に存在する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに捕捉されていてもよい。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.(ed.)(1980)に開示されている。
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適当な例には、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態をとっている、抗体を含有している固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれる。
インビボ投与のために使用される製剤は、一般に、無菌である。無菌性は、例えば、滅菌ろ過膜によるろ過によって、容易に達成され得る。
H.治療の方法および組成物
本明細書において報告される二量体ポリペプチドのいずれかを、治療法において使用することができる。
一つの局面において、医薬として使用するための本明細書において報告される二量体ポリペプチドが提供される。さらなる局面において、眼血管疾患の処置において使用するための二量体ポリペプチドが提供される。ある種の態様において、処置の方法において使用するための二量体ポリペプチドが提供される。ある種の態様において、本発明は、有効量の本明細書において報告される二量体ポリペプチドを個体へ投与する工程を含む、眼血管疾患を有する個体を処置する方法において使用するための二量体ポリペプチドを提供する。一つのそのような態様において、方法は、例えば、上記セクションDに記載されたような少なくとも1種の付加的な治療剤を、有効量、個体へ投与する工程をさらに含む。さらなる態様において、本発明は、眼における血管新生の阻害において使用するための二量体ポリペプチドを提供する。ある種の態様において、本発明は、血管新生を阻害するために有効な量の二量体ポリペプチドを個体へ投与する工程を含む、個体における血管新生を阻害する方法において使用するための二量体ポリペプチドを提供する。上記の態様のいずれかによる「個体」とは、一つの好ましい態様において、ヒトである。
さらなる局面において、本発明は、医薬の製造または調製における二量体ポリペプチドの使用を提供する。一つの態様において、医薬は、眼血管疾患の処置のためのものである。さらなる態様において、医薬は、有効量の医薬を眼血管疾患を有する個体へ投与する工程を含む、眼血管疾患を処置する方法において使用するためのものである。一つのそのような態様において、方法は、例えば、上記のような少なくとも1種の付加的な治療剤を、有効量、個体へ投与する工程をさらに含む。さらなる態様において、医薬は血管新生を阻害するためのものである。さらなる態様において、医薬は、血管新生を阻害するために有効な量の医薬を個体へ投与する工程を含む、個体における血管新生を阻害する方法において使用するためのものである。上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
さらなる局面において、本発明は、血管性眼疾患を処置する方法を提供する。一つの態様において、方法は、有効量の本明細書において報告される二量体ポリペプチドをそのような血管性眼疾患を有する個体へ投与する工程を含む。一つのそのような態様において、方法は、下記のような少なくとも1種の付加的な治療剤を、有効量、個体へ投与する工程をさらに含む。上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
さらなる局面において、本発明は、個体の眼における血管新生を阻害する方法を提供する。一つの態様において、方法は、血管新生を阻害するために有効な量の本明細書において報告される二量体ポリペプチドを個体へ投与する工程を含む。一つの態様において、「個体」はヒトである。
さらなる局面において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかにおいて使用するための、本明細書において報告される二量体ポリペプチドのいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一つの態様において、薬学的製剤は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。もう一つの態様において、薬学的製剤は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドのいずれかと、例えば、下記のような少なくとも1種の付加的な治療剤とを含む。
本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、治療において単独で使用されてもよいしまたは他の薬剤と組み合わせて使用されてもよい。例えば、本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、少なくとも1種の付加的な治療剤と共投与され得る。
本明細書において報告される二量体ポリペプチド（および任意の付加的な治療剤）は、非経口、肺内、および鼻腔内を含む任意の適当な手段によって投与され得、局所処置のために望まれる場合には、病巣内投与によって投与される。
非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。投薬は、一部分、投与が短期であるか慢性であるかに依って、任意の適当なルートによって、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によってなされ得る。単回投与または様々な時点における複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これらに限定されない、様々な投薬スケジュールが、本明細書において企図される。
本明細書において報告される二量体ポリペプチドは、グッドメディカルプラクティス（good medical practice）と一致する様式で、製剤化され、投薬され、投与されるであろう。この状況において考慮するための因子には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、障害の原因、薬剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、および医療従事者に公知のその他の因子が含まれる。二量体ポリペプチドは、必ずしも必要ではないが、当該の障害を防止するかまたは処置するために現在使用されている1種以上の薬剤と共に、任意で、製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する二量体ポリペプチドの量、障害または処置のタイプ、および上述のその他の因子に依る。これらは、一般に、本明細書に記載されたのと同一の投薬量および投与ルートで、または本明細書に記載された投薬量の約1〜99％で、または経験的／臨床的に適切であると決定された投薬量およびルートで使用される。
疾患の防止または処置のための、本明細書において報告される二量体ポリペプチドの適切な投薬量は、（単独でまたは1種以上の他の付加的な治療剤と組み合わせて使用された時）、処置される疾患のタイプ、二量体ポリペプチドのタイプ、疾患の重症度および経過、二量体ポリペプチドが予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、過去の治療、患者の病歴および二量体ポリペプチドに対する応答、ならびに主治医の裁量に依るであろう。二量体ポリペプチドは、単回で、または一連の処置により、患者へ適当に投与される。疾患のタイプおよび重症度に依って、約1μg/kg〜15mg/kg（例えば、0.5mg/kg〜10mg/kg）の二量体ポリペプチドが、例えば、1回以上の別々の投与によるかまたは連続注入によるかに関わらず、患者への投与のための初期候補投薬量であり得る。典型的な1日投薬量は、上述の因子に依って、約1μg/kg〜100mg/kgまたはそれ以上の範囲であり得る。状態によって、数日またはそれ以上にわたり繰り返し投与する場合、処置は、一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで持続されるであろう。二量体ポリペプチドの一つの例示的な投薬量は、約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲にあるであろう。従って、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、または10mg/kg（またはそれらの組み合わせ）が、1回または複数回、患者へ投与され得る。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週または3週間毎に、投与され得る（例えば、患者は、約2〜約20回、または、例えば、約6回、二量体ポリペプチドを受容する）。より高い負荷量を初回に投与し、その後、より低い用量を1回または複数回投与することもできる。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。
III.製品
本発明のもう一つの局面において、上記の障害の処置、防止、および／または診断のために有用な材料を含有している製品が提供される。製品は、容器と、容器上のまたは容器に付随するラベルまたはパッケージインサートとを含む。適当な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、IV溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。容器は、単独の組成物、または状態の処置、防止、および／もしくは診断のために有効なもう一つの組成物と組み合わせられた組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも1種の活性薬剤は、本明細書において報告される二量体ポリペプチドである。ラベルまたはパッケージインサートは、選択の状態を処置するために組成物が使用されることを示す。さらに、製品は、（a）本明細書において報告される二量体ポリペプチドを含む組成物を含有している第1の容器；および（b）さらなる細胞傷害性薬剤またはその他の治療剤を含む組成物を含有している第2の容器を含み得る。本発明のこの態様において、製品は、特定の状態を処置するために組成物が使用され得ることを示すパッケージインサートをさらに含み得る。代替的にまたは付加的に、製品は、注射用静菌水（BWFI）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第2（または第3）の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、および注射器を含む、商業的見地および使用者見地から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
上記の製品のいずれかは、本明細書において報告される二量体ポリペプチドの代わりに、またはそれに加えて、本明細書において報告されるイムノコンジュゲートを含んでいてもよいことが理解される。
IV.具体的な態様
1.N末端からC末端への方向に、1個以上のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分と、免疫グロブリンCH2ドメインと、免疫グロブリンCH3ドメインとを各々含む第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む二量体ポリペプチドであって、
（i）第1および第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（ii）第1および第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（iii）第1および第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含むか、または
（iv）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（v）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（vi）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含む、二量体ポリペプチド。
2.ヒトFcRnに特異的に結合せず、ブドウ球菌プロテインAに特異的に結合することを特徴とする、項目1の二量体ポリペプチド。
3.ホモ二量体ポリペプチドであることを特徴とする、項目1〜2のいずれかの二量体ポリペプチド。
4.ヘテロ二量体ポリペプチドであることを特徴とする、項目1〜2のいずれかの二量体ポリペプチド。
5.（i）第1のポリペプチドが変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vをさらに含み、かつ第2のポリペプチドが変異S354CおよびT366Wを含むか、または（ii）第1のポリペプチドが変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vをさらに含み、かつ第2のポリペプチドが変異Y349CおよびT366Wを含むことを特徴とする、項目1〜4のいずれかの二量体ポリペプチド。
6.免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインがIgG1サブクラスのものであることを特徴とする、項目1〜5のいずれかの二量体ポリペプチド。
7.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが変異L234AおよびL235Aをさらに含むことを特徴とする、項目1〜6のいずれかの二量体ポリペプチド。
8.免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインが、ヒトIgG2サブクラスのものであり、任意で、変異V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、およびP331Sを有することを特徴とする、項目1〜5のいずれかの二量体ポリペプチド。
9.免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインが、ヒトIgG4サブクラスのものであることを特徴とする、項目1〜5のいずれかの二量体ポリペプチド。
10.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが変異S228PおよびL235Eをさらに含むことを特徴とする、項目1〜5および9のいずれかの二量体ポリペプチド。
11.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが変異P329Gをさらに含むことを特徴とする、項目1〜10のいずれかの二量体ポリペプチド。
12.Fc領域融合ポリペプチドであることを特徴とする、項目1〜11のいずれかの二量体ポリペプチド。
13.（全長）抗体であることを特徴とする、項目1〜11のいずれかの二量体ポリペプチド。
14.（全長）抗体が単一特異性抗体であることを特徴とする、項目1〜11および13のいずれかの二量体ポリペプチド。
15.単一特異性抗体が一価の単一特異性抗体であることを特徴とする、項目1〜11および13〜14のいずれかの二量体ポリペプチド。
16.単一特異性抗体が二価の単一特異性抗体であることを特徴とする、項目1〜11および13〜15のいずれかの二量体ポリペプチド。
17.（全長）抗体が二重特異性抗体であることを特徴とする、項目1〜11および13のいずれかの二量体ポリペプチド。
18.二重特異性抗体が二価の二重特異性抗体であることを特徴とする、項目1〜11および13および17のいずれかの二量体ポリペプチド。
19.二重特異性抗体が四価の二重特異性抗体であることを特徴とする、項目1〜11および13および17〜18のいずれかの二量体ポリペプチド。
20.（全長）抗体が三重特異性抗体であることを特徴とする、項目1〜11および13のいずれかの二量体ポリペプチド。
21.三重特異性抗体が三価の三重特異性抗体であることを特徴とする、項目1〜11および13および20のいずれかの二量体ポリペプチド。
22.三重特異性抗体が四価の三重特異性抗体であることを特徴とする、項目1〜11および13および20〜21のいずれかの二量体ポリペプチド。
23.N末端からC末端への方向に、1個以上のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分と、免疫グロブリンCH2ドメインと、免疫グロブリンCH3ドメインとを各々含む第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む二量体ポリペプチドであって、第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第1および第2のポリペプチドが変異Y436A（EUインデックスによるナンバリング）を含む、二量体ポリペプチド。
24.第1および第2のポリペプチドが変異Y436Aを含むことを特徴とする、項目23の二量体ポリペプチド。
25.ヒトFcRnに特異的に結合せず、ブドウ球菌プロテインAに特異的に結合することを特徴とする、項目23〜24のいずれかの二量体ポリペプチド。
26.ホモ二量体ポリペプチドであることを特徴とする、項目23〜25のいずれかの二量体ポリペプチド。
27.ヘテロ二量体ポリペプチドであることを特徴とする、項目23〜25のいずれかの二量体ポリペプチド。
28.（a）第1のポリペプチドが変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vをさらに含み、かつ第2のポリペプチドが変異S354CおよびT366Wを含むか、または第1のポリペプチドが変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vをさらに含み、かつ第2のポリペプチドが変異Y349CおよびT366Wを含み、かつ／または
（b）（i）第1および第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（ii）第1および第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（iii）第1および第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含むか、または
（iv）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（v）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（vi）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含む
ことを特徴とする、項目23〜27のいずれかの二量体ポリペプチド。
29.免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインが、ヒトIgG1サブクラスのものであることを特徴とする、項目23〜28のいずれかの二量体ポリペプチド。
30.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが変異L234AおよびL235Aをさらに含むことを特徴とする、項目23〜29のいずれかの二量体ポリペプチド。
31.免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインが、ヒトIgG2サブクラスのものであり、任意で、変異V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、およびP331Sを有することを特徴とする、項目23〜28のいずれかの二量体ポリペプチド。
32.免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインが、ヒトIgG4サブクラスのものであることを特徴とする、項目23〜28のいずれかの二量体ポリペプチド。
33.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが変異S228PおよびL235Eをさらに含むことを特徴とする、項目23〜28および32のいずれかの二量体ポリペプチド。
34.第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが変異P329Gをさらに含むことを特徴とする、項目23〜33のいずれかの二量体ポリペプチド。
35.Fc領域融合ポリペプチドであることを特徴とする、項目23〜24のいずれかの二量体ポリペプチド。
36.（全長）抗体であることを特徴とする、項目23〜34のいずれかの二量体ポリペプチド。
37.（全長）抗体が単一特異性抗体であることを特徴とする、項目23〜34および36のいずれかの二量体ポリペプチド。
38.単一特異性抗体が一価の単一特異性抗体であることを特徴とする、項目23〜34および36〜37のいずれかの二量体ポリペプチド。
39.単一特異性抗体が二価の単一特異性抗体であることを特徴とする、項目23〜34および36〜38のいずれかの二量体ポリペプチド。
40.（全長）抗体が二重特異性抗体であることを特徴とする、項目23〜34および36のいずれかの二量体ポリペプチド。
41.二重特異性抗体が二価の二重特異性抗体であることを特徴とする、項目23〜34および36および40のいずれかの二量体ポリペプチド。
42.二重特異性抗体が四価の二重特異性抗体であることを特徴とする、項目23〜34および36および40〜41のいずれかの二量体ポリペプチド。
43.（全長）抗体が三重特異性抗体であることを特徴とする、項目23〜34および36のいずれかの二量体ポリペプチド。
44.三重特異性抗体が三価の三重特異性抗体であることを特徴とする、項目23〜34および36および43のいずれかの二量体ポリペプチド。
45.三重特異性抗体が四価の三重特異性抗体であることを特徴とする、項目23〜34および36および43〜44のいずれかの二量体ポリペプチド。
46.N末端からC末端への方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む第1のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む第2のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第1の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第4のポリペプチド
を含む、二量体ポリペプチドであって、
第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
（i）第1のポリペプチドが変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異S354CおよびT366Wを含むか、または（ii）第1のポリペプチドが変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異Y349CおよびT366Wを含み、
第1および第2のポリペプチドが変異L234A、L235A、およびP329Gをさらに含み、
（i）第1および第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（ii）第1および第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（iii）第1および第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含むか、または
（iv）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（v）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（vi）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含む、二量体ポリペプチド。
47.N末端からC末端への方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む第1のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメインを含む第2のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第1の軽鎖可変ドメインおよびサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメインを含む第3のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第4のポリペプチド
を含む、二量体ポリペプチドであって、
第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
（i）第1のポリペプチドが変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異S354CおよびT366Wを含むか、または（ii）第1のポリペプチドが変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異Y349CおよびT366Wを含み、
第1および第2のポリペプチドが変異L234A、L235A、およびP329Gをさらに含み、
（i）第1および第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（ii）第1および第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（iii）第1および第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含むか、または
（iv）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（v）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（vi）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含む、二量体ポリペプチド。
48.N末端からC末端への方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む第1のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む第2のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第1の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第4のポリペプチド
を含む、二量体ポリペプチドであって、
第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
（i）第1のポリペプチドが変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異S354CおよびT366Wを含むか、または（ii）第1のポリペプチドが変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異Y349CおよびT366Wを含み、
第1および第2のポリペプチドが変異L228P、L235E、およびP329Gをさらに含み、
（i）第1および第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（ii）第1および第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（iii）第1および第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含むか、または
（iv）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（v）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（vi）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含む、二量体ポリペプチド。
49.N末端からC末端への方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む第1のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG4の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG4の免疫グロブリンCH2ドメイン、およびサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH3ドメインを含む第2のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第1の軽鎖可変ドメインおよびサブクラスIgG4の免疫グロブリンCH1ドメインを含む第3のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第4のポリペプチド
を含む、二量体ポリペプチドであって、
第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位を形成し、
第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位を形成し、
（i）第1のポリペプチドが変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異S354CおよびT366Wを含むか、または（ii）第1のポリペプチドが変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異Y349CおよびT366Wを含み、
第1および第2のポリペプチドが変異S228P、L235E、およびP329Gをさらに含み、
（i）第1および第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（ii）第1および第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（iii）第1および第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含むか、または
（iv）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（v）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（vi）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含む、二量体ポリペプチド。
50.N末端からC末端への方向に、第1の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチドリンカー、および第1のscFvを含む第1のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチドリンカー、および第2のscFvを含む第2のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第1の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第4のポリペプチド
を含む、二量体ポリペプチドであって、
第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第1の抗原に特異的に結合する第2の結合部位を形成し、第1および第2のscFvが第2の抗原に特異的に結合し、
（i）第1のポリペプチドが変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異S354CおよびT366Wを含むか、または（ii）第1のポリペプチドが変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異Y349CおよびT366Wを含み、
第1および第2のポリペプチドが変異L234A、L235A、およびP329Gをさらに含み、
（i）第1および第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（ii）第1および第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（iii）第1および第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含むか、または
（iv）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（v）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（vi）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含む、二量体ポリペプチド。
51.N末端からC末端への方向に、第1の重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチドリンカー、および第1のscFvを含む第1のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の重鎖可変ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンヒンジ領域、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH2ドメイン、サブクラスIgG1の免疫グロブリンCH3ドメイン、ペプチドリンカー、および第2のscFvを含む第2のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第1の軽鎖可変ドメインおよびサブクラスIgG1の免疫グロブリンCH1ドメインを含む第3のポリペプチド、
N末端からC末端への方向に、第2の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第4のポリペプチド
を含む、二量体ポリペプチドであって、
第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第1の抗原に特異的に結合する第2の結合部位を形成し、かつ第1および第2のscFvが第2の抗原に特異的に結合し、
（i）第1のポリペプチドが変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異S354CおよびT366Wを含むか、または（ii）第1のポリペプチドが変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異Y349CおよびT366Wを含み、
第1および第2のポリペプチドが変異L234A、L235A、およびP329Gをさらに含み、
（i）第1および第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（ii）第1および第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（iii）第1および第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含むか、または
（iv）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、または
（v）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、または
（vi）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含む、二量体ポリペプチド。
52.以下の工程を含む、項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドを作製する方法：
（a）項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドをコードする1種以上の核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程、
（b）培養培地から二量体ポリペプチドを回収する工程、および
（c）プロテインAアフィニティクロマトグラフィによって二量体ポリペプチドを精製する工程。
53.二量体ポリペプチドのプロテインAとの結合を増加させるための変異Y436Aの使用。
54.ホモ二量体ポリペプチドからヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための、変異H310A、H433A、およびY436Aの使用。
55.ホモ二量体ポリペプチドからヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための、変異L251D、L314D、L432D、または変異L251S、L314S、L432Sの使用。
56.ホモ二量体ポリペプチドから第1および第2のポリペプチドを含むヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための、第2のポリペプチドにおける変異H310A、H433A、およびY436Aと組み合わせた第1のポリペプチドにおける変異I253A、H310A、およびH435Aの使用。
57.ホモ二量体ポリペプチドから第1および第2のポリペプチドを含むヘテロ二量体ポリペプチドを分離するための、第2のポリペプチドにおける変異L251D、L314D、L432Dまたは変異L251S、L314S、L432Sと組み合わせた第1のポリペプチドにおける変異I253A、H310A、およびH435Aの使用。
58.（i）第1のポリペプチドが変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vをさらに含み、かつ第2のポリペプチドが変異S354CおよびT366Wをさらに含むか、または（ii）第1のポリペプチドが変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vを含み、かつ第2のポリペプチドが変異Y349CおよびT366Wを含むことを特徴とする、項目53〜57のいずれかの使用。
59.項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドをそのような処置を必要とする患者へ投与することによる、眼血管疾患に罹患している患者の処置の方法。
60.硝子体内適用のための、項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチド。
61.血管性眼疾患の処置のための、項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチド。
62.項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドと、任意で、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤。
63.可溶性受容体リガンドの眼から血液眼関門を越えて血液循環への輸送のための、項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドの使用。
64.1種以上の可溶性受容体リガンドの眼からの除去のための、項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドの使用。
65.眼疾患、特に、眼血管疾患の処置のための、項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドの使用。
66.1種以上の可溶性受容体リガンドの硝子体内空間から血液循環への輸送のための、項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドの使用。
67.眼疾患の処置において使用するための、請求項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチド。
68.可溶性受容体リガンドの眼から血液眼関門を越えて血液循環への輸送において使用するための、項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチド。
69.1種以上の可溶性受容体リガンドの眼からの除去において使用するための、項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチド。
70.眼疾患、特に、眼血管疾患の処置において使用するための、項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチド。
71.1種以上の可溶性受容体リガンドの硝子体内空間から血液循環への輸送において使用するための、項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチド。
72.有効量の項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドを個体へ投与する工程を含む、眼血管疾患を有する個体を処置する方法。
73.可溶性受容体リガンドを眼から血液眼関門を越えて血液循環へ輸送するために有効な量の項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドを個体へ投与する工程を含む、個体において可溶性受容体リガンドを眼から血液眼関門を越えて血液循環へ輸送する方法。
74.1種以上の可溶性受容体リガンドを眼から除去するために有効な量の項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドを個体へ投与する工程を含む、個体において1種以上の可溶性受容体リガンドを眼から除去する方法。
75.1種以上の可溶性受容体リガンドを硝子体内空間から血液循環へ輸送するために有効な量の項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドを個体へ投与する工程を含む、個体において1種以上の可溶性受容体リガンドを硝子体内空間から血液循環へ輸送する方法。
76.可溶性受容体リガンドを眼から血液眼関門を越えて血液循環へ輸送するために有効な量の項目1〜51のいずれかの二量体ポリペプチドを個体へ投与する工程を含む、個体において可溶性受容体リガンドを硝子体内空間または眼から血液眼関門を越えて血液循環へ輸送する方法。
V.実施例
以下は本発明の方法および組成物の例である。上述の一般的な説明から、様々な他の態様が実施され得ることが理解される。
前述の本発明は、理解の明確のため、例示および例によってある程度詳細に説明されたが、説明および例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。本明細書中に引用された全ての特許および科学文献の開示は、参照によってその全体が明示的に組み入れられる。
方法
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）
0.5μLのN-Glycanase plus（Roche）および115μLの最終試料体積を入手するためのリン酸ナトリウム緩衝液（0.1M、pH7.1）を添加することによって、タンパク質アリコート（50μg）を脱グリコシルした。混合物を37℃で18時間インキュベートした。その後、還元および変性のため、60μLの4Mグアニジン*HCl（Pierce）中の0.5M TCEP（Pierce）および50μLの8Mグアニジン*HClを添加した。混合物を37℃で30分間インキュベートした。サイズ排除クロマトグラフィ（セファロースG-25、均一濃度、2％ギ酸を含む40％アセトニトリル）によって、試料を脱塩した。ESI質量スペクトル（+ve）を、ナノESIソース（TriVersa NanoMate,Advion）が装備されたQ-TOF装置（maXis,Bruker）で記録した。MSパラメータ設定は、以下の通りであった：導入：ファンネルRF、400 Vpp；ISCIDエネルギー、0eV；多重極RF、400Vpp；四重極：イオンエネルギー、4.0eV；低質量、600m/z；ソース：乾燥ガス、8L/分；乾燥ガス温度、160℃；衝突セル：衝突エネルギー、10eV；衝突RF：2000Vpp；イオン冷却器：イオン冷却器RF、300Vpp；導入時間：120μs；プレパルスストレージ（Pre Puls Storage）、10μs；スキャン範囲m/z600〜2000。データ評価のため、社内開発されたソフトウェア（MassAnalyzer）を使用した。
FcRn表面プラズモン共鳴（SPR）分析
野生型抗体および変異体のFcRnとの結合特性を、BIAcore T100装置（BIAcore AB,Uppsala,Sweden）を使用して、表面プラズモン共鳴（SPR）テクノロジーによって分析した。この系は、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。それは、リガンド／分析物結合の連続的なリアルタイムモニタリングを可能にし、従って、様々なアッセイ環境において動力学的パラメータの決定を可能にする。SPRテクノロジーは、金によってコーティングされたバイオセンサーチップの表面に近い屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、溶液中の注入された分析物との固定化されたリガンドの相互作用によって引き起こされた表面上の質量変化を示す。分子が表面上の固定化されたリガンドと結合する場合、質量が増加し、解離する場合、質量が減少する。当アッセイにおいて、FcRn受容体を、400レスポンスユニット（RU）のレベルで、アミンカップリングを介して、BIAcore CM5バイオセンサーチップ（GE Healthcare Bioscience,Uppsala,Sweden）へ固定化した。ランニング緩衝液および希釈緩衝液としてPBS、0.05％Tween20（pH6.0）（GE Healthcare Bioscience）を用いて、室温でアッセイを実施した。200nMの試料を、室温で50μl/分の流速で注入した。会合時間は180秒であり、解離相は360秒を要した。チップ表面の再生は、HBS-P（pH8.0）の短時間注入によって達成された。SPRデータの評価を、注入の180秒後と注入の300秒後との生物学的応答シグナル強度の比較によって実施した。対応するパラメータは、RU maxレベル（注入の180秒後）および後期安定性（注入の300秒後）である。
プロテインA表面プラズモン共鳴（SPR）分析
アッセイは表面プラズモン共鳴分光法に基づく。プロテインAをSPRバイオセンサーの表面に固定化する。SPR分光計のフローセルへ試料を注入することによって、それは、固定化されたプロテインAと複合体を形成し、センサーチップ表面上の質量の増加をもたらし、従って、より高いレスポンス（1RUは1pg/mm2として定義される）をもたらす。その後、試料-プロテインA複合体を溶解させることによって、センサーチップを再生させる。次いで、取得された応答を、レスポンスユニット（RU）としてのシグナル強度および解離挙動について評価する。
約3500レスポンスユニット（RU）のプロテインA（20μg/mL）を、GE Healthcareのアミンカップリングキットを使用することによってpH4.0でCM5チップ（GE Healthcare）にカップリングした。
試料および系の緩衝液は、HBS-P+（0.01M HEPES、0.15M NaCl、0.005％サーファクタントP20滅菌ろ過（pH7.4））であった。フローセル温度を25℃、試料コンパートメント温度を12℃に設定した。ランニング緩衝液によって系を開始した。次いで、試料構築物の5nM溶液を、30μL/分の流速で120秒間注入した後、300秒の解離相が続いた。次いで、30μL/分の流速で、グリシン-HCl（pH1.5）を30秒間、2回、注入することによって、センサーチップ表面を再生させた。各試料をトリプリケートとして測定した。
二重特異性抗体およびそれぞれの配列
Figure 2017508726
「変異IHH-AAAを有する」という用語は、本明細書において使用されるように、IgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの定常重鎖領域における変異I253A（Ile253Ala）、H310A（His310Ala）、およびH435A（His435Ala）の組み合わせをさし（カバットEUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）、「変異HHY-AAAを有する」という用語は、本明細書において使用されるように、IgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの定常重鎖領域における変異H310A（His310Ala）、H433A（His433Ala）、およびY436A（Tyr436Ala）の組み合わせをさし（カバットEUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）、「変異P329G LALAを有する」という用語は、本明細書において使用されるように、IgG1サブクラスの定常重鎖領域における変異L234A（Leu234Ala）、L235A（Leu235Ala）、およびP329G（Pro329Gly）の組み合わせをさし（カバットEUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）、「変異SPLEを有する」という用語は、本明細書において使用されるように、IgG4サブクラスの定常重鎖領域における変異S228P（Ser228Pro）およびL235E（Leu235Glu）の組み合わせをさす（カバットEUインデックスナンバリングシステムによるナンバリング）。
Figure 2017508726
一般
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)に与えられている。抗体鎖のアミノ酸残基は、EUナンバリング（Edelman,G.M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85；Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)）によってナンバリングされ、言及される。
組換えDNA技術
Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)に記載されるような標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。製造業者の説明書に従って分子生物学的試薬を使用した。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、Geneart（Regensburg,Germany）に、所定の仕様書に従って注文した。
DNA配列決定
MediGenomix GmbH（Martinsried,Germany）またはSequiServe GmbH（Vaterstetten,Germany）において実施された二本鎖配列決定によって、DNA配列を決定した。
DNAおよびタンパク質の配列分析および配列データ管理
GCG（Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin）のソフトウェアパッケージバージョン10.2およびInfomaxのVector NT1 Advanceスイートバージョン8.0を、配列の作出、マッピング、分析、アノテーション、および図示のために使用した。
発現ベクター
記載された抗体の発現のため、CMVイントロンAプロモーターを有するかもしくは有しないcDNA構成、またはCMVプロモーターを有するゲノム構成のいずれかに基づく（例えば、HEK293-F細胞における）一過性発現のための発現ベクターを使用した。
抗体発現カセットの他に、ベクターは、以下のものを含有していた：
- 大腸菌におけるこのベクターの複製を可能にする複製開始点、
- 大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子、および
- 真核細胞における選択可能マーカーとしてのマウス（Mus musculus）由来のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子。
抗体遺伝子の転写単位は、以下の要素から構成されていた：
- 5'末端の独特の制限部位、
- ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
- cDNA構成の場合には、その後のイントロンA配列、
- ヒト免疫グロブリン遺伝子の5'非翻訳領域、
- 免疫グロブリン重鎖シグナル配列をコードする核酸、
- cDNAとして、または免疫グロブリンエクソン-イントロン構成を有するゲノム構成において、（野生型であるかまたはドメイン交換を有する）ヒト抗体鎖をコードする核酸、
- ポリアデニル化シグナル配列を有する3'非翻訳領域、ならびに
- 3'末端の独特の制限部位。
抗体鎖をコードする核酸を、PCRおよび／または遺伝子合成によって生成し、例えば、それぞれのベクターにおける独特の制限部位を使用して、対応する核酸セグメントを接続することによって、公知の組換えの方法および技術によって組み立てた。サブクローニングされた核酸配列を、DNA配列決定によって確認した。一過性トランスフェクションのため、より大量のベクターを、形質転換された大腸菌培養物からのベクター調製によって調製した（Nucleobond AX,Macherey-Nagel）。
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.and Yamada,K.M.(eds.),John Wiley & Sons,Incに記載されるような標準的な細胞培養技術を使用した。
下記のように、懸濁培養されたHEK29-F細胞におけるそれぞれの発現ベクターの一過性コトランスフェクションによって、二重特異性抗体を発現させた。
実施例1
発現および精製
HEK293-F系における一過性トランスフェクション
単一特異性抗体および二重特異性抗体を、製造業者の説明書に従って、HEK293-F系（Invitrogen）を使用して、（例えば、重鎖および修飾型重鎖、ならびに対応する軽鎖および修飾型軽鎖をコードする）それぞれのベクターによる一過性トランスフェクションによって生成した。簡単に説明すると、振とうフラスコまたは撹拌発酵槽において、無血清FreeStyle（商標）293発現培地（Invitrogen）で懸濁培養されたHEK293-F細胞（Invitrogen）を、それぞれの発現ベクターおよび293fectin（商標）またはfectin（Invitrogen）のミックスによってトランスフェクトした。2L振とうフラスコ（Corning）のため、HEK293-F細胞を600mLで1*106細胞/mLの密度で播種し、120rpm、8％CO2でインキュベートした。翌日、細胞を、およそ1.5*106細胞/mLの細胞密度で、（A）等モル比のそれぞれ重鎖または修飾型重鎖および対応する軽鎖をコードする600μgの全ベクターDNA（1μg/mL）を含む20mLのOpti-MEM（Invitrogen）と、（B）1.2mLの293 fectinまたはfectin（2μL/mL）を含む20mlのOpti-MEMとのおよそ42mLのミックスによってトランスフェクトした。グルコース消費に応じて、グルコース溶液を発酵の途中で添加した。5〜10日後、分泌された抗体を含有している上清を採集し、上清から直接抗体を精製するか、または上清を凍結保管した。
精製
MabSelectSure-Sepharose（商標）（非IHH-AAA変異体のため）（GE Healthcare,Sweden）またはKappaSelect-Agarose（IHH-AAA変異体のため）（GE Healthcare,Sweden）を使用したアフィニティクロマトグラフィ、ブチルセファロース（GE Healthcare,Sweden）を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィ、およびSuperdex 200サイズ排除（GE Healthcare,Sweden）クロマトグラフィによって、細胞培養上清から二重特異性抗体を精製した。
簡単に説明すると、滅菌ろ過された細胞培養上清（非IHH-AAA変異および野生型抗体）を、PBS緩衝液（10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および2.7mM KCl（pH7.4））によって平衡化されたMabSelectSuRe樹脂上に捕獲し、平衡化緩衝液によって洗浄し、pH3.0の25mMクエン酸ナトリウムによって溶出させた。IHH-AAA変異体を、25mMトリス、50mM NaCl（pH7.2）によって平衡化されたKappaSelect樹脂上に捕獲し、平衡化緩衝液によって洗浄し、25mMクエン酸ナトリウム（pH2.9）によって溶出させた。溶出した抗体画分をプールし、2Mトリス（pH9.0）によって中和した。抗体プールを、0.8M硫酸アンモニウムの終濃度で1.6M硫酸アンモニウム溶液を添加することによって、疎水性相互作用クロマトグラフィのために準備し、酢酸を使用して、pHをpH5.0に調整した。35mM酢酸ナトリウム、0.8M硫酸アンモニウム（pH5.0）によるブチルセファロース樹脂の平衡化の後、抗体を樹脂に適用し、平衡化緩衝液によって洗浄し、35mM酢酸ナトリウム（pH5.0）への直線勾配によって溶出させた。（単一特異性または二重特異性）抗体を含有している画分をプールし、20mMヒスチジン、140mM NaCl（pH6.0）によって平衡化されたSuperdex 200 26/60 GL（GE Healthcare,Sweden）カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィによってさらに精製した。（単一特異性または二重特異性）抗体を含有している画分をプールし、Vivaspin限外ろ過装置（Sartorius Stedim Biotech S.A.,France）を使用して、必要とされた濃度に濃縮し、-80℃で保管した。
表：二重特異性＜VEGF-ANG-2＞抗体の収量
Figure 2017508726
各精製工程の後に、マイクロフルイディックLabchipテクノロジー（Caliper Life Science,USA）を使用したCE-SDSによって、純度および抗体完全性を分析した。5μLのタンパク質溶液を、製造業者の説明書に従って、HT Protein Express Reagent Kitを使用して、CE-SDS分析のために準備し、HT Protein Express Chipを使用して、Labchip GXII系において分析した。データをLabchip GXソフトウェアを使用して分析した。
表：CE-SDSによって決定された異なる連続精製工程による典型的な副生成物の除去
Figure 2017508726
抗体試料の凝集物含量を、25℃で、2xPBS（20mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、274mM NaCl、および5.4mM KCl（pH7.4））ランニング緩衝液で、Superdex 200分析用サイズ排除カラム（GE Healthcare,Sweden）を使用して、高速SECによって分析した。25μgのタンパク質を、0.75mL/分の流速でカラムに注入し、均一濃度で50分にわたり溶出させた。
同様に、抗VEGF/ANG2抗体、VEGF/ANG2-0012およびVEGF/ANG2-0201を調製し、以下の収率で精製した：
Figure 2017508726
IHH-AAA変異およびSPLE変異を有する抗VEGF/ANG2二重特異性抗体抗VEGF/ANG2 CrossMAb IgG4（SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45）、IHH-AAA変異を有する抗VEGF/ANG2 OAscFab IgG1（SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48）、IHH-AAA変異およびSPLE変異を有する抗VEGF/ANG2 OAscFab IgG4（SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51）、HHY-AAA変異およびP329G LALA変異を有する抗VEGF/ANG2 CrossMab IgG1（SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41）、HHY-AAA変異およびSPLE変異を有する抗VEGF/ANG2 CrossMab IgG4（SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45）、HHY-AAA変異を有する抗VEGF/ANG2 OAscFab IgG1（SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:48）、ならびにHHY-AAA変異およびSPLE変異を有する抗VEGF/ANG2 OAscFab IgG4（SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:51）、ならびに抗IGF-1R単一特異性抗体、抗IGF-1R野生型（SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89）、IHH-AAA変異を有する抗IGF-1R IgG1（SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90）、YTE変異を有する抗IGF-1R IgG1（SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:91）、KiH変異を有する抗IGF-1R IgG1野生型（SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93）、KiH変異およびホール鎖におけるIHH-AAA変異を有する抗IGF-1R IgG1（SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95）、KiH変異およびホール鎖におけるHHY-AAA変異を有する抗IGF-1R IgG1（SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97）、KiH変異およびYTE変異を有する抗IGF-1R IgG1（SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99）、KiH変異およびDDD変異を有する抗IGF-1R IgG1（SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101）、ならびにHHY-AAA変異を有する抗IGF-1R IgG1（SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:112）も、同様に調製し、精製することが可能である。
実施例2
分析論および開発可能性
小規模なDLSに基づく粘度測定
本質的に（He,F.et al.,Analytical Biochemistry 399(2009)141-143）に記載されるように、粘度測定を実施した。簡単に説明すると、試料を、200mMアルギニンコハク酸エステル（pH5.5）中の様々なタンパク質濃度に濃縮した後、ポリスチレンラテックスビーズ（300nm直径）およびポリソルベート20（0.02％v/v）を添加した。試料を0.4μmフィルタプレートを通した遠心分離によって光学384穴プレートへ移し、パラフィン油によって覆った。ラテックスビーズの見かけの直径を、25℃で、動的光散乱によって決定する。溶液の粘度を、η＝η0（rh/rh,0）（η：粘度；η0：水の粘度；rh：ラテックスビーズの見かけの水力学的半径；rh,0：水中でのラテックスビーズの水力学的半径）として計算することができる。
同一濃度での様々な試料の比較を可能にするため、粘度-濃度データをMooney式（式1）（Mooney,M.,Colloid.Sci.,6(1951)162-170；Monkos,K.,Biochem.Biophys.Acta 304(1997)1339）に適合させ、それに従ってデータを内挿した。
Figure 2017508726
（S：タンパク質の水力学的相互作用パラメータ；K：自己集合因子；Φ：溶解したタンパク質の体積分率）
結果は図2に示される：Fc領域にIHH-AAA変異を有するVEGF/ANG2-0016は、Fc領域にIHH-AAA変異を有しないVEGF/ANG2-0015と比較して、全ての測定された温度で、より低い粘度を示す。
DLS凝集開始温度
試料を、20mMヒスチジン／ヒスチジン塩酸塩、140mM NaCl（pH6.0）中の1mg/mLの濃度で調製し、0.4μmフィルタプレートを通した遠心分離によって光学384穴プレートへ移し、パラフィン油によって覆う。試料を25℃から80℃まで0.05℃/分の速度で加熱しながら、水力学的半径を動的光散乱によって繰り返し測定する。凝集開始温度は、水力学的半径が増加し始める温度として定義される。結果は図3に示される。図3に、IHH-AAA変異を有しないVEGF/ANG2-0015およびFc領域にIHH-AAA変異を有するVEGF/ANG2-0016の凝集が示される。VEGF/ANG2-0016は、61℃という凝集開始温度を示し、IHH-AAA変異を有しないVEGF/ANG2-0015は、60℃という開始温度を示した。
DLS時間経過
試料を、20mMヒスチジン／ヒスチジン塩酸塩、140mM NaCl（pH6.0）中の1mg/mLの濃度で調製し、0.4μmフィルタプレートを通した遠心分離によって光学384穴プレートへ移し、パラフィン油によって覆う。試料を145時間まで50℃の一定温度で維持しながら、水力学的半径を動的光散乱によって繰り返し測定する。この実験において、高温でのネイティブの折り畳まれていないタンパク質の凝集傾向は、経時的な平均粒子直径の増加をもたらすであろう。凝集物は散乱光強度に不釣り合いに大きく寄与するため、このDLSに基づく方法は凝集物について極めて高感度である。50℃（凝集開始温度に近い温度、上記を参照すること）で145時間後ですら、VEGF/ANG2-0015およびVEGF/ANG2-0016の両方について、0.5nm未満の平均粒子直径の増加しか見出されなかった。
100mg/mLでの40℃での7日間の保管
試料を、200mMアルギニンコハク酸（pH5.5）中の100mg/mLの終濃度に濃縮し、滅菌ろ過し、7日間40℃で静置保管する。保管の前後に、高分子量種および低分子量種（それぞれHMWおよびLMW）の含量を、サイズ排除クロマトグラフィによって決定する。保管された試料と調製直後に測定された試料との間のHMW含量およびLMW含量の差を、それぞれ、「HMW増加」および「LMW増加」として報告する。結果は、下記の表および図4に示され、それらは、（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015が、（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016と比較して、より高いメインピーク低下およびより高いHMW増加を示すことを示している。驚くべきことに、（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016は、（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015と比較して、より低い凝集傾向を示した。
表：40℃での7日後のメインピーク、HMWピーク、およびLMWピークの差
Figure 2017508726
抗VEGF/ANG2二重特異性抗体の機能分析を、25℃でBIAcore（登録商標）T100またはT200装置（GE Healthcare）を使用して、表面プラズモン共鳴（SPR）によって査定した。BIAcore（登録商標）系は、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。SPRテクノロジーは、金によってコーティングされたバイオセンサーチップの表面に近い屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、溶液中の注入された分析物との固定化されたリガンドの相互作用によって引き起こされた表面上の質量変化を示す。分子が表面上の固定化されたリガンドに結合する場合、質量は増加し、逆に、固定化されたリガンドからの分析物の解離の場合には質量が減少する（複合体解離を反映する）。SPRは、リガンド／分析物結合の連続的なリアルタイムモニタリングを可能にし、従って、会合速度定数（ka）、解離速度定数（kd）、および平衡定数（KD）の決定を可能にする。
実施例3
VEGF、ANG2、FcγR、およびFcRnとの結合
異種間交差反応性の査定を含むVEGFアイソフォームの動力学的親和性
およそ12,000レゾナンスユニット（RU）のキャプチャー系（10μg/mLヤギ抗ヒトF(ab) '2；オーダーコード：28958325；GE Healthcare Bio-Sciences AB,Sweden）を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、pH5.0で、CM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）にカップリングした。試料および系の緩衝液は、PBS-T（0.05％Tween20を含む10mMリン酸緩衝生理食塩水）（pH7.4）であった。フローセルを25℃に設定し、サンプルブロックを12℃に設定し、ランニング緩衝液によって2回プライムを行った。5μL/分の流速で30秒間50nM溶液を注入することによって、二重特異性抗体を捕獲した。1:3希釈の300nMから開始して30μL/分の流速で300秒間溶液中の様々な濃度でヒトhVEGF121、マウスmVEGF120、またはラットrVEGF164を注入することによって、会合を測定した。解離相を1200秒までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液への切り替えによって誘発した。30μL/分の流速でグリシン（pH2.1）溶液で60秒間洗浄することによって、表面を再生させた。ヤギ抗ヒトF(ab')2表面から入手されたレスポンスを差し引くことによって、バルク屈折率差を補正した。ブランク注入も差し引く（＝二重参照）。見かけのKDおよびその他の動力学的パラメータの計算のため、ラングミュア1:1モデルを使用した。結果は以下に示される。
異種間交差反応性の査定を含むANG2溶液親和性
溶液親和性は、平衡混合物中の遊離の相互作用パートナーの濃度を決定することによって、相互作用の親和性を測定する。溶液親和性アッセイは、一定濃度に維持された抗VEGF/ANG2抗体の変動する濃度のリガンド（＝ANG2）との混合を含む。最大の可能なレゾナンスユニット（例えば、17,000レゾナンスユニット（RU））の抗体を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用して、pH5.0で、CM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）表面上に固定化した。試料および系の緩衝液は、HBS-P（pH7.4）であった。フローセルを25℃に設定し、サンプルブロックを12℃に設定し、ランニング緩衝液によって2回プライムを行った。較正曲線を生成するため、増加する濃度のANG2を、固定化された抗VEGF/ANG2抗体を含有しているBIAcoreフローセルへ注入した。結合したANG2の量をレゾナンスユニット（RU）として決定し、濃度に対してプロットした。各リガンドの溶液（抗VEGF/ANG2抗体について、0〜200nMの11種の濃度）を、10nM ANG2と共にインキュベートし、室温で平衡に達しさせた。既知量のANG2を含む溶液の応答を測定する前後に生成された較正曲線から、遊離のANG2濃度を決定した。遊離のANG2濃度をy軸として使用して、阻害のために使用された抗体の濃度をx軸として使用して、Model 201を使用したXLfit4（IDBSソフトウェア）によって、4パラメータフィットを設定した。この曲線の屈曲点を決定することによって、親和性を計算した。30μL/分の流速で、30秒間、0.85％H3PO4溶液によって1回洗浄することによって、表面を再生させた。ブランクカップリング表面から入手された応答を差し引くことによって、バルク屈折率差を補正した。結果は、以下に示される。
FcRn定常状態親和性
FcRn測定について、二重特異性抗体を相互に比較するため、定常状態親和性を使用した。ヒトFcRnをカップリング緩衝液（10μg/mL、酢酸Na、pH5.0）で希釈し、200RUの最終応答で、BIAcoreウィザードを使用して、標的型固定化手法によって、C1-Chip（GE Healthcare BR-1005-35）上に固定化した。フローセルを25℃に設定し、サンプルブロックを12℃に設定し、ランニング緩衝液によって2回プライムを行った。試料および系の緩衝液は、PBS-T（0.05％Tween20を含む10mMリン酸緩衝生理食塩水）（pH6.0）であった。各抗体についての異なるIgG濃度を査定するため、62.5nM、125nM、250nM、および500nMの濃度を調製した。流速を30μL/分に設定し、180秒の会合時間を選んで、異なる試料をチップ表面へ連続的に注入した。30μL/分の流速で60秒間注入されたPBS-T（pH8）によって表面を再生させた。ブランク表面から入手された応答を差し引くことによって、バルク屈折率差を補正した。緩衝液注入も差し引く（＝二重参照）。定常状態親和性の計算のため、BIA-Evaluationソフトウェアからの方法を使用した。簡単に説明すると、分析された濃度に対してRU値をプロットし、用量応答曲線を得た。2パラメータフィットに基づき、上方漸近線を計算し、最大半量のRU値の決定を可能にし、従って、親和性の決定を可能にする。結果は、図5および以下の表に示される。同様に、カニクイザル、マウス、およびウサギのFcRnに対する親和性を決定することができる。
FcγRIIIa測定
FcγRIIIa測定のため、直接結合アッセイを使用した。およそ3,000レゾナンスユニット（RU）のキャプチャー系（1μg/mL Penta-His；Qiagen）を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、pH5.0で、CM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）にカップリングした。試料および系の緩衝液はHBS-P+（pH7.4）であった。フローセルを25℃に設定し、サンプルブロックを12℃に設定し、ランニング緩衝液によって2回プライムを行った。FcγRIIIa-His-受容体を、5μL/分の流速で60秒間100nM溶液を注入することによって捕獲した。30μL/分の流速で、180秒間、100nMの二重特異性抗体または単一特異性対照抗体（サブクラスIgG1についての抗ジゴキシゲニン抗体およびIgG4サブクラス抗体）の注入によって、結合を測定した。30μL/分の流速でグリシン（pH2.5）溶液によって120秒洗浄することによって、表面を再生させた。FcγRIIIa結合はラングミュア1:1モデルと異なるため、結合／非結合のみは、このアッセイによって決定されなかった。類似した様式で、FcγRIaおよびFcγRIIaの結合を決定することができる。結果は、図6に示され、それは、変異P329G LALAの導入によって、もはやFcγRIIIaとの結合が検出され得ないことを示している。
VEGFおよびANG2の抗VEGF/ANG2抗体との独立した結合の査定
およそ3,500レゾナンスユニット（RU）のキャプチャー系（10μg/mLヤギ抗ヒトIgG；GE Healthcare Bio-Sciences AB,Sweden）を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、pH5.0で、CM4チップ（GE Healthcare BR-1005-34）にカップリングした。試料および系の緩衝液は、PBS-T（0.05％Tween20を含む10mMリン酸緩衝生理食塩水）（pH7.4）であった。フローセルの温度を25℃に設定し、サンプルブロックを12℃に設定した。捕獲前に、ランニング緩衝液によって2回フローセルのプライムを行った。
5μL/分の流速で60秒間10nM溶液を注入することによって、二重特異性抗体を捕獲した。各リガンドの二重特異性抗体との独立した結合を、連続的にまたは同時に添加された（30μL/分の流速）各リガンドについての活性結合能力を決定することによって分析した：
1.180秒間の200nMの濃度のヒトVEGFの注入（単一の抗原の結合を同定する）。
2.180秒間の100nMの濃度のヒトANG2の注入（単一の抗原の結合を同定する）。
3.180秒間の200nMの濃度のヒトVEGFの注入の後、180秒間の100nMの濃度のヒトANG2の付加的な注入（VEGFの存在下でのANG2の結合を同定する）。
4.180秒間の100nMの濃度のヒトANG2の注入の後、200nMの濃度のヒトVEGFの付加的な注入（ANG2の存在下でのVEGFの結合を同定する）。
5.180秒間の200nMの濃度のヒトVEGFおよび100nMの濃度のヒトANG2の同時注入（VEGFおよびANG2の同時の結合を同定する）。
30μL/分の流速で3M MgCl2溶液によって60秒間洗浄することによって表面を再生させた。ヤギ抗ヒトIgG表面から入手された応答を差し引くことによって、バルク屈折率差を補正した。
アプローチ3、4、および5の得られた最終シグナルが、アプローチ1および2の個々の最終シグナルの合計に等しいかまたは類似している場合、二重特異性抗体は、両方の抗原に互いに独立に結合することができる。結果は、以下の表に示され、両方の抗体、VEGF/ANG2-0016、VEGF/ANG2-0012が、VEGFおよびANG2に互いに独立に結合することができることが示されている。
VEGFおよびANG2の抗VEGF/ANG2抗体との同時結合の査定
最初に、およそ1,600レゾナンスユニット（RU）のVEGF（20μg/mL）を、GE Healthcareによって供給されたアミンカップリングキットを使用することによって、pH5.0で、CM4チップ（GE Healthcare BR-1005-34）にカップリングした。試料および系の緩衝液は、PBS-T（0.05％Tween20を含む10mMリン酸緩衝生理食塩水）（pH7.4）であった。フローセルを25℃に設定し、サンプルブロックを12℃に設定し、ランニング緩衝液によって2回プライムを行った。第2に、二重特異性抗体の50nM溶液を、30μL/分の流速で180秒間注入した。第3に、hANG2を、30μL/分の流速で180秒間注入した。hANG2の結合応答は、VEGFに結合した二重特異性抗体の量から依存し、同時結合を示す。30μL/分の流速で0.85％H3PO4溶液による60秒間の洗浄によって表面を再生させた。同時結合は、既にVEGFと結合している抗VEGF/ANG2抗体へのhANG2の付加的な特異的結合シグナルによって示される。両方の二重特異性抗体VEGF/ANG2-0015およびVEGF/ANG2-0016について、VEGFおよびANG2の抗VEGF/ANG2抗体との同時結合が検出され得る（示されないデータ）。
表：結果：異なる種に由来するVEGFアイソフォームに対する動力学的親和性
Figure 2017508726
表：結果：ANG2に対する溶液親和性
Figure 2017508726
表：結果：抗VEGF/ANG2抗体のFcRnに対する親和性
Figure 2017508726
表：結果：FcγRI〜IIIaとの結合
Figure 2017508726
表：結果：VEGFおよびANG2の抗VEGF/ANG2抗体との独立した結合
Figure 2017508726
実施例4
質量分析
このセクションは、正確な組み立てを強調した抗VEGF/ANG2抗体の特徴決定を記載する。完全なまたはIdeS（化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）のIgG分解酵素）によって消化された脱グリコシル抗VEGF/ANG2抗体のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）によって、予想された一次構造を確認した。100μgの精製された抗体を、100mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4（pH7.1）において、2μg IdeSプロテアーゼ（Fabricator）と共にインキュベートすることによって、37℃で5時間、IdeS消化を実施した。その後、1mg/mLのタンパク質濃度で、16時間まで、37℃で、100mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4（pH7.1）において、N-グリコシダーゼF、ノイラミニダーゼ、およびO-グリコシダーゼ（Roche）によって抗体を脱グリコシルし、その後、Sephadex G25カラム（GE Healthcare）でのHPLCを介して脱塩した。全質量を、TriVersa NanoMateソース（Advion）が装備されたmaXis 4G UHR-QTOF MS系（Bruker Daltonik）でのESI-MSを介して決定した。
IdeSによって消化された脱グリコシル分子（下記の表）または完全脱グリコシル分子について入手された質量（下記の表）は、2本の異なる軽鎖LCANG2およびLCルセンティスならびに2本の異なる重鎖HCANG2およびHCルセンティスからなる抗VEGF/ANG2抗体についてのアミノ酸配列から推定された予測質量に相当する。
表：脱グリコシルIdeS消化二重特異性抗VEGF/ANG2抗体（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0201および（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0012の質量
Figure 2017508726
表：脱グリコシル抗VEGF/ANG2抗体（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016および（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015の質量
Figure 2017508726
実施例5
FcRnクロマトグラフィ
ストレプトアビジンセファロースへのカップリング：
1グラムのストレプトアビジンセファロース（GE Healthcare）を、ビオチン化され透析された受容体に添加し、振とうしながら2時間インキュベートした。受容体によって誘導体化されたセファロースを、1mL XKカラム（GE Healthcare）に充填した。
FcRnアフィニティカラムを使用したクロマトグラフィ：
条件：
カラム寸法：50mm x 5mm
ベッド高：5cm
負荷：50μgの試料
平衡化緩衝液：pH5.5に調整された150mM NaClを含む20mM MES
溶出緩衝液：pH8.8に調整された150mM NaClを含む20mMトリス/HCl
溶出：7.5CV平衡化緩衝液、30CVで100％溶出緩衝液へ、10CV溶出緩衝液
ヒトFcRnアフィニティカラムクロマトグラフィ
以下の表に、ヒトFcRnを含むアフィニティカラムにおける抗VEGF/ANG2抗体の保持時間にが与えられる。データは上記の条件を使用して入手された。
表：結果：抗VEGF/ANG2抗体の保持時間
Figure 2017508726
実施例6
IHH-AAA変異を有する抗体の薬物動態学的（PK）特性
ヒトFcRnについてトランスジェニックのFcRnマウスによるPKデータ
生存期：
研究は、雌C57BL/6Jマウス（バックグラウンド）；マウスFcRn欠損であるが、ヒトFcRnについてヘミ接合性トランスジェニック（huFcRn、系統276-/tg）を含んでいた。
パート1：
全てのマウスの右眼に、2μL/動物の適切な溶液、即ち、21μgの化合物/動物（（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015）または23.6μgの化合物/動物（（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016）を、1回、硝子体内注射した。
マウスを6匹ずつの2群に分割した。投薬から2時間後、24時間後、および96時間後に群1から、7時間後、48時間後、および168時間後に群2から、血液試料を採取する。
マウスの右眼の硝子体への注射は、World Precision Instruments,Inc.（Berlin,Germany）のナノリットル注射のためのNanoFil Microsyringe系を使用することによって実施された。マウスに2.5％イソフルランによって麻酔をかけ、マウス眼の可視化のため、40倍倍率のLeica MZFL 3顕微鏡およびLeica KL 2500 LCD照明によるリングライトを使用した。その後、2μLの化合物を35ゲージ針を使用して注射した。
血清中の化合物レベルの決定のため、各動物から反対側の眼の球後静脈叢を介して血液を収集した。
3分間の4℃での遠心分離（9,300xg）によって、RTで1時間の後、血液から少なくとも50μLの血清試料を入手した。血清試料を、遠心分離の直後に凍結させ、分析まで-80℃で凍結保管した。群1の動物の処置された眼を、処置の96時間後に単離し、群2の動物については、処置の168時間後に単離した。試料を分析まで-80℃で凍結保管した。
パート2：
全てのマウスに、尾静脈を介して、200μL/動物の適切な溶液、即ち、21μgの化合物/動物（（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015）または23.6μgの化合物/動物（（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016））を、1回、静脈内注射した。
マウスを5匹ずつの2群に分割した。投薬の1時間後、24時間後、および96時間後に群1から、7時間後、48時間後、および168時間後に群2から、血液試料を採取する。血液は、血清中の化合物レベルの決定のため、各動物から球後静脈叢を介して収集された。
3分間の4℃での遠心分離（9,300xg）によって、RTで1時間の後、血液から少なくとも50μLの血清試料を入手した。血清試料を遠心分離の直後に凍結させ、分析まで-80℃で凍結保管した。
全眼溶解物（マウス）の調製
実験動物からの全眼の物理化学的崩壊によって眼溶解物を得た。機械的破壊のため、各眼を、円錐底を有する1.5mLのミクロバイアルへ移した。凍結および解凍の後、眼を、1mLの細胞洗浄緩衝液によって1回洗浄した（Bio-Rad,Bio-Plex Cell Lysis Kit,Cat.No.171-304011）。次の工程において、500μLの新鮮に調製された細胞溶解緩衝液を添加し、眼を、1.5mLの組織粉砕乳棒（Kimble Chase,1.5mL pestle,Art.No.749521-1500）を使用して粉砕した。次いで、混合物の凍結および解凍を5回行い、再び粉砕した。残りの組織から溶解物を分離するため、試料を4,500gで4分間遠心分離した。遠心分離後、上清を収集し、定量化ELISAにおけるさらなる分析まで-20℃で保管した。
分析
マウス血清および眼溶解物における抗VEGF/ANG2抗体の濃度を、酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）によって決定した。
マウス血清試料および眼溶解物における抗VEGF/ANG2抗体の定量化のため、キャプチャー抗体および検出抗体として、ビオチン化モノクローナル抗体およびジゴキシゲニル化モノクローナル抗体を使用した標準的な固相連続サンドイッチイムノアッセイを実施した。分析物の二重特異性の完全性を確証するため、ビオチン化キャプチャー抗体は、VEGF結合部位を認識し、ジゴキシゲニル化検出抗体は、分析物のANG2結合部位に結合するであろう。次いで、ストレプトアビジンによってコーティングされたマイクロタイタープレート（SA-MTP）の固相上のキャプチャー抗体、分析物、および検出抗体の結合した免疫複合体を、抗ジゴキシゲニン抗体にカップリングした西洋ワサビペルオキシダーゼによって検出する。SA-MTPから未結合の材料を洗浄し、ABTS基質を添加した後、得されたシグナルは、SA-MTPの固相上に結合した分析物の量に比例する。次いで、平行して分析された標準物質を参照して、試料の測定されたシグナルを濃度に変換することによって、定量化を行う。
第1の工程において、MTPシェーカー上で、500rpmで、1時間、1μg/mLの濃度で、100μL/ウェルのビオチン化キャプチャー抗体溶液（mAb<Id<VEGF>>M-2.45.51-IgG-Bi（DDS）、抗イディオタイプ抗体）によって、SA-MTPをコーティングした。その間に、標準物質、QC試料、および試料を調製した。標準物質およびQC試料を2％血清マトリックスで希釈し；シグナルが標準物質の直線範囲内になるまで、試料を希釈した。
キャプチャー抗体によってSA-MTPをコーティングした後、プレートを、300μL/ウェルの洗浄緩衝液によって3回洗浄した。その後、100μL/ウェルの標準物質、QC試料、および試料をSA-MTPにピペットで移し、500rpmで1時間再びインキュベートした。分析物は、ここで、SA-MTPの固相とキャプチャー抗体を介してそのVEGF結合部位によって結合していた。インキュベーションおよびプレートの洗浄による未結合の分析物の除去の後、100μL/ウェルの第1の検出抗体（mAb<Id-<ANG2>>M-2.6.81-IgG-Dig（XOSu）、抗イディオタイプ抗体）を250ng/mLの濃度でSA-MTPに添加した。再び、プレートをシェーカー上で500rpmで1時間インキュベートした。洗浄の後、100μL/ウェルの第2の検出抗体（pAb<ジゴキシゲニン>S-Fab-POD(poly)）を50mU/mLの濃度でSA-MTPのウェルに添加し、プレートを500rpmで1時間再びインキュベートした。過剰の検出抗体を除去するための最終洗浄工程の後、100μL/ウェルの基質（ABTS）を添加する。抗体-酵素コンジュゲートは、ABTS（登録商標）基質の色反応を触媒する。次いで、シグナルを、405nmの波長（参照波長：490nm（[405/490]nm））でELISAリーダによって測定した。
薬物動態評価
薬物動態評価プログラムWinNonlin（商標）（Pharsight）バージョン5.2.1を使用して、ノンコンパートメント分析によって、薬物動態パラメータを計算した。
結果：
（A）血清濃度
血清濃度についての結果は、以下の表および図7B〜7Cに示される。
表：（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015：硝子体内適用後および静脈内適用後の血清濃度の比較
Figure 2017508726
表：（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016：硝子体内適用後および静脈内適用後の血清濃度の比較
Figure 2017508726
表：（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015および（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016：硝子体内適用後の血清濃度の比較
Figure 2017508726
表：（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015および（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016：静脈内適用後の血清濃度の比較
Figure 2017508726
結果：
（B）左眼および右眼の眼溶解物中の濃度
眼溶解物中の濃度についての結果は、以下の表および図7D〜7Eに示される。
表：右眼への硝子体内適用後の眼溶解物中の（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015の濃度
Figure 2017508726
表：静脈内適用後の眼溶解物中の（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015の濃度
Figure 2017508726
表：右眼への硝子体内適用後の眼溶解物中の（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016の濃度
Figure 2017508726
表：静脈内適用後の眼溶解物中の（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016の濃度
Figure 2017508726
結果の要約：
硝子体内適用後、本明細書において報告される二重特異性抗VEGF/ANG2抗体（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016は、IHH-AAA変異を有しない二重特異性抗VEGF/ANG2抗体VEGF/ANG2-0015と比較して、眼溶解物中の類似した濃度（96時間後および168時間後）を示す。
さらに、硝子体内適用後、本明細書において報告される二重特異性抗VEGF/ANG2抗体（IHH-AAA変異を有する）VEGF/ANG2-0016は、IHH-AAA変異を有しない二重特異性抗VEGF/ANG2抗体VEGF/ANG2-0015と比較して、血清におけるより速いクリアランスおよびより短い半減期も示す。
実施例7
マウス角膜マイクロポケット血管新生アッセイ
それぞれSEQ ID NO:20および21のVEGFに結合するVHおよびVLならびにSEQ ID NO:28および29のANG2に結合するVHおよびVLを有する二重特異性抗VEGF/ANG2抗体の、インビボのVEGFによって誘導される血管新生に対する抗血管新生効果を試験するため、マウス角膜血管新生アッセイを実施した。このアッセイにおいては、VEGFに浸されたNylafloディスクを、角膜縁血管からの固定された距離で、無血管角膜のポケットへ植え込む。発生するVEGF勾配に向かって、角膜に急速に血管が成長する。8〜10週齢の雌Balb/cマウスをCharles River,Sulzfeld,Germanyから購入した。プロトコルは、Rogers,M.S.,et al.,Nat.Protoc.2(2007)2545-2550によって記載された方法に従って修飾される。簡単に説明すると、麻酔下のマウスにおいて、メスおよび鋭利なピンセットを使用して、角膜縁から角膜頂へおよそ1mmで、約500μmの幅を有するマイクロポケットを顕微鏡下で調製する。0.6mmの直径を有するディスク（Nylaflo（登録商標）,Pall Corporation,Michigan）を植え込み、植え込み区域の表面をなめらかにする。ディスクを、対応する増殖因子または媒体において、少なくとも30分間インキュベートする。3日後、5日後、および7日後（あるいは3日後、5日後、または7日後のみ）、眼を写真撮影し、血管応答を測定する。角膜の総面積に対する新血管の面積の百分率を計算することによって、アッセイを定量化する。
ディスクに、300ng VEGFまたは対照としてのPBSを負荷し、7日間植え込む。角膜縁からディスクへの血管の伸長を、3日後、5日後、および／または7日後に経時的にモニタリングする。インビボでのVEGFによって誘導される血管新生に対する抗血管新生効果を試験するため、ディスク植え込みの1日前に、抗体を10mg/kgの用量で静脈内投与する（静脈内適用のため、IHH-AAA変異のみがVEGF/ANG2-0016と異なり、効力を媒介するために同一のVEGFおよびANG2に結合するVHおよびVLを有する血清安定的な（IHH-AAA変異を有しない）VEGF/ANG2-0015が代理として使用される）。対照群の動物は媒体を受容する。適用体積は10mL/kgである。
実施例8
HHY-AAA変異を有する抗体の薬物動態（PK）特性
ヒトFcRnについてトランスジェニックのFcRnマウスによるPKデータ
生存期：
研究は雌C57BL/6Jマウス（バックグラウンド）；マウスFcRn欠損であるが、ヒトFcRnについてヘミ接合性トランスジェニック（huFcRn、系統276-/tg）を含んでいた。
パート1：
全てのマウスの右眼に、IGF-1R 0033、IGF-1R 0035、IGF-1R 0045の適切な溶液（即ち、22.2μg化合物/動物のIGF-1R 0033、24.4μg化合物/動物のIGF-1R 0035、32.0μg化合物/動物のIGF-1R、および32.0μg化合物/動物のIGF-1R 0045）を、1回、硝子体内注射した。
13匹のマウスを、それぞれ6匹および7匹の2群に分割した。投薬後、2時間目、24時間目、および96時間目に群1から、7時間目、48時間目、および168時間目に群2から、血液試料を採取する。
マウスの右眼の硝子体への注射を、World Precision Instruments,Inc.（Berlin,Germany）のナノリットル注射のためのNanoFil Microsyringe系を使用することによって実施した。マウスに2.5％イソフルランによって麻酔をかけ、マウスの眼の可視化のため、40倍倍率のLeica MZFL 3顕微鏡およびLeica KL 2500 LCD照明によるリングライトを使用した。その後、2μLの化合物を35ゲージ針を使用して注射した。
血清中の化合物レベルの決定のため、各動物から反対側の眼の球後静脈叢を介して血液を収集した。
3分間の4℃での遠心分離（9,300xg）によって、RTで1時間の後、血液から少なくとも50μLの血清試料を入手した。血清試料を、遠心分離の直後に凍結させ、分析まで-80℃で凍結保管した。群1の動物の処置された眼を、処置の96時間後に単離し、群2の動物については、処置の168時間後に単離した。試料を分析まで-80℃で凍結保管した。
パート2：
全てのマウスに、尾静脈を介して、IGF-1R 0033、IGF-1R 0035、IGF-1R 0045の適切な溶液（即ち、22.2μg化合物/動物のIGF-1R 0033、24.4μg化合物/動物のIGF-1R 0035、32.0μg化合物/動物のIGF-1R、および32.0μg化合物/動物のIGF-1R 0045）を、1回、静脈内注射した。
12匹のマウスを6匹ずつの2群に分割した。投薬後、1時間目、24時間目、および96時間目に群1から、7時間目、48時間目、および168時間目に群2から、血液試料を採取する。血清中の化合物レベルの決定のため、各動物から球後静脈叢を介して血液を収集した。
RTで1時間後、4℃での3分間の遠心分離（9,300xg）によって、少なくとも50μLの血清試料を血液から入手した。血清試料を遠心分離の直後に凍結させ、分析まで-80℃で凍結保管した。
細胞溶解緩衝液の調製
100μLの因子1、50μLの因子2、および24.73mLの細胞溶解緩衝液（全て、Bio-Rad、Bio-Plex Cell Lysis Kit、カタログ番号171-304011）を注意深く混合し、125μLのPMSF溶液（2.0mLのDMSOで希釈された174.4mgのフェニルメチルスルホニルフルオリド）を添加する。
全眼溶解物（マウス）の調製
実験動物からの全眼の物理化学的崩壊によって眼溶解物を獲得した。機械的破壊のために、各眼を、円錐底を有する1.5mLのミクロバイアルへ移した。解凍の後、眼を、1mLの細胞洗浄緩衝液によって1回洗浄した（Bio-Rad、Bio-Plex Cell Lysis Kit、カタログ番号171-304011）。次の工程において、500μLの新鮮に調製された細胞溶解緩衝液を添加し、眼を、1.5mL組織粉砕乳棒（VWR Int.、商品番号431-0098）を使用して粉砕した。次いで、混合物の凍結および解凍を5回行い、再び粉砕した。残りの組織から溶解物を分離するため、試料を4,500xgで4分間遠心分離した。遠心分離後、上清を収集し、定量化ELISAにおけるさらなる分析まで-20℃で保管した。
分析（血清）
マウス血清試料中の抗体の定量化のため、ビオチン化モノクローナル抗体およびジゴキシゲニン化モノクローナル抗体をキャプチャー抗体および検出抗体として使用した標準的な固相連続サンドイッチイムノアッセイを実施する。血清は、全血液試料体積の約50％を占める。
より詳細には、ヒトIgG（Fab）特異的酵素連結免疫吸着アッセイによってマウス血清試料中の抗体の濃度を決定した。ストレプトアビジンによってコーティングされたマイクロタイタープレートを、アッセイ緩衝液で希釈されたキャプチャー抗体としてのビオチン化抗ヒトFab（κ）モノクローナル抗体M-1.7.10-IgGと共に、撹拌しながら、室温で1時間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水-ポリソルベート20（Tween20）で3回洗浄した後、様々な希釈率の血清試料を添加し、その後、室温で1時間、第2のインキュベーションを行った。3回繰り返し洗浄した後、その後のジゴキシゲニンとコンジュゲートされた抗ヒトFab（CH1）モノクローナル抗体M-1.19.31-IgGとのインキュベーション、その後の西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）とコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーションによって、結合した抗体を検出した。ABTS（2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)；Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany）を、有色反応生成物を形成するためのHRP基質として使用した。得られた反応生成物の吸光度を、405nm（ABTS；参照波長：490nm）で読み取った。
全ての試料、陽性対照試料、および陰性対照試料を反復分析し、提供された抗体標準物に対して較正した。
分析（眼溶解物）
マウス眼溶解物試料中の分析物の濃度を、非GLP条件下で、ELECSYS（登録商標）装置プラットフォーム（Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany）に基づく認定された電気化学発光イムノアッセイ（ECLIA）法を使用して決定した。
未希釈の上清（眼溶解物）を、37℃で、9分間、キャプチャー分子および検出分子と共にインキュベートした。ビオチン化抗ヒトFab（κ）モノクローナル抗体M-1.7.10-IgGを、キャプチャー分子として使用し、ルテニウム(II)トリス(ビスピリジル)3 2+によって標識された抗ヒトFab（CH1）モノクローナル抗体M-1.19.31-IgGを検出のために使用した。ビオチン-ストレプトアビジン相互作用によって予め形成された免疫複合体の結合を可能にするため、ストレプトアビジンによってコーティングされた磁気微粒子を添加し、37℃でさらに9分間インキュベートした。微粒子を電極に磁気的に捕獲し、共反応性トリプロピルアミン（TPA）を使用して化学発光シグナルを生成させた。取得されたシグナルを、光電子増倍管検出器によって測定した。
表：標準的なチャートIGF-1R 0033
Figure 2017508726
表：標準的なチャートIGF-1R 0035
Figure 2017508726
表：標準的なチャートIGF-1R 0045
Figure 2017508726
結果：
（A）血清濃度
血清濃度についての結果は、以下の表および図17に示される。
表：（HHY-AAA変異を有しない）IGF-1R 0033：硝子体内適用後および静脈内適用後の血清濃度の比較（n.d.＝未決定）
Figure 2017508726
表：（一方のFc領域ポリペプチドにHHY-AAA変異を有する）IGF-1R 0035：硝子体内適用後および静脈内適用後の血清濃度の比較
Figure 2017508726
表：（両方のFc領域ポリペプチドにHHY-AAA変異を有する）IGF-1R 0045：硝子体内適用後および静脈内適用後の血清濃度の比較（BLQ＝定量限界未満）
Figure 2017508726
表：1μgの適用された抗体に対して標準化された抗体IGF-1R 0033、IGF-1R 0035、およびIGF-1R 0045の静脈内適用後の血清濃度の比較
Figure 2017508726
結果：
（B）左右の眼の眼溶解物中の濃度
眼溶解物中の濃度についての結果は、以下の表および図18〜20に示される。
表：右眼への硝子体内適用後の眼溶解物中の（HHY-AAA変異を有しない）IGF-1R 0033の濃度
Figure 2017508726
表：静脈内適用後の眼溶解物中の（HHY-AAA変異を有しない）IGF-1R 0033の濃度（BLQ＝定量限界未満）
Figure 2017508726
表：右眼へ硝子体内適用後の眼溶解物中の（一方のFc領域ポリペプチドにHHY-AAA変異を有する）IGF-1R 0035の濃度
Figure 2017508726
表：静脈内適用後の眼溶解物中の（一方のFc領域ポリペプチドにHHY-AAA変異を有する）IGF-1R 0035の濃度（BLQ＝定量限界未満）
Figure 2017508726
表：右眼への硝子体内適用後の眼溶解物中の（両方のFc領域ポリペプチドにHHY-AAA変異を有する）IGF-1R 0045の濃度
Figure 2017508726
表：静脈内適用後の眼溶解物中の（両方のFc領域ポリペプチドにHHY-AAA変異を有する）IGF-1R 0045の濃度（BLQ＝定量限界未満）
Figure 2017508726
表：1μgの適用された抗体に対して基準化された右眼への硝子体内適用後の眼溶解物中のIGF-1R 0033、IGF-1R 0035、およびIGF-1R 0045の濃度
Figure 2017508726
結果のまとめ：
硝子体内適用後、（片側または両側にHHY-AAA変異を有する）本明細書において報告される抗IGF-1R抗体0035および0045は、HHY-AAA変異を有しない抗IGF-1R抗体（IGF-1R 0033）と比較して、類似した眼溶解物中の濃度（96時間後および168時間後）を示す。
さらに、硝子体内適用後、（片側または両側にHHY-AAA変異を有する）本明細書において報告される抗IGF-1R抗体0035および0045は、HHY-AAA変異を有しない抗IGF-1R抗体（IGF-1R 0033）と比較して、血清におけるより速いクリアランスおよびより短い半減期も示す。
上記の本発明は、理解の明確の目的のため、例示および例によってある程度詳細に記載されたが、説明および例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書において引用された全ての特許および科学文献の開示は、参照によってその全体が明示的に組み入れられる。

Claims (19)

  1. N末端からC末端への方向に、1個以上のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分と、免疫グロブリンCH2ドメインと、免疫グロブリンCH3ドメインとを各々含む第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含むポリペプチドであって、
    第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第1および第2のポリペプチドが変異Y436A（EUインデックスによるナンバリング）を含む、ポリペプチド。
  2. 第1および第2のポリペプチドが変異Y436Aを含むことを特徴とする、請求項1記載のポリペプチド。
  3. ヒトFcRnに特異的に結合せず、ブドウ球菌プロテインAに特異的に結合することを特徴とする、請求項1または2記載のポリペプチド。
  4. （a）第1のポリペプチドが変異Y349C、T366S、L368A、およびY407Vをさらに含み、かつ第2のポリペプチドが変異S354CおよびT366Wを含み、かつ／または
    （b）（i）第1および第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、もしくは
    （ii）第1および第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、もしくは
    （iii）第1および第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含むか、もしくは
    （iv）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異H310A、H433A、およびY436Aを含むか、もしくは
    （v）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251D、L314D、およびL432Dを含むか、もしくは
    （vi）第1のポリペプチドが変異I253A、H310A、およびH435Aを含み、かつ第2のポリペプチドが変異L251S、L314S、およびL432Sを含む
    ことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載のポリペプチド。
  5. 免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインがヒトIgG1サブクラスのものであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
  6. 第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが変異L234AおよびL235Aをさらに含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載のポリペプチド。
  7. 免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインがヒトIgG2サブクラスのものであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
  8. 免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリンCH2ドメイン、および免疫グロブリンCH3ドメインがヒトIgG4サブクラスのものであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
  9. 第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが変異S228PおよびL235Eをさらに含むことを特徴とする、請求項1〜4および8のいずれか一項記載のポリペプチド。
  10. 第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが変異P329Gをさらに含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項記載のポリペプチド。
  11. 二重特異性抗体であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載のポリペプチド。
  12. 硝子体内適用のための、請求項1〜11のいずれか一項記載のポリペプチド。
  13. 血管性眼疾患の処置のための、請求項1〜11のいずれか一項記載のポリペプチド。
  14. 請求項1〜11のいずれか一項記載のポリペプチドと、任意で、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤。
  15. 可溶性受容体リガンドの眼から血液眼関門を越えて血液循環への輸送のための、請求項1〜11のいずれか一項記載のポリペプチドの使用。
  16. 1種以上の可溶性受容体リガンドの眼からの除去のための、請求項1〜11のいずれか一項記載のポリペプチドの使用。
  17. 眼疾患の処置において使用するための、請求項1〜11のいずれか一項記載のポリペプチド。
  18. 可溶性受容体リガンドの眼から血液眼関門を越えて血液循環への輸送において使用するための、請求項1〜11のいずれか一項記載のポリペプチド。
  19. 1種以上の可溶性受容体リガンドの眼からの除去において使用するための、請求項1〜11のいずれか一項記載のポリペプチド。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7158626B1 (ja) 2020-09-04 2022-10-21 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｖｅｇｆ－ａ及びａｎｇ２に結合する抗体及び使用方法

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
CN103502271B (zh) 2011-02-28 2016-10-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗原结合蛋白
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
JP6422956B2 (ja) * 2013-10-11 2018-11-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
KR20180050321A (ko) 2015-08-07 2018-05-14 이미지냅 인코포레이티드 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
KR20180101623A (ko) 2016-02-03 2018-09-12 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 Psma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
CA3016563A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
WO2018222901A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
EP3765516A2 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
EP3765517A1 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
DE202019005887U1 (de) 2018-07-03 2023-06-14 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR-Antikörpermoleküle und Verwendungen davon
MX2021004774A (es) * 2018-10-29 2021-08-24 Hoffmann La Roche Formulacion de anticuerpos.
SG11202109061YA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
GB2597851B (en) 2019-02-21 2024-05-29 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
SG11202109122SA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
JP2022522662A (ja) 2019-02-21 2022-04-20 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド Ｔ細胞に結合する多機能性分子および自己免疫障害を処置するためのその使用
JP2022521750A (ja) 2019-02-21 2022-04-12 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
AU2020299024A1 (en) * 2019-07-02 2022-01-20 Telix Pharmaceuticals (Innovations) Pty Ltd Antibodies against CAIX with reduced affinity for the neonatal Fc receptor
WO2021072265A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
EP4084821A4 (en) 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics Inc CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES
CA3180321A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
JP2023542080A (ja) 2020-08-26 2023-10-05 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
WO2022047046A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting trbc1 or trbc2
KR20230074144A (ko) 2020-08-26 2023-05-26 마렝고 테라퓨틱스, 인크. NKp30에 결합하는 항체 분자 및 이의 용도
CN117597359A (zh) 2021-04-08 2024-02-23 马伦戈治疗公司 与tcr结合的多功能分子及其用途
WO2023038548A1 (ru) * 2021-09-08 2023-03-16 Акционерное общество "БИОКАД" Биспецифическое антитело, содержащее гетеродимер на основе мнс белков
CN115873127A (zh) * 2021-11-26 2023-03-31 深圳科兴药业有限公司 重组长效人生长激素融合蛋白及其制备方法和用途
WO2023154822A2 (en) * 2022-02-10 2023-08-17 Kodiak Sciences Inc. Methods of purifying a product
CN117467025B (zh) * 2023-12-28 2024-04-16 上海鼎新基因科技有限公司 一种抗vegf和补体双功能融合蛋白及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013004842A2 (en) * 2011-07-06 2013-01-10 Genmab A/S Antibody variants and uses thereof
WO2014006217A1 (en) * 2012-07-06 2014-01-09 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
AU743758B2 (en) 1997-04-07 2002-02-07 Genentech Inc. Anti-VEGF antibodies
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8034904B2 (en) 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1562972B1 (en) 2002-10-15 2010-09-08 Facet Biotech Corporation ALTERATION OF FcRn BINDING AFFINITIES OR SERUM HALF-LIVES OF ANTIBODIES BY MUTAGENESIS
US6736056B1 (en) 2002-11-15 2004-05-18 A Marek Ken Company Manual ink applicator
AR046071A1 (es) 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
DE602004029581D1 (de) 2003-08-13 2010-11-25 Pfizer Prod Inc Modifizierte humane igf-1r antikörper
EP1670922A2 (en) 2003-10-03 2006-06-21 University of Florida Research Foundation, Incorporated Materials and methods for synthesis of a flavor and aroma volatile in plants
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
AU2004290070A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal Fc receptor (FcRn)-binding polypeptide variants, dimeric Fc binding proteins and methods related thereto
WO2005058967A2 (en) 2003-12-16 2005-06-30 Pierre Fabre Medicament Novel anti-insulin/igf-i hybrid receptor or anti-insulin/igf-i hybrid receptor and igf-ir antibodies and uses thereof
US20050249723A1 (en) 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
WO2006031370A2 (en) 2004-08-19 2006-03-23 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2006039137A1 (en) 2004-10-01 2006-04-13 Wms Gaming Inc. Method and apparatus for serverless storage of information
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
CA2587617C (en) 2004-11-12 2011-02-01 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
PT2028193E (pt) 2005-01-05 2012-06-15 Star Biotech Forschung Entw Gmbh Domínios de imunoglobulina sintéticos com propriedades de ligação modificadas em regiões da molécula diferentes das regiões de determinação de complementaridade
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
CN101410137A (zh) 2006-03-28 2009-04-15 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-igf-1r人单克隆抗体制剂
US20080112961A1 (en) * 2006-10-09 2008-05-15 Macrogenics, Inc. Identification and Engineering of Antibodies with Variant Fc Regions and Methods of Using Same
WO2008048545A2 (en) 2006-10-16 2008-04-24 Medimmune, Llc. Molecules with reduced half-lives, compositions and uses thereof
ES2523915T5 (es) 2006-12-01 2022-05-26 Seagen Inc Agentes de unión a la diana variantes y usos de los mismos
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008114011A2 (en) 2007-03-19 2008-09-25 Medimmune Limited Fc polypeptide variants obtained by ribosome display methodology
EP2155789B1 (en) * 2007-05-01 2013-07-24 Research Development Foundation Immunoglobulin fc libraries
US8048621B2 (en) 2007-10-03 2011-11-01 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
PL2235064T3 (pl) 2008-01-07 2016-06-30 Amgen Inc Sposób otrzymywania cząsteczek przeciwciał z heterodimerycznymi fc z zastosowaniem kierujących efektów elektrostatycznych
EP2274010A1 (en) 2008-04-11 2011-01-19 Biogen Idec MA Inc. Therapeutic combinations of anti-igf-1r antibodies and other compounds
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
AR073829A1 (es) 2008-10-14 2010-12-01 Genentech Inc Variantes de inmunoglobulinas y sus usos.
US8163509B2 (en) 2008-10-20 2012-04-24 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
US8775090B2 (en) 2008-12-12 2014-07-08 Medimmune, Llc Crystals and structure of a human IgG Fc variant with enhanced FcRn binding
PE20120415A1 (es) 2008-12-12 2012-05-09 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
EP2400990A2 (en) 2009-02-26 2012-01-04 OSI Pharmaceuticals, LLC In situ methods for monitoring the emt status of tumor cells in vivo
WO2010112193A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
KR20110124369A (ko) 2009-04-07 2011-11-16 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항­ｅｒｂｂ­3／항­ｃ­ｍｅｔ 항체
KR20120030383A (ko) * 2009-04-22 2012-03-28 메르크 파텐트 게엠베하 변형된 ＦｃＲｎ 결합 자리를 갖는 항체 융합 단백질
EP2437767B1 (en) 2009-06-01 2015-07-08 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives and uses thereof
CN103833855A (zh) 2009-06-26 2014-06-04 瑞泽恩制药公司 容易地分离的具有天然免疫球蛋白形式的双特异性抗体
WO2011003780A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bi-specific digoxigenin binding antibodies
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US10143186B2 (en) 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
EP2542893A2 (en) 2010-03-03 2013-01-09 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
TWI667257B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
WO2011131746A2 (en) 2010-04-20 2011-10-27 Genmab A/S Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
GB201009172D0 (en) 2010-06-01 2010-07-14 Novaucd Process
DE102010032050B4 (de) 2010-07-23 2017-12-21 Continental Automotive Gmbh Düsenkörper mit Sackloch
EP2635607B1 (en) 2010-11-05 2019-09-04 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
WO2012083370A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Cephalon Australia Pty Ltd Modified antibody with improved half-life
SG10201609665PA (en) 2011-02-25 2017-01-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd FcɣRIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
CA2830254C (en) 2011-03-16 2019-09-10 Amgen Inc. Fc variants
ES2692268T3 (es) 2011-03-29 2018-12-03 Roche Glycart Ag Variantes de Fc de anticuerpo
DK2698431T3 (da) * 2011-03-30 2020-11-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Opretholdelse af antigen-bindende molekyler i blodplasma og fremgangsmåde til modifikation af immunogenicitet
ES2857734T3 (es) 2011-08-23 2021-09-29 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno activadoras de linfocitos T biespecíficas
MX2014002996A (es) 2011-09-23 2014-05-28 Roche Glycart Ag Anticuerpos anti - egfr/anti - igf-1r bisespecificos.
SI2771364T1 (sl) 2011-10-27 2019-10-30 Genmab As Produkcija heterodimernih proteinov
RS57414B1 (sr) 2012-03-16 2018-09-28 Regeneron Pharma Antitela sa lakim lancem konstruisanim sa histidinom i genetički modifikovani glodari za generisanje istih
GB201208370D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Antibodies
EP3495387B1 (en) 2012-07-13 2021-09-01 Roche Glycart AG Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
BR112015004119A2 (pt) 2012-08-31 2017-08-08 Univ North Carolina Chapel Hill anticorpos monoclonais para melhorar ou inibir o fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (igf-1)
IN2015MN00139A (ja) * 2012-09-25 2015-10-16 Glenmark Pharmaceuticals Sa
SG10201810481UA (en) * 2013-04-29 2018-12-28 Hoffmann La Roche Fcrn-binding abolished anti-igf-1r antibodies and their use in the treatment of vascular eye diseases
EP3878866A1 (en) * 2013-04-29 2021-09-15 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-receptor binding modified asymmetric antibodies and methods of use
WO2014177460A1 (en) 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use
GB201320066D0 (en) 2013-11-13 2013-12-25 Ucb Pharma Sa Biological products

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013004842A2 (en) * 2011-07-06 2013-01-10 Genmab A/S Antibody variants and uses thereof
WO2014006217A1 (en) * 2012-07-06 2014-01-09 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NATURE BIOTECHNOLGY, 1998, VOL. 16, PP. 677-681, JPN6018046000, ISSN: 0003925684 *
SHIELDS R L: "HIGH RESOLUTION MAPPING OF THE BINDING SITE ON HUMAN IGG1 FOR FCγRI, FC GAMMA RII, 以下備考", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. VOL:276, NR:9, JPN5017000068, 2 March 2001 (2001-03-02), US, pages 6591 - 6604, ISSN: 0003925685 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7158626B1 (ja) 2020-09-04 2022-10-21 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｖｅｇｆ－ａ及びａｎｇ２に結合する抗体及び使用方法
JP2022545849A (ja) * 2020-09-04 2022-10-31 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｖｅｇｆ－ａ及びａｎｇ２に結合する抗体及び使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015107015A1 (en) 2015-07-23
RU2016133347A3 (ja) 2018-08-09
EP3094648A1 (en) 2016-11-23
US20190127457A1 (en) 2019-05-02
BR112016014969A2 (pt) 2018-01-23
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US20230183330A1 (en) 2023-06-15
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KR20160104636A (ko) 2016-09-05
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RU2698969C2 (ru) 2019-09-02
EP3842455A1 (en) 2021-06-30
JP6778110B2 (ja) 2020-10-28
RU2016133347A (ru) 2018-02-20
US20170044246A1 (en) 2017-02-16
CN105916880A (zh) 2016-08-31
US11555067B2 (en) 2023-01-17
JP2021008508A (ja) 2021-01-28

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