CN110997921A - 在蛋白质结构上呈递环肽的超通用方法 - Google Patents
在蛋白质结构上呈递环肽的超通用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种方法，其是在具有环结构的蛋白质上呈递环肽的方法，所述环肽具有用于形成分子内环状结构的化学交联结构，所述方法包括下述步骤：通过将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基，使环肽与具有环结构的蛋白质融合。
Description
技术领域
本发明涉及在具有环结构的蛋白质上呈递环肽的方法等。
背景技术
出于使蛋白质的活性提高这一目的，已知存在修饰蛋白质的氨基酸残基，或者在蛋白质中导入其他肽结构的技术。
专利文献1公开了一种嵌合多肽，其是包含生物活性得以提高的、在内部插入有生物活性异源肽序列的血清白蛋白而成的。
专利文献2公开了在修饰基于FnIII的多肽的至少一个环区域的基础上修饰FnIII多肽的β折叠，改善了基于FnIII的结合分子与靶分子之间的结合能力。
此外，专利文献3公开了将1个以上生物活性肽重组到抗体蛋白的Fc结构域中而得到的分子，具体而言，在Fc结构域的环区域中相对于相邻的氨基酸残基插入生物活性肽。
与专利文献3同样地，专利文献4也记载了经修饰的Fc分子，但是，公开的Fc分子具有通过缀合位点的氨基酸残基的侧链共价键合的附加功能部分。具体而言，公开了缀合位点的氨基酸残基是半胱氨酸残基。
另外，专利文献5和6公开了对免疫球蛋白的结构环进行一处以上的修饰来赋予免疫球蛋白新的结合能力的技术。
在专利文献2中，从向FnIII的环结构部分插入随机化的肽序列而得到的文库中获得与靶标结合的活性物质。
此外，在专利文献5和6中，向免疫球蛋白的特定结构环的一处中插入随机化的肽序列而非已经获得的肽，从该文库中筛选具有与靶标结合的活性的活性物质。
也就是说，在这些现有技术中，仅仅获得了插入随机化的肽的文库，对于通过筛选文库鉴定出已被插入的肽部分而言，并不清楚这些肽是否可以单独维持与靶标的结合活性。换言之，被插入的肽是为了文库化而被插入的序列，原本即未期待其具有结合活性。此外，蛋白质的互换性(例如，即使将在免疫球蛋白上呈递的肽重新插入到FnIII中、也仍然能维持其原本的活性)是不清楚的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2005-505243号公报
专利文献2：日本特表2013-593362号公报
专利文献3：日本特表2008-514201号公报
专利文献4：日本特表2009-504164号公报
专利文件5：日本特表2009-541361号公报
专利文件6：日本特表2009-540837号公报
发明内容
发明要解决的课题
本发明要解决的问题是提供一种以具有环结构的蛋白质作为支架，在保持环肽所具有的结构和活性的状态下，在蛋白质上呈递环肽的方法。
用于解决课题的手段
本发明如下所述。
(1)一种方法，其是在具有环(loop)结构的蛋白质上呈递环肽的方法，所述环肽具有用于形成分子内环状结构的化学交联结构，所述方法包括下述步骤：通过将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基，使环肽与具有环结构的蛋白质融合。
(2)根据(1)所述的方法，其中，构成环结构的两个氨基酸残基的Cα原子的间距在
的范围内。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，具有环结构的蛋白质在构成环结构的两个氨基酸残基之间具有1至15个氨基酸残基。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的方法，其中，环肽由蛋白质型氨基酸和/或非蛋白质型氨基酸组成。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的方法，其中，化学交联结构包括硫醚键或二硫键。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的方法，其中，将两个以上的环肽分别与具有多个环结构的蛋白质的不同环结构融合。
(7)根据(6)所述的方法，其中，两个以上的环肽具有相同的氨基酸序列。
(8)根据(6)所述的方法，其中，两个以上的环肽具有不同的氨基酸序列。
(9)根据(1)至(8)中任一项所述的方法，其中，当将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基时，通过接头序列而用构成环结构的两个氨基酸残基替换环肽的化学交联结构。
(10)根据(1)至(9)中任一项所述的方法，其中，在包含除构成环结构的两个氨基酸以外的构成环结构的氨基酸序列的状态下，用构成环结构的两个氨基酸残基替换环肽的化学交联结构。
(11)一种制备修饰的蛋白质的方法，其是使环肽与具有环结构的蛋白质融合从而在蛋白质上呈递所述环肽的修饰的蛋白质的制备方法，其中，
环肽具有用于形成分子内环状结构的化学键结构，
从环肽的氨基酸序列中，选择要在蛋白质上呈递的部分氨基酸序列，并选择与所述部分氨基酸序列相对应的碱基序列，
选择与构成具有环结构的蛋白质的环结构的两个氨基酸残基相对应的碱基序列，根据需要删除存在于所选择的该碱基序列之间的碱基，准备具有插入与所选择的环肽的部分氨基酸序列相对应的碱基序列重组而成的碱基序列的核酸，
翻译所述核酸。
(12)根据(11)所述的方法，其中，构成环结构的两个氨基酸残基的Cα原子的间距在
的范围内。
(13)根据(11)或(12)所述的方法，其中，具有环结构的蛋白质在构成环结构的两个氨基酸残基之间具有1至15个氨基酸残基。
(14)根据(11)至(13)中任一项所述的方法，其中，所述环肽由蛋白质型氨基酸和/或非蛋白质型氨基酸组成。
(15)根据(11)至(14)中任一项所述的方法，其中，所述化学交联结构包括硫醚键或二硫键。
(16)根据(11)至(15)中任一项所述的方法，其中，将两个以上的环肽分别与具有多个环结构的蛋白质的不同环结构融合。
(17)根据(16)所述的方法，其中，两个以上的环肽具有相同的氨基酸序列。
(18)根据(16)所述的方法，其中，两个以上的环肽具有不同的氨基酸序列。
(19)根据(11)至(18)中任一项所述的方法，其中，当将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基时，通过接头序列用构成环结构的两个氨基酸残基替换环肽的化学交联结构。
(20)根据(11)至(19)中任一项所述的方法，其中，在包含除构成环结构的两个氨基酸以外的构成环结构的氨基酸序列的状态下，用构成环结构的两个氨基酸残基替换环肽的化学交联结构。
(21)修饰的蛋白质，其是通过(11)至(20)中任一项所述的制备方法而得到的。
发明效果
通过本发明，可以提供以具有环结构的蛋白质作为支架，在保持环肽所具有的结构和活性的状态下，在蛋白质上呈递环肽的方法。
附图说明
图1显示了实施例中使用的环肽的结构。在表示环肽的通式中，S表示来自Cys的巯基的硫原子。Xaa表示任意的氨基酸，且S是任意的0以上的整数。可变区(variable region)利用单字母表示构成环肽内部结构的氨基酸序列，用小写字母表示的氨基酸(w、y等)表示D型氨基酸(D-Trp、D-Tyr)。
图2显示了用作支架蛋白的纤连蛋白的第十III型重复结构域的三维结构。第十III型重复结构域中的环结构由作为BN的Val1490、作为BC的Ser1499和它们之间的8个氨基酸残基的环区域组成。
图3显示了融合环肽后的环部分的氨基酸序列，其是使用人纤连蛋白的第十III型重复结构域作为支架蛋白时的融合蛋白中的部分结构。Val1490(BN)和Ser1499(BC)之间的序列表示插入序列。在插入序列中，TGR和SPA表示来自人纤连蛋白的第十III型重复结构域的氨基酸序列，带下划线的部分表示源自环肽的氨基酸序列，灰色字母表示接头序列。
图4显示了自Expi293F细胞表达、分泌的Fn10-Fc及其环肽融合蛋白的SDS-PAGE。
图5显示了环肽融合蛋白(Fn10-Fc变体)和结合分子之间的相互作用结果。
图6显示了用作支架蛋白的人IgG来源的Fc区的立体结构。如L1位点至L8位点所示，在每个位点中，人IgG来源的Fc区中的环结构分别由以BN表示的氨基酸残基、以BC表示的氨基酸残基以及各自存在于二者之间的1-3个氨基酸残基的环区域组成。
图7显示了融合环肽后的环部分的氨基酸序列，其是使用源自人IgG的Fc区域作为支架蛋白时的融合蛋白中的部分结构。分别用L1至L3位点变体表示在Fc区的铰链区附近“上方”的L1至L3位点中融合环肽的融合蛋白。带下划线的部分表示源自环肽的氨基酸序列，灰色字母表示接头序列。
图8显示了融合环肽后的环部分的氨基酸序列，其是使用源自人IgG的Fc区域作为支架蛋白时的融合蛋白中的部分结构。分别用L4至L6位点变体表示在Fc区的“底部”的L4至L6位点中融合环肽的融合蛋白。带下划线的部分表示源自环肽的氨基酸序列，灰色字母表示接头序列。
图9显示了融合环肽后的环部分的氨基酸序列，其是使用源自人IgG的Fc区域作为支架蛋白时的融合蛋白中的部分结构。分别用L7至L8位点变体表示在Fc区的“侧面部”的L7至L8位点中融合环肽的融合蛋白。带下划线的部分表示源自环肽的氨基酸序列，灰色字母表示接头序列。
图10显示了自Expi293F细胞表达、分泌的Fc及其环肽融合蛋白的SDS-PAGE。
图11显示了环肽融合蛋白(Fc变体)与结合分子之间的相互作用的结果。
图12显示了用作支架蛋白的完整人IgG的三维结构。用于融合的Fc区域中的环结构是图6至图9所示的L1位点至L8位点，在该图中，其各自的位置表示为图6中BN和BC所示的氨基酸残基的中点。
图13A显示了自Expi293F细胞表达、分泌的IgG及其环肽融合蛋白的SDS-PAGE。图13B显示了环肽融合蛋白(IgG变体)与结合分子之间的相互作用的结果。
图14显示了用作支架蛋白的人血清白蛋白的三维结构。如L1至L4位点所示，在每个位点中，人血清白蛋白的环结构由以BN表示的氨基酸残基、以BC表示的氨基酸残基以及各自存在于二者之间的2个或4个氨基酸残基的环区域组成。
图15显示了融合环肽后的环部分的氨基酸序列，其是使用人血清白蛋白作为支架蛋白时的融合蛋白中的部分结构。在L1至L4位点中融合环肽的融合蛋白分别显示为L1至L4位点变体。带下划线的部分表示源自环肽的氨基酸序列，灰色字母表示接头序列。
图16显示了自Expi293F细胞表达、分泌的HSA及其环肽融合蛋白的SDS-PAGE。
图17显示了环肽融合蛋白(HSA突变体)与结合分子之间的相互作用的结果。
图18显示了用作支架蛋白的人生长激素的立体结构。如L1至L2位点所示，在各位点中，人生长激素中的环结构由以BN表示的氨基酸残基、以BC表示的氨基酸残基以及各自存在于二者之间的一个氨基酸残基的环区域组成。
图19显示了融合环肽后的环部分的氨基酸序列，其是使用人生长激素作为支架蛋白时的融合蛋白中的部分结构。在L1至L2位点中融合环肽的融合蛋白分别显示为L1至L2位点变体。带下划线的部分表示源自环肽的氨基酸序列，灰色字母表示接头序列。
图20A显示了自Expi293F细胞表达、分泌的hSH及其环肽融合蛋白的SDS-PAGE。图20B显示了环肽融合蛋白(hSH突变体)与结合分子之间的相互作用的结果。
图21显示了用作支架蛋白的人血清视黄醇结合蛋白的立体结构。如L1至L2位点所示，在各位点中，人血清视黄醇结合蛋白中的环结构由以BN表示的氨基酸残基、以BC表示的氨基酸残基以及各自存在于二者之间的两个氨基酸残基的环区域组成。
图22显示了融合环肽后的环部分的氨基酸序列，其是使用人血清视黄醇结合蛋白作为支架蛋白时的融合蛋白中的部分结构。在L1至L2位点中融合环肽的融合蛋白分别显示为L1至L2位点变体。带下划线的部分表示源自环肽的氨基酸序列，灰色字母表示接头序列。
图23A显示了自Expi293F细胞表达、分泌的人血清视黄醇结合蛋白(RBP)及其环肽融合蛋白的SDS-PAGE。图23B显示了环肽融合蛋白(RBP变体)与结合分子之间的相互作用的结果。
图24显示了用作支架蛋白的人胎盘碱性磷酸酶的立体结构。在各位点中，人胎盘碱性磷酸酶中的环结构由以BN表示的Lys402、以BC表示的Gly404以及二者之间的一个氨基酸残基的环区域组成。
图25显示了融合环肽后的环部分的氨基酸序列，其是使用人胎盘碱性磷酸酶作为支架蛋白时的融合蛋白中的部分结构。带下划线的部分表示源自环肽的氨基酸序列，灰色字母表示接头序列。
图26显示了自Expi293F细胞表达、分泌的人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)及其环肽融合蛋白的SDS-PAGE。
图27显示了环肽融合蛋白(PLAP变体)与结合分子之间的相互作用的结果。
图28显示了mP6-9肽融合蛋白(Fc变体)对丛蛋白B1信号传导的抑制作用。
具体实施方式
通过具体实施方式来更具体地说明本发明，但是，本发明不限于以下的具体实施方式，可以进行各种变形来实施。
本发明是一种方法，其是在具有环结构的蛋白质上呈递环肽的方法，所述环肽具有用于形成分子内环状结构的化学交联结构，所述方法包括下述步骤：通过将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基，使环肽与具有环结构的蛋白质融合。
根据本发明，可以将具有环结构的蛋白质作为支架，在保持环肽所具有的结构和活性的状态下，在蛋白质上呈递环肽。此外，通过在蛋白质上呈递环肽，从而具有环肽通过籍以蛋白质为支架而使生物相容性增加、并且可以将蛋白质所具有的功能赋予环肽的优点。
在本发明中，环肽以将其部分结构替换为蛋白质的环结构的方式，呈递在蛋白质上。此外，优选地，与环肽的环结构进行替换的部分结构是用于表现出活性、更具体而言为生物学活性的结构。此外，从结构的观点出发，优选地，与环肽的环结构进行替换的部分结构选自构成环肽的分子内环状结构的氨基酸序列。
根据本发明，可以提供在不增加对环肽和蛋白质的限制的情况下，在蛋白质结构上、即在蛋白质上呈递环肽的超通用方法。
环肽具有用于形成分子内环状结构的化学交联结构，是通过化学交联结构而具有环状结构的肽，本发明的特征在于具有下述技术构思：将化学交联结构替换为蛋白质的环结构，换言之，使用被视为单分子的蛋白质代替迄今为止在肽的环化时使用的化学交联结构。
但是，将环肽与具有环结构的蛋白质融合而成的修饰的蛋白质中的氨基酸序列的一级结构自身并未环化。并且，修饰的蛋白质中的源自环肽的结构在外观上呈与原本存在的环肽中的环状结构就整体而言不同的形状，同时在局部维持了肽的三维结构，且能维持环肽的活性。
就本发明的效果而言，可以基于使环肽融合于具有环结构的蛋白质而得到的修饰的蛋白质中的环肽保持环肽原本所有的活性，来间接地确认在具有环结构的蛋白质上以保持环肽结构的状态呈递所述环肽。换言之，可以认为在本发明中，在修饰的蛋白质中也可以发挥环肽所具有的活性，从而环状蛋白质以保持其结构的状态在具有环结构的蛋白质上呈递。并且，在本发明中，可以通过获取修饰的蛋白质的结构信息来确认环肽保持着结构的事实。
对具有环结构的蛋白质没有特别限制，可以示例以下蛋白质。在下文中，有些情况下这些蛋白质被称为“支架蛋白”。
对支架蛋白没有特别限制，可列举例如免疫球蛋白、纤连蛋白、白蛋白、人生长激素、碱性磷酸酶、视黄醇结合蛋白、子宫珠蛋白、纤维蛋白原、凝血因子、转铁蛋白、包括Cas9在内的基因组编辑酶、G蛋白偶联受体、细胞因子受体、生长因子受体、整联蛋白、钙粘蛋白、转铁蛋白受体、免疫受体、病毒包膜蛋白和病毒衣壳蛋白等。
支架蛋白可以是部分片段蛋白，可以示例上述示例性蛋白质的部分片段蛋白。
如果支架蛋白具有环结构，可以将包含环结构的部分片段用作全长蛋白质中的部分结构。
此外，作为支架蛋白，可以将具有环结构的蛋白质或其具有环结构的部分片段蛋白进一步与其他蛋白质融合。
上面示例的支架蛋白在其二级结构中具有环结构。
环结构没有特别限制，是指连接α-螺旋和/或β-折叠的多肽链区域，是具有弯曲结构的结构。
在本发明中，可以使用存在于上述示例的各种支架蛋白中的环结构。
在本发明中，将环肽插入支架蛋白的环结构中，使环肽与支架蛋白融合，所述融合优选是通过共价键融合。
对与环肽共价键合的环结构没有特别限制，可以是存在于上述示例的支架蛋白中的环结构。
对在环结构中哪个位点插入环肽没有特别限制，环肽可以通用地插入环结构中的任意的位点。
环结构中的任意的位点是指用于插入环肽的两个氨基酸残基是从环结构内选择的位点。
环结构内的两个氨基酸残基优选为在环结构中以两个氨基酸残基的C原子的间距为4至
的方式存在、并且都至少部分地暴露在蛋白质表面的两个氨基酸残基。
通过使两个氨基酸残基的Cα原子的间距为4至
与支架蛋白融合的环肽即使位于修饰的肽中，也可以容易地维持原始环肽的结构。
两个氨基酸残基的Cα原子间距可以根据立体结构清楚的支架蛋白的结构数据来确定。即使支架蛋白的立体结构不清楚，如果有根据它的相似的蛋白质(同源物)的结构信息构建的模型结构，也可以估算出上述两个氨基酸残基之间的距离。
被选择用于与环肽融合的环结构内的两个氨基酸残基可以是位于环结构内的相邻的氨基酸残基，但两个氨基酸残基优选是不相邻的氨基酸残基。两个氨基酸残基不相邻的含义等同于两个氨基酸残基是在蛋白质环结构的氨基酸一级序列中不连续的氨基酸残基。
例如，当选择在蛋白质的晶体结构中以两个氨基酸残基的Cα原子间距为4至
的方式配置的两个氨基酸残基时，在支架蛋白中，构成环结构的两个氨基酸残基之间可以存在1至15个氨基酸残基。两个氨基酸残基之间存在1至15个氨基酸残基的含义等同于两个氨基酸残基在蛋白质环结构的氨基酸一级序列中隔着1至15个氨基酸残基而存在。
两个氨基酸残基之间的1至15个氨基酸残基的部分优选是形成环结构的氨基酸残基。
本发明的在具有环结构的蛋白质上呈递环肽的方法中，环肽是以具有环结构的蛋白质为支架而呈递在所述支架蛋白上的，优选通过将环结构替换为环肽，从而保持蛋白质的结构和环肽的结构。
通过从环结构中选择与环肽键合的两个氨基酸残基，使两个氨基酸残基的Cα原子间距为4至
从而既可以维持蛋白质原本具有的结构，同时也可以保持环肽的活性。
在本发明中，所谓保持环肽的活性，优选与具有环结构的蛋白质融合的环肽是已知具有某些生理活性的化合物，是指作为环肽所具有的生理活性即使在环肽与蛋白质融合后也仍然保持着所述生理活性。
并且，在上述情况下，生理活性的水平可以表示为与蛋白质融合前后的不同的活性值/抑制值。
在本发明中，“将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基”以下述含义使用。
所谓替换为构成环结构的两个氨基酸残基，是指在构成环结构的两个氨基酸残基处，可以结合有环肽的化学交联结构以外的结构，也可以除了环肽的化学交联结构以外还结合有构成环肽的环状结构的除去一个或多个氨基酸后的部分氨基酸序列。
换言之，所谓结合有部分氨基酸序列，只要结合有环肽中包含用于显示活性(更具体而言为生理活性)的结构的部分结构即可。
此外，如下所示，构成环肽的氨基酸可以是蛋白质型氨基酸和/或非蛋白质型氨基酸，在一部分中包含非蛋白质型氨基酸的环肽是优选的，但当环肽包含非蛋白质型氨基酸时，在融合了环肽而得到的修饰的蛋白质中，优选将源自环肽的非蛋白质型氨基酸替换为蛋白质型氨基酸。
当将构成环肽的蛋白质型氨基酸与支架蛋白融合时，优选以保持氨基酸不变的方式进行融合，但也可以用其他蛋白质型氨基酸取代后融合。
此外，所融合的环肽的氨基酸序列可以与原始环肽的氨基酸序列相同，也可以是其中取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的序列。
在本发明中，一个或多个氨基酸可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，也可以是1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1个氨基酸。
在本发明中，当“将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基”时，可以通过接头序列将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基。
当通过接头序列替换时，在融合有环肽的修饰的蛋白质中，在N末端侧按源自环结构的氨基酸序列、接头序列、源自环肽的氨基酸序列的顺序融合，在C末端侧按源自环肽的氨基酸序列、接头序列、源自环结构的氨基酸序列的顺序融合。
可以在N末端侧和C末端侧都具有接头序列，也可以仅在N末端侧和C末端侧之一具有接头序列。
接头序列没有特别限制，可列举由一个或多个Ser、Gly和Cys组成的序列，可列举由1-5、1-4、1-3、1-2或1个Ser、Gly和Cys组成的序列。接头序列优选使用由Ser和/或Gly组成的序列。
在本发明中，当“将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基”时，可以在包含除构成环结构的两个氨基酸以外的构成环结构的氨基酸序列的状态下，用构成环结构的两个氨基酸残基替换环肽的化学交联结构。
当在包含除构成环结构的两个氨基酸以外的构成环结构的氨基酸序列的状态下进行替换的情况下，在融合有环肽的修饰的蛋白质中，在N末端侧按构成环结构的两个氨基酸中N末端侧的一个氨基酸、源自环结构的氨基酸序列、根据需要的接头序列、源自环肽的氨基酸序列的顺序融合，在C末端侧按源自环肽的氨基酸序列、根据需要的接头序列、源自环结构的氨基酸序列、构成环结构的两个氨基酸中C末端侧的另一个氨基酸的顺序融合。
可以在N末端侧和C末端侧都包含除了构成环结构的两个氨基酸以外的其他构成环结构的氨基酸序列，也可以仅在N末端侧和C末端侧中之一包含除了构成环结构的两个氨基酸以外的构成环结构的氨基酸序列。
所谓除了构成环结构的两个氨基酸以外的构成环结构的氨基酸序列，是指源自夹在构成环结构的两个氨基酸之间的环结构的氨基酸序列，优选是分别与构成环结构的两个氨基酸相邻而键合的氨基酸序列。
更具体地说明如下。
在本发明中，将替换环肽的化学交联结构的存在于支架蛋白中的两个氨基酸残基之中，作为构成环结构的氨基酸残基而位于N末端一侧的氨基酸残基作为BN，将位于C末端一侧的氨基酸残基作为BC时，环肽的环结构包含以-BN-(Xaa1)m-BC-表示的结构(只要形成环结构，Xaa1可以各自独立地是任意的氨基酸残基，m是0以上的任意的整数，优选是1-15的整数)。
当“用构成环结构的两个氨基酸残基替换环肽的化学交联结构”时，源自环肽的氨基酸可以与BN键合，也可以经由接头序列与BN键合，也可以根据需要，通过接头序列与自BN起第任意数位的Xaa1键合。
此外，当“将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基”时，源自环肽的氨基酸可以与BC键合，也可以经由接头序列与BC键合，也可以根据需要，通过接头序列与自BC起第任意数位的Xaa1键合。
当根据需要，通过接头序列与自BN起第任意数位的Xaa1键合时，或者当根据需要，通过接头序列与自BC起第任意数位的Xaa1键合时，融合环肽而得到的修饰的蛋白质即包含除了构成环结构的两个氨基酸以外的构成环结构的氨基酸序列。
另一方面，就环肽而言，在形成用于形成分子内环状结构的化学交联结构的两个氨基酸残基之中，位于N末端一侧的氨基酸残基为CN，位于C末端一侧的氨基酸残基为CC的情况下，环肽至少具有用CN-(Xaa2)n-CC表示的一级序列(只要能够形成环肽，Xaa2可以各自独立地是任何氨基酸残基，n是2以上的任意的整数)。环肽除分子内环状结构以外，还可以具有来自环状结构的链状支链。并且，在环肽中，两个氨基酸残基CN和CC形成用于形成分子内环状结构的化学交联结构，成为环肽。
当“将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基”时，构成环结构的两个氨基酸，或者除了构成环结构的两个氨基酸以外的构成环结构的氨基酸，可以根据需要，通过接头序列与CN和/或CC键合。
当CN和/或CC是非蛋白质型氨基酸时，优选被蛋白质型氨基酸取代，当CN和/或CC为Cys时，可以使CN和/或CC缺失，当CC为Cys时，也可以将CN取代为Cys，而使环肽融合。
当“将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基”时，源自环肽的氨基酸可以与CN键合，也可以通过接头序列与CN键合，也可以根据需要，通过接头序列与自CN起第任意数位的Xaa2键合。其中，当CN是非蛋白质型氨基酸时，可以将CN取代为蛋白质型氨基酸，根据需要通过接头序列键合。
此外，当“将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基”时，源自环肽的氨基酸可以与CC键合，也可以通过接头序列与CC键合，也可以根据需要，通过接头序列与自CC起第任意数位的Xaa2键合。其中，可以使CC缺失，根据需要，通过接头序列而与自CC起第一位的Xaa2、即与CC所键合的Xaa2键合。
当根据需要，通过接头序列与自CN起第任意数位的Xaa2键合时，或者当根据需要，通过接头序列与自CC起第任意数位的Xaa2键合时，融合环肽而得到的修饰的蛋白质含有环肽的部分序列。
环肽与具有环结构的蛋白质融合是指：以环肽中构成分子内环状结构的CN-(Xaa2)n-CC的全部或部分替换环结构-BN-(Xaa1)m-BC-的、-(Xaa1)m-中的全部或部分-(Xaa1)p-。
所述结构变成了由-BN-(Xaa1)q-[CN-(Xaa2)n-CC]-(Xaa1)r-BC-表示的结构。并且，该结构中描述的是不包含接头序列的情况(p是m以下的整数，p+q+r等于m。q和r是0以上的整数，优选是0-10的整数)，在包含接头序列的情况下，接头序列位于(Xaa1)q-[CN-(Xaa2)n-CC]的键和[CN-(Xaa 2)n-CC]-(Xaa1)r的键之间。
并且，[CN-(Xaa2)n-CC]意指所述序列中的全部或部分氨基酸序列是融合的。优选地，CN-(Xaa 2)n被融合为部分序列。此外，当CN和/或CC是非蛋白质型氨基酸时，意指分别作为蛋白质型氨基酸融合。
在本文中，用BN和BC表示的氨基酸残基可以直接使用环结构中的氨基酸残基，也可以替换成其他的氨基酸残基。此外，用CN和CC表示的氨基酸残基可以直接使用环肽中的氨基酸残基，也可以替换成其他的氨基酸残基，也可以缺失。优选地，CN被蛋白质型氨基酸取代，且CC缺失。
在融合了环肽的修饰的蛋白质中，源自环肽的氨基酸序列中的N末端氨基酸与在其N末端一侧融合的、作为BN的构成环结构的两个氨基酸残基之间的氨基酸数量，和源自环肽的氨基酸序列中的C末端氨基酸与在其C末端一侧融合的、作为BC的构成环结构的两个氨基酸残基之间的氨基酸数量，可以相同或不同。
源自环肽的氨基酸序列中的N末端氨基酸与在其N末端一侧融合的、作为BN的构成环结构的两个氨基酸残基之间的氨基酸数量可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，也可以是0-10、0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3、0-2、0-1或0个氨基酸。
同样地，源自环肽的氨基酸序列中的C末端氨基酸与在其C末端一侧融合的、作为BC的构成环结构的两个氨基酸残基之间的氨基酸数量可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，也可以是0-10、0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3、0-2、0-1或0个氨基酸。
环肽可以是通过常规的mRNA展示方法制备的肽，也可以是用TRAP方法或RaPID方法制备的肽，还可以是通过噬菌体展示方法制备的肽。此外，也可以是通过上述方法的变体制备的肽。
环肽含有例如硫醚键或二硫键作为用于形成分子内环状结构的化学交联结构。
通常，通过诸如RaPID方法或TRAP方法等mRNA展示方法或噬菌体展示方法选择的环肽，除了硫醚键或二硫键等用于形成分子内环状结构的化学交联结构以外的结构多为具有生理活性的活性位点。
如此，通过将环肽的硫醚键或二硫键替换为与具有环结构的蛋白质之间的键，通常可以将通过诸如RaPID法或TRAP法等mRNA展示方法或噬菌体展示方法获得的环肽的高特异性和高亲和力赋予所期望的蛋白质的所期望的环结构内。此外，尽管不作特别限制，但是可以通过融合具有硫醚键或二硫键作为分子内环状结构的环肽，使环肽通用性地融合。
环肽没有特别限定，可以使用天然环肽，也可以使用非天然环肽。
当在蛋白质上呈递天然环肽时，任何使氨基酸残基彼此结合的键都可以说是用于形成分子内环状结构的化学交联结构，因而可以使用任何键，但优选将天然环肽中被认为是活性部位的区域以外的氨基酸残基之间的键作为用于与蛋白质融合的化学交联结构。
环肽是分子内至少具有由四个以上氨基酸残基形成的环状结构的肽。由四个以上氨基酸残基形成的环肽中的环状结构是在直链状的肽中，由相距两个氨基酸以上的两个氨基酸残基直接地、或经由接头等键合而在分子内形成的闭环结构。
两个氨基酸残基相距两个氨基酸以上与在两个氨基酸残基之间存在至少两个氨基酸残基的含义相同，两个氨基酸残基通过它们之间的两个以上的氨基酸而键合。
环状结构中的闭环结构没有特别限制，但是是通过两个氨基酸共价键合而形成。
两个氨基酸之间的共价键可列举例如二硫键、肽键、烷基键、链烯基键、酯键、硫酯键、醚键、硫醚键、膦醚键、偶氮键、C-S-C键、C-N-C键、C＝N-C键、酰胺键、内酰胺桥联、氨甲酰键、脲键、硫脲键、胺键和硫酰胺键等。
当两个氨基酸在氨基酸的主链中键合时，会由肽键形成闭环结构，但是，通过两个氨基酸的侧链彼此之间、侧链与主链之间的键合等，也可以形成两个氨基酸之间的共价键。
环状结构不限于直链状肽的N末端和C末端的氨基酸之间的键合，也可以由末端氨基酸与非末端氨基酸的键合、或非末端氨基酸间的键合形成。当基于形成环状结构的目的键合的两个氨基酸之一是末端氨基酸，另一个是非末端氨基酸时，环肽具有直链状肽作为发自环状结构的链状支链而呈尾状连接到环状结构的结构。
除了蛋白质型氨基酸外，形成环状结构的氨基酸还包括人工氨基酸变体和衍生物，可列举例如蛋白质型L-氨基酸，和具有属于氨基酸特征的、本领域已知特性的化学合成的化合物等。
蛋白质型氨基酸(proteinogenic amino acids)用本领域普遍已知的三字母表示法表示的话，是Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr和Val。
非蛋白质型氨基酸(non-proteinogenic amino acids)意指蛋白质型氨基酸以外的天然或非天然氨基酸。
非天然氨基酸可列举例如主链结构与天然类型不同的α，α-二取代氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、N-烷基-α-氨基酸、D-氨基酸、β-氨基酸、α-羟基酸，或者侧链结构与天然类型不同的氨基酸(正亮氨酸、高组氨酸等)，侧链带有多余的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸、高苯丙氨酸、高组氨酸等)，和侧链中的羧酸官能团被磺酸官能团取代的氨基酸(半胱氨酸等)等。非天然氨基酸的具体实例可列举WO2015/030014中描述的氨基酸。
形成环状结构的氨基酸的数目只要在4个以上即可，没有特别限制，可以是例如5个以上、8个以上、10个以上，也可以是30个以下、25个以下、20个以下、15个以下。
形成环状结构的氨基酸的数目优选是4个以上且30个以下，在4个以上且30个以下的范围内，形成环状结构的氨基酸数目可以是在5个以上、8个以上、10个以上，也可以是30个以下、25个以下、20个以下、15个以下。
形成环状结构的氨基酸的数量可以是8个以上且20个以下，也可以是10个以上且20个以下，也可以是10个以上且15个以下。
用于本发明的环肽是能够使用已知的肽合成技术制备的环肽。
环肽的制备方法可列举例如液相法、固相法、液相法和固相法相组合的杂合方法等化学合成法，基因重组法，使用无细胞翻译系统的翻译合成法等。
环肽优选使用可以通过RaPID方法或TRAP方法等mRNA展示方法或噬菌体展示方法适当地制造的肽。
在RaPID方法中，例如，可以将具有下表1所示官能团1的氨基酸和具有对应的官能团2的氨基酸环化，成为环肽。
官能团1和2中的任何一个都可以位于N末端一侧，也可以安排在N末端和C末端，也可以将一个作为末端氨基酸，另一个作为非末端氨基酸，也可以两者都是非末端氨基酸。
可以认为由官能团1和官能团2形成的键是用于形成环肽中的分子环状结构的化学交联结构。
【表1】
式中，X1是离去基团，作为离去基团，可列举例如Cl、Br、I等卤素原子，Ar是可具有取代基的芳香环。
在噬菌体展示方法中，因为可以通过Cys的相互结合来获得环化的环肽，所以可以得到具有由作为官能团1的-SH和作为官能团2的HS-形成的二硫键的环肽。
作为具有(A-1)的官能团的氨基酸，可以使用例如氯乙酰化的氨基酸。作为氯乙酰化的氨基酸，可列举N-氯乙酰基-L-丙氨酸、N-氯乙酰基-L-苯丙氨酸、N-氯乙酰基-L-酪氨酸、N-氯乙酰基-L-色氨酸、N-3-(2-氯乙酰胺基)苯甲酰基-L-苯丙氨酸、N-3-(2-氯乙酰胺基)苯甲酰基-L-酪氨酸、N-3-(2-氯乙酰胺基)苯甲酰基-L-色氨酸、β-N-氯乙酰基-L-二氨基丙酸、γ-N-氯乙酰基-L-二氨基丁酸、σ-N-氯乙酰基-L-鸟氨酸、ε-N-氯乙酰基-L-赖氨酸，以及与它们对应的D-氨基酸衍生物等。
对于具有(A-1)的官能团的氨基酸，优选使用N-氯乙酰基-L-色氨酸和N-氯乙酰基-L-酪氨酸，更优选D型。
并且，在本说明书中，虽然存在明确记载为L型的情况，但其表示可以是L型，也可以是D型，还可以是L型和D型的任何比例的混合物。对于没有明确记载L型和D型的情况，也意味着可以是L型，也可以是D型，还可以是L型和D型的任何比例的混合物。
对于具有(A-2)的官能团的氨基酸，可列举例如半胱氨酸、高半胱氨酸、巯基正缬氨酸、巯基正亮氨酸、2-氨基-7-巯基庚酸，和2-氨基-8-巯基辛酸等。
对于具有(A-1)的官能团的氨基酸，可适当的使用半胱氨酸。
通过具有(A-1)的官能团的氨基酸和具有(A-2)的官能团的氨基酸的环化方法可以列举例如在Kawakami，T.等人，Nature Chemical Biology 5，888-890(2009)；Yamagishi，Y.等人，ChemBioChem 10，1469-1472(2009)；Sako，Y.等人，Journal ofAmerican Chemical Society 130，7932-7934(2008)；Goto，Y.等人，ACS ChemicalBiology 3，120-129(2008)；Kawakami T.等人，Chemistry&Biology 15，32-42(2008)和WO2008/117833中记载的方法。
对于具有(B-1)的官能团的氨基酸可列举例如炔丙基甘氨酸、高炔丙基甘氨酸、2-氨基-6-庚炔酸、2-氨基-7-辛炔酸，和2-氨基-8-壬炔酸等。
也可以使用4-戊炔酰基(4-pentynoyl)化或5-己炔酰基(5-hexynoyl)化的氨基酸。
4-戊炔酰基化氨基酸可列举例如N-(4-戊炔酰基)-L-丙氨酸、N-(4-戊炔酰基)-L-苯丙氨酸、N-(4-戊炔酰基)-L-酪氨酸、N-(4-戊炔酰基)-L-色氨酸、N-3-(4-戊炔酰胺基)苯甲酰基-L-苯丙氨酸、N-3-(4-戊炔酰胺基)苯甲酰基-L-酪氨酸、N-3-(4-戊炔酰胺基)苯甲酰基-L-色氨酸、β-N-(4-戊炔酰基)-L-二氨基丙酸、γ-N-(4-戊炔酰基)-L-二氨基丁酸、σ-N-(4-戊炔酰基)-L-鸟氨酸、ε-N-(4-戊炔酰基)-L-赖氨酸，以及与它们对应的D-氨基酸衍生物等。
5-己炔酰基化氨基酸可列举将作为4-戊炔酰基化氨基酸示例的化合物中的4-戊炔酰基替换为5-己炔酰基的氨基酸。
具有(B-2)的官能团的氨基酸可列举例如叠氮丙氨酸、2-氨基-4-叠氮丁酸、叠氮正缬氨酸、叠氮正亮氨酸、2-氨基-7-叠氮庚酸，和2-氨基-8-叠氮辛酸等。
也可以使用叠氮乙酰化或3-叠氮戊酰化的氨基酸。
叠氮乙酰化的氨基酸可列举例如N-叠氮乙酰基-L-丙氨酸、N-叠氮乙酰基-L-苯丙氨酸、N-叠氮乙酰基-L-酪氨酸、N-叠氮乙酰基-L-色氨酸、N-3-(4-戊炔酰胺基(pentynoylamido))苯甲酰基-L-苯丙氨酸、N-3-(4-戊炔酰胺基)苯甲酰基-L-酪氨酸、N-3-(4-戊炔酰胺基)苯甲酰基-L-色氨酸、β-N-叠氮乙酰基-L-二氨基丙酸、γ-N-叠氮乙酰基-L-二氨基丁酸、σ-N-叠氮乙酰基-L-鸟氨酸、ε-N-叠氮乙酰基-L-赖氨酸，以及与它们对应的D-氨基酸衍生物等。
3-叠氮戊酰化氨基酸可列举将作为叠氮乙酰化氨基酸示例的化合物中的叠氮乙酰基替换为3-叠氮戊酰基的氨基酸。
通过具有(B-1)的官能团的氨基酸和具有(B-2)的官能团的氨基酸环化的方法可列举例如Sako，Y.等人，Journal of American Chemical Society 130，7932-7934(2008)和WO 2008/117833等中记载的方法。
对于具有(C-1)的官能团的氨基酸可列举例如N-(4-氨甲基-苯甲酰基)-苯丙氨酸(AMBF)和3-氨甲基酪氨酸等。
对于具有(C-2)的官能团的氨基酸可列举例如5-羟色氨酸(WOH)等。
通过具有(C-1)的官能团的氨基酸和具有(C-2)的官能团的氨基酸环化的方法可列举例如Yamagishi，Y.等人，ChemBioChem 10，1469-1472(2009)和WO2008/117833中记载的方法等。
对于具有(D-1)的官能团的氨基酸可列举例如2-氨基-6-氯-己炔酸、2-氨基-7-氯-庚炔酸和2-氨基-8-氯-辛炔酸等。
对于具有(D-2)的官能团的氨基酸可列举例如半胱氨酸、高半胱氨酸、巯基正缬氨酸、巯基正亮氨酸、2-氨基-7-巯基庚酸和2-氨基-8-巯基辛酸等。
通过具有(D-1)的官能团的氨基酸和具有(D-2)的官能团的氨基酸环化的方法可列举例如WO2012/074129中记载的方法等。
对于(E-1)的氨基酸可列举例如N-3-氯甲基苯甲酰基-L-苯丙氨酸、N-3-氯甲基苯甲酰基-L-酪氨酸、N-3-氯甲基苯甲酰基-L-色氨酸，以及与它们对应的D-氨基酸衍生物等。
对于(E-2)的氨基酸可列举例如半胱氨酸、高半胱氨酸、巯基正缬氨酸、巯基正亮氨酸、2-氨基-7-巯基庚酸、2-氨基-8-巯基辛酸等。
通过具有(E-1)的官能团的氨基酸和具有(E-2)的官能团的氨基酸环化的方法可以参考例如(A-1)和(A-2)环化的方法，或(D-1)和(D-2)环化的方法来进行。
对于成环的氨基酸，优选具有(A-1)的官能团的氨基酸和具有(A-2)的官能团的氨基酸的组合，更优选的是以离去基团取代H而得到的N-乙酰基色氨酸和半胱氨酸的组合，进一步优选的是N-卤代乙酰基-D-酪氨酸或N-卤代乙酰基-D-色氨酸、优选N-氯乙酰基-D-酪氨酸或N-氯乙酰基-D-色氨酸、与半胱氨酸(Cys)的组合。
在本发明中，优选使用通过RaPID方法或TRAP方法这类mRNA展示方法或噬菌体展示方法制备的、对所期望的结合分子具有生理活性的环肽。
优选的是将通过在可以由RaPID方法或TRAP方法这类mRNA展示方法或噬菌体展示方法适当制备的肽中的官能团1和官能团2形成的键作为用于形成分子内环状结构的化学交联结构，与具有环结构的蛋白质融合。
下面以通过RaPID法制备的环肽为例，来说明用于本发明中的环肽。
在本发明中，对通过RaPID方法制备的环肽没有特别限制，但可列举由以下通式表示的环肽。
【化学式1】
以上述通式表示的环肽为例，具有表1记载的官能团1和官能团2为(A)时的结构。
此处，在通式中，S表示来自Cys的巯基的硫原子。Xaa表示任意的氨基酸，且S是任意的0以上的整数。可变区(variable region)表示除构成环状氨基酸的Cys以外的氨基酸序列。可变区(variable region)的N末端的氨基酸优选是具有上述(A-1)的官能团的氨基酸。
可变区(variable region)的氨基酸序列是通过RaPID方法制备的环肽中的部分氨基酸序列，可以是任意的氨基酸序列，只要其构成环肽即可。
当使用上述通式表示的肽作为环肽时，可变区的N-末端的氨基酸残基为CN，Cys是CC。
当CN是例如作为非蛋白质型氨基酸的N-卤代乙酰基-D-色氨酸时，替换为作为蛋白质型氨基酸的L-色氨酸，例如，当是作为非蛋白质型氨基酸的N-氯乙酰基-D-酪氨酸时，替换为作为蛋白质型氨基酸的L-酪氨酸，并与环肽融合是优选的。此外，也可以将CN替换为作为蛋白质型氨基酸的Cys。当CC是例如Cys时，使CC缺失并融合环肽是优选的，此外，当CC是Cys时，在一同融合作为CC的Cys的情况下，将CN替换为Cys并进行融合也是优选的。当融合通式所示的环肽时，根据需要，D-氨基酸可被替换为L-氨基酸，但是，对于构成环肽的环状结构的氨基酸序列的部分氨基酸序列，将可变区(variable region)的氨基酸序列融合至经环肽融合而得到的修饰的蛋白质中是优选的。在本发明中，当可变区(variable region)的氨基酸序列的一部分、例如CN是非蛋白质型氨基酸时，其被替换为蛋白质型氨基酸的情况也可理解为可变区(variable region)的氨基酸序列被融合至经环肽融合而得到的修饰的蛋白质中。可以将可变区(variable region)和作为CC的Cys一并融合。
当使通过RaPID方法或TRAP方法这类mRNA展示方法或噬菌体展示方法适当制备的环肽与具有环结构的蛋白质融合时，具体而言，进行以下修饰是恰当的。
(1)可以在RaPID方法或TRAP方法这类mRNA展示方法或噬菌体展示方法中分别替换或删除用于形成分子内环状结构的化学交联结构所涉及的氨基酸残基，使源自环肽的氨基酸残基与源自环结构的氨基酸残基融合。
具体而言，在RaPID方法制备的环肽中，将具有官能团1的氨基酸残基替换为蛋白质型氨基酸，使具有官能团2的氨基酸残基逐个缺失，融合为环结构。对于具有官能团1的氨基酸残基，可以使用D-氨基酸等非蛋白质型氨基酸。
在噬菌体展示方法制备的环肽中，可以删除构成化学交联结构的S-S键的Cys残基，与环结构融合。
更具体而言，在RaPID方法中，当官能团1使用(A-1)的结构时，具有(A-1)结构的氨基酸一般大多使用CIAc-D-Trp或CIAc-D-Tyr，在修饰的蛋白质中，所述氨基酸残基优选被替换为L-Trp或L-Tyr。此外，也可以缺失CIAc-D-Trp或CIAc-D-Tyr。
此外，具有(A-2)结构的氨基酸一般大多使用Cys，在修饰的蛋白质中，可以缺失所述Cys残基。
(2)在(1)中，尽管没有环肽，但也可以使用由Ser、Gly和Cys这样的氨基酸残基组成的氨基酸序列作为环肽与环结构之间的接头序列，插入到源自环肽的氨基酸残基和源自环结构的氨基酸残基之间，使其融合。
(3)在将用于形成分子内环状结构的化学交联结构中所涉及的氨基酸残基转变为L-Cys、使环肽与环结构融合而成的修饰的蛋白质中，也可以通过二硫键形成交联结构，同时，将由Ser和Gly这样的氨基酸残基组成的氨基酸序列用作环肽与环结构之间的接头序列，插入到源自环肽的氨基酸残基和源自环结构的氨基酸残基之间，使其融合。
构成接头序列的氨基酸残基的数目可以是一个以上的氨基酸残基，对氨基酸残基的数目没有特别限制。
在本发明中，在具有环结构的蛋白质上呈递环肽的方法中，包括使环肽与具有环结构的蛋白质融合的步骤，可以使用普通的基因工程技术使环肽与具有环结构的蛋白质融合。
具体而言，本发明还提供下述方法作为将环肽与蛋白质融合的方法：使环肽与具有环结构的蛋白质融合，在蛋白质上呈递环肽的修饰的蛋白质的制备方法。
本发明中的、使环肽与具有环结构的蛋白质融合从而在蛋白质上呈递环肽的修饰蛋白质的制备方法是下述的制备修饰的蛋白质的方法：
环肽具有用于形成分子内环状结构的化学交联结构，
从环肽的氨基酸序列中，选择要在蛋白质上呈递的部分氨基酸序列，并选择与所述部分氨基酸序列相对应的碱基序列，
选择与构成具有环结构的蛋白质的环结构的两个氨基酸残基相对应的碱基序列，根据需要删除存在于所选择的该碱基序列之间的碱基，准备具有插入与所选择的环肽的部分氨基酸序列相对应的碱基序列重组而成的碱基序列的核酸，
翻译所述核酸。
作为环肽，优选使用通过RaPID方法或TRAP方法等mRNA展示方法或噬菌体展示方法选择的环肽，更优选是通过mRNA展示方法选择的环肽，根据mRNA展示法等，可以容易地理解环肽之中应该插入的部分氨基酸序列的碱基序列。
选择与构成具有环结构的蛋白质的环结构的两个氨基酸残基相对应的碱基序列、根据需要删除存在于所选择的该碱基序列之间的碱基的方法，或者准备具有插入与所选择的环肽的部分氨基酸序列相对应的碱基序列重组而成的碱基序列的核酸的方法没有特别限制，可以使用常规已知的方法来实施。
此外，在本发明涉及的技术领域中，翻译所准备的核酸的方法是普遍已知的事实，因此，可以适当地应用这些普遍已知的方法来翻译核酸。
在选择与构成具有环结构的蛋白质的环结构的两个氨基酸残基相对应的碱基序列时，可以在具有环结构的蛋白质的氨基酸序列(可以是部分片段蛋白质的氨基酸序列，也可以是融合蛋白的氨基酸序列)中，从构成环结构的氨基酸序列中选择作为与环肽融合的支架的两个氨基酸残基。
两个氨基酸残基的选择可以利用支架蛋白的结构数据，或者即使在不清楚支架蛋白的立体结构时，也可以利用从与其相似的蛋白质(同源物)的结构信息构建的模型结构来进行选择。
在选择两个氨基酸残基时，当选择具有多个环结构的支架蛋白时，选择与环肽融合的环结构，优选从所述环结构内选择Cα原子间距在
的两个氨基酸残基。
当选择两个氨基酸残基时，优选选择被1至15个氨基酸残基隔开的两个氨基酸残基，更优选选择Cα原子间距为4至
且被1至15个氨基酸残基隔开的两个氨基酸残基。
在本文中，将从支架蛋白选择的两个氨基酸残基之中于原始的支架蛋白中位于N末端一侧的氨基酸残基作为BN，将位于C末端一侧的氨基酸残基作为BC。
与BN结合的C末端一侧的氨基酸序列可用于与环肽结合，此外，与BC结合的N末端一侧的氨基酸序列也可用于与环肽结合。
在选择了与环肽结合的氨基酸残基后，还可以选择添加接头序列。
在选择与支架蛋白融合的环肽时，优选选择已知具有某些生理活性、或已确认具有生理活性的环肽。此外，可以通过常规方法适当地确认环肽的氨基酸序列。
鉴定环肽的作为化学交联结构的键，基于切割该键而获得的一级氨基酸序列信息，选择待融合的环肽中的氨基酸序列。
基于所选择的氨基酸序列确定蛋白质的必要翻译所需的碱基序列并进行翻译，从而能够制备规定的修饰的蛋白质。
以通过本发明的方法获得的具有环结构的蛋白质作为支架，在所述蛋白质上呈递环肽而成的修饰蛋白质由于可以在保持环肽的结构和活性的状态下呈递环肽，因而可以用作基于环肽活性的试剂、药物等。
此外，由于经环肽融合而得到的修饰的蛋白质除了蛋白质本身所有的活性外，还表现出环肽所有的活性，因此可以用作具有两种不同活性或相同活性的变异蛋白质。
在本发明中，1种环肽可以与具有1个或2个以上环结构的蛋白质的1个或2个以上的环结构分别融合，2种以上的环肽可以与具有多个环结构的蛋白质的不同的环结构分别融合。
当2种以上的环肽进行融合时，可以是具有相同氨基酸序列的环肽，2种以上的环肽也可以是具有不同氨基酸序列的环肽。
实施例
下面通过示例实施例，来具体说明本发明，但本发明不限于以下实施例。
基于WO2011/049157和日本特开2013-46637号公报，对作为结合分子的人丛蛋白B1、人Met受体、人EGF受体和人TrkB受体实施RaPID系统处理，分别获得了1-3种与各受体特异性结合的环肽。环肽的结构如图1所示。
在图1中，可变区的氨基酸序列的N末端氨基酸和恒定区的Cys(显示在通式中)分别对应于之后用于连接的氨基酸残基CN和CC。并且，用L-氨基酸分别取代作为环肽N末端氨基酸以小写字母w和y表示的D-氨基酸，或者使其缺失，导入融合蛋白中。
在图1中记载的环肽中，P6和P7是Cell Chem.Biol，2016，23，1341-1350中记载的环肽，都具有与人丛蛋白B1结合的活性。mP6-9是对P6的氨基酸序列的一部分进行了修饰而得到的，且仍具有与P6相同的、结合人丛蛋白B1的活性。此外，P6和mP6-9通过结合人丛蛋白B1，变构地抑制信号素(semaphorin)4D与人丛蛋白B1的结合，因此具有抑制细胞内由信号素4D刺激引起的形态变化的活性(Cell Chem.Biol，2016，23，1341-1350)。
aMD4、aMD5和aML5是Nature Commun，2015，6，6373中记载的环肽，都具有结合人Met受体的活性。此外，已知这些肽单独不能活化人Met受体，但通过交联而二聚化时，可以引起人Met受体活化，具有激动剂活性。
A6-2f和trkD5分别以纳摩尔级别的亲和力与相应的人EGF受体和人TrkB受体结合。
实施例1：纤连蛋白的第十III型重复结构域与环肽的融合
1、设计环肽融合蛋白
为了替换上述8种生物活性环肽的化学交联结构，选择人纤连蛋白的第十III型重复结构域(下文称为“Fn10”)作为成为支架蛋白的具有环结构的蛋白质，从它的立体结构上夹在第六和第七β链之间的环部分中选出Cα原子间距为
的两个氨基酸残基Val1490(对应BN)和Ser1499(对应BC)作为连接残基。该部分的三维结构如图2所示。
设计下述这样的融合蛋白，即，将Fn10中夹在被选定的BN和BC这两个氨基酸残基之间的8个氨基酸残基的一部分，替换成在图1所示环肽的可变区的氨基酸序列两侧适当添加了任意的接头氨基酸后的序列(需要说明的是，如下设计被融合的环肽可变区的氨基酸序列，即，用蛋白质型氨基酸W或Y取代环肽可变区的w或y表示的非蛋白质型氨基酸。下文相同。此外，仅在融合P7时，将P7可变区中的N末端氨基酸残基w替换为Cys，CC也同时设计为相对应的Cys)。图3显示了所设计的融合蛋白中的、融合环肽后的环部分的氨基酸序列。
2、制备环肽融合蛋白
连接编码人催乳素信号序列的DNA、编码人纤连蛋白的第1418至1509位区域的氨基酸残基的DNA、和编码人IgG1的Fc区的DNA，构建Fn10-Fc融合蛋白的构建体，将其重组到表达载体pcDNA3.1(由Thermo Fisher Scientific公司生产)中。
基于Fn10-Fc表达载体，制备夹在纤连蛋白区域中的Val1490和Ser1499之间的环区域的8个氨基酸残基被替换为图3所示的插入序列而成的表达载体。使用延伸PCR方法扩增插入序列的部分，获得作为目标的各种环肽融合蛋白的构建体。将环肽融合蛋白以类似Fn10(P6)-Fc的方式分别命名为Fn10(环肽名称)-Fc。
使用3mL的Expi293表达培养基(由Thermo Fisher Scientific公司生产)，按3x106个细胞/mL，接种Expi293F细胞(由Thermo Fisher Scientific公司生产)。之后，根据常规方法，使用ExpiFectamine 293试剂(由Thermo Fisher Scientific公司生产)，向Expi293F细胞基因导入3μg Fn10-Fc(或其变体)表达用载体。基因导入后，在37℃和8％CO2的条件下，以125rpm摇动培养细胞18小时。然后，分别添加15μL和150μL的Expectamime 293Transfection Enhancer 1和Expectamime 293 Transfection Enhancer 2(由ThermoFisher Scientific公司生产)，在37℃和8％CO2的条件下，以125rpm摇动培养3天，收集培养上清液。
向0.3mL收集的培养上清液中加入30μL蛋白A-琼脂糖凝胶珠(Sepharose)(由Thermo Fisher Scientific公司生产)，旋转混合2小时。通过离心分离，使琼脂糖凝胶珠沉淀，去除上清液，用1mL Tris缓冲的生理盐水(TBS，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5)洗涤琼脂糖凝胶珠3遍，加入20μL SDS样品缓冲液，在95℃加热2分钟，洗脱样品。在还原条件下，用5μL洗脱的样品进行电泳，并用考马斯亮蓝染色。
图4显示了电泳的结果。在图4中，样品号用带圆圈的数字表示。在预期的分子量(37.5kDa)位置观察到了Fn10-Fc(样品编号1)的条带，所有的环肽融合蛋白(样品编号2至9)都表现出或多或少高于它的分子量，并与12至20个残基的氨基酸全长对应。上述各种情况都证明环肽融合蛋白可以以不逊于没有肽插入的Fn10-Fc的量自Expi293F细胞表达、分泌。
3、环肽融合蛋白与结合分子的结合
为了检验各种与环肽融合的Fn10-Fc是否保持了融合前的环肽所具有的对结合分子的结合能力，进行下拉式(pull-down)结合实验。根据Protein Exp.Purification，2014，95，240-247中记载的方法，制备编码在4种结合分子(均为单次跨膜型受体)的胞外区C末端添加了PA标签(由和光纯药工业公司生产)的融合蛋白的构建体，将所述构建体重组到表达载体pcDNA3.1(由Thermo Fisher Scientific公司生产)中。使用所述载体，通过上述方法在Expi293F细胞中瞬时表达，制备了分别含有可溶性受体片段PlexinB1-PA、Met-PA、EGFR-PA和TrkB-PA的培养上清液。
向0.5mL含有添加了PA标签的受体胞外区的培养上清液中加入30μL固定了抗PA标签抗体NZ-1的琼脂糖凝胶珠(由和光纯药工业公司生产)中，旋转混合2小时，使琼脂糖凝胶珠捕获结合分子。通过离心分离，沉淀琼脂糖凝胶珠并将之除去后，加入0.5mL含有另行制备的各种环肽融合蛋白(Fn10-Fc变体)的培养上清液，进一步旋转混合2小时，进行反应。再次通过离心分离沉淀琼脂糖凝胶珠，用1mL TBS洗涤琼脂糖凝胶珠3次，加入20μL SDS样品缓冲液，在95℃加热2分钟，洗脱样品。在还原条件下，用5μL洗脱的样品进行电泳，并用考马斯亮蓝染色。
图5显示电泳的结果。由下拉(pull-down)的结果可知，组入丛蛋白结合物P6、mP6-9和P7的氨基酸序列后的融合蛋白(样品编号2-4)与丛蛋白B1-PA特异性结合，组入Met结合物aMD4、aMD5和aML5的氨基酸序列后的融合蛋白(样品编号5-7)与Met-PA特异性结合，组入EGF受体结合物A6-2f的氨基酸序列后的融合蛋白(样品编号8)与EGFR-PA特异性结合，组入TrkB结合物trkD5的氨基酸序列后的融合蛋白(样品编号9)与TrkB-PA特异性结合。
用作对照的Fn10-Fc(样品编号1)没有显示与任何受体蛋白的结合性。由此可以确定，8种环肽均能够通过在Fn10的环结构上呈递来转变为保留原始环肽的结合能力的融合蛋白。
实施例2：抗体Fc区与环肽的融合
1、设计环肽融合蛋白
为了替换生物活性环肽的化学交联结构，选择源自人IgG的Fc区(下文称为“Fc”)作为成为支架蛋白的具有环结构的蛋白质，从在它的立体结构上被夹在β链中的环部分中寻找Cα原子间距在
之间的两个氨基酸残基。其结果是自Fc的铰链区附近的“上部”选定3处，自Fc的“底部”选定了3处，自Fc的“侧面部”选定了2处，共计8处。用于融合的位点的名称如下，自“上部”起，将两个氨基酸残基Ser267(相当于BN)和Pro271(相当于BC)作为连接残基时称为L1位点，将两个氨基酸残基Tyr296(相当于BN)和Ser298(相当于BC)作为连接残基时称为L2位点，将两个氨基酸残基Leu328(相当于BN)和Pro331(相当于BC)作为连接残基时称为L3位点。自“底部”起，将两个氨基酸残基Lys360(相当于BN)和Gln362(相当于BC)作为连接残基时称为L4位点，将两个氨基酸残基Ser383(相当于BN)和Gln386(相当于BC)作为连接残基时称为L5位点，将两个氨基酸残基Gln419(相当于BN)和Asn421(相当于BC)作为连接残基时称为L6位点。自“侧面部”起，将两个氨基酸残基Gly341(相当于BN)和Pro343(相当于BC)作为连接残基时称为L7位点，将两个氨基酸残基Ser400(相当于BN)和Gly402(相当于BC)作为连接残基时称为L8位点。这些部分的立体结构如图6所示。
设计下述这样的融合蛋白，即，将Fc的上部、底部、侧面部中夹在被选定的BN和BC这两个氨基酸残基之间的区域的一部分，替换成在环肽mP6-9、aMd4或aMD5的可变区的氨基酸序列两侧适当添加了任意的接头氨基酸后的序列。图7至图9显示了所设计的融合蛋白中的、融合环肽后的环部分的氨基酸序列。
2、制备环肽融合蛋白
连接编码人催乳素信号序列的DNA、编码His x 8标签的DNA、编码Myc标签的DNA、和编码人IgG1的Fc区的DNA，构建Fc融合蛋白的构建体，将其重组到表达载体pcDNA3.1(由Thermo Fisher Scientific公司生产)中。
基于Fc表达载体，制备将L1-L8位点的环区域的氨基酸序列替换为图7-图9所示的插入序列的表达载体。使用延伸PCR方法扩增插入序列的部分，获得作为目标的各种环肽融合蛋白的构建体。将环肽融合蛋白以类似Fc(mP6-9_L1)的方式分别命名为Fc(环肽名称_位点名称)。
通过实施例1中描述的方法，使用Expi293F细胞瞬时表达Fc及其20种环肽融合蛋白(3种肽和8个插入位点变量(variation))，通过蛋白A-琼脂糖凝胶珠沉淀培养上清液，进行SDS-PAGE分析。
电泳结果如图10所示。在预期的分子量(30.6kDa)位置观察到了Fc(样品编号1)的条带，所有的环肽融合蛋白(样品编号2至21)都表现出与30-37kDa的分子量相当的迁移率的条带。
3、环肽融合蛋白与结合分子的结合
对于得到的环肽融合蛋白(Fc变体)，按实施例1中描述的方法，通过下拉法(pull-down)检查其与捕获了可溶性受体片段丛蛋白B1-PA和Met-PA的NZ-1琼脂糖凝胶珠的结合。
图11显示电泳的结果。由下拉(pull-down)的结果可知，组入丛蛋白结合物mP6-9的氨基酸序列后的8种融合蛋白(样品编号2-9)都与丛蛋白B1-PA特异性结合，组入Met结合物aMD4和aMD5的氨基酸序列后的12种融合蛋白中的11种(样品编号10-13、15-21)与Met-PA特异性结合(需要说明的是，针对Fc(aMD5_L2，样品编号14)也可以确认特异性结合)。也就是说，确认了与Fn10-Fc的情况相同，即使直接插入到IgG Fc区域的环结构上，环肽也可以保持与其结合分子的结合活性而转变为融合蛋白。
实施例3：IgG抗体与环肽的融合
1、设计环肽融合蛋白
为了替换生物活性环肽的化学交联结构，选择人IgG全长蛋白(下文称为“IgG”)作为成为支架蛋白的具有环结构的蛋白质。因为IgG包含实施例2中使用的支架蛋白Fc作为其结构的一部分，因此融合所使用的部位就直接利用实施例2所示的L1-L8位点。IgG及其Fc区域(包含环肽的融合位点)以及两个作为抗原结合位点的Fab区域的立体结构如图12所示。
2、制备环肽融合蛋白
将编码针对神经菌毛素1(neuropilin 1)的人IgG1单克隆抗体的H链全长区域的DNA插入表达载体p3xFLAG-CMV-14(Sigma-Aldrich公司生产)。将编码同一抗体的LK链全长区域的DNA也同样地重组到p3xFLAG-CMV-14载体中。
基于上述IgG1 H链表达载体，制备了将其Fc区域的L1-L8位点的环区域的氨基酸序列替换为图7-图9所示的插入序列的H链表达载体。使用延伸PCR方法扩增插入的序列，以获得作为目标的各种环肽融合H链的构建体。环肽融合蛋白都以类似IgG(mP6-9_L1)的方式分别命名为IgG(环肽名称_位点名称)。
将H链及其丛蛋白B1结合性环肽(mP6-9)融合变体表达载体与相应的Lκ链表达载体按1∶1的比例混合，通过与实施例2相同的方法基因导入Expi293F细胞，进行瞬时表达，通过蛋白A琼脂糖凝胶珠，从培养上清液中沉淀被表达和分泌的IgG蛋白，进行SDS-PAGE分析。
电泳结果如图13A所示。在预期的分子量(H链47kDa，L链25kDa)位置观察到了未融合的IgG(样品编号1)条带，所有的环肽融合蛋白(样品编号2至9)都表现出比仅有H链时的47kDa稍高的分子量所对应的迁移率的条带，L链则呈现与融合前的IgG相同的25kDa条带。
3、环肽融合蛋白与结合分子的结合
对于得到的环肽融合蛋白(IgG变体)，按实施例2中描述的上述方法，通过下拉法(pull-down)检查其与捕获了可溶性受体片段丛蛋白B1-PA的NZ-1琼脂糖凝胶珠的结合。
图13B显示了电泳的结果。由下拉(pull-down)的结果可知，组入丛蛋白结合物mP6-9的氨基酸序列后的6种融合蛋白(样品编号2-9)都与丛蛋白B1-PA结合。也就是说，确认了与Fc单独时的情况相同，即使直接插入到IgG中的Fc区域的环结构上，环肽也可以保持与其结合分子的结合活性而转变为融合蛋白。
实施例4：人血清白蛋白与环肽的融合
1、设计环肽融合蛋白
为了替换生物活性环肽的化学交联结构，选择人血清白蛋白(下文称为“HSA”)作为成为支架蛋白的具有环结构的蛋白质，从在它的三维结构上被α螺旋夹住的环部分中寻找Cα原子间距在
之间的两个氨基酸残基。其结果是选择了HAS分子上溶剂暴露程度高的4处。用于融合的部位的名称如下，将两个氨基酸残基Asp56(相当于BN)和Ala59(相当于BC)作为连接残基时称为L1位点，将两个氨基酸残基Cys169(相当于BN)和Lys174(相当于BC)作为连接残基时称为L2位点，将两个氨基酸残基Ala363(相当于BN)和Pro366(相当于BC)作为连接残基时称为L3位点，将两个氨基酸残基Ala561(相当于BN)和Lys564(相当于BC)作为连接残基时称为L4位点。这些部分的立体结构如图14所示。
设计下述这样的融合蛋白，即，将HSA中夹在被选定的BN和BC这两个氨基酸残基之间的区域的一部分替换成在环肽mP6-9和aMd4的可变区的氨基酸序列两侧适当添加了任意的接头氨基酸后的序列。图15显示了所设计的融合蛋白中的、融合环肽后的环部分的氨基酸序列。
2、制备环肽融合蛋白
连接编码人血清白蛋白全长的DNA、编码His x 8标签的DNA、和编码Myc标签的DNA，构建HSA融合蛋白的构建体，将其重组到表达载体pcDNA3.1(由Thermo FisherScientific公司生产)中。
基于HSA表达载体，制备将L1-L4位点的环区域的氨基酸序列替换为图12所示的插入序列的表达载体。使用延伸PCR方法扩增插入序列的部分，获得作为目标的各种环肽融合蛋白的构建体。将环肽融合蛋白以类似HSA(mP6-9_L1)的方式分别命名为HSA(环肽名称_位点名称)。
通过实施例1中描述的方法，使用Expi293F细胞瞬时表达HSA及其8种环肽融合蛋白(2种肽x 4个插入位点变量)，利用C末端添加的His标签，通过Ni-NTA琼脂糖沉淀培养上清液，进行SDS-PAGE分析。
电泳结果如图16所示。在预期的分子量(67kDa)位置观察到了HSA(样品编号1)的条带，所有的环肽融合蛋白(样品编号2至9)都表现出与比它稍高的分子量相当的迁移率的条带。
3、环肽融合蛋白与结合分子的结合
对于得到的环肽融合蛋白(HSA变体)，按实施例1中描述的方法，确定与丛蛋白B1和Met的可溶性受体片段的结合。但是，在mP6-9肽融合蛋白中，使用丛蛋白B1-Fc蛋白而不是丛蛋白B1-PA作为结合分子，下拉的珠使用蛋白A-琼脂糖凝胶珠，而不是NZ-1-琼脂糖凝胶珠。
图17显示电泳的结果。由下拉(pull-down)的结果可知，组入丛蛋白结合物mP6-9的氨基酸序列后的4种融合蛋白(样品编号2-5)都与丛蛋白B1-Fc结合，组入Met结合物aMD4的氨基酸序列后的4种融合蛋白(样品编号6-9)都与Met-PA特异性结合。未与环肽融合的HAS(样品编号1)只共沉淀了即使在完全不含HAS蛋白的对照培养上清液(样品编号10)中也可见的非特异性条带。也就是说，确认了与Fn10-Fc、Fc时的情况相同，即使直接插入到被HAS的α螺旋夹住的环中，环肽也可以保持与其结合分子的结合活性而转变为融合蛋白。
实施例5：人生长激素与环肽的融合
1、设计环肽融合蛋白
为了替换生物活性环肽的化学交联结构，选择人生长激素(下文称为“hGH”)作为成为支架蛋白的具有环结构的蛋白质，从在它的立体结构上被α螺旋夹住的环部分中寻找Cα原子间距在
之间的两个氨基酸残基。其结果是选定了hGH分子上相当于长轴的前端的2处。用于融合的部位的名称如下，将两个氨基酸残基Asp130(相当于BN)和Ser132(相当于BC)作为连接残基时称为L1位点，将两个氨基酸残基Asn152(相当于BN)和Asp154(相当于BC)作为连接残基时称为L2位点。这些部分的立体结构如图18所示。
设计下述这样的融合蛋白，即，将hGH中夹在被选定的BN和BC这两个氨基酸残基之间的区域的一部分，替换成在环肽mP6-9的可变区的氨基酸序列两侧适当添加了任意的接头氨基酸后的序列。图19显示了所设计的融合蛋白中的、融合环肽后的环部分的氨基酸序列。
2、制备环肽融合蛋白
人生长激素表达载体使用在hGH全长的C末端添加His x 8标签和TEV蛋白酶识别序列的pSGHV0(记载在Protein Expr.Purif.，2000，20(3)，500-506中)。基于该载体，制备将L1-L2位点的环区域的氨基酸序列替换为图19所示的插入序列的表达载体。使用延伸PCR方法扩增插入序列的部分，获得作为目标的各种环肽融合蛋白的构建体。将环肽融合蛋白以类似hGH(mP6-9_L1)的方式分别命名为hGH(环肽名称_位点名称)。
通过实施例1中描述的方法，使用Expi293F细胞瞬时表达hGH及其2种环肽融合蛋白(1种肽x 2个插入位点变量)，通过Ni-NTA琼脂糖沉淀培养上清液，进行SDS-PAGE分析。
电泳结果如图20A所示。在预期的分子量(26kDa)位置观察到了hGH(样品编号1)的条带，2种环肽融合体(样品编号2和3)都表现出与比它稍高的分子量相当的迁移率的条带。
3、环肽融合蛋白与结合分子的结合
对于得到的环肽融合蛋白(hGH变体)，按实施例1中描述的方法，通过下拉法(pull-down)检查其与捕获了可溶性受体片段丛蛋白B1-PA的NZ-1琼脂糖凝胶珠的结合。
图20B显示了电泳的结果。由下拉(pull-down)的结果可知，野生型hGH(样品编号1)不与丛蛋白B1-PA结合，组入丛蛋白结合物mP6-9的序列后的2种融合蛋白(样品编号2和3)都与其特异性结合。也就是说，确认了与Fn10-Fc、Fc、HSA时的情况相同，即使直接插入到分泌激素hGH的环中，环肽也可以保持与其结合分子的结合活性而转变为融合蛋白。
实施例6：人血清视黄醇结合蛋白与环肽的融合
1、设计环肽融合蛋白
为了替换生物活性环肽的化学交联结构，选择人血清视黄醇结合蛋白(下文称为“RBP”)作为成为支架蛋白的具有环结构的脂结合蛋白，从它的立体结构上被β链夹住的环部分中寻找Cα原子间距在
之间的两个氨基酸残基。其结果是选定了从RBP的β桶状结构突出的发夹环的2处。用于融合的部位的名称如下，将两个氨基酸残基Leu64(相当于BN)和Trp67(相当于BC)作为连接残基时称为L1位点，将两个氨基酸残基Ala94(相当于BN)和Leu97(相当于BC)作为连接残基时称为L2位点。这些部分的立体结构如图21所示。
设计下述这样的融合蛋白，即，将RBP中夹在被选定的BN和BC这两个氨基酸残基之间的区域的一部分，替换成在环肽mP6-9的可变区的氨基酸序列两侧适当添加了任意的接头氨基酸后的序列。图22显示了所设计的融合蛋白中的、融合环肽后的环部分的氨基酸序列。
2、制备环肽融合蛋白
人RBP表达载体是连接编码RBP全长的DNA和编码PA标签的DNA而制备的，将其重组到表达载体pcDNA3.1(由Thermo Fisher Scientific公司生产)中。基于该载体，制备将L1-L2位点的环区域的氨基酸序列替换为图22所示的插入序列的表达载体。使用延伸PCR方法扩增插入序列的部分，获得作为目标的各种环肽融合蛋白的构建体。将环肽融合蛋白以类似RBP(mP6-9_L1)的方式分别命名为RBP(环肽名称_位点名称)。
通过实施例1中描述的方法，使用Expi293F细胞瞬时表达RBP及其2种环肽融合蛋白(1种肽x 2个插入位点变量)，通过固定了抗PA标签抗体NZ-1的琼脂糖凝胶珠(由和光纯药工业公司生产)沉淀培养上清液，进行SDS-PAGE分析。
电泳结果如图23A所示。在预期的分子量(25kDa)位置观察到了RBP(样品编号1)的条带，2种环肽融合体(样品编号2和3)都表现出与比它稍高的分子量相当的迁移率的条带。
3、环肽融合蛋白与结合分子的结合
对于得到的环肽融合蛋白(RBP变体)，按上述相同的方法，通过下拉法(pull-down)检查其与捕获了可溶性受体片段丛蛋白B1-Fc的蛋白A琼脂糖凝胶珠的结合。
图23B显示了电泳的结果。由下拉(pull-down)的结果可知，野生型RBP(样品编号1)不与丛蛋白B1-Fc结合，组入丛蛋白结合物mP6-9的序列后的2种融合蛋白(样品编号2和3)都与其特异性结合。也就是说，确认了与Fn10-Fc、Fc、HAS、hGH时的情况相同，即使直接插入到脂结合蛋白RBP的环中，环肽也可以保持与其结合分子的结合活性而转变为融合蛋白。
实施例7：人胎盘碱性磷酸酶与环肽的融合
1、设计环肽融合蛋白
为了替换生物活性环肽的化学交联结构，选择人胎盘碱性磷酸酶(下文称为“PLAP”)作为成为支架蛋白的具有环结构的酶蛋白。从在它的立体结构上远离酶活性位点的环部分中选定Cα原子间距为
的两个氨基酸残基Lys404(相当于BN)和Gly406(相当于BC)作为连接残基。该部分的立体结构如图24所示。
设计下述这样的融合蛋白，即，将PLAP中夹在被选定的BN和BC这两个氨基酸残基之间的区域的一部分，替换成在环肽mP6-9和aMD4的可变区的氨基酸序列两侧适当添加了任意的接头氨基酸后的序列。图25显示了所设计的融合蛋白中的、融合环肽后的环部分的氨基酸序列。
2、制备环肽融合蛋白
人胎盘碱性磷酸酶表达载体使用在PLAP全长的C末端添加了Myc标签和His x 6标签的pAPtag-5载体(记载在Methods Enzymol.2000，327，19-35中)。基于该载体，制备将环部分替换为图25所示的插入序列的表达载体。使用延伸PCR方法扩增插入序列的部分，获得作为目标的各种环肽融合蛋白的构建体。将环肽融合蛋白以类似PLAP(mP6-9)的方式分别命名为PLAP(环肽名称)。
通过实施例1中描述的方法，使用Expi293F细胞瞬时表达PLAP及其2种环肽融合蛋白(2种肽x 1个插入位点)，通过Ni-NTA琼脂糖沉淀培养上清液，进行SDS-PAGE分析。
电泳结果如图26所示。在预期的分子量(74kDa)位置观察到了PLAP(样品编号1)的条带，2种环肽融合蛋白(样品编号2和3)都表现出与比它稍高的分子量相当的迁移率的条带。
3、环肽融合蛋白与结合分子的结合
对于得到的环肽融合蛋白(PLAP变体)，按实施例1中描述的方法，通过下拉法(pull-down)检查其与捕获了可溶性受体片段丛蛋白B1-Fc和Met-Fc的蛋白A琼脂糖凝胶珠的结合。
图27显示了电泳的结果。由下拉(pull-down)的结果可知，野生型PLAP(样品编号1)不与丛蛋白B1-Fc或Met-Fc结合，组入丛蛋白结合物mP6-9的序列后的融合蛋白(样品编号2)与丛蛋白B1-Fc特异性结合，组入aMD4的序列后的融合蛋白(样品编号3)与Met-Fc特异性结合。也就是说，确认了与Fn10-Fc、Fc、HAS、hGH、RBP时的情况相同，即使直接插入到酶蛋白PLAP的环中，环肽也可以保持与其结合分子的结合活性而转变为融合蛋白。
[实施例8]环状蛋白质融合肽的生理活性
丛蛋白B1结合肽P6及其类似物mP6-9与细胞上表达的丛蛋白B1结合，抑制其信号传导。为了调查其是否在与蛋白质融合的状态下也可以发挥该抑制活性，评估信号素4D(Sema4D)刺激时对表达丛蛋白B1的细胞的形态变化的影响。
使用xCELLience RTCA DP装置(由ACEA Biosciences公司生产)，通过阻抗法测量细胞的形态变化。将稳定表达丛蛋白B1的细胞(记载在Cell Chem.Biol，2016，23，1341-1350中)按6,000个细胞/孔的浓度接种在E-PlateView 16PET板(由ACEA Biosciences公司生产)中，在37℃培养20小时。然后，在培养基中加入1nM至1μM范围内的实施例2中记载的mP6-9肽融合蛋白，进一步保温30分钟，然后加入终浓度为1nM的Sema4D-Fc蛋白(由R&DSystems公司生产)作为刺激剂，监控细胞的阻抗。
结果如图28所示。加入Sema4D-Fc后，阻抗会立即迅速降低，表明细胞形态发生了变化，粘附面积缩小。另一方面，在用六种融合蛋白预处理的细胞中，发现细胞形态变化依赖于所添加的融合蛋白浓度而得到抑制，所有的融合蛋白在100nM以上时都几乎完全阻断丛蛋白B1的活化。也就是说，表明了mP6-9在环肽的状态下所具有的丛蛋白B1信号抑制剂的效果，在转变为融合蛋白之后也得以保持。
Claims (12)
1.一种方法，其是在具有环结构的蛋白质上呈递环肽的方法，所述环肽具有用于形成分子内环状结构的化学交联结构，所述方法包括下述步骤：通过将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基，使环肽与具有环结构的蛋白质融合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，构成环结构的两个氨基酸残基的Cα原子的间距在
的范围内。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，具有环结构的蛋白质在构成环结构的两个氨基酸残基之间具有1至15个氨基酸残基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，环肽由蛋白质型氨基酸和/或非蛋白质型氨基酸组成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，化学交联结构包括硫醚键或二硫键。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，将两个以上的环肽分别与具有多个环结构的蛋白质的不同环结构融合。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，两个以上的环肽具有相同的氨基酸序列。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，两个以上的环肽具有不同的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，当将环肽的化学交联结构替换为构成环结构的两个氨基酸残基时，通过接头序列用构成环结构的两个氨基酸残基替换环肽的化学交联结构。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，在包含除构成环结构的两个氨基酸以外的构成环结构的氨基酸序列的状态下，用构成环结构的两个氨基酸残基替换环肽的化学交联结构。
11.一种制备修饰的蛋白质的方法，其是使环肽与具有环结构的蛋白质融合从而在蛋白质上呈递所述环肽的修饰的蛋白质的制备方法，其中，
环肽具有用于形成分子内环状结构的化学交联结构，
从环肽的氨基酸序列中，选择要在蛋白质上呈递的部分氨基酸序列，并选择与所述部分氨基酸序列相对应的碱基序列，
选择与构成具有环结构的蛋白质的环结构的两个氨基酸残基相对应的碱基序列，根据需要删除存在于所选择的该碱基序列之间的碱基，准备具有插入与所选择的环肽的部分氨基酸序列相对应的碱基序列重组而成的碱基序列的核酸，
翻译所述核酸。
12.修饰的蛋白质，其是通过权利要求11记载的制备方法而得到的。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000020574A2 (en) * | 1998-10-08 | 2000-04-13 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Fusions of scaffold proteins with random peptide libraries |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE60018920T2 (de) * | 1999-06-01 | 2006-04-13 | University Of Washington, Seattle | Rekombinante adenovirale vektoren, die chimäre fiberproteine exprimieren, für die zellspezifische infektion und genomische integration |
| US20020048571A1 (en) | 1999-07-19 | 2002-04-25 | Jeno Gyuris | Chimeric polypeptides of serum albumin and uses related thereto |
| WO2005047461A2 (en) * | 2003-08-18 | 2005-05-26 | The Regents Of The University Of California | Polypeptide display libraries and methods of making and using thereof |
| CA2580796C (en) | 2004-09-24 | 2013-03-26 | Amgen Inc. | Modified fc molecules having peptides inserted in internal loop regions |
| US8008453B2 (en) | 2005-08-12 | 2011-08-30 | Amgen Inc. | Modified Fc molecules |
| AT503902B1 (de) | 2006-07-05 | 2008-06-15 | F Star Biotech Forsch & Entw | Verfahren zur manipulation von immunglobulinen |
| AT503889B1 (de) | 2006-07-05 | 2011-12-15 | Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F | Multivalente immunglobuline |
| JP5605602B2 (ja) | 2007-03-26 | 2014-10-15 | 国立大学法人 東京大学 | 環状ペプチド化合物の合成方法 |
| EP2267003A1 (en) * | 2009-06-24 | 2010-12-29 | Applied NanoSystems B.V. | Biologically produced cyclic affinity tags |
| EP2492344B1 (en) | 2009-10-22 | 2016-04-06 | PeptiDream Inc. | Rapid display method in translational synthesis of peptide |
| JP6092773B2 (ja) * | 2010-07-30 | 2017-03-08 | ノバルティス アーゲー | フィブロネクチンクレードル分子及びそのライブラリ |
| EP2647721B1 (en) | 2010-12-03 | 2019-02-27 | The University of Tokyo | Peptide with safer secondary structure, peptide library, and production methods for same |
| JP6754997B2 (ja) * | 2013-08-26 | 2020-09-16 | 国立大学法人 東京大学 | 大環状ペプチド、その製造方法、及び大環状ペプチドライブラリを用いるスクリーニング方法 |
| EP3582761B1 (en) * | 2017-12-13 | 2022-04-20 | Aukera, Inc. | Methods and compositions for vault nanoparticle immobilization of therapeutic molecules and for vault targeting |
-
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2020
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-
2021
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000020574A2 (en) * | 1998-10-08 | 2000-04-13 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Fusions of scaffold proteins with random peptide libraries |
| US20010003650A1 (en) * | 1998-10-08 | 2001-06-14 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Green fluorescent protein fusions with random peptides |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J W SMITH: "Protein loop grafting to construct a variant of tissue-type plasminogen activator that binds platelet integrin alpha IIb beta 3", 《J BIOL CHEM》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200032184A (ko) | 2020-03-25 |
| JPWO2019026920A1 (ja) | 2019-11-07 |
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