ES2943577T3 - Direccionamiento doble - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a moléculas de direccionamiento dual basadas en anticuerpos ya métodos para generar dichas moléculas de direccionamiento dual, incluido un enfoque basado en bibliotecas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Direccionamiento doble

Campo de la invención

La presente invención se refiere a moléculas de direccionamiento doble basadas en anticuerpos y a procedimientos para generar dichas moléculas de direccionamiento doble, incluyendo un enfoque basado en colección.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un diseño de anticuerpos biespecíficos o fragmentos funcionales de los mismos como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En la literatura se ha informado de diversos enfoques para generar moléculas de anticuerpo biespecífico. Estos enfoques se pueden dividir en dos categorías: 1 ) generar formatos de anticuerpo biespecífico en los que los dos parátopos que reconocen dos dianas o dos epítopos se encuentran ambos dentro de una región variable de anticuerpo heterodimérico formada por un par VH-VL complementario y comprenden ambos residuos de CDR pertenecientes a este par VH-VL complementario, y 2) generar otros formatos de anticuerpo biespecífico en los que los dos parátopos que reconocen dos dianas o epítopos no se encuentran ambos dentro de una región variable de anticuerpo heterodimérico formada por un par VH-VL complementario y no comprenden ambos residuos de CDR pertenecientes al mismo par VH-VL complementario.

Dentro de la primera categoría de enfoques, solo se han descrito en la literatura dos procedimientos de genomanipulación predecible de moléculas de anticuerpo biespecífico, y estos se analizarán en detalle a continuación en las Secciones [0014] a [0015]. Sin embargo, para poner este trabajo en contexto, la segunda categoría de enfoques se resumirá primero.

Esta segunda categoría de enfoques (en la que los dos parátopos que reconocen dos dianas o epítopos no se encuentran ambos dentro de una región variable de anticuerpo heterodimérico formada por un par VH-VL complementario y no comprenden ambos residuos de CDR pertenecientes al mismo par VH-VL complementario) constituye un conjunto de trabajo muy grande de diversos trabajadores previos, y se han descrito numerosos ejemplos diversos de dichos anticuerpos biespecíficos.

En un primer grupo de ejemplos pertenecientes a la segunda categoría de enfoques, dos o más fragmentos de anticuerpo (incluyendo fragmentos Fab, Fv monocatenarios o anticuerpos de dominio único) de diferentes especificidades se combinan por enlace químico o por fusión genética por medio de uno o más conectores peptídicos. Los formatos de anticuerpos biespecíficos publicados en este grupo de ejemplos incluyen lo siguiente: a. Diacuerpos (Perisic et al., Structure. 15 de dic. de 1994; 2(12): 1217-26; Kontermann, Acta Pharmacol Sin., ene. de 2005; 26(1 ):1 -9; Kontermann, Curr Opin Mol Ther., abr. de 2010; 12(2):176-83).

b. TandAbs, etc., (Cochlovius et al., Cancer Res. 15 de ago. de 2000; 60(16):4336-41).

c. Dominios únicos específicos para diferentes dianas fusionadas genéticamente por conectores peptídicos (por ejemplo, Domantis: documento WO2008/096158; Ablynx: documento WO2007/112940)

d. Otros (para revisiones, véanse: Enever et al., Curr Opin Biotechnol., ago. de 2009; 20(4):405-11. Epub del 24 de ago. de 2009; Carter, Nat. Rev. Immunol. 6, 343 (2006); P. Kufer et al., Trends Biotechnol. 22, 238 (2004)). Para mejorar su usabilidad potencial en aplicaciones médicas, la semivida en suero in vivo de los formatos de anticuerpos biespecíficos anteriores se puede extender usando diversas tecnologías, incluyendo lo siguiente: a. Adición de seroalbúmina o una entidad de unión a seroalbúmina

b. PEGilación

c. Adición de un polímero de proteína por fusión genética, tal como HAPilación (Schlapschy et al., Protein Eng Des Sel., jun. de 2007; 20(6):273-84. Epub del 26 de jun. de 2007) o XTEN (Schellenberger, Nat. Biotechnology 12 (2009) 1186).

En este grupo de ejemplos, los anticuerpos biespecíficos compuestos de fragmentos de anticuerpo carecen de una región Fc y, por lo tanto en general no muestran la unión natural al receptor Fc neonatal FcRn, no presentan las funciones efectoras naturales (ADCC y CDC, ref.) de anticuerpos IgG completos, y normalmente no se pueden purificar por medio de resinas de afinidad derivadas de superantígenos, tales como resinas de proteína A específicas para la región Fc, de manera idéntica a los anticuerpos IgG. Estas consecuencias de falta de una región Fc pueden limitar la semivida en suero lograble, las aplicaciones viables como ingredientes activos y la fabricación económica de dichos anticuerpos biespecíficos.

En un segundo grupo de ejemplos pertenecientes a la segunda categoría de enfoques, los anticuerpos biespecíficos comprenden una molécula similar a IgG y uno o varios dominios o entidades de unión adjuntos adicionales. Dichos anticuerpos incluyen proteínas de fusión IgG-scFv en las que un Fv monocatenario se ha fusionado a uno de los extremos de las cadenas pesadas o cadenas ligeras (Universidad de California, Biogen Idec, CAT/Medlmmune), y moléculas de dominio variable doble (dvd-IgG) en las que un dominio VH adicional y un conector se fusionan al extremo N terminal de la cadena pesada y un dominio VL adicional y un conector se fusionan al extremo N terminal de la cadena ligera (Abbott). En general, estos enfoques padecen de desventajas en términos de fabricación, accesibilidad y estabilidad de las construcciones.

En un tercer grupo de ejemplos pertenecientes a la segunda categoría de enfoques, los anticuerpos biespecíficos comprenden anticuerpos similares a IgG que se han generado o modificado de tal manera que presentan dos especificidades sin la adición de otro dominio o entidad de unión. Dichos anticuerpos incluyen moléculas de IgG en las que el dominio CH3 naturalmente homodimérico se ha modificado para convertirse en heterodimérico, por ejemplo, usando una protuberancia genomanipulada (Ridgway et al., Protein Eng., jul. de 1996; 9(7):617-21), usando intercambio de hebras (Davis et al., Protein Eng Des Sel., abr. de 2010; 23(4):195-202. Epub del 4 de feb. de 2010), o usando cargas opuestas genomanipuladas (Novo Nordisk), permitiendo potencialmente de este modo que las dos mitades de la molécula similar a IgG se unan a dos dianas diferentes a través de las entidades de unión añadidas a la región Fc, normalmente regiones Fab N terminales. Los anticuerpos en este tercer grupo de ejemplos también incluyen moléculas de IgG en las que algunos bucles estructurales no implicados de forma natural en contactos con antígeno se modifican para unirse a otra diana además de la que se une de forma natural a través de bucles de CDR de región variable, por ejemplo, por mutaciones puntuales en la región Fc. (por ejemplo, unión de Xencor Fes a FcgRIIb) o por diversificación de bucles estructurales (por ejemplo, f-star Mab2 con dominio CH3 diversificado). Estos enfoques padecen de desventajas en términos de estabilidad, fabricación, valencia y afinidad/aplicaciones limitadas.

A diferencia de todos los ejemplos anteriores de anticuerpos biespecíficos en la segunda categoría, los anticuerpos biespecíficos en la primera categoría tienen dos parátopos específicos para dos dianas que comprenden ambos residuos de CDR localizados dentro de la misma región variable de anticuerpo VH-VL heterodimérico. Solo se han descrito en la técnica cuatro tipos de moléculas de anticuerpo atribuibles a esta primera categoría. De estos cuatro tipos, el primer tipo de anticuerpo no es verdaderamente biespecífico ya que no puede reconocer específicamente dos dianas no relacionadas; el segundo tipo de anticuerpo se produce de forma natural pero no se sabe si se puede genomanipular de forma predecible ya que no se ha publicado ningún ejemplo de dicho trabajo; y solo el tercer y cuarto tipos de anticuerpo se pueden genomanipular con especificidad hacia dos dianas no relacionadas de acuerdo con las publicaciones. Los cuatro tipos de moléculas de anticuerpo atribuibles a la primera categoría son los siguientes:

Anticuerpos de reactividad cruzada, que tienen una única especificidad amplia que corresponde a dos o más antígenos o epítopos estructuralmente relacionados. Para dichos anticuerpos, los dos antígenos se relacionan en secuencia y estructura. Por ejemplo, los anticuerpos pueden reaccionar de forma cruzada con dianas relacionadas de diferentes especies, tales como lisozima de clara de huevo de gallina y lisozima de pavo (documento WO 92/01047) o con la misma diana en diferentes estados o formatos, tal como hapteno y hapteno conjugado con vehículo (Griffiths AD et al. EMBO J 199413: 143245-60). Es posible genomanipular deliberadamente anticuerpos para reactividad cruzada. Por ejemplo, se han genomanipulado anticuerpos para reconocer dos antígenos relacionados de diferentes especies (ejemplo Genentech: anticuerpo que se une a LFA1 humano genomanipulado para unirse también a LFA1 de macaco de la India, lo que da como resultado el fármaco exitoso Raptiva/efalizumab). De forma similar, el documento WO 02/02773 describe moléculas de anticuerpo con "doble especificidad". Las moléculas de anticuerpo a las que se hace referencia son anticuerpos creados o seleccionados contra múltiples antígenos relacionados estructuralmente, con una única especificidad de unión que se puede acomodar a dos o más dianas relacionadas estructuralmente. Sin embargo, como se menciona anteriormente, todos estos anticuerpos con reactividad cruzada no son verdaderamente biespecíficos y no se genomanipulan para reconocer específicamente dos dianas no relacionadas.

Además, existen autoanticuerpos polirreactivos, que se producen de forma natural (Casali y Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531). Estos anticuerpos polirreactivos tienen la capacidad de reconocer al menos dos (normalmente más) antígenos o epítopos diferentes que no están estructuralmente relacionados. También se ha demostrado que las selecciones de repertorios de péptidos aleatorios usando tecnología de presentación en fagos en un anticuerpo monoclonal identificarán una variedad de secuencias peptídicas que se ajustan al sitio de unión a antígeno. Algunas de las secuencias están altamente relacionadas, se ajustan a una secuencia de consenso, mientras que otras son muy diferentes y se han denominado mimotopos (Lane y Stephen, Current Opinion in Immunology, 1993, 5, 268-271). Por lo tanto, está claro que los sitios de unión de algunos anticuerpos VH-VL heterodiméricos tienen el potencial de unirse a antígenos diferentes y a veces no relacionados. Sin embargo, como se menciona anteriormente, dichos anticuerpos polirreactivos se pueden encontrar pero no se han genomanipulado deliberadamente usando procedimientos predecibles descritos en la técnica.

Un procedimiento descrito en la técnica que permite la genomanipulación deliberada de anticuerpos biespecíficos que se pueden unir a dos dianas estructuralmente no relacionadas a través de dos parátopos, residiendo ambos dentro de un par VH-VL heterodimérico complementario y comprendiendo ambos residuos de CDR pertenecientes a este par VH-VL complementario, se refiere a anticuerpos "dos en uno". Estos anticuerpos "dos en uno" se genomanipulan para comprender dos parátopos superpuestos usando procedimientos algo distintos de los procedimientos de genomanipulación de reactividad cruzada previos. Este trabajo se ha descrito en el documento WO 2008/027236 y por Bostrom et al. (Bostrom et al., Science. 20 de mar. de 2009; 323(5921):1610-4). En los ejemplos publicados, se aisló una región variable de anticuerpo VH-VL heterodimérico específica para una diana (HER2 ) y después de esto se rediversificó la cadena ligera para lograr especificidad adicional para una segunda diana (VEGF o receptor de muerte 5). Para uno de los anticuerpos resultantes, la unión se caracterizó por la resolución de estructura y se descubrió que 11 de los 13 residuos de CDR VH y VL que estaban en contacto con HER2 en un complejo anticuerpo-antígeno también estaban en contacto con VEGF en el complejo anticuerpo-antígeno alternativo. Aunque los anticuerpos "dos en uno" publicados conservaron afinidades nanomolares para HER2, solo uno de los clones publicados por Bostrom et al. (2009) tuvo una afinidad nanomolar de 300 nM para la diana adicional, VEGF, mientras que otros cuatro clones tuvieron afinidades micromolares para las dianas adicionales. Está claro que aunque este enfoque ha logrado la unión a dos dianas estructuralmente no relacionadas, se necesita un grado de compatibilidad de superficie entre las dos dianas para permitir las especificidades de dos parátopos superpuestos. Tampoco se ha descrito en detalle cómo de altamente específicos son dichos anticuerpos "dos en uno" para solo dos dianas, y si se puede observar alguna unión inespecífica general o "pegajosidad" de dichos anticuerpos, potencialmente provocada por la necesidad de alguna flexibilidad conformacional de las cadenas laterales localizadas en la porción superpuesta de los dos parátopos.

Un segundo procedimiento descrito en la técnica que permite la genomanipulación deliberada de anticuerpos biespecíficos que se pueden unir a dos dianas estructuralmente no relacionadas a través de dos parátopos, residiendo ambos dentro de un par VH-VL heterodimérico complementario y comprendiendo ambos residuos de CDR pertenecientes a este par VH-VL complementario, se refiere a anticuerpos que comprenden pares complementarios de anticuerpos de dominio único. Los documentos WO 2003/002609 y US 2007/026482 han descrito anticuerpos VH-VL heterodiméricos, en los que un dominio variable de la cadena pesada reconoce una diana y un dominio variable de la cadena ligera reconoce una segunda diana estructuralmente no relacionada, y en los que los dos dominios únicos con diferentes especificidades se combinan en una región variable VH-VL heterodimérica conjunta. En los ejemplos publicados de dichos anticuerpos, los dominios únicos se seleccionaron por separado primero como un dominio VH no emparejado o como un dominio VL no emparejado para unirse a las dos dianas no relacionadas, y después se combinaron en una región variable VH-VL heterodimérica conjunta específica para ambas dianas.

Para todas las moléculas pertenecientes a la primera categoría de anticuerpos biespecíficos (que se pueden unir a dos dianas a través de dos parátopos, residiendo ambos dentro de un par VH-VL heterodimérico complementario y comprendiendo ambos residuos CDR pertenecientes a este par ^v H-VL complementario), no se necesita que ningún dominio o entidad adicional se fusione a una molécula de IgG, no se necesita que ningún bucle estructural de una molécula de IgG se diversifique y no se necesita que ninguna región Fc heterobiespecífica limitante se utilice para lograr la especificidad doble. Esto tiene varios beneficios potenciales:

El riesgo de reducir la estabilidad de proteína se reduce porque no se ha de diversificar ningún bucle estructural y no se ha de modificar ninguna interfaz de dominio constante, lo que da como resultado propiedades biofísicas muy mejoradas de los anticuerpos.

No se requieren conectores potencialmente proteolizados con facilidad o potencialmente inmunogénicos, lo que da como resultado una capacidad de desarrollo mejorada de los anticuerpos como ingredientes de fármacos activos.

No se pueden producir emparejamientos indeseables de dominios VH y VL, lo que evita subproductos potenciales que comprenden regiones variables VH-VL heterodiméricas emparejadas erróneamente durante la expresión, porque solo se requiere una región VH única y una región VL única.

No se espera una expresión reducida ni la formación de agregados covalentes inusuales, porque no se requieren enlaces disulfuro adicionales en comparación con anticuerpos monoespecíficos convencionales.

Las regiones variables heterodiméricas biespecíficas que comprenden dos parátopos dentro de un par VH-VL heterodimérico complementario se pueden combinar con diferentes dominios constantes, incluyendo regiones Fc. Esto ofrece varias ventajas:

a. Fabricación potencialmente mejorada usando procedimientos totalmente establecidos, por ejemplo, procedimientos idénticos a los usados en la fabricación de IgG monoespecíficas convencionales.

b. Modulación de la semivida en suero mediada por FcRn en pacientes y modelos animales.

c. Libre elección de funciones efectoras asociadas con diferentes isotipos, que van desde un comportamiento no citotóxico, esencialmente inerte (por ejemplo, en anticuerpos diseñados para el bloqueo de receptores) hasta un comportamiento citotóxico agresivo (por ejemplo, en anticuerpos diseñados para destruir células tumorales).

El tercer ejemplo anterior de anticuerpos "dos en uno" derivados por procedimientos relacionados con genomanipulación con reactividad cruzada se limita muy potencialmente en su aplicabilidad médica por la competencia de las dos dianas no relacionadas por los residuos de unión superpuestos al menos parcialmente compartidos dentro de los bucles de CDR. Además, el procedimiento de selección inherentemente secuencial de anticuerpos "dos en uno", con la especificidad lograda primero para una diana, seguido de rediversificación y a continuación descubrimiento de clones específicos para una diana adicional, lleva mucho tiempo y es impredecible, porque solo un número limitado de anticuerpos específicos para la primera diana se puede rediversificar en colecciones seleccionables, pero se desconoce cuál de los primeros clones específicos será más apto para genomanipular la especificidad deseada adicional. Finalmente, el aislamiento y la maduración de afinidad de los anticuerpos "dos en uno" se complica gravemente por el hecho de que cualquier mejora de las secuencias de dominio variable para incrementar la unión a una diana puede provocar potencialmente una reducción en la afinidad para la otra diana.

El cuarto ejemplo anterior de unir una diana a través de residuos de bucle de CDR de la cadena ligera y otra diana a través de residuos de bucle de CDR de la cadena pesada se complica gravemente por el hecho de que algunos de los residuos de CDR de la cadena ligera potencialmente importantes responsables de la unión a la primera diana son directamente contiguos a algunos de los residuos de CDR de la cadena pesada potencialmente importantes responsables de la unión a la segunda diana en la región variable de anticuerpo heterodimérico biespecífico empaquetado final. Esto quiere decir que en su estado unido, la primera diana reconocida por dichos anticuerpos puede competir potencialmente con la segunda diana reconocida por dichos anticuerpos debido al impedimento estérico, limitando potencialmente de este modo la aplicabilidad médica de dichos anticuerpos. Además, si las cadenas ligeras y las cadenas pesadas de dichos anticuerpos se aíslan independientemente por procedimientos de selección y cribado como se describió en el ejemplo histórico del documento US2007026482 (Abbott Laboratories), combinarlas en anticuerpos biespecíficos puede afectar potencialmente a las afinidades de los dominios originalmente independientes hacia las dianas individuales en las moléculas biespecíficas combinadas debido a cambios conformacionales en las CDR que se podrían producir potencialmente tras el emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras. Finalmente, combinar dominios variables VH y VL preaislados con una variedad de bucles de CDR probablemente dé como resultado una estabilidad de anticuerpo impredecible, como se ha descrito por Worn y Plückthun (1998) y Rothlisberger et al. (2005) de que se producen interacciones importantes y una estabilización mutua de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo entre los dominios VH y VL.

Por el contrario, las regiones variables heterodiméricas biespecíficas que comprenden dos parátopos dentro de un par VH-VL heterodimérico complementario se podrían usar como fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab o Fv monocatenarios y no requerirían la presencia de una región Fc para lograr su especificidad doble, lo que permite la opción de fabricación microbiana en ausencia de mecanismos de N-glucosilación de mamíferos, y su uso en aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico donde son deseables un peso molecular bajo o una semivida en suero corta.

Por tanto, mientras que el enfoque de tener dos parátopos dentro de un par VH-VL heterodimérico complementario ofrece tantas ventajas, los intentos realizados hasta ahora, que se han descrito anteriormente, han tenido un éxito limitado.

Por tanto, todavía existe una gran necesidad no satisfecha de proporcionar un formato mejorado para los anticuerpos biespecíficos que incorpore las ventajas de tener dos parátopos dentro de un par VH-VL heterodimérico complementario, evitando los problemas observados con las construcciones de la técnica anterior.

La solución a este problema que se ha proporcionado por la presente invención, es decir, el diseño de dos parátopos para cada par VH-VL heterodimérico complementario, en el que cada parátopo usa residuos de regiones CDR de ambos dominios VH y VL, hasta ahora no se ha logrado o sugerido por la técnica anterior.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos caracterizados por tener dos parátopos para cada par VH-VL heterodimérico complementario, en los que cada parátopo usa residuos de regiones c Dr de ambos dominios VH y VL, como se especifica en las reivindicaciones adjuntas.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende al menos un dominio de unión variable que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL), en el que dicho dominio de unión comprende dos parátopos para dos epítopos no relacionados, en el que (i) la unión de cada parátopo a su epítopo no evita la unión simultánea del otro parátopo a su respectivo epítopo, y en el que (ii) ambos parátopos comprenden al menos un residuo de al menos una CDR VH y al menos un residuo de al menos una CDR VL.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la presente invención.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, o el vector de acuerdo con la presente invención.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para generar el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la presente invención, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, o el vector de acuerdo con la presente invención, in vitro o bien a partir de una célula huésped apropiada, incluyendo la célula huésped de acuerdo con la presente invención.

También se describe una colección de anticuerpos o fragmento funcional de los mismos, en la que dicha colección comprende una colección diversa de secuencias de dominio variable de anticuerpo en la que (i) al menos 3 residuos de CDR de posiciones Lib1 se diversifican, siempre que al menos un residuo diversificado se localice dentro el dominio VH y al menos una posición diversificada se localice dentro del dominio VL, y en la que no se diversifica ningún residuo de las posiciones Lib2, o bien (ii) al menos 3 residuos de CDR de las posiciones Lib2 se diversifican, siempre que al menos un residuo diversificado se localice dentro del dominio VH y al menos una posición diversificada se localice dentro del dominio VL, y en la que no se diversifica ningún residuo de las posiciones Lib1.

También se describe un procedimiento para generar una molécula de anticuerpo biespecífico o fragmento funcional de la misma que comprende las etapas de

a. generar una primera colección de moléculas de anticuerpo o fragmento funcional de las mismas, comprendiendo cada una una región variable VH-VL heterodimérica, con diversidad en al menos 3 posiciones de CDR seleccionadas del grupo de Lib1, siempre que al menos un residuo diversificado se localice dentro del dominio VH y al menos una posición diversificada se localice dentro del dominio VL, y en el que no se diversifican residuos de las posiciones Lib2;

b. seleccionar una primera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma específico para una primera diana o epítopo de dicha primera colección;

c. generar una segunda colección de moléculas de anticuerpo o fragmento funcional de las mismas, comprendiendo cada una una región variable VH-VL heterodimérica, con diversidad en al menos 3 posiciones de CDR seleccionadas del grupo de Lib2, siempre que al menos un residuo diversificado se localice dentro del dominio VH y al menos una posición diversificada se localice dentro del dominio VL, y en el que no se diversifican residuos de las posiciones Lib1;

d. seleccionar una segunda molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma específico para una segunda diana o epítopo de dicha segunda colección; y

e. generar una secuencia de ácido nucleico que codifica una tercera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma que comprende una región variable VH-VL heterodimérica, en la que la tercera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma comprende al menos 3 residuos encontrados en el grupo de posiciones Lib1 en la primera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma, de la que al menos un residuo se localiza dentro del dominio VH y al menos un residuo se localiza dentro del dominio VL, y en la que la tercera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma comprende además al menos 3 residuos encontrados en el grupo de posiciones Lib2 en la segunda molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma, de la que al menos un residuo se localiza dentro del dominio VH y al menos un residuo se localiza dentro del dominio VL.

También se describe un procedimiento para generar una molécula de anticuerpo biespecífico o fragmento funcional de la misma que comprende las etapas de

a. generar una primera colección de moléculas de anticuerpo o fragmento funcional de las mismas, comprendiendo cada una una región variable VH-VL heterodimérica, con diversidad en al menos 3 posiciones de CDR seleccionadas del grupo de Lib1, siempre que al menos un residuo diversificado se localice dentro del dominio VH y al menos una posición diversificada se localice dentro del dominio VL, y en el que no se diversifican residuos de las posiciones Lib2;

b. seleccionar una primera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma específico para una primera diana o epítopo de dicha primera colección;

c. generar una segunda colección de moléculas de anticuerpo o fragmento funcional de las mismas, comprendiendo cada una una región variable VH-VL heterodimérica, diversificando dicha primera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma introduciendo diversidad en al menos 3 posiciones de CDR seleccionadas del grupo de Lib2, siempre que al menos un residuo diversificado se localice dentro del dominio VH y al menos una posición diversificada se localice dentro del dominio VL, y en el que no se diversifican residuos de las posiciones Lib1; y

d. seleccionar una segunda molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma específico para dicha primera y una segunda diana o epítopo de dicha segunda colección; y

e. de forma alternativa, realizar las etapas a. a d. con la modificación de que la primera colección en la etapa a. se genera diversificando al menos 3 posiciones de CDR seleccionadas del grupo de Lib2, y diversificando en la etapa c. dicho primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo en al menos 3 posiciones de CDR seleccionadas del grupo de Lib1.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma, y opcionalmente un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 a continuación muestra la lista de posiciones de CDR preferentes de las que todo o un subconjunto se debe diversificar en colecciones de anticuerpos en algunos modos de realización de la presente invención (A), la lista de posiciones potenciadoras opcionales preferentes en las regiones estructurales que también se pueden diversificar en colecciones de anticuerpos en algunos modos de realización de la invención (B), y la lista de posiciones de CDR de las que todas o un subconjunto se dejan preferentemente invariantes en todas las colecciones de la presente invención, es decir, tanto en colecciones en las que los residuos de Lib1 se diversifican como en colecciones en las que los residuos de Lib2 se diversifican (C).

La figura 2 a continuación ilustra en una forma esquemática el procedimiento de descubrimiento de los anticuerpos biespecíficos novedosos, usando la perspectiva de vista superior (aérea) para mostrar cómo un andamio de anticuerpo VH-VL heterodimérico se diversifica primero por separado en dos regiones que representan residuos de CDR de Lib1 y Lib2; esto proporciona dos colecciones que se seleccionan por separado para obtener dos clones de anticuerpo, uniéndose un clon a una primera diana o epítopo por medio de un primer parátopo y uniéndose el segundo clon a una segunda diana o epítopo por medio de un segundo parátopo; estos clones se combinan a continuación en un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención, introduciendo residuos específicos de diana seleccionados en posiciones Lib1 en el primer clon de anticuerpo en el segundo clon de anticuerpo, o introduciendo residuos específicos de diana seleccionados en posiciones Lib2 en el segundo clon de anticuerpo en el primer clon de anticuerpo. La figura 2 también ilustra de forma esquemática la localización de esos potenciales residuos potenciadores de acuerdo con la presente invención en las regiones estructurales que son visibles desde la perspectiva de vista superior (aérea).

La figura 3 muestra cuatro diseños de colección preferentes (colecciones Lib D1L1, Lib D1L2, Lib D1H1 y Lib D1H2), que se han sometido a prueba. Se han producido cada una de estas cuatro colecciones como un conjunto de genes sintéticos que codifican fragmentos Fab humanos con el emparejamiento VH3-VK1 mostrado como un andamio VH-VL heterodimérico. Los genes sintéticos en cada colección fueron constantes en las posiciones para las que se muestra un aminoácido específico en el código de una sola letra y se diversificaron en las posiciones marcadas con "X". Las cuatro colecciones se produjeron cada una como colecciones de presentación en fagos y se clasificaron contra varios antígenos usando procedimientos estándar conocidos en la técnica. Los clones de anticuerpo seleccionados de estas cuatro colecciones se han combinado en los anticuerpos biespecíficos detallados en la figura 4. La figura 3 muestra además tres diseños de colección preferentes adicionales (Lib D1H3, Lib D2L1 y Lib D2H1).

La figura 4 da ejemplos de secuencias de anticuerpos biespecíficos, que se generaron de acuerdo con la presente invención.

La figura 5 muestra la especificidad de los anticuerpos divulgados en la figura 4, demostrada por análisis ELISA de un clon de direccionamiento doble anti-MBP anti-GST HM2LG1.

La figura 6 muestra los datos de Biacore™ que ilustran la alta especificidad de las construcciones biespecíficas de acuerdo con la invención.

La figura 7 muestra un análisis de Biacore™ de anticuerpos originales y biespecíficos contra VEGF e IL6.

La figura 8 muestra datos de Biacore™ que ilustran la unión conjunta independiente de dos dianas a una construcción biespecífica de acuerdo con la invención: A : unión conjunta de GMCSF anticuerpo IL6; B: unión conjunta de anti-LC anticuerpo IL6

Descripción detallada de la invención

La peculiaridad de la presente invención en comparación con enfoques anteriores para la construcción de anticuerpos biespecíficos es la posibilidad hasta ahora desconocida de tener dos parátopos para cada par VH-VL heterodimérico complementario, en la que cada parátopo usa residuos de regiones CDR de ambos dominios VH y VL.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende al menos un dominio de unión variable que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL), en el que dicho dominio de unión comprende dos parátopos para dos epítopos no relacionados, en el que (i) la unión de cada parátopo a su epítopo no evita la unión simultánea del otro parátopo a su respectivo epítopo, y en el que (ii) ambos parátopos comprenden al menos un residuo de al menos una CDR VH y al menos un residuo de al menos una CDR VL.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina (Ig) que se define como una proteína perteneciente a la clase IgG, IgM, IgE, IgA o IgD (o cualquier subclase de las mismas), que incluye todos los anticuerpos conocidos convencionalmente y fragmentos funcionales de los mismos. Un "fragmento funcional" de una molécula de anticuerpo/inmunoglobulina se define aquí como un fragmento de una molécula de anticuerpo/inmunoglobulina (por ejemplo, una región variable de una IgG) que conserva la región de unión a antígeno. Una "región de unión a antígeno" de un anticuerpo típicamente se encuentra en una o más regiones hipervariables (o región determinante de la complementariedad, "CDR") de una molécula de anticuerpo, es decir, las regiones CDR-1, -2 y/o -3; sin embargo, las regiones "estructurales" variables también pueden desempeñar un papel importante en la unión a antígeno, tal como proporcionando un andamio para las CDR. Preferentemente, la "región de unión a antígeno" comprende al menos los residuos aminoacídicos 4 a 103 de la cadena ligera variable (VL) y 5 a 109 de la cadena pesada variable (VH), más preferentemente los residuos aminoacídicos 3 a 107 de VL y 4 a 111 de VH, y en particular son preferentes las cadenas VL y VH completas (posiciones aminoacídicas 1 a 109 de VL y 1 a 113 de VH; numeración de acuerdo con el documento WO 97/08320). Una clase preferente de moléculas de anticuerpo para su uso en la presente invención es IgG.

Los "fragmentos funcionales" de la invención incluyen el dominio de un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, scFv o construcciones que comprenden dominios variables de inmunoglobulina únicos o polipéptidos de anticuerpo de dominio único, por ejemplo, dominios variables de cadena pesada únicos o dominios variables de cadena ligera únicos. El F(ab')2 o Fab se puede genomanipular para minimizar o retirar completamente las interacciones de disulfuro intermoleculares que se producen entre los dominios CH1 y CL.

Un anticuerpo se puede derivar de inmunizar un animal o de una colección de anticuerpos recombinantes, incluyendo una colección de anticuerpos que se basa en secuencias de aminoácidos que se han diseñado in silico y codificado por ácidos nucleicos que se crean sintéticamente. El diseño in silico de una secuencia de anticuerpo se logra, por ejemplo, analizando una base de datos de secuencias humanas e ideando una secuencia polipeptídica utilizando los datos obtenidos de la misma. Los procedimientos para diseñar y obtener secuencias creadas in silico se describen, por ejemplo, en Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67; y la patente de EE. UU. n.° 6.300.064 presentada por Knappik et al.

En el contexto de la presente invención, el término "molécula de anticuerpo biespecífico" se refiere a una molécula de anticuerpo, que incluye un fragmento funcional de una molécula de anticuerpo, que comprende sitios de unión específicos para dos biomoléculas diana diferentes, o dos epítopos diferentes, presentes en una biomolécula diana, o bien presentes en dos moléculas diferentes, tales como en la biomolécula diana y una segunda biomolécula.

Como se usa en el presente documento, una molécula de unión es "específica para", "reconoce específicamente" o "se une específicamente a" una diana, tal como una biomolécula diana (o un epítopo de dicha biomolécula), cuando dicha molécula de unión puede discriminar entre dicha biomolécula diana y una o más moléculas de referencia, puesto que la especificidad de unión no es una propiedad absoluta, sino relativa. En su forma más general (y cuando no se menciona una referencia definida), "unión específica" se refiere a la capacidad de la molécula de unión para discriminar entre la biomolécula diana de interés y una biomolécula no relacionada, como se determina, por ejemplo, de acuerdo con procedimientos de ensayo de especificidad conocidos en la técnica. Dichos procedimientos comprenden, pero no se limitan a, inmunoelectrotransferencias, ELISA, RIA, ECL, pruebas IRMA y barridos de péptidos. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un ensayo ELISA estándar. La puntuación se puede llevar a cabo por el desarrollo de color estándar (por ejemplo, anticuerpo secundario con peróxido de rábano picante y tetrametilbencidina con peróxido de hidrógeno). La reacción en determinados pocillos se puntúa por la densidad óptica, por ejemplo, a 450 nm. El fondo típico (= reacción negativa) puede ser de aproximadamente 0,1 DO; la reacción positiva típica puede ser de aproximadamente 1 DO. Esto quiere decir que la proporción entre una puntuación positiva y una negativa puede ser de 10 veces o mayor. Típicamente, la determinación de la especificidad de unión se realiza usando no una única biomolécula de referencia, sino un conjunto de aproximadamente tres a cinco biomoléculas no relacionadas, tales como leche en polvo, BSA, transferrina o similares.

En el contexto de la presente invención, el término "aproximadamente" quiere decir entre un 90 % y un 110 % de un valor o intervalo dado.

Sin embargo, "unión específica" también se puede referir a la capacidad de una molécula de unión para discriminar entre la biomolécula diana y una o más biomoléculas estrechamente relacionadas, que se usan como puntos de referencia. Adicionalmente, la "unión específica" se puede relacionar con la capacidad de una molécula de unión para discriminar entre diferentes partes de su antígeno diana, por ejemplo, diferentes dominios, regiones o epítopos de la biomolécula diana, o entre uno o más residuos aminoacídicos clave o tramos de residuos aminoacídicos de la biomolécula diana.

En el contexto de la presente invención, el término "parátopo" se refiere a esa parte de una molécula de anticuerpo dada que se requiere para la unión específica entre una diana y la molécula de anticuerpo. Un parátopo puede ser continuo, es decir, formado por residuos aminoacídicos contiguos presentes en la molécula de anticuerpo, o discontinuo, es decir, formado por residuos aminoacídicos que están en diferentes posiciones en la secuencia primaria de los residuos aminoacídicos, tal como en la secuencia de aminoácidos de las CDR de los residuos aminoacídicos, pero en estrecha proximidad en la estructura tridimensional, que adopta la molécula de anticuerpo.

En el contexto de la presente invención, el término "epítopo" se refiere a esa parte de una diana dada que se requiere para la unión específica entre la diana y un anticuerpo. Un epítopo puede ser continuo, es decir, formado por elementos estructurales contiguos presentes en la diana, o discontinuo, es decir, formado por elementos estructurales que están en diferentes posiciones en la secuencia primaria de la diana, tal como en la secuencia de aminoácidos de una proteína como diana, pero en estrecha proximidad en la estructura tridimensional, que la diana adopta en un entorno natural, tal como en un líquido corporal.

En un modo de realización, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es un anticuerpo biespecífico.

En otros modos de realización del anticuerpo o fragmento funcional de la presente invención, la cantidad de unión de cada parátopo a su respectivo epítopo en presencia simultánea de ambos epítopos es de al menos un 25 % de la cantidad de unión que se logra en ausencia del otro epítopo en condiciones de otro modo idénticas.

En otros modos de realización del anticuerpo o fragmento funcional de la presente invención, la cantidad de unión es de al menos un 50 %, en particular al menos un 75 % y más en particular al menos un 90 %.

En otros modos de realización del anticuerpo o fragmento funcional de la presente invención, el primer parátopo comprende residuos de CDR1 y CDR3 del dominio VL y CDR2 del dominio VH, y el segundo parátopo comprende residuos de CDR1 y CDR3 del dominio VH y CDR2 del dominio VL.

En modos de realización particulares, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es un anticuerpo humano o fragmento funcional del mismo.

En otros modos de realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la presente invención se basa en una secuencia de cadena pesada de la familia VH3 humana y una secuencia de cadena ligera de la familia Vkappa1 humana.

En otros modos de realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la presente invención se basa en una secuencia de cadena pesada de la familia VH3 humana y una cadena ligera de la familia Vlambda1 humana.

En otros modos de realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la presente invención se selecciona de un fragmento Fv monocatenario, un fragmento Fab y una IgG.

En otros modos de realización del anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la invención, la unión a un epítopo se puede inactivar mutando una de las posiciones Lib1 o Lib2, mientras que la unión al otro epítopo se mantiene intacta.

En este contexto, la frase "la unión ... [se] ... inactiva" se refiere a una situación donde la afinidad por el epítopo se reduce al menos 10 veces (por ejemplo, de 1 nM a 10 nM), y la frase "la unión ... se mantiene intacta" se refiere a una situación donde la afinidad por el epítopo se reduce como máximo 3 veces (por ejemplo, de 1 nM a 3 nM).

En dichos modos de realización particulares, la unión a un epítopo se puede inactivar mutando una de las posiciones posición VL 27, o posición VH 61, o mutando una de las posiciones de Lib2, posición VL 56 o posición VH 28.

En dichos modos de realización particulares, la unión a un epítopo se puede inactivar mutando uno de los residuos enumerados en la sección [0066] a R, cuando el residuo se selecciona de D, N, E y Q, o mutando dicho residuo a D, cuando el residuo es diferente de D, N, E o Q.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de unión que comprende al menos un dominio variable de anticuerpo que comprende una cadena ligera variable y una cadena pesada variable, en la que dicho dominio variable de anticuerpo se une a al menos una primera y una segunda diana, en la que la unión de dicho dominio variable de anticuerpo a dicha primera diana es independiente de la unión de dicho dominio variable de anticuerpo a dicha segunda diana y viceversa, y en la que dicha primera y segunda diana no son anticuerpos antiidiotípicos ni péptidos no fisiológicos, tales como péptidos usados para la cartografía de epítopos.

En el contexto de la presente invención, la unión del dominio variable de anticuerpo a una diana es "independiente" de la unión a la otra diana, cuando la cantidad de unión del primer parátopo a su respectivo epítopo (la primera diana) en presencia simultánea de ambas dianas es de al menos un 25 % de la cantidad de unión que se logra en ausencia de la otra diana en condiciones de otro modo idénticas. En particular, la cantidad de unión es de al menos un 50 %, en particular al menos un 75 % y más en particular al menos un 90 %.

En modos de realización particulares, dicha primera y dicha segunda diana son ambas dianas fisiológicamente pertinentes y/o epítopos de las mismas, incluyendo dianas relacionadas con enfermedad, tales como antígenos relacionados con cáncer, receptores de superficie celular, citocinas y/u otras moléculas de señalización.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la presente invención.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, o el vector de acuerdo con la presente invención.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para generar el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la presente invención, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, o el vector de acuerdo con la presente invención, in vitro o bien a partir de una célula huésped apropiada, incluyendo la célula huésped de acuerdo con la presente invención.

También se describe una colección de anticuerpos o fragmento funcional de los mismos, en la que dicha colección comprende una colección diversa de secuencias de dominio variable de anticuerpo en la que (i) al menos 3 residuos de CDR de posiciones Lib1 se diversifican, siempre que al menos un residuo diversificado se localice dentro el dominio VH y al menos una posición diversificada se localice dentro del dominio VL, y en la que no se diversifica ningún residuo de las posiciones Lib2, o bien (ii) al menos 3 residuos de CDR de las posiciones Lib2 se diversifican, siempre que al menos un residuo diversificado se localice dentro del dominio VH y al menos una posición diversificada se localice dentro del dominio VL, y en la que no se diversifica ningún residuo de las posiciones Lib1.

También se describe en el contexto del párrafo previo una colección de anticuerpos o fragmento funcional de los mismos, en la que en el caso de (i) al menos un residuo de cada CDR1 y CDR3 del dominio VL y CDR2 del VH se diversifica, o en el caso de (ii) al menos un residuo de cada uno de CDR1 y CDR3 del dominio VH y CDR2 del VL se diversifica.

También se describe en el contexto del párrafo 76 una colección de anticuerpos o fragmento funcional de los mismos, en la que en el caso de (i) al menos un residuo de las posiciones Lib1 E en dicho dominio de unión variable se diversifica adicionalmente, y/o en la que en el caso de (ii) al menos un residuo de las posiciones Lib2E en dicho dominio de unión variable se diversifica adicionalmente.

También se describe un procedimiento para generar una molécula de anticuerpo biespecífico o fragmento funcional de la misma que comprende las etapas de

a. generar una primera colección de moléculas de anticuerpo o fragmento funcional de las mismas, comprendiendo cada una una región variable VH-VL heterodimérica, con diversidad en al menos 3 posiciones de CDR seleccionadas del grupo de Lib1, siempre que al menos un residuo diversificado se localice dentro del dominio VH y al menos una posición diversificada se localice dentro del dominio VL, y en el que no se diversifican residuos de las posiciones Lib2;

b. seleccionar una primera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma específico para una primera diana o epítopo de dicha primera colección;

c. generar una segunda colección de moléculas de anticuerpo o fragmento funcional de las mismas, comprendiendo cada una una región variable VH-VL heterodimérica, con diversidad en al menos 3 posiciones de CDR seleccionadas del grupo de Lib2, siempre que al menos un residuo diversificado se localice dentro del dominio VH y al menos una posición diversificada se localice dentro del dominio VL, y en el que no se diversifican residuos de las posiciones Lib1;

d. seleccionar una segunda molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma específico para una segunda diana o epítopo de dicha segunda colección; y

e. generar una secuencia de ácido nucleico que codifica una tercera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma que comprende una región variable VH-VL heterodimérica, en la que la tercera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma comprende al menos 3 residuos encontrados en el grupo de posiciones Lib1 en la primera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma, de la que al menos un residuo se localiza dentro del dominio VH y al menos un residuo se localiza dentro del dominio VL, y en la que la tercera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma comprende además al menos 3 residuos encontrados en el grupo de posiciones Lib2 en la segunda molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma, de la que al menos un residuo se localiza dentro del dominio VH y al menos un residuo se localiza dentro del dominio VL.

También se describe un procedimiento para generar una molécula de anticuerpo biespecífico o fragmento funcional de la misma que comprende las etapas de

a. generar una primera colección de moléculas de anticuerpo o fragmento funcional de las mismas, comprendiendo cada una una región variable VH-VL heterodimérica, con diversidad en al menos 3 posiciones de CDR seleccionadas del grupo de Lib1, siempre que al menos un residuo diversificado se localice dentro del dominio VH y al menos una posición diversificada se localice dentro del dominio VL, y en el que no se diversifican residuos de las posiciones Lib2;

b. seleccionar una primera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma específico para una primera diana o epítopo de dicha primera colección;

c. generar una segunda colección de moléculas de anticuerpo o fragmento funcional de las mismas, comprendiendo cada una una región variable VH-VL heterodimérica, diversificando dicha primera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma introduciendo diversidad en al menos 3 posiciones de CDR seleccionadas del grupo de Lib2, siempre que al menos un residuo diversificado se localice dentro del dominio VH y al menos una posición diversificada se localice dentro del dominio VL, y en el que no se diversifican residuos de las posiciones Lib1;

d. seleccionar una segunda molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma específico para dicha primera y una segunda diana o epítopo de dicha segunda colección; y

e. de forma alternativa, realizar las etapas a. a d. con la modificación de que la primera colección en la etapa a. se genera diversificando al menos 3 posiciones de CDR seleccionadas del grupo de Lib2, y diversificando en la etapa c. dicho primer anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo en al menos 3 posiciones de CDR seleccionadas del grupo de Lib1.

También se describe en el contexto de los párrafos 79 y 80 un procedimiento, que comprende además la etapa de:

f. expresar la secuencia de ácido nucleico generada en las etapas a. a e. en una célula huésped o traducir el ácido nucleico en la proteína representando la tercera molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma.

También se describe un procedimiento, en el que cualquiera de dicha colección que tiene diversidad seleccionada del grupo Lib1 incluye diversidad adicional en al menos una posición potenciadora seleccionada del grupo de Lib1 E y/o en el que cualquiera de dicha colección que tiene diversidad seleccionada del grupo Lib1 incluye diversidad adicional en al menos una posición potenciadora seleccionada del grupo de Lib2E.

También se describe un procedimiento, en el que dicha primera colección es idéntica a una colección seleccionada de Lib D1L1, Lib D1L2 y Lib D2L1, o se deriva de dicha colección que tiene las posiciones diversificadas presentes en Lib D1L1, Lib D1L2 o Lib D2L1 en combinación con más de un 90 % de identidad de secuencia, en particular más de un 95 % de identidad de secuencia, en las regiones estructurales; y en el que dicha primera colección es idéntica a una colección seleccionada de Lib D1H1, Lib D1H2, Lib D1H3 y Lib D2H1, o se deriva de dicha colección que tiene las posiciones diversificadas presentes en Lib D1H1, Lib D1H2, Lib D1H3 o Lib D2H1 en combinación con más de un 90 % de identidad de secuencia, en particular más de un 95 % de identidad de secuencia, en las regiones estructurales.

En determinados de dichos modos de realización, la molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma se selecciona de un fragmento Fv monocatenario, un fragmento Fab y una IgG.

En un noveno aspecto, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de anticuerpo o fragmento funcional de la misma, y opcionalmente un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones se pueden formular, por ejemplo, para administración una vez al día, administración dos veces al día o administración tres veces al día.

La frase "farmacéuticamente aceptable", como se usa en relación con las composiciones de la invención, se refiere a entidades moleculares y otros ingredientes de dichas composiciones que son fisiológicamente tolerables y típicamente no producen reacciones adversas cuando se administran a un mamífero (por ejemplo, un ser humano). El término "farmacéuticamente aceptable" también puede querer decir aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de EE. UU. u otra farmacopea en general reconocida para su uso en mamíferos, y más en particular en seres humanos.

En el contexto de la presente invención, el término "aproximadamente" quiere decir entre un 90 % y un 110 % de un valor o intervalo dado.

El término "vehículo" aplicado a composiciones farmacéuticas de la invención se refiere a un diluyente, excipiente o vehículo con el que se administra un compuesto activo (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo biespecífico). Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua, soluciones salinas, soluciones de dextrosa acuosas, soluciones de glicerol acuosas y aceites, incluyendo los de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de vaselina, aceite de sésamo y similares. Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de A.R. Gennaro, 20.a edición.

El ingrediente activo (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo biespecífico) o la composición de la presente invención se puede usar para el tratamiento de al menos una enfermedad o trastorno, en el que el tratamiento se adapta a o se prepara apropiadamente para una administración específica como se divulga en el presente documento (por ejemplo, para administración una vez al día, dos veces al día o tres veces al día). Para este propósito, el prospecto del envase y/o la información para el paciente contiene la correspondiente información.

El ingrediente activo (por ejemplo, la molécula de anticuerpo biespecífico o fragmento de la misma) o la composición de la presente invención se puede usar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de al menos una enfermedad o trastorno, en el que el medicamento se adapta a o se prepara apropiadamente para una administración específica como se divulga en el presente documento (por ejemplo, para administración una vez al día, dos veces al día o tres veces al día). Para este propósito, el prospecto del envase y/o la información para el paciente contiene la correspondiente información.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitar su alcance.

Aunque la primera categoría de moléculas de anticuerpo biespecífico descritas anteriormente (con dos parátopos específicos para dos dianas que comprenden ambas residuos de CDR localizados dentro de la misma región variable de anticuerpo VH-VL heterodimérico) ofrece una variedad de beneficios potenciales como se describe anteriormente, se plantea la hipótesis de que se podría crear una clase completamente novedosa de molécula de anticuerpo, que pertenece a esta primera categoría de moléculas de anticuerpo pero es completamente diferente de los cuatro ejemplos mencionados anteriormente que se han informado en la literatura. Se planteó la hipótesis de que al seguir un enfoque completamente novedoso, podría ser posible lograr algunas mejoras espectaculares en la genomanipulación deliberada de anticuerpos pertenecientes a esta primera categoría, en comparación con los ejemplos mencionados anteriormente. Esta hipótesis tuvo en cuenta el hecho de que los procedimientos históricos mencionados anteriormente tienen algunas limitaciones potenciales significativas en el desarrollo de anticuerpos como ingredientes de fármacos activos.

De acuerdo con la presente invención, se describe una clase completamente novedosa de anticuerpos biespecíficos, que abordan estos problemas y tienen ventajas inesperadas y espectaculares. Se especuló que puede ser posible genomanipular dos parátopos distintos dentro de la región variable VH-VL de un anticuerpo heterodimérico, comprendiendo cada uno residuos de CDR tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera, pero sin superponerse y preferentemente no inmediatamente contiguos entre sí, para evitar cambios conformacionales en un sitio de unión como resultado de mutaciones en el otro sitio de unión, y para reducir la probabilidad de competencia entre las dos dianas en la unión al anticuerpo (minimizando el posible impedimento estérico entre las dos dianas en su estado unido). Además, se especuló que esta clase novedosa de molécula de anticuerpo se podría genomanipular creando primero dos colecciones de anticuerpos sintéticos, cada una en el fondo de un par VH-VL heterodimérico empaquetado, de los que en uno se podría diversificar un primer conjunto (Lib1) de posiciones de CDR de cadena pesada y ligera y de los que en el otro se podría diversificar un conjunto diferente, no superpuesto (Lib2) de posiciones de CDR de cadena pesada y ligera. Se concluyó que si dichas colecciones se pudieron crear y seleccionar con éxito en paralelo contra dos dianas no relacionadas, entonces se podrían crear potencialmente anticuerpos biespecíficos rápidamente introduciendo los residuos específicos seleccionados en las posiciones Lib1 durante las selecciones contra la primera diana, en un clon de anticuerpo con residuos específicos seleccionados en las posiciones de Lib2 durante las selecciones contra la segunda diana. Viceversa, también se concluyó que si dichas colecciones se pudieron crear y seleccionar con éxito contra dos dianas distintas, entonces se podrían crear potencialmente anticuerpos biespecíficos introduciendo los residuos seleccionados en las posiciones Lib2 durante las selecciones contra la segunda diana en un clon de anticuerpo con residuos específicos seleccionados en las posiciones Lib1 durante las selecciones contra la primera diana. Se especuló que esta estrategia de introducir un conjunto de residuos de un primer anticuerpo, definiendo una primera especificidad, en un segundo anticuerpo de una segunda especificidad sería de gran ayuda al crear ambas colecciones dentro de un andamio idéntico o altamente similar que define el par VH-VL empaquetado.

En la presente solicitud, se demuestra que se ha implementado con éxito la presente invención, creando varios anticuerpos VH-VL heterodiméricos biespecíficos contra dos dianas completamente no relacionadas. De forma importante, los anticuerpos se crearon rápidamente y fueron altamente específicos para solo dos dianas, sin mostrar unión a dianas no relacionadas adicionales. Sorprendentemente, los anticuerpos biespecíficos creados mostraron no solo una alta estabilidad biofísica (que no se ha demostrado para anticuerpos que se unen a una diana a través de residuos de bucle de CDR de la cadena ligera y a otra diana a través de residuos de bucle de CDR de la cadena pesada), sino también una estabilidad biofísica extremadamente alta incluso en comparación con el andamio usado en la creación de anticuerpos "dos en uno" y en comparación con clones de anticuerpos monoespecíficos establecidos usados como ingredientes activos en fármacos comercializados. Finalmente y también sorprendentemente, usando el ejemplo de un anticuerpo biespecífico contra GM-CSF y TNF-alfa, se pudo demostrar que una única mutación puntual conservadora en una posición de CDR dentro de la región de unión a Lib1 que proporciona el supuesto parátopo implicado en la unión a TNF-alfa eliminó básicamente la unión a TNF-alfa dejando mientras la unión a GM-CSF intacta, y que una única mutación puntual conservadora diferente en una posición de CDR dentro de la región de unión a Lib2 que proporciona el supuesto parátopo implicado en la unión a GM-CSF eliminó completamente la unión a GM-CSF dejando mientras la unión a TNF-alfa intacta. Esto demuestra que los anticuerpos de la presente invención se pueden unir de hecho a dos dianas no relacionadas de manera altamente específica, en lugar de a través de una "pegajosidad" general, y que, en contraste con los anticuerpos biespecíficos anteriores conocidos en la técnica, los dos sitios de unión que se diseñan como parátopos no superpuestos se comportan de forma esencialmente independiente, aunque ambos se localizan en una región variable VH-VL heterodimérica y aunque ambos comprenden residuos de CDR pertenecientes a la misma región variable heterodimérica. Por lo tanto, los anticuerpos de la presente invención tienen ventajas clave sobre los anticuerpos biespecíficos previos.

En modos de realización preferentes de la presente invención, el procedimiento de descubrimiento preferente comprende las etapas de (1) generar un par de colecciones basadas en el mismo andamio de anticuerpo VH-VL heterodimérico o uno altamente similar por diversificación de diferentes posiciones de CDR en la primera y segunda colección, (2 ) opcionalmente, incluir también diversificación de posiciones estructurales seleccionadas en el andamio de VH-VL en una o ambas de las dos colecciones para potenciar potencialmente las propiedades de unión de los clones seleccionados de las dos colecciones, (3) seleccionar ambas colecciones independientemente contra dos moléculas diana o epítopos y caracterizar proteínas fijadoras para identificar clones de anticuerpo específicos de diana o epítopo con propiedades deseadas, (4) introducir todos los residuos o un subconjunto de los residuos (preferentemente la mayoría de los residuos pero no menos de 3 de los residuos) seleccionados en posiciones diversificadas en un clon de anticuerpo seleccionado de una colección y específico para una primera diana o epítopo en un clon de anticuerpo específico de diana seleccionado de la otra colección y específico para una segunda diana o epítopo. Para que este procedimiento de descubrimiento funcione de manera óptima, algunos grupos de residuos clave desempeñan un papel importante:

Examinando modelos moleculares de anticuerpos VH-VL heterodiméricos in silico y realizando mutagénesis de "simulaciones" de anticuerpos VH-VL heterodiméricos no seleccionados sin especificidad (datos no mostrados), se derivó una lista de residuos de CDR que se podrían diversificar potencialmente para formar el primer sitio de unión potencial contra la primera diana (residuos de Lib1) y una lista de residuos de CDR que se podrían diversificar potencialmente para formar el segundo sitio de unión potencial contra la segunda diana (residuos de Lib2). También se derivó una lista de residuos potenciadores potenciales en las regiones estructurales de anticuerpo, que en la molécula de anticuerpo plegada están en estrecha proximidad de los residuos de CDR de Lib1 o Lib2 y que se pueden diversificar potencialmente para modificar las propiedades y potenciar la unión del primer parátopo que comprende residuos de CDR de Lib1 a una primera diana (residuos potenciadores de Lib1 E) y la unión del segundo parátopo que comprende residuos de CDR de Lib2 a una segunda diana (residuos potenciadores de Lib2E). Finalmente, se derivó una lista de residuos de CDR que preferentemente se dejarían idénticos o muy similares en ambas colecciones, para mantener un paquete invariable de una región del núcleo central de la molécula de anticuerpo en ambas colecciones, que a continuación también estaría presente en todos los clones de anticuerpos biespecíficos combinados que comprenden un conjunto de residuos de Lib1 específicos de diana 1 y opcionalmente Lib1 E así como un conjunto de residuos de Lib2 específicos de diana 2 y opcionalmente Lib2E. Se concluyó que esta región de núcleo empaquetada invariable protegería los dos sitios de unión entre sí, haciendo que el primer parátopo contra la primera diana fuera de algún modo inmune a los efectos conformacionales perjudiciales que resultan de cambios en el segundo parátopo contra la segunda diana. De hecho, se ha podido demostrar que las afinidades y la cinética de unión de clones de anticuerpos originales normalmente coinciden estrechamente con clones de anticuerpos biespecíficos combinados derivados de los clones originales. El ejemplo 8 ilustra esto usando los antígenos ejemplares VEGF e IL6 donde los anticuerpos originales IL6P con una afinidad de 38 nM y VEGFP con una afinidad de 11 nM se combinaron para proporcionar el anticuerpo biespecífico VH6L con una afinidad de 40 nM para IL6 y 7,8 nM para VEGF. Este nivel sorprendentemente alto de independencia de los dos sitios de unión hace posible madurarlos por afinidad y en paralelo de una forma que no es posible para los anticuerpos "dos en uno" (tercer ejemplo histórico anterior) o heterodímeros de dominio único emparejados biespecíficos (cuarto ejemplo histórico anterior). También se concluyó que la región de núcleo invariable puede lograr un espacio entre los dos sitios de unión, permitiéndoles potencialmente que se unan a dos dianas independientemente sin competencia provocada por parátopos superpuestos o por impedimento estérico entre una primera diana unida y una segunda no unida, dependiendo de la naturaleza y tamaño molecular de cada molécula diana. De hecho, usando los antígenos ejemplares GMCSF e IL6, se ha podido demostrar para la clase novedosa de moléculas de anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que para algunos de los clones combinados, la unión conjunta de ambos antígenos a una única región variable VH-VL es posible. Además, el ejemplo 9 ilustra que la afinidad de la unión conjunta del segundo antígeno a la región variable puede ser independiente de si la primera diana está presente o ausente. La posibilidad de lograr dicha unión conjunta a la misma región variable VH-VL y la posible independencia de las afinidades de unión conjunta no se han demostrado para otros tipos de anticuerpos biespecíficos históricos y representan una ventaja única de los anticuerpos novedosos de acuerdo con la presente invención. En algunos de los anticuerpos biespecíficos novedosos, el comportamiento de unión independiente se puede demostrar además por mutaciones como las enumeradas en el ejemplo 10. En dichos anticuerpos, es posible inactivar o reducir en gran medida la afinidad para una primera diana mientras se deja intacta la afinidad para una segunda diana haciendo una mutación puntual en una posición Lib1, y viceversa, inactivar o reducir en gran medida la afinidad para dicha segunda diana mientras se deja intacta la afinidad para dicha primera diana haciendo una mutación puntual en una posición Lib2.

Ejemplo 1: construcción de colecciones

Los conjuntos de genes sintéticos para las colecciones Lib D1L1 y Lib D1H1 se adquirieron de GeneArt, mientras que los conjuntos de genes sintéticos para las colecciones D1L2 y D1H2 se adquirieron de Sloning Biotechnology. Las cuatro colecciones se clonaron en un vector de presentación en fagos recién construido que se construyó a partir del pUC19 principal (que se adquirió de NEB) por la adición de un origen M13; dos sitios de unión a ribosoma sintéticos que impulsan la expresión de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos; y genes sintéticos que codifican dos péptidos señal que impulsan la secreción de polipéptidos de anticuerpos en el periplasma de E. coli, los dominios constantes C^k y CH1 humanos y una porción C terminal truncada de la proteína III de M13 fusionada con el extremo C del dominio constante CH1 humano. Las colecciones se transformaron en células E. coli TG1 para proporcionar 4 colecciones con diversidades transformadas de 109 cada una. A partir de las células E. coli TG1 transformadas, las cuatro colecciones se produjeron como colecciones de fagos que presentan fragmentos Fab diversificados, usando el fago colaborador M13KO7 y procedimientos de biología molecular estándar como se describe por (Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1.a ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3.a ed., 2001).

Ejemplo 2: fijación

Las proteínas fijadoras de colecciones de partículas Fab-en-fago se pueden seleccionar de acuerdo con procedimientos de fijación estándar (Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1.a ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3.a ed., 2001) contra las dianas inmovilizadas MBP y GST.

Ejemplo 3: cribado

Las partículas de fago seleccionadas en el ejemplo 2 se pueden rescatar infectando células huésped bacterianas (Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1.a ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3.a ed., 2001). La proteína Fab se expresa a partir de clones individuales y se somete a prueba para determinar la unión específica contra las dianas MPB y GST. Los resultados positivos se usan en la siguiente etapa para clonar construcciones biespecíficas.

Ejemplo 4: clonación de anticuerpos biespecíficos

Los genes de anticuerpos se diseñaron en base a la secuencia de aminoácidos deseada y se adquirieron como genes sintéticos o fragmentos de genes sintéticos de GeneArt o DNA2.0. Los genes que codifican variantes de anticuerpos con mutaciones puntuales se generaron por PCR o PCR superpuesta, usando la polimerasa Pwo Master, adquirida de Roche, y oligonucleótidos sintéticos que codifican las mutaciones puntuales deseadas, adquiridos de Thermo Fisher Scientific, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se generó un vector de expresión de Fab de E. coli por la modificación del plásmido pUC19, que se adquirió de New England Biolabs. La cadena principal de pUC19 se modificó por la adición de dos sitios de unión a ribosoma sintéticos que impulsan la expresión de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, dos secuencias de péptidos señal sintéticos que impulsan la secreción de cadenas de anticuerpos en el periplasma de E. coli y un origen de fago M13 que permite potencialmente la producción de hebra única. Genes de anticuerpos sintéticos, fragmentos sintéticos de genes de anticuerpos y variantes generadas por PCR de genes de anticuerpos que codifican mutaciones puntuales se clonaron en este vector de expresión de Fab de E. coli por digestión de restricción, usando endonucleasas de restricción adquiridas de Roche, seguido de ligación, usando LigaFast adquirida de Promega, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de ligación se transformaron en células E. coli TG1 competentes adquiridas de Stratagene o Zymoresearch.

Ejemplo 5: expresión y purificación de anticuerpos

Los clones de E. co liTG1 que portan construcciones de expresión de Fab se cultivaron en medios sólidos y líquidos LB y TB, adquiridos de Carl Roth, que se complementaron con carbenicilina y glucosa, adquiridos de VWR. La expresión de anticuerpos en cultivos líquidos se realizó durante la noche en matraces Erlenmeyer en una incubadora con agitación y se indujo por la adición de isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG), adquirido de Carl Roth, al medio de crecimiento. Los sobrenadantes de cultivo que contenían fragmentos Fab secretados se aclararon por centrifugación de los cultivos de expresión. Los sobrenadantes de cultivo aclarados se complementaron con un 1 % en volumen de solución de estreptomicina/penicilina, adquirida de PAA Laboratories, un 2 % en volumen de Tris 1 M pH 8,0, adquirido de VWR, y un 0,4 % en volumen de resina STREAMLINE rProtein A, adquirida de GE Healthcare. Los sobrenadantes del cultivo complementado se incubaron en una incubadora rodante durante 3 horas o durante la noche para lograr la unión de fragmentos Fab a la resina de proteína A. A continuación, las resinas se transfirieron a columnas de flujo por gravedad, se lavaron una vez con 30 volúmenes de lecho de 2x PBS, pH 7,4, adquirido de Invitrogen, se lavaron una vez usando 5 volúmenes de lecho de un tampón que contenía Tris 10 mM, pH 6,8 y NaCl 100 mM, adquiridos de VWR, y se eluyeron usando un tampón que contenía ácido cítrico 10 mM, pH 3 y NaCl 100 mM, adquiridos de VWR. Los fragmentos Fab eluidos se neutralizaron añadiendo un 8 % en volumen de Tris 1 M, pH 8,0. Los fragmentos Fab purificados neutralizados se intercambiaron con tampón en 1x PBS puro, pH 7,4 (que contiene KH2PO41,06 mM, Na2HPO4-7H2O 2,97 mM, NaCl 155,17 mM y ningún otro complemento; Invitrogen, n.° de catálogo 10010056), usando columnas de desalinización illustra NAP-5 de GE Healthcare, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 6: medición de la estabilidad de anticuerpos

La estabilidad biofísica de los fragmentos Fab purificados e intercambiados con tampón se determinó en 1x PBS, pH 7,4 (Invitrogen, n.° de catálogo 10010056) usando calorimetría diferencial de barrido (DSC). Para todas las mediciones se usó un microcalorímetro de células capilares equipado con automuestreador y controlado por el programa informático VPViewer2000 CapDSC de MicroCal. Todos los fragmentos Fab se exploraron frente a tampón puro que no contenía anticuerpo (1x PBS, pH 7,4; Invitrogen, n.° de catálogo 10010056). Los parámetros de exploración se configuraron para analizar un margen de temperatura de 32 °C a entre 105 °C y 115 °C, con un termostato previo a la exploración de 2 minutos, un termostato posterior a la exploración de 0 minutos y sin ganancia. La tasa de exploración se configuró a 250 °C por hora para aplicaciones de cribado y a 60 °C por hora para el reanálisis de los mutantes de combinaciones más estables. La temperatura de fusión absoluta de los fragmentos Fab determinada en el modo de cribado (tasa de barrido 250 °C por hora) fue de 3,7 °C a 4,5 °C mayor que en el modo de reanálisis (tasa de barrido 60 °C por hora), pero la clasificación de clones fue la misma en ambos modos. Las temperaturas de fusión de los fragmentos Fab se determinaron después de la sustracción de referencia de PBS, usando el programa informático Origin 7.0 de MicroCal.

Ejemplo 7: medición de la especificidad de anticuerpos

Para someter a prueba la especificidad de anticuerpos seleccionados de las colecciones Lib1 y Lib2 contra una diana y la especificidad de anticuerpos biespecíficos diseñados para unirse a ambas dianas, se realizaron ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA) usando procedimientos estándar. En resumen, se prepararon placas Nunc Maxisorp recubriendo con estreptavidina disuelta en 1x PBS, uniendo 20 nM de dianas biotiniladas (GST, MBP, HEL o VEGF) en PBS-T (Tween-20 al 0,3 % disuelto en 1x PBS) y bloqueando con leche desnatada en polvo al 5 % en PBS-T. Después de esto, se añadieron 50 |jl de sobrenadante de cultivo de E. coli TG1 que expresa clones de anticuerpos como fragmentos Fab solubles en placas de microvaloración, seguido de detección de fragmentos Fab unidos usando anticuerpo policlonal anti-cadena ligera kappa humano de cabra (Sigma) o anticuerpo anti-marca Strep de ratón (IBA) específico para una marca Strep-II fusionada al extremo C de la cadena pesada en la construcción de expresión de Fab soluble. Los anticuerpos secundarios se detectaron usando anticuerpos terciarios marcados con HRP, los ELISA se desarrollaron usando sustrato TMB (KPL) y la señal se cuantificó usando un lector de placas Victor de PerkinElmer configurado a 450 nm. Se descubrió que el Fab Simulación 1 secretado en el sobrenadante de cultivo de E. coli no se unió a ninguna de las cuatro dianas, Fab LG1 (que se había seleccionado de la colección Lib D1L1) se unió solo a GST, Fab HM2 (que se había seleccionado de la colección Lib D1H1) se unió solo a MBP, y Fab DT3 (que combinó todos los residuos específicos de diana encontrados en Fab LG1 y HM2) se unió solo a GST y MBP. Ninguno de los clones se unió a las dianas de control HEL o VEGF (figura 5). Los experimentos se realizaron por duplicado usando dos colonias independientes para cada Fab.

Ejemplo 8: afinidades de anticuerpos originales y biespecíficos

Se seleccionaron colecciones de anticuerpos contra VEGF humano (Peprotech, n.° de catálogo 100-20) e IL6 humana (Peprotech, n.° de catálogo 200-06). De los clones de anticuerpos originales aislados, IL6P y VEGFP se combinaron en el clon de anticuerpo biespecífico VH6L. La secuencia de VH6L se muestra en la figura 4, que muestra una mutación puntual adicional en el aminoácido 4 de la cadena ligera. Para evaluar las afinidades de anticuerpos originales y biespecíficos, se realizó un análisis Biacore™ para analizar el comportamiento de unión de IL6P, ^v H6L y VEGFP. Para ello, se inmovilizó un anticuerpo de captura anti-cadena ligera en un chip CM5 usando acoplamiento de amina, dando como resultado 12000 UR. Los fragmentos Fab se capturaron a un nivel de 400-500 UR y se pasó por el chip una serie de concentraciones de IL6 y VEGF, variando de 0 a 450 nM. Como se representa en la figura 7, el clon IL6P se une a IL6, pero no a VEGF, el clon VEGFP se une a VEGF, pero no a IL6, y el clon combinado VH6L se une tanto a IL6 como a VEGF. Como se muestra en la tabla 1, las afinidades para las dianas son similares a los anticuerpos originales y biespecíficos. La constante de disociación, KD, es 38 nM y 40 nM para IL6P y VH6L, respectivamente, y 11 nM y 7,8 nM para VEGFP y VH6L, respectivamente.

Tabla 1. Mediciones de afinidad

Ejemplo 9: unión conjunta de dos antígenos a la misma región variable VH-VL

Para demostrar que los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención se pueden unir a dos antígenos diferentes simultáneamente a través de la misma región variable VH-VL, se realizó un experimento Biacore™ usando el clon de anticuerpo biespecífico GH6L específico para GMCSF humano e IL6 humano. La secuencia de GH6L se muestra en la figura 4, que muestra una mutación puntual adicional en el aminoácido 4 de la cadena ligera. El anticuerpo se expresó en formato de IgG1 humana usando vectores de expresión de mamífero estándares que portan ADNc de péptido señal y cadena pesada y ligera de GH6L, por transfección transitoria de células HEK293-6E. La IgG expresada se purificó por afinidad usando resina de proteína A. Para el análisis Biacore™ , se inmovilizó GMCSF (Peprotech, n.° de catálogo 300-03) o un anticuerpo de captura anti-cadena ligera en un chip CM5 usando acoplamiento de amina, dando como resultado 4000 UR y 12000 UR de GMCSF inmovilizado y anticuerpo de captura anti-cadena ligera, respectivamente.

Se capturó GH6L en las superficies preparadas y, en cada caso, se pasó una serie de concentraciones de IL6 (Peprotech, n.° de catálogo 200-06), y los datos se analizaron usando el programa informático BIAevaluation. Como se puede observar en la figura 8A, GH6L capturado en GMCSF se puede unir a IL6. Un experimento de control que inyectó GMCSF no dio lugar a una señal que mostrara que la señal de unión de IL6 se debía a la unión simultánea en la misma región variable VH-VL en lugar de la unión de un "brazo libre" de GH6L que no interactúa con GMCSF en la superficie del chip. En la figura 8B, GH6L se captura por el anticuerpo de captura anti-cadena ligera genérico para medir la afinidad de unión a IL6 de GH6L sin la presencia de GMCSF. Comparando las figuras 8A y 8B, se puede observar que GH6L se une a IL6 con una afinidad similar independientemente de si GH6L está unido a GMSCF o no.

Ejemplo 10: comportamiento de unión independiente

Para varios anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención, el comportamiento independiente de los dos sitios de unión se pudo mostrar usando mutagénesis dirigida a sitio de residuos únicos localizados dentro de las regiones de unión de Lib1 o Lib2. En un caso, se mutó un clon de anticuerpo biespecífico dirigido contra la diana A y la diana B.

Incorporando una única mutación puntual de LCDR3 conservadora H93Y dentro de la región de unión a Lib1 que proporciona el supuesto parátopo implicado en la unión a la diana A, la afinidad por la diana A se eliminó en gran medida, mientras que la afinidad por la diana B se mantuvo intacta.

Por otro lado, incorporando una única mutación puntual de LCDR2 conservadora W56Y dentro de la región de unión a Lib2 de ese clon de anticuerpo que proporciona el supuesto parátopo implicado en la unión a la diana B la afinidad por la diana B se eliminó por completo mientras que la afinidad por la diana A se mantuvo intacta.

En otro caso, se mutó un clon de anticuerpo biespecífico dirigido contra la diana C y la diana D. Incorporando una única mutación puntual LCDR1 conservadora N27D dentro de la región de unión a Lib1 que proporciona el supuesto parátopo implicado en la unión a la diana C, la afinidad por la diana C se eliminó en gran medida, mientras que la afinidad por la diana D se mantuvo intacta.

Por otro lado, incorporando una única mutación puntual de HCDR1 L28D o una única mutación puntual de LCDR2 Y56D dentro de la región de unión a Lib2 de este segundo clon de anticuerpo que proporciona el supuesto parátopo implicado en la unión a la diana D, la afinidad por la diana D se eliminó mientras que la afinidad por la diana C se mantuvo intacta.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespecífico o fragmento funcional del mismo que comprende al menos un dominio de unión variable que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL), en el que dicho dominio de unión comprende dos parátopos para dos epítopos no relacionados, en el que (i) la unión de cada parátopo a su epítopo no evita la unión simultánea del otro parátopo a su respectivo epítopo, y en el que (ii) el primer parátopo comprende residuos de CDR1 y CDR3 del dominio Vl y CDR2 del dominio Vh , y el segundo parátopo comprende residuos de CDR1 y CDR3 del dominio VH y CDR2 del dominio VL.

2. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo biespecífico, en el que dichos dos epítopos no relacionados están presentes en dos moléculas diferentes.

3. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la reivindicación 1 o 2, en el que la cantidad de unión de cada parátopo a su respectivo epítopo en presencia simultánea de ambos epítopos es de al menos un 25 % de la cantidad de unión que se logra en ausencia del otro epítopo en condiciones de otro modo idénticas.

4. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la reivindicación 3, en el que la cantidad de unión es de al menos un 50 %, en particular al menos un 75 % y más en particular al menos un 90 %.

5. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que es un anticuerpo humano o fragmento funcional del mismo.

6. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la reivindicación 5 que se basa en una secuencia de cadena pesada de la familia VH3 humana y una secuencia de cadena ligera de la familia Vkappa1 humana.

7. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la reivindicación 5 que se basa en una secuencia de cadena pesada de la familia VH3 humana y una secuencia de cadena ligera de la familia Vlambda1 humana.

8. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo se selecciona de un fragmento Fv monocatenario, un fragmento Fab y una IgG.

9. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Una célula huésped, que es una célula huésped aislada que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 o el vector de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Un procedimiento para generar el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, o el vector de acuerdo con la reivindicación 10, in vitro o bien de una célula huésped apropiada, que es una célula huésped aislada que incluye la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11.