JP5017097B2 - 設計デコイタンパク質を用いる溶液相バイオパニング方法 - Google Patents
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Description
本発明は、パニングプロセスにおいて設計デコイリガンドを用いてあらかじめ選択したドメインに結合するリガンド結合パートナーを選択する新規な方法を提供する。デコイリガンドは、それが推定結合部位を構成するあらかじめ選択したドメインにおいてのみ標的タンパク質と異なるように設計される。デコイタンパク質の設計は、実際の測定から得られる構造情報、例えばX線結晶学的データに基づくことができ、もしくは設計はインシリコ情報、三次元構造の計算モデリングにより作製されたデータに基づくことができる。構造情報が利用可能である場合、デコイタンパク質の設計は簡略化される。構造情報が利用可能でないかもしくは不完全である場合、配列の慎重な(discreet)領域の改変は、デコイを作製するために、種ホモログ(species homologue)のような天然のバリアントに基づくことができる。
略語
Abs 抗体、ポリクローナルもしくはモノクローナル
bFGF 塩基性線維芽細胞増殖因子
GM−CSF 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
IL インターロイキン
Mab モノクローナル抗体
TF 組織因子
FIIV 第IIV因子(不活性)
FIIVa 第IIVa因子(活性化)
FX 第X因子(不活性)
FX 第Xa因子(活性化)
[発明の詳細な記述]
「抗体」という用語は、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン由来の結合性フラグメントを意味する。全ての免疫グロブリンが抗原に結合するとは限らないが、抗体のフラグメントは抗原、標的ポリペプチドもしくはタンパク質、およびいくつかの他の分子に結合しうることが示されている。従って、本明細書において用いる場合、「抗原結合フラグメント」には:(i)それぞれの定常(C)ドメインと一緒に抗体重(H)鎖および軽(L)鎖の可変(V)ドメインからなるFabフラグメント(VL−CLおよびVH−CH1ドメイン);(ii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iii)単一抗体のVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント;(iv)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward,E.S.et al.,Nature 341:544−546(1989));(v)単離されたCDR領域;(vi)F(ab’)2フラグメント;(vii)VHドメインおよびVLドメインが、これら2つのドメインが結合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結される、一本鎖Fv分子(scFv);(Viii)二重特異性一本鎖Fvダイマーならびに(ix)二重特異性抗体、多価もしくは多重特異性フラグメントまたは標的ポリペプチドに結合することができそして免疫グロブリン由来のフラグメントを含んでなる他の設計構築物が包含されるがこれらに限定されるものではない、上記のものを含んでなる組み合わせおよび融合タンパク質が包含されるがこれらに限定されるものではない。
設計した競合タンパク質を用いるファージディスプレイ抗体の指定選択によりあらかじめ選択したエピトープに結合する抗体もしくは他の結合リガンドを単離する方法を考案した(図1)。該方法は、適切なデコイタンパク質の設計に適用される標的タンパク質についての構造情報に依存する。このデコイタンパク質は、所望のエピトープ特異的抗体を単離するために抗体ファージディスプレイにおける競合相手として用いられる(図1)。
各リンパ球細胞は、抗原にではなくエピトープに特異的な抗体を生産する。抗原は、免疫系により認識されそして抗体および/もしくは細胞傷害性T細胞により標的とされている外来細胞、粒子、タンパク質もしくは分子の一部であるが、エピトープはタンパク質上の抗原決定基に対応する結合部位である。ポリペプチド、脂質、核酸および多数の他の物質もまた、抗原として働くことができる。免疫応答はまた、「ハプテン」と称されるより小さい物質に対して、これらがウシ血清アルブミンもしくはヘモシアニンまたは他の合成マトリックスのようなより大きい「キャリアタンパク質」に化学的に連結される場合に生成されることもできる。ハプテンは、薬剤、単糖、アミノ酸、小ペプチド、リン脂質もしくはトリグリセリドのような様々な分子であることができる。強い免疫応答を引き出す抗原は、「強力に免疫原性」(“strongly immunogenic”)であると言われる。抗原決定基、クローン免疫応答を引き出すものは、わずか1〜8個のアミノ酸もしくは1〜6個の単糖であり得ることが実験的に決定されている。実施面上、クローン由来の免疫グロブリン(モノクローナル抗体)により認識されるエピトープは、タンパク質の表面上のより大きいそして非連続配列を包含することができる。
「デコイタンパク質」は、本明細書において用いる場合、結合する部位もしくは機能領域を含む特定のドメインで標的タンパク質と1つもしくはそれ以上の構造的特徴において異なるタンパク質をさす。従って、デコイはキメラ標的タンパク質であることができ、もしくはデコイは種ホモログのような天然に存在するタンパク質であることができ、そして標的リガンドはあらかじめ選択した結合ドメインを含む設計配列であることができる。本発明の方法において、デコイは低親和性で非特異的な結合物に結合し、そして保持される標的と複合体を形成する結合物はそれにより選択される。1つの態様において、標的エピトープを受け入れるために骨格として働くことができる適当な構造ホモログは、標的タンパク質のオーソルグであることができる。構造ホモログはまた、多重遺伝子族の別のメンバーであることもできる。
本発明のエピトープ指定抗体もしくは他の結合リガンドの単離への3つの一般的方法は:(1)抗体もしくは他の潜在的結合リガンドのディスプレイライブラリーを用いる競合選択;(2)ディスプレイライブラリーを用いる非競合選択、続いて異なる結合活性についてのスクリーニング;および(3)動物の免疫、続いて異なる結合活性についてのスクリーニングである。
TF8−5G9と称されるMabは、ヒト組織因子を認識して結合し、そしてTFもしくはTF/第VIIa複合体と第X因子との結合を妨げる(Ruf,W.and Edgington,T.S.1991.Thromb.Haemost.66:529−539)。ヒトTFと複合体を形成したTF8−5G9 Fabの結晶構造の分析に基づき、Fabにより認識されるエピトープを形成する残基は全て、ヒトTFの残基149〜204の間に入る。タンパク質のこの領域はまた、GlaドメインFXとTFとの相互作用において重要な役割を果たすことも知られている(Ruf et al 1992)。huTFの149〜204の間の15個の特定の残基は、結合に有意なエネルギー的寄与をするために適切に位置する(Huang,et al.J.Mol.Biol.275,873−894)。以下の配列アライメントにおいて例示されるように、ヒト(GenPept受託番号NP_001984)およびマウスTF(GenPept受託番号NP_034301)の細胞外ドメイン配列をヒトECドメインの残基149〜204とマウスECドメインの152〜207との間で整列させると、15個の重要な残基のうち7個が同一であり(ヒト残基K149、K165、K166、T167、T170、N171、Q190)、一方、15個の残基のうち8個が異なる(ヒト残基は:Y156T、K169I、V192M、P194F、V198T、R200Q、K201NおよびD204Gで置換される)。ボールド体の残基は、TF8−5G9:huTF複合体の安定化に有意に寄与する残基を表す。これらの残基は、1〜4kcal/mol以上の結合のΔ自由エネルギーを有する。
選択された抗mTF代理FabをmTF源としてマウス脳抽出物を用いてヒト血漿における凝固を阻害するそれらの能力について評価した。以前の実験に基づき、mTF上のTF8−5G9エピトープに結合するFabは、凝固経路を遮断しそして血栓形成を遅らせると予想される。このアッセイでは、フィブリン塊形成の阻害をヒト血漿において測定した。試験した8個のFabのうち4個は、インビトロでヒト血漿における凝固を遅らせるかもしくは阻害した:PHD103、PHD104、PHD126およびPHD127。PHD126およびPHD127は、ヒト血漿における凝固を阻害することにおいて有意により強力であった。Fab濃度に対する凝固時間に適合させた曲線の基づき、測定可能なE50値は0.2μg/ml〜63μg/mlの間であった。
凝固を阻害した抗mTF Fab(PHD103、104、126、127)による第X因子阻害をマウス脳抽出物(組織因子源として)の存在下で測定した。抽出物をFVIIaとインキュベーションし、そして抗mTF代理MabをFXの存在下で加え、そしてFXaへのFXの転化の阻害を測定した。PHD103、126および127 Fabは、第Xa因子への第X因子活性化(切断)を阻害した。次に、第X因子活性化の阻害を全長抗mTF IgGを用いて再評価した。十分な阻害がPHD103、126および127について認められ、一方、PHD104では阻害は認められなかった。
最も活性の魅力的な候補抗体として、PHD126およびPHD127を高レベルでmTFを発現するB6F10黒色腫細胞に結合するそれらの能力について評価した。PHD126およびPHD127は、それぞれ37.8nMもしくは4.35nMのEC50で用量依存的に細胞結合型mTFに結合した(図4)。図2における個々のサブドメイン成分により示されるようなPHD126および127重鎖および軽鎖の完全な可変領域配列は、示されるように配列番号:6〜9として含まれる。
本明細書に記述される実験は、設計した競合相手タンパク質を用いるファージディスプレイ抗体のエピトープ指定選択が実行可能な方法であることを示す。該方法は、適切な競合相手の設計を可能にするために標的タンパク質についての構造情報に依存する。さらに、この方法は、興味のあるタンパク質上の特定のエピトープに反応性の抗体の選択を可能にする。ファージディスプレイ抗体ライブラリーを用いる抗体選択の既存の方法は、興味のあるエピトープに正確に向けることができない。開示される方法は、標的エピトープに特異的な抗体に向かう選択の非常に正確なそして効果的な方向性を可能にするという利点を有する。我々は、mTF上の特異エピトープに対する抗体の選択を可能にするためにこの方法を用いている。
インターロイキン−13(IL−13)は、喘息の患者の気道に高レベルで存在するサイトカインである。IL−13は活性化CD4+T細胞により生産され、そしてB細胞増殖およびIgE生産、杯細胞過形成および粘液過分泌、好酸球性炎症、ならびに喘息患者で認められる気道過敏性において重要な役割を果たす。トランスジェニックマウスにおけるIL−13の過剰発現は、喘息様表現型を与えることが示されており、一方、アンタゴニストを用いるIL−13の中和は、喘息反応を弱めることが示されている。
本発明は、核磁気共鳴(NMR)を用いるタンパク質上のエピトープの同定のための新技術を記述する。NMRは、それらの局所環境に基づいて、特定の原子(一般にH1、C13およびN15)、従ってアミノ酸残基を同定する技術である。炭素および窒素NMRスペクトルはプロトンスペクトルより複雑でないが、必要とされる核の天然存在量は感度を限定し得る。巨大タンパク質では、同様の環境における原子間のスペクトルのかなりの量の重複があり得る。大部分のもしくは全ての共鳴の完全な帰属は、十分な時間および十分に高い解像度の機器が与えられれば巨大タンパク質について行うことができる。
IL−4および近いアナログ、IL−13の結晶構造に基づき、特定の受容体結合ドメインを抗体標的として選択した。両方のタンパク質のこの領域への結合物の選択のためにキメラタンパク質を設計した。
Claims (6)
- a)ファージ粒子の表面上にポリペプチドを発現するファージ粒子のライブラリーを準備する段階、
b)標的タンパク質のあらかじめ選択したエピトープに対応する標的タンパク質の5〜15の直線状セグメント内のアミノ酸配列において5〜10の改変を有するデコイタンパク質を製造する段階、
c)標的タンパク質に結合するポリペプチドを有するファージ粒子を選択するためにファージ粒子のライブラリーを標的タンパク質と共にインキュベーションする段階、
d)あらかじめ選択したエピトープに特異的なファージ粒子について陰性選択するためにモル過剰濃度で競合相手としてデコイタンパク質を加える段階、
e)標的タンパク質に結合するファージ粒子をデコイタンパク質に結合するファージ粒子から分離する段階、および
f)標的タンパク質に結合したファージ粒子を回収する段階
を含んでなる、標的タンパク質のあらかじめ選択したエピトープに結合するポリペプチドの同定方法。 - 請求項1記載の方法であって、標的タンパク質に結合する結合物を除外する前に試験用のライブラリーから結合物のサブセットを選択するためにデコイを使用することを特徴とする、方法。
- 請求項1記載の方法であって、デコイに結合する結合物を除外する前にライブラリーから結合物のサブセットを選択するために標的タンパク質を使用することを特徴とする、方法。
- 請求項1記載の方法であって、あらかじめ選択したエピトープに結合するポリペプチドが抗体または抗体フラグメントであることを特徴とする、方法。
- 請求項4記載の方法であって、ポリぺプチドがFab、Fab’もしくはF(ab’)2フラグメントをまたはその誘導体を含む抗体フラグメントであることを特徴とする、方法。
- 請求項4記載の方法であって、抗体がTF8−5G9と称されるマウス抗ヒト組織因子と同じように、マウス組織因子上の類似のエピトープに結合する代替抗体であることを特徴とする、方法。
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