CN101426526B

CN101426526B - 使用工程诱杀蛋白的液相生物淘选方法

Info

Publication number: CN101426526B
Application number: CN2005800210206A
Authority: CN
Inventors: K·奥奈尔; R·斯维特; G·赫夫纳
Original assignee: Centocor Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2004-04-26
Filing date: 2005-04-22
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2025-04-22
Also published as: CN101426526A; EP1747015B1; EP1747015A2; JP2007534759A; DK1747015T3; AU2005249379A1; CA2564098C; EP1747015A4; PT1747015E; JP5017097B2; ES2391097T3; SI1747015T1; WO2005117969A3; WO2005117969A2; AU2005249379B2; CY1113211T1; PL1747015T3; HK1132177A1; CA2564098A1

Abstract

本发明涉及定向选择可与靶生物分子中特异性功能域结合的生物治疗分子的方法。通过使用以下紧密相关的分子来进行定向选择，其中之一是诱杀物分子，另一个则含有靶域或表位。本发明根据物理数据，并结合导出数据，来确定诱杀物分子与靶分子间仅存在发生定向结合的特异性功能域或表位的差异。

Description

使用工程诱杀蛋白的液相生物淘选方法

本申请要求对美国临时申请系列No.60/565,674和No.60/565,633(申请于2004年4月26日)的优先权，其内容均通过引用全部结合到本文。因此提交的申请包含电脑可读盘上的序列表，其资料通过引用结合到本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及到通过使用组合抗体噬菌体展示文库来选择结合于所选表位上的抗体的方法。本发明也涉及通过这种方法制备的抗体。

相关技术

后基因组时代中的药物研发工作，现在已集中于寻找能特异性阻断关键蛋白的功能方法，之前已通过如微阵列技术分析疾病状态下mRNA的表达水平来鉴别这种关键蛋白。蛋白质组学是一门新的学科，包括在协同途径中并作为结合配偶体来看待蛋白分子间的相互作用方式。蛋白质的构效关系包括常规结构域作图和鉴别功能相关的三维(3D)构象信息。认识蛋白三维(3D)结构信息的方法也已经常规化。例如NCBI维护的公开使用的工具，名为VAST，结构相似性搜索服务。它将新确定蛋白的三维结构与大分子结构数据库(molecular modeling database(MMDB))和蛋白数据库(PDB)进行比较。

噬菌体展示技术是一种体外选择技术，它将多核苷酸序列编码的肽或蛋白与噬菌体的一种外壳蛋白进行遗传上的融合，使融合蛋白展示于噬菌体病毒粒子的外部，而编码融合蛋白的DNA位于病毒体内。这种展示蛋白与其编码DNA之间的物质联系使得能够通过一种称为“生物淘选(biopanning)”的简单的体外选择方法来筛选大量的变异蛋白，这些变异蛋白的每个都与其相应的DNA序列相联系。

噬菌体、核糖体、酵母和细菌展示文库都是大量筛选蛋白或肽的工具。核糖体展示方法是将mRNA翻译为其相应蛋白，同时保持蛋白附着于RNA。通过RT-PCR得到核苷酸编码序列(Mattheakis，L.C.et al.1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，9022)。酵母展示是基于构建与膜相联的a-凝集素酵母结合受体融合蛋白，aga1和aga2，以及部分接合型(mate type)系统(Broder，et al.1997.Nature Biotechnology，15：553-7)。细菌展示是基于构建靶蛋白与细菌输出蛋白(与细胞膜或细胞壁相关)的融合蛋白(Chen and Georgiou.2002.BiotechnolBioeng，79：496-503)。

与杂交瘤技术相比，噬菌体和其它抗体展示技术提供了在体外针对抗原进行操作选择的可能性，而无对抗原的宿主效应的潜在限制，反之亦然。体外选择的一个特有优势在于能够选择得到结合在靶蛋白多样性位点上的抗体。

尽管噬菌体文库简化了功能属性相关的遗传物质的回收，但仍需要多级淘选的策略以从文库中纯化出最优的候选分子。另一方面，在已知多肽配体功能域的结构信息时，就需要有能够选择结合于配体特定结构域上的抗体或其它结合配偶体(如肽或蛋白)的方法。结构域或表位定向淘选已成为选择结合于靶蛋白的抗体的常规方法。这种选择主要是使用已知的多种方法，如选择性淘选、淘汰淘选(de-selective panning)、配体捕捉、消减淘选或引导选择(pathfinderselection)，来实现抗体的逐步选择(上文Hoogenboom，H.R.等(2000))。

在消减淘选中，具有重叠区域(overlapping)但结合位点不完全相同的靶分子，可被用来淘汰不需要的结合体(binders)。这种方法已被用来鉴别与未知抗原结合的结合体，例如用在正常细胞中淘汰与癌细胞结合的结合体。也可选用包含一些共同结构域或结构的天然蛋白进行连续或竞争性选择，以获得与相关抗原中相异或共有位点结合的抗体。典型的这种研究使用与生物化学运动性或与H-ras蛋白相关的天然蛋白(Horn，I.R.et al.1999，FEBS Lett.463：115-120)。

配体捕捉定向淘选与ELISA夹心法类似，都使用无关和非邻近表位的固定抗体来捕捉靶配体并使其呈现优选结合面，以进行噬菌体淘选(US6376170)。其他研究者使用竞争性抗体来选择性掩饰非目的靶结构域上的抗原(Tsui，P.et al.2002.J.Immunol.Meth.263：123-132)。引导选择方法使用单抗和多抗，也使用与辣根过氧化物酶(HRP)直接或间接偶联的天然配体。在酪胺生物素存在时这些分子催化与靶抗原紧密结合的噬菌体发生生物素酰化，从而可以使用链霉抗生物素蛋白从全部噬菌体中特异性回收“标记”噬菌体。这种方法选择性回收了结合于靶分子本身或其邻近部位的噬菌体(Osborn，J.K.et al.1998.Immunotechnol.3：293-302)。使用单克隆抗体定向结合于交替位点也被称为“表位步查”(epitope walking)(上文Osborn，J.K.et al.1998)。

这些方法的缺陷在于，在进行得到与目的结构域结合的结合配偶体的工作之前，必须先进行大量工作以得到并鉴定非目的结合配偶体，缺陷还在于没有对特异表位进行靶定位。本发明提供了通过在淘选步骤中使用杂合竞争性蛋白，得到结合于选定表位的抗体或配体结合配偶体的新型方法。

发明概述

本发明提供了通过在淘选步骤中使用工程诱杀配体，来选择结合于预定结构域上的配体-结合配偶体的新型方法。设计诱杀配体，使其与靶蛋白仅在预定的结构域上不同，而该结构域构成公认的结合位点。可根据实际测量的结构数据(如X射线晶体衍射数据)或计算数据(来自三维结构模型的电脑计算)来设计诱杀蛋白。当得到结构信息后，诱杀蛋白的设计就简单了。如果没有结构信息或者信息不全，可根据天然变异蛋白(如种同源蛋白)来修饰序列的关键区域以制备诱杀物。

本发明进一步涉及到编码诱杀蛋白的核酸，它可用于在宿主细胞或生物中表达诱杀蛋白。

如果对宿主细胞进行转染，那么诱杀蛋白可以在细胞表面表达，或者诱杀蛋白是宿主的分泌型游离蛋白并可以从细胞培养基中回收。诱杀蛋白可以在异源环境(如细胞表面)进行纯化或使用。在生物淘选步骤中，维持靶分子与诱杀蛋白的摩尔比以淘汰非特异性和低亲和结合体，而仅回收与靶分子结合的结合体。在这种方法中，根据特异性结合靶蛋白结合位点(此位点在诱杀蛋白中发生变化，因此已知与目的结构域相互作用)的能力，从文库中选出与其同源遗传物质融合的蛋白结合配偶体。

另一方面，本发明选择结合预定表位的抗体的方法可用来将在一个物种(如动物模型)中证明有效的治疗性靶抗体或配体结合体的所需特性，直接转移至类似的生物治疗药以有效治疗其它物种。可将人类生物药物方便的转化为其同源物，用来在该动物属或种中以类似的作用机制治疗其它目的哺乳动物，如牛、猪、家禽、狗、猫或其它农业重要动物或家养动物。在本发明的一个实施方案中，此方法被用来选择与具有相同三维结构域的同源蛋白相互作用的抗体，此抗体被作为参考抗体。这一点在已知一种可与人抗原特定区域结合的单抗，并想重新得到与相同表位结合的结合配体(如人抗原的抗体)时特别有用。在另一实施方案中，当已有结合于人抗原表位的抗体，需要有在其它目的动物(如小鼠)中与相应蛋白的相同表位作用的代替抗体用于研究时，这种方法是有效的。在这种方式下，可得到与原始抗人抗体性质相似的抗鼠抗体。

因此，一方面本发明提供了从文库中选择封闭多肽配体结合配偶体的方法，其中待结合配体的特异功能域被预先确定，该方法步骤包括：a)确定待封闭蛋白的功能域，b)分析该配体的一种或多种物种同源物或功能同源物与该配体间的共同结构特征，c)构建参入有配体及所选同源物的所述共同结构特征的诱杀物，其中该诱杀物具有待封闭功能域以外区域的共同结构特征d)使用所述诱杀物(使用量大于该配体结合配偶体)以选择优先结合于待封闭功能域的结合体。

另一方面，本发明提供了鉴别可结合于靶蛋白预定表位上的多肽的方法，其步骤包括：a)建立一个在其表面表达多肽的噬菌体颗粒文库，b)制备诱杀蛋白，其相应于靶蛋白预定表位的氨基酸序列发生了变化，c)将噬菌体颗粒文库与靶蛋白一起温育以选择表面多肽与靶蛋白结合的噬菌体，d)加入过量摩尔浓度的诱杀蛋白作为竞争剂，以负选择特异于预定表位的噬菌体颗粒，e)将结合于靶蛋白的噬菌体从结合于诱杀蛋白的噬菌体中分离出，f)回收结合于靶蛋白的噬菌体颗粒。

附图简述

图1是本发明方法的示意图。

图2是结合mTF的重要候选Fab的CDR序列和构架排布。

图3表示本发明方法所选的抗体与靶蛋白(mTF，实线)和诱杀蛋白(hu/mTF(改变了预定表位中两个氨基酸)，虚线)的结合作用的浓度依赖性。

图4是选出的两种与mTF结合的Fab的浓度-相对荧光单位曲线。

图5是来自不同物种的IL-13蛋白的多序列比对。

图6A&6B是来自hIL-4晶体学数据的能量和面积大小(areadimension)。

图7A&7B根据IL-4晶体学数据计算的hIL-13的能量和面积大小。

缩写

Abs：抗体，多克隆或单克隆

bFGF：碱性成纤维细胞生长因子

GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

IL：白细胞介素

Mab：单克隆抗体

TF：组织因子

F IIV：第IIV因子(无活性)

F IIVa：第IIVa因子(活化)

FX：第X因子(无活性)

Fxa：第Xa因子(活化)

发明详述

概念定义

“抗体”指免疫球蛋白或者来源于免疫球蛋白的结合片段。虽然不是所有免疫球蛋白都与抗原结合，但已知抗体片段可以结合抗原、靶多肽或蛋白以及其它分子。因此这里所用的“抗原结合片段”包括但不仅限于：(i)Fab片段，它由抗体重链(H)和轻链(L)的可变区(V)连同各自恒定区(C)组成(VL-CL和VH-CH1区)；(ii)Fd片段，它由VH和CH1区组成；(iii)Fv片段，它由单链抗体的VL和VH区组成；(iv)dAb片段(Ward，E.S.et al.，Nature341：544-546(1989))，它由VH区组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)₂片段；(vii)单链Fv分子(scFV)，其中VH区和VL区由多肽接头连接，从而使两个区域结合形成抗原结合位点；(viii)双特异单链Fv二聚物；(ix)包含上述蛋白的重组蛋白和融合蛋白，包括但不限于双抗体、多价或多特异性片段，或其它能结合靶多肽并包含免疫球蛋白衍生片段的工程构建体。

“嵌合体”或“嵌合蛋白”指含有一种或多种同源蛋白的残基或结构域的蛋白。例如嵌合抗体，它包含的可变区典型来源于鼠科mAb，并与人免疫球蛋白的恒定区融合。

“诱杀物”或“诱杀蛋白”是一种设计的多肽，参入有预定或工程结构域，用以从潜在靶结合体文库中负选择或正选择靶配体结合配偶体。

“表位”定义为靶配体的三维区域，代表与单链抗体结合的结构单位。表位通常由氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特异的三维结构性质和特异的电荷性质。构象和非构象表位的区别在于，与前者的结合在失活溶剂中会解离，而后者不会。表位可包含上述功能单位或结构特征性蛋白结构域(例如受体结合域或纤连蛋白样结构域)，或者存在于其中。因此当一种表位是蛋白的功能域并与选定的结合配偶体结合时，会引起该靶配体的功能发生目的性修饰，这种修饰是对靶配体的功能起拮抗或激动作用。

“替代”指具有类似的生物学功能。替代抗体发挥类似功能，它在与原抗体异种的环境或动物中激动或拮抗靶配体的活性。

“人类”或其它任何种类的抗体(如人抗体)，包括那些含有从人类或其它种系免疫球蛋白序列衍生的(或极为相似的)可变区、或可变区和恒定区的抗体。本发明的抗体可包含不被免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如但不限于由体外随机突变或定点诱变引入的突变，或在体内进行的体细胞突变)。因此这里所用的“人抗体”所指抗体蛋白的每个部分(如CDR、构架、C_L、C_H区(如C_H1、C_H2、C_H3、C_H4)、铰链区(V_L、V_H))都与人种系抗体基本相似。根据其氨基酸序列相似性，已将人抗体分类，见如http://people.cryst.bb k.ac.uk/-ubcg07s/。因此使用序列相似性搜索工具，可以选择具有相似线性序列的抗体作为模板制作“人抗体”。已知鼠种系序列，也可以类似方式对其进行应用。当收集并索引其它物种的种系免疫球蛋白相关数据后，也可以类似方式应用这种序列通过本领域已知方法从噬菌体展示文库或抗原结合片段的其它集合体制备本发明的非人类抗体。

一方面，本发明涉及到噬菌体展示和组合肽文库的使用。噬菌体展示和组合肽文库已发展成为探索肽和蛋白间相互作用的有力且适宜的工具。可通过插入随机寡核苷酸文库或插入包含目的序列(如来自免疫化动物或人体的B细胞)的多核苷酸文库来制备噬菌体文库(Smith，G.P.1985.Science 228：1315-1317)。抗体噬菌体文库在一个噬菌体中包含重链(H)和轻链(L)的可变区对，使得可表达单链Fv或Fab片段(Hoogenboom，et al.2000.Immunol.Today 21(8)371-8)。可对噬菌粒文库的多样性进行操纵以提高和/或改变文库中单抗的免疫特异性，以产生并随后鉴别额外和所需的人单抗。例如可将重链(H)和轻链(L)免疫球蛋白分子的编码基因随机混合(改组)，以在装配免疫球蛋白分子的过程中制得新的HL对。另外，可对重链(H)和/或轻链(L)编码基因的免疫球蛋白可变区的互补决定区(CDR)进行诱变，并随后筛选所需亲合力和中和(neutralization)能力。也可通过选择一个或多个人类架构序列并引进衍生自人类抗体所有组分的CDR盒集合或者通过设计的可变区来合成抗体文库(Kretzschmar and von Ruden 2000，Current Opinion inBiotechnology，13：598-602)。引起多样性的位置不限于CDR区，也可包括可变区的架构段。

其它用于本发明的文库包括来自非人类动物抗体或工程抗体文库的噬菌体展示文库。前者的例子包括使用来自骆驼科(camelid)物种的免疫球蛋白，它天然缺乏轻链(Hamers-Casterman et al.，1993，Nature 363：446-448；Gahroudi et al.，1997，FEBS Lett)，后者的例子如使用来自重链或轻链的具有结合能力的单结构域抗体(见如美国专利No.6248516)。

此外多种噬菌体或其它展示系统，如核糖体、酵母、细菌或动物细胞均可与肽(或抗体)噬菌体文库以多种方式组合使用，以进行生物学探索或寻找新型药物或药物靶点。例如可使用肽噬菌体展示文库来搜索抗体噬菌体展示文库。可联合使用底物噬菌体展示和底物消减方法，通过排除法来寻找密切相关的酶之间的特异性差异，这种信息可被用于制备高选择性抑制剂(Ke，S-H，et al.1997.J.Biol.Chem.272(26)：16603-16609)。

配体和受体(如抗体和抗原)间的结合依赖于氢键、疏水性作用、静电力和范德华力。这些结合作用都是非共价性的弱键，但是已知抗原和抗体间的结合是最强的天然结合作用之一。通过相同表位的多拷贝或通过被多种抗体识别的多种表位的存在，如同抗体一样抗原也可能是多价体。涉及到多价性的相互作用可以产生更牢固的复合体，但多价性也会引起空间位阻从而降低结合的可能性。所有的抗原-抗体结合作用都是可逆的，但都遵循任何可逆生物分子相互作用的基本热力学定律：

其中K_A是亲合常数，Ab和Ag分别是抗体或抗原上未被占用的结合位点的摩尔浓度，Ab-Ag是抗体-抗原复合体的摩尔浓度。已知正向反应为“结合速率”(on rate)，解离或逆反应为“解离速率”(off rate)。

为了使抗原和抗体间相互作用有效进行，表位必须易于结合。因为抗原分子存在于空间中，被抗体识别的表位可依赖于抗原的特异性三维构象(如由两个天然蛋白亚基相互作用形成的特殊位点)，或者表位可相当于简单的初级(primary)序列区域。这种表位分别被称为“构象型”(conformational)和“线性型”(linear)。

发明方法

我们设计了通过使用工程竞争性蛋白来定向选择展示在噬菌体上的抗体，以此来分离结合于预定表位上的抗体或其它结合配体的方法(图1)。该方法依赖于靶蛋白的结构信息，此信息被用于设计合适的诱杀蛋白。这种诱杀蛋白在抗体噬菌体展示中被用作竞争剂，以分离具有所需表位-特异性的抗体(图1)。

通过传统免疫动物方法所得抗体的结合特异性由动物的免疫系统和抗原蛋白来联合决定。因此来自免疫作用的抗体经常与“优势免疫”表位相互作用，而这种表位与所需靶表位间存在差异。现有的使用抗体噬菌体展示文库的选择方法不能准确的定向选择目的表位。这里公开的方法其优势在于，能够非常精确并高效的定向选择特异于靶表位的抗体。

选择结合预定表位的抗体的方法可被用于将在一种物种(例如动物模型)中证明有效的一种治疗性靶抗体或配体结合体(生物治疗药)的所需性质，直接转化至类似生物治疗药以有效治疗其它物种。可将人类生物药物方便的转化为类似药物，从而可有效治疗其它哺乳动物，如牛、猪、家禽、狗、猫或其它农业重要的家养动物，或者稀有动物或濒临灭绝的物种。

在最常见的影响伴侣(companion)动物(狗、猫和马)的15种疾病中，许多与激素分泌相关，包括犬科和猫科动物的糖尿病，甲状腺失调，犬科动物的甲状腺机能减退，猫科动物的甲状腺机能亢进，犬科动物的阿狄森氏病和库欣氏病。伴侣动物和其它动物的其它常见病包括骨关节炎和多种癌症。因此有可能将有效的人类生物治疗药(如抗癌和抗炎抗体治疗药)转化为其它物种特异性类似药物。例如，可与人α-TNF上的特殊表位结合的英夫利西单抗药物(REMICADE)，可使用本发明的方法将起转化为治疗有效药物，以有效应用于治疗伴侣动物中常见的由α-TNF失调介导的疾病。

靶位点结合的选择

每个淋巴细胞产生的抗体都不是特异于某种抗原，而是特异于某种表位。抗原是外源细胞、颗粒、蛋白或分子的一部分，被免疫系统所识别并作为抗体和/或细胞毒素T细胞的靶子，表位也是相应于蛋白上抗原决定簇的结合位点。多肽、脂质、核酸和许多其它物质也可用作抗原。一些小分子物质如果与大“载体蛋白”(如牛血清白蛋白或蓝蛋白，或其它人工基质)化学偶连，则也可能会发生针对它们的免疫反应，这类物质称作“半抗原”。半抗原可以是多种分子，例如药物、简单糖类、氨基酸、小肽、磷脂或甘油三酸酯。能引起强烈免疫反应的抗原被称作“强免疫原”。经验证明引起克隆性免疫反应的抗原决定簇可以小至1-8个氨基酸或者1-6个单糖。实际工作中被来自克隆的免疫球蛋白(单克隆抗体)所识别的表位，可以在蛋白表面包含更大的非邻接(non-contiguous)序列。

当表位存在于蛋白的功能性区域内时，抗体的结合对该蛋白的作用将会中和由该区域结构特征所赋予该蛋白的功能。整个观点已被证实是单抗发挥治疗作用的基础。因此可再现性选择特异结合抗原或蛋白结构域的抗体或其它结合体的能力可以代表蛋白治疗领域的进展。

抗体-表位作图(Antibody epitope mapping)是一种鉴别功能域的方法。根据对象不同可以用高或低表位作图的分辨率。低分辨率作图包括使一套单抗与天然蛋白的表面序列作用。重点在于覆盖整个靶表面并鉴别哪个序列是重要的功能序列。与主导候选mAb不同，在表位作图中所用的抗体可以是低亲合力的，并应包括中和和非中和mAb，同时这种方法中并不总是需要精确确定表位。一旦在特定所需分辨率下鉴别出表位，则可使用与抗体(它发挥所需作用，通常是中和靶蛋白的功能)的竞争性试验来鉴别其它结合于此区域结合体，例如人抗体能够与鼠抗体竞争结合人类靶蛋白。

可通过其它方法使用结合靶蛋白的多套抗体来鉴别表位。例如，可使用蛋白酶消化抗原并使用ELISA或质谱分析来确定消化所得片段与抗体的结合。可用蛋白酶消化抗原-抗体复合物并用质谱分析蛋白消化片段。在这种情况下，抗体对蛋白水解位点的覆盖鉴别出表位。

也有其它鉴别抗体的表位的方法。可合成相应于整个抗原序列重叠片段的肽，并用ELISA或表面等离子共振谱(Surface PlasmonResonance spectroscopy)确定抗体与这些肽的结合。使用同位素标记抗原的NMR研究也可鉴别在抗体结合时哪些氨基酸的磁环境发生了变化。另一方法是测量热熔解转移温度(thermal melting transitiontemperature)。也可确定抗原-抗体复合物的晶体结构并用以鉴别表位。在这些方法中晶体法是最具权威性的，其次是NMR法。

在ELISA法中，检测之前先用洗涤步骤除去未结合物质。在表位是线性(抗体仅识别一个单链线性氨基酸序列)的情况下，抗体对包含表位的抗原的亲合力可高至足以对结合作用进行检测。当表位是构象型，由蛋白内的两个或更多的非邻接氨基酸序列组成时，每个单独序列对抗体的亲合力可能就很低并且不足以被检测到。使用表面等离子共振谱也可能检测不到与构成构象型表位的肽的结合作用，因为对表位中的每个肽的亲合力可能太低。如果肽的解离速率高，结合作用也可能检测不到。

也可使用核磁共振(NMR)来鉴别蛋白上的表位。申请人的待审申请(美国专利申请Ser.No.10/393926)中提出了根据局部环境，通过鉴别特异原子(通常是H¹、C¹³和N¹⁵)并由此鉴别氨基酸残基的方法。如果有足够的时间并且足够高的设备分辨率，则可为大分子蛋白进行大多数或所有共振的完整排布。这种方法的基础在于，人们发现当抗体结合于抗原上时，一些氨基酸的局部环境发生了变化。那些变化最剧烈的氨基酸就是那些与抗体作用最相关的氨基酸。理论上可以通过对结合与未结合状态下的抗体和抗原进行所有NMR排布分析，并确定哪个氨基酸发生了原子移动，来鉴别表位。抗原-抗体复合物NMR谱的复杂性使得这种分析极为困难，因而不能成为常规的表位鉴别方法。但是上文专利的申请者们使用富含C13和N15原子的氨基酸的蛋白质(其中不是总需要精确的NMR信号鉴别)通过此法鉴别出蛋白表位。当不同氨基酸的共振差异度足够大时，可以对相同蛋白的两个或多个不同氨基酸进行多重标记。例如可以将α-N15丙氨酸和ε-N15赖氨酸包含进同一蛋白，也可将ε-N15组氨酸和α-N15亮氨酸包含进同一蛋白。表位可以是抗体或者配体的结合区域。另外，预测蛋白表面暴露序列的分子模型或计算可有助于表位鉴别。

在未进行靶分子结构物理测量的情况下，表位可以根据靶分子一级氨基酸序列进行设计。例如约5-15个氨基酸残基线性片段内部的约5-10个残基可加以改变，以制得变异诱杀物或嵌合靶蛋白，并测量结合作用以确定表位。

蛋白同源性的基础是基因的碱基序列的相似性或蛋白质的氨基酸序列的相似性，它表示共同的进化起源。通常共同进化起源会导致蛋白具有相似的结构和功能。但并不总是如此，趋异进化和突变可能会引起具有相似结构的蛋白却具有不同的功能，或者结构不同的蛋白具有相似的功能，这分别称为直系同源和旁系同源。同源性扫描诱变是一种广为人知的蛋白受体结合作用的鉴别方法，它将同源蛋白的相似区域进行替换以维持原蛋白的三维结构(例如用猪生长素、人泌乳刺激素或人胎盘催乳激素中的区域替换人生长素的相应区域)，然后确定构建体的结合常数。这些天然结构变异体可被用来确定可用于构建本发明中合适的诱杀蛋白的结构域或结构域中的表位。

诱杀物的构建

这里所用的“诱杀蛋白”所指的蛋白，与靶蛋白相比在特异结构域上有一处或多处结构特征差异，该特异结构域包含着待结合的位点或区域。因此，诱杀蛋白可以是嵌合靶蛋白或者是天然蛋白，例如种同源物。而靶配体可以是工程序列，包含预定的结合结构域。在本发明的方法中，诱杀物结合低亲合力和非特异性的结合体，则那些与保留着的靶分子复合结合体就被选出。一方面，具有合适结构并可以作为接受靶表位的骨架结构的相似物可以是靶蛋白的直系同源物。结构同源物也可以是多基因家族的其它成员。

伴随着X射线晶体衍射、NMR和其它技术的进步，以及这些技术带来的关于三维结构信息的大量积累，可以方便的获取蛋白结构信息，也可以从多种途径得到真实结构信息。格拉斯哥大学(University of Glasgow)的生物信息学研究中心(BioinformaticsResearch Center)使用蛋白结构拓扑学(Topology of Protein Structure(TOPS))软件建立了描述和比较蛋白结构的网络站点(TP Flores，DSoss and JM Thornton.1994.Protein Engineering，7：31-37)。可以以PDB类似文档的格式向该服务器提交蛋白坐标(coordinates)。蛋白结构被转化以简单的卡通表示，称作拓扑表示。然后与所有已知结构的非冗余(redundant)亚组进行比较。所得结果以分类列表形式表示，显示comperssion值、结构鉴别纪录，以及为一对相同结构赋值1，为无相同特征赋值0所得的结构相似性结果。

MASS(多重二级结构比较，Multiple Alignment by SecondaryStructures)技术的基础是使用二级结构和原子表示法的两个水平的比较。该技术的基本原理是蛋白固有的由二级结构元件(SSEs)组成。这些元件是蛋白内部的区域，为蛋白提供了稳定的骨架，而功能位点即附着在该骨架上。因此SSE是高度进化保守的，而突变经常发生在柔性环上，这种柔性环更加难以进行比较。MASS是进行多个蛋白分子结构比较和检测共同结构基元的高效工具。使用二级结构信息有助于过滤掉干扰信息，并有助于提高效率节省精力。MASS的优点是不依赖于序列顺序，因此能够在多重比较或多亚组中检测到非拓扑结构基元。使用MASS可以操纵蛋白-蛋白停靠(docking)，而操纵蛋白停靠是一个相当困难的问题。MASS可以从以下站点免费获得。(http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MASS/(Dror，O.etal.Protein Science(2003)，12：2492-250))

本发明的方法联合使用结构信息和大容量的蛋白-编码核酸表达系统文库，来选择结合特殊表位的抗体。例如可以将鼠源人组织因子(TF)同源物上的复杂特异表位作为靶子。本领域现有的抗体不能抑制mTF功能，也不是结合于TF的X因子的特异性竞争抑制剂。而本文公开的抗体具有这些功能，因此可代表以前没有的可评价抗TF抗体(通过抑制FX的活化来抑制TF活力)的治疗潜力的工具。

另外，这些抗体也是研究TF在正常状态下及在致病性血栓炎症、血管形成、肿瘤转化发展过程中的作用的有利试剂。

表位-定向的抗体或其它结合配体的纯化

本发明提供了三种通用的表位-定向的抗体或其它结合配体的分离方法：(1)使用抗体或其它可能的结合配体的展示文库进行竞争性选择；(2)使用展示文库，再对差别结合活性进行筛选，从而进行非竞争性选择；(3)免疫动物，再筛选差别结合活性。

使用诱杀蛋白进行的竞争性选择时，在诱杀蛋白的存在下(其摩尔浓度超过靶蛋白)选择展示文库中与靶蛋白的结合作用。回收的抗体或结合配体的选择性通过筛选分离的与靶蛋白结合而不与诱杀物结合的抗体或结合配体来确认。

因此在本发明的一个实施例中，提供了鉴别可结合于靶蛋白上预定表位的多肽的方法，其步骤包括(a)提供一个在表面表达多肽噬菌体颗粒文库，(b)制备诱杀蛋白，其相应于靶蛋白的预定表位的氨基酸序列发生了变化，(c)将噬菌体颗粒文库与靶蛋白一起温育，以选出具有能够结合于靶蛋白的多肽的噬菌体颗粒，(d)加入诱杀蛋白(其摩尔浓度超过靶蛋白)作为竞争剂，以负选择出特异于预选定表位的噬菌体颗粒，(e)将结合于靶蛋白的噬菌体颗粒与结合于诱杀蛋白的噬菌体颗粒分开，(f)回收结合于靶蛋白的噬菌体颗粒(而不是结合于诱杀蛋白的噬菌体颗粒)。

次优选的方法是使用天然蛋白作为“诱杀物”，以选择与嵌合或突变蛋白的结合。在这种方法中，使用包含原始骨架蛋白的蛋白的摩尔浓度大于嵌合或突变蛋白。回收抗体或结合配体的选择性通过筛选与诱杀蛋白和靶蛋白结合而不与骨架蛋白结合的分离的抗体或结合配体来确认。

在使用诱杀蛋白进行两步选择的过程中，根据靶蛋白对展示文库进行选择。再筛选(通常单独进行)回收的选择性结合靶蛋白而不与诱杀蛋白结合的抗体或其它结合配体。

为了使用诱杀蛋白的免疫化作用，使用靶蛋白对适合进行稳定杂交瘤单抗纯化的动物进行免疫。制备杂交瘤并进行筛选，寻找表达有能结合于靶蛋白而不结合于诱杀蛋白的抗体的杂交瘤。免疫方法可与上述任意展示方法联合使用。因此来自免疫细胞(如脾或外周血淋巴细胞)的mRNA可被用来产生抗体文库，此文库然后可按照上文任何展示方法使用。这种方法并不仅限于只在那些适合纯化稳定杂交瘤的动物上应用。

可以根据本文详述的方法来设计肽文库，也可以根据本领域的一般方法进行(见如RAPIDLIB1 or GRABLIB′，DGI BioTechnologies，Inc.，Edison，NJ；Ph.D.C7C Disulfide Constrained Peptide Library，NewEngland Biolabs)。

可以从如Cambridge Antibody Technology、Morphosys、AffymaxResearch Institute，Palo Alto，CA等来源获得抗体文库。已有许多方法来选择可用的为进一步分析和亲合力成熟(maturation)结合体亚组。这些方法包括：通过竞争性淘汰(deselection)封闭优势免疫表位，使用表位-掩蔽技术来获得更宽范围的抗体特异性，捕获转移(capturelift)筛选，使用三明治-捕获(capture-sandwich)ELISA的抗体引导选择，接近向导(proximity-guides)(ProxiMol)的抗体选择，使用小鼠单抗引导的选择进行人单抗纯化，使用磁分类技术选择结合于细胞表面抗原的抗体，纯化人肿瘤相关细胞的表面抗原-结合单链抗体，使用组织片段消减纯化单链抗体，根据抗体结合动力学特性选择抗体，根据化合价选择功能性抗体(抗体噬菌体展示：方法和步骤，Antibody Phage Display.Methods and Protocols.IN：David W.J.Coomber，Ed.Methods in Molecular Biology.Humana Press.Vol.178，December 2001pps.133-145)。

提高亲合力是根据靶结合体的低解离速度进行的。低解离速度通常预示着高亲合力。在这些提高亲合力的例子中，靶噬菌体和靶-结合体噬菌体的继续温育在饱和量的已知靶结合配偶体的存在下进行，或者通过提高温育溶液的体积来实现。在每种情况下，裂解的靶-结合体噬菌体的再结合都被阻止，在更长的时间内，高亲合力的靶-结合体噬菌体被回收。

对每种目的靶-结合体均优化预温育时间和预温育条件。为了监测条件变化对亲合力提高的影响，进行预实验(pilot experiment)淘选。靶和靶-结合体噬菌体一起温育并转化宿主细胞后，将宿主细胞铺在选择性平板培养基上并计数。确定存活克隆数目的变化为确定亲合力提高水平提供了有力的评价工具。存活克隆数目减少时，保留下的弱结合体数目显著减少，留下更少的高亲合力靶结合体。例如，存活克隆数目的减少至仅1％、0.1％、0.001％，表明提高结合高亲合力靶的靶结合体数量的最优条件。在一些条件下，存活克隆的数目可被限制在约100个，用于测序分析。

依赖所用靶结合体文库类型的多样性，具有高亲合力的靶结合体的数目可低到小于10。

上述亲合力提高技术可在进行提高的同时不需要进行额外的淘选。当然如果必要本发明也可使用多轮淘选以提高亲合力。

引用：本文引用的所用公开文献和专利均通过引用完全结合于本文，这些引用文献表明本发明所在领域当时的技术发展水平，并且/或者提供了关于本发明的说明和授权。公开文献指任何科学或专利公开说明，或者任何其它媒体形式的任何可用信息，包括所有录音、电子文档或印刷品。以下参考文献通过引用结合于本文：Ausubel，et al.，ed.，分子生物学通用方法，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2004)；Sambrook，et al.，分子克隆：实验室指南，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndEdition，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow and Lane，抗体实验室指南，antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan，et al.，eds.，免疫学通用方法，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY(1994-2004)；Colligan et al.，蛋白研究通用方法Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，NY，(1997-2004)。

上文已从整体上描述了本发明，下面通过实例来进一步公开本发明的实施方案。

实施例1：人/鼠嵌合组织因子蛋白的设计和制备

名为TF8-5G9的Mab识别并结合于人组织因子，并阻止X因子与TF或与TF/V II a因子复合物的结合(Ruf，W.and Edgington，T.S.1991.Thromb.Haemost.66：529-539)。根据对复合了人TF的TF8-5G9Fab的晶体结构的分析，所有形成被Fab识别的表位的残基均在人TF的149-204号残基之间。这个蛋白区域在TF与Gla-结构域FX间的相互作用中也发挥了重要作用(Ruf et al 1992)。huTF的149-204号残基间的15个特异残基的合适定位，对结合有重要的能量贡献(Huang，et al.J.MoI.Biol.275，873-894)。如同下文的序列比对所揭示的，当人(GenPept Accession No.NP_001984)和鼠TF(GenPeptAccession No.NP_034301)的胞外结构域序列，进行人EC结构域的149-204号残基和鼠EC结构域的152-207号残基比较时，15个重要残基中有7个相同(人类残基K149、K165、K166、T167、T170、171、Q190)，另有8个不同(人类残基被如下替换Y156T、K169I、V192M、P194F、V198T、R200Q、K201N、D204G)。用粗体表示的残基对TF8-5G9：huTF复合物的稳定性有重要作用，这些残基有δ结合自由能，为1～4kcal/mol或更高。

人：

₁₄₉KDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTD₂₀₄

鼠：

₁₅₂KDLGYIITYRKGSSTGKKTNITNTNERSIDVEEGVSYCFFVQAMIFSRKTNQNSPG₂₀₇

根据这个分析，按照序列比对将鼠TF序列中单一TF8-5G9接触残基突变为huTF中的相应残基，可从鼠TF编码序列构建嵌合诱杀蛋白。虽然在人、鼠TF间还有其它位点存在氨基酸残基差异，但在考虑靶表位时，这些残基可认为对蛋白总体功能或结构没有作用。使用mTF基因作为模板构建一个含有突变的嵌合蛋白，将mTF的8个单一TF8-5G9接触残基突变为huTF中的相应残基(SEQ IDNO.1)。删除跨膜区域使得仅有TF的可溶性胞外结构域被表达，并在羧基末端加上His标签以方便纯化。可溶性鼠TF和嵌合蛋白在HEK293E细胞中表达并纯化。用SDS-PAGE分析纯化的蛋白，结果得到预期大小的条带(Hu/m TF(40kDa)，mTF(35Kda))。

使用生物素酰化的mTF蛋白对HuCAL噬菌体展示文库(Morphosys，Martinsreid，Germany)进行液相淘选。添加嵌合hu/mTF蛋白作为诱杀物，其摩尔添加量过量10倍以淘汰所有特异于mTF靶表位之外的表位的噬菌体。用包被在磁性珠子上的链霉抗生物素来捕获回收结合于生物素酰化mTF上的噬菌体。测序从这轮淘选中得到的所有结合体，得到23个单一Fab：在试验浓度下，9个只识别mTF，3个相对hu/mTF优先识别mTF，11个对两种蛋白的识别度相似(表1)。

进行没有嵌合蛋白竞争剂的mTF淘选，以确认所选的Fab是表位定向选择的结果，而不是mTF上热点定向选择的结果。除了竞争抗原不同，两次淘选条件完全相同。测序所得结合体，得到7个单一Fab。只有1个分离的Fab在没有竞争剂的淘选中特异性结合mTF，这说明添加竞争抗原使得Fab选择特异性识别mTF，而不特异识别在TF8-5G9表位有变化的hu/mTF(表1)。

表1

通过亲合色谱纯化人抗鼠TF特异Fab，并用ELISA评估其结合mTF或hu/mTF的能力。图2中列出类这些Fab的CDR序列；对比形态变化HuCAL手册制定构架排布。构架区序列在图2下方列出。所有9个mTF特异Fab与mTF的结合都表现出剂量依赖性，对hu/mTF有最小交叉反应活性(图3)。在Fab形式中，PHD127有最高的mTF结合亲合力，PHD127则最低。根据其对mTF的亲合力选出5个Fab(PHD103、104、126、127、130)制备全长免疫球蛋白。这5个Fab的可变区(PHD103、104、126、127、130)列于图2，SEQ ID NOS：2-11的序列被克隆到载体中，以在HEK293细胞中表达mlgG2a分子。

抗凝血

使用鼠脑提取物作为mTF来源，评估所选抗mTF的替代Fab抑制人血浆凝固的能力。根据以上试验，预测结合于mTF上TF8-5G9表位的Fab可干扰凝血途径并延迟血块的形成。在这个实验中，测量人血浆血纤蛋白凝块形成的抑制作用。进行测试的8个Fab中有4个在体外延迟或抑制了人血浆的凝固：PHD103、PHD104、PHD126、PHD127。PHD126和127具有更强的抗人血凝固的能力。根据血块形成时间-Fab浓度曲线，可测的E50值在0.2μg/ml-63μg/ml之间。

表2

Fab EC50浓度，(μg/ml)

PHD102 ＞200

PHD103 63.3

PHD104 23.8

PHD109 ＞200

PHD126 0.23

PHD127 0.82

PHD128 ＞200

PHD129 ＞200

X因子抑制

在鼠脑提取物作为mTF来源的情况下，测量上文抗凝血的抗mTF Fab的X因子抑制作用。提取物与FVIIa一起温育，在FX存在下加入抗mTF替代Mab，测量抑制FX转化为FXa的能力。PHD103、126和127Fab抑制X因子活化(裂解)为Xa因子。然后使用全长抗mTF IgG再次测量抑制X因子活化的能力。发现PHD103、126和127有良好的抑制作用，而PHD104则没有抑制作用。

FACS分析

作为最有吸引力的候选抗体PHD126和127，评估其结合于B6F10黑素瘤细胞(高水平表达mTF)的能力。PHD126和127以剂量依赖性方式结合连有mTF的细胞，其EC50值分别为37.8nM和4.35nM(图4)。PHD126和127重链和轻链的完整可变区序列分别在图2相应区域中列出(SEQ ID NOS：6-9)。

概要

上述实验阐明使用工程竞争蛋白对噬菌体展示的抗体进行表位定向选择的方法是可行的。该方法根据靶蛋白的结构信息来设计合适的竞争剂。另外，这个方法可以选择对目的蛋白上表位有反应活性的抗体。现有的使用噬菌体展示的抗体文库进行抗体选择的方法，不能准确定向目的表位。这里公开的方法具有可高效精确的选择特异于靶表位的抗体这一优势。我们已经使用该法选择到了抗mTF上单一表位的抗体。

TF是一个复杂的分子，其既可作为受体也可作为配体，能够与FVIIa和FX形成特殊的复合物。因此，阻止这种相互作用的Mab必须作用于TF分子上的单一区域。本领域现有的抗体不能抑制mTF功能，或者不是结合于TF的X因子的特异性竞争抑制剂。这里公开的抗体则具有这些功能，并因此可代表以前没有的可评价抗TF抗体(通过抑制FX的活化来抑制TF活性)的治疗潜力的工具。另外，这些抗体也是研究TF在正常状态下及在致病性血栓炎症、血管形成、肿瘤转化发展过程中的作用的有价值的试剂。

实施例2：构建嵌合诱杀蛋白用以选择结合于能够活化不同受体亚单位的共同结构域的结合体

白介素-13(IL-13)是一种细胞因子，在哮喘病人呼吸道中发现其含量水平提高。IL-13由活化的CD4⁺T细胞产生，并在哮喘病人的B细胞增殖和IgE产生，以及杯状细胞增生和黏液高分泌，嗜酸粒细胞性支气管炎，气道高反应性中都发挥重要作用。已发现IL-13在转基因小鼠中的过表达会引起哮喘样表型，而使用拮抗剂抑制IL-13则会减轻哮喘反应。

IL-13至少与两种受体结合，其中之一可以在除T细胞外的大多数细胞上发现，而另一种受体可发挥诱杀蛋白的作用。牵连到促炎症反应的受体与IL-4受体相同，它由两个亚单位组成，IL4Rα1和IL13Rβ1。IL-13是短链细胞因子家族的成员，该家族还包括IL-4、IL-2、IL-3和GM-CSF。这些蛋白具有一个4-螺旋束结构并包含两个或三个二硫键。IL-13的溶液结构已被确定，证明它与家族其它成员间具有相似性(Eisenmesser，E.Z.，et al.J.MoI.Biol.(2001)310：231-241；Moy，F.J.，et al.，J.MoI.Biol.(2001)310：219-230)。尽管IL-13与IL-4只有25％的序列相同，但两者的整体结构相似，因而预测IL-13与其受体间的相互作用应该和IL-4与其受体间的作用(最近确定)相似。事实上，考虑到两个细胞因子的受体有一个共同亚单位，那么IL-13和IL-4与IL4Rα1相互作用的结构可能是相似的。通过对IL-13的三维结构和突变研究表明，该细胞因子有两个表面在它和受体的相互作用中发挥了重要作用。该模型提出，由螺旋A和螺旋C组成的蛋白表面与受体的IL4Rα1亚单位发生相互作用，而螺旋A和螺旋D的界面与受体的IL13Rα1亚单位发生相互作用。

根据IL-13结构和受体相互作用模型预测，封闭A、D螺旋与IL13Rα1间作用的抗体，或者封闭A-C表面与IL4Rα1间作用的抗体可能是具有抗IL-13治疗作用的优秀候选抗体。在选择结合于IL-13的受体相互作用部位上的抗体时，我们计划制备嵌合细胞因子分子。在这种嵌合蛋白中，连接C、D螺旋的环将被待免疫动物的相应序列取代。在受体作用模型中，C-D间的环构成分子暴露部分的大部分表面，并且不与IL-13受体发生相互作用。另外，此环在溶液结构中表现出良好的柔韧性，因此可能可以忍受不破坏蛋白整体结构的突变。在所得嵌合蛋白中，分子的一部分与宿主本身非常相似，从而不大可能诱导显著的免疫反应。但是，分子中保留全长人序列的部分对宿主会表现外源性，可能会引起免疫反应。预测从嵌合免疫原所选择的抗体会在实验中表现出中和人受体活性的功能。

需要有强效IL-13拮抗剂来评价IL-13抑制在人类疾病(尤其是哮喘)中的作用，并由此将此拮抗剂作为治疗剂。这里描述的新型IL-13变异体可用作免疫原以提高拮抗抗体的产生，也可用作筛选或选择剂以鉴别中和抗体，或者直接用作天然IL-13的拮抗剂。另外，研发新型强效IL-13激动剂也可有助于靶定位某些在其细胞表面过表达IL-13受体的癌细胞(Hussain，S.R.and Puri，R.K.，Blood(2000)95：3506-351)。

构建新型IL-13类似物。这些化合物可被视为人IL-13和其它物种IL-13的嵌合体，因为它们使用多个物种IL-13的部分序列。可通过将其它物种的序列上不同的区域参入到人IL-13序列中，而合理设计这些突变体。

根据两个细胞因子的结构同源性，提出一个IL-13:IL-13R1复合体模型。使用IL-13(坐标文件(coordinate file)：1GA3)的NMR模型和IL-13序列构建IL-13类似物，它应具有人IL-13激动剂、人IL-13拮抗剂的功能，或可用作产生抗人IL-13抗体的免疫原，或者作为产生抗人IL-13抗体的淘选元件。

坐标文件1GA3可从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/得到，它含有IL-13的20个NMR结构的覆盖图。对结构的观察表明，尽管4个螺旋是高度保守的，但N-末端和C-末端及C、D间的环具有高度柔韧性，许多构象都证明这一点。该文件的第一个结构被用来分析设计的IL-13突变体，该突变体应保持结构和活性。

在C、D螺旋间有一个大环，它靠近几乎埋在分子内部的B螺旋。这个环可以容忍突变，因为它与A、C、D螺旋的距离都远。B环由Met⁴³到Asn⁵³的氨基酸限定，CD环由Cys⁷¹到Thr⁸⁸的氨基酸限定。环的末端难以定位，但D螺旋开始处的环末端明确是Glu⁹¹。在大多数结构中参与B螺旋和CD环间相互作用的氨基酸是：

B螺旋：Cys⁴⁵、Leu⁴⁸、GIu⁴⁹、Leu⁵¹，(可能)Asn⁵³和Val⁵⁴

C/D环：Cys⁷¹、Val⁷⁵、(可能)Lys⁷⁴、Val⁸⁵、(可能)Arg⁸⁶、Ile⁹⁰

另外，这区域中没有氢键。Pro⁷²没有参与但对转角来说必须，Trp³⁵和Arg⁸⁶与Lys⁸⁹间的环残基有重要的相互作用。

B螺旋上与C/D环相互作用的残基是Leu⁴⁸、Leu⁵¹、Val⁵⁴。

Ala⁴⁷位于一个口袋中，可能可以被替换。C/D环和B螺旋间没有氢键。

B螺旋上与A/B环相互作用的残基是Met⁴³、Ala⁴⁷、Ser⁵⁰。

在NCBI中进行Blast搜索以鉴别其它种类IL-13，结果如下(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝Protein)：

人IL-13

GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSA

IEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN

猪

GPVPPHSTALKELIEELVNITQNQKTPLCNGSMVWSVNLTTSMQYCAALESLINISDC

SAIQKTQRMLSALCSHKPPSEQVPGKHIRDTKIEVAQFVKDLLKHLRMIFRHG

牛

PVPSATALKELIEELVNITQNQKVPLCNGSMVWSLNLTSSMYCAALDSLISISNCSVI

QRTKKMLNALCPHKPSAKQVSSEYVRDTKIEVAQFLKDLLRHSRIVFRNERFN

犬

PVTPSPTLKELIEELVNITQNQASLCNGSMVWSVNLTAGMYCAALESLINVSDCSAIQ

RTQRMLKALCSQKPAAGQISSERSRDTKIEVIQLVKNLLTYVRGVYRHGNF

大鼠

GPVRRSTSPPVALRELIEELSNITQDQKTSLCNSSMVWSVDLTAGGFCAALESLTNIS

SCNAIHRTQRILNGLCNQKASDVASSPPDTKIEVAQFISKLLNYSKQLFRYG

小鼠

GPVPRSVSLPLTLKELIEELSNITQDQTPLCNGSMVWSVDLAAGGFCVALDSLTNISN

CNAIYRTQRILHGLCNRKAPTTVSSLPDTKIEVAHFITKLLSYTKQLFRHGPF

使用ClustalW算法和Vector NTi Suite(InforMax，Inc.，Bethesda，MD)比对了人、牛、猪、狗、大鼠和小鼠IL-13的序列(图5)。

下面给出B螺旋序列，其中与人不同的氨基酸用下划线标出。预测参与B螺旋和C/D环相互作用的残基用星号标出。(表3)

表3

人	M YCAALESLINV
		牛	M YCAALDSLISI
猪	MQYCAALESLINI
		狗	M YCAALESLINV
大鼠	GFCAALESLTNI
		小鼠	GFCVALDSLTNI
相互作用残基	＊＊＊＊＊

这些比对提示人IL-13B螺旋和C/D环上的一些氨基酸残基可用其它物种的IL-13相应残基替换，并保持结构完整和受体结合活性。使用B螺旋和C/D环上预测发生相互作用的残基，设计一个嵌合蛋白，其中人蛋白C/D环残基被来自其它物种的相似残基所替换。为保持蛋白稳定性，需要替换同一来源的B螺旋上相应的相互作用的残基。如果用牛、猪或小鼠IL-13，则优选的实施方案仅必须替换一个氨基酸，即Val⁵⁴替换为Ile⁵⁴，因为这些IL-13上其它的相互作用残基都与人蛋白相同。

另外的实施方案是对来自小鼠蛋白的B螺旋进行两处替换，Glu⁴⁹→Asp⁴⁹、Ala⁴⁶→Val⁴⁶。Tyr⁴¹也可替换为Phe，Leu⁵¹也可替换为Val。但是上文最后的替换靠近C螺旋，并且干扰其结构。表4列出了6种蛋白的C/D环序列，其中预测与B环相互作用的残基在最后一行用星号标出。(表4)

表4

人	CPHKVSAGQFSSLHVRDTKI
		牛	CPHKPSAKQVSSEYVRDTKI
猪	CSHKPPSEQVPGKHIRDTKI
		狗	CSQKPAAGQISSERSRDTKI
大鼠	CNQKASDVASS PPDTKI
		小鼠	CNRKAPTTVSS LPDTKI
相互作用残基	＊＊＊＊＊＊＊＊

根据同源性可在C/D环上进行许多优选变化。这些替换中许多不大可能影响环的整体构象，但是大鼠和小鼠Il-13蛋白中Arg⁸⁶替换为Pro对C/D环的结构产生重大影响，在大鼠和小鼠蛋白中删除3个氨基酸也同样如此。类似的，在牛、猪和狗蛋白中Arg⁸⁶突变为Pro也导致重大的构象重排。该区域中另外的设计方案包括在小鼠蛋白B螺旋上观察到的Ala⁴⁶→Val、Glu⁴⁹→Asp突变，以及C/D环上的Val⁸⁵→Leu突变。

用不同物种的B螺旋和C/D环的氨基酸替换人类蛋白中的相应氨基酸，使用高优化Insight II为每个突变蛋白建立模型，也可使用其它建模工具进行。

狗模型：所有构建的5个模型的能量相似。对模型的检验表明它们的CD环和其它结构都很相似。因此将犬科IL-13B螺旋和CD环的残基替换为人类蛋白相应残基后，预测将得到合适的嵌合蛋白。

牛模型：所有5个模型的能量相似。在所有3个模型的81-85侧链中的位置上有较大的差异，但是这种差异不比在20NMR模型中观察到的差异更大。在CD环上添加额外的脯氨酸没有显著改变构象。因此这些替换预测会产生可用的嵌合体。

猪模型：所有5个模型的能量相似。如同牛模型，在环侧链的一些氨基酸位置上存在差异，但在骨架上没有显著差异。在B螺旋开始处添加氨基酸取得良好效果，因此预测该变异体将是可用的嵌合体。

小鼠模型：在环上删除3个氨基酸后，所有5个模型的环构象都与人模型产生了显著差异。所有模型都具有低能量，根据绝对能量比较，这些模型是所有嵌合体中能量最低的。4个螺旋的整体结构几乎没有变化，预测该变异体将是合适的嵌合体。

所有这些嵌合体都具有可用的构象，并且在A、C和D螺旋都具有相似结构。推荐的嵌合体序列如下：

人天然蛋白

GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMYCAALESL

人-牛(SEQ ID NO：12)

GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMYCAALESL

人-猪SEQ ID NO：13)

GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMQYCAALESL

人-狗(SEQ ID NO：14)

GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMYCAALESL

人-小鼠(SEQ ID NO：15)

GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMYCAALESL

人天然蛋白

INVSGCSAIE KTQRMLSGFC PHKVSAGQFS SLHVRDTKIE VAQFVKDLLL

人-牛

INISGCSAIE KTQRMLSGFC PHKPSAKQVS SEYVRDTKIE VAQFVKDLLL

人-猪

INISGCSAIE KTQRMLSGFC SHKPPSEQVP GKHIRDTKIE VAQFVKDLLL

人-狗

INVSGCSAIE KTQRMLSGFC SQKPAAGQIS SERSRDTKIE VAQFVKDLLL

人-鼠

INISGCSAIE KTQRMLSGFC NRKAPTTV S SLP DTKIE

VAQFVKDLLLHuman HLKKLFREGR FN

人 HLKKLFREGR FN

人-牛 HLKKLFREGR FN

人-猪 HLKKLFREGR FN

人-鼠 HLKKLFREGR FN

列出了嵌合体诱杀蛋白序列：SEQ ID NO：12(人-牛)、SEQ IDNO：13(人-猪)、SEQ ID NO：14(人-狗)、SEQ ID NO：15(人-鼠)。这些嵌合蛋白的用途之一是选择可功能性中和人IL-13活性的抗体。

可通过抗体文库筛选/选择技术例如抗体噬菌体展示来回收得到抗体。另一方面，这些嵌合IL-13蛋白可用于筛选和/或选择具有中和作用的抗体。在一个实施方案中，用IL-13或一个(或多个)这些嵌合蛋白免疫动物并回收杂交瘤，可根据这些杂交瘤与未用于免疫的嵌合体间的结合来对杂交瘤进行选择，从而避免抗体识别C/D环。在另一实施方案中，可以不同方式联合使用这些嵌合蛋白以选择和筛选组合抗体文库，尤其是噬菌体展示文库。根据这里描述的设计思路，选择或筛选过程会抑制抗体识别C/D环。因此，以上两种实施方案都可有助于分离具有中和作用的抗体，尤其是那些识别A、C和D螺旋(这些结构在物种变异体和构建的嵌合蛋白中都是完全保守的)的抗体。

这些突变体的第二种应用是作为人IL-13的拮抗剂。已知IL-13结合两个受体亚单位。在该分子两个区域内引入非人类氨基酸所引起的人IL-13结构微小变化，会对它与两个受体亚单位间的结合产生变构影响。通过选择性抑制受体亚单位结合作用，可得到竞争性拮抗剂。

实施例3：使用NMR数据进行工程诱杀蛋白计算

本发明描述了使用核磁共振技术(NMR)来鉴别蛋白表位的新型方法。NMR技术根据原子局部环境鉴别特定原子(一般是H¹、C¹³、N¹⁵)，从而鉴别氨基酸。碳和氮NMR谱的复杂度小于质子NMR谱，而所需原子核的天然丰度会限制敏感性。对大蛋白来说，相似环境中原子间会存在较大数目的谱重叠。如果时间足够并且设备分辨率足够高，可以完成大蛋白的大多数或全部共振的完整排布。

当抗体结合于抗原上时，一些氨基酸的局部环境就发生变化。那些变化最大的氨基酸就是那些参与到抗体接触程度最大的氨基酸。鉴别表位的策略是，对结合和未结合状态下的抗原和抗体进行完整NMR排布，来确定哪个氨基酸发生了原子移动。如果没有今天的设备和方法，那么抗原-抗体复合物NMR谱的复杂度就会使这种分析极端困难，并且无法应用于常规表位鉴别。

可使用包含富C13或N15氨基酸的蛋白进行蛋白表位鉴别，而这其中并不总是需要精确的NMR信号鉴别。这些表位可以是抗体的结合区域，也可以是受体的结合区域。

使用重组技术表达修饰蛋白，其某个氨基酸被替换为含有N15或C13标记的同种氨基酸。所得蛋白与未修饰蛋白具有相同结构和活性。然后分别在该修饰蛋白的结合抗体存在和未存在情况下，对该蛋白进行N15或C13NMR谱分析。未标记氨基酸中共振原子核的天然丰度低，这将简化NMR谱，从而使去耦NMR谱根据氨基酸被均一标记还是被特异标记，显示N15谱的单峰和C13的单峰或其简单图式(simple patterns)。当标记氨基酸参与结合抗体时，将观察到共振移动(shift)。例如一个长200氨基酸并含有10个N15标记丙氨酸的蛋白，在其N15NMR谱中将看到10个单峰。如果在结合抗体后这些单峰中有两个发生移动，那就是由局部环境变化所引起的，从中可以推断它们在表位中的位置。而那两个丙氨酸在序列中的位置不能这个单峰谱中得到。当上述程序重复20次，并且每次标记氨基酸都不同后，就可以知道表位的组成。因为蛋白是通过重组得到的，所以其序列是已知的。根据表位组成和蛋白序列就可以确定表位位置。预测蛋白表面暴露序列的分子模型或算法可有助于表位鉴别。

不需要制备20个标记蛋白。在足以分辨不同氨基酸的共振时，可使用多重标记(在同一蛋白中标记2个或多个不同氨基酸)。例如，可在同一蛋白中参入a-N15丙氨酸和e-N15赖氨酸，或者3-N15组氨酸和a-N15亮氨酸。

该方法比现有的表位鉴别方法更加优越。那些使用合成肽的鉴别方法(聚乙烯大头针(pin)肽合成技术、固相(spot)合成技术或液相合成技术与ELISA或竞争法(competition)联合使用)或使用噬菌体的鉴别方法可能遗漏构象型表位。而这种NMR方法由于使用完整蛋白，所以可方便的同时检测到线性型表位和构象型表位。据称固相(spot)合成变异法(如肽基质(matrix))可更好的鉴别构象型表位，但所需肽的数量使得蛋白中氨基酸的数量发生指数性增长，简单的说就是一个分子量为40kD的蛋白需要约2百万个肽。蛋白水解与质谱法联用可以鉴别一些构象型表位，但这种方法会破坏蛋白，同时当蛋白分子变大时需要有更大数量的蛋白用于质谱。而NMR法对蛋白没有破坏性。如果标记蛋白量少，那么可以在每次实验后回收它并在其它抗体做图时重复使用。蛋白点突变或“丙氨酸扫描”可有效鉴别线性型表位和构象型表位，但其困难在于每个蛋白都需要有其DNA以进行表达，同时不是所有点突变体都是分泌蛋白，并且还需要确定每个点突变蛋白是否都正确折叠。而这种NMR法对所有标记蛋白都使用相同DNA，并且标记蛋白与未标记蛋白的分泌和折叠情况相同。晶体学法是表位鉴别的“金标准”(goldstandard)。它的缺点在于需要大量的时间，可能需要大量蛋白，同时衍射级别的晶体生长困难，并且事实上同一抗原的每个抗体都需要有新蛋白和新晶体。

实施例4：用晶体结构构建嵌合诱杀蛋白

根据IL-4及其近缘类似物IL-13的晶体结构，选择一个特殊受体结合域作为抗体靶点。设计并制备一个嵌合蛋白，用以选择结合于两个蛋白的该区域上的结合体。

已经得到了IL-4的晶体结构。IL-13的晶体结构尚未被确定，但已构建出一个理论模型。由于其生物学功能，IL-4和IL-13都是重要的治疗蛋白。已报道IL-4能够抑制自身免疫疾病，而IL-4和IL-13都有提高抗肿瘤免疫反应的能力。另一方面，因为这两种细胞因子都参与过敏疾病的发病机制，所以对它们的拮抗作用将有利于治疗过敏和过敏性哮喘。

已有文献描述了一些突变蛋白(如，(IL-4Y124D拮抗剂和IL-13R112D激动剂)the IL-4Y124D antagonist and the IL-13 R112D agonist，J.Biol.Chem(2000)，275，14375-14380)。使用分子模型设计了以下新型IL-4和IL-13激动突变体。因为据预测这些突变体比天然蛋白更加稳定，所以预期它们是与细胞因子受体的结合的生物上更强效的结合体，并具有抗肿瘤药物的潜力。另外，这些蛋白可被作为天然细胞因子的稳定类似物用在液相淘选方法中，或者用于寻找域选择性结合剂，如一个受体结合结构域拮抗剂。

使用Brookhaven Crystallographic Database数据库中IL-4的分子模型和晶体结构及IL-13的理论模型，检验IL-4和IL-13的结构。鉴别出分子结构内部的一些氨基酸，可对这些氨基酸进行替换，并且预计替换不会对结构造成负面影响。事实上，能量计算表明这些替换后的结构比天然序列更加稳定。这些替换是，IL-4：Thr¹³＝＞Ser¹³、Thr＝＞Ser²²、Phe55＝＞Tyr⁵⁵、Phe55＝＞Tyr⁵⁵，IL-13：Ile48＝＞Val⁴⁸、Gln⁹⁰＝＞Glu⁹⁰、Leu⁹⁵＝＞lle⁹⁵、Leu⁹⁶＝＞Ile⁹⁶、Leu⁹⁹＝＞Ile⁹⁹、Phe¹⁰³＝＞Tyr¹⁰³。

建立了一个IL-4数据库(图6A&6B)，内容包括对暴露氨基酸的计算。第一列仅包括侧链数据，第二列包括侧链数据和骨架数据。表面暴露程度很少和不暴露的氨基酸用粗体/蓝色和标出。

表中去掉了埋藏于分子内部的残基和半胱氨酸，因为替换它们会影响结构。计算可能的替换，结果如下：

通过100个共轭梯度循环，介电值(dielecrtic)100，所有氢用Tripos力场和Kollman-Uni场作用确定，将IL-4的结构范围最小化。然后进行上文建议的单个变化并计算能量。根据这些计算，最佳替换是Ser换Thr¹³，Ser换Thr²²，Tyr换Phe⁴⁵，Tyr换Phe⁵⁵。

检索IL-4晶体结构，计算结构未最小化之前的能量，计算进行上述4个替换后的能量，结果如下：

天然晶体结构

键伸缩能： 231.645

角弯曲能： 298.910

扭转能： 453.633

面外弯曲能： 46.674

1-4范德华力能： 386.851

范德华力能： 1134.199

1-4静电能： 30.608

静电能： 1043.112

-----------------------------------------

总能量： 3625.631kcals/mol

Ser ¹³ 、Ser ²³ 、Tyr ⁴⁵ 、Tyr ⁵⁵ 结构

键伸缩能： 233.378

角弯曲能： 299.147

扭转能： 449.605

面外弯曲能： 46.468

1-4范德华力能： 384.334

范德华力能： 1125.512

1-4静电能： 30.677

静电能： 1043.004

------------------------------------------

总能量： 3612.126kcals/mol

扭转能、1-4范德华力和范德华力能都降低了。根据能量计算，预测这个结构比天然序列更加稳定。被修饰的氨基酸埋藏于分子内部，但由于评估了替换后认为其不影响对二级结构，所以表面结构没有变化因而其功能活性也没有变化。

对IL-13构建类似表格(图7A&7B)。其晶体结构尚未发表但已有理论模型。对原始结构和修饰结构均进行10轮最小化。

内部残基也可被修饰。

尽管用Tyr替换Phe⁶⁶后能量更高，但其看起来像是一个良好替换。更高的能量来自更高的羟基间范德华力。

Phe⁶⁶和His⁶⁹相互作用(π-π)，两者都必须保持其芳香性。

Ile替换Va^l92带来更高的能量，但少量的最小化(minimization)大大降低了该值。这个替换很可能可用。

Tyr替换Phe103增加了一个与His⁶⁹的额外氢键，可能是一个良好替换。

检索IL-13结构，计算能量，进行替换并计算替换后的能量，结果如下：

起始模型结构

键伸缩能： 290.14

角弯曲能： 390.042

扭转能： 388.721

面外弯曲能： 30.217

1-4范德华力能： 286.329

范德华力能： 210.384

1-4静电能： 27.906

静电能： -1.547

----------------------------------------

总能量： 1622.216kcals/mol

Val ⁴⁸ 、Glu ⁹⁰ 、Ile ⁹⁵ 、Ile ⁹⁶ 、Tyr ¹⁰³ 结构

键伸缩能： 288.604

角弯曲能： 383.273

扭转能： 384.452

面外弯曲能： 29.889

1-4范德华力能： 284.920

范德华力能： 228.808

1-4静电能： 27.989

静电能： -1.594

----------------------------------------

总能量： 1626.342kcals/mol

键伸缩能、角弯曲能、1-4范德华力和范德华力能降低，而扭转能和键伸缩能提高。后者可通过复位新放置的Ile侧链得以降低。

修饰结构

能量 RMS力 max力相互作用 Eval CPU时间

kcals/mol kcals/mol A kcals/mol A 计数计数时间

1626.342 25.436 243.087 0 1 0

0:00:00.33

1326.768 14.851 134.040 1 8 0

0:00:01.11

1207.892 10.799 137.468 2 14 0

0:00:01.78

1121.012 10.155 171.991 3 20 0

0:00:02.44

1065.839 7.613 105.188 4 26 0

0:00:03.11

1031.513 6.361 73.260 5 32 0

0:00:03.76

995.717 6.643 64.166 6 38 0

0:00:04.42

965.486 5.399 54.345 7 44 0

0:00:05.09

945.615 5.429 61.839 8 50 0

0:00:05.76

924.480 4.655 50.214 9 56 0

0:00:06.42

907.908 4.448 55.866 10 62 0

0:00:07.08

警告：已达到最大迭代(iterations)数(10)。

IL-13模型1(理论模型)的分子能量

键伸缩能： 49.661

角弯曲能： 297.149

扭转能： 328.222

面外弯曲能： 8.744

1-4范德华力能： 189.249

范德华力能： 8.139

1-4静电能： 28.271

静电能： -1.556

--------------------------------------

总能量： 907.908kcals/mol

范德华力+静电对的平均数量＝5677

1-4范德华力+静电对的平均数量＝3415

标准(scaled)范德华力+静电对的平均数量＝248

	数量	CPU时间(sec)	％总体
				非键相互作用(Rebuilds)	2	0.08	1.08
能量评价	64	7.33	98.92

起始结构

IL-13模型1(理论模型)分子能量

能量 RMS力 max力相互作用 Eva1 CPU时间

kcals/mol kcals/mol A kcals/mol A 计数计数时间

1622.189 25.201 243.087 0 1 0

0:00:00.34

1328.927 14.694 132.377 1 8 0

0:00:01.12

1212.237 10.675 135.392 2 14 0

0:00:01.79

1127.031 10.061 169.922 3 20 0

0:00:02.47

1072.925 7.499 103.477 4 26 0

0:00:03.13

1039.540 6.289 73.212 5 32 0

0:00:03.81

1004.102 6.619 64.355 6 38 0

0:00:04.49

973.968 5.370 54.031 7 44 0

0:00:05.15

954.110 5.428 64.203 8 50 0

0:00:05.82

932.787 4.648 46.556 9 56 0

0:00:06.50

915.954 4.442 52.618 10 62 0

0:00:07.16

警告：已达到最大迭代数(10)。

IL-13模型1(理论模型)分子能量

键伸缩能： 48.807

角弯曲能： 300.150

扭转能： 331.002

面外弯曲能： 8.945

1-4范德华力范德华力能： 192.067

范德华力范德华力能： 8.307

1-4静电能： 28.178

静电能： -1.503

---------------------------------------------

总能量： 915.954kcals/mol

范德华力+静电对的平均数量＝5717

1-4范德华力+静电对的平均数量＝3426

标准范德华力+静电对的平均数量＝247

	数量	CPU时间(sec)	％总体
				非键相互作用(Rebuilds)	2	0.08	1.07
能量评价	64	7.41	98.93

使用Brookhaven Crystallographic Database数据库中IL-4的分子模型和晶体结构及IL-13的理论模型，检验IL-4和IL-13的结构。鉴别出分子结构内部的一些氨基酸，可对这些氨基酸进行替换，并且预计替换不会对结构造成负面影响。事实上能量计算表明这些替换后的结构比天然序列更加稳定。这些替换是，IL-4：Thr¹³＝＞Ser¹³、Thr＝＞Ser²²、Phe⁴⁵＝＞Tyr⁴⁵、Phe⁵⁵＝＞Tyr⁵⁵，IL-13：Ile⁴⁸＝＞Val⁴⁸、Gln⁹⁰＝＞Glu⁹⁰、Leu⁹⁵＝＞Ile⁹⁵、Leu⁹⁶＝＞Ile⁹⁶、Leu⁹⁹＝＞Ile⁹⁹、Phe¹⁰³＝＞Tyr¹⁰³。

完整序列为：

IL-4构建体(SEQ ID NO：16)

HKCDITLQEI IKSLNSLTEQ KSLCTELTVT DIFAASKNTT EKETYCRAAT VLRQYYSHHE

KDTRCLGATA QQFHRHKQLI RFLKRLDRNL WGLAGLNSCP VKEANQSTLE NFLERLKTIM

REKYSKCSS

IL-13构建体(SEQ ID NO：17)

PPSTALRELI EELVNITQNQ KAPLCNGSMV WSINLTAGMY CAALESLVNV SGCSAIEKTQ

RMLSGFCPHK VSAGQFSSLH VRDTKIEVAE FVKDIILHIK KLYREGRFN

下划线所示为替换氨基酸。

少数最小化后修饰结构的能量更低，这表明这个结构比原始序列更加稳定。这些构建体和通过其它类似方式制备的构建体可用于本发明方法中。

序列表

<110>Centocor，Inc.

o′Neil，Karyn

Heavner，George

Sweet，Raymond

<120>Solution Phase Biopanning Method using Engineered Decouy Proteins

<130>CEN5055

<140>TBD

<141>2005-03-21

<150>60/565,633

<151>2004-04-26

<150>60/565,674

<151>2004-04-26

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>221

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>鼠TFw 8Hu残基

<400>1

Gly Ile Pro Glu Lys Ala Phe Asn Leu Thr Trp Ile Ser Thr Asp Phe

1 5 10 15

Lys Thr Ile Leu Glu Trp Gln Pro Lys Pro Thr Asn Tyr Thr Tyr Thr

20 25 30

Val Gln Ile Ser Asp Arg Ser Arg Asn Trp Lys Asn Lys Cys Phe Ser

35 40 45

Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val

50 55 60

Thr Trp Ala Tyr Glu Ala Lys Val Leu Ser Val Pro Arg Arg Asn Ser

65 70 75 80

Val His Gly Asp Gly Asp Gln Leu Val Ile His Gly Glu Glu Pro Pro

85 90 95

Phe Thr Asn Ala Pro Lys Phe Leu Pro Tyr Arg Asp Thr Asn Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Val Ile Gln Gln Phe Glu Gln Asn Gly Arg Lys Leu Asn Val

115 120 125

Val Val Lys Asp Ser Leu Thr Leu Val Arg Lys Asn Gly Thr Phe Leu

130 135 140

Thr Leu Arg Gln Val Phe Gly Lys Asp Leu Gly Tyr Ile Ile Tyr Tyr

145 150 155 160

Arg Lys Gly Ser Ser Thr Gly Lys Lys Thr Asn Lys Thr Asn Thr Asn

165 170 175

Glu Phe Ser Ile Asp Val Glu Glu Gly Val Ser Tyr Cys Phe Phe Val

180 185 190

Gln Ala Val Ile pro Ser Arg Lys Val Asn Arg Lys Ser Pro Asp Ser

195 200 205

Ser Thr Val Cys Thr Glu Gln Trp Lys Ser Phe Leu Gly

210 215 220

<210>2

<211>118

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>结合

<222>(26)..(35)

<223>CDR1

<220>

<221>结合

<222>(50)..(67)

<223>CDR2

<220>

<221>结合

<222>(100)..(107)

<223>CDR3

<400>2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Gly Pro Gly His Ser Tyr Thr Lys Tyr Ser Pro Ser

50 55 60

Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Asn Met Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>3

<211>111

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>结合

<222>(23)..(34)

<223>CDR1

<220>

<221>结合

<222>(50)..(56)

<223>CDR2

<220>

<221>结合

<222>(89)..(99)

<223>CDR3

<400>3

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu Gly Leu Lys Lys Phe

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile

35 40 45

Tyr Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Tyr Asp Gln Thr Ile Gly

85 90 95

His Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210>4

<211>116

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>结合

<222>(26)..(34)

<223>CDR1

<220>

<221>结合

<222>(49)..(65)

<223>CDR2

<220>

<221>结合

<222>(98)..(105)

<223>CDR3

<400>4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp

20 25 30

Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly

35 40 45

Trp Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Met Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

50 55 60

Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Tyr Leu Phe Gly Leu Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>5

<211>107

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>结合

<222>(23)..(33)

<223>CDR1

<220>

<221>结合

<222>(49)..(55)

<223>CDR2

<220>

<221>结合

<222>(88)..(95)

<223>CDR3

<400>5

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Ser Tyr Tyr Val

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Asn Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Asp Ser Ser Thr Asp Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210>6

<211>119

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>结合

<222>(26)..(34)

<223>CDR1

<220>

<221>结合

<222>(49)..(65)

<223>CDR2

<220>

<221>结合

<222>(98)..(108)

<223>CDR3

<400>6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr Trp

20 25 30

Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly

35 40 45

Phe Ile Asp Pro Asp Asp Ser Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

50 55 60

Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Tyr Met Gln Gly Gly Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>7

<211>109

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>结合

<222>(23)..(33)

<223>CDR1

<220>

<221>结合

<222>(49)..(55)

<223>CDR2

<220>

<221>结合

<222>(88)..(97)

<223>CDR3

<400>7

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Ser Tyr Tyr Val

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Arg Asp Thr Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly Val Ser Asn

85 90 95

Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210>8

<211>119

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>结合

<222>(26)..(34)

<223>CDR1

<220>

<221>结合

<222>(49)..(65)

<223>CDR2

<220>

<221>结合

<222>(98)..(108)

<223>CDR3

<400>8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Tyr Ser Phe Thr Asn Ser Trp

20 25 30

Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly

35 40 45

Ile Ile Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

50 55 60

Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Ala Gly Tyr Gly Arg Met Phe Gly Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>9

<211>108

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>结合

<222>(23)..(33)

<223>CDR1

<220>

<221>结合

<222>(49)..(55)

<223>CDR2

<220>

<221>结合

<222>(88)..(96)

<223>CDR3

<400>9

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Asp Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Tyr Thr Tyr Ser Thr Ser Trp

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210>10

<211>118

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>结合

<222>(26)..(37)

<223>CDR1

<220>

<221>结合

<222>(52)..(67)

<223>CDR2

<220>

<221>结合

<222>(100)..(107)

<223>CDR3

<400>10

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Leu Ser Leu Ser Thr Sar

20 25 30

Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Ser Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Thr Ser

50 55 60

Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Tyr Lys Gln Glu Thr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>11

<211>105

<212>PRT

<213>人

<220>

<221>结合

<222>(23)..(33)

<223>CDR1

<220>

<221>结合

<222>(49)..(53)

<223>CDR2

<220>

<221>结合

<222>(86)..(93)

<223>CDR3

<400>11

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Glu Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Asp Asp Asn Asn Arg Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser

50 55 60

Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu Asp Glu

65 70 75 80

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ile Glu Ile Thr Val Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210>12

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人序列与牛同源残基取代基础上的嵌合蛋白

<400>12

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Iie Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Ile Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Pro Ser Ala Lys Gln Val Ser

65 70 75 80

Ser Glu Tyr Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

<210>13

<211>113

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人序列与猪同源残基取代基础上的嵌合蛋白

<400>13

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr ALa Gly Met Gln Tyr Cys Ala Ala Leu

35 40 45

Glu Ser Leu Ile Asn Ile Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln

50 55 60

Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Ser His Lys Pro Pro Ser Glu Gln Val

65 70 75 80

Pro Gly Lys His Ile Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val

85 90 95

Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe

100 105 110

Asn

<210>14

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人序列与狗同源残基取代基础上的嵌合蛋白

<400>14

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Ser Gln Lys Pro Ala Ala Gly Gln Ile Ser

65 70 75 80

Ser Glu Arg Ser Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

<210>15

<211>109

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人序列与小鼠同源残基取代基础上的嵌合蛋白

<400>15

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Ile Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Asn Arg Lys Ala Pro Thr Thr Val Ser Ser

65 70 75 80

Leu Pro Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu

85 90 95

Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105

<210>16

<211>129

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>稳定性提高的人IL-4

<400>16

His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Ser Leu Asn Ser

1 5 10 15

Leu Thr Glu Gln Lys Ser Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile

20 25 30

Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Tyr Cys Arg Ala

35 40 45

Ala Thr Val Leu Arg Gln Tyr Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg

50 55 60

Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile

65 70 75 80

Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu

85 90 95

Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe

100 105 110

Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser

115 120 125

Ser

<210>17

<211>109

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>稳定性增强的人IL-13

<400>17

Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile

1 5 10 15

Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser

20 25 30

Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Val

35 40 45

Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser

50 55 60

Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His

65 70 75 80

Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Glu Phe Val Lys Asp Ile Ile

85 90 95

Leu His Ile Lys Lys Leu Tyr Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105

Claims

1.一种鉴别能够结合于靶蛋白的预选定表位的多肽的方法，其步骤包括：

(a)提供将多肽表达于噬菌体颗粒表面的噬菌体颗粒文库，

(b)制备诱杀蛋白，该蛋白在对应于靶蛋白的预选定表位的该靶蛋白约5-15个氨基酸残基的线性片段内具有约5-10个氨基酸序列的变化，

(c)将噬菌体颗粒文库与靶蛋白一起温育，以选出具有能够结合于靶蛋白的多肽的噬菌体颗粒，

(d)加入摩尔浓度过量的诱杀蛋白作为竞争剂，以负选择出特异于预选定表位的噬菌体颗粒，

(e)将结合于靶蛋白的噬菌体颗粒与结合于诱杀蛋白的噬菌体颗粒分离，

(f)回收结合于靶蛋白的噬菌体颗粒。

2.权利要求1的方法，其中诱杀蛋白被用来从文库选择具有能够结合于诱杀蛋白的多肽的噬菌体颗粒进行测试，然后淘汰与靶蛋白的结合的多肽。

3.权利要求1的方法，其中靶蛋白被用来从文库中选择具有能够结合于靶蛋白的多肽的噬菌体颗粒，然后淘汰那些结合于诱杀蛋白的多肽。

4.权利要求1的方法，其中能够结合于预选定表位的多肽是抗体或抗体片段。

5.权利要求4的方法，其中多肽是抗体片段，包括Fab、Fab’或F(ab’)2片段，或这些片段的衍生物。

6.权利要求5的方法，其中抗体是作为替代抗体的单克隆抗体，其结合鼠组织因子上的类似表位。