PT1747015E - Método de seleção por biopanning de fase de solução utilizando proteínas chamariz modificadas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO DE SELEÇÃO POR BIOPANNING DE FASE DE SOLUÇÃO UTILIZANDO PROTEÍNAS CHAMARIZ MODIFICADAS" ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Arte relacionada

Na era pós-genómica, os esforços no desenvovimento de fármacos podem agora ser concentrados em encontrar métodos para bloquear especificamente a função de proteínas chave previamente identificadas por tais técnicas como análise de microarray dos níveis de expressão do ARNm em estados de doença. A proteómica é a nova ciência que abrange o entendimento do modo como as proteínas interagem umas com as outras quer em vias coordenadas quer como parceiros de ligação. As relações entre a atividade e a estrutura para as proteínas incluem o mapeamento de domínios comuns e a identificação de conformações tridimensionais responsáveis pelas funções. 0 acesso a informação tridimensional (3D) sobre as proteínas também se tornou rotineira. Por exemplo, o NCBI mantém o acesso público a uma ferramenta chamada VAST que é um serviço de pesquisa de semelhança estrutura-estrutura. Compara coordenadas 3D da estrutura de uma proteína determinada nova com aquelas na base de dados de modelação molecular (MMDB) e na base de dados de proteínas (PDB). A tecnologia de apresentação em fagos (phage display) descreve uma técnica de seleção in vitro na qual a sequência polinucleotídica que codifica um péptido ou proteína é geneticamente fundida com uma proteína de revestimento de um bacteriofago, resultando na apresentação da proteína fundida no exterior do virião do fago, enquanto o ADN que codifica a fusão reside dentro do virião. Esta ligação física entre a proteína apresentada e o ADN que a codifica permite o rastreio de vastos números de variantes 2 da proteína, cada ligada à sua sequência de ADN correspondente, por um procedimento simples de seleção in vitro chamado "biopanning".

As bibliotecas de apresentação em fago, ribossoma, levedura, e bactérias são ferramentas para pesquisar grandes números de proteínas ou péptidos. A apresentação em ribossoma é um método de traduzir ARNm nas suas proteínas cognato enquanto mantém a proteína anexada ao ARN. A sequência que codifica o ácido nucleico é recuperada por RT-PCR (Mattheakis, L.C. et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 9022). A apresentação em levedura é baseada na construção de proteínas de fusão do recetor de adesão de levedura alfa-aglutinina associado à membrana, agal e aga2, uma parte do tipo do sistema de conjugação (Broder, et al. 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7). A exibição bacteriana é baseada na fusão do alvo com as proteínas bacterianas exportadas que se associam à membrana da célula ou parece celular (Chen e Georgiou. 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503).

Quando comparado com a tecnologia do hibridoma, os métodos de apresentação em fagos e outros métodos de apresentação de anticorpos proporcionam a oportunidade de manipular a seleção contra o alvo antígeno in vitro e sem a limitação da possibilidade dos efeitos do hospedeiro no antígeno ou vice-versa. Uma vantagem particular dos métodos de seleção in vitro é a capacidade de manipular os procedimentos de seleção para obter anticorpos que se ligam a diversos locais na proteína alvo.

Enquanto as bibliotecas de fagos simplificam a recuperação de material genético associado a atributos funcionais, estratégias de panning multi-passos são necessárias para isolar o melhor candidato da biblioteca. Por outro lado, naquelas circunstâncias onde a informação estrutural respeitante ao domínio functional de um ligando polipeptídico é conhecida, seria desejável ter um método 3 para selecionar anticorpos ou outros parceiros de ligação tais como péptidos ou proteínas que se ligam a um ligando em domínios definidos especificados. 0 método de panning dirigidos a domínios ou epítopos tornaram-se uma forma rotineira de selecionar anticorpos que se ligam a uma proteína alvo. Tais seleções foram inicialmente conseguidas empregando uma seleção por passos de anticorpos utilizando métodos conhecidos variadamente como panning seletivo, panning não-seletivo, captura de ligando, panning subtrativo ou seleção pathfinder (Hoogenboom, H. R. et al (2000) supra).

No panning subtrativo, o(s) alvo(s) com locais de ligação sobreponíveis, mas não completamente idênticos, podem ser utilizados para desselecionar ligantes indesejados. Esta estratégia tem sido utilizada para identificar ligantes mesmo para antígenos desconhecidos como no uso de células normais para desselecionar ligantes a células cancerígenas. Em alternativa, proteínas que ocorrem naturalmente com alguns domínios ou estrutura comuns são utilizadas na seleção sequencial ou de competição para obter anticorpos que se ligam a locais que diferem ou são comuns entre os antígenos relacionados. Tipicamente, estes estudos utilizaram proteínas que ocorrem naturalmente tais como quimiocinas relacionadas ou proteínas H-ras mutantes (Horn, I.R. et al. 1999, FEBS Lett. 463:115-120). O panning dirigido à captura de ligando é análoga a um ensaio sandwich ELISA no qual um anticorpo imobilizado a um epítopo irrelevante e não-adjacente é utilizado para capturar e apresentar a face de ligação preferida do ligando alvo para o panning de fagos (US6376170). Outros utilizaram anticorpos que competem para mascarar seletivamente o antígeno noutro que não o domínio alvo desejado (Tsui, P. et al. 2002. J. Immunol. Meth. 263:123-132). A tecnologia pathfinder utiliza anticorpos 4 monoclonais e policlonais, bem como ligandos naturais conjugados diretamente ou indiretamente com peroxidase de rábano (HRP). Na presença de biotina tiramina estas moléculas catalizam a biotinilação de fagos que se ligam em estreita proximidade ao antigeno alvo, permitindo a recuperação especifica de fagos 'rotulados' da população total utilizando estreptavidina. Desta forma, os fagos ligados ao alvo em si, ou na sua proximidade imediata, são seletivamente recuperados (Osbom, J.K. et al. 1998 . Immunotechnol. 3: 293-302). A utilização de anticorpos monoclonais para dirigir a ligação para locais alternativos também foi chamada "epítopo andando" (do inglês epitope walking) (Osbom, J.K. et al. 1998 . supra). Burioni et al. 1998 . Research in virology 5:327-330, Zhou et al. 2002, PNAS. 99: 5241-5246 e Parsons et al. 1996 . Prot. Eng. 9: 1043-1049 revelam métodos de seleção negativa.

Estes métodos padecem do inconveniente de que um esforço completo dirigido para obter e caracterizar um parceiro de ligação indesejável tem de preceder o esforço de obter um parceiro de ligação ao domínio desejado e que um epítopo específico não seja alvo. A presente invenção providencia um método novo de obter anticorpos ou parceiros de ligação de ligandos que se ligam a um epítopo selecionado incorporando uma proteína híbrida competidora no processo de seleção por panning.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção providencia um método novo de selecionar parceiros de ligação ao ligando que se ligam a domínio pré-selecionado utilizando um ligando chamariz desenhado por engenharia genética no processo de panning de acordo com as reivindicações em anexo. O ligando chamariz é desenhado de maneira que difere da proteína alvo apenas no domínio pré-selecionado que constitui o suposto local de ligação. O desenho da proteína chamariz pode ser baseado na informação estrutural derivadas de medições reais, por 5 exemplo dados de cristalografia por raio-X, ou o desenho pode ser baseado em informação in silico, dados gerados por modelação computacional de estruturas tridimensionais. Onde a informação estrutural está disponível, o desenho da proteína chamariz é simplificado. Onde não existe informação estrutural ou esta é incompleta, a modificação de regiões discretas da sequência pode ser baseada em variantes naturais, tais como espécies homólogas, para criar um chamariz.

Os ácidos nucleicos que codificam as proteínas chamariz da invenção úteis para expressar as proteínas chamariz numa célula hosepdeira ou organismo são revelados aqui .

Se utilizada para transfetar uma célula hospedeira, a proteína chamariz pode ser expressa na superfície da célula ou como uma proteína livre segregada que é recuperável do meio de crescimento celular. A proteína chamariz pode ser purificada ou utilizada num ambiente heterogéneo, tal como aquele na superfície celular. Durante a etapa de biopanning, a razão molar da proteína alvo e chamariz é mantida de tal maneira que ligantes não específicos e de baixa afinidade são desselecionados e apenas os ligantes ao alvo são recuperados. Desta forma, os parceiros de ligação à proteína fundidos com o seu material genético cognato são selecionados de uma biblioteca pela capacidade de se ligarem especificamente à proteína alvo num local de ligação que está alterado na proteína chamariz e, portanto, sabe-se que interage com o domínio desejado.

Noutro aspeto revelado aqui o método de selecionar anticorpos que se ligam a um epítopo pré-determindo pode ser utilizado para converter as propriedades desejáveis de um anticorpo alvo terapêutico ou ligação ao ligando que provou ser bem-sucedido numa espécie, tal como um modelo animal, diretamente a um análogo bioterapêutico para uso eficaz noutra espécie. Em alternativa, medicamentos 6 biológicos humanos podem ser prontamente convertidos em análogos úteis para tratamento de outros mamíferos com um mecanismo de ação análogo no género ou espécie animal no qual é pretendido para uso, por exemplo, gado bovino, gado suíno, aves domésticas, cães, gatos, ou outros animais domésticos ou de pecuária importantes. Numa modalidade desta invenção, o processo é utilizado para selecionar anticorpos que interagem com uma proteína homóloga no mesmo domínio tridimensional que o anticorpo de referência. Isto tem aplicação particular onde, por exemplo, um anticorpo monoclonal dirigido à região particular ou epítopo de um antígeno humano é conhecido e é desejável para regenerar a ligação ao ligando, por exemplo, anticorpos humanos ao alvo humano, ao mesmo epítopo. Noutra modalidade, o processo é útil onde um anticorpo existe que se liga a um epítopo de um antígeno humano e anticorpos susbstitutos que reagem com o mesmo epítopo na proteína correspondente noutra espécie, tal como o ratinho, são desejados para fins de investigação. Desta forma, podem ser obtidos anticorpos anti-ratinho que têm propriedades semelhantes ao anticorpo anti-humano parental.

Assim, num aspeto, um método para selecionar um parceiro de ligação ao ligando polipéptido bloqueador de uma biblioteca em que a região functional específica do ligando a ser ligada está pré-determinada, dito método compeendendo as etapas de a) determinar o domínio funcional da proteína a ser bloqueada b) analisar as características estruturais comuns entre o ligando e uma ou mais espécies ou homólogos funcionais desse ligando, c) criar um chamariz que incorpora ditas características estruturais comuns do ligando e os homólogos escolhidos em que o chamariz tem as características estruturais comuns em regiões que não o domínio funcional a ser bloqueado, e d) utilizar dito chamariz em excesso do parceiro de ligação ao ligando para selecionar ligantes que se liguem preferencialmente ao 7 domínio funcional a ser bloqueado Burioni et al. 1998 .

Research in virology 5:327-330, Zhou et al. 2002, PNAS. 99:5241-5246 e Parsons et al. 1996. Prot. Eng. 9: 1043-1049 revelam métodos de seleção negativa.

Num outro aspeto, a presente invenção é dirigida para um método para identificar um anticorpo que se liga a um epítopo pré-selecionado de uma proteína alvo, que compreende (a) providenciar uma biblioteca de partículas de fago que expressam anticorpos na superfície das partículas de fago (b) preparar uma proteína chamariz que tem alterações nas sequências aminoacídicas correspondentes ao epítopo pré-selecionado da proteína alvo e em que a proteína chamariz difere da proteína alvo apenas no epítopo pré-selecionado (c) incubar a biblioteca de partículas de fago com a proteína alvo para selecionar partículas de fago com anticorpos que se ligam às partículas com a proteína alvo para selecionar partículas de fago com anticorpos qe se ligam à proteína alvo (d) adicionar a proteína chamariz como um competidor em concentração molar em excesso para selecionar negativamente as partículas de fago específicas do epítopo pré-selecionado (e) separar as partículas de fago que se ligam à proteína alvo daquelas que se ligam à proteína chamariz e (f) recuperar as partículas de fago ligadas à proteína alvo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma representação gráfica do método da invenção. A Figura 2 mostra as sequências CDR e designações de estrutura para o candidato líder Fabs de ligação mTF. A Figura 3 é um gráfico da dependência da concentração da ligação do Fabs selecionado pelo método da invenção à proteína alvo (mTF, linhas sólidas) e ao chamariz desenhado por engenharia genética com duas alterações de aminoácidos no epítopo pré-selecionado (hu/mTF, linhas tracejadas). A Figura 4 é um gráfico que mostra a concentração versus unidades fluorescentes relativas para dois Fabs selecionados que se ligam ao fator de tecido murino. A Figura 5 é um alinhamento de sequência múltiplo de proteínas IL-13 derivadas de várias espécies. A Figura 6A e B são a energia e as dimensões de área de hIL-4 derivados de dados cristalográficos. A Figura 7A e B são a energia e as dimensões de área de hIL-13 calculados de IL-4 derivada de dados cristalográficos.

Abreviações

Abs anticorpos, policlonais ou monoclonais bFGF fator de crescimento de fibroblasto básico GM-CSF fator estimulante de colónias de granulócitos- macrófagos IL interleucina

Mab anticorpo monoclonal TF fator de tecido FIIV Fator IIV (inativo)

FlIVa Fator IlVa (inativo) FX Fator X (inativo) FX Fator Xa (ativo) DESCRIÇÃO DETLHADA Definições

Pelo termo "anticorpo" quer-se dizer uma imunoglobulina ou fragmento de ligação derivado de imunoglobulina. Enquanto todas as imunoglobulinas não ligam o antígeno, foi demonstrado que os fragmentos de anticorpos podem ligar antígenos, polipéptidos ou proteínas alvo, e algumas outras moléculas. Assim, como utilizado aqui e "fragmentos de ligação a antígeno" incluem, mas não se limitam a: (i) o fragmento Fab que consiste nos domínios variáveis (V) de uma cadeia pesada (H) e leve (L) de anticorpo juntamente com os respetivos domínios constante (C) (domínios VL-CL e VH-CH1); (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CHI; (iii) o fragmento Fv que 9 consiste nos domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb (Ward, E. S. et al., Nature 341:544-546 (1989)) que consiste num domínio VH; (v) regiões isoladas CDR; (vi) fragmentos F(ab')2 (vii) moléculas Fv de cadeia simples (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por um ligante peptídico que permite aos dois domínios associarem-se para formar um local de ligação ao antígeno; (viii) dímeros Fv biespecíficos de cadeia simples e (ix) combinações e proteínas de fusão que compreendem o previamente mencionado, incluindo mas não limitado a diacorpos, fragmentos multivalentes ou multiespecíficos ou outras construções desenhadas por engenharia genética capazes de ligar um polipéptido alvo e compreender um fragmento derivado de imunoglobulina.

Uma "quimera" ou "proteínas quiméricas" são aquelas que contêm resíduos ou domínios de uma ou mais proteínas homólogas de espécies. Por exemplo, anticorpos quiméricos contêm domínios variáveis tipicamente derivados de um mAb murino fundido com domínios constantes de uma imunoglobulina humana. "Chamariz" ou "proteína chamariz" é o polipéptido desenhado que incorpora um domínio pré-selecionado ou desenhado por engenharia genética que será utilizado para seleção negativa ou positiva dos parceiros de ligação ao ligando alvo de uma biblioteca de ligantes alvo potenciais. "Epítopo" e definido como a região tridimensional de um ligando alvo que representa a unidade de estrutura ligada por um único anticorpo. Epítopos normalmente consistem em grupos moléculas de superfície quimicamente ativas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e normalmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos porque a ligação ao primeiro, mas não ao último, é perdida na presença de 10 solventes desnaturantes. O epítopo pode estar dentro ou abranger uma unidade funcional previamente descrita ou dominio de proteina estruturalmente caracterizado, tal como um dominio de ligação ao recetor ou um dominio tipo fibronectina. Assim, quando um epítopo é um domínio funcional de uma proteína, quando ligado pelo parceiro de ligação selecionado, resulta na modulação desejada da função do ligando alvo e que são antagonísticos ou agonísticos à função do ligando alvo. "Substituto" significa ter a função biológica análoga. Um anticorpo substituto desempenhará a função análoga, agonizar ou antagonizar a atividade do ligando alvo, num contexto ou espécie animal diferente do do anticorpo exemplar.

Por "humano" ou anticorpo de qualquer outra espécie, por exemplo, anticorpo humano, entende-se que inclui anticorpos tendo variáveis ou, regiões variáveis e constantes, derivadas de ou estritamente correspondentes sequências de imunoglobulinas germinativas humanas ou de outra espécie. Os anticorpos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulinas germinativas (tais como, mas não limitados a, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou específica de local in vitro ou por mutação somática in vivo) . Assim, como utilizado aqui, o termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo no qual substancialmente toda a parte da proteína (por exemplo, CDR, estrutura, domínios CL, CH (por exemplo, CH1, CH2, CH3), de dobradiça, (VL, VH)) é substancialmente semelhante com um anticorpo germinativo humano. Os anticorpos humanos têm sido classificados em grupos com base nas suas semelhanças de sequência de aminoácidos, ver por exemplo, http://people.cryst.bbk.ac.uk/-ubcg07s/. Assim, utilizar uma pesquisa por semelhança de sequência, um anticorpo com sequência linear semelhante pode ser escolhido como molde 11 para criar "anticorpos humanos". As sequências murinas germinativas também são conhecidas e podem ser empregues de maneira semelhante. Como os dados relacionados com as imunoglobulinas germinativas de outras espécies são recolhidos e indexados, uma utilização semelhante pode ser feita daquelas sequências para a produção de anticorpos não humanos da invenção de bibliotecas de exibição de fagos ou outras coleções de fragmentos de ligação ao antigeno por métodos agora conhecidos na arte.

Num aspeto, a presente invenção envolve a utilização de bibliotecas de exibição de fagos e combinatórias de péptidos. As bibliotecas de exibição de fagos e combinatórias de péptidos evoluíram em técnicas poderosas e adaptáveis para explorar interações de péptido e proteína. Uma biblioteca de fagos pode ser criada inserindo uma biblioteca de oligonucleotídeos aleatórios ou uma biblioteca de polinucleotídeos contendo sequências de interesse, tais como de células B de um animal ou humano imunizado (Smith, G.P. 1985. Science 228: 1315-1317). As bibliotecas de anticorpos de fagos contêm pares de região variável de cadeia leve (L) e pesada (H) num fago permitindo a expressão de fragmentos Fv ou fragmentos Fab de cadeia simples (Hoogenboom, et al. 2000. Immunol. Today 21 (8) 371-8) . A diversidade de uma biblioteca de fagomídeos pode ser manipulada para aumentar e/ou alterar as imunoespecificidades dos anticorpos monoclonais da biblioteca para produzir e subsequentemente identificar anticorpos monoclonais humanos adicionais desejáveis. Por exemplo, a molécula de imunoglobulina de cadeia leve (L) e de cadeia pesada (H) que codifica genes pode ser aleatoriamente misturada (baralhada) para criar novos pares HL numa molécula de imunoglobulina montada. Além disso, uma ou ambas as cadeias H e L que codificam genes podem ser mutagenizadas numa região determinante de complementaridade (CDR) da região variável do polipéptido imunoglobulina, e 12 subsequentemnte classificadas pela afinidade desejada e capacidades de neutralização. As bibliotecas de anticorpo também podem ser criadas sinteticamente criando uma ou mais sequências estrutura humanas e introduzindo coleções de cassetes CDR derivadas de repertórios de anticorpo humanos ou através de variação desenhada (Kretzschmar e von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnoloqy, 13:598-602). As posições da diversidade não estão limitadas a CDRs mas podem também incluir os seqmentos estrutura das regiões variáveis.

Outras bibliotecas úteis na prática da invenção incluem bibliotecas de exibição de fagos derivadas de animais não humanos ou de bibliotecas de anticorpo desenhados por engenharia. Um exemplo do primeiro inclui o uso de bibliotecas derivadas de imunoglobulina da espécie de camelídeo que são naturalmente desprovidas de cadeias leve (Hamers-Casterman et al., 1993, Nature 363: 446-448; Gahroudi et al., 1997, FEBS Lett.) e, do último, anticorpos de domínio simples que são derivados de um domínio variável de cadeia ou pesada ou leve com capacidade de ligação como ensinado na Patente U.S. N.° 6248516.

Além disso, vários tipos de fago ou outros sistemas de exibição, ribossoma, levedura, bactérias ou células animais, podem ser combinados com bibliotecas de fagos de péptido ou anticorpo em vários esforços para compreender a biologia ou descobrir novos fármacos ou alvos de fármacos. Por exemplo, bibliotecas de exibição de péptido de fagos podem ser utilizadas para interrogar bibliotecas de fagos de anticorpo. Utilizando um processo de eliminação, uma combinação de exibição de fagos substrato e métodos de subtração de substrato pode ser utilizada para descobrir diferenças de especificidade entre enzimas muito estreitamente relacionadas e esta informação pode ser utilizada para criar inibidores altamente seletivos (Ke, S-H, et al. 1997. J. Biol. Chem. 272 (26):16603-16609). 13 A ligação entre ligandos e recetores como antígenos e anticorpos é dependente de ligações de hidrogénio, ligações hidrofóbicas, forças eletrostáticas, e forças de van der Waals. Estas são todas ligações de uma natureza fraca, não covalente, no entanto sabe-se gue a associação entre antígeno e anticorpo é uma das ligações mais fortes encontradas na natureza. Como os anticorpos, os antígenos podem ser multivalentes, seja através de cópias múltiplas do mesmo epítopo, ou através da presença de múltiplos epítopos que são reconhecidos por múltiplos anticorpos. As interações que envolvem multivalência podem produzir complexos mais estabilizados, contudo a multivalência também pode resultar em dificuldades esféricas, reduzindo assim a possibilidade de ligação. Todas as ligações antígeno-anticorpo são reversíveis, contudo, e seguem os princípios básicos da termodinâmica de qualquer interação bimolecular reversível:

KA - fAb-Ab] koff [Ab] * [Ag]

Onde KA é a constante de afinidade, Ab e Ag são as concentrações molares de locais desocupados de ligação no anticorpo ou antígeno respetivamente, e Ab-Ag é a concentração molar do complexo anticorpo-antígeno. A reação para a frente é conhecida como a "na taxa" e a dissolução ou reação reversa é conhecida como "fora da taxa".

Para que ocorra a interação eficaz entre o antígeno e o anticorpo, o epítopo tem que estar prontamente disponível para ligação. Porque as moléculas de antígeno existem no espaço, o epítopo reconhecido por um anticorpo pode estar dependente da presença de uma conformação antigénica tridimensional específica (por exemplo um local único formado pela interação de duas subunidades de proteína nativa), ou o epítopo pode corresponder a uma região da sequência primária simples. Tais epítopos são descritos 14 como "conformacionais" e "lineares", respetivamente. Método da Invenção

Planeámos um método para isolar anticorpos ou outros ligandos de ligação que se ligam a um epitopo pré-determinado dirigindo a seleção de anticorpos exibidos de fagos utilizando uma proteína competidora fabricada por engenharia genética (Figura 1). 0 método confia na informação estrutural sobre a proteína alvo que é aplicada no desenho de uma proteína chamariz apropriada. Esta proteína chamariz é utilizada como um competidor na exibição de fago do anticorpo para isolar os anticorpos específicos de epitopo desejados (Figura 1). A especificidade de ligação dos anticorpos gerados pelo método tradicional de imunizar animais é motivada por uma combinação do sistema imune do animal e o antígeno proteína. Assim, os anticorpos derivados da imunização interagem frequentemente com epítopos "imunodominantes" que são diferentes dos epítopos alvo desejados. Métodos existentes de seleção de anticorpo utilizando bibliotecas de anticorpo exibido de fagos não podem ser dirigidos precisamente ao epitopo de interesse. 0 método revelado tem a vantagem de permitir a direção muito precisa e eficaz da seleção para anticorpos específicos para o epitopo alvo. 0 método de selecionar anticorpos que se ligam a um epitopo pré-determinado pode ser utilizado para converter as propriedades desejáveis de um anticorpo alvo terapêutico ou ligante ao ligando (bioterapêutico) que provou ser bem-sucedido numa espécie, tal como um modelo animal, diretamente a um bioterapêutico análogo para uso eficaz noutra espécie. Em alternativa, medicamentos biológicos humanos podem ser prontamente convertidos em análogos úteis para tratamento de outros mamíferos, por exemplo gado bovino, gado suíno, aves domésticas, cães, gatos, ou outros animais domésticos ou de pecuária importantes,ou animais raros ou espécies ameaçadas. 15

Entre os 15 estados mais comuns de doença que afetam os animais de companhia (cães, gatos, e cavalos) muitos são hormonais: diabetes mellitus em caninos e felinos, disfunções da tiroide em caninos e felinos, hipotiroidismo em caninos, hipertiroidismo em felinos, doença de Addison e doença de Cushing em caninos. Outras doenças comuns aos animais de companhia e outros animais incluem osteoartrite e várias formas de cancro. Assim, existe potencial para terapêuticas biológicas humanas bem-sucedidas, tais como terapêuticas de anticorpo anti-cancro e anti-inflamatórias, a serem convertidas para análogos específicos de outras espécies. Por exemplo, o fármaco REMICADE (infliximab) que se liga a um epítopo único na TNFalfa humana, utilizando os métodos da invenção poderia ser convertido num fármaco terapeuticamente eficaz para uso no tratamento de animais de companhia para disfunções mediadas pela TNFalfa comuns àquela espécie de animal.

Seleção do local alvo de ligação

Cada célula de linfócito produz anticorpos que são específicos não a um antígeno, mas a um epítopo. Enquanto um antígeno é parte de uma célula, partícula, proteína ou molécula estrangeira que está a ser reconhecida pelo sistema imune e a ser alvo por anticorpos e/ou células T citotóxicas, um epítopo é o local de ligação correspondente a um determinante antigénico numa proteína. Polipéptidos, lípidos, ácidos nucleicos e muitos outros materiais também podem funcionar como antígenos. As respostas imunes também podem ser geradas contra substâncias mais pequenas, chamadas "haptenos", se estes estão quimicamente unidos a uma "proteína transportadora" maior, tal como albumina do soro bovino ou hemocianina ou outras matrizes sintéticas. Os haptenos podem ser uma variedade de moléculas tais como fármacos, açúcares simples, aminoácidos, pequenos péptidos, fosfolípidos, ou triglicerídeos. Os antígenos que provocam fortes respostas imunes são ditos ser "fortemente 16 imunogénicos". Foi empiricamente determinado que um determinante antigénico, que provocará uma resposta imune clonal, pode ser tão pequeno quanto 1 a 8 aminoácidos ou 1 a 6 monossacarideos. Operacionalmente o epítopo reconhecido pela imunoglobulina derivada de um clone (um anticorpo monoclonal) pode abranger uma sequência maior e não contígua na superfície de uma proteína.

Quando um epítopo está dentro de uma região funcional de uma proteína, o efeito de ligação de anticorpos àquela proteína será o de neutralizar a função da proteína conferida por aquela característica estrutural da mesma. Este conceito provou ser a base dos anticorpos monoclonais terapêuticos. Logo, a capacidade de selecionar de forma reproduzível anticorpos ou outros ligantes a um epítopo específico ou domínio de proteína representaria um avanço na arte do desenvolvimento terapêutico de proteína. 0 mapeamento do epítopo do anticorpo é uma forma na qual os domínios funcionais podem ser identificados. 0 mapeamento do epítopo pode ser feito com resolução baixa ou alta dependendo do objetivo. 0 mapeamento de baixa resolução envolve expor um conjunto de anticorpos monoclonais a sequências na superfície de uma proteína nativa. A ênfase é dada na cobertura da superfície inteira do alvo e identificar que sequências são importantes para a função. Ao contrário dos candidatos mAb líder, os anticorpos utilizados no mapeamento do epítopo podem ser de baixa afinidade, deveriam incluir ambos mAbs neutralizantes e não neutralizantes, e, neste método, determinação do epítopo exato não é normalmente necessário. Uma vez que o epítopo tenha sido identificado a uma resolução desejada particular, testes de competição com o anticorpo que produz o efeito desejado, normalmente a neutralização da função, podem ser utilizados para identificar outros ligantes àquela região, por exemplo, anticorpos humanos capazes de competir com um anticorpo murino por uma proteína alvo 17 humana.

Conjuntos de anticorpos que se ligam à proteína alvo podem ser utilizados de outras maneiras para identificar epítopos. Por exemplo, o antígeno pode ser digerido com proteases e a ligação dos fragmentos resultantes ao anticorpo determinada num formato ELISA ou por espectroscopia de massa. 0 complexo antígeno-anticorpo pode ser digerido com proteases e os fragmentos proteolíticos identificados por espectroscopia de massa. Neste caso, mascarar os locais proteolíticos pelo anticorpo identifica o epítopo.

Existem outros métodos que têm sido utilizados para identificar o epítopo de um anticorpo. Podem ser sintetizados péptidos que correspondem a fragmentos sobreponíveis da sequência inteira de um antígeno e a ligação do anticorpo a estes péptidos pode ser determinada num formato ELISA ou utilizando espectroscopia de ressonância de plasma de superfície. Estudos NMR utilizando antígeno rotulado isotopicamente podem ser utilizados para identificar que aminoácidos têm alterações no seu ambiente magnético na ligação ao anticorpo. Outra técnica é a medição da temperatura de transição de fusão térmica. A estrutura cristal do complexo antígeno-anticorpo pode ser determinada e utilizada para identificar o epítopo. Destes métodos, a cristalografia é o mais definitivo seguido pelos estudos NMR.

Um formato ELISA utiliza etapas de lavagem para remover materiais não ligados antes da deteção. No caso onde o epítopo é linear (o anticorpo rconhece apenas uma única sequência linear de aminoácidos) a afinidade do anticorpo por um fragmento de péptido que contenha o epítopo pode ser suficientemente alta para detetar a ligação. Onde o epítopo é conformacional consistindo em duas ou mais sequências de aminoácidos não contíguas dentro da proteína, a afinidade de cada sequência individual pelo 18 anticorpo pode ser baixa e não detetada. Utilizando espectroscopia de ressonância de plasma de superfície, a ligação aos péptidos que define um epítopo conformacional pode não ser detetada uma vez que a afinidade por cada péptido do epítopo pode ser baixa. Se a fora da taxa do péptido é alta, a ligação pode não ser detetada.

Os epítopos também podem ser identificados em proteínas utilizando ressonância magnética nuclear (NMR). Pedidos co-pendentes de candidatos (Ser. U.S. N.° 10/393926) ensina uma técnica que identifica átomos específicos (geralmente H1, C13 e N15) , e assim resíduos de aminoácidos, com base no seu ambiente local. A designação completa da maioria ou de todas as ressonâncias pode ser feita para proteínas grandes dado o tempo suficiente e instrumentos de resolução suficientemente alta. Este método baseia-se na observação de que quando um anticorpo se liga a um antígeno, o ambiente local de alguns aminoácidos é alterado. Aqueles aminoácidos que podem estar sujeitos às maiores alterações são aqueles mais envolvidos com o contacto do anticorpo. É teoricamente possível identificar um epítopo fazendo todas as designações NMR para ambos antígeno e anticorpo em estados ligados e não ligados e determinando que aminoácidos têm átomos trocados. A complexidade dos espectros NMR de um complexo antígeno-anticorpo torna tal análise extremamente difícil e não aplicável à identificação rotineira do epítopo. Contudo, o método do candidato identifica epítopos da proteína utilizando proteínas enriquecidas com aminoácidos ou C13 ou NI5 nos quais a identificação precisa dos sinais NMR não é sempre requerida. A rotulagem múltipla de dois ou mais aminoácidos diferentes na mesma proteína pode ser utilizada onde as ressonâncias para os diferentes aminoácidos foram suficientemente distintas. Por exemplo, alfa-N15 alanina e epsílon-Nl5-lisina poderiam ser incorporados numa proteína como o poderiam ser epsílon-N15 histidina e alfa-N15 19 leucina. Os epítopos podem ou ser as regiões de ligação de anticorpos ou de ligandos. Além disso, a modelação molecular ou algoritmos que prevêm as sequências expostas à superfície nas proteínas podem assistir na identificação do epítopo.

Um epítopo também pode ser desenhado com base na sequência de aminoácido primária do alvo na ausência de medições físicas da estrutura alvo. Por exemplo, nas proteínas cerca de 5-10 resíduos de aminoácidos dentro cerca de 5-15 segmentos lineares da proteína podem ser alterados para criar uma variante chamariz ou proteína alvo quimérica e a ligação medida para determinar o epítopo. A homologia entre proteínas é baseada na semelhança em sequências base de genes ou sequências de aminoácido das proteínas que denota uma origem evolutiva comum. Em geral, haverá uma semelhança de estrutura ou função das proteínas que é devida a uma origem evolutiva comum. Este não é sempre o caso e a evolução e mutação divergentes podem conduzir a proteínas que têm semelhanças estruturais mas funções divergentes ou funções convergentes de estruturas dissimilares; ortólogos e parálogos, respetivamente. A mutagénese pesquisadora de homólogos é uma estratégia bem conhecida para a identificação de regiões de ligação a recetor de uma proteína por substituição de regiões análogas de proteínas homólogas de maneira a preservar a estrutura tridimensional nativa da proteína original; por exemplo, a substituição de regiões da hormona de crescimento humano com regiões da hormona de crescimento do porco, prolactina humana ou lactogénio placentário humana, seguido de determinação de constantes de ligação para as construções. Estas variantes estruturais naturais podem ser utilizadas para determinar domínios ou epítopos dentro dos domínios úteis na construção da proteína chamariz apropriada da invenção.

Construção do chamariz 20

Uma "proteína chamariz", como utilizado aqui, refere-se a uma proteína que difere numa ou mais características estruturais de uma proteína alvo no domínio específico abrangendo o local ou região funcional a ser ligada. Desta forma, o chamariz pode ser uma proteína alvo quimérica ou o chamariz pode ser uma proteína que ocorre naturalmente, tal como um homólogo de espécie, e o ligando alvo pode ser a sequência fabricada por engenharia genética que inclui o domínio de ligação pré-selecionado. No processo da invenção, o chamariz liga ligantes de baixa afinidade e não específicos e, aqueles ligantes complexados com o alvo que são retidos, são, assim, selecionados. Num aspeto, o homólogo estrutural adequado que pode servir como um andaime para aceitar o epítopo alvo pode ser um ortólogo da proteína alvo. Um homólogo estrutural também pode ser outro membro de uma família multigene.

Com a evolução e armazenamento de grandes quantidades de informação de estrutura tridimensional da cristalografia por raios-X, NMR, e outras técnicas, informação sobre a estrutura da proteína pode ser rapidamente obtida ou informação estrutural virtual pode ser gerada num número de maneiras. O Centro de Investigação Bioinformático da Universidade de Glasgow (Escócia) providencia acesso a um site na internet par descrever e comparar as estruturas das proteínas utilizando o software de Topologia da Estrutura da Proteína (TOPS) (TP Flores, DS Moss e JM Thornton. 1994. Protein Engineering, 7:31-37). As coordenadas da proteína -na forma de ficheiros tipo PDB, podem ser submetidas ao servidor. A estrutura é convertida numa representação animada simplificada, chamada uma representação TOPS, e depois comparada contra um subconjunto não redundante de todas as estruturas conhecidas. Os resultados são devolvidos como uma lista ordenada; mostrando o valor de compressão, o registo de identificação das estruturas, e o padrão comum utilizando um valor de 1 para um par de 21 estruturas idênticas e 0 para duas estruturas sem caracteristicas comuns. MASS (Alinhamento Múltiplo por Estruturas Secundárias) é baseado num alinhamento em dois níveis, utilizando ambas estrutura secundária e representação atómica. 0 raciocínio por trás desta abordagem é que as proteínas são inerentemente compostas de elementos de estrutura secundária (SSEs). Estes são as regiões dentro de uma proteína que providenciam o seu andaime estabilizador, no qual os locais funcionais são enxertados. Consequentemente, os SSEs são evolutivamente altamente conservados enquanto as mutações frequentemente ocorrem em loops flexíveis, que são mais difíceis de alinhar. MASS é um método altamente eficiente para o alinhamento estrutural de moléculas de proteína múltiplas e deteção de motivos estruturais comuns. Utilizar informação da estrutura secundária ajuda a filtrar soluções ruidosas e consegue eficiência e robustez. A vantagem do MASS é que é independente da ordem da sequência e, por isso, é capaz de detetar motivos estruturais não topológicos em alinhamentos ou subconjuntos múltiplos. Utilizando o MASS, é possível guiar a atracação proteína-proteína, o que é um problema notavelmente complicado. MASS está disponível gratuitamente em http: //bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MASS/. (Dror, 0. et al. Protein Science (2003), 12:2492-250.) A presente invenção emprega o método de combinar informação de estrutura com grandes bibliotecas de sistemas de expressão que codificam proteína-ácido nucleico para permitir a seleção de anticorpos a um epítopo único. A título de exemplo, um complexo e epítopo específico no homólogo murino de fator de tecido humano ("TF") foi tornado alvo. Os anticorpos existentes na arte ou não inibem a função do mTF ou não são inibidores competitivos específicos do Fator X que liga ao TF. Os anticorpos revelados têm estas funções e, por isso, representam 22 ferramentas previamente indisponíveis para avaliar o potencial terapêutico dos anticorpos anti-TF que neutralizam a atividade do TF inibindo a ativação de FX. Além disso, estes anticorpos são reagentes valiosos para dissecar o papel do TF em processos de desenvolvimento, neoplásticos, angiogénicos e inflamatórios trombóticos patogénicos e normais.

Isolamento de anticorpos dirigidos a epitopo ou outras ligações a ligandos

Três abordagens gerais ao isolamento de anticorpos dirigidos a epitopo ou outras ligações a ligandos de acordo com a invenção são: (1) seleção por competição utilizando bibliotecas de exibição de anticorpos ou outras ligações potenciais a ligandos; (2) seleção não competitiva utilizando bibliotecas de exibição seguido de classificação por atividade de ligação diferencial; e (3) imunização de animais seguido de classificação por atividade de ligação diferencial.

Na seleção por competição utilizando proteínas chamariz, a biblioteca de exibição é selecionada pela ligação à proteína alvo na presença da proteína chamariz que está em excesso molar sobre a proteína alvo. A seletividade de anticorpos recuperados ou ligação a ligandos é confirmada por classificação dos anticorpos isolados ou ligação a ligandos por ligação à proteína alvo e não ao chamariz.

Assim, num exemplo deste método, um método para identificar um polipéptido que se liga a um epitopo pré-selecionado de uma proteína alvo é providenciado, que compreende (a) providenciar uma biblioteca de partículas de fago que expressam polipéptidos na superfície das partículas de fago (b) preparar uma proteína chamariz que tem alterações nas sequências de aminoácido correspondentes ao epitopo pré-selecionado da proteína alvo (c) incubar a biblioteca de partículas de fago com a proteína alvo para 23 selecionar partículas de fago com polipéptidos que se ligam à proteína alvo (d) adicionar a proteína chamariz como um competidor em concentração molar em excesso para selecionar negativamente as partículas de fago específicas para o epítopo pré-selecionado (e) separar as partículas de fago que se ligam à proteína alvo daquelas que se ligam à proteína chamariz e (f) recuperar as partículas de fago ligadas à proteína alvo e não ao chamariz.

Menos preferido é o uso da proteína nativa como o "chamariz" para selecionar a ligação à proteína quimérica ou mutante. Neste caso, a proteína que contém a proteína andaime original é utilizada em excesso molar sobre a proteína quimérica ou mutante. A seletividade dos anticorpos recuperados ou ligação a ligandos é confirmada por classificação dos anticorpos isolados ou ligação a ligandos para ligação ao alvo chamariz e proteínas alvos e não à proteína andaime.

Numa seleção em duas etapas com uma proteína chamariz, a biblioteca de exibição é selecionada contra a proteína alvo. Os anticorpos recuperados ou outras ligações a ligandos são depois classificados (normalmente individualmente) para ligação seletiva à proteína alvo e não à proteína chamariz.

Para a abordagem de imunização utilizando a proteína chamariz, espécies animais adequadas para isolamento de hibridomas estáveis que produzem anticorpos monoclonais são imunizadas com a proteína alvo. Os hibridomas são gerados e classificados para a expressão de um anticorpo que se liga ao antígeno alvo mas não se liga à proteína chamariz. A abordagem de imunização pode ser combinada com qualquer uma das estratégias de exibição anteriormente descritas. Assim, ARNm de células imunes (por exemplo, baço ou linfócitos do sangue periférico) é utilizado para gerar uma biblioteca de anticorpo que é depois processada como descrito para qualquer das abordagens de exibição. Esta abordagem não 24 está limitada a animais adequados para isolamento de hibridomas estáveis.

As bibliotecas de péptidos podem ser desenhadas de acordo com métodos descritos em detalhe aqui, e métodos geralmente disponíveis àqueles na arte (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 5 723 286 emitida em 3 de Março de 1998 para Dower et ai.). Num aspeto, bibliotecas de exibição de fagos comercialmente disponíveis podem ser utilizadas (por exemplo, RAPIDLIB' ou GRABLIB', DGI BioTechnologies, Inc., Edison, NJ; Ph.D. C7C Disulfide Constrained Peptide Library, New England Biolabs).

As bibliotecas de anticorpo estão disponíveis de, por exemplo, Tecnologia de Anticorpo Cambridge, Morphosys, Instituto de Investigação Affymax, Paio Alto, CA. Um número de estratégias foi planeado para selecionar um subconjunto viável de ligantes para análises adicionais e maturação de afinidade. Estas incluem: epítopos imunodominantes bloqueadores por desseleção competitiva, resgate de uma gama mais ampla de especificidades de anticorpo utilizando uma estratégia de mascarar o epítopo, classificação por ascensão de captura, seleção guiada pelo anticorpo utilizando captura sandwich ELISA, seleção de anticorpo guia de proximidade (ProxiMol), isolamento de anticorpos monoclonais humanos utilizando seleção guiada com anticorpos monoclonais de ratinho, selecionar anticorpos para antígenos de superfície celular utilizando técnicas de classificação magnética, isolamento de scFvs que se ligam a antígenos de superfície celular associados com tumores humanos, isolamento subtrativo de anticorpos de cadeia simples utilizando fragmentos de tecido, seleção de anticorpos baseada em propriedades de ligação cinética do anticorpo, seleção de anticorpos funcionais com base da valência (Antibodyo Phage Display. Methods and Protocols. IN: David W. J. Coomber, Ed. Methods in Molecular Biology. Humana Press. Volume 178, Dezembro 2001 páginas 133-145). 25 0 enriquecimento da afinidade do fago é baseado em taxas de dissociação lentas dos ligantes alvo. Uma taxa de dissociação lenta é normalmente preditiva de alta afinidade. Netes exemplos de enriquecimento da afinidade, a incubação continuada do fago alvo e do fago ligante ao alvo é realizada na presença de uma quantidade saturante de um ligante alvo conhecido ou aumentando o volume da solução de incubação. Em cada caso, a re-ligação do fago ligante ao alvo dissociado é prevenida, e com o passar do tempo, os fagos ligantes ao alvo de maior afinidade são recuperados. 0 tempo de pré-incubação e as condições de pré-incubação são otimizados para cada ligante ao alvo de interesse. Para monitorizar o efeito das condições variáveis no enriquecimento da afinidade experiências de panning piloto são realizadas. Após a incubação do alvo e do fago ligante ao alvo e transformação das células hospedeiras, as células hospedeiras são colocadas em placas com meios seletivos e quantificadas. Determinar a alteração no número de colónias que sobrevivem providencia uma ferramenta de avaliação fácil para determinar o grau de enriquecimento de afinidade. À medida que o número de colónias sobreviventes diminui, o número de ligantes fracos sobreviventes é significantivamente diminuído, deixando poucos ligantes alvo com elevada afinidade. Por exemplo, a perda do número de colónias sobreviventes, até apenas 1%, 0,1%, ou 0,001% sobrevive, indica condições ótimas para enriquecer ligantes alvo que se ligam ao alvo tendo elevada afinidade. Em algumas circunstâncias, o número de colónias sobreviventes poderia ser limitado a cerca de 100 colónias para análise por sequenciação.

Dependendo da diversidade do tipo de biblioteca de ligante alvo utilizada, o número de ligantes alvo com uma elevada afinidade pode ser inferior a 10. O uso das técnicas de enriquecimento de afinidade referidas anteriormente permite o enriquecimento sem 26 necessariaente realizar rondas adicionais de panning. As técnicas de enriquecimento de afinidade podem ser utilizadas sozinhas ou em combinação. Também é para ser entendido que a presente invenção também poderia utilizar múltiplas rondas de panning para providenciar enriquecimento de afinidade se desejado.

Citações: Todas as publicações ou patentes citadas aqui mostram o estado da arte: Ausubel, et al., editor, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Filhos, Inc., NY, NY (1987-2004); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow e Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., editores, Current Protocols in Immunology, John Wiley e Filhos, Inc., NY (1994-2004); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley e Filhos, NY, NY, (1997-2004) .

Apesar de terem descrito a invenção em termos gerais, as modalidades da invenção serão reveladas adicionalmente nos exemplos seguintes. EXEMPLO 1:

DESENHO E PRODUÇÃO DA PROTEÍNA QUIMÉRICA HUMANA/FATOR DE TECIDO MURINO O MAb designado TF8-5G9 reconhece e liga-se ao Fator de tecido humano e previne a associação do Fator X com TF ou o complexo TF/Fator Vila (Ruf, W. e Edgington, T.S. 1991. Thromb. Haemost. 66:529-539). Baseado na análise da estrutura cristal do TF8-5G9 Fab complexado com TF humano, todos os resíduos que formam o epítopo reconhecido pelo Fab caem entre os resíduos 149 e 204 do TF humano. Esta região da proteína também é conhecida por desempenhar um papel importante na interação do TF com domínio Gla FX (Ruf et al. 1992) . Quinze resíduos específicos entre 149 e 204 de huTF estão localizados apropriadamente para fazer contribuições energéticas significativas à ligação (Huang, 27 et al. J. Mol. Biol. 275, 873-894). Como ilustrado no alinhamento da sequência em baixo, quando as sequências do domínio extracelular do TF humano (Acesso GenPept N.° NP_001984) e murino (Acesso GenPept N.° NP_034301) estão alinhadas entre os resíduos 149 e 204 do domínio EC humano e os 152-207 do domínio EC murino, sete dos quinze resíduos significativos são idênticos (resíduos humanos K149, K165, K166, T167, T170, N171, Q190) enquanto oito dos quinze resíduos são diferentes (resíduo humano substituído por: Y156T, Kl6 91, V192M, P194F, V198T, R200Q, K201N e D204G) .

Os resíduos a negrito representam os resíduos que contribuem significativamente para a estabilização do complexo TF8-5G9:huTF. Estes resíduos têm uma energia livre delta de ligação de 1-4 kcal/mol ou superior.

Humano 149KDLIYTLYYWKS SS SGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIP SRTVNRKS TD2 04 Ratinho i52KDLGYIITYRKGSSTGKKTNITNTNERSIDVEEGVSYCFFVQAMIFSRKTNQNSPG2 07

De acordo com esta análise, uma proteína quimérica proteína chamariz poderia ser construída a partir do Fator de tecido murino que codifica a sequência fazendo mutações dos resíduos de contacto TF8-5G9 únicos no mTF para corresponder ao resíduo encontrado em huTF na posição de acordo com o alinhamento. Apesar de haver outras posições onde existem diferenças de resíduo de aminoácido entre fator de tecido murino e humano, assumiu-se que estas não contribuem para a função ou estrutura global da proteína em termos do epítopo alvo. Utilizando o gene mTF como um molde, foi construída uma proteína quimérica tendo mutações dos oito resíduos de contacto TF8-5G9 únicos no mTF ao resíduo correspondente encontrado em huTF (SEQ. ID N.° 1) . A região de panning das membranas foi deletada de maneira que apenas do domínio extracelular solúvel do TF fosse expresso e uma His rotulada no terminal carboxi foi 28 adicionada para simplificar a purificação. 0 TF murino solúvel e a proteína quimérica foram expressos e purificados a partir de células HEK 293E. A proteína purificada foi analisada por SDS-PAGE para mostrar o peso molecular esperado para Hu/m TF (40 kDa) e para mTF (35 Kda) . A panning baseada na solução com a biblioteca de exibição de fagos HuCAL (Morphosys, Martinsreid, Alemanha) foi conseguida utilizando proteína mTF biotinilada. A proteína hu/mTF quimérica foi adicionada como um chamariz num excesso molar de dez vezes para desselecionar os fagos específicos para todos os epítopos exceto para o epítopo alvo no mTF. Os fagos ligados ao mTF biotinilado foram recuperados por captura em contas magnéticas revestidas com estreptavidina. Todos os ligantes foram sequenciados para produzir vinte e três Fabs únicos a partir desta panning: na concentração testada, 9 reconheceram apenas mTF, 3 reconheceram preferencialmente mTF sobre hu/mTF, e 11 reconheceram as duas proteínas de forma semelhante (Quadro 1) ·

Uma panning no mTF sem a proteína quimérica competidora foi realizada para verificar que os Fabs selecionados eram o resultado da seleção dirigida ao epítopo e não a ponto quente no mTF. As condições de panning foram idênticas entre as duas experiências exceto pela omissão do antígeno que compete no processo de seleção. Todos os ligantes foram sequenciados para produzir sete Fabs únicos. Apenas um dos Fabs isolados na panning sem competidor ligou-se especificamente a mTF sugerindo que a adição do antígeno competidor permitiu a seleção de Fabs que especificamente reconhecem o mTF e não a proteína hu/mTF com alterações no epítopo TF8-5G9 (Quadro 1). 29 QUADRO 1.

Experiência de panning Ligação de Clones Fab mTF » h/m TF mTF > hu/mTF mTF = h/mTF Competição (m/hTG = 10X mTF) 9/23 3/23 11/23 mTF apenas 1/7 2/7 4/7

Fabs específicos do TF anti-murino humanos foram purificados por cromatografia por afinidade e avaliados pela ligação a mTF ou hu/mTF por ELISA. As sequências das CDR para estes Fabs estão listadas na Figura 2; os alinhamentos de estrutura foram feitos por comparação com o manual HuCAL da Morphosys. As sequências estrutura estão listadas na secção inferior da Figura 2. Todos os nove Fabs específicos do mTF demonstraram ligação a mTF dependente da dose com mínima reatividade cruzada ao hu/mTF (Figura 3). No formato Fab, PHD127 apresentou a afinidade mais alta de ligação por mTF neste formato enquanto PHD103 apresentou a afinidade mais baixa. Cinco Fabs (PHD 103, 104, 126, 127, e 130) foram selecionados para conversão em imunoglobulinas de comprimento inteiro com base na sua afinidade por mTF. As regiões variáveis para os cinco Fabs (PHD 103, 104, 126, 127, e 130) estão mostradas na Figura 2 e SEQ. ID N.°s 2-11 foram clonadas em vetores para expressão das moléculas mlgG2a em células HEK 293.

Inibição da coagulação

Os Fabs substitutos anti-mTF selecionados foram avaliados pela sua capacidade de inibição da coagulação no plasma humano uilizando extratos de cérebro murino como uma fonte de mTF. Com base em experiências prévias, Fabs que se ligam ao epítopo TF8-5G9 em mTF espera-se que interrompam a via de coagulação e atrasem a formação do coágulo. Nese ensaio, a inibição da formação do coágulo de fibrina foi medida no plasma humano. Quatro dos oito Fabs testados atrasaram ou inibiram a coagulação no plasma humano in 30 vitro: PHD 103, PHD 104, PHD 126 e PHD 127. PHD126 e PHD 127 foram significativamente mais potentes em inibir a coagulação no plasma humano. Com base no ajuste da curva ao tempo de coagulação versus concentração de Fab os valores de E50 mensuráveis oscilaram entre 0,2 pg/ml a 63 pg/ml. QUADRO 2.

Fab Cone. EC50 (ug/ml) PHD102 >200 PHD103 63,3 PHD104 23, 8 PHD109 >200 PHD126 0,23 PHD127 0,82 PHD128 > 200 PHD129 > 200

Inibição do Fator X A inibição do Fator X por agueles Fabs anti-mTF que inibiram a coagulação (PHD 103, 104, 126, 127) foi medida

na presença de extratos de cérebro murino (como a fonte de fator de tecido). Os extratos foram incubados com FVIIa, e Mabs substitutos anti-mTF foram adicionados na presença de FX e a inibição da conversão do FX em FXa foi medida. Os Fabs PHD 103, 126 e 127 inibiram a ativação do Fator X (clivagem) para o Fator Xa. A inibição da ativação do Fator X foi subsequentemente re-avaliada utilizando as IgGs de comprimento inteiro anti-mTF. Uma boa inibição foi observada para PHD 103, 126 e 127, enquanto não foi observada qualquer inibição com PHD 104.

Análise de FACS

Como os anticorpos candidatos ativos atrativos, PHD126 e PHD127 foram avaliados pela sua capacidade de se ligarem a células de melanoma B6F10 que expressam o mTF em níveis elevados. PHD126 e PHD127 ligam o mTF associado à célula numa maneira dependente da dose com um EC50 de 37,8 nM ou 31 4,35 nM, respetivamente (Figura 4). As sequências da região variável completas para as cadeias pesada e leve de PHD 126 e 127 como mostrado pelos componentes de subdominio individuais na Figura 2 estão incluidas como SEQ. ID N.°s 6-9 como indicado.

Sumário

As experiências descritas aqui demonstram que a seleção dirigida pelo epítopo de anticorpos exibidos por fagos utilizando uma proteína competidora desenhada por engenharia genética é um processo viável. 0 método baseia-se na informação estrutural acerca da proteína alvo para permitir o desenho de um competidor apropriado. Além disso, este método permite a seleção de anticorpos reativos a epítopos específicos numa proteína de interesse. Métodos existentes de seleção de anticorpo utilizando bibliotecas de anticorpo exibido por fagos não podem ser dirigidos precisamente para o epítopo de interesse. 0 método revelado tem a vantagem de permitir uma direção muito precisa e eficaz da seleção para os anticorpos específicos do epítopo alvo. Empregámos este método para permitir a seleção de anticorpos para um único epítopo em mTF. 0 TF é uma molécula complexa que funciona tanto como um recetor como um ligando, sendo capaz de formar um complexo único com FVIIa e FX. Assim, Mabs que previnem esta interação têm que ser dirigidos para uma única região da molécula. Anticorpos existentes na arte ou não inibem a função do mTF ou não são inibidores competitivos específicos da ligação do Fator X ao TF. Os anticorpos revelados têm estas funções e, portanto, representam ferramentas previamente indiponíveis para avaliar o potencial terapêutico para anticorpos anti-TF que neutralizam a atividade do TF inibindo a ativação do FX. Além disso, estes anticorpos são reagentes valiosos para dissecar o papel do TF em processos de desenvolvimento, neoplásticos, angiogénicos e inflamatórios trombóticos 32 patogénicos e normais.

EXEMPLO 2: CONTRUÇÃO DE UMA PROTEÍNA CHAMARIZ QUIMÉRICA PARA SELEÇÃO DE LIGANTES A UM DOMÍNIO COMUM CAPAZ DE ATIVAR DIFERENTES SUBUNIDADES DE RECETOR A Interleucina-13 (IL-13) é uma citocina que é encontrada em níveis elevados nas vias aéreas de pacientes com asma. A IL-13 é produzida por células T CD4+ ativadas e desempenha um papel importante na proliferação de células B e produção de IgE, hiperplasia das células caliciformes e hipersecreção de muco, inflamação eosinofílica, e hiper-responsividade das vias aéreas observadas nos pacientes com asma. Mostrou-se que a sobreexpressão da IL-13 em ratinhos transgénicos confere um fenotipo tipo asma enquanto a neutralização da IL-13 utilizando antagonistas tem mostrado atenuar a resposta asmática. A IL-13 liga-se, pelo menos, a dois recetores, um que pode ser encontrado na maioria dos tipos celulares exceto nas células T, e o outro que pode funcionar como um recetor chamariz. 0 recetor que foi implicado nas respostas pró-inflamatórias é partilhado com o recetor para a IL4 e é composto de duas subunidades, IL4Ralfal e IL13Rbetal. A IL-13 é um membro da família de citocinas de cadeia curta que inclui a IL-4, IL-2, IL-3, e GM-CSF. Estas proteínas adotam uma topologia em pacote de quatro hélices e incluem duas ou três ligações dissulfido. Uma estrutura solução para IL-13 foi determinada verficando a sua semelhança com outras proteínas nesta família (Eisenmesser, E. Z., et al. J. Mol. Biol. (2001) 310:231-241; Moy, F.J., et al., J. Mol. Biol. (2001) 310:219-230). Apesar da IL-13 partilhar apenas 25% de identidade de sequência com a IL-4, as estruturas globais são bastante semelhantes e é esperado que a interação da IL-13 com o seu recetor seja semelhante à recentemente determinada para a IL-4 e o seu recetor. De facto, dado que as duas citocinas partilham uma subunidade nos seus recetores, é provável que a IL-13 e a IL-4 33 partilhem semelhanças estruturais nas suas interações com a IL4Rcxl. A estrutura tridimensional para IL-13 juntamente com estudos mutacionais indicam que existem duas faces da citocina que desempenham um papel importante na interação com o seu recetor. 0 modelo sugere que a face da proteína compreendida pelas hélices A e C interage com a subunidade IL4Ralfal do recetor e a interface hélice A até à hélice D interage com a subunidade IL13Ralfal.

Com base na estrutura da IL-13 e modelo de interação com recetor, espera-se que um anticorpo que bloqueia a interação das hélices A e D com IL13Ralfal ou que bloqueia as interações entre a face A-C e IL4Ralfal pode ser um excelente candidato para uma terapêutica anti-IL13. Num esforço para dirigir a seleção do anticorpo em direção às partes interativas do recetor da IL-13, proposemos preparar moléculas de citocina quiméricas. Nestas proteínas quiméricas, o loop que liga as hélices C e D será substituído com a sequência correspondente da espécie a ser utilizada para imunização. Nos modelos, o loop C-D é a porção exposta mais à superfície da molécula e não interage com o recetor da IL-13. Além disso, este loop é bastante flexível nas estruturas em solução e é, portanto, provável que tolere mutações sem interromper a topologia global da molécula. Na proteína quimérica resultante, uma porção da molécula parecerá muito como ele próprio para o hospedeiro e é, portanto, menos provável que induza uma resposta imune significativa. Contudo, a parte da molécula que retém a sequência inteiramente humana parecerá estrangeira para a espécie hospedeira e é provável que gere uma resposta imune. Espera-se que os anticorpos selecionados a partir dos imunogenes quiméricos exibam atividade neutralizadora em ensaios baseados em recetor humano.

Existe uma necessidade de antagonistas potentes da IL-13 para avaliar o benefício da sua inibição na doença humana, particularmente para asma, e assim como agentes 34 terapêuticos. As novas variantes da IL-13 descritas aqui são úteis como imunogenes para aumentar a geração de anticorpos antagonistas, como agentes de seleção ou classificação para identificar anticorpos neutralizantes, ou como antagonistas diretos da IL-13 nativa. Além disso, o desenvolvimento de agonistas da IL-13 potentes e novos pode ser útil para atacar certos cancros que sobre-expressam um recetor da IL-13 na superfície celular (Hussain, S.R. e Puri, R.K., Blood (2000) 95:3506-351).

Foram construídos novos análogos da IL-13. Estes compostos podem ser considerados como quimeras da IL-13 humana e a IL-13 de outras espécies uma vez que utilizam sequências parciais de múltiplas espécies. Estes mutantes foram desenhados racionalmente incorporando aminoácidos de regiões sequencialmente distintas de uma espécie na sequência IL-13 da IL-13 humana.

Com base na homologia estrutural entre as duas citocinas foi proposto um modelo para o complexo IL-13:IL-13R1. Utilizando o modelo NMR para a IL-13 (ficheiro de coordenadas: 1 GA3) e a sequência da IL-13, foram construídos análogos da IL-13 que se propõe terem utilidade como agonistas da IL-13 humana, antagonistas da IL-13 humana ou como um imunogene ou elemento de biopanning para a geração de anticorpos da IL-13 anti-humana. O ficheiro 1GA3 disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ contém uma camada de estruturas NMR para a IL-13. A observação das estruturas indicou que, enquanto as 4 hélices estão altamente conservadas, os terminais N- e C- e o loop entre as hélices C e D são altamente flexíveis, como evidenciado por numerosas conformações. A primeira estrutura no ficheiro foi utilizada para análise de mutantes da IL-13 desenhados que reteriam ambas estrutura e atividade.

Existe um grande loop entre as hélices C e D que está adjacente à hélice B maioritariamente enterrada. Este loop 35 é um lugar onde as mutações podem ser aceites uma vez que é distante das hélices A, C e D. 0 loop B é definido pelos aminoácidos Met43 a Asn53 e o loop CD é definido pelos aminoácidos Cys71 a Thr88. 0 fim do loop é difícil de estabelecer mas definitivamente termina pelo inicio da hélice D com Glu91. Na maioria das estruturas os aminoácidos envolvidos na interação entre a hélice B e o loop CD são: Hélice B: Cys45, Leu48, Glu49, Leu51, possivelmente Asn53, e Vai54

Loop CD: Cys71, Vai75, Lys74 (possível), Vai85, Arg86 (possível) Ile90

Além disso, não existem ligações de hidrogénio nesta região; Pro72 não está envolvido mas é essencial para a volta, e existe uma interação significativa entre Trp35 e resíduos do loop entre Arg86 e Lys89.

Os resíduos na hélice B que interagem com o loop C/D são Leu48, Leu51 e Vai54.

Ala47 enche um bolso e pode ser capaz de ser substituída. Não existem ligações de hidrogénio entre o loop CD e a hélice B.

Os resíduos na hélice B que interagem com o loop A/B são Met43, Ala47 e Ser50.

Uma pesquisa no Blast do NCBI foi feita para identificar outras espécies IL-13 com os seguintes resultados (http://www.nc- bi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein): 36

Human IL-13

GPVPP STALRELIEELVNITQNQKAPLCNG SMVWS XULTAGMY CAALES LIHVSGC S A IEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN

Sus Scrofa

GPVPPHSTALKELIEELVMITQNQKTPLCNGSMVWSVKLTTSMQYCAALESLINX SDC SAIQKTQRMLSALCSHKPPSEQVPGKHIRDTKIEVAQFVKDLLKHLRMIFRHG

Bos Taurus

pvpsatalkelxeelvnxtqwqkvplcwgsmvwslwlts smycaaldsli SISNCSVI

QRTKKMLNALCPHKPSAKQVSSEYVRDTKIEVAQFLKDLIjRHSRIVFFNERFN

Canis

PVTPSPTLKELlEELWITQNQASLCNGSMVWSVNLTAGHYCAALESLiaVSDCSAIQ RTQRMLKALCSQKPAAGQIS SERSRDTKIEVIQLVKNLLTYVRGVYRHGNF

Rat

G PVRRSTSPPVALRELIEELSNXTQDQKTSLCNSSMVWSVDLTAGGFCAALESLTNIS SCNAIHRTQRXLNGLCNQKASDVASSPPDTKIEVAQFISKÍ.LNYSKQLFRYG

Mouse

GPVPRSVSLPLTIjKELIEELSNITQDQTPLCNGSMVWSVDIjAAGGFCVALDSLTNISN CNAX YRTQRILHGLCNRKAPTTV SSL PDTKIEVAHFITKLL S YTKQLFRHGP F TRADUÇÃO DAS SEQUÊNCIAS:

Human IL-13: IL-13 humana

Sus scrofa = nome científico do javali

Bos taurus = nome científico do boi

Canis = género do cão

Rat = ratazana

Mouse = ratinho

As sequências da IL-13 humana, bovina, do porco, do cão, da ratazana e do ratinho foram alinhadas como mostrado (Figura 5) utilizando o algoritmo ClustalW dentro do Vector NTi Suite (InforMax, Inc., Bethesda, MD).

As sequências da hélice B são dadas em baixo com os 37 aminoácidos não idênticos a humanos sublinhados. Os resíduos nos quais a interação entre a hélice B e o loop CD estão previstos de interagir são indicados por um asterisco no QUADRO 3. QUADRO 3.

Humano M YCAALESLINV Bovino M YCAALDSLISI Porco MQYCAALESLINI Cão M YCAALESLINV Ratazana GFCAALESLTNI Ratinho GFCVALDSLTNI Interagindo *****

Estes alinhamentos sugerem vários locais nos quais os aminoácidos podem ser substituídos na hélice B e loop C/D da IL-13 humana de outra espécie, com retenção da integridade estrutural e atividade de ligação do recetor. Utilizando os resíduos da hélice B e do loop CD previstos de interagir foi planeada uma estratégia de preparação de proteínas quiméricas onde os resíduos do loop CD da proteína humana foram substituídos com os resíduos análogos de uma espécie diferente. Para manter a estabilidade da proteína também foi necessário substituir os resíduos que interagiram correspondentes da hélice B da mesma espécie. NO caso da IL-13 do bovino, porco, ou ratinho a modalidade preferida necessita alterar apenas um aminoácido, Vai54 para Ile54 uma vez que todos os outros resíduos que interagem são idênticos àqueles encontrados para a proteína humana.

Modalidades adicionais do desenho incluem duas substituições na hélice B de uma proteína de ratinho: Glu49 => Asp49 e Ala46=>Val46. Tyr44 também poderia ser substituído por Phe e Leu51 poderia ser substituído por Vai. Contudo, esta última substituição é próxima da hélice C e poderia perturbar a sua estrutura. As sequências no loop C/D são 38 para as seis proteínas são mostradas no Quadro 4 onde as posições do resíduo previstas de interagir com o loop B estão indicadas na última fila por um asterisco. QUADRO 4.

Humano CPHKVSAGQFSSLHVRDTKI Bovino CPHKPSAKQVSSEYVRDTKI Porco CSHKPPSEQVPGKHIRDTKI Cão CSQKPAAGQISSERSRDTKI Ratazana CNQKASDVASS PPDTKI Ratinho CNRKAPTTVSS LPDTKI Interagindo * * * * * * * *

No loop C/D há numerosas alterações preferidas que poderiam ser feitas com base na homologia. Muitas destas substituições são improváveis de afetar a conformação global do loop, contudo, a substituição de Arg86 para Pro na proteínas da IL-13 da ratazana e ratinho indicariam uma diferença significativa na estrutura do loop C/D, como o indicaria a deleção de três aminoácidos das proteínas de ratinho e ratazana. Do mesmo modo, a mutação de Vai75 para Pro em bovino, porco e cão sugere rearranjos conformacionais significativos. Modalidades adicionais do desenho nesta região incluem as mutações Ala46=>Val e Glu49=> Asp observadas na hélice B da proteína de ratinho juntamente com Val85=> Leu no loop C/D. Os aminoácidos na hélice B e no loop C/D de várias espécies foram substituídos pelos aminoácidos correspondentes na sequência humana e cinco modelos construídos para cada um utilizando Insightll com elevada otimização contudo outros programas de modelação poderiam ser substituídos.

Modelo do cão: Todos os cinco modelos construídos são de energia semelhante. A examinação dos modelos mostra que são todos bastante semelhantes, não apenas no loop CD mas também no resto da estrutura. Assim, a substituição dos resíduos da IL-13 canina para humana na hélice B e no loop 39 CD espera-se que proporcionem uma proteína quimérica adequada.

Modelo bovino: todos os 5 modelos são de energia semelhante. Existem diferenças consideráveis na posição das cadeias laterais na 81-85 de todos os três modelos mas a variação não é mais significativa do que a observada para os 20 modelos NMR. A adição da prolina extra no loop CD não altera a conformação significativamente. Assim, prevê-se que estas substituições produzam uma quimera aceitável.

Modelo do porco: todos os cinco modelos são de energia semelhante. Tal como com o modelo bovino, existem diferenças nas posições da cadeia lateral de vários aminoácidos no loop não diferenças significativas de estrutura. A adição do aminoácido no início da hélice B é bem acomodada. Assim, prevê-se que esta variante seja uma quimera aceitável.

Modelo do ratinho; Com a deleção de três aminoácidos no loop, todos os cinco modelos têm conformações significativamente diferentes no loop do modelo humano. Todos são de baixa energia; de uma comparação de energia absoluta, estes modelos são os mais baixos de todas as quimeras. A topologia global das quatro hélices é largamente inalterada contudo, e esta variante espera-se que seja uma quimera adequada.

Todas estas quimeras têm conformações razoáveis e deveriam ter estruturas muito semelhantes nas hélices A, C e D. As sequências das quimeras recomendadas são:

Humana (nativa)

GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMYCAALESL

Humana-Bovina (SEQ. ID N.° 12)

GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMYCAALESL

Humana-Porco (SEQ. ID N.° 13) GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMQYCAALESL Human-Cão (SEQ. ID N.° 14)

GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMYCAALESL 40

Humana-Ratinho (SEQ. ID N.° 15) GPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMYCAALESL Humana (nativa) INVSGCSAIE KTQRMLSGFC PHKVSAGQFS SLHVRDTKIE VAQFVKDLLL Humana-Bovina INISGCSAIE KTQRMLSGFC PHKPSAKQVS SEYVRDTKIE VAQFVKDLLL Humana-Porco INISGCSAIE KTQRMLSGFC SHKPPSEQVP GKHIRDTKIE VAQFVKDLLL Humana-Cão INVSGCSAIE KTQRMLSGFC SQKPAAGQIS SERSRDTKIE VAQFVKDLLL Humana-Ratinho

INISGCSAIE KTQRMLSGFC NRKAPTTV S_SLP_DTKIE

VAQFVKDLLLHuman HLKKLFREGR FN

Humana-Bovina HLKKLFREGR FN Humana-Porco HLKKLFREGR FN Humana-Cão HLKKLFREGR FN Humana-Ratinho HLKKLFREGR FN

As proteínas chamariz quiméricas são providenciadas na listagem de sequências como SEQ. ID N.° 12 (humana-bovina), SEQ. ID N.° 13 (humana-porco), SEQ. ID N.° 14 (humana-cão), SEQ. ID N.° 15 (humana-ratinho). Um uso das proteínas quiméricas é para seleção de anticorpos funcionalmente neutralizantes para a IL-13 humana.

Os anticorpos podem ser recuperados por técnicas de seleção/classificação de biblioteca de anticorpo tais como exibição de fagos de anticorpo. Num outro aspeto, estas proteínas quiméricas da IL-13 são úteis na seleção e/ou classificação de anticorpos neutralizantes. Numa aplicação, os hibridomas recuperados dos animais imunizados com IL-13 ou uma ou mais destas quimeras podem ser classificados para a ligação a uma ou mais das quimeras não utilizadas para imunização, evitando assim anticorpos que reconhecem o loop C/D. Numa segunda aplicação, estas proteínas quiméricas podem ser utilizadas em diferentes combinações para a 41 seleção e classificação de bibliotecas de anticorpo combinatórias, particularmente bibliotecas de exibição de fagos. Com base na consideração do desenho descrito aqui, a seleção ou classificação suprimirá a identificação de anticorpos que reconhecem o loop C/D. Assim, ambas aplicações espera-se que favoreçam o isolamento de anticorpos neutralizantes, particularmente aqueles que reconhecem as hélices A, C e D que estão totalmente conservados nas variantes das espécies e nas proteínas quiméricas construídas.

Uma segunda utilização destes mutantes é como antagonistas da IL-13 humana. A IL-13 é conhecida por se ligar a duas subunidades de recetor. As alterações subtis na estrutura da IL-13 humana introduzidas pelos aminoácidos não humanos nas duas regiões da molécula podem ter um efeito alostérico na ligação a qualquer uma das subunidades do recetor. Pela anulação seletiva da ligação da subunidade do recetor, é criado um antagonista competitivo.

EXEMPLO 3: CÁLCULOS PARA O FABRICO DE PROTEÍNAS CHAMARIZ POR ENGENHARIA GENÉTICA UTILIZANDO DADOS NMR

Esta invenção descreve uma nova técnica para a identificação de epítopos em proteínas utilizando ressonância magnética nuclear (NMR). A NMR é uma técnica que identifica átomos específicos (geralmente Η 1, C13 e N15) , e portanto resíduos de aminoácido, com base no seu ambiente local. Os espectros do carbono e nitrogénio da NMR são menos complexos do que os espectros de protão mas a abundância natural dos núcleos requerida pode limitar a sensibilidade. Com proteínas grandes, pode haver uma quantidade considerável de sobreposição nos espectros entre átomos em ambientes semelhantes. A designação completa da maioria ou todas as ressonâncias pode ser feita para proteínas grandes dado o tempo suficiente e instrumentos de resolução suficientemente alta.

Quando um anticorpo se liga a um antígeno, o ambiente 42 local de alguns aminoácidos é alterado. Aqueles aminoácidos que podem ser sujeitos às maiores alterações são aqueles envolvidos com contacto do anticorpo. A estratégia é identificar um epitopo designando todas as NMR para ambos e antigeno e anticorpo em estados ligados e não ligados e determinar que aminoácidos têm átomos modificados. A complexidade dos espectros da NMR de um complexo antígeno-anticorpo torna tal análise extremamente difícil, se não impossível, com os instrumentos e métodos atuais e não é aplicável à identificação rotineira do epitopo.

Os epítopos da proteína podem ser identificados utilizando proteínas enriquecidas ou com aminoácidos C13 ou com N15 nos quais a identificação precisa dos sinais da NMR não é sempre requerida. Estes epítopos poderiam ser tanto regiões de ligação de anticorpos como de recetores.

Utilizando a tecnologia recombinante, a proteína é expressa em meios nos quais um único aminoácido foi substituído com o seu correspnodente N15 ou C13 rotulado. A proteína gerada tem a estrutura e atividade idênticas que o seu correspodente não rotulado. Um espectro N15 ou C13 da NMR é depois corrido na proteína, tanto na presença e ausência de um anticorpo de ligação. A abundância natural baixa dos núcleos ressonantes dos aminoácidos não rotulados simplificará os espectros de tal maneira que espectros desacoplados exibirão singletos para espectros N15 e singlets ou padrões simples para C13 dependendo de se o aminoácido foi uniformemente ou especificamente rotulado. Naquelas ocasiões onde o aminoácido rotulado está envolvido na ligação com o anticorpo, será observada uma alteração na ressonância. Como um exemplo, se uma proteína com 200 aminoácidos contiver 10 N15 alaninas rotuladas, seriam vistos 10 singlets nos espectros N15. Se, quando ligado ao anticorpo, duas delas fossem mudadas, seria porque o seu ambiente local tinha sido alterado. A partir daqui, a sua localização no epitopo poderia ser inferida. A localização 43 específica das duas alaninas na sequência não seria conhecida deste único espectro. Quando o processo tivesse sido repetido 20 vezes com um aminoácido rotulado diferente de cada vez, a composição do epítopo seria conhecida. Uma vez que proteína está a ser produzida de forma recombinante, a sequência é conhecida. Da composição do epítopo e sequência da proteína, a localização do epítopo pode ser determinada. A modelação molecular ou algoritmos que prevêm as sequências expostas à superfície nas proteínas podem assistir na identificação do epítopo. Não tem que ser necessário preparar 20 proteínas rotuladas. A rotulagem múltipla (2 ou mais aminoácidos rotulados diferentes na mesma proteína) poderia ser utilizada onde as ressonâncias para os diferentes aminoácidos foram suficientemente distintas. Por exemplo, a-N15 alanina e e-N15-lisina poderiam ser incorporadas numa proteína tal como o poderia 3-N15 histidina e a-N15 leucina.

Esta técnica oferece várias vantagens sobre os procedimentos atuais para a identificação de epítopo. Aqueles métodos que utilizam péptidos sintéticos (pin, spot ou solução e ELISA ou competição) ou fagos podem falhar epítopos conformacionais. Este procedimento NMR, uma vez que utiliza a proteína intacta, detetará epítopos conformacionais tão prontamente quanto epítopos lineares. As variações da síntese spot (por exemplo matriz de péptidos) são reivindicadas serem melhores a identificar epítopos conformacionais mas o número de péptidos necessário aumenta exponencialmente com o número de aminoácidos na proteína até ao ponto em que aproximadamente 2 milhões de péptidos seriam necessários para uma proteína de peso molecular 40kD. A proteólise, em combinação com espectrometria de massa, pode identificar alguns epítopos conformacionais mas a técnica é destrutiva para a proteína e são necessárias quantidades crescentemente maiores da 44 proteína para espectrometria de massa à medida que o peso molecular aumenta. 0 procedimento NMR é não destrutivo. Se a proteína rotulada é de fornecimento baixo, pode ser recuperada após cada experiência e reutilizada para mapear outro anticorpo. As mutações pontuais ou "scans de alanina" da proteína podem funcionar bem para a identificação tanto de epitopos lineares como conformacionais mas as dificuldades são que cada proteína necessite do seu próprio ADN para expressão, todas as mutações pontuais não são secretadas e tem que ser determinado para cada mutação que a proteína está devidamente dobrada. 0 procedimento NMR utiliza o mesmo ADN para todas as proteínas rotuladas e as proteínas rotuladas secretam e dobram de forma idêntica que a proteína não rotulada. A cristalografia é o "padrão de ouro" para a identificação de epítopo. Os seus inconvenientes são a grande quantidade de tempo envolvido, a quantidade da proteína que pode ser necessária, a dificuldade de crescer um cristal de grau de difração e o facto de que cada anticorpo para o mesmo antígeno requer uma proteína nova e um cristal novo. EXEMPLO 4:

FABRICO POR ENGENHRAIA GENÉTICA DE UMA PROTEÍNA QUIMÉRICA CHAMARIZ UTILIZANDO ESTRUTURA CRISTAL

Com base na estrutura cristal da IL-4 e um análogo próximo, a IL-13, um domínio de ligação de recetor particular foi escolhido como um alvo de anticorpo. Uma proteína quimérica foi desenhada por engenharia genética para seleção de ligantes a esta região de ambas proteínas. A estrutura cristal da IL-4 foi resolvida. A estrutura cristal da IL-13 não foi determinada mas foi construído um modelo molecular teórico. Ambas IL-4 e IL-13 são proteínas terapeuticamente importantes com base nas suas funções biológicas. Demonstrou-se que a IL-4 é capaz de inibir doenças autoimunes, e ambas IL-4 e IL-13 mostraram potenciais para aumentar respostas imunes anti-tumorais. 45

Por outro lado, uma vez que ambas citocinas estão envolvidas na patogénese de doenças alérgicas, o antagonismo destas citocinas providenciaria benefícios terapêuticos à asma alérgica e alergia.

Algumas proteínas mutantes (por exemplo o antagonista da IL-4 Y124D e o agonista da IL-13 R112D, J. Biol. Chem (2000), 275, 14375-14380) foram descritas na literatura. Utilizando a modelação molecular, foram desenhados os seguintes mutantes agonísticos novos da IL-4 e IL-13. Porque se prevê que eles sejam estruturalmente mais estáveis do que as proteínas nativas são esperados ser biologicamente ligantes mais potentes aos recetores de citocina e terem potencial como agentes antineoplásticos. Em segundo lugar, estas proteínas podem ser utilizadas como análogos estáveis das citocinas nativas para procedimentos de panning de fase de solução e com a intenção de encontrar um agente de ligação seletivo do domínio, por exemplo, um antagonista do domínio de ligação ao recetor.

Utilizando modelação molecular, a estrutura cristal da IL-4 e o modelo teórico da IL-13 da Base de Dados Cristalográfica Brookhaven, as estruturas da IL-4 e IL-13 foram exmainadas. Vários aminoácidos no interior das estruturas foram identificados para os quais substituições poderiam ser feitas que não se esperaria que afetassem adversamente as estruturas. De facto, os cálculos de energia sugerem que estas estruturas poderiam inclusivé ser mais estáveis do que as sequências nativas. As substituições feitas para IL-4 foram Thr13=>Ser13, Thr22=>Ser22, Phe45=>Tyr45, Phe55=>Tyr55 e para IL-13 Ile48=>Val48, Gln90=>Glu90, Leu95^Ile95, Leu9<WlIe96, Leu"=>Ile", Phe103=>Tyr103.

Foi criada uma base de dados (Figuras 6A e 6B) para a IL-4 que continha cálculos dos aminoácidos expostos. A primeira coluna contém dados para as cadeias laterais apenas e a segunda coluna contém dados para ambas cadeia 46 lateral e estrutura. Os aminoácidos com pouca ou sem área exposta à superfície são mostrados a negrito/azul. FR_LATERAL FR_TOTAL Possíveis Energia ---- — ------- Substituições Aumento

Os resíduos enterrados foram extraídos do quadro e as cisternas removidas uma que vez que não podem ser substituídas sem comprometer a estrutura. 0 resultado das substituições possíveis está calculado a seguir:_ (Base é 603,493 kcal/mol) 7 LEU7 O o 0, 03 10 ILE10 0, 00 0, 00 11 ILE11 0, 09 0,07 13 THR13 0, 00 0, 00 Ser 607,457/ 14 LEU14 0, 00 0, 00 17 LEU17 0, 01 0, 04 22 THR22 0, 01 0, 10 Ser 606,487 25 THR25 0, 07 0, 05 29 VAL29 0, 01 0, 03 32 ILE32 0, 01 0, 06 45 PHE45 0, 04 0, 03 Tyr, His 609,651/652,5 01 47 ARG47 0, 06 0, 04 8 ALA48 0, 02 0, 01 Ser, Vai(?) 684,427/1355, 443 49 ALA49 0, 00 0, 00 Ser 662,543 51 VAL51 0, 02 0, 03 52 LEU52 0, 00 0, 00 Ile 642,620 55 PHE55 0, 02 0, 04 Tyr 612,756 56 TYR56 0,07 0, 06 76 HlS76 0, 02 0, 02 79 LEU79 0, 03 0, 02 80 ILE80 0, 09 0,07 47 (continuação) FR_LATERAL FR_TOTAL Possíveis Energia Substituições Aumento (Base é 603,493 kcal/mol) 83 LEU83 0, 00 0, 00 86 LEU86 0, 00 0, 00 87 ASP87 0, 04 0, 03 Asn 1139,982 90 LEU90 0, 00 0, 00 93 LEU93 0, 02 0, 04 94 ALA94 0, 00 0, 03 Ser 660,925 109 LEU109 0, 00 0, 00 112 PHE112 0, 00 0, 01 Tyr 855,581 113 LEU113 0, 04 0, 03 116 LEU116 0, 02 0, 02 120 MET120 0, 00 0, 00 A estrutura para IL-4 foi minimizada com 100 ciclos de gradiente conjugado, 100 dielétrico, com todos os hidrogénios utilizando campo de força Tripos e cargas Kollman-Uni. As alterações simples propostas anteriormente foram feitas e a energia calculada. Com base nestes cálculos, as melhores substituições seriam Ser por Thr13, Ser por Thr22, Tyr por Phe45 e Tyr por Phe55. A estrutura cristal da IL-4 foi retirada, a energia calculada antes da minimização, e quatro substituições anteriores feitas e a energia recalculada com os seguintes resultados: 48 48 231,645 298,910 453,633 46,674 386,851 1134,199 30,608 1043,112

Estrutura Cristal Nativa Energia de alongamento da ligação: Energia do ângulo de dobragem: Energia de torsão:

Energia de dobragem fora do Plano: (continuação)

Energia 1-4 van der Waals:

Energia van der Waals:

Energia Eletrostática 1-4:

Energia Eletrostática:

Energia Total: 3625,631 kcals/mol

Estrutura Ser13, Ser22, Tyr45, Tyr55

Energia de alongamento da ligação: 233,378

Energia do ângulo de dobragem: 299,147

Energia de torsão: 449,605

Energia de dobragem fora do Plano: 46,468

Energia 1-4 van der Waals: 384,334

Energia van der Waals: 1125,512

Energia Eletrostática 1-4: 30,677

Energia Eletrostática: 1043,004

Energia Total: 3612,126 kcals/mol

Existem diminuições na energia de torsão, energia 1-4 van der Waals e energia van der Waals. Com base nos cálculos de energia, esta estrutura prevê-se que seja mais estável do que a sequência nativa. Os aminoácidos modificados estão no interior da molécula mas, uma vez que as substituições foram avaliadas pela sua capacidade de não perturbar a estrutura secundária, a topologia de superfície e, portanto, a atividade funcional deveriam permanecer inalteradas.

Um quadro semelhante foi construído para a IL-13 49 (Figuras 7A e 7B) . A estrutura cristal não foi publicada mas está disponível um modelo teórico. Dez ciclos de minimização foram conduzidos em ambas estrutura inicial e na modificada.

Os resíduos internos que poderiam ser modificados. FR_LATERAL FR_TOTAL Possíveis Energia — — — Substituições Aumento (Base é 1725,42 kcal/mol) 6 LEU6 0, 06 0,07 9 LEU9 0, 03 0, 02 13 LEU13 0, 00 0, 03 17 THR17 0, 00 0, 03 Ser 1987,449 44 LEU44 0,07 0, 05 47 LEU47 0, 03 0, 02 48 ILE48 0, 08 0, 06 Vai 1722,283 50 VAL50 0, 06 0, 05 Ile 1841,982 51 SER51 0, 00 0, 00 Thr 2080,486 52 GLY52 - 0, 00 63 LEU63 0, 00 0, 00 66 PHE66 0, 04 0, 04 Tyr/His 1995,898/1766,541 69 HIS69 0, 01 0, 01 72 SER72 0, 04 0, 03 73 ALA73 0, 02 0, 01 77 SER77 0, 00 0, 01 90 GLN90 0, 02 0, 04 Glu 1730,812 92 VAL92 0, 01 0, 01 Ile 9159,549 95 LEU95 0, 00 0, 01 Ile 1631,393 96 LEU96 0, 00 0, 00 Ile 1619,286 99 LEU99 0, 03 0, 03 Ile 1628,907 103 PHE103 0, 01 0, 01 Tyr 1624,121 Apesar de Tyr por Phe66 ter uma energia superior, parece ser uma boa substituição. A energia mais elevada é 50 devido a mais interações van der Waals do hidroxilo.

Phe66 e His69 interagem (n-n). Ambos têm de permanecer aromáticos. A substituição Ile por Val92 dá uma elevada energia mas uma pequena quantidade de minimização reduz esta energia drasticamente. É provavelmente uma substituição aceitável.

Tyr por Phel03 adiciona uma ligação hidrogénio adicional com His69 e seria uma boa substituição. A estrutura para IL-13 foi retirada, a energia calculada, substituições feitas e energia recalculada para dar os seguintes resultados:

Estrutura Modelada Inicial

Energia de alongamento da ligação: 290,164

Energia do ângulo de dobragem: 390,042

Energia de torsão: 388,721

Energia de dobragem fora do Plano: 30,217

Energia 1-4 van der Waals: 286,329

Energia van der Waals: 210,384

Energia Eletrostática 1-4: 27,906

Energia Eletrostática: -1,547

Energia Total: 1622,216 kcals/mol

Energia de alongamento da ligação: Energia do ângulo de dobragem: Energia de torsão: Energia de dobragem fora do Plano: Energia 1-4 van der Waals: Energia van der Waals: Energia Eletrostática 1-4: Energia Eletrostática: 288,604 383,273 384,452 29,889 284,920 228,808 27,989 -1,594

Energia Total: 1626,342 kcals/mol 51

Existe uma diminuição na energia de alongamento da ligação, na energia do ângulo de dobragem, na energia 1-4 van der Waals e energia van der Waals com um aumento na energia de torsão e energia de alongamento da ligação. Estas últimas interações poderiam ser reduzidas por uma reposição das cadeias laterais Ile colocadas recentemente.

Estrutura Modificada Energia Força RMS kcals/mol kcals/mol A 1626,342 0 :00:00,33 25,436 1326,768 0:00:01,11 14,851 1207,892 0:00:01,78 10,799 1121,012 0:00:02,44 10,155 1065,839 0:00:03,11 7, 613 1031,513 0:00:03,76 6,361 995,717 0:00:04,42 6,643 965,486 0:00:05,09 5, 399 945,615 0:00:05,76 5, 429 924,480 0:00:06,42 4, 655 907,908 0:00:07,08 4, 448 AVISO: Número máximo atingidas

Força máx Iteração kcals/mol contagem

A 243,087 134,040 137,468 171,991 105,188 73,260 64,166 54,345 61,839 50,214 55,866 de iterações (10)

Aval Tempo

CPU

Contagem tempo 0 1 0 1 8 0 2 14 0 3 20 0 4 26 0 5 32 0 6 38 0 7 44 0 8 50 0 9 56 0 10 62 0 52

Energia de alongamento de ligação: 49,661 Energia do ângulo de dobragem: 297,149 Energia de torsão: 328,222 Energia de dobragem fora do Plano: 8, 774 Energia 1-4 van der Waals: 189,249 (continuação) Energia van der Waals: 8,139 Energia Eletrostática 1-4: 28,271 Energia Eletrostática: -1,556 Energia Total: 907,908 kcals/mol Número Tempo CPU %de (segs) Total Reconstruções não ligadas 2 0, 08 1, 08 Avaliações de Energia 64 7,33 98, 92 Número médio de van der Waals + pares electrostáticos = 5677 Número médio de 1-4 van der Waals + pares electrostáticos = 3415 Número médio de van der Waals escalados + pares electrostáticos = 248

Estrutura Inicial

Energia por molécula: INTERLEUCINA-13 MODELO 1 (MODELO TEÓRICO)

Energia Força RMS Força máx Aval Tempo CPU kcals/mol kcals/mol A kcals/mol A Iteração contagem contagem tempo 1622,189 25,201 243,087 0 1 0 0:00:00,34 1328,927 14,694 132,377 1 8 0 0:00:01,12 1212,237 10,675 135,392 2 14 0 0:00:01,79 53

1127,031 10,061 169,922 3 20 0 0:00:02,47 1072,925 7,499 103,477 4 26 0 0:00:03,13 1039,540 6,289 73,212 5 32 0 0:00:03,81 (continuação) Energia Força RMS Força máx Aval Iteração Tempo CPU kcals/mol kcals/mol kcals/mol A A contagem contagem tempo 1004,102 6,619 64,355 6 38 0 0:00:04,49 973,968 5,370 54,031 7 44 0 0:00:05,15 954,110 5,428 64,203 8 50 0 0:00:05,82 932,787 4,648 46,556 9 56 0 0:00:06,50 915,954 4,442 52,618 10 62 0 0:00:07,16 AVISO : Número máximo de iterações (10 ) atingidas Energia por molécula: INTERLEUCINA-13 MODELO 1 (MODELO TEÓRICO) Energia de alongamento de ligação: 48,807 Energia do ângulo de dobragem: 300,150 Energia de torsão: 331,002 Energia de dobragem fora do Plano: 8, 945 Energia 1- 4 van der Waals: 192,067 Energia van der Waals: 8,307 Energia Eletrostática 1-4: 28,178 Energia Eletrostática: -1,503 Energia Força RMS Força máx Iteraçao Aval Tempo CPU 54 kcals/mol kcals/mol kcals/mol contagem contagem tempo

A A

Energia Total: 915,954 kcals/mol Número Tempo CPU % do (segs ) Total Reconstruções não ligadas (continuação) 2 0, 08 1,07 Energia Total: 915,954 kcals/mol Número Tempo CPU % do (segs ) Total Avaliações de Energia 64 7, 41 98,93 Número médio de van der Waals + pares electrostáticos = 5717 Número médio de 1-4 van der Waals + pares electrostáticos = 3426 Número médio de van der Waals escalados + pares electrostáticos = 247_

Utilizando modelação molecular, a estrutura cristal da IL-4 e o modelo teórico da IL-13 da Base de Dados Cristalográfica de Brookhaven, as estruturas da IL-4 e IL-13 foram examinadas. Vários aminoácidos no interior das estruturas foram identificados para os quais poderiam ser realizadas substituições que não se esperaria que afetassem adversamente as estruturas. De facto, os cálculos energéticos sugerem que estas estruturas poderiam na realidade ser mais estáveis do que as sequências nativas.

As substituições feitas para IL-4 foram Thr13=>Ser13, Thr22Ser22, Phe45=>Tyr45, Phe55=>Tyr55 e para IL-13 Ile48=>Val48, Gln90=>Glu90, Leu95=>Ile95, Leu96=>Ile96, Leu"=>Ile", Phe103=>Tyr103.

As sequências completas sao: IL-4 Construção (SEQ. ID N.° 16) 55

HKCDITLQEI IKSLHSLTEQ KSLCTELTVT DIFAASKNTT EKETYCRAAT VLRQYYSHHE KDTRCLGATA QQFHRHKQLI RFLKRLDRHL WGLAGLMSCP VKEANQSTLE HFLERLKTIM REKYSKCSS IL-13 Construção (SEQ. ID N.° 17)

PPSTALRELI EEItVNITQNQ KAPLCNGSMV WSIWLTAGMY CAALESLVNV SGCSAIEKTQ RMLSGFCPHK VSAGQFSSLH VRDTKIEVAE FVKDIILHIK KLYRBGRFN onde os aminoácidos sublinhados indicam as substituições. A energia mais baixa da estrutura modificada após minimização menor sugere que esta estrutura é mais estável do que a sequência parental. Estas construções e outras preparadas de maneira análoga podem ser utilizadas no método da invenção. 56 56 LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Centocor, Inc. 0'Neil Raymond , Karyn Heavner, George Sweet,

<120> MÉTODO DE SELEÇÃO POR BIOPANNING DE FASE DE SOLUÇÃO UTILIZANDO PROTEÍNAS CHAMARIZ MODIFICADAS <130> CEN5055

<140> TBD <141> 2005-03-21 <150> 60/565,633 <151> 2004-04-26 <150> 60/565,674 <151> 2004-04-26 <160> 17 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> resíduos TF w 8 Hu Murino <400> 1 57

Gly Ile Pr o Glu Lys Ala Phe Asn Leu Thr Trp Ile Ser Thr Asp Phe 15 10 15

Lys Thr lie Leu Glu Trp Gin Pr o Lys Pro Thr Asn Tyr Thr Tyr Thr 20 25 30

Vai Gin lie Ser Asp Arg Ser Arg Asn Trp Lys Asn Lys Cys Phe Ser 35 40 45

Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Vai Lys Asp Vai 50 55 60

Thr Trp Ala Tyr Glu Ala Lys Vai Leu Ser Vai Pro Arg Arg Asn Ser 65 70 75 80

Vai His Gly Asp Gly Asp Gin Leu Vai ile His Gly Glu Glu Pro Pro 85 90 95

Phe Thr Asn Ala Pro Lys Phe Leu Pro Tyr Arg Asp Thr Asn Leu Gly 100 105 no

Gin Pro Vai Ile Gin Gin Phe Glu Gin Asn Gly Arg Lys Leu Asn Vai 115 120 125

Vai Vai Lys Asp Ser Leu Thr Leu Vai Arg Lys Asn Gly Thr Phe Leu 130 135 140

Thr Leu Arg Gin Vai Phe Gly Lys Asp Leu Gly Tyr Ile Ile Tyr Tyr 145 150 155 160

Arg Lys Gly Ser Ser Thr Gly Lys Lys Thr Asn Lys Thr Asn Thr Asn 165 170 175

Glu Phe Ser Ile Asp Vai Glu Glu Gly Vai Ser Tyr Cys Phe Phe Vai 180 185 190

Gin Ala Vai Ile Pro Ser Arg Lys Vai Asn Arg Lys Ser Pro Asp Ser 195 200 205

Ser Thr Vai Cys Thr Glu Gin Trp Lys Ser Phe Leu Gly 210 215 220 58 58 <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> 2 118

PRT

Humana LIGAÇÃO (26)..(35) CDR1 LIGAÇÃO (50)..(67) CDR2 LIGAÇÃO (100)..(107) CDR3 <400> 2 59

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 IS

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Ser 20 25 30

Trp lie Ala Trp Vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Txp Met 35 40 45

Gly Gly Xle Ile Gly Pro Gly His Ser Tyr Thr Lys Tyr Ser Pro Ser 50 55 60

Phe Gin Gly Gin Vai Thr Xle Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Ile Asn Met Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 3 <211> 111 <212> PRT <213> Humana <220> <221> LIGAÇÃO <222> (23)..(34) <223> CDR1 <220> LIGAÇAO (50) .. (56) CDR2 <221> <222> <223> <220> 60 <221> LIGAÇÃO <222> (89)..(99) <223> CDR3 <400> 3

Asp Ile Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ala Pro Gly Gin 15 10 is

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leia Gly Leu Lys Lys Phe 20 25 30

Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Vai Ile 35 40 45

Tyr Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly 50 55 £0

Ser Asn ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr ile Ser Gly Thr Gin Ala 65 70 75 80

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Tyr Asp Gin Thr Ile Gly 85 90 95

His Asp Vai Vai phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 110 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Humana <220> <221> LIGAÇÃO <222> (26)..(34) <223> CDR1 <220> <221> LIGAÇÃO <222> (49)..(65) 61 <223> CDR2 <220> <221> LIGAÇÃO <222> (98)..(105) <223> CDR3 <400> 4

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly 1 5

Ser Leu Lys He Ser Cys E»ys Gly 20

Ile Gly Trp Vai Arg Gin Met Pro 35 40

Trp Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Met 50 55

Gly Gin Vai Thr ile Ser Ala Asp 65 70

Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser 85

Arg Tyr Leu Phe Gly Leu Phe Asp 100

Thr Vai Ser Ser 115 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Humana <220>

<221> LIGAÇÃO

Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Glu 10 15 Ser Tyr Ser Phe Thr Ser Asn Trp 25 30 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 45 Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 60 Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu 75 80 Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 90 95 Asn Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 105 110 62 <222> (23) . . (33 <223> CDR1 <220> <221> LIGAÇÃO <222> (49) . . (55 <223> CDR2 <220> <221> LIGAÇÃO <222> (88) . . (95 <223> CDR3 <400> 5

Asp Ile Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser vai Ser Vai Ala Fro Gly Gin 1 5 io 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Ser Tyr Tyr Vai 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45

Asn Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr ile Ser Gly Thr Gin Ala Glu 6S 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Asp Ser Ser Thr Asp Vai 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Humana <220> 63 <221> LIGAÇAO <222> (26)..(34) <223> CDR1 <220> <221> LIGAÇÃO <222> (49)..(65) <223> CDR2 <220> <221> LIGAÇÃO <222> (98)..(108) <223> CDR3 <400> 6

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15 6 4

Ser Leu Lys He Ser Cys Lys 20

Gly Ser Tyr Ser Phe Ser Asn 25 30

Tyr Trp

Xle Gly Trp Vai Arg Gin Met 35

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 40 45

Met Gly

Phe Ile Asp Pro Asp Asp Ser 50 55

Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser 60

Phe Gin

Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala 65 70

Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala 75

Tyr Leu 80

Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala 85

Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 90

Cys Ala 95

Arg Ala Leu Tyr Met Gin Gly 100

Gly Ser Phe Asp Ser Trp Gly 105 HO

Gin Gly

Thr Leu val Thr Vai Ser Ser 115 <210> 7 <211> 109 <212> PRT <213> Humana <220> <221> LIGAÇÃO <222> (23) .. (33 <223> CDR1 <220> <221> LIGAÇÃO <222> (49)..(55 <223> CDR2 <220> <221> LIGAÇÃO <222> (88)..(97 65 <223> CDR3 <4Ο0> 7

Asp Ile Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ala Pro Gly Gin 1 5 10 15

Thr Ala Arg lie Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Ser Tyr Tyr Vai 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45

Arg Asp Thr Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Tyr Gly Vai Ser Asn 85 90 95

Gin Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> Humana <220> <221> LIGAÇÃO <222> (26)..(34) <223> CDR1 <220> LIGAÇAO (49)..(65) CDR2 <221> <222> <223> <220> 66 <221> LIGAÇAO <222> (98)..(108) <223> CDR3 <400> 8

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Tyr Ser Phe Thr Asn Ser Trp 20 25 30

Ile Ser Trp vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 35 40 45

He Ile Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 50 55 60

Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80

Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Gly Ala Gly Tyr Gly Arg Met Phe Gly Asp Vai Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 9 <211> 108 <212> PRT <213> Humana <220> <221> LIGAÇÃO <222> (23)..(33 <223> CDR1 <220> 67 <221> LIGAÇÃO <222> (49) . . (55 <223> CDR2 <220> <221> LIGAÇÃO <222> (88) . . (96 <223> CDR3 <400> 9

Asp Ile Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ala Pro Gly Gin 1 5 io 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45

Gin Asp Asp Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr ile Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Tyr Thr Tyr Ser Thr Ser Trp 85 90 95

Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Humana <220> <221> LIGAÇÃO <222> (26)..(37 <223> CDR1 68 <220> <221> LIGAÇÃO <222> (52)..(67) <223> CDR2 <220> <221> LIGAÇÃO <222>. (100)..(107) <223> CDR3 <4 0 0> 10

Gin Vai Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Vai Lys Pro Thr Gin 1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Leu Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Vai Gly Vai Gly Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Ser Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Thr Ser 50 55 60

Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Vai 65 70 75 80

Vai Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Vai Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Tyr Lys Gin Glu Thr He Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 11 <211> 105 <212> PRT <213> Humana 69 <220> <22l> LIGAÇÃO <222> (23)..(33) <223> CDR1 <220> <221> LIGAÇÃO <222> (49)..(53) <223> CDR2 <220> <221> LIGAÇÃO <222> (86) . . (93) <223> CDR3 <400> 11

Asp Ile Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Glu Lys Tyr Ala 20 25 30

Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45

Asp Asp Asn Asn. Arg Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser 50 55 60

Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gin Ala Glu Asp Glu 65 70 75 80

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ile Glu Ile Thr Vai Phe Gly 85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 <210> 12 <211> 112 70 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Proteína quimérica baseada na sequência humana com substituições de resíduo homólogo bovino <400> 12

Gly Pro Vai Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu 15 10 15

Vai Asn Ile Thr Gin Asn Gin Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met 20 25 30

Vai Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu 35 40 45

Ser Leu Ile Asn Ile Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gin Arg 50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Pro Ser Ala Lys Gin Vai Ser 65 70 75 80

Ser Glu Tyr Vai Arg Asp Thr Lys ile Glu Vai Ala Gin Phe Vai Lys 85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn 100 105 110 <210> 13 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Proteína quimérica baseada na sequência humana com substituições com resíduos homólogos de porco <400> 13 71

Gly Pro Vai Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Zle Glu Glu Leu 1 5 10 15

Vai Asn Ile Thr Gin Asn Gin Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met 20 25 30

Vai Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Gin Tyr Cys Ala Ala Leu 35 40 45

Glu Ser Leu Ile Asn Ile Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gin 50 55 60

Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Ser His Lys Pro Pro Ser Glu Gin Vai 65 70 75 80 pro Gly Lys His Ile Arg Asp Thr Lys Ile Glu Vai Ala Gin Phe Vai 85 90 .95

Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe 100 105 110

Asn <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Proteína quimérica baseada na sequência humana com substituições com resíduos homólogos caninos <400> 14

Gly Pro Vai Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu 72 1 5 ίο 15

Vai Asn He Thr Gin Asn Gin Lys Ala Pr o Leu Cys Asn Gly Ser Met 20 25 30

Vai Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu 35 40 45

Ser Leu Ile Asn Vai Ser Gly Çys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gin Arg 50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Ser Gin Lys Pro Ala Ala Gly Gin Ile Ser 65 70 75 80

Ser Glu Arg Ser Arg Asp Thr Lys Ile Glu Vai Ala Gin Phe Vai Lys 85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn 100 105 110 <210> 15 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Proteína quimérica baseada na sequência humana com substituições de resíduos homólogos de ratinho <400> 15 73

Gly Pro Vai Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu 15 10 15

Vai Asn Xle Thr Gin Asn Gin Lys Ala Pro Leu Cys Asa Gly Ser Met 20 25 30

Vai Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu 35 40 45

Ser Leu Ile Asn ile Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gin Arg 50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Asn Arg Lys Ala Pro Thr Thr Vai. Ser Ser 65 70 75 80

Leu Pro Asp Thr Lys Ile Glu Vai Ala Gin Phe Vai Lys Asp Leu Leu 85 90 95

Leu His Leu Lys Lys Leu phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn 100 105 <210> 16 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> IL-4 Humana com estabilidade aumentada <400> 16 74

His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gin Glu ile Ile Lys Ser Leu Asn Ser 15 10 15

Leu Thr Glu Gin Lys Ser Leu Cys Thr Glu Leu Thr Vai Thr Asp Ile 20 25 30

Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Tyr Cys Arg Ala 35 40 45

Ala Thr Vai Leu Arg Gin Tyr Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg 50 55 60

Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gin Gin 65 70

Phe His Arg His Lys Gin Leu Ile 75 80

Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg 85

Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu S0 95

Asn Ser Cys Pro Vai Lys Glu Ala 100

Asn Gin Ser Thr Leu Glu Asn Phe 105 110

Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser 115 120 125

Ser <210> 17 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> IL-13 Humana com estabilidade aumentada <400> 17 75

Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Vai Asn Ile 15 10 15

Thr Gin Asn Gin Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Vai Trp Ser 20 25 30

Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Vai 35 40 45

Asn Vai Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gin Arg Met Leu Ser 50 55 60

Gly Phe Cys Pro His Lys Vai Ser Ala Gly Gin Phe Ser Ser Leu His 65 70 75 80

Vai Arg Asp Thr Lys Ile Glu Vai Ala Glu Phe Vai Lys Asp Ile Ile 85 90 95

Leu His Ile Lys Lys Leu Tyr Arg Glu Gly Arg Phe Asn 100 105 76

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 6376170 B [0007] • US 6248516 B [0024] • US 10393926 B [0039] • US 60565633 B [0125] • US 60565674 B [0125]

Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição

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Claims (2)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para identificar um anticorpo que se liga a um epitopo pré-selecionado de uma proteína alvo, que compreende: a) providenciar uma biblioteca de partículas de fago que expressam anticorpos na superfície das partículas de fago; b) preparar uma proteína chamariz que tem alterações nas sequências de aminoácidos correspondentes ao epitopo pré-selecionado da proteína alvo, e em que a proteína chamariz difere da proteína alvo apenas no epitopo pré-selecionado; c) incubar a biblioteca de partículas de fago com a proteína alvo para selecionar partículas de fago com anticorpos que se ligam à proteína alvo; d) adicionar a proteína chamariz como um competidor em concentração molar em excesso para selecionar negativamente partículas de fago específicas para o epitopo pré-selecionado ; e) separar as partículas de fago que se ligam à proteína alvo daquelas que se ligam à proteína chamariz e f) recuperar as partículas de fago ligadas à proteína alvo.

2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, no qual a) o fragmento do anticorpo é um fragmento Fab, Fab', ou F(ab')2 ou derivado do mesmo; ou b) o anticorpo liga-se ao epitopo TF8-5G9 no fator de tecido murino.