CN117957253A - 癌症的组合治疗中针对cd40和cd137的多特异性结合剂 - Google Patents

癌症的组合治疗中针对cd40和cd137的多特异性结合剂 Download PDF

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布朗东·希格斯
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帕特里夏·加里多卡斯特罗
米歇尔·尼伍德
弗里德里克·吉泽克
卡斯滕·贝克曼
克劳迪娅·保尔曼
伊万·库兹曼诺夫
埃斯特·科尔内利娅·威廉明娜·布赖
拉尔斯·盖朗
约斯特·内森
巴尔特-扬·德克列乌克
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亚尼内·斯胡尔曼
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Abstract

本发明涉及这样的组合治疗：其使用与人CD40结合且与人CD137结合的结合剂与检查点抑制剂的组合，以降低或阻止肿瘤进展或者治疗癌症。

Description

癌症的组合治疗中针对CD40和CD137的多特异性结合剂
技术领域
本发明涉及这样的组合治疗：其使用与人CD40结合且与人CD137结合的结合剂与检查点抑制剂的组合，以降低或阻止肿瘤的进展或治疗癌症。
背景技术
CD40是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体(tumor necrosisfactor receptor，TNFR)家族的成员，并且其已知作为存在于多种细胞类型上的共刺激蛋白。CD40由抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)包括树突细胞(dendriticcell，DC)、B细胞和巨噬细胞组成型表达。其也可由内皮细胞、血小板、平滑肌细胞、成纤维细胞和上皮细胞表达。与其在正常细胞上的广泛的表达一致，CD40也在广泛范围的肿瘤细胞上表达。
肽抗原在MHC II类分子的情况下向抗原特异性CD4+T细胞的呈递，与共刺激信号(来自CD80和/或CD86)一起，导致CD4+T细胞活化以及DC许可因子CD40配体(CD40 ligand，CD40L)和淋巴毒素-α1β2(lymphotoxin-α1β2，LTα1β2)的上调。活化的抗原特异性CD4+T细胞上CD40L和LT LTα1β2的表达通过CD40和LTβ受体(LTβreceptor，LTβR)诱导信号传导，并且这许可DC诱导CD8+T细胞应答。CD40信号传导导致白介素-12(interleukin-12，IL-12)的产生和CD70、CD86、4-1BB配体(4-1BB ligand，4-1BBL)、OX40配体(OX40 ligand，OX40L)和GITR配体(GITR ligand，GITRL)的上调，然而LTβR信号传导导致I型干扰素(IFN)的产生。控制核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)活性的信号传导系统对几乎所有TNFR超家族成员都有响应。病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)也有助于这些事件。通过MHC I类限制性肽使CD8+T细胞致敏导致CD27、4-1BB、OX40和糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(glucocorticoid-induced TNFR-related protein，GITR)的上调。CD8+T细胞上这些受体被其同源TNF超家族配体的刺激与IL-12和I型IFN组合，导致稳健的CD8+T细胞活化、增殖和效应物功能，以及CD8+T细胞记忆的形成和维持。CD40抗体可发挥不同的作用：通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis，ADCP)，诱导细胞信号传导以诱导直接凋亡或生长停滞，以及不依赖于肿瘤细胞上的CD40表达，通过许可APC刺激抗癌免疫应答来杀伤表达CD40的肿瘤细胞。与CD40结合的抗体可触发APC上的CD40以使效应细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)致敏并诱导这些细胞释放IL-2，并间接地活化NK细胞。刺激CD40的抗体在现有技术中已经公开，并且包括人IgG2抗体CP-870,893(WO 03/040170)、人源化IgG1抗体达西珠单抗(dacetuzumab)(WO 00/075348)和嵌合IgG1抗体Chi Lob 7/4(US 2009/0074711)。此外，已经公开了拮抗性CD40抗体，人IgG1抗体卢卡木单抗(lucatumumab)(WO 02/028481)。
CD137(4-1BB)也是TNFR家族的成员。CD137是CD8+T细胞和CD4+T细胞、调节性T细胞(Treg)、自然杀伤T细胞(Natural Killer，NK(T)细胞)、B细胞和中性粒细胞上的共刺激分子。在T细胞上，CD137不是组成型表达的，而是在T细胞受体(T-cell receptor，TCR)活化之后被诱导(例如，在肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)上(Groset al.,J.Clin Invest 2014；124(5):2246-59))。通过其天然配体4-1BBL或激动剂抗体的刺激导致使用TRAF-2和TRAF-1作为衔接子的信号传导。通过CD137的早期信号传导涉及K-63多泛素化反应，其最终导致核因子(NF)-κB和丝裂原活化蛋白(mitogen-activatedprotein，MAP)-激酶途径的激活。信号传导导致提高的T细胞共刺激、增殖、细胞因子产生、成熟和延长的CD8+T细胞存活。已表明针对CD137的激动性抗体在多种临床前模型中促进T细胞的抗肿瘤控制(Murillo et al.,Clin Cancer Res 2008；14(21):6895-906)。刺激CD137的抗体可诱导T细胞的存活和增殖，从而增强抗肿瘤免疫应答。刺激CD137的抗体在现有技术中已经公开，并且包括人IgG4抗体乌瑞芦单抗(urelumab)(AU 2004279877)和人IgG2抗体乌托鲁单抗(utomilumab)(Fisher et al.,2012,CancerImmunol.Immunother.61:1721-1733)。
Westwood JA,et al.,Leukemia Research 38(2014),948-954公开了“Combination anti-CD137 and anti-CD40 antibody therapy in murine myc-drivenhematological cancers”。WO 2018/011421提供了结合剂，例如双特异性抗体，其与人CD40结合并与人CD137结合。这样的双特异性抗体使抗原呈递细胞(APC)上的CD40与活化的T细胞上的4-1BB交联，并从而诱导两种细胞类型的条件刺激和在两种细胞类型中的共刺激活性，其可用于治疗实体瘤。
PD-1、CTLA4、PD-L1、TIM-3、KIR或LAG-3是调节免疫系统并且能够使自身耐受的抑制性检查点分子。同时，抑制性检查点分子是癌症免疫治疗的理想靶标。
在肿瘤引流淋巴结中以及在肿瘤微环境内，4-1BB由CD4+和CD8+T细胞亚群表达，其特征在于多种TCR诱导型分子(包括高水平的程序性细胞死亡1(PD-1))的共表达(Groset al.,J.Clin Invest 2014；124(5):2246-59；Seifert et al.,Cancers(Basel)12；Simoni et al.,Nature 557:575-579)。T细胞上PD-1的上调可有助于T细胞耗竭，并在T细胞与其配体程序性细胞死亡1配体1(programmed cell death 1ligand 1，PD-L1)结合之后降低T细胞的活化(Yu et al.,Eur J Pharmacol 881:173240)。PD-L1的表达经常被肿瘤细胞上调，特别是在发炎的肿瘤中(Teng,et al.,Cancer Res 75:2139-2145)。因此，肿瘤细胞向活化的T细胞提供抑制性信号，通过该信号它们可以逃避T细胞介导的细胞毒性。阻断PD-1/PD-L1抑制性轴的抗体可恢复T细胞功能(Boussiotis et al.,N Engl J Med 375:1767-1778；Chen et al.,Nature 541:321-330)。
然而，尽管本领域中取得了这些进展，但仍相当需要改善的治疗以阻止肿瘤的进展或治疗癌症。
发明内容
本发明人出乎意料地发现(i)使用结合人CD40且结合人CD137的结合剂刺激和(ii)检查点抑制(特别是PD-1/PD-L1轴的抑制)的组合放大了免疫应答。
因此，在第一方面，本公开内容提供了结合剂，其用于在对象中降低或阻止肿瘤进展或者治疗癌症的方法，所述方法包括在施用检查点抑制剂之前、同时或之后向所述对象施用所述结合剂，其中所述结合剂包含与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区。
在第二方面中，本公开内容提供了药盒，其包含(i)含有与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区的结合剂，(ii)检查点抑制剂，和任选地(iii)一种或更多种另外的治疗剂。
在第三方面中，本公开内容提供了所述第二方面的药盒，其用于在对象中降低或阻止肿瘤进展或治疗癌症的方法。
在第四方面中，本公开内容提供了用于在对象中降低或阻止肿瘤进展或者治疗癌症的方法，所述方法包括在施用检查点抑制剂之前、同时或之后向所述对象施用所述结合剂，其中所述结合剂包含与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区。
附图说明
图1示出了CD40×4-1BB双特异性抗体的预期作用模式的示意图。CD40在抗原呈递细胞(APC)以及肿瘤细胞上表达。4-1BB(CD137)在活化的T细胞上表达。DuoBoty-CD40×4-1BB(GEN1042/BNT312)是一种双特异性抗体，其使抗原呈递细胞(APC)上的CD40与活化的T细胞上的4-1BB交联，从而有条件地刺激这两种细胞类型。因此，CD40×4-1BB双特异性抗体可增强DC许可、T细胞克隆扩增、细胞因子产生、T细胞存活以及T细胞和NK细胞介导的细胞毒性。
图2示出了在成熟树突细胞(mDC)和纯化的CD8+T细胞的混合淋巴细胞反应(mixedlymphocyte reaction，MLR)中，由bsIgG1-CD40×4-1BB与派姆单抗(pembrolizumab)组合诱导的IFNγ产生。在bsIgG1-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)、派姆单抗(0.1至30μg/mL)单独或组合的存在下，将纯化的CD8+T细胞与同种异体LPS-成熟的DC共培养5天。通过ELISA分析IFNγ分泌。示出的数据是来自包括在三个实验中的五个供体对的一个代表性供体对的重复孔的平均IFNγ±标准偏差(standard deviation，SD)。图中的水平线从上到下示出了对于不含派姆单抗的10μg/mL bsIgG1-CD40×4-1BB(虚线(interrupted line))、不含bsIgG1-CD40×4-1BB的10μg/mL派姆单抗(虚点线(interrupted,dotted line))和未经处理的情况下(简单的细线)的IFNγ产生。
图3示出了在成熟树突细胞(mDC)和纯化的CD8+T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)中，由bsIgG1-CD40×4-1BB与派姆单抗组合诱导的IFNγ产生。在bsIgG1-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)、派姆单抗(0.1至30μg/mL)单独或组合的存在下，将纯化的CD8+T细胞与同种异体LPS-成熟的DC共培养5天。通过ELISA分析IFNγ分泌。显示的数据是在三个实验中重复孔的平均IFNγ±标准偏差(SD)。每幅单独的图代表五个供体对中的一对。
图4示出了在成熟树突细胞(mDC)和纯化的CD8+T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)中，由DuoBody-CD40×4-1BB与派姆单抗组合诱导的IFNγ产生。在DuoBody-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)、派姆单抗(0.1至100μg/mL)单独或组合的存在下，或者在对照抗体bsIgG1-CD40×ctrl、bsIgG1-ctrl×4-1BB、IgG1-ctrl-FEAL(均为30μg/mL)或IgG4同种型对照(100μg/mL)的存在下将纯化的CD8+T细胞与同种异体LPS-成熟的DC共培养5天。通过ELISA分析IFNγ分泌。显示的数据是一个供体对(n＝1)的重复孔的平均IFNγ±标准偏差(SD)。
图5示出了在成熟树突细胞(mDC)和纯化的CD8+T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)中，由DuoBody-CD40×4-1BB或bsIgG1-CD40×4-1BB单独或者与派姆单抗组合诱导的IFNγ产生。在DuoBody-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)、bsIgG1-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)单独或者与派姆单抗(1μg/mL)组合的存在下，将纯化的CD8+T细胞与同种异体LPS-成熟的DC共培养5天。评价另外的30μg/mL IgG1-ctrl-FEAL的单一治疗对照处理。通过ELISA分析IFNγ分泌。显示的数据是一个供体对(n＝1)的重复孔的平均IFNγ±标准偏差(SD)。
图6示出了在成熟树突细胞(mDC)和纯化的CD8+T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)中由bsIgG1-CD40×4-1BB与内部来源的纳武单抗(nivolumab)组合诱导的IFNγ产生。在bsIgG1-CD40×4-1BB(0.001至10μg/mL)，纳武单抗(α-PD-1，0.0005至5μg/mL)单独或组合的存在下，将纯化的CD8+T细胞与同种异体LPS-成熟的DC共培养5天。通过ELISA分析IFNγ分泌。显示的数据是来自一个供体对的重复孔的平均IFNγ±标准偏差(SD)。
图7示出了在同种异体的混合淋巴细胞反应(MLR)测定中由IgG1-PD1与DuoBody-CD40×4-1BB组合诱导的IFNγ分泌。在IgG1-PD1(0.001至100μg/mL)，DuoBody-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)的存在下，或者在IgG1-PD1与DuoBody-CD40×4-1BB组合的存在下，将两个独特的供体对的同种异体人成熟树突细胞(mDC)和CD8+T细胞共培养5天。IgG1-ctrl-FERR(100μg/mL)，bsIgG1-CD40×ctrl(30μg/mL)，bsIgG1-ctrl×4-1BB(30μg/mL)和IgG1-ctrl-FEAL(30μg/mL)包括在内作为对照。使用IFNγ特异性AlphaLISA免疫测定来分析上清液中的IFNγ分泌。显示的数据是用一个代表性浓度1μg/mLIgG1-PD1处理的2个独特的同种异体供体对的平均IFNγ水平±平均值的标准误差(SEM)。
图8示出了在同种异体的混合淋巴细胞反应(MLR)测定中由IgG1-PD1和DuoBody-CD40×4-1BB的组合诱导的IFNγ分泌的协同分析。在同种异体的MLR测定中，使用Bliss和最高单一药剂(Highest Single Agent，HSA)协同效应评分模型针对供体对1(A)和2(B)确定IgG1-PD1和DuoBody-CD40×4-1BB处理组合在7×7的剂量响应矩阵中的协同作用。评分≥10表明协同作用。
图9示出了在抗原特异性T细胞刺激测定中，通过IgG1-PD1与DuoBody-CD40×4-1BB组合而对CD8+T细胞增殖的增强。将人CD8+T细胞用编码密蛋白6(claudin 6，CLDN6)特异性T细胞受体(T-cell receptor，TCR)的RNA和编码程序性细胞死亡蛋白1(programmedcell death protein1，PD-1)的RNA进行电穿孔，并用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)标记。然后，在0.8μg/mL IgG1-PD1、派姆单抗、或者IgG1-ctrl-FERR单独或与指定浓度的DuoBody-CD40×4-1BB组合存在的情况下，将T细胞与用CLDN6电穿孔的未成熟树突细胞(immature dendritic cell，iDC)共培养。在4天之后通过流式细胞术分析T细胞中的CFSE稀释，并用其计算扩增指数。示出了来自两个独立实验中评价的四个供体中的一个代表性供体的数据。误差棒代表重复孔的标准偏差(SD)。点线(dotted line)表示与模拟电穿孔(即不表达CLDN6)的iDC共培养的CD8+T细胞的扩增指数。
图10示出了在抗原特异性CD8+T细胞刺激之后，通过IgG1-PD1与DuoBody-CD40×4-1BB组合而对细胞因子分泌的增强。在0.8μg/mL IgG1-PD1、派姆单抗、或者IgG1-ctrl-FERR单独或与指定浓度的DuoBody-CD40×4-1BB组合的存在下，如图9中，将表达密蛋白6(CLDN6)特异性T细胞受体(TCR)和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的人CD8+T细胞与表达CLDN6的iDC共培养。在4天之后确定培养物上清液中的细胞因子浓度。示出了来自两个独立实验中评价的四个供体中的一个代表性供体的数据。误差棒代表重复孔的标准偏差(SD)。
图11示出了IgG1-PD1与不同物种的PD-1的结合。将用不同物种的PD-1瞬时转染的CHO-S细胞与IgG1-PD1、派姆单抗或非结合对照抗体IgG1-ctrl-FERR和IgG4-ctrl孵育，并使用流式细胞术分析结合。与IgG1-PD1孵育的未经转染的CHO-S细胞包括在内作为阴性对照。A至B.显示的数据是来自四个实验中的一个代表性实验的重复孔的几何平均荧光强度(geometric mean fluorescence intensities，gMFI)±SD。C至D.显示的数据是来自两个实验中的一个代表性实验的重复孔的gMFI±SD。E.显示的数据是来自四个实验中的一个代表性实验的重复孔的几何平均荧光强度(gMFI)±SD。缩写：gMFI＝几何平均荧光强度；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；PE＝R-藻红蛋白。
图12示出了IgG1-PD1与PD-L1和PD-L2与人PD-1的竞争性结合。在IgG1-PD1或派姆单抗的存在下，将用人PD-1瞬时转染的CHO-S细胞与1μg/mL生物素化重组人PD-L1(A)或PD-L2(B)孵育。IgG1-ctrl-FERR包括在内作为阴性对照。用链霉亲和素-别藻蓝蛋白对细胞染色，通过使用流式细胞术测量链霉亲和素-别藻蓝蛋白+细胞的百分比来确定结合生物素化PD-L1或PD-L2的细胞的百分比。在无抗体对照和未转染样品中链霉亲和素-别藻蓝蛋白+细胞的百分比用虚线表示。示出的数据来自三个独立实验中一个代表性实验的单次重复。缩写：Ab＝抗体；CHO-S＝中国仓鼠卵巢，悬浮物；ctrl＝对照；FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；PD-L1＝程序性细胞死亡1配体1；PD-L2＝程序性细胞死亡1配体2。
图13示出了由IgG1-PD1对PD-1/PD-L1检查点的功能抑制。使用基于细胞的生物发光PD-1/PD-L1阻断报道测定来测试PD-1/PD-L1轴的阻断。显示的数据是五个(派姆单抗和IgG1-PD1)、三个(IgG1-ctrl-FERR)或两个(纳武单抗)实验中一个代表性实验中重复孔的平均发光±SD。缩写：FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；PD1＝程序性细胞死亡蛋白1；PD-L1＝程序性细胞死亡1配体1；RLU＝相对光单位；SD＝标准偏差。
图14示出了在抗原特异性T细胞增殖测定中由IgG1-PD1对CD8+T细胞增殖的增强。将人CD8+T细胞用编码CLDN6特异性TCR的RNA和编码PD-1的RNA进行电穿孔，并用CFSE标记。然后，在IgG1-PD1、派姆单抗、纳武单抗或IgG1-ctrl-FERR的存在下，将T细胞与用编码CLDN6的RNA电穿孔的iDC共培养。4天之后通过流式细胞术分析T细胞中的CFSE稀释，并用其计算扩增指数。示出了来自三个独立实验中评价的四个供体中的一个代表性供体(26268_B)的数据。误差棒表示重复孔的SD。使用GraphPad Prism通过4-参数对数拟合来拟合曲线。缩写：CFSE＝羧基萤光素琥珀酰亚胺酯；FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；PD1＝程序性细胞死亡蛋白1；SD＝标准偏差。
图15示出了在同种异体MLR测定中IgG1-PD1诱导的IFNγ分泌。在IgG1-PD1或派姆单抗的存在下，将三个独特的供体对的同种异体人mDC和CD8+T细胞共培养5天。IgG1-ctrl-FERR和IgG4同种型对照包括在内作为阴性对照。使用IFNγ特异性免疫测定分析上清液中的IFNγ分泌。显示的数据是三个独特的同种异体供体对的浓度平均值±平均值的标准误差(SEM)。缩写：FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；IFN＝干扰素；IgG＝免疫球蛋白G；mDC＝成熟树突细胞；MLR＝混合淋巴细胞反应；SEM＝平均值的标准误差。
图16示出了同种异体MLR测定中IgG1-PD1诱导的细胞因子分泌。在1μg/mLIgG1-PD1或派姆单抗的存在下，将三个独特的供体对的同种异体人mDC和CD8+T细胞共培养5天。IgG1-ctrl-FERR包括在内作为阴性对照。使用Luminex来分析上清液中细胞因子分泌。(A)细胞因子水平表示为相对于未经处理共培养物中测量的细胞因子水平的平均倍数变化。(B)显示了三个独特的同种异体供体对的细胞因子产生的水平，其中水平线表示平均值、上限和下限。缩写：FC＝倍数变化；FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；GM-CSF＝粒细胞巨噬细胞集落-刺激因子；IgG＝免疫球蛋白G；IL＝白介素；MCP-1＝单核细胞趋化蛋白1；mDC＝成熟树突细胞；MLR＝混合淋巴细胞反应；TNF＝肿瘤坏死因子。
图17示出了C1q与膜结合的IgG1-PD1的结合。使用经刺激的人CD8+T细胞来分析C1q与IgG1-PD1的结合。在与IgG1-PD1、IgG1-ctrl-FERR、IgG1-ctrl或阳性对照抗体IgG1-CD52-E430G(不具有惰性突变并且具有六聚化-增强突变)孵育之后，将细胞与作为C1q来源的人血清孵育。用FITC缀合的兔抗C1q抗体来检测C1q的结合。显示的数据是来自三个相当的实验中七个供体中的一个代表性供体的重复孔的几何平均荧光强度(gMFI)±标准偏差(SD)。缩写：FITC＝异硫氰酸荧光素；gMFI＝几何平均荧光强度；PE＝R-藻红蓝蛋白。
图18示出了IgG1-PD1的FcγR结合。在合格测定中通过SPR来分析IgG1-PD1与固定化人重组FcγR构建体的结合(n＝1)。IgG1-PD1的FcγRIa(A)、FcγRIIa-H131(B)、FcγRIIa-R131(C)、FcγRIIb(D)、FcγRIIIa-F158(E)和FcγRIIIa-V158(F)结合。抗体IgG1-ctrl(不具有FER惰性突变)包括在内作为结合的阳性对照。缩写：ctrl＝对照；FcγR＝Fcγ受体；IgG＝免疫球蛋白G；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；RU＝共振单位。
图19示出了IgG1-PD1和数种其他抗PD-1抗体的FcγR结合。通过SPR来分析IgG1-PD1、纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗(dostarlimab)和西米普利单抗(cemiplimab)与固定化人重组FcγR构建体的结合(n＝3)。测试抗体的FcγRIa(A)、FcγRIIa-H131(B)、FcγRIIa-R131(C)、FcγRIIb(D)、FcγRIIIa-F158(E)和FcγRIIIa-V158(F)结合。IgG1-ctrl和IgG4-ctrl抗体包括在内作为具有野生型Fc区的IgG1和IgG4分子的FcγR结合的阳性对照。显示的是三个独立实验的结合应答±SD。缩写：ctrl＝对照；FcγR＝Fcγ受体；IgG＝免疫球蛋白G；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；RU＝共振单位。
图20示出了IgG1-PD1和数种其他抗PD-1抗体的FcγRIa结合。通过流式细胞术来分析IgG1-PD1、纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗和西米普利单抗与瞬时表达人FcγRIa的CHO-S细胞的结合。IgG1-ctrl和IgG1-ctrl-FERR包括在内分别作为阳性和阴性对照。缩写：ctrl＝对照；FcγR＝Fcγ受体；FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；huIgG＝人免疫球蛋白G；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；PE＝R-藻红蛋白。
图21示出了小鼠血浆样品中总的人IgG。在t＝0时用1或10mg/kg IgG1-PD1对小鼠进行静脉内注射，并在注射之后10分钟、4小时、1天、2天、8天、14天和21天采集一系列血浆样品。通过ECLIA确定每只小鼠血浆样品中的总huIgG。数据表示为三只个体小鼠的平均huIgG浓度±SD。虚线表示由基于人中IgG清除的二房室模型预测的野生型(wild-type，wt)huIgG的血浆浓度(Bleeker et al.,2001,Blood.98(10):3136-42)。点线表示LLOQ和ULOQ。缩写：huIgG＝人IgG；IgG＝免疫球蛋白G；LLQQ＝定量下限；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；SD＝标准偏差；ULOQ＝定量上限。
图22示出了在人PD-1敲入小鼠中，IgG1-PD1的抗肿瘤活性。在hPD-1KI小鼠中通过SC植入建立MC38结肠癌同基因肿瘤模型。对小鼠施用0.5、2或10mg/kg的IgG1-PD1或派姆单抗或10mg/kg的IgG1-ctrl-FERR，2QW×3(9只小鼠/组)。(A)每组中的平均肿瘤体积±SEM，直到该组完成的最后的时间点。(B)不同组的肿瘤体积，在所有组均完成的最后一天(第11天)。显示的数据是每个处理组中个体小鼠中的肿瘤体积，以及每个处理组的平均肿瘤体积±SEM。使用Mann-Whitney分析来比较处理组的肿瘤体积与IgG1-ctrl-FERR处理组的肿瘤体积，其中*p<0.05，**p<0.01，以及***p<0.001。C.无进展存活，定义为肿瘤体积小于500mm3的小鼠的百分比，以Kaplan-Meier曲线示出。分析排除了来自2mg/kg IgG1-PD1组中的一只小鼠，发现该小鼠在肿瘤体积超过500mm3之前，在第16天因未确定的原因死亡。缩写：2QW×3＝每周两次持续三周；ctrl＝对照；FERR＝L234F/L235E/G236R/K409R突变；IgG＝免疫球蛋白G；KI＝敲入；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；SC＝皮下；SEM＝平均值的标准误差。
图23示出了在成熟树突细胞(mDC)和纯化的CD8+T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)中，由DuoBody-CD40×4-1BB与阿特珠单抗(atezolizumab)、纳武单抗或派姆单抗组合诱导的IFNγ(A)、GM-CSF(B)、TNFα(C)、IL-2(D)和IL-6(E)的分泌。在DuoBody-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)、阿特珠单抗(1μg/mL)、纳武单抗(1μg/mL)或派姆单抗(1μg/mL)单独存在下，或者在DuoBody-CD40×4-1BB与阿特珠单抗、纳武单抗或派姆单抗组合存在下，将纯化的CD8+T细胞与同种异体LPS-成熟的DC共培养5天。未处理的共培养物(无Tx)，或者用bsIgG1-CD40×ctrl(30μg/mL)、bsIgG1-ctrl×4-1BB(30μg/mL)或IgG1-ctrl-FEAL(30μg/mL)处理的共培养物包括在内作为对照。通过ELISA来分析IFNγ的分泌，并通过Luminex来分析GM-CSF、TNFα、IL-2和IL-6的分泌。显示的数据是在一个实验中测试的4个供体对中一个代表性供体对的重复孔的平均值+标准偏差(SD)。
图24示出了在体外DuoBody-CD40×4-1BB与抗PD-(L)1抗体组合对T细胞增殖的作用。将人CD8+T细胞用编码CLDN6特异性TCR的RNA和编码PD-1的RNA一起电穿孔，并用CFSE标记。然后，在存在或不存在DuoBody-CD40×4-1BB(0.2、0.0067、或0.0022μg/mL)和抗PD-1抗体IgG1-PD1(0.8μg/mL)、派姆单抗(0.8μg/mL)、或纳武单抗(1.6μg/mL)、抗PD-L1抗体阿特珠单抗(0.4μg/mL)或阴性对照抗体IgG1-ctrl-FERR(0.8μg/mL)下，将T细胞与用CLDN6编码RNA电穿孔的iDC共培养4天。通过流式细胞术来分析T细胞中的CFSE稀释，并用其计算扩增指数。示出了测试的四个供体中一个代表性供体的数据。误差棒表示重复孔的SD。点线表示与未用抗体处理的IDC共培养的CD8+T细胞的扩增指数。CFSE＝羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；CLDN6＝密蛋白-6；iDC＝未成熟的树突细胞；PD-(L)1＝程序性细胞死亡蛋白(配体)1；SD＝标准偏差；TCR＝T细胞受体。
图25示出了在体外DuoBody-CD40×4-1BB与抗PD-(L)1抗体组合对细胞因子分泌的作用。如图24中，在存在DuoBody-CD40×4-1BB(0.2、0.0067或0.0022μg/mL)与抗PD-1抗体IgG1-PD1(0.8μg/mL)、派姆单抗(0.8μg/mL)或纳武单抗(1.6μg/mL)、抗PD-L1抗体阿特珠单抗(0.4μg/mL)，或阴性对照抗体IgG1-ctrl-FERR(0.8μg/mL)下，将表达CLDN6特异性TCR和PD-1的人CD8+T细胞与表达CLDN6的iDC共培养4天。通过多重ECLIA来确定上清液中的细胞因子浓度。示出了来自测试的四个供体中一个代表性供体的数据。误差棒表示重复孔的SD。CLDN6＝密蛋白-6；ECLIA＝电化学发光免疫测定；GM-CSF＝粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子；iDC＝未成熟的树突细胞；IFN＝干扰素；IL＝白介素；PD-(L)1＝程序性细胞死亡蛋白(配体)1；SD＝标准偏差；TCR＝T细胞受体；TNF＝肿瘤坏死因子。
图26示出了在体外DuoBody-CD40×4-1BB与抗PD-(L)1抗体组合对T细胞增殖的作用。在存在DuoBody-CD40×4-1BB(0.2μg/mL)和抗PD-1抗体派姆单抗或纳武单抗、或者抗PD-L1抗体阿特珠单抗(均为0.05、0.5或5μg/mL)单独或组合下，或者在存在阴性对照抗体IgG1-ctrl-FEAL(0.2μg/mL)下，将经CellTrace Violet标记的人PBMC用抗CD3抗体(0.09μg/mL)刺激4天。通过流式细胞术来分析CD8+T细胞(图A)和CD4+T细胞(图B)中的CellTraceViolet稀释，并用其计算扩增指数。示出了来自测试的三个供体中的一个代表性供体的数据。误差棒表示一式三份孔的SD。点线表示用IgG1-ctrl-FEAL处理的细胞的扩增指数。虚线表示用单一药剂DuoBody-CD40×4-1BB处理的细胞的扩增指数。PD-(L)1＝程序性细胞死亡蛋白(配体)1；PBMC＝外周血单个核细胞；SD＝标准偏差。
图27示出了在两轮CD3/CD28刺激之后CD3+T细胞的耗竭样表型的表征。(A)通过流式细胞术来确定在体外耗竭的CD3+T细胞上LAG3的表达。示出的数据是针对背景荧光校正的中值荧光强度(ΔMFI)。(B)将体外耗竭的CD3+T细胞与未经处理或存在1μg/mL派姆单抗的同种异体LPS成熟DC共培养。IFNγ的分泌通过AlphaLISA来分析，IL-2的分泌通过多重MSD来分析。显示的数据是在两个实验中测试的两个供体对中一个代表性供体对的重复孔的平均值+标准偏差(SD)。
图28示出了在成熟树突细胞(mDC)和体外耗竭的CD3+T细胞(Tex)的混合淋巴细胞反应(MLR)中，由DuoBody-CD40×4-1BB与派姆单抗组合诱导的IFNγ(A)和IL-2(B)的分泌。在DuoBody-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)或派姆单抗(1μg/mL)单独或组合存在下，将Tex与同种异体LPS成熟DC共培养5天。未处理(无Tx)的共培养物或者用bsIgG1-CD40×ctrl(30μg/mL)、bsIgG1-ctrl×4-1BB(30μg/mL)或IgG1-ctrl-FEAL(30μg/mL)处理的共培养物包括在内作为对照。IFNγ的分泌通过AlphaLISA来分析，并且IL-2的分泌通过多重MSD来分析。显示的数据是在两个实验中测试的两个供体对中一个代表性供体对的重复孔的平均值+标准偏差(SD)。
表1-序列
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具体实施方式
尽管下文更详细地进一步描述了本公开内容，但是应理解，本公开内容不限于本文中所描述的特定的方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述一些特定实施方案的目的，而不旨在限制将仅受所附权利要求书限制的本公开内容的范围。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
在下文中，将更详细地描述本公开内容的要素。这些要素以具体实施方案列出，然而，应理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以形成另外的实施方案。不应将多个描述的实施例和优选实施方案解释为将本公开内容仅限于明确描述的实施方案。本说明书应理解为支持和涵盖将明确描述的实施方案与任何数目的所公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合都应被视为被本申请的说明书公开。例如，如果在本文中使用的结合剂的一个优选实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO：26或34[IgG1-Fc_FEAR]中所示的氨基酸序列，或者基本上由SEQ IDNO：26或34[IgG1-Fc_FEAR]中所示的氨基酸序列组成，或者由在SEQ ID NO：26或34[IgG1-Fc_FEAR]中所示的氨基酸序列组成，并且在本文中使用的结合剂的另一个优选实施方案中，第二重链包含SEQ ID NO：25或33[IgG1-Fc_FEAL]中所示的氨基酸序列，或者基本上由SEQ ID NO：25或33[IgG1-Fc_FEAL]中所示的氨基酸序列组成，或者由在SEQ ID NO：25或33[IgG1-Fc_FEAL]中所示的氨基酸序列组成，则在本文中使用的结合剂的另一个优选实施方案中，第一重链包含SEQ ID NO：26或34[IgG1-Fc_FEAR]中所示的氨基酸序列，或者基本上由在SEQ ID NO：26或34[IgG1-Fc_FEAR]中所示的氨基酸序列组成或者由在SEQ ID NO：26或34[IgG1-Fc_FEAR]中所示的氨基酸序列组成，并且第二重链包含SEQ ID NO：25或33[IgG1-Fc_FEAL]中所示的氨基酸序列，或者基本上由在SEQ ID NO：25或33[IgG1-Fc_FEAL]中所示的氨基酸序列组成，或者由在SEQ ID NO：25或33[IgG1-Fc_FEAL]中所示的氨基酸序列组成。
优选地，本文中使用的术语如
″A multilingual glossary of biotechnological terms：(IUPACRecommendations)″，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel，和H.Eds..Helvetica ChimicaActa，CH-4010Basel，Switzerland，(1995).
中所述定义。
除非另有指出，否则本公开内容的实践将采用本领域文献中阐明的常规化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术(参见，例如
Organikum，Deutscher Verlag der Wissenschaften，Berlin 1990；Streitwieser/Heathcook，″Organische Chemie″，VCH，1990；Beyer/Walter，″Lehrbuchder Organischen Chemie″，S.Hirzel Verlag Stuttgart，1988；Carey/Sundberg，″Organische Chemie″，VCH，1995；March，″Advanced Organic Chemistry″，John Wiley&Sons，1985；Chemie Lexikon，Falbe/Regitz(Hrsg.)，GeorgThieme VerlagStuttgart，New York，1989；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，J.Sambrook et al.eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor1989.
除非本文中另外指明或者与上下文明显矛盾，否则本文中描述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本公开内容，并且不对另外要求保护的本公开内容的范围构成限制。本说明书中的语言均不应被解释为指明对实践本公开内容必需的任何未要求保护的要素。
本文中值的范围的记载仅旨在用作单独引用落入该范围的每个单独值的速记方法。除非本文另外说明，否则每个单独值均被并入说明书中，如同在本文中单独地记载一样。
在本说明书的整个文本中引用了若干文献。无论是上文还是下文，本文中引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)都在此通过引用整体并入。本文中的内容均不应解释为承认本发明无权由于在先发明而先于这样的公开内容。
定义
下面将提供适用于本公开内容的所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其领域公认的含义。
在整个本说明书和随附的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括”以及变化形式将被理解为暗含包括所述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。术语“基本上由......组成”意指排除任何实质意义的其他成员、整数或步骤。术语“包含/包括”涵盖术语“基本上由......组成”，“基本上由......组成”继而又涵盖术语“由......组成”。因此，在本申请中每次出现时，术语“包含/包括”可用术语“基本上由......组成”或“由......组成”代替。同样，在本申请中每次出现时，术语“基本上由......组成”可用术语“由......组成”代替。
除非在本文中另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词及类似的引用解释为覆盖单数和复数二者。
本文中使用的“和/或”被认为是两个指定特征或组分具有或不具有二者中另一者中的每一种的特定公开内容。例如“X和/或Y”被认为是(i)X、(ii)Y以及(iii)X和Y中每一种的特定公开内容，就如同各自单独地在本文中列出一样。
在本公开内容的上下文中，术语“约”表示本领域普通技术人员将理解的精度区间以仍然确保所讨论特征的技术效果。该术语通常表示与指定数值偏差±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％、±0.1％、±0.05％，例如±0.01％。如本领域普通技术人员将理解的，给定技术效果的数值的具体的这样的偏差将取决于技术效果的性质。例如，自然或生物技术效果可通常比人为或工程技术效果具有更大的这样的偏差。
本公开内容上下文中的术语“结合剂”是指能够与期望抗原结合的任何物质。在本公开内容的某些实施方案中，结合剂是抗体、抗体片段或其构建体。结合剂还可包含合成的、经修饰的或非天然存在的部分，特别是非肽部分。这样的部分可例如连接期望的抗原结合官能团或区域，例如抗体或抗体片段。在一个实施方案中，结合剂是包含抗原结合CDR或可变区的合成构建体。
本文中使用的“免疫检查点”是指免疫系统的调节剂，并且特别地是调节抗原的T细胞受体识别的强度(amplitude)和质量的共刺激和抑制性信号。在某些实施方案中，免疫检查点是抑制性信号。在某些实施方案中，抑制性信号是PD-1与PD-L1和/或PD-L2之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是CTLA-4与CD80或CD86之间的相互作用以取代CD28结合。在某些实施方案中，抑制性信号是LAG-3与MHC II类分子之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是TIM-3与其一种或更多种配体，例如半乳凝素9、PtdSer、HMGB1和CEACAM1之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是一种或数种KIR与其配体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是TIGIT与其配体PVR、PVRL2和PVRL3中的一种或更多种之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是CD94/NKG2A与HLA-E之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是VISTA与其结合配偶体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是一种或更多种Siglecs与其配体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是GARP与其一种或更多种配体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是CD47与SIRPα之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是PVRIG与PVRL2之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是CSF1R与CSF1之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是BTLA与HVEM之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是腺苷能途径(adenosinergic pathway)的一部分，例如，A2AR和/或A2BR与由CD39和CD73产生的腺苷之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号是B7-H3与其受体和/或B7-H4与其受体之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制性信号由IDO、CD20、NOX或TDO介导。
本文中使用的术语“检查点抑制剂”(CPI)和“免疫检查点(ICP)抑制剂”是同义的。该术语是指分子，例如结合剂，其全部或部分地降低、抑制、干扰或负调节一种或更多种检查点蛋白，或者全部或部分降低、抑制、干扰或负调节一种或更多种检查点蛋白的表达，如分子，例如结合剂，其抑制免疫检查点，特别地，抑制免疫检查点的抑制性信号。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂与一种或更多种检查点蛋白结合。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂与调节检查点蛋白的一种或更多种分子结合。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂例如在DNA或RNA水平上与一种或更多种检查点蛋白的前体结合。可使用根据本公开内容作为检查点抑制剂发挥作用的任何药剂。本文中使用的术语“部分地”意指至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的水平，例如检查点蛋白的抑制水平。
在一个实施方案中，检查点抑制剂可以是抑制免疫检查点的抑制性信号的任何化合物，例如任何结合剂，其中抑制性信号选自：PD-1与PD-L1和/或PD-L2之间的相互作用；CTLA-4与CD80或CD86之间的相互作用以取代CD28结合；LAG-3与MHC II类分子之间的相互作用；TIM-3与其一种或更多种配体，例如半乳凝素9、PtdSer、HMGB1和CEACAM1之间的相互作用；一种或数种KIR与其配体之间的相互作用；TIGIT与其配体PVR、PVRL2和PVRL3中一种或更多种之间的相互作用。CD94/NKG2A与HLA-E之间的相互作用；VISTA与其结合配偶体之间的相互作用；一种或更多种Siglec与其配体之间的相互作用；GARP与其一种或更多种配体之间的相互作用；CD47与SIRPα之间的相互作用；PVRIG与PVRL2之间的相互作用；CSF1R与CSF1之间的相互作用；BTLA与HVEM之间的相互作用；腺苷能途径的一部分，例如，A2AR和/或A2BR与由CD39和CD73产生的腺苷之间的相互作用；B7-H3与其受体和/或B7-H4与其受体之间的相互作用；由IDO、CD20、NOX或TDO介导的抑制性信号。在一个实施方案中，检查点抑制剂是选自以下中的至少一种：PD-1抑制剂；PD-L1抑制剂；PD-L2抑制剂；CTLA-4抑制剂；TIM-3抑制剂；KIR抑制剂；LAG-3抑制剂；TIGIT抑制剂；VISTA抑制剂和GARP抑制剂。在一个实施方案中，检查点抑制剂可以是阻断抗体，例如PD-1阻断抗体、CTLA4阻断抗体、PD-L1阻断抗体、PD-L2阻断抗体、TIM-3阻断抗体、KIR阻断抗体、LAG-3阻断抗体、TIGIT阻断抗体、VISTA阻断抗体或GARP阻断抗体。PD-1阻断抗体的实例包括派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗和斯巴达珠单抗(spartalizumab)。CTLA4阻断抗体的实例包括伊匹单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)。PD-L1阻断抗体的实例包括阿特珠单抗、度伐单抗(durvalumab)和阿维单抗(avelumab)。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:43的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:44的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含：
(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；
(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；和
(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列；并且
其中所述轻链可变区包含：
(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；和
(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在本文中描述的抗PD-1抗体的一个实施方案中，重链可变结构域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
在一个实施方案中，适用于本文中公开的方法的免疫检查点抑制剂是抑制性信号的拮抗剂，例如靶向例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、B7-H3或B7-H4的抗体。这些配体和受体在Pardoll,D.,Nature.12:252-264,2012.中进行了综述。本文中描述了可根据本公开内容靶向的另外的免疫检查点蛋白。
术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白质，优选涉及抗原受体，例如抗体或B细胞受体(B cell receptor，BCR)。免疫球蛋白的特征在于具有特征性免疫球蛋白(Ig)折叠的结构性结构域(即免疫球蛋白结构域)。该术语涵盖膜结合的免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。膜结合的免疫球蛋白也称为表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，其通常是BCR的一部分。可溶性免疫球蛋白通常称为抗体。
免疫球蛋白的结构已被良好地表征。参见，例如Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989)。简言之，免疫球蛋白通常包含通过二硫键连接的数条链，通常是两条相同的重链和两条相同的轻链。这些链主要由免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白区构成，例如VL或VL(可变轻链)结构域/区、CL或CL(恒定轻链)结构域/区、VH或VH(可变重链)结构域/区以及CH或CH(恒定重链)结构域/区、CH1(CH1)、CH2(CH2)、CH3(CH3)和CH4(CH4)。重链恒定区通常由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。铰链区是重链的CH1与CH2结构域之间的区域，并且具有高度柔性。铰链区中的二硫键是IgG分子中两条重链之间相互作用的部分。每个轻链通常由VL和CL构成。轻链恒定区通常由一个结构域CL构成。VH和VL区可进一步细分为高变区(或高变区，其可以是序列高变的和/或结构上限定的环形式)，也称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(frameworkregion，FR)。每个VH和VL通常由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(另见Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196,901-917(1987))。除非另有说明或与上下文相矛盾，否则本文中的CDR序列是根据IMGT规则使用DomainGapAlign来鉴定的(Lefranc MP.,Nucleic Acids Research1999；27:209-212和Ehrenmann F.,Kaas Q.and Lefranc M.-P.Nucleic Acids Res.,38,D301-307(2010)；另见互联网http地址www.imgt.org)。除非另有说明或与上下文相矛盾，否则本公开内容中关于恒定区中的氨基酸位置是根据EU-编号的(Edelman et al.,ProcNatl Acad Sci USA.1969May；63(1):78-85；Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition.1991 NIH Publication No.91-3242)。
存在五种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链，即α、δ、ε、γ和μ，其是不同种类的抗体(即，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)的原因。与可溶性免疫球蛋白的重链相反，膜或表面免疫球蛋白的重链在其羧基端包含跨膜结构域和短的胞质结构域。在哺乳动物中，有两种类型的轻链，即λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白的不同同种型内是基本上保守的，其中可变部分是高度多样化的并且负责抗原识别。
术语“氨基酸”和“氨基酸残基”在本文中可互换使用，并且不应被理解为限制性的。氨基酸是这样的有机化合物，其含有胺(-NH2)和羧基(-COOH)官能团，以及每个氨基酸特定的侧链(R基团)。在本公开内容的上下文中，氨基酸可基于结构和化学特征进行分类。因此，氨基酸的类别可反映在下表中的一个或两个中：
表2：基于R基团的结构和一般化学特征的主要分类
类别 氨基酸
酸性残基 D和E
碱性残基 K，R，和H
亲水性不带电荷的残基 S，T，N，和Q
脂肪族不带电荷的残基 G，A，V，L，和I
非极性不带电荷的残基 C，M，和P
芳香族残基 F，Y，和W
表3：氨基酸残基的替代物理和功能分类
类别 氨基酸
含羟基的残基 S和T
脂肪族残基 I，L，V，和M
环烯基相关残基 F，H，W，和Y
疏水性残基 A，C，F，G，H，I，L，M，R，T，V，W，和Y
带负电荷的残基 D和E
极性残基 C，D，E，H，K，N，Q，R，S，和T
带正电荷的残基 H，K，和R
小的残基 A，C，D，G，N，P，S，T，和V
非常小的残基 A，G，和S
涉及转角形成的残基 A，C，D，E，G，H，K，N，Q，R，S，P，和T
柔性残基 Q，T，K，S，G，P，D，E，和R
出于本公开内容的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包含氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰的变体、构象体、异构体、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。术语“变体”特别地包括氨基酸序列的片段。
氨基酸插入变体包含在特定氨基酸序列中插入单个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，向氨基酸序列中的特定位点中插入一个或更多个氨基酸残基，但是随机插入并对所产生产物进行合适的筛选也是可以的。
氨基酸添加变体包括一个或更多个氨基酸(例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸)的氨基端和/或羧基端融合。
氨基酸缺失变体的特征在于从序列中除去一个或更多个氨基酸，例如，除去1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。所述缺失可在蛋白质的任何位置中。包含蛋白质N末端和/或C末端缺失的氨基酸缺失变体也被称为N端和/或C端截短变体。
氨基酸替换变体的特征在于序列中的至少一个残基被除去，并且在其位置插入另一残基。一个氨基酸对另一个氨基酸的替换可分类为保守或非保守替换。优先考虑的是修饰发生在氨基酸序列中在同源蛋白质或肽之间非保守的位置中和/或用具有相似特性的另一些氨基酸来替换氨基酸。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸改变为保守氨基酸改变，即，替换带有类似电荷的或不带电荷的氨基酸。保守氨基酸变化涉及其侧链相关联的氨基酸家族之一的替换。在本公开内容的上下文中,“保守替换”是一个氨基酸被另一个具有相似结构和/或化学特征的氨基酸替换，一个氨基酸残基对另一个如上述两个表中的任一个所限定的相同种类的氨基酸残基的这样的替换：例如，亮氨酸可以用异亮氨酸替换，因为它们二者都是脂肪族的、分支的疏水物。类似地，天冬氨酸可以用谷氨酸替换，因为它们二者都是小的带负电荷的残基。天然存在的氨基酸一般可分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时一起被归类为芳香族氨基酸。在一个实施方案中，保守氨基酸替换包括以下组内的替换：
-甘氨酸，丙氨酸；
-缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；
-天冬氨酸，谷氨酸；
-天冬酰胺，谷氨酰胺；
-丝氨酸，苏氨酸；
-赖氨酸，精氨酸；以及
-苯丙氨酸，酪氨酸。
本文中使用的术语“对应于......的位置的氨基酸”以及相似的表述是指人IgG1重链中的氨基酸位置编号。通过与人IgG1比对，可发现其他免疫球蛋白中相应的氨基酸位置。因此，一个序列中“对应于”另一序列中的氨基酸或区段的氨基酸或区段是使用标准序列比对程序(例如通常默认设置的ALIGN、ClustalW或类似程序)与另一氨基酸或区段比对，并且与人IgG1重链具有至少50％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸或区段。如何比对序列或序列中的区段并由此确定序列中对应于根据本公开内容的氨基酸位置的位置在本领域中被认为是公知的。
本公开内容的上下文中术语“抗体”(Ab)是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一种的衍生物，其具有在通常的生理条件下与抗原(特别是抗原上的表位)特异性结合的能力，优选地具有显著时段的半衰期，所述时段例如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更多、约48小时或更多，约3、4、5、6、7或更多天等，或任意其他相关的在功能上限定的时期(例如足以诱导、促进、增强、和/或调节与和抗原结合的抗体相关的生理应答的时间和/或足以使抗体募集效应物活性的时间)。特别地，术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(heavy，H)链和两条轻(light，L)链的糖蛋白。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体以及前述任意的组合。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。可变区和恒定区在本文中也分别称为可变结构域和恒定结构域。VH和VL区可以进一步细分成称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)的高变区，散布有称为框架区(frameworkregion，FR)的更保守的区域。每个VH和VL由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。VH的CDR称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，(或CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)，VL的CDR称为LCDR1、LCDR2和LCDR3(或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。重链和轻链可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区包含重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)，其中CH可以进一步细分成恒定结构域CH1、铰链区以及恒定结构域CH2和CH3(从氨基端到羧基端按以下顺序排列：CH1、CH2、CH3)。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和补体系统的组分，如C1q。抗体可以是来源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体。
免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合区。术语“结合区”和“抗原结合区”在本文中可互换使用，并且是指与抗原相互作用的区域，并且包含VH区和VL区二者。本文中使用的抗体不仅包含单特异性抗体，而且还包括多特异性抗体，其包括多个，例如两个或更多个，例如三个或更多个不同的抗原结合区。
如上所述，除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文中的术语抗体包括是抗原结合片段的抗体片段，即保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段。已表明，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。涵盖在术语“抗体”内的抗原结合片段的实例包括(i)Fab'或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或如WO2007/059782(Genmab)中所述的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)基本上由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward et al.,Nature 341,544-546(1989))，其基本上由VH结构域组成并且也称为结构域抗体(Holt et al；TrendsBiotechnol.2003Nov；21(11):484-90)；(vi)骆驼科或纳米抗体分子(Revets et al；Expert Opin Biol Ther.2005Jan；5(1):111-24)和(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接起来，使得它们能够成为单蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(single chain Fv，scFv)，参见例如Bird et al.,Science 242,423-426(1988)和Huston et al.,PNAS USA85,5879-5883(1988))。除非另有说明或上下文明确指出，否则这样的单链抗体涵盖在术语抗体之内。尽管这样的片段通常被包括在抗体的含义之内，但是它们共同且各自独立地是本公开内容的独特特征，表现出不同的生物学特性和效用。在本公开内容情况下的这些和其他可用的抗体片段以及这样的片段的双特异性形式在本文中进一步讨论。还应理解，除非另有指明，否则术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、抗体样多肽，例如嵌合抗体和人源化抗体，以及通过任意已知技术(例如酶切割、肽合成和重组技术)提供的保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段(抗原结合片段)。
如此产生的抗体可具有任意同种型。本文中使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgD、IgA(如IgA1、IgA2)、IgE、IgM或IgY)。当本文中提及特定同种型例如IgG1时，该术语不限于特定同种型序列例如特定IgG1序列，而是用于指示抗体在序列上更接近该同种型例如IgG1而不是其他同种型。因此，例如本文中公开的IgG1抗体可以是天然存在的IgG1抗体的序列变体，包括恒定区中的变体。
IgG1抗体可以以称为同种异型的多种多态变体存在(在Jefferis和Lefranc2009.mAbs Vol 1Issue 4 1-7中综述)，其中的任一种都适用于本文中的一些实施方案。人群中常见的同种异型变体是由字母a、f、n、z或其组合命名的那些。在本文中的任一实施方案中，抗体可包含含有人IgG Fc区的重链Fc区。在另外的实施方案中，人IgG Fc区包含人IgG1。
本公开内容上下文中的术语“多特异性抗体”是指具有至少两个由不同抗体序列限定的不同抗原结合区的抗体。在一些实施方案中，所述不同的抗原结合区结合相同抗原上的不同表位。然而，在一些优选实施方案中，所述不同的抗原结合区结合不同的靶抗原。在一个实施方案中，所述多特异性抗体是“双特异性抗体”或“bs”。多特异性抗体，例如双特异性抗体可以是任何形式，包括下文中所述的任何双特异性或多特异性抗体形式。
当在抗体的上下文中使用时，术语“全长”表示抗体不是片段，而是包含特定同种型的通常在自然界中发现的该同种型的所有结构域，例如IgG1抗体的VH、CH1、CH2、CH3、铰链、VL和CL结构域。
本文中所使用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和框架区的抗体和具有人免疫蛋白恒定结构域的抗体。本文中所公开的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变、插入或缺失)。然而，本文中使用的术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一非人物种(例如小鼠)种系的CDR序列已接枝到人框架序列上的抗体。
本文中使用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区来源于非人物种(例如，来源于啮齿动物)并且恒定区来源于不同物种例如人的抗体。嵌合抗体可通过抗体工程来产生。“抗体工程”是一般用于不同种类的抗体修饰的术语，并且抗体工程的方法是技术人员公知的。特别地，嵌合抗体可以通过使用如Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning:Alaboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,Ch.15中所述的标准DNA技术产生。因此，嵌合抗体可以是经遗传改造或经酶改造的重组抗体。产生嵌合抗体在技术人员的知识范围内，并因此，嵌合抗体的产生可通过除本文中所述那些之外的其他方法来进行。开发了用于人中治疗性应用的嵌合单克隆抗体，以降低非人抗体(例如啮齿动物抗体)的预期抗体免疫原性。它们通常可包含对目的抗原具有特异性的非人(例如鼠或兔)可变区，以及人恒定抗体重链和轻链结构域。如下所述，在嵌合抗体的情况下使用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链二者的CDR和框架区的区域。
本文中使用的术语“人源化抗体”是指遗传改造的非人抗体，其包含人抗体恒定结构域和被修饰以与人可变结构域具有高水平序列同源性的非人可变结构域。这可通过将一起形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人接纳体框架区(FR)上来实现(参见WO92/22653和EP0629240)。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的框架残基替换为人框架区(回复突变)。结构同源性建模可帮助鉴定框架区中对于抗体的结合特性重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人CDR序列、任选地包含针对非人氨基酸序列的一个或更多个氨基酸回复突变的主要人框架区，以及完全人恒定区。任选地，可应用不一定是回复突变的另外的氨基酸修饰以获得具有优选特征例如亲和力和生物化学特性的人源化抗体。
如本文使用的,“来源于”另一种蛋白质的蛋白质(例如，亲本蛋白质)意指该蛋白质的一个或更多个氨基酸序列与另一种蛋白质或亲本蛋白质中的一个或更多个氨基酸序列相同或相似。例如，在来源于另一种抗体或亲本抗体、结合臂、抗原结合区或恒定区的抗体、结合臂、抗原结合区、恒定区等中，一个或更多个氨基酸序列与另一种抗体或亲本抗体、结合臂、抗原结合区或恒定区的氨基酸序列相同或相似。这样的一个或更多个氨基酸序列的实例包括但不限于VH和VL CDR和/或一个或更多个或所有的框架区、VH、VL、CL、铰链或CH区的那些。例如，人源化抗体在本文中可被描述为“来源于”非人亲本抗体，其意味着至少VL和VH CDR序列与所述非人亲本抗体的VH和VLCDR序列相同或相似。嵌合抗体在本文中可被描述为“来源于”非人亲本抗体，其意味着通常VH和VL序列可以与非人亲本抗体的VH和VL序列相同或相似。另一个实例是结合臂或抗原结合区，其在本文中可被描述为“来源于”特定的亲本抗体，意味着所述结合臂或抗原结合区通常包含与所述亲本抗体的结合臂或抗原结合区相同或相似的VH和/或VLCDR，或VH和/或VL序列。然而，如本文中其它地方所述，可以在CDR、恒定区或抗体中的其它地方、结合臂、抗原结合区等进行氨基酸修饰(如突变)以引入期望的特征。当用于来源于第一蛋白质或亲本蛋白质的一个或更多个序列的情况中时，“相似”氨基酸序列优选具有至少约50％的序列同一性，例如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约97％、98％或99％。
非人抗体可以在许多不同的物种中产生，例如小鼠、兔、鸡、豚鼠、美洲驼(llama)和山羊。
单克隆抗体可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体法，例如，Kohler andMilstein,Nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。可采用其他用于产生单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转化或使用抗体基因文库的噬菌体展示技术，并且这样的方法是本领域技术人员公知的。
在这样的非人物种中的杂交瘤产生是一种非常广泛认可的操作。用于分离经免疫接种动物/非人物种的脾细胞以进行融合的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方案也是已知的。
当在本文中使用时，除非上下文矛盾，否则术语“Fab-臂”或“臂”是指一个重链-轻链对，并且在本文中其与“半分子”可互换使用。
术语“包含抗原结合区的结合臂”意指包含抗原结合区的抗体分子或片段。因此，结合臂可包含例如六个VH和VL CDR序列、VH和VL序列、Fab或Fab’片段或Fab-臂。
当在本文中使用时，除非与上下文相矛盾，否则术语“Fc区”是指由免疫球蛋白重链的两个Fc序列组成的抗体区，其中所述Fc序列包含至少铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，本文中所使用的术语“Fc区”是指在从抗体的N-末端到C-末端的方向上包含至少铰链区、CH2区和CH3区的区域。抗体的Fc区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分)的结合。
在本公开内容的上下文中，与抗体(包括多特异性抗体)相关使用的术语“诱导Fc介导的效应物功能的程度较低”意味着与包含(i)与所述抗体相同的CDR序列，特别是包含相同的第一抗原结合区和第二抗原结合区，和(ii)包含人IgG1铰链区，CH2区和CH3区的两条重链的人IgG1抗体相比，所述抗体诱导Fc-介导的效应物功能的程度较低，这样的功能特别地选自IgG Fc受体(FcgammaR，FcγR)结合、C1q结合、ADCC或CDC的列表。
Fc介导的效应物功能可以通过与FcγR结合、与C1q结合或者经由FcγR诱导Fc介导的交联来测量。
本文中使用的术语“铰链区”是指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如人IgG1抗体的铰链区对应于根据Kabat中所述EU编号(Kabat,E.A.etal.,Sequences of proteinsof immunological interest.5th Edition-US Department of Health and HumanServices,NIH publication No.91-3242,pp662,680,689(1991))的氨基酸216至230。然而，铰链区也可以是本文中所述的任何其他亚型。
本文中使用的术语“CH1区”或“CH1结构域”是指免疫球蛋白重链的CH1区。因此，例如人IgG1抗体的CH1区对应于根据Kabat中所述的EU编号(同上)的氨基酸118至215。然而，CH1区也可以是本文中所述的任何其他亚型。
本文中使用的术语“CH2区”或“CH2结构域”是指免疫球蛋白重链的CH2区。因此，例如人IgG1抗体的CH2区对应于根据Kabat中所述EU编号(同上)的氨基酸231至340。然而，CH2区也可以是本文中所述的任何其他亚型。
本文中使用的术语“CH3区”或“CH3结构域”是指免疫球蛋白重链的CH3区。因此，例如人IgG1抗体的CH3区对应于根据Kabat中所述EU编号(同上)的氨基酸341至447。然而，CH3区也可以是本文中所述的任何其他亚型。
在本公开内容的上下文中，术语“单价抗体”意指抗体分子能够结合单个抗原分子，并因此不能够交联抗原。
“CD40抗体”或“抗CD40抗体”是如上所述的抗体，其与抗原CD40特异性结合。
“CD137抗体”或“抗CD137抗体”是如上所述的抗体，其与抗原CD137特异性结合。
“CD40xCD137抗体”或“抗CD40xCD137抗体”是双特异性抗体，其包含两个不同的抗原结合区，其中一个与抗原CD40特异性结合，另一个与抗原CD137特异性结合。
如本文所使用的术语“结合”或“能够结合”在抗体与预定抗原或表位结合的情况下，通常是当使用生物层干涉术(Bio-Layer Interferometry，BLI)确定时，或者例如当使用表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)技术在BIAcore 3000仪器中使用抗原作为配体并且抗体作为分析物确定时，以对应于约10-7M或更小(例如约10-8M或更小，例如约10-9M或更小，约10-10M或更小，或约10-11M或甚至更小)的KD的亲和力的结合。抗体以对应于以下KD的亲和力与预定抗原结合：比其与除预定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的KD低至少10倍，例如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。亲和力高出的量取决于抗体的KD，因此当抗体的KD非常低时(即，抗体是高度特异性的)，则针对抗原的亲和力低于针对非特异性抗原的亲和力的程度可以是至少10,000倍。
本文中使用的术语“kd”(秒-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为koff值。
本文中使用的术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
如果两种抗体与相同的抗原和相同的表位结合，则它们具有“相同的特异性”。待测抗体是否与某种抗原-结合抗体识别相同的表位，即抗体是否与相同的表位结合，可以通过本领域技术人员公知的不同方法进行测试。
可通过交叉阻断测定来检测抗体之间的竞争。例如，竞争性ELISA测定可用作交叉阻断测定。例如，可将靶抗原包被在微量滴定板的孔上，并且可添加抗原结合抗体和候选竞争测试抗体。与孔中抗原结合的抗原结合抗体的量与和其竞争与相同表位结合的候选竞争测试抗体的结合能力间接相关。具体地，候选竞争性测试抗体对相同表位的亲和力越大，则与抗原包被孔结合的抗原结合抗体的量就越小。与孔结合的抗原结合抗体的量可通过用可检测或可测量的标记物质标记抗体来测量。
与另一种抗体(例如包含如本文中所述的重链和轻链可变区的抗体)竞争与抗原结合的抗体，或对另一种抗体(例如包含如本文中所述的重链和轻链可变区的抗体)的抗原具有特异性的抗体可以是包含如本文中所述的所述重链和/或轻链可变区的变体(例如如本文中所述的CDR中的修饰和/或一定程度的同一性)的抗体。
本文使用的“分离的多特异性抗体”旨在是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的多特异性抗体(例如，与CD40和CD137特异性结合的分离的双特异性抗体，其基本上不含与CD40或CD137特异性结合的单特异性抗体)。
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制备物(preparation)。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一的结合特异性和亲和力。
当在本文中使用时，术语“第一CH3区与第二CH3区之间的异二聚体相互作用”是指在第一CH3/第二CH3异二聚体抗体中的第一CH3区与第二CH3区之间的相互作用。
当在本文中使用时，术语“第一CH3区与第二CH3区的同二聚体相互作用”是指在第一CH3/第一CH3同二聚体抗体中的第一CH3区与另一个第一CH3区之间的相互作用以及在第二CH3/第二CH3同二聚体抗体中的第二CH3区与另一个第二CH3区之间的相互作用。
当在本文中使用时，术语“同二聚体抗体”是指包含两个第一Fab-臂或半分子的抗体，其中所述Fab-臂或半分子的氨基酸序列是相同的。
当在本文中使用时，术语“异二聚体抗体”是指包含第一和第二Fab-臂或半分子的抗体，其中所述第一和第二Fab-臂或半分子的氨基酸序列是不同的。特别地，CH3区或抗原结合区，或者CH3区与所述第一Fab臂/半分子和第二Fab臂/半分子的抗原结合区是不同的。
术语“还原条件”或“还原环境”是指这样的条件或环境，在其中底物(例如抗体铰链区中的半胱氨酸残基)，更可能被还原而不是被氧化。
本公开内容还描述了多特异性抗体，例如双特异性抗体，其包含实施例的双特异性抗体的VL区、VH区、或者一个或更多个CDR的功能性变体。在双特异性抗体的情况下，使用的VL、VH或CDR的功能变体仍然允许双特异性抗体的每个抗原结合区保留亲本双特异性抗体的至少相当大比例(至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的亲和力和/或特异性/选择性，并且在一些情况下，这样的双特异性抗体可比亲本双特异性抗体具有更大的亲和力、选择性和/或特异性。
这样的功能性变体通常保留与亲本双特异性抗体的显著序列同一性。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数(即，同源性％＝相同位置的#/位置的总#×100)，考虑到空位的数量和每个空位的长度，空位需要引入以实现两个序列的最佳比对。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性可例如使用已并入到ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci 4,11-17(1988)的算法，使用PAM120加权残基表(weight residue table)、为12的空位长度罚分以及为4的空位罚分来确定。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48,444-453(1970)算法来确定。
在本公开内容的上下文中，除非另有说明，否则以下符号用于描述突变：i)在给定位置的氨基酸替换被写为例如K409R，这意指在蛋白质第409位的赖氨酸被精氨酸替换；和ii)对于特定变体，使用特定的三字母代码或单字母代码，包括代码Xaa和X以表示任何氨基酸残基。因此，在第409位用精氨酸替换赖氨酸被命名为：K409R，并且在第409位用任何氨基酸残基替换赖氨酸被命名为K409X。第409位赖氨酸缺失的情况用K409*表示。
示例性变体包括主要通过保守替换而与亲本序列的VH和/或VL和/或CDR不同的变体；例如，变体中的12个，例如11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个替换是保守氨基酸残基替换。
在本公开内容的上下文中，保守替换可被限定为如表2和3中限定的氨基酸类别内的替换。
本文中使用的术语“CD40”是指CD40，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5(tumor necrosis factor receptor superfamily member 5，TNFRSF5)，其是配体TNFSF5/CD40L的受体。已知CD40转导TRAF6介导的信号和MAP3K8介导的信号，其激活巨噬细胞和B细胞中的ERK，导致诱导B细胞的免疫球蛋白分泌。对于CD40使用的其他同义词，包括但不限于B细胞表面抗原CD40、Bp50、CD40L受体和CDw40。在一个实施方案中，CD40是人CD40，其具有UniProt登录号P25942。人CD40的序列也在SEQ ID NO:35中示出。SEQ ID NO:35的1至20位的氨基酸对应于人CD40的信号肽；而SEQ ID NO:35的21至193位的氨基酸对应于人CD40的胞外结构域；和蛋白质的其余部分；即来自SEQ ID NO:35的194至215位和216至277位的氨基酸分别是跨膜结构域和胞质结构域。
本文使用的术语“CD137”是指CD137(4-1BB)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)，其是配体TNFSF9/4-1BBL的受体。CD137(4-1BB)被认为参与T细胞活化。CD137的其他同义词包括但不限于4-1BB配体受体、CDw137、T细胞抗原4-1BB同源物和T细胞抗原ILA。在一个实施方案中，CD137(4-1BB)是人CD137(4-1BB)，其具有UniProt登录号Q07011。人CD137的序列也在SEQ ID NO:37中示出。SEQ ID NO:37的1至23位的氨基酸对应于人CD137的信号肽；而SEQ ID NO:37的24至186位的氨基酸对应于人CD137的胞外结构域；和蛋白质的其余部分，即来自SEQ ID NO:37的187至213位和214至255位的氨基酸分别是跨膜结构域和胞质结构域。
“程序性死亡-1(Programmed Death-1，PD-1)”受体是指属于CD28家族的免疫抑制性受体。PD-1(也称作CD279)主要在体内先前活化的T细胞上表达，并与两种配体PD-L1(也称作B7-H1或CD274)和PD-L2(也称作B7-DC或CD273)结合。本文中使用的术语“PD-1”包括人PD-1(hPD-1)，hPD-1的变体、同种型和物种同源物，以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。人PD-1的序列也在SEQ ID NO:39中示出。“程序性死亡配体1(Programmed DeathLigand-1，PD-L1)”是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种是PD-L2)，其在与PD-1结合之后下调T细胞活化和细胞因子分泌。本文中使用的术语“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)，hPD-L1的变体、同种型和物种同源物(例如猕猴(食蟹猴)、亚洲象、野猪和小鼠PD-L1(参见，分别例如Genbank登录号NP_054862.1、XP_005581836、XP_003413533、XP_005665023和NP_068693)，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。人PD-L1的序列也在SEQ IDNO:40中示出，其中预测1至18位的氨基酸为信号肽。猕猴(食蟹猴)PD-L1的序列也在SEQ IDNO:41中示出，其中预测1至18位的氨基酸为信号肽。本文中使用的术语“PD-L2”包括人PD-L2(hPD-L2)，hPD-L2的变体、同种型和物种同源物，以及与hPD-L2具有至少一个共同表位的类似物。PD-1的配体(PD-L1和PD-L2)在抗原呈递细胞(例如树突细胞或巨噬细胞)以及其他免疫细胞的表面上表达。PD-1与PD-L1或PD-L2的结合导致T细胞活化的下调。表达PD-L1和/或PD-L2的癌细胞能够关闭T细胞表达PD-1，其导致抗癌免疫应答的抑制。PD-1与其配体之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖降低以及癌细胞的免疫逃避。免疫抑制可通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用来逆转，并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，这种作用是累加的。
“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T Lymphocyte AssociatedAntigen-4，CTLA-4)”(也被称为CD152)是T细胞表面分子，并且是免疫球蛋白超家族的成员。该蛋白质通过与CD80(B7-1)和CD86(B7-2)结合来下调免疫系统。本文中使用的术语“CTLA-4”包括人CTLA-4(hCTLA-4)，hCTLA-4的变体、同种型和物种同源物，以及与hCTLA-4具有至少一个共同表位的类似物。CTLA-4是刺激性检查点蛋白CD28的同源物，对CD80和CD86具有高得多的结合亲和力。CTLA4在活化的T细胞表面表达，并且其配体在专职抗原呈递细胞表面上表达。CTLA4与其配体的结合阻止CD28的共刺激信号并产生抑制性信号。因此，CTLA-4下调T细胞活化。人CTLA-4的序列也在SEQ ID NO:42中示出。
“具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体”(T cell Immunoreceptor with Ig andITIM domain，TIGIT，也被称为WUCAM或Vstm3)是T细胞和自然杀伤(Natural Killer，NK)细胞上的免疫受体，并与在DC、巨噬细胞等上的PVR(CD155)和PVRL2(CD112；连接蛋白-2)和PVRL3(CD113；连接蛋白-3)结合并调节T细胞介导的免疫。本文中使用的术语“TIGIT”包括人TIGIT(hTIGIT)，hTIGIT的变体、同种型和物种同源物，以及与hTIGIT具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“PVR”包括人PVR(hPVR)，hPVR的变体、同种型和物种同源物，以及与hPVR具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“PVRL2”包括人PVRL2(hPVRL2)，hPVRL2的变体、同种型和物种同源物，以及与hPVRL2具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“PVRL3”包括人PVRL3(hPVRL3)，hPVRL3的变体、同种型和物种同源物，以及与hPVRL3具有至少一个共同表位的类似物。
“B和T淋巴细胞弱化子”(B and T Lymphocyte Attenuator，BTLA，也被称为CD272)是在Th1(而非Th2细胞)中表达的TNFR家族成员。BTLA表达在T细胞活化期间被诱导，并且特别地在CD8+T细胞表面表达。本文中使用的术语“BTLA”包括人BTLA(hBTLA)，hBTLA的变体、同种型和物种同源物，以及与hBTLA具有至少一个共同表位的类似物。BTLA表达在人CD8+T细胞分化为效应细胞表型期间逐渐被下调。肿瘤特异性人CD8+T细胞表达高水平的BTLA。BTLA与“疱疹病毒进入介质”(Herpesvirus entry mediator，HVEM，也被称为TNFRSF14或CD270)结合并参与T细胞抑制。本文中使用的术语“HVEM”包括人HVEM(hHVEM)，hHVEM的变体、同种型和物种同源物，以及与hHVEM具有至少一个共同表位的类似物。BTLA-HVEM复合物负调节T细胞免疫应答。
“杀伤细胞免疫球蛋白样受体”(Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor，KIR)是NK T细胞和NK细胞上MHC I类分子的受体，参与健康细胞和病变细胞之间的区分。KIR与人白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)A、B和C结合，抑制正常的免疫细胞活化。本文中使用的术语“KIR”包括人KIR(hKIR)，hKIR的变体、同种型和物种同源物，以及与hKIR具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“HLA”包括HLA的变体、同种型和物种同源物，以及与HLA具有至少一个共同表位的类似物。如本文中所用，KIR特别是指KIR2DL1、KIR2DL2和/或KIR2DL3。
“淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte Activation Gene-3，LAG-3)”(也被称为CD223)是通过与MHC II类分子结合而与淋巴细胞活性的抑制相关的抑制性受体。该受体增强Treg细胞的功能并抑制CD8+效应T细胞功能，导致免疫应答的抑制。LAG-3在活化的T细胞、NK细胞、B细胞和DC上表达。本文中使用的术语“LAG-3”包括人LAG-3(hLAG-3)，hLAG-3的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。
“T细胞膜蛋白-3(T Cell Membrane Protein-3，TIM-3)”(也被称为HAVcr-2)是通过抑制Th1细胞应答参与淋巴细胞活性的抑制的抑制性受体。其配体是在多种类型的癌症中上调的半乳凝素9(galectin 9，GAL9)。其他TIM-3配体包括磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PtdSer)、高速泳动族蛋白1(High Mobility Group Protein 1，HMGB1)和癌胚抗原相关细胞黏附分子1(Carcinoembryonic Antigen Related Cell Adhesion Molecule 1，CEACAM1)。本文中使用的术语“TIM-3”包括人TIM3(hTIM-3)，hTIM-3的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“GAL9”包括人GAL9(hGAL9)，hGAL9的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“PdtSer”包括变体和具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“HMGB1”包括人HMGB1(hHMGB1)，hHMGB1的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“CEACAM1”包括人CEACAM1(hCEACAM1)，hCEACAM1的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。
“CD94/NKG2A”是主要在自然杀伤细胞和CD8+T细胞的表面上表达的抑制性受体。本文中使用的术语“CD94/NKG2A”包括人CD94/NKG2A(hCD94/NKG2A)，hCD94/NKG2A的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。CD94/NKG2A受体是包含CD94和NKG2A的异二聚体。其可通过与配体(例如HLA-E)结合来抑制NK细胞活化和CD8+T细胞功能。CD94/NKG2A限制自然杀伤细胞(NK细胞)、自然杀伤T细胞(NK-T细胞)和T细胞(α/β和γ/δ)的细胞因子释放和细胞毒性应答。NKG2A经常在肿瘤浸润细胞中表达，而HLA-E在数种癌症中过表达。
“吲哚胺2,3-双加氧酶”(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)是具有免疫抑制特性的色氨酸分解代谢酶。本文中使用的术语“IDO”包括人IDO(hIDO)，hIDO的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。IDO是色氨酸降解的限速酶，催化其转化为犬尿酸原。因此，IDO参与必需氨基酸的耗竭。已知其参与抑制T细胞和NK细胞，产生和活化Treg和髓源性抑制子细胞，以及促进肿瘤血管生成。IDO在许多癌症中过表达，并且表明IDO促进肿瘤细胞的免疫系统逃逸，并且当被局部炎症诱导时促进慢性肿瘤进展。
如本文中所用，在“腺苷能途径”或“腺苷信号传导途径”中，ATP被外核苷酸酶CD39和CD73转化为腺苷，导致通过腺苷与一种或更多种抑制性腺苷受体“腺苷A2A受体”(Adenosine A2AReceptor，A2AR，也被称为ADORA2A)和“腺苷A2B受体”(Adenosine A2BReceptor，A2BR，也被称为ADORA2B)的结合的抑制性信号传导。腺苷是具有免疫抑制特性的核苷，并且在肿瘤微环境中以高浓度存在，限制免疫细胞浸润、细胞毒性和细胞因子产生。因此，腺苷信号传导是癌细胞避免宿主免疫系统清除的一种策略。通过A2AR和A2BR的腺苷信号传导是由通常存在于肿瘤微环境中的高腺苷浓度激活的癌症治疗重要检查点。CD39、CD73、A2AR和A2BR由大多数免疫细胞表达，包括T细胞、不变自然杀伤细胞、B细胞、血小板、肥大细胞和嗜酸性粒细胞。通过A2AR和A2BR的腺苷信号传导抵消了T细胞受体介导的免疫细胞活化，并导致Treg数量提高，DC和效应T细胞活化降低。本文中使用的术语“CD39”包括人CD39(hCD39)，hCD39的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“CD73”包括人CD73(hCD73)，hCD73的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“A2AR”包括人A2AR(hA2AR)，hA2AR的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“A2BR”包括人A2BR(hA2BR)，hA2BR的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。
“T细胞活化的V结构域Ig抑制子”(V-domain Ig suppressor of T cellactivation，VISTA，也被称为C10orf54)与PD-L1具有同源性，但显示出限制于造血区室的独特表达模式。本文中使用的术语“VISTA”包括人VISTA(hVISTA)，hVISTA的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。VISTA诱导T细胞抑制并由肿瘤内的白细胞表达。
“唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素”(Sialic acid binding immunoglobulintype lectin，Siglec)家族成员识别唾液酸并参与区分“自身”和“非自身”。本文中使用的术语“Siglec”包括人Siglec(hSiglec)，hSiglec的变体、同种型和物种同源物，以及与一种或更多种hSiglec具有至少一个共同表位的类似物。人基因组包含14个Siglec，其中数个参与免疫抑制，包括但不限于Siglec-2、Siglec-3、Siglec-7和Siglec-9。Siglec受体结合含有唾液酸的聚糖，但在其识别唾液酸残基的连接区域化学和空间分布方面是不同的。家庭成员也有不同的表达模式。多种恶性肿瘤过表达一种或更多种Siglec。
“CD20”是在B细胞和T细胞表面上表达的抗原。CD20的高表达可见于癌症，例如B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和黑素瘤癌症干细胞。本文中使用的术语“CD20”包括人CD20(hCD20)，hCD20的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。
“糖蛋白A为主的重复序列”(Glycoprotein Arepetitions predominant，GARP)在免疫耐受和肿瘤逃逸患者免疫系统的能力中发挥作用。本文中使用的术语“GARP”包括人GARP(hGARP)，hGARP的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。GARP在淋巴细胞上表达，包括外周血中的Treg和肿瘤部位的肿瘤浸润T细胞。其可与潜在的“转化生长因子β”(transforming growth factorβ，TGF-β)结合。Treg细胞中GARP信号传导的中断导致耐受性降低并抑制Treg向肠道的迁移和细胞毒性T细胞的增殖提高。
“CD47”是与配体“信号调节蛋白α”(signal-regulatory protein alpha，SIRPα)结合的跨膜蛋白。本文中使用的术语“CD47”包括人CD47(hCD47)，hCD47的变体、同种型和物种同源物，以及与hCD47具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“SIRPα”包括人SIRPα(hSIRPα)，hSIRPα的变体、同种型和物种同源物，以及与hSIRPα具有至少一个共同表位的类似物。CD47信号传导参与一系列细胞过程，包括凋亡、增殖、黏附和迁移。CD47在许多癌症中过表达，并用作对巨噬细胞的“别吃我(don't eat me)”信号。通过抑制性抗CD47或抗SIRPα抗体阻断CD47信号传导，使得巨噬细胞能够吞噬癌细胞并促进癌症特异性T淋巴细胞的活化。
“含有脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域”(poliovirus receptorrelated immunoglobulin domain containing，PVRIG，也被称为CD112R)与“脊髓灰质炎病毒受体相关2”(Poliovirus receptor-related 2，PVRL2)结合。PVRIG和PVRL2在许多癌症中过表达。PVRIG表达还诱导TIGIT和PD-1表达，并且PVRL2和PVR(一种TIGIT配体)在数种癌症中共同过表达。阻断PVRIG信号传导途径会导致T细胞功能和CD8+T细胞应答的提高，并从而降低免疫抑制和提高干扰素应答。本文中使用的术语“PVRIG”包括人PVRIG(hPVRIG)，hPVRIG的变体、同种型和物种同源物，以及与hPVRIG具有至少一个共同表位的类似物。如本文中所用，“PVRL2”包括如上定义的hPVRL2。
“集落刺激因子1”(colony-stimulating factor 1，CSF1)途径是根据本公开内容可被靶向的另一个检查点。CSF1R是结合CSF1的髓样生长因子受体。阻断CSF1R信号传导可在功能上对巨噬细胞应答进行重编程，从而增强抗原呈递和抗肿瘤T细胞应答。本文中使用的术语“CSF1R”包括人CSF1R(hCSF1R)，hCSF1R的变体、同种型和物种同源物，以及与hCSF1R具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“CSF1”包括人CSF1(hCSF1)，hCSF1的变体、同种型和物种同源物，以及与hCSF1具有至少一个共同表位的类似物。
“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH氧化酶”是指产生免疫抑制活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)的髓系细胞的NOX家族酶的酶。已发现五种NOX酶(NOX1至NOX5)参与癌症发展和免疫抑制。升高的ROS水平在几乎所有癌症中都检测到，并促进肿瘤发展和进展的许多方面。NOX产生的ROS会抑制NK和T细胞的功能，并且抑制髓样细胞中的NOX改善相邻NK细胞和T细胞的抗肿瘤功能。本文中使用的术语“NOX”包括人NOX(hNOX)，hNOX的变体、同种型和物种同源物，以及与hNOX具有至少一个共同表位的类似物。
根据本公开内容可被靶向的另一个免疫检查点是由“色氨酸-2,3-双加氧酶”(tryptophan-2,3-dioxygenase，TDO)介导的信号。TDO表示色氨酸降解中IDO的替代途径，并参与免疫抑制。由于肿瘤细胞可通过TDO而不是IDO分解代谢色氨酸，因此TDO可代表检查点阻断的另外的靶标。实际上，已发现数种癌细胞系上调TDO，并且TDO可补充IDO抑制。本文中使用的术语“TDO”包括人TDO(hTDO)，hTDO的变体、同种型和物种同源物，以及与hTDO具有至少一个共同表位的类似物。
许多免疫检查点受特定受体与配体对之间的相互作用(例如上述那些)调节。因此，免疫检查点蛋白介导免疫检查点信号传导。例如，检查点蛋白直接或间接调节T细胞活化、T细胞增殖和/或T细胞功能。癌细胞经常利用这些检查点途径来保护其免受免疫系统的攻击。因此，检查点蛋白的功能通常是调节T细胞活化、T细胞增殖和/或T细胞功能。免疫检查点蛋白因此调节和维持自身耐受性以及生理免疫应答的持续时间和强度。许多免疫检查点蛋白属于B7:CD28家族或肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族，并且通过与特定配体结合，激活被募集到胞质结构域的信号传导分子(Suzuki etal.,2016,Jap J Clin Onc,46:191-203)。
本文中使用的术语“功能失调”是指处于对抗原刺激的免疫应答性降低的状态的免疫细胞。功能失调包括对抗原识别无应答以及将抗原识别转化成下游T细胞效应物功能的能力受损，所述功能例如增殖、细胞因子产生(例如，IL-2)和/或靶细胞杀伤。
本文中使用的术语“无反应性”是指由于通过T细胞受体(T cell receptor，TCR)递送的信号不完整或不足导致对抗原刺激无应答的状态。在没有共刺激的情况下，用抗原刺激时也会导致T细胞无反应性，导致即使在共刺激的情况下，细胞也难以被抗原随后激活。无应答状态通常会被IL-2的存在所覆盖。无反应性T细胞不会进行克隆扩增和/或获得效应物功能。
本文中使用的术语“耗竭”是指免疫细胞耗竭，例如作为在许多慢性感染和癌症期间发生的持续TCR信号传导引起的T细胞功能障碍状态的T细胞耗竭。其与无反应性的区别在于，其不是通过不完整或不充分的信号传导产生的，而是由于持续的信号传导产生的。耗竭由不良的效应物功能、抑制性受体的持续表达和不同于功能性效应子或记忆T细胞的转录状态定义。耗竭阻止对疾病(例如感染和肿瘤)的最佳控制。耗竭可由外在负调节途径(例如免疫调节细胞因子)以及细胞内在负调节途径(抑制性免疫检查点途径，例如本文中所述)引起。
“增强T细胞功能”意指诱导、引起或刺激T细胞具有持续的或放大的生物学功能，或者更新或再活化已耗竭或失活的T细胞。增强T细胞功能的实例包括：相对于干预之前的该水平，来自CD8+T细胞的γ-干扰素分泌提高、增殖提高、抗原应答性(例如肿瘤清除)提高。在一个实施方案中，增强水平为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％或更多。测量这种增强的方式是本领域普通技术人员已知的。
本文中使用的术语“抑制性核酸”或“抑制性核酸分子”是指完全或部分降低、抑制、干扰或负调节一种或更多种检查点蛋白的核酸分子，例如DNA或RNA。抑制性核酸分子包括但不限于寡核苷酸、siRNA、shRNA、反义DNA或RNA分子以及适配体(例如，DNA或RNA适配体)。
本文中使用的术语“寡核苷酸”是指能够降低蛋白质表达(特别是检查点蛋白的表达，例如本文中所述的检查点蛋白的表达)的核酸分子。寡核苷酸是短的DNA或RNA分子，通常包含2至50个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的。检查点抑制剂寡核苷酸可以是反义寡核苷酸。
反义寡核苷酸是与给定序列互补，特别是与检查点蛋白的核酸序列(或其片段)的序列互补的单链DNA或RNA分子。反义RNA通常用于通过与所述mRNA结合来阻止mRNA，例如编码检查点蛋白的mRNA的蛋白质翻译。反义DNA通常用于靶向特定的互补(编码或非编码)RNA。如果发生结合，则这样的DNA/RNA杂交体可被酶RNase H降解。此外，吗啉代反义寡核苷酸可用于脊椎动物的基因敲除。例如，Kryczek et al.,2006(J Exp Med,203:871-81)设计了B7-H4特异性的吗啉代，其特异性阻断巨噬细胞中B7-H4的表达，导致具有肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)特异性T细胞的小鼠中T细胞增殖提高以及肿瘤体积降低。
术语“siRNA”或“小干扰RNA”或“小抑制性RNA”在本文中可互换使用并且是指具有20至25个碱基对的典型长度的双链RNA分子，其干扰具有互补核苷酸序列的特定基因，例如编码检查点蛋白的基因的表达。在一个实施方案中，siRNA干扰mRNA，因此阻断翻译，例如免疫检查点蛋白的翻译。外源siRNA的转染可用于基因敲低，然而效果可能只是暂时的，尤其是在快速分裂的细胞中。可例如通过RNA修饰或通过使用表达载体来实现稳定转染。用于使siRNA稳定转染细胞的可用修饰和载体是本领域已知的。还可修饰siRNA序列以在两条链之间引入短环，从而产生“小发夹RNA”或“shRNA”。shRNA可被Dicer加工成功能性siRNA。shRNA具有相对较低的降解率和周转率。因此，免疫检查点抑制剂可以是shRNA。
本文中使用的术语“适配体”是指能够结合靶分子(例如多肽)的通常长度为25至70个核苷酸的单链核酸分子，例如DNA或RNA。在一个实施方案中，适配体与免疫检查点蛋白，例如本文中所述的免疫检查点蛋白结合。例如，根据本公开内容的适配体可与免疫检查点蛋白或多肽特异性结合，或者与调节免疫检查点蛋白或多肽表达的信号传导途径中的分子特异性结合。适配体的产生和治疗性用途是本领域公知的(参见，例如，US 5,475,096)。
术语“小分子抑制剂”或“小分子”在本文中可互换使用，并且是指低分子量有机化合物，通常高至1000道尔顿，其全部或部分降低、抑制、干扰或负调节一个或更多个如上所述的检查点蛋白。这样的小分子抑制剂通常是通过有机化学合成的，但也可从天然来源(例如，植物、真菌和微生物)中分离。小分子量允许小分子抑制剂迅速扩散穿过细胞膜。例如，本领域已知的多种A2AR拮抗剂是具有低于500道尔顿的分子量的有机化合物。
术语“基于细胞的治疗”是指将表达免疫检查点抑制剂的细胞(例如，T淋巴细胞、树突细胞或干细胞)移植到对象中以用于治疗疾病或障碍(例如，癌症疾病)的目的。
本文中使用的术语“溶瘤病毒”是指能够在体外或体内选择性地在癌细胞或过度增殖细胞中复制并减缓其生长或诱导其死亡，同时对正常细胞没有影响或影响很小的病毒。用于递送免疫检查点抑制剂的溶瘤病毒包含可编码免疫检查点抑制剂的表达盒，所述免疫检查点抑制剂是抑制性核酸分子，例如siRNA、shRNA、寡核苷酸、反义DNA或RNA、适配体、抗体或其片段或者可溶性免疫检查点蛋白或融合物。溶瘤病毒优选具有复制能力并且表达盒在病毒启动子(例如，合成的早期/晚期痘病毒启动子)的控制下。示例性溶瘤病毒包括水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)、弹状病毒(例如，小核糖核酸病毒，例如塞内加谷病毒(Seneca Valley virus)；SVV-001)、柯萨奇病毒、细小病毒、新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV；OncoVEX GMCSF)、逆转录病毒(例如流感病毒)、麻疹病毒、呼肠孤病毒、辛德比斯病毒(Sinbis virus)、痘苗病毒，如WO 2017/209053中示例性所述(包括Copenhagen、WesternReserve、Wyeth毒株)以及腺病毒(例如，δ-24、δ-24-RGD、ICOVIR-5、ICOVIR-7、Onyx-015、ColoAd1、H101、AD5/3-D24-GMCSF)。包含可溶形式的免疫检查点抑制剂的重组溶瘤病毒的产生及其使用方法公开于WO 2018/022831中，其通过引用整体并入本文。溶瘤病毒可用作减毒病毒。
“治疗周期”在本文中被定义为在因其药效学而增加的单独剂量的结合剂的影响范围内的时间段，或者换言之，是对象身体内所施用的结合剂基本上清除之后的时间段。在小时间窗内(例如在2至24数小时内，如2至12小时或在同一天)的多次小剂量可能等于较大的单次剂量。
在本发明上下文中，术语“治疗”及其变化形式或“治疗性干预”涉及出于对抗病症(例如疾病或障碍)的目的对对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应理解为出于对抗疾病、病症或障碍目的的对个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以防止症状或并发症的发作。在一个实施方案中，“治疗”是指出于减轻、改善、阻止、或根除(治愈)症状或疾病状态的目的，施用有效量的本公开内容的治疗活性结合剂，例如治疗活性抗体。
对用本公开内容的结合剂治疗的抗性、无响应和/或复发可根据实体瘤响应评价标准1.1版本(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors version 1.1，RECISTCriteria v1.1)来确定。RECIST标准在下表中示出(LD(longest dimension)：最长尺寸)。
表4：响应的定义(RECIST标准v1.1)
“最佳总体响应”是从治疗开始直至疾病进展/复发记录的最佳响应(自治疗开始以来所记录的最小测量值将用作PD的参考)。具有CR或PR的对象被认为是客观响应。具有CR、PR或SD的对象被认为处于疾病控制中。具有NE的对象被视为无响应者。最佳总体响应是从治疗开始直至疾病进展/复发记录的最佳响应(自治疗开始以来所记录的最小测量值将用作PD的参考)。具有CR、PR或SD的对象被认为处于疾病控制中。具有NE的对象被视为无响应者。
“响应持续时间(duration of response，DOR)”仅适用于所确认最佳总响应为CR或PR的对象，并且其被定义为从第一次记录客观肿瘤响应(CR或PR)到第一次PD或者到因潜在癌症死亡的日期的时间。
“无进展存活(progression-free survival，PFS)”被定义为从第1周期的第1天到第一次记录的进展或者到因任何原因而导致死亡的天数。
“总存活(overall survival，OS)”被定义为从第1周期第1天到因任何原因而导致死亡的天数。如果不知道对象已经死亡，那么将在已知对象存活的最晚日期(截止日期当天或之前)删失OS。
在本公开内容的上下文中，术语“治疗方案”是指设计的以改善和保持健康的结构化治疗计划。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指在所需的剂量下和时段内有效实现期望治疗结果的量。结合剂(例如抗体，如多特异性抗体或单克隆抗体)的治疗有效量可根据个体因素(诸如疾病状态、年龄、性别和体重)以及结合剂在个体中引发期望响应的能力而变化。治疗有效量也是其中结合剂或其片段的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。在初始剂量下患者中的反应不充分的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现有效地更高的剂量)。在一定剂量的患者出现不期望的副作用的情况下，可以使用更低的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现有效地更低剂量的施用)。
如本文所使用，术语“癌症”包括以异常调节的细胞生长、增殖、分化、黏附和/或迁移为特征的疾病。“癌细胞”意指通过迅速、不受控制的细胞增殖而生长并且在引发新生长的刺激停止之后继续生长的异常细胞。
根据本公开内容的术语“癌症”包括白血病、精原细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renal cancer)、尿路上皮癌、肾上腺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌(stomach cancer)、肠癌、头颈癌、胃癌(gastriccancer)、胃肠癌、淋巴结癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、阴茎癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移。其一些实例是肺癌、乳房癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌，或者上述癌症类型或肿瘤的转移。
根据本公开内容的术语“癌症”还包括癌症转移。“转移”意指癌细胞从其原始部位扩散到机体的其他部分。转移的形成是很复杂的过程，并且取决于恶性细胞从原发性肿瘤脱离，侵袭胞外基质，渗透内皮基底膜以进入体腔和血管，并然后在通过血液转运之后浸润靶器官。最终，在靶位点的新肿瘤，即继发肿瘤或转移性肿瘤的生长取决于血管生成。甚至在去除原发性肿瘤之后，也经常发生肿瘤转移，这是因为肿瘤细胞或组分可能保留并产生转移潜力。在一个实施方案中，根据本公开内容的术语“转移”涉及“远端转移”，其涉及远离原发性肿瘤和局部淋巴结系统的转移。
本文中使用的术语例如“降低”、“抑制”、“干扰”和“负调节”意指引起水平总体降低例如约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多或者约75％或更多的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全抑制或基本上完全抑制，即降低至零或基本上降低至零。
在一个实施方案中，术语例如“提高”或“增强”涉及提高或增强至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约80％，或至少约100％。
本文中使用的“生理pH”是指为约7.5的pH。
本公开内容中使用的“重量％”是指重量百分比，其是测量物质量(以克(g)计)的浓度单位，表示为总组合物总重量(以克(g)计)的百分比。
术语“冷冻”涉及液体的固化，通常伴随着热量的去除。
术语“冻干”及其变化形式是指通过将物质冷冻并随后降低周围压力(例如，低于15Pa，例如低于10Pa、低于5Pa或1Pa或更低)以使物质中的冷冻介质直接从固相升华至气相而进行的物质的冷冻干燥。因此，术语“冻干(lyophilizing)”和“冷冻干燥(freeze-drying)”在本文中可互换使用。
在本公开内容的上下文中的术语“重组”意指“通过遗传工程制备的”。在一个实施方案中，在本公开内容的上下文中的“重组物体”不是天然存在的。
本文中使用的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中存在的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从天然来源中分离且没有在实验室中被人故意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中存在”意指“存在于自然界中”并且包括已知的物体以及尚未从自然界发现和/或分离但可在将来从天然来源中发现和/或分离的物体。
根据本公开内容，术语“肽”包括寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且最高约50个、约100个、或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但是术语“肽”和“蛋白质”在本文中通常作为同义词使用。
“治疗性蛋白质”当以治疗有效量向对象提供时，对该对象的病症或疾病状态具有积极或有利作用。在一个实施方案中，治疗性蛋白质具有治愈性或姑息治疗性(palliative)特性并且可被施用以改善、缓解、减轻、逆转疾病或障碍、延迟疾病或障碍发作，或者减轻疾病或障碍的一种或更多种症状的严重程度。治疗性蛋白质可以具有预防特性，并且可用于延迟疾病发作或减轻这样的疾病或病理状况的严重程度。术语“治疗性蛋白质”包括完整的蛋白质或肽，并且也可指其治疗活性片段。其还可包括蛋白质的治疗活性变体。治疗活性蛋白质的一些实例包括但不限于用于疫苗接种的抗原以及免疫刺激剂(例如细胞因子)。
术语“部分(portion)”是指小部分(fraction)。对于例如氨基酸序列或蛋白质的特定结构，术语其“部分”可指所述结构的连续或不连续小部分。
术语“部分”和“片段”在本文中可互换使用，并且是指连续元件。例如，结构(例如氨基酸序列或蛋白质)的部分是指所述结构的连续元件。当在组合物的上下文中使用时，术语“部分”意指组合物的一部分。例如，组合物的一部分可以是所述组合物的0.1％至99.9％(例如0.1％、0.5％、1％、5％、10％、50％、90％或99％)的任何部分。
当提及氨基酸序列(肽或蛋白质)时，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即表示在N端和/或C端缩短的氨基酸序列的序列。在C端缩短的片段(N端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的3'末端之截短的开放阅读框来获得。在N端缩短的片段(C端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的5'末端之截短的开放阅读框来获得，只要截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选地包含来自氨基酸序列的至少6个、特别地至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。
根据本公开内容，肽或蛋白质的一部分或片段优选地具有其所来源的肽或蛋白质的至少一种功能特性。这样的功能特性包括药理活性、与其他肽或蛋白质的相互作用、酶活性、与抗体的相互作用以及核酸的选择性结合。例如，肽或蛋白质的药理活性片段具有片段所来源的肽或蛋白质的至少一种药理活性。肽或蛋白质的一部分或片段优选地包含肽或蛋白质的至少6个，特别是至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个或至少50个连续氨基酸的序列。肽或蛋白质的一部分或片段优选地包含肽或蛋白质的最高8个，特别是最高10个、最高12个、最高15个、最高20个、最高30个或最高55个连续氨基酸的序列。
本文中的“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本氨基酸序列的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(wild type，WT)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸序列的经修饰形式。优选地，变体氨基酸序列与亲本氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比，具有1至约20个氨基酸修饰，并且优选1至约10个或者1至约5个氨基酸修饰。
本文中的“野生型”或“WT”或“天然的”意指在自然界中存在的氨基酸序列，包括等位基因变化。野生型氨基酸序列、肽或蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列。
优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性(优选同一性)程度将为至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地针对为参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出相似性或同一性的程度。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性的程度优选地针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸(在一些实施方案中为连续氨基酸)给出。在一些实施方案中，相似性或同一性的程度针对参考氨基酸序列的全长给出。可用本领域已知的工具进行确定序列相似性(优选序列同一性)的比对，优选使用最佳序列比对，例如，使用Align，采用标准设定，优选EMBOSS::needle，Matrix:Blosum62，空位开放(Gap Open)10.0，空位扩展(Gap Extend)0.5来进行。
“序列相似性”表示相同的或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两条氨基酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的核苷酸的百分比。
术语“％相同”和“％同一性”或类似术语特别地旨在是指待比较的序列之间在最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异可以是但不一定是随机分布在待比较序列的全长上。两个序列的比较通常在关于区段或“比较窗口”最佳比对以确定相应序列的局部区域之后通过比较所述序列来进行。用于比较的最佳比对可人工进行，或者借助于Smith and Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法、借助于Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法、借助于Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444的相似性检索算法、或者借助于使用所述算法的计算机程序(Wisconsin Genetics SoftwarePackage,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)来进行。在一些实施方案中，使用可在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站(例如在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)获得的BLASTN或BLASTP算法来确定两个序列的同一性百分比。在一些实施方案中，NCBI网站上用于BLASTN算法使用的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设置为28；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)匹配/不匹配评分设置为1、-2；(v)空位成本(Gap Cost)设置为线性；以及(vi)针对正在使用的低复杂性区域的筛选程序(filter)。在一些实施方案中，NCBI网站上用于BLASTP算法使用的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设置为3；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)矩阵设置为BLOSUM62；(v)空位成本设置为存在11延伸:1；以及(vi)条件组成评分矩阵调整。
同一性百分比通过确定待比较序列所对应的相同位置的数目，将该数目除以所比较位置的数目(例如，参考序列中的位置数目)，并将该结果乘以100来获得。
在一些实施方案中，相似性或同一性程度针对参考序列全长的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸残基组成，则同一性程度针对至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个、或约200个氨基酸残基(在一些实施方案中，为连续氨基酸残基)给出。在一些实施方案中，相似性或同一性的程度针对参考序列的全长给出。
根据本公开内容，同源氨基酸序列显示出氨基酸残基的至少40％，特别地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，并且优选至少95％、至少98％或至少99％同一性。
本文中所述的氨基酸序列变体可由技术人员例如通过重组DNA操作来容易地制备。例如，用于制备具有替换、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的DNA序列的操作在Sambrooket al.(1989)中详细描述。此外，本文中所述的肽和氨基酸变体可借助于已知的肽合成技术例如如通过固相合成和类似方法来容易地制备。
在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选是“功能片段”或“功能变体”。术语氨基酸序列的“功能片段”或“功能变体”涉及以下任何片段或变体，其表现出与该片段或变体所来源的氨基酸序列的一种或更多种功能特性相同或相似的一种或更多种功能特性(即，其是功能等同的)。关于抗原或抗原性序列，一种特定的功能是由该片段或变体所来源的氨基酸序列表现的一种或更多种免疫原性活性。本文中使用的术语“功能片段”或“功能变体”特别地是指这样的变体分子或序列，其包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变了一个或更多个氨基酸并且仍然能够实现亲本分子或序列的一种或更多种功能(例如诱导免疫应答)的氨基酸序列。在一个实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变该分子或序列的特征。在不同的实施方案中，功能片段或功能变体的功能可降低，但仍然显著存在，例如，功能变体的免疫原性可以是亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在另一些实施方案中，与亲本分子或序列相比，功能片段或功能变体的免疫原性可以是增强的。
“来源于”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员将理解，适用于本文中的抗原可被改变，使得它们的序列与它们所来源的天然存在或天然的序列不同，同时保留天然序列的期望活性。
“分离的”意指从天然状态中改变或脱离天然状态。例如，天然存在于活的动物中的核酸或肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存材料中部分或完全分离的同样的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可存在于非天然环境，例如如宿主细胞中。在一个优选实施方案中，本公开内容中使用的结合剂是基本上纯化的形式。
术语“遗传修饰”或简称“修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸，特别是RNA引入到细胞中。出于本公开内容的目的，术语“转染”还包括将核酸引入到细胞中或者由这样的细胞摄取核酸，其中细胞可存在于对象例如患者中。因此，根据本公开内容，用于转染本文中所述核酸的细胞可存在于体外或体内，例如，细胞可形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本公开内容，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，在所转染的遗传物质仅瞬时表达时就已足够。RNA可被转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。由于在转染过程中引入的核酸通常不会整合到核基因组中，因此外源核酸将通过有丝分裂而被稀释或者降解。允许核酸进行游离扩增的细胞大大降低了稀释率。如果期望所转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须发生稳定的转染。这样的稳定的转染可通过使用用于转染的基于病毒的体系或基于转座子的体系来实现。一般而言，将编码抗原的核酸瞬时转染到细胞中。RNA可被转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。
根据本公开内容，肽或蛋白质的类似物是其所来源的所述肽或蛋白质的经修饰形式，并且具有所述肽或蛋白质的至少一种功能特性。例如，肽或蛋白质的药理活性类似物具有类似物所来源的肽或蛋白质的至少一种药理活性。这样的修饰包括任何化学修饰，并且包括与蛋白质或肽缔合的任何分子例如碳水化合物、脂质和/或蛋白质或肽的单个或多个替换、缺失和/或添加。在一个实施方案中，蛋白质或肽的“类似物”包括由糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、引入保护/封闭基团、蛋白水解切割或者与抗体或其他细胞配体结合得到的那些经修饰形式。术语“类似物”还延伸到所述蛋白质和肽的所有功能化学等同物。
本文中使用的“活化”或“刺激”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的免疫效应细胞(例如T细胞)的状态。活化也可与信号传导途径的启动、诱导的细胞因子产生和可检测的效应物功能相关。术语“活化的免疫效应细胞”尤其是指正在进行细胞分裂的免疫效应细胞。
术语“致敏”是指其中免疫效应细胞例如T细胞首次与其特异性抗原接触并导致分化成效应细胞例如效应T细胞的过程。
术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体倍增的过程。在本公开内容的上下文中，该术语优选地在免疫应答的背景下使用，在所述免疫应答中免疫效应细胞被抗原刺激、增殖，并且识别所述抗原的特异性免疫效应细胞扩增。优选地，克隆扩增导致免疫效应细胞的分化。
根据本公开内容的“抗原”涵盖将引起免疫应答的任何物质和/或免疫应答或免疫机制(例如细胞应答)所针对的任何物质。这也包括这样的情况，其中抗原被加工成抗原肽，并且免疫应答或免疫机制针对一种或更多种抗原肽，特别是如果在MHC分子的背景下呈递的话。特别地，“抗原”涉及与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应的任何物质，优选肽或蛋白质。根据本公开内容，术语“抗原”包括包含至少一个表位(例如T细胞表位)的任何分子。优选地，在本公开内容的上下文中的抗原是任选地在加工之后诱导免疫反应的分子，该免疫反应优选特异性地针对该抗原(包括表达该抗原的细胞)。在一个实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，或者来源于这样的抗原的表位。
根据本公开内容，可使用作为免疫应答的候选物的任何合适的抗原，其中免疫应答可以是体液免疫应答和细胞免疫应答二者。在本公开内容的一些实施方案的情况下，抗原优选由细胞呈递，优选由抗原呈递细胞呈递(在MHC分子的情况下)，其导致针对抗原的免疫应答。抗原优选是对应于或来源于天然存在的抗原的产物。这样的天然存在的抗原可以包括或可以来源于变应原、病毒、细菌、真菌、寄生物和其他感染原和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本公开内容，抗原可对应于天然存在的产物，例如病毒蛋白质，或其一部分。
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是这样的分子：其包含将刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。疾病相关抗原包括病原体相关抗原，即，与由微生物感染相关的抗原，通常为微生物抗原(例如细菌或病毒抗原)，或与癌症相关的抗原，通常为肿瘤，例如肿瘤抗原。
在一个优选实施方案中，抗原是肿瘤抗原，即，肿瘤细胞的一部分，特别是主要存在于胞内或作为肿瘤细胞表面抗原的那些。在另一个实施方案中，抗原是病原体相关抗原，即，来源于病原体的抗原，例如，来源于病毒、细菌、单细胞生物体或寄生物的抗原，例如病毒抗原(例如病毒核糖核蛋白或外壳蛋白)。特别地，抗原应由MHC分子呈递，其导致免疫系统的调节，特别是细胞的活化，优选CD4+和CD8+淋巴细胞，特别是通过对T细胞受体的活性的调节。
术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的成分，其可来源于细胞质、细胞表面或细胞核。特别地，它是指在细胞内产生的或作为肿瘤细胞上的表面抗原的那些抗原。例如，肿瘤抗原包括癌胚抗原、α1-胎蛋白、异铁蛋白和胎儿磺基糖蛋白、α2-H-铁蛋白和γ-胎蛋白，以及多种病毒肿瘤抗原。根据本公开内容，肿瘤抗原优选地包含肿瘤或癌症的特征性的以及就类型和/或表达水平而言肿瘤或癌细胞特征性的任何抗原。
术语“病毒抗原”是指具有抗原特性，即，能够在个体中引起免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。
术语“细菌抗原”是指具有抗原特性，即，能够在个体中引起免疫应答的任何细菌组分。细菌抗原可来源于细菌的细胞壁或胞质膜。
术语“表位”是指分子(例如抗原)中的抗原决定簇，即，分子中被免疫系统识别，例如被抗体T细胞或B细胞识别的一部分或片段，特别是当在MHC分子的情况下呈递时。在一个实施方案中，“表位”意指能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子的表面基团例如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合会丧失，但与后者的结合不会丧失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断或覆盖的氨基酸残基(换言之，氨基酸残基在特定抗原结合肽的覆盖区(footprint)内)。
蛋白质的表位优选地包含所述蛋白质的连续或不连续部分，并且长度优选约5至约100个氨基酸，优选约5至约50、更优选约8至约0、最优选约10至约25个氨基酸，例如，表位的长度可优选9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。特别优选的是在本公开内容的上下文中的表位是T细胞表位。
术语例如“表位”、“抗原片段”、“免疫原性肽”和“抗原肽”在本文中可互换使用，并且优选地涉及抗原的不完整表示，其优选地能够引发针对抗原或者表达或包含并且优选呈递抗原的细胞的免疫应答。优选地，该术语涉及抗原的免疫原性部分。优选地，其为抗原的被T细胞受体识别(即，特异性结合)的部分，特别是如果在MHC分子的情况下呈递的话。某些优选的免疫原性部分与MHC I类或II类分子结合。术语“表位”是指被免疫系统识别的分子(例如抗原)的一部分或片段。例如，表位可以被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可为约5至约100，例如约5至约50，更优选约8至约30，最优选约10至约25个氨基酸，例如，表位的长度可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10个氨基酸至约25个氨基酸。术语“表位”包括T细胞表位。
术语“T细胞表位”是指当在MHC分子的情况下呈递时被T细胞识别的蛋白质的部分或片段。术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”包括I类MHC和II类MHC分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合体。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被T细胞上的T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)二者展示给T细胞。在MHC I类/肽复合体的情况下，结合肽通常长约8至约10个氨基酸，但是更长或更短的肽也可以是有效的。在II类MHC/肽复合体的情况下，结合肽通常长约10至约25个氨基酸，并且特别地长约13至约18个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。
肽和蛋白质抗原的长度可以为2至100个氨基酸，包括例如5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸或50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于100个氨基酸。
肽或蛋白质抗原可以是可诱导免疫系统产生针对该肽或蛋白质的抗体和T细胞应答的能力或将该能力提高的任何肽或蛋白质。
在一个实施方案中，疫苗抗原，即接种到对象中诱导免疫应答的抗原，被免疫效应细胞识别。优选地，疫苗抗原如果被免疫效应细胞识别，则能够在存在适当的共刺激信号的情况下，诱导携带识别该疫苗抗原的抗原受体的免疫效应细胞的刺激、致敏和/或扩增。在本公开内容实施方案的上下文中，疫苗抗原优选呈递或存在于细胞(优选抗原呈递细胞)的表面上。在一个实施方案中，抗原由病变细胞(例如肿瘤细胞或受感染细胞)呈递。在一个实施方案中，抗原受体是与在MHC的背景下呈递的抗原的表位结合的TCR。在一个实施方案中，当TCR由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，其与由细胞例如抗原呈递细胞呈递的抗原的结合导致所述T细胞的刺激、致敏和/或扩增。在一个实施方案中，当TCR由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，其与病变细胞上呈递的抗原的结合导致病变细胞的细胞溶解和/或凋亡，其中所述T细胞优选地释放细胞毒性因子，例如穿孔素和颗粒酶。
在一个实施方案中，抗原受体是与抗原中的表位结合的抗体或B细胞受体。在一个实施方案中，抗体或B细胞受体与抗原的天然表位结合。
术语“在细胞表面上表达”或“与细胞表面缔合”意指分子(例如抗原)与细胞质膜缔合并位于细胞质膜，其中该分子的至少一部分朝向所述细胞的胞外空间并且可例如通过位于细胞外部的抗体从所述细胞的外部接近。在该情况下，部分为优选至少4个、优选至少8个、优选至少12个、更优选至少20个氨基酸。该缔合可以是直接的或间接的。例如，该缔合可以是通过一个或更多个跨膜结构域、一个或更多个脂质锚，或者是通过与可在细胞质膜外小叶上存在的任何其他蛋白质、脂质、糖类或其他结构的相互作用。例如，与细胞表面缔合的分子可以是具有胞外部分的跨膜蛋白，或者可以是通过与另一种是跨膜蛋白的蛋白质相互作用而与细胞表面缔合的蛋白质。
“细胞表面”或“细胞的表面”根据其在本领域中的通常含义使用，并因此包括可通过蛋白质与其他分子结合可及的细胞外部。如果抗原位于所述细胞的表面并且可通过例如添加至所述细胞的抗原特异性抗体的结合可及，则所述抗原在所述细胞的表面上表达。
在本公开内容的上下文中，术语“胞外部分”或“胞外结构域”是指朝向细胞的胞外空间并且优选地从所述细胞的外部可及(例如通过位于细胞外部的结合分子，例如抗体)的分子(例如，蛋白质)的一部分。优选地，该术语是指一个或更多个胞外环或结构域或者其片段。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且其包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和包括溶细胞性T细胞的细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，CTL)(CD8+T细胞)。术语“抗原特异性T细胞”或类似术语涉及识别T细胞所靶向的抗原的T细胞，特别是当在MHC分子的情况下呈递在抗原呈递细胞或病变细胞(例如癌细胞)的表面上时，并且优选地发挥T细胞的效应物功能。如果T细胞杀伤表达抗原的靶细胞，则该T细胞被认为对抗原具有特异性。可使用例如在铬释放测定或增殖测定内的多种标准技术中的任一种来评价T细胞特异性。或者，可测量淋巴因子(例如干扰素γ)的合成。在本公开内容的某些实施方案中，RNA(特别是mRNA)编码至少一个表位。
术语“靶标”应意指作为针对免疫应答(例如细胞免疫应答)的靶标的物质，例如细胞或组织。靶标包括呈递抗原或抗原表位(即来源于抗原的肽片段)的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是表达抗原并优选用I类MHC呈递所述抗原的细胞。
“抗原加工”是指抗原降解成作为所述抗原的片段的加工产物(例如，蛋白质降解成肽)，以及这些片段中的一个或更多个与MHC分子缔合(例如通过结合)，以用于由细胞(优选抗原呈递细胞)呈递至特定的T细胞。
“抗原应答性CTL”意指对由抗原呈递细胞表面的I类MHC呈递的抗原或来源于所述抗原的肽具有应答性的CD8+T细胞。
根据本公开内容，CTL应答性可包括持续的钙通量、细胞分裂、细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)产生、活化标志物(例如CD44和CD69)上调、以及对表达肿瘤抗原的靶细胞的特异性细胞裂解性杀伤。CTL应答性也可使用精确指示CTL应答性的人工报告物来确定。
术语“免疫应答”和“免疫反应”在本文中按其常规含义可互换使用，并且是指对抗原的整体身体应答，并且优选地是指细胞免疫应答、体液免疫应答或者这二者。根据本公开内容，关于物质(例如抗原、细胞或组织)的术语“对......的免疫应答”或“针对......的免疫应答”涉及针对所述物质的免疫应答，例如细胞应答。免疫应答可包括选自以下的一种或更多种反应：产生针对一种或更多种抗原的抗体和抗原特异性T淋巴细胞(优选CD4+和CD8+T淋巴细胞，更优选CD8+T淋巴细胞)的扩增，其可在体外的多种增殖或细胞因子产生测试中检测。
在本公开内容的上下文中，术语“诱导免疫应答”和“引起免疫应答”和类似术语是指免疫应答的诱导，优选细胞免疫应答、体液免疫应答或二者的诱导。免疫应答可以是保护性/防止性/预防性和/或治疗性的。免疫应答可针对任何免疫原或抗原或抗原肽，优选针对肿瘤相关抗原或病原体相关抗原(例如，病毒(例如流感病毒(A、B或C)、CMV或RSV)的抗原)。在这种情况下，“诱导”可意指在诱导之前没有针对特定抗原或病原体的免疫应答，但其也可意指在诱导之前存在一定水平的针对特定抗原或病原体的免疫应答，并且在诱导之后，所述免疫应答增强。因此，在该背景下，“诱导免疫应答”也包括“增强免疫应答”。优选地，在个体中诱导免疫应答之后，所述个体被保护免于发展疾病，例如感染性疾病或癌性疾病，或者通过诱导免疫应答来改善疾病状况。
术语“细胞免疫应答”、“细胞应答”、“细胞介导的免疫”或类似术语旨在包括针对以表达抗原和/或者用I类或II类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答与称为T细胞或T淋巴细胞的细胞有关，这些细胞充当“辅助者”或“杀手”。辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)通过调节免疫应答来发挥中心作用，并且杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、细胞裂解性T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀伤细胞(例如病变细胞)。
术语“体液免疫应答”是指活生物体中的过程，其中响应于物质和生物体而产生抗体，所述抗体最终中和和/或消除所述物质和生物体。抗体应答的特异性由T和/或B细胞通过结合单一特异性的抗原的膜缔合受体介导的。在结合适当的抗原以及接收多种其他活化信号之后，B淋巴细胞分裂，这产生了记忆B细胞以及分泌抗体的浆细胞克隆，每个克隆产生识别与其抗原受体所识别的相同的抗原表位的抗体。记忆B淋巴细胞保持休眠状态，直至其随后被其特异性抗原活化。当再次暴露于特异性抗原时，这些淋巴细胞提供了记忆的细胞基础，并导致抗体应答的迅速增加。
术语“疫苗接种”和“免疫接种”描述了出于治疗或预防原因而治疗个体的过程，并且涉及以下程序：向个体施用一种或更多种如本文所述的免疫原或抗原或其衍生物(特别是以编码它们的RNA(尤其是mRNA)的形式)，以及刺激针对所述一种或更多种的免疫原或抗原或者特征在于呈递所述一种或更多种的免疫原或抗原的细胞的免疫应答。
“特征在于呈递抗原的细胞”或“呈递抗原的细胞”或“在抗原呈递细胞表面上呈递抗原的MHC分子”或类似表述意指直接地或在MHC分子(优选MHC I类和/或MHC II类分子，最优选MHC I类分子)的情况下加工之后呈递抗原或抗原肽的细胞，例如病变细胞(特别是肿瘤细胞或感染细胞)或抗原呈递细胞。
在本公开内容的上下文中，术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码转录成RNA(特别是mRNA)的过程。随后，RNA(尤其是mRNA)可以翻译成肽或蛋白质。
本文中使用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及通过其mRNA的链指导组装氨基酸序列以产生肽或蛋白质之细胞的核糖体中的过程。
本文中使用的术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、状况或情况可发生或可不发生，并且所述描述包括其中所述事件、状况或情况发生的实例以及其中所述事件、状况或情况不发生的实例。
本文中使用的“内源性”是指来自或产生于生物体、细胞、组织或系统内部的任何物质。
本文中使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合/融合体”可互换使用。这些术语是指将两个或更多个元件或组分或结构域连接在一起。
术语“疾病”(在本文中也称为“障碍”)是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可以由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可以由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于是指引起患病个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡或者与该个体接触的那些的类似问题的任何病症。从广义上讲，疾病有时包括损伤、残疾、障碍、综合征、感染、孤立的症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些情况下和出于其他目的，这些可被视为是可区分的类别。疾病通常不仅在身体上而且在情感上影响个体，因为对许多疾病的感染和经历可改变个体对生命的看法和个体的性格。
术语“治疗性处理”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可在个体中消除疾病、在个体中阻止或减缓疾病的发生、在个体中抑制或减缓疾病的发生、在个体中降低症状的频率或严重程度、和/或在目前患有或先前曾患有疾病的个体中降低复发。
术语“预防性处理”或“防止性处理”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性处理”或“防止性处理”在本文中可互换使用。类似地，在疾病进展(例如肿瘤或癌症的进展)的上下文中，术语“用于防止的方法”涉及旨在防止个体中疾病进展的任何方法。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可能患有疾病或障碍(例如，癌症、感染性疾病)或易于患有疾病或障碍(例如，癌症、感染性疾病)但可患有或可未患有疾病或障碍或者可需要预防性干预(例如疫苗接种)或者可需要进行干预(例如通过蛋白质替代)的人或另一些哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)或任何其他非哺乳动物(包括鸟类(鸡)、鱼或任何其他动物物种)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不意指特定年龄，并因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。
术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。
本公开内容的方面和实施方案
在第一方面，本公开内容提供了一种用于降低或防止对象中的肿瘤进展或治疗对象中的癌症的方法中的结合剂，所述方法包括在施用检查点抑制剂之前、同时或之后向所述对象施用所述结合剂，其中所述结合剂包含与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区。
如本公开内容中所表明的，(i)用结合人CD40和结合人CD137的结合剂刺激和(ii)检查点抑制(特别是PD-1/PD-L1轴的抑制)的组合放大了免疫应答。不受任何理论的束缚，这一令人惊讶的发现背后的原理如下：CD137在PD-1+细胞上共表达。因此，阻断PD-L1/PD-1信号并且通过CD137共刺激可协同增强T细胞效应功能并改善应答的持续时间。通过CD40和CD137的条件性活化，靶向CD40和CD137的结合剂通过增强的T细胞致敏、细胞因子和趋化因子的产生以及经历抗原的T细胞的扩增和存活诱导了强效的抗肿瘤活性。预计PD-(L)1途径在致敏期间以及抗原持续暴露期间被激活，其可降低由靶向CD40和CD137的结合剂诱导的免疫应答的幅度。
与CD40和CD137结合的结合剂
在一个实施方案中，CD40是人CD40，特别是包含SEQ ID NO:36中所示序列的人CD40。在一个实施方案中，CD137是人CD137，特别是包含SEQ ID NO:38中所示序列的人CD137。在一个实施方案中，CD40是人CD40并且CD137是人CD137。在一个实施方案中，CD40是包含SEQ ID NO:36中所示序列的人CD40，并且CD137是包含SEQ ID NO:38中所示序列的人CD137。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，
a)与人CD40结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7或9的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQID NO:8或10的CDR1、CDR2和CDR3序列；
并且
b)与人CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:17或19的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:18或20的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，
a)与人CD40结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含分别在SEQ ID NO:1、2和3中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含分别在SEQ ID NO:4、5和6中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；
并且
b)与人CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含分别在SEQ ID NO:11、12和13中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含分别在SEQ ID NO:14、15和16中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，
a)与人CD40结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:7或9具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％，或100％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:8或10具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的氨基酸序列；
b)与人CD137结合的第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:17或19具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％，或25 100％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:18或20具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％，或100％序列同一性的氨基酸序列。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，
a)与人CD40结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7或9中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ IDNO:8或10中所示的氨基酸序列；
并且
b)与人CD137结合的第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:17或19中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:18或20中所示的氨基酸序列。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，
a)与人CD40结合的第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ IDNO:10中所示的氨基酸序列；
并且
b)与人CD137结合的第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ IDNO:20中所示的氨基酸序列。
特别地，结合剂可以是抗体，例如多特异性抗体，例如双特异性抗体。结合剂还可以是全长抗体或抗体片段的形式。
进一步优选地，所述结合剂是人抗体或人源化抗体。
每个可变区可包含三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和四个框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)。
互补决定区(CDR)和框架区(FR)可从氨基端到羧基端以以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
在第一方面的一个实施方案中，所述结合剂包含：
i)含有所述第一重链可变区(VH)和第一重链恒定区(CH)的多肽，以及
ii)含有所述第二重链可变区(VH)和第二重链恒定区(CH)的多肽。在第一方面的一个实施方案中，所述结合剂包含：
i)含有所述第一轻链可变区(VL)并且还含有第一轻链恒定区(CL)的多肽，以及
ii)含有所述第二轻链可变区(VL)并且还含有第二轻链链恒定区(CL)的多肽。
在第一方面的一个实施方案中，所述结合剂是包含第一结合臂和第二结合臂的抗体，其中所述第一结合臂包含：
i)含有所述第一重链可变区(VH)和所述第一重链恒定区(CH)的多肽，以及
ii)含有所述第一轻链可变区(VL)和所述第一轻链恒定区(CL)的多肽；
并且所述第二结合臂包含：
iii)含有所述第二重链可变区(VH)和所述第二重链恒定区(CH)的多肽，以及
iv)含有所述第二轻链可变区(VL)和所述第二轻链恒定区(CL)的多肽。
在第一方面的一个实施方案中，所述结合剂包含i)含有能够与CD40结合的所述抗原结合区的第一重链和第一轻链，所述第一重链包含第一重链恒定区，并且第一轻链包含第一轻链恒定区；以及ii)含有能够与CD137结合的所述抗原结合区的第二重链和第二轻链，所述第二重链包含第二重链恒定区，并且所述第二轻链包含第二轻链恒定区。
所述第一重链恒定区(CH)和所述第二重链恒定区(CH)各自可包含恒定重链1(CH1)区、铰链区、恒定重链2(CH2)区和恒定重链3(CH3)区中的一者或更多者，优选地包含至少铰链区、CH2区和CH3区。
所述第一重链恒定区(CH)和所述第二重链恒定区(CH)各自可包含CH3区，其中这两个CH3区包含非对称突变。非对称突变意指所述第一CH3区和第二CH3区的序列在不同位置包含氨基酸替换。例如，所述第一CH3区和第二CH3区之一在与根据EU编号的人IgG1重链中的位置405相对应的位置处包含突变，并且所述第一CH3区和第二CH3区中的另一个在与根据EU编号的人IgG1重链中的位置409相对应的位置处包含突变。
在所述第一重链恒定区(CH)中，与选自根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409位置相对应的位置处的至少一个氨基酸可已被替换，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，与选自根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409位置相对应的位置处的至少一个氨基酸可已被替换，在一些具体实施方案中，所述第一重链和所述第二重链不在相同的位置替换(即所述第一重链和所述第二重链包含非对称突变)。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，(i)在所述第一重链恒定区(CH)中，与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置处的氨基酸是L，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置处的氨基酸是R，或者(ii)在所述第一重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置处的氨基酸是R，并且在所述第二重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置处的氨基酸是L。
在第一方面的一个实施方案中，与包含相同的第一抗原结合区和第二抗原结合区以及含有人IgG1铰链区、CH2区和CH3区的两个重链恒定区(CH)的另一抗体相比，所述结合剂诱导Fc介导的效应物功能的程度较低。
在根据第一方面的结合剂的一个具体实施方案中，所述第一重链恒定区(CH)和所述第二重链恒定区(CH)被修饰，使得与除了包含未经修饰的第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)之外都相同的抗体相比，所述抗体诱导Fc介导的效应物功能的程度较低。特别地，所述未经修饰的第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)各自或二者均包含SEQID NO:21或29中所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO:21或29中所示的氨基酸序列组成，或者基本上由SEQ ID NO:21或29中所示的氨基酸序列组成。
所述Fc介导的效应物功能可通过测量所述结合剂与Fcγ受体的结合、与C1q的结合、或者诱导Fe介导的Fcγ受体的交联来确定。特别地，Fc介导的效应物功能可通过测量所述结合剂与C1q的结合来确定。
所述结合剂的第一重链恒定区和第二重链恒定区已被修饰，使得与野生型抗体相比，C1q与所述抗体的结合降低，优选降低至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中C1q结合优选通过ELISA确定。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，在所述第一重链恒定区(CH)和所述第二重链恒定区(CH)中的至少一者中，与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235、D265、N297和P331相对应的位置处的一个或更多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，在所述第一重链和所述第二重链中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235的位置分别可以是F和E。
特别地，在所述第一链恒定区和第二重链恒定区(HC)中，与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265相对应的位置分别可以是F、E和A。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，第一重链恒定区和第二重链恒定区二者中与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235相对应的位置分别是F和E，其中：(i)第一重链恒定区中与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置是L，并且第二重链中与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置是R，或者(ii)第一重链恒定区中与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置是R，并且第二重链中与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置是L。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，第一重链恒定区和第二重链恒定区二者中与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265相对应的位置分别是F、E和A，其中：(i)第一重链恒定区中与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置是L，并且第二重链恒定区中与根据EU编号的人IgG1重链中K409相对应的位置是R，或者(ii)第一重链中与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置是R，并且第二重链中与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置是L。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，所述第一重链和/或第二重链的恒定区包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:29所示的序列[IgG1-FC]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N-端或C-端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；和
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多10个替换，例如至多9个替换、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个替换的序列。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，所述第一重链或第二重链的恒定区，例如第二重链的恒定区，包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)在SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:30中所示的序列[IgG1-F405L]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N-端或C-端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；和
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多9个替换，例如至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个替换的序列。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，所述第一重链或第二重链的恒定区，例如第一重链的恒定区，包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或由选自以下的氨基酸序列组成：
a)在SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:31中示出的序列[IgG1-F409R]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N-端或C-端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；和
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多10个替换，例如至多9个替换、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个替换、至多3个、至多2个或至多1个替换的序列。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，所述第一重链和/或第二重链的恒定区包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或由选自以下的氨基酸序列组成：
a)在SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:32中所示的序列[IgG1-Fc_FEA]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N-端或C-端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；和
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多7个替换，例如至多6个替换、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个替换的序列。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，所述第一重链和/或第二重链的恒定区，例如第二重链的恒定区，包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)在SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:33中所示的序列[IgG1-Fc_FEAL]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N-端或C-端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；和
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多6个替换，例如至多5个替换、至多4个替换、至多3个、至多2个或至多1个替换的序列。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，所述第一重链和/或第二重链的恒定区，例如第一重链的恒定区，包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)在SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:34中所示的序列[IgG1-Fc_FEAR]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N-端或C-端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；和
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多6个替换，例如至多5个替换、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个替换的序列。
在第一方面的一个实施方案中，结合剂包含kappa(κ)轻链恒定区。
在第一方面的一个实施方案中，结合剂包含lambda(λ)轻链恒定区。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，第一轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区或lambda(λ)轻链恒定区。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，第二轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区或kappa(κ)轻链恒定区。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，第一轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区并且第二轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区，或者第一轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区并且第二轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，kappa(κ)轻链包含选自以下的氨基酸序列：
a)在SEQ ID NO:27中所示的序列；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N-端或C-端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；和
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多10个替换，例如至多9个替换、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个替换、至多3个、至多2个或至多1个替换的序列。
在根据第一方面的结合剂的一个实施方案中，lambda(λ)轻链包含选自以下的氨基酸序列：
a)在SEQ ID NO:28中所示的序列；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N-端或C-端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；和
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多10个替换，例如至多9个替换、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个替换、至多3个、至多2个或至多1个替换的序列。
根据第一方面的结合剂(特别是抗体)是选自IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4的同种型。特别地，结合剂可以是全长IgG1抗体。在第一方面的优选实施方案中，结合剂(特别是抗体)是IgG1m(f)同种异型。
优选地，结合剂以合适的量施用，即，例如在每个剂量和/或治疗周期中施用的结合剂的量，当其与另一细胞上表达的CD137结合时，可诱导胞内信号传导。因此，根据本公开内容的合适量的结合剂能够反式激活两种不同的细胞。在人中，CD40在许多细胞上表达，包括抗原呈递细胞(APC)，例如树突细胞，而CD137在T细胞和其他细胞上表达。因此，根据本公开内容的以合适的量与CD40和CD137结合的结合剂能够同时与APC和表达这些受体的T细胞结合。不受理论的束缚，结合剂可因此(i)通过受体结合来介导APC与T细胞之间的细胞-细胞相互作用，以及(ii)同时激活CD40和CD137二者，这主要是由在细胞-细胞相互作用后的交联和受体聚集诱导的，并且不一定依赖于亲本单特异性二价抗体的激动活性。因此，这些反式激活结合剂在APC:T细胞相互作用的背景下发挥共刺激活性，并且可引发针对肿瘤细胞的T细胞应答。因此，该作用机制可由活化的APC通过抗原呈递来反映天然的T细胞活化，允许由APC向T细胞呈递多种肿瘤特异性抗原。不受理论的限制，共刺激活性可提供以下中一者或更多者：(i)仅特定T细胞被活化(即与APC接触的那些细胞)，这与任何T细胞相反；(ii)通过由活化的APC和CD137触发的强的共刺激再激活耗竭的T细胞；以及(iii)通过由活化的APC诱导抗原呈递并同时触发CD137来致敏T细胞。
在每个剂量和/或治疗周期中施用的结合剂的量可特别地在一定范围内，其中大于5％，优选大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％，甚至更优选大于25％，甚至更优选大于30％，甚至更优选大于35％，甚至更优选大于40％，甚至更优选大于45％，最优选大于50％的所述结合剂与CD40和CD137二者结合。
在一些优选实施方案中，施用的结合剂的量(例如在每个剂量和/或每个治疗周期中)为：
a)约0.01至2.5(例如约0.04至2.5)mg/kg体重或者总计约1至200
(例如约3至200)mg；和/或
b)约0.07×10-9至16.9×10-9(例如约0.25×10-9至16.9×10-9)mol/kg体重或者总计约8×10-9至1350×10-9(例如约20×10-9至1350×10-9)mol。
在一些实施方案中，施用的结合剂的量(例如在每个剂量和/或每个治疗周期中)为：
a)约0.62至1.88(例如约1.0至1.5)mg/kg体重或者总计约50至150
(例如约80至120)mg；和/或
b)约4.1×10-9至12.7×10-9(例如约6.7×10-9至10.1×10-9)mol/kg体重或者总计约335×10-9至1020×10-9(例如约535×10-9至810×10-9)mol。根据这些实施方案，基于施用结合剂的对象的中位体重为80kg，以mg/kg限定的剂量可转换为固定剂量(flat dose)，并且反之亦然。
结合剂可以以任何方式以及通过本领域已知的任何途径施用。在一个优选实施方案中，全身性施用结合剂，例如肠胃外施用，特别是静脉内施用。
结合剂可以以如本文所述的任何合适的药物组合物的形式施用。在一个优选实施方案中，结合剂以输注的形式施用。
结合剂可在施用检查点抑制剂之前、同时或之后施用。
在一个实施方案中，在施用检查点抑制剂之前施用结合剂。例如，在施用结合剂的结束与施用检查点抑制剂的开始之间的间隔可以是至少约10分钟，例如至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟、至少约40分钟、至少约45分钟、至少约50分钟、至少约55分钟、至少约60分钟、至少约90分钟、或至少约120分钟，并且高至约14天(高至约2周)，例如高至约13天、高至约12天、高至约11天、高至约10天、高至约9天、高至约8天、高至约7天(高至约1周)、高至约6天、高至约5天、高至约4天、高至约3天、高至约2天、高至约1天(高至约24小时)、高至约18小时、高至约12小时、高至约6小时、高至约5小时、高至约4小时、高至约3小时、高至约2.5小时或高至约2小时。
在一个实施方案中，在施用检查点抑制剂之后施用结合剂。例如，在施用检查点抑制剂的结束与施用结合剂的开始之间的间隔可以是至少约10分钟，例如至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟、至少约40分钟、至少约45分钟、至少约50分钟、至少约55分钟、至少约60分钟、至少约90分钟、或至少约120分钟，并且高至约14天(高至约2周)，例如高至约13天、高至约12天、高至约11天、高至约10天、高至约9天、高至约8天、高至约7天(高至约1周)、高至约6天、高至约5天、高至约4天、高至约3天、高至约2天、高至约1天(高至约24小时)、高至约18小时、高至约12小时、高至约6小时、高至约5小时、高至约4小时、高至约3小时、高至约2.5小时或高至约2小时。
在一个实施方案中，结合剂与检查点抑制剂同时施用。例如，可使用包含两种药物的组合物来施用结合剂和检查点抑制剂。或者，可将结合剂施用到对象的一个肢中，而检查点抑制剂可施用到对象的另一个肢中。
检查点抑制剂
在一个实施方案中，适用于本文公开的方法的免疫检查点抑制剂是抑制信号的拮抗剂，例如靶向例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3或TIM-3的抗体。这些配体和受体在Pardoll,D.,Nature.12:252-264,2012.中进行了综述。本文中描述了根据本公开内容的可被靶向的另外的免疫检查点蛋白。
在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止与免疫检查点相关的抑制性信号。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏或抑制与免疫检查点相关的抑制性信号传导的抗体或其片段。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏或抑制抑制性信号传导的小分子抑制剂。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏或抑制抑制性信号传导的基于肽的抑制剂。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏或抑制抑制性信号传导的抑制性核酸分子。
如本文中所述，抑制或阻断抑制性免疫检查点信号传导导致阻止或逆转免疫抑制以及针对癌细胞的T细胞免疫的建立或增强。在一个实施方案中，如本文中所述，免疫检查点信号传导的抑制降低或抑制了免疫系统的功能失调。在一个实施方案中，如本文中所述，免疫检查点信号传导的抑制使功能失调的免疫细胞功能失调程度降低。在一个实施方案中，如本文中所述，免疫检查点信号传导的抑制使功能失调的T细胞功能失调程度降低。
在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止检查点阻断剂蛋白质之间的相互作用，例如PD-1与PD-L1或PD-L2之间的相互作用；CTLA-4与CD80或CD86之间的相互作用；LAG-3与其一种或更多种配体之间的相互作用；一种或更多种KIR与其各自配体的相互作用；TIM-3与其一种或更多种配体(例如半乳凝素-9、PtdSer、HMGB1和CEACAM1)的相互作用；TIGIT与其一种或更多种配体(例如PVR、PVRL2和PVRL3)的相互作用；VISTA与其一种或更多种结合配偶体的相互作用；GARP与其一种或更多种配体的相互作用；通过CD39和/或CD73的抑制性信号传导和/或A2AR和/或A2BR与腺苷的相互作用；B7-H3与其受体和/或B7-H4与其受体的相互作用；BTLA与其配体HVEM的相互作用；CD94/NKG2A与HLA-E的相互作用；一种或更多种Siglec与其各自配体的相互作用；CD20信号传导；CD47与SIRPα的相互作用；PVRIG与PVRL2的相互作用；CSF1R与CSF1的相互作用；NOX信号传导；和/或IDO信号传导和/或TDO信号传导。
免疫检查点抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段或其包含具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的构建体。抗体或其抗原结合片段如本文中所述。作为免疫检查点抑制剂的抗体或其抗原结合片段特别地包含与免疫检查点蛋白(例如免疫检查点受体或免疫检查点受体配体)结合的抗体或其抗原结合片段。如本文中所述，抗体或抗原结合片段也可与另外的部分缀合。特别地，抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。优选地，免疫检查点抑制剂抗体或其抗原结合片段是免疫检查点受体的拮抗剂或是免疫检查点受体配体的拮抗剂。
在一个优选实施方案中，作为免疫检查点抑制剂的抗体是分离的抗体。
在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止检查点阻断剂蛋白质之间相互作用的抗体、其片段或构建体，例如，阻止PD-1与PD-L1或PD-L2之间相互作用的抗体或其片段；阻止CTLA-4与CD80或CD86之间相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止LAG-3与其配体之间相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止TIM-3与其一种或更多种配体半乳凝素-9、PtdSer、HMGB1和CEACAM1之间相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止一种或更多种KIR与其各自配体相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止TIGIT与其一种或更多种配体PVR、PVRL2和PVRL3相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止VISTA与其一种或更多种结合配偶体相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止GARP与其一种或更多种配体相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止通过CD39和/或CD73的抑制性信号传导和/或阻止A2AR和/或A2BR与腺苷的相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止B7-H3与其受体和/或B7-H4与其受体的相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止BTLA与其配体HVEM的相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止LAG-3与其一种或更多种配体的相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止CD94/NKG2A与HLA-E的相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止一种或更多种Siglec与其各自配体的相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止CD20信号传导的抗体、其片段或其构建体；阻止CD47与SIRPα的相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止PVRIG与PVRL2的相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止CSF1R与CSF1的相互作用的抗体、其片段或其构建体；阻止NOX信号传导的抗体、其片段或其构建体；和/或阻止IDO信号传导和/或TDO信号传导的抗体、其片段或其构建体。
免疫检查点抑制剂可以是抑制性核酸分子，例如寡核苷酸、siRNA、shRNA、反义DNA或RNA分子、以及适配体(例如DNA或RNA适配体)，特别是反义寡核苷酸。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂siRNA干扰mRNA，因此阻断翻译，例如免疫检查点蛋白的翻译。
检查点抑制剂也可以是以可溶性形式的分子(或其变体)本身的形式，例如可溶性PD-L1或PD-L1融合物。
在本公开内容的上下文中，可使用多于一种的检查点抑制剂，其中多于一种的检查点抑制剂靶向不同的检查点途径或相同的检查点途径。优选地，多于一种的检查点抑制剂是不同的检查点抑制剂。优选地，如果使用多于一种的不同的检查点抑制剂，特别是使用至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的检查点抑制剂，优选使用2、3、4或5种不同的检查点抑制剂，更优选使用2、3或4种不同的检查点抑制剂，甚至更优选使用2或3种不同的检查点抑制剂并且最优选使用2种不同的检查点抑制剂。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂(免疫检查点阻断剂)是PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是PD-1信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，PD-1信号传导途径的检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在某些实施方案中，PD-1信号传导途径的检查点抑制剂是PD-1配体抑制剂，例如PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂。在一个优选实施方案中，PD-1信号传导途径的检查点抑制剂是破坏或抑制PD-1受体与其一种或更多种配体PD-L1和/或PD-L2之间的相互作用的抗体、其抗原结合部分或其构建体。与PD-1结合并破坏或抑制PD-1与其一种或更多种配体之间的相互作用的抗体是本领域已知的。在某些实施方案中，抗体、其抗原结合部分或其构建体与PD-1特异性结合。在某些实施方案中，抗体、其抗原结合部分或其构建体与PD-L1特异性结合，并破坏或抑制其与PD-1的相互作用，从而提高免疫活性。在某些实施方案中，抗体、其抗原结合部分或其构建体与PD-L2特异性结合，并破坏或抑制其与PD-1的相互作用，从而提高免疫活性。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是CTLA-4信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是CTLA-4信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，CTLA-4信号传导途径的检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂。在某些实施方案中，CTLA-4信号传导途径的检查点抑制剂是CTLA-4配体抑制剂。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是TIGIT信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是TIGIT信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，TIGIT信号传导途径的检查点抑制剂是TIGIT抑制剂。在某些实施方案中，TIGIT信号传导途径的检查点抑制剂是TIGIT配体抑制剂。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是B7家族信号传导途径的组分。在某些实施方案中，B7家族成员是B7-H3和B7-H4。在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是B7-H3和/或B7-4的抑制剂。B7家族没有任何限定的受体，但这些配体在肿瘤细胞或肿瘤浸润细胞上调。临床前小鼠模型已表明，阻断这些配体可增强抗肿瘤免疫。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是BTLA信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是BTLA信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，BTLA信号传导途径的检查点抑制剂是BTLA抑制剂。在某些实施方案中，BTLA信号传导途径的检查点抑制剂是HVEM抑制剂。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是一种或更多种KIR信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是一种或更多种KIR信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，一种或更多种KIR信号传导途径的检查点抑制剂是KIR抑制剂。在某些实施方案中，一种或更多种KIR信号传导途径的检查点抑制剂是KIR配体抑制剂。例如，根据本公开内容的KIR抑制剂可以是与KIR2DL1、KIR2DL2和/或KIR2DL3结合的抗KIR抗体。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是LAG-3信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是LAG-3信号传导的抑制剂。在某些实施方案中，LAG-3信号传导途径的检查点抑制剂是LAG-3抑制剂。在某些实施方案中，LAG-3信号传导途径的检查点抑制剂是LAG-3配体抑制剂。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是TIM-3信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是TIM-3信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，TIM-3信号传导途径的检查点抑制剂是TIM-3抑制剂。在某些实施方案中，TIM-3信号传导途径的检查点抑制剂是TIM-3配体抑制剂。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是CD94/NKG2A信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是CD94/NKG2A信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，CD94/NKG2A信号传导途径的检查点抑制剂是CD94/NKG2A抑制剂。在某些实施方案中，CD94/NKG2A信号传导途径的检查点抑制剂是CD94/NKG2A配体抑制剂。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是IDO信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是IDO信号传导途径的抑制剂，例如IDO抑制剂。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是腺苷信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是腺苷信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，腺苷信号传导途径的检查点抑制剂是CD39抑制剂。在某些实施方案中，腺苷信号传导途径的检查点抑制剂是CD73抑制剂。在某些实施方案中，腺苷信号传导途径的检查点抑制剂是A2AR抑制剂。在某些实施方案中，腺苷信号传导途径的检查点抑制剂是A2BR抑制剂。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是VISTA信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是VISTA信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，VISTA信号传导途径的检查点抑制剂是VISTA抑制剂。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是一种或更多种Siglec信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是一种或更多种Siglec信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，一种或更多种Siglec信号传导途径的检查点抑制剂是Siglec抑制剂。在某些实施方案中，一种或更多种Siglec信号传导途径的检查点抑制剂是Siglec配体抑制剂。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是CD20信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是CD20信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，CD20信号传导途径的检查点抑制剂是CD20抑制剂。
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是GARP信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是GARP信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，GARP信号传导途径的检查点抑制剂是GARP抑制剂。
在一个实施方案中，抑制性免疫调节剂是CD47信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是CD47信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，CD47信号传导途径的检查点抑制剂是CD47抑制剂。在某些实施方案中，CD47信号传导途径的检查点抑制剂是SIRPα抑制剂。
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是PVRIG信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是PVRIG信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，PVRIG信号传导途径的检查点抑制剂是PVRIG抑制剂。在某些实施方案中，PVRIG信号传导途径的检查点抑制剂是PVRIG配体抑制剂。
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是CSF1R信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是CSF1R信号传导途径的抑制剂。在某些实施方案中，CSF1R信号传导途径的检查点抑制剂是CSF1R抑制剂。在某些实施方案中，CSF1R信号传导途径的检查点抑制剂是CSF1抑制剂。
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是NOX信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是NOX信号传导途径的抑制剂。例如NOX抑制剂。
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是TDO信号传导途径的组分。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检查点抑制剂是TDO信号传导途径的抑制剂，例如TDO抑制剂。
示例性PD-1抑制剂包括但不限于抗PD-1抗体，例如BGB-A317(BeiGene；参见US 8,735,553、WO 2015/35606和US2015/0079109)，兰立珠单抗(lambrolizumab)(例如，在WO2008/156712中公开为hPD109A及其人源化衍生物h409A1、h409A16和h409A17)，AB137132(Abcam)，EH12.2H7和RMP1-14(#BE0146；Bioxcell Lifesciences Pvt.LTD.)，MIH4(Affymetrix eBioscience)，纳武单抗(OPDIVO，BMS-936558；Bristol Myers Squibb；参见美国专利No.8,008,449、WO 2013/173223、WO2006/121168)，派姆单抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA；MK-3475；Merck；参见WO 2008/156712)，皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011；CureTech；参见Hardy et al.,1994,Cancer Res.,54(22):5793-6和WO 2009/101611)，PDR001(Novartis；参见WO 2015/112900)，MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca；参见WO 2012/145493)，TSR-042(参见WO 2014/179664)，西米普利单抗(REGN-2810；Regeneron；H4H7798N；参见US2015/0203579和WO 2015/112800)，JS001(TAIZHOU JUNSHI PHARMA；参见Si-Yang Liu et al.,2007,J.Hematol.Oncol.70:136)，AMP-224(GSK-2661380；参见Li etal.,2016,Int J Mol Sci 17(7):1151以及WO 2010/027827和WO 2011/066342)、PF-06801591(Pfizer)，替雷利珠单抗(BGB-A317；BeiGene；参见WO 2015/35606、美国专利No.9,834,606和US2015/0079109)，BI 754091，SHR-1210(参见WO2015/085847)，以及如WO2006/121168中所述的抗体17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4，INCSHR1210(Jiangsu HengruiMedicine；也被称为SHR-1210；参见WO 2015/085847)，TSR-042(TesaroBiopharmaceutical；也被称为ANB011；参见W02014/179664)，GLS-010(Wuxi/HarbinGloria Pharmaceuticals；也被称为WBP3055；参见Si-Yang et al.,2017,J.Hematol.Oncol.70:136)，STI-1110(Sorrento Therapeutics；参见WO 2014/194302)，AGEN2034(Agenus；参见WO 2017/040790)，MGA012(Macrogenics；参见WO 2017/1983046)，IBI308(Innovent；参见WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/132825和WO 2017/133540)，西利单抗(cetrelimab)(JNJ-63723283；JNJ-3283；参见Calvo et al.,J.Clin.Oncol.36，no.5_suppl(2018)58)，杰诺单抗(genolimzumab)(CBT-501；参见Patelet al.,J.ImmunoTher.Cancer,2017,5(Suppl 2):P242)，萨善利单抗(sasanlimab)(PF-06801591；参见Youssef et al.,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.Ann.Meeting 2017；CancerRes2017；77(13Suppl):Abstract)，特瑞普利单抗(toripalimab)(JS-001；参见US2016/0272708)，卡瑞利珠单抗(camrelizumab)(SHR-1210；INCSHR-1210；参见US2016/376367；Huang et al.,Clin.Cancer Res.2018；24(6):1296-1304)，斯巴达珠单抗(spartalizumab)(PDR001；参见WO 2017/106656；Naing et al.,J.Clin.Oncol.34，no.15_suppl(2016)3060-3060)，BCD-100(JSC BIOCAD，Russia；参见WO 2018/103017)，巴替利单抗(balstilimab)(AGEN2034；参见WO 2017/040790)，信迪利单抗(sintilimab)(IBI-308；参见WO 2017/024465和WO 2017/133540)，埃本利单抗(ezabenlimab)(BI-754091；参见US2017/334995；Johnson etal.,J.Clin.Oncol.36,no.5_suppl(2018)212-212)，赛帕利单抗(zimberelimab)(GLS-010；参见WO 2017/025051)，LZM-009(参见US 2017/210806)，AK-103(参见WO 2017/071625、WO 2017/166804和WO 2018/036472)，瑞弗利单抗(retifanlimab)(MGA-012；参见WO 2017/019846)，Sym-021(参见WO 2017/055547)，CS1003(参见CN107840887)，本文所公开的抗PD-1抗体IgG1-PD1(即包含SEQ ID NO:43中所限定的VH序列、SEQ ID NO:44中所限定的VL序列、SEQ ID NO:61中所限定的Fc序列和SEQ ID NO:27中所限定的κ序列)，如在例如US 7,488,802、US 8,008,449、US 8,168,757、WO 03/042402、WO 2010/089411(还公开了抗PD-L1抗体)、WO 2010/036959、WO 2011/159877(还公开了针对TIM-3的抗体)、WO 2011/082400、WO 2011/161699、WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2012/145493(还公开了针对PD-L1的抗体)、WO 2015/035606、WO 2014/055648(还公开了抗-KIR抗体)、US2018/0185482(还公开了抗-PD-L1抗体和抗-TIGIT抗体)、US 8,008,449、US 8,779,105、US 6,808,710、US 8,168,757、US 2016/0272708以及US 8,354,509中所述的抗-PD-1抗体，如在例如Shaabani et al.,2018,Expert Op Ther Pat.,28(9):665-678和Sasikumar and Ramachandra,2018,BioDrugs,32(5):481-497中所公开的针对PD-1信号传导途径的小分子拮抗剂，如在例如WO 2019/000146和WO 2018/103501中公开的针对PD-1的siRNA，如WO 2018/222711中公开的可溶性PD-1蛋白，以及如在例如WO 2018/022831中所述的包含可溶性形式的PD-1的溶瘤病毒。
在某个实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗(OPDIVO；BMS-936558)、派姆单抗(KEYTRUDA；MK-3475)、皮地利珠单抗(CT-011)、PDR001、MEDI0680(AMP-514)、TSR-042、REGN2810、JS001、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、BGB-A317、BI 754091或SHR-1210。在一个实施方案中，PD-1抑制剂是本文中所公开的IgG1-PD1。
在某些实施方案中，所述抑制性免疫调节剂是这样的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含上述抗-PD-1抗体或抗原结合片段中之一的互补决定区(CDR)，例如选自纳武单抗，Amp-514，替雷利珠单抗，西米普利单抗，TSR-042，JNJ-63723283，CBT-501，PF-06801591，JS-001，卡瑞利珠单抗，PDR001，BCD-100，AGEN2034，IBI-308，BI-754091，GLS-010，LZM-009，AK-103，MGA-012，Sym-021，CS1003，以及IgG1-PD1的一种抗PD-1抗体或抗原结合片段的CDR。
在一些实施方案中，使用Kabat编号方案描述了抗PD-1抗体的CDR(Kabat,E.A.,etal.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NTH Publication No.91-3242)。
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是这样的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含上述抗-PD-1抗体或抗原结合片段中之一的重链可变区和轻链可变区，例如选自纳武单抗，Amp-514，替雷利珠单抗，西米普利单抗，TSR-042，JNJ-63723283，CBT-501，PF-06801591，JS-001，卡瑞利珠单抗，PDR001，BCD-100，AGEN2034，IBI-308，BI-754091，GLS-010，LZM-009,AK-103，MGA-012，Sym-021，CS1003，以及IgG1-PD1的一种抗PD-1抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是选自纳武单抗，Amp-514，替雷利珠单抗，西米普利单抗，TSR-042，JNJ-63723283，CBT-501，PF-06801591，JS-001，卡瑞利珠单抗，PDR001，BCD-100，AGEN2034，IBI-308，BI-754091，GLS-010，LZM-009，AK-103，MGA-012，Sym-021，CS1003，IgG1-PD1的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
本公开内容的抗PD-1抗体优选为单克隆的，并且可以是多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表达文库产生的片段以及上述任一者的PD-1结合片段。在一些实施方案中，本文中所述的抗PD-1抗体与PD-1(例如，人PD-1)特异性结合。本公开内容的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
在本公开内容的某些实施方案中，抗PD-1抗体是如本文中所述的抗原结合片段(例如，人抗原结合片段)，并且包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗原结合片段，包括单链抗体，可包含单独的可变区或与以下的整体或一部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域。本公开内容还包括抗原结合片段，其包含可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域的任意组合。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
本文中公开的抗PD-1抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或更高的多特异性的。多特异性抗体可对PD-1的不同表位具有特异性，或者可对PD-1和异源蛋白二者均具有特异性。参见例如
PCT公开wO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt，et al，1991，J.Immunol.147：60 69；U.S.Pat.Nos.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny et al，1992，J.Immunol.148：1547 1553.
本文中公开的抗PD-1抗体可就其包含的特定CDR来描述或说明。给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可使用许多公知的方案的任一种来容易地确定，所述方案包括由以下描述的那些：
kabat et al.(1991)，″Sequences of Proteins of Immunological Interest，″5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(″kabat″编号方案)；Al-Lazikani et al.，(1997)JMB 273，927-948(″Chothia″编号方案)；MacCallum et al.，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)，″Antibody-antigen interactions：Contact analysis and binding site topography，″J.Mol.Biol.262，732-745.”(″Contact″编号方案)；Lefranc MP et al.,″IMGT unique numbering for immunoglobulinand T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains，″DevComp Immunol，2003；27(1)：55-77(″IMGT″编号方案)；Honegger A and Plückthun A，″Yetanother numbering scheme for immunoglobulin variable domains：an automaticmodeling and analysis tool，″J Mol Biol，2001；309(3)：657-70，(″Aho″编号方案)；andMartin et al.，″Modeling antibody hypervariable loops：a combined algorithm，″PNAS，1989，86(23)：9268-9272，(″AbM″编号方案).
给定CDR的边界可根据所使用的用于鉴定的方案而变化。在一些实施方案中，给定抗体或其区域(例如，其可变区)的CDR或单个特定CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)应被理解为涵盖了由任何前述方案定义的(或特异性)CDR。例如，如任何前述方案所定义的，其中陈述为特定的CDR(例如，CDR-H3)包含给定VH或VL区氨基酸序列中相应CDR的氨基酸序列时，应理解为这样的CDR在可变区内部具有相应CDR(例如，CDR-H3)的序列。可指定用于鉴定特定CDR的方案，例如由Kabat、Chothia、AbM或IMGT方法定义的CDR。
在一些实施方案中，本文中提供的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的CDR序列中氨基酸残基的编号是根据如Lefranc，M.P.et al.，Dev.Comp.Immunol.，2003，27，55-77中所述的IMGT编号方案进行的。
在一些实施方案中，本文中公开的抗PD-1抗体包含抗体纳武单抗的CDR。参见WO2006/121168。在一些实施方案中，使用Kabat编号方案(Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Departmentof Health and Human Services，NTH Publication No.91-3242)来描述抗体纳武单抗的CDR。本公开内容涵盖了包含重链可变结构域或轻链可变结构域的抗PD-1抗体或其衍生物，所述可变结构域包含(a)三个CDR的组，其中所述CDR的组来自单克隆抗体纳武单抗，和(b)四个框架区的组，其中所述框架区的组不同于单克隆抗体纳武单抗中的框架区的组，并且其中所述抗PD-1抗体或其衍生物与PD-1结合。在某些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗。
本文中公开的抗PD-1抗体也可就其与PD-1(例如，人PD-1)的结合亲和力进行描述或说明。优选的结合亲和力包括具有的解离常数或Kd小于
5x10-2M，10-2M，5x10-3M，10-3M，5x10-4M，10-4M，5x10-5M，10-5M，5x10-6M，10-6M，5x10- 7M，10-7M，5x10-8M，10-8M，5x10-9M，10-9M，5x10-10M，10-10M，5x10-11M，10-11M，5x10-12M，10-12M，5x10-13M，10-13M，5x10-14M，10-14M，5x10-15M，或10-15M
的那些。
抗PD-1抗体还包含经修饰的衍生物和构建体，即通过将任何类型的分子与抗体共价连接，使得共价连接不会阻止抗体与PD-1结合。例如，而非通过限制的方式，抗PD-1抗体衍生物包括已经被修饰的抗体，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接等。多种化学修饰中的任一种均可通过已知技术进行，包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物或构建体可包含一个或更多个非经典氨基酸。
示例性PD-1配体抑制剂为PD-L1抑制剂和PD-L2抑制剂，并且包括但不限于抗PD-L1抗体，例如MEDI4736(度伐单抗(durvalumab)；AstraZeneca；参见WO 2011/066389)、MSB-0010718C(参见US 2014/0341917)、YW243.55.S70(参见WO 2010/077634和US 8,217,149的SEQ ID NO：20)、MIH1(Affymetrix eBioscience；参见EP 3 230 319)、MDX-1105(Roche/Genentech；参见WO2013019906和US 8,217,149)STI-1014(Sorrento；参见W02013/181634)、CK-301(检查点治疗剂)，KN035(3D Med/Alphamab；参见Zhang et al.，2017，CellDiscov.3：17004)、阿特珠单抗(TECENTRIQ；RG7446；MPDL3280A；R05541267；参见US 9,724,413)、BMS-936559(Bristol Myers Squibb；参见US 7,943,743、WO 2013/173223)、阿维单抗(bavencio；参见US2014/0341917)、LY3300054(Eli Lilly Co.)、CX-072(Proclaim-CX-072；也称为CytomX；参见WO2016/149201)、FAZ053、KN035(参见WO2017020801和WO2017020802)、MDX-1105(参见US2015/0320859)，在US 7,943,743中公开的抗PD-L1抗体，包括3G10、12A4(也称为BMS-936559)、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4，如在
WO 2010/077634，US 8,217,149，WO 2010/036959，WO 2010/077634，WO 2011/066342，US 8,217,149，US 7,943,743，WO 2010/089411，US 7,635,757，US 8,217,149，US2009/0317368，WO 2011/066389，WO2017/034916，WO2017/020291，WO2017/020858，WO2017/020801，WO2016/111645，WO2016/197367，WO2016/061142，WO2016/149201，WO2016/000619，WO2016/160792，WO2016/022630，WO2016/007235，WO2015/179654，WO2015/173267，WO2015/181342，WO2015/109124，WO 2018/222711，WO2015/112805，WO2015/061668，WO2014/159562，WO2014/165082，WO2014/100079
中所述的抗PD-L1抗体。
在某一实施方案中，PD-L1抑制剂是阿特珠单抗(TECENTRIQ；RG7446；MPDL3280A；R05541267；参见US 9,724,413)。
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是这样的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含上述抗PD-L1抗体或抗原结合片段中之一的互补决定区(CDR)，例如阿特珠单抗或其抗原结合片段的CDR。
在一些实施方案中，使用Kabat编号方案(Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Healthand Human Services，NTH Publication No.91-3242)来描述抗PD-L1抗体的CDR。
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是这样的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含上述抗PD-L1抗体或抗原结合片段中之一的重链可变区和轻链可变区，例如阿特珠单抗或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区。
本公开内容的抗PD-L1抗体优选为单克隆抗体，并且可以是多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表达文库产生的片段以及上任一者的PD-L1结合片段。在一些实施方案中，本文中所述的抗PD-L1抗体与PD-L1(例如，人PD-L1)特异性结合。本公开内容的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
在本公开内容的某些实施方案中，抗PD-1抗体是如本文中所述的抗原结合片段(例如，人抗原结合片段)，并且包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗原结合片段，包括单链抗体，可包含单独的可变区或与以下的整体或一部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域。本公开内容还包含抗原结合片段，其包含可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域的任意组合。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
本文中公开的抗PD-L1抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或更高的多特异性的。多特异性抗体可对PD-L1的不同表位具有特异性，或者可对PD-L1和异源蛋白二者均具有特异性。参见例如
PCT公开WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；wO 92/05793；Tutt，et al.，1991，J.Immunol.147：60 69；U.S.P，at.Nos.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny et al.，1992，J.Immunol.148：1547 1553.
本文中公开的抗PD-L1抗体可就其包含的特定CDR来描述或指定。给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可使用许多公知的方案的任一种来容易地确定，包括由以下描述的那些：
Kabat et al.(1991)，″Sequences of Proteins of Immnnological Interest，″5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(″kabat″编号方案)；Al-Lazikani et al.，(1997)JMB273，927-948(″Chothia″编号方案)；MacCallum et al.，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)、″Antibody-antigen interactions：Contact analysis and binding site topography，″J.Mol.Biol.262，732-745.”(″Contact″编号方案)；Lefranc MP et al，″IMGT unique numbering for immunoglobulinand T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains，″DevComp Immunol，2003；27(1)：55-77(″IMGI″编号方案)；Honegger A aud Plückthun A，″Yetanother numbering scheme for immunoglobulin variable domains：an automaticmodeling and analysis tool，″J Mol Biol，2001；309(3)：657-70，(″Aho″编号方案)；andMartin et al，″Modeling antibody hypervariable loops：a combined algorithm，″PNAS，1989，86(23)：9268-9272，(″AbM″编号方案)。
给定CDR的边界可根据所使用的用于鉴定的方案而变化。在一些实施方案中，给定抗体或其区域(例如，其可变区)的CDR或单个特定CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)应被理解为涵盖了由任何前述方案定义的(或特异性)CDR。例如，如任何前述方案所定义的，其中陈述为特定的CDR(例如，CDR-H3)包含给定VM或VL区氨基酸序列中相应CDR的氨基酸序列时，应理解为这样的CDR在可变区内具有相应CDR(例如，CDR-H3)的序列。可指定用于鉴定特定CDR的方案，例如由Kabat、Chothia、AbM或IMGT方法定义的CDR。
在一些实施方案中，本文中提供的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的CDR序列中氨基酸残基的编号是根据如Lefranc，M.P.et al.，Dev.Comp.Immunol.，2003，27，55-77中所述的IMGT编号方案进行的。
在一些实施方案中，本文中公开的抗PD-L1抗体包含抗体阿特珠单抗的CDR。参见US 9,724,413。在一些实施方案中，使用Kabat编号方案(Kabat，E.A.，et a1.(1991)Sequences ofProteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department ofHealth and Human Services，NTH Publication No.91-3242)来描述抗体阿特珠单抗的CDR。本公开内容涵盖了包含重链可变结构域或轻链可变结构域的抗PD-L1抗体或其衍生物，所述可变结构域包含(a)三个CDR的组，其中所述CDR的组来自单克隆抗体阿特珠单抗，和(b)四个框架区的组，其中所述框架区的组不同于单克隆抗体阿特珠单抗中的框架区的组，并且其中所述抗PD-L1抗体或其衍生物与PD-L1结合。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。
本文中公开的抗PD-L1抗体也可就其与PD-L1(例如，人PD-L1)的结合亲和力进行描述或说明。优选的结合亲和力包括具有的解离常数或Kd小于
5x10-2M，10-2M，5x10-3M，10-3M，5x10-4M，10-4M，5x10-5M，10-5M，5x10-6M，10-6M，5x10- 7M，10-7M，5x10-8M，10-8M，5x10-9M，10-9M，5x10-10M，10-10M，5x10-11M，10-11M，5x10-12M，10-12M，5x10-13M，10-13M，5x10-14M，10-14M，5x10-15M，或10-15M
的那些。
抗PD-L1抗体还包含经修饰的衍生物和构建体，即通过将任何类型的分子与抗体共价连接，使得共价连接不会阻止抗体与PD-L1结合。例如，而非通过限制的方式，抗PD-L1抗体衍生物包括已经被修饰的抗体，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接等。多种化学修饰中的任一种均可通过已知技术进行，包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物或构建体可包含一个或更多个非经典氨基酸。
示例性CTLA-4抑制剂包括但不限于单克隆抗体伊匹单抗(Yervoy；Bristol MyersSquibb)和曲美木单抗(Pfizer/Medlmmune)，trevilizumab，AGEN-1884(Agenus)和ATOR-1015，在WO 2001/014424、US 2005/0201994、EP 1212422、US 5,811,097、US 5,855,887、US6,051,227、US 6,682,736、US 6,984,720、WO 01/14424、WO 00/37504、US 2002/0039581、US2002/086014、WO 98/42752、US 6,207,156、US 5,977,318、US 7,109,003和US 7,132,281中公开的抗CTLA4抗体，显性负蛋白阿巴西普(Orencia；参见EP 2 855 533)，其包含与CTLA-4ECD融合的IgG 1的Fe区，以及贝拉西普(Nulojix；参见WO 2014/207748)，其是相对于阿巴西普在CTLA-4ECD中具有两个氨基酸替换的第二代更高亲和力CTLA-4-Ig变体，可溶性CTLA-4多肽，例如RG2077和CTLA4-IgG4m(参见US 6,750,334)，针对CTLA-4的抗CTLA-4适配体和siRNA，例如，如US2015/203848中所公开。示例性的CTLA-4配体抑制剂在Pile etal.,2015(Encyclopedia of Inflammatory Diseases,M.Parnham(ed.),doi:10.1007/978-3-0348-0620-6_20)中描述。
TIGIT信号传导途径的示例性检查点抑制剂包括但不限于抗TIGIT抗体，例如BMS-986207、COM902(CGEN-15137；Compugen)、AB154(Arcus Biosciences)或etigilimab(OMP-313M32；OncoMed Pharmaceuticals)，或者在WO2017/059095(特别是“MAB10”)、US2018/0185482、WO 2015/009856和US2019/0077864中公开的抗体。
B7-H3的示例性检查点抑制剂包括但不限于Fc优化的单克隆抗体依诺妥珠单抗(enoblituzumab)(MGA271；Macrogenics；参见US 2012/0294796)以及抗B7-H3抗体MGD009(Macrogenics)和皮地利珠单抗(参见US 7,332,582)。
示例性B7-H4抑制剂包括但不限于如在Dangaj et al.,2013(Cancer Research73:4820-9)中和在Smith et al.,2014(Gynecol Oncol,134:181-189)、WO 2013/025779(例如，由SEQ ID NO:3和4编码的2D1、由SEQ ID NO:37和39编码的2H9和由SEQ ID NO:41和43编码的2E11)中以及在WO 2013/067492(例如，具有选自SEQ ID NO:1至8的氨基酸序列的抗体)中所述的抗体、吗啉代反义寡核苷酸，例如，如由Kryczek etal.,2006(J Exp Med,203:871-81)所述、或B7-H4的可溶性重组形式，如US2012/0177645中公开的。
示例性BTLA抑制剂包括但不限于在Crawford and Wherry,2009(JLeukocyteBiol 86:5-8)、WO 2011/014438(例如，4C7或包含根据SEQ ID NO:8和15和/或根据SEQ IDNO:11和18的重链和轻链的抗体)、WO 2014/183885(例如，以编号CNCM I-4752保存的抗体)和US2018/155428中所述的抗BTLA抗体。
KIR信号传导的示例性抑制剂包括但不限于单克隆抗体利瑞单抗(lirilumab)(1-7F9；IPH2102；参见US 8,709,411)、IPH4102(Innate Pharma；参见Marie-Cardine et al.,2014,Cancer 74(21):6060-70)、如例如在US 2018/208652、US2018/117147、US2015/344576、WO 2005/003168、WO 2005/009465、WO 2006/072625、WO 2006/072626、WO 2007/042573、WO 2008/084106(例如，包含根据SEQ ID NO:2和3的重链和轻链的抗体)、WO 2010/065939、WO 2012/071411、WO 2012/160448和WO 2014/055648中公开的抗KIR抗体。
示例性LAG-3抑制剂包括但不限于抗LAG-3抗体BMS-986016(Bristol-MyersSquibb；参见WO 2014/008218和WO 2015/116539)，25F7(参见US2011/0150892)，IMP731(参见WO 2008/132601)，H5L7BW(参见WO2014140180)，MK-4280(28G-10；Merck；参见WO 2016/028672)，REGN3767(Regneron/Sanofi)，BAP050(参见WO 2017/019894)，IMP-701(LAG-525；Novartis)Sym022(Symphogen)，TSR-033(Tesaro)，MGD013(MacroGenics开发的靶向LAG-3和PD-1的双特异性DART抗体)，BI754111(Boehringer Ingelheim)，FS118(F-star开发的靶向LAG-3和PD-1的双特异性抗体)，GSK2831781(GSK)以及如WO 2009/044273、WO 2008/132601、WO 2015/042246、EP 2 320 940、US2019/169294、US 2019/169292、WO 2016/028672、WO 2016/126858、WO 2016/200782、WO 2015/200119、WO 2017/220569、WO 2017/087589、WO 2017/219995、WO 2017/019846、WO 2017/106129、WO 2017/062888、WO 2018/071500、WO 2017/087901、US2017/0260271、WO 2017/198741、WO2017/220555、WO2017/015560、WO2017/025498、WO2017/149143、WO 2018/069500、WO2018/083087、WO2018/034227、WO2014/140180中公开的抗体，LAG-3拮抗性蛋白AVA-017(Avacta)，可溶性LAG-3融合蛋白IMP321(eftilagimod alpha；Immutep；参见EP 2 205 257和Brignone et al.,2007,J.Immunol.,179:4202-4211)，以及在WO 2018/222711中公开的可溶性LAG-3蛋白。
示例性TIM-3抑制剂包括但不限于靶向TIM-3的抗体，例如F38-2E2(BioLegend)，考伯利单抗(cobolimab)(TSR-022；Tesaro)，LY3321367(Eli Lilly)，MBG453(Novartis)以及如在例如WO 2013/006490、WO 2018/085469(例如，包含由根据SEQ ID NO:3和4的核酸序列编码的重链和轻链序列的抗体)、WO 2018/106588、WO 2018/106529(例如，包含根据SEQID NO:8至11的重链和轻链序列的抗体)中公开的抗体。
示例性TIM-3配体抑制剂包括但不限于CEACAM1抑制剂，例如抗CEACAM1抗体CM10(cCAM Biotherapeutics；参见WO 2013/054331)，在WO 2015/075725中公开的抗体(例如CM-24、26H7、5F4、TEC-11、12-140-4、4/3/17、COL-4、F36-54、34B1、YG-C28F2、D14HD11、M8.7.7、D11-AD11、HEA81、B l.l、CLB-gran-10、F34-187、T84.1、B6.2、B 1.13、YG-C94G7、12-140-5、scFv DIATHIS1、TET-2；cCAM Biotherapeutics)，Watt et al.,2001(Blood,98:1469-1479)和WO 2010/12557中所述的抗体，以及PtdSer抑制剂，例如巴维昔单抗(bavituximab)(Peregrine)。
示例性CD94/NKG2A抑制剂包括但不限于，莫那利珠单抗(monalizumab)(IPH2201；Innate Pharma)以及如在US 9,422,368(例如，人源化Z199；参见EP 2 628 753)、EP 3 193929和WO2016/032334(例如，人源化Z270；参见EP 2 628 753)中公开的抗体及其制备方法。
示例性IDO抑制剂包括但不限于exiguamine A，epacadostat(INCB024360；InCyte；参见US 9,624,185)，indoximod(Newlink Genetics；CAS#：110117-83-4)，NLG919(Newlink Genetics/Genentech；CAS#：1402836-58-1)，GDC-0919(Newlink Genetics/Genentech；CAS#：1402836-58-1)，F001287(Flexus Biosciences/BMS；CAS#：2221034-29-1)，KHK2455(Cheong et al.,2018,Expert Opin Ther Pat.28(4):317-330)，PF-06840003(参见WO 2016/181348)，navoximod(RG6078，GDC-0919，NLG919；CAS#：1402837-78-8)，linrodostat(BMS-986205；Bristol-Myers Suibb；CAS#：1923833-60-6)，小分子，例如1-甲基-色氨酸、吡咯烷-2,5-二酮衍生物(参见WO 2015/173764)，以及由Sheridan,2015,NatBiotechnol33:321-322公开的IDO抑制剂。
示例性CD39抑制剂包括但不限于A001485(Arcus Biosciences)，PSB 069(CAS#:78510-31-3)以及抗CD39单克隆抗体IPH5201(Innate Pharma；参见Perrot et al.,2019,Cell Reports 8:2411-2425.E9)。
示例性CD73抑制剂包括但不限于抗CD73抗体，例如CPI-006(CorvusPharmaceuticals)，MEDI9447(MedImmune；参见WO2016075099)，IPH5301(Innate Pharma；参见Perrot et al.,2019,Cell Reports 8:2411-2425.E9)，WO2018/110555所述的抗CD73抗体，小分子抑制剂PBS12379(Tocris Bioscience；CAS#：1802226-78-3)，A000830，A001190以及A001421(Arcus Biosciences；参见Becker et al.,2018,Cancer Research78(13Supplement):3691-3691,doi:10.1158/1538-7445.AM2018-3691)，CB-708(Calithera Biosciences)以及如由Allard et al.,2018(Immunol Rev.,276(1):121-144)所述的基于嘌呤细胞毒性核苷类似物的二膦酸盐。
示例性A2AR抑制剂包括但不限于小分子抑制剂，例如istradefylline(KW-6002；CAS#:155270-99-8)，PBF-509(Palobiopharma)，ciforadenant(CPI-444：Corvus Pharma/Genentech；CAS#：1202402-40-1)，ST1535([2丁基-9-甲基-8-(2H-1,2,3-三唑2-基)-9H-嘌呤-6-xylamine]；CAS#：496955-42-1)，ST4206(参见Stasi et al.,2015,Europ J Pharm761:353-361；CAS#：1246018-36-9)，tozadenant(SYN115；CAS#：870070-55-6)，V81444(参见WO 2002/055082)，preladenant(SCH420814；Merck；CAS#：377727-87-2)，vipadenant(BIIB014；CAS#：442908-10-3)，ST1535(CAS#：496955-42-1)，SCH412348(CAS#：377727-26-9)，SCH442416(Axon 2283；Axon Medchem；CAS#：316173-57-6)，ZM241385(4-(2-(7-氨基-2-(2-呋喃基)-(1,2,4)三唑并(2,3-a)-(1,3,5)三嗪-5-基-氨基)乙基)酚；Cas#：139180-30-6)，AZD4635(AstraZeneca)，AB928(双重A2AR/A2BR小分子抑制剂；Arcus Biosciences)以及SCH58261(参见Popoli et al.,2000,Neuropsychopharm 22:522-529；CAS#:160098-96-4)。
示例性A2BR抑制剂包括但不限于AB928(双重A2AR/A2BR小分子抑制剂；ArcusBiosciences)，MRS1706(CAS#：264622-53-9)，GS6201(CAS#：752222-83-6)以及PBS1115(CAS#：152529-79-8)。
示例性VISTA抑制剂包括但不限于抗VISTA抗体，例如JNJ-61610588(onvatilimab；Janssen Biotech)和小分子抑制剂CA-170(抗PD-L1/L2和抗VISTA的小分子；CAS#：1673534-76-3)。
示例性Siglec抑制剂包括但不限于在US2019/023786和WO 2018/027203中公开的抗Sigle-7抗体(例如，包含根据SEQ ID NO:1的重链可变区和根据SEQ ID NO:15的轻链可变区的抗体)，抗Siglec-2抗体奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)(Besponsa；参见US8,153,768和US 9,642,918)，抗Siglec-3抗体吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumabozogamicin)(Mylotarg；参见US 9,359,442)，或者在US2019/062427、US2019/023786、WO2019/011855、WO 2019/011852(例如，包含根据SEQ ID NO:171至176、或3和4、或5和6、或7和8、或9和10、或11和12、或13和14、或15和16、或17和18、或19和20、或21和22、或23和24、或25和26的CDR的抗体)、US2017/306014和EP 3 146 979中公开的抗Siglec-9抗体。
示例性CD20抑制剂包括但不限于抗CD20抗体，例如利妥昔单抗(rituximab)(RITUXAN；IDEC-102；IDEC-C2B8；参见US 5,843,439)、ABP798(利妥昔单抗生物仿制药)、奥法木单抗(ofatumumab)(2F2；参见W02004/035607)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥美珠单抗(ocrelizumab)(2h7；参见2004/056312)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin)、托西莫单抗(tositumomab)、优利妥昔单抗(ublituximab)(LFB-R603；LFBBiotechnologies)以及US2018/0036306中公开的抗体(例如，包含根据SEQ ID NO:1至3和4至6，或7和8，或9和10的轻链和重链的抗体)。
示例性GARP抑制剂包括但不限于抗GARP抗体，例如ARGX-115(arGEN-X)以及如US2019/127483、US2019/016811、US2018/327511、US2016/251438、EP 3 253 796中公开的抗体及其制备方法。
示例性CD47抑制剂包括但不限于抗CD47抗体，例如HuF9-G4(StanfordUniversity/Forty Seven)，CC-90002/INBRX-103(Celgene/Inhibrx)，SRF231(SurfaceOncology)，IBI188(Innovent Biologics)，AO-176(Arch Oncology)，靶向CD47的双特异性抗体，包括TG-1801(NI-1701；靶向CD47和CD19的双特异性单克隆抗体；Novimmune/TGTherapeutics)和NI-1801(靶向CD47和间皮素的双特异性单克隆抗体；Novimmune)，以及CD47融合蛋白，例如ALX148(ALX Oncology；参见Kauder et al.,2019,PLoS One,doi:10.1371/journal.pone.0201832)。
示例性SIRPα抑制剂包括但不限于抗SIRPα抗体，例如OSE-172(BoehringerIngelheim/OSE)、FSI-189(Forty Seven)、抗SIRPα融合蛋白，例如TTI-621和TTI-662(Trillium Therapeutics；参见WO 2014/094122)。
示例性PVRIG抑制剂包括但不限于抗PVRIG抗体，例如COM701(CGEN-15029)和在例如WO 2018/033798(例如CHA.7.518.1H4(S241P)、CHA.7.538.1.2.H4(S241P)、CPA.9.086H4(S241P)、CPA.9.083H4(S241P)、CHA.9.547.7.H4(S241P)、CHA.9.547.13.H4(S241P)中公开的抗体及其制造方法，以及WO 2018/033798中包含根据SEQ ID NO:5的可变重结构域和根据SEQ ID NO:10的可变轻结构域的抗体，或者包含根据SEQ ID NO:9的重链和根据SEQ IDNO:14的轻链的抗体；WO 2018/033798还公开了抗TIGIT抗体以及抗TIGIT与抗PVRIG抗体的组合治疗)，WO2016134333、WO2018017864(例如，包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的根据SEQ ID NO:5至7的重链和/或与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的根据SEQ ID NO:8至10的轻链的抗体，或者由SEQ ID NO:13和/或14或者SEQ ID NO:24和/或29编码的抗体，或者在WO 2018/017864中公开的其他抗体)，以及如WO 2016/134335中公开的抗PVRIG抗体和融合肽。
示例性CSF1R抑制剂包括但不限于抗CSF1R抗体卡比利珠单抗(cabiralizumab)(FPA008；FivePrime；参见WO 2011/140249、WO 2013/169264和WO 2014/036357)、IMC-CS4(EiiLilly)、emactuzumab(R05509554；Roche)、RG7155(WO 2011/70024、WO 2011/107553、WO 2011/131407、WO 2013/87699、WO 2013/119716、WO 2013/132044)以及小分子抑制剂BLZ945(CAS#：953769-46-5)和pexidartinib(PLX3397；Selleckchem；CAS#：1029044-16-3)。
示例性CSF1抑制剂包括但不限于在EP 1 223 980和Weir et al.,1996(J BoneMineral Res 11:1474-1481)、WO 2014/132072中公开的抗CSF1抗体，以及如WO 2001/030381中公开的反义DNA和RNA。
示例性NOX抑制剂包括但不限于NOX1抑制剂，例如小分子ML171(Gianni et al.,2010,ACS Chem Biol 5(10):981-93)、NOS31(Yamamoto etal.,2018,Biol Pharm Bull.41(3):419-426)，NOX2抑制剂，例如小分子ceplene(二盐酸组胺；CAS#：56-92-8)、BJ-1301(Gautam et al.,2017,Mol Cancer Ther 16(10):2144-2156；CAS#：1287234-48-3)和Luet al.,2017,Biochem Pharmacol 143:25-38所述的抑制剂，NOX4抑制剂，例如小分子抑制剂VAS2870( et al.,2012,Cell Mol Life Sciences69(14):2327-2343)、二亚苯基碘/>(CAS#：244-54-2)和GKT137831(CAS#：1218942-37-0；参见Tang et al.,2018,19(10):578-585)。
示例性TDO抑制剂包括但不限于4-(吲哚-3-基)-吡唑衍生物(参见US 9,126,984和US2016/0263087)，3-吲哚取代的衍生物(参见WO 2015/140717、WO 2017/025868、WO2016/147144)，3-(吲哚-3-基)-吡啶衍生物(参见US2015/0225367和WO 2015/121812)，双重IDO/TDO拮抗剂，例如在WO 2015/150097、WO 2015/082499、WO 2016/026772、WO 2016/071283、WO 2016/071293、WO 2017/007700中公开的小分子双重IDO/TDO抑制剂，以及小分子抑制剂CB548(Kim,C,et al.,2018,Annals Oncol 29(增刊_8):viii400-viii441)。
根据本公开内容，免疫检查点抑制剂是抑制性检查点蛋白的抑制剂但优选不是刺激性检查点蛋白的抑制剂。
在一个优选实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体，特别是拮抗或阻断抗体，其破坏或抑制本文中所述抑制性免疫检查点信号传导途径之一，特别是选自以下的抑制性免疫检查点信号传导途径之一：PD-1途径(PD-1与其一种或更多种配体(例如PD-L1和/或PD-L2)的相互作用)，CTLA-4途径(CTLA-4与其一种或更多种配体(如CD80或CD86)的相互作用)，TIM-3途径(TIM-3与其一种或更多种配体(如Galectin-9、PtdSer、HMGB1和CEACAM1)的相互作用)，KIR途径(KIR与其一种或更多种配体的相互作用)，LAG-3途径(LAG-3与其一种或更多种配体的相互作用)，TIGIT途径(TIGIT与其一种或多种配体(如PVR、PVRL2和PVRL3)的相互作用)，VISTA途径(VISTA与其一种或更多种配体的相互作用)，以及GARP途径(GARP与其一种或更多种配体的相互作用)。在一个优选实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体，特别是拮抗或阻断抗体，其破坏或抑制选自PD-1途径(PD-1与其一种或更多种配体(如PD-L1和/或PD-L2)的相互作用)，CTLA-4途径(CTLA-4与其一种或更多种配体(如CD80或CD86)的相互作用)的抑制性免疫检查点信号传导途径之一。在一个优选实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体，特别是拮抗或阻断抗体，其破坏或抑制PD-1途径(PD-1与其一种或更多种配体(如PD-L1和/或PD-L2)的相互作用)。在一个优选实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体，特别是拮抗或阻断抗体，其破坏或抑制PD-1与PD-L1之间的相互作用。
检查点抑制剂可以以编码免疫检查点抑制剂(例如，抑制性核酸分子或抗体或其片段)的核酸(如DNA或RNA分子)的形式施用。例如，如本文中所述，抗体可在表达载体中递送，编码。核酸分子可以其本身递送，例如以质粒或mRNA分子的形式，或者与递送载剂复合，例如脂质体、脂质复合物或核酸脂质颗粒。检查点抑制剂也可通过包含编码检查点抑制剂的表达盒的溶瘤病毒施用。检查点抑制剂也可通过施用能够表达检查点抑制剂的内源性或同种异体细胞来施用，例如以基于细胞的治疗的形式。
在一个实施方案中，基于细胞的治疗包括经遗传改造细胞。在一个实施方案中，经遗传改造细胞表达免疫检查点抑制剂，例如本文中所述。在一个实施方案中，经遗传改造细胞表达免疫检查点抑制剂，该免疫检查点抑制剂是抑制性核酸分子，例如siRNA、shRNA、寡核苷酸、反义DNA或RNA、适配体、抗体或其片段或者可溶性免疫检查点蛋白或融合物。经遗传改造细胞还可表达增强T细胞功能的另外的物质。这样的物质是本领域已知的。用于抑制免疫检查点信号传导的基于细胞的治疗公开于例如WO 2018/222711中，其通过引用整体并入本文。
优选地，以合适的量施用检查点抑制剂，即，例如在每个剂量和/或治疗周期中，施用的检查点抑制剂的量可全部或部分降低、抑制、干扰或负调节一种或更多种检查点蛋白，或者可全部或部分降低、抑制、干扰或负调节一种或更多种检查点蛋白的表达。因此，根据本公开内容的合适量的检查点抑制剂能够全部或部分降低、抑制、干扰或负调节一种或更多种检查点蛋白，或者能够全部或部分降低、抑制、干扰或负调节一种或更多种检查点蛋白的表达。因此，检查点抑制剂优选阻止与免疫检查点相关的抑制性信号，其导致阻止或逆转免疫抑制，并建立或增强针对癌细胞的T细胞免疫。
在每个剂量和/或治疗周期中施用的检查点抑制剂的量可特别在一定范围内，其中大于5％，优选大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％，甚至更优选大于25％，甚至更优选大于30％，甚至更优选大于35％，甚至更优选大于40％，甚至更优选大于45％，最优选大于50％的所述检查点抑制剂与检查点蛋白结合。
在优选的实施方案中，例如在每个剂量和/或每个治疗周期中施用的检查点抑制剂的量为
a)总共约100至200mg；和/或
b)总共约0.20×10-9至1350×10-9mol。
检查点抑制剂可以以任何方式以及通过本领域已知的任何途径施用。施用方式和途径将取决于待使用的检查点抑制剂的类型。在一个优选实施方案中，全身性地施用检查点抑制剂，例如肠胃外施用，特别是静脉内施用。
检查点抑制剂可以以如本文中所述的任何合适的药物组合物的形式施用。在一个优选实施方案中，检查点抑制剂以输注的形式施用。
另外的治疗剂
除了结合剂和检查点抑制剂之外，根据本公开内容第一方面的治疗方案还可包括向对象施用一种或更多种另外的治疗剂。
在一个实施方案中，一种或更多种另外的治疗剂包含一种或更多种化学治疗剂，特别是通常用于治疗本文中所述的肿瘤或癌症的那些化学治疗剂。例如，一种或更多种化学治疗剂包括基于铂的化合物(例如，顺铂、奥沙利铂和卡铂)，基于紫杉烷的化合物(例如，紫杉醇和nab-紫杉醇)，核苷类似物(例如，5-氟尿嘧啶和吉西他滨)及其组合(例如，顺铂/卡铂+5-氟尿嘧啶或nab-紫杉醇+吉西他滨)。
对象和待治疗的肿瘤或癌症
根据本公开内容待治疗的对象优选为人对象。
待治疗的肿瘤或癌症可以是任何肿瘤或癌症。肿瘤/癌症的实例包括但不限于上皮癌，淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病，例如骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤黑素瘤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、结直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(central nervous system，CNS)赘生物、神经外胚层癌症、脊柱轴肿瘤、胶质瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤。
在一个实施方案中，待治疗的肿瘤或癌症为非中枢神经系统(CNS)肿瘤或癌症，例如非CNS恶性肿瘤。
优选地，肿瘤或癌症可选自黑素瘤、卵巢癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC))、结直肠癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、尿路上皮癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、胸腺瘤和胸腺癌、脑癌、胶质瘤、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、其他皮肤癌、肉瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、子宫内膜癌、前列腺癌、阴茎癌、宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)以及间皮瘤。更优选地，肿瘤或癌症选自黑素瘤、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和头颈癌。
在一个优选实施方案中，待治疗的肿瘤或癌症是实体瘤或癌症。在一个实施方案中，待治疗的肿瘤或癌症是非CNS实体瘤或癌症，例如非CNS实体恶性肿瘤。
肿瘤或癌症尤其可以是黑素瘤。皮肤黑素瘤是第十七种最常见的恶性肿瘤，估计年龄标准化发生率为3.4/100,000。全世界，在2020年，预计大约有324,635例皮肤黑素瘤的新病例和57,043例死亡病例(GLOBOCAN，2020)。患有局部或远处疾病患者的五年存活结果分别为约66％和27％(SEER，2018)。在一线(1L)环境中，靶向治疗和免疫检查点(immunecheckpoint，ICP)抑制剂已被批准用于单独或组合治疗晚期或转移性黑素瘤。虽然组合治疗如程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)加细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂与改善的结局相关，但患者会经历更频繁和更严重的免疫相关不良事件(irAE)(NCCN，2021c)。旨在增强效力和限制毒性的新组合方法为改善现有护理标准(standard of care，SOC)提供了机会。在靶向治疗或免疫治疗中有进展的晚期或转移性黑素瘤患者通常接受具有适度响应率的细胞毒性治疗；因此，在二线(2L)和后期(2L+)环境中，还有高度未满足的医疗需求(NCCN，2021c)。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是黑素瘤，所述肿瘤或癌症不是眼(葡萄膜)或黏膜黑素瘤。在一个实施方案中，肿瘤或癌症是皮肤或肢端黑素瘤。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是黑素瘤，所述黑素瘤是不可切除的黑素瘤，特别是不可切除的III期或IV期黑素瘤(优选地，根据美国癌症联合委员会(AmericanJoint Committee on Cancer，AJCC；版本8)的分期系统)。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是黑素瘤，对象先前尚未接受过对不可切除或转移性黑素瘤的全身性抗癌治疗，即在根据第一方面的治疗之前，所述对象尚未接受过对不可切除或转移性黑素瘤的全身性抗癌治疗。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症为黑素瘤，对象具有根据当地标准测试(优选FDA批准的测试)的已知的肿瘤BRAF突变状态。对于这样的对象，特别是对于患有BRAFV600E突变体黑素瘤的对象，优选满足以下标准中的一个或更多个(优选全部)：(I)乳酸脱氢酶<正常的局部上限；(ii)根据研究者的判断，没有临床显著的肿瘤相关症状；以及(iii)根据研究者的判断，不存在快速进展的转移性黑素瘤。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症为黑素瘤，对象先前尚未接受过用免疫检查点(ICP)抑制剂进行的治疗，即，在根据第一方面的治疗之前，所述对象尚未接受过用ICP抑制剂进行的治疗(换句话说，所述对象未接受过ICP抑制剂(CPI-初始(naive))。
肿瘤或癌症特别可以是结直肠癌。结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是男性中第三最常被诊断的癌症，在女性中为第二最常被诊断的癌症。在全世界，2020年估计约有1,931,590例新的CRC病例和935,173例死亡病例(GLOBOCAN，2020)。在美国，诊断时患有区域性疾病的患者的五年相对存活率为71％，诊断时患有远端疾病的患者的五年相对存活率为14％(SEER，2018)。晚期或转移性疾病的推荐初始治疗选择取决于患者是否是强化治疗的候选者。更加强化的初始治疗选择包括5-氟尿嘧啶(5-FU)/甲酰四氢叶酸与奥沙利铂(FOLFOX)、5-FU/甲酰四氢叶酸与伊立替康(FOLFIRI)、卡培他滨与奥沙利铂、以及5-FU、奥沙利铂和伊立替康(FOLFOXIRI)。添加生物剂(例如贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab))与这些方案中的一些而组合也是一种选择(NCCN，2021a)。虽然靶向剂例如贝伐单抗和西妥昔单抗的批准已改善了患有转移性CRC患者的结局，但目前批准的所有靶向剂要么靶向VEGF途径，要么靶向EGFR途径。因此，仍然需要具有新作用机制(MoA)的新药剂，尤其是对于含有RAS(KRAS，NRAS)或BRAF突变的肿瘤的患者，以及对于在经可用的治疗选择后疾病已有进展的患者。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症为CRC，对象先前尚未接受过用免疫检查点(ICP)抑制剂进行的治疗，即，在根据第一方面的治疗之前，所述对象尚未接受过用ICP抑制剂的治疗。
肿瘤或癌症特别可以是肺癌。所述肺癌可以是非小细胞肺癌(NSCLC)，例如鳞状或非鳞状NSCLC。肺癌是第二最常见的恶性肿瘤，具有22.4/100,000的预计的年龄标准化发生率，并且是男性和女性双方癌症死亡的首要原因(Kantar，2021)。全世界中，2020年预计约有2,206,771例新肺癌病例和1,796,144例死亡病例(GLOBOCAN，2020年)。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有病例的85％至90％，在疾病的整个全部阶段中，5年存活率为约18％，对转移性疾病来说其仅为3.5％(Jemal et al.，2011)(Kantar,2021；SEER,2018)。在1L环境中，治疗通常由免疫治疗或靶向治疗与基于铂的化学治疗组合组成，这取决于分子和生物标志物分析以及肿瘤的组织学(NCCN，2021d)。最近，PD-1和程序性死亡配体1(programmed deathligand 1，PD-L1)抑制剂的出现改善了无驱动突变患者(约62％的非鳞状群体和77％的鳞状群体(Kantar，2021))的结局。对于其肿瘤不含有某些致癌突变或不表达针对检查点抑制剂(CPI)选项的生物标志物的患者，需要更多的治疗替代选择。增强响应的与补充方法的新的组合可进一步解决该群体中未满足的需求。对于处于2L环境中的患者，SOC限于基于铂的化学治疗、CPI单一治疗或者多西他赛加或不加雷莫卢单抗(ramucirumab)，这取决于此前接受的治疗。对于处于三线(3L)环境中的患者，化学治疗单一治疗是标准。需要新的治疗来限制毒性，并在该群体中潜在地增强效力(NCCN，2021d)。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是肺癌，该肿瘤或癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)，例如鳞状或非鳞状NSCLC。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是肺癌，特别是NSCLC，所述肿瘤或癌症不具有表皮生长因子(epidermal growth factor，EGFR)-敏感突变和/或间变性淋巴瘤(ALK)转移/ROS1重排。对于已知具有主要为鳞状组织学之肿瘤的对象，如果符合当地SOC，则不需要进行EGFR突变和ALK转移的分子测试。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是肺癌，特别是NSCLC，所述肿瘤或癌症包含癌细胞，并且PD-L1在≥1％的癌细胞中表达。这样的表达可以通过技术人员已知的任何手段和方法来确定，例如通过由当地SOC测试(优选FDA批准的测试)或在中心实验室确定的免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是肺癌，对象具有经组织学确认的IV期转移性或复发性NSCLC(AJCC第8版)的诊断，先前没有给予作为晚期或转移性疾病的主要治疗的全身性抗癌治疗。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症为肺癌，对象先前尚未接受过用免疫检查点(ICP)抑制剂的治疗，即，在根据第一方面的治疗之前，所述对象尚未接受过用ICP抑制剂的治疗。
肿瘤或癌症特别可以是头颈癌。全世界每年诊断超过600,000例头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)。在2020年，美国同期将出现约65,630例口腔癌、咽癌和喉癌的新病例，估计有14,500例死亡(NCCN，2021b)。烟草使用、酒精使用、和人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染提高了发生HNSCC的风险。与患有HPV阴性疾病的患者相比，患有局部HPV阳性HNSCC的患者具有改善的治疗结果。对于患有复发或转移性HNSCC的患者，派姆单抗/铂(顺铂或卡铂)/5-FU和派姆单抗单一治疗(对于PD-L1组合阳性评分(combined positive score，CPS)≥20或≥1的患者)是推荐的1L方案；然而，中位总存活(median overall survival，mOS)低于15个月(NCCN，2021b)。因此，HNSCC仍是医疗需求高度未满足的领域，并且存在用新的治疗方法改善结果的进一步的机会。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是头颈癌，所述肿瘤或癌症是鳞状细胞癌(HNSCC)。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是头颈癌，经组织学或细胞学确认的复发性或转移性HNSCC被认为无法通过局部治疗治愈。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是头颈癌，对象尚未在复发性或转移性环境中有过先前施用的全身性治疗。如果全身性治疗是作为局部晚期疾病多模式治疗的一部分而给予，则在签署同意书之前超过6个月完成的全身性治疗是允许的。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症为头颈癌，符合条件的原发性肿瘤位置为口咽、口腔、下咽和喉。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症为头颈癌，对象不具有鼻咽(任何组织学)的原发性肿瘤部位。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症为头颈癌，对象具有肿瘤PD-L1IHC组合阳性评分(CPS)≥1(其可通过当地(优选FDA批准的测试)或者中心实验室测试(扩增阶段要求进行中心测试)来确定)。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是口咽癌，对象具有人乳头瘤病毒(HPV)p16测试结果(优选可通过当地SOC获得)。口腔癌、下咽癌和喉癌不需要进行通过p16 IHC的HPV测试，因为按照惯例，这些肿瘤部位被假定为HPV阴性。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症为头颈癌，对象尚未接受过用免疫检查点(ICP)抑制剂的治疗，即，在根据第一方面的治疗之前，所述对象尚未接受过用ICP抑制剂的治疗。
肿瘤或癌症可以特别是胰腺导管腺癌。胰腺导管腺癌(pancreatic ductaladenocarcinoma，PDAC)是美国癌症相关死亡的第三大原因。据估计，2021年美国将出现约60,430例胰腺癌新病例和48,220例死亡病例(Siegal，2021)。对于诊断时患有转移性疾病的患者，预后不佳，具有<1年的mOS。单独或与白蛋白结合的紫杉醇组合的吉西他滨和FOLFOXIRI是该情况中用作1L治疗的主要的全身性治疗方案，但是含有药剂(例如伊立替康脂质体注射剂(与5-FU和甲酰四氢叶酸组合)、贝伐单抗、或厄洛替尼(erlotinib)和FOLFOX)的其他方案可用作2L+治疗(NCCN，2021e)。尽管在该情况下可用治疗数目提高，但就目前的化学治疗和组合方式而言，显著毒性以及存活益处的缺乏表明临床试验对于新诊断的患有晚期疾病的患者是至关重要的选择。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是胰腺癌，所述肿瘤或癌症不是胰腺内分泌癌。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是胰腺癌，所述肿瘤或癌症是胰腺导管腺癌(PDAC)。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症为胰腺癌，对象先前尚未接受过通过放射治疗、手术、化学治疗或研究性治疗对转移性疾病进行的治疗，即，在根据第一方面的治疗之前，所述对象尚未接受过通过放射治疗、手术、化学治疗或研究性治疗进行的转移性疾病的治疗。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症为胰腺癌，对象先前尚未接受过用检查点抑制剂的治疗，即，在根据第一方面的治疗之前，所述对象尚未接受过用ICP抑制剂的治疗。
在一个实施方案中，其中肿瘤或癌症是胰腺癌，所述肿瘤或癌症不具有可作用的基因改变，例如BRCA1/2或PALB2突变。
治疗方案
结合剂和检查点抑制剂可通过任何合适的方式施用，例如静脉内施用、动脉内施用、皮下施用、皮内施用、肌内施用、节内施用或瘤内施用。
在第一方面的一个实施方案中，结合剂特别通过全身性施用向对象施用。优选地，结合剂通过静脉内注射或输注而施用至对象。在一个实施方案中，结合剂在至少一个治疗周期中施用。
在一个实施方案中，检查点抑制剂特别通过全身性施用向对象施用。优选地，检查点抑制剂通过静脉内注射或输注而施用至对象。在一个实施方案中，检查点抑制剂在至少一个治疗周期中施用。
在一个实施方案中，结合剂和检查点抑制剂特别通过全身性施用向对象施用。优选地，结合剂和检查点抑制剂通过静脉内注射或输注而施用至对象。在一个实施方案中，结合剂和检查点抑制剂在至少一个治疗周期中施用。
在一个实施方案中，每个治疗周期为约两周(14天)、三周(21天)或四周(28天)，优选三周(21天)。
在特定实施方案中，每个剂量每两周一次(1Q2W)、每三周一次(1Q3W)或每四周一次(1Q4W)进行施用或输注，优选每三周一次(1Q3W)。
在一些实施方案中，一剂或各剂在每个治疗周期的第1天施用或输注。例如，可在每个治疗周期的第1天施用一剂结合剂和一剂检查点抑制剂。
每个剂量可在最少30分钟内施用或输注，例如在最少60分钟内、最少90分钟内、最少120分钟内或最少240分钟内施用或输注。
结合剂和检查点抑制剂可同时施用。在一个替代优选实施方案中，结合剂和检查点抑制剂单独施用。
在一个实施方案中，其中方法还包括向对象施用一种或更多种另外的治疗剂，所述一种或更多种另外的治疗剂优选包含一种或更多种化学治疗剂，例如基于铂的化合物(例如顺铂、奥沙利铂和卡铂)、基于紫杉烷的化合物(例如紫杉醇和nab-紫杉醇)、核苷类似物(例如5-氟尿嘧啶和吉西他滨)及其组合(例如顺铂/卡铂+5-氟尿嘧啶或nab-紫杉醇+吉西他滨)。在该实施方案中，优选一种或更多种另外的治疗剂在至少一个治疗周期中施用，其中每个治疗周期优选为三周(21天)。例如，对于至少第一个治疗周期，一剂一种或更多种另外的治疗剂至少每三周一次施用(1Q3W)，例如每三周两次(2Q3W)施用，持续至少第一治疗周期。在一个实施方案中，至少在至少第一治疗周期的第1天，例如在至少第一治疗周期的第1天和第8天，施用一剂一种或更多种另外的治疗剂。
结合剂、检查点抑制剂和一种或更多种另外的治疗剂(如果存在的话)可以以任何合适的形式施用(例如，以其本身裸施用)。然而，优选地，结合剂、检查点抑制剂和一种或更多种另外的治疗剂(如果存在的话)以本文中所述的任何合适的药物组合物的形式施用。在一个实施方案中，至少结合剂和检查点抑制剂以单独的药物组合物的形式施用(即一种结合剂的药物组合物，和一种检查点抑制剂的药物组合物)，优选地，结合剂、检查点抑制剂和一种或更多种另外的治疗剂(如果存在的话)以单独的药物组合物的形式施用(即一种结合剂的药物组合物，一种检查点抑制剂的药物组合物，和一种或更多种另外的治疗剂的至少一种药物组合物。)
根据常规技术例如在Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995中公开的那些，组合物或药物组合物可与载体、赋形剂和/或稀释剂以及适用于药物组合物的任何其他组分进行配制，包括已知的佐剂。可药用载体或稀释剂以及任何已知的佐剂和赋形剂应该适用于结合剂和/或检查点抑制剂和/或一种或更多种另外的治疗剂(如果存在的话)以及所选择的施用方式。基于对所选择的化合物或药物组合物的所期望生物学特性缺乏显著的负面影响(例如，小于对抗原结合的显著性影响(10％或更低的相对抑制，5％或更低的相对抑制等))来确定药物组合物的载体和其它组分的合适性。
组合物，特别是结合剂的药物组合物、检查点抑制剂的药物组合物，以及一种或更多种另外的治疗剂(如果存在的话)的至少一种药物组合物，可包含稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如，非离子洗涤剂，例如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如，糖或无蛋白氨基酸)、防腐剂、增溶剂和/或适用于包含在药物组合物中的其他材料。
用于治疗用途的可药用载体、赋形剂或稀释剂在制药领域中是公知的，并且例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishingco.(A.RGennaroedit.1985)中描述。
可根据预期施用途径和标准药学实践选择药物载体、赋形剂或稀释剂。
可药用载体包括任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等，其与活性化合物，特别是结合剂、检查点抑制剂和/或本文中所使用的一种或更多种另外的治疗剂(如果存在的话)在生理学上相容。
可用于(药物)组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油和芝麻油)、羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)，和/或多种缓冲剂。其他载体在制药领域是公知的。
可药用载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这样的介质和试剂在药物活性物质中的应用是本领域已知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑其在(药物)组合物中的使用。
本文中使用的术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的(药物)组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释剂和/或稀化剂。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮剂和/或混合介质中的任一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。
(药物)组合物还可包含可药用抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属-螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
(药物)组合物还可在组合物中包含等张剂，如糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇、甘油或氯化钠。
(药物)组合物还可包含适合于所选施用途径的一种或更多种辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，其可提高组合物的保质期或有效性。本文中所使用的组合物可用将保护化合物免于快速释放的载体来制备，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。这样的载体可包括明胶，单硬脂酸甘油酯，二硬脂酸甘油酯，可生物降解的、生物相容的聚合物(例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和单独的或与蜡的聚乳酸)，或本领域公知的其他物质。用于制备这样的制剂的方法通常是本领域技术人员已知的，参见例如Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
“可药用盐”包括，例如，酸加成盐，其可例如通过使用可药用酸，例如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸形成。此外，合适的可药用盐可包括碱金属盐(例如，钠盐或钾盐)；碱土金属盐(例如，钙盐或镁盐)；铵(NH4+)；以及与合适的有机配体(例如，使用反荷阴离子例如卤化物、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的季铵和胺阳离子)形成的盐。可药用盐的示例性实例包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、精氨酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、乙二胺四乙酸钙、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、二盐酸盐、十二烷基硫酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、乙磺酸盐(ethanesulfonate)、甲酸盐、富马酸盐、半乳酸盐(galactate)、半乳糖醛酸盐、葡萄糖酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酰阿散酸盐(glycolylarsanilate)、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、羟基萘酸盐、碘化物、异丁酸盐、异硫氰酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲烷磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、2-萘磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、N-甲基葡萄糖铵盐、油酸盐、草酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、邻苯二甲酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、辛二酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘盐(triethiodide)、十一烷酸盐、戊酸盐等(参见，例如，S.M.Berge et al.,"Pharmaceutical Salts",J.Pharm.Sci.,66,pp.1-19(1977))。非可药用盐可用于制备可药用盐，并且包括在本公开内容中。
在一个实施方案中，本文中所使用的结合剂、检查点抑制剂和一种或更多种另外的治疗剂(如果存在的话)可被配制以确保在体内适当的分布。用于肠胃外施用的可药用载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这样的介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域中已知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑将其在组合物中的使用。其他活性或治疗化合物也可以并入组合物中。
注射用药物组合物通常必须是无菌的并且在制备和储存条件下是稳定的。组合物可被配制为溶液剂、微乳剂、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是水性或非水性溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。例如，可通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，将优选在所述组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇(例如甘油、甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现可注射组合物的延长吸收。无菌可注射溶液可通过将活性化合物以所需的量与例如如上文列举的成分之一或组合(根据需要)一起并入合适的溶剂中，随后灭菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物并入无菌载剂来制备分散体，所述载剂包含基本的分散介质和所需的例如来自上文列举的那些的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的所期望成分的粉末。
无菌可注射溶液可通过将活性化合物以所需的量与以上列举的成分中成分之一或组合(根据需要)一起并入在合适的溶剂中，随后灭菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物并入无菌载剂中来制备分散体，所述载剂包含基本分散介质和所需的来自以上列举的那些的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的所期望成分的粉末。
在第二方面中，本发明提供了药盒，其包含：(I)包含与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区的结合剂，(ii)检查点抑制剂，和任选地(iii)一种或更多种另外的治疗剂。本文中公开的关于第一方面(特别是关于结合剂、检查点抑制剂和任选的一种或更多种另外的治疗剂)的实施方案也应用于第二方面的药盒。在一个实施方案中，药盒包含至少两个容器，其中一个容器含有结合剂(就其本身或者以(药物)组合物的形式)，并且第二个容器含有检查点抑制剂(就其本身或者以(药物)组合物的形式)。如果药盒还包含一种或更多种另外的治疗剂，优选药盒包含至少三个容器，一个容器含有结合剂(就其本身或者以(药物)组合物的形式)，一个容器含有检查点抑制剂(就其本身或者以(药物)组合物的形式)，和至少第三个容器含有一种或更多种另外的治疗剂(就其本身或者以(药物)组合物的形式)。
在第三方面中，本公开内容提供了第二个方面的药盒，其用于在对象中降低或阻止肿瘤进展或者治疗癌症的方法中。本文中公开的关于第一方面(特别是关于结合剂、检查点抑制剂、任选的一种或更多种另外的治疗剂、治疗方案、特定肿瘤/癌症和对象)和/或第二方面的实施方案也应用于第三方面中应用的药盒。
在第四方面中，本公开内容提供了用于在对象中降低或阻止肿瘤进展或者治疗癌症的方法，所述方法包括在施用检查点抑制剂之前、同时或之后向所述对象施用结合剂，其中所述结合剂包含与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区。本文中公开的关于第一方面(特别是关于结合剂、检查点抑制剂、任选的一种或更多种另外的治疗剂、治疗方案、特定肿瘤/癌症和对象)的实施方案也应用于第四方面的方法。
在另一个方面中，本公开内容提供了检查点抑制剂，其用于在对象中降低或阻止肿瘤进展或者治疗癌症的方法中，所述方法包括在施用结合剂抑制剂之前、同时或之后向所述对象施用检查点抑制剂，其中所述结合剂包含与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区。本文中公开的关于第一方面的实施方案(特别是关于结合剂、检查点抑制剂、任选的一种或更多种另外的治疗剂、治疗方案、特定的肿瘤/癌症和对象)也应用于该另一方面中应用的检查点抑制剂。
本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
呈现该描述(包括以下实施例)是为了使本领域普通技术人员能够制备和使用多个实施方案。对特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述实例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多个实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实例和应用。因此，多个实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实例，而是与符合权利要求书的范围相一致。
逐项列出的权利要求
1.结合剂，其用于在对象中降低或阻止肿瘤进展或者治疗癌症的方法，所述方法包括在施用检查点抑制剂之前、同时或之后向所述对象施用所述结合剂，其中所述结合剂包含与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区。
2.项目1所述应用的结合剂，其中CD40是人CD40，特别是包含SEQ ID NO:36中所示序列的人CD40，和/或CD137是人CD137，特别是包含SEQ ID NO:38中所示序列的人CD137。
3.项目1或2所述应用的结合剂，其中所述检查点抑制剂是选自以下中的至少一者：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIM-3抑制剂、KIR抑制剂、LAG-3抑制剂、TIGIT抑制剂、VISTA抑制剂和GARP抑制剂。
4.项目1至3中任一项所述应用的结合剂，其中所述检查点抑制剂是抗体，例如PD-1阻断抗体，特别是派姆单抗。
4a.项目1至4中任一项所述应用的结合剂，其中所述检查点抑制剂是这样的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含本文中所述抗PD-1抗体或抗原结合片段中之一的互补决定区(CDR)，例如选自以下的一种抗PD-1抗体或抗原结合片段的CDR：纳武单抗、Amp-514、替雷利珠单抗、西米普利单抗、TSR-042、JNJ-63723283、CBT-501、PF-06801591、JS-001、卡瑞利珠单抗、PDR001、BCD-100、AGEN2034、IBI-308、BI-754091、GLS-010、LZM-009、AK-103、MGA-012、Sym-021和CS1003。
4b.项目1至4a中任一项所述应用的结合剂，其中所述检查点抑制剂是这样的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含本文中所述抗PD-1抗体或抗原结合片段中之一的重链可变区和轻链可变区，例如选自以下的一种抗PD-1抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区：纳武单抗、Amp-514、替雷利珠单抗、西米普利单抗、TSR-042、JNJ-63723283、CBT-501、PF-06801591、JS-001、卡瑞利珠单抗、PDR001、BCD-100、AGEN2034、IBI-308、BI-754091、GLS-010、LZM-009、AK-103、MGA-012、Sym-021、CS1003和IgG1-PD1。
4b1.项目1至4a中任一项所述应用的结合剂，其中所述检查点抑制剂是包含如SEQID NO:43中所限定的重链可变区和如SEQ ID NO:44中所限定的轻链可变区的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
4c.项目1至4b中任一项所述应用的结合剂，其中所述检查点抑制剂是选自以下的抗PD-1抗体或其抗原结合片段：纳武单抗、Amp-514、替雷利珠单抗、西米普利单抗、TSR-042、JNJ-63723283、CBT-501、PF-06801591、JS-001、卡瑞利珠单抗、PDR001、BCD-100、AGEN2034、IBI-308、BI-754091、GLS-010、LZM-009、AK-103、MGA-012、Sym-021、CS1003和IgG1-PD1。
4c1.项目1至4b1中任一项所述应用的结合剂，其中所述检查点抑制剂是这样的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗PD-1抗体包含如SEQ ID NO:43中所限定的VH序列、如SEQ ID NO:44中所限定的VL序列、如SEQ ID NO:61中所限定的Fc序列、和任选地如SEQ ID NO:27中所限定的κ序列。
4d.项目1至4中任一项所述应用的结合剂，其中所述检查点抑制剂是这样的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含本文中所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段中之一的互补决定区(CDR)，例如阿特珠单抗或其抗原结合片段的CDR。
4e.项目1至4以及4d中任一项所述应用的结合剂，其中所述检查点抑制剂是这样的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含本文中所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段中之一的重链可变区和轻链可变区，例如阿特珠单抗或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区。
5.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂和所述检查点抑制剂中的一者或二者全身性施用，优选静脉内施用。
6.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中：
a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7或9的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:8或10的CDR1、CDR2和CDR3序列；
并且
b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:17或19的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ IDNO:18或20的CDR1、CDR2和CDR3序列。
7.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中：
a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含分别在SEQ ID NO:1、2和3中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含分别在SEQ ID NO:4、5和6中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；
并且
b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含分别在SEQ ID NO:11、12和13中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含分别在SEQ ID NO:14、15和16中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。
8.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中：
a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:7或9具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:8或10具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
b)所述第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:17或19具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或25 100％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:18或20具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
9.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中：
a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7或9中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:8或10中所示的氨基酸序列；
并且
b)所述第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:17或19中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:18或20中所示的氨基酸序列。
10.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中：
a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列；
并且
b)所述第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。
11.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂是多特异性抗体，例如双特异性抗体。
12.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂是全长抗体或抗体片段的形式。
13.项目6至12中任一项所述应用的结合剂，其中每个可变区包含三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和四个框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)。
14.项目13所述应用的结合剂，其中所述互补决定区和所述框架区从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
15.项目6至14中任一项所述应用的结合剂，其包含：
i)含有以下、由以下组成、或基本上由以下组成的多肽：所述第一重链可变区(VH)和第一重链恒定区(CH)，以及
ii)含有以下、由以下组成、或基本上由以下组成的多肽：所述第二重链可变区(VH)和第二重链恒定区(CH)。
16.项目6至15中任一项所述应用的结合剂，其包含：
i)含有所述第一轻链可变区(VL)并且还含有第一轻链恒定区(CL)的多肽，以及
ii)含有所述第二轻链可变区(VL)并且还含有第二轻链恒定区(CL)的多肽。
17.项目6至16中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂是包含第一结合臂和第二结合臂的抗体，其中：
所述第一结合臂包含：
i)含有所述第一重链可变区(VH)和第一重链恒定区(CH)的多肽，以及
ii)含有所述第一轻链可变区(VL)和第一轻链恒定区(CL)的多肽；
并且所述第二结合臂包含：
iii)含有所述第二重链可变区(VH)和第二重链恒定区(CH)的多肽，以及
iv)含有所述第二轻链可变区(VL)和第二轻链恒定区(CL)的多肽。
18.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其包含：
i)含有所述能够与CD40结合的抗原结合区的第一重链和第一轻链，以及
ii)含有所述能够与CD137结合的抗原结合区的第二重链和第二轻链。
19.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂包含：
i)含有所述能够与CD40结合的抗原结合区的第一重链和第一轻链，所述第一重链包含第一重链恒定区，并且所述第一轻链包含第一轻链恒定区；以及
ii)含有所述能够与CD137结合的抗原结合区的第二重链和第二轻链，所述第二重链包含第二重链恒定区，并且所述第二轻链包含第二轻链恒定区。
20.项目15至19中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区(CH)各自包含恒定重链1(CH1)区、铰链区、恒定重链2(CH2)区和恒定重链3(CH3)区中的一者或更多者，优选至少包含铰链区、CH2区和CH3区。
21.项目15至20中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区(CH)各自包含CH3区，并且其中这两个CH3区包含非对称突变。
22.项目15至21中任一项所述应用的结合剂，其中在所述第一重链恒定区(CH)中，与选自根据EU编号的人IgG1重链中T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置相对应的位置处的至少一个氨基酸已被替换，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，与选自根据EU编号的人IgG1重链中T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置相对应的位置处的至少一个氨基酸已被替换，并且其中所述第一重链和所述第二重链不在相同的位置发生替换。
23.项目22所述应用的结合剂，其中(i)在所述第一重链恒定区(CH)中，与根据EU编号的人IgG1重链中F405相对应的位置处的氨基酸是L，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，与根据EU编号的人IgG1重链中K409相对应的位置处的氨基酸是R，或者(ii)在所述第一重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中K409相对应的位置处的氨基酸是R，并且在所述第二重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中F405相对应的位置处的氨基酸是L。
24.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中与包含相同的第一和第二抗原结合区以及含有人IgG1铰链区、CH2区和CH3区的两个重链恒定区(CH)的另一抗体相比，所述结合剂诱导Fc介导的效应物功能的程度较低。
25.项目24所述应用的结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区(CH)被修饰，使得与除了包含未经修饰的第一和第二重链恒定区(CH)之外都相同的抗体相比，所述抗体诱导Fc介导的效应物功能的程度较低。
26.项目25所述应用的结合剂，其中所述未经修饰的第一和第二重链恒定区(CH)各自包含SEQ ID NO:21或29中所示的氨基酸序列。
27.项目25或26所述应用的结合剂，其中所述Fc介导的效应物功能通过与Fcγ受体的结合、与C1q的结合、或对Fe介导的Fcγ受体交联的诱导来测量。
28.项目27所述应用的结合剂，其中所述Fc介导的效应物功能通过与C1q的结合来测量。
29.项目24至28中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区已被修饰，使得与野生型抗体相比，C1q与所述抗体的结合降低，优选降低至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中C1q结合优选通过ELISA确定。
30.项目15至29中任一项所述应用的结合剂，其中在所述第一和第二重链恒定区(CH)中的至少一个中，与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235、D265、N297和P331相对应的位置处的一个或更多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。
31.项目30所述应用的结合剂，其中在所述第一和第二重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235相对应的位置分别是F和E。
32.项目30或31中所述应用的结合剂，其中在所述第一和第二重链恒定区(HC)中，与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265相对应的位置分别是F、E和A。
33.项目30至32中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区二者中与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235相对应的位置分别是F和E，并且其中(i)所述第一重链恒定区中与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置是L，并且所述第二重链中与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置是R，或者(ii)所述第一重链恒定区中与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置是R，并且所述第二重链中与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置是L。
34.项目30至33中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区二者中与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265相对应的位置分别是F、E和A，并且其中(i)所述第一重链恒定区中与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置是L，并且所述第二重链恒定区中与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置是R，或者(ii)所述第一重链中与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置是R，并且所述第二重链中与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置是L。
35.项目15至34中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和/或第二重链的恒定区包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:21或29中所示序列[IgG1-FC]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多10个替换，例如至多9个替换、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
36.项目15至34中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一或第二重链的恒定区，例如所述第二重链的恒定区，包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:22或30中所示序列[IgG1-F405L]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多9个替换，例如至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
37.项目15至34中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一或第二重链的恒定区，例如所述第一重链的恒定区，包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:23或31中所示序列[IgG1-F409R]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多10个替换，例如至多9个替换、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个替换、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
38.项目15至34中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和/或第二重链的恒定区包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:24或32中所示序列[IgG1-Fc_FEA]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多7个替换，例如至多6个替换、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
39.项目15至38中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和/或第二重链的恒定区，例如所述第二重链的恒定区，包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:25或33中所示序列[IgG1-Fc_FEAL]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多6个替换，例如至多5个替换、至多4个替换、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
40.项目15至39中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和/或第二重链的恒定区，例如所述第一重链的恒定区，包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:26或34中所示序列[IgG1-Fc_FEAR]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多6个替换，例如至多5个替换、至多4个、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
41.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂包含kappa(κ)轻链恒定区。
42.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂包含lambda(λ)轻链恒定区。
43.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区或lambda(λ)轻链恒定区。
44.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述第二轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区或kappa(κ)轻链恒定区。
45.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区并且所述第二轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区，或者所述第一轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区并且所述第二轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区。
46.项目41至45中任一项所述应用的结合剂，其中kappa(κ)轻链包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:27中所示序列；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多10个替换，例如至多9个替换、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个替换、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
47.项目42至46中任一项所述应用的结合剂，其中lambda(λ)轻链包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:28中所示序列；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多10个替换，例如至多9个替换、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个替换、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
48.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂具有选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种型。
49.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂是全长IgG1抗体。
50.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂是IgG1m(f)同种异型的抗体。
51.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述对象是人对象。
52.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是实体瘤或癌症。
53.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症选自黑素瘤、卵巢癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、结直肠癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、尿路上皮癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、胸腺瘤和胸腺癌、脑癌、胶质瘤、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、其他皮肤癌、肉瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、子宫内膜癌、前列腺癌、阴茎癌、宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、梅克尔细胞癌和间皮瘤。
54.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症选自黑素瘤、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和头颈癌。
55.项目53或54所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是黑素瘤，例如皮肤黑素瘤或肢端黑素瘤。
56.项目55所述应用的结合剂，其中所述黑素瘤是不可切除的黑素瘤，特别是不可切除的III期或IV期黑素瘤。
57.项目55或56所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过使用检查点抑制剂的治疗。
58.项目55至57中任一项所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过针对不可切除的黑素瘤或转移性黑素瘤的全身性抗癌治疗。
59.项目53或54所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)，例如鳞状NSCLC或非鳞状NSCLC。
60.项目59所述应用的结合剂，其中所述肺癌，特别是NSCLC，不具有表皮生长因子(EGFR)致敏突变和/或间变性淋巴瘤(ALK)易位/ROS1重排。
61.项目59或60所述应用的结合剂，其中所述肺癌，特别是NSCLC，包含癌细胞，并且PD-L1在≥1％的所述癌细胞中表达。
62.项目59至61中任一项所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过使用检查点抑制剂的治疗。
63.项目53或54所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是头颈癌，特别是头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。
64.项目63所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过使用检查点抑制剂的治疗。
65.项目53或54所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是胰腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)。
66.项目65所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过通过放射治疗、手术、化学治疗或研究性治疗对转移性疾病进行的治疗。
67.项目65或66所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过使用检查点抑制剂的治疗。
68.项目53或54所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是结直肠癌。
69.项目68所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过使用检查点抑制剂的治疗。
70.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂和所述检查点抑制剂在至少一个治疗周期中施用，每个治疗周期是三周(21天)。
71.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中每三周一次(1Q3W)施用一剂所述结合剂和一剂所述检查点抑制剂。
72.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中在每个治疗周期的第1天施用一剂所述结合剂和一剂所述检查点抑制剂。
73.前述项目中任一项所述应用的结合剂，其中所述方法还包括向所述对象施用一种或更多种另外的治疗剂。
74.项目73所述应用的结合剂，其中所述一种或更多种另外的治疗剂包含一种或更多种化学治疗剂，例如基于铂的化合物(例如顺铂，奥沙利铂和卡铂)、基于紫杉烷的化合物(例如紫衫醇和nab-紫杉醇)、核苷类似物(例如5-氟尿嘧啶和吉西他滨)及其组合(例如顺铂/卡铂+5-氟尿嘧啶或nab-紫杉醇+吉西他滨)。
75.项目73或74所述应用的结合剂，其中所述一种或更多种另外的治疗剂在至少一个治疗周期中施用，每个治疗周期是三周(21天)。
76.项目73至75中任一项所述应用的结合剂，其中至少每三周一次(1Q3W)施用一剂所述一种或更多种另外的治疗剂，持续至少第一治疗周期，例如每三周两次(2Q3W)施用一剂所述一种或更多种另外的治疗剂，持续至少第一治疗周期。
77.项目73至76中任一项所述应用的结合剂，其中至少在至少第一治疗周期的第1天，例如在至少第一治疗周期的第1天和第8天，施用一剂所述一种或更多种另外的治疗剂。
78.药盒，其包含(i)含有与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区的结合剂，(ii)检查点抑制剂，以及任选的(iii)一种或更多种另外的治疗剂。
79.根据项目78所述的药盒，其中所述结合剂和/或所述检查点抑制剂和/或所述一种或更多种另外的治疗剂根据项目1至50和74中任一项中所限定。
80.根据项目78或79所述的药盒，其中所述结合剂、所述检查点抑制剂、以及如果存在的话所述一种或更多种另外的治疗剂，用于全身性施用，特别是用于注射或输注，例如静脉内注射或输注。
81.根据项目78至80中任一项所述的药盒，其用于在对象中降低或阻止肿瘤进展或者治疗癌症的方法。
82.根据项目81所述应用的药盒，其中所述肿瘤或癌症和/或所述对象和/或所述方法根据项目51至77中任一项中所限定。
83.用于在对象中降低或阻止肿瘤进展或者治疗癌症的方法，所述方法包括在施用检查点抑制剂之前、同时或之后向所述对象施用所述结合剂，其中所述结合剂包含与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区。
84.项目83所述的方法，其中所述肿瘤或癌症和/或所述对象和/或所述方法和/或所述结合剂和/或所述检查点抑制剂根据项目1至77中任一项中所限定。
本文中公开了本公开内容的另一些方面。
实施例
实施例1：在同种异体MLR测定中bsIgG1-CD40×4-1BB和DuoBody-CD40×4-1BB与派姆单抗组合对IFNγ分泌的作用
为了分析在混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction，MLR)测定中bsIgG1-CD40×4-1BB(Fc活性)或DuoBody-CD40×4-1BB(Fc失活)与派姆单抗的组合与单一药剂活性相比是否可导致细胞因子产生的增强，在存在以下的情况下将CD8+T细胞和人成熟树突细胞(mDC)的五个独特的同种异体对共培养：单独的bsIgG1-CD40×4-1BB、单独的DuoBody-CD40×4-1BB、单独的派姆单抗、或者双特异性的CD40×4-1BB中任一者与派姆单抗的组合。使用IFNγ特异性免疫测定评估共培养物上清液中的干扰素(IFN)γ分泌。
方法
来自健康供体的单核细胞和T细胞
CD14+单核细胞和纯化的CD8+T细胞从Precision Medicine或BioIVT获得。同种异体供体对用于MLR测定。
单核细胞向未成熟树突细胞的分化
从健康供体中获得人CD14+单核细胞(参见上文)。为了使其分化成未成熟树突细胞(iDC)，将1至1.5×106个单核细胞/mL在37℃下于T25培养瓶(Falcon，目录号：353108)中在补充有10％热灭活胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS；Gibco，目录号：16140071)、100ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor，GM-CSF；BioLegend，目录号：766106)和300ng/mL白介素-4(interleukin-4，IL-4；BioLegend，目录号：766206)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640完全培养基(ATCC改良配方；ThermoFisher，目录号：A1049101)中培养6天。在这六天期间之后，将培养基更换为具有补充物的新鲜培养基。
iDC的成熟
为了使iDC成熟，通过收集非黏附细胞来收获细胞，对其进行计数，在37℃下以1至1.5×106个细胞/mL在补充有10％ FBS、100ng/mL GM-CSF、300ng/mL IL-4和1×脂多糖(LPS；ThermoFisher，目录号：00-4976-93)的RPMI 1640完全培养基中孵育24小时，在此之后开始混合淋巴细胞反应(MLR)测定。
混合淋巴细胞反应(MLR)
在MLR测定开始之前一天，将从同种异体健康供体获得的纯化的CD8+T细胞解冻。将细胞以1×106个细胞/mL重悬于补充有10％ FBS和10ng/mL IL-2(BioLegend，目录号：589106)的RPMI 1640完全培养基中并在37℃下孵育，O/N。
第二天，收获LPS-成熟的树突细胞(mDC，参见iDC的成熟)和同种异体的纯化的CD8+T细胞，并分别以4×105个细胞/mL和4×106个细胞/mL将其重悬于AIM-V培养基(ThermoFisher，目录号：12055091)中。
在共培养物中，在存在以下的情况下在37℃下于96孔圆底板(Falcon，目录号：353227)中在AIM-V培养基中将20,000个mDC与200,000个同种异体的纯化的CD8+T细胞(DC:T细胞的比例为1:10)一起孵育：单独或与派姆单抗(0.1至30μg/mL或0.1至100μg/mL；临床产品派姆单抗的非临床/研究级形式；Selleckchem，目录号：A2005)组合的DuoBody-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)、单独或与派姆单抗(0.1至30μg/mL)组合的bsIgG1-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)、派姆单抗(0.1至30μg/mL或0.1至100μg/mL)、bsIgG1-CD40×ctrl(30μg/mL)、bsIgG1-ctrl×4-1BB(30μg/mL)、IgG4(100μg/mL；Biolegend，目录号：403702)、IgG1-ctrl-FEAL(30μg/mL)或IgG1-ctrl(0.001至30μg/mL)。在5天之后，将板以500×g离心5分钟，并将上清液从每个孔小心地转移至新的96孔圆底板。
在Envision仪器上使用Alpha Lisa IFNγ试剂盒(Perkin Elmer，目录号：AL217)根据制造商的说明通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析从MLR测定收集的上清液的干扰素(IFN)γ水平。
抗体
下面列出的抗体表示为IgG1,κ。当适用时，在GeneArt通过基因合成引入特定的突变。通过蛋白A亲和色谱从培养物上清液中纯化抗体。双特异性抗体(DuoBody分子)通过受控的Fab臂交换(WO2011/131746)获得。简而言之，单独产生两种在CH3结构域中含有单个匹配的点突变(一者为F405L并且另一者为K409R[EU编号(Kabat,NIH publication no91-3242,5th edition ed.National Institutes of Public Health,Bethesda,MD,USA.662,680,689)])的亲本抗体，将其混合并经受受控的还原条件。还原破坏了分子的链间二硫键，而匹配的CH3结构域(包含F405L和K409R)驱动Fab臂的异二聚化和双特异性分子的形成。随后二硫键的再氧化产生具有规则IgG1构型的高纯度双特异性抗体制备物。通过在280nm处的吸光度来测量IgG浓度。将纯化的抗体在4℃下储存。
表5：
1该抗体在Fc-活性IgG1主链中包含表1中所示的CD40-特异性和4-1BB-特异性Fab臂(即没有Fc-沉默L234F、L235E、D265A突变)。
2基于抗HIV gp120抗体IgG1-b12的对照结合部分(Barbas et al.,J Mol Biol1993,230:812-823)。
结果
在第一个实验中，在五个供体对中，与IgG1-ctrl相比，BsIgG1-CD40×4-1BB增强了纯化的CD8+T细胞和同种异体mDC的共培养物中的IFNγ分泌(参见图2&3，表6)。同时暴露于bsIgG1-CD40×4-1BB和派姆单抗与单独的bsIgG1-CD40×4-1BB相比，诱导了IFNγ的1.89至2.73倍提高(图2，表7)，以及与单独的派姆单抗相比，诱导了IFNγ的2.14至3.09倍提高(图2，表8)。在用bsIgG1-CD40×4-1BB与>1μg/mL的派姆单抗的组合处理之后观察到最高的IFNγ浓度。
在第二个实验中，与IgG1-ctrl-FEAL和单价对照抗体bsIgG1-CD40×ctrl或bsIgG1-ctrl×4-1BB相比，DuoBody-CD40×4-1BB增强了纯化的CD8+T细胞和同种异体mDC的共培养物中的IFNγ分泌(图4)。在所有测试浓度下，与单独的DuoBody-CD40×4-1BB相比以及与单独的派姆单抗相比，同时暴露于DuoBody-CD40×4-1BB和派姆单抗诱导了IFNγ的提高(图4)。当DuoBody-CD40×4-1BB与0.1、1、10或100μg/mL的派姆单抗组合时，观察到相当水平的IFNγ(图4)。当比较DuoBody-CD40×4-1BB和bsIgG1-CD40×4-1BB时，两种双特异性抗体在单独或与1μg/mL派姆单抗组合下均诱导相当水平的IFNγ(图5)。
结论
总之，这些结果表明，在成熟的DC/CD8-T细胞MLR测定中，将DuoBody-CD40×4-1BB或bsIgG1-CD40×4-1BB与派姆单抗组合增强了IFNγ分泌。该数据表明，通过靶向PD-1/PD-L1轴并与CD40和4-1BB共刺激组合可扩大免疫应答的强度。
表6：由单独或与PD-1mAb组合的bsIgG1-CD40×4-1BB诱导的IFNγ分泌
表7：与bsIgG1-CD40×4-1BB相比的ymax的倍数提高
表8：与派姆单抗相比的ymax的倍数提高
实施例2：临床试验设计
试验设计
这是在患有实体恶性肿瘤的对象中针对GEN1042首次在人中进行的、开放标签、多中心1/2期试验。该试验由4部分组成：GEN1042单一治疗剂量递增(1a期)、GEN1042单一治疗扩展(2a期)、组合治疗安全性磨合(run-in)(1b期)和组合治疗扩展(2期)。
单一治疗的剂量递增(1a期)将在患有非中枢神经系统(CNS)实体恶性肿瘤的对象中评价GEN1042，以确定MTD或最大施用剂量和/或RP2D。安全性磨合1b期将在选定肿瘤类型中评价与一种或更多种治疗组合的来自剂量递增的GEN1042单一治疗RP2D，详情如下所述。将在2期中进一步评价在安全性磨合期间确定的GEN1042的RP2D。
治疗方案
组合治疗的安全性磨合-1b期
“3+3”设计是1期肿瘤学研究的常规设计。该试验的组合安全性磨合部分将遵循“3+3”，以允许所施用的GEN1042+/-派姆单抗+/-化学治疗的每个剂量在3个待评估的对象中的安全性，然后用相同或下一个剂量治疗另外的对象。对象将不被随机化；当对象准备进入试验时，他们将被分配到正在填补的组群中。
详细来说，安全性组合组群将接受GEN1042+派姆单抗或GEN1042+化学治疗+/-派姆单抗。在已经从剂量递增部分(1a期)确定了GEN1042单一治疗的RP2D之后，将开始1b期的招募。
在组合安全性磨合期间，计划了三种平行方案：
1.GEN1042+派姆单抗Q3W；持续治疗直至PD、过度毒性、撤回同意书或多至35个周期(总共2年)
·NSCLC(CPI-初始，PD-L1表达，根据当地实验室测试TPS≥1％)
·HNSCC(CPI-初始，PD-L1表达，根据当地实验室测试CPS≥1)
·黑素瘤(CPI-初始，无论PD-L1表达如何)
2.GEN1042+派姆单抗+顺铂/卡铂+5-FU Q3W，持续6个周期，随后是GEN1042+派姆单抗Q3W；持续治疗直至PD、过度毒性、撤回同意书或者多至另外的29个周期(总共2年)
·HNSCC(CPI-初始，PD-L1表达，根据当地实验室测试CPS≥1)
3.PDAC(无论PD-L1表达如何)
·方案3a：GEN1042 Q3W+吉西他滨+nab-紫杉醇2Q3W，持续总共8个周期
·方案3b：GEN1042+派姆单抗Q3W+吉西他滨+nab-紫杉醇2Q3W，持续8个周期，随后是GEN1042+派姆单抗Q3W，持续治疗直至PD、过度毒性、撤回同意书或者多至另外的27个周期(总共2年)。
将按照3+3剂量递减设计对上述各自的安全性组合方案进行评价。3至6个对象的组群将顺序地进入递减剂量等级。对于方案1、2和3a，GEN1042的起始剂量为100mg 1Q3W(DL1)。下一个剂量水平将是60mg(DL2)的GEN1042。通过方案3a确定的GEN1042的剂量将是方案3b的起始剂量。将按照SOC实践使用批准剂量的派姆单抗和化学治疗。
·每个方案将从三个对象开始进行测试，对于方案1、2和3a，使用来自1a期的RP2DGEN1042剂量(100mg，1Q3W)；或者对于方案3b，使用来自方案3a的安全且可耐受剂量，与以上示出的指定治疗组合施用。
·如果组群中的三个对象均未经历DLT，则将认为方案是安全的，并且将在扩展组中进一步测试该方案。
·如果前三个对象中的一者经历了DLT，则将在相同的剂量水平下治疗三个更多的对象。如果至多六分之一的对象经历了DLT，则也将认为方案是安全的以进入扩展部分。
·如果3至6个对象的组群中至少有2个对象经历了DLT(即在该剂量水平下≥33％的对象具有DLT)，则递减至下一个较低的剂量水平，例如60mg的GEN1042。
·方案3的目标是鉴定GEN1042与派姆单抗、吉西他滨和nab-紫杉醇组合的安全且可耐受剂量。
在剂量递增部分中被认为是安全的低于最高剂量水平的剂量(例如，300mg、30mg等)也可在研究者和主办者同意之后在扩展部分进行测试。如果没有鉴定出可耐受剂量，则将终止安全性磨合及其相关的扩展组。
在每个对象完成DLT观察期(即分别为GEN1042+派姆单抗的1个周期(21天)或者GEN1042+化学治疗+/-派姆单抗的2个周期(21天))之后，将对DLT进行评价。组合方案的GEN1042之RP2D的确定将基于数据的整体性，考虑DLT和总体安全性谱、抗肿瘤活性、PK和生物标志物数据(如果可获得的话)。
扩展部分-组合治疗组群-2期
对于组合治疗扩展，将与如下所示的一种或更多种治疗组合施用根据1b期组合安全性磨合确定的选定RP2D GEN1042剂量。组合治疗将作为1L治疗设置而施用。计划在四种适应证中进行五个平行组。
表9：
/>
缩写：1L＝1线；2Q3W＝每3周两次(每周1次，持续2周，随后休息一周)；5-FU＝5-氟尿嘧啶；Cis/Carbo＝顺铂/卡铂；CPI＝检查点抑制剂；CPS＝组合阳性评分；HSNCC＝头颈鳞状细胞癌；NSCLC＝非小细胞肺癌；PD＝进行性疾病；PDAC＝胰腺导管腺癌；PD-L1＝程序性死亡配体1；Q3W＝每3周；TPS＝肿瘤比例评分。
表10：剂量和施用
/>
缩写：5-FU＝5-氟尿嘧啶；Q3W＝每3周。
a.从第7周期开始，不具有疾病进展的对象将持续接受GEN1042+派姆单抗Q3W
b.从第9周期开始，不具有疾病进展的对象将持续接受GEN1042+派姆单抗Q3W
对于组合治疗扩展，将按照以下所示顺序施用治疗：首先将施用派姆单抗输注，随后为GEN1042，接着为SOC化学治疗。基于对象和机构的便利性，药物之间的间隔可为30分钟至2小时(进餐休息、短途步行、管理输注相关反应[infusion-related reaction，IRR]等)，只要适时地记录组合方案的每个组分的开始时间即可。
双特异性抗体的产生
用表1中所述的人源化VH和VL序列、人κ轻链和人IgG1重链产生双特异性抗CD40抗4-1BB(下文中称为GEN1042或DuoBody-CD40x4-1BB)。已经用人IgG1重链产生了CD40结合臂，所述人IgG1重链包含以下氨基酸突变：L234F、L235E、D265A和F405L(FEAL)，其中氨基酸位置编号根据EU编号(对应于SEQ ID NO:33)。已经用人IgG1重链产生了CD137结合臂，所述人IgG1重链包含以下氨基酸突变：L234F、L235E、D265A和K409R(FEAR)，其中氨基酸位置编号根据EU编号(对应于SEQ ID NO:34)。
双特异性IgG1抗体是在受控还原条件下进行Fab-臂交换产生的。该方法的基础是使用在特定的测定条件下促进异二聚体形成的互补CH3结构域，如WO2011/131746中所述。将F405L和K409R(EU编号)突变引入相关抗体以产生具有互补CH3结构域的抗体对。
为了产生双特异性抗体，在31℃下将两种亲本互补抗体(各抗体的最终浓度为0.5mg/ml)与在总体积100μL PBS中的75mM 2-巯基乙胺-HCl(2-MEA)一起孵育5小时。使用旋转柱(Microcon离心过滤器，30k，Millipore)根据制造商的方案，通过除去还原剂2-MEA来停止还原反应。
组合治疗的纳入标准
对象年龄必须≥18岁；根据RECIST 1.1患有可测量的疾病；预期寿命≥3个月；具有0至1的东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)表现状态；足够的器官、骨髓、肝、凝血和肾功能；并且未接受过用抗PD-1、抗PD-L1或抗程序性死亡配体2的药剂或者用针对另一刺激性或共抑制性T细胞受体(例如CTLA-4、OX-40、CD40或4-1BB)的药剂的先前治疗。各组群的另外的标准如下：
·黑素瘤
a.根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC；第8版)分期系统，经组织学确认为不可切除的III期或IV期黑素瘤。原发性眼部或黏膜黑素瘤除外。
b.对不可切除的黑素瘤或转移性黑素瘤没有先前全身性抗癌治疗。
c.根据当地标准测试(优选经FDA批准的测试)，具有已知的肿瘤BRAF突变状态。
d.对于具有BRAF V600E突变体黑素瘤的对象，应满足以下另外的标准：
i.乳酸脱氢酶<当地正常值的上限
ii.研究者判断没有临床显著的肿瘤相关症状
iii.研究者判断不存在快速进展的转移性黑素瘤
·NSCLC
a.具有IV期转移性或复发性NSCLC(AJCC第8版)的经组织学确认的诊断，不具有作为晚期或转移性疾病的主要治疗而给予的先前全身性抗癌治疗。
b.肿瘤没有可作用的EGFR激活突变或ALK易位。对于已知患有主要为鳞状组织学的肿瘤的对象，如果符合当地SOC，则不需要进行EGFR突变和ALK易位的分子测试。
c.通过当地SOC测试(优选经FDA批准的测试)或在中心实验室确定，肿瘤在≥1％的肿瘤细胞中显示出PD-L1表达(TPS≥1％)，如通过免疫组织化学(IHC)评估的。扩展期要求进行中心实验室测试。
·HNSCC
a.经组织学或细胞学确认的复发性或转移性HNSCC，其被认为通过局部治疗无法治愈。
b.对象不应具有在复发性或转移性情况下施用的先前全身性治疗。如果作为局部晚期疾病多模式治疗的一部分而给予，则允许在签署同意书之前多于6个月完成全身性治疗。
c.符合条件的原发性肿瘤位置是口咽、口腔、下咽和喉。
d.对象不应有鼻咽的原发性肿瘤部位(任何组织学)。
e.根据当地(优选经FDA批准的测试)或中心实验室测试(扩展期要求进行中心测试)，肿瘤PD-L1 IHC CPS≥1。
f.根据当地SOC可获得患有口咽疾病的参加者的人乳头瘤病毒(HPV)p16测试结果。注意：口腔癌、下咽癌和喉癌不需要通过p16 IHC进行IHV测试，因为按照惯例这些肿瘤部位被假定为HPV阴性。
·PDAC
a.经组织学或细胞学确认的转移性胰腺腺癌。排除胰腺内分泌癌。
b.没有可作用的基因改变，例如BRCA 1/2或PALB2突变。
c.没有用于治疗转移性疾病的先前放射治疗、手术、化学治疗或研究性治疗。
d.如果对象已经具有辅助/新辅助治疗和/或针对局部晚期疾病的治疗(与放射治疗组合或者不组合的用于非转移性胰腺癌的化疗治疗)，则所有毒性必须已恢复至基线或≤1级。
结果
在GCT1042-01试验1/2期的单一治疗剂量递增部分中，以0.1mg至400mg Q3W的剂量治疗耗竭标准护理治疗的50个患有转移性或不可切除的非中枢神经系统(CNS)实体瘤的对象。根据RECIST v1.1，在剂量递增部分中治疗的50个对象中的2个具有经确认的部分响应(4.0％)，包括1名患有神经内分泌肺癌的对象和1名患有黑素瘤的对象。50％的对象实现了疾病控制。根据RECIST v1.1，疾病控制被定义为具有完全、部分和稳定疾病的最佳总体响应。
在剂量递增部分之后，选择100mg Q3W用于在大量经预治疗的检查点抑制剂(CPI)后NSCLC和黑素瘤对象中进行进一步评价。在治疗的22个CPI后NSCLC对象中，有9个对象(40.9％)实现了稳定疾病的最佳响应。在CPI后NSCLC组群中没有对象经历确认的或部分的响应，并且6个对象(27.3％)根据RECIST v1.1无法评价响应。在22年5月21日数据截止时，在用100mg GEN1042 Q3W治疗的CPI后黑素瘤单一治疗扩展组群中的1个对象可评价响应。该对象实现了稳定疾病的最佳总体响应。
在剂量递增部分之后，研究了与派姆单抗200mg Q3W组合的GEN1042 100mg Q3W。截至22年5月21日的数据截止，试验中共招募了10个患有转移性黑素瘤、NSCLC或HNSCC的不具有针对转移性疾病的先前全身性抗癌治疗的对象。所有治疗对象的根据RECIST v1.1的客观响应率(ORR)为40％(4/10)。两个对象经历了完全响应以及2个对象经历了部分响应。70％的对象实现了疾病控制，并根据RECIST v1.1将其定义为具有完全、部分和稳定疾病的最佳总体响应。
实施例3：在同种异体MLR测定中bsIgG1-CD40×4-1BB与纳武单抗组合对IFNγ分泌的作用
为了分析bsIgG1-CD40×4-1BB(Fc活性)与纳武单抗的组合与单一药剂活性相比是否可导致细胞因子产生的增强，进行了同种异体MLR测定，其中在存在单独的bsIgG1-CD40×4-1BB、单独的纳武单抗、或者两种抗体的组合的情况下，共培养CD8+T细胞和人成熟树突细胞(mDC)的一个同种异体对。使用IFNγ特异性免疫测定评估共培养物上清液中的IFNγ分泌。
方法
来自健康供体的单核细胞和T细胞
CD14+单核细胞和纯化的CD8+T细胞从Precision Medicine或BioIVT获得。同种异体供体对用于MLR测定。
单核细胞向未成熟树突细胞的分化
从健康供体中获得人CD14+单核细胞。为了使其分化成未成熟树突细胞(iDC)，将1至1.5×106个单核细胞/mL在37℃下于T25培养瓶(Falcon，目录号：353108)中在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco，目录号：16140071)、100ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；BioLegend，目录号：766106)和300ng/mL白介素-4(IL-4；BioLegend，目录号：766206)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640完全培养基(ATCC改良配方；ThermoFisher，目录号：A1049101)中培养6天。在这六天期间之后，将培养基更换为具有补充物的新鲜培养基。
iDC的成熟
为了使iDC成熟，通过收集非黏附细胞来收获细胞，对其进行计数，在37℃下以1至1.5×106个细胞/mL在补充有10％ FBS、100ng/mL GM-CSF、300ng/mL IL-4和1×脂多糖(LPS；ThermoFisher，目录号：00-4976-93)的RPMI 1640完全培养基中孵育24小时，在此之后开始混合淋巴细胞反应(MLR)测定。
混合淋巴细胞反应(MLR)
在MLR测定开始之前一天，将从同种异体健康供体获得的纯化的CD8+T细胞解冻。将细胞以1×106个细胞/mL重悬于补充有10％ FBS和10ng/mL IL-2(BioLegend，目录号：589106)的RPMI 1640完全培养基中并在37℃下孵育，O/N。
第二天，收获LPS-成熟的树突细胞(mDC，参见iDC的成熟)和同种异体的经纯化的CD8+T细胞，并分别以4×105个细胞/mL和4×106个细胞/mL将其重悬于AIM-V培养基(ThermoFisher，目录号：12055091)中。
在共培养物中，在存在以下的情况下在37℃下于96孔圆底板(Falcon，目录号：353227)中在AIM-V培养基中将20,000个mDC与200,000个同种异体的纯化的CD8+T细胞(DC:T细胞的比例为1:10)一起孵育：单独或与纳武单抗MDX-1106(0.0005至5μg/mL)组合的DuoBody-CD40×4-1BB(0.001至10μg/mL)，以及IgG1-ctrl(0.001至10μg/mL)。在5天之后，将板以500×g离心5分钟，并将上清液从每个孔小心地转移至新的96孔圆底板。
在Envision仪器上使用Alpha Lisa IFNγ试剂盒(Perkin Elmer，目录号：AL217)根据制造商的说明通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析从MLR测定收集的上清液的干扰素γ(IFNγ)水平。
表11：抗体
1该抗体在Fc-活性IgG1主链中包含表1所示的CD40-特异性和4-1BB-特异性Fab臂(即没有Fc-沉默L234F、L235E、D265A突变)。
2该抗体在Fc-惰性IgG1主链中包含表1中所示的纳武单抗(MDX-1106)的CDR序列(即具有Fc-沉默L234F、L235E、D265A突变和DuoBody突变F405L)。
3基于抗HIV gp120抗体IgG1-b12(Barbas et al.,J Mol Biol 1993,230:812-823)。
结果
与IgG1-ctrl相比，BsIgG1-CD40×4-1BB增强了纯化的CD8+T细胞和同种异体mDC的共培养物中的IFNγ分泌(参见图6)。与单独的bsIgG1-CD40×4-1BB或单独的纳武单抗相比，同时暴露于bsIgG1-CD40×4-1BB和0.05至5μg/mL纳武单抗(IgG1-PD1-MDX1106-FEAL，α-PD1)诱导了IFNγ的剂量依赖性提高(图6)。
结论
该数据表明，通过使用抗PD1抗体靶向PD-1/PD-L1轴并与CD40和4-1BB共刺激组合可扩大免疫应答的强度。
实施例4：在同种异体MLR测定中DuoBody-CD40×4-1BB与IgG1-PD1组合对IFNγ分泌的作用
为了分析在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中DuoBody-CD40×4-1BB与IgG1-PD1(IgG1同种型的Fc惰性抗PD-1单克隆抗体)的组合与单一药剂活性相比是否可导致细胞因子产生的增强，在存在以下的情况下将CD8+T细胞与人成熟树突细胞(mDC)的两个独特的同种异体对共培养：单独的DuoBody-CD40×4-1BB、单独的IgG1-PD1、或两种抗体的组合。使用IFNγ特异性免疫测定评估共培养物上清液中的IFNγ分泌。
方法
来自健康供体的单核细胞和T细胞
CD14+单核细胞和纯化的CD8+T细胞从BioIVT获得。两个独特的同种异体供体对用于MLR测定。
单核细胞向未成熟树突细胞的分化
从健康供体中获得人CD14+单核细胞。为了使其分化成未成熟树突细胞(iDC)，将1至1.5×106个单核细胞/mL在37℃下于T25培养瓶(Falcon，目录号：353108)中在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco，目录号：16140071)、100ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；BioLegend，目录号：766106)和300ng/mL白介素-4(IL-4；BioLegend，目录号：766206)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640完全培养基(ATCC改良配方；ThermoFisher，目录号：A1049101)中培养6天。在四天之后，将培养基更换为具有补充物的新鲜培养基。
iDC向mDC的分化
在开始MLR测定之前，通过收集非黏附细胞来收获iDC，并通过在37℃下将1至1.5×106个细胞/mL在补充有10％ FBS、100ng/mL GM-CSF、300ng/mL IL-4和5μg/mL脂多糖(LPS；ThermoFisher，目录号：00-4976-93)的RPMI 1640完全培养基中孵育24小时来使其分化成成熟DC(mDC)。
混合淋巴细胞反应(MLR)
在MLR测定开始之前一天，将从同种异体健康供体获得的纯化的CD8+T细胞解冻，以1×106个细胞/mL重悬于补充有10％ FBS和10ng/mL IL-2(BioLegend，目录号：589106)的RPMI 1640完全培养基中并在37℃下孵育，O/N。
第二天，收获LPS-成熟的树突细胞(mDC，参见iDC的成熟)和同种异体的纯化的CD8+T细胞，并分别以4×105个细胞/mL和4×106个细胞/mL将其重悬于AIM-V培养基(ThermoFisher，目录号：12055091)中。以1:10的DC:T细胞比例接种共培养物(对应于将20,000个mDC与200,000个同种异体的纯化CD8+T细胞一起孵育)，并在存在以下的情况下在37℃下于96孔圆底板(Falcon，目录号：353227)中在AIM-V培养基中培养5天：作为单一药剂的IgG1-PD1(0.001至100μg/mL)、作为单一药剂的DuoBody-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)、或两种药剂组合(对应于7×7组合的剂量响应矩阵)。包括用IgG1-ctrl-FERR(100μg/mL)、bsIgG1-CD40×ctrl(30μg/mL)、bsIgG1-ctrl×4-1BB(30μg/mL)和IgG1-ctrl-FEAL(30μg/mL)处理的共培养物作为对照。在5天之后，将板以500×g离心5分钟，并将上清液从每个孔小心地转移至新的96孔圆底板。
在Envision仪器上使用Alpha Lisa IFNγ试剂盒(Perkin Elmer，目录号：AL217)根据制造商的说明通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析从MLR测定收集的上清液的IFNγ水平。
表12：
1基于抗HIV gp120抗体IgG1-b12的对照结合部分(Barbas et al.,J Mol Biol1993,230:812-823)。
协同分析
在协同分析中，针对每个供体对的数据单独进行处理。每个处理条件中的IFNγ的浓度(μg/mL)通过减去对照值(无处理对照孔)进行归一化，并表示为测定(IFNγ诱导)中最大值的百分比。IFNγ诱导值代表两次重复的平均值。使用R(v 4.1.0)中的SynergyFinder包(v 3.2.2；Zheng et al.,2021bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.06.01.446564)分析组合的两种抗体之间的相互作用。协同作用被定义为观察到的作用超过预期作用的过量部分，其通过两个参考模型(协同评分模型)：Highest SingleAgent(HAS；Berenbaum,1989Pharmacol Rev.41:93–141)和Bliss(Bliss,1939Annals ofApplied Biol.26:585-615)计算。
结果&结论
在MLR测定中，用单独的DuoBody-CD40×4-1BB或IgG1-PD1处理增强了IFNγ的分泌；DuoBody-CD40×4-1BB与1μg/mL IgG1-PD1的组合与单一药剂活性相比进一步增强了IFNγ的分泌(图7)。对于两个独特的供体对，使用DuoBody-CD40×4-1BB和IgG1-PD1的组合处理在一系列浓度组合的范围内导致协同作用，如使用Bliss和HSA协同评分模型确定的(图8)。
实施例5：进行抗原特异性刺激测定以确定IgG1-PD1与DuoBody-CD40×4-1BB组合增强T细胞增殖和细胞因子分泌的能力
为了确定与单一药剂活性相比，DuoBody-CD40×4-1BB和IgG1-PD1对T细胞增殖和细胞因子产生的组合作用，使用过表达PD-1的人CD8+T细胞和表达同源抗原的未成熟树突细胞(iDC)的共培养物进行抗原特异性刺激测定。
方法
细胞的分离和单核细胞向未成熟树突细胞的分化
HLA-A*02+外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)从健康供体(Transfusionszentrale,University Hospital,Mainz,Germany)获得。通过磁激活细胞分选(magnetic-activated cell sorting，MACS)技术使用抗CD14微珠(Miltenyi；目录号：130-050-201)根据制造商的说明从PBMC中分离单核细胞。将外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte，PBL，CD14阴性级分)冷冻保存以用于T细胞分离。为了分化成iDC，将1×106个单核细胞/mL在RPMI 1640(Life Technologies GmbH，目录号：61870-010)中培养5天，所述RPMI 1640含有5％合并的人血清(One Lambda Inc，目录号：A25761)、1mM丙酮酸钠(Life technologies GmbH，目录号：11360-039)、1×非必需氨基酸(LifeTechnologies GmbH，目录号：11140-035)、200ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；Miltenyi，目录号：130-093-868)和200ng/mL白介素-4(IL-4；Miltenyi，目录号：130-093-924)。在第3天，用含有补充物的新鲜培养基更换一半的培养基。通过收集非黏附细胞来收获iDC，并通过在37℃下与含有2mM EDTA的Dulbecco磷酸缓冲盐水(Dulbecco’sphosphate-buffered saline，DPBS)一起孵育10分钟使黏附细胞脱离。在用DPBS洗涤之后，将iDC冷冻保存在含有10％ DMSO(AppliChem GmbH，目录号：A3672,0050)的FBS(Sigma-Aldrich，目录号：F7524)中，以用于未来用于抗原特异性T细胞测定。
iDC和CD8+T细胞的电穿孔和CFSE标记
在抗原特异性CD8+T细胞刺激测定开始之前一天，将来自同一供体的冷冻PBL和iDC解冻。通过MACS技术使用抗CD8微珠(Miltenyi，目录号：130-045-201)根据制造商的说明从PBL分离CD8+T细胞。在250μLX-Vivo15培养基(Lonza，目录号：BE02-060Q)中将约10×106至15×106个CD8+T细胞用各自10μg的编码特异性针对人密蛋白-6(CLDN6；HLA-A*02-限制性；在WO 2015150327 A1中描述)的鼠TCR的α链和β链的体外翻译(IVT)-RNA加10μg编码人PD-1(UniProt Q15116)的IVT-RNA进行电穿孔。将细胞转移至4-mm电穿孔比色皿(VWRInternational GmbH，目录号：732-0023)，并使用BTX 830电穿孔系统(BTX；500V，3毫秒脉冲)进行电穿孔。在电穿孔之后，立即将细胞转移至含有5％合并的人血清的新鲜IMDM GlutaMAX培养基(Life Technologies GmbH，目录号：319800-030)中，并在37℃、5％CO2下静置至少1小时。使用在PBS中的0.8μM羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE；Life Technologies GmbH，目录号：V12883)根据制造商的说明标记T细胞并将其在补充有5％人AB血清的IMDM培养基中孵育过夜。
使用如上所述的电穿孔系统(300V，12毫秒脉冲)在250μL X-Vivo15培养基中将多至5×106个解冻的iDC用2μg编码全长人CLDN6(WO 2015150327A1)的IVT-RNA进行电穿孔，并将其在补充有5％合并的人血清的IMDM培养基中孵育过夜。
第二天，收获细胞。通过流式细胞术确定iDC上CLDN6的细胞表面表达，以及T细胞上CLDN6-特异性TCR和PD-1的细胞表面表达。为此，将iDC用经荧光标记的CLDN6-特异性抗体(不可商购获得；内部生产)进行染色。将T细胞用brilliant violet(BV)421缀合的抗小鼠TCR-β链抗体(Becton Dickinson GmbH，目录号：562839)和别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗人PD-1抗体(Thermo Fisher Scientific，目录号：17-2799-42)进行染色。
抗原-特异性体外T细胞刺激测定
将经电穿孔的iDC与经电穿孔的、经CFSE标记的T细胞以1:10的比例在96孔圆底板中在含有5％合并的人血清的IMDM培养基中在存在以下的情况下孵育：单独或与DuoBody-CD40×4-1BB(0.0022、0.0067或0.2μg/mL)组合的IgG1-PD1(0.8μg/mL)、派姆单抗(Merck Sharp&Dohme GmbH，PZN 10749897)(0.8μg/mL)，或者阴性对照抗体IgG1-ctrl-FERR(0.8μg/mL)。在培养4天之后，将细胞用APC缀合的抗人CD8抗体进行染色。使用BD FACSCelestaTM流式细胞仪(Becton Dickinson GmbH)通过对CD8+T细胞中CFSE稀释的流式细胞术分析评价T细胞增殖。
使用FlowJo软件版本10.7.1分析流式细胞术数据。使用FlowJo中的增殖建模工具评估CD8+T细胞的CFSE标记稀释，并使用积分公式计算扩增指数。
细胞因子浓度的确定
使用用于检测10种人细胞因子组(GM-CSF、IL-2、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、干扰素[IFN]γ、IFNγ可诱导蛋白[IP]-10[也称为C-X-C基序趋化因子配体10]、巨噬细胞趋化蛋白[macrophage chemoattractant protein，MCP]1和肿瘤坏死因子[TNF]α；MesoScale Discovery，目录号：K15067L-2)的定制的U-Plex生物标志物组1(人)测定，按照制造商的方案通过多重电化学发光免疫测定来确定从4天之后的T细胞/iDC共培养物中收集的上清液中的细胞因子浓度。
表13：抗体
1基于抗HIV gp120抗体IgG1-b12的对照结合部分(Barbas et al.,J Mol Biol1993,230:812-823)。
结果
与DuoBody-CD40×4-1BB与非结合对照抗体IgG1-ctrl-FERR组合相比，以及与作为单一处理的IgG1-PD1相比，用IgG1-PD1和DuoBody-CD40×4-1BB的组合处理增强了CD8+T细胞增殖(图9)。与两种单一药剂处理相比，当在组合处理中使用高浓度的DuoBody-CD40×4-1BB(0.2μg/mL)时观察到增殖的提高。与单独的IgG1-PD1相比，IgG1-PD1与低(0.0022μg/mL)或中间(0.0067μg/mL)浓度的DuoBody-CD40×4-1BB的组合对增殖的影响最小或没有影响。与作为单一药剂的两种化合物相比，用派姆单抗和高浓度的DuoBody-CD40×4-1BB的组合处理也增强了增殖。
与DuoBody-CD40×4-1BB和IgG1-ctrl-FERR组合相比以及与作为单一处理的IgG1-PD1相比，用IgG1-PD1和DuoBody-CD40×4-1BB的组合处理增强了促炎细胞因子GM-CSF、IFNγ、IL-13和TNFα的分泌(图10)。与两种单一药剂处理相比，当在组合处理中使用高浓度的DuoBody-CD40×4-1BB(0.2μg/mL)时观察到细胞因子分泌的提高。与单独的IgG1-PD1相比，IgG1-PD1与低(0.0022μg/mL)或中间(0.0067μg/mL)浓度的DuoBody-CD40×4-1BB的组合对细胞因子分泌的影响最小或没有影响。与作为单一药剂的两种化合物相比，用派姆单抗和高浓度的DuoBody-CD40×4-1BB的组合处理也增强了细胞因子分泌。与单一药剂处理相比，测试的其他细胞因子的分泌没有持续增强或者没有增强。
实施例6：IgG1-PD1的产生和材料筛选
PD-1和FcγR构建体
产生了编码多种全长PD-1变体的质粒：人(智人(Homo sapiens)；UniProtKB ID：Q15116)、食蟹猴(食蟹猕猴(Macaca fascicularis)；UniProtKB ID：B0LAJ3)、狗(家犬(Canis familiaris)；UniProtKB ID：E2RPS2)、兔(穴兔(Oryctolagus cuniculus)；UniProtKB ID：G1SUF0)、猪(野猪(Sus scrofa)；UniProtKB ID：A0A287A1C3)、大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus)；UniProtKB ID：D3ZIN8)和小鼠(小家鼠(Mus musculus)；UniProtKBID：Q02242)，以及编码人FcγRIa的质粒(UniProt KB ID：P12314)。
瞬时表达全长PD-1或FcγR变体的CHO-S细胞系的产生
使用FreeStyleTMMAX Reagent(ThermoFisher Scientific，目录号：16447100)和OptiPROTM无血清培养基(ThermoFisher Scientific，目录号：12309019)根据制造商的说明用PD-1或FcγR质粒转染CHO-S细胞(适于悬浮生长的CHO细胞的亚克隆；ThermoFisherScientific，目录号：R800-07)。
抗体变体的产生
IgG1-PD1
用重组人His标记的PD-1蛋白(R&D Systems，目录号：8986-PD)免疫接种三只新西兰白兔(New Zealand White rabbit)。通过人PD-1酶联免疫吸附测定(ELISA)、细胞的人PD-1结合测定并通过人PD-1/PD-L1阻断生物测定来分选来自血液的单个B细胞并针对PD-1特异性抗体的产生筛选上清液。从筛选的阳性B细胞中提取RNA并进行测序。基因合成重链和轻链的可变区并克隆含有突变L234A和L235A(LALA)的人免疫球蛋白恒定部分(IgG1/κ)的N端，其中氨基酸位置编号根据EU编号(SEQ ID NO:70)，以使与Fcγ受体的相互作用最小化。
使用293-free转染试剂(Novagen/Merck)通过Tecan Freedom Evo装置进行HEK293-FreeStyle细胞的瞬时转染。使用带有板自动进样器的Dionex Ultimate 3000HPLC上的蛋白A亲和色谱从细胞上清液中纯化产生的嵌合抗体。纯化的抗体用于进一步分析，特别是通过人PD-1ELISA、细胞的人PD-1结合测定、人PD-1/PD-L1阻断生物测定和T细胞增殖测定进行的再测试。嵌合兔抗体MAB-19-0202(SEQ ID NO:71和72)被鉴定为表现最好的克隆，并随后被人源化。
嵌合PD-1抗体MAB-19-0202的可变区序列在下表中示出。表14示出了重链的可变区，而表15示出了轻链的可变区。在这两种情况下，限定了根据Kabat编号的框架区(FR)以及互补决定区(CDR)。带下划线的氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。加粗字母表示Kabat和IMGT编号的相交部分。
表14：MAB-19-0202(MAB-19-0202-HC；SEQ ID NO:71)的重链的框架和可变区(包括根据Kabat(加粗字母)编号或IMGT(带下划线)编号的CDR)
表15：MAB-19-0202(MAB-19-0202-LC；SEQ ID NO:72)的轻链的框架和可变区(包括根据Kabat(加粗字母)编号或IMGT(带下划线)编号的CDR)
通过结构建模辅助的CDR接枝、基因合成和克隆人免疫球蛋白恒定部分(具有LALA突变的IgG1/κ)的N端产生人源化重链和轻链可变区抗体序列。人源化抗体用于进一步分析，特别是通过人PD-1ELISA、细胞的人PD-1结合测定、人PD-1/PD-L1阻断生物测定和T细胞增殖测定进行的再测试。人源化抗体MAB-19-0618(SEQ ID NO:43和44)被鉴定为表现最好的克隆。
重组人源化序列的人源化轻链和重链相对于抗体ID的分配在表16中列出。人源化轻链和重链的可变区序列在表17和18中示出。表17示出了重链的可变区，而表18示出了轻链的可变区。在这两种情况下，限定了根据Kabat编号的框架区(FR)以及互补决定区(CDR)。带下划线的氨基酸表示根据IMGT编号的CDR。
表16：重组人源化序列的人源化轻链和重链相对于抗体ID的分配
表17：MAB-19-0618(SEQ ID NO:43，来源于MAB-19-0202-H5)的重链的框架区和可变区，包括根据Kabat(加粗字母)编号或IMGT(带下划线)编号的CDR
表18：MAB-19-0618(SEQ ID NO:44，来源于MAB-19-0202-L4)的轻链的框架区和可变区，包括根据Kabat(加粗字母)编号或IMGT(带下划线)编号的CDR
基因合成MAB-19-0618的重链和轻链的可变区的序列，并通过不依赖连接的克隆(ligation-independent cloning，LIC)将其克隆至具有密码子优化序列的表达载体中，所述密码子优化序列编码含有Fc沉默突变L234F、L235E和G236R(FER)的人IgG1m(f)重链恒定结构域，其中氨基酸位置编号根据EU编号(SEQ ID NO:61)以及人κ轻链恒定结构域(SEQ IDNO:27)。所得抗体被命名为IgG1-PD1。
使用GS表达系统(Lonza)以产生表达IgG1-PD1的稳定细胞系。通过LonzaBiologics plc将编码IgG1-PD1的重链和轻链的序列分别克隆至表达载体pXC-18.4和pXC-Kappa(含有谷氨酰胺合成酶[GS]基因)中。接下来，通过将重链载体的完整表达盒连接至轻链载体来构建编码IgG1-PD1的重链和轻链二者的双基因载体(DGV)。用限制酶PvuI-HF(NewEngland Biolabs，R3150L)使该DGV的DNA线性化，并将其用于/>细胞的稳定转染。纯化IgG1-PD1以用于功能表征。
IgG1-CD52-E430G
在C1q结合实验中将具有与CAMPATH-1H(CD52特异性抗体)相同的抗原结合结构域以及在Fc结构域(SEQ ID NO:73)中具有E430G六聚化增强突变(WO 2013/004842 A2)的人IgG1抗体用作阳性对照(Crowe et al.,1992Clin Exp Immunol.87(1):105-110)(SEQ IDNO.74和75)。
对照抗体
在数个实验中将具有与b12(HIV1 gp120特异性抗体)相同的抗原结合结构域的人IgG1抗体用作阴性对照(Barbas et al.,J Mol Biol.1993Apr5；230(3):812-2)。通过从头基因合成(GeneArt Gene Synthesis；ThermoFisher Scientific，Germany)制备b12的VH和VL结构域(SEQ ID NO:59和60)并将其克隆至表达载体中，所述表达载体含有人IgG1m(f)同种异型(SEQ ID NO:29)或其变体(含有L234F/L235E/G236R突变和在本研究的背景下功能不相关的Fc结构域中的另外的K409R突变，缩写为FERR突变)(SEQ ID NO:62)的人IgG1重链恒定区(即CH1区、铰链区、CH2区和CH3区)，或者含有人IgG4重链恒定区(SEQ ID NO:76)，或人κ轻链(light chain，LC)的恒定区(SEQ ID NO:27)，视所选结合结构域而定。通过在产生细胞系中转染重链和轻链表达载体获得抗体，并进行纯化以用于功能表征。
实施例7：IgG1-PD1与来自不同物种的PD-1的结合
使用来自不同动物物种的瞬时表达PD-1的CHO-S细胞，通过流式细胞术评估IgG1-PD1与通常用于非临床毒理学研究的物种的PD-1的结合。
将CHO-S细胞(5×104个细胞/孔)接种在圆底96孔板中。在Genmab(GMB)荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)缓冲液(磷酸缓冲盐水[PBS；Lonza，目录号：BE17-517Q，在蒸馏水中稀释至1×PBS]；补充有0.1％[w/v]牛血清白蛋白[BSA；Roche；目录号：10735086001]和0.02％[w/v]叠氮化钠[NaN3；bioWORLD，目录号：41920044-3])中制备IgG1-PD1、IgG1-ctrl-FERR和派姆单抗的抗体稀释液(1.7×10-4至30μg/mL或者5.6×10-5至10μg/mL，3倍稀释)。仅在测试的最高浓度(30μg/mL或10μg/mL)下包含针对派姆单抗的IgG4同种型对照(BioLegend，目录号：403702)。将细胞离心，去除上清液，并将细胞在4℃下于50μL的抗体稀释液中孵育30分钟。将细胞用GMB FACS缓冲液洗涤两次，并在4℃下与50μL二抗R-藻红蛋白(R-phycoerythrin，PE)缀合的山羊抗人IgG F(ab')2(Jackson ImmunoResearch，目录号：109-116-098；在GMB FACS缓冲液中以1:500稀释)一起避光孵育30分钟。将细胞用GMB FACS缓冲液洗涤两次，重悬于补充有2mM乙二胺四乙酸(EDTA；Sigma-Aldrich，目录号：03690)和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)生存力标志物(1:5,000；BD Pharmingen，目录号：564907)的GMB FACS缓冲液中。在iQuePLUS Screener(Intellicyt Corporation)上使用FlowJo软件通过流式细胞术分析与具生存力细胞(通过DAPI排除鉴定)结合的抗体。使用GraphPad Prism中的非线性回归分析(四参数剂量响应曲线拟合)来分析结合曲线。
使用瞬时转染以在细胞表面上表达人、食蟹猴、狗、兔、猪、大鼠或小鼠PD-1蛋白的CHO-S细胞通过流式细胞术评价IgG1-PD1与不同物种的PD-1的结合。对于人和食蟹猴PD-1观察到了IgG1-PD1的剂量依赖性结合(图11A-B)。派姆单抗表现出相当的结合。并且仅在最高浓度下观察到IgG1-PD1与啮齿动物PD-1(小鼠、大鼠PD-1)交叉反应性的显著降低(图11C至D)，并且没有观察到IgG1-PD1与经常用于毒理学研究的其他物种(兔、狗、猪)的PD-1的结合(图11E)。没有观察到与未转染对照细胞的IgG1-PD1结合(图11E)，也没有观察到作为阴性对照包括在内的IgG1-ctrl-FERR与任何测试物种的PD-1结合(图11)。
总之，IgG1-PD1显示出与膜表达的人PD-1和食蟹猴PD-1相当的结合，以及与小鼠、大鼠、兔、狗和猪PD-1的显著较低的结合或者不与其结合。
实施例8：通过表面等离子体共振确定与人和食蟹猴PD-1的结合
使用Biacore 8K SPR系统，通过表面等离子体共振(SPR)分析固定化的IgG1-PD1、派姆单抗和纳武单抗与人和食蟹猴PD-1的结合。具有C端His标签的重组人和食蟹猴PD-1胞外结构域(extracellular domain，ECD)从Sino Biological获得(目录号分别为：HPLC-10377-H08H和HPLC-90311-C08H)。
使用胺偶联和人抗体捕获试剂盒，2型(Cytiva，目录号：BR100050和BR100839)根据制造商的说明将Biacore系列S传感器芯片CM5(Cytiva，目录号：29149603)用抗Fc抗体共价包被。
随后，在25℃下将在HBS-EP+缓冲液(Cytiva，目录号：BR100669；在蒸馏水[BBraun，目录号：00182479E]中稀释至1×)中稀释的IgG1-PD1(2nM)、纳武单抗(Bristol-Myers Squibb，批号：ABP6534；1.25nM)和派姆单抗(Merck Sharp&Dohme，批号：T019263；1.25nM)以10μL/分钟的流速和60秒的接触时间捕获在表面上。这导致约50个共振单位(resonance units，RU)的捕获水平。
在HBS-EP+缓冲液的三个初始循环之后，注射人或食蟹猴PD-1ECD样品(0.19至200nM；在HBS-EP+缓冲液中的2倍稀释；12个循环)以产生结合曲线。在抗体包被表面(活性表面)上分析的每个样品也在不具有抗体的平行流动池(参考表面)上进行分析，其用于背景校正。
在每个循环结束时，使用pH 1.5的10mM甘氨酸-HCl(Cytiva，目录号：BR100354)使表面再生。使用Biacore Insight评价软件(Cytiva)中预定义的“Multi-cycle kineticsusing capture”分析数据。从分析中省略具有最高浓度的人或食蟹猴PD-1(200nM)的样品，以允许更好的数据曲线拟合。
固定化的IgG1-PD1与人PD-1ECD结合的结合亲和力(KD)为1.45±0.05nM(表19)。纳武单抗和派姆单抗与人PD-1ECD的结合具有与IgG1-PD1的KD相当的结合亲和力，即KD值在低纳摩尔范围内(分别为4.43±0.08nM和3.59±0.10nM)(表19)。
固定化的IgG1-PD1与食蟹猴PD-1ECD结合的KD为2.74±0.58nM(表20)，这与IgG1-PD1针对人PD-1的亲和力相当。纳武单抗和派姆单抗与食蟹猴PD-1ECD结合具有的结合亲和力与IgG1-PD1针对食蟹猴PD-1ECD的KD相当，并且与纳武单抗和派姆单抗针对人PD-1ECD的KD相当，即KD值在低纳摩尔范围内(分别为2.93±0.58nM和0.90±0.06nM)(表20)。
表19.通过表面等离子体共振确定的PD-1抗体与人PD-1的胞外结构域的结合亲和力。IgG1-PD1、纳武单抗和派姆单抗针对人PD-1的ECD的结合速率常数ka(1/Ms)、解离速率常数kd(1/s)和平衡解离常数KD(M)通过SPR确定。
a来自三个独立实验的平均值和SD。
b来自两个独立实验的平均值和SD。
缩写：KD＝平衡离解常数；ka＝缔合速率常数；kd＝解离速率常数或解离速率；SD＝标准偏差。
表20.通过表面等离子体共振确定的PD-1抗体与食蟹猴PD-1的胞外结构域的结合亲和力。IgG1-PD1、纳武单抗和派姆单抗针对食蟹猴PD-1的ECD的结合速率常数ka(1/Ms)、解离速率常数kd(1/s)和平衡解离常数KD(M)通过SPR确定。
a来自三个独立实验的平均值和SD。
b来自两个独立实验的平均值和SD。
缩写KD＝平衡离解常数；ka＝缔合速率常数；kd＝解离速率常数或解离速率；SD＝标准偏差。
实施例9：IgG1-PD1对PD-1配体结合和PD-1/PD-L1信号传导的作用
为了确定IgG1-PD1作为经典免疫检查点抑制剂的功能，体外评估了IgG1-PD1破坏PD-1配体结合和PD-1检查点功能的能力。
通过流式细胞术评估IgG1-PD1与重组人PD-L1和PD-L2与膜表达人PD-1的竞争性结合。将用人PD-1瞬时转染的CHO-S细胞(参见实施例6；5×104个细胞/孔)添加至圆底96孔板(Greiner，目录号：650180)的孔，使其沉淀并置于冰上。将在PBS(Cytiva，目录号：SH3A3830.03)中稀释的生物素化重组人PD-L1(R&D Systems，目录号：AVI156)或PD-L2(R&DSystems，目录号：AVI1224)添加至细胞(最终浓度：1μg/mL)，在此之后立即添加在PBS中稀释的一定浓度范围的IgG1-PD1、派姆单抗(MSD，批号：T019263和T036998)或IgG1-ctrl-FERR(最终浓度：30μg/mL至0.5ng/mL，三倍稀释步骤)。然后在RT下将细胞孵育45分钟。将细胞用PBS洗涤两次并在4℃下与50μL链霉亲和素-别藻蓝蛋白(R&DSystems，目录号：F0050；在PBS中以1:20稀释)一起避光孵育30分钟。将细胞用PBS洗涤两次，并重悬在20μL GMBFACS缓冲液中。在iQue Screener PLUS(Sartorius)上使用FlowJo软件通过流式细胞术分析链霉亲和素-别藻蓝蛋白结合。
使用基于生物发光细胞的PD-1/PD-L1阻断报道测定(Promega，目录号：J1255)基本按照制造商的描述确定IgG1-PD1对PD-1和PD-L1的功能性相互作用的影响。简而言之，在37℃、5％ CO2下将PD-L1aAPC/CHO-K1细胞和PD-1效应细胞的共培养物与经连续稀释的IgG1-PD1、派姆单抗(MSD，批号：10749880或T019263)、纳武单抗(Bristol-Myers Squibb，批号：11024601)或IgG1-ctrl-FERR(最终测定浓度：在3倍稀释液中15至0.0008μg/mL或在5倍稀释液中10至0.0032μg/mL)一起孵育6小时。然后在RT下将细胞与重组的Bio-GloTM一起孵育5至30分钟，在此之后使用F200PRO读取器(Tecan)或EnVision Multilabel板读取器(PerkinElmer)测量发光(以相对光单位[RLU]计)。
使用GraphPad Prism软件通过非线性回归分析(四参数剂量-响应曲线拟合)对剂量-响应曲线进行分析，并且从拟合曲线得出观察到50％最大(抑制)作用时的浓度(EC50/IC50)。
IgG1-PD1以剂量依赖性方式破坏人PD-L1和PD-L2与膜表达人PD-1的结合(图12)，其中PD-L1结合抑制的IC50值为2.059±0.653μg/mL(13.9±4.4nM)，并且PD-L2结合抑制的IC50值为1.659±0.721μg/mL(11.2±4.9nM)，即在纳摩尔范围内(表21)。派姆单抗显示出具有相当效力的PD-L1和PD-L2结合抑制，即具有在纳摩尔范围内的IC50值。
使用基于细胞的生物发光PD-1/PD-L1阻断报道测定来测试PD-1/PD-L1轴的功能性阻断。将表达人PD-1并携带NFAT-RE驱动的萤光素酶的报道Jurkat T细胞与表达人PD-L1和抗原依赖性TCR激活物的PD-L1 aAPC/CHOK1细胞的共培养物，在不存在和存在IgG1-PD1、派姆单抗或纳武单抗的浓度稀释系列的情况下一起孵育。包括IgG1-ctrl-FERR作为阴性对照。PD-1/PD-L1相互作用的阻断导致PD1/PDL1介导的抑制性信号的释放，进而导致TCR活化和NFAT-RE介导的萤光素酶表达(经发光测量的)。IgG1-PD1诱导了在PD-1+报道T细胞中TCR信号传导的剂量依赖性提高(图13)。EC50为0.165±0.056μg/mL(1.12±0.38nM；表22)。派姆单抗类似地缓解了PD-1介导的对TCR信号传导的抑制，其中EC50为0.129±0.051μg/mL(0.86±0.34nM)，即具有相当的效力。纳武单抗缓解了对TCR信号传导的抑制，其中EC50为0.479±0.198μg/mL(3.28±1.36nM)，即具有稍低的效力。
总之，IgG1-PD1通过阻断PD-1配体结合和破坏PD-1免疫检查点功能在体外充当经典的免疫检查点抑制剂。
表21.IgG1-PD1介导对PD-1配体结合抑制的IC50值。IC50值从竞争性结合曲线计算。
缩写：IC50＝观察到50％抑制作用时的浓度；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；PD-L1＝程序性细胞死亡1配体1；PD-L2＝程序性细胞死亡1配体2；SD＝标准偏差。
表22.PD 1/PD-L1检查点阻断的EC50。在PD-1/PD-L1阻断报道测定中，将PD-1+报道T细胞和PD-L1 aAPC/CHO-K细胞的共培养物与一定浓度系列的IgG1-PD1、派姆单抗或纳武单抗一起孵育。通过测量发光确定了导致报道T细胞中的下游TCR信号传导和萤光素酶表达的PD-1/PD-L1检查点功能的抑制。EC50值从所得剂量-响应曲线计算。
缩写：aAPC＝人工抗原呈递细胞；CHO＝中国仓鼠卵巢；EC50＝观察到50％最大作用时的浓度；PD-1＝程序性细胞死亡蛋白1；PD-L1＝程序性细胞死亡1配体1；S＝标准偏差；TCR＝T细胞受体。
实施例10：进行抗原特异性增殖测定以确定IgG1-PD1增强活化T细胞的增殖的能力
为了确定IgG1-PD1增强T细胞增殖的能力，使用过表达PD-1的人CD8+T细胞进行抗原特异性增殖测定。
HLA-A*02+外周血单个核细胞(PBMC)从健康供体(Transfusionszentrale，University Hospital，Mainz，Germany)中获得。通过磁激活细胞分选(MACS)技术使用抗CD14微珠(Miltenyi；目录号：130-050-201)根据制造商的说明从PBMC中分离单核细胞。将外周血淋巴细胞(PBL，CD14阴性级分)冷冻保存以用于T细胞分离。为了分化成未成熟DC(iDC)，将1×106个单核细胞/mL在RPMI 1640(Life Technologies GmbH，目录号：61870-010)中培养5天，所述RPMI 1640含有5％合并的人血清(One Lambda Inc，目录号：A25761)、1mM丙酮酸钠(Life technologies GmbH，目录号：11360-039)、1×非必需氨基酸(LifeTechnologies GmbH，目录号：11140-035)、100IU/mL青霉素-链霉素(Life TechnologiesGmbH，目录号：15140-122)、100ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；Miltenyi，目录号：130-093-868)和50ng/mL白介素-4(IL-4；Miltenyi，目录号：130-093-924)。在这5天期间之后，用新鲜培养基更换一半培的养基。通过收集非黏附细胞来收获iDC，并通过与在37℃下与含有2mM EDTA的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)一起孵育10分钟使黏附细胞脱离。在用DPBS洗涤之后，将iDC冷冻保存在含有10％ DMSO(AppliChem GmbH，目录号：A3672,0050)和10％人白蛋白(CSLBehring，PZN 00504775)的RPMI 1640中，以用于未来用于抗原特异性T细胞测定。
在抗原特异性CD8+T细胞增殖测定开始之前一天，将来自同一供体的冷冻PBL和iDC解冻。通过MACS技术使用抗CD8微珠(Miltenyi，目录号：130-045-201)根据制造商的说明从PBL分离CD8+T细胞。在250μLX-Vivo15培养基(Lonza，目录号：BE02-060Q)中将约10×106至15×106个CD8+T细胞用各自10μg的编码特异性针对人密蛋白-6(CLDN6；HLA-A*02-限制性；在WO 2015/150327 A1中描述)的鼠TCR的α链和β链的体外翻译(IVT)-RNA加10μg编码人PD-1(UniProt Q15116)的IVT-RNA进行电穿孔。将细胞转移至4-mm电穿孔比色皿(VWRInternational GmbH，目录号：732-0023)，并使用BTX 830电穿孔系统(BTX；500V，1×3毫秒脉冲)进行电穿孔。在电穿孔之后，立即将细胞转移至含有5％合并的人血清的新鲜IMDM GlutaMAX培养基(Life Technologies GmbH，目录号：319800-030)中，并在37℃、5％CO2下静置至少1小时。使用在在PBS中的1.6μM羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE；LifeTechnologies GmbH，目录号：V12883)根据制造商的说明标记T细胞并将其在补充有5％人AB血清的IMDM培养基中孵育过夜。
使用如上所述的电穿孔系统(300V，1×12毫秒脉冲)在250μLX-Vivo15培养基中将多至5×106个解冻的iDC用2μg编码全长人CLDN6(WO 2015/150327 A1)的IVT-RNA进行电穿孔，并将其在补充有5％合并的人血清的IMDM培养基中孵育过夜。
第二天，收获细胞。通过流式细胞术确定iDC上CLDN6的细胞表面表达，以及T细胞上CLDN6-特异性TCR和PD-1的细胞表面表达。为此，将iDC用DyLight650缀合的CLDN6-特异性抗体(不可商购获得；内部生产)进行染色。将T细胞用brilliant violet(BV)421缀合的抗小鼠TCR-β链抗体(Becton Dickinson GmbH，目录号：562839)和别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗人PD-1抗体(Thermo Fisher Scientific，目录号：17-2799-42)进行染色。
将经电穿孔的iDC与经电穿孔的、经CFSE标记的T细胞以1:10的比例在96孔圆底板中在含有5％合并的人血清的IMDM培养基中在存在以下的情况下孵育：以4倍连续稀释(0.00005至0.8μg/mL)的IgG1-PD1、派姆单抗(Merck Sharp&Dohme GmbH，PZN10749897)或纳武单抗(/>Bristol-Myers Squibb，PZN 11024601)。以0.8μg/mL的单一浓度使用阴性对照抗体IgG1-ctrl-FERR。在培养4天之后，将细胞用APC缀合的抗人CD8抗体进行染色。使用BD FACSCelestaTM流式细胞仪(Becton Dickinson GmbH)通过对CD8+T细胞中CFSE稀释的流式细胞术分析评价T细胞增殖。
使用FlowJo软件版本10.7.1分析流式细胞术数据。使用FlowJo中的增殖建模工具评估CD8+T细胞的CFSE标记稀释，并使用积分公式计算扩增指数。在GraphPad Prism版本9(GraphPad Software，Inc.)中使用4参数对数拟合生成剂量响应曲线。使用GraphPadPrism版本9，通过Friedman检验和Dunn多重比较检验确定统计学显著性。
CD8-T细胞的抗原特异性增殖通过IgG1-PD1以剂量依赖性方式增强(图14)，具有在皮摩尔范围内的EC50值(表23)。用派姆单抗或纳武单抗处理也以剂量依赖性方式增强T细胞增殖。派姆单抗的平均EC50与IgG1-PD1相当，而纳武单抗的EC50显著(P＝0.0267)高于IgG1-PD1的EC50。
表23：抗原特异性增殖测定中的EC50值。IgG1-PD1、派姆单抗和纳武单抗的EC50值使用如通过抗原特异性T细胞增殖测定所测量的CD8+T细胞扩增指数确定。示出的数据是基于4参数对数拟合计算的值。缩写：EC50＝半数最大有效浓度；FERR＝L234F/L235E/G236R-K409R；PD1＝程序性细胞死亡蛋白1；SD＝标准偏差。
实施例11：在同种异体MLR测定中IgG1-PD1对细胞因子分泌的作用
为了研究在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中IgG1-PD1增强细胞因子分泌的能力，在存在IgG1-PD1的情况下，共培养CD8+T细胞与人成熟树突细胞(mDC)的三个独特的同种异体对。使用IFNγ特异性免疫测定测量IFNγ的水平，同时使用定制的Luminex多重免疫测定确定单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、GM-CSF、白介素(IL)-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12-p40、IL-15、IL-17α和肿瘤坏死因子(TNFα)的水平。
从健康供体(BioIVT)中获得人CD14+单核细胞。为了使其分化成未成熟树突细胞(iDC)，将单核细胞在37℃下在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco，目录号：16140071)、100ng/mL GM-CSF和300ng/mL IL-4(BioLegend，目录号：766206)的RPMI-1640完全培养基(ATCC改良配方；ThermoFisher，目录号：A1049101)中培养6天。在第4天，将培养基更换为具有补充物的新鲜培养基。为了使iDC成熟，将细胞在37℃下在补充有10％ FBS、100ng/mLGM-CSF、300ng/mL IL-4和5μg/mL脂多糖(LPS；Thermo Fisher Scientific，目录号：00 4976 93)的RPMI-1640完全培养基中孵育24小时，随后开始MLR测定。并行地，将从同种异体健康供体(BioIVT)获得的纯化的CD8+T细胞解冻，并在37℃下在补充有10％ FBS和10ng/mLIL-2(BioLegend，目录号：589106)的RPMI-1640完全培养基中孵育，O/N。
第二天，收获LPS-成熟的树突细胞(mDC)和同种异体CD8+T细胞，并分别以4×105个细胞/mL和4×106个细胞/mL将其重悬于预热的AIM-V培养基(ThermoFisher，目录号：12055091)中。在37℃下在96孔圆底板中在AIM-V培养基中在存在一定抗体浓度范围(0.001至30μg/mL)的IgG1-PD1、IgG1-ctrl-FERR或派姆单抗(MSD，目录号：T019263)的情况下或在存在30μg/mL的IgG4同种型对照(BioLegend，目录号：403702)的情况下，将mDC(20,000个细胞/孔)与同种异体的初始CD8+T细胞(200,000个细胞/孔)一起孵育。
在5天之后，将不含细胞的上清液从每个孔转移至新的96孔板，并储存在-80℃下，直至进一步分析细胞因子浓度。
在Envision仪器上使用IFNγ特异性免疫测定(Alpha Lisa IFNγ试剂盒，PerkinElmer，目录号：AL217)根据制造商的说明确定IFNγ水平。
使用基于人TH17磁珠板的定制/>多重免疫测定(Millipore，订购号：SPR1526)确定MCP-1、GM-CSF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12-p40、IL-15、IL-17α和TNFα的水平。简而言之，将不含细胞的上清液解冻并将各样品的10μL添加至用1×洗涤缓冲液预洗涤的384孔板(Greiner Bio-One，目录号：781096)的孔中的10μL测定缓冲液。并行地，将测定缓冲液中的10μL标准物或对照物添加至该孔，在此之后添加10μL测定培养基。将针对不同细胞因子的磁珠混合，并在珠稀释剂(BeadDiluent)中稀释至1×浓度，在此之后将10μL混合珠添加至每个孔。将板密封并在4℃下振荡孵育，O/N。将孔用60μL1×洗涤缓冲液洗涤三次。随后，将10μL的定制检测抗体(CustomDetection Antibodies)添加至每个孔，并将板密封并在RT下振荡孵育1小时。接下来，将10μL的链霉亲和素-PE添加至每个孔，并将板密封并在RT下振荡孵育30分钟。如上所述，将孔用60μL 1×洗涤缓冲液洗涤三次，在此之后通过在RT下振荡5分钟将珠重悬于75μLLuminex鞘液(Luminex Sheath Fluid)中。将样品在Luminex FlexMap 3D系统上运行。
在MLR测定开始和结束时，使用PE-Cy7缀合的抗PD-1(BioLegend，目录号：329918；1:20)、别藻蓝蛋白缀合的抗PD-L1(BioLegend，目录号：329708；1:80)、BUV496缀合的抗CD3(BD Biosciences，目录号：612940；1:20)和BUV395缀合的抗CD8(BD Biosciences，目录号：563795；1:20)通过流式细胞术确定CD8+T细胞上的PD-1表达和mDC上的PD-L1表达。
IgG1-PD1以剂量依赖性方式持续增强IFNγ的分泌(图15)。IgG1-PD1还增强了MCP-1、GM-CSF、IL-2、IL-6、IL-12p40、IL-17α、IL-10和TNFα的分泌(图16)。派姆单抗对细胞因子分泌有类似的作用。
实施例12：C1q与IgG1-PD1结合的评价
使用活化的人CD8+T细胞评估补体蛋白C1q与在恒定重链区携带FER Fc-沉默突变的IgG1-PD1的结合。包括IgG1-CD52-E430G作为阳性对照，其具有基于CD52抗体CAMPATH-1H的VH和VL结构域，并且其具有当与细胞表面结合时有效结合C1q的Fc-增强的主链。包括IgG1-ctrl-FERR和IgG1-ctrl作为非结合阴性对照抗体。
通过使用RosetteSepTM人CD8+T细胞富集混合物(Stemcell Technologies，目录号：15023C.2)进行阴性选择，或者通过使用CD8微珠(Miltenyi Biotec，目录号：130-045-201)和LS柱(Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401)经由磁激活细胞分选(MACS)进行阳性选择，从获自健康志愿者(Sanquin)的血沉棕黄层中纯化(富集)人CD8+T细胞，所有均根据制造商的说明进行。将经纯化的T细胞重悬于T细胞培养基(具有25mM HEPES和L-谷氨酰胺[Lonza，目录号：BE12-115F]的Roswell Park Memorial Institute[RPMI]-1640培养基，其补充有10％热灭活的含铁的供体牛血清[DBSI；Gibco，目录号：20731-030]和青霉素/链霉素[pen/strep；Lonza，目录号：DE17-603E])中。
将抗CD3/CD28珠(DynabeadsTM人T-激活剂CD3/CD28；ThermoFisher Scientific，目录号：11132D)用PBS洗涤，并重悬于T细胞培养基中。将珠以1:1的比例添加至富集的人CD8+T细胞中，并在37℃、5％ CO2下孵育48小时。接下来，使用磁体移除珠，并将细胞在PBS中洗涤两次，并再次计数。
使用IgG1-PD1(30μg/mL)和R-藻红蛋白(PE)缀合的山羊抗人IgG F(ab’)2(在GMBFACS缓冲液中以1:200稀释；Jackson ImmunoResearch，目录号：109-116-098)，或市售的PE缀合的PD-1抗体(BioLegend，目录号：329906；以1:50稀释)，通过流式细胞术确定活化的CD8+T细胞上的PD-1表达。
将活化的CD8+T细胞接种在圆底96孔板中(30,000或50,000个细胞/孔)，使其沉淀，并重悬于30μL测定培养基(具有25mM HEPES和L-谷氨酰胺的RPMI-1640，其补充有0.1％[w/v]牛血清白蛋白级分V[BSA；Roche，目录号：10735086001]和青霉素/链霉素)中。随后，将50μL的IgG1-PD1、IgG1-ctrl-FERR、IgG1-CD52-E430G或IgG1-ctrl(在测定培养基中在3倍稀释步骤中，最终浓度为1.7×10-4至30μg/mL)添加至每个孔，并在37℃下孵育15分钟，以使抗体与细胞结合。
添加作为C1q来源的人血清(20μL/孔，Sanquin，批号：20L15-02)，直至20％的最终浓度。将细胞在冰上孵育45分钟，随后用冰冷的GMB FACS缓冲液洗涤两次，并且在4℃下在存在或不存在别藻蓝蛋白缀合的小鼠抗CD8(BD Biosciences，目录号：555369；在GMB FACS缓冲液中以1:50稀释)的情况下，将其与50μL异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)缀合的兔抗人C1q(最终浓度为20μg/mL[DAKO，目录号：F0254]；在GMB FACS缓冲液中以1:75稀释)于黑暗中一起孵育30分钟。将细胞用冰冷的GMB FACS缓冲液洗涤两次，重悬于20μL补充有2mM乙二胺四乙酸(EDTA；Sigma-Aldrich，目录号：03690)和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)生存力染料(1:5,000；BD Pharmingen，目录号：564907)的GMB FACS缓冲液中。在iQue Screener PLUS(Sartorius)或iQue3(Sartorius)上通过流式细胞术分析C1q与具生存力细胞(如通过DAPI排除鉴定)的结合。使用GraphPadPrism软件，使用非线性回归分析(具有可变斜率的S形剂量响应)分析结合曲线。
尽管观察到与膜结合IgG1-CD52-E430G的剂量依赖性C1q结合，但未观察到与膜结合IgG1-PD1或者与非结合对照抗体的C1q结合(图17)。
这些结果表明IgG1-PD1的功能惰性主链不结合C1q。
实施例13：通过SPR确定的IgG1-PD1与Fcγ受体的结合
通过SPR在体外评估IgG1-PD1与固定化的FcγR(FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa)的结合。对于FcγRIIa(H131和R131)和FcγRIIIa(V158和F158)包括两种多态变体。作为FcγR结合的阳性对照，包括具有野生型Fc区的IgG1-ctrl。
在第一个实验中，使用Biacore 8KSPR系统分析IgG1-PD1或IgG1-ctrl与固定化的人重组FcγR变体(FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa)的结合。在第二组实验中，使用相同的方法分析IgG1-PD1、纳武单抗(Bristol-Meyers Squibb，批号：ABP6534)、派姆单抗(Merck Sharp&Doh me，批号：U013442)、多塔利单抗(GlaxoSmithKline，批号：1822049)、西米普利单抗(Regeneron，批号：1F006A)、IgG1-ctrl或IgG4-ctrl的结合。
使用胺偶联和His捕获试剂盒(Cytiva，目录号：BR100050和目录号：29234602)，根据制造商的说明将Biacore系列S传感器芯片CM5(Cytiva，目录号：29104988)用抗组氨酸(His)抗体共价包被。将在HBS-EP+(Cytiva，目录号：BR100669)中稀释的FcγRIa、FcγRIIa(H131和R131)、FcγRIIb和FcγRIIIa(V158和F158)(SinoBiological，目录号分别为：10256-H08S-B、10374-H08H1、10374-H27H、10259-H27H、10389-H27H1和10389-H27H)以10μL/分钟的流速和60秒的接触时间捕获到抗His包被的传感器芯片的表面上，以导致约350至600共振单位(RU)的捕获水平。
在HBS-EP+缓冲液的三个初始循环之后，使用表24中所示的抗体范围注射测试抗体(IgG1-PD1、纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗、西米普利单抗、IgG1-ctrl或IgG4-ctrl)以产生结合曲线。在具有捕获的FcγR的表面(活性表面)上分析的每个样品也在不具有捕获的FcγR的平行流动池(参考表面)上进行分析，其用于背景校正。从其他传感图中减去含有HBS-EP+作为(模拟)分析物的第三个初始循环，以得到双重参考数据。
在每个循环结束时，使用pH 1.5的10mM甘氨酸-HCl(Cytiva，目录号：BR100354)使表面再生。使用Biacore Insight评价软件(Cytiva)生成传感图，并将四参数逻辑拟合应用于终点测量(结合平台期相对于捕获后的基线)。第一次实验(n＝1；定量的SPR测定)的数据在图18中示出；第二组实验(n＝3)的数据在图19中示出。
表24.与单独FcγR结合的测试条件
来自第一个实验的结果显示IgG1-ctrl与所有FcγR结合，而未观察到IgG1-PD1与FcγRIa、FcγRIIa(H131和R131)、FcγRIIb和FcγRIIIa(V158和F158)的结合(图18)。
来自第二组实验的结果确定了IgG1-PD1缺乏FcγR结合(图19)。IgG4-ctrl和测试的其他抗PD-1抗体(纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗和西米普利单抗；所有均为IgG4亚类)表现出与FcγRIa、FcγRIIa-H131、FcγRIIa-R131和FcγRIIb的明确结合，以及与FcγRIIIa-F158和FcγRIIIa-V158的极低至非常低的结合。
这些数据确定了IgG1-PD1的Fc结构域缺乏FcγR结合，并表明FcγR与纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗和西米普利单抗结合。总之，这些数据表明IgG1-PD1的Fc结构域不能诱导FcγR介导的效应子功能(ADCC，ADCP)。
实施例14：通过流式细胞术确定的IgG1-PD1与细胞表面表达的FcγRIa的结合
使用流式细胞术分析IgG1-PD1、纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗和西米普利单抗与人细胞表面表达的FcγRIa的结合。
FcγRIa在瞬时转染的CHO-S细胞上表达，并且使用FITC缀合的抗FcyRI抗体(BioLegend，目录号：305006；1:25)通过流式细胞术确定细胞表面表达。如实施例7中所述评估抗PD-1抗体与转染的CHO-S细胞的结合。简而言之，在GMB FACS缓冲液中制备IgG1-PD1、纳武单抗(Bristol-Meyers Squibb，批号：ABP6534)、派姆单抗(Merck Sharp&Dohme，批号：U013442)、多塔利单抗(GlaxoSmithKline，批号：1822049)、西米普利单抗(Regeneron，批号：1F006A)、IgG1-ctrl和IgG1-ctrl-FERR的抗体稀释液(最终浓度：1.69×10-4至10μg/mL，3倍稀释)。将细胞离心，去除上清液，并在4℃下将细胞(50μL中30,000个细胞)与50μL抗体稀释液一起孵育30分钟。将细胞用GMB FACS缓冲液洗涤两次，并在4℃下与50μL二抗(PE-缀合的山羊-抗人IgG F(ab')2；1:500)一起避光孵育30分钟。将细胞用GMBFACS缓冲液洗涤两次，并重悬于补充有2mM EDTA和DAPI生存力标志物(1:5,000)的GMBFACS缓冲液中。
在Intellicyt iQue PLUS Screener(Intellicyt公司)上使用FlowJo软件通过对PE阳性、DAPI阴性细胞设门，通过流式细胞术分析抗体与具生存力细胞的结合。在GraphPadPrism中使用非线性回归分析(四参数剂量响应曲线拟合)分析结合曲线。
在流式细胞术结合测定中，阳性对照抗体IgG1-ctrl(具有野生型Fc区)显示出与瞬时表达FcγRIa的细胞的结合，而未观察到针对阴性对照抗体IgG1-ctrl-FERR(具有包含FER惰性突变和另外的在本研究背景下功能不相关的K409R突变的Fc区)的结合(图20)。针对IgG1-PD1未观察到结合，而观察到针对派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗和多塔利单抗的浓度依赖性结合。
这些数据确定了IgG1-PD1的Fc结构域缺乏FcγRIa结合，并表明FcγRIa与纳武单抗、派姆单抗、多塔利单抗和西米普利单抗结合。总之，这些数据表明IgG1-PD1的Fc结构域不能诱导FcγRIa介导的效应子功能。
实施例15：IgG1-PD1与新生儿Fc受体的结合
新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor，FcRn)通过保护IgG免于降解从而实现IgG的长血浆半衰期。IgG在酸性(pH 6.0)内体环境中与FcRn结合，但在中性pH(pH 7.4)下与FcRn解离。抗体与FcRn的这种pH依赖性结合导致抗体与FcRn一起再循环，防止胞内抗体降解，并因此是该抗体的体内药动学指标。通过表面等离子体共振(SPR)在pH 6.0和pH 7.4下体外评估IgG1-PD1与固定化的FcRn的结合。
使用Biacore 8K SPR系统分析IgG1-PD1与固定化的人FcRn的结合。使用胺偶联和His捕获试剂盒(Cytiva，目录号：BR100050和目录号：29234602)根据制造商的说明将Biacore系列S传感器芯片CM5(Cytiva，目录号：29104988)用抗组氨酸(His)抗体共价包被。将在pH 7.4的PBS-P+缓冲液(Cytiva，目录号：28995084)中或者在pH调至6.0的PBS-P+缓冲液(通过添加盐酸[Sigma-Aldrich，目录号：07102])中稀释至5nM的包被浓度的FcRn(SinoBiological，目录号：CT071-H27H-B)以10μL/分钟的流速和60秒的接触时间捕获到抗His包被的传感器芯片的表面上。这导致捕获水平约为50RU。在pH 6.0或pH 7.4的PBS-P+缓冲液的三个初始循环之后，注射测试抗体(pH 6.0或pH 7.4的PBS-P+缓冲液中的6.25至100nM两倍稀释系列的IgG1-PD1、派姆单抗(MSD，批号T019263)或纳武单抗(Bristol-MyersSquibb，批号ABP6534))以产生结合曲线。在具有捕获的FcγR的表面(活性表面)上分析的每个样品也在不具有捕获的FcγR的平行流动池(参考表面)上进行分析，其用于背景校正。从其他传感图中减去含有HBS-EP+作为(模拟)分析物的第三个初始循环，以得到双重参考数据。在每个循环结束时，使用pH 1.5的10mM甘氨酸HCl(Cytiva，目录号：BR100354)使表面再生。使用Biacore Insight评价软件(Cytiva)中预定义的“Multi-cycle kinetics usingcapture”评价方法分析数据。数据基于具有技术重复的三个独立实验。
在pH 6.0时，IgG1-PD1结合FcRn的平均亲和力(KD)为50nM(表25)，这与具有野生型Fc区的IgG1-ctrl抗体相当(文献中报道了野生型IgG1分子的宽范围亲和力；在具有相同测定设置的先前内部实验中，通过12个数据点测量的IgG1-ctrl的平均KD为34nM)。派姆单抗和纳武单抗的亲和力约两倍低(KD分别为116nM和133nM)。在pH 7.4时未观察到FcRn结合(未显示)。总之，这些结果表明IgG1-PD1 Fc区中的FER惰性突变不影响FcRn结合，并表明IgG1-PD1在体内将保留典型的IgG药动学特性。
表25.通过SPR确定的对FcRn的亲和力。通过SPR分析IgG1-PD1、派姆单抗和纳武单抗与用人FcRn包被的传感器芯片的结合。平均亲和力和SD基于具有技术重复的三个独立测量。
缩写：KD＝平衡离解常数；ka＝缔合速率常数；kd＝解离速率常数或解离速率；SD＝标准偏差。
实施例16：在不存在靶标结合的情况下的IgG1-PD1的药动学分析
在小鼠中分析了IgG1-PD1的药动学特性。PD-1主要在活化的B和T细胞上表达，并且因此预计其表达在缺乏成熟B和T细胞的非荷瘤SCID小鼠中受到限制。此外，IgG1-PD1对瞬时过表达小鼠PD-1的细胞显示出显著降低的交叉反应性(实施例7)。因此，IgG1-PD1在非荷瘤SCID小鼠中的药动学(PK)特性有望反映在不存在靶标结合的情况下的IgG1-PD1的PK特性。
本研究中的小鼠饲养在中心实验室动物设施(Central Laboratory AnimalFacility，Utrecht，荷兰)中。所有小鼠都饲养在单独通风的笼中，随意提供食物和水。所有实验均符合从指令(2010/63/EU)翻译而来的荷兰动物保护法(Dutch animal protectionlaw)(WoD)，并获得了荷兰中心动物实验委员会(Dutch Central Commission for animalexperiments)和当地伦理委员会(local Ethical committee)的批准。向SCID小鼠(Hsd-Prkdcscid，Envigo)静脉内注射1或10mg/kg IgG1-PD1，每组使用3只小鼠。在抗体施用之后10分钟、4小时、1天、2天、8天、14天和21天从隐静脉或面颊静脉收集血液样品(40μL)。将血液收集至含有K2-乙二胺四乙酸的小瓶中，并储存在-65℃下，直至抗体浓度的确定。
通过进行总人IgG(hIgG)电化学发光免疫测定(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)确定特定的hIgG浓度。将Meso Scale Discovery(MSD)标准板(96孔MULTI-ARRAY板，目录号：L15XA-3)在2至8℃下用在PBS(Lonza，目录号：BE17-156Q)中稀释的小鼠抗hIgG捕获抗体(IgG2amm-1015-6A05)包被16至24小时。在将板用PBS-吐温(PBS-T；补充有0.05％(w/v)吐温-20[Sigma，目录号：P1379]的PBS)洗涤以去除未结合的抗体之后，在RT下将未被占据的表面封闭60±5分钟(补充有3％(w/v)Blocker-A[MSD，目录号：R93AA-1]的PBS-T)，随后用PBS-T洗涤。小鼠血浆样品最初在测定缓冲液(补充有1％(w/v)Blocker-A的PBS-T)中稀释50倍(2％小鼠血浆)。为了产生参考曲线，将IgG1-PD1(与用于注射的物质为相同批次)在校准稀释剂(测定缓冲液中的2％小鼠血浆[K2EDTA，合并的血浆，BIOIVT，目录号：MSE00PLK2PNN])中稀释(测量范围：0.156至20.0μg/mL；锚定点：0.0781μg/mL和40.0μg/mL)。为了适应样品中存在的预期广泛的抗体浓度，在样品稀释剂(测定缓冲液中的2％小鼠血浆)中将样品以1:10或1:50进行另外的稀释。将包被和封闭的板在RT下用50μL稀释的小鼠样品(参考曲线)和适当的质量控制样品(掺有IgG1-PD1的合并的小鼠血浆，覆盖参考曲线的范围)孵育90±5分钟。在用PBS-T洗涤之后，将板在RT下用SULFO-TAG缀合的小鼠抗hIgG检测抗体IgG2amm-1015-4A01孵育90±5分钟。在用PBS-T洗涤之后，通过添加读取缓冲液(MSD GOLD Read Buffer，目录号：R92TG-2)并使用MSD Sector S600板读取器测量在约620nm下的发光来使经固定化的抗体可视化。使用SoftMax Pro GxP软件v7.1进行分析数据的处理。不允许低于运行定量下限(LLOQ)或高于定量上限(ULOQ)的外推。
IgG1-PD1在不存在靶标结合的情况下的血浆清除率谱与通过基于人IgG1清除率的两室模型预测的野生型人IgG1抗体在SCID小鼠中的清除率谱(Bleeker et al.,2001,Blood.98(10):3136-42)相当(图21)。未记录临床观察结果并且且未观察到体重减轻。
总之，这些数据表明，在不存在靶标结合的情况下，IgG1-PD1的PK特性与正常人IgG抗体的PK特性相当。
实施例17：IgG1-PD1在人PD-1敲入小鼠中的抗肿瘤活性
IgG1-PD1仅显示出与瞬时过表达小鼠PD-1的细胞的有限结合(实施例7)。因此，为了在体内评估IgG1-PD1的抗肿瘤活性，使用经改造以在小鼠PD-1基因座中表达人PD-1胞外结构域(ECD)的C57BL/6小鼠(hPD-1敲入[KI]小鼠)。
所有动物实验均在Crown Bioscience Inc.进行并且在执行之前获得其机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的批准。根据如由实验动物护理评估和认证协会(Association for Assessment and Accreditationof Laboratory Animal Care，AALAC)的规定定义的良好动物规范饲养动物和处理动物。向7至9周龄的以C57BL/6为背景的雌性纯合人PD-1敲入小鼠(hPD-1KI小鼠；BeijingBiocytogenCo.,Ltd；C57BL/6-Pdcd1tm1(PDCD1)/Bcgen，库存号：110003)的右下腹皮下(SC)注射同基因MC38结肠癌细胞(1×106个细胞)。使用卡尺评价肿瘤生长(在随机化之后每周三次)，并按照以下从卡尺测量计算肿瘤体积(mm3)：肿瘤体积＝0.5×(长度×宽度2)，其中长度为最长的肿瘤尺寸，并且宽度为垂直于长度的最长肿瘤尺寸。当肿瘤达到约60mm3的平均体积时(记录为第0天)，基于肿瘤体积和体重对小鼠进行随机化(每组9只小鼠)。在开始处理时，向小鼠静脉内注射(IV；剂量体积为在PBS中10mL/kg)0.5、2或10mg/kg IgG1-PD1或派姆单抗(由Crown Bioscience Inc.从Merck获得；批号：T042260)，或者注射10mg/kg同型对照抗体IgG1-ctrl-FERR。随后的剂量经腹膜内(IP)施用。使用的给药方案为每周两个剂量，持续三周(2QW×3)。每天监测动物的发病率和死亡率，并常规监测其他临床观察结果。当个别小鼠的肿瘤体积超过1,500mm3或者当动物达到其他人道终点时结束实验。
为了比较各组之间的无进展存活，将曲线拟合应用于个体肿瘤生长图，以建立每只小鼠的肿瘤体积超过500mm3的进展天数。这些天数值绘制在Kaplan-Meier存活曲线中，并用于在个体曲线之间使用SPSS软件进行Mantel-Cox分析。在所有组仍然完整的最后一天(即直至研究中的第一例肿瘤相关死亡，即第11天)，使用非参数曼-惠特尼分析(Mann-Whitney analysis)(在GraphPad Prism中)比较各组之间肿瘤体积的差异。P值伴随中值(每组)一起呈现，包括中值差异的95％置信区间(Hodges Lehmann)。
小鼠没有出现疾病体征，但发现两只小鼠死亡(2mg/kg IgG1-PD1组中的一只和2mg/kg派姆单抗处理组中的一只)。尚未确定这些死亡的原因。
用IgG1-PD1和派姆单抗处理在所有测试剂量下均抑制肿瘤生长(图22A)。在第11天(即完成所有处理组的最后一天)，在所有测试剂量下，用IgG1-PD1或派姆单抗处理的小鼠中的肿瘤均显著小于用10mg/kg IgG1-ctrl-FERR处理的小鼠中的肿瘤(图22B)。另外，在10mg/kg下，用IgG1-PD1处理的小鼠中的肿瘤体积显著小于用等同剂量的派姆单抗处理的小鼠中的肿瘤体积(曼-惠特尼检验，P＝0.0188)。
与用10mg/kg IgG1-ctrl-FERR处理的小鼠相比，用IgG1-PD1或派姆单抗处理在所有测试剂量下均显著提高了无进展存活(PFS)(图22C)。与用派姆单抗处理的小鼠相比，在10mg/kg下，用IgG1-PD1处理的小鼠的无进展存活显著延长(中值PFS10mg/kg IgG1-PD1：20.56天，中值PFS 10mg/kg派姆单抗：13.94天；P值＝0.0021)。
总之，IgG1-PD1在携带MC38肿瘤的hPD-1KI小鼠中表现出强效的抗肿瘤活性。
实施例18：在同种异体MLR测定中DuoBody-CD40×4-1BB与抗PD-(L)1抗体组合对细胞因子分泌的作用
为了分析在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中DuoBody-CD40×4-1BB与阿特珠单抗、纳武单抗或派姆单抗的组合与单一药剂活性相比是否可导致细胞因子产生的增强，在存在以下的情况下将CD8+T细胞和人成熟树突细胞(mDC)的四个独特的同种异体对共培养：单独的DuoBody-CD40×4-1BB、单独的阿特珠单抗、单独的纳武单抗、单独的派姆单抗、或者DuoBody-CD40×4-1BB与阿特珠单抗、纳武单抗或派姆单抗中一者的组合。使用IFNγ特异性免疫测定和Luminex细胞因子组评估共培养物的上清液中的细胞因子分泌。
方法
来自健康供体的单核细胞和T细胞
CD14+单核细胞和纯化的CD8+T细胞从BioIVT获得。四个独特的同种异体供体对用于MLR测定。
单核细胞向未成熟树突细胞的分化
从健康供体中获得人CD14+单核细胞。为了使其分化成未成熟树突细胞(iDC)，将1至1.5×106个单核细胞/mL在37℃下于T25培养瓶中(Falcon，目录号：353108)中在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco，目录号：16140071)、100ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；BioLegend，目录号：766106)和300ng/mL白介素-4(IL-4；BioLegend，目录号：766206)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640完全培养基(ATCC改良配方；ThermoFisher，目录号：A1049101)中培养6天。在4天之后，将培养基更换为新鲜培养基与补充物。
iDC向mDC的分化
在开始MLR测定之前，通过收集非黏附细胞来收获iDC，并通过在37℃下将1至1.5×106个细胞/mL在补充有10％ FBS、100ng/mL GM-CSF、300ng/mL IL-4和5μg/mL脂多糖(LPS；ThermoFisher，目录号：00-4976-93)的RPMI 1640完全培养基中孵育24小时来使其分化成成熟DC(mDC)。
混合淋巴细胞反应(MLR)
在MLR测定开始之前一天，将从同种异体健康供体获得的纯化的CD8+T细胞解冻，以1×106个细胞/mL重悬于补充有10％ FBS和10ng/mL IL-2(BioLegend，目录号：589106)的RPMI 1640完全培养基中并在37℃下孵育，O/N。
第二天，收获LPS-成熟的树突细胞(mDC，参见iDC向mDC的成熟)和同种异体的纯化的CD8+T细胞，并分别以4×105个细胞/mL和4×106个细胞/mL将其重悬于AIM-V培养基(ThermoFisher，目录号：12055091)中。以1:10的DC:T细胞比例接种共培养物(对应于将20,000个mDC与200,000个同种异体的纯化的CD8+T细胞一起孵育)，并在存在以下的情况在37℃下于96孔圆底板(Falcon，目录号：353227)中在AIM-V培养基中培养5天：作为单一药剂的阿特珠单抗(1μg/mL；临床产品阿特珠单抗的非临床/研究级形式；Selleckchem，目录号：A2004)、纳武单抗(1μg/mL；临床产品纳武单抗的非临床/研究级形式；Selleckchem，目录号：A2002)、派姆单抗(1μg/mL；临床产品派姆单抗的非临床/研究级形式；Selleckchem，目录号：A2005)或DuoBody-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)、或者DuoBody-CD40×4-1BB与阿特珠单抗、纳武单抗或派姆单抗中一者的组合。包括用bsIgG1-CD40×ctrl(30μg/mL)、bsIgG1-ctrl×4-1BB(30μg/mL)或IgG1-ctrl-FEAL(30μg/mL)处理的共培养物作为对照。在5天之后，将板以500×g离心5分钟，并将上清液从每个孔小心地转移至新的96孔圆底板。
在Envision仪器上使用Alpha Lisa IFNγ试剂盒(Perkin Elmer，目录号：AL217)根据制造商的说明通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析从MLR测定收集的上清液的IFNγ水平。
在Luminex FLEXMAP 系统上使用定制的Milliplex趋化因子磁珠组(Millipore Sigma，目录号：HCYTOMAG-60K-08，批号：3730985)根据制造商的说明分析从MLR测定收集的上清液的白介素(IL)-10、IL-12p40、IL-15、IL-17a、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-23、IL-5、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和颗粒酶B。
表26：抗体
1基于抗HIV gp120抗体IgG1-b12的对照结合部分(Barbas et al.,J Mol Biol1993,230:812-823)。
结果&结论
在MLR测定中，用单独的DuoBody-CD40×4-1BB、阿特珠单抗、纳武单抗或派姆单抗处理增强了IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-2和IL-6的分泌。与单一药剂活性相比，≥0.1μg/mL的DuoBody-CD40×4-1BB与1μg/mL的阿特珠单抗、1μg/mL的纳武单抗或1μg/mL的派姆单抗的组合进一步增强了IFNγ、GM-CSF、TNFα、IL-2和IL-6的分泌(图23)。将DuoBody-CD40×4-1BB与阿特珠单抗、纳武单抗或派姆单抗组合使IFNγ、GM-CSF和IL-6的水平提高至相同程度。在将DuoBody-CD40×4-1BB与派姆单抗组合之后，TNFα和IL-2分泌最高。这些数据表明，通过靶向PD-1/PD-L1轴并与CD40和4-1BB共刺激组合可扩大免疫应答的强度。
实施例19：进行抗原特异性刺激测定以确定DuoBody-CD40×4-1BB与抗PD-(L)1抗体组合增强T细胞增殖和细胞因子分泌的能力
为了确定与单一药剂活性相比，DuoBody-CD40×4-1BB和抗PD-(L)1抗体对T细胞增殖和细胞因子产生的组合作用，使用过表达PD-1的人CD8+T细胞和表达同源抗原的未成熟树突细胞(iDC)的共培养物进行抗原特异性刺激测定。
方法
细胞的分离和单核细胞向iDC的分化
HLA-A*02+外周血单个核细胞(PBMC)从健康供体(Transfusionszentrale,University Hospital,Mainz,Germany)获得。通过磁激活细胞分选(MACS)技术使用抗CD14微珠(Miltenyi；目录号：130-050-201)根据制造商的说明从PBMC中分离单核细胞。将外周血淋巴细胞(PBL，CD14阴性级分)冷冻保存以用于T细胞分离。为了分化成iDC，将1×106个单核细胞/mL在RPMI 1640(Life Technologies GmbH，目录号：61870-010)中培养5天，所述RPMI 1640含有5％合并的人血清(One Lambda Inc，目录号：A25761)、1mM丙酮酸钠(Lifetechnologies GmbH，目录号：11360-039)、1×非必需氨基酸(Life Technologies GmbH，目录号：11140-035)、200ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；Miltenyi，目录号：130-093-868)和200ng/mL白介素-4(IL-4；Miltenyi，目录号：130-093-924)。在第3天，用含有补充物的新鲜培养基更换一半的培养基。通过收集非黏附细胞收获iDC，并通过在37℃下与含有2mM EDTA的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)一起孵育10分钟使黏附细胞脱离。在用DPBS洗涤之后，将iDC冷冻保存在含有10％ DMSO(AppliChem GmbH，目录号：A3672,0050)的FBS(Sigma-Aldrich，目录号：F7524)中，以用于未来用于抗原特异性T细胞测定。
iDC和CD8+T细胞的电穿孔和CFSE标记
在抗原特异性CD8+T细胞刺激测定开始之前一天，将来自同一供体的冷冻PBL和iDC解冻。通过MACS技术使用抗CD8微珠(Miltenyi，目录号：130-045-201)根据制造商的说明从PBL分离CD8+T细胞。在250μLX-Vivo15培养基(Lonza，目录号：BE02-060Q)中将约10×106至15×106个CD8+T细胞用各自10μg的编码特异性针对人密蛋白-6(CLDN6；HLA-A*02-限制性；在WO 2015150327 A1中描述)的鼠TCR的α链和β链的体外转录的(IVT)-RNA加10μg编码人PD-1(UniProt Q15116)的IVT-RNA进行电穿孔。将细胞转移至4-mm电穿孔比色皿(VWRInternational GmbH，目录号：732-0023)，并使用BTX 830电穿孔系统(BTX；500V，3毫秒脉冲)进行电穿孔。在电穿孔之后，立即将细胞转移至含有5％合并的人血清的新鲜IMDM GlutaMAX培养基(Life Technologies GmbH，目录号：319800-030)中，并在37℃、5％CO2下静置至少1小时。使用在PBS中的0.8μM羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE；LifeTechnologies GmbH，目录号：V12883)根据制造商的说明标记T细胞并将其在补充有5％合并的人血清的IMDM培养基中孵育过夜。
使用如上所述的电穿孔系统(300V，12毫秒脉冲)在250μL X-Vivo15培养基中将多至5×106个解冻的iDC用2μg编码全长人CLDN6(WO 2015/150327A1)的IVT-RNA进行电穿孔，并将其在补充有5％合并的人血清的IMDM培养基中孵育过夜。
第二天，收获细胞。通过流式细胞术确定iDC上CLDN6的细胞表面表达，以及T细胞上CLDN6-特异性TCR和PD-1的细胞表面表达。为此，将iDC用经荧光标记的CLDN6-特异性抗体(不可商购获得；内部生产)进行染色。将T细胞用brilliant violet(BV)421缀合的抗小鼠TCR-β链抗体(Becton Dickinson GmbH，目录号：562839)和别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗人PD-1抗体(Thermo Fisher Scientific，目录号：17-2799-42)进行染色。
抗原-特异性体外T细胞刺激测定
将经电穿孔的iDC与经电穿孔的、CFSE标记的T细胞以1:10的比例在96孔圆底板(VWR International GmbH，目录号：734-1797)中在含有5％合并的人血清(One LambdaInc.，目录号：A25761)的IMDM培养基(Life Technologies GmbH，目录号：31980030)中在存在以下的情况下孵育：单独或与抗PD-1抗体派姆单抗(Merck Sharp&DohmeGmbH，PZN 10749897)(0.8μg/mL)、纳武单抗(/>Bristol-Myers-Squib GmbH，PZN11024601)(1.6μg/mL)、或IgG1-PD1(0.8μg/mL)、抗PD-L1抗体阿特珠单抗(/>Roche Pharma AG，PZN 11306050)(0.4μg/mL)组合的DuoBody-CD40×4-1BB(0.0022μg/mL、0.0067μg/mL或0.2μg/mL)，或者阴性对照抗体IgG1-ctrl-FERR(0.8μg/mL)。在培养4天之后，将细胞用APC缀合的抗人CD8抗体进行染色。使用BD FACSCelestaTM流式细胞仪(BectonDickinson GmbH)通过对CD8+T细胞中CFSE稀释的流式细胞术分析评价T细胞增殖。
使用FlowJo软件版本10.7.1分析流式细胞术数据。使用FlowJo中的增殖建模工具评估CD8+T细胞的CFSE标记稀释，并使用积分公式计算扩增指数。
细胞因子浓度的确定
使用用于检测10种人细胞因子组(GM-CSF、IL-2、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、IFNγ、IFNγ可诱导蛋白[IP]-10[也称为C-X-C基序趋化因子配体10]、巨噬细胞趋化蛋白[MCP]1和TNFα；Meso Scale Discovery，目录号：K15067L-2)的定制U-Plex生物标志物组1(人)测定，按照制造商的方案通过多重电化学发光免疫测定来确定从4天之后的T细胞/iDC共培养物中收集的上清液中的细胞因子浓度。
表27：抗原特异性T细胞刺激测定中使用的抗体
1基于抗HIV gp120抗体IgG1-b12的对照结合部分(Barbas et al.,J Mol Biol1993,230:812-823)。
结果&结论
与DuoBody-CD40×4-1BB和非结合对照抗体IgG1-ctrl-FERR组合相比，以及与作为单一处理的抗PD-(L)1抗体相比，用DuoBody-CD40×4-1BB和抗PD-(L)1抗体的组合处理增强了CD8+T细胞增殖(图24)。与两种单一药剂处理相比，当在组合处理中使用高浓度的DuoBody-CD40×4-1BB(0.2μg/mL)时观察到增殖的提高。与单独的抗PD-(L)1抗体相比，抗PD-(L)1抗体与低(0.0022μg/mL)或中间(0.0067μg/mL)浓度的DuoBody-CD40×4-1BB的组合对增殖的影响很小或没有影响。
与DuoBody-CD40×4-1BB与IgG1-ctrl-FERR组合相比，以及与作为单一处理的抗PD-(L)1抗体相比，用DuoBody-CD40×4-1BB和抗PD-(L)1抗体的组合处理增强了促炎细胞因子GM-CSF、IFNγ、IL-13和TNFα的分泌(图25)。与两种单一药剂处理相比，当组合处理中使用高浓度的DuoBody-CD40×4-1BB(0.2μg/mL)时观察到细胞因子分泌提高。与单独的抗PD-(L)1抗体相比，抗PD-(L)1抗体与低(0.0022μg/mL)或中间(0.0067μg/mL)浓度的DuoBody-CD40×4-1BB的组合对细胞因子分泌的影响很小或影响作用。与单一药剂处理相比，测试的其他细胞因子的分泌没有持续增强或没有增强。
实施例20：进行多克隆刺激测定以确定DuoBody-CD40×4-1BB与抗PD-(L)1抗体组合增强T细胞增殖的能力
为了确定与单一药剂活性相比，DuoBody-CD40×4-1BB和抗PD-(L)1抗体对T细胞增殖的组合作用，使用用抗CD3抗体刺激的PBMC培养物进行多克隆刺激测定。
方法
多克隆体外T细胞刺激测定
从健康供体(Transfusionszentrale，University Hospital，Mainz，Germany)获得PBMC。使用在PBS中的2.5μM CellTraceTM Violet(Thermo Fisher Scientific，目录号：C34557)根据制造商的说明标记PBMC。
在存在以下的情况下在96孔圆底板(VWR International GmbH，目录号：734-1797)中在含有5％合并的人血清(One Lambda Inc.，目录号：A25761)的IMDM培养基(LifeTechnologies GmbH，目录号：31980030)中将PBMC与0.09μg/mL的抗CD3抗体(克隆UCHT1，R&D systems，目录号：MAB100-500)一起培养：单独或与抗PD-1抗体派姆单抗(Merck Sharp&Dohme GmbH，PZN 10749897)或纳武单抗(/>Bristol-Myers-SquibGmbH，PZN 11024601)，或抗PD-L1抗体阿特珠单抗(/>Roche Pharma AG，PZN11306050)(全部以0.0、0.5和5μg/mL使用)组合的DuoBody-CD40×4-1BB(0.2μg/mL)。包括非结合抗体IgG1-ctrl-FEAL(0.2μg/mL)作为阴性对照。在培养4天之后，用APC缀合的抗人CD8(Becton Dickinson GmbH，目录号：640584)和PE缀合的抗人CD4(TONBO Biosciences，目录号：50-0049)抗体对细胞进行染色。使用BD FACSCelestaTM流式细胞仪(BectonDickinson GmbH)通过对CD8+和CD4+T细胞中的CellTraceTM Violet稀释的流式细胞术分析评价T细胞增殖。
表28：在多克隆刺激测定中使用的抗体
1基于抗HIV gp120抗体IgG1-b12的对照结合部分(Barbas et al.,J Mol Biol1993,230:812-823)。
结果
与DuoBody-CD40×4-1BB相比以及与作为单一处理的抗PD-(L)1抗体相比，用DuoBody-CD40×4-1BB和抗PD-(L)1抗体的组合处理增强了CD8+和CD4+T细胞增殖(图26)。在抗PD-(L)1抗体的所有测试浓度下均观察到单一药剂活性的增强。
实施例21：在LPS-成熟的树突细胞和体外耗竭T细胞的同种异体MLR测定中DuoBody-CD40×4-1BB与派姆单抗组合对细胞因子分泌的作用
为了分析在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中DuoBody-CD40×4-1BB与派姆单抗的组合是否可逆转T细胞耗竭，在存在以下的情况下将体外耗竭T细胞(Tex)和人成熟树突细胞(mDC)的两个独特的同种异体对共培养：单独的DuoBody-CD40×4-1BB、单独的派姆单抗、或两种抗体的组合。通过流式细胞术确定Tex上抑制性受体的表达，并评估共培养物上清液中干扰素(IFN)γ和白介素(IL)-2的分泌。
方法
来自健康供体的单核细胞和T细胞
CD14+单核细胞和纯化的CD3+T细胞从BioIVT获得。两个独特的同种异体供体对用于MLR测定。
单核细胞向未成熟树突细胞的分化
从健康供体中获得人CD14+单核细胞。为了使其分化成未成熟树突细胞(iDC)，将1至1.5×106个单核细胞/mL在37℃下于T25培养瓶(Falcon，目录号：353108)中在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco，目录号：16140071)、100ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；BioLegend，目录号：766106)和300ng/mLIL-4(BioLegend，目录号：766206)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640完全培养基(ATCC改良配方；ThermoFisher，目录号：A1049101)中培养6天。在4天之后，将培养基更换为具有补充物的新鲜培养基。
iDC向mDC的分化
在开始MLR测定之前，通过收集非黏附细胞来收获iDC，并通过在37℃下将1至1.5×106个细胞/mL在补充有10％ FBS、100ng/mL GM-CSF、300ng/mL IL-4和5μg/mL脂多糖(LPS；ThermoFisher，目录号：00-4976-93)的RPMI 1640完全培养基中孵育24小时来使其分化成mDC。
T细胞的耗竭
将从健康供体中获得的纯化的CD3+T细胞解冻并以1×106个细胞/mL重悬于补充有5％ FBS和10ng/mLIL-2(BioLegend，目录号：589106)的AIM-V培养基(ThermoFisher，目录号：12055091)中。为诱导T细胞具有耗竭样表型，将细胞在37℃和5％ CO2下用DynabeadsTMHuman TActivator CD3/CD28(Gibco，目录号：11161D)以1:1的珠:细胞比例刺激两轮，48小时。在两轮刺激之后，将耗竭的CD3+T细胞(Tex)静置24小时。
作为非刺激对照，在MLR测定开始之前一天将从健康供体中获得的纯化的CD3+T细胞解冻，以1×106个细胞/mL重悬于补充有10％ FBS和10ng/mL IL-2的RPMI 1640完全培养基中，并在37℃下孵育，O/N。在MLR测定之前，收集未经刺激的T细胞和Tex的等分试样用于进行流式细胞术。
流式细胞术
为了对Tex上的抑制性受体进行流式细胞术分析，以400×g持续5分钟使细胞沉淀，将细胞在磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤，再次沉淀，重悬于1mL补充有LIVE/DEADTM可固定近红外死细胞染色剂(Fixable Near-IR Dead Cell Stain，ThermoFisher Scientific，目录号：L10119，以1:500稀释)的PBS中，并在4℃下在黑暗中孵育20分钟。接下来，洗涤细胞，使其沉淀，将其在含有5％人血清(Sigma，目录号：H4522)的FACS缓冲液(Dulbecco磷酸缓冲盐水[DPBS，Gibco，目录号：14190136]，补充有0.5％牛血清白蛋白[BSA，Sigma，目录号：A9576]和2mM乙二胺四乙酸[EDTA，Invitrogen，目录号：15575-038])中重悬至8×106个细胞/mL，并在4℃下孵育15分钟。然后，将含有200,000个细胞的25μL转移至新的96孔板，并在RT下在黑暗中孵育20分钟，所述新的96孔板含有在补充有Brilliant Stain Buffer Plus(BD Horizon，目录号：566385)的FACS缓冲液中的具有经PE标记的抗人LAG3(Biolegend，目录号：369306，以1:60稀释)的150μL染色混合物。使细胞沉淀，使用FACS缓冲液洗涤，将其重悬于100μL固定缓冲液(Biolegend，目录号：420801)中，并在4℃下在黑暗中孵育15分钟。使细胞再次沉淀，将其洗涤并重悬于100μL FACS缓冲液中。在Aurora流式细胞仪(Cytek Biosciences)上分析样品。
MLR测定
收获mDC(参见iDC向mDC的成熟)并以4×105个细胞/mL重悬于AIM-V培养基中。收集Tex和未经刺激的CD3+T细胞(参见T细胞的耗竭)，并以4×106个细胞/mL重悬于AIM-V培养基中。将mDC和Tex的共培养物以1:4或1:10的DC:T细胞比例进行接种(相当于将20,000个mDC与80,000或200,000个Tex一起孵育)，并在存在以下的情况下在37℃下在96孔圆底板(Falcon，目录号：353227)中在AIM-V培养基中培养5天：作为单一药剂的派姆单抗(1μg/mL；临床产品派姆单抗的非临床/研究级形式；Selleckchem，目录号：A2005)或DuoBody-CD40×4-1BB(0.001至30μg/mL)，或者两种药剂的组合。包括用bsIgG1-CD40×ctrl(30μg/mL)、bsIgG1-ctrl×4-1BB(30μg/mL)或IgG1-ctrl-FEAL(30μg/mL)处理的共培养物作为对照。并行地，在具有和不具有1μg/mL派姆单抗的情况下，培养mDC和未经刺激的CD3+T细胞(DC:T细胞比例为1:10，对应于将20,000个mDC与200,000个T细胞一起孵育)的共培养物。在5天之后，将板以500×g离心5分钟，并将上清液从每个孔小心地转移至新的96孔圆底板。
在Envision仪器上使用AlphaLISAIFNγ试剂盒(Perkin Elmer，目录号：AL217)根据制造商的说明通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析所收集的上清液的IFNγ水平。在MesoSector S 600(Meso Scale Discovery[MSD]，目录号：R31QQ-3)上使用V-Plex促炎组(Proinflammatory Panel)1人试剂盒根据制造商的说明分析所收集的上清液的IL-2。
表29：抗体
1基于抗HIV gp120抗体IgG1-b12的对照结合部分(Barbas et al.,J Mol Biol1993,230:812-823)。
结果&结论
如由在mDC和Tex的MLR测定中与未经刺激的CD3+T细胞相比IFNγ和IL-2分泌降低所表明的，在用CD3/CD28珠进行两轮刺激之后，T细胞表达抑制性受体LAG3，并且变得对双重的抗CD3和抗CD28刺激具有低响应性(图27)。用作为单一药剂的派姆单抗或DuoBody-CD40×4-1BB进行处理分别地部分挽救了IFNγ或IL-2的分泌。在mDC:Tex MLR测定中，与单一药剂活性相比，≥0.1μg/mL的DuoBody-CD40×4-1BB与1μg/mL派姆单抗的组合进一步增强了IFNγ的分泌(图28)。这些数据表明，通过靶向PD-1/PD-L1轴并与CD40和4-1BB共刺激组合，可部分逆转耗竭T细胞的细胞因子分泌的损失。

Claims (84)

1.结合剂，其用于在对象中降低或阻止肿瘤进展或者治疗癌症的方法，所述方法包括在施用检查点抑制剂之前、同时或之后向所述对象施用所述结合剂，其中所述结合剂包含与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区。
2.权利要求1所述应用的结合剂，其中CD40是人CD40，特别是包含SEQ ID NO:36中所示序列的人CD40，和/或CD137是人CD137，特别是包含SEQ ID NO:38中所示序列的人CD137。
3.权利要求1或2所述应用的结合剂，其中所述检查点抑制剂是选自以下中的至少一者：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIM-3抑制剂、KIR抑制剂、LAG-3抑制剂、TIGIT抑制剂、VISTA抑制剂和GARP抑制剂。
4.权利要求1至3中任一项所述应用的结合剂，其中所述检查点抑制剂是抗体，例如PD-1阻断抗体，特别是派姆单抗。
5.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂和所述检查点抑制剂中的一者或二者全身性施用，优选静脉内施用。
6.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中：
a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7或9的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:8或10的CDR1、CDR2和CDR3序列；
并且
b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:17或19的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:18或20的CDR1、CDR2和CDR3序列。
7.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中：
a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含分别在SEQ ID NO:1、2和3中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含分别在SEQ ID NO:4、5和6中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；
并且
b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含分别在SEQ ID NO:11、12和13中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含分别在SEQ ID NO:14、15和16中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。
8.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中：
a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:7或9具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:8或10具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
b)所述第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:17或19具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或25 100％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:18或20具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
9.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中：
a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7或9中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:8或10中所示的氨基酸序列；并且
b)所述第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:17或19中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:18或20中所示的氨基酸序列。
10.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中：
a)所述第一结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列；
并且
b)所述第二结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。
11.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂是多特异性抗体，例如双特异性抗体。
12.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂是全长抗体或抗体片段的形式。
13.权利要求6至12中任一项所述应用的结合剂，其中每个可变区包含三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和四个框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)。
14.权利要求13所述应用的结合剂，其中所述互补决定区和所述框架区从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
15.权利要求6至14中任一项所述应用的结合剂，其包含：
i)含有以下、由以下组成、或基本上由以下组成的多肽：所述第一重链可变区(VH)和第一重链恒定区(CH)，以及
ii)含有以下、由以下组成、或基本上由以下组成的多肽：所述第二重链可变区(VH)和第二重链恒定区(CH)。
16.权利要求6至15中任一项所述应用的结合剂，其包含：
i)含有所述第一轻链可变区(VL)并且还含有第一轻链恒定区(CL)的多肽，以及
ii)含有所述第二轻链可变区(VL)并且还含有第二轻链恒定区(CL)的多肽。
17.权利要求6至16中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂是包含第一结合臂和第二结合臂的抗体，其中：
所述第一结合臂包含：
i)含有所述第一重链可变区(VH)和第一重链恒定区(CH)的多肽，以及
ii)含有所述第一轻链可变区(VL)和第一轻链恒定区(CL)的多肽；
并且所述第二结合臂包含：
iii)含有所述第二重链可变区(VH)和第二重链恒定区(CH)的多肽，以及
iv)含有所述第二轻链可变区(VL)和第二轻链恒定区(CL)的多肽。
18.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其包含：
i)含有所述能够与CD40结合的抗原结合区的第一重链和第一轻链，以及
ii)含有所述能够与CD137结合的抗原结合区的第二重链和第二轻链。
19.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂包含：
i)含有所述能够与CD40结合的抗原结合区的第一重链和第一轻链，所述第一重链包含第一重链恒定区，并且所述第一轻链包含第一轻链恒定区；以及
ii)含有所述能够与CD137结合的抗原结合区的第二重链和第二轻链，所述第二重链包含第二重链恒定区，并且所述第二轻链包含第二轻链恒定区。
20.权利要求15至19中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区(CH)各自包含恒定重链1(CH1)区、铰链区、恒定重链2(CH2)区和恒定重链3(CH3)区中的一者或更多者，优选至少包含铰链区、CH2区和CH3区。
21.权利要求15至20中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区(CH)各自包含CH3区，并且其中这两个CH3区包含非对称突变。
22.权利要求15至21中任一项所述应用的结合剂，其中在所述第一重链恒定区(CH)中，与选自根据EU编号的人IgG1重链中T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置相对应的位置处的至少一个氨基酸已被替换，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，与选自根据EU编号的人IgG1重链中T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置相对应的位置处的至少一个氨基酸已被替换，并且其中所述第一重链和所述第二重链不在相同的位置发生替换。
23.权利要求22所述应用的结合剂，其中(i)在所述第一重链恒定区(CH)中，与根据EU编号的人IgG1重链中F405相对应的位置处的氨基酸是L，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，与根据EU编号的人IgG1重链中K409相对应的位置处的氨基酸是R，或者(ii)在所述第一重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中K409相对应的位置处的氨基酸是R，并且在所述第二重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中F405相对应的位置处的氨基酸是L。
24.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中与包含相同的第一和第二抗原结合区以及含有人IgG1铰链区、CH2区和CH3区的两个重链恒定区(CH)的另一抗体相比，所述结合剂诱导Fc介导的效应物功能的程度较低。
25.权利要求24所述应用的结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区(CH)被修饰，使得与除了包含未经修饰的第一和第二重链恒定区(CH)之外都相同的抗体相比，所述抗体诱导Fc介导的效应物功能的程度较低。
26.权利要求25所述应用的结合剂，其中所述未经修饰的第一和第二重链恒定区(CH)各自包含SEQ ID NO:21或29中所示的氨基酸序列。
27.权利要求25或26所述应用的结合剂，其中所述Fc介导的效应物功能通过与Fcγ受体的结合、与C1q的结合、或对Fe介导的Fcγ受体交联的诱导来测量。
28.权利要求27所述应用的结合剂，其中所述Fc介导的效应物功能通过与C1q的结合来测量。
29.权利要求24至28中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区已被修饰，使得与野生型抗体相比，C1q与所述抗体的结合降低，优选降低至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中C1q结合优选通过ELISA确定。
30.权利要求15至29中任一项所述应用的结合剂，其中在所述第一和第二重链恒定区(CH)中的至少一个中，与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235、D265、N297和P331相对应的位置处的一个或更多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。
31.权利要求30所述应用的结合剂，其中在所述第一和第二重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235相对应的位置分别是F和E。
32.权利要求30或31中所述应用的结合剂，其中在所述第一和第二重链恒定区(HC)中，与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265相对应的位置分别是F、E和A。
33.权利要求30至32中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区二者中与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235相对应的位置分别是F和E，并且其中(i)所述第一重链恒定区中与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置是L，并且所述第二重链中与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置是R，或者(ii)所述第一重链恒定区中与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置是R，并且所述第二重链中与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置是L。
34.权利要求30至33中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区二者中与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265相对应的位置分别是F、E和A，并且其中(i)所述第一重链恒定区中与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置是L，并且所述第二重链恒定区中与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置是R，或者(ii)所述第一重链中与根据EU编号的人IgG1重链中的K409相对应的位置是R，并且所述第二重链中与根据EU编号的人IgG1重链中的F405相对应的位置是L。
35.权利要求15至34中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和/或第二重链的恒定区包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:21或29中所示序列[IgG1-FC]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多10个替换，例如至多9个替换、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
36.权利要求15至34中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一或第二重链的恒定区，例如所述第二重链的恒定区，包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:22或30中所示序列[IgG1-F405L]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多9个替换，例如至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
37.权利要求15至34中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一或第二重链的恒定区，例如所述第一重链的恒定区，包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:23或31中所示序列[IgG1-F409R]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多10个替换，例如至多9个替换、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个替换、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
38.权利要求15至34中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和/或第二重链的恒定区包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:24或32中所示序列[IgG1-Fc_FEA]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多7个替换，例如至多6个替换、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
39.权利要求15至38中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和/或第二重链的恒定区，例如所述第二重链的恒定区，包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:25或33中所示序列[IgG1-Fc_FEAL]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多6个替换，例如至多5个替换、至多4个替换、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
40.权利要求15至39中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一和/或第二重链的恒定区，例如所述第一重链的恒定区，包含选自以下的氨基酸序列、或者基本上由选自以下的氨基酸序列组成、或者由选自以下的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:26或34中所示序列[IgG1-Fc_FEAR]；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多6个替换，例如至多5个替换、至多4个、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
41.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂包含kappa(κ)轻链恒定区。
42.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂包含lambda(λ)轻链恒定区。
43.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区或lambda(λ)轻链恒定区。
44.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述第二轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区或kappa(κ)轻链恒定区。
45.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述第一轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区并且所述第二轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区，或者所述第一轻链恒定区是lambda(λ)轻链恒定区并且所述第二轻链恒定区是kappa(κ)轻链恒定区。
46.权利要求41至45中任一项所述应用的结合剂，其中kappa(κ)轻链包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:27中所示序列；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多10个替换，例如至多9个替换、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个替换、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
47.权利要求42至46中任一项所述应用的结合剂，其中lambda(λ)轻链包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:28中所示序列；
b)a)中序列的子序列，例如其中从a)中所限定序列的N端或C端开始，已缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的子序列；以及
c)与a)或b)中所限定氨基酸序列相比，具有至多10个替换，例如至多9个替换、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个替换、至多3个、至多2个替换、或至多1个替换的序列。
48.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂具有选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种型。
49.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂是全长IgG1抗体。
50.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂是IgG1m(f)同种异型的抗体。
51.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述对象是人对象。
52.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是实体瘤或癌症。
53.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症选自黑素瘤、卵巢癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、结直肠癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、尿路上皮癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、胸腺瘤和胸腺癌、脑癌、胶质瘤、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、其他皮肤癌、肉瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、子宫内膜癌、前列腺癌、阴茎癌、宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、梅克尔细胞癌和间皮瘤。
54.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症选自黑素瘤、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和头颈癌。
55.权利要求53或54所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是黑素瘤，例如皮肤黑素瘤或肢端黑素瘤。
56.权利要求55所述应用的结合剂，其中所述黑素瘤是不可切除的黑素瘤，特别是不可切除的III期或IV期黑素瘤。
57.权利要求55或56所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过使用检查点抑制剂的治疗。
58.权利要求55至57中任一项所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过针对不可切除的黑素瘤或转移性黑素瘤的全身性抗癌治疗。
59.权利要求53或54所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)，例如鳞状NSCLC或非鳞状NSCLC。
60.权利要求59所述应用的结合剂，其中所述肺癌，特别是NSCLC，不具有表皮生长因子(EGFR)致敏突变和/或间变性淋巴瘤(ALK)易位/ROS1重排。
61.权利要求59或60所述应用的结合剂，其中所述肺癌，特别是NSCLC，包含癌细胞，并且PD-L1在≥1％的所述癌细胞中表达。
62.权利要求59至61中任一项所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过使用检查点抑制剂的治疗。
63.权利要求53或54所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是头颈癌，特别是头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。
64.权利要求63所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过使用检查点抑制剂的治疗。
65.权利要求53或54所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是胰腺癌，特别是胰腺导管腺癌(PDAC)。
66.权利要求65所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过通过放射治疗、手术、化学治疗或研究性治疗对转移性疾病进行的治疗。
67.权利要求65或66所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过使用检查点抑制剂的治疗。
68.权利要求53或54所述应用的结合剂，其中所述肿瘤或癌症是结直肠癌。
69.权利要求68所述应用的结合剂，其中所述对象先前没有接受过使用检查点抑制剂的治疗。
70.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂和所述检查点抑制剂在至少一个治疗周期中施用，每个治疗周期是三周(21天)。
71.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中每三周一次(1Q3W)施用一剂所述结合剂和一剂所述检查点抑制剂。
72.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中在每个治疗周期的第1天施用一剂所述结合剂和一剂所述检查点抑制剂。
73.前述权利要求中任一项所述应用的结合剂，其中所述方法还包括向所述对象施用一种或更多种另外的治疗剂。
74.权利要求73所述应用的结合剂，其中所述一种或更多种另外的治疗剂包含一种或更多种化学治疗剂，例如基于铂的化合物(例如顺铂，奥沙利铂和卡铂)、基于紫杉烷的化合物(例如紫衫醇和nab-紫杉醇)、核苷类似物(例如5-氟尿嘧啶和吉西他滨)及其组合(例如顺铂/卡铂+5-氟尿嘧啶或nab-紫杉醇+吉西他滨)。
75.权利要求73或74所述应用的结合剂，其中所述一种或更多种另外的治疗剂在至少一个治疗周期中施用，每个治疗周期是三周(21天)。
76.权利要求73至75中任一项所述应用的结合剂，其中至少每三周一次(1Q3W)施用一剂所述一种或更多种另外的治疗剂，持续至少第一治疗周期，例如每三周两次(2Q3W)施用一剂所述一种或更多种另外的治疗剂，持续至少第一治疗周期。
77.权利要求73至76中任一项所述应用的结合剂，其中至少在至少第一治疗周期的第1天，例如在至少第一治疗周期的第1天和第8天，施用一剂所述一种或更多种另外的治疗剂。
78.药盒，其包含(i)含有与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区的结合剂，(ii)检查点抑制剂，以及任选的(iii)一种或更多种另外的治疗剂。
79.根据权利要求78所述的药盒，其中所述结合剂和/或所述检查点抑制剂和/或所述一种或更多种另外的治疗剂根据权利要求1至50和74中任一项中所限定。
80.根据权利要求78或79所述的药盒，其中所述结合剂、所述检查点抑制剂、以及如果存在的话所述一种或更多种另外的治疗剂，用于全身性施用，特别是用于注射或输注，例如静脉内注射或输注。
81.根据权利要求78至80中任一项所述的药盒，其用于在对象中降低或阻止肿瘤进展或者治疗癌症的方法。
82.根据权利要求81所述应用的药盒，其中所述肿瘤或癌症和/或所述对象和/或所述方法根据权利要求51至77中任一项中所限定。
83.用于在对象中降低或阻止肿瘤进展或者治疗癌症的方法，所述方法包括在施用检查点抑制剂之前、同时或之后向所述对象施用所述结合剂，其中所述结合剂包含与CD40结合的第一结合区和与CD137结合的第二结合区。
84.权利要求83所述的方法，其中所述肿瘤或癌症和/或所述对象和/或所述方法和/或所述结合剂和/或所述检查点抑制剂根据权利要求1至77中任一项中所限定。
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