WO2024150828A1 - 遺伝子導入方法 - Google Patents

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WO2024150828A1
WO2024150828A1 PCT/JP2024/000684 JP2024000684W WO2024150828A1 WO 2024150828 A1 WO2024150828 A1 WO 2024150828A1 JP 2024000684 W JP2024000684 W JP 2024000684W WO 2024150828 A1 WO2024150828 A1 WO 2024150828A1
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WO
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cells
vector
gene
target
sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2024/000684
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English (en)
French (fr)
Inventor
仁志 井上
起里 朴
星 釜我
貴也 大下
Original Assignee
積水化学工業株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to a gene transfer method.
  • This application claims priority to Japanese Patent Application No. 2023-002988, filed in Japan on January 12, 2023, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Chemical methods involve the use of transfection agents such as cationic polymers, cationic lipids, or calcium phosphate to introduce genes into target cells through endocytosis.
  • Physical methods involve the direct introduction of genes into target cells through physical manipulations such as microinjection, sonoporation, laser irradiation, or electroporation.
  • Biological methods involve the use of viral vectors such as retroviruses, lentiviruses, adeno-associated viruses (AAV), or adenoviruses to transfer nucleic acids within viral particles into target cells using the infectious ability of the virus.
  • retroviruses such as retroviruses, lentiviruses, adeno-associated viruses (AAV), or adenoviruses to transfer nucleic acids within viral particles into target cells using the infectious ability of the virus.
  • AAV adeno-associated viruses
  • the transposon method is a method for introducing a target gene into cells without using a virus.
  • Representative examples of the transposon method include the piggyBac transposon method and the Sleeping Beauty transposon method.
  • Non-Patent Document 1 describes that the piggyBac transposon method is useful for long-term expression of a target gene.
  • a target gene expression vector transposon vector
  • a piggyBac transposase vector that expresses a gene transposase.
  • the incorporated transposase vector expresses piggyBac transposase in the host cell, and specific sequences at both ends of the target gene expression vector are excised.
  • the excised sequences are incorporated into the TTAA sequence (base sequence) in the genome of the host cell, and the target gene is introduced into the cell.
  • the integration of the target gene into the genome of the host cell realizes long-term expression of the target gene in the host cell.
  • Non-Patent Document 2 reports the initial results of a phase I/II clinical trial using donor-derived CD19 CAR T cells differentiated into cytokine-induced killer (CIK) cells produced with a Sleeping Beauty (SB) transposon in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) that had relapsed after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.
  • the Sleeping Beauty transposon method is a method for introducing a target gene using a jumping DNA fragment called "Sleeping Beauty,” and can efficiently incorporate designed foreign DNA into the genome of mammalian cells.
  • the piggyBac method is an example of the transposon method.
  • the transposon method has a low efficiency of introducing the target gene.
  • electroporation By combining the transposon method with electroporation, it is possible to ensure long-term expression of the target gene.
  • the objective of the present invention is to provide a gene transfer method that is excellent in the transfer efficiency of a target gene into a target cell and in the survival rate of the target cell into which the target gene has been transferred, and that can ensure long-term expression of the target gene.
  • a method for gene transfer comprising the steps of: contacting a first vector with a target cell; introducing the first vector into the target cell; contacting a second vector with the target cell; introducing the second vector into the target cell; and irradiating the target cell with plasma.
  • the gene transfer method according to [1] wherein the step of irradiating the target cells with plasma is carried out before the step of introducing the first vector into the target cells.
  • the second vector is a vector incorporating a sequence of an enzyme that transfers a target sequence of the first vector to a genome.
  • the first vector is a modified transposon vector into which a nucleic acid fragment of the following item (1) or (2) has been inserted: (1) A sequence in which a recombination reaction occurs that is located between the 5' terminal inverted repeat (TIR) sequence and the 3' terminal inverted repeat (TIR) sequence of a transposon gene.
  • the present invention includes the following embodiments.
  • a method for producing a gene for a cell line comprising: an introduction step of contacting a target cell with a liquid containing a first vector that induces long-term expression of a gene of interest; and an activation step of contacting a target cell with a liquid containing a second vector that prolongs the expression of the first vector in the target cell, The activation step is performed either before or after the introduction step, or both.
  • the target cells are irradiated with plasma.
  • Gene transfer methods [14] The gene transfer method according to [13], wherein the second vector is a vector incorporating a sequence of an enzyme that transfers a target sequence of the first vector to a genome.
  • the target cells are at least one type selected from the group consisting of blood-derived cells, adherent cells, and iPS cells.
  • the blood-derived cells include T cells.
  • adherent cells include HEK293F cells, mesenchymal stem cells, and adipose-derived stem cells.
  • the present invention provides a gene transfer method that is excellent in the efficiency of transferring a target gene into a target cell and in the survival rate of the target cell into which the target gene has been transferred, while also ensuring long-term expression of the target gene.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of a gene transfer device that can be used in the gene transfer method of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the irradiating body 14 of FIG. 1.
  • 1 is a graph showing the measurement results of Experimental Examples 1 to 6 using a flow cytometer.
  • 1 is a graph showing the results of measuring the cell numbers after gene transfer treatment using a flow cytometer in Experimental Examples 1 to 6.
  • 1 is a graph showing the results of measuring the number of GFP cells after gene transfer treatment using a flow cytometer in Experimental Examples 1 to 6.
  • 1 is a graph showing the percentage (%) of GFP cells after gene transfer treatment in Experimental Examples 1 to 6. 1 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 2.
  • 1 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 2.
  • 1 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 2.
  • 1 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 2.
  • 1 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 4.
  • 1 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 4.
  • 1 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 4.
  • 1 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 5.
  • 1 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 5.
  • 1 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 5.
  • 1 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 5.
  • 13 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 6.
  • 13 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 6.
  • 13 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 6.
  • 13 shows a microscopic image of target cells after gene transfer in Experimental Example 6.
  • 1 is a graph showing the results of measuring the number of viable cells using a flow cytometer in Experimental Examples 7 to 12.
  • 1 is a graph showing the results of measurement of the number of cells showing positive GFP fluorescence using a flow cytometer in Experimental Examples 7 to 12.
  • 1 is a graph showing the results of measuring the number of viable cells using a flow cytometer in Experimental Examples 13 to 16.
  • 1 is a graph showing the results of measurement of the number of cells showing positive GFP fluorescence using a flow cytometer in Experimental Examples 13 to 16.
  • 1 is a graph showing the GFP-positive cell rate obtained from the measurement results using a flow cytometer in Experimental Examples 13 to 16.
  • 1 is a graph showing the transfection efficiency obtained from the measurement results using a flow cytometer in Experimental Examples 17 to 19.
  • 13 is an image of the electrophoresis results of PCR products in Experimental Example 20.
  • 1 is a graph showing the measurement results of Experimental Examples 21 and 22 using a flow cytometer.
  • the " ⁇ " symbol indicating a range of values means that the values before and after it are included as the lower and upper limits.
  • the gene transfer method of the present invention includes the steps of contacting a first vector with a target cell, introducing the first vector into the target cell, contacting a second vector with the target cell, introducing the second vector into the target cell, and irradiating the target cell with plasma.
  • the gene transfer method of the present invention includes an introduction step and an activation step.
  • the introduction step is a step of contacting a first vector with target cells, and may be a step of contacting a liquid containing a first vector that induces long-term expression of a gene of interest with the target cells.
  • the target gene is not particularly limited as long as it is a gene to be expressed in a target cell
  • examples of the target gene include cDNA (complementary DNA), DNA encoding miRNA (microRNA), and DNA encoding shRNA (small hairpin RNA).
  • cDNA contains the sequence of the region of a gene that is translated into a protein, from the start codon to the stop codon, and in a target cell into which the gene has been introduced, it is transcribed into mRNA and, through translation in liposomes, can express proteins such as enzymes and fluorescent proteins.
  • miRNA is a functional nucleic acid that undergoes a multi-step production process starting from transcription to ultimately become a 20-25 base long microRNA. miRNA is classified as a functional ncRNA (non-coding RNA) and plays an important role in biological phenomena by regulating the expression of other genes.
  • shRNAs are hairpin-shaped RNA sequences used for gene silencing by RNA interference.
  • the size (number of bases) of the target gene is not particularly limited, but is preferably 10 bp to 10 kbp, more preferably 500 bp to 6 kbp, and even more preferably 1 kbp to 3 kbp.
  • the first vector is a vector that directs long-term expression of a gene of interest.
  • the first vector is preferably a modified transposon vector into which a nucleic acid fragment having the characteristics of item (1) or (2) below has been inserted, and more preferably a modified transposon vector into which a nucleic acid fragment having the characteristics of item (3) below has been inserted in addition to item (1) or (2) below.
  • TIR 5' terminal inverted repeat
  • TIR 3' terminal inverted repeat
  • the transposon gene has a 5' inverted repeat/direct repeat (IR/DR) sequence and a 3' inverted repeat/direct repeat (IR/DR) sequence, and a sequence in which recombination reaction occurs is inserted between these sequences.
  • IR/DR 5' inverted repeat/direct repeat
  • IR/DR 3' inverted repeat/direct repeat
  • a restriction enzyme recognition site or a foreign gene expression cassette is inserted between the 5' inverted repeat (TIR) sequence and the 3' inverted repeat (TIR) sequence or the inverted repeat/direct repeat (IR/DR) sequence of the transposon gene.
  • sequence in which the recombination reaction occurs refers to the target gene to be expressed in the target cell.
  • a transposon is a base sequence that can transpose its position on the genome within a cell, and is also called a mobile gene or a transposable element.
  • transposons There are two types of transposons: a DNA type in which a DNA fragment is directly transposed, and an RNA type in which the DNA fragment is transposed through the process of transcription and reverse transcription. Usually, only the DNA type is called a transposon.
  • the RNA type transposon is usually distinguished by being called a retrotransposon or a retroposon.
  • an enzyme called transposase is required, which is encoded by the transposon itself.
  • the transposon has an inverted repeat sequence (inverted repeat sequence, TIR sequence) or an inverted repeat sequence/direct repeat (IR/DR) sequence at its end, and the transposase recognizes this sequence and excises the transposon from the genome sequence. It is then reinserted into the appropriate genomic sequence.
  • a foreign gene expression cassette is defined as a nucleic acid fragment to which a suitable promoter, a stop codon, a polyA additional signal sequence, a Kozak sequence, a secretion signal, etc. are added to a foreign gene. By introducing this into a suitable cell, the foreign gene can be expressed in the cell.
  • the liquid containing the first vector is not particularly limited as long as it is a solution or dispersion containing the above-mentioned first vector.
  • the first vector may be dissolved or dispersed in a buffer solution.
  • the buffer solution is not particularly limited, but it is preferable that it has no or little effect on the efficiency of gene transfer into the target cells and has no or little cytotoxicity to the target cells.
  • the target cell refers to a cell into which a gene is introduced, and is not limited to a specific type of cell.
  • Specific examples of such target cells include animal cells including human cells, non-human animal individuals, cells taken from human individuals, cells in human individuals, human individuals, plant cells, and microbial cells. These target cells may be used as a single type or as a mixture of two or more types.
  • the above-mentioned cells collected from human individuals include cells that are not intended to be returned to human individuals and are used for pharmaceutical research and development, etc., and cells that are intended to be returned to human individuals and are used for regenerative medicine, etc.
  • the above-mentioned cells collected from human individuals also include cells cultured from cells collected from human individuals.
  • non-human animal cells and plant cells mentioned above include cells present within an individual, cells present within a tissue, cells harvested from an individual or tissue, and cells cultured from cells harvested from an individual or tissue.
  • the target cells used in the present invention include prokaryotic cells such as Escherichia coli, actinomycetes, and Bacillus subtilis; and eukaryotic cells such as yeast, non-human animal cells, cells taken from a human individual, cells contained in a human individual, and plant cells.
  • the target cells are preferably at least one type selected from the group consisting of blood-derived cells, adherent cells, and iPS cells.
  • the blood-derived cells include, for example, T cells, etc.
  • the adherent cells include, for example, HEK293 cells, mesenchymal stem cells, and adipose-derived stem cells, etc.
  • T cells are a type of lymphocyte, which are precursor cells produced in the bone marrow that have been selected in the thymus and then differentiated and matured. T cells have a characteristic T cell receptor (TCR) on the cell surface. They account for 70-80% of lymphocytes in peripheral blood. T cells can be used not only from peripheral blood but also from cultured cells. T cells are included in CD3 positive cells.
  • T cells can be cultured using a commercially available T cell medium according to a known protocol.
  • HEK293 cells are a cell line established by transforming human fetal kidney cells with the E1 gene of adenovirus.
  • HEK293 cells are easy to culture and easy to introduce genes into, and are used for various purposes such as recombinant protein production and as a host for recombinant adenovirus production and amplification, and are available as commercially available products.
  • Mesenchymal stem cells are a type of stem cell present in adults and have the ability to differentiate into bone, cartilage, blood vessels, and cardiac muscle cells, which are tissues derived from the mesoderm.
  • Adipose-derived stem cells are a type of mesenchymal stem cells (MSCs) that can be harvested from adipose tissue.
  • adipose-derived MSCs Compared to bone marrow-derived MSCs, adipose-derived MSCs have the following advantageous characteristics: they are more abundant in the body and can be harvested in large quantities from adipose tissue throughout the body; they produce a large amount of growth factors (regeneration-promoting factors) such as HGF (hepatocyte growth factor) and VEGF (vascular endothelial growth factor) that contribute to organ repair; they have a high immunosuppressive ability; and they can grow without problems even when obtained from the adipose tissue of elderly people.
  • growth factors regeneration-promoting factors
  • HGF hepatocyte growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • the target cells used in the present invention also include those having a lipid bilayer structure, such as erythrocyte ghosts and liposomes.
  • the target cells used in the present invention may not have been subjected to any particular treatment, but may be subjected to treatment as competent cells, which is generally used in gene transfer, in order to improve the efficiency of gene transfer.
  • competent cells which is generally used in gene transfer, in order to improve the efficiency of gene transfer.
  • competent cells of Escherichia coli which have been treated with calcium chloride to change the structure of the cell membrane and make it easier to dialyze DNA molecules.
  • genes can be introduced into multiple target cells simultaneously.
  • the multiple target cells may be cells of the same species or cells of different species.
  • the multiple target cells include cells of different species.
  • the target cells are one or more types selected from the group consisting of non-human animal cells, non-human animal individuals, cells collected from human individuals, cells in human individuals, human individuals, plant cells, and microbial cells.
  • the target cells may be contained in a tissue.
  • a tissue containing target cells may be referred to as a target tissue.
  • the target tissue is not limited to a particular type of tissue. Specific examples of such target tissues include organs from donors used for transplantation, tissues such as skin and tooth roots reconstructed using regenerative medicine methods, and pre-differentiated plant tissues constructed by callus culture. A single type of these target tissues may be used, or two or more types may be mixed together.
  • the method used to introduce genes into target cells in the introduction process is the plasma introduction method, in which the target cells are irradiated with plasma to activate the target cells' function and introduce genes into them.
  • the plasma introduction method is a method of introducing genes into target cells by irradiating them with discharge plasma. This method has the advantage of having little risk of carcinogenesis because it does not use viruses, and little risk of cell dysfunction because it does not use chemicals. In addition, there is little damage to the cells because no current is passed directly through the cells, and the survival rate of cells into which genes have been introduced is high.
  • plasma is defined as satisfying the following (1), (2), and (3).
  • (1) A collection of charged particles of opposite charge that is nearly electrically neutral as a whole.
  • (2) At least one group of charged particles among those described in (1) above is undergoing irregular thermal motion.
  • (3) The charged particles in (1) and (2) above have dimensions greater than the Debye length.
  • plasma can refer to ionized gas, but in this invention, plasma is not limited to plasma generated by discharge in the gas phase, but also includes plasma generated by discharge in liquid. Furthermore, “irradiating plasma” does not only mean directly contacting a target with plasma, but also includes acting on the target with active species generated by the reaction of plasma with surrounding gas or liquid, electromagnetic waves such as ultraviolet rays, electrons, heat, etc. generated by plasma.
  • the step of irradiating plasma refers to generating plasma in the vicinity of the liquid containing the first vector and the target cells while the liquid is in contact with the target cells.
  • the conditions for plasma irradiation will be described in detail in the explanation of the gene introduction device below.
  • the step of irradiating the target cells with plasma induces endocytosis in the target cells.
  • the first and second vectors are introduced into the target cells.
  • the step of irradiating the target cells with plasma may be performed before the step of introducing the first vector into the target cells, or may be performed between the step of contacting the first vector with the target cells and the step of introducing the first vector into the target cells.
  • the step of introducing the second vector into the target cells may be carried out simultaneously with the step of introducing the first vector into the target cells.
  • the first and second vectors are simultaneously brought into contact with the target cells, and then the target cells are irradiated with plasma. Endocytosis of the target cells is induced by the plasma irradiation, and the first and second vectors are simultaneously introduced into the target cells.
  • the method of contacting the liquid containing the first vector with the target cells is not particularly limited, and may be, for example, pouring the liquid containing the first vector into a container containing the target cells so that the liquid comes into contact with the target cells.
  • the activation step is a step of contacting the target cells with a fluid containing a second vector that prolongs expression of the first vector in the target cells.
  • the activation step is carried out either before or after the introduction step, or both.
  • the second vector is preferably a vector incorporating a sequence of an enzyme that transfers the target sequence of the first vector to the genome.
  • the target sequence is, for example, a foreign gene sequence.
  • fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein, red fluorescent protein, and blue fluorescent protein, protein tags such as His tags and epitope tags, and gene sequences encoding CAR (chimeric antigen receptor).
  • the second vector is a transposase gene expression plasmid and a helper plasmid carrying a gene encoding the transposase.
  • the liquid containing the second vector is not particularly limited as long as it is a solution or dispersion containing the above-mentioned second vector.
  • the second vector may be dissolved or dispersed in a buffer solution.
  • the buffer solution is not particularly limited, but it is preferable that it has no or little effect on the efficiency of gene transfer into the target cells and has no or little cytotoxicity to the target cells.
  • Target cells This is similar to the target cells in the introduction step described above.
  • the method of contacting the liquid containing the second vector with the target cells is not particularly limited.
  • the liquid containing the second vector may be poured into a vessel containing the target cells so as to come into contact with the target cells.
  • the activation step is performed after the introduction step, the liquid containing the second vector may be poured into a vessel containing the target cells and the liquid containing the first vector so as to come into contact with the target cells.
  • the gene transfer method of the present invention may further include a step of adding a substance that improves the transfer efficiency of at least one of the first vector and the second vector (hereinafter, sometimes referred to as a transfer efficiency improver).
  • the introduction efficiency improving agent is preferably at least one selected from the group consisting of cytokines and recombinant forms thereof.
  • cytokines include interleukins (hereinafter sometimes referred to as “IL”), interferons, chemokines, colony-stimulating factors, tumor necrosis factors, and growth factors, with IL being more preferred, IL produced by activated T cells being even more preferred, and interleukin-2 (hereinafter sometimes referred to as "IL2”) and interleukin-15 (hereinafter sometimes referred to as "IL15”) being even more preferred.
  • the introduction efficiency improving agent may be added in a state of being mixed with a liquid.
  • the liquid is not particularly limited, but examples thereof include liquids in which the introduction efficiency improving agent is dissolved or dispersed in a buffer solution.
  • the buffer solution is not particularly limited, but it is preferable that the buffer solution has no or only a small effect on the efficiency of molecular introduction into target cells and has no or only a small cytotoxicity to the target cells.
  • the concentration of the introduction efficiency improving agent in the liquid containing the introduction efficiency improving agent is not particularly limited, but in the case of IL2 or IL15, the concentration in the system in which the target cells exist, for example, in the medium in contact with the target cells, is 10 to 2000 ng/mL.
  • the timing of adding the introduction efficiency improving agent is not particularly limited.
  • the introduction efficiency improving agent may be added to a solution containing target cells, such as a culture medium.
  • the target cells may be cultured in a culture medium containing the introduction efficiency improving agent, and then the first vector and the second vector may be introduced into the target cells.
  • the introduction efficiency improving agent may be added to a liquid containing at least one of the first vector and the second vector.
  • the present invention also provides a method for producing a gene-transferred cell using the above-mentioned gene transfer method.
  • the method for producing a gene-transferred cell of the present invention includes a step of contacting a first vector with a target cell, a step of introducing the first vector into the target cell, a step of contacting a second vector with the target cell, a step of introducing the second vector into the target cell, and a step of irradiating the target cell with plasma.
  • the method for producing a gene-transferred cell of the present invention includes an introduction step of contacting a target cell with a liquid containing a first vector that causes long-term expression of a target gene, and an activation step of contacting a target cell with a liquid containing a second vector that causes long-term expression of the first vector in the target cell, the activation step being performed either before or after the introduction step, or both, and the target cell is irradiated with plasma in the introduction step.
  • the gene introduction device of this embodiment has a first electrode, a second electrode, and an irradiation field located between the first electrode and the second electrode.
  • the gene introduction device introduces a gene into a target cell.
  • the gene introduction device generates plasma from a first electrode, irradiates an irradiation object in which the target cell and the gene coexist, and introduces the gene into the target cell.
  • the gene introduction device 1 in FIG. 1 has a first electrode 10, a second electrode 20, a power supply unit 30, and a container 40.
  • the second electrode 20 is spaced apart from the first electrode 10 and is located below the lower end (tip) of the first electrode 10. That is, the second electrode 20 is located beyond the tip of the first electrode 10, and the first electrode 10 and the second electrode 20 face each other.
  • the power supply unit 30 is connected to the first electrode 10 and the second electrode 20 .
  • the container 40 is located between the first electrode 10 and the second electrode 20. The container 40 is opposed to the second electrode 20 and is spaced apart from the first electrode 10.
  • the first electrode 10 has an electrode body 12 and an irradiating body 14 provided at the tip of the electrode body 12. Note that in the present invention, the first electrode 10 may be composed of only the irradiating body 14. In this embodiment, the first electrode 10 is a high voltage electrode.
  • the electrode body 12 is a rod-shaped body extending in one direction.
  • the electrode body 12 may have a hollow structure such as a cylindrical shape or a polygonal tube shape, or may have a solid structure such as a cylindrical shape or a polygonal column shape. In particular, when the electrode body 12 has a solid structure, durability is increased and manufacturing is easy. Examples of materials for the electrode body 12 include metals such as stainless steel, copper, and tungsten, and carbon.
  • the irradiator 14 has a flat substrate 15 and a wall 16 that hangs down from the periphery of the substrate 15.
  • the substrate 15 and the wall 16 are connected.
  • FIG. 2 shows the end face of the irradiator 14 when the first electrode 10 is viewed from the lower end (i.e., the direction of the second electrode 20).
  • the wall 16 is hollow and cylindrical with an open lower end (tip).
  • the wall 16 is a single cylinder with the tube axis O1 extending from the first electrode 10 toward the second electrode 20.
  • the wall 16 is not limited to a cylindrical shape, and may be a polygonal tube.
  • Reference numeral 17 denotes the inner surface of the wall 16.
  • Reference numeral 18 denotes the outer surface of the wall.
  • Examples of materials for the substrate portion 15 include metals such as stainless steel, copper, and tungsten, and carbon.
  • materials for the wall portion 16 include metals such as stainless steel, copper, and tungsten, and carbon.
  • the base portion 15 and the wall portion 16 may be an integrally molded product, or may be molded separately and then joined together.
  • the substrate portion 15 may or may not have a through hole that connects the inside of the electrode body 12 to the inside of the wall portion 16.
  • the thickness (outer diameter) R16 of the wall 16 can be appropriately determined taking into consideration the size of the container 40, etc.
  • the outer diameter R16 is preferably, for example, more than 1 mm, more preferably 3 to 50 mm, and even more preferably 5 to 10 mm.
  • the outer diameter R16 is equal to or greater than the above-mentioned lower limit, the plasma can be irradiated over a wider range, and the efficiency of gene introduction into the target cells (hereinafter, sometimes simply referred to as "introduction efficiency") can be further improved.
  • introduction efficiency When the outer diameter R16 is equal to or less than the above-mentioned upper limit, a stable discharge can be easily generated.
  • the outer diameter R16 is preferably larger than the outer diameter R12.
  • the outer diameter R16 is large, the plasma can be irradiated over a wider range, and the introduction efficiency can be further improved.
  • the outer diameter R16 is the diameter of a circumscribing circle of the cross section of the wall portion 16.
  • the outer diameter R16 of the wall portion 16 is the outer diameter of the wall portion 16 located on the outermost side.
  • the inner diameter r16 of the wall portion 16 is preferably, for example, 0.1 mm or more.
  • the inner radius r16 is the diameter of the inscribed circle of the cross section of the wall portion 16.
  • the inner diameter r16 of the wall portion 16 is the inner diameter of the wall portion 16 located innermost.
  • the angle ⁇ 1 between the lower end face of the wall 16 and the outer surface of the wall 16 is, for example, preferably 60° or less, more preferably 30° or less, and even more preferably 10° or less.
  • the intersection between the lower end face of the wall 16 and the outer surface of the wall 16 is a so-called edge. If the angle ⁇ 1 is equal to or less than the upper limit, an electric field is concentrated at the edge, making it easier to generate plasma between the electrodes.
  • the angle between the lower end surface of the wall portion 16 and the inner surface of the wall portion 16 is the same as the angle ⁇ 1.
  • the angle between the lower end surface of the wall portion 16 and the inner surface of the wall portion 16 may be the same as or different from the angle ⁇ 1.
  • the thickness t16 of the wall portion 16 is preferably, for example, 1 mm or less, and more preferably 0.1 mm or less. If the thickness t16 is equal to or less than the upper limit value, the strength of the electric field at the end can be further increased.
  • the height h16 of the wall portion 16 is not particularly limited, but is preferably 1 to 10 mm, for example.
  • the second electrode 20 may be any electrode that functions as a ground electrode, and may be, for example, a flat electrode.
  • Examples of materials for the second electrode 20 include metals such as stainless steel, copper, and tungsten, and carbon.
  • the area of the second electrode 20 is larger than the area of the first electrode 10. If the area of the second electrode 20 is larger, the plasma can be irradiated from the first electrode 10 to the irradiation target over a wider area.
  • the power supply unit 30 is required only to be able to apply a voltage between the first electrode 10 and the second electrode and generate plasma between the two electrodes.
  • the power supply unit 30 switches between starting and stopping the supply of electricity to the electrodes.
  • the power supply unit 30 also adjusts the voltage and frequency applied to the electrodes.
  • An example of the power supply unit 30 is a circuit that is connected to an external power source and includes an inverter.
  • An example of the power supply unit 30 is a secondary battery.
  • the container 40 functions as an irradiation field.
  • the irradiation field may be any place where an irradiation target is positioned in a gene introduction method described later. Therefore, when the container 40 is not a part of the configuration of the gene introduction device 1, the second electrode 20 on which the container 40 is placed may be the irradiation field.
  • the container 40 may be any container that can accommodate an irradiation target, such as each well of a microplate.
  • the inner bottom surface of the container 40 is spaced apart from the tip of the first electrode 10 (i.e., the irradiation body 14).
  • the material of the container 40 may be a conductive material or an insulating material. However, from the viewpoint of preventing localized discharge caused by high voltage, an insulating material is preferable. Examples of insulating materials include resin, ceramics, glass, etc. Examples of resins include polystyrene, polyolefin, polyester, etc.
  • the control unit 50 controls the power supply unit 30 and a liquid addition unit (not shown) by a computer.
  • the computer of the control unit 50 includes a processing unit (CPU), a main memory (memory), a storage area (storage), and an input/output (I/O) circuit, reads out a program recorded in the storage, and performs processing by the CPU using the memory as a working area.
  • the control unit 50 controls a liquid injection step in which the liquid addition unit injects a liquid containing a first vector or a liquid containing a second vector into the container 40, a voltage application step in which the power supply unit 30 applies a voltage between the first electrode 10 and the second electrode 20, and the timing of execution of the liquid injection step and the voltage application step.
  • the gene introduction device 1 of this embodiment may further include an image acquisition unit (not shown) that acquires an image of the target cells in the container 40 .
  • the control unit 50 analyzes image data from the image acquisition unit, and controls a liquid injection step in which the liquid addition unit injects a liquid containing a first vector or a liquid containing a second vector into the container 40, a voltage application step in which the power supply unit 30 applies a voltage between the first electrode 10 and the second electrode 20, and the timing of execution of the liquid injection step and the voltage application step.
  • plasma is irradiated into the container 40 while the target cells etc. 44 are in contact with the liquid 42 containing the first vector.
  • the first vector is introduced into the target cells etc. 44 through plasma irradiation.
  • plasma may be irradiated into the container 40 while the target cells etc. 44 are in contact with the liquid 42 containing the first and second vectors, and the first and second vectors may be introduced into the target cells etc. 44.
  • the plasma irradiation power is fed from the power feeder 30 to the first electrode 10 , and a voltage is applied between the first electrode 10 and the second electrode 20 .
  • a voltage is applied between the electrodes, an electric field is concentrated at the edge of the lower end of the wall 16, and plasma is generated from the electric field concentration point toward the second electrode 20.
  • the wall 16 is cylindrical, the plasma can be irradiated over a wide range of the irradiation target.
  • the first vector can be introduced into target cells, etc. over a wide range of the irradiation target by a single plasma irradiation. This increases the amount introduced per unit time, and further improves the introduction efficiency.
  • the distance L40 from the lower end of the first electrode 10 (the lower end surface of the wall portion 16) to the irradiation target (the liquid in which the first vector and the target cells, etc. 44 coexist) is preferably 0.1 to 5 mm. If the distance L40 is within the above range, plasma can be generated more stably.
  • the AC voltage applied between the first electrode 10 and the second electrode 20 is preferably 1 to 30 kVpp, and more preferably 5 to 20 kVpp. If the AC voltage is equal to or higher than the lower limit, the introduction efficiency can be further improved. If the AC voltage is equal to or lower than the upper limit, damage to target cells can be further reduced.
  • the unit of AC voltage "Vpp (Volt peak to peak)" is the potential difference between the maximum and minimum values of the AC voltage waveform.
  • the frequency of the alternating current applied between the first electrode 10 and the second electrode 20 is preferably 1 to 500 kHz, and more preferably 10 to 200 kHz. If the frequency is equal to or higher than the lower limit, the introduction efficiency can be further improved. If the frequency is equal to or lower than the upper limit, damage to target cells, etc. can be further reduced.
  • the plasma irradiation time in the irradiation step is, for example, preferably 10 nanoseconds to 1 second, and more preferably 100 nanoseconds to 0.1 seconds. If the irradiation time is equal to or greater than the above lower limit, the amount of the first vector (or the first vector and the second vector) introduced into the target cells, etc. 44 can be further increased. If the irradiation time is equal to or less than the above upper limit, damage to the target cells, etc. can be further reduced.
  • the environment inside the container 40 is not particularly limited, but may be, for example, in the presence of CO 2.
  • the CO 2 concentration is, for example, 1 to 10% by volume.
  • Experimental Examples 1 to 3 are working examples
  • Experimental Examples 4 to 6 are comparative examples.
  • Example 1 Molecular introduction device The molecular introduction device shown in FIG. 1 was used.
  • First electrode Hollow pipe-shaped electrode with a diameter of 3 mm Power supply frequency: 50 kHz Discharge voltage: 16 kV p-p Discharge time: 60 ms Discharge points per well: 4 points r2 (distance from the center of the irradiation container to the plasma irradiation point): 12 mm Distance between electrode end and container top: 3 mm DNA amount: pBR-TPV-eGFP, 20 ⁇ g, pRI-Pbase (+mCherry), 30 ⁇ g DNA solution: 50 ⁇ L Amount of DNA: 40-50 ⁇ g per well
  • HEK293F cells (Thermo Fisher Scientific) were seeded in each well of a 6-well plate at 0.86 ⁇ 10 6 cells/well/3 mL, and cultured in HE100 medium in a CO 2 incubator (37°C, 5% by volume CO 2 concentration) for 48 to 54 hours until plasma irradiation. Before plasma irradiation, the medium/supernatant was removed, and a transposon vector containing the eGFP gene between the TIR sequences shown in Table 1 (pBR-TPV-eGFP, first vector) and a transposase vector containing the mcherry gene and PBase (pRI-Pbase(+mCherry), second vector) were added.
  • a plasma irradiation treatment was performed (discharge time 60 ms), and 3 mL of HE100 medium was added as a recovery medium.
  • the cells were cultured in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 by volume). After the transfection, 2, 5, 9, 12, and 16 days later, the total number of cells (All Events), the gate presumed to be live cells (R1), and the number of cells showing positive GFP fluorescence (R4) were measured using a flow cytometer. On the same day, the cells were diluted 1/8 and continued to be cultured after 5 days. The results of the measurement using a flow cytometer are shown in FIG. 3 to FIG. 5, and the percentage of the number of GFP cells is shown in FIG.
  • Example 2 The experiment was carried out in the same manner as in Experimental Example 1, except that the amount of DNA was changed as follows. pBR-TPV-eGFP, 20 ⁇ g pRI-Pbase (+mCherry), 20 ⁇ g The results of the measurement using a flow cytometer are shown in FIG. 3 to FIG. 5, and the percentage of the number of GFP cells is shown in FIG. Micrographs of the target cells after gene transfer are shown in Figures 7 to 10.
  • Figure 7 is an image of GFP fluorescence
  • Figure 8 is an image of mCherry fluorescence
  • Figure 9 is a merge of Figures 7 and 8
  • Figure 10 is a bright field observation image.
  • Example 3 The experiment was carried out in the same manner as in Experimental Example 1, except that the amount of DNA was changed as follows. pBR-TPV-eGFP, 20 ⁇ g pRI-Pbase (+mCherry), 10 ⁇ g The results of the measurement using a flow cytometer are shown in FIG. 3 to FIG. 5, and the percentage of the number of GFP cells is shown in FIG.
  • Example 4 The experiment was carried out in the same manner as in Experimental Example 1, except that the amount of DNA was changed as follows. pBR-TPV-eGFP, 20 ⁇ g pRI-Pbase (+mCherry), None The results of measurement using a flow cytometer are shown in FIG. 3 to FIG. 5, and the percentage of GFP cells is shown in FIG. Micrographs of the target cells after gene transfer are shown in Figures 11 to 14.
  • Figure 11 is an image of GFP fluorescence
  • Figure 12 is an image of mCherry fluorescence
  • Figure 13 is a merge of Figures 11 and 12
  • Figure 14 is a bright field observation image.
  • First electrode One end of a stainless steel cylinder with a diameter of 3 mm was covered with an alumina cap with a thickness of 0.5 mm. A through hole with a diameter of 0.1 mm was formed by laser processing on the surface of the alumina cap facing the second electrode to prepare the first electrode.
  • Discharge voltage 16 kV p-p Discharge time: 40 ms
  • Discharge points per well 9 points r2 (distance from the center of the irradiation container to the plasma irradiation point): 12 mm Distance between electrode end and container top: 2 mm
  • DNA amount pBR-TPV-eGFP (w/o Puro), 25 ⁇ g pRI-Pbase, 25 ⁇ g
  • DNA solution 50 ⁇ L
  • Amount of DNA 50 ⁇ g per well
  • HEK293F cells (Thermo Fisher Scientific) were seeded in each well of a 6-well plate at 0.86 ⁇ 10 6 cells/well/3 mL, and cultured in HE100 medium in a CO 2 incubator (37°C, 5% by volume CO 2 concentration) for 48 to 54 hours until plasma irradiation. Before plasma irradiation, the medium/supernatant was removed, and pBR-TPV-eGFP (w/o Puro) was added as a transposon vector (first vector) containing the eGFP gene between the TIR sequences shown in Table 1, and pRI-Pbase was added as a transposase vector (second vector) containing PBase.
  • first vector containing the eGFP gene between the TIR sequences shown in Table 1
  • pRI-Pbase was added as a transposase vector (second vector) containing PBase.
  • a plasma irradiation treatment was performed (discharge time: 40 ms), and 3 mL of HE100 medium was added as a recovery medium.
  • the cells were cultured in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 by volume). After the transfection, 2, 5, 9, 12, and 16 days, the number of cells in the gate presumed to be live cells (R1) and showing positive GFP fluorescence (R4) was counted using a flow cytometer. On the same day, the cells were diluted 1/8 and continued to be cultured from 5 days later. The results of measuring the number of live cells and the number of cells showing positive GFP fluorescence using a flow cytometer are shown in FIG. 23 and FIG. 24, respectively.
  • Example 8 The experiment was carried out in the same manner as in Experimental Example 1, except that the amount of DNA was changed as follows. pBR-TPV-eGFP (w/o Puro), 20 ⁇ g pRI-Pbase, None The results of measuring the number of live cells and the number of cells showing positive GFP fluorescence using a flow cytometer are shown in FIG. 23 and FIG. 24, respectively.
  • Example 10 The experiment was carried out in the same manner as in Experimental Example 9, except for the following conditions. ⁇ Electroporation device BioRAD Gene Pulser Xcell TM > Electroporation: 250 V, 950 ⁇ F, 29.5 msec, 4 mm cuvette. The results of measuring the number of live cells and the number of cells showing positive GFP fluorescence using a flow cytometer are shown in FIG. 23 and FIG. 24, respectively.
  • Example 12 An experiment was carried out in the same manner as in Experimental Example 7, except that plasma irradiation was not carried out.
  • the results of measuring the number of live cells and the number of cells showing positive GFP fluorescence using a flow cytometer are shown in FIG. 23 and FIG. 24, respectively.
  • Experimental Example 7 in which the transposon vector and transposase vector were introduced by plasma irradiation, showed the highest number of cells that showed positive GFP fluorescence.
  • the number of cells into which genes were introduced was found to be approximately 100 times higher than in Experimental Example 9, in which electroporation was used.
  • Example 13 Molecular introduction device The following molecular introduction device was used. First electrode: The same first electrode as in Experimental Example 7 was used. Power supply frequency: 50 kHz Discharge voltage: 16 kV p-p Discharge time: 80 ms Discharge points per well: 1 point Distance between electrode end and top of container: 1 mm DNA amount: pBR-TPV-eGFP, 2 ⁇ g pRI-Pbase, 2 ⁇ g DNA solution: 4 ⁇ L DNA amount: 4 ⁇ g per well
  • Jurkat cells (ECACC, The European Collection of Authenticated Cell Cultures), which are CD3 positive cells, were seeded in each well of a 48-well plate at 2 x 105 cells/well/0.4 mL, and the cells were incubated in a CO2 incubator in RPMI1640 medium until plasma irradiation. The cells were cultured for 48 hours (37°C, 5% CO2 by volume). Before plasma irradiation, the medium/supernatant was removed, and pBR-TPV-eGFP was added as a transposon vector (first vector) containing the eGFP gene between the TIR sequences shown in Table 1, and pRI-Pbase was added as a transposase vector (second vector) containing PBase.
  • first vector containing the eGFP gene between the TIR sequences shown in Table 1
  • pRI-Pbase was added as a transposase vector (second vector) containing PBase.
  • a plasma irradiation treatment was performed (discharge time 80 ms), and 0.4 mL of RPMI 1640 medium was added as a recovery medium.
  • the cells were cultured in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 by volume).
  • 10 mg/ml Puromycin was added to a concentration of 2 ⁇ g/ml/well.
  • the medium was replaced with RPMI1640 medium supplemented with 5% serum to remove Puromycin.
  • the number of cells in the gate presumed to be live cells (R1) and showing positive GFP fluorescence (R4) was counted using a flow cytometer.
  • the cells were then diluted 1/8 and further cultured. The results of measuring the number of live cells and the number of cells showing positive GFP fluorescence using a flow cytometer, as well as the positive cell rate (R4/R1), are shown in Figures 25 to 27, respectively.
  • Example 14 The experiment was carried out in the same manner as in Experimental Example 13, except that the amount of DNA was changed as follows. pBR-TPV-eGFP, 2 ⁇ g pRI-Pbase, None The results of measuring the number of live cells and the number of cells showing positive GFP fluorescence using a flow cytometer, as well as the positive cell rate (R4/R1), are shown in FIGS. 25 to 27, respectively.
  • Example 15 The experiment was carried out in the same manner as in Experimental Example 13, except that the amount of DNA was changed as follows. pBR-TPV-eGFP (w/o Puro), 2 ⁇ g pRI-Pbase, None The results of measuring the number of live cells and the number of cells showing positive GFP fluorescence using a flow cytometer, as well as the positive cell rate (R4/R1), are shown in FIGS. 25 to 27, respectively.
  • Example 17 Molecular introduction device The following molecular introduction device was used. First electrode: The same first electrode as in Experimental Example 7 was used. Power supply frequency: 50 kHz Discharge voltage: 16 kV p-p Discharge time: 80 ms Discharge points per well: 1 point Distance between electrode end and top of container: 1 mm DNA amount: pBR-TPV-eGFP, 2 ⁇ g, pRI-Pbase, 2 ⁇ g DNA solution: 4 ⁇ L DNA amount: 4 ⁇ g per well
  • Jurkat cells (ECACC, The European Collection of Authenticated Cell Cultures), which are CD3 positive cells, were seeded at 2 x 105 cells/well/0.4 mL in each well of a 48-well plate, and cultured in RPMI1640 medium supplemented with 10 ng/mL IL2 (Miltenyi Biotec) and 5% serum in a CO2 incubator for 48 hours (37°C, 5% by volume CO2 concentration) until plasma irradiation.
  • RPMI1640 medium supplemented with 10 ng/mL IL2 (Miltenyi Biotec) and 5% serum in a CO2 incubator for 48 hours (37°C, 5% by volume CO2 concentration) until plasma irradiation.
  • pBR-TPV-eGFP was added as a transposon vector (first vector) containing the eGFP gene between the TIR sequences shown in Table 1, and pRI-Pbase was added as a transposase vector (second vector) containing PBase.
  • a plasma irradiation treatment was performed (discharge time: 80 ms), and 3 mL of RPMI 1640 medium was added as a recovery medium.
  • the cells were cultured in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 by volume).
  • Genome walking was performed using Universal GenomeWalker (registered trademark) 2.0 (Takara Bio, product code 636405). Genomic genes were recovered from the cells into which the transposon vector and transposase vector obtained in Experimental Example 13 were introduced using NucleoSpin Tissue (Takara Bio, product code: 740952.10). The recovered genomic genes were treated with the restriction enzyme EcoRV (Takara Bio, product code: 1042A). GenomeWalker Adaptors were added to the restriction enzyme-treated genomic genes, and primary PCR was performed under the following conditions using "Adaptor Primer 1 (AP1)" included in Universal GenomeWalker and an introduced transposon vector specific primer (AAGTTATCACGTAAGTAGAACATG, SEQ ID NO: 6). ⁇ Primary PCR conditions> 7 cycles: 94°C, 25 sec, then 72°C, 3 min for each cycle 32 cycles: 94°C, 25 sec, then 67°C, 3 min for each cycle 67°C, 7 min
  • Secondary PCR was carried out under the following conditions. As shown in Figure 29, the amplification of fragments corresponding to GW1 and GW2 was confirmed. In Figure 29, MK indicates the marker, and GW indicates the lane of the secondary PCR product. ⁇ Secondary PCR conditions> 5 cycles: 94°C, 25 sec, then 72°C, 3 min for each cycle 20 cycles: 94°C, 25 sec, then 67°C, 3 min for each cycle 67°C, 7 min
  • the resulting fragment GW1 (SEQ ID NO: 7) and fragment GW2 (SEQ ID NO: 8) were extracted and purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up (Takara Bio, product code: 740609.50) and then subjected to base sequence analysis, resulting in the sequences shown in Table 2.
  • the underlined portion indicates the inserted target sequence.
  • the sequence following the TTAA sequence is the genome sequence of the target cell. It was confirmed that the target gene had been inserted at the target base sequence TTAA in the genome of the target cell.
  • Example 21 Molecular introduction device The following molecular introduction device was used. First electrode: The same first electrode as in Experimental Example 7 was used. Power supply frequency: 50 kHz Discharge voltage: 16 kV p-p Discharge time: 80 ms Discharge points per well: 1 point Distance between electrode end and top of container: 1 mm DNA amount: pBR-TPV-CD19CAR-Puro, 2 ⁇ g, pRI-Pbase, 2 ⁇ g DNA solution: 4 ⁇ L DNA amount: 4 ⁇ g per well
  • Jurkat cells (ECACC, The European Collection of Authenticated Cell Cultures, Inc.), which are CD3 positive cells, were seeded in each well of a 48-well plate at 2 x 105 cells/well/0.4 mL, and cultured in RPMI1640 medium in a CO2 incubator (37°C, 5% by volume CO2 concentration) for 48 hours until plasma irradiation. Before plasma irradiation, the medium/supernatant was removed, and pBR-TPV-CD19CAR-Puro was added as a transposon vector (first vector) containing an eGFP gene between the TIR sequences shown in Table 1, and pRI-Pbase was added as a transposase vector (second vector) containing PBase.
  • first vector containing an eGFP gene between the TIR sequences shown in Table 1
  • pRI-Pbase was added as a transposase vector (second vector) containing PBase.
  • a plasma irradiation treatment was performed (discharge time: 80 ms), and 3 mL of RPMI 1640 medium was added as a recovery medium.
  • the cells were cultured in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 by volume).
  • 2 ⁇ g/ml of puromycin was added to the wells at 2 ⁇ g/ml.
  • the medium was replaced with RPMI1640 medium supplemented with 5% serum to remove Puromycin. 12, 15, and 19 days after the transfection treatment, the medium was replaced and the cells were diluted to 1/8 and subcultured in RPMI 1640 medium.
  • CD19-CAR-PE Anti-FMC63 Idiotype, product number 130-127-342, manufactured by Miltenyi Biotec
  • IgG-PE REA Control Antibody, human IgG1, PE, REAfinity (registered trademark), product number 130-113-450, manufactured by Miltenyi Biotec
  • CD3-FITC BD (registered trademark) CD3 FITC, product number 349201, manufactured by BD)
  • Example 22 The experiment was carried out in the same manner as in Experimental Example 21, except that pBR-TPV-CD19CAR-Puro and pRI-Pbase were not added. The results of measuring the number of CD19-CAR-PE positive cells (vertical axis) and the number of CD3-FITC positive cells (horizontal axis) using a flow cytometer are shown in FIG. 30.
  • the first row shows the results when CD19-CAR-PE and CD3-FITC were added
  • the second row shows the results when IgG-PE and CD3-FITC were added
  • the third row shows the results when only CD19-CAR-PE was added
  • the fourth row shows the results when no antibody was added (i.e., the control).
  • IgG-PE a negative control for CD3-FITC
  • CD3-FITC a negative control for CD3-FITC
  • SEQ ID NO: 7 Sequence name: GW1 / Sequence length: 113 bases gaatgcatgcgtcaattttacgcagactatctttctagggttaagcattaggctcacctcctagctgaaatacatcttgattgtttacatcaaagaatctgagtaggttaaaa
  • SEQ ID NO: 8 Sequence name: GW2 / Sequence length: 70 bases gaatgcatgcgtcaattttacgcagactatctttctagggttaagcacctaataagcacttattaatatt
  • 1 Molecule introduction device 10 First electrode, 12 Electrode body, 14 Irradiation body, 16 Wall, 20 Second electrode, 30 Power supply, 40 Container, 42 Molecules, 44 Target cells, O1 Tube axis, ⁇ 1 Angle

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Abstract

この遺伝子導入方法は、第一のベクターを標的細胞に接触させる工程と、前記第一のベクターを前記標的細胞に導入する工程と、第二のベクターを前記標的細胞に接触させる工程と、前記第二のベクターを前記標的細胞に導入する工程と、前記標的細胞に、プラズマを照射する工程と、を含む。

Description

遺伝子導入方法
　本発明は、遺伝子導入方法に関する。
　本願は、２０２３年１月１２日に日本に出願された特願２０２３－００２９８８号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ヒトゲノム及びマウスゲノムの解読がなされ、医学又は薬学等の分野において、分子生物学関連の研究開発又は医薬品開発を行なう際に、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ等のポリヌクレオチド又はその誘導体、シグナル伝達タンパク質若しくは転写調節因子等のタンパク質又はその誘導体等の高分子化合物、低分子生理活性物質、又は薬剤候補品等の分子を標的細胞内に導入し、標的細胞内での遺伝子の機能又は生理活性分子の生理的な活性を試験する必要が増している。
　標的細胞に遺伝子を導入する方法は、化学的手法、物理的手法、及び生物学的手法の大きく３つの手法がある。化学的手法は、カチオンポリマー、カチオン脂質、又はリン酸カルシウム等のトランスフェクション試薬を用いて、エンドサイトーシスにより遺伝子を標的細胞に取り込ませる手法である。物理的手法は、マイクロインジェクション、ソノポレーション、レーザー照射、又はエレクトロポレーション等の物理的操作により遺伝子を標的細胞に直接導入する手法である。生物学的手法は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又はアデノウイルス等のウイルスベクターを用い、ウイルスの感染能力によりウイルス粒子内の核酸を標的細胞内に移行させる手法である。
　ウイルスを用いずに目的遺伝子を細胞に導入する方法として、トランスポゾン法がある。トランスポゾン法の代表的なものとして、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン法とＳｌｅｅｐｉｎｇ　Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン法がある。
　非特許文献１には、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン法が目的遺伝子の長期発現のために有用であることが記載されている。
　ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン法を利用して遺伝子を導入するには、まず、目的遺伝子発現ベクター（トランスポゾンベクター）と、遺伝子転位酵素を発現するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースベクターの２種類のＤＮＡプラスミドを用意する。組み込まれたトランスポゼースベクターにより、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースが宿主細胞内で発現し、目的遺伝子発現ベクターの両端の特異的な配列が切り出される。切り出された配列が、宿主細胞のゲノム中のＴＴＡＡ配列（塩基配列）に組み込まれることで、目的遺伝子が細胞に導入される。目的遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれることで、宿主細胞における目的遺伝子の長期発現が実現されている。
　非特許文献２では、同種造血幹細胞移植後に再発したＢ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）患者を対象に、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ　Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾンで作製したサイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞に分化させたドナー由来のＣＤ１９　ＣＡＲ　Ｔ細胞を用いた第Ｉ／ＩＩ相臨床試験の初期結果が報告されている。
　Ｓｌｅｅｐｉｎｇ　Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン法は、「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ　Ｂｅａｕｔｙ（眠れる森の美女）」と呼ばれるジャンピングＤＮＡの断片を利用した目的遺伝子の導入方法であり、哺乳類細胞のゲノムに、デザインした外来ＤＮＡを効率的に組み込むことができる。
Ｎａｋａｚａｗａ，Ｙ．外８名、"Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ"、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、２００９年１０月、第３２巻、第８号、ｐ．８２６－８３６ Ｍａｇｎａｎｉ，Ｃｈｉａｒａ　Ｆ．外２９名、"Ｓｌｅｅｐｉｎｇ　Ｂｅａｕｔｙ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ＣＡＲ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ａｃｈｉｅｖｅ　ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｅｖｅｒｅ　ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ"、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２０２０年１１月、第１３０巻、第１１号、ｐ．６０２１－６０３３
　トランスポゾン法の一例として、ｐｉｇｇｙＢａｃ法が挙げられる。トランスポゾン法には目的遺伝子の導入効率が低い。トランスポゾン法にエレクトロポレーション法を組み合わせることにより目的遺伝子の長期発現を担保できる。しかし、この系では、宿主細胞への目的遺伝子の導入効率及びトランスフェクション後の宿主細胞の生存率を向上することが困難である。
　本発明は、標的細胞に対する目的遺伝子の導入効率及び目的遺伝子を導入した標的細胞の生存率が優れるとともに、目的遺伝子の長期発現を担保できる、遺伝子導入方法を提供することを課題とする。
［１］　第一のベクターを標的細胞に接触させる工程と、前記第一のベクターを前記標的細胞に導入する工程と、第二のベクターを前記標的細胞に接触させる工程と、前記第二のベクターを前記標的細胞に導入する工程と、前記標的細胞に、プラズマを照射する工程と、含む、遺伝子導入方法。
［２］　前記プラズマを照射する工程が、前記第一のベクターを前記標的細胞に導入する工程の前に行われる、［１］に記載の遺伝子導入方法。
［３］　前記第二のベクターを前記標的細胞に導入する工程が、前記第一のベクターを前記標的細胞に導入する工程と同時に行われる、［１］又は［２］に記載の遺伝子導入方法。
［４］　前記第二のベクターは、前記第一のベクターの目的配列をゲノムに移転させる酵素の配列を組込んでいるベクターである、［１］～［３］のいずれか一項に記載の遺伝子導入方法。
［５］　前記第一のベクターは、下記項目（１）又は（２）の核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターである、［１］～［４］のいずれか一項に記載の遺伝子導入方法。
（１）トランスポゾン遺伝子の５’側逆方向反復（ＴＩＲ：Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｉｎｖｅｒｔｅｄ　Ｒｅｐｅａｔ）配列及び３’側逆方向反復（ＴＩＲ）配列があり、これらの配列間に位置する組換え反応が生じる場の配列。
（２）トランスポゾン遺伝子の５’逆向き反復配列／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列及び３’逆向き反復配列／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列があり、これらの配列間に位置する組換え反応が生じる場の配列。
［６］　前記第一のベクターは、上記項目（１）又は（２）に加え、さらに下記項目（３）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターである、［５］に記載の遺伝子導入方法。
（３）トランスポゾン遺伝子の５’側逆方向反復（ＴＩＲ）配列と３’側逆方向反復（ＴＩＲ）配列との間、又は５’逆向き反復配列／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列と３’逆向き反復配列／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列との間に位置する、制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセット。
［７］　前記細胞と接触させる前記第一のベクターと前記第二のベクターの量のモル比が１：０．１～１：１０である、［１］～［６］のいずれかに記載の遺伝子導入方法。
［８］　前記標的細胞が、血液由来細胞、接着細胞、及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］～［７］のいずれかに記載の遺伝子導入方法。
［９］前記血液由来細胞がＣＤ３陽性細胞を含む、［８］に記載の遺伝子導入方法。
［１０］前記第一のベクターがキメラ抗原受容体をコードする遺伝子配列を含む、［９］に記載の遺伝子導入方法。
［１１］前記ＣＤ３陽性細胞がＴ細胞を含む、［９］又は［１０］に記載の遺伝子導入方法。
［１２］前記接着細胞がＨＥＫ２９３細胞、間葉系幹細胞及び脂肪由来幹細胞を含む、［８］～［１１］のいずれか一項に記載の遺伝子導入方法。
　もう一つの側面として、本発明は以下の態様を含む。
［１３］　目的遺伝子を長期発現させる第一のベクターを含む液体と標的細胞とを接触させる導入工程、及び
　前記標的細胞の前記第一のベクターの発現を長期化させる第二のベクターを含む液体と前記標的細胞とを接触させる活性化工程
を含み、
　前記導入工程の前及び後のいずれか一方又は両方に前記活性化工程を行い、
　前記導入工程において前記標的細胞にプラズマを照射する、
遺伝子導入方法。
［１４］　前記第二のベクターは、前記第一のベクターの目的配列をゲノムに移転させる酵素の配列を組込んでいるベクターである、［１３］に記載の遺伝子導入方法。
［１５］　前記第一のベクターは、下記項目（１）又は（２）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターである、［１３］又は［１４］に記載の遺伝子導入方法。
（１）トランスポゾン遺伝子の５’側逆方向反復（ＴＩＲ：Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｉｎｖｅｒｔｅｄ　Ｒｅｐｅａｔ）配列及び３’側逆方向反復（ＴＩＲ）配列があり、これらの配列間に組換え反応が生じる場の配列が挿入される。
（２）トランスポゾン遺伝子の５’逆向き反復配列／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列及び３’逆向き反復配列／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列があり、これらの配列間に組換え反応が生じる場の配列が挿入される。
［１６］　前記第一のベクターは、上記項目（１）又は（２）に加え、さらに下記項目（３）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターである、［１５］に記載の遺伝子導入方法。
（３）トランスポゾン遺伝子の５’側逆方向反復（ＴＩＲ）配列と３’側逆方向反復（ＴＩＲ）配列又は逆向き反復配列／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列との間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入されている。
［１７］　前記第一のベクターと前記第二のベクターのモル比が１：０．１～１：１０である、［１３］～［１６］のいずれかに記載の遺伝子導入方法。
［１８］　前記標的細胞が、血液由来細胞、接着細胞、及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、［１３］～［１７］のいずれかに記載の遺伝子導入方法。
［１９］前記血液由来細胞がＴ細胞を含む、［１８］に記載の遺伝子導入方法。
［２０］前記接着細胞がＨＥＫ２９３Ｆ細胞、間葉系幹細胞及び脂肪由来幹細胞を含む、［１８］又は［１９］に記載の遺伝子導入方法。
　本発明によれば、標的細胞に対する目的遺伝子の導入効率及び目的遺伝子を導入した標的細胞の生存率が優れるとともに、目的遺伝子の長期発現を担保できる、遺伝子導入方法を提供することができる。
本発明の遺伝子導入方法に用いることができる遺伝子導入装置の断面図である。 図１の照射体１４の断面図である。 実験例１～６のフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 実験例１～６のフローサイトメーターによる遺伝子導入処理後の細胞数の測定結果を示すグラフである。 実験例１～６のフローサイトメーターによる遺伝子導入処理後のＧＦＰ細胞数の測定結果を示すグラフである。 実験例１～６の遺伝子導入処理後のＧＦＰ細胞数割合（％）を示すグラフである。 実験例２の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例２の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例２の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例２の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例４の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例４の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例４の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例４の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例５の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例５の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例５の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例５の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例６の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例６の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例６の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例６の遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡観察像である。 実験例７～１２のフローサイトメーターによる生細胞数の測定結果を示すグラフである。 実験例７～１２のフローサイトメーターによるＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数の測定結果を示すグラフである。 実験例１３～１６のフローサイトメーターによる生細胞数の測定結果を示すグラフである。 実験例１３～１６のフローサイトメーターによるＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数の測定結果を示すグラフである。 実験例１３～１６のフローサイトメーターによる測定結果から得られるＧＦＰ陽性細胞率を示すグラフである。 実験例１７～１９のフローサイトメーターによる測定結果から得られる導入効率を示すグラフである。 実験例２０におけるＰＣＲ産物の電気泳動結果の画像である。 実験例２１～２２のフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。
　本発明において、数値範囲を示す「～」は、その前後に記載した数値を下限値及び上限値として含むことを意味する。
［遺伝子導入方法］
　本発明の遺伝子導入方法は、第一のベクターを標的細胞に接触させる工程と、　前記第一のベクターを前記標的細胞に導入する工程と、第二のベクターを前記標的細胞に接触させる工程と、前記第二のベクターを前記標的細胞に導入する工程と、前記標的細胞に、プラズマを照射する工程と、を含む。もう一つの側面として、本発明の遺伝子導入方法は、導入工程及び活性化工程を含む。
＜導入工程＞
　前記導入工程は、第一のベクターを標的細胞に接触させる工程であり、目的遺伝子を長期発現させる第一のベクターを含む液体と標的細胞とを接触させる工程であってもよい。
（目的遺伝子）
　本実施形態において、目的遺伝子は特に限定されず、標的細胞で発現させる遺伝子であればよく、例えばｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ，相補的ＤＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，マイクロＲＮＡ）をコードするＤＮＡ、又はｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ，小ヘアピンＲＮＡ）をコードするＤＮＡ等が挙げられる。
　ｃＤＮＡは、遺伝子の上でタンパク質に翻訳される領域の配列が開始コドンから終止コドンまで一続きに含まれており、遺伝子が導入された標的細胞において、ｍＲＮＡに転写され、リポソームでの翻訳を経て、酵素及び蛍光タンパク質等のタンパク質を発現させることができる。
　ｍｉＲＮＡは、転写から多段階的な生成過程を経て最終的に２０～２５塩基長の微小ＲＮＡとなる機能性核酸である。ｍｉＲＮＡは、機能性のｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ，非コードＲＮＡ）に分類されており、ほかの遺伝子の発現を調節するという、生命現象において重要な役割を担っている。
　ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。
　目的遺伝子のサイズ（塩基数）は特に限定されないが、１０ｂｐ～１０ｋｂｐが好ましく、５００ｂｐ～６ｋｂｐがより好ましく、１ｋｂｐ～３ｋｂｐがさらに好ましい。
（第一のベクターを含む液体）
　第一のベクターは、目的遺伝子を長期発現させるベクターである。
　前記第一のベクターは、下記項目（１）又は（２）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターであることが好ましく、下記項目（１）又は（２）に加え、さらに下記項目（３）の特徴を有する核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターであることがより好ましい。
（１）トランスポゾン遺伝子の５’側逆方向反復（ＴＩＲ：Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｉｎｖｅｒｔｅｄ　Ｒｅｐｅａｔ）配列及び３’側逆方向反復（ＴＩＲ）配列があり、これらの配列間に組換え反応が生じる場の配列が挿入されている。
（２）トランスポゾン遺伝子の５’逆向き反復配列／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列及び３’逆向き反復配列／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列があり、これらの配列間に組換え反応が生じる場の配列が挿入されている。
（３）トランスポゾン遺伝子の５’側逆方向反復（ＴＩＲ）配列と３’側逆方向反復（ＴＩＲ）配列または逆向き反復配列／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）との間に制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセットが挿入されている。
　項目（１）及び（２）における「組換え反応が生じる場の配列」とは、標的細胞で発現させる目的遺伝子である。
　トランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）は、細胞内においてゲノム上の位置を転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）することのできる塩基配列であり、動く遺伝子又は転移因子（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）とも呼ばれる。トランスポゾンには、ＤＮＡ断片が直接転移するＤＮＡ型と、転写と逆転写の過程を経るＲＮＡ型があるが、通常ＤＮＡ型のみをトランスポゾンと称する。ＲＮＡ型のトランスポゾンは、通常レトロトランスポゾン（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）又はレトロポゾンと呼んで区別される。ＤＮＡ型トランスポゾンが転移するためにはトランスポゼース（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）と呼ばれる酵素が必要であり、これはトランスポゾン自身がコードしている。トランスポゾンは、末端に逆向きの反復配列（逆方向反復配列，ＴＩＲ配列）又は逆向き反復配列／直列反復（ＩＲ／ＤＲ）配列を持っており、トランスポゼースはこの配列を認識してトランスポゾンをゲノム配列から切り出す。そして適当なゲノム配列に再度挿入する。
　外来遺伝子発現カセットは、外来遺伝子に適当なプロモーター、終止コドン、ポリＡ付加シグナル配列、Ｋｏｚａｋ配列及び分泌シグナルなどを付加した核酸断片と定義される。これを適当な細胞に導入することにより、外来遺伝子を該細胞内に発現させることができる。
　第一のベクターを含む液体は、上述した第一のベクターを含む溶液又は分散液であれば特に限定されない。例えば第一のベクターを緩衝液に溶解又は分散したものが挙げられる。前記緩衝液は、特に限定されないが、標的細胞への遺伝子導入効率に対する影響が無いか低いものであり、かつ、標的細胞に対する細胞毒性が無いか低いものが好ましい。
（標的細胞）
　標的細胞とは、遺伝子を導入する標的となる細胞のことを示し、特に特定の種類の細胞に限定されるものではない。このような標的細胞の具体例としては、ヒトを含む動物細胞、ヒト以外の動物個体、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体内の細胞、ヒトの個体、植物細胞及び微生物細胞などが挙げられる。これらの標的細胞は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
　なお、上述したヒトの個体から採取された細胞には、医薬品の研究開発などに用いられるヒトの個体に戻すことを前提としない細胞と、再生医療などに用いられるヒトの個体に戻すことを前提とする細胞とが含まれる。また、上述したヒトの個体から採取された細胞には、ヒトの個体から採取された細胞から培養された細胞も含まれる。
　さらに、上述したヒト以外の動物細胞及び植物細胞には、個体内に存在する細胞と、組織内に存在する細胞と、個体や組織から採取された細胞と、個体や組織から採取された細胞から培養された細胞と、が含まれる。
　ここで、別の側面から捉えれば、本発明に用いる標的細胞には、大腸菌、放線菌及び枯草菌などの原核細胞；並びに酵母、ヒト以外の動物細胞、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体に含まれる細胞及び植物細胞などの真核細胞が含まれる。
　標的細胞としては、血液由来細胞、接着細胞、及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
　前記血液由来細胞は、例えばＴ細胞などを含む。また、前記接着細胞は、例えばＨＥＫ２９３細胞、間葉系幹細胞、及び脂肪由来幹細胞などを含む。
　Ｔ細胞は、リンパ球の一種で、骨髄で産生された前駆細胞が胸腺（ｔｈｙｍｕｓ）での選択を経て分化成熟したものである。Ｔ細胞は、細胞表面に特徴的なＴ細胞受容体（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＣＲ）を有している。末梢血中のリンパ球の７０～８０％を占める。Ｔ細胞は末梢血から採取したもののほか、培養したものも用いることができる。Ｔ細胞は、ＣＤ３陽性細胞に含まれる。ＣＤ３陽性細胞としては、Ｔ細胞のほかにＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。Ｔ細胞の培養は、市販のＴ細胞用培地を用いて、公知のプロトコールに従って行うことができる。
　ＨＥＫ２９３細胞は、ヒト胎児腎細胞をアデノウイルスのＥ１遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株である。ＨＥＫ２９３細胞は、組培養のしやすさと遺伝子導入の容易さから、換えタンパク質生産や組換えアデノウイルス作製や増幅のための宿主などさまざまな用途にて利用されており、市販品を購入して利用できる。
　間葉系幹細胞（ＭＳＣ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ）は、成体内に存在する幹細胞の一種であり、中胚葉由来の組織である骨や軟骨、血管、心筋細胞に分化できる能力をもつ細胞である。１９６０年代、まず骨髄から発見され、ついで２０００年代には脂肪組織からも発見されており、ともに「間葉系幹細胞」と呼ばれている。近年では、外胚葉由来の神経細胞やグリア細胞（神経細胞を支持するなどの機能をもつ）、内胚葉由来の肝細胞にも分化できることが報告されている。
　脂肪由来幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の一種であり、脂肪組織から採取することができるＭＳＣである。脂肪由来のＭＳＣには、骨髄由来のＭＳＣに比べ、体内の含有量が多く、全身の脂肪組織から大量に採取することができる、臓器修復に寄与するＨＧＦ（肝細胞増殖因子）やＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）等の成長因子（再生促進因子）の産生が多い、免疫抑制能が高い、高齢者の脂肪組織から得たものであっても、問題なく増殖することができる、という有利な特徴がある。
　ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞，ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）は、体細胞へ４種類の遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）のように非常に多くの細胞に分化できる分化万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）と、分裂増殖を経てもそれを維持できる自己複製能を持たせた細胞である。
　さらに、本発明に用いる標的細胞には、赤血球ゴーストやリポソームなどの脂質二重膜構造をもつものも含まれる。
　また、本発明に用いる標的細胞は、特に処理を施されていないものであってもよいが、遺伝子の導入効率を向上するためには、遺伝子導入の際に一般的に用いられる、コンピータント細胞としての処理を施されたものであってもよい。具体例としては、塩化カルシウムで処理され、細胞膜の構造が変化してＤＮＡ分子を透析しやすくなった大腸菌のコンピータント細胞などが挙げられる。
　なお、本発明においては、複数の標的細胞に同時に遺伝子の導入を行うこともできる。この場合、複数の標的細胞は、同種の細胞であってもよく、異種の細胞であってもよい。又は、この複数の標的細胞は、異種の細胞を含むことも好ましい。また、この標的細胞は、ヒト以外の動物細胞、ヒト以外の動物個体、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体内の細胞、ヒトの個体、植物細胞、微生物細胞からなる群より選ばれる１種以上であることが望ましい。
　前記標的細胞は、組織に含まれていてもよい。標的細胞を含む組織を、本発明では標的組織ということがある。標的組織は特に特定の種類の組織に限定されるものではない。このような標的組織の具体例としては、移植に用いられるドナーからの臓器、再生医療の方法を用いて再構成された皮膚や歯根などの組織、カルス培養で構築された植物に分化前の組織、などが挙げられる。これらの標的組織は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
（プラズマ照射）
　導入工程において標的細胞に遺伝子を導入する方法としては、標的細胞にプラズマを照射して標的細胞の働きを活性化し、遺伝子を標的細胞の中に導入するプラズマ導入法を使用する。プラズマ導入法は、放電プラズマを標的細胞に照射して遺伝子を標的細胞に導入する手法である。この手法は、ウイルスを使わないため発がんのリスクは少なく、化学薬品を使わないため細胞の機能障害のリスクも少ないという利点を有する。そして、直接細胞に電流を流さないために細胞へのダメージも少なく、遺伝子を導入した細胞の生存率も高い。
　　本明細書において、プラズマとは以下の（１）、（２）及び（３）を満たすものと定義される。
（１）異符号の荷電粒子の集合で、全体としてほぼ電気的に中性であること。
（２）上記（１）のうち少なくとも１種の荷電粒子の集団が不規則な熱運動を行っていること。
（３）上記（１）及び（２）の荷電粒子がデバイ長よりも大きな寸法を有していること。
　なお、狭義には、プラズマは電離した気体を指す場合もあるが、本発明におけるプラズマは、気相における放電で生成したプラズマに限らず、液中の放電により生成したプラズマを含む。また、「プラズマを照射する」とは、プラズマを直接的に対象に接触させることに限らず、プラズマと周辺気体又は液体の反応により生成した活性種や、プラズマにより生じる紫外線等の電磁波、電子又は熱等を対象に作用させることを含む。
　プラズマを照射する工程は、第一のベクターを含む液体と標的細胞とを接触させている状態で、前記液体と標的細胞との近傍においてプラズマを発生させることを意味する。プラズマの照射条件については、後述する遺伝子導入装置の説明において詳述する。
　プラズマを照射する工程により、標的細胞のエンドサイトーシスが惹起される。その結果、第一及び第二のベクターが標的細胞内に導入される。プラズマを照射する工程は、第一のベクターを標的細胞に導入する工程の前に行われてもよく、第一のベクターを標的細胞に接触させる工程と、第一のベクターを標的細胞に導入する工程との間に行われてもよい。
　また、第二のベクターを標的細胞に導入する工程が、第一のベクターを標的細胞に導入する工程と同時に行われてもよい。例えば、第一及び第二のベクターを同時に標的細胞に接触させ、その後プラズマを標的細胞に照射する。プラズマ照射により標的細胞のエンドサイトーシスが惹起され、第一及び第二のベクターが同時に標的細胞に導入される。
（接触させる方法）
　前記第一のベクターを含む液体と前記標的細胞とを接触させる方法は特に限定されない。例えば、標的細胞を含む容器に、標的細胞上に接触するよう第一のベクターを含む液体を投入する等が挙げられる。
＜活性化工程＞
　活性化工程は、前記標的細胞の前記第一のベクターの発現を長期化させる第二のベクターを含む液体と前記標的細胞とを接触させる工程である。
　前記活性化工程は、前記導入工程の前及び後のいずれか一方又は両方において行われる。
（第二のベクターを含む液体）
　前記第二のベクターは、前記第一のベクターの目的配列をゲノムに移転させる酵素の配列を組込んでいるベクターであることが好ましい。
　前記目的配列は、例えば外来遺伝子配列である。具体例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質、Ｈｉｓタグ及びエピトープタグ等のタンパク質タグ、及びＣＡＲ（キメラ抗原受容体）をコードする遺伝子配列等が挙げられる。
　また、前記第二のベクターは、トランスポゼース遺伝子発現プラスミドであり、トランスポゼースをコードする遺伝子をもつヘルパープラスミドである。
　第二のベクターを含む液体は、上述した第二のベクターを含む溶液又は分散液であれば特に限定されない。例えば第二のベクターを緩衝液に溶解又は分散したものが挙げられる。前記緩衝液は、特に限定されないが、標的細胞への遺伝子導入効率に対する影響が無いか低いものであり、かつ、標的細胞に対する細胞毒性が無いか低いものが好ましい。
（標的細胞）
　上述した導入工程における標的細胞と同様である。
（接触させる方法）
　前記第二のベクターを含む液体と前記標的細胞とを接触させる方法は特に限定されない。例えば、前記活性化工程を前記導入工程の前に行う場合、標的細胞を含む容器に、標的細胞上に接触するよう第二のベクターを含む液体を投入する等が挙げられる。前記活性化工程を前記導入工程の後に行う場合、標的細胞及び第一のベクターを含む液体を含む容器に、標的細胞上に接触するよう第二のベクターを含む液体を投入する等が挙げられる。
　本発明における遺伝子導入方法は、さらに第一のベクター及び第二のベクターの少なくとも一方の導入効率を改善する物質（以降、導入効率改善剤と記載することがある）を添加する工程を含んでいてもよい。
　導入効率改善剤としては、サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。サイトカインは、例えばインターロイキン（以下「ＩＬ」と記載することがある。）、インターフェロン、ケモカイン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、及び増殖因子であり、ＩＬがより好ましく、活性化Ｔ細胞によって産生されるＩＬがさらに好ましく、インターロイキン－２（以下「ＩＬ２」と記載することがある。）及びインターロイキン－１５（以下「ＩＬ１５」と記載することがある。）がいっそう好ましい。
　導入効率改善剤は、液体と混合した状態で添加されてもよい。液体は、特に限定されないが、例えば導入効率改善剤を緩衝液に溶解又は分散したものが挙げられる。緩衝液は、特に限定されないが、標的細胞への分子導入効率に対する影響が無いか低いものであり、かつ、標的細胞に対する細胞毒性が無いか低いものが好ましい。
　導入効率改善剤を含む液体中の導入効率改善剤の濃度は特に限定されないが、ＩＬ２又はＩＬ１５の場合で、標的細胞が存在する系内、例えば標的細胞と接触する培地の濃度において１０～２０００ｎｇ／ｍＬであることが挙げられる。
　導入効率改善剤の添加のタイミングは、特に限定されない。例えば、標的細胞を含む溶液、例えば培地に導入効率改善剤を添加してもよい。例えば、導入効率改善剤を含む培地で標的細胞を培養後、第一のベクター及び第２のベクターを標的細胞に導入してもよい。また、第一のベクター及び第２のベクターの少なくとも一方を含む液体に導入効率改善剤を添加してもよい。
［遺伝子導入細胞の製造方法］
　本発明は、また、上述した遺伝子導入方法を用いる遺伝子導入細胞の製造方法を提供する。本発明の遺伝子導入細胞の製造方法は、第一のベクターを標的細胞に接触させる工程と、前記第一のベクターを前記標的細胞に導入する工程と、第二のベクターを前記標的細胞に接触させる工程と、前記第二のベクターを前記標的細胞に導入する工程と、前記標的細胞に、プラズマを照射する工程と、を含む。もう一つの側面として、本発明の遺伝子導入細胞の製造方法は、目的遺伝子を長期発現させる第一のベクターを含む液体と標的細胞とを接触させる導入工程、及び前記標的細胞の前記第一のベクターの発現を長期化させる第二のベクターを含む液体と前記標的細胞とを接触させる活性化工程を含み、前記導入工程の前及び後のいずれか一方又は両方に前記活性化工程を行い、前記導入工程において前記標的細胞にプラズマを照射する。
［遺伝子導入装置］
　以下、本発明の遺伝子導入方法に好適に用いることができる遺伝子導入装置について、一実施形態を挙げて説明する。
　本実施形態の遺伝子導入装置は、第一電極と、第二電極と、第一電極と第二電極との間に位置する照射場とを有する。
　遺伝子導入装置は、標的細胞に遺伝子を導入する。遺伝子導入装置は、第一電極からプラズマを生じ、標的細胞と遺伝子とが共存する照射対象に照射し、標的細胞に遺伝子を導入する。
　図１の遺伝子導入装置１は、第一電極１０と、第二電極２０と、給電部３０と、容器４０とを有する。
　第二電極２０は、第一電極１０と離間し、第一電極１０の下端（先端）の下方に位置している。即ち、第二電極２０は、第一電極１０の先端の先方に位置し、第一電極１０と第二電極２０とは対向している。
　給電部３０は、第一電極１０と第二電極２０とに接続されている。
　容器４０は、第一電極１０と第二電極２０との間に位置している。容器４０は、第二電極２０上に対置され、かつ第一電極１０と離間している。
　第一電極１０は、電極本体１２と、電極本体１２の先端に設けられた照射体１４とを有する。なお、本発明において、第一電極１０は、照射体１４のみで構成されていてもよい。
　本実施形態において、第一電極１０は、高圧電極である。
　電極本体１２は、一方向に延びる棒状体である。
　電極本体１２は、円筒状、多角筒状等の中空構造でもよいし、円柱状、多角柱状等の中実構造でもよい。中でも、電極本体１２は、中実構造であると、耐久性を高め、かつ製造が容易である。
　電極本体１２の材料としては、ステンレス、銅、タングステン等の金属、カーボン等を例示できる。
　電極本体１２の太さ（外径）Ｒ１２は、例えば１～５０ｍｍとされる。電極本体１２が多角筒状又は多角柱状である場合、外径Ｒ１２は電極本体１２の横断面の外接円の直径である。
　照射体１４は、平板状の基板部１５と、基板部１５の周縁から垂下する壁部１６とを有する。基板部１５と壁部１６とは接続している。図２は、第一電極１０を下端（即ち、第二電極２０の方向）から見た照射体１４の端面である。図２に示すように、壁部１６は、内部が中空で、下端（先端）に開口した円筒状である。壁部１６は、第一電極１０から第二電極２０に向かう方向を管軸Ｏ１とした、一重の円筒である。なお、壁部１６は、円筒状に限られず、多角筒状でもよい。符号１７は、壁部１６の内面を示す。符号１８は、壁部の外面を示す。
　基板部１５の材料としては、ステンレス、銅、タングステン等の金属、カーボン等を例示できる。
　壁部１６の材料としては、ステンレス、銅、タングステン等の金属、カーボン等を例示できる。
　基板部１５と壁部１６とは、一体成形物でもよいし、個々に成形されて接合されたものでもよい。
　電極本体１２が中空構造である場合、基板部１５には電極本体１２の内部と壁部１６の内部とを連通する貫通孔を有してもよく、有しなくてもよい。
　壁部１６の太さ（外径）Ｒ１６は、容器４０の大きさ等を勘案して適宜決定できる。外径Ｒ１６は、例えば１ｍｍ超が好ましく、３～５０ｍｍがより好ましく、５～１０ｍｍがさらに好ましい。外径Ｒ１６が上記下限値以上であると、プラズマをより広範囲に照射して、標的細胞への遺伝子の導入効率（以下、単に「導入効率」ということがある）をさらに高められる。外径Ｒ１６が上記上限値以下であると、安定した放電を生成しやすくなる。
　また、外径Ｒ１６は、外径Ｒ１２よりも大きいことが好ましい。外径Ｒ１６が大きいと、より広範囲にプラズマを照射して、導入効率をさらに高められる。
　壁部１６が多角筒状である場合、外径Ｒ１６は壁部１６の横断面の外接円の直径である。
　照射体１４が２以上の壁部１６を有する場合、壁部１６の外径Ｒ１６は、最も外側に位置する壁部１６の外径である。
　壁部１６の内径ｒ１６は、例えば０．１ｍｍ以上が好ましい。
　壁部１６が多角筒状である場合、内径ｒ１６は壁部１６の横断面の内接円の直径である。
　照射体１４が２以上の壁部１６を有する場合、壁部１６の内径ｒ１６は、最も内側に位置する壁部１６の内径である。
　壁部１６の下端面と壁部１６の外面とのなす角度θ１は、例えば６０°以下が好ましく、３０°以下がより好ましく、１０℃以下がさらに好ましい。壁部１６の下端面と壁部１６の外面との交点は、いわゆるエッジである。角度θ１が上記上限値以下であると、エッジに電界が集中して、電極間にプラズマをより容易に生じさせられる。
　壁部１６の下端面と壁部１６の内面とのなす角度は、角度θ１と同様である。壁部１６の下端面と壁部１６の内面とのなす角度は、角度θ１と同じでもよいし、異なってもよい。
　壁部１６の厚さｔ１６は、例えば１ｍｍ以下が好ましく、０．１ｍｍ以下がより好ましい。厚さｔ１６が上記上限値以下であると、端部の電界の強さをより高められる。
　壁部１６の高さｈ１６は、特に限定されず、例えば１～１０ｍｍが好ましい。
　第二電極２０は、設置電極として機能するものであればよく、例えば平板状の電極が挙げられる。
　第二電極２０の材料としては、ステンレス、銅、タングステン等の金属、カーボン等を例示できる。
　平面視において、第二電極２０の面積は、第一電極１０の面積よりも大きい。第二電極２０の面積が大きいと、第一電極１０から照射対象に対して、より広範囲にプラズマを照射できる。
　給電部３０は、第一電極１０と第二電極との間に電圧を印加し、両電極間にプラズマを生じることができればよい。給電部３０は、電極への電気の供給の開始又は停止を切り替える。また、給電部３０は、電極に印加する電圧及び周波数を調整する。給電部３０としては、例えば外部の電源と接続し、インバータを含む回路等を例示できる。また、給電部３０としては、二次電池を例示できる。
　本実施形態において、容器４０は、照射場として機能する。照射場は、後述する遺伝子の導入方法において、照射対象を位置させる場所であればよい。このため、容器４０を遺伝子導入装置１の構成の一部としない場合、容器４０を載置する第二電極２０を照射場としてもよい。
　容器４０は、照射対象を収容できればよく、例えばマイクロプレートの各ウェル等を例示できる。
　容器４０の内底面は、第一電極１０の先端（即ち、照射体１４）から離間している。
　容器４０の材料は、導電性材料でもよいし、絶縁性材料でもよい。但し、高電圧により局所的な放電が発生することを防ぐ観点から、絶縁性材料が好ましい。絶縁性材料としては、樹脂、セラミックス、ガラス等を例示できる。樹脂としては、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリエステル等を例示できる。
　制御部５０は、給電部３０及び図示していない液体添加部をコンピュータにより制御する。制御部５０のコンピュータは、演算ユニット（ＣＰＵ）、主記憶（メモリ）、記憶領域（ストレージ）、及び入出力（Ｉ／Ｏ）回路を備え、ストレージに記録されたプログラムを読み出し、メモリを作業領域として用いて、ＣＰＵによる処理を行う。
　制御部５０は、液体添加部に容器４０への第一のベクターを含む液体又は第二のベクターを含む液体の注入を行わせる液体注入ステップ、給電部３０に第一電極１０と第二電極２０との間に電圧を印加させる電圧印加ステップ、並びに前記液体注入ステップ及び前記電圧印加ステップの実行タイミングを制御する。
　液体添加部は、制御部５０からの指令により、容器４０への第一のベクターを含む液体又は第二のベクターを含む液体の注入を行う。
　本実施形態の遺伝子導入装置１は、さらに、容器４０内の標的細胞の画像を取得する画像取得部（図示せず）を備えていてもよい。
　この場合、制御部５０は、前記画像取得部からの画像データを解析して、液体添加部に容器４０への第一のベクターを含む液体又は第二のベクターを含む液体の注入を行わせる液体注入ステップ、給電部３０に第一電極１０と第二電極２０との間に電圧を印加させる電圧印加ステップ、並びに前記液体注入ステップ及び前記電圧印加ステップの実行タイミングを制御する。
　本発明の遺伝子導入方法における前記導入工程において、標的細胞等４４と第一のベクターを含む液体４２とが接触している状態で、容器４０内にプラズマを照射する。プラズマ照射を経ることで、標的細胞等４４に第一のベクターが導入される。なお、導入工程において、標的細胞等４４と第一のベクター及び第二のベクターを含む液体４２とが接触している状態で、容器４０内にプラズマを照射し、標的細胞等４４に第一のベクター及び第二のベクターが導入されてもよい。
　プラズマ照射においては、給電部３０から第一電極１０に給電し、第一電極１０と第二電極２０との間に電圧を印加する。
　電極間に電圧を印加すると、壁部１６の下端のエッジに電界集中が生じ、電界集中地点から第二電極２０に向けてプラズマが生じる。この際、壁部１６が円筒状となっているため、照射対象に対して、広範囲にプラズマを照射できる。広範囲にプラズマを照射すると、１回のプラズマ照射によって、照射対象の広範囲で第一のベクターを標的細胞等へ導入できる。このため、単位時間当たりの導入量を増やし、導入効率をより高められる。
　第一電極１０の下端（壁部１６の下端面）から、照射対象（第一のベクターと標的細胞等４４とが共存する液）までの距離Ｌ４０は、０．１～５ｍｍが好ましい。距離Ｌ４０が上記範囲内であると、プラズマをより安定して生成できる。
　第一電極１０と第二電極２０との間に印加する交流電圧は、１～３０ｋＶｐｐが好ましく、５～２０ｋＶｐｐがより好ましい。交流電圧を上記下限値以上とすると、導入効率をさらに高められる。交流電圧を上記上限値以下とすると、標的細胞等への損傷をより低減できる。交流電圧を表す単位「Ｖｐｐ（Ｖｏｌｔ　ｐｅａｋ　ｔｏ　ｐｅａｋ）」は、交流電圧波形の最高値と最低値との電位差である。
　第一電極１０と第二電極２０との間に印加する交流電流の周波数は、１～５００ｋＨｚが好ましく、１０～２００ｋＨｚがより好ましい。周波数を上記下限値以上とすると、導入効率をさらに高められる。周波数を上記上限値以下とすると、標的細胞等への損傷をより低減できる。
　照射工程におけるプラズマの照射時間は、例えば、１０ナノ秒間～１秒間が好ましく、１００ナノ秒間～０．１秒間がより好ましい。照射時間が上記下限値以上であると、標的細胞等４４への第一のベクター（あるいは、第一のベクター及び第二のベクター）の導入量をより高められる。照射時間が上記上限値以下であると、標的細胞等への損傷をより低減できる。
　照射工程において、容器４０内の環境は、特に限定されないが、例えば、ＣＯ２存在下としてもよい。ＣＯ２濃度は、例えば、１～１０体積％とされる。
［作用効果］
　本発明の遺伝子導入方法では、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン法にプラズマ照射によるベクター導入方法を組み合わせたトランスフェクションにより、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン法のみ、又はｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン法とエレクトロポレーション法（電気穿孔法）を組み合わせてトランスフェクションした場合に比べて、優れた遺伝子導入効率と遺伝子導入細胞の優れた生存率を達成することができた。
　以下では実験例によって本発明をより具体的に説明する。ただし、後述する実施例は本発明を限定するものではない。
　実験例１～３は実施例、実験例４～６は比較例である。
［実験例１］
〈分子導入装置〉
　図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
　第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
　電源周波数：５０ｋＨｚ
　放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
　放電時間：６０ｍｓ
　１ウェルあたりの放電箇所：４箇所
　ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
　電極端部と容器上面の離間距離：３ｍｍ
　ＤＮＡ量：ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ，２０μｇ，
　　　　　　ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ（＋ｍＣｈｅｒｒｙ），３０μｇ
　ＤＮＡ溶液：５０μＬ
　ＤＮＡ量：１ウェルあたり４０～５０μｇ
〈実験手順〉
　６ウェルプレートの各ウェルにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬを播種し、ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射までＨＥ１００培地にて４８～５４時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
　プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、表１に示すＴＩＲ配列間にｅＧＦＰ遺伝子を含むトランスポゾンベクター（ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ、第一のベクター）、ｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子とＰＢａｓｅを含むトランスポゼースベクター（ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ（＋ｍＣｈｅｒｒｙ）、第二のベクター）を添加した。
　プラズマ照射処理を行い（放電時間６０ｍｓ）、回復培地としてＨＥ１００培地を３ｍＬ添加した。
　ＣＯ２インキュベーターにて培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
　導入処理後、２日後、５日後、９日後、１２日後、１６日後、フローサイトメーターにより細胞全量（Ａｌｌ　Ｅｖｅｎｔｓ）、生細胞と推定されるゲート（Ｒ１）、ＧＦＰの蛍光が陽性（Ｒ４）を示す細胞数を測定した。同日に細胞を５日後以降は、細胞を１／８希釈し継続培養した。
　フローサイトメーターによる測定結果を図３～図５に、ＧＦＰ細胞数の割合を図６に、それぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実験例２］
　ＤＮＡ量を、以下のように変更した以外は実験例１と同様にして実験を行った。
ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ，２０μｇ
ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ（＋ｍＣｈｅｒｒｙ），２０μｇ
　フローサイトメーターによる測定結果を図３～図５に、ＧＦＰ細胞数の割合を図６に、それぞれ示す。
　また、遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡写真を図７～図１０に示す。図７はＧＦＰの蛍光を撮影したものであり、図８はｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を撮影したものであり、図９は図７及び図８をマージしたものであり、図１０は明視野観察像である。
［実験例３］
　ＤＮＡ量を、以下のように変更した以外は実験例１と同様にして実験を行った。
ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ，２０μｇ
ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ（＋ｍＣｈｅｒｒｙ），１０μｇ
　フローサイトメーターによる測定結果を図３～図５に、ＧＦＰ細胞数の割合を図６に、それぞれ示す。
［実験例４］
　ＤＮＡ量を、以下のように変更した以外は実験例１と同様にして実験を行った。
ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ，２０μｇ
ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ（＋ｍＣｈｅｒｒｙ），なし
　フローサイトメーターによる測定結果を図３～図５に、ＧＦＰ細胞数の割合を図６に、それぞれ示す。
　また、遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡写真を図１１～図１４に示す。図１１はＧＦＰの蛍光を撮影したものであり、図１２はｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を撮影したものであり、図１３は図１１及び図１２をマージしたものであり、図１４は明視野観察像である。
［実験例５］
　図１に概要を示す分子導入装置の代わりに電気穿孔法装置を用いた点を除いて、実験例２と同様にして実験を行った。
〈電気穿孔法装置　ＢｉｏＲＡＤ社　Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　ＸｃｅｌｌＴＭ〉
　電気穿孔法：１８０Ｖ，９５０μＦ，２８．４ｍｓｅｃ，４ｍｍキュベット
　ＤＮＡ量：ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ，２０μｇ
　　　　　　ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ（＋ｍＣｈｅｒｒｙ），２０μｇ
Ｏｐｔｉｍｅｍ　３５０μＬ
　フローサイトメーターによる測定結果を図３～図５に、ＧＦＰ細胞数の割合を図６に、それぞれ示す。
　また、遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡写真を図１５～図１８に示す。図１５はＧＦＰの蛍光を撮影したものであり、図１６はｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を撮影したものであり、図１７は図１５及び図１６をマージしたものであり、図１８は明視野観察像である。
［実験例６］
　プラズマ照射を行わなかったことを除いて実験例２と同様にして実験を行った。
　フローサイトメーターによる測定結果を図３～図５に、ＧＦＰ細胞数の割合を図６に、それぞれ示す。
　また、遺伝子導入後の標的細胞の顕微鏡写真を図１９～図２２に示す。図１９はＧＦＰの蛍光を撮影したものであり、図２０はｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を撮影したものであり、図２１は図１９及び図２０をマージしたものであり、図２２は明視野観察像である。
　実験例１～３では、標的細胞に対する目的遺伝子の導入効率及び目的遺伝子を導入した標的細胞の生存率が優れるとともに、目的遺伝子の長期発現を担保することができた。
　実験例４では、標的細胞に対する目的遺伝子の導入効率及び目的遺伝子を導入した標的細胞の生存率が優れていたが、目的遺伝子の長期発現を担保することができなかった。
　実験例５では、実験例１～３に比べて、目的遺伝子を導入した標的細胞の生存率が劣っていた。
　実験例６では、実験例１～３に比べて、標的細胞に対する目的遺伝子の導入効率が劣っていた。
［実験例７］
〈分子導入装置〉
　以下に示す分子導入装置を用いた。
　第一電極：直径３ｍｍのステンレススチール製円柱の一端を、肉厚０．５ｍｍのアルミナ製のキャップで被覆した。アルミナ製キャップの第二電極に対向する面にレーザー加工により直径０．１ｍの貫通孔を形成して、第一電極を作成した。
　電源周波数：５０ｋＨｚ
　放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
　放電時間：４０ｍｓ
　１ウェルあたりの放電箇所：９箇所
　ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
　電極端部と容器上面の離間距離：２ｍｍ
　ＤＮＡ量：ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ（ｗ／ｏ　Ｐｕｒｏ），２５μｇ
　　　　　　ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ，２５μｇ
　ＤＮＡ溶液：５０μＬ
　ＤＮＡ量：１ウェルあたり５０μｇ
〈実験手順〉
　６ウェルプレートの各ウェルにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬを播種し、ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射までＨＥ１００培地にて４８～５４時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
　プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、表１に示すＴＩＲ配列間にｅＧＦＰ遺伝子を含むトランスポゾンベクター（第一のベクター）としてｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ（ｗ／ｏ　Ｐｕｒｏ）、ＰＢａｓｅを含むトランスポゼースベクター（第二のベクター）としてｐＲＩ－Ｐｂａｓｅを添加した。
　プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、回復培地としてＨＥ１００培地を３ｍＬ添加した。
　ＣＯ２インキュベーターにて培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
　導入処理後、２日後、５日後、９日後、１２日後、１６日後、フローサイトメーターにより生細胞と推定されるゲート（Ｒ１）、ＧＦＰの蛍光が陽性（Ｒ４）を示す細胞数を測定した。同日に細胞を、５日後以降は、細胞を１／８希釈し継続培養した。
　フローサイトメーターによる生細胞数及びＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数の測定結果をそれぞれ図２３及び図２４に示す。
［実験例８］
　ＤＮＡ量を、以下のように変更した以外は実験例１と同様にして実験を行った。
ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ（ｗ／ｏ　Ｐｕｒｏ），２０μｇ
ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ，なし
　フローサイトメーターによる生細胞数及びＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数の測定結果をそれぞれ図２３及び図２４に示す。
［実験例９］
　分子導入装置の代わりに電気穿孔法装置を用いた点を除いて、実験例７と同様にして実験を行った。
〈電気穿孔法装置　ＢｉｏＲＡＤ社　Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　ＸｃｅｌｌＴＭ〉
　電気穿孔法：１８０Ｖ，９５０μＦ，３１．４ｍｓｅｃ，４ｍｍキュベット
　フローサイトメーターによる生細胞数及びＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数の測定結果をそれぞれ図２３及び図２４に示す。
［実験例１０］
　以下の条件とした点を除いて、実験例９と同様にして実験を行った。
〈電気穿孔法装置　ＢｉｏＲＡＤ社　Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　ＸｃｅｌｌＴＭ〉
　電気穿孔法：２５０Ｖ，９５０μＦ，２９．５ｍｓｅｃ，４ｍｍキュベット
　フローサイトメーターによる生細胞数及びＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数の測定結果をそれぞれ図２３及び図２４に示す。
［実験例１１］
　以下の条件とした点を除いて、実験例９と同様にして実験を行った。
〈電気穿孔法装置　ＢｉｏＲＡＤ社　Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　ＸｃｅｌｌＴＭ〉
　電気穿孔法：２５０Ｖ，５５０μＦ，１８．２ｍｓｅｃ，４ｍｍキュベット
　フローサイトメーターによる生細胞数及びＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数の測定結果をそれぞれ図２３及び図２４に示す。
［実験例１２］
　プラズマ照射を行わなかったことを除いて実験例７と同様にして実験を行った。
　フローサイトメーターによる生細胞数及びＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数の測定結果をそれぞれ図２３及び図２４に示す。
　図２３及び図２４に示す通り、トランスポゾンベクター及びトランスポゼースベクターをプラズマ照射により導入した実験例７ではＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数が最も高い結果となった。実験例７では、電気穿孔法を用いた実験例９と比較した場合でも遺伝子導入された細胞数が約１００倍多いことが分かった。
［実験例１３］
〈分子導入装置〉
　以下に示す分子導入装置を用いた。
　第一電極：実験例７と同じ第一電極を使用した。
　電源周波数：５０ｋＨｚ
　放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
　放電時間：８０ｍｓ
　１ウェルあたりの放電箇所：１箇所
　電極端部と容器上面の離間距離：１ｍｍ
　ＤＮＡ量：ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ，２μｇ
　　　　　　ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ，２μｇ
　ＤＮＡ溶液：４μＬ
　ＤＮＡ量：１ウェルあたり４μｇ
〈実験手順〉
　４８ウェルプレートの各ウェルにＣＤ３陽性細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞（ＥＣＡＣＣ、Ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ社製）２ｘ１０５個／ウェル／０．４ｍＬを播種し、ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射までＲＰＭＩ１６４０培地にて 
４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
　プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、表１に示すＴＩＲ配列間にｅＧＦＰ遺伝子を含むトランスポゾンベクター（第一のベクター）としてｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ、ＰＢａｓｅを含むトランスポゼースベクター（第二のベクター）としてｐＲＩ－Ｐｂａｓｅを添加した。
　プラズマ照射処理を行い（放電時間８０ｍｓ）、回復培地としてＲＰＭＩ１６４０培地を０．４ｍＬ添加した。
　ＣＯ２インキュベーターにて培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
　導入処理１日後に１０ｍｇ／ｍｌのＰｕｒｏｍｙｃｉｎを２μｇ／ｍｌ／ウェルとなるよう添加した。
　導入処理５日後、５％血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に交換してＰｕｒｏｍｙｃｉｎを除去した。
　導入処理後１２日後、１５日後、１９日後及び２６日後にフローサイトメーターにより生細胞と推定されるゲート（Ｒ１）、ＧＦＰの蛍光が陽性（Ｒ４）を示す細胞数を測定した。また、細胞を１／８希釈し継続培養した。
　フローサイトメーターによる生細胞数及びＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数の測定結果、並びに陽性細胞率（Ｒ４／Ｒ１）をそれぞれ図２５～２７に示す。
［実験例１４］
　ＤＮＡ量を、以下のように変更した以外は実験例１３と同様にして実験を行った。
ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ，２μｇ
ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ，なし
　フローサイトメーターによる生細胞数及びＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数の測定結果、並びに陽性細胞率（Ｒ４／Ｒ１）をそれぞれ図２５～２７に示す。
［実験例１５］
　ＤＮＡ量を、以下のように変更した以外は実験例１３と同様にして実験を行った。
ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ（ｗ／ｏ　Ｐｕｒｏ），２μｇ
ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ，なし
　フローサイトメーターによる生細胞数及びＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数の測定結果、並びに陽性細胞率（Ｒ４／Ｒ１）をそれぞれ図２５～２７に示す。
［実験例１６］
　プラズマ照射を行わなかったことを除いて実験例１３と同様にして実験を行った。
　フローサイトメーターによる生細胞数及びＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数の測定結果、並びに陽性細胞率（Ｒ４／Ｒ１）をそれぞれ図２５～２７に示す。
　図２５～２７に示す通り、トランスポゾンベクター及びトランスポゼースベクターをプラズマ照射によりＪｕｒｋａｔ細胞に導入した実験例１３ではＰｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択後、ＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数が最も高い値となり、導入後１５日以降では陽性細胞率が９０％以上となった。トランスポゼースベクターを含まない実験例１４～１５、プラズマ照射を行わなかった実験例１６では、細胞の増殖が見られなかった。
［実験例１７］
〈分子導入装置〉
　以下に示す分子導入装置を用いた。
　第一電極：実験例７と同じ第一電極を使用した。
　電源周波数：５０ｋＨｚ
　放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
　放電時間：８０ｍｓ
　１ウェルあたりの放電箇所：１箇所
　電極端部と容器上面の離間距離：１ｍｍ
　ＤＮＡ量：ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ，２μｇ，
　　　　　　ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ，２μｇ
　ＤＮＡ溶液：４μＬ
　ＤＮＡ量：１ウェルあたり４μｇ
〈実験手順〉
　４８ウェルプレートの各ウェルにＣＤ３陽性細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞（ＥＣＡＣＣ、Ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ社製）２ｘ１０５個／ウェル／０．４ｍＬを播種し、ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）及び５％血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地にて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
　プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、表１に示すＴＩＲ配列間にｅＧＦＰ遺伝子を含むトランスポゾンベクター（第一のベクター）としてｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ、ＰＢａｓｅを含むトランスポゼースベクター（第二のベクター）としてｐＲＩ－Ｐｂａｓｅを添加した。
　プラズマ照射処理を行い（放電時間８０ｍｓ）、回復培地としてＲＰＭＩ１６４０培地を３ｍＬ添加した。
　ＣＯ２インキュベーターにて培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
　導入処理１日後にフローサイトメーターにより生細胞と推定されるゲート（Ｒ１）、ＧＦＰの蛍光が陽性（Ｒ４）を示す細胞数を測定した。
　上述の細胞数から得られた導入効率（Ｒ４／Ｒ１）を図２８に示す。
［実験例１８］
　１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２の代わりに１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を添加したことを除いて実験例１６と同様にして実験を行った。
　Ｒ１及びＲ４から算出される導入効率（Ｒ４／Ｒ１）を図２８に示す。
［実験例１９］
　１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２を添加しなかったことを除いて実験例１６と同様にして実験を行った。
　Ｒ１及びＲ４から算出される導入効率（Ｒ４／Ｒ１）を図２８に示す。
　実験例１９の導入効率を１００％とすると、ＩＬ２を添加した実験例１７及びＩＬ１５を添加した実験例１８は、導入効率が１３０～１４４％となり、導入効率の向上が見られた。
［実験例２０］
　以下の手順により、標的細胞の標的塩基配列ＴＴＡＡに目的遺伝子が挿入されているかを確認した。
　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（登録商標）２．０（タカラバイオ社製　製品コード６３６４０５）を用いてゲノムウォーキングを行った。実験例１３にて得られたトランスポゾンベクター及びトランスポゼースベクターが導入された細胞からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｔｉｓｓｕｅ（タカラバイオ社製、製品コード：７４０９５２．１０）によりゲノム遺伝子を回収した。回収されたゲノム遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＶ（タカラバイオ社製、製品コード：１０４２Ａ）を用いて処理した。制限酵素処理したゲノム遺伝子にＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ　Ａｄａｐｔｏｒｓを付与し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒに含まれる「Ａｄａｐｔｏｒ　Ｐｒｉｍｅｒ　１　（ＡＰ１）」と導入トランスポゾンベクター特異的プライマー（AAGTTATCACGTAAGTAGAACATG、配列番号６）を用いて、１次ＰＣＲを以下の条件で実施した。
<１次ＰＣＲ条件>
　７ｃｙｃｌｅｓ：各サイクルにつき９４℃、２５ｓｅｃの後、７２℃、３ｍｉｎ
　３２ｃｙｃｌｅｓ：各サイクルにつき９４℃、２５ｓｅｃの後、６７℃、３ｍｉｎ
　６７℃、７ｍｉｎ
　１次ＰＣＲ産物を用いて、２次ＰＣＲを以下の条件で実施した。図２９に示す通り、ＧＷ１及びＧＷ２に相当する断片の増幅が確認された。図２９においてＭＫはマーカーを、ＧＷは二次ＰＣＴ産物のレーンを示す。
<２次ＰＣＲ条件>
　５ｃｙｃｌｅｓ：各サイクルにつき９４℃、２５ｓｅｃの後、７２℃、３ｍｉｎ
　２０ｃｙｃｌｅｓ：各サイクルにつき９４℃、２５ｓｅｃの後、６７℃、３ｍｉｎ
　６７℃、７ｍｉｎ
　得られた断片ＧＷ１（配列番号７）及び断片ＧＷ２（配列番号８）をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ―Ｕｐ（タカラバイオ社製、製品コード：７４０６０９．５０）で抽出精製後、塩基配列解析を行った結果、配列は、それぞれ表２に示す通りであった。下線部は、挿入された目的配列を示す。ＴＴＡＡ配列以降は、標的細胞のゲノム配列である。標的細胞のゲノムの標的塩基配列ＴＴＡＡの位置に目的遺伝子が挿入されていることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実験例２１］
〈分子導入装置〉
　以下に示す分子導入装置を用いた。
　第一電極：実験例７と同じ第一電極を使用した。
　電源周波数：５０ｋＨｚ
　放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
　放電時間：８０ｍｓ
　１ウェルあたりの放電箇所：１箇所
　電極端部と容器上面の離間距離：１ｍｍ
　ＤＮＡ量：ｐＢＲ－ＴＰＶ－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｐｕｒｏ，２μｇ，
　　　　　　ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ，２μｇ
　ＤＮＡ溶液：４μＬ
　ＤＮＡ量：１ウェルあたり４μｇ
〈実験手順〉
　４８ウェルプレートの各ウェルにＣＤ３陽性細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞（ＥＣＡＣＣ、Ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ社製）２ｘ１０５個／ウェル／０．４ｍＬを播種し、ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射までＲＰＭＩ１６４０培地にて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
　プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、表１に示すＴＩＲ配列間にｅＧＦＰ遺伝子を含むトランスポゾンベクター（第一のベクター）としてｐＢＲ－ＴＰＶ－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｐｕｒｏ、ＰＢａｓｅを含むトランスポゼースベクター（第二のベクター）としてｐＲＩ－Ｐｂａｓｅを添加した。
　プラズマ照射処理を行い（放電時間８０ｍｓ）、回復培地としてＲＰＭＩ１６４０培地を３ｍＬ添加した。
　ＣＯ２インキュベーターにて培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
　導入処理１日後に２μｇ／ｍｌのＰｕｒｏｍｙｃｉｎを２μｇ／ｍｌ／ウェルとなるよう添加した。
　導入処理５日後、５％血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に交換してＰｕｒｏｍｙｃｉｎを除去した。
　導入処理後１２日後、１５日後、１９日後に培地交換しながら細胞を１／８希釈しRPMI１６４０培地にて継代培養した。
　導入処理後２６日後の細胞３×１０４ｃｅｌｌｓに対し、以下の抗体をそれぞれ１μＬ添加し、４℃で３０分間静置し、染色した。その後、フローサイトメーターにより生細胞と推定されるゲート（Ｒ１）を測定した（実験例２１－１）。
（抗体）
　ＣＤ１９－ＣＡＲ－ＰＥ（Ａｎｔｉ－ＦＭＣ６３　Ｉｄｉｏｔｙｐｅ、品番１３０－１２７－３４２、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）
　ＩｇＧ－ＰＥ（ＲＥＡ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ１,ＰＥ,ＲＥＡｆｉｎｉｔｙ（登録商標）、品番１３０－１１３－４５０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）
　ＣＤ３－ＦＩＴＣ（ＢＤ（登録商標）　ＣＤ３　ＦＩＴＣ、品番３４９２０１、ＢＤ社製）
　以上の実験をもう一度繰り返した（実験例２１－２）。
　フローサイトメーターによるＣＤ１９－ＣＡＲ－ＰＥ陽性細胞数（縦軸）及びＣＤ３－ＦＩＴＣ陽性細胞数（横軸）の測定結果を図３０に示す。
［実験例２２］
　ｐＢＲ－ＴＰＶ－ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｐｕｒｏ及びｐＲＩ－Ｐｂａｓｅを添加しなかったこと以外は実験例２１と同じ手順で実験を行った。
　フローサイトメーターによるＣＤ１９－ＣＡＲ－ＰＥ陽性細胞数（縦軸）及びＣＤ３－ＦＩＴＣ陽性細胞数（横軸）の測定結果を図３０に示す。
　図３０において、一段目はＣＤ１９－ＣＡＲ－ＰＥ及びＣＤ３－ＦＩＴＣを添加した結果、二段目はＩｇＧ－ＰＥ及びＣＤ３－ＦＩＴＣ、三段目はＣＤ１９－ＣＡＲ－ＰＥのみを添加した結果、四段目は抗体を添加しなかった結果（つまりコントロール）を示している。
　一段目では実験例２１－１及び２１－２においてＣＤ１９－ＣＡＲ－ＰＥ及びＣＤ３－ＦＩＴＣの双方に対して陽性であることが確認された。一方で、実験例２２では、ＣＤ３－ＦＩＴＣに対して陰性であることが確認された。
　二段目ではＣＤ３－ＦＩＴＣのネガティブコントロールであるＩｇＧ－ＰＥが添加されており、実験例２１－１、２１－２及び２２においてＩｇＧ－ＰＥに対し陰性であることが確認された。
　三段目では実験例２１－１及び２１－２においてＣＤ１９－ＣＡＲ－ＰＥに対して陽性であることが確認された。一方で、実験例２２では、ＣＤ１９－ＣＡＲ－ＰＥに対して陰性であることが確認された。
　以上の結果から、実験例２１－１及び２１－２では、Ｊｕｒｋａｔ細胞にＣＤ１９－ＣＡＲ遺伝子が導入されたといえる。つまり、ＣＤ３陽性細胞にＣＤ１９－ＣＡＲ遺伝子が導入されたといえる。
［配列一覧］
●配列番号１／配列名称：ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ／配列長：８３３２ｂｐ
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●配列番号２／配列名称：ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ（＋ｍＣｈｅｒｒｙ）／配列長：７５５８ｂｐ
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●配列番号３／配列名称：ｐＢＲ－ＴＰＶ－ｅＧＦＰ（ｗ／ｏ　Ｐｕｒｏ）／配列長：５７０４ｂｐ
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●配列番号４／配列名称：ｐＲＩ－Ｐｂａｓｅ／配列長：５９５７ｂｐ
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●配列番号５／配列名称：ｐＢＲ－ＴＰＶ－ＣＤ１９ＣＡＲ―Ｐｕｒｏ／配列長：８５４６ｂｐ
ttaaccctagaaagatagtctgcgtaaaattgacgcatgcattcttgaaatattgctctctctttctaaatagcgcgaatccgtcgctgtgcatttaggacatctcagtcgccgcttggagctcccgtgaggcgtgcttgtcaatgcggtaagtgtcactgattttgaactataacgaccgcgtgagtcaaaatgacgcatgattatcttttacgtgacttttaagatttaactcatacgataattatattgttatttcatgttctacttacgtgataacttattatatatatattttcttgttatagatatcatcaactttgtatagaaaagttgggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggtctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaaacccagctttcttgtacaaagtggtgatcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgctggctgccatgaacaaaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattccttattccatagaaaagccttgacttgaggttagattttttttatattttgttttgtgttatttttttctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcctgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatggagatccctcgacctgcagcccaagcttcgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcgccaccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgactcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggctcgagttaattaacgagagcataatattgatatgtgccaaagttgtttctgactgactaataagtataatttgtttctattatgtataggttaagctaattacttattttataatacaacatgactgtttttaaagtacaaaataagtttatttttgtaaaagagagaatgtttaaaagttttgttactttatagaagaaattttgagtttttgtttttttttaataaataaataaacataaataaattgtttgttgaatttattattagtatgtaagtgtaaatataataaaacttaatatctattcaaattaataaataaacctcgatatacagaccgataaaacacatgcgtcaattttacgcatgattatctttaacgtacgtcacaatatgattatctttctagggttaaataatagtttctaatttttttattattcagcctgctgtcgtgaataccgagctccaattcgccctatagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctcgaaattaaccctcactaaagggaacaaaagctggtacctcgcgcgacttggtttgccattctttagcgcgcgtcgcgtcacacagcttggccacaatgtggtttttgtcaaacgaagattctatgacgtgtttaaagtttaggtcgagtaaagcgcaaatctttt
●配列番号６／配列名称：Ｐｒｉｍｅｒ／配列長：２４ｂａｓｅ
aagttatcacgtaagtagaacatg
●配列番号７／配列名称：ＧＷ１／配列長：１１３ｂａｓｅ
gaatgcatgcgtcaattttacgcagactatctttctagggttaagcattaggctcacctcctagctgaaatacatcttgattgtttacatcaaagaatctgagtaggttaaaa
●配列番号８／配列名称：ＧＷ２／配列長：７０ｂａｓｅ
gaatgcatgcgtcaattttacgcagactatctttctagggttaagcacctaataagcacttattaatatt
　１　分子導入装置、１０　第一電極、１２　電極本体、１４　照射体、１６　壁部、２０　第二電極、３０　給電部、４０　容器、４２　分子、４４　標的細胞、Ｏ１　管軸、θ１　角度

Claims (12)

  1. 　第一のベクターを標的細胞に接触させる工程と、
    　前記第一のベクターを前記標的細胞に導入する工程と、
    　第二のベクターを前記標的細胞に接触させる工程と、
    　前記第二のベクターを前記標的細胞に導入する工程と、
    　前記標的細胞に、プラズマを照射する工程と、
    を含む、遺伝子導入方法。
  2. 　前記プラズマを照射する工程が、前記第一のベクターを前記標的細胞に導入する工程の前に行われる、請求項１に記載の遺伝子導入方法。
  3. 　前記第二のベクターを前記標的細胞に導入する工程が、前記第一のベクターを前記標的細胞に導入する工程と同時に行われる、請求項１に記載の遺伝子導入方法。
  4. 　前記第二のベクターは、前記第一のベクターの目的配列をゲノムに移転させる酵素の配列を組込んでいるベクターである、請求項１又は２に記載の遺伝子導入方法。
  5. 　前記第一のベクターは、下記項目（１）又は（２）の核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターである、請求項１又は２に記載の遺伝子導入方法。
    （１）トランスポゾン遺伝子の５’側逆方向反復配列及び３’側逆方向反復配列があり、これらの配列間に位置する組換え反応が生じる場の配列。
    （２）トランスポゾン遺伝子の５’逆向き反復配列／直列反復配列及び３’逆向き反復配列／直列反復配列があり、これらの配列間に位置する組換え反応が生じる場の配列。
  6. 　前記第一のベクターは、上記項目（１）又は（２）に加え、さらに下記項目（３）の核酸断片が挿入された改変トランスポゾンベクターである、請求項５に記載の遺伝子導入方法。
    （３）トランスポゾン遺伝子の５’側逆方向反復配列と３’側逆方向反復配列との間、又は５’逆向き反復配列／直列反復配列及び３’逆向き反復配列／直列反復配列の間に位置する、制限酵素認識部位又は外来遺伝子発現カセット。
  7. 　前記第一のベクターと前記第二のベクターのモル比が１：０．１～１：１０である、請求項１又は２に記載の遺伝子導入方法。
  8. 　前記標的細胞が、血液由来細胞、接着細胞、及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の遺伝子導入方法。
  9. 　前記血液由来細胞がＣＤ３陽性細胞を含む、請求項８に記載の遺伝子導入方法。
  10. 　前記第一のベクターがキメラ抗原受容体をコードする遺伝子配列を含む、請求項９に記載の遺伝子導入方法。
  11. 　前記ＣＤ３陽性細胞がＴ細胞を含む、請求項９に記載の遺伝子導入方法。
  12. 　前記接着細胞がＨＥＫ２９３Ｆ細胞、間葉系幹細胞及び脂肪由来幹細胞を含む、請求項８に記載の遺伝子導入方法。
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