CN105408473B - 工程化嵌合抗原受体(car)t细胞的人应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于使用包含嵌合抗原受体(CAR)的经修饰的T细胞的免疫疗法的方法和组合物。在具体方面，使用与基于转座子的整合系统结合的电穿孔来产生表达CAR的T细胞，以产生表达CAR的细胞的群体，所述表达CAR的细胞需要最小限度的离体扩增或可被直接向患者施用以进行疾病(例如，癌症)治疗。

Description

工程化嵌合抗原受体(CAR)T细胞的人应用
本申请要求2013年5月14日提交的美国临时专利申请第61/823,253号的权益，所述美国临时专利申请的完整内容通过引用并入本文。
本发明在由国防部授予的第W81XWH-11-1-0002-01号基金下借助政府支持进行。政府具有本发明的某些权利。
序列表的并入
文件中包含的称为“UTFC.P1222WO_ST25.txt”的序列表(其在Microsoft
Figure BDA0000904213610000011
中测量为37KB并且创建于2014年5月14日)以电子形式一起提交并且通过引用并入本文。
发明背景
1.发明领域
本发明总体上涉及医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学领域。在某些方面，本发明的领域涉及免疫疗法。更具体地，其涉及临床级嵌合抗原受体(CAR)T细胞的生产和使用此类细胞的治疗方法。
2.相关领域的描述
临床级T细胞的效力可以通过将基因疗法与免疫疗法组合以工程化生物制品来改善，所述生物制品具有获得优异的(i)肿瘤相关抗原(TAA)的识别，(ii)输注后的持续性，(iii)迁移至肿瘤部位的潜力，和(iv)在肿瘤微环境内再循环效应子功能的能力的潜力。此类基因疗法与免疫疗法的组合可重定向T细胞对于B谱系抗原的特异性并且具有晚期B细胞恶性肿瘤的患者从此类肿瘤特异性T细胞的输注获益(Jena等，2010；Till等，2008；Porter等，2011；Brentjens等，2011；Cooper和Bollard,2012；Kalos等，2011；Kochenderfer等，2010；Kochenderfer等，2012；Brentjens等，2013)。大多数遗传操纵针对人应用工程化的T细胞的方法已使用逆转录病毒和慢病毒来稳定地表达嵌合抗原受体(CAR)(Jena等，2010；Ertl等，2011；Kohn等，2011)。该方法，尽管遵从现行良好生产操作规程(cGMP)，但可能昂贵的，因为其依赖于临床级重组病毒从有限数量的生产设施的制造和释放。需要新的方法来产生具有针对恶性血液病和实体瘤的特异性的经遗传修饰的临床级T细胞产物。
发明概述
在第一实施方案中，提供了在患有疾病的人受试者中提供T细胞应答的方法，其包括从所述受试者获得细胞样本，(包含T细胞或T细胞的祖细胞)；用能够整合进细胞的基因组的编码嵌合T细胞受体(CAR)的核酸转染细胞；和向所述受试者施用有效量的转基因细胞以提供T细胞应答。
因此，在一些方面，实施方案的方法包括：(a)从受试者获得细胞样本，所述样本包含T细胞或T细胞的祖细胞；(b)用编码侧接转座子的嵌合抗原受体(CAR)和有效地将编码CAR的DNA整合进细胞的基因组的转座酶的DNA转染细胞，以提供表达转基因CAR的细胞的群体；(c)任选地在选择性增强表达CAR的T细胞的增殖的培养基中离体培养转基因CAR细胞的群体，其中培养所述转基因CAR细胞，如果有的话，不超过21天；和(d)向所述受试者施用有效量的转基因CAR细胞以提供T细胞应答。因此，在一些方面，将所述转基因CAR细胞离体培养少于21天，诸如为少于18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2天或更短时间。在某些方面，将CAR细胞离体培养不超过3至5天。在另一个方面，在不超过21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天内完成本方法的步骤(a)-(d)(即，获取细胞样本以施用CAR T细胞)。
在另一个方面，根据实施方案的在患有疾病的人受试者中提供T细胞应答的方法包括：(a)从所述受试者获得细胞样本，所述样本包含T细胞或T细胞的祖细胞并且当从受试者获得时具有约20至200ml的初始体积；(b)用编码侧接转座子的嵌合抗原受体(CAR)和有效地将编码CAR的DNA整合进细胞的基因组的转座酶的DNA转染细胞，以提供表达转基因CAR的T细胞群体；(c)任选地在选择性增强表达CAR的T细胞的增殖的培养基中离体培养转基因CAR细胞的群体；和(d)向所述受试者施用有效量的转基因CAR T细胞以提供T细胞应答。例如，来自受试者的细胞样本可以为少于约200ml的外周血或脐带血样本。在一些方面，样本可以通过血浆分离置换来收集。然而，在某些优选方面，通过不涉及血浆分离置换的方法(例如，通过静脉穿刺)收集样本。在另一个方面，细胞样本具有少于约175、150、125、100、75、50或25ml的初始体积(例如，当获自受试者时，细胞样本具有约50至200ml、约50至100ml或100至200ml的初始体积)。
在另一个实施方案中，提供了分离的转基因细胞，其包含靶向HERV-K的包膜蛋白的表达的CAR。在某些方面，所述细胞包含编码被整合进细胞的基因组的CAR的DNA(例如，侧接转座子重复序列的CAR DNA)。例如，所述CAR序列可包含单克隆抗体6H5的CDR序列(例如，CDR 1-6)或单克隆抗体6H5的scFV序列。在一些方面，HERV-K-靶向CAR与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，与SEQ ID NO:4具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列)。在某些方面，实施方案的细胞(例如，人HERV-K-靶向CAR细胞)可用于治疗患有表达HERV-K的癌症的受试者(或在受试者中提供免疫应答)。
在另一个实施方案中，提供了分离的转基因细胞，其包含表达的CAR和表达的膜结合的IL-15。例如，在一些方面，所述膜结合的IL-15包括IL-15与IL-15Rα之间的融合蛋白。在另一个方面，所述膜结合的IL-15包含与SEQ ID NO：6(在本文中称为mIL15)具有至少约85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列。如本文中进一步详细描述的，在一些情况下，所述膜结合的IL-15由RNA或DNA(例如，染色体外或附加型载体)编码。在某些方面，所述细胞包含编码整合进细胞的基因组中的膜结合的IL-15的DNA(例如，侧接转座子重复序列的编码DNA)。在某些方面，实施方案的细胞(例如，人CAR细胞，表达膜结合的细胞因子)可用于治疗具有低水平的靶抗原的受试者，诸如具有最小残留疾病(如本文中进一步描述的)的受试者(或在受试者中提供免疫应答)。
在一些方面，实施例的方法涉及用编码嵌合T细胞受体(CAR)和在一些情况下转座酶的DNA转染细胞。转染细胞的方法在本领域中是公知的，但在某些方面，使用高效的转染方法诸如电穿孔。例如，可使用核转染装置将核酸引入细胞。优选地，转染步骤不涉及用病毒感染或转导细胞，所述感染或转导可在被治疗的受试者中引起基因毒性和/或导致针对含有病毒序列的细胞的免疫应答。
实施方案的其它方面涉及利用编码CAR的表达载体转染细胞。许多CAR构建体和用于其的表达载体在本领域中是已知的并且在本文中进一步详述。例如，在一些方面，CAR表达载体是DNA表达载体诸如质粒、线性表达载体或附加体。在一些方面，所述载体包含额外的序列，诸如促进CAR表达的序列，诸如启动子、增强子、多聚腺苷酸信号和/或一个或多个内含子。在优选的方面，CAR编码序列侧接转座子序列，以便转座酶的存在允许编码序列整合进转染细胞的基因组中。
正如上文所述，在某些方面，细胞用促进CAR编码序列整合至转染细胞的基因组中的转座酶进一步转染。在一些方面，将转座酶提供为DNA表达载体。然而，在优选的方面，将转座酶提供为可表达的RNA或蛋白质，以便转座酶的长期表达不在转基因细胞中发生。例如，在一些方面，将转座酶提供为mRNA(例如，包含帽和多聚腺苷酸尾的mRNA)。可按照实施方案使用任何转座系统。然而，在一些方面，转座酶是鲑鱼型Tc1样转座酶(SB)。例如，转座酶可以是所谓的“睡美人(Sleeping Beauty)”转座酶，参见，例如，美国专利6,489,458，其通过引用并入本文。在某些方面，转座酶是具有增加的酶促活性的工程化酶。转座酶的一些具体实例包括，但不限于，SB10、SB11或SB100x转座酶(参见，例如，Mates等，2009，通过引用并入本文)。例如，方法可牵涉用编码SB10、SB11或SB100x转座酶的mRNA对细胞进行电穿孔。
在另一个方面，实施方案的转基因CAR细胞还包含用于表达刺激T细胞增殖和/或存活的膜结合的细胞因子的表达载体。具体地，包含此类细胞因子的CAR细胞可因由细胞因子表达提供的刺激而在几乎不与或不与活化和增殖细胞(AaPC)或人工抗原呈递细胞(aAPC)一起离体培养的情况下增殖和/或维持。同样地，此类CAR细胞甚至在大量被CAR识别的抗原不存在时(例如，如在处于缓解的癌症患者或具有最小残留疾病的患者的情况下)亦可在体内增殖。在一些方面，CAR细胞包含用于Cγ细胞因子和元件(例如，跨膜结构域)表达以提供细胞因子的表面表达的DNA或RNA表达载体。例如，CAR细胞可包含IL-7、IL-15或IL-21的膜结合形式。在一些方面，通过细胞因子编码序列与细胞因子的受体的融合将细胞因子栓系于膜。例如，细胞可包含用于IL-15-IL-15Rα融合蛋白(例如，包含SEQ ID NO：6的序列的蛋白质)表达的载体。在另一个方面，编码膜结合的Cγ细胞因子的载体是DNA表达载体，诸如被整合进CAR细胞的基因组的载体或染色体外载体(例如，和附加型载体)。在另一个方面，膜结合的酶Cγ细胞因子的表达在诱导型启动子(例如，药物诱导型启动子)的控制之下，以便可通过诱导或抑制启动子活性来控制所述细胞因子在CAR细胞中的表达(和由此CAR细胞的增殖)。
实施方案的方面涉及从患者获得包含NK细胞、NKT细胞、T细胞或T细胞的祖细胞的样本。例如，在某些情况下，样本是脐带血样本、外周血样本(例如，单核细胞级分)或来自受试者的包含多能细胞的样本。在一些方面，可培养来自受试者的样本以产生诱导的多能干(iPS)细胞，并且这些细胞用于产生NK细胞、NKT细胞或T细胞。细胞样本可直接从受试者培养，或可在使用前将其冷冻保存。在一些方面，获得细胞样本包括采集细胞样本。在其它方面，通过第三方获得样本。在另一个方面，可处理来自受试者的样本以纯化或富集样本中的T细胞或T细胞的祖细胞。例如，可使样本经历梯度纯化、细胞培养选择和/或细胞分选(例如，通过荧光激活细胞分选(FACS))。
在一些方面，实施方案的方法还包括、获得、产生或使用抗原呈递细胞。例如，所述抗原呈递细胞可以是树突细胞、活化和增殖细胞(AaPC)，或失活的(例如，辐照的)人工抗原呈递细胞(aAPC)。用于产生此类aAPC的方法在本领域中是已知的，并在本文中进一步详述。因此，在一些方面，将转基因CAR细胞与失活的aAPC离体共培养有限的时间段，以扩增所述CAR细胞群体。可在包含例如白细胞介素-21(IL-21)和/或白细胞介素-2(IL-2)的培养基中进行CAR细胞与aAPC共培养的步骤。在一些方面，以约10:1至约1:10、约3:1至约1:5或约1:1至约1:3的CAR细胞与失活的aAPC的比率进行共培养。例如，可以以约1:1、约1:2或约1:3的比率共培养CAR细胞和aAPC。
在一些方面，将用于CAR细胞的培养的细胞诸如AaPC或aAPC工程化以表达增强CAR细胞的生长的特定多肽。例如，所述细胞可包含(i)被转基因CAR细胞上表达的CAR靶向的抗原；(ⅱ)CD64；(ⅱ)CD86；(ⅲ)CD137L；和/或(v)aAPC的表面上表达的膜结合的IL-15。在一些方面，所述AaPC或aAPC包含在AaPC或aAPC的表面上表达的CAR结合抗体或其片段。优选地，测试用于本方法的AaPC或aAPC的感染物质并确认所述感染物质不存在和/或测试所述AaPC或aAPC并确认其失活和是非增殖性的。
虽然对AaPC或aAPC的扩增可增加培养中的CAR细胞的数目或浓度，但该方法太费力且昂贵。此外，在一些方面，应当在尽可能短的时间内用转基因CAR细胞重新输注需要治疗的受试者。因此，在一些方面，离体培养转基因CAR细胞(c)不超过14天，不超过7天或不超过3天。例如，可进行离体培养(例如，在AaPC或aAPC存在的情况下培养)，达到转基因CAR细胞的少于一次群体倍增。在另一个方面，不在AaPC或aAPC存在的情况下离体培养所述转基因细胞。
在另一个方面，实施方案的方法包括用于在细胞的转染(步骤(b))后或在细胞的离体扩增(步骤(c))后富集细胞群体的表达CAR的T细胞的步骤。例如，所述富集步骤可包括细胞的分选(例如，通过FACS)，例如，通过使用被CAR或CAR结合抗体结合的抗原。在另一个方面，所述富集步骤包括耗竭所述非T细胞或耗竭缺乏CAR表达的细胞。例如，可从细胞群体耗竭CD56+细胞。在另一个方面，当向受试者施用细胞时保存CAR细胞的样本(或在培养中维持)。例如，可冷冻保存样本以待以后扩增或分析。
在某些方面，使实施方案的转基因CAR细胞的内源T细胞受体和/或内源HLA的表达失活。例如，T细胞可被工程化来消除内源α/βT细胞受体(TCR)的表达。在具体实施方案中，将CAR+T细胞遗传修饰以消除TCR的表达。在一些方面，使用锌指核酸酶(ZFN)破坏表达CAR的T细胞中的T细胞受体α/β。在某些方面，例如通过使用锌指核酸酶敲除表达CAR的T细胞中的T细胞受体αβ链。
如本文中进一步详述的，实施方案的CAR细胞可用于治疗许多疾病和病况。可通过将CAR细胞靶向抗原来治疗基本上任何牵涉特定抗原的特异性或增强的表达的疾病。例如，自身免疫性疾病、感染和癌症可用本发明的方法和/或组合物来治疗。这些疾病包括癌症，诸如原发性癌症、转移性癌症、复发性癌症、对治疗敏感的癌症、难治性癌症(例如，化疗难治性癌症)。癌症可以是血液癌、肺癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胃癌、子宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌、垂体癌、食道癌、脾癌、皮肤癌、骨癌等(例如，B细胞淋巴瘤或黑素瘤)。在癌症治疗的情况下，CAR细胞通常靶向癌细胞抗原(也称为肿瘤相关抗原(TAA))。
在另一个方面，实施方案的转基因CAR细胞可用于治疗具有最小残留疾病的受试者(例如，具有极低量的存在的CAR靶向抗原的受试者)，诸如处于明显缓解的癌症患者。通过使用高度灵敏的诊断技术，可在不表现明显癌症症状的患者中检测到癌症相关抗原(或癌细胞)。可通过本方法治疗此类患者以通过利用抗原靶向CAR细胞消除残留疾病。在优选实施方案中，用于残留疾病的靶向的转基因CAR细胞还包含膜结合的增殖的细胞因子的表达，因为这些细胞将保留在体内扩增(尽管量少)以靶向抗原的能力。
实施方案的方法可用于制造(例如，用于临床试验)用于多种肿瘤抗原(例如，CD19、ROR1、CD56、EGFR、CD123、c-met、GD2)的CAR+T细胞。使用该技术产生的CAR+T细胞可用于治疗具有白血病(AML、ALL、CML)、感染和/或实体瘤的患者。例如，实施方案的方法可用于治疗细胞增殖性疾病、真菌、病毒、细菌或寄生虫感染。可被靶向的病原体包括，但不限于，疟原虫、锥虫、曲霉属(Aspergillus)、念珠菌属(Candida)、HSV、RSV、EBV、CMV、JC病毒、BK病毒或埃博拉病原体。可被实施方案的CAR细胞靶向的抗原的另外的实例包括，但不限于，CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41，GD2、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素(meothelin)、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII或VEGFR2。在某些方面，实施方案的方法涉及CD19或HERV-K-表达细胞的靶向。例如，HERV-K靶向CAR细胞可包含包括单克隆抗体6H5的scFv序列的CAR。在另一个方面，可将实施方案的CAR与细胞因子诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或其组合缀合或融合。
在一些实施方案中，提供了治疗具有医学病况的个体的方法，其包括提供有效量的来自本文所述的细胞群体的细胞的步骤，在一些方面包括不止一次，诸如间隔至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。在具体实施方案中，所述癌症是淋巴瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病、慢性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病或B细胞相关自身免疫性疾病。
在另一个实施方案中，提供了包含CD19靶向CAR的分离或重组多肽，所述CAR包含与SEQ ID NO:1具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在相关实施方案中，提供了编码CD19靶向CAR的分离或重组多核苷酸序列(例如，编码与SEQ ID NO:1具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列)。例如，在一些方面，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:3(其编码CD-19靶向CAR)或SEQ ID NO:4(其编码CD-19靶向CAR、表达控制序列和侧翼转座子重复)具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方案中，提供了包含实施方案的编码CD19靶向CAR的多肽和/或编码CD19靶向CAR的多核苷酸的宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是T细胞或T细胞前体。优选地，宿主细胞是人细胞。本领域技术人员将承认，可按照本文所述的方法使用任何前述多肽、多核苷酸或宿主细胞。
在另一个实施方案中，提供了包含HERV-K靶向CAR的分离或重组多肽，所述CAR包含与SEQ ID NO:4具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在相关实施方案中，提供了编码HERV-K靶向CAR的分离或重组多核苷酸序列(例如，编码与SEQ ID NO:4具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列)。例如，在一些方面，所述多核苷酸序列与SEQ IDNO:5(其编码HERV-K靶向CAR、表达控制序列和侧翼转座子重复)具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方案中，提供了包含实施方案的编码HERV-K靶向CAR的多肽和/或编码HERV-K靶向CAR的多核苷酸的宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是T细胞或T细胞前体。优选地，宿主细胞是人细胞。本领域技术人员将承认，可按照本文所述的方法使用任何前述多肽、多核苷酸或宿主细胞。
在另一个实施方案中，提供了包含膜结合的IL-15的分离或重组多肽，所述膜结合的IL-15包含与SEQ ID NO:6具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在相关实施方案中，提供了编码膜结合的IL-15的分离或重组多核苷酸序列(例如，编码与SEQ ID NO:6具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列)。例如，在一些方面，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:7(膜结合的IL-15、表达控制序列和侧翼转座子重复)具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在另一个实施方案中，提供了包含实施方案的编码膜结合的IL-15的多肽和/或编码膜结合的IL-15的多核苷酸的宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是T细胞、T细胞前体或aAPC。优选地，宿主细胞是人细胞。本领域技术人员将认识到，可按照本文所述的方法使用任何前述多肽、多核苷酸或宿主细胞。
如本文本说明书中所用，“一个(a)”或“一种(an)”可意指一个或多个。如本文的权利要求中所用，当与词语“包含”结合使用时，词语“一个(a)”或“一种(an)”可意指一个或不止一个。
尽管本公开支持指唯一供选方案和“和/或”的定义，除非明确指明是指唯一供选方案或供选方案是相互排斥的，否则术语“或”在权利要求中的用途被用于表示“和/或”。如本文中所用，“另一个”可以指至少第二个或更多个。
在整个本申请中，术语“约”用于表示数值包括用于测定所述值的设备、方法的固有误差变化，或研究受试者之间存在的变化。
根据下列详细描述，本发明的其它的目的、特征和有利方面将变得显而易见。然而，应该理解的是，详细描述和具体实施例，虽然指示本发明的优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于领域技术人员将变得显而易见。
附图简述
下列附图形成本说明书的部分，并被包括来进一步证明本发明的某些方面。通过参照与本文所提供的特定实施方案的详细描述结合的这些附图中的一个或多个，可更好地理解本发明。
图1：概括对来自PB和UCB的CAR+T细胞进行电穿孔和繁殖的过程的步骤。
图2：来自PB的经遗传修饰的T细胞的表征。(A)用以评估基因转移的效率的第一刺激周期的第0天的EGFP的表达。如在(B)电穿孔后约24小时和(C)在aAPC上共培养后28天通过对CD3+、CD8+和CD4+T细胞的流式细胞术评估的CD19特异性CAR(CD19RCD28)的表达。对于UCB衍生的T细胞观察到类似的CAR表达。(D)CAR表达的动力学。
图3：PB衍生的CAR+T细胞的增殖。通过在重组人可溶性IL-2和IL-21存在的情况下在经γ-辐照的aAPC上重复共培养进行的来源于PB的CD3+和CAR+T细胞的数字扩增速率。向上的箭头表示标志每一个刺激周期的开始的经γ辐照的aAPC的添加。UCB衍生的CAR+T细胞展示相似的数字扩增速率。
图4：使用SB和aAPC系统遗传修饰和繁殖来源于PB和UCB的CAR+T细胞的生产过程的示意图。通过SB衍生的超螺旋DNA质粒的电转移和随后在重组人可溶性IL-2和IL-21存在的情况下在K562衍生的aAPC(克隆#4)上进行的共培养来产生CD19特异性CAR+T细胞。
图5：aAPC的收集和表征。(A，B)Sepax体积减小。在Sepax II中使用CS-490.1试剂盒收集在VueLife包中生长的aAPC克隆#4。将Sepax收集(S,n＝4)与手工(M,n＝1)程序相比较。平均处理前/后细胞计数(4.9x108对比5x108)与使用Sepax系统的相似。(C)aAPC的表型(克隆#4)。显示在K562aAPC和K562亲代对照上与EGFP(mIL-15-EGFP)共表达的CD19、CD64、CD86、CD137L和IL-15的膜结合形式(与经修饰的IgG4Fc区融合的肽)的表达的流式细胞术分析。
图6：产生临床级CD19特异性T细胞的过程的示意图。产生K562衍生的aAPC(克隆#4)的MCB(PACT)和WCB(MDACC)。为了产生CAR+T细胞，在袋中数字扩增aAPC，使用Sepax II系统收集，辐照(100Gy)和冷冻保存以待以后使用。如下生产CD19特异性T细胞；使用Sepax II系统从正常供体血浆分离置换产物分离PBMC并将其冷冻保存。随后将PBMC解冻，使用Nucleofector系统利用SB DNA质粒(CD19RCD28CAR转座子，SB11转座酶)对其进行电穿孔，与解冻的经辐照的aAPC连同细胞因子(IL-2和IL-21)一起共培养28天的培养期，随后冷冻保存。
图7：CAR+T细胞的表型。(A)在电穿孔后当天(培养第1天)和在缺乏CD19+aAPC的情况下在aAPC克隆#4上共培养28天后T细胞上的CD19RCD28CAR的表达。(B)使用CD3-ζ特异性抗体通过蛋白质印迹分析的CAR表达。将全细胞裂解物在还原条件下于SDS-PAGE上电泳。分子量标准(M)，亲代Jurkat细胞(泳道1)，CD19RCD28+JurkaT细胞(泳道2)，CARneg对照原代T细胞(泳道3)和CD19RCD28+T细胞(泳道4)。(C)随时间在培养物中的淋巴细胞门控中的CD3+、CD4+CAR+和CD8+CAR+T细胞的表达百分比。每一个符号代表单独的实验；实线是3次验证实验的平均值。(D)共培养结束(d28)时记忆/首次接受实验的CAR+T细胞的免疫表型、附着、活化、细胞裂解及其上的耗竭标志物。
图8：CAR+T细胞的扩增动力学和重定向特异性。将经遗传修饰的T细胞与aAPC克隆#4共培养28天。在每一个刺激周期(7天)结束时，对细胞计数，并针对细胞的CAR和CD3的表达进行染色。进行3次验证运行(V1、V2和V3)，并且图代表推断的(A)CAR+T细胞、(B)CD3+T细胞、(C)随时间的总的活细胞。箭头指示aAPC至培养物的添加。(D)使用4小时的铬释放测定利用CAR+T细胞测定的，相较于CD19neg EL-4的本底裂解的CD19+靶(Daudiβ2m、NALM-6、CD19+EL-4)的裂解。提供了次个验证运行的平均值±SD。
图9：与SB系统相关的安全性特征谱。(A)使用荧光原位杂交和流式细胞术(Flow-FISH)测定来测量细胞的端粒长度。将第28天占优势的T细胞群体(V1和V2，CD8+T细胞；V3，CD4+T细胞)与来自第0天的各自的miltenyi柱纯化的T细胞的亚组相比较。(B)使用对CD19RCD28CAR特异的引物和探针扩增来自第28天的CAR+T细胞的基因组DNA。使用CD19RCD28CAR转导的Jurka细胞(根据FISH分析，已知其具有每个基因组一个CD19RCD28CAR的整合)作为参照以及使用内源RNA酶P作为标准化者测定CD19RCD28靶拷贝数的相对量(RQ)分析。(C)第28天和第35天CAR+T细胞的TCR Vβ分析。数据显示与第0天未操作的对照相比较的3个验证运行CAR+T细胞的平均值±SD。(D)显示不存在SB11转座酶整合的基因组PCR。使用SB11或GAPDH引物扩增基因组DNA(20ng)。使用SB11引物扩增的CARneg对照T细胞(泳道5)和CAR+T细胞(泳道7)；使用GAPDH引物扩增的CARneg对照T细胞(泳道6)、CAR+T细胞(泳道8)和稳定表达SB11的Jurkat(泳道4)。使用SB11引物扩增的稳定地表达SB11的Jurkat(Jurkat/SB11-IRES2-EGFP)(泳道3)和线性质粒pKan-CMV-SB11(泳道2)用作阳性对照。(E)来自3次验证运行的CAR+T细胞的G带核型显示无结构或数值改变。显示了来自验证2的代表性染色体涂片(spread)。
图10：CD19RCD28CAR转座子的产生。利用SpeI及NheI和SpeI及NruI消化含有密码子优化的嵌合抗原受体(CAR)的CD19RCD28mz(CoOp)/pEK载体和SB DNA质粒pT-MNDU3-EGFP(Singh等，2008；Hollis等，2006)以分别释放CAR和EGFP片段。随后将缺失EGFP的pT-MNDU3载体与CAR片段连接以产生CD19RCD28mz(CoOp)/pT-MNDU3载体。进一步将卡那霉素抗性基因和通过pEK载体的AseI及PacI消化获得的ColE1复制起点连接入SalI及ZraI消化的CD19RCD28mz(CoOp)pT-MNDU3载体，以产生Pre-CD19RCD28mz(CoOp)/pSBSO。在最后的步骤中，使用利用NheI及NsiI的消化从Pre-CD19RCD28mz(CoOp)/pSBSO释放MNDU3启动子，并用使用XhoI及NheI从pVitro4载体获得的hEF-1a启动子片段替代所述MNDU3启动子，以产生最终的载体CD19RCD29mz(CoOp)/pSBSO。
图11：SB11转座酶的产生。利用PvuII消化SB转座酶载体pCMV-SB11以释放含有CMV启动子/增强子和SB转座酶编码基因的片段，可将该片段连接至含有卡那霉素抗性基因和来自pEK载体的ColE1复制起点的片段以产生pKan-CMV-SB11载体。
图12：CD19表达质粒ΔCD19CoOp-F2A-Neo/pSBSO的示意图。用通过F2A接头(氨基酸，VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP；[Szymczak等，2004；Yang等，2008；Kim等，2011])与密码子优化的(GENEART)截短的CD19(ΔCD19,[Serrano等，2006；Mahmoud等，1999])融合的编码新霉素抗性基因(NeoR)的DNA片段[从pSelect-Neo(InvivoGen)克隆的PCR]交换来自质粒CoOpCD19RCD28/pSBSO的编码CD19RCD28CAR的DNA片段，以产生ΔCD19CoOp-F2A-Neo/pSBSO。EF1α启动子，延伸因子-1α启动子；NeoR，新霉素抗性基因；bGHpAn，来自牛生长因子激素的多聚腺苷酸化信号；ColE1，ori；KanR，卡那霉素抗性基因；IR，SB反向/正向重复。
图13：CD19特异性CAR+T细胞的数字扩增的速率。在7天的刺激周期中将经遗传修饰的T细胞与aAPC共培养，并且计算总的T细胞、CD3+和CAR+T细胞的每一个刺激周期结束时来自每一次验证运行的周倍数扩增速率。显示了平均倍数扩增(n＝3)。
图14：CD19特异性CAR+T细胞的重定向的特异性。在标准4小时铬测定中于3次验证运行(V1、V2、V3)中产生的CAR+T细胞对CD19+肿瘤靶(Daudiβ2m、NALM-6、CD19+EL-4)的CD19特异性裂解。针对CARneg对照的本底自体裂解为1.5％。
图15：关于染色体畸变的安全性。从验证运行(V1和V3)产生的CAR+T细胞的G带核型显示无结构或数值改变。
图16：(A)当与同种型IgG2a对照染色(底图)相比较时具有不同强度(评分为0-3)的HERV-K表达(顶图)的肿瘤细胞(200X)的代表性图像。(B)显示为点状的并且毗邻细胞膜(实线箭头)的HERV-K染色或更加弥散的细胞质染色(虚线箭头)的肿瘤细胞的图像(400X)。(C)代表每一个患者的H-指数的点图显示良性与肿瘤组织之间的显著差异(p<0.0267)。(D)在恶性与转移性肿瘤之间未看到显著的差异。并且在良性肿瘤与恶性或转移性肿瘤之间看到显著差异。
图17：(A)HERV-K特异性CAR编码SB质粒。(B)代表第1天和第35天CD3+HERV-K特异性CAR+T细胞的CAR(Fc)表达的流量图。流量图的象限百分比在右上角。CAR，嵌合抗原受体。(C)HERV-K特异性CAR+T细胞与非特异性CD-19CAR+T细胞之间在总细胞生长方面无显著差异。(D)到第21天，所有HERV-K特异性CAR细胞是CD3+T细胞。(E)CAR整合分析显示HERV-K特异性CAR+T细胞具有少于每细胞2次整合。数据代表两次独立实验(利用3个不同供体以一式三份进行)的平均值。(F)HERV-K特异性CAR+T细胞的表型为产生高水平的粒酶B的CD3+CD56+CD45ROhi CD45RAloCD27+CD62L+T细胞。所有数据代表4个供体的平均值。
图18：(A)代表相较于同种型对照(以蓝色标示)的肿瘤细胞表面上的HERV-K抗原表达(以红色标示)的直方图。(B)相较于无DNA的对照T细胞(以虚线标示)利用不同稀释度的HERV-K特异性CAR+T细胞(以实线标示)进行的黑素肿瘤靶的标准4小时CRA。数据为从两次独立实验汇集的来自4个健康供体的平均值±SD(对于每一个供体的一式三份测量值的平均值)。对(B)和(C)HERV-K特异性CAR+T细胞与无DNA的对照细胞之间进行利用Bonferroni事后检验的双因素ANOVA。CAR，嵌合抗原受体；CRA，铬释放测定；E:T，效应子与靶的比率。(D)当与靶孵育时由CAR+T细胞进行的IFN-γ产生。PMA-离子霉素用作阳性对照。
图19：HERV-K特异性CAR+T细胞的特异性。(A)与HERV-Kneg EL4亲代(蓝色)和同种型对照染色(橙色)一起绘制的人工地表达HERV-K抗原(以黑色标示)的EL4细胞的直方图。(B)4小时CRA显示在不同的E:T比率下HERV-K特异性CAR+T细胞相较于亲代对表达抗原的EL4细胞的杀伤的显著增加(p<0.001)。(C)进行免疫印迹测定以显示当与A888亲代或用乱序shRNA处理的A888相比较时，A888细胞中的HERV-K env特异性shRNA介导的敲低。下图显示作为对照的肌动蛋白表达。(D)HERV-K特异性CAR+T细胞与A888HERV-K KD细胞、A888亲代(A888P)和A888乱序对照(A888scra)的CRA显示显著的由T细胞产生的抗原特异性杀伤。所有数据代表两次独立实验(利用3个供体以一式三份进行)的平均值。将利用Bonferroni事后检验的双因素ANOVA用于(B)比较EL4亲代与HERV-K+EL4以及将利用Newman-Keuls多重比较检验的单因素ANOVA用于(C)比较A888KD与A888P和A888scra。
图20：为了在15小时的时期中测定HERV-K特异性CAR+T细胞的活性，将靶细胞与效应细胞以1:5的比率与
Figure BDA0000904213610000161
(Invitrogen，死细胞染色)涂铺在培养基中。在该时期中每7分钟记录每一个靶与效应细胞的50个图像。(A)代表HERV-K+黑素瘤细胞(A888和A375)和HERV-Kneg对照(HEK293亲代)细胞与CAR+T细胞一起是不同的时间点的图像。将变绿的细胞记录为死细胞并且测量荧光的强度。(B、C、D)代表靶细胞的平均荧光强度。上面的线代表死细胞而下面的线代表活细胞的基线强度。(E)代表在15小时的时间点上相较于HEK293亲代细胞的平均荧光强度的显著差异(*p<0.05)的曲线。数据代表2次独立实验的平均值，每次实验50个图像。进行利用Tukey事后检验的单因素ANOVA。
图21：HERV-K特异性CAR+T细胞的体内抗肿瘤活性。(A)实验的示意图。(B)第3天至第25天的小鼠的代表性图像。(C)来源于mKate+rRLuc+HERV-K+A375-SM肿瘤的BLI和(D)肝组织的事后分析，其中红点代表mKate+肿瘤转移病灶。数据为平均值±SD(n＝5-6只小鼠/组)。利用(D中)双因素ANOVA(利用Bonferroni事后检验)和在处理的与未处理的小鼠之间进行的统计。**P<0.01和***P<0.001。ANOVA，分差分析；BLI，生物发光成像；CAR，嵌合抗原受体；IL，白细胞介素。
图22：(A)显示了来自29个正常器官的组织切片上HERV-K抗原表达的代表性图像(200X)。将H-指数计算为0，因为在任何这些组织中未观察到染色。(B)来自各种器官和不同患者的恶性组织的H-指数示于点图中。
图23：(A)显示CD4+对比CD8+HERV-K特异性CAR+T细胞的生长。(B)代表HERV-K特异性CAR+T细胞对比无DNA的对照细胞中的各种基因的表达的nCounter分析。红色表示高表达，而绿色表示低mRNA表达水平。(C)在HERV-K特异性CAR+T细胞中高度表达的基因的独创性途径分析。
图24：利用黑素瘤和CD19特异性肿瘤靶和CD19CAR+T细胞进行的4小时标准CRA。所有数据代表两次独立实验(利用平均6个供体进行和使用利用Bonferroni事后检验的双因素ANOVA分析)。
图25：编码复处于hEF-1α启动子之下的HERV-K抗原和处于CMV启动子下的新霉素抗性基因的双向SB质粒。
图26：代表与肿瘤细胞表面上的HERV-K抗原(示以红色)衔接的HERV-K特异性CAR(示以绿色)的图像。
图27：(A)编码具有新霉素抗性基因的myc-ffLuc的SB质粒。(B)HERV-K特异性CAR+T细胞和HERV-K特异性CAR-ffLuc+T细胞的总的细胞生长。(C)利用HERV-K特异性CAR-ffLuc+T细胞进行的A375SM和EL4亲代细胞的4小时CRA。(D)代表ffLuc活性的小鼠图像。(E)用于肿瘤细胞成像的编码RLuc和mKate的慢病毒质粒。
图28A-B：mIL15的示意图。A)侧接作为”睡美人”表达质粒的组分的反向重复序列的mIL15构建体。mIL15突变蛋白为IL-15通过柔性丝氨酸-甘氨酸接头与全长IL-15Rα的融合蛋白。B)代表mIL15的表达的蛋白质结构的示意图。
图29A-B：在5个刺激周期后在aAPC上离体扩增后经遗传修饰的T细胞中的CAR和mIL15表达。A)5个供体的代表性样本的表达。B)经遗传修饰的T细胞中的指示的标志物(CAR和/或mIL15)的表达。
图30：通过pSTAT5的phosflow进行的mIL15的功能性的验证。除非另外指出，否则在血清中和不含细胞因子的条件下孵育细胞5小时以获得基线和IL-15介导的磷酸化。代表性曲线图(n＝6)。
图31：在aAPC上进行4个刺激周期后具有或不具有mIL15的共表达的CAR+T细胞的推断的计数。利用可溶性IL-2和IL-21(标准培养条件)或IL-15和IL-21(可溶性细胞因子对照)培养CAR+T细胞，以及利用IL-21培养mIL15+CAR+T细胞。数据为平均值±SD，n＝4。
图32A-B：离体扩增的mIL15+CAR+T细胞的表型和特异性裂解能力。A)在aAPC上进行4次刺激后某些T细胞活化和分化相关标志物的表面表达百分比。水平线表示平均值。*P＝0.047，配对t检验，n>4。B)在aAPC上进行CD19+或CD19neg靶的5次刺激后来自4小时铬释放测定的CAR+T细胞(左图)和mIL15+CAR+T细胞(右图)特异性裂解。数据表示为平均值±SD，n＝3。
图33：保持功能活性和对AICD的抗性mIL15+CAR+T细胞的体外长期持续性。A)4次aAPC刺激后离体扩增的mIL15+/-CAR+T细胞经历从抗原再刺激的撤除以评估长期体外持续性和在60多天中观察扩增动力学。mIL15+CAR+T细胞不接受任何外源细胞因子支持，而CAR+T细胞不接受细胞因子、IL-2或IL-15。数据是平均数的对数±SD，****P<0.0001，RM ANOVA，n＝3。B)通过与：无靶、CD19+/-EL4、CD19+Nalm-6或LAC一起孵育6小时来测试抗原暴露后超过75天的存活T细胞的抗原应答性。分析是通过IFNγ细胞内染色的流式细胞术。显示了代表性流量图，n＝3。C)测试撤除后75天的存活的T细胞，如先前所述利用aAPC以1:1刺激其，并且利用在撤除培养维持过程中使用的细胞因子(如果有的话)加上IL-21的添加来补充培养基。8天后，利用膜联蛋白V对T细胞进行染色以测定刺激培养中的活细胞对比凋亡/坏死细胞的比例。显示了代表性流量图，n＝3。
图34A-C:长期维持mIL15+CAR+T细胞呈现叉状分枝的CD45RA+CCR7+/-表型。A)来自刺激4的mIL15+CAR+T细胞的CD45RA和CCR7群体以及在最后一次抗原刺激后维持75天的那些细胞群体的代表性流量图，n＝7。B)来自(A)的群体亚组的频率。***P<0.001和****P<0.0001，RM ANOVA，n＝7。C)显示来自刺激4的CCR7neg和CCR7+mIL15+CAR+T细胞和在最后一次刺激后维持75天的那些细胞中的膜联蛋白V水平的代表性直方图，n＝3。针对淋巴细胞群体门控直方图以避免非特异性CCR7染色。
图35A-D：图形显示通过流式细胞术分析进行的对mIL15+CAR+T细胞的另外表征。图35A，已在无抗原再刺激的情况下培养1-2年的来自3个正常供体的WD-mIL15+CAR+T细胞(染色后10天的PKH稀释物)的稳态增殖水平(顶图)和这些细胞在利用aAPC进行抗原再刺激后的增殖能力(底图)。图35B，提交长期撤除mIL15+CAR+T细胞(CD3和mIL15表面表达)的表型用于核型分析。首先用aAPC再刺激撤除T细胞，随后将其进行基因分型和提交用以进行核型分析。图35C，在抗原再刺激和外源细胞因子不存在的情况下长期(1.5-2.46年)体外维持的mIL15+CAR+T细胞的正常核型(G显带)结果。显示了来自4个正常供体的代表性中期染色体涂片。图35D，使用K562aAPC刺激细胞后的记忆动力学。图3E，利用1次对比2次的CAR和mIL15+CAR+T细胞的刺激的记忆动力学。
图36：分子特征谱表明长期维持的mIL15+CAR+T细胞展示与分化程度较低的T细胞亚组相关的特征。基于基因本体信息在宽广的分类下将在来自刺激4的mIL15+CAR+T细胞与始终在撤除条件中维持的那些mIL15+CAR+T细胞之间显著地差异表达的所有基因进行功能性分类。基于维持的撤除mIL15+CAR+T细胞中的上调或下调分配类型中的基因。
图37：与T细胞分化状态相关的转录因子的验证表明长期维持的mIL15+CAR+T细胞展示低分化状态。顶图：通过细胞内染色验证和通过流式细胞术分析选定的差异表达的基因(Tcf-7、Blimp-1和T-bet)。显示了代表性流量图，n＝5。底图：来自nCounter分析系统输出的标准化的mRNA拷贝数。
图38:与T细胞分化状态相关的表面标志物的验证表明长期持续的mIL15+CAR+T细胞显示较低分化。顶图：通过染色验证选择的差异表达的基因IL-7Ra和CCR7，并且通过流式细胞术分析其。*P＝0.0156和**P<0.001，分别为单尾Wilcoxon配对符号秩次检验和配对单尾T检验。显示了代表性流图，n＝5-7。底图：来自nCounter分析系统输出的标准化的mRNA拷贝数，n＝3。
图39：mIL15+CAR+T细胞的IL-2产生能力的获得。A)刺激4和未被刺激的或用淋巴细胞激活混合物(LAC)活化6小时，随后进行细胞内IL-2染色和流式细胞术分析的维持的抗原撤除mIL15+CAR+T细胞(WD-mIL15-CAR)的IL-2细胞内染色的代表性直方图。B)来自(A)的产生IL-2的LAC刺激的T细胞的频率。****P<0.0001，n＝6，配对t检验。
图40A-D：mIL15+CAR+T细胞在具有丰富肿瘤抗原的环境中的体内持续性和抗肿瘤活性。A)实验的示意图。B)在Nalm-6肿瘤引入后过继转移进小鼠中的来源于mIL15+/-CAR+ffluc+T细胞的BLI(n＝5)。C)通过利用人CD3的染色和利用流式细胞术的检测进行的第14天的脾(顶图)和骨髓(底图)中人T细胞的存在的分析。代表性流量图(n＝5)。D)通过流式细胞术进行的外周血中CD3+和CD19+细胞的存在的分析。在滤出鼠CD45+细胞后获得的频率。数据描述个别小鼠和平均值±SD。***P<0.001，单因素ANOVA，n＝3-5。
图41A-E：在低抗原环境中评估mIL15+CAR+T细胞持续性和抗肿瘤效率的体内模型。A)实验的示意图。B)接受CAR+T细胞或mIL15+CAR+T细胞的过继转移，随后在T细胞移入6天后接受CD19+Nalm-6肿瘤注射的小鼠的T细胞(ffLuc+)BLI。C)监控Nalm-6负荷的纵向BLI。图像代表来自Nalm-6细胞衍生的rLuc活性的光子通量。D)利用CAR+T细胞、mIL15+CAR+T细胞或未用T细胞处理的小鼠的随时间的肿瘤流量(rLuc)。数据为平均值±SD。****P<0.0001，单因素ANOVA，n＝4-5。E)其中通过流式细胞术检测人T细胞(人CD3+)和Nalm-6肿瘤细胞(人CD19+)的收集的组织和血液的分析。E)通过使用低肿瘤模型，评估小鼠的长期存活至第98天。如先前针对其中用mIL15-CAR T细胞(n＝7)、CAR T细胞(n＝8)或不用T细胞(n＝8)移入小鼠，随后进行NALM-6肿瘤激发的低肿瘤模型所描述的，类似地进行实验条件。刮弧内的分数代表存活至第98天的小鼠的比例。*P＝0.045(mIL15-CAR对比CAR T细胞处理)，对数秩检验(Mantel-Cox)。
图42A-E：不依赖于抗原的mIL15+CAR+T细胞的持续性和保持的功能。A)实验的示意图。B)在肿瘤抗原存在的情况下利用CAR+和mIL15+CAR+T细胞处理的小鼠中的ffLuc+T细胞的BLI。C)人CD3+T细胞和CD19+肿瘤细胞的骨髓、脾和外周血的分析，如通过流式细胞术检测的。显示了代表性流量图(左图)，并将人CD3+T细胞的频率作图(右图)。数据表示为平均值±SD，n＝5。**P＝0.0027(骨髓)，**P＝0.0081(脾)，ns＝不显著的，未配对t检验。D)T细胞流量(ffluc)的纵向作图。通过从不接受ffluc+T细胞的小鼠获得流量确定本底发光(标以灰色阴影的)。数据表示为平均值±SD，n＝5。*P＝0.0128，**P+0.00231，未配对t检验。E)在aAPC上离体地扩增从脾、肝或骨髓分离的细胞以产生充足的细胞数量来评估响应CD19-和CD19+靶(如先前所描述的)的细胞内IFNγ产生，n＝7，来自3个组织来源和4只小鼠。针对CD3门控直方图。
图43：显示使用以mRNA形式提供的SB转座酶的用于CAR T细胞产生的示例性方案的示意图。可在两周或更少时间(例如，16天)内产生有效量的活性CAR T细胞。
图44A-D：图44A，图(左图)和流式细胞术直方图(右图)显示稳定地表达CAR的T细胞的百分比从第9天(8.3％)至第16天(66.2％)显著增加。图44B，图形显示T细胞快速生长并且在电穿孔后至第16天扩增20倍。图44C，图形显示来自使用第16天的T细胞的铬释放测定的结果。所产生的CAR T细胞提供针对靶细胞的CD-19特异性细胞毒性(左图)。对于未经修饰的T细胞基本上未看到细胞毒性活性(右图)。图44D，流式细胞术直方图显示电穿孔后第9天(左图)和第17天(右图)的中心记忆T细胞的数目。用于这些研究的细胞来自称为#O的供体并且将SB11 mRNA用于电穿孔。
图45A-B：图45A，图形显示来自使用第9天(上图)和第15天(下图)T细胞的铬释放测定的结果。所产生的CAR T细胞提供针对靶细胞的CD-19特异性细胞毒性(左图)。对于未经修饰的T细胞基本上未看到细胞毒性活性(右图)。经修饰的T细胞以相似的效率在第9天和第15天杀伤CD19阳性靶细胞，尽管CAR阳性细胞的数目不同。图45B，图形显示电穿孔细胞中的CAR拷贝数(左图)和CAR表达(右图)。结果显示CAR DNA拷贝数从第15天至第22天从1.5减少至0.9，并且在该时间点后保持稳定。用于这些研究的细胞来自命名为#1的供体，并且将SB100x mRNA用于电穿孔。
图46：显示电穿孔后细胞活力的流式细胞术数据。在用DNA/mRNA电穿孔后，细胞总数首先减少(第1和2天)，随后细胞开始增长。根据cellometer计数，细胞数目在电穿孔后第2天减少59％-76％(活力24-41％)。
说明性实施方案的描述
临床试验已证明已接受经遗传修饰以具有所需特异性的T细胞的患者中的抗肿瘤作用。在本文中，详细描述了生产遵照cGMP的抗原特异性CAR+T细胞的新方法。所述系统将高效转染系统与转座子和转座酶系统CAR基因整合结合使用。这些非病毒方法作为对病毒介导的转导的替代具有显著的优势，因为临床级CAR+T细胞优选地不应当包括添加的病毒序列。通过电转移来源于转座子系统，诸如来自”睡美人”或piggyBac的DNA质粒，并在aAPC上扩增经遗传修饰的T细胞来获得高质量的cGMP CAR T细胞。所述方法导致临床上吸引人的数目的显示对于它们的靶抗原(例如，CD19)的特异性的CAR+T细胞的产生。重要的是，所述细胞满足由FDA建立的用于临床试验的发布标准。这些方法避免了因病毒介导的转导而引起的遗传毒性和因病毒的使用而引起的免疫原性。
嵌合抗原受体(CAR)不依赖于人白细胞抗原(HLA)识别细胞表面肿瘤相关抗原，并且使用一个或多个信号传导分子来活化经遗传修饰的T细胞，以进行杀伤、增殖和细胞因子产生(Jena等，2010)。表达CAR的T细胞的过继转移已在多个临床试验中显示了光明的前景。现可能使用模块方法来制造临床级的经遗传修饰的T细胞。在某些实施方案中，本文中公开的平台技术包括(i)使用电穿孔设备(例如，nucleofector)的非病毒基因转移，(ii)转座(例如，SB转座子，参见，美国专利6,489,458，通过引用并入本文)，(iii)通过内结构域发信号的CAR(例如，CD28/CD3-ζ、CD137/CD3-ζ或其它组合)，(iv)具有可变长度的连接抗原识别结构域与细胞表面的细胞外结构域的CAR和，在一些情况下，(v)能够强劲地和数字扩增CAR+T细胞的来源于K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)(Singh等，2008；Singh等，2011；Huang等，2012)。
在一些实施方案中，目前公开的方法可用于遗传修饰来源于外周血和/或脐带血的T细胞以表达可使用aAPC在体外数字扩增的CAR(Singh等，2008；Singh等，2011)。归因于DNA质粒产生的相对容易性、电穿孔、解冻的经γ辐照的主库(master-bank)aAPC的使用，所述方法已牵涉细胞和基因疗法，并且可被容易地转移至根据用于I/II期试验的现行良好生产操作规程(cGMP)运行的设施。生产T细胞的公开方法是独特的，至少因为其不使用(i)病毒转导或(ii)裸DNA电穿孔，随后在PBMC/LCL饲养层上的快速扩增。作为实例，公开了用于通过不依赖于HLA识别CD19的CAR的强制表达靶向CD19的方法。这些T细胞符合通过无菌、表型、活力和细胞数目定义的释放标准。过程中测试揭示电穿孔的/繁殖的T细胞在记忆/首次接受实验的群体中表达CAR，具有正常的核型，保存TCR Vβ库，并且能够以CAR依赖性方式识别并裂解CD19+肿瘤靶。
非病毒质粒的电转移为转导的吸引人的替代选择，因为可以以约1/10的重组GMP-级病毒的成本产生达到临床级的DNA种类。为了提高整合的效率，本发明人改造“睡美人”(SB)转座子和转移酶以使其适应人应用(Aronovich等，2011；Hackett等，2010；Izsvak等，2010；Kebriaei等，2012；Williams,2008)。另外，他们已使用piggyBac转座子/转座酶来强制CAR表达(Manuri等，2010)。本发明人的SB系统使用两个DNA质粒，所述质粒包含编码目标基因(例如，第2代CD19特异性CAR转基因，诸如指定的CD19RCD28)的转座子和转座酶(例如，SB11)，所述转座酶将转基因插入靶细胞基因组中的TA二核苷酸重复序列(Geurts等，2006；Ivics等，1997；Izsvak和Ivics,1997)。为了增加治疗潜力，本发明人的第2代CAR(Kowolik等，2006)通过CD28和CD3-ζ发信号，除了这将在体内支持T细胞增殖和再循环效应子功能外。另外，可使用SB系统表达具有不同细胞外长度和不同内结构域信号传导基序的CAR。
为了恢复稳定地表达CAR的T细胞要素，开发表达与共刺激分子(诸如CD86、CD137L、白细胞介素(IL)-15的膜结合形式(与经修饰的IgG4Fc区融合的肽或与IL-15受体α融合的细胞因子肽)和CD64(Fc-γ受体1))一起的所需抗原(例如，CD19)的K562aAPC(克隆#4)，以在体外选择能够支持CAR介导的增殖的T细胞。该强有力的技术已允许制造适合用于人应用的临床相关数目(高达1010)的CAR+T细胞。视需要，可进行另外的刺激来产生更大量的经遗传修饰的T细胞。此外，如果需要更少的CAR+T细胞，可使用更少的比色皿和仅携带一个亚组的数字扩增的T细胞用于在aAPC(在每一个刺激周期开始时添加)上进行0、1或更多轮增殖来按比例缩减电穿孔和增殖的方法。通常地，至少90％的繁殖的T细胞表达CAR并且被冷冻保存以用于输注。此外，该方法可被利用来通过将引入的CAR的特异性与被aAPC上的CAR识别的肿瘤相关抗原(TAA)的表达配对产生针对多种肿瘤类型的T细胞。离体扩增平台也已被改造来适合制造NK细胞、NK T细胞和γδT细胞。
表达第2代CAR的CD4+和CD8+T细胞的产生包括具有干细胞/记忆/初始表型的细胞，并且展示重定向的特异性的3个标志。第一，经遗传修饰的T细胞特异性裂解CD19+靶。第二，它们响应CD19+刺激细胞而产生细胞因子(例如，IFN-γ)。第三，它们全都以CAR依赖性方式响应CD19+刺激而增殖(Singh等，2011；Singh等2008)。aAPC和组织培养环境(例如，IL-21的添加)已被修饰来产生患者和供体来源的CD19特异性T细胞以用于在造血干细胞移植后进行输注(Singh等，2011；Singh等2008)。本发明人可从通过静脉穿刺简单地获得的外周血产生CAR+T细胞，这避免了通过血浆分离置换获得单核细胞的成本、不适和不方便。从少数单核细胞衍生大量CAR+T细胞的能力对于在同种异体脐带血移植后输注T细胞是特别吸引人的。新生儿供体的小尺寸和匿名性避免了在以后的时间点上重新评估该个体并且仅有有限数目的收集的单核细胞可用作用于T细胞制造的起始材料，以避免干扰造血作用。所述生产方法的其它进步包括与完全密闭的WAVE生物反应器偶联的高通量电穿孔设备以使操作减少至最少。
目前的生产方法包括执行加工和培养系统以减小工作负荷和防止无菌的违反。为此，本发明人在生物反应器和/或袋而非培养瓶中共同培养T细胞与经γ辐照的aAPC。该转变通常在电穿孔后第14天发生。另外，在生物反应器和/或袋中数字扩增作为源材料的aAPC，并且本发明人改造Sepax装置来适应处理aAPC以进行冷冻保存。当使用大体积的培养基(>900mL)时，Sepax收集法具有优于自动化的另外优势，因为其减少了人工处理所需的额外的离心步骤。
I.定义
如本文中所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”可指例如人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，并包括将人工特异性移植至特定免疫效应细胞上的工程化受体。CAR可用于将单克隆抗体的特异性赋予T细胞，从而允许大量特异性T细胞产生，例如以用于过继性免疫细胞疗法。在具体实施方案中，CAR例如将细胞的特异性引导至肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，CAR包含细胞内激活结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的细胞外结构域。在具体方面，CAR包括与CD3-ζ(一种跨膜结构域和内结构域)融合的来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合物。其它CAR设计的特异性可来源于受体的配体(例如，肽)或来自模式识别受体诸如Dectin。在具体实施方案中，可通过使用对于B谱系分子CD19特异的CAR重定向T细胞的特异性来靶向恶性B细胞。在某些情况下，可修改抗原-识别结构域的间距以减少激活诱导的细胞死亡。在某些情况下，CAR包含用于另外的共刺激信号传导的结构域诸如CD3-ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。在一些情况下，可将分子与CAR，共表达，所述分子包括共刺激分子、用于成像(例如，用于正电子发射断层摄影术)的报告基因、在添加前药后有条件地消除T细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
如本文中所用，术语“T细胞受体(TCR)”是指T细胞上的蛋白质受体，其由阿尔法(α)和贝塔(β)链的异二聚体组成，尽管在一些细胞中，TCR由γ和δ(γ/δ)链组成。在本发明的实施方案中，例如，可以例如在包含TCR的任何细胞，包括辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞上修饰TCR。
术语“肿瘤相关抗原”和“癌细胞抗原”在本文中可互换使用。在每一种情况下，所述术语是指由癌细胞特异性或优先表达的蛋白质、糖蛋白或糖类。
II.嵌合抗原受体
如本文中所用，术语“抗原”是能够被抗体或或T细胞受体结合的分子。抗原另外地能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，从而导致B和/或T淋巴细胞的产生。
本发明的实施方案涉及核酸，包括编码抗原特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽(包括已被人源化以减小免疫原性的CAR(hCAR)，其包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含一个或多个信号传导基序的细胞外结构域)的核酸。在某些实施方案中，该CAR可识别由一个或多个抗原之间的共享空间组成的表位。模式识别受体，诸如Dectin-1，可用于推断对糖类抗原的特异性。在某些实施方案中，所述结合区可包含单克隆抗体的互补性决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，该特异性来源于结合受体的肽(例如，细胞因子)。互补性决定区(CDR)是在抗原受体(例如，免疫球蛋白和T细胞受体)蛋白的可变结构域中发现的短氨基酸序列，其与抗原互补，并从而为受体提供了针对该特定抗原的其特异性针。抗原受体的每一条多肽链含有3个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。由于抗原受体通常由两个多肽链组成，因此对于每一个抗原受体存在可与抗原接触的6个CDR—每一条重链和轻链含有3个CDR。由于大多数与免疫球蛋白和T细胞受体相关的序列变异在CDR中发现，因此这些区域有时被称为高变结构域。在这些中，CDR3显示最大的可变性，因为其由VJ(在重链和TCRαβ链的情况下，VDJ)区的重组编码。
预期人CAR核酸是增强人患者的细胞免疫疗法的人基因。在具体的实施方案中，本发明包括全长CAR cDNA或编码区。抗原结合区或结构域可包含来源于特定人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段，诸如在美国专利7,109,304(通过引用并入本文)中描述的那些片段。所述片段还可以是人抗原特异性抗体的许多不同抗原结合结构域。在更具体的实施方案中，所述片段是由针对人密码子使用优化以用于在人细胞中表达的序列编码的抗原特异性scFv。
排列可以是多聚体的，诸如双抗体或多聚体。所述多聚体最可能通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成已被Winters称为双抗体的物质来形成。所述构建体的铰链部分可具有从被完全缺失至具有维持的第一半胱氨酸、至脯氨酸而非丝氨酸取代、至被截断直至第一半胱氨酸的多个替代选择。Fc部分可被缺失。作为稳定的和/或二聚化的任何蛋白质可用于此目的。可只使用Fc结构域的一个，例如，来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。还可使用已被修饰来提高二聚化的人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区。还可只使用免疫球蛋白的铰链区。还可使用CD8α的部分。
本发明的嵌合受的体细胞内信号传导结构域负责其中已放置了嵌合受体的免疫细胞的至少一个正常效应子功能的激活。术语“效应子功能”是指分化细胞的专门功能。T细胞的效应子功能，例如，可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。初始、记忆或记忆型T细胞中的效应子功能包括抗原依赖性增殖。因而术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号，并指导细胞执行专门功能的蛋白质的部分。虽然通常将使用完整的细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用完整的细胞内多肽。在一定程度上可使用细胞内信号传导结构域的截短部分，此类截短的部分可用于替代完整链，只要其仍然转导效应子功能信号。术语细胞内信号结构域从而意指包括足以转导效应功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短的部分。实例包括T细胞受体的ζ链或任何其同源物(例如，η、δ、γ或ε)、MB1链、B29、FC RIII、FC RI及信号传导分子的组合，诸如CD3ζ和CD27、4-1BB、DAP-10、OX40及其组合，以及其它类似分子和片段。可使用活化蛋白质的家族的其它成员的细胞内信号传导部分，诸如FcγRIII和FcεRI。关于使用这些替代跨膜和细胞内结构域的cTCR的公开内容，参见Gross等(1992),Stancovski等(1993),Moritz等(1994),Hwu等(1995),Weijtens等(1996)和Hekele等(1996)。在优选实施方案中，人CD3ζ细胞内结构域被用于活化。
抗原特异性细胞外结构域与胞内信号传导结构域可通过跨膜结构域诸如人IgG4Fc铰链和Fc区连接。备选方案包括人CD4跨膜结构域、人CD28跨膜结构域、跨膜人CD3ζ结构域或半胱氨酸突变的人CD3ζ结构域，或来自其它人跨膜信号传导蛋白诸如CD16和CD8以及促红细胞生成素受体的其它跨膜结构域。
在一些实施方案中，CAR核酸包含编码其它共刺激受体，诸如跨膜结构域和经修饰的CD28胞内信号传导结构域的序列。其它共刺激受体包括，但不限于CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10和4-1BB(CD137)的一个或多个。除了由CD3ζ引发的初始信号以外，由插入在人CAR中的人共刺激受体提供的另外的信号对于T细胞的完全活化是重要的，并且可帮助提高体内持续性和过继免疫疗法的治疗成功。
在具体实施方案中，本发明涉及分离的核酸片段和掺入编码CAR的DNA序列的表达盒。本发明的载体被设计来主要将所需基因在受调节的真核启动子例如MNDU3启动子、CMV启动子、EF1α启动子或遍在蛋白启动子的控制下递送至免疫细胞，优选地T细胞。同样地，载体还可含有选择标记，如果没有其它原因，以方便其体外操作。在其它实施方案中，可从由DNA模板体外转录的mRNA表达CAR。
嵌合抗原受体分子是重组体并且特征在于它们结合抗原和通过存在于它们的胞质尾中的免疫受体活化基序(ITAM)传导激活信号的能力。利用抗原结合部分(例如，从单链抗体(scFv)产生)的受体构建体提供为“通用”的额外优势，因为它们以不依赖于HLA的方式结合靶细胞表面上的天然抗原。例如，几个实验室已报道与编码CD3复合物的ζ链(ζ)、Fc受体γ链和sky酪氨酸激酶的细胞内部分的序列融合的scFv构建体(Eshhar等，1993；Fitzer-Attas等，1998)。已在几个鼠和人抗原-scFv:ζ系统中记录了重定向T细胞效应机制(包括通过CTL的肿瘤识别和裂解)(Eshhar,1997；Altenschmidt等，1997；Brocker等，1998)。
迄今为止非人抗原结合区通常用于构建嵌合抗原受体。关于使用非人抗原结合区，诸如鼠单克隆抗体的潜在问题是缺乏人效应子功能，和不能渗透进肿瘤块。换言之，此类抗体可能不能介导补体依赖性裂解或通过抗体依赖性细胞毒性或Fc受体介导的吞噬作用裂解人靶细胞以破坏表达CAR的细胞。此外，非人单克隆抗体可被人宿主识别为外源蛋白质，因此，此类外来抗体的重复注射可引起导致有害的超敏反应的免疫应答的诱导。对于基于鼠的单克隆抗体，这经常被称为人抗小鼠抗体(HAMA)应答。因此，人抗体的使用是更优选的，因为它们不引起与鼠抗体一样强的HAMA应答。类似地，在CAR中使用人序列可避免通过存在于接受者中并且在HLA的情况中识别加工的抗原的内源T细胞产生的免疫介导的识别和由此产生的消除。
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包含：a)细胞内信号传导结构域，b)跨膜结构域，和c)包含抗原结合区的细胞外结构域。
在具体实施方案中，CAR中的细胞内受体信号传导结构域包括例如T细胞抗原受体复合物中的那些细胞内受体信号传导结构域，诸如CD3的ζ链，还有FcγRIII共刺激信号传导结构域、CD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2(单独地或与CD3ζ串联)。在具体实施方案中，细胞内结构域(其可被称为胞质结构域)包括TCRζ链、CD28、CD27、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12和CD40的一个或多个的部分或全部。在一些实施方案中，在细胞内结构域中使用内源T细胞受体复合物的任何部分。可使用一个或多个胞质结构域，因为所谓的第三代CAR具有例如至少两个或三个融合在一起以获得累加或协同作用的信号传导结构域。
在嵌合抗原受体的某些实施方案中，受体的抗原特异性部分(其可被称为包含抗原结合区的细胞外结构域)包含肿瘤相关抗原或病原体特异性抗原结构结构域，包括被模式识别受体诸如Dectin-1识别的糖类抗原。肿瘤相关抗原可为任何类型，只要其在肿瘤细胞的细胞表面上表达。肿瘤相关抗原的示例性实施方案包括CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮肿瘤抗原、黑色瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras等。在某些实施方案中，当存在低量的肿瘤相关抗原时，可将CAR与膜结合的细胞因子共表达以提高持续性。例如，可将CAR与膜结合的IL-15共表达。
在某些实施方案中，细胞内肿瘤相关抗原可被靶向，诸如HA-1、存活素、WT1和p53。这可通过在通用T细胞上表达的CAR来实现，所述CAR在HLA的情况中识别来源于细胞内肿瘤相关抗原的经加工的肽。另外，通用T细胞可经遗传修饰来表达在HLA情况中识别细胞内加工的肿瘤相关抗原的T细胞受体对。
病原体可以是任何种类，但在具体的实施方案中，病原体是例如真菌、细菌或病毒。示例性病毒病原体包括腺病毒科、EB病毒(EBV)科、巨细胞病毒(CMV)科、呼吸道合胞病毒(RSV)科、JC病毒科、BK病毒科、HSV、HHV病毒科、细小RNA病毒科、疱疹病毒科、嗜肝病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳多空病毒科、多瘤病毒属、弹状病毒科和披膜病毒科的那些病毒病原体。示例性病原性病毒引起天花、流行性感冒、流行性腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉病和风疹。示例性致病型真菌包括念珠菌属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺囊虫属(Pneumocystis)和葡萄穗霉属(Stachybotrys)。示例性致病性细菌包括链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、志贺菌属(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、螺杆菌属(Helicobacter)、大肠杆菌(E.coli)、立克次体属(Rickettsia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、博德特氏菌属(Bordetella)、衣原体属(Chlamydia)、螺旋体(Spirochetes)和沙门菌属(Salmonella)。在一个实施方案中，病原体受体dectin-1可被用于产生识别真菌细胞壁上的糖类结构的CAR。经遗传修饰以表达基于Dectin-1的特异性的CAR的T细胞可识别曲霉属和靶向菌丝生长。在另一个实施方案中，可基于中断病毒感染和病理的识别病毒决定簇(例如，来自CMV和埃博拉病毒的糖蛋白)的抗体产生CAR。
在一些实施方案中，致病抗原是曲霉属糖类抗原，对于所述抗原，CAR中的细胞外结构域诸如通过Dectin-1识别真菌细胞壁的糖类模式。
根据本发明的嵌合免疫受体可通过本领域已知的任何方法来产生，尽管优选其使用重组DNA技术来产生。可制备编码嵌合受体的几个区域的核酸序列，并通过分子克隆的标准技术(基因组文库筛选、PCR、引物辅助连接、来自酵母和细菌的scFv文库、定点诱变等)将其组装成完整的编码序列。可将所得编码区插入表达载体并用于转化合适的表达宿主同种异体T细胞系。
如本文中所用，核酸构建体或核酸序列或多核苷酸意欲指可被转化或转导进入T细胞并被转录和翻译以产生产物(例如，嵌合抗原受体)的DNA分子。
在用于本发明的示例性核酸构建体(多核苷酸)中，将启动子可操作地连接于编码本发明的嵌合受体的核酸序列，即，将它们这样放置，以促进信使RNA从编码嵌合受体的DNA转录。所述启动子可以是基因组来源或合成产生的。用于T细胞的多种启动子在本领域中是公知的(例如，由Marodonet等(2003)公开的CD4启动子)。该启动子可以是例如组成型或诱导型的(其中诱导与特定细胞类型或成熟的特定水平相关)。或者，许多公知的病毒启动子也是合适的。目标启动子包括β肌动蛋白启动子、SV40早期和晚期启动子、免疫球蛋白启动子、人巨细胞病毒启动子、逆转录病毒启动子和Friend脾病灶形成病毒启动子。所述启动子可与或可以不与增强子缔合，其中所述增强剂可天然地与特定特定启动子缔合或与不同的启动子缔合。
编码嵌合受体的开放阅读框架的序列可获自基因组DNA来源、cDNA来源，或可被合成(例如，通过PCR)，或其组合。取决于基因组DNA的大小和内含子的数目，可能期望使用cDNA或其组合，因为已发现内含子使mRNA稳定或提供T细胞特异性表达(Barthel和Goldfeld,2003)。同样地，可进一步有利的是使用内源或外源非编码区来使mRNA稳定。
为了表达本发明的嵌合抗原受体，可将编码嵌合受体的N末端组件的核酸序列的天然存在的或内源转录起始区用于在靶宿主中产生嵌合受体。或者，可使用允许组成型或诱导型表达的外源转录起始区，其中可取决于靶宿主、所需表达水平、靶宿主的性质等来控制表达。
同样地，将嵌合受体导向表面膜的信号序列可以是嵌合受体的N末端组件的内源信号序列。任选地，在一些情况下，可能希望将此序列与不同的信号序列交换。然而，所选定的信号序列应当与T细胞的分泌途径相容，以便嵌合受体被呈现在T细胞的表面上。
类似地，终止区可通过编码该嵌合受体的C末端组件的核酸序列的天然存在的或内源转录终止区来提供。或者，终止区可来源于不同的来源。在大多数情况下，所述终止区的来源通常被认为对于重组蛋白的表达不重要，并且可使用多种终止区而不会不利地影响表达。
正如本领域技术人员将理解的，在一些情况下，CAR中的抗原结合结构域末端上的几个氨基酸(例如，通常不超过10个，更常见地不超过5个残基)可被缺失。同样地，还可能希望在边界引入少数氨基酸，通常不超过10个，更常见地不超过5个残基。氨基酸的缺失或插入可以是为了结构的需求，提供便利的限制性位点，操作的便利，表达水平的提高等。另外，用不同氨基酸对一个或多个氨基酸的取代可因相似的原因而发生，在任何一个结构域中通常取代不超过约5个氨基酸。
可以以方便的方式制备编码根据本发明的嵌合受体的嵌合构建体。因为，在大多数情况下，可使用天然序列，在适当的情况下可分离和操作天然基因，以便允许各种组件的适当联接。因此，可使用导致基因的不想要部分的缺失的适当引物，通过使用聚合酶链式反应(PCR)来分离编码嵌合受体的N-末端和C-末端蛋白质的核酸序列。或者，可将克隆的基因的限制性消化用于产生嵌合构建体。在这两种情况下，所述序列可被选择来提供为平端的或具有互补式重叠的限制性位点。
可在体外进行用于制备嵌合构建体的各种操作，并且在具体的实施方案中，使用标准转化或转染法将所述嵌合构建体引入用于在适当的宿主中克隆和表达的载体。因此，在每一个操作后，克隆由DNA序列的联接所得构建体，分离所述载体，并且筛选所述序列以确保所述序列编码所需嵌合受体。可通过限制性分析、测序等筛选所述序列。
本发明的嵌合构建体通过减小肿瘤的尺寸或防止肿瘤在这些受试者中生长或再生长而用于患有癌症或怀疑患有癌症的受试者。因此，本发明还涉及用于在受试者中减少肿瘤生长或阻止其形成的方法，方式是将本发明的嵌合构建体引入受试者的分离的T细胞并将转化的T细胞重新引入所述受试者，从而实现抗肿瘤应答以减少或消除受试者中的肿瘤。可使用的合适的T细胞包括细胞毒性淋巴细胞(CTL)或需要破坏的具有T细胞受体的任何细胞。如对于本领域普通技术人员是公知的，各种方法可容易获得用于从受试者分离这些细胞。例如，使用细胞表面标志物表达或使用商购可得的试剂盒(例如，来自Pierce,Rockford,Ill的ISOCELLTM)。
预期可将嵌合构建体作为裸DNA或在合适的载体中引入受试者自已T细胞。使用裸DNA通过电穿孔稳定地转染T细胞的方法在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利第6,410,319号。裸DNA通常是指以适当取向包含在质粒表达载体中以用于表达的编码本发明的嵌合受体的DNA。有利地，裸DNA的使用减少产生表达本发明的嵌合受体的T细胞所需的时间。
或者，病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)可用于将嵌合构建体引入T细胞。根据本发明的方法使用的合适的载体在受试者的T细胞中是非复制的。已知许多基于病毒的载体，其中细胞中维持的病毒的拷贝数低至足以维持细胞的活力。说明性载体包括本文中公开的pFB-neo载体(
Figure BDA0000904213610000351
)以及基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。
一旦确定所述转染或转导的T细胞能够通过所需调节和以所需水平将嵌合受体表达为表面膜蛋白，就可确定所述嵌合受体在宿主细胞中是否具有提供所需的信号诱导的功能。随后，将被转导的T细胞重新引入或施用至所述受试者，以在受试者中激活抗肿瘤应答。为了便于施用，可用适当的载体或稀释剂(其也可以是药学上可接受的)将根据本发明的转导的T细胞制成药物组合物或制成适合用于体内施用的植入物。制备此类组合物或植入物的方法在本领域中已进行了描述(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Mack编辑(1980))。适当时，可以以用于它们的各自施用途径的常用方式将转导的T细胞配制成呈半固体或液体形式的制剂，诸如胶囊、溶液、注射剂、吸入剂或气雾剂。本领域中已的方法可用于在其到达靶组织或器官之前阻止或减少所述组合物的释放和吸收，或确保组合物的定时释放。然而，理想地，使用不使表达嵌合受体的细胞失效的药学上可接受的形式。因此，理想地，可将转导的T细胞制成含有平衡盐溶液，优选地Hanks平衡盐溶液或生理盐水的药物组合物。
III.与实施方案相关的方法和组合物
在某些方面，本发明包括制备和/或扩增抗原特异性重定向T细胞的方法，所述方法包括用含有编码hCAR的DNA构建体的表达载体转染T细胞，随后任选地用抗原阳性细胞、重组抗原或针对引起细胞增殖的受体的抗体刺激所述细胞。
在另一个方面，提供了使用裸DNA，通过电穿孔或其它非病毒基因转移(诸如，但不限于声致穿孔)稳定转染和重定向T细胞的方法。大多数研究者已使用病毒载体来将外源基因携带进入T细胞。通过使用裸DNA，可减少产生重定向T细胞中所需的时间。“裸DNA”是指以适当取向包含在表达盒或载体中以用于表达的编码嵌合T细胞受体(cTCR)的DNA。本发明的电穿孔方法产生在它们的表面上表达和承载嵌合TCR(cTCR)的稳定转染子。
“嵌合TCR”意指由T细胞表达的并且包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外结构域的受体，其中所述细胞外结构域能够以不受MHC约束的方式特异性结合通常不被T细胞受体以该方式结合的抗原。在适当的条件下抗原对T细胞的刺激导致细胞的增殖(扩增)和/或IL-2的产生。本申请的示例性CD19-和HERV-K特异性嵌合受体是嵌合TCR的实例。然而，所述方法也适用于利用对于其它靶抗原特异的嵌合TCR，诸如对于HER2/Neu(Stancovski等，1993)、ERBB2(Moritz等，1994)、叶酸结合蛋白(Hwu等，1995)、肾细胞癌(Weitjens等，1996)和HIV-1包膜糖蛋白gp120和gp41(Roberts等，1994)特异的嵌合TCR进行的转染。其它细胞表面靶抗原包括，但不限于，CD20、癌胚抗原、间皮素、ROR1、c-Met、CD56、GD2、GD3、甲胎蛋白、CD23、CD30、CD123、IL-11Rα、κ链、λ链、CD70、CA-125、MUC-1、EGFR及变体、上皮肿瘤抗原等。
在某些方面，T细胞是原代人T细胞，诸如来源于人外周血单核细胞(PBMC)、用G-CSF刺激后收集的PBMC、骨髓或脐带血的T细胞。条件包括mRNA和DNA和电穿孔的使用。转染后，可立即输注细胞或可贮存细胞。在某些方面，在转染后，可将细胞在基因转移进细胞后约1、2、3、4、5天或更多天内作为大群体离体繁殖数天、数周或数月。在另一个方面，转染后，克隆转染子，并离体地扩增显示存在单个整合的或以附加体维持的表达盒或质粒并表达嵌合受体的克隆。被选择用于扩增的克隆显示特异性识别并裂解表达CD19的靶细胞的能力。重组T细胞可通过利用IL-2或结合共同γ链的其它细胞因子(例如，IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)的刺激来扩增。重组T细胞可通过利用人工抗原呈递细胞的刺激来扩增。可在人工抗原呈递细胞上或利用抗体诸如交联T细胞表面上的CD3的OKT3来扩增重组T细胞。可在人工抗原呈递细胞上或利用抗体诸如结合T细胞表面上的CD52的Campath来缺失重组T细胞的亚组。在另一个方面，可冷冻保存所述经遗传修饰的细胞。
可通过如下方式评估输注后T细胞增殖(存活)：(i)使用对于CAR特异的引物的q-PCR；(ii)使用对于CAR特异的抗体的流式细胞术；和/或(iii)可溶性TAA。
本发明的实施方案还涉及使用重定向免疫T细胞进行的具有为CD19特异性的细胞表面表位的B细胞恶性肿瘤或包括B细胞的病症的靶向。恶性B细胞为重定向T细胞的优良靶，因为B细胞可用作T细胞的免疫刺激抗原呈递细胞。支持利用具有人或人源化CAR的供体来源的CD19特异性T细胞的过继疗法的抗肿瘤活性的临床前研究包括(i)CD19+靶的重定向杀伤，(ii)在与CD19+靶/刺激细胞孵育后细胞因子的重定向分泌/表达，和(iii)在与CD19+靶/刺激细胞孵育后持续的增殖。
在本发明的某些实施方案中，将CAR细胞递送至有此需要的个体，诸如患有癌症或感染的个体。细胞随后提高个体的免疫系统以攻击各自的癌细胞或致病细胞。在一些情况下，给个体提供一个或多个剂量的抗原特异性CART-细胞。在其中给个体提供两个或更多个剂量的抗原特异性CAR T细胞的情况下，施用之间的持续时间应当足以允许留出用于在个体中增殖的时间，并且在具体的实施方案中剂量之间的持续时间为l、2、3、4、5、6、7天或更多天。
经修饰包含两种嵌合抗原受体并且缺乏功能性TCR的同种异体T细胞的来源可为任何类型，但在具体的实施方案中，所述细胞获自例如脐带血的库、外周血、人胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。用于获得治疗效果的合适剂量，例如，优选在一系列给药周期中，可为每剂至少105或约105至约1010个细胞。示例性给药方案由4个递增剂量的一周给药周期组成，始于第0天至少约105个细胞，例如在开始患者内剂量递增方案的数周内逐渐增加至高达约1010个细胞的目标剂量。合适的施用模式包括静脉内、皮下、腔内(例如，通过储存器接入装置)、腹膜内和直接注射进肿瘤块。
本发明的药物组合物可被单独使用或与用于治疗癌症的其它得到确认的药剂组合使用。无论是单独递送还是与其它药剂组合递送，可通过各种途径将本发明的药物组合物递送至哺乳动物(特别是人)身体中的各种部位以实现特定的效果。本领域技术人员将认识到，虽然可用不止一个途径进行施用，但特定的途径可提供比另一种途径更直接和更有效的反应。例如，对于黑素瘤的治疗，可有利地使用真皮内递送(其优于吸入)。局部或全身递送可通过施用(包括将制剂敷在体腔中或滴注至体腔内，吸入或吹入气溶胶)，或通过肠胃外引入(包括肌内、静脉内、门静脉内、肝内、腹膜、皮下或真皮内施用)来实现。
本发明的组合物可以以单位剂型提供，其中每一个剂量单位，例如，注射剂，单独地或与其它活性剂适当地组合含有预定量的所述组合物。如本文所用，术语单位剂型是指作为单位剂量适于人和动物受试者使用的物理上分离的单位，每一个单位含有预定量的单独的或与其它活性剂组合的本发明的组合物，该量经计算为在适当的情况下与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物相结合时足以产生所需的效果。本发明的新型单位剂型的技术规范取决于特定受试者中的与所述药物组合物相关的特定药效动力学。
理想地，有效量或充足数量的分离的转导的T细胞存在于组合物中，并将其引入受试者，以便建立长期特异性抗肿瘤应答，以减小肿瘤的尺寸或消除肿瘤生长或再生长，否则会导致此类治疗的不存在。理想地，被重新引入受试者的转导的T细胞的量，当与另外地其中所述转导的T细胞不存在的相同条件比较时，导致10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的肿瘤尺寸的减小。
因此，施用的转导的T细胞的量应当考虑施用途径并且应当使得充足量的所述转导的T细胞将被引入，以实现所需的治疗反应。此外，本文所述的组合物中包含的每一种活性剂的量(例如，每细胞待接触的量或每某一体重的量)在不同应用中可变化。一般地，转导的T细胞的浓度理想地应当足以在待治疗的受试者中提供至少约1×106至约1×109个转导的T细胞，甚至更理想地，约1×107至约5×108个转导的T细胞，虽然在上文中可使用任何适合的量，例如大于5×108个细胞，或低于，例如少于1×107个细胞。给药方案可基于得到确认的基于细胞的疗法(参见，例如，Topalian和Rosenberg,1987；美国专利第4,690,915号)，或可使用替代性连续输注策略。
这些值提供了待由医生在优化用于本发明的实践的本发明的方法后使用的转导的T细胞的范围的一般指导。此类范围的本文中的引述绝不排除较高或较低量的组分的使用，这在特定应用中可被保证。例如，实际剂量和方案可取决于是否将所述药物组合物与其它药物组合物组合施用，或取决于药代动力学、药物配置和代谢的个体差异而变化。本领域技术人员可容易地根据特定状况的紧急性作出任何必需的调整。
IV.示例性人CD19特异性嵌合抗原受体T细胞
CD19(一种免疫球蛋白超家族的细胞表面糖蛋白)是用于B细胞相关恶性肿瘤的抗体疗法的潜在的有吸引力的靶。该抗原不存在于造血干细胞中，并且在健康个体中其存在只限制于B系和可能地一些滤泡树突状细胞(Scheuermann等，1995)。事实上，其在至B细胞胚细胞的发育过程中存在于来自最早可识别的B谱系细胞的B细胞中，但在至浆细胞的成熟中丢失。此外，CD19不从细胞表面脱落并且在肿瘤转化过程中很少丢失(Scheuermann等，1995)。所述蛋白在大多数恶性B谱系细胞上表达，包括来自患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金细胞淋巴瘤(NHL)和急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的患者的细胞(Uckun等，1988)。CD19主要用作与CD21和CD81结合的B细胞共受体。当激活时，CD19的胞质尾被磷酸化，这导致由Src家族激酶结合和PI-3激酶的招募。
在一个方面，实施方案的组合物和方法涉及人CD19特异性嵌合T细胞受体(或嵌合抗原受体，CAR)多肽(指定为hCD19CAR)，所述受体多肽包含细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含人CD19结合区的细胞外结构域。在另一个方面，所述CD19结合区是F(ab')2、Fab'、Fab、Fv或scFv。结合区可包含与野生型氨基酸序列具有至少、至多或约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。所述细胞内结构域可包含人CD3ζ的细胞内信号传导结构域，并且还可包含人CD28细胞内区段。在某些方面，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域。
在另一个方面，本发明的组合物包含编码上述多肽的核酸。在某些方面，优化所述核酸序列以供人密码子使用。
在另一个方面，本发明的组合物包括表达本文所述的多肽的细胞。T细胞可包含编码hCD19CAR多肽的表达盒。所述表达盒可被包含在非病毒载体，诸如转座子或人转座子或其重组变体中。所述表达盒可包被包含在病毒载体或其重组变体中。可将所述表达盒晶型基因组整合或以附加体形式维持或从mRNA表达。
在另一个方面，本发明包括产生表达人CD19特异性CAR的T细胞的方法，所述方法包括将表达盒引入细胞，其中所述表达盒编码包含人细胞外CD19结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域的多肽。所述方法可进一步包括用CD19+细胞、重组CD19或针对所述受体的抗体刺激所述细胞以使细胞增殖、杀伤和/或产生细胞因子；例如，可用CD19+人工抗原呈递细胞刺激所述细胞以增殖或扩增。
在某些方面，本发明包括治疗与表达内源CD19的细胞相关的人疾病状态的方法，其包括用足以治疗所述病况的量的表达人CD19特异性CAR的重组细胞输注患者，其中所述人CD19特异性CAR包含人CD19细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。所述病况可以是例如淋巴瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病、慢性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病或B细胞相关自身免疫性疾病。
本发明涉及人CD19特异性嵌合抗原受体(hCD19RCD28或hCAR)的产生。在某些方面，表达hCAR的重组细胞具有改善的体内维持和抗肿瘤功效。人hCAR具有相较于鼠hCAR降低的免疫原性，所述鼠hCAR包含来源于鼠CD19特异性单克隆抗体(mAb)的scFv区段。抗肿瘤效果可通过经遗传修饰的细胞(使得其对于CD19特异)来增强。通常，T细胞特异性通过编码hCAR的表达盒的电转移来实现。
所述hCAR可以是包含一个或多个活化内结构域诸如CD3-ζ来源的活化结构域的嵌合受体。另外的T细胞活化基序包括，但不限于，CD28、CD27、OX-40、DAP10和4-1BB。在某些方面，活化结构域还可以包括CD28跨膜和/或活化结构域。在另一个方面，将针对在人细胞和受试者中的表达优化的hCAR编码区和/或表达盒密码子(例如在一个实施实施中，从CD19特异性人抗体的VH和VL序列获得的scFv区)并入hCAR的CD19结合区段(例如参见美国专利第7,109,304，其通过引用整体并入本文)。在另一个实施方案中，将所述hCAR表达盒以附加体形式维持或整合进重组细胞的基因组中。在某些方面，将所述表达盒包含在能够通过使用整合酶机制整合的核酸、病毒载体(诸如逆转录病毒载体)或非病毒载体(诸如转座子机制)中。在另一个实施方案中，将所述表达盒包含在基于转座子的核酸中。在具体的实施方案中，所述表达盒是两组件“睡美人”(SB)或piggyBac系统的部分，其将转座子和转座酶用于增强的非病毒基因转移。
可将表达重组hCAR的细胞数字扩增至临床上有意义的数量。此类扩增的一个实例使用人工抗原呈递细胞(aAPC)。表达重组hCAR的细胞可通过流式细胞术和蛋白质印迹分析来验证和鉴定。表达CD19特异性CAR的表达重组hCAR的T细胞可识别并杀死表达CD19的靶细胞。在另一个方面，可将hCAR表达进通用细胞，随后可将所述通用细胞输注穿过移植屏障，以帮助防止免疫原性。可将所述hCAR与人基因一起使用以进行T细胞的成像(诸如通过正电子发射断层摄影术，PET)和条件消除(如果存在细胞毒性的话)。本发明的重组T细胞可用于CD19特异性细胞疗法。
V.示例性HERV靶向嵌合抗原受体T细胞
在人类基因组计划中，发现一组称为人内源逆转录病毒(HERV)的古逆转录病毒被稳定地整合进人基因组中，构成总人基因组的8.5％。在HERV当中，HERV-K被发现为参与黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、畸胎癌和前列腺癌以及各种自身免疫性疾病(如多发性硬化和类风湿关节炎)的致癌等位基因变体(Buscher等，2005；Dreyfus,2011；Seifarth等，1995)。HERV-K的致癌潜力归因于包膜(env)和GAG蛋白(Rec)。最近的研究已经表明，HERV-K env蛋白只在肿瘤细胞表面上而不在正常皮肤细胞上表达(Wang-Johanning等，2008；Li等，2010)。发现HERV-K env蛋白的表达随更具侵袭性和转移性的III型和IV型黑素瘤而非具有较小侵袭性和局限性的I型黑素瘤而增加(Buscher等，2005；Hahn等，2008；Serafino等，2009)。HERV-K env蛋白在黑素瘤细胞上的该选择性表达可被用作用于具有难治性或转移性黑素瘤的患者的治疗策略，患有转移性黑素瘤的患者因对常规疗法诸如化学疗法、辐照和手术的抗性而具有不良预后(Bhatia等，2009)。因此，需要新的靶向治疗策略来改善治疗结果。
为了产生用于黑素瘤的T细胞疗法，本发明人靶向来源于HERV的TAA，其基因组在数百万年前稳定地整合进人中。为了靶向HERK-K，通过用抗HERV-K env特异性单克隆抗体的单链抗体(scFv)序列替代CD19特异性CAR的抗原结合外结构域来工程化T细胞以表达对于env蛋白特异的CAR。将该新CAR作为转座子克隆入SB系统。将编码HERV-K env特异性CAR和SB转座酶的DNA质粒电转移至原代人T细胞中，并且在经辐照的表达HERV-K env和所需T细胞共刺激分子的人工抗原呈递细胞(aAPC)上选择性繁殖经遗传修饰的CAR+T细胞。在经γ辐照的aAPC上共培养后，95％的CD3+T细胞表达CAR，并且与CAR+T细胞相反，这些CAR+T细胞能够在体外特异性杀伤HERV-K env+肿瘤靶，但不杀伤HERV-K env-肿瘤靶。通过在相较于HERV-K env-亲代细胞优先被杀伤的抗原阴性EL4小鼠细胞中表达HERV-K env蛋白来证明这些CAR+T细胞的特异性，并且通过shRNA(特异性靶向HERV-K env RNA)对A888-mel细胞进行的HERV-K敲低导致相较于亲代减少的杀伤。CAR+T细胞也成功地减缓肿瘤生长和减少A375-超级转移性(SM)肿瘤细胞在体内从肺至肝的转移。接受CAR+T细胞的荷瘤小鼠比单独的荷瘤小鼠组存活更长并且表现更健康。因此，通过使用对于临床试验具有转化吸引力的方法，靶向活跃逆转录病毒的T细胞可用作黑素瘤的免疫疗法。
黑素瘤细胞的克隆演变可因其对用于肿瘤识别的MHC复合物的依赖性而使TCR疗法失效。与基于TCR的T细胞疗法不同，CAR可通过以不依赖于MHN的方式介导的细胞死亡来克服黑素瘤细胞的该克隆演变。HERV-K抗原只在肿瘤细胞表面上而非正常细胞上表达。因此，HERV-K特异性CAR+T细胞可特异性靶向和消除肿瘤细胞而无任何不利副作用。它们可被输注来治疗处于沿着癌谱(从最小残留疾病至大块肿瘤、至常规疗法难以治疗的疾病)的许多分期中的HERV-K+恶性肿瘤。
HERV-K在许多肿瘤类型上表达，包括但不限于，黑素瘤(Muster等，2003；Buscher等，2005；Li等，2010；Reiche等，2010；Serafino等，2009)、乳腺癌(Patience等，1996；Wang-Johanning等，2003；Seifarth等，1995)、卵巢癌(Wang-Johanning等，2007)、淋巴瘤(Contreras-Galindo等，2008)以及畸胎癌(Bieda等，2001；Lower等，1993)。此外，感染的细胞，包括被HIV感染的那些细胞(Jones等，2012)也表达HERV-K。这提供了有吸引力的机会：一个靶向HERV-K的CAR设计可用于治疗多种癌症和感染。
VI.用于靶向最小残留疾病的共表达嵌合抗原受体T细胞的示例性膜结合的IL-15
成人和小儿B谱系急性成淋巴细胞性白血病(B-ALL)的化学治疗性治疗因耐药残留疾病而分别具有65％和20％的疾病复发率。B-ALL复发(尤其在预后不良的群体中)的高发病率，已促进采用同种异体造血干细胞移植(HSCT)的基于免疫的疗法的使用。该疗法依赖于存在于供体移植物中的同种异体反应性细胞，所述细胞用于根除剩下的白血病细胞，或最少残留疾病，以提高无病生存率。供体淋巴细胞输注已被用于在同种异体HSCT后提高移植的T细胞靶向残留B-ALL的能力，但用于此类患者的该治疗方法实现小于10％的缓解率，并且从移植物抗宿主疾病(GVHD)的频率和严重性来看与高度的发病率和死亡率相关。由于这些难治性恶性肿瘤中的共同和致命问题复发，因此通过将供体T细胞的特异性重新靶向肿瘤相关抗原(TAA)，将在HSCT后采用外周血单核细胞(PBMC)来源的T细胞的过继疗法用于增强抗肿瘤效果或移植物抗白血病(GVL)效果。
已经开发了对于靶抗原特异的CAR的许多制剂，其中CD19特异性CAR靶向B-ALL的细胞表面上的CD19抗原。观察CAR+细胞的长期持续性和在不同临床方案间的患者中实现持久的应答仍然是阻碍基于CAR的疗法的治疗功效的关键问题。
目前，经CAR修饰的T细胞依赖于获得只在遭遇肿瘤抗原时才发生的通过CAR的存活信号传导。在其中将这些经CAR修饰的T细胞输注至具有巨大肿块疾病的患者中的临床情境中，存在充足的肿瘤抗原来提供足够的经由CAR的激活和存活信号传导。然而，患有复发的B-ALL的患者通常利用清髓性化学疗法，随后进行HSCT来条件化，并呈现最小残留疾病(MRD)。在该情况下，患者具有低肿瘤负荷并且分钟级TAA严格限制支持输注的T细胞所必需的CAR介导的信号传导，从而有损治疗潜力。预期用于增强T细胞持续性的替代性不依赖于CAR的方法改善经CAR修饰的T细胞的移入。
共同γ链受体家族(γC)中的细胞因子是T细胞的重要共刺激分子，其对于淋巴功能、存活和增殖是至关重要的。IL-15具有对于过继治疗是理想的几个属性。IL-15是支持长寿命记忆细胞毒性T细胞的存活，通过减轻肿瘤驻留细胞的功能性抑制来促进已建立的肿瘤的根除，并且抑制AICD的稳态细胞因子。
IL-15是组织限定性的，并且只有在病理状况下才可观察到其以任何水平存在于血清或全身中。与被分泌至周围环境中的其它γC细胞因子不同，IL-15在IL-15受体α(IL-15Rα)的情况中由生成细胞反式提供给T细胞。该细胞因子至T细胞和其它应答细胞的独特递送机制：(i)是高度靶向的和局部的，(ⅱ)增加IL-15的稳定性和半衰期，和(iii)产生通过可溶性IL-15实现的性质上不同的信号传导。
在一个实施方案中，本发明提供了产生用于治疗例如表现出最小残留疾病(MRD)的白血病患者的目的，具有长寿命体内潜力的经嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞的方法。总的来说，该方法描述了可如何将可溶性分子诸如细胞因子与细胞表面融合以增强治疗潜力。该方法的核心依赖于利用白细胞介素-15(IL-15)的人细胞因子突变蛋白(此后称为mIL15)共修饰CAR T细胞。所述mIL15融合蛋白由经由柔性丝氨酸-甘氨酸接头与全长IL15受体α融合的IL-15的密码子优化的cDNA序列组成。以这样的方式设计该IL-15突变蛋白，以：(ⅰ)将mIL15表达限定于CAR+T细胞的表面，以限制细胞因子在体内环境中扩散至非靶，从而潜在地改善其安全性特征，因为外源可溶性细胞因子的施用已导致毒性；和(ii)在IL-15Rα的情况中呈递IL-15以模拟IL-15/IL-15Ra复合物的相关较长细胞因子半衰期的生理相关和定性信号传导以及稳定和再循环。表达mIL15的T细胞能够继续支持细胞因子信号传导，这对于它们的输注后存活是至关重要的。由非病毒“睡美人”系统遗传修饰和随后在临床上适用的平台上离体扩增产生的mIL15+CAR+T细胞在具有高肿瘤负荷、低肿瘤负荷或无肿瘤负荷的鼠模型中产生了具有增强的输注后持续性的T细胞输注产品。此外，mIL15+CAR+T细胞还在高或低肿瘤负荷模型中显示了提高的抗肿瘤效率。
在高肿瘤负荷模型中mIL15+CAR+T细胞相对于CAR+T细胞的提高的持续性和抗肿瘤活性表明，mIL15+CAR+T细胞在治疗患有其中肿瘤负荷是普遍的活动性疾病的白血病患者方面比CAR+T细胞更有效。因此，mIL15+CAR+T细胞可在最广的应用中替代过继疗法中的CAR+T细胞。mIL15+CAR+T细胞不依赖于经由CAR的存活信号传导存活的能力使得尽管肿瘤抗原不存在，但这些经修饰的T细胞能够在输注后持续。因此，这预期在MRD治疗环境中，尤其是已进行了清髓性化学治疗和造血干细胞移植的患者中在治疗效率上产生最大影响。这些患者可接受利用mIL15+CAR+T细胞的过继T细胞转移来治疗他们的MRD和防止复发。
膜结合的细胞因子诸如mIL15具有广泛影响。除了膜结合的IL-15以外，还可设想其它膜结合的细胞因子。还可将所述膜结合的细胞因子扩展至与用于人应用的活化和增殖细胞相关的其它分子的细胞表面表达。这些分子包括，但不限于细胞因子、趋化因子和促成用于人应用的细胞活化和增殖的其它分子。
膜结合的细胞因子诸如mIL15可被离体地用于制备用于人应用的细胞以及可在用于人应用的输注的细胞(例如，T细胞)上。例如，可将膜结合的IL-15在人工抗原呈递细胞(aAPC)(诸如来源于K562)上表达以刺激T细胞和NK细胞(以及其它细胞)进行活化和/或繁殖。通过aAPC上的mIL15活化/增殖的T细胞群体包括经遗传修饰的淋巴细胞，而且还包括肿瘤浸润性淋巴细胞和其它免疫细胞。不输注这些aAPC。相反地，可将mIL15(和其它膜结合的分子)在被输注的T细胞和其它细胞上表达。
采用经CAR修饰的T细胞的MRD治疗的治疗功效因T细胞的过继转移后持续性的缺乏而受阻碍。mIL15+CAR+T细胞不依赖于肿瘤抗原的体内长期存活的能力表明用于治疗具有MRD的患者的巨大潜力。在该情况下，mIL15和其支持的持续性T细胞可解决需要，因为目前的用于MRD患者的方法是不够的。在具有MRD的患者中输注的T细胞和其它淋巴细胞的持续性超过CAR+T细胞。如果将要获得持续治疗影响，则用于治疗和预防恶性肿瘤、感染或自身免疫性疾病的任何免疫细胞必须能够长期持续。因此，除了来源于内源T细胞受体或引入的免疫受体的信号以外激活T细胞的持续性对于过继免疫疗法的许多方面是重要的。膜结合的细胞因子的表达从而可用于增强被输注用于多种病理状况的T细胞和其它免疫细胞的治疗潜力和持续性。
本发明人已产生在CAR+T细胞上被表达为IL-15与IL-15Rα(mIL15)的膜结合融合蛋白的IL-15的突变蛋白。将mIL15构建体与CD19特异性CAR(在第0天)作为两个“睡美人”DNA转座子质粒一起共电转移进原代人T细胞。通过在CD19+人工抗原呈递细胞和补充的IL-21上共培养来产生临床上相关的数量的mIL15+CAR+T细胞。经遗传修饰的T细胞中的通过IL-15受体复合物的信号传导通过STAT5(pSTAT5)的磷酸化来验证，并且这些T细胞显示等同于CAR+T细胞的CD19+肿瘤靶的重定向特异性裂解。此外，在抗原撤除后，通过mIL15产生的信号传导增加了具有分化程度较低/较年轻的表型的T细胞的占有率，所述T细胞具有记忆相关属性，包括特定细胞表面标志物、转录因子和分泌IL-2的能力。这些特征在用于过继转移的T细胞中是理想的性状，因为它们与显示体内长期持续的能力的T细胞亚组相关联。在具有弥散性CD19+白血病的免疫受损的NSG小鼠中，mIL15+CAR+T细胞显示持续性和抗肿瘤效果，然而其CAR+T细胞对应物不能维持显著的持续性，尽管TAA存在。在其中首先移入mIL15+/-CAR+T细胞6天，随后引入弥散性CD19+白血病的预防性小鼠(NSG)模型中，只发现mIL15+CAR+T细胞持续以及阻止肿瘤移入。为了测试mIL15+CAR+T细胞是否能够不依赖于来自TAA的刺激而持续，将mIL15+/-CAR+T细胞过继转移至无肿瘤的NSG小鼠中。只有mIL15+CAR+T细胞能够在该无外源细胞因子支持或CD19TAA存在的体内环境中持续。这些数据表明mIL15可在CAR+T细胞中被共表达，从而导致增强的体内持续性而无需TAA或外源细胞因子支持。总之，该细胞因子融合分子：(i)提供了经由pSTAT5的刺激信号，从而导致增强的体内T细胞持续性，同时维持肿瘤特异性功能性，(ii)维持促进记忆样表型的T细胞亚组，(iii)消除对用于体外和体内T细胞扩增和持续性的临床级IL-2的需要和花费，和(iv)减少对临床级可溶性IL-15的需要。
VII.免疫系统和免疫疗法
在一些实施方案中，通过转移引发特异性免疫应答的重定向T细胞来治疗医学病症。在本发明的一个实施方案中，通过转移引发特异性免疫应答的重定性T细胞来治疗B细胞系恶性肿瘤或病症。因此，对免疫应答的基本理解是必需的。
过继免疫系统的细胞是一种类型的白细胞，称为淋巴细胞。B细胞和T细胞是主要类型的淋巴细胞。B细胞和T细胞来源于相同的多能造血干细胞，并且直至它们被活化才可彼此区别。B细胞在体液免疫应答中起着重大作用，而T细胞密切参与细胞介导的免疫应答。它们可与其它淋巴细胞类型相区别，诸如B细胞与NK细胞区别在于它们的细胞表面上称为T细胞受体(TCR)的特定受体的存在。在几乎所有其它脊椎动物中，B细胞和T细胞由骨髓中的干细胞产生。T细胞游走至它们的名称所源自的胸腺并在其中发育。在人中，约1％-2％的淋巴细胞库每小时再循环以优化抗原特异性淋巴细胞在次级淋巴组织内发现它们的特异性抗原的机会。
T淋巴细胞产生于骨髓中的造血干细胞，并且通常迁移至胸腺成熟。T细胞在它们的膜上表达独特的抗原结合受体(T细胞受体)，其只能识别其它细胞的表面上的与主要组织相容性复合体(MHC)分子缔合的抗原。存在称为T辅助细胞和T细胞毒性细胞的至少两个T细胞群体。T辅助细胞和T细胞毒性细胞主要区别在于它们分别展示膜结合的糖蛋白CD4和CD8。T辅助细胞分泌对于B细胞、T细胞毒性细胞、巨噬细胞和免疫系统的其它细胞的活化是至关重要的各种淋巴因子。相反地，识别的抗原-MHC复合物的T细胞毒性细胞增殖和分化成称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的效应细胞。CTL通过产生导致细胞裂解的物质消除展示抗原的身体的细胞，诸如病毒感染的细胞和肿瘤细胞。自然杀伤细胞(或NK细胞)是一种类型的细胞毒性淋巴细胞，其构成先天免疫系统的主要组分。NK细胞在肿瘤和被病毒感染的细胞的排斥中起主要作用。细胞通过释放称为穿孔素和粒酶的蛋白质的小细胞质颗粒(其引起靶细胞通过细胞凋亡死亡)来进行杀伤。
抗原呈递细胞(其包括巨噬细胞、B淋巴细胞和树突细胞)区别在于它们的特定MHC分子的表达。APC内化抗原，并在它们的外层细胞膜上再表达与MHC分子一起的该抗原的部分。主要组织相容性复合体(MHC)是具有多个基因座的大的基因复合物。MHC基因座编码两大类称为I类和II类MHC的MHC膜分子。T辅助淋巴细胞通常识别与MHC II类分子缔合的抗原，并且T细胞毒性淋巴细胞识别与MHC I类分子缔合的抗原。在人中，MHC被称为HLA复合物，在小鼠中被称为H-2复合物。
T细胞受体或TCR是在T淋巴细胞(或T细胞)的表面上发现的分子，其通常负责识别结合于主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原。其在95％的T细胞中为由α和β链组成的异二聚体，而5％的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。TCR与抗原和MHC的衔接通过一系列由相关酶、共受体和专门的辅助分子介导的生物化学事件导致其T淋巴细胞的活化。在免疫学中，CD3抗原(CD代表分化簇)在哺乳动物中是由四条不同的链(CD3γ、CD3δ，和2倍的CD3ε)组成的蛋白质复合物，其与称为T细胞受体(TCR)的分子和ζ链缔合以在T淋巴细胞中产生活化信号。TCR、ζ链和CD3分子一起构成TCR复合物。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白，其含有单个细胞外免疫球蛋白结构域。CD3链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的TCR链(TCRα和TCRβ)缔合的特性。CD3分子的细胞内尾含有称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或缩写ITAM的单个保守基序，该基序是TCR的信号传导能力所必需的。
CD28是在T细胞上表达的分子之一，其提供共刺激信号，该信号是T细胞活化所需的。CD28是B7.1(CD80)和B7.2(CD86)的受体。当被Toll样受体配体激活时，B7.1表达在抗原呈递细胞(APC)中被上调。抗原呈递细胞上的B7.2表达是组成型的。CD28是唯一的在初始T细胞上组成型表达的B7受体。除了TCR以外的通过CD28的刺激可为用于产生各种白细胞介素(特别地IL-2和IL-6)的T细胞提供高效共刺激信号。
分离和扩增作为用于人疾病的治疗干预的抗原特异性T细胞的策略已在临床试验中获得验证(Riddell等，1992；Walter等，1995；Heslop等，1996)。
恶性B细胞似乎是重定向T细胞的极好的靶，因为B细胞可用作T细胞的免疫刺激抗原呈递细胞(Glimcher等，1982)。淋巴瘤，凭借其淋巴结向性，在解剖学上理想地用于T细胞介导的识别和消除。已在接受HIV特异性CD8+CTL克隆的输注的HIV患者中记录了输注的T细胞至淋巴结的大量定位。在这些患者中，淋巴结活检材料的评价揭示输注的克隆构成约2％-8％的淋巴结的CD8+细胞。淋巴结归巢可通过用在组成型启动子控制下的编码L-选择分子的cDNA构建体共转染T细胞来进一步改善，因为该粘附分子将循环T细胞导回淋巴结并且因体外扩增而被下调(Chao等，1997)。本发明可提供治疗与表达内源CD19的细胞相关的人疾病状态的方法，所述方法包括给患者输注治疗有效剂量的如上所述的表达重组人CD19特异性CAR的细胞。与表达内源CD19的细胞相关的人类疾病状态可选自由以下组成的组：淋巴瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病、慢性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病和B细胞相关自身免疫性疾病。
白血病是血液或骨髓的癌症，并且特征在于血细胞通常是白血细胞(白细胞)的异常增殖(多倍地产生)。其为称为血液肿瘤的疾病广泛组的一部分。白血病为涵盖一系列疾病的广义术语。白血病在临床和病理上被分成其急性和慢性形式。
急性白血病的特征在于未成熟血细胞的快速增殖。这种拥挤使得骨髓无法制造健康的血细胞。急性形式的白血病可发生于儿童和青少年中。事实上，其是美国儿童的比任何其它类型的恶性疾病更常见的死亡原因。急性白血病因恶性细胞的快速进展和积累(其随后溢出至血流中并扩散至身体的其它器官)而需要即刻治疗。中枢神经系统(CNS)病变是不常见的，虽然该疾病偶尔可引起颅神经麻痹。慢性白血病由相对成熟，但仍然异常的血细胞过度堆积区分开来。通常花费数月至数年进展，所述细胞以比正常高得多的速率产生，从而在血液中导致许多异常的白细胞。慢性白血病主要在老年人中发生，但理论上可在任何年龄组中发生。然而急性白血病必须立即治疗，慢性形式有时在治疗前被监测一段时间，以确保治疗的最大效率。
此外，疾病被分类成淋巴细胞的或成淋巴细胞的，这表示癌变在通常接着形成淋巴细胞的一种类型的骨髓细胞中发生；以及骨髓性的或骨髓的，这表示癌变在通常接着形成红细胞、一些类型的白细胞和血小板的一种类型的骨髓细胞中发生(见淋巴样细胞对比髓样细胞)。
急性淋巴细胞白血病(也称为急性成淋巴细胞性白血病，或ALL)是幼儿中最常见类型的白血病。该疾病也影响成年人，特别是65岁和更老的那些人。慢性淋巴细胞白血病(CLL)最常见地影响55岁以上的成年人。其有时会在年轻成人中发生，但其几乎从不影响儿童。急性骨髓性白血病(也称为急性髓样白血病，或AML)在成人中比在儿童中更常发生。该类型的白血病以前称为“急性非淋巴细胞白血病”。慢性骨髓性白血病(CML)主要在成人中发生。极少数儿童也发生该疾病。
淋巴瘤是源于淋巴细胞(在脊椎动物的免疫系统中的一种类型的白血细胞)的一种类型的癌症。存在许多类型的淋巴瘤。根据美国国立卫生研究院，在美国淋巴瘤占所有癌症病例的约5％，以及在美国霍奇金淋巴瘤具体地占所有癌症病例的不到1％。因为淋巴系统是人体免疫系统的一部分，因此具有减弱的免疫系统(诸如因HIV感染或因某些药物或药剂造成的)的患者也具有较高的淋巴瘤发病率。
在19和20世纪，所述疾患被称为霍奇金病，因为其是由托马斯·霍奇金(ThomasHodgkin)在1832年发现的。通俗地说，淋巴瘤被大致分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(所有其它类型的淋巴瘤)。淋巴瘤的类型的科学分类更加具体。虽然较老的分类称为组织细胞性淋巴瘤，但这些淋巴瘤在较新的分类中被公认为B、T或NK细胞谱系。
自身免疫性疾病或自身免疫性是生物体不能将其自已的构成部分(低至亚分子水平)识别为“自已”，这导致针对其自身细胞和组织的免疫应答。由此类异常免疫应答引起的任何疾病被称为自身免疫性疾病。突出的例子包括乳糜泻、1型糖尿病(IDDM)、系统性红斑狼疮(SLE)，干燥综合征、多发性硬化症(MS)、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、特发性血小板减少性紫癜和类风湿关节炎(RA)。
炎性疾病，包括自身免疫性疾病，也是一类与B细胞病症相关的疾病。自身免疫性疾病的实例包括，但不限于，急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西德纳姆舞蹈症(Sydenham’s chorea)、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合症、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨诺-许兰氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾炎后、结节性红斑、高安动脉炎(Takayasu’sarteritis)、阿狄森氏病(Addison’s disease)、类风湿关节炎、多发性硬化症、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture’s syndrome)，thromboangitisubiterans、干燥综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病和纤维化肺泡炎。最常见的治疗是皮质类固醇和细胞毒性药物，其可以是毒性非常高的。这些药物也抑制整个免疫系统，可导致严重感染，且对骨髓、肝脏和肾脏具有不良影响。已被用于治疗III类自身免疫性疾病的其它治疗剂迄今已针对T细胞和巨噬细胞。存在对治疗自身免疫性疾病，特别是III类自身免疫性疾病的更有效方法的需要。
VIII.人工抗原呈递细胞
在一些情况下，aAPC用于制备实施方案的治疗性组合物和细胞治疗产品。对于有关抗原呈递系统的制备和使用的一般指导，参见，例如，美国专利第6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662号；美国专利申请公开第2009/0017000和2009/0004142号；和国际公开第WO2007/103009号)。
通常将aAPC与具有最佳长度的肽一起孵育，所述长度允许所述肽与MHC分子直接结合而无需另外处理。或者，所述细胞可表达目标抗原(即，在不依赖于MHC的抗原识别的情况下)。除了肽-MHC分子或目标抗原以外，所述aAPC系统还可包含至少一个外源辅助分子。可使用任何合适的数量和组合的辅助分子。所述辅助分子可选自辅助分子诸如共刺激分子和粘附分子。示例性共刺激分子包括CD70和B7.1(B7.1以前称为B7并且也称为CD80)，除其它事项外，其结合于T细胞表面上的CD28和/或CTLA-4分子，从而影响例如T细胞扩增、Th1分化、短期T细胞存活和细胞因子分泌诸如白细胞介素(IL)-2(见Kim等，2004,Nature，第22卷(4)，第403-410页)。粘附分子可包括糖结合糖蛋白诸如选择蛋白，跨膜结合糖蛋白诸如整联蛋白、钙依赖性蛋白诸如钙粘蛋白，以及单次跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族的蛋白，诸如细胞间粘附分子(ICAM)，其促进例如细胞间或细胞与基质间的接触。示例性粘附分子包括LFA-3和ICAM，诸如ICAM-1。用于选择、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术、方法和试剂列举于，例如，美国专利第6,225,042、6,355,479和6,362,001号中。
被选择来变成aAPC的细胞优选在细胞内抗原加工、细胞内肽运输和/或细胞内MHCI类或II类分子-肽加载中具有缺陷，或是变温的(即，对温度的攻击不如哺乳动物细胞系敏感)，或同时具有缺陷和变温性质。优选地，被选择来变成aAPC的细胞也缺乏表达被引入细胞的外源MHC I类或II类分子和辅助分子组分的至少一种内源对应物(例如，如上所述的内源MHC I类或II类分子和/或内源辅助分子)的能力。此外，aAPC优选地保留由所述细胞在它们被修饰以产生所述aAPC之前所具有的缺陷和变温性质。示例性aAPC构成与抗原加工(TAP)缺陷型细胞系诸如昆虫细胞系相关的运输器(transporter)或来源于其。示例性变温昆虫细胞系是果蝇细胞系，诸如Schneider 2细胞系(参见，例如，Schneider,J.Embryol.Exp.Morph.1972第27卷，第353-365页)。用于Schneider 2细胞的制备、生长和培养的说明性方法提供于美国专利第6,225,042、6,355,479和6,362,001号中。
在一个实施方案中，还使aAPC经历冻融循环。在示例性冻融循环中，可通过将装有aAPC的合适容器与适当量的液氮、固体二氧化碳(即，干冰)或类似的低温材料接触以使冷冻快速发生来冷冻aAPC。随后通过将aAPC从低温材料中移除并将其暴露于环境室温条件，或通过其中使用温水浴或温暖的手来促进更短的解冻时间的便利解冻过程来将冷冻的aAPC解冻。另外，可将aAPC冷冻并在解冻之前贮存延长的时间。还可将冷冻的aAPC解冻，随后在进一步使用之前冻干。优选地，可不利地影响冻融过程的防腐剂诸如二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)和其它防腐剂不存在于含有经历冻融循环的aAPC的介质中，或诸如通过将aAPC转移至基本上不含此类防腐剂的介质中来基本上去除所述防腐剂。
在其它优选的实施方案中，异种核酸和对于所述aAPC是内源的核酸可通过交联失活，以使得在失活后基本上没有细胞生长、核酸复制或表达发生。在一个实施方案中，在外源MHC和辅助分子表达、于aAPC表面上呈递此类分子以及加载呈递的MHC分子与选择的肽后的点上使aAPC失活。因此，加载了此类失活和选择的肽的aAPC，虽然被使得基本上不能增殖或复制，但仍保留选择的肽呈递功能。优选地，所述交联也产生基本上不含污染性的微生物，诸如细菌和病毒的aAPC而基本上不降低aAPC的抗原呈递细胞功能。因此，交联维持aAPC的重要APC功能，同时帮助缓解有关使用aAPC开发的细胞治疗产品的安全问题。关于与交联和aAPC相关的方法，参见，例如，美国专利申请公开第20090017000号，其通过引入并入本文。
IX.本发明的试剂盒
可将本文所述的任何组合物包含在试剂盒中。在一些实施方案中，在试剂盒中提供同种异体CAR T细胞，所述试剂盒还可包括适合用于扩增细胞的试剂诸如介质、aAPC、生长因子，抗体(例如，用于分选或表征CAR T细胞)和/或编码CAR或转座酶的质粒。
在非限制性实例中，嵌合受体表达构建体、一种或多种产生嵌合受体表达构建体的试剂、用于表达构建体的转染的细胞和/或一个或多个用于获得用于表达构建体的转染的同种异体细胞的仪器(例如仪器可以是注射器、移液管、镊子和/或任何此类医学上批准的装置)。
在一些实施方案中，在试剂盒中提供了用于消除内源TCRα/β表达的表达构建体、一种或多种产生构建体的试剂和/或CAR+T细胞。在一些实施方案中，包括编码锌指核酸酶的表达构建体。
在一些方面，所述试剂盒包含用于细胞的电穿孔的试剂或装置。
试剂盒可包含一种或多种适当等份的本发明的组合物或产生本发明的组合物试剂。该试剂盒的组分可被包装在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置可包括至少一个其中可放置组分并且优选地等分组分的小瓶、试管、培养瓶、瓶子、注射器或其它容器装置。当试剂盒中存在不止一种组分时，试剂盒通常还将含有可将另外的组分单独地置于其中的第二、第三或其它另外的容器。然而，可在小瓶中包含成分的各种组合。本发明的试剂盒通常还包括用于将嵌合受体构建体和任何其它试剂容器装在密封构造中的装置以供商业销售。此类容器可包括例如其中保留所需小瓶的注塑或吹塑成型的塑料容器。
X.实施例
包括下列实施例来示范本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，下列实施例中公开的技术代表本发明人已发现非常适合于本发明的实施，并从而被认为构成用于其实施的优选模式的技术。然而本领域技术人员应当理解的是，根据本发明的公开内容，在具体的公开的实施方案中可进行许多改变但仍然可在不背离本发明的精神和范围的情况下获得相同或相似的结果。
实施例1–将“睡美人”和人工抗原呈递细胞临床应用于来自外周和脐带血的经遗传修饰的T细胞–材料和方法
来自PB和UCB的单核细胞(MNC)的分离。在第0天或第0天之前，用等体积的PBS-EDTA稀释PB以及用4倍体积的PBS-EDTA稀释UCB。缓慢地将稀释的血液(25mL)铺在50mL离心管中的Ficoll(12mL)上，并以400x g离心30-40分钟(无间断)。使用移液管收集单核细胞级分(界面)并将其转移至新鲜的50mL离心管中。用PBS-EDTA将体积添加至50mL，并以450x g离心10分钟。抽吸上清液，随后轻轻地将细胞沉淀重悬浮于50mL的完全培养基(CCM)中。以400x g离心10分钟。将细胞沉淀轻轻地重悬浮和汇集在CCM中，并使用台盼蓝排除法(Cellometer,PBMC程序)进行细胞计数。可将MNC用于电穿孔(核转染)或冷冻保存以待将来使用。
用于在第0天电穿孔的T细胞的制备。如果使用冷冻保存的MNC，则在37℃的水浴中迅速解冻足够的细胞以用于满刻度电穿孔(2×108，添加约20％以占在离心过程中的细胞损失，和2小时孵育)。轻轻地重悬浮细胞并将其转移至含有预温热的完全不含苯酚的RPMI培养基(PF-RPMI)的适当尺寸的离心管中，以200×g离心10分钟(无间断)，并吸出上清液。随后，如果使用新鲜分离的MNC，则将MNC重悬浮于PF-RPMI中，进行细胞计数(Cellometer)并将细胞以106个细胞/ml的浓度转移至适当尺寸的细胞培养容器中。将细胞在加湿的37℃/5％CO2的培养箱中孵育2小时±30分钟。将MNC转移至无菌离心管中，以200×g旋转5分钟(无间断)，吸出上清液，随后将细胞沉淀轻轻重悬浮于PF-RPMI中并将其组合。进行细胞计数(Cellometer)和计算所需的细胞悬浮液(2×108MNC)的体积。将计算的体积转移至无菌的50mL离心管中并以200×g旋转10分钟(无间断)。吸出上清液，以使无残留培养基剩余，并通过轻敲管的侧面来轻轻地重悬浮。
在第0天进行的MNC的电穿孔(核转染)(使用10个比色皿的满刻度法)。在加湿的37℃/5％CO2培养箱中预孵育无菌12孔板，其中10个孔含有4mL温PF-RPMI。在BiosafetyCabinet(BSC)中制备和预温热Lonza Nucleofector溶液人T细胞试剂盒(LonzaNucleofector Solution Human T cell kit)(按照制造商的说明书重建的，www.lonza.com)至环境温度。通过添加100μL的被Nucleofector溶液、15μg转座子(称为CD19RCD28/pSBSO的超螺旋DNA质粒)和5μg转座酶(称为pCMV-SB11的超螺旋DNA质粒)/反应/比色皿制备Nucleofector染溶液/DNA预混合物。通过轻敲离心管侧面分散MCN细胞沉淀，将其以2×107个细胞/100μL的终细胞浓度重悬浮于核转染溶液/DNA预混合物中。小心地将100μL细胞悬浮液转移至10个Lonza核转染比色皿的每一个，小心避免气泡。敲打比色皿一次，并使用程序U-014(用于未刺激的T细胞)进行电穿孔。将比色皿和12孔板转移至BSC。通过添加来自对应孔的约500μL预温热的培养基，使用Amaxa细尖移液管从每一个比色皿收集电穿孔的细胞，随后将板返回加湿的37℃/5％CO2培养箱持续2小时±30分钟。孵育2小时后，从所有孔收集细胞并将其转移至无菌离心管。通过在环境温度、无间断下以140×g离心8分钟来洗涤细胞，弃去上清液以便无残留培养基覆盖细胞沉淀。通过轻轻敲打离心管的侧面分散细胞沉淀，随后轻轻重悬浮于CCM中，以获得单细胞悬液。进行细胞计数，将细胞浓度在CCM中调整至106个细胞/mL。将所述细胞悬液转移至细胞培养瓶中，并置于培养箱中过夜。对于对照EGFP转染的细胞可使用相同的方法(5×106个细胞/比色皿，利用5μg Amaxa对照EGFP超螺旋质粒，pmaxGFP)。
在第1和随后的刺激周期的第1天通过流式细胞术进行的CAR表达的分析。收集电穿孔的细胞并使用台盼蓝排除法(血细胞计数器)进行细胞计数。利用对于CD3、CD4、CD8特异的抗体和人IgG Fcγ对细胞(1-2×106)进行染色，作为CAR表达的量度。在FACS Calibur上获得细胞，使用FCS Express软件分析数据以计算CAR的表达。通过以下公式计算培养物中的CAR+细胞：(总的活细胞数目)x(％CAR+细胞)＝CAR+细胞的数目。
在第1和随后的刺激周期的第1天进行的aAPC(克隆#4)的制备。从K562细胞(获自美国典型培养物保藏中心的亲代品系)衍生aAPC(克隆#4)以共表达所需的T细胞共刺激分子。在37℃水浴中解冻冷冻的经100Gy辐照的aAPC的等份试样。通过在CCM中以400×g离心10分钟洗涤细胞2次，随后使用Cellometer(台盼蓝排除法)进行计数。计算用于刺激所需的活aAPC的数目：(CAR+细胞的数目)x 2＝所需的经辐照的aAPC的数目
在第1和随后的刺激周期开始的第1天进行的CAR+T细胞的aAPC介导的刺激。在无菌容器中将电穿孔的细胞(表达CAR)与经γ辐照的aAPC(克隆#4)以1:2的比率(CAR+细胞:活aAPC)于CCM中混合。注意，在电穿孔后当天基于流式细胞术就CAR的表达调整aAPC比率。将IL-21(30ng/mL)添加至细胞悬液中。以106个细胞/mL的浓度在T-75cm2培养瓶和/或VueLife培养袋中等分，随后将其返回培养箱。
在第3和5天进行的CAR+T细胞的连续培养。进行半培养基改变，补充IL-21，和以106个细胞/mL的浓度维持T细胞。
第7天第一aAPC介导的刺激周期的结束。收集T细胞，计数，并对其CD3、CD4、CD8和Fcγ(CAR)进行染色。
电穿孔后7至14天CD56+细胞的耗竭。如果CD56+CD3neg淋巴细胞≥10％，使用顺磁珠粒进行CD56耗竭。
在对应于第8→14天、第15→21天和第22→28天的刺激周期#2、#3和#4过程中递归添加aAPC以将T细胞繁殖至临床上足够的数目。重复刺激过程高达4次。将IL-2(50U/mL)添加至始于第7、14和21天和随后每一次培养基改变时(按照周一-周三-周五的安排，每周3次)的培养物。视需要，使用程序降温仪冷冻保存(归档)过量T细胞以用于释放测试和输注。
实施例2–将“睡美人”和人工抗原呈递细胞临床应用于遗传修饰来自外周血和脐带血的T细胞–结果
可将DNA质粒的电转移和T细胞在经γ辐照的aAPC上的扩增用于产生具有临床吸引力的数目的来源于PB和UCB的T细胞，以用于人应用。这些经遗传修饰的T细胞表达引入的CAR，其不依赖于主要组织相容性复合物识别TAA CD19。先前已描述了表达(i)转座子，通过CD28和CD3-ε14发信号的第2代CAR(CD19RCD28)和(ii)转座酶SB11(Jin等，2011)的SB衍生的DNA质粒(Singh等，2011；Davies等，2010；Kebriaei等，2012)。用于本研究的质粒由WaismanClinical Biomanufacturing Facility(Madison,WI)商业产生。来源于K562细胞(获自美国典型培养物保藏中心的亲代品系)的aAPC(克隆#4)共表达所需的T细胞共刺激分子(90％的aAPC细胞表面上的每一个引入的分子)，如先前所描述的(Manuri等，2010)。此处，可使用SB转座引入CAR，随后添加aAPC以以CAR依赖性方式数字扩增T细胞来从来源于PB和UCB的单核细胞(MNC)产生CD19特异性T细胞(图1和4)(Singh等，2011；Singh等，2008)。对于每一个接受者，使用15μg的编码转座子(CAR)的DNA质粒(CD19RCD28/pSBSO)和5μg的编码转座酶(SB11)的DNA质粒(pCMV-SB11)对10个比色皿(2x107MNC/比色皿)进行电穿孔。如果MNC有限或被按比例缩减以用于实验室工作，则可减少比色皿的数目。电穿孔当天被定义为刺激周期#1的“第0天”。作为流式细胞术和培养条件的对照，对自体T细胞进行模拟电穿孔(无DNA质粒)，并将其在经γ辐照的aAPC(克隆#4)上进行数字扩增，所述aAPC已预加载了OKT3以交联CD3来支持T细胞增殖。常规地评估电穿孔后当天T细胞的电转移效率和活力(图2B)。该起始时间点上的EGFP从对照DNA质粒(被称为pmaxGFP)的表达和CAR的表达反映来自整合的质粒和附加型质粒的蛋白质表达。通常地，在电穿孔后当天EGFP表达被测量为60％，并且CAR表达被测量为约40％(图2A)，T细胞活力为40％-50％。在可溶性重组人IL-2和IL-21存在的情况下经γ辐照的aAPC的递归添加恢复稳定地表达CAR(CD19RCD28)的T细胞。如果这些NK细胞的百分比≥10％，尤其如果T细胞上表达的CAR的百分比低，则使用CD56特异性顺磁珠粒从培养物耗竭CD3negCD56+NK细胞。该耗竭阻止干扰aAPC支持CAR+T细胞的增殖的能力的NK细胞的快速过度生长。偶尔地，在最后两个刺激周期中从CAR+T细胞耗竭NK细胞，但这因CD56在一些CAR+T细胞上的共表达而引入了所需细胞的丢失。使用VueLife培养袋在功能上封闭的系统中使所述T细胞生长，通过第14天。通常在于aAPC上共培养的第14天或第21天(刺激周期#2或#3结束时)冷冻保存一个亚组的经遗传修饰的和繁殖的T细胞，以用作用于将来分析的归档材料的来源，以及如果在制造过程中随后发生预料之外的问题，则将其解冻。通常在培养的第28天或其附近(图3)收集常规地表达>90％的CAR并且>80％是活的的T细胞(图2C,D)。在于aAPC上共培养4周后，CD3+T细胞的平均倍数扩增为19,800±11,313，其中CAR+表达为90％±7.5％(Singh等，2011)。将这些T细胞冷冻保存，并且经历过程中和释放测试，所述测试提供关于制造的产品的安全性和治疗潜力的信息。遵照临床实验室改进修正案(CLIA)进行相关测试以在输注入进行临床试验的接受者之前产生化验证明书。
实施例3-使用“睡美人”和人工抗原呈递细胞制造稳定地表达嵌合抗原受体的临床级CD19特异性T细胞–材料和方法
临床级DNA质粒的产生。SB转座子CoOpCD19RCD28/pSBSO在由延伸因子-1α(EF-1α)(Kim等，1990)和人T细胞白血病病毒(HTLV)的5’非翻译区(Singh等，2011；Davies等，2010)组成的EF-1/HTLV杂交复合启动子(InvivoGen)下表达人密码子优化的(CoOp)第二代CoOpCD19RCD28CAR(SEQ ID NO:1)。该DNA质粒的衍生描述于图10中。从DNA质粒pCMV-SB11(Singh等，2011)顺式表达在巨细胞病毒(CMV)启动子下的SB转座酶SB11。该DNA质粒的衍生描述于图11中。对两种质粒的整体进行测序，并且由Waisman Clinical BiomanufacturingFacility(Madison,WI)使用卡那霉素(用于细菌菌株大肠杆菌(E.coli)DH5α的选择)制造所述质粒。DNA质粒的发布标准示于表1中。使用DNA质粒ΔCD19CoOp-F2A-Neo/pSBSO表达CD19(图12)。
表1:编码SB转座子和转座酶的DNA质粒的发布标准
Figure BDA0000904213610000621
细胞计数。将台盼蓝排除法用于区分活细胞与死细胞并使用Cellometer(Nexecelom Bioscience)来计数(Singh等，2011)。
PBMC的分离。来自两个男性志愿者健康供体的白细胞去除产品购自KeyBiologics LLC(Memphis,TN)。通过改造Biosafe Sepax系统(Eysins,Switzerland)以适合用于遵照cGMP的工作来分离外周血单核细胞(PBMC)。简言之，在关闭CS-900试剂盒上的所有磁夹后，通过60mL注射器将100mL Ficoll(GE Healthcare)经由Luer锁定连接器无菌地转移至密度梯度培介质袋(“蔗聚糖袋(ficoll bag)”)，并使用手持式封口机(Sebra，型号2380)热封输液管。将试剂盒spike-连接至用于洗涤的1,000mL的袋(含有CliniMACS缓冲液(PBS/EDTA,Miltenyi,Cat#70026)和20mL 25％人血清白蛋白(HSA)(Baxter)(2％v/v，洗涤缓冲液)、终产品袋[300mL带耦合器的传输包(Baxter/Fenwal 4R2014)]和试剂/血液袋。通过使用基于密度梯度的分离方案(v126)，将注射器柱塞加载至离心小室中，并关闭Sepax单元的盖子。悬挂试剂/血液袋和产品袋，并将所有活塞置于‘T’位置中的旋转销上。在连接压力传感器线后，通过自动一次性使用测试验证试剂盒，随后使用重力流量手工引发试剂盒。在周期完成后，将终产物无菌地转移至离心管中，并利用洗涤缓冲液和磷酸盐缓冲盐水(PBS)各自洗涤(以400g离心10分钟)一次。计数后，在程序降温仪(Planer Kryo 750)中使用BM5程序(以-2℃/分钟的速率从4℃至-4℃，以-35℃/分钟的速率从-4℃至-60℃、以8℃/分钟的速率从-60℃至-20℃、以-2.5℃/分钟的速率从-20℃至-45℃、以-10℃/分钟的速率从-45℃至-80℃)，在CryoMACS冷冻袋(Miltenyi)和小瓶(Nunc)中使用冷冻保存介质(50％HSA,40％Plasmalyte,10％DMSO)冷冻保存细胞。
aAPC(克隆#4)原始和工作细胞库的制造。在宾夕法尼亚大学利用慢病毒转导K562来产生aAPC(克隆#4，命名为CJK64.86.41BBL.GFP.IL-15.CD19)，所述aAPC共表达(i)CD19、(ii)CD64、(iii)CD86、(iv)CD137L和(v)膜结合的IL-15(mIL15)(作为与EGFP的双顺反子载体)。在含有10％热失活的成分明确FBS(Hyclone)和以5x105个细胞/mL维持细胞的2mMGlutamax-1(Life Technologies-Invitrogen)培养基(CM)的HyQ RPMI 1640(Hyclone)中数字扩增aAPC。通过细胞疗法的生产援助(Production Assistance of CellularTherapies)(PACT)产生320个小瓶的原始细胞库(MCB)(表2)。随后在MDACC产生200小瓶来源于MCB的克隆4aAPC的工作细胞库(WCB)，并对其进行测试(表3)。
表2:K562衍生的aAPC(克隆#4)原始细胞库的发布标准
Figure BDA0000904213610000641
Figure BDA0000904213610000651
表3:K562衍生的aAPC(克隆#4)工作细胞库的发布标准
Figure BDA0000904213610000652
选择性繁殖CAR+T细胞的aAPC(克隆#4)。将经γ辐照的aAPC用于数字扩增经遗传修饰的T细胞。在VueLife细胞培养袋中将解冻的来自WCB的aAPC在CM中繁殖长达60天，使用Biosafe Sepax II收集法来收集所述细胞。简言之，将CS-490.1试剂盒通过Luer锁定连接与300mL输出袋(transfer pack)连接。将分离槽安装在小凹中，将输液管插入光学传感器和在T位置中对齐的活塞中。在连接压力传感器线后，将产品袋和上清液/血浆袋挂在支持架上。从Sepax菜单选择修改的方案PBSCv302并将待处理的输出产物的体积(初始体积)设置为≤840mL。在验证和试剂盒测试后，开始程序。在完成后，移走袋子，关闭磁夹，移走试剂盒。无菌地取出来自终产品袋的细胞，用培养基(10％的Plasmalyte中的HSA)洗涤2次，随后计数。使用CIS BIO International辐射器(IBL-437C#09433)辐照(100Gy)aAPC，随后使用程序降温仪(Planer Kryo 750)在冷冻保存培养基中冷冻保存所述细胞以待以后使用。
aAPC的OKT3-加载。将加载有OKT3(通过CD64)的aAPC(克隆#4)用于繁殖未曾经历遗传修饰的对照(CARneg)自体对照T细胞。将获自培养物的aAPC在称为加载介质(LM)的含有0.2％乙酰半胱氨酸(Acetadote,Cumberland Pharmaceuticals)无血清X-Vivo 15(目录号04-744Q,Lonza)中孵育过夜。第二天洗涤细胞，使用Gamma Cell 1000Elite Cs-137辐射器(MDS Nordion)辐照(100Gy)所述细胞，将其以106个细胞/mL的浓度与1μg/106个细胞的功能级纯化的抗人CD3(克隆-OKT3,16-0037-85,eBioscience)一起重悬浮于LM中，并在4℃下于3-D旋转器(Lab-Line)上伴随轻轻搅拌孵育30分钟。在用LM洗涤3次后，将细胞用于实验或在蒸汽层中以等份试样在液氮中冷冻以待以后使用。
CAR+T细胞的制造。将解冻的PBMC与(ii)编码CD19RCD28CAR转座子的DNA质粒(CoOpCD19RCD28/pSBSO)(15μg超螺旋DNA/2×107PBMC/比色皿)和(iii)编码SB11转座酶的DNA质粒(pCMV-SB11)(5μg超螺旋DNA/2×107PBMC/比色皿)一起重悬浮于(i)人T细胞试剂盒(目录号VPA-1002,Lonza；在1个比色皿中，100μL，用于2×107个细胞)。将该混合物立即转移至比色皿(Lonza)，使用Nucleofector II(Amaxa/Lonza)进行电穿孔(定义培养第0天)，将其在10％RPMI完全培养基中静置2至3小时，并在半培养基改变后，于37℃、5％CO2下孵育过夜。第2天，收集细胞，对其进行计数，通过流式细胞术进行表型分型，将其以与1:2(CAR+T细胞:aAPC)的比率与经γ辐照的aAPC共培养，这标记培养第1天和7天的刺激周期的开始。分别地从第1天至第7天按照周一-周三-周五的安排添加IL-21(目录号AF-200-21,PeproTech)和IL-2(目录号NDC 65483-116-07,Novartis)。NK细胞可阻止CAR+T细胞的数字扩增，尤其当它们的过度生长在组织培养过程的早期发生时。因此，如果CD3negCD56+细胞≥10％，则在含有25％HSA(80μL/107个细胞)的CliniMACS缓冲液中的LS柱(目录号130-042-401,Miltenyi Biotech)上使用CD56珠粒(目录号70206,Miltenyi Biotech,20μL珠粒/107个细胞)进行CD56耗竭。如上所述使用程序降温仪(Planer Kryo 750)在电穿孔后培养的第21天和第3轮刺激周期结束时将T细胞冷冻保存作为备份，并将其在液氮(蒸汽层)中保存。将总T细胞、CD3+和CAR+T细胞的细胞计数随时间绘图，使用线性回归测定斜率。使用学生t检验比较倍数扩增结果。计算每一个时间点和验证运行的CD4/CD8比率，并计算其平均值。
CARneg对照T细胞的产生。作为对照，在7天的刺激周期中以1:1的比率将5x106个模拟转染的PBMC与经辐照并加载有抗CD3(OKT3)的K562衍生的aAPC克隆#4共培养。从培养的第1天开始一直往后给所有培养物补充IL-21(30ng/mL)，并且在培养开始后7天开始补充IL-2(50U/mL)。随后按照周一-周三-周五的安排添加所有细胞因子。
细胞系。如先前所述(Singh等，2011)，培养CD19+Daudiβ2m[伯基特淋巴瘤，共表达β2微球蛋白，(Rabinovich等，2008)]和CD19+NALM-6(前B细胞)。使用构建体ΔCD19CoOp-F2A-Neo/pSBSO修饰来自ATCC的EL-4细胞(小鼠T细胞淋巴瘤细胞系)以表达CD19。简言之，将5x106个EL-4细胞重悬浮于100μL的具有SB转座子(ΔCD19CoOp-F2A-Neo/pSBSO,3μg)和SB转座酶(pCMV-SB11,1μg)的Amaxa Mouse T cell Nucleofector试剂盒(目录号VPA-1006)中，并使用Nucleofector II(Lonza)进行电穿孔(程序X-001)。将转化子在杀细胞浓度的G418(0.8mg/mL)中进行培养，并经历CD19的均一表达的荧光激活细胞分选(FACS)，以获得克隆(克隆#17)。从ATCC获得Jurkat细胞，并使用Amaxa/Lonza Nucleofector溶液(试剂盒V)利用CoOpCD19RCD28mz(CoOp)/pSBSO进行电穿孔(程序T-14,Nucleofector II,Lonza)。电穿孔后2周，稳定地表达CAR的JurkaT细胞经历对于CAR的匀一表达的FACS以获得克隆(克隆#12)(Maiti等，2013)。将细胞系维持在补充有2mM Glutamax-1(Invitrogen)和10％热失活的胎牛血清(FCS)(Hyclone；10％RPMI)的HyQ RPMI 1640(Hyclone)中。按照机构细胞系认证策略(institutional cell line authentication policy)使用STR分析或核型分析验证所有细胞系。
细胞的免疫表型。在4℃下使用100μL FACS缓冲液(2％FBS,0.1％叠氮化钠)中的抗体(表4)对细胞进行染色持续30分钟。对于细胞内染色，在固定/透化20分钟后，在4℃下利用适当的抗体在烫洗涤缓冲液中对细胞进行染色。使用FACSCalibur(BD Bioscience)进行获取，以及使用Cell Quest(BD Bioscience)或FCS Express 3.00.0612(De Novo软件，Thornhill,Ontario,Canada)进行分析。
表4:用于流式细胞术的抗体。
Figure BDA0000904213610000681
Figure BDA0000904213610000691
蛋白质印迹。如先前所述(Singh等，2008)评估来源于CD19RCD28的嵌合CD3-ζ(73-kDa)的蛋白质表达。简言之，使用iBlot Dry印迹系统(Invitrogen)将蛋白质裂解物转移至硝酸纤维素膜上，与用抗人CD3-ζ单克隆抗体(目录号551033,0.5μg/mL,BD Biosciences,CA)，随后与缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG(目录号1858413,1:10,000；Pierce,IL)孵育，使用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity底物(Pierce,IL)进行显影，随后使用VersaDocTM4000凝胶成像系统(BioRad,CA)捕获化学发光。
通过荧光原位杂交和流式细胞术(Flow-FISH)进行的端粒长度分析。按照制造商的说明书，通过使用端粒PNA试剂盒(Telomere PNA kit)/用于流式细胞术的FITC(DAKO)测量T细胞的端粒长度。简言之，在82℃下将分离的细胞(CD4或CD8)和对照细胞(目录号85112105,CEM-1301细胞系；ECACC)以等同的量度在具有或不具有FITC标记的端粒PNA探针的杂交溶液中混合10分钟；在室温下于黑暗中杂交过夜；在40℃下用洗涤溶液洗涤2次；重悬浮于含有2％FCS和碘化丙啶(1μg/mL)的PBS中；和在FACSCalibur(BD Biosciences)上进行分析。将FITC标记的荧光校准珠粒(目录号824A,QuantumTMFITC MESF,BangsLaboratories)用于流式细胞仪的校准。通过按照下式将T细胞与CEM-1301细胞系比较来测定相对端粒长度(RTL)：
Figure BDA0000904213610000701
铬释放测定。使用51Cr-标记的靶细胞在标准4小时铬释放测定中评价T细胞的细胞毒性。将T细胞以1x105、0.5x105、0.25x105、0.125x105和0.0625x105个细胞/孔与5x103个靶细胞一起一式三份涂铺在96孔V型底板(Costar)中。孵育后，将50μL上清液收集至LumaPlate(Perkin Elmer)上，在TopCount NXT(Perkin Elmer)中读数，随后按下式计算百分比特异性裂解：
Figure BDA0000904213610000702
通过测量与CM或0.1％Triton X-100(Sigma)一起孵育的靶细胞的条件上清液中的铬来分别测定自发释放和最大释放。
内毒素测试。按照制造商的指导方针使用
Figure BDA0000904213610000703
-PTS Portable测试系统(Charles River Laboratories)测定终产物中的内毒素水平。所述测试具有0.01-10EU/mL的检测限，其可被转换成EU/患者重量。
支原体属测试。按照制造商的说明书使用TaKaRa Mycoplasma检测试剂盒(Clontech)进行利用PCR的支原体属检测。
T细胞受体Vβ库。使用与CD3特异性mAb(目录号340949,BD Biosciences,10μL)和同种型匹配的对照mAb(目录号552834,BD Biosciences)结合使用的一小组24个TCR Vβ特异性mAb(目录号IM3497,IO TEST Beta Mark TCR-Vβ库试剂盒，Beckman Coulter)来测定CAR+T细胞培养的第28天和第35天的T细胞受体(TCR)-Vβ使用。
测定整合的CAR的拷贝数的实时PCR。为了测定在经遗传修饰的T细胞中整合的CD19RCD28CAR的拷贝数，使用Steponeplus实时PCR系统(Applied Biosystems)，利用以下引物：正向(5’-CAGCGACGGCAGCTTCTT-3’；SEQ ID NO:8)，反向(5’-TGCATCACGGAGCTAAA-3’；SEQ ID NO:9)和探针(5’-AGAGCCGGTGGCAGG-3’；SEQ ID NO:10)在PCR反应(50℃，2分钟；95℃，10分钟；随后进行40个循环(95℃，15秒和60℃，1分钟)中扩增50-100ng基因组DNA(目录号80204,AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒，Qiagen)。用于PNA酶P基因的引物(目录号4316844,Applied Biosystems)用作内部对照。将来自含有1个拷贝的来自CD19RCD28mz(CoOp)/pSBSO DNA质粒的CAR的经遗传修饰的JurkaT细胞(克隆#12)的系列稀释基因组DNA用于产生标准曲线(Maiti等，2013)。所有引物、探针和TaqMan基因表达预混液(TaqManGene Expression Master Mix)购自Applied Biosystems。
用于SB11转座酶的PCR。使用热循环仪(PTC-200,DNA Engine,BioRad)，在PCR反应(95℃，5分钟；25个循环：95℃，15秒；58℃，40秒；72℃，60秒；随后在72℃进行终延伸7分钟)中使用正向(5’-ATGGGAAAATCAAAAGAAATC-3’；SEQ ID NO:11)和反向(5’-CTAGTATTTGGTAGCATTGC-3’；SEQ ID NO:12)引物来扩增从CAR+T细胞分离的DNA(20ng)(AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒，Qiagen)。将GAPDH用作管家基因，并在相同的PCR反应中使用正向(5’-TCTCCAGAACATCATCCCTGCCAC-3’；SEQ ID NO:13)和反向(5’-TGGGCCATGAGGTCCACCACCCTG-3’；SEQ ID NO:14)引物来进行扩增。将线性化的pCMV-SB11质粒DNA(1ng)和来自稳定地表达SB11和EGFP(从DNA质粒SB11-IRES2-EGFP表达)(Maiti等，2013)的经遗传修饰的JurkaT细胞的基因组DNA(20ng)用作阳性对照。将模拟电穿孔的(无DNA)和通过OKT3-aAPC繁殖的T细胞用作阴性对照。
评估不期望的自主T细胞生长的测定。为监测异常T细胞生长，将2x105个在4个aAPC介导的刺激周期(电穿孔后28天)后收集的CAR+T细胞一式三份培养在24孔组织培养板中，持续另外18天。(i)阳性对照：aAPC和细胞因子(50U/mL IL-2和30ng/mL IL-21)的存在。(ii)测试：aAPC和细胞因子的不存在。当第18天的总的活细胞(i)>2x105个细胞(对于在aAPC和细胞因子存在的情况下培养的CAR+T细胞)和(ii)<2x104个细胞(对于aAPC和细胞因子不存在的情况下培养的CAR+T细胞)时，经遗传修饰的T细胞通过测定。
G-带核型分析。收集共培养结束时的CAR+T细胞，并使用标准方法，使用吉姆萨染色剂(Giemsa stain)对载玻片进行染色。分析了总共20个G-带分带的中期。
实施例4–使用”睡美人”和人工抗原呈递细胞制造稳定地表达嵌合抗原受体的临床级CD19特异性T细胞–结果
aAPC(克隆#4)。将充当aAPC(克隆#4)的K562用于选择性繁殖CAR+T细胞。使用体积减小法(其花费约40分钟)通过Sepax II装置从VueLife袋收集培养的aAPC。平均处理前体积和aAPC计数分别为575mL(范围500-700mL)和4.9x108(范围3.2x108至7.7x108)。在用Sepax II处理后，细胞的平均回收率为108％(范围75％至136％)，其中125mL(范围50-200mL)的输出体积导致78.3％(范围60％至91.6％，图5A、B)的平均体积减小。自动细胞回收与手动体积减小方法(82％)(其花费45分钟的持续操作时间并且导致91％的体积减小)相似。通过流式细胞术定期监测aAPC的>80％的引入的编码CD19、CD64、CD86、CD137L和EGFP(作为mIL15的表达的标志物)的转基因的表达。在产生MCB和WCB后以及在每一次向T细胞培养物添加经γ辐照的aAPC(标志每一个刺激周期的开始，图5C)后进行免疫表型分型。克隆4aAPC的MCB和WCB对于细胞和细胞上清液上的无菌性和支原体属测试为阴性。在生物安全性测试中，通过外来病毒测试、有复制能力的逆转录病毒测试和对人致病病毒的范围的筛选未检测到病毒。基于指纹分析测试确认aAPC(克隆#4)来源于K562(表5)。
表5:K562aAPC(克隆#4)的STR指纹分析
STR K562aAPC(克隆4)
AMEL X
CSF1PO 9,10
D13S317 8
D16S539 11,12
D18S51 15,16
D19S433 14,14.2
D21S11 29,30,31
D2S1338 17
D3S1358 16
D5S818 11
D7S820 9,11
D8S1179 12
FGA 21
TH01 9.3
TPOX 8,9
vWA 16
CAR+T细胞的制造。对CD19-特异性CAR+T细胞的大规模生产进行验证研究以确定PBMC可被电穿孔和繁殖至临床上有意义的数目(Huls等，2013)(图6)以及满足预先确定的发布标准(表6)。使用Sepax细胞处理系统处理两种正常供体血浆分离置换产物以分离单核细胞(MNC)。在两个批次(约100mL/批次)中处理所述血浆分离置换产物201mL(供体1)和202mL(供体2)，产生50mL输出产物。血浆分离置换产物的处理前计数与处理后计数相似。从供体1和供体2分离分别含有40.5％和51％CD3+T细胞的总共5.3x109和7.1x109个细胞。随后将样本以等份试样(4x107个细胞/mL)冷冻保存在CryoMACS冷冻袋(10mL)和参照冷冻小瓶(1mL)中以待以后使用。进行3个单独的验证实验，并将其概述于表6中。对于验证运行1和2(V1、V2)使用来自供体1的细胞，对于验证3(V3)使用来自供体2的细胞。对于每一个运行，将新鲜解冻的PBMC电穿孔并在单独的培养过程进行离体数字扩增(表7)。在培养的第0天，将3x108(V1)和8x108(V2、V3)个细胞解冻(活力，88.9％至97.6％)并在电穿孔前静置2小时。利用CD19RCD28mz(CoOp)/pSBSO转座子和pCMV-SB11转座酶DNA质粒以2x107个细胞/比色皿对2至3x108个细胞(V1＝2x108；V2和V3＝3x108)进行电穿孔，并在第2天(培养的第1天)基于CAR表达将其与aAPC克隆#4共表达。在培养的第1天评估3个验证运行的电穿孔效率，如通过CAR的表达(33.7％、25.5％和47.1％)测量的。共培养结束时(培养的第28天)的CAR表达为92％、99.2％和96.7％，并且培养物含有平均95％±5.3％的CD3+T细胞，污染性CD19+细胞(平均＝0.7％±0.15％)和CD32+aAPC(平均＝0.6％±0.6％，图7A，表6)的量可忽略不计。本发明人还通过使用CD3-ζ链特异性mAb的电穿孔的/繁殖的T细胞的全细胞裂解物的蛋白质印迹进一步确认CAR表达，显示预期的73-kDa嵌合ζ链(Singh等，2008)(图7B)。在观察aAPC上生长的T细胞的动力学后，本发明人在第二周的培养结束时(刺激周期2结束时)观察到加速的T细胞繁殖的速率，这与相较于刺激的第一周中的倍数扩增的增加的总T细胞(p＝0.01)和CD3+(p＝0.01)T细胞的倍数扩增一致。总的T细胞(p＝0.01，p<0.001)、CD3+(p＝0.03，p<0.001)、CAR+(p＝0.02，p<0.001)T细胞的第三和第四周结束时的周倍数扩增分别一致地高于第一周的周倍数扩增(图13)。
表6：用于释放电穿孔的和繁殖的T细胞的接受标准
Figure BDA0000904213610000741
Figure BDA0000904213610000751
Figure BDA0000904213610000761
本发明人观察到第一周刺激后CD3+与CAR+T细胞的相似的周倍数扩增。在经γ辐照的aAPC上共培养4周后，存在平均545倍的CD3+T细胞的数字扩增，CAR+T细胞具有1,111倍扩增。离体扩增(培养的第28天)导致平均2.86x1010个CD3+T细胞，其几乎全部为CAR+(2.65x1010)。3个验证运行的总的T细胞(p＝0.18)、CD3+(p＝0.17)和CAR+(p＝0.2)T细胞的繁殖动力学相似(图8A、B、C)。这些数据支持用于CD19特异性T细胞的选择性产生的aAPC的递归添加。
电穿孔和繁殖的CAR+T细胞的免疫表型。3个验证运行中的2个导致CD8+CAR+T细胞(平均76％±22％)相较于CD4+CAR+T细胞(平均16％±24％)的优先生长(图7C)，这可通过包含IL-21预测(Singh等，2011)。在共培养过程中调节CAR+T细胞的平均CD4/CD8比率，因为在aAPC上共培养开始时(培养的第1天，比率＝3.3)CD4+CAR+T细胞占优势，从而导致在培养的第14天等量的CD4+CAR+和CD8+CAR+T细胞(比率＝0.9)，此后比率下降(培养的第21天，比率＝0.4；培养的第28天，比率＝0.3)。总的CD4/CD8比率遵照相似的趋势，并随时间过去下降(表7)。繁殖期结束时(培养的第28天)的CAR+T细胞被活化(CD69表达，平均43.6％；HLA-DR表达，平均61.2％)，能够细胞裂解(粒酶B表达，平均92.3％)并且表达记忆/初始T细胞的标志物(CD62L表达，平均45.6％；CD28表达，平均66.4％；CD27表达，平均77.5％，CD45RA表达，平均99.7％)。本发明人不能检测衰竭/衰老的细胞表面标志物(PD-1表达，平均2.7％；CD57表达，平均3.3％)(图7D)。这些数据与支持CAR+T细胞的异质群体的产生的aAPC一致。
CAR+T细胞的重定向特异性。从所有3个验证运行产生的T细胞能够特异性裂解CD19+肿瘤靶。在20:1的效应子与靶的比率下平均57％±4％(平均±SD，范围61.2％至53.8％)Daudiβ2m和49％±7％(平均±SD，范围，41％至54％)NALM-6被裂解。在20:1的效应子/靶比率下，CD19特异性杀伤经显示对CD19+EL-4(范围，4.2至9.2倍)的杀伤为对CD19neg亲代EL-4细胞的平均6.2±2.6(平均±SD)倍，其中CARneg(模拟电穿孔的)对照产生1.4±1(平均±SD)倍本底CD19特异性裂解(图8D,14)。这暗示电穿孔的和繁殖的T细胞中的CAR使对CD19的杀伤重定向。
由经遗传修饰的和繁殖的T细胞引起的不希望的自主增殖的缺乏。本发明人在K562aAPC和细胞因子(IL-2和IL-21)存在/不存在的情况下评估CAR+T细胞的生长，以排除因通过SB转座引起的潜在遗传毒性而导致的异常T细胞生长。在18天的培养结束时，本发明人观察到未接受细胞因子和aAPC的经遗传修饰的T细胞中的<2×104个细胞(平均2,800，范围0.0-5.6×103)，而接受细胞因子和aAPC的对照组数字扩增至平均7.6×107个细胞，范围4.12×107至12.8×107(表8)。这些数据表明CAR+T细胞在撤除生长因子和抗原刺激后不能维持扩增。
表8:由经遗传修饰的T细胞引起的自主细胞生长的缺乏
Figure BDA0000904213610000781
a当接种T细胞时培养的天数
b实验开始时培养物中接种的T细胞的总数
c在细胞因子和aAPC不存在的情况下计数的T细胞的总数
d在细胞因子和aAPC存在的情况下(阳性对照)计数的T细胞的总(推断的)数
e完美的倍数变化＝[(c/b)÷(d/b)]*100
表9:用于电穿孔和繁殖的T细胞的过程中测试
Figure BDA0000904213610000791
CAR+T细胞中的端粒长度。端粒长度为细胞分化和至衰老的进展的重要量度。因此，为了评估CAR+T细胞的SB转座和离体数字扩增对端粒长度的影响，本发明人使用Flow-FISH测定将来自CAR+T细胞(培养的第28天)的端粒长度与它们各自的匹配的未操作的对照(电穿孔前)相比较。由于V1和V2中占优势的CD8+CAR+T细胞和V3中占优势的CD4+CAR+T细胞的产生，本发明人将CD8+T细胞(对于V1和V2)和CD4+T细胞(对于V3)的端粒长度分别与来自繁殖前的CD8+和CD4+T细胞比较(图9A)。离体数字扩增后T细胞的平均端粒长度(培养的第28天，8.93％±1.33％)与未操作的对照T细胞的平均端粒长度(第0天，7.77％±1.21％)相似。这些结果表明CAR+T细胞的电穿孔和繁殖不导致端粒长度的侵蚀。
CAR转基因的拷贝数。使用CD19RCD28+Jurkat细胞克隆#12作为参照以及内源RNA酶P作为标准化者来测定整合的CD19RCD28转基因的拷贝数(Maiti等，2013)。验证运行中产生的每T细胞的平均转基因拷贝为0.96±0.09(范围，0.75至1.07，图9B)。这些数据表明SB转座导致约1个整合的拷贝的CAR/T细胞基因组。
TCR Vβ使用。T细胞的电穿孔和繁殖可导致可指示优先生长和从而为遗传毒性事件的指示剂的T细胞的寡克隆或克隆群体的出现。因此，本发明人通过流式细胞术作为评估库多样性的工具来评估TCR Vβ使用。在aAPC上共培养28天后，所有测试的24个TCR Vβ家族保持在T细胞中，这与电穿孔前的库相似。此外，在延长培养时间后TCR Vβ家族得到保持(培养的第35天，图9C)。这些数据表明培养的CAR+T细胞中的广泛TCR多样性的维持并且未显示TCR序列的使用中的不平衡。
CAR+T细胞中的SB11转座酶的缺乏。SB11转座酶的持续表达可导致整合的CAR转基因的再活化。因此，本发明人进行基因组PCR以排除CAR+T细胞中的编码SB11的DNA质粒的不合理的同源重组。在测定的限制内，本发明不能在PCR反应中检测到含有来自培养28天的CAR+T细胞的并使用SB11特异性引物扩增的DNA的条带(约1kb)(图9D)。这些数据表明在电穿孔的和繁殖的T细胞中不存在SB11转座酶的整合。
CAR+T细胞的核型。评价染色体结构的完整性以排除与SB转座相关的全局性遗传毒性。来自所有3个验证运行的CAR+T细胞(电穿孔后28天收集的)的G显带在所有分析的中期染色体涂片中显示正常(男性)核型(图9E，15)。
实施例5–使用经工程化表达嵌合抗原受体的过继T细胞靶向在癌症和感染中表达的古病毒-方法
免疫组织化学。利用DiH2O水解获自U.S.Biomax(Rockville,MD)的组织微阵列(#ME1004a,ME2082b,FDA998t)。进行使用无EDTA的柠檬酸盐缓冲液(pH 6)的抗原修复。使用3％过氧化氢(Biocare Medical,Concord,CA)、抗生物素蛋白(Biocare Medical)、生物素(Biocare Medical)和多价全血清(Biocare Medical)封闭载玻片。将载玻片与以1:20的稀释度HERV-K mAb(0.6mg/ml)，随后与生物素化的抗小鼠IgG(Biocare Medical)和链霉抗生物素蛋白-HRP(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)各自孵育30分钟，利用Mayer苏木精复染(Sigma-Aldrich)进行显示。利用同种型对照小鼠IgG2a(0.25mg/ml)抗体(BD Pharmingen,Franklin Lakes,NJ)对载玻片进行类似的染色方法。
质粒。将针对HERV-K包膜蛋白的scFv序列(来自mAb克隆6H5)进行密码子优化(CoOp)(Invitrogen,Carlsbad,CA)，随后克隆至处于人延伸因子-1α(hEF-1α)启动子控制下的SB转座子，所述SB转座子侧接形成CoOp6H5CD28/pSBSO的SB反向重复序列。
从含有双向启动子hEF-1α和巨细胞病毒(CMV)的SB质粒表达HERV-K抗原。在hEF-1α启动子的控制下对具有病毒跨膜结构域的密码子优化的全长抗原序列进行克隆，并且在双向载体中在CMV启动子控制下转录新霉素基因。从质粒pCMV-SB11(Davies等，2010)顺式表达转座酶(SB11)。
为了产生用于T细胞的体内成像SB质粒，将密码子优化的萤火虫荧光素酶与myc标签融合，并于CMV启动子的控制下表达。将编码在eEF1α启动子的控制下的mKate-海肾荧光素酶的慢病毒载体用作用于体内黑素瘤肿瘤细胞的成像载体。
细胞系和它们的繁殖。A375-mel和A888-mel是来自The University of Texas MDAnderson Cancer Center(Houston,TX)的Dr.Lazlo Radvanyi的友好礼物。A624-mel和EL4亲代获自美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)。从University of Texas MDAnderson Cancer Center(Houston,TX)的CCGS核心设施接收A375-SM(超级转移性黑素瘤细胞系)。将所有细胞系培养在含有10％FBS(Thermo Scientific)和5％glutamax(GibcoLife technologies,Grand Island,NY)的RPMI(Thermo Scientific,Rockford,IL)中。通过形态学、细胞指纹分析和/或流式细胞术验证所有细胞系。测试它们的支原体属并将它们保存在研究细胞库中。
表达HERV-K特异性CAR的T细胞的产生和扩增。通过Ficoll-Paque密度梯度离心(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)从健康供体分离PBMC，随后使用Amaxa电穿孔系统利用HERV-K SB转座子和SB11转座酶进行电穿孔。简言之，洗涤2x107个PBMC细胞，随后在补充有10％胎牛血清(Thermo Scientific)和1％glutamax(Gibco Lifetechnologies)的完全RPMI中孵育2小时。随后将这些细胞与HERV-K CAR转座子(6H5CD28/pSBSO,15μg)和SB转座酶(pCMV-SB11,5μg)一起重悬浮于100μl的Amaxa Nucleofector溶液(人T细胞试剂盒)中，转移至单个比色皿，随后在Amaxa电穿孔仪(Lonza,USA)中使用U-14程序进行电穿孔。将电穿孔的T细胞在完全不含苯酚的RPMI(Thermo Scientific)中于37℃孵育4小时，随后进行半培养基改变。
K562表达内源HERV-K抗原，从而用作用于繁殖HERV-K特异性CAR+T细胞的aAPC。以1:2的T细胞:aAPC比率用经γ辐射的(100Gy)K562-aAPC补充在含有10％FBS的RPMI中培养的电穿孔的T细胞。在每一周的T细胞刺激结束时以相同的比率添加经辐射的aAPC。分别以30ng/ml和50U/ml的浓度补充可溶性IL-21(eBioscience)和IL-2(Chiron)细胞因子，以在电穿孔后培养中每隔一天完成RPMI培养基。在加载有OKT3的K562细胞存在的情况下生长的模拟转染的无DNA对照T细胞用作阴性对照。在与CAR+T细胞中相同的培养条件下使用CoOpCD19CARCD28/pSBSO和SB11转座酶电穿孔的CD19CAR+T细胞生长，并将所述CD19CAR+T细胞用作非特异性CAR+T细胞对照。
每一周监测T细胞培养物的CD3negCD56+细胞的存在，并且如果所述群体超过总群体的10％则耗竭所述培养物。该耗竭通常在与aAPC的初始共培养的第10至14天发生。按照制造商的说明书，使用阳性选择“possel”，在Automax(Miltenyi Biotech)上使用CD56珠粒(Miltenyi Biotech Inc,Auburn,CA)进行所述耗竭。
使用Cellometer自动细胞计数器(自动T4细胞计数器，Nexcelom Bioscience,Lawrence,MA)基于台盼蓝排除法评估T细胞活力。在电穿孔和共培养期的过程中使用程序“PBMC_human_frozen”和“活化的T细胞”分析活力。计算个体供体的7天、14天、28天、32天的共培养结束时的总细胞、CD3+、CD4+、CD8+和CAR+细胞的倍数扩增(相较于第1天)，并且使用学生t检验比较CD19CAR+T细胞与无DNA对照细胞之间的3个供体的平均值。
流式细胞术。除非另外提及，否则所有试剂获自BD Biosciences(FranklinLakes,NJ)。用缀合有异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、缀合于花青染料的多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCPCy5.5)或别藻蓝蛋白(APC)的抗体对100万个细胞进行染色。所使用的抗体包括抗CD3FITC(5μl)、抗CD3PerCPCy5.5(2.5μl)、抗CD3PE(2μl)、抗CD4APC(2.5μl)、抗CD8PerCPCy5.5(4μl)、抗CD56APC(2.5μl)、膜联蛋白V(5μl)、抗CD32FITC(5μl)、抗CD45RAFITC(5μl)、抗CD45RO APC(2.5μl)、抗粒酶B FITC(5μl)、抗CD62L APC(2.5μl)、抗IFN-γAPC(2μl)、抗CD27PE(2μl)、抗αβTCR FITC(5μl)、抗γδTCR PE(2μl)和抗CCR7PerCPCy5.5(2.5μl,Biolegend)。缀合有FITC(3μl,Invitrogen)和缀合有PE的(2.5μl,Invitrogen)山羊抗人Fcγ的F(ab′)2片段用于检测HERV-K特异性CAR的细胞表面表达。使用FACS洗涤缓冲液(2％FBS和0.1％叠氮化钠，于PBS中)实现非特异性抗体结合的封闭。使用CellQuest 3.3版(BD Biosciences)在FACSCalibur(BD Biosciences)获取数据。使用FlowJo 7.5.5版进行中位数荧光强度(MFI)的分析和计算。
nCounter分析数字基因表达系统。使用nCounter分析系统(型号NCT-SYST-120,NanoString Technologies；Geiss等，2008)评价HERV-K特异性CAR+T细胞与无DNA对照T细胞之间的基因表达的差异。简言之，在RNeasy裂解缓冲液(RLT；5μl,Qiagen,Gaithersburg,MD)中裂解104个HERV-K特异性CAR+T细胞或无DNA T细胞，并在65℃下将mRNA与报告的代码组和使用nCounterGene表达测定试剂盒定制设计的捕获代码组杂交12小时。将nCounter预备站用于杂交后处理。将Nanomir软件用于利用内部对照标准化mRNA水平。将R-程序、树状检视和聚类检视(clustal view)用于输出通过统计分析的数据。将标准化的结果表达为相对mRNA水平。对统计上显著的基因进行独创性途径分析(IPA)(Ingenuity Systems,www.ingenuity.com)以基于来源于文献来源的数据库理解它们的生物相互作用。
整合分析。使用QIAamp DNA mini试剂盒(Qiagen)分离HERV-K特异性CAR+T细胞的基因组DNA，和如先前所述(Maiti等，2013)进行实时PCR。将具有先前所述的CAR拷贝的单个整合的Jurkat细胞(克隆#14)的基因组DNA用作阳性对照(Maiti等，2013)。以一式三份，利用与10μl的TaqMan基因表达预混液(Applied Biosystems,Foster City,CA)、1μl(250nM的1x探针，和900nM的1x引物)的20x FAM-标记的对于IgG4Fc特异的CAR特异性TaqMan探针引物组[正向(5′-GAGGGCAACGTCTTTAGCTG-3′；SEQ ID NO:15)和反向(5′-GATGATGAAGGCCACTGTCA-3′；SEQ ID NO:16)引物和羧基荧光素(FAM)-标记的探针(5′-AGATGTTCTGGGTGCTGGTC-3′；SEQ ID NO:17)]和1μl(900nM的1x引物和250nM的1x探针)的20x VIC标记的TaqMan RNA酶P探针引物组(Applied Biosystems)混合的100ng的基因组DNA在20μl的总反应体积中进行实验。引物杂交在CAR的IgGFc4部分中发生。扩增循环包括50℃，2分钟；95℃，10分钟；和40个循环：95℃，15秒和60℃，1分钟。利用StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)进行检测。将每二倍体细胞以2个拷贝存在的常染色体RNA酶P基因用作用于标准化的内源参照(Jin等，2011)。将ΔΔCT法(Applied Biosystems,CA)用于计算关于RNA酶P的整合数，并将Jurkat克隆用作标准化对照。
铬释放测定(CRA)。如先前所述(Maiti等，2013；Jin等，2011)进行CRA。简言之，用51Cr处理HERV-K+ve靶2小时，随后与第35天的HERV-K特异性CAR+T细胞或无DNA对照T细胞一起孵育，并使用下式计算的51Cr释放百分比：
Figure BDA0000904213610000851
缩时生物成像。(A)为了显现CAR与肿瘤细胞上的抗原的衔接，使用BioStation IMCell-S1/Cell-S1-P系统(Nikon,Melville,NY)进行缩时成像。用抗HERV-K APC抗体(1μg)对K562亲代细胞进行染色，并使用FITC标记的山羊抗人Fcγ抗体的F(ab′)2片段(5μl,BDBiosciences)对HERV-K特异性CAR+T细胞的CAR表面表达进行染色。将T细胞与靶细胞以5:1的比率混合，并随后于完全RPMI培养基中涂铺在T-35mm玻璃底板(Fisher Scientific,Hampton,NH)上。在37℃下每2分钟对细胞立即成像，持续长达8小时。分别地，使用相差荧光通道2(以观察绿色HERV-K特异性CAR+T细胞)和荧光通道3(以观察红色K562细胞)，以1/125和1/5秒的暴光时间，用20X物镜以1600×1200个像素记录每一个图像。当APC标记的抗原与绿色标记的CAR重叠时，看到CAR与抗原的衔接。
(B)为了显现和定量HERV-K特异性CAR+T细胞杀伤肿瘤细胞所花的时间，利用含有1ng/mg
Figure BDA0000904213610000852
(Invitrogen)的完全RPMI将肿瘤细胞与HERV-K特异性CAR+T细胞一起涂铺在T-35mm玻璃底板中。将肿瘤细胞死亡记录为当肿瘤细胞壁被穿孔并且细胞变绿(通过使用BiostationIM cell-S1-P系统(Nikon))时的时间。在15小时的时期中使用活细胞成像软件(Nikon)记录每一个肿瘤样本中的绿色荧光的强度。
细胞内IFN-γ释放测定。利用200μl的完全RPMI培养基将HERV-K特异性CAR+T细胞以1:10的比率与肿瘤细胞在圆底96孔板中共培养。在所有孔中添加蛋白质转运抑制剂(含有布雷菲德菌素A的BD Golgi Plug)以将IFN-γ捕捉在细胞内部。在37℃孵育共培养物4小时，随后在4℃对HERV-K特异性CAR表达染色20分钟。随后洗涤、固定细胞，并在4℃用100μl的Cytofix/Cytoperm缓冲液(目录号555028)透化所述细胞20分钟。随后利用抗缀合有IFN-γAPC的抗体对透化的细胞针对细胞因子进行染色。洗涤细胞，随后利用FACSCalibur对其进行分析。将PMA(佛波醇12肉豆蔻酸13酯)-和离子霉素-(BD Biosciences)处理的T细胞用作该测定的阳性对照。利用无DNA对照T细胞进行类似测定。
HERV-K+veEL4细胞系的开发。将200万个EL4细胞悬浮于含有表达HERV-K抗原的SB转染子和SB11转座酶(2μg的总DNA)的AMAXA小鼠T细胞核转染溶液(Amaxa,USA)，达到100ml的终体积。将该悬液转移至单个比色皿，并在Amexa电穿孔仪中使用C-09程序进行电穿孔。将细胞在37℃于补充有10％FBS(Thermo Scientific Pierce)的利用试剂盒提供的电穿孔介质中孵育4小时。随后将细胞转移至DMEM,10％FBS(Thermo Scientific Pierce)和5％glutamax(Gibco Life Technologies)中。随后使这些细胞在0.8mg/ml的G418存在的情况下进行生长，并使用HERV-K抗体分选抗新霉素的HERVK+veEL4细胞，使其生长以获得纯的细胞群体。
A888-mel细胞中的shRNA-介导的HERV-K敲低。使A888-mel细胞在6孔板中生长至90％汇合。随后使用100μl的HERV-K特异性shRNA或乱序shRNA慢病毒和聚凝胺(5μg/ml)替代培养基，在37℃下转导4小时，随后用常规RPMI培养基替代培养基。随后基于GFP表达分选细胞，并使其生长。将乱序shRNA转导的A888-mel细胞用作对照。进行细胞系裂解物的免疫印迹测定以测定HERV-K敲低的程度。将6H5HERV-K抗体用于检测在具有HERV-K shRNA或乱序shRNA的A888-mel细胞或亲代细胞上的HERV-K抗原表达。用含有蛋白酶抑制剂(RocheApplied Science,San Francisco,CA)的RIPA缓冲液裂解1000万个细胞。进行BCA测定以检测蛋白质浓度(Thermo Scientific Pierce)。将4％-20％梯度凝胶(Biorad,Hercules,CA)用于运行在SDS加载缓冲液中煮沸的10μg蛋白质。随后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，并用5％的PBST中的牛奶进行封闭，随后与6H5HERV-K抗体(mg/ml)进行孵育。利用山羊抗小鼠Fc-HRP(Sigma-Aldrich)检测结合，并使用ECL WestfemtoTM底物(Thermo ScientificPierce)进行显影。使用Versa doc QuantityoneTM软件(Biorad)对印迹成像，以及使用Image J软件定量印迹。
体内分析。转移性黑素瘤模型：在第0天用106个A375-SM细胞静脉内注射5周龄雌性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ(NSG)小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)。先前利用mKate-rRLuc稳定地转导A375-SM细胞，并分选细胞的均一群体。始于第7、14和21天，处理组群(n＝7)中的小鼠开始接受2x106个HERV-K特异性CAR-FfLuc+T细胞。在治疗期中每周3次腹膜内(i.p.)注射IL-2(600U；eBioscience)。一个组群的荷瘤小鼠(n＝6)不接受治疗，而一组群的无肿瘤小鼠(n＝3)接受与对照组中相似的数目的CAR+T细胞。
流量定量：每周进行生物发光成像(BLI)以在体内对肿瘤和T细胞活性成像。麻醉小鼠，将其以前-后位放置，以如先前所述(Singh等，2007)使用Xeno IVIS 100系列系统(Caliper Life Sciences)进行BLI。为了将HERV-K特异性CAR-ffLuc+T细胞活性成像，腹膜内(i.p.)注射150μl(200μg/小鼠)的D-荧光素钾盐(Caliper Life Sciences)。在注射后10分钟，使用Living Image 2.50.1(CaliperLife Sciences)程序定量发发射的光子。为了将肿瘤细胞活性成像，腹膜内注射100μl的Endurin(Promega,Fitchburg,WA)。注射后20分钟，肿瘤活性经定量与ffLuc相似。进行未配对学生t检验来确定流量的统计显著性。
统计分析。对于分析不同等级和分期的黑素瘤与正常组织之间的抗原表达的统计差异，使用学生t检验和ANOVA。对于分析对照对比HERV-K特异性CAR+T细胞扩增之间的差异，进行表型分析，和功能测定，学生t检验，计算平均值、标准偏差和95％的置信区间(CI)。对于体内转移性黑素瘤模型，使用学生t检验来分析肿瘤组与治疗组之间的流量数据的显著性。所有统计测试是双面的，并且使用Graph Pad Prism软件(GraphPad Software Inc,San Diego,CA)来进行。所有小于0.05的P值被认为是统计上显著的。
实施例6–使用经工程化表达嵌合抗原受体的过继T细胞靶向在癌症和感染中表达的古逆转录病毒-结果
黑素瘤患者样本中的HERV-K的表达。为了阐明HERV-K在黑素瘤于体内侵袭和转移过程中的生理相关性，研究人员力图评估获自具有不同分期的黑素瘤的患者的活检组织中的肿瘤抗原HERV-K包膜蛋白的表达。使用IHC分析来自268个患者的恶性肿瘤组织和来自40个患者的良性皮肤和乳腺组织。基于对于HERV-K呈阳性的肿瘤细胞的百分比和染色强度对肿瘤组织染色分级，并且计算它们的产物以获得H-指数。肿瘤组织显示不同水平的染色强度，且当与相同组织上的同种型对照染色相比较时，所述肿瘤组织被评分为0、1、2或3分(图16A)。抗原在细胞上以强调形式沿着细胞表面表达，如用实线箭头显示的，或呈弥散的细胞质染色，如用虚线箭头显示的(图16B)。这可暗示为了脱落病毒蛋白(REF)的目的抗原至细胞表面的循环和积累。肿瘤细胞表达相较于良性肿瘤显著更高的HERV-K抗原的H-指数(图16C)。尽管恶性肿瘤与转移性肿瘤之间的H-指数没有差异，但可在处于I和II分期的肿瘤与处于III和IV期的肿瘤之间看到显著差异(图16D,E)。为了进一步显示HERV-K在肿瘤细胞而非正常细胞上的表达特异性，分析来自33个类型的正常器官(每一个类型获自3个正常供体)的组织。在任何正常器官组织中未观察到HERV-K的显著表达(图22)。这些发现表明在肿瘤细胞中特异性发生的HERV-K上调可用作免疫疗法的独特靶标志物。
HERV-K特异性CAR+T细胞的繁殖和表征。在小鼠中开发HERV-K env特异性单克隆抗体(mAb)，并发现6H5mAb克隆在体内检测抗原时最灵敏(Wang-Johanning等，2003)。将6H5mAb克隆的scFv序列用于构建CAR。通过柔性接头将scFv盒与IgG4Fc区，随后与CD28跨膜结构域以及CD28和CD3z细胞内结构域融合。随后将该融合构建体克隆进SB转座子载体(图17A)。
为了产生对于HERV-K env抗原特异的CAR+T细胞，本发明人利用SB转座子与SB11转座酶一起对外周血单核细胞(PBMC)进行电穿孔，随后在内源地衍生的HERV-K+veK562aAPC上繁殖所述细胞。为了选择性繁殖具有CAR的稳定表达的T细胞，将内源地表达HERV-K抗原的这些aAPC进行遗传修饰以共表达所需的T细胞共刺激分子CD86、4-1BBL和膜结合的IL-15(与增强的绿色荧光蛋白EGFP共表达的)(Singh等，2008)。将在相同培养条件下于加载有OKT3的aAPCP上生长的无任何转座子电穿孔的PBMC用作阴性无DNA对照。
使用对于IgG4Fc区特异的多克隆Fc抗体检测CAR的表达。在用经辐照的aAPC补充培养物之前每7天用Fc抗体对CAR+T细胞进行染色。流量数据显示95％的T细胞在其表面上表达CAR，对于长达35天的培养这可被检测到(图17B)。当与无DNA对照细胞相比较时，在HERV-K特异性CAR+T细胞的生长动力学方面未看到显著差异，并且所有HERV-K特异性CAR+T细胞在培养的第14天为CD3+T细胞(图17C,D)。CAR+CD4的百分比平均数目增加，然而CAR+CD8细胞随着培养期进行而减少(图23A)。对HERV-K特异性CAR+T细胞相较于无DNA对照细胞的基因组DNA的实时PCR分析显示，在CAR+T细胞基因组中存在少于2个CAR的整合(图17D)。培养的CAR+T细胞具有效应子记忆表型，其包括具有如通过粒酶B水平观察到的显著的裂解潜力的CD3+CD56+CD45RO+TCRαβ+CD27negCCR7neg细胞(图17F)。
测量来自3个正常供体的HERV-K特异性CAR+T细胞的mRNA水平，使用nCounter分析将其与来自培养的第28天的无DNA对照T细胞的mRNA水平相比较。HERV-K特异性CAR+T细胞具有显著更高水平的化学引诱剂、转录调节剂和激活剂。CAR+T细胞中的穿孔素1和粒酶H的升高的水平显示这些细胞的更高裂解潜力(图23B)。独创性途径分析(IPA)(p<0.05)表明这些在HERV-K特异性CAR+T细胞中被上调的基因中的几个参与NF-κB激活。化学引诱剂和细胞因子参与IL-10、IFN-γ和IL-12调节(图23C)。这些数据加强了先前的观察：HERV-K特异性CAR+T细胞具有中心效应子表型。
HERV-K CAR+T细胞功能性的表征。使用针对HERV-K env蛋白的单克隆6H5抗体分析黑素瘤细胞系诸如A888、A375、A375-SM、A624上的抗原表达(图18A)。将黑素瘤细胞上的HERV-K抗原表达与同种型对照(小鼠IgG2a)相比较。为了分析HERV-K特异性CAR+T细胞的功能性，用放射性铬脉冲HERV-K+肿瘤细胞，并用不同比率的HERV-K特异性CAR+T细胞进行培养。利用无DNA对照作为阴性对照进行CRA。当与无DNA对照T细胞相比较时，对于HERV-K特异性CAR+T细胞观察到显著更高水平的HERV-K+肿瘤细胞裂解(图18B)。还将无关CAR诸如CD19特异性CAR+T细胞用于进行CRA，并且当与CD19抗原阳性肿瘤细胞诸如具有CD19抗原的EL-4细胞相比较时，对于HERV-K抗原阳性肿瘤细胞观察到非特异性杀伤的基线水平(图24A)。
为了进一步证明这些HERV-K特异性CAR+T细胞的功能性，进行4小时IFN-γ释放。将黑素瘤肿瘤靶以1:10的比率与HERV-K特异性CAR+T细胞或无DNA对照T细胞共培养，随后使用流式细胞术分析细胞内细胞因子水平。利用PMA-离子霉素培养的T细胞用作阳性对照。HERV-K特异性CAR+T细胞相较于无DNA对照T细胞显示更高水平的IFN-γ释放(图18C)并且该结果与CRA相关联。
HERV-K特异性CAR+T细胞的特异性。为了显示HER-K特异性CAR的特异性，利用编码处于hEF-1α启动子下的HERV-K抗原和处于CMV启动子下的新霉素抗性的双向SB载体对HERV-Kneg EL-4细胞进行电穿孔(图25A)。随后对EL-4HERV-K+ve细胞进行单细胞分选，并使其在哺乳动物选择标志物新霉素存在的情况下生长，以获得纯的表达HERV-K env的群体。有趣地，这些细胞因翻译后修饰和蛋白水解裂解在10天的培养内丧失HERV-K抗原表达。在10天的分选中对这些EL-4HERV-K+ve细胞进行4小时CRA。将铬脉冲的EL-4HERV-K+ve细胞和HERV-KnegEL4亲代细胞与不同浓度的HERV-K特异性CAR+T细胞共培养，并以抗原特异性方式观察分级的肿瘤特异性裂解(图19B)。
为了进一步证明特异性，使用shRNA慢病毒在A888黑素瘤细胞中对HERV-K env抗原进行敲低。免疫印迹分析显示相较于A888亲代和对照乱序shRNA约50％的HERV-K蛋白水平敲低(图19C)。HERV-K特异性CAR+T细胞与HERV-K敲低细胞、A888亲代和具有乱序shRNA的A888的CRA显示相较于亲代和对照肿瘤细胞对于HERV-K敲低的杀伤的显著降低(图19D)。
进行缩时成像以显现和定量CAR+T细胞杀伤肿瘤靶所花的时间和在15小时的时期中杀死的肿瘤细胞的数目。在
Figure BDA0000904213610000911
存在的情况下以1:5的比率培养肿瘤细胞和T细胞，当破坏细胞膜时所述
Figure BDA0000904213610000912
使细胞变绿。随着黑素瘤靶A888和A375细胞被HERV-K特异性CAR+T细胞杀伤，在5小时左右报告了绿色荧光的突然上升，其在15小时的时期中逐渐升高。对于HERVK-Kneg HEK293亲代靶未观察到杀伤。约30％的A888细胞和35％的A375细胞在15小时的时期中被CAR+T细胞杀伤。为了使抗原特异性CAR衔接可视化，K562细胞对于HERV-K抗原染色呈阳性(显以红色)并且HERV-K特异性CAR对于Fc染色显以绿色。在抗体结合的抗原和CAR被细胞内化后5小时的时期内看到CAR与抗原的重叠(图26A)。
HERV-K特异性CAR+T细胞在体内的肿瘤杀伤能力。利用编码HERV-K特异性CAR和具有SB11转座酶的myc-FFLuc的SB载体对PBMC进行双重电穿孔。具有myc-ffLuc基因的SB载体具有通过接头连接的新霉素抗性基因(图27A)。这些HERV-K特异性CAR-ffLuc+T细胞具有与HERV-K-特异性-CAR+T细胞相似的生长动力学，并且它们的肿瘤杀伤能力和特异性相当(图27B,C)。
开发其中通过NSG小鼠的尾静脉输注A375-超级转移性(A375-SM)细胞系的转移性黑色素瘤模型。这些细胞移入肺中并转移至肝。为了非侵袭性地使肿瘤块的减小可视化，用具有mKate-rRLuc基因的慢病毒载体转导肿瘤细胞，并使用mKate标志物分选所述细胞以获得纯的细胞群体(图21A)。在1周的肿瘤细胞移入后，在第8、15和22天将2000万个CAR+T细胞与IL-2(腹膜内)(每周2次，持续3周)一起静脉内输注。将生物发光成像(BLI)用于评估每一组小鼠的rRLuc活性。具有单独肿瘤细胞的小鼠组到第25天相较于接受HERV-K CAR+T细胞的具有肿瘤细胞的小鼠组具有显著更高的荧光素酶活性(图21A，B)。此外，具有单独肿瘤的小鼠因肿瘤至肝的高度转移而在第28天变得垂死，然而接受CAR+T细胞的小鼠组展示健康食欲和活动。肿瘤细胞上的mKate的离体成像显示具有单独肿瘤的小鼠在肝中具有比处理组更显著的肿瘤群落(图21C)。病理学检查提供这样的观察，其中肿瘤组在肝中相较于处理组具有显著更高的转移群落，这表明了HERV-K CAR+T细胞在减少肿瘤生长和转移中的作用(图21D)。
讨论。这些结果显示HERV-K特异性CAR+T细胞能够成功地靶向病毒糖蛋白，并且在体外以抗原特异性方式杀伤HERV-K+肿瘤细胞和在体内减少黑素瘤肿瘤生长和转移。
HERV-K env在黑素瘤转移过程中被显著上调，并且仅存在于肿瘤细胞上而非相邻的正常黑素细胞上。在黑素瘤中，HERV-K env蛋白与和肿瘤进展相关的MEK-ERK和p16INK4A–CDK4途径活化相关联(Li等，2010)。HERV-K分子模拟也导致降低的谷胱甘肽过氧化物酶水平，从而导致在组织中增加的活性氧种类，从而导致黑素瘤发生(Krone等，2005)。HERV-K env表达的异常水平似乎是参与黑素瘤发作的触发因子，从而导致形态学和细胞修改，导致肿瘤进展(Serafino等，2009)。HERV-K的病毒转录的调节导致增加的炎症和黑素细胞的形态学分化(Sciamanna等，2005)。组织微阵列表现与黑素瘤进展相关的抗原表达的升高的水平，然而正常人组织具有基线水平的HERV-K表达或不存在HERV-K表达。
黑素瘤的免疫原性性质使其成为开发高效的基于T细胞的疗法的有吸引力的模型和靶。对基于T细胞的疗法的主要限制之一是对TCR的基于HLA的限制，其限制抗原识别(Garrido等，1997)。遗传修饰T细胞以表达肿瘤抗原特异性受体克服了该限制，并且赋予基于非HLA的抗原识别(Gross等，1989)。可通过使用病毒或非病毒载体来产生T细胞修饰。“睡美人”载体是将基因引入T细胞的非病毒途径。“睡美人”系统优于其它病毒转导法的主要优势之一是遗传上安全的、高效的并且没有逆转录病毒转导昂贵(Maiti等，2013)。利用IL-2和IL-21培养这些CAR+T细胞产生足够的细胞来用于输注目的。这已导致使用针对B系恶性肿瘤的CD19CAR+T细胞的初步临床试验。使HERV-K特异性CAR+T细胞以与临床级CD19CAR+T细胞相似的方式生长。这些HERV-K特异性CAR+T细胞主要是效应子记忆表型，其非常适合靶向和杀伤肿瘤细胞。
已知多种因子诸如细胞因子、激素和化学物质在癌症过程中调节HERV-K水平(Taruscio和Mantovani,2004)。已知HERV-K env抗原在细胞膜与细胞质之间循环，并且在某些肿瘤状态中还从细胞表面出芽分离出来。因此，使用过继T细胞疗法可以是只需要细胞表面上的短暂抗原表达的有利治疗策略。
还发现HERV-K env抗原与乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、畸胎癌、自身免疫性疾病诸如多发性硬化症和感染性疾病诸如HIV(Wang-Johanning等，2003；Contreras-Galindo等，2008；Jones等，2012；Ono,1986；Wang-Johanning等，2007)相关。因此，使用过继T细胞疗法靶向env抗原可以是用于多种疾病状态的治疗选择。与该假说一致，HERV-K env可被HERV-K CAR+T细胞成功地且选择性地靶向。在体内输注这些经遗传修饰的CAR+T细胞与肿瘤消退和减少的转移相关，从而显示了这些细胞的抗肿瘤活性。
实施例7–使用膜结合的细胞因子产生具有用于最小残留疾病的免疫疗法的长寿命的体内潜力的T细胞
mIL15的产生和表达。mIL15构建体(图28)利用丝氨酸-甘氨酸接头将IL-15 cDNA序列(NM_000585.4)与全长IL-15Rα(NM_002189.3)融合。将IL-15和IL-15Rα的信号肽省略并且将IgE信号肽(gb|AAB59424.1)用于mIL15构建体。该构建体将产生为膜结合的，但也存在于类似于上述反式呈递模型的IL-15Rα的情况中的IL-15。通过GeneArt(Regensburg,Germany)分析所述DNA质粒，随后将其亚克隆至“睡美人”质粒(非病毒基因转移法)。用CAR质粒(对于CD19特异)，用或不用mIL15质粒和用SB-11转座子对原代人T细胞进行共电穿孔。经遗传修饰的T细胞的繁殖和扩增通过表达41BBL和CD86共刺激分子的CD19+K562人工抗原呈递细胞(aAPC)变体的每周刺激来实现。所使用的CAR是含有CD3ζ和CD28信号传导细胞质结构域的第2代CAR。CD19在aAPC上的存在允许抗原特异性T细胞的选择性产生，而共刺激分子促进体外扩增。mIL15分子可与CAR被经修饰的T细胞稳定地共表达，并且共表达T细胞代表大部分群体(图29)。另外，对于经mIL15-CAR修饰的T细胞，经修饰的T细胞中的总的CAR表达达到大于90％(图29)。
mIL15的功能性。IL-15受体复合物的信号传导主要诱导信号转导分子和转录激活子5的磷酸化。通过使用phosflow观看磷酸化的STAT5(pSTAT5)，可确定mIL15是否能够诱导细胞因子的信号传导途径。pSTAT5的水平在已补充了这些细胞因子的CAR+T细胞中被升高，这些水平在血清和细胞因子饥饿下被消除。在饥饿条件下，mIL15+CAR+T细胞中的pSTAT5水平得到维持(图30)。这些数据表明mIL15具有功能性并且激活细胞因子信号传导途径的pSTAT5部分。
临床上有意义的数目的mIL15+CAR+T细胞的繁殖。在用CAR重定向T细胞特异性时，离体扩增中的焦点在于驱动CAR+T细胞群体，在该情况下具有或不具有mIL15的CAR。用可溶性IL-2和IL-21生长标准CAR+T细胞，但为mIL15+CAR+T细胞提供可溶性IL-21以利用报道的IL-15与IL-21之间的协同作用。补充有IL-21的mIL15+CAR+T细胞显示可与标准CAR+T细胞以及被给予IL-15和IL-21的对照CAR+T细胞相比较的表达(P＝0.53，双因素ANOVA；图31)。mIL15+CAR+T细胞的离体扩增产生临床上显著的数目的细胞。
评估mIL15+CAR+T细胞的表型和功能性。离体扩增的mIL15+CAR+T细胞的表型与CAR+T细胞非常相似，除IL-7Ra表达外。在该时间点上代表输注产品的细胞的一般表型主要是具有活化标志物CD45RO和CD25的中至高表达的CD8+(细胞毒性)T细胞。对于两个T细胞群都存在可变的低至中等水平的T细胞记忆相关标志物(CD62L、CCR7、CD27和CD28)的表达(图32A)。在经修饰的T细胞的离体扩增后，T细胞必需保留它们的重定向的T细胞特异性和裂解功能。进行铬释放测定来评估扩增产物中的T细胞的功能。将CD19+和CD19-EL4靶与经修饰的T细胞以不同的效应子与靶的比率涂铺。在所有效应子与靶的比率上，mIL15+CAR+T细胞和CAR+T细胞都显示了CD19+肿瘤靶的特异性裂解(P<0.001，双因素ANOVA，n＝3)并且两种细胞对所述CD19+肿瘤靶的特异性裂解彼此之间没有差异(P>0.05，双因素ANOVA)。mIL15+CAR+T细胞对CD19+靶裂解是特异性的并且与CD19-靶的本底裂解显著不同(P<0.001，双因素ANOVA)(图32B)。mIL15+CAR+T细胞保留它们的重定向的特异性和裂解能力。
特异性mIL15+CAR+T细胞亚组在体外长期持续并且保留功能性。为了评估体外长期持续性，长期培养4种aAPC刺激扩增的mIL15+/-CAR+T细胞而无进一步的抗原再刺激。CAR+T细胞接受IL-2、IL-15或无细胞因子补充，而mIL15+CAR+T细胞不接受外源细胞因子。如所预期的，未接受细胞因子补充的CAR+T细胞不持续。mIL15+CAR+T细胞以及接受IL-2或IL-15的CAR+T细胞相较于未补充的CAR+T细胞具有显著更大的相对倍数扩增(P<0.0001，重复测量ANOVA，n＝3；图33A)。接近0的mIL15+CAR+T细胞相对扩增的维持也表明这些修饰的细胞不以无限制的方式生长。为了对临床应用是有益的，CAR+T细胞必须保持响应抗原。因此，用：无靶、CD19-EL-4、CD19+EL-4、CD19+Nalm-6(人白血病细胞系)激发从遭遇抗原以来75+天的这些T细胞，或在与靶孵育6小时后通过细胞内细胞因子染色来评估淋巴细胞活化混合物(LAC)和干扰素γ(IFNg)的产生。与接受IL-2或IL-15的CAR+T细胞类似，mIL15+CAR+T细胞也响应于CD19+靶和LAC而产生IFNg(图33B)。在另一个测定中，用aAPC刺激和用IL-21补充这些75-天的撤除T细胞。因此，利用IL-2培养的CAR+T细胞现已被提供IL-2和IL-21，IL-15培养T细胞则接受IL-15和IL-21，并且mIL15+CAR+T细胞仅补充IL-21。在aAPC刺激后8天通过膜联蛋白V染色评估T细胞活力。已显示mIL15+CAR+T细胞具有最大的活细胞群体(膜联蛋白Vneg)(图33C)并且显示对活化诱导的细胞死亡的抗性。
持续性mIL15+CAR+T细胞具有分化程度较低的T细胞的性状。在表征长期持续性mIL15+CAR+T细胞时，本发明人假设持续性mIL15+CAR+T细胞可展示与分化程度较低的T细胞亚组相关的特征，因为这些细胞亚组因它们的长寿命潜力而为人所知。对于组成型出现，从而可能组成型发信号，在mIL15+CAR+T细胞的体内培养过程中，本发明人评估这些T细胞是否具有可产生具有持续性优势的细胞的针对较低分化状态的分子编程。使用nCounter分析系统对来自刺激4的CAR+和mIL15+CAR+T细胞(撤除测定T细胞输入)进行多重数字基因表达谱的分析。标准化的mRNA计数的分析使用基于负二项分布的统计程序(Lohse等，NucleicAcids Res.(2012)40,W622-7)。如果大于2倍的差异mRNA计数(P<0.05，FDR q<0.05)，则基因被认为是显著地差异表达的。通过使用这些标准，只有5个基因被认为是差异地表达的，从而表明不存在由mIL15提供的培养或分子编程优势。
本发明人随后表征长期持续性mIL15+CAR+T细胞。首先，使用CD45RA和CCR7标志物来评估它们的表型以在表型上描述的它们的分化状态。这些标志物将T细胞的分化状态表征为CD45RA+CCR7+<CD45RA-CCR7+<CD45RA-CCR7-<CD45RA+CCR7，代表从最低至最高分化状态的细胞。在将75-天撤除mIL15+CAR+T细胞与实验开始时的它们的对应物(Stim 4mIL15+CAR+T细胞)比较时，观察到持续性mIL15+CAR+T细胞培养物具有增加的CD45RA+CCR7+和CD45RA+CCR7-T细胞亚组的比例(***P<0.001，双因素重复测量ANOVA，n＝7；图34)。CCR7表达在撤除mIL15+CAR+T细胞中相对于CAR T细胞得到显著增强。CCR7neg和CCR7+亚组的活力通过抗原撤除后mIL15+CAR+T细胞、接受IL-2(50U/ml)的CAR+T细胞和接受可溶性IL-15(5ng/ml)的CAR+T细胞的膜联蛋白V染色来评估。发现，无论细胞因子刺激的类型是什么(IL-2、IL-15复合物或mIL15)，CCR7neg T细胞都显示等频率的活细胞。相反地，暴露于mIL15的CCR7+T细胞具有比接受IL-2或IL-15复合物(两者P<0.05；图34)的CAR T细胞显著更高的活力。这些数据表明mIL15足以支持CCR7+表型，所述CCR7+表型从而促成维持分化程度较低的CD45RA+CCR7+T细胞亚组。mIL15+CAR+T细胞促进分化程度较低的T细胞的持续性的能力是用于过继疗法的期望表型，并且似乎确证了报道长寿命T细胞亚组具有分化程度较低的表型的其它研究。另外，还观察到高度分化的亚组的存活，可能由组成型IL-15信号传导支持的。
长期持续性mIL15+CAR+T细胞展示与分化程度较低的T细胞亚组相关的一些分子标志物。使用nCounter分析系统分析所述T细胞的基因表达模式并且产生来自刺激4的mIL15+CAR+T细胞与存活至第75天撤除的那些mIL15+CAR+T细胞之间的差异表达的层次聚类的热图(>2倍截断值，P<0.05，FDR q<0.05)。这些研究鉴定了108个显著地差异表达的基因(>2倍截断值，P<0.05，FDR q<0.05)。使用DAVID功能注释评估基因本体分类。可将差异表达的基因的功能分类分成宽的分类：T细胞活化、分化、增殖和细胞凋亡。即，在mIL15+CAR+T细胞中存在更多数目的在分化的正向调控、细胞凋亡的调控和细胞凋亡的诱导中被下调的基因。在mIL15+CAR+T细胞中更多数目的基因在分化和Wnt信号传导途径的负向调控中被上调(图36)。这表明持续性mIL15+CAR+T细胞的分子标签不如处于刺激4的mIL15+CAR+T细胞(实验开始时的T细胞)的分化程度高。
通过流式细胞术验证所选定的基因的表达。与分化程度较低的状态相关的转录因子(Tcf-7)的表达和效应子功能/分化状态(Blimp-1和Tbet)的获得表明持续性mIL15+CAR+T细胞展示与分化程度较低的细胞相关的转录因子平衡。这通过Tcf-7的更多表达以及Blimp-1和Tbet的较低表达来表征(图37)。进行细胞表面标志物IL-7Ra和CCR7的评估，因为它们由分化程度较低的T细胞亚组特征性表达。持续性mIL15+CAR+T细胞已增加了与长寿命T细胞亚组相关的这些标志物的表达(图38)。区分T细胞分化的水平的一个另外的量度是通过分化程度较低的T细胞产生IL-2的能力。对来自刺激4或75天的撤除培养的mIL15+CAR+T细胞进行模拟处理或用LAC处理6小时，随后通过细胞内细胞因子染色来评估其IL-2产量。刺激4T细胞不能产生IL-2，然而持续75天的退出T细胞获得产生IL-2的能力(图39)。这些结果一起表明虽然在离体扩增的CAR+T细胞或mIL15+CAR+T细胞之间不存在可鉴定的差异，但所得的长期持续性mIL15+CAR+T细胞展示与在体内显示长期存活的分化程度较低的T细胞亚组相关的特征。
mIL15+CAR+T细胞在高肿瘤负荷模型中的体内持续性和抗肿瘤效率。为了评估体内持续性，共修饰mIL15+CAR+T细胞和CAR+T细胞以表达荧火虫荧光素酶(ffLuc)来使得能够使用生物发光成像(BLI)在体内纵向监测T细胞。使用一次至具有弥散性Nalm-6(CD19+)恶性肿瘤的NSG小鼠(无处理对照组)内的20×106个CAR+T细胞的T细胞输注来过继转移这些经修饰的T细胞。14天后处死所述小鼠。虽然未发现CAR+T细胞持续，但通过BLI观察到mIL15+CAR+T细胞在整个11天的成像期中持续(图40B)。收集骨髓、脾和外周血，并通过流式细胞术(使用人CD3作为标志物和门控排除鼠淋巴细胞)评估其的人T细胞的存在。输注有mIL15+CAR+T细胞的小鼠在骨髓(0.49-2.17％,P＝0.0001，未配对t检验，n＝5)、脾(1.15-12.38％,P<0.0001，未配对t检验，n＝5)和外周血(58.39-92.60％,P<0.0001，未配对t检验，n＝5)中检测出显著的CD3+T细胞(图40C)。在来自CAR+T细胞处理组(图40C)和无处理组(只有肿瘤)的样本中在任何评估的组织中未检测出CD3+细胞。在该模型中，mIL15+CAR+T细胞在外周血中显示肿瘤控制(图40D)，但未观察到完全肿瘤清除。这些数据表明尽管肿瘤抗原普遍存在，但CAR+T细胞在体内持续性不足，然而mIL15+CAR+T细胞以显著水平存在于整个身体中。
mIL15+CAR+T细胞在低肿瘤负荷模型中的体内持续性和抗肿瘤功效。本发明人随后在具有低肿瘤负荷的预防性模型中评估T细胞移入和抗肿瘤活性。将经修饰的T细胞(mIL15+/-CAR+ffLuc+)输注入NSG小鼠(无外源细胞因子)并使其移入6天，随后输注经海肾荧光素酶(rLuc)修饰的Nalm-6。小鼠在30天的过程中经历BLI。在该预防性模型中，观察到mIL15+CAR+T细胞在整个实验持续过程中持续，并且阻止肿瘤移入，这相较于CAR+T细胞和无T细胞处理组具有显著的抗肿瘤作用(P<0.0001，单因素ANOVA,n＝4-5)(图41C-D)。通过流细胞术进行的器官和外周血的分析在mIL15+CAR+T细胞处理组中检测到人CD3+T细胞，但有趣地所述T细胞只在骨髓中被发现(图41E)，并且可表示肿瘤遭遇后的优先归巢或存活。在类似的实验中，测试存活，并且mIL15+CAR+T细胞处理的小鼠展示相较于无T细胞处理或CAR+T细胞处理的小鼠显著改善的存活[P＝0.045(mIL15+CAR+T细胞对比CAR+T细胞，对数秩Mantel-Cox检验，n＝7-8；图41)。
mIL15+CAR+T细胞在CAR活化不存在的情况下的体内持续性。为了评估mIL15+CAR+T细胞是否可在体内长期持续而无需CAR信号传导，将经修饰的T细胞(mIL15+/-CAR+ffLuc+)输注入小鼠(无肿瘤或外源细胞因子)并监测长达47天。以该方式测试T细胞也将阐明所述持续性T细胞是否显示不受限制的生长或它们是否以自我平衡样方式维持它们的群体。未观察到CAR+T细胞持续，然而mIL15+CAR+T细胞的存在在外源细胞因子和抗原不存在的情况下展示持续的持续性(图42B)。这通过从骨髓、脾和外周血分离的CD3染色的细胞的流式细胞术来进一步确认(图43C)。评估纵向T细胞持续性，流量值表明mIL15+CAR+T细胞水平似乎随时间过去保持稳定的水平或缓慢下降，但不表示不受控制的扩增的发生(图42D)。收集这些持续性T细胞，并且以与如先前针对经遗传修饰的T细胞的离体扩增所描述的相似的方式进行离体扩增。这些细胞能够抗原特异性活化，如通过干扰素γ产生测定的(图42E)。该体内数据显示mIL15+CAR+T细胞的以非CAR依赖性和自我平衡样方式的增强的持续性，同时保留它们的抗原特异性应答性。
mIL15+CAR+T细胞的细胞增殖和记忆动力学。将流式细胞术分析用于进一步表征mIL15+CAR+T细胞(结果示于图35中)。长期持续性mIL15+CAR+T细胞以低周转率在培养中维持，如通过已恒定培养1年多的样本中的超过10天的最小PKH稀释度指示。此外，分裂细胞似乎主要是CCR7-。此数据表明与不受限制的自主增殖或生长相反，T细胞通过自我平衡来维持(图35A)。用aAPC活化连续长期培养(1.5至2.45年)中的mIL15+CAR+T细胞，对其进行表型分型，和提交用于核型分析。表型分型显示这些T细胞表达mIL15，并且所有提交的供体的核型分析结果显示正常的中期染色体涂片(图35B-C)。图35D显示使用K562aAPC刺激细胞后的记忆动力学：刺激1-CAR对比撤除过程中的mIL15+CAR的条件：对于这些研究，CAR T细胞在刺激的前9天只获得IL-21，随后在Ag撤除条件过程中只获得IL2；mIL5+CAR T细胞在前9天的过程获中得IL-21，随后在撤除条件过程中无外源细胞因子提供。结果表明在CAR与mIL15+CAR T细胞之间在刺激1后第19天CCR7和IL-7Ra的表达没有差异。只有经mIL15修饰的T细胞才存在CCR7和IL-7Ra的表达随时间远离抗原暴露(第29天对比第19天)而增加。在不暴露于抗原的情况下CAR表达增加至约80％(在刺激1后第9天，PB522为51％，以及PB273为53％)。图35E显示CAR和mIL15+CAR T细胞的记忆动力学1对比2刺激。撤除过程中的条件：CAR T细胞在Ag撤除过程中只获得IL2，这在刺激后10天建立；mIL15+CAR T细胞在撤除过程中未获得外源细胞因子。比较1次刺激和2次刺激后相似的时间点上的CCR7与IL-7Ra的表达显示对于在19天的1次刺激CAR与mIL15+CAR之间无记忆差异。在刺激2中，在与刺激1等同的时间点上，具有2个刺激的CAR T细胞相较于刺激1的对应物具有少得多的CCR7并且几无IL-7Ra。具有2次刺激的mIL15+CAR T细胞也具有较少的记忆，但保留比仅有CAR的T细胞更多的“记忆”，其中mIL15+CAR T细胞剩下一些CCR7(但IL-7Ra几乎完全消失)。
实施例8–使用编码SB转座酶的mRNA产生最少操作的T细胞
进行研究以确定使用以mRNA提供的SB转座酶进行电穿孔是否可使用SB转座酶系统进一步增强CAR T的产生。对于这些研究，如上所述，使用编码侧接转座子重复序列的CAR的质粒和编码转座酶(例如，SB11或100x)的mRNA对细胞进行电穿孔。用于研究的mRNA是m7GTP加帽的并且包含多聚腺苷酸尾。图43中显示了显示用于使用以mRNA提供的mRNA SB转座酶进行CAR T细胞产生的方案的示意图。对于这些研究，利用SB11 mRNA对来自供体#O的细胞进行电穿孔，而对来自供体#1的研究细胞利用100x mRNA来进行电穿孔。
通过流式细胞术分析表征从供体#O产生的细胞的CAR表达和细胞增殖。如图44A中所示，稳定地表达CAR的T细胞的百分比从第9天(8.3％)至第16天(66.2％)显著增加。T细胞快速生长并且到转染后第16天扩增20倍(图44B)。图44D中显示的进一步研究用于评估电穿孔后第9天(左图)和第17天(右图)的中心记忆T细胞(Tcm)的数目。这些结果显示尽管分化程度较低的中央中心T细胞(Tcm)的数目在第9天至第17天下降，但其仍然保持相对高(27％)。随后，将铬释放测定用于测定细胞的细胞毒性活性。如图44C中所示，所产生的CART细胞提供针对靶细胞的CD-19特异性细胞毒性，然而对于未经修饰的T细胞基本上未看到细胞毒性活性。
还研究了从供体#1产生的细胞。如图45A中所示，从该供体产生的CAR T细胞还提供了针对靶T细胞的CD-19特异性毒性，并且对未修饰的T细胞基本上未看到细胞毒性活性(右图)。此外，所述未经修饰的T细胞在第9和第15天以相似的效率杀伤CD19阳性靶细胞，尽管CAR阳性细胞的数目不同。在图45B中，评估CAR拷贝数和表达的研究的结果如所显示的。这些结果表明CAR DNA拷贝数从第15天至第22天从1.5减少至0.9并且在该时间点后保持稳定。
最后，将流式细胞术用于评估电穿孔后细胞活力。如图46中所示，在用DNA/mRNA电穿孔后，细胞的总数首先(第1和2天)减少，随后细胞开始生长。根据细胞计数器计数，细胞数目在电穿孔后第2天减少59％-76％(活力24-41％)。
因此，前述数据显示通过使用应用编码转座酶的mRNA的CAR产生技术，可在极其短的时间段内和以最少操作产生有效数量的靶特异性细胞毒性T细胞。虽然mRNA电穿孔的效率是供体依赖的，但SB100x转座酶在CAR产生中似乎更高效。有趣地，即使在电穿孔后较早期(第9天)较低百分比的细胞表达CAR，但总的细胞群体杀伤被靶向的肿瘤细胞的效率几乎与来自较晚期(第15-16天)的细胞群体一样高，并且包含更多中心记忆(分化程度较低的)细胞。还确认了SB11和SB100x编码mRNA提供了在测试的条件下每个细胞基因组约一个拷贝的CAR编码基因的整合。
***
根据本公开的内容，可以制备并实施本文中公开并要求保护的所有方法，而无须过度实验。尽管已以优选的实施方案的方式描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员而言，很明显的是可在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下对本文中所述的方法以及所述方法的步骤或所述方法的步骤的顺序进行变化。更具体地，很明显，某些在化学上和生理上相关的试剂可以代替本文所述的试剂然而仍可获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员很显然的所有此类相似的代替和修改均可认为是在如由所述权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念内的。
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Claims (22)

1.一种工程化的细胞，包含嵌合T细胞受体(CAR)和膜结合的IL-15，其中所述膜结合的IL-15包括IL-15与IL-15Rα的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的工程化的细胞，其中所述膜结合的IL-15包含SEQ ID NO:6第19-395位所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的工程化的细胞，其中所述膜结合的IL-15由SEQ ID NO: 7的第1256-2386位所示的多核苷酸序列编码。
4.根据权利要求1所述的工程化的细胞，其中编码所述CAR的DNA被整合进所述细胞的基因组。
5.根据权利要求1所述的工程化的细胞，其中编码所述膜结合的IL-15的DNA包含染色体外元件。
6.根据权利要求1所述的工程化的细胞，其中编码所述膜结合的IL-15的DNA被整合进所述细胞的基因组。
7.根据权利要求1所述的工程化的细胞，其中所述细胞是T细胞或T细胞前体。
8.如权利要求1所述的工程化细胞，其中所述融合蛋白还包括连接所述IL-15和IL-15Ra的接头。
9.如权利要求8所述的工程化细胞，其中所述接头是丝氨酸-甘氨酸接头。
10.如权利要求1所述的工程化细胞，其中所述融合蛋白还包含IgE信号肽。
11.根据权利要求1-10任一所述的工程化细胞的用途，其特征在于，用于制备治疗癌症的药物。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述CAR被靶向癌细胞抗原。
13.权利要求11所述的用途，其特征在于，所述癌细胞抗原是CD19。
14.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述癌细胞抗原是ROR1, CD56, EGFR,CD123, c-met, GD2, HER2, CD20, MUC-1, CD23, CD22，癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、叶酸结合蛋白、CD30、CD33、CD138、CD56、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、组合的HER2-HER3、或组合的HER1和HER2。
15.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述癌是白血病或实体瘤。
16.一种工程化的细胞，其包含密码子优化的DNA，所述DNA编码：
(a) 嵌合抗原受体(CAR)和；
(b)包含SEQ ID NO:6的第19-395位所示氨基酸序列的融合蛋白。
17.如权利要求16所述的细胞，还包含转座酶。
18.如权利要求17所述的工程化细胞，所述转座酶是睡美人(SB)转座酶。
19.如权利要求17所述的细胞，其中所述转座酶由DNA表达载体提供。
20.如权利要求17所述的细胞，其中所述转座酶是编码睡美人转座酶的mRNA。
21.如权利要求20所述的细胞，其特征在于，所述mRNA包含帽和/或多聚腺苷酸尾。
22.如权利要求16所述的细胞，其特征在于，所述DNA包含编码SEQ ID NO:6第19-395位所示氨基酸序列的核苷酸序列。
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Expression of IL-15RA or an IL-15/IL-15RA fusion on CD81 T cells modifies adoptively transferred T-cell function in cis;Jesse Rowley et al.;《Eur. J. Immunol.》;20091231;摘要，第497页右栏最后一段到第499页左栏第二段，附图6 *
IL-15:IL-15 receptor alpha superagonist complex: High-level co-expression in recombinant mammalian cells, purification and characterization;Kai-ping Han et al.;《Cytokine》;20111022;804-810 *
Redirecting Specificity of T-Cell Populations For CD19 Using the Sleeping Beauty System;Harjeet Singh et al.;《Cancer Research》;20080415;摘要，第2965页右栏第一段,附图1 *

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