CN114981413A

CN114981413A - 过继免疫治疗

Info

Publication number: CN114981413A
Application number: CN202080089175.8A
Authority: CN
Inventors: R·康纳; D·辛哈
Original assignee: Queensland Institute of Medical Research QIMR
Current assignee: QIMR Berghofer Medical Research Institute
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2020-10-23
Publication date: 2022-08-30
Also published as: WO2021077175A1; AU2020371562A1; US20230210984A1; KR20220092905A; EP4048780A1; JP2022554217A; EP4048780A4

Abstract

本发明公开了过继免疫治疗的治疗组合物和方法。更具体而言，本发明公开了患有Epstein‑Barr病毒(EBV)相关疾病、病症或病况(如癌症)的受试者中的过继免疫治疗的方法。

Description

过继免疫治疗

相关申请

本申请要求2019年10月23日提交的标题为“过继免疫治疗”的澳大利亚临时申请号2019903995的优先权，其全部内容在此以其整体引入作为参考。

技术领域

本发明一般涉及治疗组合物和过继免疫治疗方法领域。更具体而言，本发明涉及在患有Epstein-Barr病毒(EBV)相关疾病、病症或病况(如癌症)的受试者中实施过继免疫治疗的方法。

背景技术

过继免疫治疗或细胞免疫治疗已成为治疗癌症、感染性并发症和自身免疫病的有力工具[1]。Steven Rosenberg团队率先在体外扩增患者来源的肿瘤浸润细胞(TIL)，并将其回输到晚期黑色素瘤患者体内，这是T细胞治疗在临床上的首次成功[2]。自此，已经证实，T细胞效应子功能可以在临床上成功治疗耐药细菌和真菌感染[3]，包括HIV[4]、CMV[5]和BKV[6]在内的病毒感染；以及造血干细胞移植(HSCT)和实体器官移植(SOT)患者中的血液恶性肿瘤和EBV相关移植后淋巴增生性疾病(PTLD)[7]。然而，在针对实体癌获得有效和持续的临床反应方面，这些治疗的影响仍然是一个重大挑战。

与针对癌症的有效过继细胞转移(ACT)反应相关的作用机制，围绕着T细胞识别恶性细胞上HLA分子呈递的肿瘤相关抗原(TAA)的能力[1]。TAA包括在细胞增殖中起关键作用的分子因子、体细胞突变产生的新抗原、和位于免疫豁免部位的睾丸/生殖系癌抗原(CTA)。来自肿瘤浸润淋巴细胞或外周血单核细胞的体外扩增的T细胞已被广泛使用。这项技术在病毒相关癌症和移植物患者疾病的治疗中受到了广泛关注。尤其是，过继T细胞治疗已显示，对移植后EB病毒(EBV)相关的淋巴细胞增殖性疾病(PTLD)具有显著临床反应[7]。EBV是一种人类遍在的强B淋巴细胞致癌性疱疹病毒，已知与多种人恶性肿瘤相关。

在健康受试者中，EBV感染通过功能性CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4⁺T淋巴细胞进行免疫控制，这些T淋巴细胞主要识别病毒感染的B细胞中表达的EBNA3-6抗原[8,9]。然而，由于其遍在性质和有力的细胞转化能力，EBV感染与B细胞和上皮细胞起源的多种恶性肿瘤有关，如伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、天然杀伤或T(NK/T)细胞淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病(PTLD)、鼻咽癌(NPC)和胃癌(GC)[10]。迄今为止，放射治疗和/或化疗仍然是治疗EBV相关恶性肿瘤的主要手段。目前，应用EBV特异性自体T细胞免疫治疗的大量临床试验正在进行中[7]。然而，在施用入患者体内之前，制造和测试自体CTL的安全性所需的时间窗，一直是产生用于ACT的EBV特异性T细胞的主要限制之一。

发明概述

本发明一般地涉及，用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况(如EBV相关癌症)的方法，所述方法包括施用结合或识别EBV抗原表位的同种异体EBV特异性T细胞。

在第一方面，本发明提供在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的方法，该方法包括以下步骤：

(a)对该受试者施用结合或识别EBV抗原的第一表位的第一同种异体T细胞群体；和

(b)对该受试者施用结合或识别所述EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位的第二同种异体T细胞群体；

从而在该受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况。

在此方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括在体外产生该第一和/或第二同种异体T细胞群体的初始步骤。

适宜地，所述方法包括对受试者施用治疗剂的另一步骤。在一个实施方案中，该治疗剂选自：免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂(如MEK1/2抑制剂)、BET抑制剂及其任何组合。在这方面，该免疫治疗剂可以适宜地是或包含免疫检查点抑制剂，如PD1抑制剂、PDL1抑制剂、CTLA4抑制剂、LAG3抑制剂、TIM3抑制剂或CD96抑制剂。在一些具体实施方案中，该免疫检查点抑制剂是或包含抗PD1抗体。

在第二方面，本发明涉及用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的药物组合物，该组合物包含：

-结合或识别EBV抗原的第一表位的第一同种异体T细胞群体；

-结合或识别所述EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位的第二同种异体T细胞群体；

和

-可选地，可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。

对于上述方面，所述第一同种异体T细胞群体和所述EBV相关疾病、病症或病况的细胞适宜地均包含编码第一MHC蛋白的第一人白细胞抗原(HLA)等位基因，或是该第一人白细胞抗原(HLA)等位基因限制性的。在这方面，该第一MHC蛋白可在所述EBV相关疾病、病症或病况的细胞上呈递所述EBV抗原的第一表位。

对于第一和第二方面，所述第二同种异体T细胞群体和所述EBV相关疾病、病症或病况的细胞均包含编码第二MHC蛋白的第二HLA等位基因，或是该第二HLA等位基因限制性的。为此，该第二MHC蛋白可以适宜地在所述EBV相关疾病、病症或病况的细胞上呈递所述EBV抗原或所述另一EBV抗原的第二表位。

在上述方面的一些实施方案中，该第二同种异体T细胞群体在施用该第一同种异体T细胞群体之前、同时和/或之后施用。

在第三方面，本发明涉及在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的方法，该方法包括以下步骤：

(a)对该受试者施用结合或识别EBV抗原表位的同种异体T细胞群体；和

(b)对该受试者施用治疗剂，其中该治疗剂选自免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂、BET抑制剂及其任何组合；

从而在该受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况。

适宜地，该同种异体T细胞群体在施用该治疗剂之前、同时和/或之后施用。

在一些实施方案中，本方法进一步包括在体外产生同种异体T细胞群体的初始步骤。

在第四方面，本发明提供用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的药物组合物，该组合物包含：

-结合或识别EBV抗原表位的同种异体T细胞群体；

-治疗剂，其中该治疗剂选自：免疫治疗剂、MAPK通路抑制剂、BET抑制剂及其任何组合；和

-可选地，可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。

关于第三和第四方面，所述同种异体T细胞群体和所述EBV相关疾病、病症或病况的细胞适宜地均包含编码第一MHC蛋白的第一人白细胞抗原(HLA)等位基因，或是该第一人白细胞抗原(HLA)等位基因限制性的。在一些实施方案中，该MHC蛋白在所述EBV相关疾病、病症或病况的细胞上呈递所述EBV抗原的表位。

对于第三和第四方面，适宜地，该免疫治疗剂是或包含免疫检查点抑制剂，如PD1抑制剂、PDL1抑制剂、CTLA4抑制剂、LAG3抑制剂、TIM3抑制剂或CD96抑制剂。在某些实施方案中，该免疫检查点抑制剂是或包含抗PD1抗体。在一些实施方案中，该MAPK途径抑制剂是或包含MEK1/2抑制剂。

在第五方面，本发明涉及结合或识别EBV抗原的第一表位的第一同种异体T细胞群体在制备用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的药物中的用途；其中，第一同种异体T细胞群体将与以下组合施用：(a)结合或识别所述EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位的第二同种异体T细胞群体；和/或(b)治疗剂，其中该治疗剂选自免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂、BET抑制剂及其任何组合。

在第六方面，本发明提供结合或识别EBV抗原的第一表位的第一同种异体T细胞群体用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况；其中，该第一同种异体T细胞群体将与以下组合施用：(a)结合或识别所述EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位的第二同种异体T细胞群体；和/或(b)治疗剂，其中该治疗剂选自免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂、BET抑制剂及其任何组合。

关于前述方面，所述EBV抗原和/或所述另一EBV抗原适宜地选自EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、LMP1、LMP2及其任何组合。在一个实施方案中，所述EBV抗原和/或所述另一EBV抗原是或包含EBNA1、LMP1和/或LMP2。

适合于上述方面，所述的EBV相关疾病、病症或病况是或包括EBV相关癌症。在某些实施方案中，所述EBV相关癌症选自鼻咽癌、NKT细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胃癌及其任何组合。

适宜地，本发明前述方面的受试者是哺乳动物。

优选地，该受试者是人。

在本说明书中，除非另有说明，否则“包含”、“含有”和“包括”都是包含性而非排他性地使用，因此所陈述的整数或整数组可以包含一个或多个其他未陈述的整数或整数组。

还应理解，不定冠词“一”和“一个”不应理解为单数不定冠词，或排除一个以上或多个该不定冠词所指的主题。例如，“一种”蛋白质包括一种蛋白质、一种或多种蛋白质或多种蛋白质。

附图简述

图1：同种异体“非定制型”(off-the-shelf)EBV特异性T细胞在体外识别和消除多种癌症的功效。(A)与NP43(EBV-)癌细胞相比，各EBV相关癌细胞系中所示EBV相关基因在转录物水平的相对表达倍数。用管家基因、HPRT1和18s RNA作为上样对照。(B)FACS图显示，在LMP1/2和EBNA1特异性肽存在下的IFN-γ表达，其中如前所述[1]，在所示的同种异体EBV特异性AdE1-LMPpoly转染的效应T细胞中，在活CD8+群体中观察所述表达。(C)在所示EBV相关癌细胞系中，通过LDH释放测定测量的细胞毒性，表明不同效应细胞与靶细胞比率(5:1-100:1)下T细胞源性细胞毒性的剂量依赖性增加。将HLA匹配的T细胞的细胞毒性表示为，与阳性对照(去垢剂裂解的对照)相比，T细胞处理癌细胞24小时后LDH释放的相对倍数变化。(D)通过MTS测定测量细胞存活率，表明了HLA匹配的T细胞在不同效应细胞与靶细胞比率(5:1-100:1)下剂量依赖性地抑制不同来源的多种EBV相关癌细胞系的细胞生长。用TI_001和TI_002处理SNKT16(HLA)，并将其细胞存活率与SNU719(HLA)和C17(HLA)的细胞存活率进行比较。各癌细胞的细胞存活率表示为，在T细胞处理24小时后，与模拟(PBS)处理对照相比，活细胞的相对倍数变化。(E)在存在HLA匹配的T细胞(效应细胞与靶细胞比率为50:1)的情况下，通过膜联蛋白V结合测定，在所示EBV相关癌细胞系中测量的细胞死亡。将各癌细胞中的细胞死亡表示为，T细胞处理48小时后，与模拟(PBS)处理相比，经T细胞处理的样品中膜联蛋白V结合的相对倍数变化。误差条代表三个独立实验的±SEM。

图2：EBV相关癌细胞和效应T细胞的体外表型表征。(A)在用模拟(PBS)和HLA匹配的T细胞处理24小时后，比较活的所示EBV相关癌细胞系中(i)Ki67+群体的百分比、(ii)活性胱天蛋白酶3+群体的百分比、以及(iii)BCL2+群体的百分比。SNU719和C17分别用TI_001和TI_002T细胞处理，而SNKT16则用两种T细胞处理。SNU719和C17门控分拣为CD45-群体，SNKT16门控分拣为CD45+CD3+CD56+群体，以将它们与T细胞群体区分开。(B)在如(A)所述用于处理各EBV相关癌细胞系的活T细胞中，比较(i)CD8+群体的百分比、(ii)Ki67+群体的百分比、(iii)GnzB+(颗粒酶B)群体的百分比、(iv)GnzK+(颗粒酶K)群体的百分比、(iii)Perf+(穿孔素)群体的百分比。误差条代表三个独立实验的±SEM。采用单因素方差分析计算p值：*p<0.01和***p<0.001。

图3：评估同种异体EBV特异性细胞毒性T细胞在体内对实体癌的治疗功效。在(A)C17和(B)C666.1来源的肿瘤异种移植物中，施用单剂量T细胞后；以及在(C)C17和(D)C666.1来源的肿瘤异种移植物中，以96小时间隔(用黑色箭头指示)施用两剂量T细胞后，观察T细胞治疗后的肿瘤生长和存活百分比。C17用TI_002处理，而C666.1用TI_004处理。使用数字卡尺测量肿瘤大小(面积，mm²)，并显示每个群组的平均肿瘤大小。将每个细胞系来源的异种移植物的肿瘤生长表示为n≥4只小鼠/组的平均肿瘤面积±SEM。在所示时间段内监测小鼠存活情况，并通过对数秩检验分析数据的统计显著性：*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。

图4：评估“切换抗原”疗法改善EBV特异性细胞毒性T细胞的体内功效。(A)与模拟(PBS)治疗对照组相比，在T细胞治疗(两个剂量，间隔96小时)组中观察SNU719来源的异种移植物的(i)肿瘤生长；(ii)在肿瘤生长的伦理极限下的肿瘤重量(单位：克)；(iii)T细胞治疗后的存活百分比。(B)与模拟(PBS)治疗对照组相比，在T细胞治疗(三个剂量)组中观察SNU719来源的异种移植物的(i)肿瘤生长；(ii)在肿瘤生长的伦理极限下的肿瘤重量(单位：克)；(iii)T细胞治疗后的存活百分比。红色箭头指示，施用三个连续剂量的TI_001(每个剂量间隔96小时)；而绿色箭头指示，将第三个剂量切换为TI_004，其在两个剂量的TI_001后施用。将每个细胞系来源的异种移植物的肿瘤生长表示为n≥5只小鼠/组的平均肿瘤面积±SEM。用Mann-Whitney t检验分析肿瘤重量数据的统计学显著性。在所示时间段内监测小鼠存活情况，并通过对数秩检验分析数据的统计显著性：*p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001。

图5：评估同种异体EBV特异性细胞毒性T细胞对淋巴恶性肿瘤的体内治疗功效。(A)示意性显示，使用照射后的CD34+细胞，在NRG小鼠中经12周重建人免疫系统并监测小鼠的移植物抗宿主病(GVHD)的时间表。该示意图还显示，在重建后施用EBV病毒(QIMR-WIL毒株)，并监测2周EBV感染。在EBV感染后在所示日期(用红色箭头突出显示)施用HLA匹配的T细胞，并在T细胞治疗后2周处死小鼠。(B)通过各组中活的(i)CD45+；(ii)CD45+CD3+；以及(iii)CD45+CD19+群体的存在百分比，显示12周人免疫系统的重建。(C)脾的总体形态，显示了在各治疗组中，用CB33A CD34+脐血细胞重建的n＝3只小鼠的脾脏中，淋巴恶性肿瘤的大小和存在。G1表示施用连续三个剂量(每个剂量间隔96小时)的TI_005，而G2表示将第三个剂量切换为TI_002，其在两个剂量的TI_005后施用。(D)比较各治疗组的脾脏重量(单位：克)。(E)脾的总体形态，显示在各治疗组中，用CB03 CD34+脐血细胞重建的n＝3只小鼠的脾脏中，淋巴恶性肿瘤的大小和存在。根据(C)中所示的策略，G1用TI_002治疗，而G2用TI_003治疗。(F)比较各治疗组的脾脏重量(单位：克)。通过单因素方差分析，分析肿瘤重量数据的统计显著性：*p<0.01和***p<0.001。

图6：PD1抑制对同种异体EBV特异性细胞毒性T细胞的体内治疗功效的影响。(A)热图显示326个基因的基因标签(gene signature)，这些基因是使用NanoString ImmuneFunction Panel从肿瘤浸润(TIL)CD8+细胞分离的RNA中观察到的。当肿瘤大小达到40mm²时，在单剂量TI_001治疗5天后，从六只独立小鼠(LT5-10)的SNU719来源的异种移植物分离TIL。将在该TIL中观察到的基因表达，与未刺激(LT11)和EBV-pepmix刺激(LT12)的基因表达进行比较。(B)比较在(如(A)中所述的)存活的TIL中的(i)CD3+CD8+群体百分比；(ii)CD8+PD1+群体百分比；(iii)CD8+LAG3+群体百分比；和(iv)CD8+TIM3+群体百分比，并与未刺激的T细胞(T细胞治疗)进行比较。误差条代表三个独立实验的±SEM。采用单因素方差分析计算p值。与模拟(PBS)治疗对照组相比，在各治疗组中观察，在T细胞、抗PD1以及T细胞和抗PD1联合治疗后，SNU719来源的异种移植物的(C)肿瘤生长；(D)在肿瘤生长的伦理极限下的肿瘤重量(单位：克)；和(E)存活百分比。用单因素方差分析，分析肿瘤重量数据的统计学显著性。在所示时间段内监测小鼠存活情况，并通过对数秩检验分析数据的统计显著性：ns不显著，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图7：MEK/12抑制剂与EBV特异性T细胞的组合。(A)MTS分析测定细胞存活率，显示HLA匹配的EBV特异性T细胞和MEK1/2抑制剂(AZD6244和曲美替尼)在单独或组合情况下在与SNU719细胞孵育48小时后在抑制细胞生长方面的影响。(B)通过膜联蛋白V结合测定测量细胞死亡，显示在EBV特异性T细胞和MEK1/2抑制剂作为单一和联合治疗与SNU719细胞孵育48小时后观察到的细胞死亡水平。(C)生长曲线，显示在单独或联合使用HLA匹配的EBV特异性T细胞和MEK1/2抑制剂的情况下用xCELLigence观察到的细胞死亡速率。采用单因素方差分析计算P值：*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001。

图8：JQ1与EBV特异性T细胞的组合。(A)MTS分析测定细胞存活率，显示HLA匹配的EBV特异性T细胞和JQ1在单独或组合情况下在与SNU719细胞孵育48小时后在抑制细胞生长方面的影响。(B)通过膜联蛋白V结合测定测量细胞死亡，显示在EBV特异性T细胞和JQ1作为单一和联合治疗与SNU719细胞孵育48小时后观察到的细胞死亡水平。采用单因素方差分析计算P值：ns-不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图9：测定MEK1/2抑制剂的IC₅₀值。在用0.1μM-5μM的司美替尼(selumatinib)(左图)和曲美替尼(trametinib)(右图)孵育所示细胞系48小时后，使用MTS测定细胞存活率。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。

图10：MEK1/2抑制剂与HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞的组合。通过MTS分析测定细胞存活率，其中显示了，HLA匹配的EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞比率为25:1)，与MEK1/2抑制剂(浓度为1μM)司美替尼(上图)和曲美替尼(下图)，在单独或组合情况下，与所示细胞(A)C17、(B)C666.1、(C)SNU719和(D)YCCLE1孵育48小时后，对细胞生长的抑制作用。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。采用单因素方差分析计算p值：ns＝不显著，*＝p<0.05，***＝p<0.01，***＝p<0.001和****＝p<0.0001。

图11：MEK1/2抑制剂和HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞两者组合的影响。(A)细胞生长曲线，显示在HLA匹配的EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞的比率为25:1)和司美替尼(1μM)单独或组合存在的情况下观察到的SNU719(上图)和C666.1(下图)的细胞增殖速率，其中使用Xcellegence进行测量。单独和组合对SNU719(上图)和C666.1(下图)的(B)细胞增殖(基于Ki67表达)和(C)细胞死亡(基于活性胱天蛋白酶-3表达)的影响，其中使用流式细胞术进行分析。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。采用单因素方差分析计算p值：ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图12：MEK1/2抑制剂与HLA不匹配的同种异体特异性T细胞的组合。通过MTS分析测量细胞存活率，显示了HLA不匹配的特异性T细胞(效应细胞与靶细胞比率为25:1)与浓度为1μM的MEK1/2抑制剂(A)司美替尼和(B)曲美替尼，在单独或组合情况下，在与SNU719(上图)和C666.1(下图)孵育48小时后，在抑制细胞生长方面的影响。(C)通过MTS分析测量细胞存活率，其中比较了，在与SNU719(上图)和C666.1(下图)孵育时，HLA匹配和HLA不匹配的EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞的比率为25:1)在单独或与司美替尼和曲美替尼(1μM)组合的情况下的影响。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。采用单因素方差分析计算p值：ns＝不显著，*＝p<0.05，***＝p<0.01，***＝p<0.001和****＝p<0.0001。

图13：通过表型分析MEK1/2抑制剂和HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞两者组合对癌细胞内在途径的影响。在SNU719(上图)和C666.1(下图)中，使用单独或组合的司美替尼(1μM)和HLA匹配的EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞的比率为25:1)处理16小时后，使用流式细胞术测量(A)pERK1/2、(B)MHC I类、(C)pSTAT3和(D)MYC的表达，以进行癌细胞表型分析。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。采用单因素方差分析计算p值：ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图14：测定JQ1抑制剂的IC₅₀值。用0.5μM-10μM JQ1孵育所示细胞系48小时后，使用MTS分析进行细胞存活率测量。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。

图15：JQ1抑制剂和HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞组合的影响。通过MTS分析测量细胞存活率，显示HLA匹配的EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞的比率为25:1)和JQ1(2.5μM)在单独或组合情况下，在与所示(A)胃癌(SNU719、YCCLE1(上图))和鼻咽癌细胞(C17、C666.1(下图))孵育48小时后，在抑制细胞生长方面的影响。(B)细胞生长曲线，显示在HLA匹配的EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞的比率为25:1)和JQ1(2.5μM)单独或组合存在的情况下观察到的SNU719(上图)和C666.1(下图)细胞的增殖速率，其中使用Xcellegence进行测量。使用流式细胞术检测，单独和双重组合对SNU719(上图)和C666.1(下图)的(C)细胞增殖(基于Ki67表达)和(D)细胞死亡(基于活性胱天蛋白酶-3表达)的影响。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。采用单因素方差分析计算p值：ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图16：JQ1抑制剂与HLA不匹配的同种异体特异性T细胞的组合。(A)通过MTS分析测量细胞存活率，显示HLA不匹配的特异性T细胞(效应细胞与靶细胞的比率为25:1)和JQ1抑制剂(浓度为2.5μM)在单独或组合情况下，在与SNU719(上图)和C666.1(下图)孵育48小时后，在抑制细胞生长方面的影响。(B)通过MTS分析测量细胞存活率，比较在与SNU719(上图)和C666.1(下图)孵育时，HLA匹配和HLA不匹配的EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞的比率为25:1)在单独以及与JQ1抑制剂(2.5μM)组合情况下的影响。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。采用单因素方差分析计算p值：ns＝不显著，*＝p<0.05，***＝p<0.01，***＝p<0.001和****＝p<0.0001。

图17：表型分析JQ1抑制剂和HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞两者组合对癌细胞内在途径的影响。在SNU719(上图)和C666.1(下图)中，使用单独或组合的JQ1(2.5μM)和HLA匹配的EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞的比率为25:1)16小时后，使用流式细胞术测量(A)MYC、(B)pERK1/2、(C)pAKT和(D)pSTAT3表达，进行癌细胞表型分析。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。采用单因素方差分析计算p值：ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图18：表型分析JQ1抑制剂和HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞组合对免疫调节分子的影响。在SNU719(上图)和C666.1(下图)中，使用单独或组合的JQ1(2.5μM)和HLA匹配的EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞的比率为25:1)16小时后，使用流式细胞术测量(A)MHC I类、(B)PD-L1和(C)CD47表达，进行癌细胞表型分析。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。采用单因素方差分析计算p值：ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图19：评估司美替尼和同种异体EBV特异性细胞毒性T细胞联合的体内治疗功效。(A)评估了司美替尼和同种异体T细胞(TIG-001)组合对NRG小鼠中EBV阳性SNU719异种移植物生长的影响。用两个剂量的HLA匹配T细胞(黑箭头所示，每只小鼠每个剂量2×10⁷个T细胞)和连续14天口服司美替尼(12.5mg/Kg)单独或组合治疗荷瘤小鼠。将每个异种移植物的生长表示为n＝9只小鼠/组的平均肿瘤面积±SD。(B)从所示治疗组小鼠分离的肿瘤的总体形态。(C)来自所示治疗组的小鼠的(B)中所述肿瘤的肿瘤重量。数据表示为每组n＝3只小鼠的平均值±SD。采用单因素方差分析计算p值。(D)通过使用流式细胞术检测CD45、CD3和CD8表达，确定在同种异体T细胞(TIG-001)单独以及与司美替尼组合治疗中观察到的肿瘤浸润物的存活百分比。采用Student T检验计算p值。(E)(A)中所述EBV相关肿瘤的荷瘤小鼠在进行司美替尼和同种异体T细胞单一和联合治疗后的Kaplan–Meier总生存率分析。在所示时间段内监测动物的存活情况(n＝6只小鼠/组)，并通过对数秩检验分析统计显著性：ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

发明详述

本发明至少部分地基于如下令人惊讶的发现，即使用“非定制型”同种异体EBV特异性T细胞的过继免疫治疗能够治疗或预防一系列EBV相关或EBV阳性癌症。已显示，在联合使用对不同EBV抗原表位特异的EBV特异性T细胞群体时，这种治疗效果是特别有效的。此外，本发明人已证明，同种异体EBV特异性T细胞与免疫检查点抑制剂、MEK1/2抑制剂和/或BET抑制剂的组合可显著提高这种过继T细胞治疗对EBV相关疾病、病症或病况的功效。

因此，在广义上，本发明涉及在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的方法，该方法包括对该受试者施用结合或识别EBV抗原表位的同种异体T细胞群体的步骤，从而在该受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况。

在一个方面，本发明涉及在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的方法，该方法包括以下步骤：

(a)对该受试者施用治疗有效量的结合或识别EBV抗原的第一表位的第一同种异体T细胞群体；和

(b)对该受试者施用治疗有效量的结合或识别该EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位的第二同种异体T细胞群体；

从而在该受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况。

在一个相关方面，本发明提供用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的药物组合物，该组合物包含：

-结合或识别EBV抗原的第一表位的第一同种异体T细胞群体；

-结合或识别该EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位的第二同种异体T细胞群体；和

-可选地，可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。

以下陈述同等地适用于上述两个方面。

Epstein-Barr病毒或EBV是一种常见的人类病原体，可以引起一种或多种人类疾病、病症或病况或与之相关。因此，上述方法的某些实施方案涉及，预防和/或治疗由EBV感染引起或与之相关的一种或多种人类疾病、病症或病况，如EBV相关癌症。EBV主要通过上皮细胞和B淋巴细胞感染人宿主，然后可以在人宿主体内建立长期的潜伏。全世界90％以上的传染性单核细胞增多症(IM)病例由EBV的原发感染引起，通过EB病毒感染的B细胞的扩增，主要感染儿童和年轻人。EBV还与几种癌症有关，包括伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤、胃癌和鼻咽癌、HIV感染者的淋巴瘤以及移植后淋巴增生性疾病(PTLD)。也发现EBV与自身免疫病，尤其是多发性硬化有关。

在本发明的上下文中，“EBV相关疾病、病症或病况”指由Epstein Barr病毒感染引起或与之相关的任何临床病理。为此，EBV相关疾病、病症或病况可指由EBV直接或间接引起的任何疾病、以及使患者易受EBV感染的疾病。前一类疾病的实例包括传染性单核细胞增多症、鼻咽癌和伯基特淋巴瘤。后一类疾病(即，将患者置于EBV感染风险的疾病)包括获得性免疫缺陷综合征以及，一般性地，导致免疫抑制状态或免疫系统功能降低的任何病况，如接受器官移植和某些癌症治疗的患者。在一个具体实施方案中，该EBV相关疾病、病症或病况适宜地是或包括多发性硬化。

术语“EBV阳性细胞”指，(例如，以潜伏形式)表达EBV或一种或多种EBV蛋白的细胞，包括癌细胞。

在优选实施方案中，EBV相关疾病、病症或病况是或包括EBV相关和/或阳性癌症。除非另有规定，本文所用的术语“EBV相关癌症”或“EBV阳性癌症”指与Epstein-Barr病毒(EBV)相关的癌症。在某些实施方案中，EBV阳性癌症是其中大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％或大于约80％含有或表达EBV病毒的癌症。

本文中广泛使用的术语“癌症”、“肿瘤”、“恶性的”和“恶性肿瘤”指疾病或病况，或与疾病或病况相关的细胞或组织，其特征在于异常或不正常的细胞增殖、分化和/或迁移，通常伴随着异常或不正常的分子表型，包括与肿瘤发生、肿瘤标记物表达、肿瘤抑制蛋白的表达或活性的丧失、和/或异常或不正常的细胞表面标记物表达相关的一个或多个基因突变或其他基因变化。

癌症可以包括任何侵袭性或潜在侵袭性癌症、肿瘤或其他恶性肿瘤，如http://www.cancer.gov/cancertopics/alphalist的NCI Cancer Index中所列，包括所有主要癌症形式，如肉瘤、癌瘤、淋巴瘤、白血病和母细胞瘤，但不限于此。这些癌症可以包括乳腺癌、肺癌(包括肺腺癌)、生殖系统癌症(包括卵巢癌、宫颈癌、子宫癌和前列腺癌)、脑和神经系统癌症、头颈癌、胃肠道癌症(包括结肠癌、结直肠癌和胃癌)、肝癌、肾癌、皮肤癌(如黑色素瘤和皮肤癌)、血细胞癌(包括淋巴样癌和骨髓单核细胞癌)、内分泌系统癌(如胰腺癌和垂体癌)、肌肉骨骼癌(包括骨骼和软组织癌)，但不限于此。在具体实施方案中，癌症为实体癌或白血病或液体癌。适宜地，该癌症表达(例如过量表达)一种或多种EBV抗原，如上文所述的EBV抗原。

在具体实施方案中，EBV相关癌症选自鼻咽癌、NKT细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胃癌、腮腺癌、乳腺癌、平滑肌肉瘤及其任何组合。在一个具体实施方案中，该EBV相关癌症不是移植后淋巴增生性疾病。

本文所用的“分离的”是指，已从其自然状态移出或以其他方式进行人为操作的材料。分离的材料可基本上或实质上不含在其自然状态下通常伴随的成分，或可以经操作从而与在其自然状态下通常伴随的成分一起处于人工状态。分离的材料可以是重组、化学合成、富集、纯化或部分纯化的形式。

本文所用的“治疗”是指在EBV相关疾病、病症或病况开始发展后，至少部分改善、消除或减少其症状或病征的治疗干预。治疗无需对该受试者绝对有益。

本文所用的“预防”是指在感染或暴露于EBV或其分子成分之前和/或在EBV相关疾病、病症或病况的症状或病征出现之前，为了至少部分预防和/或减少该症状或病征而启动的行动。应理解，这种预防无需对受试者绝对或完全有益。

术语“治疗有效量”描述了述及的活性剂，如EBV特异性同种异体T细胞或治疗剂的一定量，所述量足以在用该活性剂治疗的受试者中达到期望的作用。例如，这可以是包含第一同种异体T细胞群体、第二同种异体T细胞群体和/或本文中所述治疗剂的组合物的量，所述量为减少、缓解和/或防止EBV相关疾病、病症或病况(包括EBV相关癌症、癌症转移和复发)所必需的量。在一些实施方案中，“治疗有效量”足以减少或消除EBV相关疾病、病症或病况的症状。在其他实施方案中，“治疗有效量”是足以达到期望生物学效应的量，例如，有效减少或防止EBV相关癌症生长、复发和/或转移的量。

理想地，活性剂的治疗有效量是足以诱导期望结果而不会在受试者中引起实质性细胞毒性作用的量。用于减少、减轻和/或预防EBV相关疾病、病症或病况的活性剂的有效量将取决于所治疗的受试者、任何相关疾病、病症和/或病况的类型和严重程度(例如，EBV相关疾病、病症或病况的类型)以及治疗组合物的施用方式。

应理解，除了上述治疗之外，本方面的方法还可以包括一种或多种其他治疗，如癌症治疗。此类治疗可包括药物治疗、化疗、抗体、核酸和其他生物分子治疗、放射治疗、手术、营养治疗、放松或冥想治疗以及其他自然或整体治疗，但不限于此。通常，药物、生物分子(例如抗体、抑制性核酸，如siRNA)或化疗剂在本文中称为“抗癌治疗剂”或“抗癌剂”。

“施用”是指通过特定的选择途径将本文公开的同种异体T细胞和/或治疗剂或组合物引入动物受试者。

同种异体T细胞和/或治疗剂或包含该同种异体T细胞和/或治疗剂的组合物的施用可通过任何已知的胃肠外、局部或肠道途径进行，包括静脉内、肌肉内、腹腔内、颅内、经皮、口服、鼻内、肛门和眼内，但不限于此。

剂型包括片剂、分散剂、悬浮剂、注射剂、溶液、糖浆、锭剂、胶囊、栓剂、气雾剂、透皮贴剂等。这些剂型还可包括注射或植入专为此目的而设计的控释装置，或经修改以额外地以这种方式起作用的其他形式的植入物。治疗剂的控制释放可通过例如用疏水聚合物(包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸)以及某些纤维素衍生物(如羟丙基甲基纤维素)包被该治疗剂来实现。此外，控制释放可通过使用其他聚合物基质、脂质体和/或微球来实现。

适用于口服或胃肠外给药的本发明组合物可呈现为离散单元，如胶囊、小袋或片剂，每个胶囊、小袋或片剂含有预定量的本发明一种或多种治疗剂，呈现形式可以为粉末或颗粒，或水性液体、非水性液体中的溶液或悬浮液，水包油乳剂或油包水液体乳剂。此类组合物可通过任何药学方法制备，但所有方法均包括使一种或多种如上所述的活性剂与构成一种或多种必需成分的载体组合的步骤。一般而言，通过将本发明的活性剂与液体载体或精细分散的固体载体或两者均匀且紧密地混合，然后根据需要将产品成形为所希望的呈现形式，来制备组合物。

本文所述的同种异体T细胞、治疗剂和组合物可以以与剂型相容的方式及以药学上有效的量施用。在本发明的上下文中，对患者施用的剂量应足以在适当的时间段内在患者中产生有益反应。给药的活性剂(一种或多种)的量可取决于待治疗的受试者(包括年龄、性别、体重和一般健康状况)、由医生判断的因素。

在某些实施方案中，本文所述的治疗EBV相关疾病、病症或病况的方法包括，对受试者施用至少2个剂量(例如2、3、4、5、6个剂量等)的第一和/或第二同种异体T细胞群体和/或治疗剂。该剂量可根据需要以周期性方式施用，如每日、每周、每两周、每月等。

本发明的一个具体的广泛应用是提供在患有EBV相关疾病、病症或病况(如上文所述)的受试者中进行细胞或过继免疫治疗的方法，该方法包括对该受试者施用治疗有效量的本文所述同种异体T细胞和可选的可药用载体、稀释剂或赋形剂的步骤。

术语“细胞免疫治疗”或“过继免疫治疗”是指免疫活性细胞(如T细胞)的转移，用于治疗癌症或感染性疾病(参见例如June,C.H.编辑,2001,In:Cancer Chemotherapy andBiotherapy:Principles and Practice,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore；Vonderheide等,2003,Immun.Research 27:1-15)。为此，应理解，过继免疫治疗是一种策略，通常旨在通过自体或同种异体细胞(如T细胞)替换、修复或增强组织或系统(如免疫系统)的生物学功能。

本文所用的术语“同种异体”是指来源于相同物种但基因不同的受试者并因此通常在免疫学上不相容的细胞或组织，如T细胞。因此，术语“同种异体细胞”是指抗原性不同但属于同一物种的细胞类型。通常，术语“同种异体”用于定义从供体移植到相同物种的受体的细胞，如T细胞。

本文所用的术语“T细胞”(即T淋巴细胞)旨在包括T细胞谱系内的所有细胞，包括来自哺乳动物(例如人)的胸腺细胞、未成熟T细胞、成熟T细胞等。各种T细胞群体，如辅助性T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤性T细胞和记忆性T细胞，可以根据其细胞因子谱及其功能来定义。优选地，T细胞是表达CD4或CD8(但不是两者)和T细胞受体的成熟T细胞。应理解，T细胞受体(TCR)是见于T细胞表面的分子，负责识别与MHC或HLA分子结合的抗原肽。适宜地，同种异体T细胞包括CD4+辅助性T细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞。在这方面，本文所述的同种异体T细胞可以是CD4+辅助性T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群体。

根据本发明，对人类患者施用包含EBV特异性T细胞的同种异体T细胞群体，如第一和/或第二同种异体T细胞群体。对人类患者施用的该同种异体T细胞群体适宜地是HLA等位基因限制性的，所述HLA等位基因是与EBV相关疾病、病症或病况的EBV阳性细胞所共有的HLA等位基因。在一个具体实施方案中，该第一同种异体T细胞群体和EBV相关疾病、病症或病况的细胞均包含或共有编码第一MHC蛋白的第一人白细胞抗原(HLA)等位基因，或是所述第一人白细胞抗原(HLA)等位基因限制性的。在另一个实施方案中，该第二同种异体T细胞群体和EBV相关疾病、病症或病况的细胞均包含编码第二MHC蛋白的第二HLA等位基因，或是所述第二HLA等位基因限制性的。在一些实施方案中，通过确定EBV相关疾病、病症或病况的细胞(例如癌细胞)的HLA分型(HLA assignment)，并选择受限于此类细胞的HLA等位基因的包含EBV特异性T细胞的同种异体T细胞群体(或用于产生该同种异体T细胞群体的T细胞系)，来确保这种HLA等位基因限制。HLA分型(即HLA基因座类型)可通过本领域已知的任何方法确定(即分型)。用于确定HLA分型的非限制性示例性方法可见于ASHI LaboratoryManual,4.2版(2003)中，其在此引入作为参考。

在某些实施方案中，第一和/或第二同种异体T细胞群体与EBV相关疾病、病症或病况的EBV阳性细胞共有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8个)HLA等位基因(例如HLA-A等位基因、HLA-B等位基因、HLA-C等位基因和/或HLA-DR等位基因)。在这方面，可以设想，该第一和第二同种异体T细胞群体可以与EBV相关疾病、病症或病况的细胞共有一个或多个相同的HLA等位基因。实际上，在具体实施方案中，该第一同种异体T细胞群体与该第二同种异体T细胞群体共有一个或多个HLA等位基因(例如1、2、3、4、5、6、7、8个HLA等位基因)。理想地，该第一同种异体T细胞群体适宜地包含一个或多个与EBV相关疾病、病症或病况的细胞共有的HLA等位基因(如第一HLA等位基因)，且该HLA等位基因与第二同种异体T细胞群体的HLA等位基因(如第二HLA等位基因)不共有(即，不同)。类似地，该第二同种异体T细胞群体适宜地包含一个或多个与EBV相关疾病、病症或病况的细胞共有的HLA等位基因(如第二HLA等位基因)，且该等位基因与第一同种异体T细胞群体所包含的HLA等位基因(如第一HLA等位基因)不共有(即不同)。为此，该第一和第二同种异体T细胞群体优选不具有或不包含相同或同一的HLA等位基因成分。此外，该第一同种异体T细胞群体适宜地不识别或结合该第二表位，和/或该第二同种异体T细胞群体适宜地不识别或结合该第一表位。

本文所用的术语“主要组织相容性复合体”(MHC)是指抗原呈递分子、蛋白质或多肽，其作为免疫系统的一部分发挥作用来结合抗原和其他肽片段，并将其展示在细胞表面以供抗原识别分子(如TCR)识别。在用于人MHC时，MHC可与术语“人白细胞抗原”(HLA)互换使用；因此，MHC指所有HLA亚型，包括但不限于本文公开的经典MHC等位基因或基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR，以及其所有变体(variant)、同型(isoform)、同种型(isotype)和其他生物等同物。MHC I类(MHC-I)和MHC II类(MHC-II)分子利用不同的抗原加工途径。通常，来源于胞内抗原的肽通过MHC I类分子呈递给CD8+T细胞，MHC I类分子在几乎所有细胞上都表达；而来源于胞外抗原的肽通过MHC-II分子呈递给CD4+T细胞。然而，已观察到这一一般原则有若干例外。

在本文公开的一些实施方案中，具体的EBV特异性抗原、肽和/或表位在EBV相关疾病、病症或病况的细胞上，在适宜的MHC I类或II类蛋白质的背景中，在抗原-MHC复合物中被识别和呈递。作为实例，第一MHC蛋白适宜地在EBV相关疾病、病症或病况的细胞上呈递EBV抗原的第一表位，用于第一同种异体T细胞群体识别；而第二MHC蛋白可在EBV相关疾病、病症或病况的细胞上呈递该EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位，用于第二同种异体T细胞群体识别。鉴于上述，可评估本文所述同种异体T细胞的遗传组成，以针对具体受试者和/或具有具体EBV抗原组的EBV相关疾病、病症或病况，确定适宜的HLA/MHC等位基因。

适宜地，该EBV抗原和/或该另一EBV抗原可以是本领域已知的任何抗原。示例性EBV抗原包括蛋白质EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、LMP1和LMP2。在具体实施方案中，该EBV抗原和/或该另一EBV抗原是或包含EBNA1、LMP1和/或LMP2。

本文所述的同种异体T细胞适宜地对该EBV抗原和/或该另一EBV抗原具有抗原特异性。本文中使用的短语“具有抗原特异性”和“引发抗原特异性反应”意指，该同种异体T细胞可以特异性结合并免疫识别抗原，从而该同种异体T细胞与该抗原的结合引发免疫反应。不受限于具体理论或机制，认为通过引发针对EBV相关疾病、病症或病况的EBV阳性细胞的抗原特异性反应，本文所述的EBV特异性同种异体T细胞可提供以下任何一项或多项功能：靶向和破坏EBV阳性细胞，如EBV阳性癌细胞，减少或消除癌细胞，促进免疫细胞浸润到(一个或多个)肿瘤部位，增强/延长抗癌反应。

本文中广泛使用的表述“表位”是指，包含蛋白质的连续或不连续氨基酸序列的抗原性蛋白质片段，其中表位可被免疫系统的元件(如抗体或其他抗原受体，如MHC蛋白质)识别或结合。本领域技术人员将很好地理解，大多数EBV抗原可以具有多个表位或抗原决定簇。

鉴于前述，第一表位可以是EBV蛋白质的抗原性蛋白片段，而第二表位适宜地是来自衍生该第一表位的相同EBV蛋白质或另一EBV蛋白质的不同抗原性蛋白片段。

本文中，“蛋白质”是氨基酸聚合物，其中氨基酸可包括D-氨基酸、L-氨基酸、天然和/或非天然氨基酸。如本文中通常使用，“肽”是包含不超过六十(60)个连续氨基酸的蛋白质。如本文中通常使用，“多肽”是包含超过六十(60)个连续氨基酸的蛋白质。术语“蛋白质”也应理解为涵盖含蛋白质的分子，诸如糖蛋白和脂蛋白等，但不限于此。

在一些实施方案中，本文所述的同种异体T细胞和/或治疗剂(包括它们的组合)可以以包含可药用载体、稀释剂或赋形剂的组合物的形式对受试者施用。

应理解，可药用载体、稀释剂和/或赋形剂可包括可安全用于全身施用的任何固体、半固体、凝胶或液体填充剂、稀释剂或包封物质。取决于具体的施用途径，载体、稀释剂和/或赋形剂可选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石粉、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、等渗盐水、无热原水、润湿剂或乳化剂、膨胀剂、助流剂、包衣(例如肠衣)、软化剂、粘合剂、填料、崩解剂、润滑剂、pH缓冲剂(例如磷酸盐缓冲剂)和/或调味剂，但不限于此。组合物可以以任何一种或多种剂型，包括片剂、分散剂、悬液、注射剂、糖浆、锭剂、胶囊、栓剂、气雾剂、透皮贴剂等，对人施用。

描述可药用载体、稀释剂和赋形剂的有用参考文献是Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA,1991)，其在此引入作为参考。

在具体实施方案中，该第二同种异体T细胞群体在施用该第一同种异体T细胞群体(i)之前、(ii)之后或(iii)同时施用。在一个实施方案中，施用该第一同种异体T细胞群体和施用该第二同种异体T细胞群体(顺次或并行)导致EBV相关疾病、病症或病况的治疗或预防，且该治疗和预防大于该第一同种异体T细胞群体或该第二同种异体T细胞群体中任一者在缺乏另一者时施用导致的治疗或预防。

在具体实施方案中，上述方法还包括体外产生该第一和/或第二同种异体T细胞群体的初始步骤。用于对人患者施用的、包含EBV特异性T细胞的该第一和第二同种异体T细胞群体，可通过本领域已知的方法产生，或可从通过本领域已知的方法产生的冷冻保存T细胞系(每个T细胞系包含EBV特异性T细胞)的现有库(保藏)选择，并在施用前解冻并优选扩增。

在某些实施方案中，体外产生同种异体T细胞群体的步骤包括，用一种或多种EBV抗原致敏(即，刺激)同种异体T细胞，以产生EBV特异性T细胞。用于在体外产生同种异体T细胞群体的同种异体T细胞，可通过本领域已知的任何方法从同种异体T细胞供体分离。在具体实施方案中，从同种异体T细胞供体的PBMC分离的外周血淋巴细胞中，富集该同种异体T细胞。

在具体实施方案中，使同种异体T细胞致敏的步骤包括，使用源自一种或多种EBV抗原的至少一种免疫原性肽，装载或转化抗原呈递细胞，如树突状细胞、细胞因子激活的单核细胞、或外周血单核细胞。为此，可用例如包含源自一个或多个EBV抗原的重叠肽的池或复合表位抗原(polytope),装载或转化抗原呈递细胞。在一个具体实施方案中，体外产生同种异体T细胞群体的步骤包括，使用外周血单个核细胞致敏同种异体T细胞。

适宜地，前述方法包括对受试者施用治疗剂的另一步骤。类似地，上述组合物可进一步包含治疗剂。本文所用的术语“治疗剂”指，用于在受试者中成像、影响、治疗、解决、预防或改善不希望的病况或疾病(如EBV相关疾病、病症或病况)的化合物或分子。

治疗剂可以是本领域已知的任何药物。在一些实施方案中，该治疗剂是或包含抗癌治疗或抗癌剂。通常，药物、生物分子(例如抗体、抑制性核酸，如siRNA)或化疗剂在本文中称为“抗癌治疗剂”。仅作为实例，这些可包括：化疗剂，如紫杉醇、阿霉素、甲氨蝶呤、伊立替康、达卡巴嗪、替莫唑胺和顺铂，但不限于此；生物治疗剂或免疫治疗剂，如抗PD-1抗体(如纳武单抗)和抗CTLA4抗体(如伊匹单抗)，但不限于此；和/或分子靶向活性剂，如MAPK途径(即Ras-Raf-MEK-ERK信号通路)抑制剂和BET抑制剂。

在具体实施方案中，治疗剂选自免疫治疗剂、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径抑制剂、BET抑制剂及其任何组合。

本文所使用的术语“免疫治疗剂”是指，可以在受试者中诱导、增强或抑制免疫反应的任何活性剂。在某些实施方案中，免疫治疗剂可以是免疫检查点调节剂。本文所用的术语“免疫检查点调节剂”指可以完全或部分减少、抑制、干扰或调节一种或多种调节T细胞活化或功能的免疫检查点蛋白的分子。在某些实施方案中，该免疫检查点调节剂是免疫检查点抑制剂。

免疫检查点蛋白的非限制性实例包括细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA；例如CTLA4)及其配体CD80和CD86；程序性细胞死亡蛋白(PD，例如PD-1)及其配体和PDL2；吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶-1(ID01)；T细胞膜蛋白(TIM，例如TIM3)；腺苷A2a受体(A2aR)；淋巴细胞激活基因(LAG，例如LAG3)；杀伤性免疫球蛋白受体(KIR)；CD96；诸如此类。应理解，这些蛋白质通常负责共刺激或抑制性T细胞反应。免疫检查点蛋白可以广泛调节和维持自身耐受性以及生理免疫反应的持续时间和幅度。

在某些实施方案中，免疫检查点调节剂(例如免疫检查点抑制剂)可以是结合或抑制免疫检查点蛋白的生物学活性的小分子、抗体、重组结合蛋白或肽。

免疫检查点调节剂(例如免疫检查点抑制剂)的非限制性实例包括，CTLA4抑制剂(例如伊匹单抗)、PD1抑制剂(例如纳武单抗)、PDL1抑制剂(例如阿替利珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗)、LAG3抑制剂、KIR抑制剂、B7-H3配体、B7-H4配体、CD96抑制剂和TIM3抑制剂。在具体实施方案中，该免疫检查点抑制剂选自抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体、抗LAG3抗体、抗TIM3抗体、抗CD96抗体及其任何组合。

在一个具体实施方案中，免疫检查点抑制剂是或包含PD1抑制剂，更具体而言是抗PD1抗体。示例性PD1抑制剂和抗PD1抗体包括，帕普利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、司利珠单抗(spartalizumab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、信迪利单抗(sintilimab)、替雷利珠单抗(tislelizumab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、AMP-224和AMP-514。

本文所用的“抗体”是或包含免疫球蛋白，包括其片段。术语“免疫球蛋白”包括哺乳动物免疫球蛋白基因复合体的任何抗原结合蛋白产物，包括免疫球蛋白同种型IgA、IgD、IgM、IgG和IgE及其抗原结合片段。术语“免疫球蛋白”包括重组、嵌合或人源化的、或以其他方式包含改变或变异的氨基酸残基、序列和/或糖基化的免疫球蛋白，无论是天然存在的还是通过人为干预(例如通过重组DNA技术)产生的。

本发明还在其范围内包括抗体片段，如Fc、Fab或F(ab)2片段或单链Fv抗体(ScFv)。本发明还考虑包括多个单链抗体的多价重组抗体片段，即所谓的二链抗体、三链抗体和/或四链抗体，以及二聚化激活的demibody(例如WO/2007/062466)。作为实例，此类抗体可根据Holliger等,1993Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448中或Kipriyanov,2009Methods Mol Biol562:177-93中所述的方法制备，在此以其整体引入作为参考。

通常，抗体和抗体片段可以是多克隆的或单克隆的。还应理解，通过在适当的宿主细胞中表达编码抗体或抗体片段的核酸，抗体可作为重组合成抗体或抗体片段产生。Coligan等,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY的第7章中以及Zuberbuhler等,2009,Protein Engineering,Design&Selection 22 169中提供了重组抗体表达和选择技术的非限制性实例，包括噬菌体展示方法。

本文所用的术语“MAPK抑制剂”是指在对受试者施用后，导致受试者的一个或多个细胞(如癌细胞)中MAPK途径抑制的任何化合物或化学物质。MAPK抑制剂包括但不限于，低分子量抑制剂、抗体或抗体片段、反义构建体、小抑制性RNA(即通过dsRNA的RNA干扰；RNAi)和核酶。在一些实施方案中，该MAPK抑制剂是小的有机分子。MAPK抑制剂包括例如RAS抑制剂、RAF抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、JNK抑制剂和/或p38抑制剂。

MAPK途径抑制剂可以是本领域已知的任何此类抑制剂，包括Ras(即HRas、KRas和/或NRas)、Raf(即A-Raf、B-Raf和/或C-Raf)、丝裂原活化蛋白激酶(即MEK1/2)和/或细胞外信号调节激酶(即ERK1/2)的功能和/或信号传导(包括其突变变体)的特异性抑制剂。作为实例，此类MAPK途径抑制剂可选自以下：

i)MEK抑制剂：AZD6244、R04987655、R05126766、TAK-733、MSC1936369B(AS703026)、GSK1 120212、BAY86-9766、GDC-0973、GDC-0623、PD325901、ARRY-438162、CM040、E6201、ARRY300；

ii)Raf和/或BRaf选择性抑制剂：PLX4032、GSK21 18436、索拉非尼(BAY-43-9006)、BMS-908662(XL-281)、RAF265、RG-7256(RO5212054、PLX3603)、R05126766、ARQ-736、E-3810、DCC-2036；

iii)ERK抑制剂：Ulixertinib(BVD-523)、SCH772984、DEL-22379、MK-8353(SCH900353)、AZD0364、VX-11e、CC-90003；

iv)Ras抑制剂：MCI-062、Salirasib、BAY 293、ARS-1620。

可以设想，BET抑制剂可以是本领域已知的任何一种。本文所用的术语“BET抑制剂”指结合BET并抑制和/或降低BET的生物学活性的化合物。在一些实施方案中，该BET抑制剂基本上或完全抑制BET的生物学活性。在一些实施方案中，该生物活性是BET与染色质(例如与DNA结合的组蛋白)和/或另一乙酰化蛋白质的结合。适宜地，该BET抑制剂抑制BRD2、BRD3、BRD4和BRDT中的一种或多种。BET抑制剂包括，含有溴区结构域的蛋白质的调节剂，如美国公开号2014/0336190中公开的苯并咪唑衍生物。示例性BET抑制剂包括I-BET 151(GSK1210151A)、I-BET 762(GSK525762)、OTX-015、TEN-010、CPI-203、CPI-0610、olinone、RVX-208、LY294002、AZD5153、MT-1和MS645。

在另一方面，本发明涉及在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的方法，该方法包括以下步骤：

从而在该受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况。

在相关方面，本发明涉及用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的药物组合物，该组合物包含：

-结合或识别EBV抗原表位的同种异体T细胞群体；

-治疗剂，其中该治疗剂选自免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂、BET抑制剂及其任何组合；和

-可选地，可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。

“可药用载体”是指，由并非在生物学上或在其他方面不期望的材料组成的药物载体，即该材料可与所选择的活性剂一起对受试者施用，而不会引起任何或实质性不良反应。载体可包括赋形剂和其他添加剂，如稀释剂、洗涤剂、着色剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂、转染剂等。

类似地，本文提供的化合物的“可药用”盐、酯、酰胺、前药或衍生物是并非在生物学上或其他方面不期望的盐、酯、酰胺、前药或衍生物。

以下陈述同等地适用于上述两个方面。

适宜地，同种异体T细胞群体和EBV相关疾病、病症或病况的细胞共有编码MHC蛋白的人白细胞抗原(HLA)等位基因。在具体实施方案中，该MHC蛋白在EBV相关疾病、病症或病况的细胞上呈递EBV抗原的表位。

免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂和/或BET抑制剂可以是本领域已知的任何抑制剂，如上文所述。在具体实施方案中，该MAPK途径抑制剂是或包含MEK1/2抑制剂。在另一实施方案中，该免疫治疗剂是或包含免疫检查点抑制剂，如抗PD1抗体。

适宜地，同种异体T细胞群体在施用治疗剂之前、同时和/或之后施用。因此，在某些实施方案中，对受试者施用该治疗剂，随后施用该同种异体T细胞。在备选实施方案中，对受试者施用该同种异体T细胞，随后施用该治疗剂。在另一备选实施方案中，该同种异体T细胞与该治疗剂同时施用。

在一个实施方案中，本方面的方法还包括在体外产生该同种异体T细胞群体的初始步骤，如通过上述方法。

适宜地，该EBV抗原和/或另一EBV抗原选自EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、LMP1、LMP2及其任何组合。更具体而言，该EBV抗原和/或该另一EBV抗原适宜地是或包含EBNA1、LMP1和/或LMP2。

适宜地，该EBV相关疾病、病症或病况是或包括EBV相关癌症，如上文所述的那些。在一个实施方案中，该EBV相关癌症选自鼻咽癌、NKT细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胃癌及其任何组合。

在另一方面，本发明涉及结合或识别EBV抗原的第一表位的第一同种异体T细胞群体(例如，如本文所述的)在制备用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的药物中的用途；其中该第一同种异体T细胞群体将与以下组合施用：(a)结合或识别该EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位的第二同种异体T细胞群体，例如如本文所述的；和/或(b)治疗剂，例如如本文所述的治疗剂，其中该治疗剂选自免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂、BET抑制剂及其任何组合。

在最后一个方面，本发明提供如本文所述的结合或识别EBV抗原的第一表位的第一同种异体T细胞群体用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况；其中该第一同种异体T细胞群体与以下组合施用：(a)如本文所述的结合或识别该EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位的第二同种异体T细胞群体；和/或(b)如本文所述的治疗剂，其中该治疗剂选自免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂、BET抑制剂及其任何组合。

关于上述方面，术语“受试者”包括但不限于，包括人、表演动物(如马、骆驼、灰狗)、牲畜(如牛、绵羊、马)和陪伴动物(如猫和狗)在内的哺乳动物。在一个具体实施方案中，受试者是人。

提及以下非限制性实施例，以详细描述和实施优选实施方案。

实施例

实施例1

同种异体“非定制型”T细胞治疗已成为在移植受体中治疗感染性并发症的有力工具。这些同种异体抗原特异性T细胞是从大量健康供体收集的外周血淋巴细胞扩增而来，提供了多样化的HLA覆盖，可以冷冻保存并在有需要的HLA匹配的移植患者中使用。在本实施例中，我们提供了同种异体EBV特异性T细胞作为治疗工具用于多种癌症治疗的临床前评估。此外，我们还证明，同种异体抗原特异性T细胞和阻断PD1/PD-L1轴的抗体的组合显著提高了过继T细胞治疗对EBV癌症的功效。

材料和方法

细胞培养

本研究中使用的EBV相关细胞系购自美国典型培养物保藏中心((ATCC,Manassas,Virginia,USA)，并按照ATCC的建议进行培养和维持。表1中列出了研究中使用的各EBV相关细胞系及其相应的HLA。这些细胞系的培养物通过在37℃、20％氧气水平和5％二氧化碳水平下培养来维持。所有组织培养塑料耗材均购自

Stone Staffordshire,UK(瓶子和平板)和

Washington DC,USA(塑料吸管)。所有细胞系都定期进行支原体感染检测，并通过QIMR Berghofer Medical Research Institute的科学服务机构使用短串联重复序列(STR)分析进行验证。

RNA提取和实时定量PCR

按照制造商的指南，使用QIAgen

试剂盒(Valencia,CA,USA)从各细胞系提取RNA。使用胰蛋白酶-EDTA(Sigma-

)将各细胞系的1×10⁶个细胞接种平板并收获，然后洗涤(PBS，2次)，然后在4℃下加入适当体积的RLT缓冲液(试剂盒中提供)，并进行制造商指示的后续步骤。RNA提取后使用iScript^TM cDNA试剂盒(Bio-Rad LaboratoriesInc)中提供的DNA酶进行DNA酶消化步骤。使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Thermo-Scientific)评估RNA质量和数量。使用iScript^TM Reverse Transcriptase(Bio-RadLaboratories Inc.)按照制造商说明书进行反转录。所使用的循环条件是：在25℃启动5分钟，46℃反转录20分钟，95℃反转录酶失活1分钟。使用Biorad CFX384 Touch^TM实时PCR检测系统在384孔板中进行qRT-PCR。引物由从相应出版物获得的EBV相关基因LMP1、LMP2和EBNA1组成。总体积为10μL的主混合物的组成包括：5μL Sybr green、每种引物各1mM、1μL稀释的cDNA和3μL H₂O，用于一式两份进行的三个生物学重复。所使用的循环条件为：95℃5分钟；然后进行以下的40个循环：95℃10秒，60℃10秒，72℃5秒；最终延伸步骤为72℃5分钟。使用随附的Biorad CFX384软件(版本1.5.0.39)进行Ct值计算，然后使用ΔΔCt方法进行计算，将值对18sRNA和HPRT进行归一化。对于每个生物cDNA样品分析，使用含有cDNA溶液而不使用逆转录酶处理的阴性对照，以确保没有基因组DNA污染。除此之外，各引物组还包括一个仅含H₂O的常规阴性对照。引物由以下组成：LMP1：FP-5’-CAGTCAGGCAAGCCTATGA3’、RP-5’CTGGTTCCGGTGGAGATGA3’；LMP2：5′-AGCTGTAACTGTGGTTTCCATGAC-3′、RP-5′-GCCCCCTGGCGAAGAG-3′；EBNA1：FP-5′-TACAGGACCTGGAAATGGCC-3′、RP-5′-TCTTTGAGGTCCACTGCCG-3′；HPRT1：FP-5'-CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT-3'、RP-5'-AGACGTTCAGTCCTGTCCATAA-3'；18sRNA：5’-CGAAAGCATTTACCAAGGAC-3’、RP-5’-TTATTGTGTCTGGACCTGG-3’。

T细胞的产生

为了产生LMP/EBNA1特异性“非定制型”T细胞库，从覆盖广泛HLA谱的血清阳性供体的100-300mL静脉血中采集外周血单个核细胞(PBMC)。然后用AdE1-LMPpoly载体感染30％的PBMC(MOI为10:1)，该载体包含具有16个HLA限制性LMP1&2表位的多表位，其融合到截短的gly/ala缺失的EBNA1基因上[11,12]。然后对这些转染的PBMC进行辐照，并与剩余的PBMC共培养两周。培养物每3-4天补充新鲜生长培养基和120IU/mL重组IL-2(KomturPharmaceuticals)。在发放用于输注之前，对扩增的T细胞进行抗原特异性和微生物污染检测。表1中列出了用于靶向HLA匹配的EBV相关癌细胞系的相应T细胞。

胞内细胞因子测定

为了分析AdE1-LMPpoly载体转染的T细胞产物中LMP1&2和EBNA1特异性的频率，在GolgiPlug(BD Biosciences)的存在下，使用来自LMP1&2或EBNA1的一组确定的表位或使用涵盖整个EBNA1蛋白的一组重叠肽(均来自Mimotopes,GenScript或JPT Technologies)，进行4小时刺激。对于多参数分析，在GolgiPlug和GolgiStop(BD Biosciences)存在下，用上述肽和抗CD107a-FITC(BD Biosciences)刺激细胞4小时。然后洗涤细胞并用抗CD8-PerCPCy5.5(eBioscience)和抗CD4-PECy7(BD Biosciences)染色，用Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)固定和透化，再次洗涤并用抗IFN-γ-AF700染色(均来自BDBiosciences)[11]。进一步洗涤后，将细胞重悬在PBS中，并使用BD LSR Fortessa和FACSDiva软件(BD Biosciences)获取。使用FlowJo软件(TreeStar)进行获取后的Boolean分析。

细胞存活率测定

使用CellTiter

AQueous one细胞存活率测定试剂(Promega,WI,USA)，一式三份对每个EBV相关癌细胞系的三个生物学重复进行细胞存活率测定。简言之，将癌细胞(靶细胞)以每孔5000个细胞的密度接种在96孔组织培养板(BD Falcon^TM)上，总培养基体积为200μL。将AdE1-LMPpoly转染的效应T细胞在37℃和50％CO₂下新鲜融化在含10％FCS和120IU/mL重组IL-2的RPMI-1640中。接种并在37℃和50％CO₂下孵育24小时后，按效应细胞与靶细胞(E:T)为5:1-100:1的梯度比率，将效应T细胞与靶细胞混合。除PBS处理的靶细胞(Es)和单独培养基(M₀)外，将每个E:T比率(E_T)所使用的确切数目的T细胞(T₀)独立地用作对照。37℃和50％CO₂孵育24小时后，将MTS添加到每个孔中(1:100稀释在培养基中)，并孵育1小时，随后在室温下以1200x g离心平板5分钟，并通过酶标仪测量490nm光密度下混合物的吸光度。使用以下公式计算相对细胞存活率：

细胞毒性测定

使用CytoTox

非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega,WI,USA)，一式三份对每个EBV相关癌细胞系进行三个生物学重复的细胞毒性测定[14]。简言之，将癌细胞(靶细胞)以每孔5000个细胞的密度接种在96孔组织培养板上，总培养基体积为200μL，并保持与如前所述的细胞存活率测定试验类似的条件。此外，我们还接种了确切数目的靶细胞(E_M)。在37℃下混合效应细胞和靶细胞24小时后，向E_M孔中加入10x裂解剂，并在37℃和50％CO₂下孵育45分钟。在靶细胞完全裂解后，在室温下以1200x g离心平板5分钟，并将每个孔的50μl上清液转移到另一块平板中。将测定缓冲液与底物混合物混合，并等分到每个孔中。用终止溶液终止后，通过酶标仪测量490nm光密度下混合物的吸光度。实验和对照孔中的相对裂解计算如下：

癌细胞表型的多色分析

将各EBV相关癌细胞按每孔1×10⁵个细胞的密度接种，并在24小时后，将其以50:1的效应细胞:靶细胞比率(E:T)与T细胞混合，并在37℃和50％CO₂下孵育24小时。为了评估T细胞对癌细胞的影响，随后将细胞与以下抗体在4℃下孵育：人抗CD45-V500、抗CD3-AF700、抗Ki67-BV421、抗BCL2-FITC和抗活性胱天蛋白酶3-BV605。使用BD LSR Fortessa和FACSDiva软件(BD Biosciences)采集细胞，并使用FlowJo软件(TreeStar)进行采集后分析。

AdE1-LMPpoly转染的T细胞表型的多色分析

将AdE1-LMPpoly转染的效应T细胞新鲜融化，并按效应细胞与靶细胞(E:T)50:1的比率与靶细胞(1×10⁵)混合，37℃和50％CO₂下孵育24小时。为了评估表面表型，然后将细胞与下组的抗体在4℃下孵育：(i)人抗CD45-V500、抗CD3-AF700、抗CD4-PECy7和抗CD8-PerCPCy5.5；(ii)人抗CD45-V450、抗CD4-AF700、抗CD8-PerCPCy5.5、抗CD14-eFluor450、抗CD19-eFluor450、抗PD-1-BV786；(iii)MHC I类抗体(克隆W6/32)(自制，在小鼠体内产生)，并使用LIVE/DEAD可固定近红外死细胞染色剂(Thermo Fisher Scientific，MA)。对于细胞内分析，用TF固定/透化缓冲液(BD Biosciences)处理细胞，然后在Perm/Wash存在下用以下抗体染色：(i)抗穿孔素-BV421、抗颗粒酶B-AF700和抗颗粒酶K-FITC。使用BD LSRFortessa和FACSDiva软件(BD Biosciences)采集细胞，并使用FlowJo软件(TreeStar)进行采集后分析。

动物饲养

所有动物工作均由QIMR Berghofer医学研究所动物伦理委员会批准(编号A0707-606M)，并严格按照《澳大利亚科学用途动物护理和使用规范》进行。所有实验动物均维持在混合(129SV/E X C57BL/6)品系上，并在25℃条件下按12小时昼夜周期在昆士兰医学研究所动物机构内在

笼舍(Centennial,Colorado,USA)中饲养。干燥颗粒食品通过辐射灭菌。小鼠可以随意获取食物和无菌水。

同种异体EBV特异性T细胞治疗功效的体内评估

本研究共使用了12-24只7-8周龄的雌性NOD/SCID小鼠(取决于实验)。对小鼠进行0.8Gy钴-60照射，4小时后，用29号针头皮下注射5×10⁶个相应的EBV相关癌细胞。每周三次监测小鼠的肿瘤生长、体重和身体评分。一旦肿瘤可触知，将小鼠随机分入相应的组，并用相应剂量的PBS或20×10⁶个肿瘤HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞治疗。使用游标卡尺每周测量三次这些小鼠的肿瘤大小。为了计算肿瘤面积，使用了以下公式：肿瘤面积＝B*S，其中基于前面描述的二维卡尺测量值，B＝最大肿瘤测量值，S＝最小值[13]。

同种异体EBV特异性T细胞在人源化小鼠模型中的治疗功效的体内评估

在父母书面知情同意后，从健康足月新生儿获得新鲜人CD34+脐血细胞，并按照制造商的说明使用免疫磁珠进行富集(CD34+选择试剂盒，Miltenyi Biotec，BergischGladbach，德国)。7-8周龄的雌性NRG小鼠以275cGy和3-4小时间隔照射两次，然后用29号针头向每只小鼠静脉注射5x10⁴个CD34+细胞(HLA与用于治疗的AdE1-LMPpoly转染的T细胞相匹配)。每周两次监测小鼠的体重、身体评分和不良反应，包括移植物抗宿主病(GVHD)。此外，在第4周、第8周、第10周和第12周进行尾静脉采血，在此期间，每次从每只小鼠将100μL至200μL的血液收集到EDTA管中，以监测人免疫系统的重建。为了评估人CD34+脐血细胞的重建，使用人抗CD45-V500、小鼠抗CD45-V450、抗CD3-APC、抗CD4-AF700、抗CD8-PerCPCy5.5、抗CD8-PerCPCy5.5、抗CD14-FITC、抗CD19-PeCy5、抗CD23-BV786和抗CD56-BV650进行表面表型分析。在重建的第12周，在非麻醉条件下，使用29号针头在100μL PBS中以10⁶个EBV颗粒的剂量向人源化NRG小鼠静脉注射EBV B95-8。在EBV感染后第13天，用相应剂量的PBS或20×10⁶个肿瘤HLA匹配或转换的AdE1-LMPpoly转染的T细胞治疗小鼠。表1中列出了相应脐血细胞和用于治疗淋巴恶性肿瘤的相应T细胞的HLA。在T细胞治疗后，对小鼠进行14天的监测，然后处死并对其脾脏进行肿瘤负荷分析。

免疫组织化学

为了进行组织学检查，采集组织，并在洗涤(PBS，3次)后将其固定在含4％甲醛的PBS中，并在处理前保存在70％乙醇中。然后将组织包埋在石蜡块中，并制备5μm厚的切片进行染色。将组织包埋在石蜡中，使用Sakura Tissue-

TEC^TM(Sakura Finetek,Tokyo,Japan)将4μm切片封固在Superfrost plus玻片上。免疫组织化学在QIMR Berghofer医学研究所内部设施的协助下进行。用含2.94g柠檬酸三钠的1L MQ(pH 6.0)缓冲液和微波进行抗原修复。组织切片在0.2％Triton X-100/PBS中透化5分钟，然后在0.05％Triton X-100/PBS中10分钟。组织切片用3％(vol/vol)H₂O₂处理，然后用2％BSA中的抗CD3(1:40DakoM7254)抗体进行免疫染色，然后用二抗(VEMP7402)Dako EnVision^TM(Agilent,systemWaukesha,WI,USA)染色，并用苏木精复染。用20倍或40倍物镜在

XT(

Vista,USA)上扫描玻片。

使用NanoString和浸润物分析进行基因标签谱分析

对总计6只8周龄的雌性NOD/SCID小鼠进行0.8Gy钴-60照射，4小时后用29号针头皮下注射5×10⁶个SNU719细胞。肿瘤大小达到40mm²后，用20×10⁶个Ti_001T细胞治疗小鼠。5天后收集肿瘤，并使用FACS，使用人抗CD45-V500、小鼠抗CD45-V450、抗CD3-APC、抗CD4-PE和抗CD8-PerCPCy5.5从T细胞分选活的CD8+细胞群体。按上文所述用Qiagen RNAeasy试剂盒从分选的小鼠个体的活CD8+群体分离RNA。使用定制的326-NanoString Immune GeneExpression Panel，进行基因表达分析。使用每个小鼠样品的50ng总RNA(在5μl终体积中)，并与3’生物素化捕获探针和5’报告探针混合，该报告探针标记有来自定制基因表达代码集的荧光条形码。探针和靶标转录物在65℃下杂交12-16小时。使用推荐的制造商流程，在NanoString nCounter制备站上运行杂交样品，其中去除多余的捕获探针和报告探针，并将转录物特异性三元复合物固定在链霉抗生物素蛋白包被的筒上。样品在nCounter数字分析仪上以最大扫描分辨率进行扫描。使用nSolver分析软件和nCounter高级分析模块，处理数据。对于基因表达分析，使用GeNorm算法选择的管家基因的几何平均值对数据进行归一化。

统计分析

使用GRAPHPAD PRISM v6.0(GraphPAd Software,LaJolla,CA,USA)进行Student’s t检验或单因素或双因素方差分析，以及Bonferoni事后检验或Mann-Whitney U检验(如图例所示)，并按图例所示计算p值。星号表示显著性差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001)，ns＝不显著。

结果

同种异体“非定制型”EBV特异性T细胞对多种癌症的体外识别

为了评估EBV编码基因(LMP1、LMP2和EBNA1)在多种EBV相关恶性肿瘤(包括NPC、胃癌、NKT淋巴瘤和BLCL)中的表达，我们采用qRT-PCR，分析了这些基因的转录物水平。我们观察到，与LMP1相比，在所有EBV相关恶性肿瘤中，LMP2和EBNA1的表达水平始终较高(图1A)。我们评估了这些EBV阳性癌细胞对LMP1、LMP2和/或EBNA1特异的同种异体“非定制型”EBV特异性T细胞的易感性(图1B；表2)。图1C-D中的数据显示，胃癌(SNU719)、NPC(C17和C661)和NKT淋巴瘤(SNKT16)细胞被同种异体HLA匹配的EBV特异性T细胞在多种效应细胞与靶细胞比率下有效识别。此外，与模拟处理的对照组相比，膜联蛋白V结合测定也显示了膜联蛋白V结合能力增加，表明靶细胞死亡(图1D-E)。

在下一组实验中，我们分析了同种异体EBV特异性T细胞对EBV相关癌细胞的表型变化的影响。如Ki67染色显示，在HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞存在的情况下，我们在24小时后观察到胃癌SNU719和NPC、C17细胞的增殖速率显著降低(p<0.001)(图2A)。此外，我们还观察到活性胱天蛋白酶3染色显著增加(p<0.001)以及BCL2染色显著减少(p<0.01)，表明EBV特异性T细胞诱导了增加的细胞死亡(图2A)。我们还研究了EBV相关癌细胞对同种异体EBV特异性T细胞的影响。我们观察到，在存在EBV相关癌细胞的情况下，CD8+T细胞群体的显著增加(p<0.01)(图2B)。与此数据一致，当暴露于EBV阳性癌细胞时，我们观察到CD8+T细胞上Ki67表达显著增加(图2B)。此外，这些T细胞还显示高水平的效应子功能，如GzmB、GzmK和Perf染色的表达显著增加所示(图2B)。总之，这些数据证明，同种异体EBV特异性T细胞可以在体外有效识别HLA匹配的多种类型EBV相关癌细胞。

同种异体EBV特异性细胞毒性T细胞的体内治疗功效评估

建立了同种异体EBV特异性T细胞在体外对多种EBV相关癌症的有效识别后，我们接下来评估了这些效应细胞在体内的治疗功效。在第一组实验中，免疫缺陷型NOD-SCID小鼠在照射后接种EBV相关NPC肿瘤C17和C666.1(皮下)。当每只动物的肿瘤达到25mm²时，用HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞治疗这些动物。用单次或两次输注(每次输注2×10⁷个T细胞/动物)的同种异体HLA匹配EBV特异性T细胞治疗这些动物，并监测肿瘤生长。图3中的数据显示，单次输注同种异体HLA A2/B40限制性或HLA A11/B58限制性LMP2特异性T细胞(2×10⁷个T细胞)足以显著减少肿瘤生长，并提高荷瘤小鼠的总体生存率(图3A和B)。当通过两次输注同种异体EBV特异性T细胞来治疗这些动物时，观察到肿瘤负担和总体生存率的进一步改善(图3C和D)。

在下一组实验中，我们将治疗功效分析扩展到胃癌。在这些实验中，免疫缺陷型NOD-SCID小鼠接种EBV相关胃癌SNU719，当每只动物的肿瘤达到25mm²时，用HLA A24限制性同种异体LMP2特异性T细胞治疗。与NPC肿瘤模型获得的数据一致，当用HLA匹配的同种异体LMP2特异性T细胞治疗这些动物时，观察到肿瘤负担显著减少，总体生存率提高(图4A)。有趣的是，我们注意到，虽然第一次T细胞输注后肿瘤生长显著减少，但第二次输注T细胞后这种治疗益处不太明显。这种现象的一种可能解释可能是由于存在免疫抑制性肿瘤微环境[16,17]或HLA丢失导致免疫逃逸[18]，从而对临床结果产生不利影响。因此，我们假设EBV相关肿瘤可以通过改变其HLA表达或调节EBV基因表达(可能阻碍EBV表位呈递给CD8+T细胞)，而推翻同种异体EBV特异性T细胞的治疗影响。为了探索这一假说，我们建立了三组胃癌荷瘤小鼠(SNU719)，并使用三个连续剂量的相同HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞(HLA A24限制性LMP2特异性T细胞)治疗一组小鼠(G1)。同时，我们还用两个连续剂量的相同HLA-A24限制性同种异体EBV特异性T细胞、以及切换为不同T细胞系(HLA B7限制性EBNA1特异)的第三个剂量，治疗另一组(G2)(图4B)。我们观察到，与G1相比，G2组在输注第三剂量的T细胞后显示肿瘤生长显著减少，总体生存率提高(图4B)。有趣的是，与G2组动物相比，G1组在第三次输注后对肿瘤生长的影响微小，且肿瘤负担高得多(图4B)。总之，这些数据清楚地证明，同种异体HLA匹配的T细胞可以有效地阻止肿瘤生长，并提高EBV相关上皮肿瘤的荷瘤小鼠的总体生存率。

同种异体EBV特异性T细胞过继免疫治疗有效抑制EBV相关淋巴恶性肿瘤的生长

如前所述，EBV在病因上与多种疾病有关，包括免疫功能低下患者的淋巴增生性疾病(LPD)，如PTLD、AID相关淋巴瘤和其他恶性淋巴瘤，即霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤[19-22]。为了进一步证明同种异体EBV特异性T细胞的潜在治疗功效，我们利用了包含功能性重建的人免疫系统的人源化小鼠模型。在NOD-Rag1^null IL2rg^null(称为NRG)小鼠中，使用静脉施用的脐血来源的CD34+干细胞，建立人免疫系统重建，并如图5A和B所示定期监测这些动物。12周后，这些小鼠感染EBV(QIMR-WIL毒株)，在发展EBV-LPD后，用HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞过继治疗。进行了两组独立的实验。在第一组中，将携带EBV-LPD的NRG小鼠分为三组(每组6只)，进行模拟治疗或输注T细胞治疗(称为G1和G2)。G1组动物用三个剂量的HLA A2和A24限制性同种异体LMP1和LMP2特异性T细胞(2×10⁷个T细胞/剂量)治疗，而G2组动物给予两个剂量的HLAA2和A24限制性同种异体LMP1和LMP2特异性T细胞(2×10⁷个T细胞/剂量)以及单个剂量的HLA A2、B40和Cw3限制性LMP1、LMP2和EBNA1特异性T细胞(2×10⁷个T细胞)。图5C-D中的数据显示，与模拟治疗的小鼠相比，G1组动物肿瘤负担显著降低。然而，与模拟治疗组和G1组动物相比，用两种不同的同种异体EBV特异性T细胞的组合治疗的G2组动物显示肿瘤负担显著降低。这些观察结果在第二组独立实验中得到进一步确认，在第二组实验中，用同种异体EBV特异性T细胞治疗的动物也显示显著更低的肿瘤负担(图5E-F)。这些数据进一步证明，同种异体HLA匹配的EBV特异性T细胞可以有效阻止肿瘤生长，并提高EBV相关淋巴恶性肿瘤的荷瘤小鼠的总体生存率。

阻断PD1/PD-L1轴增强同种异体EBV特异性T细胞的治疗功效

为了进一步阐明过继转移的同种异体EBV特异性T细胞与肿瘤细胞的体内相互作用，我们从SNU719肿瘤分离出浸润性T细胞，并使用NanoString技术分析转录标签(transcriptional signature)。此外，我们还使用特异性抗体验证了一些检查点分子的表达。图6A中的数据显示了T细胞治疗产品和纯化的肿瘤浸润人T细胞中基因表达的热图。该分析显示，在肿瘤浸润人淋巴细胞中，许多参与效应细胞功能的细胞基因和与效应细胞功能相关的转录因子下调。相比之下，许多检查点分子的表达在这些T细胞中上调。为了验证这些检查点分子的表达，我们用特异性抗体对肿瘤浸润人淋巴细胞进行染色，并将其表达与施用给荷瘤小鼠的T细胞治疗进行比较。该分析确认了NanoString表达，并显示肿瘤浸润人淋巴细胞表达高水平的PD-1、LAG3和TIM3(图6B)。

基于这些观察结果，我们假设检查点抑制剂和T细胞治疗的组合可以对EBV相关肿瘤提供更好的治疗益处。为了检验我们的假设，即上调的PD1/PD-L1轴是否在获得适应性免疫抗性方面影响癌细胞，我们使用抗PD1抗体(纳武单抗)在体内阻断PD1，以与同种异体EBV特异性T细胞组合。具体而言，在T细胞输注后24小时施用纳武单抗，我们观察到，与单一治疗组和模拟治疗组相比，联合治疗组显示显著减少的SNU719胃癌生长(p<0.0001)(图6C)。此外，我们观察到，与单一治疗组相比，联合治疗组中肿瘤重量减少，表明肿瘤大小显著减小(图6D)。重要的是，我们观察到，与单一治疗组或模拟治疗组相比，联合治疗组显示了显著提高的治疗后生存率(p<0.0001)(图6E)。值得注意的是，与仅T细胞治疗组相比，联合治疗组的生存率提高了约2倍(p<0.01)(图6E)。总之，这些数据突显了PD1/PD-L1信号传导途径在消除癌细胞方面对同种异体CD8+T细胞的命运具有负面影响，因为它的抑制能够在体内增强同种异体EBV特异性CD8+T细胞。

表1

研究中的EBV相关癌细胞和用于治疗的同种异体EBV特异性T细胞列表

表2

研究中使用的各同种异体EBV特异性T细胞的HLA和抗原识别

实施例2

MEK1/2和BET抑制与EBV特异性T细胞的双重组合的功效

抑制对肿瘤生长和维持至关重要的分子或生化途径的靶向治疗，在影响肿瘤的免疫环境方面具有重要意义。最近，多项研究证明，靶向治疗也可能调节免疫反应，如弱化特定免疫细胞群体(即细胞毒性T淋巴细胞和T_reg)的功能[23]。它们影响T细胞启动，并决定其分化为记忆和效应表型，同时通过树突状细胞增强肿瘤抗原呈递，使肿瘤细胞对免疫介导的破坏更敏感[23]。尽管免疫治疗和靶向治疗的可能相互作用仍有待充分阐明，但联合方法的协同作用和毒性特征将在很大程度上取决于时间、顺序和剂量[23]。

特别令人感兴趣的是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，已知该途径上调IL-8和VEGF的产生，进而诱导对T细胞功能和招募的抑制作用[24]。最近的研究表明，MEK1/2抑制可选择性地阻断幼稚但未经抗原接触的效应T细胞活化[25]。此外，独立研究表明，BRAF抑制剂通过上调肿瘤抗原表达和呈递而具有免疫致敏潜力；例如，在黑色素瘤中，MAPK上调导致黑素细胞分化抗原(MAD)上调[26,27]。最近一项基于鼠模型的研究证明，pmel-1ACT和BRAF抑制剂达拉非尼与曲美替尼(MEK抑制剂)联合使用可提高功效，因为三联使用可增加T细胞对肿瘤的浸润，提高体内细胞毒性，并在同基因BRAF^V600E驱动的黑色素瘤小鼠模型中导致肿瘤完全消退[28]。此外，Kang等人已经证明，曲美替尼以STT3依赖的方式增强人HNSCC细胞系中MHC I类的表达，从而允许更好的CD8+T细胞浸润[29]。

独立地，使用小分子表观遗传修饰剂对DNA进行的表观遗传修饰也可以改变免疫基因标签，并影响抗原加工、呈递和免疫逃逸[30,31]。最近，Kagoya等人已经显示，溴区结构域和额外末端(BET)基序蛋白抑制剂JQ1可以维持CD8+T细胞的干细胞样和中央记忆的功能特性[32]。在机制上，BRD4(一种BET蛋白)直接调节CD8+T细胞中BATF(一种转录因子)的表达，BATF决定T细胞向效应记忆表型的分化过程。因此，JQ1处理的CD8+T细胞在针对黑色素瘤的鼠过继T细胞模型中显示出增强的抗肿瘤作用[32]。此外，JQ1与多种癌症中MYC的下调有关[33]。MYC已显示通过转录调节PD-L1和CD47等免疫调节物，强烈调节肿瘤微环境[34]。因此，MYC抑制可通过下调不利的肿瘤微环境和促进免疫介导的肿瘤消除，强烈导致抗肿瘤进展。

结果

MEK1/2抑制剂与EBV特异性T细胞组合

我们用浓度分别为0.5μM和1.0μM的MEK1/2抑制剂(AZD6244(或司美替尼)和曲马替尼)，作为单一治疗或与EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞比率25:1)组合，处理SNU719细胞(胃癌细胞)。我们观察到，与单一治疗相比，MEK1/2抑制剂和EBV特异性T细胞组合存在时，SNU719的细胞存活率显著降低(图7A)。类似地，我们观察到，与单一治疗组相比，双重联合组在SNU719细胞中产生了显著更高的膜联蛋白V结合(图7B)。此外，使用Xcellegence，我们观察到，与MEK1/2抑制剂或EBV特异性T细胞的单一治疗相比，双重组合在SNU719细胞中导致更快的细胞死亡(图7C)。总之，这些结果突出显示了MEK1/2抑制与EBV特异性T细胞双重组合的体外功效。

JQ1抑制剂与EBV特异性T细胞组合

我们用浓度为5.0μM的JQ1抑制剂，作为单一治疗或与EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞比率25:1)组合，处理SNU719细胞。我们观察到，与单一治疗相比，JQ1抑制剂和EBV特异性T细胞组合存在时，SNU719的细胞存活率显著降低(图8A)。类似地，我们观察到，与单一治疗组相比，双重联合组在SNU719细胞中产生了显著更高的膜联蛋白V结合(图8B)。总之，这些结果突出显示了BET抑制与EBV特异性T细胞双重组合的体外功效。

实施例3

为了确定EBV相关实体癌中MAPK途径的上调，我们首先确定了MEK1/2抑制剂(AZD6244或司美替尼和曲马替尼)在鼻咽癌和胃癌细胞系中的IC50值(药物浓度范围为0.1μM-5μM)。我们观察到，与NPC43^(EBV-)细胞系相比，EBV相关细胞系一致地显示对MAP途径的高度依赖性，因为两种抑制剂在浓度约为2.5μM的情况下用MTS测定都实现了约50％的细胞存活率降低(IC50)(图9)。在下一组实验中，我们想确定MEK1/2抑制与同种异体EBV特异性T细胞组合对EBV相关实体癌的影响。因此，我们单独或联合使用MEK1/2抑制剂(司美替尼和曲马替尼)和EBV特异性T细胞处理各EBV相关细胞系(胃和鼻咽)。我们选择了相应MEK1/2抑制剂的亚IC₅₀值(或IC₂₅值)(1μM)，与相应HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞比率为25:1)，用于体外处理。我们观察到，与单一治疗相比，MEK1/2抑制剂和EBV特异性T细胞组合存在时，相应鼻咽癌细胞(C17和C666.1)和胃癌细胞(SNU719和YCCLE1)的细胞存活率显著降低(图10)。

此外，为了验证该组合对EBV相关癌细胞增殖的影响，应用Xcellegence，我们用单一和双重组合处理了SNU719和C666.1细胞。我们观察到，与MEK1/2抑制剂(司美替尼)或HLA匹配的EBV特异性T细胞单一处理相比，双重组合导致SNU719和C666.1细胞的细胞死亡更快(图11A)。我们还在体外单一和双重处理16小时后使用流式细胞术对SNU719和C666.1细胞进行了表型表征。我们观察到，与单一处理相比，双重处理导致了细胞增殖显著丧失(由Ki67+染色所示)，并造成了显著的细胞死亡(由活性胱天蛋白酶3染色所示)(图11B-C)。

接下来，我们想确定该组合的特异性，因此我们用HLA不匹配的同种异体T细胞和MEK1/2抑制剂(司美替尼和曲马替尼)单独或组合挑战SNU719和C666.1细胞。我们观察到，HLA不匹配的同种异体T细胞单独对EBV相关癌细胞的细胞存活率没有显著影响(图12A-B)。有趣的是，我们观察到，与DMSO处理(对照)的癌细胞相比，MEK1/2抑制剂和HLA不匹配的同种异体T细胞双重组合存在时，癌细胞的细胞存活率显著降低(图12A-B)。然而，与单独MEK1/2抑制剂处理相比，在双重组合存在时观察到的细胞存活率降低未显示显著性(图12A-B)。该数据表明，在存在双重组合的情况下观察到的细胞存活率降低是由于MAPK途径抑制单独引起的；添加HLA不匹配的T细胞未增强该组合的功效。为了进一步验证这一概念，我们比较了HLA匹配和HLA不匹配的T细胞，在单独使用以及与MEK1/2抑制剂(司美替尼和曲马替尼)组合使用时，引起的EBV相关癌细胞(SNU719和C666.1)的细胞存活率降低。我们观察到，与HLA不匹配的T细胞相比，单独使用HLA匹配的T细胞导致了显著的细胞死亡，并且在存在司美替尼或曲马替尼的情况下，这种效应被显著放大(图12C)。

在下一组实验中，我们想研究双重组合对癌细胞内在途径的影响，并描述MEK1/2抑制与T细胞处理的有效组合的原理。我们观察到，在处理16小时后，MEK1/2抑制剂(司美替尼)的存在导致癌细胞中pERK1/2的显著降低(图13A)。因此，在司美替尼单独存在以及与各HLA匹配的T细胞组合时，我们观察到了MHC I类表达的上调(图13B)。为了验证这些癌细胞中MHC I类表达上调的机制，我们研究了MEK1/2抑制对pSTAT3和MYC表达的影响。我们观察到，司美替尼的存在导致pSTAT3表达上调(图13C)，这已被证明与驱动MHC I类表达有关[29,35,36]。此外，我们还观察到MEK1/2抑制导致MYC表达下调(图13D)。已经证实，在EBV相关癌症中，存在MYC表达可以下调MHC I类表达，因此其间接抑制可能有助于这些癌症中的MHC I类表达[37]。因此，MEK1/2途径的抑制通过上调STAT3途径和下调MYC，导致MHC I类表达上调，从而在HLA匹配的同种异体T细胞存在的情况下实现更好的治疗相容性。总之，这些结果突出显示了MEK1/2抑制与EBV特异性T细胞双重组合的体外功效。

类似地，我们使用JQ1抑制剂，通过首先测定该抑制剂在鼻咽癌和胃癌细胞系(药物浓度范围为0.5μM-10μM)中的IC₅₀值，来靶向MYC依赖的癌症内在途径。我们观察到，与NPC43^(EBV-)细胞系相比，JQ1抑制剂在EBV相关细胞系中在约2.5μM浓度显示出约50％的细胞存活率降低(IC₅₀)(图14)。为了表征JQ1抑制与同种异体EBV特异性T细胞组合对EBV相关癌细胞的影响，我们在体外使用IC₂₅值的JQ1(2.5μM)以及相应HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞(效应细胞与靶细胞比率为25:1)。我们观察到，与单独处理相比，JQ1抑制剂和EBV特异性T细胞组合存在时，相应胃癌细胞(SNU719和YCCLE1)和鼻咽癌细胞(C17和C666.1)的细胞存活率显著降低(图15A)。此外，使用Xcellegence，我们观察到，与单独处理相比，双重组合导致SNU719和C666.1细胞的细胞死亡更快(图15B)。我们还使用流式细胞术，在体外单独和双重处理16小时后对SNU719和C666.1细胞进行了表型表征。我们观察到，与单独处理相比，双重处理导致细胞增殖显著丧失(Ki67+染色所示)，并导致显著的细胞死亡(活性胱天蛋白酶3染色所示)(图15B-C)。

接下来，我们想确定该组合的特异性，因此我们用HLA不匹配的同种异体T细胞和JQ1抑制剂单独或组合挑战SNU719和C666.1细胞。与我们之前关于MEK1/2抑制剂的数据一致，我们观察到，与DMSO处理(对照)的癌细胞相比，JQ1抑制剂和HLA不匹配的同种异体T细胞组合存在时，癌细胞的细胞存活率显著降低(图16A)。然而，与JQ1抑制剂单独处理相比，在双重组合存在的情况下观察到的细胞存活率降低显示没有显著性(图16A)。我们观察到，与HLA不匹配的T细胞相比，HLA匹配的T细胞诱导了显著的细胞死亡，并且这种效应在JQ1存在时显著放大(图16B)。在下一组实验中，我们想研究JQ1抑制与T细胞处理有效组合的原理。我们观察到，在处理16小时后，JQ1抑制剂的存在导致癌细胞中MYC表达显著降低(图17A)。因此，它导致pERK1/2、pAKT和pSTAT3表达下调(图17B-C)。此外，我们还观察到，MYC的下调导致这些癌症中MHC I类的增强(图18A)，如上文所讨论[37]。值得注意的是，我们还观察到PD-L1和CD47等免疫调节分子的表达下调(图18B-C)。因此，MYC表达的丧失通过增强MHC I类表达、下调免疫逃逸分子，从而使该组合变得高效，来增强细胞毒性T细胞的功效。总之，这些结果突出显示了JQ1抑制与EBV特异性T细胞双重组合的体外功效。

在下一组实验中，我们想研究上述小分子与HLA匹配的同种异体EBV特异性T细胞组合的体内效果。我们使用司美替尼和HLA匹配的T细胞产品(TIG-001)的组合来治疗雌性NRG小鼠中SNU719来源的异种移植肿瘤模型。一旦异种移植物达到约25mm²的大小，我们通过两次输注TIG-001(每次输注2×10⁷个细胞)单独或与每日口服施用司美替尼(12.5mg/kg)14天组合，来治疗小鼠。我们观察到，与单一治疗相比，双重组合导致肿瘤进展显著减少(图19A)。当对照组达到150mm²的伦理大小极限时，我们处死每组三只小鼠；相比之下，我们观察到，与单一治疗相比，双重治疗组的肿瘤大小显著更小(图19B-C)。接下来，我们使用流式细胞术对这些肿瘤中浸润的人源淋巴细胞进行表型分析。我们观察到，与单一治疗的T细胞组相比，联合治疗组显示数量显著更多的活CD45+CD3+CD8+细胞(图19D)。我们还对这些治疗后的情况进行了长期监测(监测各组小鼠的肿瘤进展至150mm²的伦理大小极限)，并观察到，与单一治疗组相比，双重联合治疗组显示更好的生存率(图19E)。

本文引用的任何参考文献均不应解释为承认这种参考文献可作为本申请的“现有技术”使用。

在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制于任何一个实施方案或具体的特征集合。因此，本领域技术人员将理解，在本公开的指引下，可以在具体的示例性实施方案中进行多种修改和改变，而不偏离本发明的范围。所有此类修改和改变旨在包括在所附权利要求书的范围内。

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Claims

1.在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的方法，所述方法包括以下步骤：

(b)对该受试者施用结合或识别该EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位的第二同种异体T细胞群体；

从而在该受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况。

2.用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的药物组合物，该组合物包含：

结合或识别EBV抗原的第一表位的第一同种异体T细胞群体；

结合或识别该EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位的第二同种异体T细胞群体；和

可选地，可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。

3.权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中该第一同种异体T细胞群体和该EBV相关疾病、病症或病况的细胞均包含编码第一MHC蛋白的第一人白细胞抗原(HLA)等位基因，或是所述第一人白细胞抗原(HLA)等位基因限制性的。

4.权利要求3的方法或组合物，其中该第一MHC蛋白在该EBV相关疾病、病况或病况的细胞上呈递该EBV抗原的第一表位。

5.权利要求1至4中任一项的方法或组合物，其中该第二同种异体T细胞群体和该EBV相关疾病、病症或病况的细胞均包含编码第二MHC蛋白的第二HLA等位基因，或是所述第二HLA等位基因限制性的。

6.权利要求5的方法或组合物，其中该第二MHC蛋白在该EBV相关疾病、病症或病况的细胞上呈递该EBV抗原或该另一EBV抗原的第二表位。

7.权利要求1和3至6中任一项的方法，其中该第二同种异体T细胞群体在施用该第一同种异体T细胞群体之前、同时和/或之后施用。

8.权利要求1及3至7中任一项的方法，其进一步包括在体外产生该第一和/或第二同种异体T细胞群体的初始步骤。

9.权利要求1及3至8中任一项的方法，其包括对该受试者施用治疗剂的另一步骤。

10.权利要求9的方法，其中该治疗剂选自免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂、BET抑制剂及其任何组合。

11.药物组合物，其包含权利要求2的药物组合物以及免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂、BET抑制剂或其组合。

12.在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的方法，所述方法包括以下步骤：

从而在该受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况。

13.用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的药物组合物，该组合物包含：

结合或识别EBV抗原表位的同种异体T细胞群体；

治疗剂，其中该治疗剂选自免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂、BET抑制剂及其任何组合；和

可选地，可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。

14.权利要求12的方法或权利要求13的组合物，其中该同种异体T细胞群体和该EBV相关疾病、病症或病况的细胞均包含编码MHC蛋白的人白细胞抗原(HLA)等位基因，或是所述HLA等位基因限制性的。

15.权利要求14的方法或组合物，其中该MHC蛋白在该EBV相关疾病、病症或病况的细胞上呈递该EBV抗原的表位。

16.权利要求10至15中任一项的方法、组合或组合物，其中该免疫治疗剂是或包含免疫检查点抑制剂，如PD1抑制剂(例如抗PD1抗体)、PD-L1抑制剂(例如抗PD-L1抗体)、CTLA4抑制剂(例如抗CTLA4抗体)、LAG3抑制剂(例如抗LAG3抗体)，TIM3抑制剂(例如抗TIM3抗体)或CD96抑制剂(例如抗CD96抗体)。

17.权利要求15的方法或组合物，其中该免疫检查点抑制剂是或包含抗PD1抗体。

18.权利要求16的方法或组合物，其中该抗PD1抗体选自帕普利珠单抗、纳武单抗或西米普利单抗。

19.权利要求15的方法或组合物，其中该免疫检查点抑制剂是或包含抗PD-L1抗体。

20.权利要求19的方法或组合物，其中该抗PD1抗体选自阿替利珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗。

21.权利要求10至16中任一项的方法、组合或组合物，其中该MAPK途径抑制剂是或包含MEK1/2抑制剂。

22.权利要求21的方法或组合物，其中该MEK1/2抑制剂选自司美替尼和/或曲美替尼。

23.权利要求10至16中任一项的方法、组合或组合物，其中该BET抑制剂是JQ1。

24.权利要求12和14至23中任一项的方法，其中该同种异体T细胞群体在施用该治疗剂之前、同时和/或之后施用。

25.权利要求12和14至24中任一项的方法，其进一步包括在体外产生该同种异体T细胞群体的初始步骤。

26.前述权利要求中任一项的方法或组合物，其中该EBV抗原和/或该另一EBV抗原选自EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、LMP1、LMP2及其任何组合。

27.权利要求26的方法或组合物，其中该EBV抗原和/或该另一EBV抗原是或包含EBNA1、LMP1和/或LMP2。

28.前述权利要求中任一项的方法或组合物，其中该EBV相关疾病、病症或病况是或包含EBV相关癌症。

29.权利要求22的方法或组合物，其中该EBV相关癌症选自鼻咽癌、NKT细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胃癌及其任何组合。

30.结合或识别EBV抗原的第一表位的第一同种异体T细胞群体的用途，用于制备用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况的药物；其中该第一同种异体T细胞群体与以下组合施用：(a)结合或识别该EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位的第二同种异体T细胞群体；和/或(b)治疗剂，其中该治疗剂选自免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂、BET抑制剂及其任何组合。

31.结合或识别EBV抗原的第一表位的第一同种异体T细胞群体用于在受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况；其中该第一同种异体T细胞群体与以下组合施用：(a)结合或识别该EBV抗原或另一EBV抗原的第二表位的第二同种异体T细胞群体；和/或(b)治疗剂，其中该治疗剂选自免疫治疗剂、MAPK途径抑制剂、BET抑制剂及其任何组合。

32.在受试者中治疗或预防EBV相关癌症或肿瘤的方法，所述方法包括以下步骤：

从而在该受试者中治疗或预防EBV相关疾病、病症或病况。

33.用于在受试者中治疗或预防EBV相关癌症或肿瘤的药物组合物，该组合物包含：

结合或识别EBV抗原表位的同种异体T细胞群体；

可选地，可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。

34.权利要求26的方法或权利要求27的组合物，其中该同种异体T细胞群体和该EBV相关疾病、病症或病况的细胞均包含编码MHC蛋白的人白细胞抗原(HLA)等位基因，或是所述HLA等位基因限制性的。

35.权利要求28的方法或组合物，其中该MHC蛋白在癌症或肿瘤细胞上呈递该EBV抗原的表位。

36.权利要求26至29中任一项的方法、组合或组合物，其中该免疫治疗剂是或包含免疫检查点抑制剂，如PD1抑制剂(例如抗PD1抗体)、PD-L1抑制剂(例如抗PD-L1抗体)、CTLA4抑制剂(例如抗CTLA4抗体)、LAG3抑制剂(例如抗LAG3抗体)、TIM3抑制剂(例如抗TIM3抗体)或CD96抑制剂(例如抗CD96抗体)。

37.权利要求30的方法或组合物，其中该免疫检查点抑制剂是或包含抗PD1抗体。

38.权利要求31的方法或组合物，其中该抗PD1抗体选自帕普利珠单抗、纳武单抗或西米普利单抗。

39.权利要求30的方法或组合物，其中该免疫检查点抑制剂是或包含抗PD-L1抗体。

40.权利要求33的方法或组合物，其中该抗PD1抗体选自阿替利珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗。

41.权利要求26至29中任一项的方法、组合或组合物，其中该MAPK途径抑制剂是或包含MEK1/2抑制剂。

42.权利要求35的方法或组合物，其中该MEK1/2抑制剂选自司美替尼和/或曲美替尼。

43.权利要求26至29中任一项的方法或组合物，其中该BET抑制剂是JQ1。

44.权利要求26和28至37中任一项的方法，其中该同种异体T细胞群体在施用该治疗剂之前、同时和/或之后施用。

45.权利要求26和28至38中任一项的方法，其进一步包括在体外产生该同种异体T细胞群体的初始步骤。

46.权利要求26至39中任一项的方法或组合物，其中该EBV抗原和/或该另一EBV抗原选自EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、LMP1、LMP2及其任何组合。

47.权利要求40的方法或组合物，其中该EBV抗原和/或该另一EBV抗原是或包含EBNA1、LMP1和/或LMP2。

48.权利要求26至41中任一项的方法或组合物，其中该癌症或肿瘤选自鼻咽癌、NKT细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胃癌及其任何组合。