PT1541680E - Anticorpo citotóxico dirigido contra um péptido c-terminal de gpc3 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Anticorpo citotóxico dirigido contra um péptido C-terminal de GPC3"

Campo técnico 0 presente invento refere-se a um anticorpo dirigido contra um péptido C-terminal de GPC3. 0 invento refere-se a um anticorpo dirigido contra um péptido C-terminal de GPC3 com cerca de 30 kDa, tal como encontrado na forma solúvel da proteína central GPC3. Técnica anterior A presença da família de glipicanos é descrita como uma nova família de proteoglicanos de sulfato de heparano existentes na superfície celular. Até ao momento, foram referidos cinco tipos de glipicanos (glipicano 1, glipicano 2, glipicano 3, glipicano 4 e glipicano 5) . Os membros da família têm uma proteína central de tamanho uniforme (cerca de 60 kDa), possuem resíduos de cisteína raros e conservados em comum e estão presos à membrana celular através de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI).

Sabe-se que o glipicano 3 (GPC3) está profundamente envolvido na divisão celular durante o desenvolvimento e no controlo do seu padrão. Adicionalmente, sabe-se que o gene GPC3 é grandemente expresso nas células de hepatoma e que o gene GPC3 é eventualmente utilizado como um marcador do carcinoma hepatocelular.

Os inventores verificaram anteriormente que um anticorpo anti-GPC3 possuía uma actividade ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpos) e uma actividade CDC (citotoxicidade dependente do complemento) e era útil como tratamento terapêutico do hepatoma, tendo apresentado um pedido de patente (Pedido de Patente Japonesa 2001-189443).

Contudo, GPC3 é uma proteína ligada à membrana e não foi referida a existência de uma proteína GPC3 sob a forma segregada. Assim, não foi feita nenhuma análise quanto à 2 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ utilização da proteína GPC3 em si como marcador tumoral no sangue.

Descrição do invento

Os presentes inventores constataram que o glipicano 3 (GPC3) é clivado ao nível do seu resíduo de aminoácido 358 ou ao nível do seu resíduo de aminoácido 374 ou numa região nas proximidades dos resíduos.

Os inventores verificaram que um anticorpo dirigido contra o extremo C de GPC3 possuía uma actividade citotóxica elevada e consideraram que a utilização do anticorpo anti-GPC3 reconhecendo o extremo C seria preferida para provocar uma disrupção das células cancerosas, isto é, para tratar terapeuticamente o cancro. Em seguida, os inventores fizeram uma tentativa para desenvolver um anticorpo reconhecendo o péptido C-terminal de GPC3 e, assim, chegaram ao invento. 0 invento refere-se a um anticorpo dirigido contra um péptido que consiste nos resíduos de aminoácidos 375-580 de GPC3, em que o anticorpo possui actividade citotóxica.

Numa concretização, a actividade citotóxica é uma actividade citotóxica contra as células HepG2 ou HuH-7.

Ainda adicionalmente, o invento refere-se ao anticorpo, que é um anticorpo monoclonal.

Adicionalmente, o invento refere-se ao anticorpo, que é um anticorpo quimérico.

Além disso, o invento refere-se ao anticorpo, que é um anticorpo humanizado.

Adicionalmente, o invento refere-se ao anticorpo, que é um anticorpo recombinante.

Além disso, o invento refere-se ao anticorpo, em que o anticorpo foi produzido numa célula de mamífero. Numa concretização, a célula de mamífero poderá ser uma célula seleccionada entre uma célula CHO, COS, de mieloma, BHK, vero 3 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ e Hela. A célula de mamífero poderá ser transformada com um vector de expressão compreendendo um gene que codifica o anticorpo.

Numa concretização, o invento refere-se ao anticorpo, em que a célula de mamífero compreende: (a) um vector de expressão compreendendo um gene que codifica a cadeia pesada (H de "heavy") do anticorpo e um vector de expressão separado compreendendo um gene que codifica a cadeia leve (L) do anticorpo; ou (b) um vector de expressão único que codifica ambas as cadeias H e L.

Nessas circunstâncias, pode acontecer que: (a) o gene que codifica a cadeia H do anticorpo compreende a sequência de SEQ ID NO: 9; e/ou (b) o gene que codifica a cadeia L do anticorpo compreende a sequência de SEQ ID NO: 17.

Pode também suceder que: (a) o gene que codifica a cadeia H do anticorpo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11; e/ou (b) o gene que codifica a cadeia L do anticorpo compreende a sequência de SEQ ID NO: 19.

Assim, o invento refere-se ao anticorpo para utilização em disrupção celular, em que as células que virão a sofrer ruptura expressam GPC 3.

Adicionalmente, o invento refere-se ao agente de disrupção celular, em que a célula é uma célula cancerosa.

Além disso, o invento refere-se a um agente anticanceroso compreendendo o anticorpo. Em particular, o anticorpo do invento poderá ser um anticorpo para utilizar no tratamento do cancro, em que o cancro expressa GPC3. 4

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Numa concretização, o cancro é um hepatoma, o cancro pancreático, o cancro do pulmão, o cancro do cólon, o cancro da mama, o cancro da próstata, uma leucemia ou um linfoma. 0 invento refere-se também a uma formulação farmacêutica compreendendo um anticorpo do invento e um veiculo farmaceuticamente aceitável. 0 invento é agora descrito em pormenor abaixo.

Como o anticorpo dirigido contra o péptido C-terminal de GPC3 de acordo com o invento possui uma actividade citotóxica elevada, o anticorpo pode ser utilizado para a disrupção das células cancerosas, isto é, para tratar terapeuticamente o cancro. O cancro eventualmente tratado de forma clinica utilizando o anticorpo inclui, embora não esteja limitado a estes, um hepatoma, o cancro pancreático, o cancro do pulmão, o cancro do cólon, o cancro da mama, o cancro da próstata, uma leucemia e um linfoma. Preferencialmente, o cancro é um hepatoma. 1. Preparação do anticorpo anti-GPC3 dirigido contra o péptido N-terminal ou do anticorpo anti-GPC3 dirigido contra o péptido C-terminal A sequência de aminoácidos e a sequência nucleotídica de GPC3 estão descritas em Lage, H. et al. Gene 188 (1997), 151-156 ou no GenBank: Z37987. 0 anticorpo anti-GPC3 dirigido contra o péptido C-terminal utilizado no invento deverá ser capaz de se ligar especificamente ao péptido C-terminal da proteína GPC3 que consiste nos resíduos de aminoácidos 375 a 580 de GPC3. A sua origem ou tipo (monoclonal, policlonal) ou a sua forma não estão especificamente limitados. Especificamente, é possível utilizar anticorpos conhecidos, tais como um anticorpo de ratinho, um anticorpo de rato, um anticorpo humano, um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado.

Quando a proteína GPC3 é clivada num local de clivagem, ela é clivada num péptido com cerca de 40 kDa e num péptido com cerca de 30 kDa, que se encontram no lado N-terminal e no 5

ΕΡ 1 541 58 0/PT lado C-terminal, respectivamente. O local de clivagem de GPC3 é o resíduo de aminoácido 358, o resíduo de aminoácido 374 ou uma região nas proximidades destes. Crê-se que o principal local de clivagem seja o resíduo de aminoácido 358. O péptido C-terminal de GPC3 é um péptido C-terminal de GPC3 com cerca de 30 kDa encontrado na forma solúvel da proteína central GPC3. Com base no local de clivagem referido acima, o péptido C-terminal é um péptido com uma sequência de aminoácidos compreendida entre Vai 375 e His 580. De acordo com o invento, poderão utilizar-se fragmentos deste péptido C-terminal. Neste fascículo, o péptido C-terminal é também designado por fragmento C-terminal ou fragmento do péptido C-terminal.

Por outras palavras, o anticorpo dirigido contra o péptido C-terminal de GPC3 de acordo com o invento é um anticorpo que reconhece um epitopo existente no péptido C-terminal da proteína GPC3 que consiste nos aminoácidos 375 a 580, e o local do epitopo reconhecido não está limitado. O anticorpo poderá ser um anticorpo policlonal, mas é preferencialmente um anticorpo monoclonal. 0 anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 para utilização de acordo com o invento pode ser obtido como um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal, utilizando técnicas conhecidas. O anticorpo anti-GPC3 para utilização de acordo com o invento é preferencialmente um anticorpo monoclonal derivado de mamíferos. O anticorpo monoclonal derivado de mamíferos inclui aqueles anticorpos produzidos por um hibridoma, e aqueles anticorpos gerados em hospedeiros transformados com vectores de expressão que transportam o gene do anticorpo através de tecnologia de engenharia genética. O hibridoma produtor de um anticorpo monoclonal é preparado utilizando técnicas conhecidas da forma que se segue. Um animal é imunizado através de um método de imunização convencional, usando GPC3 como antigénio de sensibilização, para obter uma célula imunitária que é depois fundida com uma célula parental conhecida por meio de um 6

ΕΡ 1 541 68 0/PT método de fusão celular convencional. As células fundidas são tríadas quanto à presença de células produtoras do anticorpo monoclonal através de um método de rastreio convencional.

Especificamente, um anticorpo monoclonal é preparado da forma que se segue.

Primeiro, a proteína GPC3 a utilizar como antigénio de sensibilização para obtenção do anticorpo é preparada através da expressão do gene/sequência de aminoácidos de GPC3 (MXR7) descritos em Lage, H. et al. Gene 188 (1997), 151-156. Em particular, a sequência génica que codifica GPC3 é inserida num vector de expressão conhecido para transformar uma célula hospedeira apropriada e, em seguida, a proteína GPC3 humana pretendida é purificada a partir da célula hospedeira ou de um seu sobrenadante de cultura.

Adicionalmente, a proteína GPC3 de ocorrência natural também poderá ser purificada e utilizada.

Em seguida, a proteína GPC3 purificada é utilizada como antigénio de sensibilização. É possível utilizar a proteína GPC3 completa como antigénio de sensibilização. Como neste caso são também induzidos um anticorpo dirigido contra o péptido N-terminal da proteína GPC3 e um anticorpo dirigido contra o seu péptido C-terminal, o anticorpo dirigido contra o seu péptido C-terminal poderá ser seleccionado separadamente. Em alternativa, também é possível utilizar um péptido C-terminal parcial de GPC3 como antigénio de sensibilização. Nesse caso, este péptido parcial poderá ser obtido por síntese química com base na sequência de aminoácidos da GPC3 humana, por inserção de uma porção do gene GPC3 num vector de expressão ou por degradação da GPC3 de ocorrência natural com proteases. Um péptido C-terminal de GPC3 poderá ser utilizado como péptido parcial, e um fragmento peptídico mais pequeno compreendendo o epitopo também poderá ser utilizado.

Os mamíferos destinados a imunização com um antigénio de sensibilização são preferencialmente seleccionados tendo em atenção a compatibilidade com as células parentais que serão utilizadas na fusão celular. Os mamíferos utilizados para 7

ΕΡ 1 541 58 0/PT imunização incluem preferencialmente, embora não estejam limitados a estes, roedores como o ratinho, o rato, o hamster ou o coelho, ou o macaco.

Para a imunização dos animais com um antigénio de sensibilização, é possível usar métodos conhecidos. Geralmente, por exemplo, um antigénio de sensibilização é injectado intraperitonealmente ou subcutaneamente nos mamíferos. Especificamente, um antigénio de sensibilização é diluído ou suspenso em PBS (solução salina tamponada com fosfato), em solução salina fisiológica ou em solução idêntica, para um volume apropriado, e misturado com um volume adequado de adjuvantes convencionais, como o adjuvante completo de Freund. Após emulsificação, a mistura emulsionada é administrada aos mamíferos várias vezes a cada 4 a 21 dias. Adicionalmente, poderá utilizar-se um veículo apropriado durante a imunização com um antigénio de sensibilização. No caso de utilizar-se um péptido parcial de peso molecular muito pequeno como antigénio de sensibilização, o péptido parcial poderá ser preferencialmente ligado a proteínas de transporte, tal como a albumina e a hemocianina de lapa, aquando da imunização.

Após imunização dos mamíferos como descrito acima e observação do aumento do nível do antigénio desejado no soro, as células imunitárias são recolhidas dos mamíferos e são depois sujeitas a fusão celular. Preferencialmente, a célula imunitária é um esplenócito. A outra célula parental a fundir com a célula imunitária poderá ser uma célula de mieloma de mamífero. Como célula de mieloma, são preferencialmente usadas várias linhas celulares conhecidas, incluindo, por exemplo, P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler G. & Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), F0 (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) e R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133). 8 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ A fusão celular da célula imunitária com a célula de mieloma é essencialmente efectuada por métodos conhecidos, por exemplo, o método de Kohler & Milstein et al. (Kohler G. & Milstein C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Mais especificamente, a fusão celular é efectuada em meio de cultura nutritivo convencional, na presença de um agente de estimulação da fusão celular. 0 agente de estimulação da fusão celular inclui, por exemplo, o polietilenoglicol (PEG) e o virus Sendai (HVJ). Se desejado, agentes auxiliares, como o dimetilsulfóxido, podem ser adicionados e utilizados de modo a reforçar a eficiência da fusão. A razão das células imunitárias para as células de mieloma pode ser determinada de modo adequado. Por exemplo, prefere-se que o número de células imunitárias seja 1 a 10 maior que o número de células de mieloma. O meio de cultura a utilizar na fusão celular inclui, por exemplo, o meio RPMI 1640, o meio MEM e outros meios de cultura convencionais adequados para o crescimento de linhas celulares de mieloma. Adicionalmente, agentes séricos auxiliares, como soro fetal de vitelo (FCS), poderão ser utilizados em combinação. A fusão celular pode ser realizada através da mistura cuidadosa de quantidades predeterminadas de células imunitárias e de células de mieloma no meio de cultura, adição da mistura resultante a uma solução de PEG (por exemplo, peso molecular médio de cerca de 1.000 a 6.000) previamente aquecida a cerca de 37°C, geralmente numa concentração de 30 a 60% (p/v) , e mistura subsequente da solução para permitir a formação da célula de fusão pretendida (hibridoma). Subsequentemente, o agente de fusão celular e componentes similares que não são preferidos para o crescimento do hibridoma são removidos por adição de meio de cultura apropriado sequencialmente, centrifugação da mistura para eliminar o sobrenadante e repetição dos procedimentos descritos acima.

O hibridoma assim obtido é seleccionado através de cultura num meio de cultura selectivo convencional, como seja o meio HAT (contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). A 9

ΕΡ 1 541 58 0/PT cultura em meio HAT é prosseguida durante um período de tempo suficiente (tipicamente vários dias a várias semanas) para levar à morte das células (células não fundidas) distintas das células de hibridoma pretendidas. Em seguida, utiliza-se um método de diluição limite convencional para efectuar o rastreio e obter um monoclone do hibridoma produtor do anticorpo pretendido. O rastreio e a obtenção do monoclone do hibridoma poderão ser efectuados por meio de um método de rastreio baseado em reacções anticorpo-antigénio conhecidas. 0 antigénio é ligado a suportes, tais como esferas de poliestireno e materiais similares ou placas de microtitulação de 96 poços disponíveis comercialmente, e deixado reagir com um sobrenadante de cultura do hibridoma. Após lavagem dos suportes, adiciona-se um anticorpo secundário marcado enzimaticamente à placa para determinar se um anticorpo pretendido, que reage com o antigénio de sensibilização, está ou não contido no sobrenadante de cultura. O hibridoma produtor do anticorpo pretendido pode ser clonado pelo método de diluição limite. O péptido exterminai de GPC3 ou um seu fragmento poderão ser utilizados como antigénio para o rastreio.

Além da obtenção de um hibridoma por imunização de um animal não humano com um antigénio, um anticorpo humano pode ser preparado por outro método. Para obter um anticorpo humano desejado com uma actividade de ligação ao péptido exterminai de GPC3 (ver JP-B-1-59878), um linfócito humano é sensibilizado com GPC3 in vitro e é depois fundido com uma célula de mieloma de origem humana que tem um potencial de divisão permanente. Além disso, um anticorpo humano dirigido contra o péptido C-terminal de GPC3 poderá ser obtido através da administração de GPC3 como antigénio a um animal transgénico que possui todos os repertórios de genes de anticorpos humanos, para obter uma célula produtora de um anticorpo anti-GPC3 dirigido contra o péptido C-terminal, seguida de imortalização da célula (ver as Publicações Internacionais WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918 e WO 94/02602) . 10

ΕΡ 1 541 58 0/PT Ο hibridoma produtor do anticorpo monoclonal assim preparado pode ser subcultivado num meio de cultura convencional e pode ser armazenado em azoto liquido durante um período de tempo prolongado.

Um método para obter o anticorpo monoclonal a partir do hibridoma envolve a cultura do hibridoma por um método convencional e a obtenção do anticorpo monoclonal a partir de um seu sobrenadante de cultura. Outro método envolve a administração do hibridoma a um animal compatível com o hibridoma de modo a permitir a sua proliferação e a obtenção do anticorpo monoclonal sob a forma de ascite. O primeiro método é adequado para obter o anticorpo com uma pureza elevada, ao passo que o último método é adequado para a produção em grande escala do anticorpo.

De acordo com o invento, um anticorpo monoclonal inclui um anticorpo recombinante produzido por tecnologia recombinante. Um anticorpo recombinante pode ser gerado por clonagem do gene do anticorpo a partir do hibridoma, integração do gene num vector apropriado, introdução do gene num hospedeiro e permitir que o anticorpo recombinante seja produzido pelo hospedeiro (ver, por exemplo, Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990). Especificamente, o ARNm que codifica a região variável (V) do anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 é isolado a partir do hibridoma produtor do anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3. O isolamento do ARNm pode ser efectuado através de métodos conhecidos. Por exemplo, o ARN total é preparado pelo método de ultracentrifugação com guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) ou pelo método AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) , e o ARNm pretendido é depois preparado a partir dele utilizando um kit de purificação de ARNm (produzido por Pharmacia) . Em alternativa, o ARNm pode ser preparado directamente utilizando o kit de purificação de ARNm QuickPrep (produzido por Pharmacia).

O ADNc da região V do anticorpo é sintetizado a partir do ARNm resultante, utilizando a transcriptase inversa. O ADNc pode ser sintetizado utilizando um kit de síntese de ADNc de primeira cadeia com transcriptase inversa AMV 11

ΕΡ 1 541 58 0/PT (produzido por Seikagaku Corporation). O ADNc também pode ser sintetizado e amplificado utilizando o kit 5'-AmpliFinder Race (produzido por Clontech) e o método 5'-RACE com recurso à reacção de PCR (Frohman, M.A. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et ai., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932). O fragmento de ADN pretendido é purificado a partir do produto de PCR resultante e ligado a um vector de ADN. Prepara-se um vector recombinante a partir do vector de ADN e introduz-se em Escherichia coli ou espécie idêntica para seleccionar uma colónia e, assim, preparar um vector recombinante desejado. Subsequentemente, a sequência nucleotídica do ADN pretendido pode ser confirmada através de métodos conhecidos, por exemplo, o método de didesoxi.

Após obtenção do ADN que codifica a região V do anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 pretendido, o ADN é inserido num vector de expressão contendo ADN que codifica a região constante (região C) desejada do anticorpo.

Para produzir o anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 utilizado de acordo com o invento, o gene do anticorpo é introduzido num vector de expressão de modo que o gene seja expresso sob o controlo de uma região de regulação da expressão, por exemplo, um amplificador e um promotor. Em seguida, transforma-se uma célula hospedeira com o vector de expressão para expressar o anticorpo. 0 gene do anticorpo poderá ser expresso introduzindo o ADN que codifica a cadeia pesada (cadeia H) do anticorpo e o ADN que codifica a sua cadeia leve (cadeia L) separadamente em vectores de expressão para transformar simultaneamente uma célula hospedeira, ou introduzindo os ADN que codificam a cadeia H e a cadeia L num vector de expressão único para transformar uma célula hospedeira (ver WO 94/11523).

Adicionalmente, é possível utilizar não só estas células hospedeiras, como também um animal transgénico para gerar um anticorpo recombinante. Por exemplo, o gene do anticorpo é introduzido num gene que codifica uma proteína (por exemplo, a caseína β de cabra) produzida inerentemente no leite para 12 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ preparar um gene de fusão. 0 fragmento de ADN compreendendo o gene de fusão com o gene do anticorpo ai inserido é injectado num embrião de cabra, que é introduzido numa cabra fêmea. 0 anticorpo desejado é obtido a partir do leite produzido por uma cabra transgénica nascida da cabra que recebeu o embrião ou de um seu descendente. Para aumentar a quantidade de leite contendo o anticorpo desejado produzida pela cabra transgénica, poderão administrar-se hormonas à cabra transgénica (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

De acordo com o invento, anticorpos recombinantes modificados artificialmente, tal como um anticorpo quimérico (por exemplo, um anticorpo humanizado) , também poderão ser usados. Estes anticorpos modificados podem ser produzidos utilizando métodos existentes. No caso de o anticorpo do invento vir a ser utilizado para tratamento terapêutico, utiliza-se preferencialmente o anticorpo de tipo recombinante obtido por via genética.

Um anticorpo quimérico pode ser obtido mediante a ligação do ADN que codifica a região V do anticorpo, obtido da forma descrita acima, ao ADN que codifica a região C de um anticorpo humano, inserção do ADN resultante num vector de expressão e introdução do vector num hospedeiro para produção do anticorpo. Utilizando este método existente, é possível obter um anticorpo quimérico útil de acordo com o invento.

Um anticorpo humanizado é também designado por anticorpo humano remodelado e é preparado por transplante da região determinante de complementaridade (CDR de "complementarity determining region") de um anticorpo de um mamífero não humano, por exemplo um ratinho, para a região determinante de complementaridade de um anticorpo humano. As técnicas gerais de recombinação genética para este procedimento também são conhecidas na técnica (ver Pedido de Patente europeia EP 125023; WO 96/02576) .

Especificamente, uma sequência de ADN concebida de forma que a CDR do anticorpo de ratinho possa ser ligada à região de estrutura (FR de "framework region") do anticorpo humano é preparada sinteticamente por PCR, utilizando vários 13

ΕΡ 1 541 680/PT oligonucleótidos que foram desenhados de modo a terem porções sobrepostas com as regiões terminais tanto da CDR como da FR (ver o método descrito em WO 98/13388). A região FR do anticorpo humano que será ligada à CDR é seleccionada de modo que a CDR possa formar um local de ligação do antigénio favorável. Se necessário, os aminoácidos na FR da região V do anticorpo poderão ser substituídos, para que a CDR do anticorpo humano remodelado possa formar um local de ligação do antigénio apropriado (Sato, K. et al., Câncer Res. (1993) 53, 851-856).

Como regiões C do anticorpo quimérico e do anticorpo humanizado, utilizam-se aquelas de um anticorpo humano; por exemplo, Cyl, 0γ2, Cy3 e 0γ4 podem ser utilizadas para a cadeia H, ao passo que Ck e CA podem ser usadas para a cadeia L. De modo a melhorar a estabilidade do anticorpo ou a sua produção, a região C do anticorpo humano poderá ser modificada.

Preferencialmente, o anticorpo quimérico contém uma sequência de um anticorpo derivado de um mamífero não humano na região V e contém uma sequência derivada de um anticorpo humano na região C.

Um anticorpo humanizado compreende a CDR de um anticorpo derivado de um mamífero não humano e as regiões FR e C derivadas de um anticorpo humano. Como a antigenicidade de um anticorpo quimérico, por exemplo um anticorpo humanizado, é reduzida nos seres humanos, um anticorpo quimérico é útil como componente activo de um agente terapêutico do invento. 0 anticorpo a utilizar de acordo com o invento não é somente a molécula do anticorpo completo, mas também um fragmento do anticorpo ou um seu produto modificado, incluindo um anticorpo divalente e um anticorpo monovalente, desde que este fragmento ou este produto modificado possa ligar-se ao péptido C-terminal de GPC3. Por exemplo, o fragmento do anticorpo inclui os fragmentos Fab, F(ab')2, Fv, Fab/C possuindo um Fab e FC completo, ou Fv de cadeia simples (scFv) em que os Fv da cadeia H e da cadeia L estão ligados através de um elemento de ligação apropriado. 14

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Especificamente, o anticorpo é tratado com enzimas, por exemplo, papaina e pepsina, para gerar os fragmentos do anticorpo. Caso contrário, os genes que codificam estes fragmentos do anticorpo são construídos, introduzidos num vector de expressão e expressos numa célula hospedeira apropriada (ver, por exemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc. ; Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press. Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669; Bird, R. E. et al. , TIBTECH (1991) 9, 132-137). O fragmento scFv pode ser obtido por ligação da região V da cadeia H com a região V da cadeia L de um anticorpo. Neste scFv, a região V da cadeia H e a região V da cadeia L estão ligadas através de um elemento de ligação, preferencialmente um elemento de ligação peptídico (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). A região V da cadeia H e a região V da cadeia L em scFv poderão ser derivadas de quaisquer anticorpos aqui descritos. Qualquer péptido de cadeia simples apropriado, compreendendo 12 a 19 resíduos de aminoácidos, poderá ser utilizado como elemento de ligação peptídico para ligar as regiões V. O ADN que codifica o fragmento scFv é obtido amplificando primeiro o ADN que codifica a cadeia H ou a região V da cadeia H e o ADN que codifica a cadeia L ou a região V da cadeia L, utilizando como molde uma porção de ADN que codifica todas estas sequências, ou uma sequência de aminoácidos desejada aí contida, e um par de iniciadores que define ambas as extremidades, e amplificando depois o ADN com um ADN que codifica o elemento de ligação peptídico e um par de iniciadores concebido de forma que ambas as extremidades do elemento de ligação peptídico possam ser ligadas, respectivamente, à cadeia H e à cadeia L.

Uma vez preparado o ADN que codifica scFv, é possível obter um vector de expressão que transporta o ADN e um hospedeiro transformado com o vector de expressão por métodos 15

ΕΡ 1 541 68 0/PT convencionais. O fragmento scFv pode ser obtido fazendo uso do hospedeiro por métodos convencionais.

Os fragmentos do anticorpo podem ser produzidos obtendo e expressando o gene da forma descrita acima e permitindo depois que um hospedeiro produza os fragmentos. 0 "anticorpo" de acordo com o invento inclui tais fragmentos do anticorpo.

Também é possível utilizar um produto modificado do anticorpo, por exemplo, anticorpos anti-glipicano conjugados com várias moléculas tais como substâncias de marcação, toxinas e materiais radioactivos. O "anticorpo" de acordo com o invento inclui estes anticorpos modificados. Tais anticorpos modificados podem ser obtidos por modificação química de um anticorpo. Os métodos para modificar os anticorpos já foram estabelecidos na técnica.

Para além disso, o anticorpo a utilizar de acordo com o invento poderá ser um anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico poderá incluir aqueles anticorpos com locais de ligação do antigénio que reconhecem diferentes epitopos no péptido C-terminal de GPC3. Em alternativa, um dos locais de ligação do antigénio reconhece o péptido C-terminal de GPC3, enquanto o outro local de ligação do antigénio poderá reconhecer uma substância de marcação ou elemento idêntico. Este anticorpo biespecífico pode ser preparado ou obtido por ligação de pares HL de dois tipos de anticorpos, ou por fusão de hibridomas produtores de diferentes anticorpos monoclonais para preparar uma célula de fusão capaz de produzir um anticorpo biespecífico. Adicionalmente, este anticorpo biespecífico pode ser preparado por técnicas de engenharia genética.

De acordo com o invento, um anticorpo com uma cadeia açúcar modificada também poderá ser utilizado com o objectivo de reforçar a actividade citotóxica. A técnica de modificação da cadeia açúcar do anticorpo é conhecida na técnica (por exemplo, WO 00/61739, WO 02/31140, etc.). O gene do anticorpo construído da forma descrita acima pode ser expresso e obtido através de métodos conhecidos. No caso de uma célula de mamífero, um promotor útil 16

ΕΡ 1 541 68 0/PT convencional, o gene do anticorpo que se pretende expressar e um sinal poli (A) a jusante do seu lado 3' são ligados funcionalmente para a expressão. Por exemplo, o promotor/amplificador inclui o amplificador/promotor precoce imediato de citomegalovirus humano.

Adicionalmente, o promotor/amplificador a utilizar na expressão do anticorpo para uso de acordo com o invento inclui, por exemplo, amplificadores/promotores de vírus, incluindo retrovírus, poliomavirus, adenovírus e o vírus símio 40 (SV40), ou amplificadores/promotores derivados de células de mamíferos, como seja o promotor do factor de alongamento humano Ia (HEFIa).

No caso de utilizar um promotor/amplificador de SV40, a expressão génica pode ser facilmente realizada pelo método de Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108). No caso de utilizar o promotor/amplificador de HEFIa, a expressão génica pode ser facilmente realizada pelo método de Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

No caso de Escherichia coli, um promotor convencional útil, uma sequência de sinal para a secreção do anticorpo e o gene do anticorpo que se pretende expressar são ligados funcionalmente para expressar o gene. 0 promotor inclui, por exemplo, o promotor lacz e o promotor araB. No caso de se pretender utilizar o promotor lacz, o gene pode ser expresso pelo método de Ward et al. (Nature (1098), 341, 544-546; FASEBJ. (1992) 6, 2422-2427). No caso de se pretender utilizar o promotor araB, o gene pode ser expresso pelo método de Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043).

Como sequência de sinal para a secreção do anticorpo, é possível utilizar a sequência de sinal pelB (Lei, S. P. et al. J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) quando o anticorpo é gerado no periplasma de Escherichia coli. Após separação do anticorpo produzido no periplasma, a estrutura do anticorpo sofre um reenrolamento apropriado para o anticorpo ser utilizado.

Como origem de replicação, é possível utilizar as origens de SV40, poliomavirus, adenovírus e vírus do papiloma 17

ΕΡ 1 541 58 0/PT bovino (VPB) . Para amplificação do número de cópias do gene num sistema de célula hospedeira, o vector de expressão poderá transportar um marcador selectivo, por exemplo, o gene da aminoglicósido-transferase (ΑΡΗ), o gene da timidina-cinase (TK), o gene da xantina-guanina-fosforribosil-transferase de Escherichia coli (Ecogpt) e o gene da di-hidrofolato-redutase (dhfr)

Para produzir o anticorpo utilizado de acordo com o invento, é possível usar um sistema de expressão apropriado, por exemplo, um sistema de célula eucariótica ou de célula procariótica. A célula eucariótica inclui, por exemplo, linhas de células animais estabelecidas, tais como linhas celulares de mamífero, linhas celulares de insecto, células fúngicas e células de levedura. A célula procariótica inclui, por exemplo, células bacterianas como as células de Escherichia coli.

Preferencialmente, o anticorpo a utilizar de acordo com o invento é expresso em células de mamífero, por exemplo, células CHO, COS, de mieloma, BHK, Vero e HeLa. A célula hospedeira transformada é cultivada in vitro ou in vivo para produzir o anticorpo pretendido. A célula hospedeira poderá ser cultivada através de métodos conhecidos. Como meio de cultura, é possível utilizar, por exemplo, os meios DMEM, MEM, RPMI 1640 e IMDM. Um fluido sérico auxiliar, como o soro fetal de vitelo (FCS), também poderá ser utilizado em combinação. O anticorpo expresso e produzido da forma descrita acima pode ser separado das células ou animais hospedeiros e pode depois ser purificado até à homogeneidade. O anticorpo a utilizar de acordo com o invento pode ser separado e purificado utilizando uma coluna de afinidade. Uma coluna de proteína A inclui, por exemplo, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia). Adicionalmente, quaisquer métodos de separação e purificação geralmente usados para proteínas poderão ser empregues no invento. Por exemplo, colunas de cromatografia distintas da coluna de afinidade, a filtração, a ultrafiltração, o salting-out e a diálise poderão ser utilizados em combinação para separar e purificar o anticorpo 18

ΕΡ 1 541 58 0/PT (Antibodies A Laboratory Manual, Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 2. Disrupção de células cancerosas utilizando o anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 e terapia do cancro utilizando o mesmo (1) Determinação da actividade do anticorpo É possível utilizar técnicas conhecidas para analisar a actividade de ligação a antigénios do anticorpo a utilizar de acordo com o invento (Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) e uma actividade de inibição da ligação do receptor ao seu ligando (Harada, A. et al., International Immunology (1993) 5, 681-690).

Um método para analisar a actividade de ligação ao antigénio do anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 utilizado de acordo com o invento inclui o ensaio ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima), o ensaio EIA (imunoensaio enzimático), o ensaio RIA (radioimunoensaio) e um método com anticorpos fluorescentes. No imunoensaio enzimático, uma amostra contendo o anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3, por exemplo, um sobrenadante de cultura de uma célula produtora do anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 ou o anticorpo purificado, é adicionada a uma placa revestida com o péptido C-terminal de GPC3 que consiste nos resíduos de aminoácidos 375-380 de GPC3. Adiciona-se um anticorpo secundário marcado com uma enzima, como a fosfatase alcalina, a placa é incubada e lavada e, em seguida, adiciona-se um substrato da enzima, como seja o ácido p-nitrofenilfosfórico, para medir a absorvância e avaliar a actividade de ligação ao antigénio.

Para determinar a actividade do anticorpo utilizado de acordo com o invento, mede-se a actividade de neutralização do anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3. 19

ΕΡ 1 541 680/PT (2) Citotoxicidade

Para fins terapêuticos, o anticorpo utilizado de acordo com o invento tem preferencialmente actividade ADCC ou actividade CDC como actividade citotóxica. A actividade ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpos) pode ser analisada misturando uma célula efectora, uma célula-alvo e o anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 e examinando o nivel de ADCC. Como célula efectora, é possível utilizar, por exemplo, esplenócitos de ratinho e células mononucleares isoladas do sangue humano periférico ou da medula óssea. Como célula-alvo, é possível utilizar uma linha de células humanas tal como a linha de hepatoma humano HuH-7. As células-alvo são preliminarmente marcadas com 51Cr e incubadas com o anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 e, em seguida, as células efectoras, numa razão apropriada, são adicionadas às células-alvo e incubadas. Após incubação, recolhe-se o sobrenadante para contar a radioactividade e analisar a actividade ADCC.

Além disso, a actividade CDC (citotoxicidade dependente do complemento) pode ser analisada através de mistura da célula-alvo marcada descrita acima com o anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3, subsequente adição do complemento e contagem da radioactividade no sobrenadante após incubação. 0 grupo Fc é necessário para que o anticorpo exerça a sua actividade citotóxica. Assim, no caso de o inibidor da proliferação celular de acordo com o invento utilizar a citotoxicidade do anticorpo, o anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 utilizado de acordo com o invento contém preferencialmente o grupo Fc. (3) Disrupção celular 0 anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 do invento também poderá ser utilizado para disrupção celular, particularmente a disrupção de células cancerosas. Além disso, o anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 do invento pode ser utilizado como agente anticanceroso. Os cancros que podem ser tratados e prevenidos terapeuticamente com o 20

ΕΡ 1 541 58 0/PT anticorpo do invento incluem, embora não estejam limitados a estes, o hepatoma, o cancro do pulmão, o cancro do cólon, o cancro da mama, o cancro da próstata, o cancro pancreático e o linfoma, de preferência o hepatoma. (4) Método de administração e formulação farmacêutica O agente de disrupção celular ou agente anticanceroso de acordo com o invento é utilizado com o objectivo de tratar ou melhorar terapeuticamente doenças causadas por um crescimento celular anómalo, particularmente o cancro. A dose eficaz é seleccionada dentro da gama de 0,001 mg a 1.000 mg por kg de peso corporal. Do mesmo modo, a dose eficaz é seleccionada numa gama de 0,01 mg a 100.000 mg/peso corporal por doente. Contudo, a dose dos agentes terapêuticos que contêm o anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 do invento não está limitada às doses indicadas acima. O momento de administração do agente terapêutico do invento é antes ou após o inicio dos sintomas clínicos das doenças. O agente terapêutico compreendendo o anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 de acordo com o invento como componente activo pode ser formulado por um método convencional (Remington's Pharmaceutical Science, última edição, Mark Publishing Company, Easton, EUA) e também pode conter veículos e aditivos farmaceuticamente aceitáveis.

Os exemplos destes veículos e aditivos farmacêuticos incluem a água, solventes orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, o colagénio, o álcool polivinílico, a polivinilpirrolidona, um polímero carboxivinílico, a carboximetilcelulose de sódio, o poliacrilato de sódio, o alginato de sódio, o dextrano solúvel em água, o carboximetilamido de sódio, a pectina, a metilcelulose, a etilcelulose, a goma xantana, a goma-arábica, a caseína, o ágar-ágar, o polietilenoglicol, a diglicerina, a glicerina, o propilenoglicol, a vaselina, a parafina, o álcool estearílico, o ácido esteárico, a albumina sérica humana 21

ΕΡ 1 541 68 0/PT (HSA), o manitol, ο sorbitol, a lactose e tensioactivos que são aceitáveis como aditivos farmacêuticos.

Na prática, a selecção de um aditivo ou de uma combinação deles depende da forma farmacêutica do agente terapêutico do invento. Contudo, o aditivo não está limitado aqueles descritos acima. No caso de o agente terapêutico vir a ser utilizado numa formulação para injecção, o anticorpo anti-péptido C-terminal de GPC3 purificado do invento é dissolvido num solvente, como solução salina fisiológica, tampões e solução de glucose, e adicionam-se agentes de prevenção da adsorção, como Tween 80, Tween 20, gelatina e albumina sérica humana. Em alternativa, o agente terapêutico é disponibilizado sob uma forma liofilizada como forma farmacêutica para dissolver e reconstituir antes da utilização. Como excipientes para a liofilização, é possível utilizar, por exemplo, açúcar-álcoois como o manitol e a glucose e açúcares.

Breve descrição das figuras A Fig. 1 apresenta gráficos de barras que ilustram os resultados da análise da expressão do ARNm de GPC3 utilizando GeneChip, em que a Fig. IA representa a expressão de GPC3 e a Fig. 1B representa a expressão de alfa-fetoproteína (AFP). NL, CH, LC, WD, MD e PD no eixo horizontal representam, respectivamente, fígado normal, lesão inflamatória de hepatite, lesão de cirrose hepática, cancro bem diferenciado, cancro moderadamente diferenciado e cancro fracamente diferenciado. A Fig. 2 apresenta imagens da proteína GPC3 solúvel purificada do tipo aduto sulfato de heparano e da proteína central GPC3, coradas com CBB. A Fig. 3 apresenta gráficos de barras que ilustram a expressão do gene GPC3 em hepatoma humano. A Fig. 4 apresenta os resultados da análise de transferência de western da forma solúvel da proteína central, utilizando o anticorpo anti-GPC3. 22

ΕΡ 1 541 68 0/PT A Fig. 5 ilustra o principio do ensaio ELISA tipo sanduíche, utilizando o anticorpo anti-GPC3. A Fig. 6 é um gráfico da curva padrão para o ensaio ELISA tipo sanduíche de GPC3, utilizando M6B1 e M18D4. A Fig. 7 é uma perspectiva esquemática da estrutura de GPC3. A Fig. 8 ilustra combinações dos anticorpos anti-GPC3 empregues no ensaio ELISA. A Fig. 9 é um gráfico da curva padrão para o sistema ELISA tipo sanduíche de GPC3, utilizando várias combinações dos anticorpos anti-GPC3. A Fig. 10 apresenta os resultados do ensaio da actividade ADCC do anticorpo anti-GPC3. A Fig. 11 apresenta os resultados do ensaio da actividade CDC do anticorpo anti-GPC3.

Melhor forma de realização do invento O invento é agora descrito especificamente nos exemplos que se seguem. Contudo, o invento não está limitado pelos exemplos.

Nos exemplos descritos neste fascículo, utilizaram-se os materiais que se seguem.

Como vectores de expressão da forma solúvel de GPC3 e da forma solúvel da proteína central GPC3, utilizaram-se os vectores pCXND2 e pCXND3 preparados por integração do gene DHFR e do gene de resistência à neomicina em pCAGGS. A linha DXB11 foi adquirida de ATCC. Para a cultura, utilizou-se FBS a 5% (GIBCO BRL CAT n.° 10099-141, Lote n.° A0275242)/Meio mínimo essencial alfa (cxMEM ( + ) ) (GIBCO BRL CAT n.° 12571-071)/penicilina-estreptomicina a 1% (GIBCO BRL CAT n.° 15140-122). Para a selecção da linha celular estável DXB11 expressando cada uma das proteínas, utilizou-se 23 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ geneticina numa concentração de 500 μg/ml (GIBCO BRL CAT n.° 10131-027)/FBS a 5%/aMEM sem ribonucleótidos e desoxirribonucleótidos (GIBCO BRL CAT n.° 12561-056)(aMEM(-)) /PS sozinho ou suplementado com MTX para uma concentração final de 25 nM.

As células HepG2 foram adquiridas de ATCC e mantidas em FBS a 10%/meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (GIBCO BRL CAT n.° 11995-065)/PS. 0 hibridoma foi mantido em FBS a 10%/RPMI 1640/ suplemento de meio HAT lx (SIGMA CAT n.° H-0262)/suplemento para clonagem de hibridoma BM-Condimed Hl 0,5x (Roche CAT n.° 1088947).

Exemplo 1

Clonagem e análise da expressão do ADNc de GPC3 humana (GPC3)

Clonagem do ADNc completo que codifica o glipicano 3 humano (GPC3 aqui a seguir) O ADNc completo que codifica a proteína GPC3 humana foi amplificado por PCR, utilizando como molde um ADNc de primeira cadeia preparado a partir de uma linha de células de cancro do cólon Caco2 por um método geral e o kit Advantage 2 (Clontech Cat. n.° 8430-1). Especificamente, 50 μΐ de uma mistura de reacção contendo 2 μΐ de ADNc derivado de Caco2, 1 μΐ de um iniciador directo (SEQ ID NO: 1), 1 μΐ de um iniciador inverso (SEQ ID NO: 2), 5 μΐ de tampão de PCR Advantage 2 lOx, 8 μΐ de mistura de dNTP (1,25 mM) e 1,0 μΐ de mistura de polimerases Advantage foram submetidos a 35 ciclos de um minuto a 94°C, 30 segundos a 63°C e 3 minutos a 68 °C. O produto amplificado a partir da reacção de PCR (inserido no vector TA, pGEM-T Easy, utilizando o sistema pGEM-T Easy Vector System I (Promega Cat n.° A1360)) foi sequenciado utilizando o sequenciador de ADN ABI3100, para confirmar o isolamento do ADNc que codifica a proteína GPC3 humana completa. A sequência representada pela SEQ ID NO: 3 indica a sequência nucleotídica do gene GPC3 humano, enquanto 24

ΕΡ 1 541 68 0/PT a sequência representada pela SEQ ID NO: 4 indica a sequência de aminoácidos da proteína GPC3 humana.

SEQ ID NO: 1: GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT SEQ ID NO: 2: GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC

Análise da expressão do ARNm de GPC3 humano utilizando GeneChip A expressão do ARNm foi analisada em 24 casos com lesões de hepatoma (cancro bem diferenciado: WD; cancro moderadamente diferenciado: MD; cancro fracamente diferenciado: PD), 16 casos de hepatoma com lesões distintas de cancro (lesão de hepatite: CH; lesão de cirrose: LC) e 8 casos com fígado normal: NL (consentimento informado obtido; disponíveis a partir da Universidade de Tóquio, Escola de Medicina e Centro Saitama do Cancro), utilizando GeneChip” UG-95A Target (Affymetrix). Especificamente, o ARN total foi preparado a partir dos tecidos individuais utilizando ISOGEN (Nippon Gene) e usaram-se 15 pg do ARN total de cada um deles para a análise da expressão génica de acordo com o manual técnico de análise da expressão (Affymetrix).

Como ilustrado na Fig.l, o nível de expressão do ARNm do gene GPC3 humano (Probe Set ID: 39350_at) foi manifestamente mais elevado em muitos dos casos em comparação com a expressão no tecido hepático normal, apesar das fases de diferenciação do hepatoma. Além disso, efectuou-se uma comparação com a expressão do ARNm da alfa-fetoproteína (Probe Set ID: 40114_at), habitualmente utilizada como marcador de diagnóstico do hepatoma. Demonstrou-se que mesmo no cancro bem diferenciado que não apresenta praticamente nenhuma expressão do ARNm de alfa-fetoproteína, ocorreu uma expressão do ARNm de GPC3 bastante intensificada, e que a razão da activação da expressão do ARNm de GPC3 foi superior. Assim, considera-se que a detecção de GPC3 é útil como método de diagnóstico do hepatoma numa fase precoce. 25

ΕΡ 1 541 58 0/PT

Exemplo 2

Preparação de anticorpo anti-GPC3

Preparação da forma solúvel de GPC3 humana

Como material para preparar o anticorpo anti-GPC3, preparou-se uma forma solúvel da proteína GPC3 sem a região hidrofóbica no lado C-terminal.

Utilizando um ADN plasmídico contendo o ADNc da proteína GPC3 humana completa fornecido pela Universidade de Tóquio, Advanced Technology Institute, construiu-se um ADN plasmídico para expressar o ADNc da forma solúvel de GPC3. A reacção de PCR foi realizada utilizando um iniciador a jusante (5'-ATA GAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C-3') (SEQ ID NO: 5) concebido para remover a região hidrofóbica no lado C-terminal (aminoácidos 564-580) e um iniciador a montante (51 — ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTT C-3') (SEQ ID NO: 6) ao qual se juntaram a sequência de reconhecimento EcoRI e a sequência de Kozak. O fragmento de PCR resultante (1711 pb) foi clonado em pCXND2-Flag. O ADN plasmídico de expressão preparado foi introduzido numa linha de células CHO DXB11. A selecção com geneticina numa concentração de 500 pg/ml resultou numa linha CHO que expressa níveis elevados da forma solúvel de GPC3.

Utilizando um frasco rotativo de 1700 cm2, cultivou-se a linha CHO expressando níveis elevados da forma solúvel de GPC3 em grande escala, e o sobrenadante de cultura foi recolhido para purificação. O sobrenadante de cultura foi aplicado em DEAE Sepharose Fast Flow (Amersham CAT n.° 17- 0709-01), lavado e eluído com um tampão contendo NaCl 500 mM. Subsequentemente, o produto foi purificado por afinidade utilizando um gel de afinidade de agarose e anticorpo M2 anti-Flag (SIGMA CAT n.° A-2220) e eluído com péptido Flag numa concentração de 200 pg/ml. Após concentração com Centriprep-10 (Millipore Cat n.° 4304), o péptido Flag foi removido por filtração em gel com Superdex 200 HR 10/30 (Amersham CAT n.° 17-1088-01). Finalmente, o produto foi concentrado utilizando uma coluna de DEAE Sepharose Fast Flow 26

ΕΡ 1 541 58 0/PT e eluido com PBS (contendo NaCl 500 mM), sem conter qualquer Tween 20, para substituição do tampão.

Preparação da forma solúvel da proteína central GPC3 humana

Utilizando o ADNc de GPC3 humano de tipo selvagem como molde, preparou-se um ADNc por PCR de reunião ("assembly PCR") , no qual a Ser 495 e a Ser 509 foram substituídas por Ala. Um iniciador foi desenhado de forma que uma marca His pudesse ser adicionada à extremidade C. O ADNc resultante foi clonado no vector pCXND3. O ADN plasmídico de expressão preparado foi introduzido numa linha DXB11, seguido de selecção com geneticina numa concentração de 500 pg/ml, para obter uma linha de células CHO que expressa níveis elevados da forma solúvel da proteína central GPC3.

Efectuou-se uma cultura em grande escala num frasco rotativo de 1700 cm2, e o sobrenadante de cultura foi recolhido para purificação. O sobrenadante foi aplicado em Q Sepharose Fast Flow (Amersham CAT n.° 17-0510-01), lavado e eluido com um tampão fosfato contendo NaCl 500 mM. Subsequentemente, o produto foi purificado por afinidade utilizando Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham CAT n.° 17-0575-01) e eluido com um gradiente de imidazol 10-150 mM. Finalmente, o produto foi concentrado com Q Sepharose Fast Flow e eluido com um tampão fosfato contendo NaCl 500 mM. A electroforese em gel de poliacrilamida-SDS revelou uma banda tipo mancha com 50 a 300 kDa e uma banda de cerca de 40 kDa. A Fig. 2 mostra os resultados da electroforese. A proteína GPC3 é um proteoglicano de 69 kDa que possui adicionalmente uma sequência de adição de sulfato de heparano na extremidade C. Considerou-se que a banda tipo mancha corresponde a GPC3 modificada com sulfato de heparano. Os resultados da sequenciação de aminoácidos indicaram que a banda de cerca de 4 0 kDa tinha uma origem no fragmento N-terminal. Assim, antecipou-se que a proteína GPC3 estava mais ou menos clivada.

Para remover os anticorpos dirigidos contra o sulfato de heparano no rastreio subsequente do hibridoma, preparou-se a 27 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ forma solúvel da proteína central GPC3 em que a Ser 495 e a Ser 509 da sequência de adição de sulfato de heparano foram substituídas por Ala. A linha de células CHO expressando níveis elevados da proteína foi preparada como acima, e o sobrenadante de cultura foi purificado por afinidade utilizando a marca His. A electroforese em qel de poliacrilamida-SDS mostrou três bandas de 70 kDa, 40 kDa e 30 kDa. A sequenciação de aminoácidos indicou que a banda de 30 kDa era o fraqmento C-terminal de GPC3. O fraqmento C-terminal começa a partir da serina 359 ou da valina 375. Assim, antecipou-se que GPC3 sofreu alguma clivagem enzimática. A razão pela qual a banda de 30 kDa não foi observada na GPC3 do tipo sulfato de heparano adicionado foi o facto de o fragmento ter formado a banda tipo mancha devido à adição de sulfato de heparano. O facto de a proteína GPC3 sofrer uma clivagem enzimática ao nível de uma sequência de aminoácidos específica é uma constatação nova, mas o seu significado biológico ainda não foi elucidado.

Com base nos resultados, os inventores avançaram a hipótese de que a GPC3 existente na membrana, mesmo em doentes com hepatoma, seria clivada e segregada para o sangue como a forma solúvel. Comparada com a AFP como marcador do hepatoma, a expressão do gene GPC3 revelou-se mais elevada nos doentes com hepatoma nas fases mais precoces (Fig. 1). De modo a examinar a possibilidade de GPC3 ser um novo marcador tumoral com uma utilidade clínica superior à de AFP, preparou-se um anticorpo anti-GPC3 para construir um sistema ELISA tipo sanduíche como descrito no Exemplo 2 ou abaixo.

Preparação do anticorpo anti-GPC3

Como a homologia do GPC3 humano com o GPC3 de ratinho atinge 94% ao nível de aminoácidos, considerou-se que talvez fosse difícil obter o anticorpo anti-GPC3 através da imunização de um ratinho normal com GPC3 humano. Assim, utilizou-se o ratinho MRL/lpr com doença auto-imune como animal a imunizar. Imunizaram-se cinco ratinhos MRL/lpr (CRL) com a forma solúvel de GPC3. Para a primeira imunização, a proteína imunogénica foi ajustada a 100 pg/animal e depois foi emulsionada utilizando FCA (adjuvante completo de Freund (H37Ra), Difco (3113-60), Becton Dickinson (cat n.° 231131)), 28

ΕΡ 1 541 58 0/PT sendo em seguida administrada subcutaneamente aos ratinhos. Duas semanas mais tarde, a proteína foi ajustada a 50 pg/animal e emulsionada com FIA (adjuvante incompleto de Freund, Difco (0639-60), Becton Dickinson (cat n.° 263910)) para administração subcutânea aos ratinhos. A intervalos de uma semana depois disso, administraram-se reforços num total de 5 vezes. Para o reforço final, a proteína foi diluída com PBS para 50 pg/animal e foi administrada na veia da cauda. Através de ensaio ELISA utilizando uma imunoplaca revestida com a proteína central GPC3, confirmou-se a saturação do título de anticorpo sérico dirigido contra GPC3. Uma célula de mieloma murino P3U1 e um esplenócito de ratinho foram misturados para permitir a sua fusão celular na presença de PEG 1500 (Roche Diagnostics, cat n.° 783641) . A mistura resultante foi inoculada numa placa de cultura de 96 poços. A partir do dia seguinte, o hibridoma foi seleccionada com o meio HAT, e o sobrenadante de cultura foi rastreado por ELISA. Os clones positivos foram submetidos a monoclonagem pelo método de diluição limite. O monoclone resultante foi cultivado em maior escala, e o sobrenadante de cultura foi recolhido. O rastreio por ELISA foi efectuado utilizando como marcador a actividade de ligação à proteína central GPC3, obtendo-se seis clones de um anticorpo anti-GPC3 com uma potência de ligação forte. O anticorpo foi purificado utilizando HiTrap Protein G HP (Amersham CAT n.° 17-0404-01) . O sobrenadante de cultura do hibridoma foi aplicado directamente numa coluna, lavado com tampão de ligação (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0) e eluído com tampão de eluição (glicina-HCl 0,1 M; pH 2,7). O eluato foi recolhido para um tubo contendo tampão de neutralização (Tris-HCl 1M, pH 9,0) para neutralização imediata. Após reunião das fracções do anticorpo, a "pool" resultante foi dialisada contra Tween 20 a 0,05%/PBS durante a noite e durante um dia completo para substituição do tampão. Adicionou-se NaN3 ao anticorpo purificado para uma concentração de 0,02%. O anticorpo foi armazenado a 4°C.

Análise do anticorpo anti-GPC3 A concentração do anticorpo foi determinada por ensaio ELISA tipo sanduíche de IgG de ratinho, utilizando anticorpo 29 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ de cabra anti-IgG (gama) de ratinho (ZYMED CAT n.° 62-6600) e anticorpo de cabra anti-IgG (gama) de ratinho conjugado com fosfatase alcalina (ZYMED CAT n.° 62-6622), juntamente com um anticorpo IgGl de ratinho purificado e comercialmente disponível (ZYMED CAT n.° 02-6100) como padrão. A isotipagem do anticorpo anti-GPC3 foi efectuada com o kit de isotipagem de anticorpos monoclonais ImmunoPure II (PIERCE CAT n.° 37502) pelo método de acordo com o manual incluso. Os resultados da isotipagem indicaram que todos os anticorpos eram do tipo IgGl.

Através de análise de transferência de western utilizando a proteína central GPC3, classificaram-se os epitopos do anticorpo anti-GPC3. A forma solúvel da proteína central GPC3 foi aplicada num mini SDS-PAGE a 10% (TEFCO CAT n.° 01-075), a 100 ng/pista, para electroforese (60 V durante 30 min; 120 V durante 90 min) e subsequentemente transferida para membranas Immobilon-P (Millipore CAT n.° IPVH R85 10), utilizando a célula de transferência electroforética semi-seca Trans-Blot SD (BIO-RAD) (15 V durante 60 min). Após lavagem cuidadosa da membrana com TBS-T (Tween 20 a 0,05% em TBS) , a membrana foi agitada em TBS-T contendo leite magro a 5% durante uma hora (à temperatura ambiente) ou durante a noite (a 4°C) . Após agitação em TBS-T durante cerca de 10 minutos, adicionou-se cada anticorpo anti-GPC3 diluído com TBS-T contendo leite magro a 1%, numa concentração entre 0,1 e 10 pg/ml, durante uma hora com agitação. A membrana foi lavada com TBS-T (10 minutos x três vezes), agitada com anticorpo anti-IgG de ratinho conjugado com HRP (Amersham CAT n.° NA 931), diluído de 1:1000 com TBS-T contendo leite magro a 1%, durante uma hora e lavada com TBS-T (10 minutos x três vezes) . Utilizou-se ECL-Plus (Amersham RPN 2132) para a reacção cromogénica. Utilizou-se Hyperfilm ECL (Amersham CAT n.° RPN 2103K) para a detecção. A Fig. 4 apresenta os resultados da análise de transferência de western. Para a classificação, determinou-se que o anticorpo que reage com a banda de 40 kDa possui um epitopo na extremidade N, enquanto o anticorpo que reage com a banda de 30 kDa possui um epitopo na extremidade C. Como anticorpos que reconhecem o lado N-terminal, obteve-se M6B1, M18D4 e M19B11. Como anticorpos que reconhecem o lado C-terminal, obteve-se M3C11, M13B3 e M3B8. 30 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ

Os resultados da análise utilizando BIACORE indicaram que os valores de KD dos anticorpos individuais encontravam-se na gama de 0,2 a 17,6 nM.

Exemplo de referência 1

Detecção da forma segregada de GPC3

Modelo de xenoenxerto em ratinho 3.000.000 de células HepG2 de hepatoma humano foram transplantadas sob a pele abdominal de ratinhos SCID (Fox CHASE C.B-17/Icr-scidJcl, Japan Clair) e de ratinhos atimicos (nude) (BALB/cA Jcl-nu, Japan Clair) fêmea com 6 semanas de idade. 53 dias mais tarde, quando o tumor estava suficientemente formado, recolheu-se sangue completo da veia cava posterior dos ratinhos SCID transplantados com HepG2 n.os 1, 3 e 4. O plasma foi preparado na presença de EDTA-2Na e de aprotinina (tubo de recolha de sangue Nipro Neotube, NIPRO, NT-EA0205) e armazenado a -20°C até à data do ensaio. No caso do ratinho SCID transplantado com HepG2 n.° 2, o sangue completo foi recolhido 62 dias após o transplante de HepG2. No caso dos ratinhos atimicos transplantados com HepG2 n.os 1 e 2, o sangue completo foi recolhido 66 dias após o transplante de HepG2. Como controlo, preparou-se plasma a partir de ratinhos SCID normais da mesma idade usando os mesmos procedimentos.

Ensaio ELISA tipo sanduíche

De modo a detectar a forma segregada de GPC3 no sangue, construiu-se um sistema ELISA tipo sanduíche de GPC3. O anticorpo aplicado como revestimento numa placa de 96 poços foi M6B1. O anticorpo utilizado para detectar a proteína GPC3 ligada a M6B1 foi o anticorpo M18D4 marcado com biotina. Para a reacção cromogénica, utilizou-se AMPAK de DAKO para obter uma sensibilidade de detecção elevada.

Uma imunoplaca de 96 poços foi revestida com o anticorpo anti-GPC3 diluído em tampão de revestimento (NaHCCh 0,1M; pH 9,6; NaN3 a 0,02% (p/v) ) , numa concentração de 10 pg/ml, e incubada a 4°C durante a noite. No dia seguinte, a placa foi 31 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ lavada três vezes com 300 μΐ/poço de tampão de enxaguamento (Tween 20 a 0,05% (v/v) em PBS) e adicionaram-se 200 μΐ de tampão de diluição (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1; MgCl2 1 mM; NaCl 150 mM; Tween 20 a 0,05% (v/v), NaN3 a 0,02% (p/v) , BSA a 1% (p/v)) para bloqueio. Após armazenamento durante várias horas à temperatura ambiente ou a 4°C durante a noite, adicionou-se o plasma de ratinho ou o sobrenadante de cultura adequadamente diluídos em tampão de diluição e incubou-se à temperatura ambiente durante uma hora. Após lavagem três vezes com 300 μΐ/poço de tampão de enxaguamento, adicionou-se o anticorpo anti-GPC3 marcado com biotina e diluído em tampão de diluição, numa concentração de 10 pg/ml, e incubou-se à temperatura ambiente durante uma hora. Após lavagem três vezes com 300 μΐ/poço de tampão de enxaguamento, adicionou-se o conjugado estreptavidina-AP (fosfatase alcalina) (ZYMED), diluído de 1:1000 em tampão de diluição, e incubou-se à temperatura ambiente durante uma hora. Após lavagem cinco vezes com 300 μΐ/poço de tampão de enxaguamento, adicionou-se AMPAK (DAKO CAT n.° K6200) para a reacção cromogénica de acordo com o protocolo incluso e mediu-se a absorvância com um leitor de microplacas.

Para a biotinilação do anticorpo, utilizou-se o kit de marcação com biotina (CAT n.° 1 418 165) da Roche. Utilizou-se um software tipo folha de cálculo GlaphPad PRISM (GlaphPad software Inc. ver. 3.0) para calcular a concentração da forma solúvel de GPC3 numa amostra. A Fig. 5 ilustra o princípio do ensaio ELISA tipo sanduíche deste Exemplo.

Utilizando a forma solúvel purificada de GPC3, preparou-se uma curva padrão. Consequentemente, um sistema com um limite de detecção de vários nanogramas/ml pôde ser construído. A Fig. 6 ilustra uma curva padrão para o sistema ELISA tipo sanduíche de GPC3, utilizando M6B1 e M18D4. Utilizando o sistema, fez-se uma tentativa para detectar a forma segregada de GPC3 no sobrenadante de cultura de células HepG2 e no soro de um ratinho transplantado com células HepG2 de hepatoma humano. A forma segregada de GPC3 foi detectada no sobrenadante de cultura de HepG2 e no soro do ratinho transplantado com células HepG2 de hepatoma humano, enquanto a forma segregada de GPC3 estava abaixo do limite de detecção no meio de cultura de controlo e no soro de ratinho de 32 ΕΡ 1 541 68 0/PT controlo. Numa base de concentração da forma solúvel purificada de GPC3, a forma solúvel de GPC3 encontrava-se presente numa concentração de 1,2 pg/ml no sobrenadante de cultura de HepG2 e numa concentração de 23 a 90 ng/ml no soro de ratinho (Tabela 1).

Tabela 1

Análise da forma segregada de GPC3 no plasma de um ratinho transplantado com HepG2 (ng/ml)

Volume do tumor (mm3) M6B01(N)-M18D4(N) M19B11(N)-M18D4(N) M6B1(N)-BioM3Cll(C) M13B3(C)-BioM18D4(N) M13B3(C)-BioM3B8(C) Sobrenadante de cultura de HepG2 1190 1736 224 234 <1 Ratinho SCID transplantado com HepG2 n.° 1 2022 65, 4 76, 9 <10 <10 <10 Ratinho SCID transplantado com HepG2 n.° 2 1706 71,7 94,8 <10 <10 <10 Ratinho SCID transplantado com HepG2 n.° 3 2257 90, 3 113, 9 <10 <10 <10 Ratinho SCID transplantado com HepG2 n.° 4 2081 87, 3 107, 3 <10 15, 0 <10 Ratinho atimico transplantado com HepG2 n.° 1 1994 58, 7 53,6 19,7 35, 5 102,2 Ratinho atimico transplantado com HepG2 n.° 2 190 & 549 22,9 33, 6 <10 11, 5 40,6 Ratinho SCID normal η. ° 1 0 <10 <10 <10 <10 <10 Ratinho SCID normal n. ° 2 0 <10 <10 <10 <10 <10 Ratinho SCID normal n. ° 3 0 <10 <10 <10 <10 <10

Estrutura da forma segregada de GPC3

Examinou-se se a proteína GPC3 segregada para o sangue possui ou não a estrutura do fragmento N-terminal como 33

ΕΡ 1 541 68 0/PT preliminarmente assumido. No caso de a forma segregada de GPC3 ser o fragmento N-terminal, considera-se que a forma segregada de GPC3 não será detectada por um sistema ELISA tipo sanduíche com uma combinação de um anticorpo que reconhece a extremidade N e um anticorpo que reconhece a extremidade C. Utilizando três tipos de anticorpo que reconhece o fragmento N-terminal e três tipos de anticorpo que reconhece o fragmento C-terminal, construiram-se sistemas ELISA tipo sanduíche com várias combinações. A Fig. 7 ilustra a estrutura da forma segregada de GPC3 e a Fig. 8 mostra as combinações dos anticorpos. A Fig. 9 representa uma curva padrão do sistema ELISA tipo sanduíche. A Tabela 1 apresenta os resultados do ensaio. Como ilustrado na Tabela 1, a forma segregada de GPC3 foi detectada em níveis mais elevados no sobrenadante de cultura de células HepG2 e no soro de um ratinho transplantado com células HepG2 de hepatoma humano com combinações de anticorpos que reconhecem o fragmento N-terminal, enquanto foi detectada abaixo do limite de detecção em muitas amostras dos ratinhos com os sistemas contendo anticorpos que reconhecem o fragmento C-terminal. Assim, antecipou-se que a forma segregada de GPC3 compreende de modo dominante o fragmento N-terminal. Por conseguinte, sugeriu-se que a proteína GPC3 segregada para o sangue foi eventualmente detectada com uma sensibilidade elevada, mediante a utilização de um anticorpo dirigido contra a sequência de aminoácidos que compreende o resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 374 de GPC3.

Exemplo 3

Preparação de anticorpo quimérico ratinho-humano anti- GPC3

Utilizando o ARN total extraído de um hibridoma que produz um anticorpo capaz de se ligar à proteína GPC3 humana (anticorpo dirigido contra a GPC3 humana que reconhece a extremidade C: M3C11, M1E07; anticorpo dirigido contra a GPC3 humana que reconhece a extremidade N: M19B11, M18D04, M5B09, M10D02), amplificou-se o ADNc da região variável do anticorpo por RT-PCR. O ARN total foi extraído a partir de 1 χ 107 células de hibridoma usando kits RNeasy Plant Mini (fabricado por QIAGEN) . Utilizando 1 pg do ARN total e o kit de 34

ΕΡ 1 541 68 0/PT amplificação de ADNc SMART RACE (fabricado por CLONTECH), um oligonucleótido sintético MHC-IgGl (SEQ ID NO:7) complementar da sequência da região constante de IgGl de ratinho ou um oligonucleótido sintético capa (SEQ ID NO:8) complementar da sequência nucleotidica da região constante da cadeia κ de ratinho, amplificou-se um fragmento 5'-terminal do gene. A transcrição inversa foi efectuada a 42°C durante uma hora e trinta minutos. 50 μΐ da solução de PCR continham 5 μΐ de tampão de PCR Advantage 2 lOx, 5 μΐ da mistura Universal Primer A lOx, dNTP 0,2 mM (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) , 1 μΐ de mistura de polimerases Advantage 2 (todos fabricados por CLONTECH), 2,5 μΐ do produto da transcrição inversa e 10 pmole do oligonucleótido sintético MHC-IgGl ou kappa. Após a temperatura inicial a 94°C durante 30 segundos, efectuaram-se cinco ciclos consistindo em 5 segundos a 94°C e 3 minutos a 72°C; cinco ciclos consistindo em 5 segundos a 94°C, 10 segundos a 70°C e 3 minutos a 72°C; e 25 ciclos consistindo em 5 segundos a 94°C, 10 segundos a 68°C e 3 minutos a 72°C. Finalmente, o produto de reacção foi aquecido a 72°C durante 7 minutos. Após os produtos individuais de PCR terem sido purificados a partir do gel de agarose utilizando o kit de extracção a partir de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN), os produtos foram clonados no vector pGEM-T Easy (fabricado por Promega), e a sequência nucleotidica foi determinada.

Em seguida, as sequências das regiões variáveis da cadeia H e da cadeia L foram ligadas às regiões constantes da cadeia H e da cadeia L humanas. A reacção de PCR foi efectuada utilizando um oligonucleótido sintético que é complementar da sequência nucleotidica 5'-terminal da região variável da cadeia H de cada anticorpo e possui uma sequência de Kozak e um oligonucleótido sintético que é complementar da sequência nucleotidica 3'-terminal e possui um local Nhel. Os produtos de PCR resultantes foram clonados num vector pB-CH possuindo a região constante de IgGl humana inserida no vector pBluescript KS+ (produzido por TOYOBO). A região variável da cadeia H de ratinho e a região constante da cadeia H (cadeia γΐ) humana são ligadas através do local Nhel. O fragmento génico da cadeia H preparado foi clonado num vector de expressão pCXND3. O esquema da construção do vector pCXND3 está descrito abaixo. De modo a separar o gene que codifica a cadeia H do anticorpo e a sequência do vector 35

ΕΡ 1 541 68 0/PT de DHFR-ÀE-rvH-PMl-f (ver WO 92/19759), o vector foi digerido nos locais das enzimas de restrição EcoRI/Smal para recuperar somente a sequência do vector. Subsequentemente, a sequência do vector foi clonada no adaptador EcoRI-NotI-BamHI (produzido por Takara Shuzo Co., Ltd.). Este vector foi designado por pCHOl. Uma região de pCHOl que expressa o gene DHFR foi clonada em pCXN no local da enzima de restrição HindIII (Niwa et al., Gene 1991, 108: 193-200) . O vector resultante foi designado por pCXND3. As sequências nucleotidicas das cadeias H dos anticorpos quiméricos ratinho-humano anti-GPC3 (M3C11, M1E07, M19B11, M18D04) contidas em cada plasmideo estão apresentadas nas SEQ ID NOS: 9, 11, 13 e 15, respectivamente. As suas sequências de aminoácidos estão apresentadas nas SEQ ID NOS: 10, 12, 14 e 16, respectivamente. Adicionalmente, a reacção de PCR foi efectuada utilizando um oligonucleótido sintético que é complementar da sequência nucleotidica 5'-terminal da região variável da cadeia L de cada anticorpo e possui uma sequência de Kozak e um oligonucleótido sintético que é complementar da sequência nucleotidica 3'-terminal e possui um local BsiWI. Os produtos de PCR resultantes foram clonados num vector pB-CL, em que a região constante da cadeia capa humana foi previamente inserida no vector pBluescript KS+ (produzido por TOYOBO). A região variável da cadeia L humana e a região constante foram ligadas através do local BsiWI. O fragmento génico da cadeia L preparado foi clonado num vector de expressão pUCAG. O vector pUCAG é um vector preparado pela digestão de pCXN (Niwa et al., Gene 1991: 108: 193-200) com a enzima de restrição BamHI para obter um fragmento de 2,6 kpb, que é depois clonado no local da enzima de restrição BamHI do vector pUC19 (produzido por TOYOBO). As sequências nucleotidicas das cadeias L dos anticorpos quiméricos ratinho-humano anti-GPC3 (M3C11, M1E07, M19B11, M18D04) contidas em cada plasmideo estão apresentadas nas SEQ ID NOS: 17, 19, 21 e 23, respectivamente. As suas sequências de aminoácidos estão apresentadas nas SEQ ID NOS: 18, 20, 22 e 24, respectivamente.

De modo a preparar um vector de expressão do anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3, um fragmento génico obtido por digestão do vector pUCAG, que contém o fragmento génico da cadeia L inserido, com a enzima de restrição 36 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ

HindiII (produzida por Takara Shuzo Co., Ltd.) foi clonado no local de clivagem da enzima de restrição HindiII de pCXND3, que contém o gene da cadeia H inserido. 0 plasmideo expressará o gene de resistência à neomicina, o gene DHFR e o gene do anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3 em células animais.

Preparou-se uma linha celular à base de células CHO para expressão estável (linha DG44) da seguinte forma. 0 gene foi introduzido pelo método de electroporação utilizando Gene PulserlI (produzido por Bio Rad) . 25 pg de cada vector de expressão do anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3 e 0,75 ml de células CHO (1 x 107 células/ ml) suspensas em PBS foram misturados e arrefecidos em gelo durante 10 minutos, sendo depois transferidos para uma cuvete e recebendo um impulso a 1,5 kV e 25 pFD. Após um período de recuperação de 10 minutos à temperatura ambiente, as células tratadas por electroporação foram suspensas em 40 ml de um meio de cultura CHO-S-SFMII (produzido por Invitrogen) contendo suplemento HT lx (produzido por Invitrogen). Preparou-se uma diluição de 50x utilizando o mesmo meio de cultura e adicionou-se a uma placa de cultura de 96 poços, numa quantidade de 100 μΐ/poço. Após cultura num incubador de CO2 (5% de CO2) durante 24 horas, adicionou-se geneticina (produzida por Invitrogen) numa concentração de 0,5 mg/ml e prosseguiu-se a cultura durante 2 semanas. A IgG presente no sobrenadante de cultura dos poços contendo colónias de uma célula transformante resistente a geneticina foi analisada pelo método de determinação da concentração que se segue. Uma linha celular de produtividade elevada foi expandida em larga escala. A linha celular que expressa o anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3 de forma estável foi cultivada em grande escala, e o sobrenadante de cultura foi recolhido. A concentração de IgG no sobrenadante de cultura foi determinada por ensaio ELISA tipo sanduíche de IgG humana, utilizando anticorpo de cabra anti-IgG humana (produzido por BIOSORCE) e anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com fosfatase alcalina (produzido por BIOSORCE), e comparada com a IgG humana purificada disponível comercialmente (produzida por Cappel). 37 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ

Cada anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3 foi purificado utilizando HiTrap Protein G HP (produzida por Amersham). 0 sobrenadante de cultura de uma linha de células CHO que produz o anticorpo quimérico ratinho-humano anti-GPC3 foi aplicado directamente numa coluna e eluido com tampão de eluição (glicina-HCl 0,1 M; pH 2,7) . O eluato foi recolhido para um tubo contendo tampão de neutralização (Tris-HCl 1M; pH 9,0) para neutralização imediata. As fracções de anticorpo foram reunidas e dialisadas contra Tween 20 a 0,05% em PBS durante a noite e durante um dia completo para substituir o tampão. Adicionou-se NaN3 ao anticorpo purificado para uma concentração de 0,02% e armazenou-se a 4°C.

Exemplo 4

Preparação de uma linha de células CHO que expressa a proteína GPC3 completa de forma estável O ADNc da proteína GPC3 humana foi obtido por digestão do vector pGEM-T Easy, que contém o ADNc de GPC3 humano completo, com a enzima de restrição EcoRI (produzida por Takara Shuzo Co., Ltd.) e clonado num vector de expressão pC0S2. 0 esquema da construção do vector pCOS2 está descrito abaixo. De modo a separar o gene da cadeia H do anticorpo de DHFR-AE-rvH-PMl-f (ver WO 92/19759) do vector, o vector foi digerido nos locais das enzimas de restrição EcoRI/Smal para recuperar apenas a sequência do vector. Subsequentemente, a sequência do vector foi clonada no adaptador EcoRI-NotI-BamHI (produzido por Takara Shuzo Co., Ltd.). Este vector foi designado por pCHOl. Uma região de pCHOl que expressa o gene DHFR foi removida, na qual a sequência do gene de resistência à neomicina em HEF-VH-gYl (Sato et al., Mol. Immunol. 1994: 31: 371-381) foi inserida. O vector foi designado por pCOS2.

Uma linha celular que expressa a proteína GPC3 humana completa de forma estável foi preparada da forma que se segue. 10 μΐ do vector que expressa o gene GPC3 humano completo e 60 μΐ de SuperFect (produzido por QIAGEN) foram misturados para formar um complexo, que foi depois adicionado a uma linha de células CHO DXB11 para introduzir o gene. Após cultura num incubador de CO2 (5 % de CO2) durante 24 horas, utilizou-se meio oMEM (produzido por GIBCO BRL) contendo 38 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ geneticina (produzida por Invitrogen) numa concentração final de 0,5 mg/ml e FBS a 10% (produzido por GIBCO BRL) para iniciar a selecção. As colónias resultantes resistentes a geneticina foram recolhidas, e a clonagem celular foi efectuada pelo método de diluição limite. Os clones de células individuais foram solubilizados para confirmar a expressão da proteína GPC3 humana completa por transferência de western, utilizando o anticorpo anti-GPC3. Obteve-se uma estirpe celular que expressa de forma estável a proteína GPC3 humana.

Exemplo 5

Ensaio de ADCC utilizando CMSP derivadas de sangue periférico humano (1) Preparação de CMSP humanas 0 sangue periférico foi recolhido a partir de sujeitos normais com seringas heparinizadas, diluído 2 vezes com PBS (-) e aplicado sobre Ficoll-Paque”PLUS (Amersham Pharmacia Biotech AB) . Este foi centrifugado (500 xg, 30 minutos, 20°C), e a camada intermédia foi recolhida como uma fracção de células mononucleares. Após lavar três vezes, a fracção resultante foi suspensa em FBS a 10%/RPMI para preparar uma solução de CMSP (células mononucleares de sangue periférico) humanas. (2) Preparação da célula-alvo

As células HepG2 cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 contendo FBS a 10% foram destacadas da placa utilizando tripsina-EDTA (Invitrogen Corp), divididas pelos poços de uma placa de 96 poços de fundo em U (Falcon) , numa quantidade de 1 x 104 células/poço, e cultivadas durante 2 dias. Após a cultura, adicionou-se crómio-51 (5,55 MBq) e as células foram incubadas num incubador com 5% de C02 a 37 °C durante uma hora. As células resultantes foram lavadas uma vez com o meio de cultura e adicionaram-se 50 μΐ de meio de cultura RPMI 1640 contendo FBS a 10% para preparar uma célula-alvo. 39

ΕΡ 1 541 68 0/PT (3) Ensaio de libertação de crómio (actividade ADCC)

Adicionaram-se 50 μΐ de uma solução de anticorpo com diferentes concentrações à célula-alvo em gelo durante 15 minutos. Subsequentemente, adicionaram-se 100 μΐ de uma solução de CMSP humanas (5 x 105 células/poço) e incubou-se num incubador com 5% de C02 a 37 °C durante 4 horas. Após a incubação, a placa foi centrifugada, e a radioactividade em 100 μΐ do sobrenadante de cultura foi contada num contador gama. A razão de libertação especifica do crómio foi determinada pela seguinte fórmula:

Razão de libertação especifica crómio (%) = (A-C) x 100/(B-C) "A" representa o valor da radioactividade média (cpm) em cada poço; "B" representa o valor da radioactividade média (cpm) num poço onde se adicionaram 100 μΐ de solução aquosa de NP-40 a 2% (Nonidet P-40, Código n.° 252-23, Nakarai Tesque) e 50 μΐ de meio de cultura RPMI contendo FBS a 10% à célula-alvo; e "C" representa o valor da radioactividade média (cpm) num poço onde se adicionaram 150 μΐ de meio de cultura RPMI contendo FBS a 10% à célula-alvo. O teste foi efectuado em triplicado para calcular a média da actividade ADCC (%) e o erro padrão.

Os resultados estão apresentados na Fig. 10. Entre os seis tipos de anticorpos quiméricos anti-GPC3, os anticorpos ch.M3Cll e ch.MlE07 que reconhecem a extremidade C mostraram actividade ADCC, ao passo que os anticorpos ch.M19Bll, ch.M18D04, ch.M5E09 e ch.M10D02 que reconhecem a extremidade N revelaram pouca actividade ADCC. Os resultados acima indicam que as actividades ADCC dos anticorpos quiméricos dependem dos locais de reconhecimento dos anticorpos. Além disso, esperava-se que os anticorpos que reconhecem a extremidade C de GPC3 fossem eventualmente úteis em aplicações clinicas, uma vez que os anticorpos que reconhecem os lados C-terminais em relação aos locais de clivagem mostraram actividade ADCC. 40

ΕΡ 1 541 68 0/PT

Exemplo 6

Ensaio de actividade citotóxica dependente do complemento (actividade CDC) (1) Preparação de tampão veronal contendo albumina humana (HAVB) 12,75 g de NaCl (qualidade superior; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); 0,5625 g de Na-barbital (qualidade superior; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e 0,8625 g de barbital (qualidade superior; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foram dissolvidos em água Milli Q para 200 ml e autoclavados (121°C, 20 minutos). Adicionaram-se 100 ml de água Milli Q autoclavada quente. Em seguida, confirmou-se que a mistura resultante tinha um pH de 7,43 (pH 7,5 é o valor recomendado). Esta mistura foi definida como sendo o tampão veronal 5x. 0,2205 g de CaCl2.2H20 (qualidade superior; Wako

Pure Chemical Industries, Ltd.) foram dissolvidos em 50 ml de água Milli Q para uma concentração de 0,03 mol/1. A solução resultante foi definida como sendo a solução de CaCl2. 1,0165 g de MgCl2.6H20 (qualidade superior; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foram dissolvidos em 50 ml de água Milli Q para 0,1 mol/1. A solução resultante foi definida como sendo a solução de MgCl2. 100 ml de tampão veronal 5x, 4 ml de albumina sérica humana (BuminateR a 25%, concentração de albumina sérica humana de 250 mg/ml, Baxter), 2,5 ml da solução de CaCl2, 2,5 ml da solução de MgCl2, 0,1 g de KC1 (qualidade superior; Wako Pure Chemical Industries , Ltd.) e 0,5 g de glucose (D(+)-glucose, glucose anidra, qualidade superior; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foram dissolvidos em água Milli Q para 500 ml. Esta solução foi definida como sendo o tampão HAVB. Após filtração e esterilização, a solução resultante foi armazenada a uma temperatura definida de 5°C. (2) Preparação da célula-alvo A célula CHO expressando GPC3 na membrana celular, tal como preparada no Exemplo 4, foi cultivada em meio de cultura alfa-MEM (+)-ácido nucleico (GIBCO) suplementado com FBS a 10% e geneticina numa concentração de 0,5 mg/ml (GIBCO), 41 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ destacada da placa utilizando um tampão para dissociação de células (Invitrogen Corp) e dividida pelos poços de uma placa de fundo plano de 96 poços (Falcon) , numa quantidade de 1 x 104 células/poço, para cultura durante 3 dias. Após a cultura, adicionou-se crómio-51 (5,55 MBq) e as células foram incubadas num incubador com 5% de CO2 a 37 °C durante uma hora. A célula resultante foi enxaguada duas vezes com tampão HAVB e adicionaram-se 50 μΐ de tampão HAVB para preparar uma célula-alvo. (3) Ensaio de libertação de crómio (actividade CDC)

Cada anticorpo quimérico foi diluído em tampão HAVB para preparar uma solução de anticorpo com uma concentração de 40 pg/ml. A solução de anticorpo foi adicionada à célula-alvo num volume de 50 μΐ, deixando-se depois em gelo durante 15 minutos. Subsequentemente, adicionou-se complemento de coelho bebé (Cedarlane) diluído em tampão HAVB, em porções de 100 μΐ, a cada poço para uma concentração final de 30% (concentração final de anticorpo de 10 pg/ml) e incubou-se num incubador com 5% de CO2 a 37°C durante 90 minutos. Após centrifugação da placa, recuperou-se uma porção de 100 μΐ do sobrenadante de cada poço, e a radioactividade foi medida com um contador gama. A razão de libertação específica do crómio foi determinada pela seguinte fórmula:

Razão de libertação específica crómio (%) = (A-C) x 100/(B-C) "A" representa o valor da radioactividade média (cpm) em cada poço; "B" representa o valor da radioactividade média (cpm) num poço onde se adicionaram 100 μΐ de solução aquosa de NP-40 a 2% (Nonidet P-40, Código n.° 252-23, Nakarai

Tesque) e 50 μΐ de HAVB à célula-alvo; e "C" representa o valor da radioactividade média (cpm) num poço onde se adicionaram 150 μΐ de HAVB à célula-alvo. O teste foi efectuado em triplicado para calcular a média da actividade CDC (%) e o erro padrão.

Os resultados estão apresentados na Fig. 11. Entre os seis tipos de anticorpos quiméricos anti-GPC3, os anticorpos ch.M3Cll e ch.MlE07 que reconhecem a extremidade C mostraram actividade CDC, enquanto os anticorpos ch.M19Bll, ch.M18D04, 42

ΕΡ 1 541 68 0/PT ch.M5E09 e ch.Ml0D02 que reconhecem a extremidade N apresentaram actividades CDC baixas. Os resultados acima indicam que as actividades CDC dos anticorpos quiméricos dependem dos locais de reconhecimento dos anticorpos. Além disso, esperava-se que os anticorpos que reconhecem a extremidade C de GPC3 fossem eventualmente úteis em aplicações clinicas, uma vez que os anticorpos que reconhecem os lados C-terminais em relação aos locais de clivagem mostraram actividade CDC.

Aplicabilidade industrial

Como ilustrado nos Exemplos, foi sugerido que uma porção da proteína GPC3 grandemente expressa em células de hepatoma pudesse existir como uma forma segregada no sangue. Observa-se que a proteína GPC3 é expressa em linhas celulares de cancro distintas de linhas celulares de hepatoma, tais como o cancro do pulmão, o cancro do cólon, o cancro da mama, o cancro da próstata, o cancro pancreático e o linfoma. Caso se utilizem anticorpos reconhecendo o fragmento C-terminal com actividade ADCC e/ou actividade CDC para tratar o hepatoma, os anticorpos podem atingir eficazmente a célula de hepatoma sem serem detidos pela forma segregada de GPC3 presente no sangue. Assim, estes anticorpos são úteis como agentes de disrupção das células cancerosas e como agentes anticancerosos. O conteúdo de todas as publicações referidas neste fascículo está integralmente incluído no fascículo. Adicionalmente, um perito na técnica compreenderá facilmente que são possíveis várias modificações e variações do invento sem um afastamento do âmbito técnico e da amplitude do invento descritos nas reivindicações anexas. O invento pretende também abranger estas modificações e variações. 43

ΕΡ 1 541 58 0/PT

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> ANTICORPO DIRIGIDO CONTRA PÉPTIDO C-TERMINAL DE GPC3

<130> N.94176 GCW <140> EP 03794236.4 <141> 04-09-2003 <150> PCT/JP03/11318 <151> 04-09-2003 <150> PCT/JP02/08999 <151> 04-09-2002 <160> 24 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: ADN sintético <400> 1 gatatcatgg ccgggaccgt gcgcaccgcg t 31

<210> 2 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: ADN sintético <400> 2 gctagctcag tgcaccagga agaagaagca c 31 44

ΕΡ 1 541 68 0/PT <210> 3 <211> 2300 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (109) . . (1851 <400> 3 cagcacgtct cttgctcctc agggccactg ccaggcttgc cgagtcctgg gactgctctc 60 gctccggctg ccactctccc gcgctctcct agctccctgc gaagcagg atg gcc ggg 11"?

Met Ala Gly 1 acc gtg cgc acc gcg tgc ttg gtg gtg gcg atg ctg ctc age ttg gac 165

Thr Vai Arg Thr Ala Cys Leu Vai Vai Ala Met Leu Leu Ser Leu ftsp 5 10 15 ttc ccg gga cag geg cag ccc ccg ccg ccg ccg ccg gac gcc acc tgt 213 45 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ

Phe Pro Gly 20 cac caa gtc His Gin Val gtg cca gaa Vai Pro Glu aag ggc cca Lys Gly Pro 70 aca gea cga Thr Ala Arg 85 ctc aag ttc Leu Lys Phe 100 gaa att gtt Glu Ile Val aac aac tac Asn Asn Tyr ttt ttc aca Phe Phe Thr 150 gat gac atg Asp Asp Met 165 acc cag cta TV-, _» X U X Gin Leu 180 gag tgc ctc Glu Cys Leu ccc aag ctt Pro Lys Leu ate ttc Ctt lie Phe Leu 230 gat cac ctg Asp His Leu 245 tgg tac tgc Trp Tyr Cys 260 ggt tac tgc Gly Tyr Cys att gac aag Ile Asp Lys aat ggc atg Asn Gly Met 310 ttt tea aca Phe Ser Thr 325 aag ctg acc Lys Leu Thr

Gin Ala Gin 25 ege tcc ttc Arg Ser 40 Phe act ccc gtg Thr 55 Pro Val aca tgc tgc Thr Cys Cys ttg aac atg Leu Asn Met tta att att Leu Ile Ile 105 gtt ege cat val Arg 120 His cca age ctg Pro 135 Ser Leu gat gtg tet Asp Val Ser gtc aat gaa Val Asn Glu atg aac cca Met Asn Pro 185 cga gga gea Arg Gly 200 Ala att atg acc Ile 215 Met Thr cag gct ctg Gin Ala Leu aag ttc agt Lys Phe Ser tet tac tgc Ser Tyr Cys 265 aat gtg gtc Asn val 280 Val tac tgg aga Tyr 295 Trp Arg tac aga ate Tyr Arg Ile ate cat gat Ile His Asp acc act att Thr Thr Ile

Pro Pro Pro ttc cag aga Phe Gin Arg cca gga tea Pro Gly Ser 60 tea aga aag Ser Arg Lys 75 gaa cag ctg Glu Gin Leu 90 cag aat gct Gin Asn Ala gee aag aac Ala Lys Asn act cca caa Thr Pro Gin 140 ctc tac ate Leu Tyr Ile 155 ttg ttt gac Leu Phe Asp 170 ggc ctg cct Gly L»cij Pro aga cgt gac Arg Arg Asp cag gtt tcc Gin Val Ser 220 aat ctt gga Asn Leu Gly 235 aag gac tgt Lys Asp Cys 250 cag gga ctg Gin Gly Leu atg caa ggc Met Gin Gly gaa tac att Glu Tyr Ile 300 tat gac atg Tyr Asp Met 315 tet ate cag Ser Ile Gin 330 ggc aag tta Gly Lys Leu

Pro Pro Pro 30 ctg cag CCC Leu Gin Pro 45 gat ttg caa Asp Leu Gin atg gaa gaa Met Glu Glu ctt cag tet Leu Gin Ser 95 gcg gtt ttc Ala Val Phe 110 tac acc aat Tyr Thr Asn 125 gct ttt gag Ala Phe Glu ttg ggt tet Leu Gly Ser age ctg ttt Ser Leu Phe 175 gat tea gee Asp Sêí Ala 190 ctg aaa gta Leu Lys Val 205 aag tea ctg Lys Ser Leu att gaa gtg Ile Glu Val ggc cga atg Gly Arg Met 255 atg atg gtt Met Met Val 270 tgt atg gea Cys Met Ala 285 ctg tcc ctt Leu Ser Leu gag aac gta Glu Asn Val tat gtc cag Tyr Val Gin 335 tgt gee cat Cys Ala His

Asp Ala Thr gga ctc aag Gly Leu Lys 50 gta tgt ctc Val Cys Leu 65 aaa tac caa Lys Tyr Gin 80 gea agt atg Ala Ser Met caa gag çcc Gin Glu Ala gee atg ttc Ala Met Phe 130 ttt gtg ggt Phe Val Gly 145 gac ate aat Asp Ile Asn 160 cca gtc ate Pro Val Ile ttg gac ate Leu Asp Ile ttt ggg aat Phe Gly Asn 210 caa gtc act Gin Val Thr 225 ate aac aca Ile Asn Thr 240 ctc acc aga Leu Thr Arg aaa ccc tgt Lys Pro Cys ggt gtg gtg Gly Val Val 290 gaa gaa ctt Glu Glu Leu 305 ctg ctt ggt Leu Leu Gly 320 aag aat gea Lys Asn Ala tet caa caa Ser Gin Gin

Cys 35 tgg Trp 261 cct Pro 309 cta Leu 357 gag Glu 405 ttt Phe 115 453 aag Lys 501 gaa Glu 549 gta Val 597 tat Tyr 645 aat Asn 195 693 ttc Phe 741 agg Arg 789 act Thr 837 atg Met 885 ggc Gly 275 933 gag Glu 981 gtg Val 1029 ctc Leu 1077 gga Gly 1125 ege Arg 1173 46 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ 340 345 350 355 caa tat aga tet gct tat tat cct gaa gat ctc ttt att gac aag aaa 1221 Gin Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile ASp Lys Lys 360 365 370 gta tta aaa gtt gct cat gta gaa cat gaa gaa acc tta tcc age cga 1269 Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg 375 380 385 aga agg gaa cta att cag aag ttg aag tet ttc ate age ttc tat agt 1317 Arg Arg Glu Leu Ile Gin Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser 390 395 400 gct ttg cct ggc tac ate tgc age cat age cct gtg gcg gaa aac gac 1365 Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp 405 410 415 ac c ctt tgc tgg aat gga caa gaa ctc gtg gag aga tac age caa aag 1413 Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gin Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gin Lys 420 425 430 435 gca gca agg aat gga atg aaa aac cag ttc aat ctc cat gag ctg aaa 1461 Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gin Phe Asn Leu His Glu Leu Lys 440 445 4 50 atg aag ggc cct gag cca gtg gtc agt caa att att gac aaa ctg aag 1509 Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gin Ile Ile Asp Lys Leu Lys 455 460 4 65 cac att a ac cag ctc ctg aga acc atg tet atg ccc aaa ggt aga gtt 1557 His Ile Asn Gin Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val 470 475 480 ctg gat aaa aac ctg gat gag gaa ggg ttt gaa agt gga gac tgc ggt 1605 Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly 485 490 495 gat gat gaa gat gag tgc att gga ggc tet ggt gat gga atg ata aaa 1653 Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys 500 505 510 515 gtg aag aat cag ctc ege ttc ctt gca gaa ctg gee tat gat ctg gat 1701 Val Lys Asn Gin Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp 520 525 530 gtg gat gat gcg cct gga aac agt cag cag gca act ccg aag gac aac 1749 Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gin Gin Ala Thr Pro Lys Asp Asn 535 540 545 gag ata age acc ttt cac aac ctc ggg aac gtt cat tcc ccg ctg aag 1797 Glu lie Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn val His Ser Pro Leu Lys 550 555 560 ctt ctc acc age atg gee ate teg gtg gtg tgc ttc ttc ttc ctg gtg 1845 Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe Phe Leu Val 565 570 575 cac tga ctgcctggtg cccagcacat gtgctgccct : acagcaccct gtggtcttcc 1901

His 580 tcgataaaçg gaaccacttt cttatttttt tctatttttt tttttttgtt atcctgtata 1961 cctcctccag ccatgaagta gaggactaac catgtgttat gttttcgaaa atcaaatggt 2021 atcttttgga ggaagataca ttttagtggt agcatataga ttgtcctttt gcaaagaaag 2081 aaaaaaaacc atcaagttgt gccaaattat tctcctatgt ttggctgcta gaacatggtt 2141 accatgtctt tctctctcac tccctccctt tctatcgttc tctctttgca tggatttctt 2201 tgaaaaaaaa taaattgctc aaataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2261 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2300<210> 4 <211> 580 <212> PRT<213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Gly Thr Vai Arg Thr Ala Cys Leu Vai Vai Ala Met Leu Leu 15 47

ΕΡ 1 541 68 0/PT 1 Ser Leu Asp Phe Ala Thr Cys 20 His Leu Lys 35 Trp Vai Cys 50 Leu Pro Lys 65 Tyr Gin Leu Thr Ser Met Glu Leu Glu Ala Phe 100 Glu Met Phe 115 Lys Asn Vai 130 Gly Glu Phe 145 Ile Asn Vai Asp Vai Ile Tyr Thr Asp Ile Asn 180 Glu Gly Asn 195 Phe Pro Vai 210 Thr Arg Ile 225 Asn Thr Thr Asp Thr Arg Met Trp Pro Cys Gly 260 Gly Vai Vai 275 Glu Ile Glu 290 Leu Vai Asn 305 Leu Gly Leu Phe Asn Ala Gly Lys Gin Gin Arg 340 Gin Asp Lys 355 Lys Vai Ser 370 Ser Arg Arg 385 Phe Tyr Ser Ala Glu Asn Asp Thr Ser Gin Lys 420 Ala Glu Leu 435 Lys Met Lys 450 Leu Lys His 465 Gly Arg Vai Leu 5 Pro Gly Gin Ala Gin Vai Arg Ser 40 Pro Glu Thr 55 Pro Gly Pro 70 Thr Cys Ala 85 Arg Leu Asn Lys Phe Leu Ile Ile Val Val Arg 120 Asn Tyr Pro 135 Ser Phe Thr 150 Asp Val Asp 165 Met Val Asn Gin Leu Met Asn Cys Leu Arg Gly 200 Lys Leu Ile 215 Met Phe Leu 230 Gin Ala His 245 Leu Lys Phe Tyr Cys Ser Tyr Tyr Cys Asn Val 280 Asp LyS Tyr 295 Trp Gly Met 310 Tyr Arg Ser 325 Thr Ile His Leu Thr Thr Thr Tyr Arg Ser Ala 360 Leu Lys Val 375 Ala Arg Glu 390 Leu Ile Leu 405 Pro Gly Tyr Leu Cys Trp Asn Ala Arg Asn Gly 440 Lys Gly Pro 455 Glu Ile Asn 470 Gin Leu Asp 485 Lys Asn Leu 10 Gin 25 Pro Pro Pro Phe Phe Gin Arg Val Pro Gly Ser 60 Cys Ser Arg 75 Lys Met Glu 90 Gin Leu Ile 105 Gin Asn Ala His Ala Lys Asn Leu Thr Pro Gin 140 Ser Leu Tyr 155 Ile Glu Leu 170 Phe Asp Pro 185 Gly Leu Pro Ala Arg Arg Asp Thr Gin Val Ser 220 Leu Asn Lêu 235 Gly Ser Lys 250 Asp Cys Cys 2 65 Gin Gly Leu Val Met Gin Gly Arg Glu Tyr Ile 300 Ile Tyr Asp 315 Met Asp Ser 330 Ile Gin Ile 345 Gly Lys Leu Tyr Tyr Pro Glu His Val Glu His 380 Gin Lys Leu 395 Lys Ile Cys 410 Ser His Gly 425 Gin Glu Leu Met Lys Asn Gin Pro Val Val Ser 4 60 Leu Arg Thr 475 Met Asp Glu 490 Glu Gly

Pro Pro 30 Pro Asp Leu 45 Gin Pro Gly Asp Leu Gin Val Met Glu Glu Lys 80 Leu Gin Ser 95 Ala Ala Val 110 Phe Gin Tyr 125 Thr Asn Ala Ala Phe Glu Phe Leu Gly Ser Asp 160 Ser Leu Phe 175 Pro Asp Ser 190 Ala Leu Leu 205 Lys Val Phe Lys Ser Leu Gin Ile Glu Val Ile 240 Gly Arg Met 255 Leu Met Met 270 Val Lys Cys 285 Met Ala Gly Leu Ser Leu Glu Glu Asn Val Leu 320 Tyr Val Gin 335 Lys Cys Ala 350 His Ser Asp 365 Leu Phe Ile Glu Glu Thr Leu Ser Phe Ile Ser 400 Ser Pro Val 415 Ala val Glu 430 Arg Tyr Phe 445 Asn Leu His Gin Ile Ile Asp Ser Met Pro Lys 4 60 Phe Glu Ser 495 Gly 48

ΕΡ 1 541 58 0/PT 48 ΕΡ 1 541 58 0/PT Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly 500 505 510 Met Ile Lys Vai Lys Asn Gin Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr 515 520 525 Asp Leu Asp Vai Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gin Gin Ala Thr Pro 530 535 540 Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Vai His Ser 545 550 555 560 Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Vai Vai Cys Phe Phe 565 570 575 Phe Leu Vai His 580

<210> 5 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: ADN sintético <400> 5 atagaattcc accatggccg ggaccgtgcg c 31

<210> 6 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: ADN sintético <400> 6 ataggatccc ttcagcgggg aatgaacgtt c 31

<210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: ADN sintético <400> 7 21 gggccagtgg atagacagat g 49 ΕΡ 1 541 58 0/PT <210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artifici <400> 8 gctcactgga tggtgggaag atg <210> 9 <211> 1392 <212> ADN <213> Artificial Sequence <22 0> <221> CDS <222> (1)..(1389) <22 0> <223> Descrição da sequência artifici ratinho-humano (cadeia H de M3C11) 1: ADN sintético 23 1: Anticorpo quimérico <400> 9 50 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ atg aac ttc ggg ctc acc ttg att ttc ctt gtc ctt act tta aaa ggt 48 Met Asn Phe Gly Leu Thr Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtg caa ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg aag 96 val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 cct gga gga tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc 144 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt cg c tat gcc atg tct tgg gtt ege cag att cca gag aag ata ctg 192 Ser Arg Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ile Pro Glu Lys Ile Leu 50 SS 60 gag tgg gtc gca gcc att gat agt agt ggt ggt gac acc tac tat tta 240 Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Ser Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 gac act gtg aag gac cga ttc acc ate tcc aga gac aat gcc aat aat 288 Asp Thr Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn 85 90 95 acc ctg cac Ctg caa atg ege agt ctg agg tct gag gac aca gcc ttg 336 Thr Leu His Leu Gin Met Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu 100 105 110 tat tac tgt gta aga cag ggg ggg gct tac tgg ggc caa ggg act ctg 384 Tyr Tyr Cys Val Arg Gin Gly Gly Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 120 125 gtc act gtc tct gca gct age acc aag ggc cca teg gtc ttc ccc ctg 432 Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe Pro L€U 130 135 140 gca ccc tcc tcc aag age acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc 480 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 145 150 155 160 ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg teg tgg aac tca 528 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 165 170 175 ggc gcc ctg acc age ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc 576 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 180 185 190 tca gga ctc tac tcc ctc age age gtg gtg acc gtg ccc tcc age age 624 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser vai Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 195 2 00 205 ttg ggc acc cag acc tac ate tgc aac gtg aat cac aag ccc age aac 672 Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 210 215 220 acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac 720 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 225 230 235 240 aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc 768 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 245 250 255 ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc 816 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 51

ΕΡ 1 541 680/PT cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag 864 Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu 215 280 285 gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag 912 Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys 290 295 300 aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age 960 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val Val Ser 305 310 315 320 gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag 1008 Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate 1056 Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 1104 Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg 1152 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat 1200 Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct CCC gtg Ctg gac tcc 1248 Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 405 410 415 gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg 1296 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg 1344 Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu 435 440 445 cac aac cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga 1392 His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 4 50 455 4 60

<210> 10 <211> 463 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo quimérico ratinho-humano (cadeia H de M3C11) <400> 10

Met 1 Asn Phe Gly Leu 5 Thr Leu Ile Phe Leu 10 Val Leu Thr Leu Lys 15 Gly Val Gin Cys Glu 20 Val Gin Leu Val Glu 25 Ser Gly Gly Gly Leu 30 Val Lys Pro Gly Gly 35 Ser Leu Lys Leu Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Thr Phe Ser Arg 50 Tyr Ala Met Ser Trp 55 Val Arg Gin Ile Pro 60 Glu Lys Ile Leu Glu 65 Trp Val Ala Ala Ile 70 Asp Ser Ser Gly Gly 75 ASp Thr Tyr Tyr Leu 80 Asp Thr Val Lys Asp 85 Arg Phe Thr Ile Ser 90 Arg Asp Asn Ala Asn 95 Asn Thr Leu His Leu 100 Gin Met Arg Ser Leu 105 Arg Ser Glu Asp Thr 110 Ala Leu 52 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ

Tyr Tyr Cys Val Arg Gin Gly Gly Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 120 125 Vai Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 130 135 140 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 145 150 155 160 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 165 170 175 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 180 185 190 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 195 200 205 Leu Gly Thr Gin Thr Tyr ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 210 215 220 Thr Lys Val Asp Lys Lys val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 225 230 235 240 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 ?ro Glu val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 3S0 Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460

<210> 11 <211> 1413 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (1410) <220> <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo quimérico ratinhi-humano (cadeia H de M1E07) <400> 11 atg gga tgg aac tgg ate ttt att tta ate ctg tea gta act aca ggt 48 Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Vai Thr Thr Gly 53 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ 1 5 10 15 gtc cac tet gag gtc cag ctg cag cag tet gga cct gag ctg gtg aag 96 Uai His Ser Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tea gtg aag ata tcc tgc aag gct tet ggt tac tea ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 act ggc tac tac atg cac tgg gtg aag caa agt cct gaa aag age ctt 192 Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gin Ser Pro Glu Lys Ser Leu 50 55 60 gag tgg att gga gag att aat cct age act ggt ggt act acc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Glu lie Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag gee aag gee aca ttg act gta gac aaa tcc tcc age 288 Gin Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gee tac atg cag ctc aag age ctg aca tet gag gac tet gea gtc 336 Thr Ala Tyr Met Gin Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gea agg agg ggc gga tta act ggg acg age ttc ttt gct 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Leu Thr Gly Thr Ser Phe Phe Ala 115 120 125 tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tet gea gct age acc aag 432 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys 130 135 140 ggc cca teg gtc ttc ccc ctg gea ccc tcc tcc aag age acc tet ggg 480 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 ggc aca gcg gee ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg 528 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 gtg acg gtg teg tgg aac tea ggc gee ctg acc age ggc gtg cac acc 576 Vai Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 ttc ccg gct gtc cta cag tcc tea gga ctc tac tcc ctc age age gtg 624 Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 gtg acc gtg ccc tcc age age ttg ggc acc cag acc tac ate tgc aac 672 Vai Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 gtg aat cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc 720 Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys co >1 Val Glu Pro 225 230 235 240 aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gea cct gaa 768 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255 ctc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc Ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 816 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 864 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val val Asp 275 280 285 gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 912 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 960 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 305 310 315 320 age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 1008 Ser Thr Tyr Arg val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 325 330 335 54

ΕΡ 1 541 58 0/PT ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1056 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350 gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 1104 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365 cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 1152 Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380 cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate 1200 Gin val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 gcc gtg gag tgg gag age aat 999 cag ccg gag aac aac tac aag acc 1248 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag 1296 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc 1344 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag age ctc 1392 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 4 60 tcc ctg tet ccg ggt aaa tga 1413 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 4 65 470

<210> 12 <211> 470 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo quimérico ratinho-humano (cadeia H de M1E07) <400> 12

Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gin Ser Pro Glu Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Gin Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gin Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Leu Thr Gly Thr Ser Phe Phe Ala 115 120 125 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 55

ΕΡ 1 541 58 0/PT 180

Phe Pro Ala 195 Val Vai Thr 210 Val Pro Vai 225 Asn His Lys Lys Ser Cys Asp Leu Leu Gly Gly 260 Thr Leu Met 275 He Vai Ser 290 His Glu Vai 305 Glu Val His Ser Thr Tyr Arg Leu Asn Gly Lys 340 Ala Pro Ile 355 Glu Pro Gin 370 Val Tyr Gin 385 Vai Ser Leu Ala Val Glu Trp Thr Pro Pro Val 420 Leu Thr Val 435 Asp Ser Val 450 Met His Ser 465 Leu Ser Pro

Leu Gin Ser Ser 200 Ser Ser Ser 215 Leu Pro Ser 230 Asn Thr Lys 245 Thr His Thr Pro Ser val Phe Ser Arg Thr Pro 280 Asp Pro Glu 295 Val Asn Ala 310 Lys Thr Val 325 val Ser Val Glu Tyr Lys Cys Lys Thr Ile Ser 360 Thr Leu Pro 375 Pro Thr Cys 390 Leu Val Glu 4 05 Ser Asn Gly Leu Asp Ser Asp Lys Ser Arg Trp 440 Glu Gly Ala Lys 470 Leu 455 His 185 Gly Leu Tyr Ser Gly Thr Gin Thr 220 Lys Val Asp 235 Lys Cys Pro 250 Pro Cys Leu 265 Phe Pro Pro Glu Val Thr Cys Lys Phe Asn Trp 300 Lys Pro Arg 315 Glu Leu Thr 330 Val Leu Lys 345 Val Ser Asn Lys Ala Lys Gly Ser Arg Asp Glu 380 Lys Gly Phe 395 Tyr Gin Pro 410 Glu Asn Gly 425 Ser Phe Phe Gin Gin Gly Asn Asn His Tyr Thr 460

Leu 190 Ser Ser Val 205 Tyr Ile Cys Asn Lys Val Glu Pro Pro Ala Pro 240 Glu Lys Pro 255 Lys Asp Val 270 Val Val Asp 285 Tyr Val Asp Gly Glu Gin Tyr Asn His Gin Asp 320 Trp VI >1 Ala 335 Leu Pro Gin 350 Pro Arg Glu 365 Leu Thr Lys Asn Pro Ser Asp Ile Asn Tyr Lys 400 Thr Leu Tyr 415 Ser Lys Val 430 Phe Ser Cys 445 Gin Lys Ser Leu

<210> 13 <211> 1416 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <221> CDS <222> (1) .. (1413) <220> quimérico <223> Descrição da sequência artificial: Anti ratinho-humano (cadeia H de M19B11) <400> 13 atg aac ttc ggg ctc acc ttg att ttc ctc gtc ctt act tta aaa ggt Met Asn Phe Gly Leu Thr Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac tta gtg aag Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 cct gga ggg acc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga tcc act ttc Pro Gly Gly Thr Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe 35 40 45 56

ΕΡ 1 541 680/PT agt aac tat gee atg tet tgg gtt ege cag act cca gag aag agg ctg 192 Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 gag tgg gtc gea gee att gat agt aat gga ggt acc acc tac tat cca 240 Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Ser Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 gac act atg aag gac cg a ttc acc att tcc aga gac aat gee aag aac 288 Asp Thr Met Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 acc ctg tac ctg caa atg aac agt ctg agg tet gaa gac aca gee ttt 336 Tbr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe 100 105 110 tat cac tgt aca aga cat aat gga ggg tat gaa aac tac ggc tgg ttt 384 Tyr His Cys Thr Arg His Asn Gly Gly Tyr Glu Asn Tyr Gly Trp Phe 115 120 125 gct tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tet gea gct age acc 432 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr 130 135 140 aag ggc cca teg gtc ttc ccc ctg gea ccc tcc tcc aag age acc tet 480 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 ggg ggc aca çcg gee ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 528 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 ccg gtg acg gtg teg tgg aac tea ggc gee ctg acc age ggc gtg cac 576 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly val His 180 185 190 acc ttc ccg gct gtc Cta cag tcc tea gga Ctc tac tcc ctc age age 624 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 gtg gtg acc gtg ccc tec age age ttq ggc acc cag acc tac ate tgc 672 Vai Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 aac gtg aat cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag 720 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 225 230 235 240 ccc aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gea cct 768 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 gaa ctc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag 816 Glu Leu Leu Gly Gly PrO Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 gac acc ctc atg ate tec cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg 864 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys val Val Val 275 280 285 gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac 912 Asp Val Ser Kis Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac 960 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 305 310 315 320 aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 1008 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr val Leu His Gin Asp 325 330 335 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gee etc 1056 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 cca gee ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa gee aaa ggg cag ccc cga 1104 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 355 360 365 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag 1152 57

ΕΡ 1 541 680/PT

Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 370 375 380 aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac 1200 A sn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 ate gee gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag 1248 Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age 1296 Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea 1344 Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser 435 440 445 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag age 1392 Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 450 455 4 60 ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga 1416 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 14 <211> 471 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo quimérico ratinho-humano (cadeia H de M19B11) <4 0 0> 14

Met Asn Phe Gly Leu Thr Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly 1 5 10 15 Vai Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Thr Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Ser Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Thr Met Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe 100 105 110 Tyr His Cys Thr Arg His Asn Gly Gly Tyr Glu Asn Tyr Gly Trp Phe 115 120 125 Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 225 230 235 240 58

ΕΡ 1 541 68 0/PT

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 370 375 380 Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 4 30 Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 15 <211> 1413

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> CDS <222> (1)..(1410) <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo quimérico ratinho-humano (cadeia H de M18D04) <400> 15 atg gaa tct aac tgg ata ctt cct ttt att ctg tcg gta gct tca ggg 48 Met Glu Ser Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Ala Ser Gly 1 5 10 15 gtc tac tca gag gtt cag ctc cag cag tct ggg act gtg ctg gca agg 96 val Tyr Ser Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg 20 25 30 cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 act ggc tac tgg atg cgc tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt ctg 192 Thr Gly Tyr Trp Met Arg Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 gaa tgg att ggc gct att tat cct gga aat agt gat aca aca tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag ggc aag gcc aaa ctg act gca gtc aca tct gtc age 288 59

ΕΡ 1 541 68 0/PT

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser vai Ser 85 90 95 act gee tac atg gaa ctc age age ctg aca aat gag gac tet gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt tea aga teg 999 gac cta act ggg ggg ttt gct tac tgg 384 Tyr Tyr Cys Ser Arg Ser Gly Asp Leu Thr Gly Gly Phe Ala Tyr Trp 115 120 125 ggc caa 999 act ctg gtc act gtc tet aca gee aaa gct age acc aag 432 Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Val Ser Thr Ala Lys Ala Ser Thr Lys 130 135 140 ggc cca teg gtc ttc ccc ctg 9 ca ccc tcc tcc aag age acc tet ggg 480 Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 ggc aca gcg gee ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg 528 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 gtg a cg gtg teg tgg aac tea ggc gee ctg acc age ggc gtg cac acc 576 Uai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 ttc ccg gct gtc cta cag tcc tea gga ctc tac tcc ctc age age gtg 624 Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 gtg acc gtg ccc tcc age age ttg ggc acc cag acc tac ate tgc aac 672 vai Thr vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 gtg aat cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc 720 Vai Asn Hls Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gea cct gaa 768 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 2 50 255 ctc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 816 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 2 60 265 270 acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 864 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val val Asp 275 280 285 gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 912 Vai Ser Hls Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 960 Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 305 310 315 320 age acg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg 1008 Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 32 5 330 335 ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gee ctc cca 1056 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350 gee ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa gee aaa 999 cag CCC cga gaa 1104 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365 cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 1152 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380 cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate 1200 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 385 390 395 400 gee gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 1248 Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 60

ΕΡ 1 541 68 0/PT 405 410 415 acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag 1296 Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc 1344 Leu Thr Vai Asp LyS Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag age ctc 1392 Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 4 60 tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1413 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 16 <211> 470 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo quimérico ratinho-humano (cadeia H de M18D04) <4 00> 16

Met Glu Ser Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Ala Ser Gly 1 5 10 15 Val Tyr Ser Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Trp Met Arg Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp lie Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Val Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Arg Ser Gly Asp Leu Thr Gly Gly Phe Ala Tyr Trp 115 120 125 Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Lys Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 61

ΕΡ 1 541 68 0/PT 290 295 300 Val Glu Val HiS Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 325 330 335 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 34 5 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380 Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 4 60 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 17 <211> 717 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> CDS <222> (1)..(714) <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo quimérico ratinho-humano (cadeia L de M3C11) <400> 17 atg agt cct gcc cag ttc ctg ttt ctg tta gtg ctc tgg att cgg gaa 48 Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu 1 5 10 15 acc aac ggt gat gtt gtg atg acc cag act cca ctc act ttg teg gtt 96 Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val 20 25 30 acc att gga caa cca gcc tcc ate tct tgc aag tea agt cag age ctc 144 Thr Ile Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys LyS Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45 tta gat agt gat gga aag aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg cca 192 Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aag cg c cta ate tat ctg gtg tct aaa ttg gac tct 240 Gly Gin Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 65 70 75 80 gga gcc cct gac agg ttc act ggc agt gga tea ggg aca gat ttc aca 288 Gly Ala Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctg aaa ate agt aga gtg gag gct gag gat ttg gga att tat tat tgc 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys 100 105 110 tgg caa ggt aca cat ttt ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg 384 Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 62 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ 115 120 125 gag ctg aaa cgt acg gtg gct gea cca tct gtc ttc ate ttc ceg cca 432 Glu Leu Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg 480 Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu 145 150 155 160 aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac 528 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn 165 Π0 175 gcc ctc caa teg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac age 576 Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190 aag gac age acc tac age ctc age age acc ctg acg ctg age aaa gea 62 4 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc 672 Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly 210 215 220 ctg age teg ccc gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tga 717 Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 18 <211> 238 <212> PRT <213> Sequência artificia 1 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial : Anticorpo quimérico ratinho-humano (cadeia L de M3C11) 1 <4 0 0> 18 Met Ser Pro Ala Gin Phe Leu Phe Leu Leu vai Leu Trp Ile Arg Glu 1 5 10 15 Thr Asn Gly Asp Vai Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val 20 25 30 Thr lie Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Vai Ser Lys Leu Asp Ser 65 70 75 80 Gly Ala Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly ile Tyr Tyr Cys 100 105 110 Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Leu Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly 210 215 220 Leu ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 63 ΕΡ 1 541 680/ΡΤ

<210> 19 <211> 717 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <221> CDS <222> (1)..(714) <220> <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo quimérico ratinho-humano (cadeia L de M1E07) <4 0 0> 19 atg agt cct gtc cag ttc ctg ttt ctg tta atg ctc tgg att cag gaa 48 Met Ser Pro Vai Gin Phe Leu Phe Leu Leu Met Leu Trp Ile Gin Glu 1 5 10 15 acc aac ggt gat gtt gtg atg acc cag act cca ctg tct ttg teg gtt 96 Thr Asn Gly Asp Vai Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val 20 25 30 acc att gga caa cca gcc tct ate tct tgc aag tea agt cag age ctc 144 Thr Ile Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45 tta tac agt aat gga aag aca tat ttg aat tgg tta caa cag agg cct 192 Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gin Gin Arg Pro 50 55 60 ggc cag gct cca aag cac cta atg tat cag gtg tcc aaa ctg gac cct 240 Gly Gin Ala Pro Lys His Leu Met Tyr Gin Val Ser Lys Leu Asp Pro 65 70 75 80 ggc ate cct gac agg ttc agt ggc agt gga tea gaa aca gat ttt aca 288 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctt aaa ate age aga gtg gag gct gaa gat ttg gga gtt tat tac tgc 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 ttg caa agt aca tat tat ccg ctc aeg ttc ggt gct ggg acc aag ctg 384 Leu Gin Ser Thr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gag ctg aaa cgt a cg gtg gct gea cca tct gtc ttc ate ttc ccg cca 432 Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg 480 Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac 528 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn 165 17 0 175 gcc ctc caa teg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac age 576 Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190 aag gac age acc tac age ctc age age acc ctg acg ctg age aaa gea 62 4 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 20 5 gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc 672 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly 210 215 220 ctg age teg ccc gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tga 717 Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 230 225 235 64

ΕΡ 1 541 68 0/PT

<210> 20 <211> 238 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo quimérico ratinho-humano (cadeia L de M1E07) <400> 20

Met Ser Pro Vai Gin Phe Leu Phe Leu Leu Met Leu Trp Ile Gin Glu 1 5 10 15 Thr Asn Gly Asp Vai Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val 20 25 30 Thr Ile Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45 Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gin Gin Arg Pro 50 55 60 Gly Gin Ala Pro Lys His Leu Met Tyr Gin Val Ser Lys Leu Asp Pro 65 TO 75 80 Cl 1—· *< Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Leu Gin Ser Thr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 2 00 205 Asp Tyr Glu Lys HiS Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 21 <211> 705 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> CDS <222> (1)..(702) <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo quimérico ratinho-humano (cadeia L de M19B11) 65 ΕΡ 1 541 68 0/PT <400> 21 atg aga ccc tcc att cag ttc ctg ggg ctc ttg ttg ttc tgg ctt cat 48 Met Arg PrO Ser Ile Gin Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 ggt gtt cag tgt gac ate cag atg aca cag tet cea tcc tea ctg tet 96

Gly Vai Gin Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 gea tet ctg gga ggc aaa gtc acc ate act tgc aag gea agt cag gac 144 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp 35 40 45 att aac aag aat ata gtt tgg tac ca a cac aag cct gga aaa ggt cct 192 Ile Asn Lys Asn Ile Vai Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 agg ctg etc ata tgg tac aca tet aca tta cag cca ggc ate cca tea 240 Arg Leu Leu Ile Trp Tyr Thr Ser Thr Leu Gin Pro Gly ile Pro Ser 65 70 75 80 agg ttc agt gga agt ggg tet 999 aga gat tat tcc ttc age ate age 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser phe Ser Ile Ser 85 90 95 aac ctg gag cct gaa gat att gea act tat tac tgt cta cag tat gat 336 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp 100 105 110 aat ctt CCâ cgg acg ttc ggt gga ggc acc aaa ctg gaa ate aaa cgt 384 Asn Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 11S 120 125 a cg gtg gct gea cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet gat gag cag 4 32 Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140 ttg aaa tet gga act gee tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 480 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 ccc aga gag gee aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gee ctc caa teg 528 Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 no 175 ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac age aag gac age acc 576 Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 tac age ctc age age acc ctg acg ctg age aaa gea gac tac gag aaa 624 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 cac aaa gtc tac gee tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg age teg ccc 672 His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tga 705 Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230

<210> 22 <211> 234 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> quimérico <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo ratinho-humano (cadeia L de M19B11) 66 ΕΡ 1 541 68 0/PT <400> 22

Met Arg Pro Ser Ile Gin Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His 1 5 10 15 Gly Vai Gin Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Gly Lys Vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp 35 40 45 Ile Asn Lys Asn Ile Vai Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Gly Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Trp Tyr Thr Ser Thr Leu Gin Pro Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp 100 105 110 Asn Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230

<210> 23 <211> 720 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <220> <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo quimérico ratinho-humano (cadeia L de M18D04) 67 ΕΡ 1 541 680/PT <400> 23 atg agg ttc tct gct cag ctt ctg ggg ctg ctt gtg ctc tgg ate cct 46 Met Arg Phe Ser Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 gga tcc act gca gat att gtg atg acg cag gct gca ttc tcc aat cca 96 Gly Ser Thr Ala Asp ile Val Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro 20 25 30 gtc act ctt gga aca tca act tcc ate tcc tgc agg tct agt aag agt 144 Vai Thr Leu Gly Thr Ser Thr Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 ctc cta cat agt aat ggc ate act tat ttg tat tgg tat ctg cag aag 192 Leu Leu HiS Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys 50 55 60 cca ggc cag tct cct cag ctc ctg att tat cag atg tcc aac ctt gee 240 PtO Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 tca gga gtc cca gac agg ttc agt age agt ggg tca gga act gat ttc 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 aca ctg aga ate age aga gtg gag gct gag gat gtg ggt gtt tat tac 336 Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgt gct caa aat cta gaa ctt ccg tat acg ttc gga teg ggg acc aag 384 Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys 115 120 125 ctg gaa ata aaa cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc ate ttc ccg 432

Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gee tct gtt gtg tgc ctg 480 Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gee aaa gta cag tgg aag gtg gat 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp 165 170 175 aac gee ctc caa teg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp 180 185 190 age aag gac age acc tac age ctc age age acc ctg acg ctg age aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gee tgc gaa gtc acc cat cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin 210 215 220 ggc ctg age teg ccc gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tga 720 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 24 <211> 239 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> quimérico <223> Descrição da sequência artificial: Anticorpo ratinho-humano (cadeia L de M18D04) 68

ΕΡ 1 541 68Ο/PT <400> 24

Met Arg Phe Ser Ala Gin Leu Leu 1 5 Gly Ser Thr Ala Asp Ile Val Met 20 Vai Thr Leu Gly Thr Ser Thr Ser 35 40 Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr 50 55 Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu 65 70 Ser Gly val Pro Asp Arg Phe Ser 85 Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu 100 Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro 115 120 Leu Glu Ue Lys Arg Thr Val Ala 130 135 Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser 145 150 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 165 Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser 180 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 195 200 Ala Asp Tyr Glu Lys Hls Lys Val 210 215 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 225 230

Gly Leu 10 Leu Val Leu Trp Ile 15 Pro Thr 25 Gin Ala Ala Phe Ser 30 Asn Pro Ile Ser Cys Arg Ser 45 Ser Lys Ser Tyr Leu Tyr Trp 60 Tyr Leu Gin Lys Ile Tyr Gin 75 Met Ser Asn Leu Ala 80 Ser Ser 90 Gly Ser Gly Thr Asp 95 Phe Ala 105 Glu Asp Val Gly Val 110 Tyr Tyr Tyr Thr Phe Gly Ser 125 Gly Thr Lys Ala Pro Ser Val 140 Phe ile Phe Pro Gly Thr Ala 155 Ser Val Val Cys Leu 160 Ala Lys 170 Val Gin Trp Lys Val 175 Asp Gin 185 Glu Ser Val Thr Glu 190 Gin Asp Ser Ser Thr Leu Thr 205 Leu Ser Lys Tyr Ala Cys Glu 220 Val Thr His Gin Ser Phe Asn 235 Arg Gly Glu Cys

Lisboa, 2012-02-03

Claims (18)

1. ΕΡ 1 541 680/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo dirigido contra um péptido que consiste nos resíduos de aminoácidos 375-580 de GPC 3, em que o anticorpo possui uma actividade citotóxica.
2. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que a actividade citotóxica é uma actividade citotóxica contra células HepG2 ou HuH-7
3. 3. Anticorpo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o anticorpo é: um anticorpo monoclonal; e/ou é um anticorpo quimérico; e/ou é um anticorpo humanizado.
4. 4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a actividade citotóxica é uma actividade ADCC.
5. 5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a actividade citotóxica é uma actividade CDC.
6. 6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo recombinante.
7. 7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 6, em que o anticorpo foi produzido numa célula de mamífero.
8. 8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, em que a célula de mamífero é seleccionada entre uma célula CHO, COS, de mieloma, BHK, vero e Hela.
9. 9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que a célula de mamífero é transformada com um vector de expressão compreendendo um gene que codifica o anticorpo. ΕΡ 1 541 680/ΡΤ 2/3
10. 10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 9, em que a célula de mamífero compreende: (a) um vector de expressão compreendendo um gene que codifica a cadeia pesada (H) do anticorpo e um vector de expressão separado compreendendo um gene que codifica a cadeia leve (L) do anticorpo; ou (b) um vector de expressão único que codifica ambas as cadeias H e L.
11. 11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que: (a) o gene que codifica a cadeia H do anticorpo compreende a sequência de SEQ ID NO: 9; e/ou (b) o gene que codifica a cadeia L do anticorpo compreende a sequência de SEQ ID NO: 17.
12. 12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que: (a) o gene que codifica a cadeia H do anticorpo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11; e/ou (b) o gene que codifica a cadeia L do anticorpo compreende a sequência de SEQ ID NO: 19.
13. 13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que é um anticorpo humanizado.
14. 14. Anticorpo tal como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização no tratamento do cancro, em que o cancro expressa GPC 3.
15. 15. Anticorpo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 para utilização na disrupção celular, em que as células que sofrerão ruptura expressam GPC 3.
16. 16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 15, em que a célula é uma célula cancerosa.
17. 17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 14 ou 16, em que o cancro é o hepatoma, o cancro pancreático, o cancro ΕΡ 1 541 58 0/PT 3/3 do pulmão, o cancro do cólon, o cancro da mama, próstata, a leucemia ou o linfoma.
18. 18. Formulação farmacêutica compreendendo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 veiculo e/ou aditivo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 2012-02-03 cancro da anticorpo a 13 e um