CN101186650A - 抗存在于血液中的gpc3的分泌性n-端肽或c-端肽的抗体 - Google Patents

抗存在于血液中的gpc3的分泌性n-端肽或c-端肽的抗体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗可溶形式的GPC3的抗体，其能够检测测试样品中可溶形式的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)。有可能确定对象是否患有癌症，尤其是肝癌。本发明还公开了抗GPC的抗体以及包含此抗体，可破坏细胞，尤其是癌细胞的细胞破坏剂和抗癌剂。

Description

抗存在于血液中的GPC3的分泌性N-端肽或C-端肽的抗体
本申请为国际申请PCT/JP2003/011318于2005年3月4日进入中国国家阶段、申请号为03821057.6、发明名称为“抗存在于血液中的GPC3的分泌性N-端肽或C-端肽的抗体”的分案申请。
技术领域
本发明涉及抗GPC3的N-端肽或C-端肽的抗体。更具体而言，本发明涉及抗GPC3N-端肽的抗体，所述肽的分子量约40kDa，以可溶性形式的GPC3核心蛋白发现。此外，本发明还涉及抗GPC3C-端肽的抗体，所述肽的分子量约30kDa，以可溶性形式的GPC3核心蛋白发现。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)家族被报道成在细胞表面上存在的新家族的硫酸乙酰肝素蛋白多糖。直至现在，报道有5种磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，磷脂酰肌醇蛋白聚糖2，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖4和磷脂酰肌醇蛋白聚糖5)。家族成员具有大小均匀(约60kDa)的核心蛋白以及共同的完全保守的独特的半胱氨酸残基，并且通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜结合。
已知磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在发育过程中深度参与细胞分裂及其模式控制。此外，已知GPC3基因在肝癌细胞中高度表达，以及GPC3基因可能用作肝细胞癌的标记。
本发明人事先发现，抗GPC3抗体具有ADCC活性和CDC活性，以及作为肝癌的治疗性处理是有用的，并且提交了专利申请(日本专利申请2001-189443)。
然而，GPC3是细胞膜结合的蛋白，并且还没有对GPC3蛋白的分泌形式的存在进行报道。因此，有关使用GPC3蛋白本身作为血液中的肿瘤标记一直未加以研究。
本发明公开
本发明人发现下列事实：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在其氨基酸残基358或其氨基酸残基374或邻近残基的区域处进行切割。假设可溶形式的GPC3会在肝癌患者的血液中分泌，本发明人建立了GPC3夹心ELISA系统以显示分泌形式的GPC3存在于高度表达GPC3的人肝癌细胞HepG2的培养上清液中。此外，本发明人成功地分析了不仅在移植有HepG2的小鼠的血浆中，而且在人肝癌患者的血清中分泌形式的GPC3。由于与涉及出现AFP作为肝癌标记的时间比较，GPC3基因的表达在肝癌的更早期阶段被观察到，因此本发明人认为，GPC3的检测对癌症诊断是有用的。加之，由于采用识别C-端肽片段的抗GPC3抗体检测分泌形式的GPC3看起来是困难的，因此GPC3的分泌形式设想以N-端肽片段显著存在。本发明人认为，识别N-端的抗GPC3抗体优选用于检测分泌形式的GPC3。于是，本发明人努力开发识别GPC3N-端肽的抗体，从而实现了本发明。本发明人还发现，抗GPC3的C端的抗体具有高的胞毒活性，而且认为，使用识别C端的抗GPC3抗体对于破坏癌细胞，即治疗性处理癌症将是更可取的。然后，本发明人努力开发识别GPC3的C端肽的抗体，从而实现了本发明。
既然观察到GPC3在除肝癌细胞系之外的癌细胞系中表达，诸如在肺癌，肠癌，乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌以及淋巴癌的细胞系中表达，因此，GPC3可能适用于除了肝癌之外的癌症的诊断。
具体而言，本发明涉及抗GPC3的N-端肽的抗体。
此外，本发明涉及抗体，其中GPC3的N-端肽是血液中发现的分泌形式的肽。
此外，本发明涉及抗体，其中GPC3的N-端肽包含GPC3的氨基酸残基1-374，或者包含GPC3的氨基酸残基1-358。
此外，本发明涉及抗体，其是单克隆抗体。
另外，本发明涉及抗体，其固定到不溶性支持物上。
另外，本发明涉及抗体，其标记有标记物质。
另外，本发明涉及抗GPC3的C-端肽的抗体。
此外，本发明涉及抗体，其中GPC3的C-端肽包含GPC3的氨基酸残基359-580，或者包含GPC3的氨基酸残基375-580。
此外，本发明涉及抗体，其是单克隆抗体。
另外，本发明涉及抗体，其是嵌合抗体。
另外，本发明涉及抗体，其是胞毒抗体。
另外，本发明涉及包含抗体的细胞破坏剂。
另外，本发明涉及细胞破坏剂，其中细胞为癌细胞。
另外，本发明涉及包含抗体的抗癌剂。
另外，本发明涉及诱导细胞毒性的方法，包括将细胞与抗体接触。
另外，本发明涉及方法，其中细胞为癌细胞。
本发明下文详细描述。
本发明提供抗分泌形式的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的抗体，其能够检测测试样品中分泌形式的GPC3。通过体外检测测试样品中分泌形式的GPC3，可诊断测试对象是否患有癌症，尤其是肝癌。
检测包括定量或非定量检测，并且包括例如，GPC3蛋白存在的简单分析，GPC3蛋白以给定量或更多量存在的分析，和GPC3蛋白量与其他样品(例如，对照样品)量的比较分析作为非定量分析；以及GPC3蛋白的浓度分析和GPC3蛋白量的分析作为定量分析。
测试样品包括但不限于任何可能含有GPC3蛋白的样品。优选从哺乳动物的生物体中采集样品。此外，更优选从人中采集样品。这种测试样品的具体例子包括血液，组织液，血浆，血管外液，脑脊液，滑液，胸膜液，血清，淋巴液，唾液和尿液。优选地，测试样品是血液，血清或血浆。此外，从测试样品获得的样品，诸如从生物体采集的细胞培养基，也包括在本发明的测试样品中。
根据本发明，利用抗GPC3的N-端肽的抗体诊断的癌症包括但不限于，肝癌，胰腺癌，肺癌，肠癌，乳腺癌，前列腺癌，白血病和淋巴癌。优选地，癌症为肝癌。
由于本发明的抗GPC3的C-端肽的抗体具有高度胞毒活性，因此抗体可用于破坏癌细胞，即用于治疗性处理癌症。利用抗体临床上可能治疗的癌症包括但不限于，肝癌，胰腺癌，肺癌，肠癌，乳腺癌，前列腺癌，白血病和淋巴癌。优选地，癌症为肝癌。
1.抗N-端肽的抗GPC3抗体或抗C-端肽的抗GPC3抗体的制备
GPC3的氨基酸序列和核苷酸序列描述在Lage，H.等，Gene188(1997)，151-156或GenBank：Z37987。
本发明中所用的抗N-端肽的抗GPC3抗体或抗C-端肽的抗GPC3抗体应能够分别特异性结合到GPC3蛋白的N-端肽或C-端肽。其起源或类型(单克隆，多克隆)还是形状不受特别限制。具体而言，可使用已知抗体，诸如小鼠抗体，大鼠抗体，人抗体，嵌合抗体和人源化抗体。
当GPC3在切割位点切割时，GPC3被切成约40kDa的肽和约30kDa的肽，分别位于N-端和C-端。GPC3的切割位点为氨基酸残基358，氨基酸残基374或其邻近区域。主要切割位点据信是氨基酸残基358。
GPC3的N-端肽约40kDa，以可溶形式的GPC3核心蛋白发现。N-端肽优选为包含从Met 1到Lys 374的氨基酸序列，或包含从Met 1到Arg 358的氨基酸序列。更优选地，N-端肽为包含从Met 1到Arg 358的氨基酸序列，这是因为主要切割位点预测位于氨基酸残基358处。根据本发明，也可采用N-端肽的片段。在本说明书中，N-端肽也称作N-端片段或N-端肽片段。
换言之，本发明的抗GPC3的N-端肽的抗体识别存在于GPC3蛋白的N-端肽上的表位。识别的表位位点不受特别限制。
GPC3的C-端肽约30kDa，以可溶形式的GPC3核心蛋白发现。基于上述切割位点，C-端肽优选为从Ser 359到His 580的氨基酸序列，或从Val 375到His 580的氨基酸序列。更优选地，C-端肽为包含从Ser359到His 580的氨基酸序列，这是因为主要切割位点认定位于氨基酸残基358的位点处。根据本发明，也可采用这种C-端肽的片段。在本说明书中，C-端肽也称作C-端片段或C-端肽片段。
换言之，本发明的抗GPC3的C-端肽的抗体识别存在于GPC3蛋白的C-端肽上的表位，而识别的表位位点不受特别限制。
抗体可以为多克隆抗体，但优选是单克隆抗体。
用于本发明的抗GPC3 N-端肽抗体或抗GPC3 C-端肽抗体利用已知技术可以多克隆抗体或单克隆抗体的形式获得。用于本发明的抗GPC3抗体优选是衍生自哺乳动物的单克隆抗体。衍生自哺乳动物的单克隆抗体包括那些由杂交瘤生产的抗体，以及那些通过基因工程技术在转化有携带抗体基因的表达载体的宿主中生成的抗体。
生产单克隆抗体的杂交瘤的制备基本上是使用如下的已知技术。通过常规免疫方法，利用GPC3为致免抗原对动物进行免疫以得到免疫细胞，然后采用常规细胞融合方法与已知亲本细胞融合。通过常规筛选方法从融合细胞中筛选出生成单克隆抗体的细胞。
具体而言，单克隆抗体的制备如下。
首先，为得到抗体用作致免抗原的GPC3的制备方法是表达公开在Lage，H.等，Gene 188(1997)，151-156中的GPC3(MXR7)基因/氨基酸序列。具体而言，编码GPC3的基因序列插入到已知表达载体，转化合适的宿主细胞，然后从宿主细胞或其培养上清液中纯化所需的人GPC3蛋白。
此外，天然存在的GPC3也可纯化和使用。
接着，纯化的GPC3蛋白用作致免抗原。全GPC3蛋白可用作致免抗原。由于抗GPC3蛋白的N-端肽的抗体和抗其C-端肽的抗体也在这种情形下得以诱导，因此抗GPC3蛋白的N-端肽的抗体和抗其C-端肽的抗体可分开进行选择。此外，GPC3的部分N-端肽或其部分C-端肽也可用作致免抗原。在此情形下，这种部分肽可在人GPC3的氨基酸序列基础上通过化学合成或将部分GPC3基因插入到表达载体中或通过用蛋白酶降解天然存在的GPC3而得到。用作部分肽的部分GPC3为N-端GPC3肽。也可使用在部分中含有表位的更小的肽片段。此外，GPC3的C-端肽可用作部分肽，并且还可使用在部分中含有表位的更小的肽片段。
优选选择用致免抗原免疫的哺乳动物，同时考虑与细胞融合中所用的亲本细胞的相容性。用于免疫的哺乳动物优选包括但不限于，啮齿动物，诸如小鼠，大鼠，仓鼠或兔子或猴子。
对于以致免抗原免疫动物而言，可采用已知方法。一般而言，例如，将致免抗原腹膜内或皮下注射在哺乳动物中。具体而言，使致免抗原稀释或悬浮在PBS(磷酸盐缓冲液)或生理盐水等中至合适的体积，并且与合适体积的常规佐剂，诸如弗氏完全佐剂混合。乳化后，每4-21天，乳化混合物给哺乳动物施用若干次。此外，在用致免抗原免疫的过程中，可使用合适载体。在分子量很小的部分肽必被用作致免抗原的情形下，部分肽在免疫时可优选结合到载体蛋白，诸如白蛋白和匙孔血蓝蛋白。
在哺乳动物如上免疫后，观察到所需抗原在血清中水平的增加，从哺乳动物中采集免疫细胞，然后进行细胞融合。优选地，免疫细胞为脾细胞。
作为另一个与免疫细胞融合的亲本细胞，可使用哺乳动物骨髓瘤细胞。作为骨髓瘤细胞，优选使用已知的各种细胞系，包括例如P3(P3×63Ag8.653(J.Immunol.(1979)123，1548-1550))，P3×63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)，NS-1(Kohler G.和Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)，MPC-11(Margulies，D.H.等，Cell(1976)8，405-415)，SP2/0(Shulman，M.等，Nature(1978)276，269-270)，F0(de St.Groth，S.F.等，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)，S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)，以及R210(Galfre，G.等，Nature(1979)277，131-133)。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合基本上通过已知方法进行，例如Kohler & Milstein等的方法(Kohler G.和Milstein C.，MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)。
更具体而言，细胞融合在存在细胞融合刺激剂的存在下在常规营养培养基中实施。细胞融合刺激剂包括例如，聚乙二醇(PEG)和仙台病毒(HVJ)。如果需要，为了提高融合效率，还可加入和使用诸如二甲基亚砜的助剂。
所用的免疫细胞与骨髓瘤细胞的比可适当加以确定。例如，优选免疫细胞为骨髓瘤细胞的1-10倍。细胞融合中所用的培养基包括例如，RPMI1640和MEM，以及其他适于骨髓瘤细胞生长的常规培养基。此外，可组合使用诸如胎牛血清(FCS)的血清助剂。
细胞融合方法是在培养基中充分混合预定量的免疫细胞和骨髓瘤细胞，向预先加热至约37℃的PEG溶液(例如，平均分子量约1,000-6,000)加入所得混合物一般到30-60w/v％，随后混合混合物，从而形成想要的融合细胞(杂交瘤)。接着，通过按序加入合适的培养基，离心混合物，丢弃上清液，并且重复上述步骤而去除对杂交瘤生长不利的细胞融合剂等。
由此获得的杂交瘤通过培养在常规选择性培养基，诸如HAT培养基(含有次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷)中而加以选择。在HAT培养基中继续培养足够的时间段(通常几天到几周)以杀死除了想要的杂交瘤细胞之外的细胞(非融合细胞)。然后，常规有限稀释方法的实施用于筛选和单个克隆生产所需抗体的杂交瘤。
筛选和单个克隆杂交瘤可通过筛选方法在已知抗原-抗体反应的基础上进行。抗原结合到载体，诸如由聚苯乙烯等制成的珠子，或可商购的96孔微量滴定板上，并且与杂交瘤的培养上清液反应。冲洗载体后，向平板中加入酶标记的二级抗体以确定与致免抗原反应的目的抗体是否包含在培养上清液中。生长目的抗体的杂交瘤通过有限稀释方法可加以克隆。GPC3的N-端肽或其片段，或GPC3的C-端肽或其片段可用作筛选抗原。
除了通过用抗原免疫非人的动物而获得杂交瘤之外，人抗体的制备可采用另一方法。人淋巴细胞用GPC3体外致免，然后融合到衍生自人且具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞，从而获得与GPC3的N-端肽或C-端肽具有结合活性的所需的人抗体(参见JP-B-1-59878)。此外，抗GPC3的N-端肽或C-端肽的人抗体的获得方法是将GPC3作为抗原施用给携带所有人抗体基因库的转基因动物，从而获得生产抗N-端肽的抗GPC3抗体的细胞或生产抗C-端肽的抗GPC3抗体的细胞，然后使细胞永生(参见国际公布WO 94/25585，WO 93/12227，WO 92/03918和WO 94/02602)。
由此制备的生产单克隆抗体的杂交瘤可被传代培养在常规培养基中，并且长时间储存在液氮中。
从杂交瘤中获得单克隆抗体的一个方法包括通过常规方法培养杂交瘤，以及从其培养上清液中获得单克隆抗体。另一方法包括给与杂交瘤相容的动物施用杂交瘤用于增殖，并且以腹水形式获得单克隆抗体。前一种方法适合于获得高纯度的抗体，而后一种方法适合于大规模生产抗体。
根据本发明，单克隆抗体包括由基因重组技术生产的重组抗体。重组抗体的生成方法是从杂交瘤中克隆抗体基因，将基因整合到合适载体中，使基因导入宿主，并且让宿主生产重组抗体(参见例如Vandamme，A.M.等，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775，1990)。具体而言，编码抗GPC3 N-端肽或抗GPC3 C-端肽的可变(V)区的mRNA分别分离自生成抗GPC3 N-端肽抗体的杂交瘤或生成抗GPC3 C-端肽抗体的杂交瘤。mRNA分离可采用已知方法进行。例如，总RNA的制备方法有胍超离心法(Chirgwin，J.M.等，Biochemistry(1979)18，5294-5299)或AGPC法(Chomczynski，P.等，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)，由此利用mRNA纯化试剂盒(生产商为Pharmacia)制备所需的mRNA。此外，利用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(生产商为Pharmacia)可直接制备mRNA。
采用反转录酶，从所得mRNA中合成抗体V区的cDNA。利用AMV反转录酶第一链cDNA合成试剂盒(生产商为SeikagakuCorporation)可合成cDNA。利用5’-AmpliFinder Race试剂盒(生产商为Clontech)和5’-RACE方法通过PCR(Frohman，M.A.等，Proc.Natl.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)也可合成和扩增cDNA。
所需的DNA片段纯化自得到的PCR产物，并连接到载体DNA。从载体DNA中制备重组载体，并导入大肠杆菌(E.coli)等以选择制备所需重组载体的菌落。随后，所需DNA的核苷酸序列可通过已知方法加以确认，例如二脱氧核苷酸链终止方法。
在获得编码所需抗GPC3 N-端肽抗体或所需抗GPC3 C-端肽抗体的V区的DNA后，将DNA插入到含有编码所需的抗体的恒定区(C区)的DNA的表达载体中。
为了生产用于本发明的抗GPC3 N-端肽抗体或抗GPC3 C-端肽抗体，将抗体基因导入表达载体，以便基因的表达处于表达调节区，例如增强子和启动子的控制之下。然后，宿主细胞用表达载体转化，从而表达抗体。
抗体基因的表达方法是在不同表达载体中分别插入编码抗体重链(H链)的DNA和编码其轻链(L链)的DNA，同时转化宿主细胞，或在单个表达载体中插入编码H链和L链的DNA，转化宿主细胞(参见WO94/11523)。
此外，不仅这样的宿主细胞而且转基因动物可用于生成重组抗体。例如，抗体基因中间插入编码奶中固有的蛋白(例如，山羊β酪蛋白)的基因，以制备融合基因。将包含融合基因和插入其中的抗体基因的DNA片段注射在山羊胚胎中，导入雌性山羊。所需抗体得自由转基因山羊生产的奶，所述转基因山羊出生自已接受胚胎的山羊或其子代。为了提高转基因山羊生产的含所需抗体的奶量，可给转基因山羊适当施用激素(Ebert，K.M.等，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
根据本发明，也可使用人工修饰的重组抗体，例如嵌合抗体(例如，人源化抗体)。利用现有技术，可生产这些修饰的抗体。在本发明抗体被当作治疗性处理用的抗体的情形下，优选使用基因重组型抗体。
通过连接编码抗体V区的DNA(制备方式如上所述)与编码人抗体的C区的DNA，将所得DNA插入在表达载体中，以及利用现有技术将载体导入抗体生产用宿主，可获得本发明有用的嵌合抗体。
人源化抗体也称为再造(reshaped)人抗体，其制备方法是将除人之外的哺乳动物，如小鼠的抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的互补决定区。通用基因重组技术在本领域也是已知的(参见欧洲专利申请EP 125023；WO 96/02576)。
具体而言，设计DNA序列，使得小鼠抗体的CDR可连接到人抗体的框架区(FR)，并且利用若干寡核苷酸，通过PCR合成，所述寡核苷酸的制备方式是使寡核苷酸的部分可能与CDR和FR的末端区重叠(参见WO 98/13388中所述方法)。
选择与CDR连接的人抗体的FR区，以便CDR可形成良好的抗原结合位点。如果需要，抗体V区的FR中的氨基酸可被取代，从而再造人抗体的CDR可形成合适的抗原结合位点(Sato，K.等，CancerRes.(1993)53，851-856)。
作为嵌合抗体和人源化抗体的C区，使用人抗体的那些C区；例如，Cγ1，Cγ2，Cγ3和Cγ4可用于H链，而Cκ和Cλ可用于L链。为了提高抗体的稳定性或其生产，人抗体的C区可加以修饰。
优选地，嵌合抗体在V区含有衍生自除人之外的哺乳动物的抗体序列，并且在C区含有衍生自人抗体的序列。
人源化抗体包括衍生自除人之外的哺乳动物的抗体的CDR以及衍生自人抗体的FR和C区。由于嵌合抗体，诸如人源化抗体的抗原性在人中降低，嵌合抗体可用作本发明治疗剂的活性组分。
用于本发明的抗体不仅是全抗体分子而且是抗体片段或其修饰产物，包括二价抗体和单价抗体，只要这种片段或修饰的产物可结合到GPC3 N-端肽或C-端肽。例如，抗体片段包括Fab，F(ab’)2，Fv，具有一个Fab和完整FC的Fab/C，或单链Fv(scFv)，其中H链和L链的Fv通过适当的接头连接。具体而言，抗体用酶处理，例如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，以生成抗体片段。否则，构建编码这些抗体片段的基因，导入表达载体，并且表达在合适的宿主细胞中(参见例如，Co，M.S.等，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.& Horwitz，A.H.Methodsin Enzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.；Plueckthun，A.& Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，AcademicPress，Inc.；Lamoyi，S.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663；Rousseaux，J.等，Methods in Enzymology(1989)121，663-669；Bird，R.E.等，TIBTECH(1991)9，132-137)。
通过连接抗体H链的V区和L链的V区可获得scFv。在此scFv中，H链的V区和L链的V区通过接头，优选肽接头连接在一起(Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中H链的V区和L链的V区可衍生自在此所述的任何抗体。包含12-19个氨基酸残基的合适单链肽可当作用于连接V区的肽接头。
利用部分编码其全部序列的DNA或其中所需的氨基酸序列作为模板，以及限定两端的一对引物，首先扩增编码H链或H链的V区的DNA和编码L链或L链的V区的DNA，然后用编码肽接头的DNA和一对限定方式使肽接头的两端可分别连接至H链和L链的引物扩增DNA，从而获得编码scFv的DNA。
一旦编码scFv的DNA得以制备，采用常规方法可获得携带此DNA的表达载体和转化有该表达载体的宿主。通过常规方法利用宿主可获得scFv。
通过以如上所述的相同方式获得并表达基因，并且使宿主生产片段，可生成抗体片段。本发明的“抗体”包括这种抗体片段。
也可使用抗体的修饰产物，例如，与各种不同的分子共轭的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体，所述分子诸如标记物质，毒素和放射性材料。本发明的“抗体”包括这些修饰的抗体。通过化学修饰抗体可获得这种修饰的抗体。修饰抗体的方法已在本领域中得以建立。
用于本发明的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体可包括那些具有抗原结合位点识别GPC3的N-端肽或C-端肽上的不同表位的抗体。此外，其中一个抗原结合位点识别GPC3的N-端肽或C-端肽，而其他抗原结合位点可识别标记物质等。这种双特异性抗体的制备或获得方法是将两种类型抗体的HL对连接或把生成不同单克隆抗体的杂交瘤融合在一起以制备能够生产双特异性抗体的融合细胞。此外，这种双特异性抗体还可通过基因工程技术来制备。
根据本发明，带有修饰糖链的抗体也可用于增强胞毒活性的目的。抗体糖链的修饰技术在本领域是公知的(例如，WO 00/61739，WO02/31140等)。
以上述方式构建的抗体基因可通过已知方法表达和获得。在哺乳动物细胞的情形下，常用启动子，待表达抗体基因及其3’端下游的poly(A)信号可功能性地加以连接用于表达。例如，启动子/增强子包括人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子。
此外，根据本发明，用于抗体表达的启动子/增强子包括例如，病毒启动子，包括反转录病毒，多瘤病毒，腺病毒和猿病毒40(SV40)/衍生自哺乳动物细胞的增强子或启动子，诸如人延伸因子Ia(HEFIa)/增强子。
在利用SV40启动子/增强子的情形下，基因表达采用Mulligan等(Nature(1979)277，108)的方法可容易地进行。在利用HEFIa启动子/增强子的情形下，基因表达采用Mizushima等的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可容易地进行。
在大肠杆菌(E.coli)的情形下，常用启动子，抗体分泌的信号序列以及待表达的抗体基因功能性地加以连接用于表达基因。启动子包括例如lacz启动子和araB启动子。在使用lacz启动子的情形下，基因采用Ward等(Nature(1998)，341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)的方法进行表达。在使用araB启动子的情形下，基因采用Better等(Science(1988)240，1041-1043)的方法进行表达。
当抗体在大肠杆菌的周质中生成时，pelB信号序列(Lei，S.P.等，J.Bacteriol.(1987)169，4379)可用作抗体分泌的信号序列。在生成于周质中的抗体分离后，抗体的结构被适当再折叠备用。
可使用的复制起点来自SV40，多瘤病毒，腺病毒和牛乳头瘤病毒(BPV)。为了扩增基因在宿主细胞系统中的拷贝数，表达载体可携带选择性标记，例如，氨基糖苷转移酶(APH)基因，胸苷激酶(TK)基因，大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因和脱氢叶酸还原酶(dhfr)基因。
为了生产用于本发明的抗体，可使用合适的表达系统，例如真核细胞或原核细胞。真核细胞包括例如建立的动物细胞系，诸如哺乳动物细胞系，昆虫细胞系，真菌细胞和酵母细胞。原核细胞包括例如细菌细胞，诸如大肠杆菌细胞。
优选地，用于本发明的抗体表达在哺乳动物细胞，例如CHO，COS，骨髓瘤，BHK，Vero和Hela细胞中。
转化的宿主细胞体外或体内培养生产所需抗体。采用已知方法培养宿主细胞。例如，DMEM，MEM，RPMI 1640和IMDM可用作培养基。辅助血清液，诸如胎牛血清(FCS)也可组合使用。
如上所述表达和生成的抗体可分离自这种细胞或宿主动物，然后可被纯化至均一性。用于本发明的抗体可利用亲和柱分离和纯化。蛋白质A柱包括例如，Hyper D，POROS，Sepharose F.F.(生产商为Pharmacia)。此外，一般用于蛋白的任何分离和纯化方法可用于本发明中。例如，除亲和柱之外的其他色谱柱，过滤，超滤，盐析，和透析可组合使用以分离和纯化抗体(抗体：实验室手册(Antibodies ALaboratory Manual)，Harlow，David Lane主编，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。
2.GPC3的检测
利用本发明的抗GPC3的N-端肽的抗体，可检测测试样品中的GPC3。
利用本发明抗体检测的GPC3包括但不限于全长GPC3及其片段。为了检测GPC3片段，优选检测N-端肽的片段。
检测测试样品中的GPC3蛋白的方法没有具体限制。利用抗GPC3N-端肽抗体，GPC3蛋白优选通过免疫分析方法检测。免疫分析方法包括例如，放免分析，酶免疫分析，荧光免疫分析，发光免疫分析，免疫沉淀方法，免疫比浊法，蛋白质印迹技术，免疫染色，以及免疫扩散法。优选地，免疫分析方法为酶免疫分析法。尤其优选地，免疫分析方法为酶联免疫吸附分析(ELISA)(例如，夹心ELISA)。免疫分析法，例如，如上所述的ELISA，可由本领域技术人员根据已知方法进行。
利用抗GPC3 N-端肽抗体检测测试样品中的GPC3蛋白的通用检测方法包括例如，将抗GPC3 N-端肽抗体固定到支持物上，向支持物上加入测试样品，温育使GPC3蛋白结合到抗GPC3 N-端肽抗体上，冲洗支持物，以及检测通过抗GPC3 N-端肽抗体与支持物结合的GPC3蛋白。
用于本发明的支持物包括例如，不溶性多糖，诸如琼脂糖和纤维素，合成树脂，诸如硅树脂，聚苯乙烯树脂，聚丙烯酰胺树脂，尼龙树脂和聚碳酸酯树脂，以及不溶性支持物，诸如，玻璃。这些支持物可采用珠子和平板的形式。在珠子的情形下，可使用填充有珠子的柱子。在平板的情形下，可使用多孔平板(例如，96孔多孔板)和生物传感器芯片。抗-GPC3 N-端肽抗体通过通用方法，诸如化学结合和物理吸附可结合至支持物上。这种支持物可商购。
抗GPC3 N-端肽抗体与GPC3蛋白的结合通常在缓冲液中进行。例如，磷酸缓冲液，Tris缓冲液，柠檬酸缓冲液，硼酸盐缓冲液，以及碳酸盐缓冲液可用作缓冲液。温育在常用条件下实施，例如在4℃-室温下温育1-24小时。温育后冲洗可使用任何不抑制GPC3蛋白与抗GPC3 N-端肽抗体结合的溶液。例如，可使用含有诸如Tween 20的表面活性剂的缓冲液。
对于本发明检测GPC3蛋白的方法而言，除了含有待测GPC3蛋白的测试样品之外，可放置对照样品。对照样品包括例如，不含GPC3蛋白的阴性对照样品或含有GPC3蛋白的阳性对照样品。在此情形下，测试样品中的GPC3蛋白的检测方法是比较利用不含GPC3蛋白的阴性对照样品获得的结果以及利用含有GPC3蛋白的阳性对照样品获得的结果。另外，制备一系列浓度连续变化的对照样品，并且以数值得到在单个对照样品中的检测结果，从而制备标准曲线。基于标准曲线，在测试样品中所含的GPC3蛋白根据测试样品的数值可进行定量确定。
通过抗GPC3 N-端肽抗体结合到支持物上的GPC3蛋白的检测的优选实施方案包括的方法采用标记有标记物质的抗GPC3 N-端肽抗体。
例如，使测试样品与固定在支持物上的抗GPC3抗体接触，然后冲洗，从而利用特异性识别GPC3蛋白的标记抗体检测GPC3蛋白。
在此情形下，固定在支持物上的抗GPC3 N-端肽抗体和标记有标记物质的抗GPC3 N-端肽C抗体可识别GPC3分子的同样表位，但优选识别不同的表位。
采用一般公知的方法，可标记抗GPC3 N-端肽抗体。任何本领域技术人员公知的的标记物质均可使用，包括例如，荧光染料，酶，辅酶，化学发光物质和放射性物质。标记物质的具体例子包括例如，放射性同位素(32p，14C，125I，3H和131I)，荧光素，罗丹明，丹磺酰氯，伞形酮，荧光素酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，腊根过氧化物酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，微过氧化物酶，和生物素。优选地，在生物素用作标记物质的情形下，在加入生物素标记的抗体后再加入与诸如碱性磷酸酶的酶结合的亲和素。对于抗GPC3抗体与标记物质结合而言，可使用任何已知的方法，诸如戊二醛法，马来酰亚胺法，吡啶基二硫化物法以及高碘酸盐法。
具体而言，向诸如平板的支持物中加入含有抗GPC3 N-端肽抗体的溶液以固定抗GPC3 N端肽抗体。冲洗平板后，为了防止非特异蛋白结合，平板用例如BSA封闭。再次冲洗平板后，向其中加入测试样品。温育后，冲洗平板，加入标记的抗GPC3抗体。适当温育后，冲洗平板，检测遗留在平板上的标记抗GPC3抗体。检测可通过本领域技术人员已知的方法进行。例如，在用放射性物质标记的情形下，检测可通过液体闪烁或RIA方法进行。在用酶标记的情形下，可加入各自酶的底物以采用分光光度计经过例如显色而检测酶-底物变化。这种底物的具体例子包括：2，2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，1，2-亚苯基二胺(邻亚苯基二胺)，以及3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TME)。在用荧光物质标记的情形下，荧光物质可通过荧光光度计进行检测。
根据本发明，GPC3蛋白的检测方法的尤其优选的实施方案包括利用标记有生物素和亲和素的抗GPC3 N-端肽抗体。
具体而言，向诸如平板的支持物中加入含有抗GPC3 N-端肽抗体的溶液以固定抗GPC3 N-端肽抗体。冲洗平板后，为了防止非特异蛋白结合，抗体用例如BSA封闭。再次冲洗平板后，向其中加入测试样品。温育后，冲洗平板，加入生物素标记的抗GPC3抗体。适当温育后，冲洗平板，加入与诸如碱性磷酸酶或过氧化物酶的酶共轭的亲和素。温育后，冲洗平板，加入对应于同亲和素共轭的各种酶的底物，利用酶-底物变化作为指示剂检测GPC3蛋白。
根据本发明检测GPC3蛋白的方法的另一实施方案包括使用特异性识别GPC3蛋白的一级抗体和特异性识别一级抗体的二级抗体。
例如，将测试样品与固定在支持物上的抗GPC3 N-端肽抗体接触。温育后，冲洗支持物，并利用一级抗GPC3抗体和特异性识别一级抗体的二级抗体，对冲洗后与支持物结合的GPC3蛋白进行检测。在此情形下，二级抗体优选标记有标记物质。
具体而言，向诸如平板的支持物中加入含有抗GPC3 N-端肽抗体的溶液以固定抗GPC3 N-端肽抗体。冲洗平板后，为了防止非特异蛋白结合，抗体用例如BSA封闭。再次冲洗平板后，向其中加入测试样品。温育后，冲洗平板，加入一级抗GPC3抗体。适当温育后，冲洗平板，加入特异性识别一级抗体的二级抗体。适当温育后，冲洗平板，并检测遗留在平板上的二级抗体。二级抗体的检测可采用上述方法进行。
根据本发明，检测GPC3蛋白的方法的另一实施方案包括利用聚集反应。在此方法中，利用致免有抗GPC3 N-端肽抗体的载体可检测GPC3。任何载体可用作以抗体致免的载体，只要载体是不溶性和稳定的，并且不进行非特异性反应即可。例如，可使用乳胶粒子，班脱土，火棉胶，高岭土和固定的羊红细胞。优选使用乳胶粒子。乳胶粒子包括例如，聚苯乙烯乳胶粒子，苯乙烯-丁二烯共聚物乳胶粒子，以及聚乙烯甲苯乳胶粒子。优选使用聚苯乙烯乳胶粒子。在致免粒子与样品混合，并搅拌给定的时间段后，通过裸眼观察聚集可检测GPC3，这是因为样品中所含的GPC3抗体浓度越高，表明这种粒子的聚集水平越高。此外，利用分光光度计等可对聚集的浊度进行测量以检测GPC3。
根据本发明，检测GPC3蛋白的方法的另一实施方案包括使用具有表面等离子体共振现象的生物传感器。具有表面等离子体共振现象的生物传感器利用痕量没有标记的蛋白使蛋白-蛋白相互作用能实时观察成表面等离子体共振信号。例如，利用诸如BIAcore(生产商为Pharmacia)的生物传感器，可检测GPC3蛋白与抗GPC3 N-端肽抗体的结合。具体而言，将测试样品与具有固定其上的抗GPC3 N-端肽抗体的传感器芯片接触，并且使与抗GPC3 N-端肽抗体结合的GPC3蛋白检测成共振信号的变化。
利用各种不同的全自动实验室设备，本发明的检测方法可实现自动化，以便每次能检测大量样品。
本发明目的是提供癌症诊断试剂或试剂盒，用于检测测试样品中的GPC3蛋白。诊断试剂或试剂盒至少含有抗GPC3 N-端肽抗体。在诊断试剂或试剂盒基于EIA的情形下，含有用于固定抗体的载体，或抗体可预先与载体结合。在诊断试剂或试剂盒基于利用诸如乳胶的载体的聚集方法的情形下，试剂或试剂盒含有其上吸附抗体的载体。此外，试剂盒可适当地含有例如，封闭溶液，反应溶液，反应终止溶液和用于处理样品的试剂。
3.利用抗GPC3 C-端肽抗体破坏癌细胞以及利用相同抗体进行癌症治疗
(1)确定抗体活性
利用已知技术(抗体：实验室手册(Antibodies A LaboratoryManual)，Harlow，David Lane主编，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，可分析用于本发明的抗体的抗原结合活性和抑制其配体-受体结合的活性(Harada，A.等，International Immunology(1993)5，681-690)。
分析用于本发明的抗GPC3 C-端肽抗体的抗原结合活性的方法包括ELISA(酶联免疫吸附分析)，EIA(酶免疫分析)，RIA(放免分析)和荧光抗体法。在酶免疫分析中，向包被有GPC3 C-端肽的平板中加入含有抗GPC3 C-端肽抗体的样品，例如生产抗GPC3 C-端肽抗体的细胞的培养上清液，或加入纯化抗体。加入标记有酶，诸如碱性磷酸酶的二级抗体，温育和冲洗平板，然后加入诸如p-硝基苯基磷酸的酶底物，以测定吸光度和评价抗原结合活性。
为了确定用于本发明的抗体的活性，测量抗GPC3 C-端肽抗体的中和活性。
(2)细胞毒性
为治疗目的，用于本发明的抗体优选具有作为细胞毒性的ADCC活性或CDC活性。
ADCC活性的分析方法是将效应细胞，靶细胞和抗GPC3 C-端肽抗体混合在一起，并且查验ADCC水平。小鼠脾细胞，和分离自人外周血液或骨髓的单核细胞等可用作效应细胞。人细胞系，诸如人肝癌系HuH-7可用作靶细胞。靶细胞预先用51Cr标记，并与抗GPC3 C-端肽抗体温育，然后向靶细胞中加入适当比例的效应细胞，以及温育。温育后，收集上清液，以计算上清液中的放射性，从而分析ADCC活性。
此外，CDC活性的分析方法是将上述标记的靶细胞与抗GPC3 C-端肽抗体混合，随后加入补体，以及计算温育后上清液中的放射性。
抗体行使细胞毒性，需要Fc部分。在本发明的细胞增殖的抑制剂利用抗体的细胞毒性的情形下，用于本发明的抗GPC3 C-端肽抗体优选含有Fc部分。
(3)细胞破坏
本发明的抗GPC3 C-端肽抗体也可用于细胞破坏，尤其是癌细胞的破坏。此外，本发明的抗GPC3 C-端肽抗体可用作抗癌剂。被本发明的抗体治疗性处理和预防的癌症包括但不限于肝癌，肺癌，肠癌，乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌和淋巴癌，优选是肝癌。
(4)施用方法和药物制剂
本发明的细胞破坏剂或抗癌剂用于治疗性处理或缓解由异常细胞生长所导致的疾病，尤其是癌症的目的。
有效剂量的选择范围为0.001-1,000mg/kg体重。同样，有效剂量的选择范围为0.01-100,000mg/体重/患者。然而，含有本发明的抗GPC3C-端肽抗体的治疗剂的剂量不受上述剂量的限制。
施用本发明治疗剂的时间在疾病的临床症状发作前后。
含有本发明的抗GPC3C-端肽抗体作为活性成分的治疗剂可通过常规方法配制(Remington’s Pharmaceutical Science，最新版，MarkPublishing Company，Easton，USA)，并还可含有可药用载体和添加剂。
这种载体和药物添加剂的例子包括水，可药用有机溶剂，胶原蛋白，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羧基乙烯基聚合物，羧基甲基纤维素钠，聚丙烯酸钠，藻酸钠，水溶性右旋糖苷，羧基甲基淀粉钠，果胶，甲基纤维素，乙基纤维素，黄原胶，阿拉伯胶，酪蛋白，琼脂，聚乙二醇，二甘油，甘油，丙二醇，凡士林，石蜡，硬脂醇，硬脂酸，人血清白蛋白(HSA)，甘露醇，山梨醇，乳糖和可用作药物添加剂的表面活性剂。
在实践中，依据本发明治疗剂的剂型，选择添加剂或其组合。然而，添加剂不限于上述这些添加剂。在治疗剂用于注射制剂的情形下，将本发明纯化的抗GPC3 C-端肽抗体溶于溶剂，诸如生理盐水，缓冲液和葡萄糖溶液，以及加入诸如Tween 80，Tween 20，明胶和人血清白蛋白的吸附防止剂。此外，治疗剂以冻干的剂型提供，并在用前复溶。例如，甘露醇的糖醇和葡萄糖和食糖可用作冻干的赋形剂。
附图简述
图1的条线图示出利用基因芯片对GPC3 mRNA表达分析的结果，其中图1A表示GPC3表达，而图1B表示α-胎蛋白(AFP)的表达。水平轴上的NL，CH，LC，WD，MD和PD分别代表正常肝脏，肝炎炎性损伤，肝硬化损伤，分化良好的癌症，分化中度的癌症和分化差的癌症。
图2示出如用CBB染色，纯化的可溶性GPC3的硫酸乙酰肝素加成型和GPC3核心蛋白的图像。
图3的条线图示出GPC3基因在人肝癌中的表达。
图4示出利用抗GPC3抗体对可溶形式的核心蛋白进行蛋白质印迹的结果。
图5示出利用抗GPC3抗体进行夹心ELISA的原理。
图6示出利用M6B1和M18D4对GPC3进行夹心ELISA的标准曲线图。
图7为GPC3结构的示意图。
图8示出ELISA中所用的抗GPC3抗体的组合。
图9示出利用多种不同组合的抗GPC3抗体，GPC3夹心ELISA系统的标准曲线图。
图10示出抗GPC3抗体的ADCC活性的分析结果。
图11示出抗GPC3抗体的CDC活性的分析结果。
实施本发明的最佳方式
本发明现在以下列实施例具体加以描述。然而，本发明不受实施例的限制。
在本说明书所述的实施例中，使用下列材料。
使用可溶形式的GPC3和可溶形式的GPC3核心蛋白的表达载体pCXND2和pCXND3，所述载体是将DHFR基因和新霉素抗性基因整合在pCAGGS中而制备的。
DXB11购自ATCC。对培养而言，使用5％FBS(GIBCO BRL CAT#10099-141，Lot#AO275242/最低必需培养基α培养基(αMEM(+))(GIBCO BRL CAT#12571-071)/1％青霉素-链霉素(GIBCOBRL CAT#15140-122)。对选择表达各种蛋白的DXB11的稳定细胞系而言，单独使用500μg/mL庆大霉素的氨基糖苷(Geneticin)(GIBCOBRL CAT#10131-027)/5％FBS/不含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的αMEM(GIBCO BRL CAT#12561-056)(αMEM(-))/PS或用MTX补充至终浓度25nM。
HepG2购自ATCC，并维持在10％FBS/Dulbecco氏修饰Eagle培养基(DMEM)(GIBCO BRL CAT#11995-065)/PS中。
杂交瘤维持在10％FBS/RPMI 1640/1×HAT培养基补体(SIGMACAT#H-0262)/0.5×BM-Condimed H1杂交瘤克隆补体(Roche CAT#1088947)。
实施例1
克隆和表达分析人GPC3(GPC3)cDNA
克隆编码人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(下文称GPC3)的全长cDNA
采用一般方法从肠癌细胞系Caco 2制备的第一链cDNA作为模板以及Advantage 2试剂盒(Clontech Cat.No.8430-1)，通过PCR扩增编码人GPC3的全长cDNA。具体而言，将50μl含有2μl衍生自Caco2的cDNA的反应溶液，1μl有义引物(SEQ ID NO：1)，1μl反义引物(SEQID NO：2)，5μl Advantage210×PCR缓冲液，8μl dNTP混合物(1.25mM)和1.0μl Advantage聚合酶混合物进行35个循环：94℃1分钟，63℃30秒，以及68℃3分钟。利用ABI3100 DNA测序仪对PCR扩增产物(通过pGEM-T Easy载体系统I(Promega Cat No A1360)插入在TA载体pGEM-T easy中)进行测序以确认编码全长人GPC3的cDNA得到分离。SEQ ID NO：3所示的序列表示人GPC3基因的核苷酸序列，而SEQ ID NO：4所示序列表示人GPC3蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1：GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT
SEQ ID NO：2：GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC
利用GeneChip对人GPC3mRNA进行表达分析
利用GeneChipTM UG-95A靶(Affymetrix)对24个肝癌损伤(分化良好的癌症：WD；中度分化的癌症：MD；分化差的癌症：PD)病例，16个非癌症损伤(肝炎损伤：CH，硬化损伤：LC)肝癌病例，8例正常肝脏：NL(知情同意书，获自Tokyo University，School of Medicine andSaitama Cancer Center)的mRNA表达进行分析。具体而言，利用ISOGEN(Nippon Gene)从单个组织中制备总RNA，根据表达分析技术手册(Affymetrix)，从中分别取出15μg总RNA用于基因表达分析。
如图1所示，人GPC3基因的mRNA表达水平(探针组ID：39350at)在许多病例中明显高于正常肝组织的表达，尽管肝癌处于分化阶段。此外，对目前最常用作肝癌诊断标记的α胎蛋白的mRNA表达(探针组ID：40114at)进行比较。显示即使在分化良好的癌症中，几乎没有这样的α胎蛋白的mRNA表达，观察到充分提高的GPC3的mRNA表达，以及显示GPC3的mRNA表达的活化比是更高的。因此，可以认为，GPC3检测作为早期肝癌的诊断方法是有用的。
实施例2
抗GPC3抗体的制备
可溶形式的人GPC3的制备
作为用于制备抗GPC3抗体的材料，对C-端缺少疏水区的可溶形式的GPC3蛋白进行制备。
利用来自Tokyo University，Adavanced Technology Institute的含有完整的全长人GPC3 cDNA的质粒DNA，构建用于表达可溶形式的GPC3 cDNA的质粒DNA。利用设计去除C-端(氨基酸564-580)疏水区的下游引物(5’-ATA GAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCGC-3’)(SEQ ID NO：5)和带有EcoRI识别序列和添加了Kozak序列的上游引物(5’-ATA GGA TCC CTT CAG CGG GGA ATG AAC GTTC-3’)(SEQ ID NO：6)进行PCR。所得PCR片段(1711bp)克隆在pCXND2-Flag中。制备的表达质粒DNA导入CHO细胞系DXB11。用500μg/mL庆大霉素的氨基糖苷选择产生高度表达可溶形式的GPC3的CHO系。
利用1700-cm2转瓶，将高度表达可溶形式的GPC3的CHO系大规模培养，收集培养上清液进行纯化。将培养上清液上样到DEAESepharose Fast Flow(Amersham CAT#17-0709-01)，冲洗后，用含有500mM NaCl的缓冲液洗脱。随后，产物用抗Flag M2琼脂糖亲和凝胶(SIGMA CAT#A-2220)进行亲和纯化，并用200μg/mL Flag肽洗脱。在用Centriprep-10(Millipore Cat#4304)浓缩后，通过Superdex 200HR10/30(Amersham CAT#17-1088-01)的凝胶过滤去除Flag肽。最后，产物用DEAE Sepharose Fast Flow柱浓缩，并且用不含Tween 20的PBS(含有500mM NaCl)代替缓冲液洗脱。
可溶形式的人GPC3核心蛋白的制备
利用野生型人GPC3 cDNA作为模板，通过组装PCT制备cDNA，其中Ser 495和Ser 509用Ala取代。引物设计的方式使得His标签可添加到C端。所得cDNA克隆到pCXND3载体中。制备的表达质粒DNA导入DXB11系，接着用500μg/mL庆大霉素的氨基糖苷选择从而获得高度表达可溶形式的GPC3核心蛋白的CHO系。
利用1700-cm2转瓶进行大规模培育，收集培养上清液用于纯化。将上清液上样到Q Sepharose Fast Flow(Amersham CAT#17-0510-01)，冲洗后，用含有500mM NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱。随后，产物用螯合Sepharose Fast Flow(Amersham CAT#17-0575-01)进行亲和纯化，并用梯度10-150mM咪唑洗脱。最后，产物用Q Sepharose Fast Flow柱浓缩，并用含有500mM NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示50-300kDa的拖尾样条带和约40kDa的条带。图2示出电泳结果。GPC3为69kDa的蛋白多糖，在其C端有硫酸乙酰肝素加成序列。据认为，拖尾样条带对应于修饰有硫酸乙酰肝素的GPC3。氨基酸测序结果表明，约40kDa的条带在N-端片段中具有起点。因此，可以预计GPC3是或多或少被切割的。
为了在下列杂交瘤的筛选中去除抗硫酸乙酰肝素的抗体，在可溶形式的GPC3核心蛋白中，硫酸乙酰肝素加成信号序列Ser 495和Ser509用Ala取代。高度表达蛋白的CHO细胞系如上制备，并利用His-标签对培养上清液进行亲和纯化。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示70kDa，40kDa和30kDa的三条带。氨基酸测序表明，30kDa的条带为GPC3的C-端片段。C-端片段起始于Ser 359或Val 375。因此，可以预计GPC3受到了某些酶的切割。30kDa的条带为何未在硫酸乙酰肝素加成型的GPC3中被观察到是由于添加有硫酸乙酰肝素，所述片段形成拖尾样条带。新发现GPC3在特定氨基酸序列处受到酶的切割，但是其生物学意义还未阐明。
本发明人基于下列结果提出了假说：即使是在肝癌患者中，膜上的GPC3会被切割并在血液中分泌成可溶形式。与肝癌标记的AFP比较，发现GPC3的基因表达水平在更早期肝癌患者中较高(图1)。为了检查作为新型肿瘤标记比AFP具有更高临床实用性的可能性，制备抗GPC3抗体以构建如实施例2或下文所述的夹心ELISA系统。
抗GPC3抗体的制备
由于人GPC3与小鼠GPC3的同源性在氨基酸水平上高至94％，因此可以认为，用人GPC3免疫正常小鼠将难以得到抗GPC3抗体。因此，具有自身免疫疾病的MRL/lpr小鼠用作待免疫动物。5只MRL/lpr小鼠(CRL)用可溶形式的GPC3免疫。对于第一次免疫，将免疫原蛋白调节至100μg/动物，用FCA(弗氏完全佐剂(H37Ra)，Difco(3113-60)，Becton Dickinson(cat#231131))乳化，然后皮下施用给小鼠。2周后，将蛋白调节至50μg/动物，并用FIA(弗氏不完全佐剂，Difco(0639-60)，Becton Dickinson(cat#263910))乳化后用于皮下施用给小鼠。从此每间隔1周，进行加强免疫，总共5次。对于最后的加强免疫，蛋白用PBS稀释至50μg/动物，施用在臀脉。利用包被有GPC3核心蛋白的免疫平板，通过ELISA，可确认抗GPC3的血清抗体效价是饱和的。将小鼠骨髓瘤细胞P3U1和小鼠脾细胞混合在一起，使得细胞融合在PEG1500(Roche Diagnostics，cat#783641)存在下进行。所得混合物接种在96孔培养板中。从次日起，用HAT培养基选择杂交瘤，通过ELISA筛选培养上清液。阳性克隆子通过有限稀释方法进行单克隆。所得单克隆子进行规模放大培养，并收集培养上清液。利用GPC3核心蛋白的结合活性作为标记通过ELISA进行筛选，以获得6个具有强结合能力的抗GPC3抗体的克隆子。
利用Hi Trap蛋白G HP(Amersham CAT#17-0404-01)纯化抗体。将杂交瘤培养物的上清液直接上样到柱上，用结合缓冲液(20mM磷酸钠，pH 7.0)冲洗，并用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7)洗脱。洗脱液收集至含有中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH 9.0)的试管中立即中和。在抗体组分合并后，所得组分池对0.05％Tween 20/PBS透析过夜，并且用缓冲液置换一整天。向纯化抗体中加入NaN3至0.02％。抗体储存在4℃。
抗GPC3抗体的分析
利用山羊抗小鼠IgG(γ)(ZYMED CAT#62-6600)和碱性磷酸酶-山羊抗小鼠IgG(γ)(ZYMED CAT#62-6622)以及商购的纯化小鼠IgG1抗体(ZYMED CAT#02-6100)作为标准通过小鼠IgG夹心ELISA对抗体浓度进行分析。
利用ImmunoPure单克隆抗体分型试剂盒II(PIERCE CAT#37502)，通过随附手册所述的方法，对抗GPC3抗体进行分型。分型结果表明，所有抗体皆为IgG1型抗体。
利用GPC3核心蛋白，通过蛋白质印迹，对抗GPC3抗体的表位加以分类。将可溶形式的GPC3核心蛋白以100ng/泳道上样到10％SDS-PAGE mini(TEFCO CAT#01-075)上电泳(60V 30分钟；120V 90分钟)，随后利用转印迹SD半干电泳转移池(BIO-RAD)转移至Immobilon-P(Millipore CAT#IPVH R85 10)上(15V 60分钟)。膜用TBS-T(0.05％Tween 20，TBS)轻轻冲洗后，膜与含有5％脱脂奶的TBS-T一起振荡1小时(室温下)或过夜(4℃)。与TBS-T一起振荡约10分钟后，振荡下加入各种用含有1％脱脂奶的TBS-T稀释至0.1-10μg/ml的抗GPC3抗体，历时1小时。膜用TBS-T冲洗(10分钟×3次)，并与用含1％脱脂奶的TBS-T稀释至1∶1000的HRP-抗小鼠IgG抗体(AmershamCAT#NA 931)一起振荡1小时，再用TBS-T冲洗(10分钟×3次)。ECL-PLUS(Amersham RPN 2132)用于生色反应。HyperfilmECL(Amersham CAT#RPN 2103K)用于检测。图4示出蛋白质印迹分析的结果。对于分类，已确定的是，与40kDa的条带反应的抗体在N端具有表位，而与30kDa的条带反应的抗体在C端具有表位。作为识别N端的抗体，得到了M6B1，M18D4，和M19B11，而作为识别C端的抗体，得到了M3C11，M13B3，和M3B8。利用BIACORE分析的结果表明，单个抗体的KD值为0.2-17.6nM。
实施例3
分泌形式的GPC3的检测
小鼠异种移植模型
将3,000,000个人肝癌HepG2细胞移植在6周雌性SCID小鼠(FoxCHASE C.B-17/Icr-scidJcl，JapanClair)和裸小鼠(BALB/cAJcl-nu，JapanClair)的肚皮下。53天后，当肿瘤充分形成时，全血取自HepG2-移植的SCID小鼠#1，3和4的后腔静脉(posterior cava)。血浆在EDTA-2Na和抑肽酶(aprotinin)(Nipro Neotube真空采血管，NIPRO，NT-EA0205)存在下制备，并在-20℃下储存直到分析那天。在HepG2-移植的SCID小鼠#2的情形下，HepG2移植后62天采集全血。在HepG2-移植的裸小鼠#1和#2的情形下，HepG2移植后66天采集全血。作为对照，通过同样程序从同样年龄的正常SCID小鼠中制备血浆。
夹心ELISA
为了检测血液中分泌形式的GPC3，构建GPC3的夹心ELISA系统。M6B1用作抗体包被在96孔板中。标记有生物素的M18D4用作抗体检测与M6B1结合的GPC3。对于生色反应，DAKO的AMPAK用于实现高的检测灵敏度。
96孔免疫板包被有用包被缓冲液(0.1M NaHCO3，pH 9.6，0.02w/v％NaN3)稀释的抗GPC3抗体，得到浓度为10μg/mL，并在4℃下温育过夜。次日，平板用300μl/孔的冲洗缓冲液(0.05v/v％，Tween 20，PBS)冲洗3次，并加入200μl的稀释缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.1，1mM MgCl2，150mM NaCl，0.05v/v％Tween 20，0.02w/v％NaN3，1w/v％BSA)用于封闭。室温下储存几小时或4℃下储存过夜后，加入用稀释缓冲液适当稀释的小鼠血浆或培养上清液，并在室温下温育1小时。以300μl/孔用RB冲洗3次后，加入用稀释缓冲液稀释至10μg/mL的生物素标记的抗GPC3抗体，再在室温下温育1小时。以300μl/孔用RB冲洗3次后，加入用稀释缓冲液稀释至1/1000的AP链亲和素(ZYMED)，再在室温下温育1小时。以300μl/孔用冲洗缓冲液冲洗5次后，加入AMPAK(DAKO CAT#K6200)，根据随附的方案，用于生色反应，并且通过微量滴定板读数仪测量吸光度。
对于抗体的生物素酰化而言，使用Roche的生物素标记试剂盒(CAT#1 418 165)。Spreadsheet软件GlaphPad PRISM(GlaphPad softwareInc.ver.3.0)用于计算样品中可溶形式的GPC3的浓度。图5示出该实施例中夹心ELISA的原理。
采用纯化的可溶形式的GPC3，制备标准曲线。结果，可组建检测极限为几个ng/mL的系统。图6显示利用M6B1和M18D4进行GPC3夹心ELISA的标准曲线。利用该系统，尝试检测HepG2的培养上清液和移植有人肝癌HepG2的小鼠血清中分泌形式的GPC3。在HepG2的培养上清液和移植有人肝癌HepG2的小鼠血清中检测到分泌形式的GPC3，而在对照培养基和对照小鼠血清中分泌形式的GPC3低于检测极限。在纯化的可溶形式的GPC3的浓缩基础上，可溶形式的GPC3在HepG2的培养上清液中为1.2μg/mL，而在小鼠血清中为23-90ng/mL(表1)。
表1
在移植有HepG2的小鼠血浆中分泌形式的GPC3的分析(ng/mL)
  肿瘤体积(mm3)   M6B01(N)-M1BD4(N)   M19B11(N)-M18D4(N)  M6B1(N)-BioM3C11(C)   M13B3(C)-BioM18D4(N)  M13B3(C)-BioM3B8(C)
  HepG2的培养上清液   1190   1736  224   234  ＜1
  HepG2移植的SCID小鼠#1   2022   65.4   76.9  ＜10   ＜10  ＜10
  HepG2移植的SCID小鼠#2   1706   71.7   94.8  ＜10   ＜10  ＜10
  HepG2移植的SCID小鼠#3   2257   90.3   113.9  ＜10   ＜10  ＜10
  HepG2移植的SCID小鼠#4   2081   87.3   107.3  ＜10   15.0  ＜10
  HepG2移植的裸小鼠#1   1994   58.7   53.6  19.7   35.5  102.2
  HepG2移植的裸小鼠#2   190 &549   22.9   33.6  ＜10   11.5  40.6
  正常SCID小鼠#1   0   ＜10   ＜10  ＜10   ＜10  ＜10
  正常SCID小鼠#2   0   ＜10   ＜10  ＜10   ＜10  ＜10
  正常SCID小鼠#3   0   ＜10   ＜10  ＜10   ＜10  ＜10
分泌形式的GPC3的结构
检查血液分泌性GPC3是否具有如预先认定的N-端片段的结构。在分泌形式的GPC3为N-端片段的情形下，可以认为，分泌形式的GPC3不会被夹心ELISA结合识别N端的抗体和识别C端的抗体所检测。利用3种类型的各种识别N端片段的抗体和各种识别C端片段的抗体，可组建各种不同组合的夹心ELISA系统。图7显示分泌形式的GPC3的结构，而图8显示抗体的组合。图9示出夹心ELISA的标准曲线。表1显示分析结果。如表1所示，利用识别N端片段的抗体组合，分泌形式的GPC3的检测值在HepG2的培养上清液和移植有人肝癌HepG2的小鼠血清中更高，同时在许多来自其系统含有识别C端片段的抗体的小鼠样品中检测低于检测极限。因此，可以预计分泌形式的GPC3主要包括N端片段。因此，这暗示血液分泌性GPC3的检测通过利用抗包含GPC3氨基酸残基1-374的氨基酸序列的抗体可能具有高灵敏度。
实施例4
抗GPC3小鼠-人嵌合抗体的制备
利用提取自生产能够结合到人GPC3的抗体(识别C端的人GPC3抗体：M3C11，M1E07；识别N端的人GPC3抗体：M19B11，M18D04，M5B09，M10D02)的杂交瘤的总RNA，通过RT-PCR扩增抗体可变区的cDNA。利用RNeasy植物微型试剂盒(生产商为QIAGEN)，从1×107个杂交瘤细胞中提取总RNA。利用1μg总RNA，以及利用SMARTRACE cDNA扩增试剂盒(生产商为CLONTECH)，互补于小鼠IgG1恒定区序列的合成寡核苷酸MHC-IgG1(SEQ ID NO：7)或互补于小鼠κ链恒定区的核苷酸序列的合成寡核苷酸κ(SEQ ID NO：8)，对基因的5’端片段进行扩增。在42℃下反转录进行1小时30分钟。50μl的PCR溶液含有5μl的10×Advantage 2PCR缓冲液，5μl的10×通用引物AMix，0.2mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1μl的Advantage2聚合酶Mix(全部由CLONTECH生产)，2.5μl的反转录产物，以及10pmole合成寡核苷酸MHC-IgG1或κ。起始温度94℃下30秒后，下列循环重复5次：94℃5秒和72℃3分钟；下列循环重复5次：94℃5秒，70℃10秒和72℃3分钟，以及下列循环重复25次：94℃5秒，68℃10秒以及72℃3分钟。最后，反应产物在72℃下加热7分钟。利用QIAquick凝胶提取试剂盒(生产商为QIAGEN)从琼脂糖凝胶中纯化出单个PCR产物后，将产物克隆在pGEM-T Easy载体(生产商为Promega)，以及确定核苷酸序列。
然后，将H链和L链的可变区的序列连接到人H链和L链的恒定区。利用互补于各种抗体的H链可变区的5’端核苷酸序列并且具有Kozak序列的合成寡核苷酸以及互补于3’端核苷酸序列并且具有NheI位点的合成寡核苷酸，进行PCR。所得PCR产物克隆到pB-CH载体，其中人IgG1恒定区插入在pBluescript KS+载体(生产商为TOYOBO)。小鼠H链可变区和人H链(γ1链)恒定区通过NheI位点连接在一起。制备的H链基因片段克隆在表达载体pCXND3。构建载体pCXND3的方案如下所述。为了使编码抗体H链的基因和载体序列从DHFR-ΔE-rvH-PM1-f中分开(参见WO 92/19759)，载体在限制性酶EcoRI/SmaI位点处消化以仅回收载体序列。随后，载体序列克隆在EcoRI-NotI-BamHI接头(生产商为Takara Shuzo Co.，Ltd.)。该载体命名为pCHO1。pCHO1表达DHFR基因的区域克隆在pCXN的限制性酶HindIII位点(Niwa等，Gene 1991，108，193-200)。所得载体命名为pCXND3。各种质粒中所含的抗GPC3小鼠-人嵌合抗体(M3C11，M1E07，M19B11，M18D04)的H链的核苷酸序列分别示成SEQ IDNOS：9，11，13和15。其氨基酸序列分别示成SEQ ID NOS：10，12，14和16。此外，利用互补于各种抗体的L链可变区的5’端核苷酸序列并且具有Kozak序列的合成寡核苷酸以及互补于3’端核苷酸序列并且具有BsiWI位点的合成寡核苷酸，进行PCR。所得PCR产物克隆到pB-CL载体，其中人κ链恒定区预先插入在pBluescript KS+载体(生产商为TOYOBO)。人L链可变区和恒定区通过BsiWI位点连接在一起。制备的L链基因片段克隆在表达载体pUCAG。载体pUCAG的制备方法是用限制性酶BamHI消化pCXN(Niwa等，Gene 1991，108：193-200)得到2.6kb片段，然后克隆到pUC19载体(生产商为TOYOBO)的限制性酶BamHI位点中。各种质粒中所含的抗GPC3小鼠-人嵌合抗体(M3C11，MIE07，M19B11，M18D04)的L链的核苷酸序列分别示成SEQ ID NOS：17，19，21和23。其氨基酸序列分别示成SEQ ID NOS：18，20，22和24。
为了制备抗GPC3小鼠-人嵌合抗体的表达载体，将通过用限制性酶III(生产商为Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化其中插入有L链基因片段的pUCAG载体而获得的基因片段克隆到其中插入有H链基因的pCXND3的限制性酶HindIII切割位点。质粒将在动物细胞中表达新霉素抗性基因，DHFR基因和抗GPC3小鼠-人嵌合抗体基因。
稳定表达的基于CHO的细胞系(DG44系)的制备如下。利用基因脉冲仪II(生产商为Bio Rad)通过电穿孔方法导入基因。将25μg抗GPC3小鼠-人嵌合抗体的各种表达载体和0.75ml悬浮在PBS中的CHO细胞(1×107细胞/ml)混合在一起，并在冰上冷却10分钟，然后转移到小杯中并接受1.5kV和25μFD的脉冲。室温下回收10分钟后，将通过电穿孔处理的细胞悬浮在40mL含有1×HT补体(生产商为Invitrogen)的CHO-S-SFMII培养基(生产商为Invitrogen)。利用同样培养基稀释50倍，并以100μl/孔加入96孔培养板中。在CO2培养箱(5％CO2)中培养24小时后，加入庆大霉素的氨基糖苷(生产商为Invitrogen)至0.5mg/mL，继续培养2周。通过下列浓缩法，对来自庆大霉素的氨基糖苷抗性转化细胞菌落的孔的培养上清液中的IgG进行分析。高生产率的细胞系以放大的规模扩增。将稳定表达抗GPC3小鼠-人嵌合抗体的细胞系进行大规模培养，并收集培养上清液。
利用山羊抗人IgG(生产商为BIOSORCE)和共轭的山羊抗人IgG碱性磷酸酶(生产商为BIOSORCE)，通过人IgG夹心ELISA，对培养上清液中的IgG浓度进行分析，并且与商购的纯化人IgG(生产商为Cappel)加以比较。
利用Hi Trap蛋白G HP(生产商为Amersham)纯化各种抗GPC3小鼠-人嵌合抗体。将生产抗GPC3小鼠-人嵌合抗体的CHO细胞系的培养上清液直接上样到柱上，并用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7)洗脱。洗脱液收集至含有中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH 9.0)的试管中立即中和。抗体组分合并后，对0.05％Tween 20/PBS透析过夜，并且用缓冲液置换一整天。向纯化抗体中加入NaN3至0.02％，并储存在4℃。
实施例5
稳定表达全长GPC3的CHO细胞系
通过用限制性酶EcoRI(生产商为Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化其中克隆有全长人GPC3 cDNA的pGEM-T Easy载体而获得人GPC3cDNA，并克隆在表达载体pCOS2。构建载体pCOS2的方案描述如下。为了使DHFR-ΔE-rvH-PM1-f(参见WO 92/19759)的抗体H链的基因从载体中分开，载体在限制性酶EcoRI/SmaI位点处消化以仅回收载体序列。随后，载体序列克隆在EcoRI-NotI-BamHI接头(生产商为TakaraShuzo Co.，Ltd.)。该载体命名为pCHOl。去除pCHO1表达DHFR基因的区域，其中插入HEF-VH-gγ1(Sato等，Mol.Immunol.1994，31：3171-381)的新霉素抗性基因的序列。该载体命名为pCOS2。
稳定表达全长人GPC3的细胞系的制备如下。将10μl表达全长人GPC3基因的载体与60μl SuperFect(生产商为QIAGEN)混合在一起，形成复合物，然后加入到CHO细胞系DXB11中导入基因。在CO2培养箱(5％CO2)中培养24小时后，含有庆大霉素的氨基糖苷(生产商为Invitrogen)(终浓度为0.5mg/mL)和10％FBS(生产商为GIBCO BRL)的αMEM(生产商为GIBCO BRL)用于起始选择。收集所得庆大霉素的氨基糖苷抗性菌落，并通过有限稀释方法进行细胞克隆。溶解单个细胞克隆，利用抗GPC3抗体通过蛋白质印迹以确认全长人GPC3的表达，从而获得稳定表达人GPC3的细胞株。
实施例6
利用衍生自人外周血的PBMC进行ADCC分析
(1)人PBMC的制备
用肝素化注射器，从正常对象中采集外周血，用PBS(-)稀释至2倍，并覆盖在Ficoll-PaqueTM PLUS(Amersham Pharmacia Biotech AB)上。离心(500×g，30分钟，20℃)，收集中间层作为单核细胞组分。冲洗3次后，所得组分悬浮在10％FBS/RPMI中以制备人PBMC溶液。
(2)靶细胞的制备
利用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen Corp)将培养在10％FBS/RPMI1640培养基中的HepG2细胞从培养皿分离，以1×104细胞/孔分配在U型底96孔板(Falcon)中，并培养2天。培养后，加入5.55MBq的Cr-51，细胞在5％CO2气体培养箱中37℃下温育1小时。所得细胞用培养基冲洗一次，其中加入50μl的10％FBS/RPMI 1640培养基以制备靶细胞。
(3)Cr释放测试(ADCC活性)
将50μl制成各种浓度的抗体溶液加入到靶细胞中，冰上放置15分钟。随后，加入100μl人PBMC溶液(5×105细胞/孔)，并在5％CO2气体培养箱中37℃下温育4小时。温育后，平板离心，用γ计数仪计算100μl培养上清液中的放射性。通过下列公式确定特异Cr释放比：特异Cr释放比(％)＝(A-C)×100/(B-C)
“A”代表各孔中的平均放射性值(cpm)；“B”代表孔中平均放射性值(cpm)，其中100μl的2％NP-40水溶液(Nonidet P-40，编码No.252-23，Nakarai Tesque)和50μl的10％FBS/RPMI培养基加入到靶细胞；而“C”代表孔中的平均放射性值(cpm)，其中150μl的10％FBS/RPMI培养基加入到靶细胞。测试一式三份，以计算ADCC活性的平均值(％)和标准误差。
结果示于图10。在6种类型的抗GPC3嵌合抗体中，识别C端的抗体ch.M3C11和ch.M1E07行使ADCC活性，而识别N端的抗体ch.M19B11，ch.M18D04，ch.M5E09和ch.M10D02几乎不行使ADCC活性。上述结果表明嵌合抗体的ADCC活性取决于抗体的识别位点。此外，可以预计，识别GPC3 C端的抗体在临床上可能是有用的，这是因为从切割位点识别C端的抗体行使ADCC活性。
实施例7
补体依赖的胞毒活性(CDC活性)的分析
(1)人白蛋白巴比妥缓冲液(HAVB)的制备
将12.75g的NaCl(优级，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，0.5625g的巴比妥钠(优级，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和0.8625g的巴比妥(优级，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)溶解在Milli Q水中至200mL，高压灭菌(121℃，20分钟)。加入100mL高压灭菌的温热Milli Q水。然后，确认所得混合物的pH为7.43(建议pH为7.5)。将此定义成5×巴比妥缓冲液。将0.2205g的CaCl2.2H2O(优级，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)溶解在50ml的Milli Q水中至0.03mol/L。所得溶液定义成CaCl2溶液。将1.0165g的MgCl2.6H2O(优级，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)溶解在50ml的Milli Q水中至0.1mol/L。所得溶液定义成MgCl2溶液。将100mL的5×巴比妥缓冲液，4mL人血清白蛋白(
Figure A20061017240300401
25％，250mg/mL人血清白蛋白浓缩液，Baxter)，2.5mL的CaCl2溶液，2.5mL的MgCl2溶液，0.1g的KCl(优级，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，和0.5g葡萄糖(D(+)葡萄糖，无水葡萄糖，优级，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)溶解在Milli Q水中至500mL。将此定义成HAVB。过滤和灭菌后，所得溶液以设定温度5℃储存。
(2)靶细胞的制备
将如实施例4中制备的细胞膜上表达GPC3的CHO细胞培养在α-MEM核酸(+)补充有10％FBS和0.5mg/mL庆大霉素的氨基糖苷(GIBCO)的培养基(GIBCO)中，利用细胞分离缓冲液(Invitrogen Corp)从培养皿中分离细胞，以1×104细胞/孔分配在平型底96孔板(Falcon)的各孔中，培养3天。培养后，加入5.55MBq的Cr-51，并在5％CO2气体培养箱中37℃下温育1小时。所得细胞用HAVB冲洗2次，其中加入50μl的HAVB以制备靶细胞。
(3)Cr释放测试(CDC活性)
各种嵌合抗体用HAVB稀释制备浓度为40μg/mL的抗体溶液。抗体溶液以50μl加入到靶细胞，然后冰上放置15分钟。随后，以100μl向各孔中加入用HAVB稀释的幼兔补体(Cedarlane)至终浓度30％(抗体终浓度为10μg/mL)，留在5％CO2气体培养箱中37℃下温育90分钟。平板离心后，从各孔回收100μl上清液，并用γ计数仪测量放射性。通过下列公式确定特异Cr释放比：特异Cr释放比(％)＝(A-C)×100/(B-C)
“A”代表各孔中的平均放射性值(cpm)；“B”代表孔中平均放射性值(cpm)，其中100μl的2％NP-40水溶液(Nonidet P-40，编码No.252-23，Nakarai Tesque)和50μl的HAVB加入到靶细胞；而“C”代表孔中的平均放射性值(cpm)，其中150μl的HAVB加入到靶细胞。测试一式三份，以计算CDC活性的平均值(％)和标准误差。
结果示于图11。在6种类型的抗GPC3嵌合抗体中，识别C端的抗体ch.M3C11和M1E07行使CDC活性，而识别N端的抗体ch.M19B11，ch.M18D04，ch.M5E09和ch.M10D02行使低的CDC活性。上述结果表明嵌合抗体的CDC活性取决于抗体的识别位点。此外，可以预计，识别GPC3C端的抗体在临床上可能是有用的，这是因为从切割位点识别C端的抗体行使CDC活性。
工业实用性
如实施例所提示，在肝癌细胞中高度表达的GPC3部分可以分泌形式存在于血液中。由于GPC3的基因表达比肝癌标记AFP在更早期被观察到，GPC3检测预计对癌症检测是有用的。GPC3表达在除了肝癌细胞系外的癌细胞系中，诸如肺癌，肠癌，乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌和淋巴癌。因此，GPC3有可能适用于除了肝癌之外的癌症诊断。
此外，还提示血液中分泌形式的GPC3主要包括约40kDa的N端片段，其以可溶形式的GPC3核心蛋白存在。这表明识别N端片段的抗体可用于这样的诊断中。此外，如果具有ADCC活性和/或CDC活性的识别C端片段的抗体用于治疗性处理肝癌，则抗体可有效抵达肝癌细胞而不会被血液中存在的分泌形式的GPC3所捕获。因此，这些抗体可用作癌细胞破坏剂和抗癌剂。
所有本说明书中列出的出版物的内容全部包含在其中。此外，本领域专业人员会容易地理解，在不背离随附权利要求书中所述的技术范围和实质内容的情况下，对本发明进行多种不同的修饰和改变是可能。本发明的目的还包括这些修饰和改变。
序列表
<110>中外制药株式会社(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA)
<120>抗存在于血液中的GPC3的分泌性N-端肽或C-端肽的抗体
(ANTIBODY AGAINST SECRETED N-TERMINAL PEPTIDE OF GPC3PRESENTED IN BLOOD
OR C-TERMINAL PEPTIDE OF GPC3)
<130>SPI066331-47
<140>PCT/JP03/11318
<141>2003-09-04
<150>PCT/JP02/O8999
<151>2002-09-04
<160>24
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成DNA
<400>1
gatatcatgg ccgggaccgt gcgcaccgcg t                                    31
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成DNA
<400>2
gctagctcag tgcaccagga agaagaagca c                                    31
<210>3
<211>2300
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(109)..(1851)
<400>3
cagcacgtct cttgctcctc agggccactg ccaggcttgc cgagtcctgg gactgctctc     60
gctccggctg ccactctccc gcgctctcct agctccctgc gaagcagg atg gcc ggg      117
                                                     Met Ala Gly
                                                       1
acc gtg cgc acc gcg tgc ttg gtg gtg gcg atg ctg ctc agc ttg gac       165
Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Asp
      5                  10                  15
ttc ccg gga cag gcg cag ccc ccg ccg ccg ccg ccg gac gcc acc tgt       213
Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys
 20                  25                  30                  35
cac caa gtc cgc tcc ttc ttc cag aga ctg cag ccc gga ctc aag tgg       261
His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp
                 40                  45                  50
gtg cca gaa act ccc gtg cca gga tca gat ttg caa gta tgt ctc cct       309
Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro
             55                  60                  65
aag ggc cca aca tgc tgc tca aga aag atg gaa gaa aaa tac caa cta       357
Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu
         70                  75                  80
aca gca cga ttg aac atg gaa cag ctg ctt cag tct gca agt atg gag       405
Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu
     85                  90                  95
ctc aag ttc tta att att cag aat gct gcg gtt ttc caa gag gcc ttt       453
Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe
100                 105                 110                 115
gaa att gtt gtt cgc cat gcc aag aac tac acc aat gcc atg ttc aag       501
Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys
                120                 125                 130
aac aac tac cca agc ctg act cca caa gct ttt gag ttt gtg ggt gaa       549
Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu
            135                 140                 145
ttt ttc aca gat gtg tct ctc tac atc ttg ggt tct gac atc aat gta       597
Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val
        150                 155                 160
gat gac atg gtc aat gaa ttg ttt gac agc ctg ttt cca gtc atc tat       645
Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr
    165                 170                 175
acc cag cta atg aac cca ggc ctg cct gat tca gcc ttg gac atc aat       693
Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn
180                 185                 190                 195
gag tgc ctc cga gga gca aga cgt gac ctg aaa gta ttt ggg aat ttc       741
Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe
                200                 205                 210
ccc aag ctt att atg acc cag gtt tcc aag tca ctg caa gtc act agg       789
Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg
            215                 220                 225
atc ttc ctt cag gct ctg aat ctt gga att gaa gtg atc aac aca act       837
Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr
        230                 235                 240
gat cac ctg aag ttc agt aag gac tgt ggc cga atg ctc acc aga atg       885
Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met
    245                 250                 255
tgg tac tgc tct tac tgc cag gga ctg atg atg gtt aaa ccc tgt ggc       933
Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly
260                 265                 270                 275
ggt tac tgc aat gtg gtc atg caa ggc tgt atg gca ggt gtg gtg gag       981
Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu
                280                 285                 290
att gac aag tac tgg aga gaa tac att ctg tcc ctt gaa gaa ctt gtg       1029
Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val
            295                 300                 305
aat ggc atg tac aga atc tat gac atg gag aac gta ctg ctt ggt ctc       1077
Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu
        310                 315                 320
ttt tca aca atc cat gat tct atc cag tat gtc cag aag aat gca gga       1125
Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly
    325                 330                 335
aag ctg acc acc act att ggc aag tta tgt gcc cat tct caa caa cgc       1173
Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg
340                 345                 350                 355
caa tat aga tct gct tat tat cct gaa gat ctc ttt att gac aag aaa       1221
Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys
                360                 365                 370
gta tta aaa gtt gct cat gta gaa cat gaa gaa acc tta tcc agc cga       1269
Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg
            375                 380                 385
aga agg gaa cta att cag aag ttg aag tct ttc atc agc ttc tat agt       1317
Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser
        390                 395                 400
gct ttg cct ggc tac atc tgc agc cat agc cct gtg gcg gaa aac gac       1365
Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp
    405                 410                 415
acc ctt tgc tgg aat gga caa gaa ctc gtg gag aga tac agc caa aag       1413
Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys
420                 425                 430                 435
gca gca agg aat gga atg aaa aac cag ttc aat ctc cat gag ctg aaa       1461
Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys
                440                 445                 450
atg aag ggc cct gag cca gtg gtc agt caa att att gac aaa ctg aag       1509
Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys
            455                 460                 465
cac att aac cag ctc ctg aga acc atg tct atg ccc aaa ggt aga gtt       1557
His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val
        470                 475                 480
ctg gat aaa aac ctg gat gag gaa ggg ttt gaa agt gga gac tgc ggt       1605
Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly
    485                 490                 495
gat gat gaa gat gag tgc att gga ggc tct ggt gat gga atg ata aaa       1653
Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys
500                 505                 510                 515
gtg aag aat cag ctc cgc ttc ctt gca gaa ctg gcc tat gat ctg gat       1701
Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp
                520                 525                 530
gtg gat gat gcg cct gga aac agt cag cag gca act ccg aag gac aac   1749
Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn
            535                 540                 545
gag ata agc acc ttt cac aac ctc ggg aac gtt cat tcc ccg ctg aag   1797
Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys
        550                 555                 560
ctt ctc acc agc atg gcc atc tcg gtg gtg tgc ttc ttc ttc ctg gtg   1845
Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe Phe Leu Val
    565                 570                 575
cac tga ctgcctggtg cccagcacat gtgctgccct acagcaccct gtggtcttcc    1901
His
580
tcgataaagg gaaccacttt cttatttttt tctatttttt tttttttgtt atcctgtata 1961
cctcctccag ccatgaagta gaggactaac catgtgttat gttttcgaaa atcaaatggt 2021
atcttttgga ggaagataca ttttagtggt agcatataga ttgtcctttt gcaaagaaag 2081
aaaaaaaacc atcaagttgt gccaaattat tctcctatgt ttggctgcta gaacatggtt 2141
accatgtctt tctctctcac tccctccctt tctatcgttc tctctttgca tggatttctt 2201
tgaaaaaaaa taaattgctc aaataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2261
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa                        2300
<210>4
<211>580
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu
  1               5                  10                  15
Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp
             20                  25                  30
Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly
         35                  40                  45
Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val
     50                  55                  60
Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys
 65                  70                  75                  80
Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala
                 85                  90                  95
Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln
            100                 105                 110
Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala
        115                 120                 125
Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe
    130                 135                 140
Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp
145                 150                 155                 160
Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro
                165                 170                 175
Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu
            180                 185                 190
Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe
        195                 200                 205
Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln
    210                 215                 220
Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile
225                 230                 235                 240
Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu
                245                 250                 255
Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys
            260                 265                 270
Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly
        275                 280                 285
Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu
    290                 295                 300
Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu
305                 310                 315                 320
Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys
                325                 330                 335
Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser
            340                 345                 350
Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile
        355                 360                 365
Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu
    370                 375                 380
Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser
385                 390                 395                 400
Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala
                405                 410                 415
Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr
            420                 425                 430
Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His
        435                 440                 445
Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp
    450                 455                 460
Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys
465                 470                 475                 480
Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly
                485                 490                 495
Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly
            500                 505                 510
Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr
        515                 520                 525
Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro
    530                 535                 540
Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser
545                 550                 555                 560
Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe
                565                 570                 575
Phe Leu Val His
            580
<210>5
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成DNA
<400>5
atagaattcc accatggccg ggaccgtgcg c                                    31
<210>6
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成DNA
<400>6
ataggatccc ttcagcgggg aatgaacgtt c                                    31
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成DNA
<400>7
gggccagtgg atagacagat g                                               21
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成DNA
<400>8
gctcactgga tggtgggaag atg                                             23
<210>9
<211>1392
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1389)
<220>
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M3C11 H链)
<400>9
atg aac ttc ggg ctc acc ttg att ttc ctt gtc ctt act tta aaa ggt       48
Met Asn Phe Gly Leu Thr Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly
  1               5                  10                  15
gtc cag tgt gag gtg caa ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg aag       96
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
             20                  25                  30
cct gga gga tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc       144
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
         35                  40                  45
agt cgc tat gcc atg tct tgg gtt cgc cag att cca gag aag ata ctg       192
Ser Arg Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ile Pro Glu Lys Ile Leu
     50                  55                  60
gag tgg gtc gca gcc att gat agt agt ggt ggt gac acc tac tat tta       240
Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Ser Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Leu
 65                  70                  75                  80
gac act gtg aag gac cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aat aat       288
Asp Thr Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn
                 85                  90                  95
acc ctg cac ctg caa atg cgc agt ctg agg tct gag gac aca gcc ttg       336
Thr Leu His Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu
            100                 105                 110
tat tac tgt gta aga cag ggg ggg gct tac tgg ggc caa ggg act ctg       384
Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
        115                 120                 125
gtc act gtc tct gca gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg       432
Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
    130                 135                 140
gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc       480
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145                 150                 155                 160
ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca       528
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                165                 170                 175
ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc       576
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
            180                 185                 190
tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc       624
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
        195                 200                 205
ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac       672
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
    210                 215                 220
acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac       720
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
225                 230                 235                 240
aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc       768
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
                245                 250                 255
ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc      816
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
            260                 265                 270
cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag      864
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
        275                 280                 285
gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag      912
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
    290                 295                 300
aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc      960
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305                 310                 315                 320
gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag      1008
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
                325                 330                 335
tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc      1056
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
            340                 345                 350
tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc      1104
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
        355                 360                 365
cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg      1152
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
    370                 375                 380
gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat      1200
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385                 390                 395                 400
ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc      1248
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                405                 410                 415
gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg      1296
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
            420                 425                 430
tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg      1344
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
        435                 440                 445
cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga      1392
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>10
<211>463
<212>PRT
<213>人工序列
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M3C11 H链)
<400>10
Met Asn Phe Gly Leu Thr Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly
  1               5                  10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
             20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
         35                  40                  45
Ser Arg Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ile Pro Glu Lys Ile Leu
     50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Ser Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Leu
 65                  70                  75                  80
Asp Thr Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn
                 85                  90                  95
Thr Leu His Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
        115                 120                 125
Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
    130                 135                 140
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145                 150                 155                 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                165                 170                 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
            180                 185                 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
        195                 200                 205
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
    210                 215                 220
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
225                 230                 235                 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
                245                 250                 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
            260                 265                 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
        275                 280                 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
    290                 295                 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305                 310                 315                 320
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
                325                 330                 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
            340                 345                 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
        355                 360                 365
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
    370                 375                 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385                 390                 395                 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
                405                 410                 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
            420                 425                 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
        435                 440                 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>11
<211>1413
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1410)
<220>
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M1E07 H链)
<400>11
atg gga tgg aac tgg atc ttt att tta atc ctg tca gta act aca ggt      48
Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly
  1               5                  10                  15
gtc cac tct gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag      96
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
             20                  25                  30
cct ggg gct tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc      144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
         35                  40                  45
act ggc tac tac atg cac tgg gtg aag caa agt cct gaa aag agc ctt      192
Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu
     50                  55                  60
gag tgg att gga gag att aat cct agc act ggt ggt act acc tac aac      240
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn
 65                  70                  75                  80
cag aag ttc aag gcc aag gcc aca ttg act gta gac aaa tcc tcc agc      288
Gln Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
                 85                  90                  95
aca gcc tac atg cag ctc aag agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc      336
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
tat tac tgt gca agg agg ggc gga tta act ggg acg agc ttc ttt gct      384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Leu Thr Gly Thr Ser Phe Phe Ala
        115                 120                 125
tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca gct agc acc aag      432
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys
    130                 135                 140
ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg      480
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145                 150                 155                 160
ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg      528
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
                165                 170                 175
gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc      576
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
            180                 185                 190
ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg      624
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
        195                 200                 205
gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac      672
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
    210                 215                 220
gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc      720
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225                 230                 235                 240
aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa      768
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
                245                 250                 255
ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac      816
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
            260                 265                 270
acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac      864
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
        275                 280                 285
gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc      912
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
    290                 295                 300
gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac      960
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305                 310                 315                 320
agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg      1008
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                325                 330                 335
ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca      1056
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
            340                 345                 350
gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa      1104
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        355                 360                 365
cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac      1152
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
    370                 375                 380
cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc      1200
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc      1248
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                405                 410                 415
acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag      1296
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            420                 425                 430
ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc      1344
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        435                 440                 445
tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc      1392
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    450                 455                 460
tcc ctg tct ccg ggt aaa tga                                          1413
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>12
<211>470
<212>PRT
<213>人工序列
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M1E07 H链)
<400>12
Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly
  1               5                  10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
             20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
         35                  40                  45
Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu
     50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn
 65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
                 85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Leu Thr Gly Thr Ser Phe Phe Ala
        115                 120                 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys
    130                 135                 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
                165                 170                 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
            180                 185                 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
        195                 200                 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
    210                 215                 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225                 230                 235                 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
                245                 250                 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
            260                 265                 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
        275                 280                 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
    290                 295                 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305                 310                 315                 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                325                 330                 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
            340                 345                 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        355                 360                 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
    370                 375                 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                405                 410                 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            420                 425                 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        435                 440                 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>13
<211>1416
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1413)
<220>
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M19B11 H链)
<400>13
atg aac ttc ggg ctc acc ttg att ttc ctc gtc ctt act tta aaa ggt      48
Met Asn Phe Gly Leu Thr Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly
  1               5                  10                  15
gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac tta gtg aag      96
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
             20                  25                  30
cct gga ggg acc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga tcc act ttc      144
Pro Gly Gly Thr Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe
         35                  40                  45
agt aac tat gcc atg tct tgg gtt cgc cag act cca gag aag agg ctg      192
Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
     50                  55                  60
gag tgg gtc gca gcc att gat agt aat gga ggt acc acc tac tat cca      240
Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Ser Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro
 65                  70                  75                  80
gac act atg aag gac cga ttc acc att tcc aga gac aat gcc aag aac      288
Asp Thr Met Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                 85                  90                  95
acc ctg tac ctg caa atg aac agt ctg agg tct gaa gac aca gcc ttt      336
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe
            100                 105                 110
tat cac tgt aca aga cat aat gga ggg tat gaa aac tac ggc tgg ttt      384
Tyr His Cys Thr Arg His Asn Gly Gly Tyr Glu Asn Tyr Gly Trp Phe
        115                 120                 125
gct tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca gct agc acc      432
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr
    130                 135                 140
aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct      480
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145                 150                 155                 160
ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa      528
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
                165                 170                 175
ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac      576
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
            180                 185                 190
acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc      624
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
        195                 200                 205
gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc      672
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
    210                 215                 220
aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag      720
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
225                 230                 235                 240
ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct      768
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
                245                 250                 255
gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag      816
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            260                 265                 270
gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg      864
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
        275                 280                 285
gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac      912
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
    290                 295                 300
ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac      960
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305                 310                 315                 320
aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac      1008
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
                325                 330                 335
tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc      1056
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
            340                 345                 350
cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaagcc aaa ggg cag ccc cga       1104
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
        355                 360                 365
gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag      1152
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
    370                 375                 380
aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac      1200
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385                 390                 395                 400
atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag      1248
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                405                 410                 415
acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc      1296
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
            420                 425                 430
aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca      1344
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
        435                 440                 445
tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc      1392
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
    450                 455                 460
ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga                                      1416
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>14
<211>471
<212>PRT
<213>人工序列
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M19B11H链)
<400>14
Met Asn Phe Gly Leu Thr Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly
  1               5                  10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
             20                  25                  30
Pro Gly Gly Thr Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe
         35                  40                  45
Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
     50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Ala Ile Asp Ser Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro
 65                  70                  75                  80
Asp Thr Met Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                 85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe
            100                 105                 110
Tyr His Cys Thr Arg His Asn Gly Gly Tyr Glu Asn Tyr Gly Trp Phe
        115                 120                 125
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr
    130                 135                 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
                165                 170                 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
            180                 185                 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
    210                 215                 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
225                 230                 235                 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
                245                 250                 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            260                 265                 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
        275                 280                 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
    290                 295                 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305                 310                 315                 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
                325                 330                 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
            340                 345                 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
        355                 360                 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
    370                 375                 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385                 390                 395                 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                405                 410                 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
            420                 425                 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
        435                 440                 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
    450                 455                 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>15
<211>1413
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1410)
<220>
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M18D04 H链)
<400>15
atg gaa tct aac tgg ata ctt cct ttt att ctg tcg gta gct tca ggg      48
Met Glu Ser Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Ala Ser Gly
  1               5                  10                  15
gtc tac tca gag gtt cag ctc cag cag tct ggg act gtg ctg gca agg      96
Val Tyr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg
             20                  25                  30
cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt      144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
         35                  40                  45
act ggc tac tgg atg cgc tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt ctg      192
Thr Gly Tyr Trp Met Arg Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
     50                  55                  60
gaa tgg att ggc gct att tat cct gga aat agt gat aca aca tac aac      240
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn
 65                  70                  75                  80
cag aag ttc aag ggc aag gcc aaa ctg act gca gtc aca tct gtc agc      288
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Val Ser
                 85                  90                  95
act gcc tac atg gaa ctc agc agc ctg aca aat gag gac tct gcg gtc      336
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
tat tac tgt tca aga tcg ggg gac cta act ggg ggg ttt gct tac tgg      384
Tyr Tyr Cys Ser Arg Ser Gly Asp Leu Thr Gly Gly Phe Ala Tyr Trp
        115                 120                 125
ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct aca gcc aaa gct agc acc aag      432
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Lys Ala Ser Thr Lys
    130                 135                 140
ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg      480
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145                 150                 155                 160
ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg      528
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
                165                 170                 175
gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc      576
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
            180                 185                 190
ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg      624
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
        195                 200                 205
gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac      672
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
    210                 215                 220
gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc      720
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225                 230                 235                 240
aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa      768
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
                245                 250                 255
ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac      816
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
            260                 265                 270
acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac      864
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
        275                 280                 285
gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc      912
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
    290                 295                 300
gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac      960
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305                 310                 315                 320
agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg      1008
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                325                 330                 335
ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca      1056
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
            340                 345                 350
gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa      1104
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        355                 360                 365
cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac      1152
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
    370                 375                 380
cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc      1200
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc      1248
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                405                 410                 415
acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag      1296
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            420                 425                 430
ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc      1344
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        435                 440                 445
tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc      1392
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    450                 455                 460
tcc ctg tct ccg ggt aaa tga                                          1413
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>16
<211>470
<212>PRT
<213>人工序列
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M18D04 H链)
<400>16
Met Glu Ser Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Ala Ser Gly
  1               5                  10                  15
Val Tyr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg
             20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
         35                  40                  45
Thr Gly Tyr Trp Met Arg Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
     50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Thr Tyr Asn
 65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Val Ser
                 85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ser Arg Ser Gly Asp Leu Thr Gly Gly Phe Ala Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Lys Ala Ser Thr Lys
    130                 135                 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
                165                 170                 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
            180                 185                 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
        195                 200                 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
    210                 215                 220
Val Ash His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225                 230                 235                 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
                245                 250                 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
            260                 265                 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
        275                 280                 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
    290                 295                 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305                 310                 315                 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                325                 330                 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
            340                 345                 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        355                 360                 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
    370                 375                 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                405                 410                 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            420                 425                 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        435                 440                 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>17
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(714)
<220>
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M3C11 L链)
<400>17
atg agt cct gcc cag ttc ctg ttt ctg tta gtg ctc tgg att cgg gaa       48
Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu
  1               5                  10                  15
acc aac ggt gat gtt gtg atg acc cag act cca ctc act ttg tcg gtt       96
Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val
             20                  25                  30
acc att gga caa cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag agc ctc       144
Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
         35                  40                  45
tta gat agt gat gga aag aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg cca       192
Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro
     50                  55                  60
ggc cag tct cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct aaa ttg gac tct       240
Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
 65                  70                  75                  80
gga gcc cct gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca       288
Gly Ala Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                 85                  90                  95
ctg aaa atc agt aga gtg gag gct gag gat ttg gga att tat tat tgc       336
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
tgg caa ggt aca cat ttt ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg       384
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
gag ctg aaa cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca       432
Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
    130                 135                 140
tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg  480
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145                 150                 155                 160
aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac  528
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
                165                 170                 175
gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc  576
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
            180                 185                 190
aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca  624
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
        195                 200                 205
gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc  672
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
    210                 215                 220
ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tga      717
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>18
<211>238
<212>PRT
<213>人工序列
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M3C11 L链)
<400>18
Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu
  1               5                  10                  15
Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val
             20                  25                  30
Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
         35                  40                  45
Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro
     50                  55                  60
Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
 65                  70                  75                  80
Gly Ala Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                 85                  90                  95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
    130                 135                 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
                165                 170                 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
            180                 185                 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
        195                 200                 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
    210                 215                 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>19
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(714)
<220>
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M1E07 L链)
<400>19
atg agt cct gtc cag ttc ctg ttt ctg tta atg ctc tgg att cag gaa       48
Met Ser Pro Val Gln Phe Leu Phe Leu Leu Met Leu Trp Ile Gln Glu
  1               5                  10                  15
acc aac ggt gat gtt gtg atg acc cag act cca ctg tct ttg tcg gtt       96
Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val
             20                  25                  30
acc att gga caa cca gcc tct atc tct tgc aag tca agt cag agc ctc       144
Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
         35                  40                  45
tta tat agt aat gga aag aca tat ttg aat tgg tta caa cag agg cct       192
Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro
     50                  55                  60
ggc cag gct cca aag cac cta atg tat cag gtg tcc aaa ctg gac cct       240
Gly Gln Ala Pro Lys His Leu Met Tyr Gln Val Ser Lys Leu Asp Pro
 65                  70                  75                  80
ggc atc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca gaa aca gat ttt aca       288
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr
                 85                  90                  95
ctt aaa atc agc aga gtg gag gct gaa gat ttg gga gtt tat tac tgc       336
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
ttg caa agt aca tat tat ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg       384
Leu Gln Ser Thr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
gag ctg aaa cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca       432
Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
    130                 135                 140
tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg       480
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145                 150                 155                 160
aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac       528
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
                165                 170                 175
gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc      576
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
            180                 185                 190
aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca      624
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
        195                 200                 205
gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc      672
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
    210                 215                 220
ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tga          717
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>20
<211>238
<212>PRT
<213>人工序列
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M1E07 L链)
<400>20
Met Ser Pro Val Gln Phe Leu Phe Leu Leu Met Leu Trp Ile Gln Glu
  1               5                  10                  15
Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val
             20                  25                  30
Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
         35                  40                  45
Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro
     50                  55                  60
Gly Gln Ala Pro Lys His Leu Met Tyr Gln Val Ser Lys Leu Asp Pro
 65                  70                  75                  80
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr
                 85                  90                  95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
Leu Gln Ser Thr Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
    130                 135                 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
                165                 170                 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
            180                 185                 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
        195                 200                 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
    210                 215                 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>21
<211>705
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(702)
<220>
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M19B11 L链)
<400>21
atg aga ccc tcc att cag ttc ctg ggg ctc ttg ttg ttc tgg ctt cat       48
Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His
  1               5                  10                  15
ggt gtt cag tgt gac atc cag atg aca cag tct cca tcc tca ctg tct       96
Gly Val Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
             20                  25                  30
gca tct ctg gga ggc aaa gtc acc atc act tgc aag gca agt cag gac       144
Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
         35                  40                  45
att aac aag aat ata gtt tgg tac caa cac aag cct gga aaa ggt cct       192
Ile Asn Lys Asn Ile Val Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro
     50                  55                  60
agg ctg ctc ata tgg tac aca tct aca tta cag cca ggc atc cca tca       240
Arg Leu Leu Ile Trp Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser
 65                  70                  75                  80
agg ttc agt gga agt ggg tct ggg aga gat tat tcc ttc agc atc agc       288
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser
                 85                  90                  95
aac ctg gag cct gaa gat att gca act tat tac tgt cta cag tat gat       336
Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp
            100                 105                 110
aat ctt cca cgg acg ttc ggt gga ggc acc aaa ctg gaa atc aaa cgt       384
Asn Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        115                 120                 125
acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag       432
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
    130                 135                 140
ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat       480
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg       528
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
                165                 170                 175
ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc       576
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
            180                 185                 190
tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa       624
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
        195                 200                 205
cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc       672
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
    210                 215                 220
gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tga                           705
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>22
<211>234
<212>PRT
<213>人工序列
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M19B11 L链)
<400>22
Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His
  1               5                  10                  15
Gly Val Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
             20                  25                  30
Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
         35                  40                  45
Ile Asn Lys Asn Ile Val Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro
     50                  55                  60
Arg Leu Leu Ile Trp Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser
 65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser
                 85                  90                  95
Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp
            100                 105                 110
Asn Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        115                 120                 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
    130                 135                 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
            180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
        195                 200                 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
    210                 215                 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>23
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(717)
<220>
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M18D04 L链)
<400>23
atg agg ttc tct gct cag ctt ctg ggg ctg ctt gtg ctc tgg atc cct       48
Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro
  1               5                  10                  15
gga tcc act gca gat att gtg atg acg cag gct gca ttc tcc aat cca       96
Gly Ser Thr Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro
             20                  25                  30
gtc act ctt gga aca tca act tcc atc tcc tgc agg tct agt aag agt       144
Val Thr Leu Gly Thr Ser Thr Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser
         35                  40                  45
ctc cta cat agt aat ggc atc act tat ttg tat tgg tat ctg cag aag       192
Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys
     50                  55                  60
cca ggc cag tct cct cag ctc ctg att tat cag atg tcc aac ctt gcc       240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala
 65                  70                  75                  80
tca gga gtc cca gac agg ttc agt agc agt ggg tca gga act gat ttc       288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                 85                  90                  95
aca ctg aga atc agc aga gtg gag gct gag gat gtg ggt gtt tat tac       336
Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
tgt gct caa aat cta gaa ctt ccg tat acg ttc gga tcg ggg acc aag       384
Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys
        115                 120                 125
ctg gaa ata aaa cgt acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg       432
Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg       480
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat       528
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac       576
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa       624
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag       672
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tga       720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>24
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<223>人工序列描述：小鼠-人嵌合抗体(M18D04 L链)
<400>24
Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro
  1               5                  10                  15
Gly Ser Thr Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro
             20                  25                  30
Val Thr Leu Gly Thr Ser Thr Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser
         35                  40                  45
Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys
     50                  55                  60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala
 65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                 85                  90                  95
Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235

Claims (10)

1.识别GPC3的C端肽的抗体，其中GPC3的C端肽如SEQIDNO：4所示，为由GPC3的氨基酸残基359-580组成的肽，或由GPC3的氨基酸残基375-580组成的肽。
2.权利要求1的抗体，其是单克隆抗体。
3.权利要求1或2的抗体，其是重组抗体。
4.权利要求1-3任一项的抗体，其是嵌合抗体。
5.权利要求1-4任一项的抗体，其是人源化抗体。
6.权利要求1-5任一项的抗体，其是胞毒抗体。
7.权利要求6的抗体，其中的胞毒抗体具有ADCC活性。
8.权利要求6的抗体，其中的胞毒抗体具有CDC活性。
9.权利要求1-8任一项的抗体在制备用于给细胞诱导细胞毒性的胞毒剂中的应用。
10.权利要求9的应用，其中细胞为癌细胞。
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