CN106442982A

CN106442982A - 一种禽白血病病毒j亚群特异抗原多肽及其应用

Info

Publication number: CN106442982A
Application number: CN201610796060.8A
Authority: CN
Inventors: 秦爱建; 田雪; 邵红霞; 钱琨; 叶建强
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2016-08-31
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2036-08-31
Also published as: CN106442982B

Abstract

本发明提供一种禽白血病病毒J亚群(ALV‑J)特异抗原多肽及其应用。该抗原多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或者其衍生序列，由病毒的囊膜蛋白基因(env)的gp85部分基因编码；其特异性强、亲水性较好，反应性好、纯度高。此外，将该抗原多肽用于制备特异性检测ALV‑J抗体的间接ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包括包被由一个或者几个如上所述的ALV‑J特异抗原多肽的酶标板以及相关试剂，该试剂盒检测ALV‑J抗体，特异性高，成本低，有利于推广使用，其效果明显优于常规试剂盒和进口试剂盒。上述ALV‑J特异抗原多肽，和由其制备的间接ELISA检测试剂盒适用于评价ALV‑J感染或者净化结果；上述ALV‑J特异抗原多肽适用于制备特异性抗ALV‑J的抗体。

Description

一种禽白血病病毒J亚群特异抗原多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种禽白血病病毒J亚群(ALV-J)特异抗原多肽、使用其制备的ELISA检测试剂盒，以及它们的应用。

背景技术

禽白血病J亚群病毒(ALV-J)为C型反转录病毒，是内源性病毒与外源性病毒整合而成的重组病毒，主要基于其独特的囊膜糖蛋白(gp85)而被划为单独的一个亚群。它不但引起肉用鸡发生髓细胞瘤以及其它恶性肿瘤，还能引起蛋鸡肿瘤性疾病，给养禽业造成重大经济损失。目前尚无针对J亚群禽白血病的有效的治疗方法和疫苗，只能通过特异性检测并淘汰阳性鸡以及采取种群净化的方式来控制此病。现在用于检测该禽白血病的方法主要有病毒分离、IFA、ELISA、RT-PCR等。其中，ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体上进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，加入酶标底物后，底物被酶催化成有颜色的产物，产物的量与待检物的量直接相关，故可以根据用分光光度计(酶标仪)加以测定进行定量或定性的分析，由于酶的催化效率很高，间接放大了免疫反应的结果，使测定方法敏感度大大提高，该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。

然而，检测ALV-J亚群抗体是评价该亚群感染和净化效果的主要指标。目前有关检测ALV-J亚群特异抗体的方法不多，并且这些试剂盒不稳定、特异性一直不高，经常出现假阳性和假阴性，如：目前市场上商品化的ALV-J抗体ELISA检测试剂盒。造成非特异性的原因主要是由于抗原的表达纯化或融合蛋白的非特异性反应等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、亲水性较好，反应性好、纯度高的禽白血病病毒J亚群(ALV-J)特异抗原多肽，该抗原多肽具有ALV-J特异性抗原表位，与相应抗ALV-J血清有良好的生物学反应，并能作为抗原刺激机体产生特异性抗体；并且使用该抗原多肽构建具有更强特异性和稳定性、并适用于ALV-J血清抗体的检测ELISA检测技术，以解决目前ALV-J抗体试剂盒特异性不高的技术问题。其基本原理是：基于ALV-J的特异性主要取决env编码基因的gp85蛋白，而这一蛋白特异性反应则由其氨基酸序列中的特定多肽抗原表位决定的研究结果(Qin A,Lee LF,Fadly A,Hunt H,Cui Z.，Development andcharacterization of monoclonal antibodies to subgroup J avian leukosisvirus.Avian Dis.2001；45(4):938-45)，选取决定禽白血亚群类型的env基因的gp85段的部分序列进行分析，筛选出可以特异性检测ALV-J抗体、并且具有较好抗原性及亲水性的多肽序列(如：与抗体特异性结合的B细胞抗原表位)进行抗原多肽合成；并利用该多肽作为抗原包被酶标板，选择最佳包被浓度及多抗血清、酶标二抗的最佳稀释度及孵育时间并确定临界值，以建立简单快捷、并且可以特异性检测ALV-J抗体的ELISA技术，为ALV-J的净化提供技术支撑。建立检测J亚群抗体的方法，并成功应用于鸡ALV-J抗血清的检测。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种禽白血病病毒J亚群(ALV-J)特异抗原多肽，用来特异性检测ALV-J的抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5或者其衍生序列，由病毒的囊膜蛋白基因(env)的gp85部分基因编码，并具有强的反应原性；其中，上述抗原多肽的氨基酸序列分别如下：

SEQ ID NO.1：MIKNGTKRTCVTFGSVCYKEGNHSKVCHNF；

SEQ ID NO.2：DGNFNGTGGAEAELRDFIAKWKSDDLLIRP；

SEQ ID NO.3：DLASQTACLIQALNTTLPWDPQELDILGSQ；

SEQ ID NO.4：IAKWKSDDLLIRPYVNQ；

SEQ ID NO.5：TSNETRYYQGNLSDWCSSKGGEWSAGYSNGTECSSG。

本发明提供了一种用于特异性检测ALV-J抗体的间接ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包括包被上述特异性反应性抗原多肽中的一个或者几个抗原多肽片段组合的酶标板，或为人工偶联的牛血清白蛋白(BSA)-多肽；所述检测试剂盒还包括以下试剂：酶标抗体、10X洗涤液、阳性对照、阴性对照、TMB底物溶液和终止液。

本发明还提供了上述禽白血病病毒J亚群(ALV-J)特异抗原多肽、以及使用上述抗原多肽用于特异性检测ALV-J抗体的间接ELISA检测试剂盒在评价ALV-J感染或者净化结果方面的应用；以及上述禽白血病病毒J亚群(ALV-J)特异抗原多肽在制备特异性抗ALV-J的抗体方面的应用。

本发明的技术方案达到了如下的有益效果：

1)本发明所提供的抗原多肽为抗原性比较好的、ALV-J的env基因gp85段特异性多肽序列人工合成，将其根据软件分析的结果分为五段，检测时选择其中的一个或几个抗原多肽片段组合；该抗原多肽是ALV-J亚群特异性的B细胞表位，具有高度特异性，且具有很好的抗体反应性，亲水性较好，且纯度高，可以用来特异性检测ALV-J的抗体；

2)将该氨基酸序列设计合成的抗原多肽应用于ALV-J的抗体检测，与其他方法如PCR，p27ELISA试剂盒，或表达产物ELISA试剂盒比较，此方法具有快速安全可靠，可操作性高的优点；此外，选取抗原性强、亲水性较好的序列进行抗原多肽合成，克服了常规ELISA中包被抗原不纯而带来的非特异性反应，提高检测的特异性；优势抗原表位的合成，同时可提高检测的灵敏度，从而使得试剂盒的制备和样品的检测更加快速简便准确，在禽白血病种群净化过程中可以用作为净化的指标；

3)采用本发明的ELISA检测试剂盒检测J亚群特异抗体，特异性高，成本低，有利于推广使用；目前已进行平行测定，效果明显优于常用试剂盒；与进口试剂盒比较发现，并经荧光抗体验证，该试剂盒可以检测到进口试剂盒检测不到的特异性抗体(如实施例6所示)，应用开发潜力巨大；

4)通过本发明合成的抗原多肽免疫动物，可以制备特异性抗J亚群禽白血病病毒的抗体；应用这些抗体，可以进行病毒抗原检测。

附图说明

图1是免疫荧光验证本发明构建试剂盒和商品化试剂盒检测的结果。图中，A.两种试剂盒均检测为阳性的鸡血清，IFA阳性；B.本发明构建试剂盒检测为阳性而进口试剂盒检测为阴性的血清，IFA阳性；C.两种试剂盒均检测为阴性的血清，IFA阴性；D.SPF鸡阴性血清对照，IFA阴性。

具体实施方式

为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供一种用于特异性检测ALV-J抗体的间接ELISA检测试剂盒，其组成如下:

[1]包被抗原多肽的酶标板，所述的抗原多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或者其衍生序列，由病毒的囊膜蛋白基因(env)的gp85部分基因编码，并具有强的反应原性；

[2]酶标抗体:辣根过氧化物酶标记的抗鸡IgG；

[3]底物溶液配制:100mmol/L的柠檬酸溶液((21g柠檬酸(C₆H₈O；·H₂0)溶于去离子水，定容至1L)24.3mL,200mmol/LNa₂HP0₄.12H₂0(71.6g Na₂HP0₄.12H₂0溶于去离子水，定容至1L)25.7mL混匀，加入50mg的四甲基联苯胺(TMB)，临用前加入50μL的30％H₂0₂；

[4]终止液(2mol/L)H₂S0₄:分别取蒸馏水177.8mL和浓硫酸22.2mL混和即可；

[5]洗涤液:1000mL10mmo1/L pH7.4的PBS中加入0.5mL Tween-20；

[6]阴性对照和阳性对照。

本领域的普通技术人员无需特别的实验即可理解，所述的ELISA检测法是指酶联免疫分析，即利用了抗原多肽可以特异性结合待检血清中的ALV-J抗体，然后加入HRP标记的二抗检测，最后读取波长450nm或650nm的OD值，按照此方法便可检测出个体是否感染过ALV-J，在临床上可以用于ALV-J净化水平的评估。其检测ALV-J抗体的步骤包括：

1)抗原多肽以0.5μg/ml的浓度包被酶标版；包被后用10％脱脂乳封闭。

2)待检鸡血清1:300稀释后每孔100μl在37℃与包被的抗原多肽相互作用1h；

3)洗涤5次后，加入HRP标记的兔抗鸡IgG二抗共同孵育1h；

4)洗涤6次，加TMB显色液反应15min；

5)最后用2M硫酸或0.1％SDS终止反应，以450nm或650nm波长下读取OD值。

根据临界值(OD≥0.20)确定感染鸡，这些步骤并非一成不变的，本领域的普通技术人员可以根据实际情况进行合理修缮以达到好的效果。

实施例2

利用生物软件分析ALV-J的GP85的氨基酸序列，抗原性较好的氨基酸序列SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.5，进行常规抗原多肽合成，任选其中一种抗原多肽包被酶标板，制备用于特异性检测ALV-J抗体的间接ELISA检测试剂盒(组成及方法见实施例1)，并检测人工感染ALV-J的不同日龄的鸡血清，检测结果如表1所示。

表1：基于抗原肽序列SEQ ID NO.1的ELISA检测效果：

从上表结果可以清楚地看出，该多肽构建的试剂盒可以检测到ALV-J感染的不同日龄鸡血清中的特异性抗体。

实施例3

本实施例中，与实施例2的不同之处在于，任选5个多肽序列中的一种，如SEQ IDNO.3，仅合成前二分之一序列长度，对该肽衍生缩短了一半。用该合成的缩短抗原多肽包被ELISA酶标板，构建试剂盒，检测人工感染ALV-J的鸡血清，检测结果如表2所示。可以看出，以序列衍生缩短抗原肽构建试剂盒，仍然可以检测出ALV-J抗体阳性鸡，OD值均大于0.2。

表2：基于SEQ ID NO.3序列衍生缩短抗原肽构建试剂盒的ELISA检测效果：

实施例4

本实施例中，与实施例2的不同之处在于，肽1(SEQ ID NO.1)和肽2(SEQ ID NO.2)混合包被酶标板，与人工感染ALV-J的不同日龄鸡血清反应，检测结果如表3所示。证明混合多肽包被酶标板可以检测出ALV-J特异抗体。该结果说明，不同抗原多肽可以同时包被，特别是检测不同时期不同抗原表位的相应抗体水平有一定意义。由于不同抗原表位的优势程度不一样，产生抗体的时间也不一致，同时包被不同多肽可以检测出更多的特异性抗体。

表3：基于抗原肽序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的ELISA检测效果：

实施例5

选择SEQ ID NO.1至NO5序列，进行常规抗原多肽合成，任选其中一种抗原多肽与BSA进行人工常规偶联，制备BSA-多肽，如：多肽SEQ ID NO.2制备的BSA-肽；并以此制备ELISA试剂盒，检测人工感染ALV-J的不同日龄鸡血清，检测结果见表4。从结果可以看出，偶联BSA-多肽对检测的敏感性有所提高，效果更好。

表4：基于BSA-肽的ELISA检测效果：

实施例6

本实施例中，本发明提供的ELISA试剂盒以SEQ ID NO.2包被，构建的检测ALV-J抗体试剂盒，与进口试剂盒(禽白血病J亚群抗体检测试剂盒)比较(见表5)，并经荧光抗体(见图1)验证发现，该试剂盒可以检测到进口试剂盒检测不到的特异性抗体。

表5：IFA验证本发明构建试剂盒与进口试剂盒检测部分差异结果：

实施例7

应用本发明合成的抗原多肽免疫动物，可以制备特异性抗J亚群禽白血病病毒的抗体。应用这些抗体，可以进行病毒抗原检测。选择SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5序列，进行常规抗原多肽合成，任选其中一种抗原多肽，与佐剂混合，免疫小鼠3次，每次间隔10天，10天后采血，检测其血清中的抗体，结果如下(见表6)。从表6可以发现，该小鼠均产生了抗J亚群的抗体，OD值均大于0.2，不同小鼠产生抗体的水平有一定个体差异。

表6：抗原多肽免疫小鼠产生抗体情况：

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims

1.一种禽白血病病毒J亚群特异抗原多肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或者其衍生序列，由病毒的囊膜蛋白基因(env)的gp85部分基因编码。

2.一种用于特异性检测禽白血病病毒J亚群抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括由一个或者几个如权利要求1所述的禽白血病病毒J亚群(ALV-J)特异抗原多肽包被的酶标板。

3.如权利2所述的一种用于特异性检测禽白血病病毒J亚群抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的禽白血病病毒J亚群(ALV-J)特异抗原多肽为人工偶联的牛血清白蛋白(BSA)-肽复合物。

4.如权利3所述的一种用于特异性检测禽白血病病毒J亚群抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括以下试剂：酶标抗体、10X洗涤液、阳性对照、阴性对照、TMB底物溶液和终止液。

5.如权利2所述的一种用于特异性检测禽白血病病毒J亚群抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括以下试剂：酶标抗体、10X洗涤液、阳性对照、阴性对照、TMB底物溶液和终止液。

6.如权利要求1所述的禽白血病病毒J亚群特异抗原多肽，以及如权利要求2-5中任意一项所述的用于特异性检测禽白血病病毒J亚群抗体的间接ELISA检测试剂盒在评价ALV-J感染或者净化结果方面的应用。

7.如权利要求1所述的禽白血病病毒J亚群特异抗原多肽在制备特异性抗ALV-J的抗体方面的应用。