CN112552381B

CN112552381B - 大鼠冠状病毒的抗原肽及其应用

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Publication number: CN112552381B
Application number: CN202011519564.8A
Authority: CN
Inventors: 向志光; 蔡鹃; 佟巍; 郭智; 李欣悦
Original assignee: Institute of Laboratory Animal Science of CAMS
Current assignee: Institute of Laboratory Animal Science of CAMS
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112552381A

Abstract

本发明涉及生物医药与生物检测技术领域，特别涉及大鼠冠状病毒的血清学检测用抗原及其应用。本发明提供了大鼠冠状病毒的血清学检测用抗原。该抗原能够检测动物是否感染大鼠冠状病毒。所述抗原其氨基酸序列见序列表SEQ ID No.4和SEQ ID No.9，或者包含有SEQ ID No.4和SEQ ID No.9的向N端或/和C端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85%的序列。本发明所述的抗原肽分子量小，降低了与其它分子的交叉反应，从而提高诊断的准确率。

Description

大鼠冠状病毒的抗原肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药与生物检测技术领域，特别涉及大鼠冠状病毒的血清学检测用抗原及其应用。

背景技术

大鼠冠状病毒（rat coronavirus，RCV）属于冠状病毒科，大鼠等啮齿类实验动物为易感动物。大鼠冠状病毒是引起啮齿类动物消化系统疾病的主要病原之一，其传染性强，容易扩散，在多数情况下呈隐性感染，可改变体内细胞免疫反应，且很难从鼠群中清除。因此实验动物需要进行质量控制，排除该病原的干扰。所以开发一种能够及时的、准确的检测大鼠冠状病毒的产品，对动物和人类的健康具有重要意义。其中血清学的检测方法是评价动物感染病毒后机体产生的抗体反应。目前应用较多的抗原物质为病毒颗粒本身。但病毒的制备需要生物安全管控，寻找其他抗原物质十分必要。

用抗原的优势表位检测动物体是否感染该抗原的原理是，当动物体感染抗原后，动物体就会产生针对该抗原的抗体，该抗体分布在动物的血清中，通过检测血清中该抗体的存在与否，就能得知动物体是否感染所述抗原。动物体产生的抗体一般是针对抗原的优势表位，即所产生的抗体能特异性的与抗原的优势表位相结合。所以通过抗原优势表位检测血清中是否存在与其结合的抗体，就能得知动物体是否感染该病毒。

综上，提供一种检测动物是否感染大鼠冠状病毒的抗原具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了大鼠冠状病毒的血清学检测用抗原。该抗原能够检测动物是否感染大鼠冠状病毒。所述抗原其氨基酸序列见序列表SEQ ID No.4和SEQ ID No.9，或者包含有No.4和SEQ ID No.9的向N端或/和C端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85%的序列。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了多肽或其组合，所述多肽具有：

（Ⅰ）、如SEQ ID No.1~9任一所示的氨基酸序列；或

（Ⅱ）、如（Ⅰ）所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与（Ⅰ）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

（III）、与（Ⅰ）或（Ⅱ）所述序列至少有85%同源性的氨基酸序列。

在上述研究基础上，本发明还提供的所述的多肽或其组合，包括如SEQ ID No.1~9任一所示的氨基酸序列至少有90%同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的多肽或其组合包括如SEQ ID No.1~9任一所示的氨基酸序列至少有95%同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的多肽或其组合包括如SEQ ID No.1~9任一所示的氨基酸序列至少有98%同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合中具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的多肽与具有如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列的多肽的摩尔比为1：10~10：1。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合中具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的多肽与具有如SEQ ID No.9所示的氨基酸序列的多肽的摩尔比为1：1。

基于上述研究，本发明还提供了所述的多肽或其组合在制备大鼠冠状病毒的检测试剂或检测工具中的应用。

本发明还提供了检测大鼠冠状病毒的试剂，包括所述的多肽或其组合以及检测可接受的助剂。

此外，本发明还提供了检测大鼠冠状病毒的试剂盒，包括所述的多肽或其组合以及检测可接受的助剂或载体。在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为芯片。

本发明还公开了检测大鼠冠状病毒抗体的方法，采用上述检测大鼠冠状病毒的试剂或试剂盒检测。

具体的，本发明还公开了一种检测大鼠冠状病毒抗体的方法：

a)将抗原肽包被到ELISA板上，每孔100ul，抗原肽SEQ ID No.4和SEQ ID No.9的浓度均为10ug/ml，4℃过夜。

b)洗涤液清洗酶标板3次，37℃下用样品稀释液封闭酶标板1h。

c)准备待测样品，用样品稀释液按需要稀释样品，取稀释后的样品加入酶标板中，每孔50µl，室温孵育1 h。每个样品包被2个孔，同时将抗血清进行梯度稀释，每孔100µl。

d)洗涤液清洗酶标板3次，加入辣根过氧化物酶标记二抗，所述二抗按1：1000稀释，分别加入孔中，每孔100µl，37℃孵育1h，再用洗涤液清洗3次。

e)加辣根过氧化物酶底物缓冲液100µl，显色5min后，加入终止液50µl，终止显色。

用酶标仪检测OD450的值，阴阳性判断标准采用 Cutoff值法。求出所有阴性样品OD450的平均值（

）和标准差(SD)，当样本的OD450 值≥（

）+ 3SD时为阳性，样本的OD450值≤（

）+2SD时为阴性，当（

）+3SD≥样本OD450的值≥（

）+2SD时为可疑，需要重新测样本，如果样本血清的OD450值仍然小于（

）+3SD则判为阴性。

本发明提供了大鼠冠状病毒的血清学检测用抗原。该抗原能够检测动物是否感染大鼠冠状病毒。所述抗原其氨基酸序列见序列表SEQ ID No.4和SEQ ID No.9，或者包含有SEQ ID No.4和SEQ ID No.9的向N端或/和C端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85%的序列。本发明所述的抗原肽分子量小，降低了与其它分子的交叉反应，从而提高诊断的准确率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示抗原多肽阵列与大鼠血清结合实验图，具体示RCV跨叠多肽阵列与RCV阳性＋／RCV阴性－血清的反应；

图2示大鼠冠状病毒和筛选的10条优势抗原肽分别与阴性血清和阳性血清的结合实验图；

图3示SEQ ID No.4所示的抗原肽和SEQ ID No.9所示的抗原肽等摩尔混合物抗原与梯度稀释的阳性、阴性对照血清的结合实验图。

具体实施方式

本发明公开了大鼠冠状病毒的血清学检测用抗原，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明根据大鼠冠状病毒抗原的氨基酸序列，设计并合成了抗原多肽阵列芯片，通过检测芯片上的抗原肽分别与未感染大鼠冠状病毒的动物血清和感染了大鼠冠状病毒的动物血清的结合与否，来筛选大鼠冠状病毒特异性的、分子量小的线性表位。

1）配置 0.25M Fmoc-氨基酸溶液；封闭液 I：含有2% (v/v) 乙酸酐的二甲基甲酰胺溶液；封闭液 II：2% (v/v) 乙酸酐 +含有2% (v/v) N，N-二异丙基乙胺的二甲基甲酰胺溶液，Fmoc-移除液（含有20% (v/v) 哌啶的二甲基甲酰胺溶液）。

2）把活化的 PEG-纤维素膜放置在 Autos potter 上，根据程序自动移液 0.1ul的Fmoc-氨基酸溶液到活化的 PEG-纤维素膜上的特定位置与膜进行反应 20分钟，再重复一遍该点膜过程；

3）把 PEG-纤维素膜按序浸入封闭液 I 中（反应5 分钟）和封闭液 II 中（反应20 分钟），进行侧链封闭，然后用 DMF 清洗 4 次。

4）把 PEG-纤维素膜加入 Fmoc-移除液中（2 次，每次 5 分钟），用于移除氨基端的Fmoc保护基团；

5) 去保护基团后，用 DMF 清洗3次，每次30 秒钟，而后再用乙醇干燥。

6）重复以上步骤，直至各个多肽全部合成。全部合成后，先用 TFA cocktail 去除侧链保护基团，再用 CH₂C_l2 清洗 4次，而后用乙醇干燥。

本发明将用上述合成的相同的2张多肽阵列芯片分别与未感染大鼠冠状病毒的动物血清和感染大鼠冠状病毒的动物血清做结合检测。通过比对相同抗原肽与两种血清结合情况，判断该抗原肽是否是大鼠冠状病毒的优势抗原肽。本发明筛选到10个优势抗原肽。

本发明合成上述10个优势抗原肽，并和大鼠冠状病毒全抗原比较与阳性血清中抗大鼠冠状病毒抗体的结合活性，结果显示所述SEQ ID No.4和SEQ ID No.9具有较好的抗原性。

通过SEQ ID No.4所示的抗原肽和SEQ ID No.9所示的抗原肽1：1等摩尔混合物包被ELISA平板与梯度稀释的阴性及阳性血清的结合反应显示：所述抗原肽混合物与阳性血清具有良好的量效关系，SEQ ID No.4所示的抗原肽和SEQ ID No.9所示的抗原肽的混合物与阳性血清中大鼠冠状病毒的抗体是特异性的结合。所以本发明所述的SEQ ID No.4所示的抗原肽和SEQ ID No.9所示的抗原肽的混合物，能够用于大鼠冠状病毒的血清学检测。

本发明还公开了一种检测大鼠冠状病毒抗体的方法：

f)将抗原肽包被到ELISA板上，每孔100ul，抗原肽SEQ ID No.4和SEQ ID No.9的浓度均为10ug/ml，4℃过夜。

g)洗涤液清洗酶标板3次，37℃下用样品稀释液封闭酶标板1h。

h)准备待测样品，用样品稀释液按需要稀释样品，取稀释后的样品加入酶标板中，每孔50µl，室温孵育1 h。每个样品包被2个孔，同时将抗血清进行梯度稀释，每孔100µl。

i)洗涤液清洗酶标板3次，加入辣根过氧化物酶标记二抗，所述二抗按1：1000稀释，分别加入孔中，每孔100µl，37℃孵育1h，再用洗涤液清洗3次。

j)加辣根过氧化物酶底物缓冲液100µl，显色5min后，加入终止液50µl，终止显色。

k)用酶标仪检测OD450的值，阴阳性判断标准采用 Cutoff值法。求出所有阴性样品OD450的平均值（

）和标准差(SD)，当样本的OD450 值≥（

）+ 3SD时为阳性，样本的OD450值≤（

）+2SD时为阴性，当（

）+3SD≥样本OD450的值≥（

）+3SD则判为阴性。

上述检测大鼠冠状病毒抗体的方法可以用于疾病的诊断，也可以是非诊断目的抗体的普通检测方法。

本发明的有益效果包括但不限于：本发明所述的抗原肽分子量小，降低了与其它分子的交叉反应，从而提高诊断的准确率。

本发明提供的大鼠冠状病毒的血清学检测用抗原中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例 1大鼠冠状病毒优势抗原多肽表位的筛选

1.材料和设备

PEG 修饰纤维素膜，Fmoc-氨基酸，二氯甲烷（DCM），二甲基甲酰胺（amine freeDMF），乙醇，乙酸酐，醋酸（Acetic acid），二异丙胺(Diisopropylamine)，二异丙基(Diisopropylcarbodiimide)，溴酚蓝（Bromophenol blue），哌啶（Piperidine）等，上述材料均为市购。

自动单点多肽合成仪（Auto Spot peptide synthesizer），Bio-Rad 数字成像分析仪。

2.方法

大鼠冠状病毒所有结构蛋白分析抗原性后设计合成120点多肽阵列，用多肽阵列技术制作了2张多肽阵列。用此阵列与大鼠RCV阳性血清（RCV+）及RCV阴性血清（RCV-）进行杂交，筛选差异位点。阵列芯片以 overlapping 方式设计。

2.1多肽阵列合成

6）重复以上步骤，直至各个多肽全部合成。全部合成后，先用 TFA cocktail 去除侧链保护基团，再用 CH₂C_l2 清洗 4次，而后用乙醇干燥。-20度保存用于下一步免疫反应实验。

2.3）多肽阵列与大鼠血清免疫反应

将两张多肽阵列芯片与两种实验大鼠血清，阴性对照组大鼠血清 1份，阳性组大鼠血清 1 份，分别进行了免疫反应检测，包括以下步骤：

a)封闭：4% 脱脂牛奶（skim milk）+5% 蔗糖（sucrose） TBST buffer，室温 4 小时；

b)一抗孵育：大鼠血清 1：500 稀释；与多肽阵列反应，4℃ 下过夜；

c)洗膜：用 TBST buffer 漂洗3次，每次10 分钟；

d)二抗孵育：二抗（羊抗鼠）IgG-HRP，用封闭液 1：2000 稀释，室温下 2 小时；

e)洗膜：用 TBST buffer 漂洗3次，每次10 分钟；

f)显色：加入 ECL 发光试剂，数字成像。

3.实验结果

多肽阵列与大鼠血清结合结果见图1，为阳性血清RCV+和对照阴性血清RCV-与阵列反应后所得图像（源自成像仪分析软件生成图像）发现多个抗原性高的位点。选择10个位点进行后续验证。

实施例2 大鼠冠状病毒抗原多肽的抗原性验证

制备将实施例1所选的10条多肽，多肽的制备可以通过生物学的方法制备，本发明通过化学合成的方法，得到所述10条多肽编号RCV1-RCV10。

根据跨叠多肽阵列的测试结果，合成纯度98%的多肽，多肽序列及编号见下表：

表1

将上述所得的10条抗原肽以1mg/mL浓度包被至ELISA反应板中，使用RCV阳性血清和RCV阴性血清应用ELISA方法进行测试。上述10条抗原肽分别与阳性血清和阴性血清做反应，结果见图2和下表。多肽RCV4和RCV9表现出较好的免疫原性。

表2 RCV抗原肽验证

实施例3 大鼠冠状病毒抗原多肽的制备及功能鉴定

混合多肽抗原包被ELISA平板的与梯度稀释质控血清进行测试，确定检测方法的灵敏度。

本发明选择多肽RCV4和RCV9等摩尔混合抗原肽包被ELISA平板，并将阴性及阳性血清按以下稀释度稀释：1:40，1:80，1:160，1:320， 1:640，1:1280， 1:2560，1:5120，1:10240，1:20480，并将稀释的血清与抗原肽做结合实验，结果见图3和下表。

表3 RCV阳性样本和阴性样本系列稀释实验

结果显示本发明所筛选的抗原肽RCV4和RCV9等摩尔混合抗原物质与倍比稀释的免疫血清显示了较好的量效关系。

实施例4 一种检测大鼠冠状病毒抗体的方法

本发明利用上述实施例所述的RCV4和RCV9等摩尔混合抗原肽，通过ELISA方法检测大鼠冠状病毒的抗体。

1）ELISA实验中常规试剂的配制：

a)包被缓冲液（PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液）；

NaHCO₃1.59克

NaHCO₃ 2.93克加蒸馏水至1000ml；

b)洗涤缓冲液（PH7.4 PBS）：0.15M

KH₂PO₄ 0.2克

Na₂HPO₄·12H₂O 2.9克

NaCl 8.0克

KCl 0.2克

Tween-20 0.05% 0.5ml 加蒸馏水至1000ml；

c)样品稀释液：

牛血清白蛋白（BSA） 0.1克加洗涤缓冲液至100ml；

d)终止液（2M H₂SO4）：

蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml；

e)底物缓冲液（PH5.0磷酸枣柠檬酸）：

0.2MNa₂HPO₄（28.4克/L）25.7ml

0.1M柠檬酸（19.2克/L）24.3ml 加蒸馏水50ml；

2）检测大鼠冠状病毒抗体的ELISA实验步骤，如下：

a)将RCV4和RCV9等摩尔混合抗原肽包被到ELISA板上，每孔100ul，抗原肽A的浓度为10ug/ml，4℃过夜。

b)洗涤液清洗酶标板3次，37℃下用样品稀释液封闭酶标板1h以上。

c)准备待测样品，抽取待测动物的静脉血，离心收集血清。

d)用样品稀释液按1：2的比例稀释血清，取稀释后的血清加入酶标板中，每孔50µl，室温孵育1h。每个样品包被2个孔。

e)洗涤液清洗酶标板3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，所述二抗按1：10000的比例稀释，分别加入孔中，每孔100µl，37℃孵育1h，再用洗涤液清洗3次。

f)加辣根过氧化物酶底物缓冲液100µl，显色5min后，加入终止液100µl，终止显色。

g)用酶标仪检测OD450的值，阴阳性判断标准采用 Cutoff值法。求出所有阴性样品OD450的平均值（

）和标准差(SD)，当样本的OD450 值≥（

）+ 3SD时为阳性，样本的OD450值≤（

）+2SD时为阴性，当（

）+3SD≥样本OD450的值≥（

）+3SD则判为阴性。

h)Cut off值测定：阴性血清检测值需进行质控，在空白空OD450控制在0.100 以下，阴性质控品测定OD450值可控制在0.2500以下；满足上述条件时对30份RCV阴性血清进行测定，其均值为0.22，标准差为0.48。为了简并计算，评估阴性样本测定的标准差为0.5，cut off值设定为阴性对照OD450+0.15.

实施例5 RCV抗原肽在ELISA实验中与其他病毒抗血清抗体无交叉反应。

特异性实验：

（1）实验方法和步骤依据实施例4的实施方案；

（2）测试样品为淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、小鼠肺炎病毒（PVM）、呼肠孤病毒III型（Reo-3）、仙台病毒（SV）、细小病毒（KRV）以及小鼠肝炎病毒（MHV）的大鼠免疫血清。这些血清为检测这些病毒的质控品，按照1：100进行稀释进行测试；

（3）样品做复孔检测，取平均值进行判定。Cut off值为0.207+0.15=0.357。

表4

结果分析：

（1）在对多份不同病毒的质控血清的测试中阴性样品为SPF大鼠血清，无感染上述病毒的情况下对RCV抗原的免疫反应性应为阴性，按照检测方法的要求，测定值应低于0.25，本次测试的测试值为0.207，质控结果符合。

（2）本次测试的Cut off值设定为0.357，基于此进行判定。

（3）阳性对照为RCV病毒阳性大鼠血清，测试值为1.421，结果高于Cut off值。

（4）其他病毒阳性的血清与RCV多肽抗原的反应性低于Cut off值，可判定为阴性。

（5）上述结果表面，该检测方法的在测定大鼠RCV血清抗体过程中，与其他病毒的抗体无交叉反应，具有较高的特异性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院医学实验动物研究所

<120> 大鼠冠状病毒的抗原肽及其应用

<130> MP2025406

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Lys Thr Thr Trp Ala Asp Gln Thr Glu Arg Gly Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Gly Ser Val Val Pro His Tyr Ser Trp Phe Ser Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Pro Ser Ser His Glu Ala Ile Pro Thr Arg Phe Ala Pro

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Asp Pro Gln Phe Pro Ile Leu Ala Glu Leu Ala Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Lys Leu Glu Leu Val Lys Lys Asn Ser Gly Gly Ala Asp

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Thr Ser Ile Ser Asn Ala Arg Ala Pro Ser Val Ser Thr

1 5 10

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

His Arg Glu Cys Asn Val Gln Ala Ser Gly Phe Lys His

1 5 10

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Phe Val Gln Asp His Gly Glu Trp Lys Phe Thr Gly Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ser Asp Pro Gln Phe Pro Ile Leu Ala Glu Leu Ala Pro

1 5 10

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Lys Lys Thr Thr Trp Ala Asp Gln Thr Glu Arg Gly Gln

1 5 10

Claims

1.多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.如权利要求1所述的多肽在制备大鼠冠状病毒的检测试剂或检测工具中的应用。

3.检测大鼠冠状病毒的试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的多肽以及检测可接受的助剂。

4.检测大鼠冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的多肽以及检测可接受的助剂或载体。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为芯片。