JP2796962B2 - 口蹄疫ビールスの抗原活性を有する組成物 - Google Patents
口蹄疫ビールスの抗原活性を有する組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、口蹄疫ビールスA
10亜型の抗原エピトープまたはその分子トポロジー的
同等物である口蹄疫ビールスの抗原活性を有する組成物
に関する。 【0002】 【従来の技術】本明細書中に使用される下記にリストア
ップした用語は、以下に述べる意味を有する。 エピトープ:抗体分子と相互作用する領域によって描写
される抗原分子の特定の表面。 カタマー (catamer):正確に定義された連鎖を有し、か
つ小さい分子の正確な数の縮合によって形成されたポリ
マー分子。この用語は、ポリマー分子において小さい分
子を結合するために異なる種類の縮合反応が用いられて
いる場合を含むことに注意すべきである。 【0003】用語“カタマー" の前に置かれた数字は、
そのカタマーが示された数の小さい分子の縮合によって
形成されたことを示し、たとえば、8−カタマーは8個
の小さい分子からそのカタマーが形成されていることを
意味する。カタマーの例には、既知のペプチド、および
既知のオリゴ糖類が含まれる。 モノマー:相互に縮合してカタマーを形成することがで
きる多数の小分子の群。 【0004】この小分子の群には、たとえば通常のL−
アミノ酸の群、D−アミノ酸の群、合成アミノ酸の群、
ヌクレオチドの群およびペントースおよびヘキソースの
群が含まれるが、それらに限定されない。 ペプチド:小分子がα−アミノ酸であり、このα−アミ
ノ酸がペプチド結合で相互に連合しているカタマー。本
明細書中においては、アミノ酸がL−光学異性体または
D−光学異性体であることを知るべきである。 ミモトープ(mimotope):少なくともその配置の一つに、
擬態であるがエピトープのそれと等価の分子トポロジー
の表面領域を有するカタマー。 相補性:抗体パラトープ(paratope)の反応表面と、その
特定エピトープとの相互組み合わせに関する。これら表
面は、抗体パラトープと、そのエピトープとの結合の
間、組み合わされなければならない。すなわち、パラト
ープおよびそのエピトープは相補性として記述され、更
に特徴となる接触表面は相互に相補性である。 パラトープ(paratope):特定のエピトープに対して相補
性である抗体の結合部位。 【0005】以下は、すでに良く知られていることであ
る: 1.抗原はタンパク質または多糖類のような巨大分子で
あり、必ずとは云えないが、通常ではヒトおよび動物に
とって異物であり、人体または動物体内に導入された場
合に液素性または細胞性免疫応答、またはその両者を刺
激する; 2.抗体が結合する抗原の特定領域はエピトープとして
知られている; 3.抗原分子上には一つ以上のエピトープが存在する; 4.抗原に対する身体の全体的液素性応答は、抗原の種
々のエピトープに対する抗体を生成することである;個
々の抗体の夫々はモノクロナール抗体であり、定義によ
れば単一の前駆体B−細胞の増殖および分化によっても
たらされる細胞群から生成される; 5.抗体分子のパラトープは、エピトープと抗体の間の
接触表面である抗体結合部位の分子表面として定義され
る; 6.抗原の所定のエピトープに対して、夫々パラトープ
が異なる一つ以上の抗体が生成される;夫々のパラトー
プは、相補性エピトープへの特異性によって特徴づけら
れる;および 7.抗原による攻撃に対応して生成された抗体は、幾分
かは抗原と結合することによって直接的に中和されるこ
と;他の部分はマクロファージ系によって処理されうる
集合体を形成できること;更になお他の部分は評価しう
る何らの生物学的影響も示すことができないこと。 【0006】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、口蹄
疫ビールスA10亜型の抗原エピトープまたはその分子ト
ポロジー的同等物である、口蹄疫ビールスの抗原活性を
有する組成物を提供することである。 【0007】 【課題を解決するための手段】本発明の組成物は、下記
式を有するペプチドの混合物からなる。 Y−X−X−D2−D1−X−X−X−X−(固体支持体) (ここで、D1およびD2の各々は所定のアミノ酸を示
し、Xはいずれかのアミノ酸を示し、かつYは末端基を
示す)前記した口蹄疫ビールスA10亜型抗原のエピト
ープと同等な短いカタマー連鎖は、エピトープが結合す
ると同じ抗体と結合することができる。これらカタマ
ー、すなわちペプチドは、エピトープのミモトープであ
る。この情報は、口蹄疫ビールスA10亜型に対する合
成カタマーワクチンをデザインする上で、およびすべて
の特定の診断薬および治療薬をデザインする上ではかり
知れないほど価値がある。 【0008】 【発明の実施の形態】相互に縮合してカタマーを形成す
ることができる小分子の最も有用な群はα−アミノ酸で
ある。しかしながら、化学的に矛盾なく選択された他の
分子も使用することができる。たとえばβ−アミノ酸
は、カタマーの正確に制御された位置に付加的なC−結
合スペーサーを付加できる利点があるので使用すること
ができる。 【0009】本発明によれば、対象の抗体の特定パラト
ープに対して相補性のあるエピトープのトポロジー的同
等物であるモノマーの連鎖が提供される。これらのカタ
マーは下記工程により合成できる。 (1)多数のカタマー標本、すなわちペプチドの混合物
からなる組成物を合成する工程;ここで該カタマー標本
の夫々は、各カタマーにおける一つまたはそれ以上の指
定された位置における構成が知られており、その他の位
置における構成が、限定されたモノマーセットの構成員
から無作為に形成されている多数のカタマーから成り;
そして該多数のカタマー標本は、指定された位置におけ
る構成が限定されたモノマーセットからの構成員を含有
するように系統的に変えられている標本から成り; (2)該多数のカタマー標本を、対象とする抗体と接触
せしめる工程; (3)前記抗体のパラトープに対するミモトープの部分
連鎖を示すために、前記多数のカタマー標本の夫々と前
記抗体との間の結合の存在の有無を検出または決定する
工程、 (4)次に、各カタマー中に前記工程(1)におけるよ
り更に一つまたはそれ以上構成が知られた指定位置を有
する多数のカタマー標本を更に合成する工程;および (5)前記工程(2)および(3)を、前記工程(4)
で合成された多数のカタマー標本に関して繰り返す工
程。 【0010】工程(4)および(5)の操作は、各カタ
マー標本におけるすべての位置が明らかになるまで繰り
返される;そしてすべての推論されたミモトープが次い
で合成され、対象とする抗体との相対的な反応能力か
ら、どれがこの所定の抗体に対応するエピトープのより
良いミモトープであるか決定される。本発明は、抗体
が、該抗体に対応するエピトープのミモトープであるカ
タマー、すなわちペプチドと特異的に反応することにも
とづいている。 【0011】更に本発明は、免疫学の現代技術によれば
抗体とそのエピトープとの間の反応を、両者が極めて小
量存在する場合も検出することができる知識にもとづく
ものである。抗体とそのエピトープが、約1pモルの量
で存在する場合には、結合は検出される。従って、もし
抗体がそのエピトープに対するミモトープであるカタマ
ーとの混合物として存在するならば、その混合物と反応
してミモトープと特異的に結合することが見られよう。 【0012】最近の指摘によれば、モノマーが一連のα
−アミノ酸に由来する場合には長さが約8モノマーであ
るカタマーによってエピトープが擬態化される。8カタ
マーがエピトープのミモトープとなる能力は、特定のモ
ノマーを有するすべての位置に決定的に依存するもので
はない。しかしながら、本発明は8個のモノマーから形
成された連鎖に限定されないことが理解されるべきであ
る。 【0013】本発明の実施に際して合成される、要求さ
れる多数のカタマー標本は、既知のカタマー製造法のい
づれかによって製造することができる。モノマーがアミ
ノ酸であるときの好ましい方法は、オーストラリア特許
明細書第25429/84号に記述された固相技術を用いる方法
であり、ここではカタマーの各混合物はポリエチレン支
持体上に合成される。 【0014】このようにして製造された多数のカタマー
標本を、次いで対象となる特定の抗体と接触させる。抗
体とカタマー標本の成分との間の反応は、次いで通常の
いづれかの方法、たとえば放射線免疫試験(RIA)に
よって検出される。しかしながら、抗体−ミモトープ結
合の存在を検出する好ましい方法は、良く知られた酵素
連結イムノソルベントアッセイ(ELISA)を使用す
ることである。 【0015】夫々の試験の最後に、カタマー標本から抗
体を、たとえば8M尿素、0.1%2−メルカプトエタノ
ールおよび0.1%ナトリウムドデシルサルフェート溶液
で洗浄し、次いでリン酸塩緩衝食塩水で数回洗浄するこ
とにより除去することができる。このようにして、多数
のカタマー標本を多くの他の抗体との試験に使用するこ
とができる。 【0016】カタマー標本と抗体との試験において、或
る種の棒が抗体と検出可能な結合を示すことが見出され
る。抗体と最も強く結合しているカタマーを選択するこ
とは単純である。このカタマーがエピトープの最良のミ
モトープであることの最終的チエックとして、カタマー
の連鎖がオーストラリア特許明細書第25428/84号に記載
されたような置換ネット(net) の母体連鎖として使用さ
れる。 【0017】カタマー標本、すなわちペプチドの混合物
からなる組成物は、口蹄疫ビールスA10亜型の診断薬お
よび治療薬をデザインする上で価値がある。 【0018】 【実施例】下記に示す実施例1および参考例1,2にお
いて、限定されたモノマーセットは通常のL−α−アミ
ノ酸の組みである。このモノマーのセットは、指定され
た位置および任意の位置(D1 , D2 およびX位置)の
両方のために用いられる。 実施例1 下記一般式を有する多数の8−カタマー標本が合成され
た。 【0019】アセチル−NH−X−X−D2−D1−X−
X−X−X−〔固体支持体〕 ここでXは、20個の通常のL−α−アミノ酸の群の一員
であり、この結果、この群の各員はカタマー標本におい
てX位置にほぼ等モル量存在する;指示された位置D1
およびD2 も共に同一のモノマーの群の一員であり;−
NH−はカタマーの末端アミン基を表わす。 【0020】8−カタマー標本は一般的にオーストラリ
ア特許明細書第25429/84号に記載されているようにし
て、合成中にL−α−アミノ酸を保護するためにBOC
基を用いて、固体ポリマーのピンまたは棒上に合成され
た。通常のα−アミノ酸の群の各員は、X位置で下記の
ようにして結合された: 1.アミノ酸の混合物を 102mlのジメチルホルムアミド
(DMF)に溶解した。この混合物は下記から成る。 【0021】 BOC−L−アラニン 32 mg BOC−メトキシベンジル−L−システイン 100 mg BOC−ベンジル−L−アスパラギン酸 90 mg BOC−ベンジル−L−グルタミン酸 96 mg BOC−L−フェニルアラニン 61 mg BOC−L−グリシン 27 mg BOC−トシル−L−ヒスチジン 142 mg BOC−L−イソロイシン・1/2H2O 51 mg BOC−カルボベンゾキシ−L−リジン 124 mg BOC−L−ロイシン・H2O 55 mg BOC−L−メチオニン 54 mg BOC−L−アスパラギン 47 mg BOC−L−プロリン 42 mg BOC−L−グルタミン 53 mg BOC−トシル−L−アスパラギン・H2O 167 mg BOC−ベンジル−L−セリン 76 mg BOC−ベンジル−L−スレオニン 83 mg BOC−L−バリン 42 mg BOC−L−トリプトファン 78 mg BOC−ベンジル−L−チロシン 116 mg 2.1310mgの1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HO
BT)を34mlのDMFに溶解した溶液を作った。 【0022】3.N,N'−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド(DCC)1150mgを34mlのDMFに溶解した溶液
を作った。 4.使用前に、HOBTの溶液をアミノ酸の溶液に加
え、混合した。次いでDDCの溶液を加え混合した。次
いで、すでに固体支持体上にあるカタマーまたは結合分
子を、得られた混合物と反応させた。 【0023】個々のL−アミノ酸を、オーストラリア特
許明細書第25429/84号記載の方法に従ってD1 およびD
2 位置に結合させた。この結果、D1 およびD2 位置で
20の通常のアミノ酸のありうる組み合わせにあたる 400
種のカタマー標本が合成された。多数の8−カタマー標
本をモノクロナール抗体に対してELISAによって試
験をした。このモノクロナール抗体は、当該分野におい
て良く知られている技術を用いて、口蹄疫ビールス (F
MDV) A10亜型に対して製造された。 【0024】ELISA試験の実施においては、支持体
に支持されたペプチドを、1%オバルブミン/1%ウシ
血清アルブミン/0.1%トウィーン20のリン酸塩緩衝食
塩水(PBS)中におけるプリコート溶液中で25℃で1
時間保持して、抗体の非特定的吸収を塞いだ。次いで、
プリコート溶液中のモノクロナール抗体の適当な希釈物
中4℃で1夜保持した後に、0.05%トウィーン(Tween)
20/PBS中で3回洗浄した。 【0025】セイヨウワサビペルオキシダーゼに配合さ
れ、プリコート溶液で希釈されたヤギ抗マウスIgGと
25℃で1時間反応後にPBS/トウィーンで十分に洗浄
して過剰の配合体を除去した。抗体の存在は、新たに調
製した酵素基質溶液(o−フエニレンジアミン40mgおよ
びリン酸塩/クエン酸塩緩衝液pH5.0 100ml 中の“120v
ol."過酸化水素18μl )と45分間反応させ、次に450nm
で検出された発色によって検出した。 【0026】図1は、この抗体による8−カタマー標本
の試験結果を示す。図1において、20本の線から成る各
群は、ELISA試験において 450nmで測定した場合に
発現した色の吸光度の応答を単位で表わす。20本の線の
群における夫々の線は、各群の直下に一文字記号で示さ
れた共通のアミノ酸をD1 位置に有する。20本の線の各
群の夫々の線は、D2 位置で異なるアミノ酸を表わす−
これらは一文字記号のアルファベット順である。これら
の結果を表1にまとめた(表1および以下の記載を通し
て、アミノ酸の一文字記号が用いられる)。 【0027】 【表1】【0028】表1から、抗体が多数の8−カタマー標本
と強く反応することが明らかである。反応の強さの順
に、指示された位置(−D2 −D1 −) が−M−H−,
−M−K−,−K−K−,−K−H−,−Q−H−およ
び−H−H−である8−カタマー標本が含まれる。 【0029】更に2種類の多数の8−カタマー標本が合
成された。これらは下記の式を有する。 アセチル−NH−X−D3−M−K−X−X−X−X−
〔固体支持体〕 および アセチル−NH−X−X−M−K−D4−X−X−X−
〔固体支持体〕 ここでMはメチオニン残基を示し、Kはリジン残基を示
し、D3 およびD4 はこれら一連の合成のために新たに
指示された位置を示す。式中で用いられた他の用語は先
に用いられたとおりである。 【0030】これら8−カタマー標本を、口蹄疫ビール
ス(FMDV)A10に対するモノクロナール抗体に対し
て試験した。図2AおよびBは、図1に示した結果を得
るのに用いたモノクロナール抗体によるELISA試験
の結果を示す。図2Aは、下記一般式の8−カタマー標
本を表わす。 【0031】アセチル−NH−X−D3−M−K−X−
X−X−X−〔固体支持体〕 図2Bは下記一般式の8−カタマー標本を示す。 アセチル−NH−X−X−M−K−D4−X−X−X−
〔固体支持体〕 図2AおよびBの両方において、D3 またはD4 位置に
おけるアミノ酸を、450nm で測定したときの発色の吸光
度を表わす各線の下に示した。 【0032】この結果を表2にまとめた。抗体結合活性
を、1.1よりも大きな値を与えるすべての8−カタマー
標本について、指定されたアミノ酸対M−Kを含む8−
カタマー標本について示した。また、逆の対K−Mにつ
いて見出された値も示した。 【0033】 【表2】【0034】モノクロナール抗体と最も反応性に富む8
−カタマー標本は、指定された位置に下記の連鎖を有す
ることが明らかである。図2Aから、−H−M−K−,
−W−M−K−および−Q−M−K−。図2Bから、−
M−K−H−,−M−K−Q−および−M−K−W−。 【0035】M−Kで指示された対のいずれかの側にヒ
スチジンの加入によって、最大の抗体結合活性が得られ
た。しかしながら、アミノ末端側のヒスチジンは、トリ
プトファンよりも著しく良好なわけではなく、指定され
た連鎖W−M−K−Hを選定して更に評価した。個々の
好ましい延長とM−K対との組み合わせが最適であると
予想される指定された連鎖W−M−K−Hを用いて試験
を続行した場合の効果を試験した。 【0036】母体連鎖アセチル−NH−X−W−M−K
−H−X−X−X−SS 〔固体支持体〕にもとづくカタ
マー連鎖を合成し、四つの指定された位置の各々を19の
すべてのアミノ酸で一度に一つづつ置換した。このカタ
マー標本の組みの、モノクロナール抗体(MAb) との
結合活性の試験から、Q−M−R−Hが好ましい連鎖延
長であることが示された (得られたE 450 は;Ac X−
W−M−K−H−X−X−X−SS =0.69, Ac −X−
Q−M−K−H−X−X−X−SS =1.47, およびAc
−X−W−M−R−H−X−X−X−SS =1.11, 試験
バックグラウンド0.2であった)。 【0037】指定された連鎖M−K−Hのアミノ末端側
において、M−K対について決定されたように、トリプ
トファンよりもグルタミンが優れていることは、個々に
決定された最適性の相互依存性を示している。次に、下
記一般式の8−カタマー標本を合成した。 アセチル−NH−D5−Q−M−R−H−X−X−X−
〔固体支持体〕 および アセチル−NH−X−Q−M−R−H−D6−X−X−
〔固体支持体〕 最高の抗体結合活性を有する標本は、D5 =トリプトフ
ァンおよびD6 =セリンの場合であり、このことからW
−Q−M−R−H−Sが最適の連鎖であることが示唆さ
れる。この連鎖のいづれかの側にアミノ酸を更に指定す
ることによる抗体結合活性の著るしい改善は得られなか
った。 【0038】この連鎖のすべての単一アミノ酸置換体か
らなり、ヘキサペプチドとして合成したペプチドのセッ
トの評価から、W−Q−M−R−H−Sが最適のヘキサ
ペプチドに近いことが確認された。ペプチドのアルギニ
ンをグリシンで置換して連鎖W−Q−M−G−H−Sと
なした場合、いくらかの抗体結合活性の増加が示され
た。 【0039】関連するペプチドの決定された群の、試験
MAbに対する抗体結合反応の特異性を確認するため
に、ペプチドに対する試験MAbの滴定数を、マッコウ
クジラ・ミオグロビンまたはA型肝炎に対する試験MA
bのそれと比較した(表3)。抗体結合反応の特異性
は、これらペプチドの連鎖を決定するために用いた抗体
である試験MAbに関して明らかである。 【0040】 【表3】【0041】各MAbについての抗体滴定数はELIS
Aにより測定し、試験バックグラウンドの3倍の吸光を
生ずる腹水の相互希釈に相当する。数値は、希釈した夫
々の腹水と関係のないペプチドコントロール(Ac −G
−D−L−G−S−I−SsおよびAc −G−D−L−
Q−V−L−Ss ) との反応によって測定された非特異
的吸収に関して補正した。 【0042】試験したモノクロナール抗体は下記のとお
りであった:本書中に記載した試験MAbである抗−F
MDV,A10型 (全ビールスに対する滴定数1.3×1
06 );抗−A型肝炎,反応の位置は未知(A型肝炎ビ
ールスに対する滴定数106 ) ; および抗ミオグロビン
(マッコウクジラ), 反応位置は未知 (マッコウクジラ
・ミオグロビンに対する滴定数106 ) 。 参考例1 参考例1は、本発明をポリクロナール抗体に適用した場
合を述べる。 【0043】実施例1に記述したように、下記一般式を
有する多数の8−カタマーを更に合成した。 アセチル−NH−X−X−D2−D1−X−X−X−X−
〔固体支持体〕 これらカタマーを、合成ペプチドC−G−D−L−G−
S−I−A−Kに対して得られた抗体に対して試験し
た。この合成ペプチドは、メリフィールド(Merrifield)
の固相ペプチド合成の通常の技術を用いて合成した。こ
のペプチドをシステイン部分のスルフヒドリル基を経て
キーホール・リンペット・ヘモシアニンと結合させた。
この結合したペプチドをフロインドの不完全アジュバン
トで製剤化し、ウサギに筋肉内注射した。注射後40日を
経てウサギの血液から抗血清を得た。 【0044】多数の8−カタマー標本の、抗体によるE
LISA試験の結果を図1と同様な方法で図3に示し
た。図3から、E(グルタミン酸)をD1 位置に有する
すべての8−カタマー標本は、抗体と顕著に反応するこ
とが明らかである。抗体と顕著に反応する他の組み合わ
せには、減少する順に、−D−I−,−G−D−,−I
−G−および−D−V−が含まれる。 【0045】上記実施例1で述べたようにして、下記の
式を有する多数の8−カタマー標本を更に合成した。 アセチル−NH−X−D3−D−I−X−X−X−X−
〔固体支持体〕 および アセチル−NH−X−X−D−I−D4−X−X−X−
〔固体支持体〕 ここでDはアスパラギン酸であり、Iはイソロイシンで
ある。 【0046】抗体との試験結果を、図2におけると同様
な方法で図4に示した。図4Aは下記一般式の8−カタ
マー標本を示し、 アセチル−NH−X−D3−D−I−X−X−X−X−
〔固体支持体〕 図4Bは下記一般式の8−カタマー標本を示す。 アセチル−NH−X−X−D−I−D4−X−X−X−
〔固体支持体〕 図4から抗体と反応する8−カタマー標本は、指定され
た位置に下記の連鎖を含むことを示す。 【0047】−G−D−I−,−A−D−I−,−P−
D−I−,−D−I−D−,−D−I−M−および−D
−I−T−。図4AとBとの比較から、−D−I−対の
直前の位置は−D−I−対の直後の位置よりもはるかに
少ない範囲のアミノ酸が許されることが明白である。下
記母体連鎖にもとづき、カタマー標本における四つの指
定された位置が夫々一度に一つづつ、すべて19の他のア
ミノ酸で置換された8−カタマー標本を合成した。 【0048】アセチル−NH−X−X−G−D−I−D
−X−X−〔固体支持体〕 この標本の組みの、試験抗体との結合活性についての試
験は、この抗体との反応能力を保持するためにはグリシ
ン残基はアラニンによってのみ置換されること;アミノ
末端アスパラギン酸は他のアミノ酸で置換できないこ
と;イソロイシンはバリン,ロイシンまたはスレオニン
または結合活性は減少するが約10の他のアミノ酸で置換
できること;およびカルボキシル末端アスパラギン酸は
事実上いづれのアミノ酸によっても置換でき、この位置
におけるセリンは最も強い結合を与えることを示してい
る。また試験結果は、指定された連鎖G−D−I−Sが
鎖延長に好ましいことを示している。 【0049】上記のような指定連鎖の延長は、アミノ末
端へのトリプトファンおよびカルボキシル末端へのヒス
チジンの加入が好ましいことを示している。しかしなが
ら、いづれの鎖延長も抗体結合活性においては顕著な増
加を示さなかった。好ましい指定された連鎖W−G−D
−I−S−Hを更に延長することは、更に連鎖を延長す
ることにほとんど利点がないことを示した。 【0050】この特定の抗体に対して決定されたミモト
ープ、すなわちW−G−D−I−S−Hは、抗体を導入
するために使用したペプチド、すなわちC−G−D−L
−G−S−I−A−Kに対して一時的な類似性を有する
のみであることに注目すべきである。しかしながら、免
疫学的連鎖G−D−L−G−S−Iにもとづく置換ネッ
トにおける抗体の試験では、導入連鎖G−D−L−G−
S−Iよりも連鎖G−D−L−G−D−Iが著るしく好
ましいことを示した (E450 値は夫々0.16および0.45)
。 【0051】決定されたミモトープと抗体に結合してい
るペプチドとの間には類似性がある。このことは本発明
の方法を広範囲に適用できる強力な証拠である。 参考例2 この参考例2は多数のカタマー標本の鎖長を8−カタマ
ーよりも短くすることができることを示す。 【0052】下記一般式を有する4−カタマー標本を合
成した。 アセチル−NH−X−D2−D1−X−〔固体支持体〕 ここで略記号は実施例1で用いたものと同様であり、合
成方法も実施例1で用いた方法と同一である。この4−
カタマーを当該分野において良く知られている技術を用
いてマッコウクジラ・ミオグロビンに対して生じたモノ
クロナール抗体に対して試験した。 【0053】この抗体による多数の4−カタマー標本の
ELISA試験の結果を、図1と同様な方法で図5に示
す。図5から、下記の一般式を有するカタマー標本のみ
が アセチル−NH−X−L−A−X−〔固体支持体〕 モノクロナール抗体と反応できることが明らかである。 【0054】前記実施例1に述べたようにして、更に下
記一般式を有する多数の4−カタマー標本を合成した。 アセチル−NH−D3−L−A−X−〔固体支持体〕 および アセチル−NH−X−L−A−D4−〔固体支持体〕 表4にモノクロナール抗体によるELISA系において
試験をした最も活性なカタマー標本をまとめた。 【0055】 【表4】 【0056】下記母体連鎖に基づくカタマー標本を合成
して、参考例1に述べたような置換ネットを形成した。 アセチル−NH−P−L−A−Q−〔固体支持体〕 これらのペプチドのモノクロナール抗体によるELIS
A試験の結果を図6に示す。図6における20個の線の各
群は、母体レスポンス(E450 =2.62, バックグラウン
ド0.25) の平均に対して比較したレスポンス%を表わ
す。図6中の20個の線の群の各員は、他のアミノ酸によ
って置換された、下に示したアミノ酸を有する。線の順
序はアミノ酸の一文字記号のアルファベット順である。 【0057】20個の線の各群における太い線は、母体連
鎖P−L−A−Qを示す。図6から、カタマー標本が母
体連鎖の少なくとも半分の活性を以てこのモノクロナー
ル抗体と結合しうるには、プロリンはバリン,イソロイ
シン,ロイシン,アラニンまたはセリンで置換できるこ
と;ロイシンはフエニルアラニンのみで置換できるこ
と;アラニンは事実上他のいづれのアミノ酸によっても
置換できること;およびグルタミン残基はアスパラギン
によってのみしか置換可能でないことが明らかである。 【0058】マッコウクジラ・ミオグロビン連鎖のすべ
ての重複する4−カタマーのセットを、実施例1におい
て指定された位置について述べた方法を用いて合成し
た。これらのカタマーをELISA試験によりモノクロ
ナール抗体と反応させた。結果を図7に示す。各線はE
LISA試験において450nm で読んだ発色を示す。各線
に付した番号は、特定のカタマーのアミノ末端における
残基がマッコウクジラ・ミオグロビン連鎖におけると同
一番号を有するように付けた。 【0059】図7から、モノクロナール抗体と反応する
唯一の4−カタマーは、マッコウクジラ連鎖の88〜91残
基から成ることが明白である。この連鎖はP−L−A−
Qである。明らかに、モノクロナール抗体はマッコウク
ジラ・ミオグロビン上のこの特定の決定基を認識してい
る。下記一般式を有する一連の5−カタマーを合成して
指定された連鎖に対する最上の鎖延長を決定した。 【0060】アセチル−NH−D5−P−L−A−Q−
〔固体支持体〕 および アセチル−NH−P−L−A−Q−D6 −〔固体支持
体〕 最上の結合性標本は、 アセチル−NH−K−P−L−A−Q−〔固体支持体〕 アセチル−NH−P−L−A−Q−Y−〔固体支持体〕 であった。 【0061】連鎖K−P−L−A−Qは残基87〜91にお
けるマッコウクジラ・ミオグロビンの連鎖と相同である
ことに注目すべきである。更に、この参考例は本発明技
術の適用可能性を示している。 【0062】 【発明の効果】口蹄疫ビールスA10型抗原エピトープま
たはその分子トポロジー的同等物であるアミノ酸連鎖お
よびそれらの免疫学的に活性な同等物が提供される。こ
れらを用いて口蹄疫の診断および治療に有用な試薬をデ
ザインできる。
10亜型の抗原エピトープまたはその分子トポロジー的
同等物である口蹄疫ビールスの抗原活性を有する組成物
に関する。 【0002】 【従来の技術】本明細書中に使用される下記にリストア
ップした用語は、以下に述べる意味を有する。 エピトープ:抗体分子と相互作用する領域によって描写
される抗原分子の特定の表面。 カタマー (catamer):正確に定義された連鎖を有し、か
つ小さい分子の正確な数の縮合によって形成されたポリ
マー分子。この用語は、ポリマー分子において小さい分
子を結合するために異なる種類の縮合反応が用いられて
いる場合を含むことに注意すべきである。 【0003】用語“カタマー" の前に置かれた数字は、
そのカタマーが示された数の小さい分子の縮合によって
形成されたことを示し、たとえば、8−カタマーは8個
の小さい分子からそのカタマーが形成されていることを
意味する。カタマーの例には、既知のペプチド、および
既知のオリゴ糖類が含まれる。 モノマー:相互に縮合してカタマーを形成することがで
きる多数の小分子の群。 【0004】この小分子の群には、たとえば通常のL−
アミノ酸の群、D−アミノ酸の群、合成アミノ酸の群、
ヌクレオチドの群およびペントースおよびヘキソースの
群が含まれるが、それらに限定されない。 ペプチド:小分子がα−アミノ酸であり、このα−アミ
ノ酸がペプチド結合で相互に連合しているカタマー。本
明細書中においては、アミノ酸がL−光学異性体または
D−光学異性体であることを知るべきである。 ミモトープ(mimotope):少なくともその配置の一つに、
擬態であるがエピトープのそれと等価の分子トポロジー
の表面領域を有するカタマー。 相補性:抗体パラトープ(paratope)の反応表面と、その
特定エピトープとの相互組み合わせに関する。これら表
面は、抗体パラトープと、そのエピトープとの結合の
間、組み合わされなければならない。すなわち、パラト
ープおよびそのエピトープは相補性として記述され、更
に特徴となる接触表面は相互に相補性である。 パラトープ(paratope):特定のエピトープに対して相補
性である抗体の結合部位。 【0005】以下は、すでに良く知られていることであ
る: 1.抗原はタンパク質または多糖類のような巨大分子で
あり、必ずとは云えないが、通常ではヒトおよび動物に
とって異物であり、人体または動物体内に導入された場
合に液素性または細胞性免疫応答、またはその両者を刺
激する; 2.抗体が結合する抗原の特定領域はエピトープとして
知られている; 3.抗原分子上には一つ以上のエピトープが存在する; 4.抗原に対する身体の全体的液素性応答は、抗原の種
々のエピトープに対する抗体を生成することである;個
々の抗体の夫々はモノクロナール抗体であり、定義によ
れば単一の前駆体B−細胞の増殖および分化によっても
たらされる細胞群から生成される; 5.抗体分子のパラトープは、エピトープと抗体の間の
接触表面である抗体結合部位の分子表面として定義され
る; 6.抗原の所定のエピトープに対して、夫々パラトープ
が異なる一つ以上の抗体が生成される;夫々のパラトー
プは、相補性エピトープへの特異性によって特徴づけら
れる;および 7.抗原による攻撃に対応して生成された抗体は、幾分
かは抗原と結合することによって直接的に中和されるこ
と;他の部分はマクロファージ系によって処理されうる
集合体を形成できること;更になお他の部分は評価しう
る何らの生物学的影響も示すことができないこと。 【0006】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、口蹄
疫ビールスA10亜型の抗原エピトープまたはその分子ト
ポロジー的同等物である、口蹄疫ビールスの抗原活性を
有する組成物を提供することである。 【0007】 【課題を解決するための手段】本発明の組成物は、下記
式を有するペプチドの混合物からなる。 Y−X−X−D2−D1−X−X−X−X−(固体支持体) (ここで、D1およびD2の各々は所定のアミノ酸を示
し、Xはいずれかのアミノ酸を示し、かつYは末端基を
示す)前記した口蹄疫ビールスA10亜型抗原のエピト
ープと同等な短いカタマー連鎖は、エピトープが結合す
ると同じ抗体と結合することができる。これらカタマ
ー、すなわちペプチドは、エピトープのミモトープであ
る。この情報は、口蹄疫ビールスA10亜型に対する合
成カタマーワクチンをデザインする上で、およびすべて
の特定の診断薬および治療薬をデザインする上ではかり
知れないほど価値がある。 【0008】 【発明の実施の形態】相互に縮合してカタマーを形成す
ることができる小分子の最も有用な群はα−アミノ酸で
ある。しかしながら、化学的に矛盾なく選択された他の
分子も使用することができる。たとえばβ−アミノ酸
は、カタマーの正確に制御された位置に付加的なC−結
合スペーサーを付加できる利点があるので使用すること
ができる。 【0009】本発明によれば、対象の抗体の特定パラト
ープに対して相補性のあるエピトープのトポロジー的同
等物であるモノマーの連鎖が提供される。これらのカタ
マーは下記工程により合成できる。 (1)多数のカタマー標本、すなわちペプチドの混合物
からなる組成物を合成する工程;ここで該カタマー標本
の夫々は、各カタマーにおける一つまたはそれ以上の指
定された位置における構成が知られており、その他の位
置における構成が、限定されたモノマーセットの構成員
から無作為に形成されている多数のカタマーから成り;
そして該多数のカタマー標本は、指定された位置におけ
る構成が限定されたモノマーセットからの構成員を含有
するように系統的に変えられている標本から成り; (2)該多数のカタマー標本を、対象とする抗体と接触
せしめる工程; (3)前記抗体のパラトープに対するミモトープの部分
連鎖を示すために、前記多数のカタマー標本の夫々と前
記抗体との間の結合の存在の有無を検出または決定する
工程、 (4)次に、各カタマー中に前記工程(1)におけるよ
り更に一つまたはそれ以上構成が知られた指定位置を有
する多数のカタマー標本を更に合成する工程;および (5)前記工程(2)および(3)を、前記工程(4)
で合成された多数のカタマー標本に関して繰り返す工
程。 【0010】工程(4)および(5)の操作は、各カタ
マー標本におけるすべての位置が明らかになるまで繰り
返される;そしてすべての推論されたミモトープが次い
で合成され、対象とする抗体との相対的な反応能力か
ら、どれがこの所定の抗体に対応するエピトープのより
良いミモトープであるか決定される。本発明は、抗体
が、該抗体に対応するエピトープのミモトープであるカ
タマー、すなわちペプチドと特異的に反応することにも
とづいている。 【0011】更に本発明は、免疫学の現代技術によれば
抗体とそのエピトープとの間の反応を、両者が極めて小
量存在する場合も検出することができる知識にもとづく
ものである。抗体とそのエピトープが、約1pモルの量
で存在する場合には、結合は検出される。従って、もし
抗体がそのエピトープに対するミモトープであるカタマ
ーとの混合物として存在するならば、その混合物と反応
してミモトープと特異的に結合することが見られよう。 【0012】最近の指摘によれば、モノマーが一連のα
−アミノ酸に由来する場合には長さが約8モノマーであ
るカタマーによってエピトープが擬態化される。8カタ
マーがエピトープのミモトープとなる能力は、特定のモ
ノマーを有するすべての位置に決定的に依存するもので
はない。しかしながら、本発明は8個のモノマーから形
成された連鎖に限定されないことが理解されるべきであ
る。 【0013】本発明の実施に際して合成される、要求さ
れる多数のカタマー標本は、既知のカタマー製造法のい
づれかによって製造することができる。モノマーがアミ
ノ酸であるときの好ましい方法は、オーストラリア特許
明細書第25429/84号に記述された固相技術を用いる方法
であり、ここではカタマーの各混合物はポリエチレン支
持体上に合成される。 【0014】このようにして製造された多数のカタマー
標本を、次いで対象となる特定の抗体と接触させる。抗
体とカタマー標本の成分との間の反応は、次いで通常の
いづれかの方法、たとえば放射線免疫試験(RIA)に
よって検出される。しかしながら、抗体−ミモトープ結
合の存在を検出する好ましい方法は、良く知られた酵素
連結イムノソルベントアッセイ(ELISA)を使用す
ることである。 【0015】夫々の試験の最後に、カタマー標本から抗
体を、たとえば8M尿素、0.1%2−メルカプトエタノ
ールおよび0.1%ナトリウムドデシルサルフェート溶液
で洗浄し、次いでリン酸塩緩衝食塩水で数回洗浄するこ
とにより除去することができる。このようにして、多数
のカタマー標本を多くの他の抗体との試験に使用するこ
とができる。 【0016】カタマー標本と抗体との試験において、或
る種の棒が抗体と検出可能な結合を示すことが見出され
る。抗体と最も強く結合しているカタマーを選択するこ
とは単純である。このカタマーがエピトープの最良のミ
モトープであることの最終的チエックとして、カタマー
の連鎖がオーストラリア特許明細書第25428/84号に記載
されたような置換ネット(net) の母体連鎖として使用さ
れる。 【0017】カタマー標本、すなわちペプチドの混合物
からなる組成物は、口蹄疫ビールスA10亜型の診断薬お
よび治療薬をデザインする上で価値がある。 【0018】 【実施例】下記に示す実施例1および参考例1,2にお
いて、限定されたモノマーセットは通常のL−α−アミ
ノ酸の組みである。このモノマーのセットは、指定され
た位置および任意の位置(D1 , D2 およびX位置)の
両方のために用いられる。 実施例1 下記一般式を有する多数の8−カタマー標本が合成され
た。 【0019】アセチル−NH−X−X−D2−D1−X−
X−X−X−〔固体支持体〕 ここでXは、20個の通常のL−α−アミノ酸の群の一員
であり、この結果、この群の各員はカタマー標本におい
てX位置にほぼ等モル量存在する;指示された位置D1
およびD2 も共に同一のモノマーの群の一員であり;−
NH−はカタマーの末端アミン基を表わす。 【0020】8−カタマー標本は一般的にオーストラリ
ア特許明細書第25429/84号に記載されているようにし
て、合成中にL−α−アミノ酸を保護するためにBOC
基を用いて、固体ポリマーのピンまたは棒上に合成され
た。通常のα−アミノ酸の群の各員は、X位置で下記の
ようにして結合された: 1.アミノ酸の混合物を 102mlのジメチルホルムアミド
(DMF)に溶解した。この混合物は下記から成る。 【0021】 BOC−L−アラニン 32 mg BOC−メトキシベンジル−L−システイン 100 mg BOC−ベンジル−L−アスパラギン酸 90 mg BOC−ベンジル−L−グルタミン酸 96 mg BOC−L−フェニルアラニン 61 mg BOC−L−グリシン 27 mg BOC−トシル−L−ヒスチジン 142 mg BOC−L−イソロイシン・1/2H2O 51 mg BOC−カルボベンゾキシ−L−リジン 124 mg BOC−L−ロイシン・H2O 55 mg BOC−L−メチオニン 54 mg BOC−L−アスパラギン 47 mg BOC−L−プロリン 42 mg BOC−L−グルタミン 53 mg BOC−トシル−L−アスパラギン・H2O 167 mg BOC−ベンジル−L−セリン 76 mg BOC−ベンジル−L−スレオニン 83 mg BOC−L−バリン 42 mg BOC−L−トリプトファン 78 mg BOC−ベンジル−L−チロシン 116 mg 2.1310mgの1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HO
BT)を34mlのDMFに溶解した溶液を作った。 【0022】3.N,N'−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド(DCC)1150mgを34mlのDMFに溶解した溶液
を作った。 4.使用前に、HOBTの溶液をアミノ酸の溶液に加
え、混合した。次いでDDCの溶液を加え混合した。次
いで、すでに固体支持体上にあるカタマーまたは結合分
子を、得られた混合物と反応させた。 【0023】個々のL−アミノ酸を、オーストラリア特
許明細書第25429/84号記載の方法に従ってD1 およびD
2 位置に結合させた。この結果、D1 およびD2 位置で
20の通常のアミノ酸のありうる組み合わせにあたる 400
種のカタマー標本が合成された。多数の8−カタマー標
本をモノクロナール抗体に対してELISAによって試
験をした。このモノクロナール抗体は、当該分野におい
て良く知られている技術を用いて、口蹄疫ビールス (F
MDV) A10亜型に対して製造された。 【0024】ELISA試験の実施においては、支持体
に支持されたペプチドを、1%オバルブミン/1%ウシ
血清アルブミン/0.1%トウィーン20のリン酸塩緩衝食
塩水(PBS)中におけるプリコート溶液中で25℃で1
時間保持して、抗体の非特定的吸収を塞いだ。次いで、
プリコート溶液中のモノクロナール抗体の適当な希釈物
中4℃で1夜保持した後に、0.05%トウィーン(Tween)
20/PBS中で3回洗浄した。 【0025】セイヨウワサビペルオキシダーゼに配合さ
れ、プリコート溶液で希釈されたヤギ抗マウスIgGと
25℃で1時間反応後にPBS/トウィーンで十分に洗浄
して過剰の配合体を除去した。抗体の存在は、新たに調
製した酵素基質溶液(o−フエニレンジアミン40mgおよ
びリン酸塩/クエン酸塩緩衝液pH5.0 100ml 中の“120v
ol."過酸化水素18μl )と45分間反応させ、次に450nm
で検出された発色によって検出した。 【0026】図1は、この抗体による8−カタマー標本
の試験結果を示す。図1において、20本の線から成る各
群は、ELISA試験において 450nmで測定した場合に
発現した色の吸光度の応答を単位で表わす。20本の線の
群における夫々の線は、各群の直下に一文字記号で示さ
れた共通のアミノ酸をD1 位置に有する。20本の線の各
群の夫々の線は、D2 位置で異なるアミノ酸を表わす−
これらは一文字記号のアルファベット順である。これら
の結果を表1にまとめた(表1および以下の記載を通し
て、アミノ酸の一文字記号が用いられる)。 【0027】 【表1】【0028】表1から、抗体が多数の8−カタマー標本
と強く反応することが明らかである。反応の強さの順
に、指示された位置(−D2 −D1 −) が−M−H−,
−M−K−,−K−K−,−K−H−,−Q−H−およ
び−H−H−である8−カタマー標本が含まれる。 【0029】更に2種類の多数の8−カタマー標本が合
成された。これらは下記の式を有する。 アセチル−NH−X−D3−M−K−X−X−X−X−
〔固体支持体〕 および アセチル−NH−X−X−M−K−D4−X−X−X−
〔固体支持体〕 ここでMはメチオニン残基を示し、Kはリジン残基を示
し、D3 およびD4 はこれら一連の合成のために新たに
指示された位置を示す。式中で用いられた他の用語は先
に用いられたとおりである。 【0030】これら8−カタマー標本を、口蹄疫ビール
ス(FMDV)A10に対するモノクロナール抗体に対し
て試験した。図2AおよびBは、図1に示した結果を得
るのに用いたモノクロナール抗体によるELISA試験
の結果を示す。図2Aは、下記一般式の8−カタマー標
本を表わす。 【0031】アセチル−NH−X−D3−M−K−X−
X−X−X−〔固体支持体〕 図2Bは下記一般式の8−カタマー標本を示す。 アセチル−NH−X−X−M−K−D4−X−X−X−
〔固体支持体〕 図2AおよびBの両方において、D3 またはD4 位置に
おけるアミノ酸を、450nm で測定したときの発色の吸光
度を表わす各線の下に示した。 【0032】この結果を表2にまとめた。抗体結合活性
を、1.1よりも大きな値を与えるすべての8−カタマー
標本について、指定されたアミノ酸対M−Kを含む8−
カタマー標本について示した。また、逆の対K−Mにつ
いて見出された値も示した。 【0033】 【表2】【0034】モノクロナール抗体と最も反応性に富む8
−カタマー標本は、指定された位置に下記の連鎖を有す
ることが明らかである。図2Aから、−H−M−K−,
−W−M−K−および−Q−M−K−。図2Bから、−
M−K−H−,−M−K−Q−および−M−K−W−。 【0035】M−Kで指示された対のいずれかの側にヒ
スチジンの加入によって、最大の抗体結合活性が得られ
た。しかしながら、アミノ末端側のヒスチジンは、トリ
プトファンよりも著しく良好なわけではなく、指定され
た連鎖W−M−K−Hを選定して更に評価した。個々の
好ましい延長とM−K対との組み合わせが最適であると
予想される指定された連鎖W−M−K−Hを用いて試験
を続行した場合の効果を試験した。 【0036】母体連鎖アセチル−NH−X−W−M−K
−H−X−X−X−SS 〔固体支持体〕にもとづくカタ
マー連鎖を合成し、四つの指定された位置の各々を19の
すべてのアミノ酸で一度に一つづつ置換した。このカタ
マー標本の組みの、モノクロナール抗体(MAb) との
結合活性の試験から、Q−M−R−Hが好ましい連鎖延
長であることが示された (得られたE 450 は;Ac X−
W−M−K−H−X−X−X−SS =0.69, Ac −X−
Q−M−K−H−X−X−X−SS =1.47, およびAc
−X−W−M−R−H−X−X−X−SS =1.11, 試験
バックグラウンド0.2であった)。 【0037】指定された連鎖M−K−Hのアミノ末端側
において、M−K対について決定されたように、トリプ
トファンよりもグルタミンが優れていることは、個々に
決定された最適性の相互依存性を示している。次に、下
記一般式の8−カタマー標本を合成した。 アセチル−NH−D5−Q−M−R−H−X−X−X−
〔固体支持体〕 および アセチル−NH−X−Q−M−R−H−D6−X−X−
〔固体支持体〕 最高の抗体結合活性を有する標本は、D5 =トリプトフ
ァンおよびD6 =セリンの場合であり、このことからW
−Q−M−R−H−Sが最適の連鎖であることが示唆さ
れる。この連鎖のいづれかの側にアミノ酸を更に指定す
ることによる抗体結合活性の著るしい改善は得られなか
った。 【0038】この連鎖のすべての単一アミノ酸置換体か
らなり、ヘキサペプチドとして合成したペプチドのセッ
トの評価から、W−Q−M−R−H−Sが最適のヘキサ
ペプチドに近いことが確認された。ペプチドのアルギニ
ンをグリシンで置換して連鎖W−Q−M−G−H−Sと
なした場合、いくらかの抗体結合活性の増加が示され
た。 【0039】関連するペプチドの決定された群の、試験
MAbに対する抗体結合反応の特異性を確認するため
に、ペプチドに対する試験MAbの滴定数を、マッコウ
クジラ・ミオグロビンまたはA型肝炎に対する試験MA
bのそれと比較した(表3)。抗体結合反応の特異性
は、これらペプチドの連鎖を決定するために用いた抗体
である試験MAbに関して明らかである。 【0040】 【表3】【0041】各MAbについての抗体滴定数はELIS
Aにより測定し、試験バックグラウンドの3倍の吸光を
生ずる腹水の相互希釈に相当する。数値は、希釈した夫
々の腹水と関係のないペプチドコントロール(Ac −G
−D−L−G−S−I−SsおよびAc −G−D−L−
Q−V−L−Ss ) との反応によって測定された非特異
的吸収に関して補正した。 【0042】試験したモノクロナール抗体は下記のとお
りであった:本書中に記載した試験MAbである抗−F
MDV,A10型 (全ビールスに対する滴定数1.3×1
06 );抗−A型肝炎,反応の位置は未知(A型肝炎ビ
ールスに対する滴定数106 ) ; および抗ミオグロビン
(マッコウクジラ), 反応位置は未知 (マッコウクジラ
・ミオグロビンに対する滴定数106 ) 。 参考例1 参考例1は、本発明をポリクロナール抗体に適用した場
合を述べる。 【0043】実施例1に記述したように、下記一般式を
有する多数の8−カタマーを更に合成した。 アセチル−NH−X−X−D2−D1−X−X−X−X−
〔固体支持体〕 これらカタマーを、合成ペプチドC−G−D−L−G−
S−I−A−Kに対して得られた抗体に対して試験し
た。この合成ペプチドは、メリフィールド(Merrifield)
の固相ペプチド合成の通常の技術を用いて合成した。こ
のペプチドをシステイン部分のスルフヒドリル基を経て
キーホール・リンペット・ヘモシアニンと結合させた。
この結合したペプチドをフロインドの不完全アジュバン
トで製剤化し、ウサギに筋肉内注射した。注射後40日を
経てウサギの血液から抗血清を得た。 【0044】多数の8−カタマー標本の、抗体によるE
LISA試験の結果を図1と同様な方法で図3に示し
た。図3から、E(グルタミン酸)をD1 位置に有する
すべての8−カタマー標本は、抗体と顕著に反応するこ
とが明らかである。抗体と顕著に反応する他の組み合わ
せには、減少する順に、−D−I−,−G−D−,−I
−G−および−D−V−が含まれる。 【0045】上記実施例1で述べたようにして、下記の
式を有する多数の8−カタマー標本を更に合成した。 アセチル−NH−X−D3−D−I−X−X−X−X−
〔固体支持体〕 および アセチル−NH−X−X−D−I−D4−X−X−X−
〔固体支持体〕 ここでDはアスパラギン酸であり、Iはイソロイシンで
ある。 【0046】抗体との試験結果を、図2におけると同様
な方法で図4に示した。図4Aは下記一般式の8−カタ
マー標本を示し、 アセチル−NH−X−D3−D−I−X−X−X−X−
〔固体支持体〕 図4Bは下記一般式の8−カタマー標本を示す。 アセチル−NH−X−X−D−I−D4−X−X−X−
〔固体支持体〕 図4から抗体と反応する8−カタマー標本は、指定され
た位置に下記の連鎖を含むことを示す。 【0047】−G−D−I−,−A−D−I−,−P−
D−I−,−D−I−D−,−D−I−M−および−D
−I−T−。図4AとBとの比較から、−D−I−対の
直前の位置は−D−I−対の直後の位置よりもはるかに
少ない範囲のアミノ酸が許されることが明白である。下
記母体連鎖にもとづき、カタマー標本における四つの指
定された位置が夫々一度に一つづつ、すべて19の他のア
ミノ酸で置換された8−カタマー標本を合成した。 【0048】アセチル−NH−X−X−G−D−I−D
−X−X−〔固体支持体〕 この標本の組みの、試験抗体との結合活性についての試
験は、この抗体との反応能力を保持するためにはグリシ
ン残基はアラニンによってのみ置換されること;アミノ
末端アスパラギン酸は他のアミノ酸で置換できないこ
と;イソロイシンはバリン,ロイシンまたはスレオニン
または結合活性は減少するが約10の他のアミノ酸で置換
できること;およびカルボキシル末端アスパラギン酸は
事実上いづれのアミノ酸によっても置換でき、この位置
におけるセリンは最も強い結合を与えることを示してい
る。また試験結果は、指定された連鎖G−D−I−Sが
鎖延長に好ましいことを示している。 【0049】上記のような指定連鎖の延長は、アミノ末
端へのトリプトファンおよびカルボキシル末端へのヒス
チジンの加入が好ましいことを示している。しかしなが
ら、いづれの鎖延長も抗体結合活性においては顕著な増
加を示さなかった。好ましい指定された連鎖W−G−D
−I−S−Hを更に延長することは、更に連鎖を延長す
ることにほとんど利点がないことを示した。 【0050】この特定の抗体に対して決定されたミモト
ープ、すなわちW−G−D−I−S−Hは、抗体を導入
するために使用したペプチド、すなわちC−G−D−L
−G−S−I−A−Kに対して一時的な類似性を有する
のみであることに注目すべきである。しかしながら、免
疫学的連鎖G−D−L−G−S−Iにもとづく置換ネッ
トにおける抗体の試験では、導入連鎖G−D−L−G−
S−Iよりも連鎖G−D−L−G−D−Iが著るしく好
ましいことを示した (E450 値は夫々0.16および0.45)
。 【0051】決定されたミモトープと抗体に結合してい
るペプチドとの間には類似性がある。このことは本発明
の方法を広範囲に適用できる強力な証拠である。 参考例2 この参考例2は多数のカタマー標本の鎖長を8−カタマ
ーよりも短くすることができることを示す。 【0052】下記一般式を有する4−カタマー標本を合
成した。 アセチル−NH−X−D2−D1−X−〔固体支持体〕 ここで略記号は実施例1で用いたものと同様であり、合
成方法も実施例1で用いた方法と同一である。この4−
カタマーを当該分野において良く知られている技術を用
いてマッコウクジラ・ミオグロビンに対して生じたモノ
クロナール抗体に対して試験した。 【0053】この抗体による多数の4−カタマー標本の
ELISA試験の結果を、図1と同様な方法で図5に示
す。図5から、下記の一般式を有するカタマー標本のみ
が アセチル−NH−X−L−A−X−〔固体支持体〕 モノクロナール抗体と反応できることが明らかである。 【0054】前記実施例1に述べたようにして、更に下
記一般式を有する多数の4−カタマー標本を合成した。 アセチル−NH−D3−L−A−X−〔固体支持体〕 および アセチル−NH−X−L−A−D4−〔固体支持体〕 表4にモノクロナール抗体によるELISA系において
試験をした最も活性なカタマー標本をまとめた。 【0055】 【表4】 【0056】下記母体連鎖に基づくカタマー標本を合成
して、参考例1に述べたような置換ネットを形成した。 アセチル−NH−P−L−A−Q−〔固体支持体〕 これらのペプチドのモノクロナール抗体によるELIS
A試験の結果を図6に示す。図6における20個の線の各
群は、母体レスポンス(E450 =2.62, バックグラウン
ド0.25) の平均に対して比較したレスポンス%を表わ
す。図6中の20個の線の群の各員は、他のアミノ酸によ
って置換された、下に示したアミノ酸を有する。線の順
序はアミノ酸の一文字記号のアルファベット順である。 【0057】20個の線の各群における太い線は、母体連
鎖P−L−A−Qを示す。図6から、カタマー標本が母
体連鎖の少なくとも半分の活性を以てこのモノクロナー
ル抗体と結合しうるには、プロリンはバリン,イソロイ
シン,ロイシン,アラニンまたはセリンで置換できるこ
と;ロイシンはフエニルアラニンのみで置換できるこ
と;アラニンは事実上他のいづれのアミノ酸によっても
置換できること;およびグルタミン残基はアスパラギン
によってのみしか置換可能でないことが明らかである。 【0058】マッコウクジラ・ミオグロビン連鎖のすべ
ての重複する4−カタマーのセットを、実施例1におい
て指定された位置について述べた方法を用いて合成し
た。これらのカタマーをELISA試験によりモノクロ
ナール抗体と反応させた。結果を図7に示す。各線はE
LISA試験において450nm で読んだ発色を示す。各線
に付した番号は、特定のカタマーのアミノ末端における
残基がマッコウクジラ・ミオグロビン連鎖におけると同
一番号を有するように付けた。 【0059】図7から、モノクロナール抗体と反応する
唯一の4−カタマーは、マッコウクジラ連鎖の88〜91残
基から成ることが明白である。この連鎖はP−L−A−
Qである。明らかに、モノクロナール抗体はマッコウク
ジラ・ミオグロビン上のこの特定の決定基を認識してい
る。下記一般式を有する一連の5−カタマーを合成して
指定された連鎖に対する最上の鎖延長を決定した。 【0060】アセチル−NH−D5−P−L−A−Q−
〔固体支持体〕 および アセチル−NH−P−L−A−Q−D6 −〔固体支持
体〕 最上の結合性標本は、 アセチル−NH−K−P−L−A−Q−〔固体支持体〕 アセチル−NH−P−L−A−Q−Y−〔固体支持体〕 であった。 【0061】連鎖K−P−L−A−Qは残基87〜91にお
けるマッコウクジラ・ミオグロビンの連鎖と相同である
ことに注目すべきである。更に、この参考例は本発明技
術の適用可能性を示している。 【0062】 【発明の効果】口蹄疫ビールスA10型抗原エピトープま
たはその分子トポロジー的同等物であるアミノ酸連鎖お
よびそれらの免疫学的に活性な同等物が提供される。こ
れらを用いて口蹄疫の診断および治療に有用な試薬をデ
ザインできる。
【図面の簡単な説明】
【図1】FMDV A10に対するモノクローナル抗体と
8−カタマーとの反応のELISA試験結果を示す。 【図2】A、B共にFMDV A10に対するモノクロー
ナル抗体と8−カタマーとの反応のELISA試験結果
を示す。 【図3】合成ペプチドC−G−D−L−G−S−I−A
−Kに対する抗体と8−カタマーとの反応のELISA
試験結果を示す。 【図4】A、B共に合成ペプチドC−G−D−L−G−
S−I−A−Kに対する抗体と8−カタマーとの反応の
ELISA試験結果を示す。 【図5】マッコウクジラ・ミオグロビンに対するモノク
ローナル抗体と4−カタマーとの反応のELISA試験
結果を示す。 【図6】マッコウクジラ・ミオグロビンに対するモノク
ローナル抗体と4−カタマーとの反応のELISA試験
結果を示す。 【図7】マッコウクジラ・ミオグロビンに対するモノク
ローナル抗体と、マッコウクジラ・ミオグロビン連鎖に
由来するすべての4−カタマーとの反応のELISA試
験結果を示す。
8−カタマーとの反応のELISA試験結果を示す。 【図2】A、B共にFMDV A10に対するモノクロー
ナル抗体と8−カタマーとの反応のELISA試験結果
を示す。 【図3】合成ペプチドC−G−D−L−G−S−I−A
−Kに対する抗体と8−カタマーとの反応のELISA
試験結果を示す。 【図4】A、B共に合成ペプチドC−G−D−L−G−
S−I−A−Kに対する抗体と8−カタマーとの反応の
ELISA試験結果を示す。 【図5】マッコウクジラ・ミオグロビンに対するモノク
ローナル抗体と4−カタマーとの反応のELISA試験
結果を示す。 【図6】マッコウクジラ・ミオグロビンに対するモノク
ローナル抗体と4−カタマーとの反応のELISA試験
結果を示す。 【図7】マッコウクジラ・ミオグロビンに対するモノク
ローナル抗体と、マッコウクジラ・ミオグロビン連鎖に
由来するすべての4−カタマーとの反応のELISA試
験結果を示す。
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フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名)
C07K 14/09
C07K 7/06
BIOSIS(DIALOG)
CA(STN)
CAOLD(STN)
REGISTRY(STN)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.下記式を有するぺプチドの混合物からなる口蹄疫ビ
ールスの抗原活性を有する組成物。 Y−X−X−D2−D1−X−X−X−X−(固体支持体) (ここで、D1およびD2の各々は所定のアミノ酸を示
し、Xはいずれかのアミノ酸を示し、かつYは末端基を
示す) 2.前記末端基がH又はアセチルである請求項1記載の
口蹄疫ビールスの抗原活性を有する組成物。 3.前記いずれかのアミノ酸が20個の通常のL−α−
アミノ酸のいずれかである請求項1又は2記載の口蹄疫
ビールスの抗原活性を有する組成物。
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