JPH03284696A - ペプチドおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明はペプチドおよびその用途に間する。 本発明によって提供されるペプチドは、非Ａ非Ｂ型肝炎
関連抗原（以下、これをＨＣＶ抗原と略称する）に対し
て特異性を有する抗体（以下、これを抗ＨＣＶ抗体と略
称する）と高度に特異的に結合する能力を有することか
ら、抗ＨＣＶ抗体の測定に利用できる。 本発明によって提供される抗ＨＣＶ抗体の測定試薬は、
血清または血漿中の抗ＨＣ％′抗体を高感度で横比する
能力を有しており、抗ＨＣＶ抗体の測定に有用である。 ［従来の技＃ｉ］ 肝疾患の大部分を占めるウィルス性肝炎の病因ウィルス
としては現在５種類が知られており、それぞれＡ型、Ｂ
型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎ウィルスと呼ばれている。ウ
ィルス性肝炎のなかでも＾型肝炎およびＥ型肝炎は経口
感染であり、一過性感染のみで慢性化することはないが
、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎は輸血によって感染し、さら
に持続感染により慢性化し、高い確率で肝硬変または肝
癌に移行するため、大きな問題となっている。＾型肝炙
、Ｂ型肝炎およびＤｆｆｌ肝炎についてはそれらのＪＩ
ｉ囚ウィルスが見い出され、現在では免疫学的な診断が
可能となっている。Ｅｆｆｌ肝炎ウィルスについても最
近遺伝子がＪｌｌｍｌされたとの報告がある。輸血後非
Ａ非Ｂ型肝炎（以下、二わをＰＴＮＡＮＢ）Ｉと略称す
る）の病因ウィルスについては多くの研究者による研究
にもかかわらず長い閏不明であったが、１９８８年りこ
アメリカのカイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ）の研究グループによって、ＰＴＮＡＮＢ）Ｉ
に感染させたチンパンジーの血禁からＰＴＮＡＮＢＨウ
ィルスの遺伝子の単離、同定がなさね［サイエンス（５
ｃｉｅｎｃｅ）、第２４４１！、第３５９頁（１９８８
年）およびサイエンス、第２４４巻、第３６２頁（１９
８８年）参照コ、Ｃ型肝炎ウィルス（以下、これをＨＣ
Ｎと略称する）と命名された。その遺伝子の塩基配列と
推定されるものの一部はすでに明らかにされており［ヨ
ーロッパ特許第０３１８２１６号明細書参照コ、抗）Ｉ
ＣＶ抗体の検出ができるようになり、）Ｉｃｓ’惑″？
、についての血清学的診断が可能となフている。 また、本発明者らの１人を含む数人によってＰＴＮＡ）
ＩＢ）ｌの原因となるウィルスの遺伝子と推定されるリ
ボ核酸がＰＴＮＡＮＢＨ！！！、者の血清から単離され
、同定されたことが報告されている［ガストロエンテロ
ロシア・ジャポニカ（Ｇａ５ｔｒｏｅｎｔ、ｅｒｏｌｏ
ｇｉａＪａｐｏｎｉｃａ）、　第２４省、　第５号、　
第５４０頁　（１９８９年）二カスドロエンテロロシア
・ジャ、？テーカ、第２４＠、第５号、第５４５頁（１
９８９年）および内科、　第６４巻、第６号、　第１０
２２頁（１９８９年）参Ｆｉ、げ］。 これまてｃＤＮＡライブラリーからの必要なｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａのスクリーニングの手段として、入ファージを利用
した抗原抗体反応二二よって抗Ｈい抗体の陽性または陰
性の判定を行う二とが一般的：こ行われてきたが、上記
のイムノスクリーニング法は定量性がなく、大腸菌の発
現産物中の非特異な抗原成分との反応が起こる場合があ
り、現在、Ｈいの遺伝子をクローニングし、ファージに
組み込んで酵母を宿主として発現させた抗原蛋白を用い
て行うｗｌ素免疫測定法による抗）ＩＣ−゛抗体の検査
薬の開発が検討されている［内科、第６４巻、第６号、
第１０２７頁（１９８９年）参照コ。さらに、ウィルス
またはその抗原成分によって感作されたゼラチン粒子が
抗ウイルス抗体存在下で凝集する性質を利用し・た粒子
凝集法または酵素免疫測定をウィルスまたはその抗原成
分をコーティングしたビーズを用いて行うビーズ法の開
発が進められている。 ［発明が解決しようとするｒｉ題］ ＨＣ〜′関連抗原を利用したこれまでの酵素免疫Ｉ１１
定法では、測定対象が臨床的にＰＴＮＡＮＢＨと診断さ
れた場合においても、抗ＨＣ〜′抗体陽性率は約７５％
であり、ＰＴＮＡＮＢＨの約２５％が抗）ＩＣｖ抗体陰
性と判定される。またＨＣ〜″の遺伝子をクローニング
し・、ファージに組み込んで酵母を宿主として発現させ
た抗原蛋白は非特異な種々の抗原成分を含有し７ている
ことから、その抗原蛋白を試薬とし・て用いて抗ＨＣ’
＋’抗体の測定を行う場合には、その試薬が試料中の抗
ＨＣＸ抗体以外の他の非特異な抗体成分をも認識するこ
とになり、測定結果は必ずしも抗ＨＣ〜抗体の存在を正
確に表しているとは隈らないことになる。このようにＨ
Ｃ〜関連抗原を利用したこれまでの酵素免疫測定法によ
れば、抗ＨＣ￥抗体の存在を正確に知ることかてぎない
のが現状である。 しかして、本発明の１つの目的は抗ＨＣＶ抗体と詩興的
に結合する能力を有するペプチドを提供することにある
。本発明の使の】つの目的は抗ＨＣ〜抗体の測定試薬を
提供することＬ′：、ある。 ［課題な解決するための手段］ 本発明者らは、ＰＴＮＡｈＢｌ１間達遺伝子にコートさ
れるポリペプチドから選択されたペプチド断片の中から
、非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原二こ対する特異性４有する抗
体と特異的：こ結合する能力を有する特定のペプチドを
見い出し・、本発明を完成する二二至りた。 本発明によれば、上記の目的は、 ０式 ％式％ で示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその断
片からなり、かつ該断片が −Ｌｙｓ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−

【遺伝子
配列があります】であって、非電非Ｂ型肝炎関連抗原に
対して特異性を有する抗示されるアミノ酸配列を有する
ペプチド、およびび ■上記のペプチドからなる抗ＨＣＶ抗体の測定試薬を提
供することによって達成される。 本明細書においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述
する。 Ａｌａ：　　Ｌ−アラニン残基 Ａｒｇ：　　Ｌ−アルギニン残基 Ａｓｎ：　　Ｌ−アスパラギン残基 Ａｓｐ：　　Ｌ−アスパラギン酸残基 Ｃｙｓ：　　Ｌ−システィン残基 Ｇｌｎ：　　Ｌ−グルタミン残基 ＧＩＩＪ二　Ｌ−グルタミン酸残基 Ｇｌｙ：　　グリシン残基 ）１ｉｓ：　　Ｌ−ヒスチジン残基 ｅ：Ｌ−イソロイシン残基 Ｌｅｕ：　　Ｌ−ロイシン残基 Ｌｙｓ：Ｌ−リシン残基 Ｍｅｔ：　　Ｌ−メチオニン残基 Ｐｈｅ：　　Ｌ−フェニルアラニン残基Ｐｒｏ：　　Ｌ
−プロリン残基 Ｓｅｒ：　　Ｌ−セリン残基 Ｔｈｒ：　　Ｌ−）レオニン残基 Ｔｒｐ：　　Ｌ−）リブトファン残基 Ｔｙｒ：　　Ｌ−チロシン残基 Ｖａｌ：　　Ｌ−バリン残基 また本明細書においては、常法に従ってアミノ酸配列を
Ｎ末端のアミノ酸残基が左側に位置し・、Ｃ末端のアミ
ノ酸残基が右側に位置するように記述する。 本発明のペプチドの合成は、ペプチドの合成において通
常用いられる方法、例えば、固相合成法または段階的伸
長法、フラグメント縮合法のような渣相合成法により行
われるが、固相合成法により行うのが操作上簡便である
［例えば、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサエティ　　（，１ｏｕｒｎａｌ　　　ｏｆ　　
　ｔｈｅ　　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　　Ｃｈｅｗ＋１ｃ
ａｌ　　　５ｏｃｉｅｔｙ）第８５巻、第２１４９〜２
１５４頁（１９６３年）；　日本生化学会編「生化学実
験講座１タンパク質の化学■化学修飾とペプチド合成」
　（昭和５２年１１月１５日株式会社東京化学同人発行
）、第２０７〜４９５頁；　日本生化学会編「続生化学
実験講座２　タンパク質の化学（下）」（昭和６２年５
月２０日　株式会社東京化学同人発行）、第６４１〜６
９４頁なと参照コ。 本発明のペプチドの固相合成法による製造は、例えば、
スチレンージビニルヘンゼン共重合体なとの反応溶媒二
二不溶性である重合体に、目的とするペプチドのＣ末端
に対応するアミノ酸またはそのアミドをそれらが有する
α−ＣＯＯＨ基またはα−ＣＯＮ８２基からそれぞれ水
素原子を除いて得られるα−Ｃ０〇−基またはα−ＣＯ
ＮＨ−基を介して結合させ、次いて該アミノ酸またはそ
のアミドに目的とするペプチドのＮ末端の方向に向って
、対応するアミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸ま
たはペプチド断片が有するα−ＣＯＯＨ基以外のα−ア
ミノ基なとの官能基を保護したうえて縮合させて結合さ
せる操作と、該結合したアミノ酸またはペプチド断片に
おけるα−アミノ基なとのペプチド結合を形成するアミ
ノ基が有する保護基を除去する操作を１８次繰返すこと
によって、ペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチド
に対応するペプチド鎖を形成し、次いて該ペプチド鎖を
重合体から脱離させ、かつ保護されている官能基から保
護基を除去することにより目的とするペプチドを得、次
いてこれを精製することによって実施される。二こで、
ペプチド鎖の重合体からの脱離および保護基の除去は、
フッ化水素を用いて同時に行うのが副反応を抑制する歓
点から好ましい。また、得られたペプチドのｅｌｌ！は
逆相液体クロマトグラフィーで行うのが効果的である。 本発明のペプチドは特異的に抗ＩＣ〜′抗体を結合する
能力を有するので、ＨＣ＼′感染により出現する抗ＨＣ
〜′抗体の検出のための測定試薬とし・て有効である。 なかでも式 ％式％ で示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその断
片からなり、かつ該断片が −Ｌｙｓ−Ａｒｚ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−のアミノ
ｗ１．配列を有するペプチドは抗ＨＣＶ抗体に対して特
に高い感度と特異性を有するので、抗ＢＣＶ抗体測定試
薬としてより有効である。 本発明のペプチドを利用した抗ＨＣＶ抗体の測定は、蛍
光免疫測定法、受身血球凝集法、ｔ！！ＬＨ免疫測定法
、酵素免疫測定法のいずれかを利用することによって行
われる。これらの方法はいずれも公知であるが、例えば
酵素免疫測定法を利用する場合について以下に説明する
。 創建系全体の構成要素は担体、測定＃１′薬としての本
発明のペプチド、ブロッキング剤、被検試料、標識用抗
体、酵素および基質からなる。担体に本発明のペプチド
をコーティングし、次いでペプチドコーティング担体に
ブロッキング剤を作用させて担体上の非特異的な蛋白結
合部位をブロックし、ペプチドコーティング担体に被検
試料を加えてインキュベートし、続いて酵素標識抗体を
接触させティンキュベートし、次にこのように処理した
担体に基質を加えてインキュベートし、基質の分解量を
吸光度計を用いて測定する。なお、コーティングに用い
られる本発明のペプチドは１種類でも２種類以上でもよ
い。担体としてはエンザイムイムノアッセイ用カップ、
またはガラスもしくはｓｆｉ！製のビーズを用いるのが
好ましい。測定に先立ち、本発明のペプチドを０．０１
Ｍ炭酸緩衝液に熔解し、その溶液を例えばポリスチレン
製エンザイムイムノアッセイ用カップに加えたのち、４
℃で一夜または室温で３時間静置することにより、担体
表面は本発明のペプチドによってコートされる。担体上
の非特異的な蛋白結合部位をブロックするためのブロッ
キング剤としては例えば、牛血清アルブミン、　カゼイ
ン、脱脂粉乳、　抗ヒト１．Ｇ抗体または抗ヒトＩｇ？
！抗体を得るための免疫原動物の血清、ゼラチンなどが
用いられる。標識用抗体としては例えば、抗ヒト１．Ｇ
抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体などが用いられる。また酵素と
しては例えば、　アルカリフォスファターゼ、グルコー
スオキシダーゼ７　ペルオキシダーゼ、ベータガラクト
シダーゼなどが挙げられる。Ｉｌ！ｌ定に先立ち、　ゲ
ルタールアルデヒドなどの２ｍ以上の官能基を有する化
合物を用いて、＊＊ＪＩｌ抗体に酵素を結合せしめてコ
ンジュゲートとし、測定系全体の構成要素の一部として
予め準備しておくことが好ましい。基質は選択した酵素
に応じて適宜使用すればよい９例えば、酵素としてペル
オキシダーゼを選択した場合にはＯ−フェニレンジアミ
ンなどを使用することが好ましい。 ［実施例］ 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらの実施例により限定されるものではない。 実施例１ 式 ％式％ で示されるペプチドをペプチド自動合成装置［米国アプ
ライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｊｅｄＢｉ　ｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）社製、モデル４３］Ａ　（１ｌｏｄｅｌ
　４３１Ａ）コを用いて固相合成法により合成した。 すなわち、４−［ｈ“０−　（ｔ−ブトキシカルボニル
）−Ｎ’　−（２−クロロベンジルオキシカルボニル）
−１，、−リジンーフェニルアセトメチルコ基 Ｈ （ＣＩ！２）　。 を０．６５ミリモル／ｇ（樹脂）の割合で有するスチレ
ンーシヒニルベンゼン共重合体［スチレンとジビニルベ
ンゼンの構成モル比コ９９対］コからなる粒状樹脂［米
国アプライド・バイオシステムズ社製、　　ＰＡＭ　　
　　リ　ジ　ン　（Ｌｙｓｉｎｅ）　　、ｔ−Ｂｏｃ−
Ｌ−Ｌｙｓ　（ＣＩ−Ｚ）　］を７６０＋１用い、　こ
れに第１表に示す一連の操作に従って目的とするペブチ
ドのＮ末端の方向に向って対応するＬ−アルギニン、Ｌ
−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン
、　Ｌ−グルタミン酸、　Ｌ−リジン、　Ｌ−セリン、
　Ｌ−）レオニンを順次結合させた。縮合反応において
、上記のアミノ酸はそれぞれＮ”　−（ｔ−ブトキシカ
ルボニル）−ＮＹ　−（メシチレン−２−スルフォニル
）−Ｌ−アルギニン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボ
ニル）−Ｌ−アスパラギン、ト（ｔ−ブトキシカルボニ
ル）Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエステル、Ｎ−
（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン無水物、
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）　−Ｌ−グルタミン酸
−γ−ベンジルエステル、Ｎｏ−（ｔ−ブトキシカルボ
ニル）−Ｎ’　−（２−クロロベンジルオキシカルボニ
ル）　−Ｌ−リジン無水物、ト（ｔ−ブトキシカルボニ
ル）−〇−ベンジルーし一セリン無水物、Ｎ−（ｔ−ブ
トキシカルボニル）−〇−ベンジルーＬ−）レオニン無
水物として用い、それらの使用量は基質に対して約４倍
モル量とした。縮合反応は室温下で行った。アミノ酸１
残基を縮合させる反応時間は１０５分間であった。 全てのアミノ酸についての反応操作が終了したのち、得
られた樹脂をグラスフィルター上でジクロロメタンおよ
びメタノールを用いて順次洗浄し、次いで真空乾燥する
ことによって２．５８．の乾＃！樹脂を得た０次に、ポ
リトリプルオロモノクロロエチレン製の反応容器（株式
会社ペプチド研究所製、ＨＦ−反応装置ＩＩ型）中で、
得られた乾＊Ｉｌｌ脂０．７ｇをアニソール１．０５ｍ
１およびエチルメチルスルフィド０．１７５＋１と混合
し、この混合物に一２０℃の温度でフン化水素７．０ｍ
ｌを加え、同温度で３０分間１次いで０℃の温度で３０
分間攪斗した。得られた反応混合物からフン化水素、ア
ニソールおよびエチルメチルスフイドを減圧下ｌこ除去
し、残留物をグラスフィルター上でジエチルエーテルお
よびジクロロメタンを用いて充分洗浄した。得られたそ
の残留物を２規定の酢酸水溶液で抽出し、抽出液を凍結
乾燥することによりペプチドの粗製物を２００Ｂ得た。 得られた粗製物を分取用逆相高速液体クロマトグラフィ
ー［カラム：　オクタデシル化シリカゲル（粒径：　　
１５μｍ）充填カラム（内径：　　５０ｍｍ、長さ：　
３００＋ｙ＋ｉ）、　日本ウォーターズ社製、μ　ＢＯ
ＮＤＡＳＰＨＥＲＥ　　１５μＣ１８−１００人；　移
動相：　トリフルオロ酢酸を０．０５容量％含有するア
セトニトリルと水との混合溶媒（アセトニトリルの濃度
は３０分間で１０容量％から２０容量％になるように漸
次変化させた）；　流速：　　５ｍｌ／分；　検出法：
　波長２１０ｎｍにおける吸光度コで！！することによ
って、　目的とするペプチドのＷＩＩ！物を８０ｔｒｇ
得た。得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグ
ラフィー［カラム：　オクタデシル化シリカゲル（粒径
：５μｍ）充填カラム（内径：４Ｍ、長さ：　　１５０
ｍｍ）、東ソー株式会社製、ＴＳＫ−ｇｅｌ　０ＤＳ−
８０Ｔ！’Ｉ；　　移動相ニトリフルオロ！！酸を０．
０５容量％含有するアセトニトリルと水との混合溶媒（
アセトニトリルの濃度は３０分間で５容量％から５０容
量％になるように漸次変化させた）；　流速：　　１ｍ
ｌ／分；　検出法：　波長２］Ｏｎｎにおける吸光度］
に付したところ、１５．０分に単一の鋭いピークが示さ
れた。高速原子ｌｌｌ１法（以下、これをＦＡＢ法と略
称する）マススペクトルにより求められた精製物の分子
量は３１８８であった（３！ｌ！論値：　３１８７．５
３）。 第１表 １ｔ−ブトキシ　トリフルオロ酢酸 カルオ；ニル 基の除去 ０ ２洗浄 ジクロロメタン ピロリドン溶液 ４洗摩 Ｎ−メチルピロリドン ジイソプロビルエチルアミン ６　　ｉ５’ｃ摩 Ｎ−メチルピロリトン ク ピロリドン溶液 ８洗浄 ジクロロメタン 以下余白 実施例２ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式８式％ で示されるペプチドを得た。得られたペプチドを分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同し）に付し
・たところ、１４゜２分に単一の鋭いビークが示された
。　　ＦＡＢ法マススペクトルにより求められたペプチ
ドの分子量は１２４３てあった（理論値：　１２４３．
３３）。 実施例３ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび＠製を行うことにより、式８式％ て示されるペプチドを得た。得られたペプチドな分析用
逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ〉に付し
たところ、２４．６分に単一の鋭いビークが示された。 　　ＦＡＢ法マススペクトルにより求められたペプチド
の分子量は４０３１てあった（理論値：　４０３１．３
Ｂ）。 参考例１ 実施例１におけると同様な方法てペプチドの固相合成お
よＶｇ製を行う二と乙こより、式８式％ て示されるアミノ酸配列を有し！ない式トＬｙｓ−Ａｓ
ｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｒｇ
−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ＯＨで示されるペプチドを
得た。得られたペプチドを分析用逆相高速液体クロマト
クラフィー（前記と同し）に付し・たところ、１１．９
分ζこ単一の鋭いビークが示された。ＦＡＢ法マススペ
クトルにより求められたペプチドの分子量は１２９０て
あった（理論値：　１２９０．３９）。 参考例２ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行う二とにより、式８式％ で示されるアミノ酸配列を有し・ない式）１−Ａｒｇ−
５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｚ−５
ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇ１１」川−ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨで示されるノ＼ブチトを得た。得ら
れたペプチドを分析用逆相高速液体クロマトグラフィー
（前記と同し）に付し・たところ、１３．６分に単一の
鋭いビークが示された６ＦＡＢ法マススペクトルとこよ
り求めらＪまたペプチドの分子量は１９１５であった（
理論値１９１５．１６）。 参考例３ 被Ｊ−試−村 ＧＰＴ＞　２００１Ｌに　　ＨＢｓｌｌｇ（−）血清　
：６５検体正常ヒト血清　　　　　　　　：１０検体ｍ
艶二一二】９巨≧〜二５３λ、−影乞；辷１す□二ズＥ
４−リー□ぞざ）−一」牛チ（、ＪＥ各血清検体ζこつ
いて、下記の酵素免疫測定法により抗）ＩＣ〜□抗体の
有無を検定し・た。 すなわち、本発明渚らの１人を含む数人によって単離さ
ねたりボ核酸からクローン化された＃８クローン、＃１
４クローンおよび＃１８クローンを持つファージ入εｔ
　ｌ　ｌを含む溶液１００μｍに大腸菌Ｖ６Ｏ１３株（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　１’１０９０）を
支持菌として混合したのち、３７℃で１５分間インキコ
ｌ＼−ジョンし、ファージを大Ｈ菌に悪染させた。続い
て、５０μｇ／ｍ　ｌのアンビンリンを含む寒天培地；
こ上記の混合液を植菌し、　４３℃で３時間培養し・た
。　次二こ、１０ｍＨのｌ　ＰＴＧ水溶液に２時間浸漬
したのち風乾し・で得られた二トルセルロース膜を、上
記の寒天培地上に載せ、３７゛Ｃて３時間インキユヘー
し！ヨンした。 こうし１て得られたニトロセルロース膜を１５０ｍＭＮ
ａＣｌを含むｌ０ｍＭ１−リス塩Ｈ（ｐＨ７，５）　　
（↓）下、これをＴＳ　Ｂｕｆｆｅｒと略称する）で３
回洗浄し、ン欠いて５００ｍＭＮａＣｌおよび３％セラ
テンを含む２０ｍＭ　）リス塩酸（ｐＨ７，５）中で室
温で一贈１Ｌで膝上の非特罪的な蛋白結合部岱をフロッ
クした。続いて、ＴＳ　Ｂｕｆｆｅｒ中で２分間振盪し
・で膜を洗浄り、た。　内情検体を１％セラチンを含む
ＴＳ　Ｂｕｆｆｅｒて希駅して得られた溶液中に、上記
でｊ昇られたニトロセルロス膜を漫潰し、室温で３時間
採りした、こうして得られたニトロセルロース膜を０．
０５％　Ｔ−・

【び：ｎ２０を含むＴＳ　Ｂｕｆｆｅｒ
　（以下、これをＴＳ−Ｔ　Ｂｕｆｆｅｒと略称する）
中で室温で５分間１［１、二の操作を５）回繰り返した
。続いて、ヤギ抗ヒト１ｇＧ抗体−ベルオキシダーゼコ
ンジュゲート（１％ゼラチンを含むＴ　Ｓ　Ｂ　ＩＪ　
ｆ　ｆ　ｅ　ｒで至適濃度に希釈し・たもの）中にニト
ロセルロース膜を浸漬し、室温で１．５時間振盪した。 こうして得られたニトロセルロース膜をＴＳ−ＴＢｕｆ
ｆｅｒ中で室温で５分間振盪し、二の操作を５回縁り返
した。 ７欠に、０．０５％ＩＩＲＰ−ｃｏｌｏｒ　（バイオラ
ット社！！＞、０．０５％Ｈ２Ｏ２，１７％メタノール
を含むＴＳ　Ｂｕｆｆｅｅｒてニトロセルロース膜をｍ
Ｗし、発色反応を行ったのち、蒸留水中で室温で５分間
振盪し・、この操作を５回縁り返した。ｍ１後、発色の
有無により、用いた血清中の抗ＨＣ−′抗体の有無を検
定した。 １浬 検定結果を第２表に示す。その結果より被検試料である
ＧＰＴ＞　２００１ＬＩ：　　ＨＢｓ）Ｉｇ（−）血清
６５検体は３群ごこ分類できることが判った。すなわち
、＃１４クローンおよＵ＃１８クローンの２つにおいて
陽性と判定された群Ａ、＃８クローン、＃１４クローン
および＃１８クローンの３つにおいて陽性と判定された
群Ｂならひに＃８クローン、＃Ｉ４クローンおよび＃１
８クローンのいずれミニおいても陰性と判定された群Ｃ
の３群である。 第２表 以下余白 実施例４ （上−翼］」 ＧＰＴ　＞　２００１ＬＩ：　　ＨＢｓＡｇ（−）血清
Ａコ　　３０検体ＧＰＴ　　＞２００１１Ｊ：　　ＨＢ
ｓＡｇ（−）血清Ｂ：　　１５検体ＧＰ丁　＞２００１
す；　　ＨＢｓＡｇ（−）血清Ｃ：　　　２０検体正常
ヒト面清　　　　　　　Ｄ：　　　１０検体ｔ　　　　
　　　　　：こ 各血清検体ミニついて、下記の酵素免疫測定法ミニより
吸光度を測定し、抗Ｈ已″抗体の有無を検定した。 すなわち、抗原物質とし・て実施例１、実施例２、実施
例３、参考例１および参考例２て得られたペプチドをそ
れぞれ０　、０１　Ｍ炭酸緩市？ａ（ｐ）１９．５）に
溶解し、得られたペプチド溶液をボリスチしン製エンサ
′イムイムノアッセイ用カップ（グイナテック社製）に
各１００ｕ１つつ加えたのち、４℃で１２２時間静置る
ことにより、ベブチｌ’　＋こよるコーチインクを行っ
た。次いて、それらのカップを０．０５容量％Ｔ−・ｅ
ｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（以下
、二）′１をＰＢＳと略称する）で３回洗浄した。続い
て、それらのカップに２０容量％のヤギ血清を含むＰＢ
Ｓ１５０μｍを加えて室温で３時間静置し、非特異的な
蛋白結合部位をブロックし・た６　次いで、ブロッキン
グに用いたＰＢＳを除いたのち、各アッセイ用カップを
軽燥させた。 血清希駅用溶ｉｆｆとして１０容１％の正常ヤギ血清を
含むＰＢＳを上記の各アッセイ用カップここ１００μづ
つ加えたのち、各被検血清（ＧＰＴ＞　：ｑＯＯＩＬ’
：ｕｓｘｇ（−）血清へ　３０検体、　ｃｌ’Ｔ＞　２
００１Ｌ１；　　旧）ｓｒ〜ｇ（−）血ＩＢ＋５検体、
　ＧＰＴ＞　２００１Ｌｌ：　　）ＩＢｓＡｇ（・）血
清Ｃ２０検体および１名ヒト血清［）１０林体）を血清
希釈用溶液と被検血清の割合か２０対１（容量比）とな
るようここ加えた。３７”ＣてＩＩＩＧ間インキュヘー
ンヨシ後、それらのカップを０，０５容１１９６のＴｖ
ｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し・　た。 得られた各アッセイ用カップこに、ヤギ抗ヒ）・ｇｃ抗
体〜ベルオキシダーゼコンジュゲ−１・（１０容■％の
正常ヤギ血清を含むＰＢＳで至適濃度に希釈したもの）
　１００μｍを加えた。３７℃で３０分間インキュヘー
ション後、それらのカップを０．０５容量％のＴｉｙｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。続いて、得られ
た各アッセイ用カップに基質（０−フエニしンジアミン
を０．３！ｉｆ！ｉ％となるように０．０２容量％の過
酸化水素を含む０．１門クエン酸−リン酸績衝濯ｐｉ（
５，６！こ溶解したもの）１００μｍを加えた。室温で
１５分間静置したのち、２Ｎ硫酸１００μｍを加えて反
応を停止し、反応源の４９２ｎ＋ｎの吸光度０ＤＪｓ：
ｑ値を測定した。 結」謬 測定結果を第３ａ表、第３ｂ表、第３ｃ表および第３ｄ
表に示す。第３ａ表、第３　ｂ表、第３ｃ表およ′Ｕ第
３ｄ表は実施例１〜３および参考例１〜２て得られたペ
プチドを用いた酵素免疫抗体法でそれぞれ血ｉｊ＄ｉＡ
、血清Ｂ１　　血清ＣおよＵ血ＩＤを測定した場合のそ
れぞれの測定結果を示す。さら１こ正常ヒトｍ？ＷＤＪ
Ｏ検体の００７９２値よりカットオフ値を設定し、抗Ｈ
Ｃ〜抗体陽性・陰性の判定を行フた。カットオフ値は、 （（正常ヒト血清のＯＤ、ｅ　２値の平均値）＋２５Ｄ
）の計Ｗ−式により求めた。第３ａ表、第３ｂ表、第３
０表と第３ｄ表に基づいて計算し・たカットオフ値ここ
より、実施例１〜３および２考例１〜２のペプチドのそ
わぞれのＯＤ、９：ｌ値の号令ｉを第１ａ図、第１ｂ図
、第１ｃ図、第１ｄ図および第１ｅ１７Ｉに示す。なお
、これらの図において、血清Ａが与えたＯＤ、　９２値
を・記号で示し５、血清Ｂが与えたＯＤａ　ｓ・値を○
記号で示し、血清Ｃが与えたＯＤ、９２［を×記号で示
す。第３ａ表、第３ｂ表、第３ｃ表および第３ｄ表と上
記のカットオフ値ｔこより算出した陽性率を第４表：こ
示す。第４表より、実施例１て得られたペプチドによる
酵素免疫１ｕｌｌ定法を実線した場合、血清、へ、血清
Ｂ、血清Ｃおよび正常ヒト血ｆ４Ｄ　テはそねぞれ９３
．３％、９３　、３　％、１ｏ　、　ｏ　ｑｒ、０．０
％の陽性率を示し・た６　実施例２て１ｑられたペプチ
ド：こよる酵漿免疫Ｊｌｌ定法を実施した場合、血清Ａ
、血清Ｂ、血清Ｃおよび圧密ヒト血清りてはそれぞれ９
６　、７９６．９３．３％、０４０％、０．０％の陽性
率をボし・た。さらに、実施例３て得られたペプチドに
よる酵素免疫測定法を実施し・た場合、血清へ、血清Ｂ
、血清Ｃおよび血清ｒ）ではそれぞれ９３　、　：（％
、９３．３％、０４０％、１０．０％の曙性率を示し・
、二のペプチドを用いた酵素免疫測定法は、参考例３に
示し・たイムノスクリーニングン去と高い相間かあるこ
とか１１つだ。また、参考例１およＵ参考例２て得られ
たベブチＩ’　＋こよる酵素免疫測定法を実施した場合
、血清Ａでは陽性率はともに２０．０％であり、血清丁
３では陽性率はそれぞれ６．７％、１３．３％であって
、これらのペプチドを用いた酵素免疫ｄｌｌ定法は感度
が不良であることが１１つだ。 以上の結果より、実施例１、実施例２およＵ実施例３て
得られたベブチｌ−を用いることによって、有効な抗）
）Ｃ〜抗体の有無の判定がなされる二とか示された。な
かでも実施例１て得られたペプチドを用いた場合に５度
および特異性が高い二とが１１つた＠ ！３ａ男 以下余白 第３ｂ表 第３ｄ表 以下余力 第３ｃ表 実施例５ 被」劃１し料 第５表に用いた血清検体が由来する疾患名と検体数を示
した。 第５表 第５表：こ示し・た各血清検体について、下記の酵素免
疫測定法により吸光度を測定し、抗ＨＣ〜抗体の有無を
検定した。 すなわち、実施例４におけると同様な方法で抗原物質と
して実施例】、実施例２、実施例３、参考例１および参
考例２て得られたペプチドをアッセイ用マイクロカップ
にコーティングし、第５表に示した各血清検体との反応
を行い、反応液の４９２ｎｍの吸光度０Ｄ−９２値を測
定し・た。 ■ 測定結果を第６表に示す。第６表は実施例１〜３おより
参考例１〜２て得られたペプチドを用いた酵素免疫抗体
法により第５表に示し・た各血清検体を検定し・た場合
のそれぞれの測定結果を示す。 さらに正常者血清】０検体の０Ｄ＝ｓ２値よりカットオ
フ値を設定し、抗Ｈ（＼１抗体陽性・陰性の判定を行っ
た。カットオフ値は、 （（正常者血清の０Ｄａ９２値の平均ｔｌＩ）＋２ＳＤ
）の計算式により求めた。第６表の正常者血ｊｌＩ検体
の測定値に基づいて計算し、たカットオフ値により、陽
性または陰性の区別を判定しまた結果を第６表中に示し
た。第６表より、実施例１て得られたベブチｊ・；こよ
る酵素免疫測定法を実施し・た場合、散発性非Ａ非Ｂ型
肝炎急性・回復期および慢性肝炎、ＰＴＮ′い’ＢＨ急
性・極間およＵ慢廿肝炎の芒１者血清は抗ＨＣＸ抗体が
陽性と判定され、アルコール性肝炎患者血清、［）ユ２
肝炎だ、者血清および正常者血清では抗１（Ｃ〜抗体は
陰性と判定された。実施例２およＵ実施例３て得られた
ベブチ）・による酵素免疫Ｊｌｌ定法を実施した場合、
非Ａ非１３型肝炎庁、者血清て：ｉ抗１（Ｃ１抗体か陽
性と判定され、アノしコール性肝４３　、！８、者血清
、Ｂ型肝炎７巴者血清および正常者血清では抗ＨＣＩ抗
体は陰性と判定された。以上のことから実施例」、実施
例２および実施例３て得られたペプチドを用いた酵素免
疫測定法は非Ａ非１３型肝炎の診断：こ有用てあり、な
かても実施例］て得られたペプチドを用いた酵素免疫測
定法は１ｃＸｒＢ染後早］１１１　Ｃ出現する抗ＨＣＳ
抗体を検出できることから、非Ａ非Ｂ型肝炎の早期診断
に有用であることが判った６　また、参考例１および参
考例２て得られ非Ａ非１３型肝炎の患者血清て抗ＨＣＶ
抗体が陰性と測定される場合があり、また、Ｂ型肝炎芒
、者血清および正常者血清て抗ＨＣ〜抗体が陽性と判定
される場合があり、特異性および感度が不良であった。 すなわち、参考例１およＵ参考例２て得られたペプチド
を用いた酵素免疫測定法ここよる判定結果は偽陰性およ
び偽陽性を含み、このペプチドを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎
の診断効率は不良であることが１すった。以上の結果よ
り、実施例１、実施例２および実施例３で得られたペプ
チドを用いること：こよって、有効な抗ＨＣ＼抗体の有
振の１り定かなされることが示された。 以下余白 たベフ゛チｊ−コこよる酵素免疫ｉ則定イ去を実施し・
た場合、［発明の効果］ 本発明によれば、抗ＨＣ＼抗体と特異的乙こ結合する能
力を有するペプチドが提供される。このペプチドζこよ
り抗ＨＣλ抗体の測定試薬を提供することが可能となっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図、第１ｂ図、第１ｃ図、第１ｄ図および第１ｅ
図はそれぞれ実施例１、実施例２、実施例３、参考例Ｉ
および参考例２て得られたペプチドを用いて実施例４に
記載された方法により測定した各血清検体が与えたＯＤ
、９２値の分布図である。 第１　ａ図、　第　１　ｂ図、　第１０図、　第１　ｄ
図および第】ｅ図ｔこおいて各記号は次のことを示す。 ・：　　ＧＰＴ＞　２００１ＬＩ：　　ＨＢｓＡｇ（−
）血清Ａが与えたＯ： ×： ０Ｄ１９２値 ＧＰＴ＞　２００１Ｕ： ０ＤＡＱ２値 ＧＰＴ＞　　２００１Ｕ： （’Ｄｚｇ２値 ＨＢｓＡｇ（ ）血清Ｂが与えた ＨＢｓＡｇ（−）血清Ｃが与えた

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその断
   片からなり、かつ該断片が −Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−のアミノ
   酸配列を有するペプチドであつて、非Ａ非Ｂ型肝炎関連
   抗原に対して特異性を有する抗体と特異的に結合する能
   力を有するペプチド。 ２、請求項１記載のペプチドからなる非Ａ非Ｂ型肝炎関
   連抗原に特異性を有する抗体の測定試薬。