JP2020002073A

JP2020002073A - ペプチド及びその利用

Info

Publication number: JP2020002073A
Application number: JP2018123612A
Authority: JP
Inventors: 純子赤田; Junko Akada; 吉生山岡; Yoshio Yamaoka; 村上　和成; Kazunari Murakami; 和成村上; 星児塩田; Seiji Shioda
Original assignee: Oita University
Current assignee: Oita University
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2020-01-09
Anticipated expiration: 2038-06-28
Also published as: JP7222511B2

Abstract

【課題】本発明は、より正確且つ簡便なピロリ菌感染の有無等の把握に有用なペプチド及びその利用を提供することを目的とする。【解決手段】配列番号１（Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ）で表されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が３３以下である、ペプチド。ここで、Ｘａａは、それぞれ同じアミノ酸であっても異なるアミノ酸であってもよく、それぞれ独立して、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる群より選択されるいずれかであればよい。【選択図】なし

Description

本発明は、ペプチド及びその利用に関する。

ピロリ菌（Helicobacter pylori）は、例えば、長い慢性感染を経て胃癌を誘発することが知られており、また、抗ピロリ菌剤も知られている（特許文献１）。

従来、ピロリ菌感染の有無を判定するための検査として、抗体検査、尿素呼気試験、鏡検法等の複数の検査方法が知られている。例えば、抗体検査においては、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay）法や、ラテックス凝集免疫比濁法等が利用されている。これらの方法は、主に抗原抗体反応を利用するものであるが、Ｓ／Ｎ比が低い、ピロリ菌感染の陽性と陰性とを識別するカットオフ値の設定が難しく偽陰性や偽陽性の問題が生じ易い、といった問題がある。また、このような検査は、各種機関にて行われていることが想定されるところ、正確な結果を得る等の観点から、簡便に検査できることが望ましい。

このことから、ピロリ菌感染の有無等をより正確且つ簡便に把握することができる技術を提供することは重要である。

ＷＯ２００８／３２８１７号公報

本発明は、より正確且つ簡便なピロリ菌感染の有無等の把握に有用なペプチド及びその利用を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記課題に鑑み鋭意検討を行ったところ、特定の配列を備えるペプチドが、抗ピロリ菌抗体に高い反応性を示すことを見出した。本発明は該知見に基づき更に検討を重ねた結果完成されたものであり、次に掲げるものである。
項１．配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が３３以下である、ペプチド。
項２．配列番号１で表されるアミノ酸配列が、次の（１）〜（６）の少なくとも１つの特徴を有する、項１に記載のペプチド、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のＸａａが、アスパラギンまたはセリン、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のＸａａが、アスパラギン、セリンまたはプロリン、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から３番目のＸａａが、トレオニン、グルタミン酸またはアラニン、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目のＸａａが、グルタミンまたはリシン、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から５番目のＸａａが、アスパラギンまたはアラニン、
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６番目のＸａａが、リシンまたはバリン。
項３．配列番号１で表されるアミノ酸配列が、前記（１）〜（６）の特徴を有する、項１または２に記載のペプチド。
項４．配列番号１で表されるアミノ酸配列が、次の（１’）〜（６’）または（１’’）〜（６’’）の特徴を有する、項１〜３のいずれかに記載のペプチド、
（１’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のＸａａがアスパラギン、
（２’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のＸａａが、アスパラギンまたはセリン、
（３’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から３番目のＸａａが、トレオニン、グルタミン酸またはアラニン、
（４’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目のＸａａが、グルタミンまたはリシン、
（５’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から５番目のＸａａが、アスパラギン、及び
（６’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６番目のＸａａが、リシン、
（１’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のＸａａが、アスパラギンまたはセリン、
（２’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のＸａａが、プロリン、
（３’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から３番目のＸａａが、グルタミン酸、
（４’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目のＸａａが、グルタミン、
（５’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から５番目のＸａａが、アラニン、及び
（６’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６番目のＸａａが、バリン。
項５．配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２〜７からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列からなる、項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
項６．配列番号８〜１２からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列を含む、項１〜５のいずれかに記載のペプチド。
項７．項１〜６のいずれかに記載するペプチドを含有する、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体検出または定量用組成物。
項８．項１〜６のいずれかに記載するペプチドを含有する、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体検出または定量用キット。
項９．採取された血清または尿と項１〜６のいずれかに記載するペプチドとを接触させる工程を含む、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体を検出または定量する方法。

本発明によれば、ピロリ菌感染の有無等をより正確且つ簡便に把握することができる。特に、本発明のペプチドを用いることにより、血清中や尿中の抗ピロリ菌抗体を、より正確且つ簡便に検出、定量することができる。

図１は、各種ペプチドの抗ピロリ菌抗体への反応性を調べた結果を示す。

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が３３以下である、ペプチドを提供する。

該ペプチドのアミノ酸残基数は、この限りにおいて制限されないが、好ましくは１４〜３３である。

配列番号１で表されるアミノ酸配列は、次の通りである。
Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ

配列番号１で表されるアミノ酸配列において６箇所に存在する「Ｘａａ」は、それぞれ同じアミノ酸であっても異なるアミノ酸であってもよく、それぞれ独立して、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リシン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アルギニン（Ａｒｇ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）からなる群より選択されるいずれかであればよい。

この限りにおいて制限されないが、好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列として、次の（１）〜（６）の少なくとも１つの特徴を有するものが例示される。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のＸａａが、アスパラギンまたはセリン、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のＸａａが、アスパラギン、セリンまたはプロリン、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から３番目のＸａａが、トレオニン、グルタミン酸またはアラニン、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目のＸａａが、グルタミンまたはリシン、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から５番目のＸａａが、アスパラギンまたはアラニン、
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６番目のＸａａが、リシンまたはバリン。

また、この限りにおいて制限されないが、より好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列として、前記（１）〜（６）の特徴を有するものが例示される。

また、この限りにおいて制限されないが、更に好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列として、次の（１’）〜（６’）または（１’’）〜（６’’）の特徴を有するものが例示される。
（１’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のＸａａがアスパラギン、
（２’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のＸａａが、アスパラギンまたはセリン、
（３’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から３番目のＸａａが、トレオニン、グルタミン酸またはアラニン、
（４’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目のＸａａが、グルタミンまたはリシン、
（５’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から５番目のＸａａが、アスパラギン、及び
（６’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６番目のＸａａが、リシン；
（１’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のＸａａが、アスパラギンまたはセリン、
（２’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のＸａａが、プロリン、
（３’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から３番目のＸａａが、グルタミン酸、
（４’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目のＸａａが、グルタミン、
（５’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から５番目のＸａａが、アラニン、及び
（６’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６番目のＸａａが、バリン。

また、この限りにおいて制限されないが、特に好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列として、配列番号２〜７からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列が例示される。

本発明のペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、１回のみ含まれていても良く、２回含まれていても良い。

本発明のペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列以外を構成するアミノ酸は、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、これらのアミノ酸はそれぞれ独立して、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リシン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アルギニン（Ａｒｇ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）及びチロシン（Ｔｙｒ）からなる群より選択されるいずれであってもよい。

本発明のペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列以外を構成するアミノ酸は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端側に存在していてもよく、Ｃ末端側に存在していてもよく、Ｎ末端側とＣ末端側の両方にそれぞれ存在していてもよい。また、本発明のペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列が２回含まれる場合、配列番号１で表されるアミノ酸配列以外を構成するアミノ酸は、更に、配列番号１で表されるアミノ酸配列と配列番号１で表されるアミノ酸配列の間に存在してもよい。Ｎ末端側、Ｃ末端側に存在するアミノ酸残基の数、また、配列番号１で表されるアミノ酸配列と配列番号１で表されるアミノ酸配列の間に存在するアミノ酸残基の数は制限されない。

本発明のペプチドを制限するものではないが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含みアミノ酸残基数が３３以下であるペプチドとして、好ましくは、配列番号２〜７からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列を１回または２回含むペプチド、配列番号８〜１２からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列を１回含むペプチドが例示される。

本発明のペプチドは、配列番号２〜７からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであってもよく、配列番号８〜１２からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。

本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列またはそれをコードする塩基配列の情報を基に周知の遺伝子工学的手法や化学合成法等によって作製できる。例えば、本発明のペプチドは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入し、該ベクターが組み込まれた形質転換体を培養したのち、所望のペプチドを取得することにより作製することができる。化学合成法としては、液相法や固相法等によるペプチド合成法が包含される。

本発明のペプチドによれば、抗ピロリ菌抗体をより正確に認識することができる。本発明のペプチドによれば、抗ピロリ菌抗体を簡単に認識することができる。特に、胃癌誘導に重要な役割を果たすと考えられている主要な病原因子の一つであり、且つ、主要な抗原蛋白質として、ピロリ菌のＣａｇＡ蛋白質が知られているところ、本発明のペプチドによれば、抗ピロリ菌ＣａｇＡ抗体をより正確に認識することができる。このことから、本発明のペプチドによれば、ピロリ菌感染の有無等をより正確且つ簡便に把握することができる。また、このことから、本発明のペプチドによれば、抗ピロリ菌抗体のより正確かつ簡便な特異的検出、定量等が可能である。

また、本発明は、本発明の前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

本発明のポリヌクレオチドも、従来公知の遺伝子工学的手法や化学合成法等を用いて作製できる。例えば、本発明のペプチドをコードするアミノ酸の配列情報やヌクレオチドの配列情報に基づいて、従来公知の化学的ＤＮＡ合成法により所望のポリヌクレオチドを作製、取得すればよい。また、例えば、所望のポリヌクレオチドを有する微生物をはじめ適当な起源から定法に従ってｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ライブラリーから、適切なプローブ等を用いて、所望のポリヌクレオチドを取得すればよい。

本発明のポリヌクレオチドの状態は特に制限されず、例えば、単離されたもの、ベクター内に組み込まれたものであってもよい。この場合、ベクターの構造、由来、用途等は制限されない。例えば、ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス等）のいずれであってもよく、また、クローニング用ベクター、発現用ベクターのいずれであってもよい。ベクターは、必要に応じて、エンハンサー、プロモーター、制限酵素切断部位、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、薬剤耐性遺伝子、Green Fluorescent Protein（ＧＦＰ）等のマーカー遺伝等の塩基配列が接続されていてもよい。また、ベクターとの関係や目的に応じて宿主細胞を適宜選択すればよく、宿主細胞として、大腸菌、放線菌等の原核細胞や、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞等の真核細胞といった各種細胞が例示される。

このことから、更に、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、前記前記ポリヌクレオチドを含む形質転換を提供する。形質転換体はベクターを宿主細胞に導入して得られ、その方法も特に制限されず、従来公知の一般的な方法に従い行えばよい。例えば、従来公知の標準的な実験室マニュアルに記載される方法に従って行うことができ、塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、リポソーム等のカチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、ファージ等による感染等が例示される。

これらは、本発明の前記ペプチドの簡便な発現に有用である。

本発明はまた、本発明のペプチドを含有する、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体検出または定量用組成物を提供する。

本発明のペプチドは、前述の通りである。従来、ピロリ菌検査では、採取が簡便等である点から、試料として血清や尿が頻用されているところ、本発明のペプチドは、このような血清中や尿中の抗ピロリ菌抗体の検出または定量に有用である。

本発明の抗ピロリ菌抗体検出または定量用組成物には、本発明のペプチド以外に、緩衝液、抗ピロリ菌抗体を認識するために使用される従来公知の抗原等が必要に応じて含まれていても良い。

本発明はまた、本発明のペプチドを含有する、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体検出または定量用キットを提供する。

本発明のペプチドは、前述の通りである。

本発明のキットには、本発明のペプチド以外に、免疫学的検出または定量に用いられ得る、２次抗体、検量線用コントロールペプチド、検量線用コントロール抗体、マスキング剤、ブロッキング剤、標識酵素等の標識剤、基質、反応停止剤、緩衝液、分子量マーカー、マイクロビーズやマイクロプレート等の固相、使用説明書等が必要に応じて含まれていても良い。

本発明の抗ピロリ菌抗体検出または定量用組成物やキットによれば、一層容易に、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体の検出または定量が可能になる。

本発明はまた、採取された血清または尿と本発明のペプチドとを接触させる工程を含む、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体を検出または定量する方法を提供する。

採取された血清または尿は、例えば、ヒト由来であっても、非ヒト哺乳動物由来であってもよく、その由来は問わない。

血清または尿と本発明のペプチドとの接触方法は、これらが接触する限り、制限されない。例えば、接触方法として、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay）法、ラテックス凝集免疫比濁法等の従来公知の抗原抗体反応を利用する免疫学的方法に従う接触方法が例示される。このことから、本発明の方法は、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集免疫比濁法等の従来公知の抗原抗体反応を利用する免疫学的方法において使用されるといえ、好ましくはＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集免疫比濁法等において使用される。ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集免疫比濁法等の免疫学的方法は従来公知であるため、これらの従来公知の手順に従い、本発明のペプチドを用いて血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体を検出または定量する方法を実施すればよい。

本発明の方法によれば、抗ピロリ菌抗体をより正確かつ簡便に検出または定量することができる。特に、胃癌誘導に重要な役割を果たすと考えられている主要な病原因子の一つであり、且つ、主要な抗原蛋白質としてピロリ菌のＣａｇＡ蛋白質が知られているところ、本発明の方法によれば、抗ピロリ菌ＣａｇＡ抗体をより正確かつ簡便に検出または定量することができる。本発明を制限するものではないが、本発明は、例えば、所謂、アジアに多いＡＢＤ型ＣａｇＡに対する抗体（抗ピロリ菌ＡＢＤ型ＣａｇＡ抗体）の認識にも有用である。

以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

試験例１
１．ペプチドの作製
ペプチドの合成を外注することにより、合計８７種のペプチド（各ペプチドのアミノ酸残基数１９〜２０）を合成した。

２．反応の手順
２−１．ペプチド及び検量線用抗体の準備
合成したペプチドを１ｎｍｏｌ／μＬの濃度でＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）に溶解後、９倍量のＰＢＳを添加して、ペプチド濃度１００ｐｍｏｌ／μＬとなるように希釈し、ペプチドストック液として凍結保存した。ＰＢＳの組成は次の通りである。０．３５ｇＮａＨ_２ＰＯ_４、１．２８ｇＮａ_２ＨＰＯ_４及び８ｇＮａＣｌ含有の１Ｌ水溶液（ｐＨ７．４）。

抗体検出の検量線用には、ピロリ菌感染患者由来の抗原蛋白質ＣａｇＡを認識することが既に知られているペプチド（配列番号１３、対照ペプチドと記載する）を用いた。外注にて、抗対照ペプチドウサギポリクロ―ナル抗体を作成し、対照ペプチドカラムにて、抗体のアフィニティー精製を行った。精製した対照ペプチド抗体は５０％グリセロール／ＰＢＳにて１ｍｇ／ｍＬに調整した。

２−２．試料の準備
本試験例では試料として血清を用いた。具体的には、倫理審査を経て、同一被験者から胃内視鏡下で採取された胃生検試料を用いて、ピロリ菌の培養と組織染色を行った。培養下でピロリ菌株の分離ができたか組織染色下でピロリ菌が確認されたか、または、これらの両方が可能であった場合にＨｐ（＋）（Positive試料）とした。どちらも出来なかった場合をＨｐ（−）とした。最終的に、Ｈｐ（＋）ヒト血清６２試料、Ｈｐ（−）ヒト血清１２８試料を本試験において用いた（合計１９０試料）。

なお、培養したピロリ菌株の病原因子ＣａｇＡ遺伝子のタイピングを行うと、Ｈｐ（＋）ヒト血清のうち、２試料はＣａｇＡ遺伝子欠損株感染者由来であり、２試料は西洋型であり、これら以外の試料はアジア型であった。後述の図１中、Positive試料において○はCagA遺伝子欠損株、□はAB型CagA株（西洋型）、△はABC型CagA株（西洋型）、●はABD型CagA株（アジア型）である。

また、Ｈｐ（−）ヒト血清は初診（除菌治療前、Negative試料）と再診（除菌後、Eradicated試料）の２グループに分類し、それぞれNegative５７試料とEradicate７１試料であった。

２−３．ペプチド固定化ＥＬＩＳＡプレートの作成
前述のようにして調製したペプチドストック液を、５０ｍＭ炭酸緩衝液（Na₂CO₃-NaHCO₃buffer (pH 9.6)）にて１０倍希釈し（０．１ｐｍｏｌ／μＬ）、得られた溶液を、９６ウエルのＥＬＩＳＡプレート（Immobilizer-Amino Plate & Modules (Nunc Cat.#436013)）にそれぞれ１００μＬずつ分注した（１０ｐｍｏｌ／ウエル）。抗体検出の検量線用には、同様に対照ペプチド（０．１ｐｍｏｌ／μＬ）を６ウエルに分注した。陰性コントロールとしてＢＳＡ５０μｇ／ｗｅｌｌを、２次抗体の陽性コントロールとして、ヒトＩｇＧ抗体１０ｐｍｏｌ／ウエルを分注した。分注後、ＥＬＩＳＡプレートを遮光し、４℃にて一晩振盪しながら、ペプチドをプレートに固定させた。

２−４．ＥＬＩＳＡによる抗体検出及び定量
前記２−３においてペプチドを固定したプレートの溶液を捨て、３００μＬの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ（ＰＢＳ−０．１Ｔ）にて各ウエルを３回洗浄した。各ウエルに１００μＬマスキング溶液（１００ｍＭエタノールアミンを５０ｍＭ炭酸緩衝液に溶解）を添加し、室温で１時間緩やかに振盪してマスキングを行った。３００μＬＰＢＳ−０．１Ｔにて各ウエルを３回洗浄後、１００μＬブロッキング溶液（２％牛血清アルブミンをＰＢＳに溶解）を各ウエルに添加して、１時間振盪した。次に、ブロッキング溶液を捨て、各ウェルに１００μＬ血清液（前述のようにして準備した血清をブロッキング液で２００倍希釈）を加え、５分間強く振盪した後、２時間室温にて緩やかに振盪した。続いて血清液を捨て、３００μＬＰＢＳ−０．１Ｔにて５回洗浄後、１００μＬ二次抗体液（西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体をブロッキング液にて４０００倍希釈）を添加し、１時間緩やかに振盪した。二次抗体を捨て、３００μＬＰＢＳ−０．１Ｔにて５回洗浄後、ペルオキシダーゼ基質であるＴＭＢ溶液を各ウエルに１００μＬずつ添加し、暗下で５分間反応させて青色に発色させた後、１規定塩酸を１００μＬ添加して、反応を停止させた。黄色の反応液はプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの波長で抗体量を測定し、検量線と照らし合わせて定量した。

検量線用には、対照ペプチド（０．１ｐｍｏｌ／μＬ）を固定したウエルを用い、精製対照ペプチド抗体（１ｍｇ／ｍＬ）の希釈系列を１次抗体として用い、抗ウサギＩｇＧ二次抗体を用いた。その他の操作は同様に行った。

３．結果
３−１．代表的な血清を用いた全ペプチドＥＬＩＳＡの結果
前述のように分類した３つのグループ（Negative試料、Positive試料、Eradicated試料）において、まず各グループのうち９〜１０個の血清を用いて、全ペプチドに対するＥＬＩＳＡ解析を行った。その結果、Negative試料に対しPositive試料で有意に（ｐ＜０．０１）高い反応が１７種のペプチドで認められた。また、Positive試料に対し、Eradicated試料で有意に（ｐ＜０．０１）低い反応が１１種のペプチドで認められた。

３−２．選択したペプチドを用いた全ての血清のＥＬＩＳＡの結果
前記３−１において最も高い反応が認められた３種ペプチド（それぞれ配列番号８、９及び１４のペプチド）について、全ての血清（Positive 62試料、Negative 57試料、Eradicate 71試料）を用いたＥＬＩＳＡ解析を行った。

また、既に小児血清で反応を認めた２種のペプチド（それぞれ配列番号１３及び１５のペプチド）及び本試験で作製したペプチド（配列番号１６のペプチド）についても同様に解析した。

その結果、配列番号８または９のペプチドでは、Negative試料に対してもEradicated試料に対しても、Positive試料において極めて有意に高い反応が再現された（図１）。また、これらのペプチドは、Positive試料の中でも、ＣａｇＡ遺伝子欠損株の感染者（〇）に対しては反応しなかった。

これに対し、配列番号８と配列番号９以外のペプチドにおいては、望ましい結果は得られず、具体的には、配列番号８と配列番号９以外のペプチドのPositive試料への反応性はやや弱いか、一部の血清のみに反応性を示すだけであった。特に、図１から理解できる通り、配列番号８と配列番号９以外のペプチドの中でPositive試料に対して比較的高い反応性を示した配列番号１６のペプチドでも、Negative試料とPositive試料の間に有意差はなかった。

これらのことから、配列番号８、９で表されるペプチドは、ピロリ菌ＣａｇＡの特異的検出や定量に非常に有用であることが分かった。また、特に、配列番号８、９で表されるペプチドを用いた場合は、Negative試料に対してもEradicated試料に対しても、Positive試料で極めて有意に高い反応が再現されたことから、バックグラウンドが低くＳ／Ｎ比の小さな、抗ピロリ菌抗体のより正確かつ簡便な特異的検出または定量が可能であることが分かった。このように、配列番号８、９で表されるペプチドを用いることにより、抗ピロリ菌抗体の検出や定量を一層高感度化することができ、また、より簡便に行うことができることが分かった。このことから、これらのペプチドによれば、ピロリ菌感染の有無等をより正確且つ簡便に把握することができることが理解できる。

試験例２
１．手順
前記試験例１において得られた配列番号８、９のペプチドにおいて、共通する配列が認められた。そこで、これらのアミノ酸配列のどの部分が抗体との反応に重要であるのかについて検討した。具体的には、前記配列番号８、９のペプチドのアミノ酸配列に基づいて、更に複数種のペプチドを作製した。これらのペプチドの作製は、前記試験例と同様に外注した。作製したペプチドについて、前述と同様の手順にて、抗原抗体反応を行った。

本試験例では、配列番号８〜１２及び１７〜２２で表される各ペプチドを用いた。

２．結果
結果を表１に示す。

表１には、各試料に対する前記ペプチドの反応性（ｎｇ／ｍＬ以上）と、前記ペプチドに０．５ｎｇ／ｍＬ以上の反応性を示した試料の数（括弧内は全１４試料に対する割合）を示す。

その結果、配列番号８のペプチド、配列番号９のペプチドのうち、ＡＧＱＡＴ配列を有するがＥＰＩＹＡ配列を欠く配列番号１９のペプチドでは、抗体との反応性が著しく低下した。また、ＡＧＱＡＴ配列を有さずＥＰＩＹＡも欠く配列番号１７、２１、２２のペプチドでも、抗体との反応性が著しく低下した。また、配列番号８、９のペプチドにおいて、ＥＰＩＹＡに比較的近いＣ末端のアミノ酸を欠く配列番号１８及び２０のペプチドにおいても、反応性がやや低くなった。

一方、配列番号１０〜１２のペプチドでは、配列番号８、９のペプチドと同様に、高い反応が得られた。より具体的には、配列番号８〜１１のペプチドは、試験した１４種全てのPositive試料に対して高い反応性を示し、配列番号１２のペプチドは、試験したPositive試料うち１試料を除き、高い反応性を示した。

次いで、前記試験例１において配列番号８及び９のペプチドと高い反応性を示した血清を提供した被験者のピロリ菌ＣａｇＡ遺伝子のアミノ酸配列を解析したところ、一例として、配列番号４〜７に示す配列が認められた。配列番号８及び９と配列番号４〜７には、次の下線で示す通り共通する配列が存在することが分かった。また、配列番号１０及び１１のペプチドにおいても、同様の共通する配列が存在することが分かった。

ＮＮＴＥＰＩＹＡＱＶＮＫＫＫＡＧＱＡＴ（配列番号８）
ＡＧＱＡＴＳＰＥＥＰＩＹＡＱＶＡＫＫＶ（配列番号９）
ＮＮＥＥＰＩＹＡＫＶＮＫＫＫ（配列番号４）
ＮＮＥＥＰＩＹＡＱＶＮＫＫＫ（配列番号５）
ＳＰＥＥＰＩＹＡＱＶＡＫＫＶ（配列番号６）
ＮＰＥＥＰＩＹＡＱＶＡＫＫＶ（配列番号７）
ＮＧＬＫＮＮＴＥＰＩＹＡＱＶＮＫＫＫＡ（配列番号１０）
ＳＰＥＥＰＩＹＡＱＶＡＫＫＶＳＡＫＩＤ（配列番号１１）

これらのことから、ピロリ菌感染特異的反応性を示すペプチドとして、該共通する配列が重要であることが分かった。

Claims

配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が３３以下である、ペプチド。
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、次の（１）〜（６）の少なくとも１つの特徴を有する、請求項１に記載のペプチド、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のＸａａが、アスパラギンまたはセリン、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のＸａａが、アスパラギン、セリンまたはプロリン、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から３番目のＸａａが、トレオニン、グルタミン酸またはアラニン、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目のＸａａが、グルタミンまたはリシン、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から５番目のＸａａが、アスパラギンまたはアラニン、
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６番目のＸａａが、リシンまたはバリン。
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、前記（１）〜（６）の特徴を有する、請求項１または２に記載のペプチド。
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、次の（１’）〜（６’）または（１’’）〜（６’’）の特徴を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド、
（１’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のＸａａがアスパラギン、
（２’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のＸａａが、アスパラギンまたはセリン、
（３’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から３番目のＸａａが、トレオニン、グルタミン酸またはアラニン、
（４’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目のＸａａが、グルタミンまたはリシン、
（５’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から５番目のＸａａが、アスパラギン、及び
（６’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６番目のＸａａが、リシン、
（１’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のＸａａが、アスパラギンまたはセリン、
（２’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から２番目のＸａａが、プロリン、
（３’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から３番目のＸａａが、グルタミン酸、
（４’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から４番目のＸａａが、グルタミン、
（５’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から５番目のＸａａが、アラニン、及び
（６’’）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６番目のＸａａが、バリン。
配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２〜７からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
配列番号８〜１２からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド。
請求項１〜６のいずれかに記載するペプチドを含有する、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体検出または定量用組成物。
請求項１〜６のいずれかに記載するペプチドを含有する、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体検出または定量用キット。
採取された血清または尿と項１〜６のいずれかに記載するペプチドとを接触させる工程を含む、血清中または尿中の抗ピロリ菌抗体を検出または定量する方法。