KR20220029898A

KR20220029898A - 한탄바이러스 항원 단백질을 이용한 혈청학적 진단 방법

Info

Publication number: KR20220029898A
Application number: KR1020200111432A
Authority: KR
Inventors: 송진원; 조승찬; 박꽃한아름
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2022-03-10

Abstract

본 발명은 절단된 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 항원 단백질로 이용한 혈청학적 진단 방법에 관한 것으로, 본 발명은 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하여 환자에게 감염이 발생한 직후에 나타나는 초기 IgM의 존재를 MAC-ELISA 진단법으로 확인함으로써 종래의 진단 방법에 비해 민감도 및 특이도가 현저히 높아졌으므로, 이를 한탄바이러스 감염 또는 신증후군출혈열 진단에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

한탄바이러스 항원 단백질을 이용한 혈청학적 진단 방법{SEROLOGICAL DETECTION METHOD USING ANTIGEN OF HTNV}

본 발명은 절단된 한탄바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 항원 단백질로 이용한 혈청학적 진단 방법에 관한 것이다.

세계 공중 보건학적으로 매우 중요한 위치를 차지하고 있는 한탄바이러스는 한타바이러스 속(Hantavirus genus), 분야비리대 과(Bunyaviridae family)에 속하는 단일가닥 음성 RNA 바이러스(single stranded negative sense RNA virus)로 현재까지 300종 이상의 종(species)으로 구성되어 있다. 한탄바이러스의 형태는 Plyusnin A 등(Plyusnin A., et al, 1996, Hantaviruses: genome structure, expression and evolution, J. Gen. Virol., 77, 2677-2687)의 보고에서 직경 80 내지 120nm의 구형으로, 유전자는 S 분절(Small segment, 또는 S segment), M 분절(Medium segment, 또는 M segment) 및 L 분절(Large segment, 또는 L segment)과 같이 3개 분절로 이루어져 있으며, 각각의 분절은 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein)을 암호화하는 것으로 평균 크기가 1.6 kb정도인 S 분절(S segment), 당단백질(Glycoprotein)인 G1과 G2를 암호화하는 것으로 평균 크기가 3.6kb인 M 분절(M segment) 및 RNA 의존 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)를 암호화하는 것으로 평균 크기가 6.5 kb인 L 분절(L segment)이다.

현재까지 한탄바이러스로 인한 질병은 설치류에 의해 매개되는 두 가지의 다른 임상 양상을 가지는 질병을 유발한다고 알려져 있으며, 한국을 포함하는 아시아 및 유라시아 지역에서 발생하는 유행성출혈열이라고도 하는 신증후군출혈열(Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)과 아메리카 대륙에서 발병하는 한타바이러스 폐증후군(Hantavirus pulmonary syndrome, HPS)을 유발한다. 그 중에서 대표적으로 알려진 신증후군출혈열은 한타바이러스 속에 속하는 여러 종의 바이러스에 의해 유발되는 설치류 매개 인수공통감염병으로 원인병원체는 주로, Bi, Z. 등(Bi, Z., et al, 2008, Hantavirus infection: a review and global update, J. Infect. Dev. Ctries., 2, 3-23)의 보고에서 한탄바이러스(Hantaan virus, HTNV), 서울바이러스(Seoul virus, SEOV), 푸말라바이러스(Puumala virus, PUUV), 도브라바바이러스(Dobrava virus, DOBV)가 있으며, 한타바이러스폐증후군을 일으키는 신놈브레바이러스(Sin Nombre virus, SNV), 안데스바이러스(Andes virus, ANDV)가 대표적인 원인 병원체로 알려져 있다. 지역마다 분포하는 바이러스의 종에 차이가 있지만, 중국, 러시아 등 동북아시아와 스칸디나비아 반도, 유럽, 북아메리카 등 세계적인 분포를 보이며, 연간 전 세계에서 150,000여명의 신증후군출혈열 환자가 발생한다. 오르쏘한타바이러스속 바이러스 속 중 한탄바이러스는 한국, 중국, 러시아 등에 분포하며, 한국에서 발병하는 신증후군출혈열의 약 70%의 원인이 되고 있으며, 이외에 서울바이러스가 발병 원인이 되기도 한다. 신증후군출혈열은 신부전, 출혈, 혈소판감소증, 쇼크를 특징으로 하는 급성 발열질환으로, 일반적으로 초기 신증후군출혈열의 임상적 특징은 고열을 동반한 독감 증상과 비슷하기 때문에, 정확한 진단이 어렵다.

한국에서 발생하는 신증후군출혈열 환자의 수는 매년 약 400명 내외로, 한탄바이러스 및 서울바이러스 두 종에 의한 것으로 알려져 있다. 바이러스가 감염된 설치류의 타액, 소변, 분변 등을 통해 전파되는 질병 특성상, 야외 활동이 빈번할수록 감염에 노출될 가능성이 크며, 생활환경의 영향이 크다. 그러나 최근 약 10년 동안의 국내 발생 현황에 따르면 생활환경의 개선과 백신접종에도 불구하고 환자 및 사망자가 꾸준히 발생하고 있어 체계적인 감시를 위한 진단법의 개발이 필요하다.

기존에 사용되고 있는 IgG 간접면역형광항체법(IFA) 진단은 민감도가 낮으며, 결과 판독이 실험자의 검경으로 이루어져 객관성이 결여되는 점이 있고, 비특이 반응에 의한 위양성이 많고, 민감도도 낮으며, 쯔쯔가무시증, 중증열성혈소판감소증 등과 같은 유사 질병과 교차 반응이 일어날 가능성이 있다. 특히 쯔쯔가무시증은 신증후군출혈열, 렙토스피라증과 함께 우리나라의 3대 가을철 발열성질환의 하나이며, 매년 수천명의 환자가 발생하기 때문에 신증후군출혈열 진단시 감별진단이 매우 중요하다. 상용화되어 있는 IgG ELISA의 경우, 민감도가 높으며, 객관적 수치를 통한 판단이 가능하나, 역시 위양성, 위음성 구별에 문제가 있으며, 교차반응 판별이 불가하다. 따라서 새로운 진단 방법이 필요하지만, 진단제제 관련 연구 및 생산이 경제성 등의 이유로 이루어지지 않고 있어 계속해서 간접면역형광항체법을 통한 진단이 이루어지고 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 한탄바이러스 특이적 항원 단백질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 항원 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 한탄바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 시료 내 한탄바이러스 항체를 검출하기 위한 진단 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 한탄바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 신증후군출혈열 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 한탄바이러스 특이적 항원 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항원 단백질의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 항원 단백질, 항원 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 및 표지물질을 포함하는, 한탄바이러스 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 시료 내 한탄바이러스 항체를 검출하기 위한 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 한탄바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 신증후군출혈열 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

종래의 IgG ELISA 시스템의 경우 진단법의 객관성이 결여되어, 위음성(False negative) 반응이 존재하여 진단 특이도가 낮고, 기존에 백신을 투여 받은 환자에서 항체 양성이 나타난 경우 실제 감염과 구분하기 어려워 선별할 수 없는 단점이 존재했으나, 본 발명은 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하여 환자에게 감염이 발생한 직후에 나타나는 초기 IgM의 존재를 MAC-ELISA 진단법으로 확인함으로써 민감도 및 특이도가 현저히 높아졌으므로 한탄바이러스 감염 또는 신증후군출혈열 진단에 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 항원 단백질들의 한탄바이러스에서의 대략적인 위치를 모식도로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 항원 단백질들 (PatrNP_Set-5 및 AatrNP_Set-4)를 발현 및 정제한 것을 확인한 도이다:
레인 1: IPTG 발현유도 전 세포파쇄물;
레인 2: IPTG 발현유도 후 세포파쇄물;
레인 3: Ni-NTA 컬럼을 20 mM 이미다졸 워시 버퍼(Imidazole washing buffer)로 용출한 분획; 및
레인 4 내지 13: Ni-NTA 컬럼을 250 mM 이미다졸 용출 버퍼(Imidazole elution buffer)로 용출한 분획.
도 3은 본 발명의 정제된 한탄바이러스 특이적 항원 단백질들(Purified HTNV NP) (PatrNP_Set-5 및 AatrNP_Set-4)를 이용한 MAC-ELISA 분석 방법으로 환자 혈청에서 한탄바이러스 IgM을 검출하는 것을 모식도로 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 항원 단백질들을 이용한 MAC-ELISA 분석 방법의 검출 한도를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 항원 단백질들을 이용한 MAC-ELISA 분석 방법의 검출 민감도 및 특이도를 확인한 도이다.
도 6은 수신자 조작특성 (Receiver Operating Characteristics, ROC) 그래프에서 AUC 값을 확인한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "대상체" 또는 "환자"는 인간, 유인원, 원숭이, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

본 발명에서 용어, "시료(샘플)" 또는 "검체"는 대상 또는 환자로부터 얻은 생물학적 시료를 의미한다. 생물학적 시료의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 세포일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 한탄바이러스(Hantaan virus, HTNV) 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 항원 단백질에 관한 것이다.

일 구현예에서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 단백질 발현 벡터는 발현되는 항원 단백질이 한탄바이러스 감염 여부 진단에 유용하도록 항원성이 극대화되게 제작되었을 뿐만 아니라 항원 단백질의 정제가 용이하도록 단백질의 N-말단부위에 태그(tag)가 발현되도록 제작되어 있는 벡터를 사용하여 설계될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포로는 박테리아와 같은 원핵세포, 효모와 같은 진핵세포 또는 다세포 유기체 세포와 같은 포유동물세포가 사용될 수 있으나, 발현을 통한 대량생산을 위해서는 대장균이 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 용어, '폴리뉴클레오티드'란, 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬 모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 본 발명에 따른 항원 단백질을 암호화/코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy), 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 재조합 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 상기 변형 유전자 역시 본 발명의 보호범위 내에 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 용어, '벡터'는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 상기 발현 벡터의 제작 시에는 상기 항원 단백질을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (inhancer) 등과 같은 발현 조절 서열 및 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터, 및 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에서 숙주가 효모 (yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2시그널 서열 등이, 숙주가 동물 세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, '숙주 세포'는 하나 이상의 DNA 또는 벡터가 도입되는 진핵 또는 원핵 세포를 가리키며, 특정 대상 세포만이 아니라 그 자손 혹은 잠재적 자손까지도 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 어떤 변형이 돌연변이 혹은 환경적 영향 때문에 후속 세대에 일어날 수 있기 때문에 사실 상기 자손은 부모 세포와 동일하지는 않지만, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어의 범주 내에서 여전히 포함된다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 항원 단백질을 수득하는 것을 포함하는 항원 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 태그-결합 레진을 이용한 크로마토그라피에 의한 정제공정을 더 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 단백질, 항원 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 및 표지물질을 포함하는, 한탄바이러스 진단용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 항원 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 표지물질은 육안 또는 형광을 통하여 확인 가능한 재질이라면 제한되지 않으나, 예를 들어 형광물질, 금, 컬러 유리, 및 플라스틱 비드 형광물질, 효소, 효소 반응 또는 비효소 반응에 사용되는 발색기질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 발색체는 상기 예시된 것에 한정되지 아니하고 육안 또는 형광을 통하여 확인 가능한 다른 재질로 대체 가능하다. 상기 표지물질의 발색에 의해 생물학적 샘플로부터 본 발명의 한탄바이러스 특이적 항원 단백질과 반응하는 항체의 존재 여부를 검출할 수 있다.

상기 효소 반응에 사용되는 발색기질은 DAB(diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbasole), BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium), pNPP(para-Nitrophenyl phosphate), 나프톨 AS-TR 포스페이트(naphthol AS-TR phosphate), BCIP/INT(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/iodonitrotetrazolium), NF(New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), 페닐렌다이아민(phenylenediamine), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetra methylbenzidine), 다이아니시딘(dianisidine), 아미노-살리실릭산(amino-salicylic acid), 3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine), 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole), 4-클로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphthol), TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(ophenylenediamine)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 발색유도물질은 발색효소이며, HRP(Horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose Oxidase), 루시퍼라아제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase) 및 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 비효소 반응에 사용되는 발색기질은 아이오딘(iodine), 칼슘(calcium), 구리(copper), 철(iron), 아미노산(amino acid) 및 크레아틴(creatinine)으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 발색유도물질은 전분(starch), o-크레졸프탈레인 콤플렉손(o-cresolphthalein complexone), 바소큐프로인 디설포네이트(bathocuproin disulfonate), 바소페난트롤린 디설포네이트(bathophenanthroline disulfonate), 닌히드린(ninhydrin), o-프탈알데히드(o-phthalaldehyde: OPA) 및 피크레이트(picrate)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

발색기질은 상기 예시된 것에 한정되지 아니하고, 육안 또는 형광을 통하여 확인 가능한 다른 재질로 대체 가능하다.

일 측면에서, 본 발명은 IgM 항체 또는 이의 단편이 고정된 기판; 개체로부터 분리된 생물학적 시료 주입부; 본 발명의 항원 단백질; 및 상기 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편, 및 표지물질을 포함하는, 시료 내 한탄바이러스 항체를 검출하기 위한 진단 키트에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 키트는 IgM 항체 또는 이의 단편이 고정된 기판; 대상으로부터 분리된 생물학적 시료 주입부; 및 본 발명의 항원 단백질, 상기 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편, 및 표지물질을 동시에 또는 개별적으로 포함하는 패드를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 생물학적 시료는 혈청, 혈장 또는 전혈일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 키트는 스트립, ELISA 플레이트, 딥-스틱디바이스, 방사 분할 면역검정 디바이스, 또는 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 형태의 키트일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 키트는 한탄바이러스의 IgM를 검출할 수 있으며, MAC-ELISA(IgM antibody capture-ELISA) 분석 방법으로 검출될 수 있다.

일 구현예에서, 생물학적 시료 주입부는 한탄바이러스 감염이 의심되는 대상/개체로부터 분리된 생물학적 시료 예를 들어, 혈액이 투입되는 부분으로, 혈구 분리가 되고 기판 또는 멤브레인으로 이동하여 이에 고정된 항-인간 IgM 항체와 반응할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 혈구가 분리된 혈액은 액상 형태로 시료 주입부의 아래 방향에 위치한 패드로 이동할 수 있다. 상기 패드는 본 발명의 한탄바이러스 특이적 항원 펩타이드, 상기 항원 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 및 표지물질을 동시에 또는 개별적으로 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명의 키트는 진단키트 내 샘플의 전달을 원활하게 하고 항원-항체를 반응시키기 위해 완충용액으로 전처리된 버퍼패드를 추가로 포함할 수 있으며, 패드와 연결되어 진단 키트의 말단에 위치할 수 있다. 상기 완충용액은 붕산염 완충용액, 트리스 완충용액 또는 인산염 완충용액일 수 있고, 경우에 따라서 Triton X-100, Tween 20, 카제인 등의 물질을 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 키트는 진단키트에 의한 결과를 교란시키지 않도록 하기 위해 과량의 샘플 또는 완충용액을 흡수하여 제거하는 흡수패드를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 진단키트는 생물학적 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 시약을 포함하는 용기 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다.

본 발명에서 상기 IgM는 한탄바이러스에 감염되어 면역반응을 통해 생성된 항체 IgM를 의미한다.

본 발명의 키트에는 상기 구성 성분들뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

경우에 따라서, 생물학적 시료 내 한탄바이러스에 대한 IgM 항체를 구별하여 검출하기 위하여, IgM 인간 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 마우스의 항체를 포함할 수 있다.

상기 생물학적 시료를 항-인간 IgM 항체와 반응시키고, 한탄바이러스 항원 (본 발명의 항원 단백질)-항체-표지물질 복합체와 추가적으로 반응시키면, 표지물질-항체-한탄바이러스 항원-생물학적 시료 내 한탄바이러스 특이적 항원과 반응하는 IgM 항체-항-인간 IgM 항체의 형태로 반응한다. 이러한 반응에 의해 발색이 형성되므로, 이를 통해 생물학적 시료 내 한탄바이러스에 대한 항체가 존재하는지 여부를 신속하게 확인할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 목적하는 대상으로부터 분리된 시료 내에서 제 1항의 항원 단백질과의 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정하는 단계; 및 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준을 정상 대조군 시료에서 제 1항의 항원 단백질과의 항원-항체 결합 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 한탄바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 항원-항체 복합체 형성 수준 측정은 방사상면역분석, 웨스턴 블롯, MAC-ELISA(IgM antibody capture-ELISA), ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석 방법을 통해 측정될 수 있으나, MAC-ELISA(IgM antibody capture-ELISA) 방법으로 측정되는 것이 가장 바람직하다.

일 구현예에서, 본 발명의 항원 단백질과 항원-항체 복합체를 형성하는 시료 내의 항체는 IgM일 수 있다.

일 구현예에서, 목적하는 대상으로부터 분리된 시료에서 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준이 정상 대조군 시료에서 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준보다 높은 경우, 한탄바이러스에 감염된 것으로 평가할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, '목적하는 대상'이란, 한탄바이러스 감염의 여부가 확실하지 않은 개체로, 감염 가능성이 높은 개체를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, '항원-항체 복합체'란, 본 발명에 따른 항원 단백질과 목적하는 대상 내에 존재하는 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성 수준은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 세기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

일 측면에서, 본 발명은 목적하는 대상으로부터 분리된 시료 내에서 본 발명의 항원 단백질과의 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정하는 단계; 및 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준을 정상 대조군 시료에서 제 1항의 항원 단백질과의 항원-항체 결합 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 신증후군출혈열(Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS) 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 항원 단백질과 항원-항체 복합체를 형성하는 시료 내의 항체는 IgM일 수 있으며, 상기 방법은 시료 내 한탄바이러스 IgM 항체를 검출함으로써 신증후군출혈열을 진단할 수 있다.

일 구현예에서, 항원-항체 복합체 형성 수준 측정은 MAC-ELISA(IgM antibody capture-ELISA) 분석 방법을 통해 측정될 수 있다.

일 구현예에서, 목적하는 대상으로부터 분리된 시료에서 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준이 정상 대조군 시료에서 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준보다 높은 경우, 신증후군출혈열인 것으로 평가할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 목적상, 진단은 한탄바이러스 감염 여부 또는 신증후군출혈열을 확인하는 것이다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 한탄바이러스의 절단형 뉴클레오캡시드 단백질 발현 및 정제

신증후군출혈열 양성 환자시료로부터 한탄바이러스의 전장 유전체 서열을 등록특허 10-1815105에 기재된 Multiplex PCR-based target enrichment 방법으로 확보하고, 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 (NP)의 1 내지 75의 아미노산을 포함하는 절단형 뉴클레오캡시드 단백질 PatrNP_Set-5 (서열번호 1)의 유전자 (서열번호 3) 및 한탄바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 1 내지 100의 아미노산을 포함하는 절단형 뉴클레오캡시드 단백질 AatrNP_Set-4 (서열번호 2)의 유전자 (서열번호 4) (도 1)를 각각 pET28a 벡터에 클로닝한 뒤, 이를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하여 IPTG를 이용하여 발현을 유도하고 Ni-NTA 컬럼으로 정제하였다. 발현 및 정제한 절단형 뉴클레오캡시드 단백질 PatrNP_Set-5 및 AatrNP_Set-4를 SDS-PAGE 젤에 전기영동하고 쿠마시 브릴리언트 블루 염색하여 타겟 단백질의 발현을 확인한 결과, 각 SET들의 분자량에 상응하는 (AatrNP_SET-4: 16.1 kDa, PatrNP_SET-5: 13.3 kDa) 크기의 밴드들이 레인 7~13에 나타나는 것을 확인할 수 있었으며 (도 2), 이 분획들을 모아 1xPBS(pH7.5)에 투석 후 농축하여 정제액을 회수하였다. 또한, 정제된 단백질이 한탄바이러스 특이적 항원 단백질인지 확인하기 위해, 웨스턴 블롯(western blot) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 시료 3 μg을 15% SDS-PAGE에 전기영동 시켜, Immun-Blot PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. 상기 막은 5% 스킴밀크 TBST 용액으로 1시간 이상 블로킹(blocking)한 뒤, 4℃에서 밤새 5% 스킴밀크 TBST 용액에 1차 항체 설치류 혈청(Rodent serum) (1:32,000 희석) 또는 환자 혈청(Patient serum) (1:32,000 희석)을 넣고 교반하며 반응시켰다. 이 후, TBST로 세척하고 다시 HRP-conjugated 2차 항체와 상온에서 1시간 반응시켰다. TBST로 세척 후 ECL을 처리한 후 필름 현상을 한 결과, 절단형 뉴클레오캡시드 단백질 AatrNP_SET-4 및 PatrNP_SET-5는 한탄바이러스(HTN) 양성 설치류 혈청 및 신증후군출혈열(HFRS) 양성 환자 혈청에서만 특이적 항원 단백질로 작용한다는 것을 확인하였다 (도 2).

실시예 2. 검출 한도 확인

본 발명의 절단형 뉴클레오캡시드 단백질 PatrNP_Set-5 및 AatrNP_Set-4을 이용한 IgM-포획효소면역측정법 (IgM capture enzyme-linked immunosorbent assay, MAC-ELISA, 도 3) 분석 방법이 환자 혈청을 어느 정도 희석농도까지 선별할 수 있는지 확인하기 위해, 96웰 마이크로플레이트에 항-인간 IgM (Anti-Human IgM; capture antibody, Total Protein: 7.8 mg/mL; Antibody Protein: 3.5 mg/mL)을 PBS에 1:500으로 희석하여 4℃에서 밤새 코팅하였다. 0.1% Tween 20이 포함된 인산완충용액(PBST)으로 3회 세척한 후 5% 스킴밀크 PBST로 37 ℃에서 45분간 블로킹하였다. 0.1% PBST로 3회 세척 후 희석용액 (2.5% FBS,PBST)에 1차 항체인 신증후군출혈열(HFRS) 양성 환자 혈청과 정상인 혈청(Test Specimen Sera)을 희석용액 (2.5% FBS,PBST)에 2⁷ ~ 2¹⁶까지 단계 희석(serial dilution)하여 37℃에서 45분간 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척 후 본 발명의 절단형 뉴클레오캡시드 단백질 PatrNP_Set-5 및 AatrNP_Set-4 (viral antigens)를 1 μg/well이 되도록 각각 희석용액 (2.5% FBS,PBST)에 희석하여 37℃에서 45분간 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척 후 2차 항체인 한탄바이러스 단일클론 항체를(Detector antibodies) 희석용액에 1:500으로 희석하여 37℃에서 45분간 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척 후 희석용액에 HRP-conjugate anti-mouse IgG를 1:5,000으로 희석한 후 37℃에서 45분간 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척하고 TMB 기질용액으로 발색시킨 후 ELISA 판독기로 파장 450nm에서 OD를 측정하였다. 그 결과, 2⁸ ~ 2¹²까지 단계 희석(serial dilution)한 범위에서 OD값이 직선범위 (Linear range)에 속하는 것을 확인하였고, 이 측정 범위 내에서 단일 희석배수를 희석의 편의성을 고려하여 2¹⁰으로 결정하였다 (도 4).

실시예 3. 민감도 및 특이도 확인

종래의 검출 방법인 면역형광반응법(IFA)를 이용하여 확인된 한탄바이러스 양성 및 음성 환자 혈청을 확보한 뒤, 본 발명의 절단형 뉴클레오캡시드 단백질 PatrNP_Set-5 및 AatrNP_Set-4을 이용한 IgM-포획효소면역측정법 (IgM capture enzyme-linked immunosorbent assay, MAC-ELISA, 도 3) 분석 방법이 환자 혈청을 어느 정도 희석농도까지 선별할 수 있는지 확인하기 위해, 96웰 마이크로플레이트에 항-인간 IgM (Anti-Human IgM; capture antibody, Total Protein: 7.8 mg/mL; Antibody Protein: 3.5 mg/mL)을 PBS에 1:500으로 희석하여 4℃에서 밤새 코팅하였다. 0.1% Tween 20이 포함된 인산완충용액(PBST)으로 3회 세척한 후 5% 스킴밀크 PBST로 37℃에서 45분간 블로킹하였다. 0.1% PBST로 3회 세척 후 희석용액 (2.5% FBS, PBST)에 1차 항체인 신증후군출혈열(HFRS) 양성 환자 혈청과 정상인 혈청 (Test Specimen Sera)을 1:1,024으로 희석해 37℃에서 45분간 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척 후 본 발명의 절단형 뉴클레오캡시드 단백질 PatrNP_Set-5 및 AatrNP_Set-4 (viral antigens)를 1 μg/well이 되도록 희석용액 (2.5% FBS,PBST)에 희석하여 37℃에서 45분간 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척 후 2차 항체인 한탄바이러스 단일클론 항체를(Detector antibodies) 희석용액에 1:500 및 1:2,000으로 희석하여 37℃에서 45분간 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척 후 희석용액에 HRP-conjugate anti-mouse IgG를 1:5,000으로 희석하여 37℃에서 45분간 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척 후 TMB 기질용액으로 발색시킨 뒤 ELISA 판독기로 파장 450nm에서의 OD값을 측정하였다. 이를 바탕으로 기존 IFA 방법 대비 양성 선별능력을 확인하고, One-way ANOVA test를 통해 수행한 ELISA 값에 대한 통계적 유의미를 판단하여 그래프로 표시한 결과, 1:500 및 1:2,000으로 희석한 결과에서 모두 p<0.001 의 높은 통계적 유의성을 나타내는 선별능을 나타냈다 (도 5). 또한, 본 결과를 토대로 수신자 조작특성 (Receiver Operating Characteristics, ROC) 그래프를 도출하여 ROC 커브를 확인한 결과, 모두 높은 민감도, 특이도 및 AUC 값을 가지는 것을 확인하였다 (도 6).

이를 통해, 본 발명의 한탄바이러스의 절단형 뉴클레오캡시드 단백질 PatrNP_Set-5 또는 AatrNP_Set-4는 한탄바이러스의 진단에 유용하게 이용될 수 있으며, 이를 MAC-ELISA 분석에 이용할 경우 한탄바이러스 양성 IgM의 유무를 진단할 수 있고, 특히, 과거 감염, 백신 접종 등에 의해서도 양성을 나타내 분자생물학적 진단을 통해 상호 보완적으로 결과를 확인해야 했던 기존의 진단 방법에 비해 간단하고 민감도 및 특이도가 현저히 향상된 진단 방법임을 알 수 있다.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> SEROLOGICAL DETECTION METHOD USING ANTIGEN OF HTNV <130> DP-2020-0421 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 74 <212> PRT <213> Hantaan virus <400> 1 Ala Thr Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly Gln 1 5 10 15 Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr Glu 20 25 30 Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Ala Leu Thr Asp Arg Glu Gly 35 40 45 Val Ala Val Ser Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln Leu 50 55 60 Ala Asp Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu 65 70 <210> 2 <211> 99 <212> PRT <213> Hantaan virus <400> 2 Ala Thr Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly Gln 1 5 10 15 Leu Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr Glu 20 25 30 Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Ala Leu Thr Asp Arg Glu Gly 35 40 45 Val Ala Val Ser Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln Leu 50 55 60 Ala Asp Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu Gln Asp Pro 65 70 75 80 Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg Ser Met Leu Ser 85 90 95 Tyr Gly Asn <210> 3 <211> 222 <212> DNA <213> Hantaan virus <400> 3 gcaactatgg aggaactaca gagggaaatc aatgcccacg agggtcaact tgtgatagcc 60 aggcagaagg tgagggatgc agaaaaacag tatgaaaagg atccggatga gttgaacaag 120 agagcattaa cagaccgaga gggtgttgca gtatctatcc aggcaaagat tgatgagtta 180 aagaggcagc tggcagatag gattgcaact gggaaaaacc tt 222 <210> 4 <211> 297 <212> DNA <213> Hantaan virus <400> 4 gcaactatgg aagaattaca gagggaaatc aatgcccatg agggtcaact tgtgatagcc 60 aggcagaagg taagggatgc agaaaaacag tatgaaaagg atccggatga gttgaacaag 120 agagcattaa cagaccgaga gggtgttgca gtatctatcc aggcaaagat tgatgagtta 180 aagaggcagc tggcagatag gattgcaact gggaaaaatc ttgggaagga acaagatcca 240 acaggggtag agcctggaga ccatctgaaa gaaagatcaa tgctcagtta tggtaat 297

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 한탄바이러스(Hantaan virus, HTNV) 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 항원 단백질.
제 1항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 한탄바이러스 절단형 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 항원 단백질.
제 1항의 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제 3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제 4항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제 5항의 숙주 세포를 배양하고, 항원 단백질을 수득하는 것을 포함하는 항원 단백질의 제조 방법.
제 1항의 항원 단백질, 항원 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 및 표지물질을 포함하는, 한탄바이러스 진단용 조성물.
제 7항에 있어서, 표지물질은 형광물질, 금, 컬러 유리, 및 플라스틱 비드 형광물질, 효소, 효소 반응 또는 비효소 반응에 사용되는 발색기질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 한탄바이러스 진단용 조성물.
a) IgM 항체 또는 이의 단편이 고정된 기판;
b) 개체로부터 분리된 생물학적 시료 주입부;
c) 제 1항의 항원 단백질; 및
d) 상기 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편, 및 표지물질을 포함하는, 시료 내 한탄바이러스 항체를 검출하기 위한 진단 키트.
제 9항에 있어서, 생물학적 시료는 혈청, 혈장 또는 전혈인, 시료 내 한탄바이러스 항체를 검출하기 위한 진단 키트.
제 9항에 있어서, 스트립, ELISA 플레이트, 딥-스틱디바이스, 방사 분할 면역검정 디바이스, 또는 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 형태인, 시료 내 한탄바이러스 항체를 검출하기 위한 진단 키트.
제 9항에 있어서, 한탄바이러스의 IgM를 검출하는, 시료 내 한탄바이러스 항체를 검출하기 위한 진단 키트.
제 9항에 있어서, 검출방법은 MAC-ELISA(IgM antibody capture-ELISA) 분석 방법인, 시료 내 한탄바이러스 항체를 검출하기 위한 진단 키트.
(a) 목적하는 대상으로부터 분리된 시료 내에서 제 1항의 항원 단백질과의 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준을 정상 대조군 시료에서 제 1항의 항원 단백질과의 항원-항체 결합 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 한탄바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 14항에 있어서, 항원-항체 복합체 형성 수준 측정은 방사상면역분석, 웨스턴 블롯, MAC-ELISA(IgM antibody capture-ELISA), ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석 방법을 통해 측정되는, 한탄바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 14항에 있어서, 항체는 IgM인, 한탄바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 14항에 있어서, (a) 단계에서 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준이 (b) 단계에서 측정된 정상 대조군 시료의 항원-항체 복합체 형성 수준보다 높은 경우, 한탄바이러스에 감염된 것으로 평가하는, 한탄바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
(a) 목적하는 대상으로부터 분리된 시료 내에서 제 1항의 항원 단백질과의 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준을 정상 대조군 시료에서 제 1항의 항원 단백질과의 항원-항체 결합 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 신증후군출혈열(Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS) 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 18항에 있어서, 시료 내 한탄바이러스 IgM 항체를 검출하는, 신증후군출혈열 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 18항에 있어서, 항원-항체 복합체 형성 수준 측정은 MAC-ELISA(IgM antibody capture-ELISA) 분석 방법을 통해 측정되는, 신증후군출혈열 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제 18항에 있어서, (a) 단계에서 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준이 (b) 단계에서 측정된 정상 대조군 시료의 항원-항체 복합체 형성 수준보다 높은 경우, 신증후군출혈열인 것으로 평가하는, 신증후군출혈열 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.