PT1888107E - Novas formulações de vacinas - Google Patents

Description

ΡΕ1888107 2 DESCRIÇÃO "NOVAS FORMULAÇÕES DE VACINAS"

Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica a prioridade para o Pedido dos E.U.A. com o N° de Série 11/107 000 apresentado em 15 de abril de 2005, cujos conteúdos são aqui expressamente incorporados aqui por referência.

Campo da Invenção A presente invenção diz respeito a emulsões de óleo em água, sua utilização como adjuvantes, e composições farmacêuticas, imunitárias ou de vacina compreendendo as mesmas.

Antecedentes da Invenção A utilização de adjuvantes nas vacinas é bem conhecida. Um adjuvante é um composto que, quando combinado com um imunogénio de vacina, aumenta a resposta imunitária ao imunogénio da vacina. Entre as estratégias que promovem a imunogenicidade de uma proteina, glicoproteina ou péptido estão aquelas que emulsionam imunogénios de vacina. (Nossal, in Paulo (Ed.), Fundamental Immunology, Lippincott-Raven Publishers, Filadélfia, PA, 1999; Vogel e 3 ΡΕ1888107

Powell, in Powell e Newman (Eds.), Vacine Design. The Subunit and Adjuvant Approach, Plenum Press, NI, NI, 1995, p 141). Devido ao papel essencial que os adjuvantes desempenham na melhoria da imunogenicidade de imunogénios de vacinas, o uso de adjuvantes na formulação de vacinas tem sido virtualmente ubiqua (Nossal, supra, 1999/ Vogel e Powell, supra, 1995; cujos ensinamentos são aqui incorporadas por referência). Os adjuvantes convencionais, bem conhecidos na técnica, são de natureza diversa. Eles podem, por exemplo, consistir de sais inorgânicos insolúveis em água, lipossomas, micelas ou emulsões, ou seja Adjuvantes de Freund. Outros adjuvantes podem ser encontrados em Vogel e Powell, supra mencionado, 1995. Embora não haja nenhum mecanismo único de acção de adjuvante, uma caraterística essencial é a sua capacidade para aumentar significativamente a resposta imunitária a um imunogénio de vacina, quando em comparação com a resposta induzida pelo imunogénio da vacina sozinho (Nossal, supra, 1999; Vogel e Powell, supra, 1995) . A este respeito, alguns adjuvantes são mais eficazes em aumentar as respostas imunitárias humorais; outros adjuvantes são mais eficazes em aumentar respostas mediadas por células imunitárias (Vogel e Powell, supra, 1995), e ainda um outro grupo de adjuvantes aumenta ambas as respostas imunitárias humorais e mediadas por células contra os antigénios da vacina (Vogel e Powell, supra, 1995).

Geralmente, as emulsões utilizados na formulação de vacina compreendem uma mistura de óleo, solução aquosa e 4 ΡΕ1888107 tensioativos. Algumas emulsões incorporam um agente tensio-ativo lipofílico tal como Span 80® e um agente tensioativo hidrofílico tal como Tween 80®. Estas emulsões podem também conter compostos tais como lecitina ou saponina conhecidos por terem propriedades tensioativas iónicas. WO 2005/009462 revela emulsões de óleo em água que compreendem uma solução aquosa contendo um imunogénio, um agente tensioativo lipofilico não iónico (tal como Span 85) , um óleo mineral (tal como parafina) e um álcool gordo etoxilado hidrofilico não iónico (tal como Brij 96).

No entanto, os problemas de estabilidade podem ser observados com emulsões utilizadas como adjuvantes de vacinas, em particular durante o armazenamento ou o transporte. Atividades enzimáticas de lipase ou esterase presentes na solução ou suspensão de imunogénio podem hidrolisar os agentes tensioativos da emulsão um 2Xmch leva a uma falta de estabilidade do adjuvante. As lipases ou esterases podem vir por exemplo da cultura celular usada para cultivar virus ou de bactérias. Isto é particularmente verdadeiro quando estas composições contêm imunogénios concentradas, especialmente imunogénios concentrados não purificados. Tipicamente, este é o caso com adjuvantes utilizados em vacinas inativadas (mortas). Este problema é ainda mais significativo com composições de vacinas multivalentes porque os imunogénios estão mais concentrados no mesmo volume de diluente. 5 ΡΕ1888107

Um outro problema com o uso de adjuvante está ligado a um risco de efeitos adversos tais como a toxicidade ou a inflamação local no local da injecção. Por exemplo, uma resposta inflamatória local e/ou granulomas podem resultar após a injecção. De maneira a limitar uma tal reação adversa, os agentes tensioativos e outros componentes na emulsão podem ser reduzidos; no entanto, a redução pode em seguida resultar, numa diminuição na estabilidade da composição de vacina. Existe, por conseguinte, uma necessidade de novos adjuvantes e composições de vacina contendo tais adjuvantes com maior segurança e estabilidade . A citação ou identificação de qualquer documento neste pedido não é uma admissão de que tal documento está disponível como técnica anterior à presente invenção.

Sumário da Invenção

Numa primeira incorporação, a presente invenção proporciona uma nova emulsão de óleo em água (0/A), com uma maior estabilidade na presença de suspensões de bactérias, parasitas ou virus, especialmente aquelas concentradas e não purificadas ou fracamente purificadas.

Uma outra incorporação da presente invenção proporciona uma emulsão de 0/A estável, segura e facilmente administrável, em particular injectável, atuando como um veiculo para a entrega de uma composição farmacêutica 6 ΡΕ1888107 compreendendo pelo menos um ingrediente ativo que pode ser, mais particularmente, um imunogénio.

Ainda uma outra incorporação da presente invenção proporciona uma emulsão de 0/A estável, segura e injectável atuando como um adjuvante para aumentar a resposta imunitária induzida por um imunogénio. Em particular, a presente invenção proporciona um novo adjuvante que, quando utilizado numa composição de vacina contendo um imunogénio, aumenta a resposta imunitária celular do vacinado, a resposta imunitária humoral ou, vantajosamente, ambas, ao imunogénio.

Ainda uma outra incorporação da presente invenção proporciona uma composição ou vacina compreendendo uma emulsão de 0/A estável, segura e imunogénica.

Uma incorporação adicional da presente invenção proporciona um método de fazer uma composição de vacina utilizando o adjuvante da presente invenção, a composição de vacina assim obtida, e métodos de utilização dos mesmos.

Ainda uma outra incorporação da presente invenção proporciona um kit compreendendo um imunogénio ou outro produto farmacêutico num primeiro frasco, e um adjuvante feito de acordo com a presente invenção num segundo frasco, com o adjuvante concebido para ser misturado com o imunogénio ou outro produto de vacina antes da utilização. 7 ΡΕ1888107

Numa incorporação, a presente invenção proporciona uma emulsão de óleo em água (0/A) que pode compreender: (1) uma solução aquosa contendo um imunogénio; (2) um óleo mineral; (3) um álcool gordo etoxilado lipofílico não iónico; (4) um agente tensioativo hidrofílico não iónico que é um álcool gordo etoxilado

As emulsões feitas de acordo com a presente invenção baseiam-se numa combinação de pelo menos dois agentes tensioativos escolhidos entre os membros de dois grupos diferentes de agentes tensioativos (agentes tensioativos lipofilicos e hidrofilicos) , e é possível utilizar um ou mais agentes tensioativos pertencentes a cada grupo.

Ainda noutra incorporação vantajosa, a presente invenção proporciona uma composição de vacina compreendendo uma emulsão nova que pode conter pelo menos um imunogénio adequado para eliciar uma resposta imunitária num vacinado. A invenção proporciona ainda composições tais, em que a emulsão atua como um adjuvante para aumentar a resposta imunitária induzida pelo imunogénio, em particular, para aumentar a resposta celular, a resposta humoral ou, vantajosamente, ambas.

Numa incorporação vantajosa, o antigénio ou imunogénio é, ou é derivado de, Mycoplasma, vantajosamente Mycoplasma hyopneumoniae, circovírus suíno, vantajosamente 8 ΡΕ1888107 circovírus suíno 2, ou Helicobacter, vantajosamente Helicobacter cerdo ou Helicobacter pylori.

Numa outra incorporação vantajosa, a presente invenção proporciona um método de fazer uma composição de vacina em que um imunogénio, especialmente um imunogénio em forma liofilizada ou numa solução aquosa, é misturado com o adjuvante de acordo com a presente invenção. 0 imunogénio pode ser seleccionado a partir do grupo constituído por: patogénios inativados, patogénios atenuados, antigénios subunidades, vectores de expressão recombinantes incluindo plasmídios, e semelhantes. 0 patogénio pode ser de origem bacteriana, virai, protozoária, parasítica ou fúngica ou o imunogénio pode ser um toxoide.

Numa outra incorporação vantajosa, a presente invenção proporciona um método de induzir uma resposta imunitária num vacinado contra um patogénio compreendendo a administração da composição de vacina da presente invenção ao vacinado.

Numa outra incorporação vantajosa, a presente invenção proporciona kits que compreendem pelo menos dois frascos, num primeiro frasco um imunogénio, especialmente um imunogénio na forma liofilizada ou em solução num meio aquoso, e num segundo frasco um adjuvante ou uma emulsão de acordo com a presente invenção.

Note-se que nesta divulgação e particularmente 9 ΡΕ1888107 nas reivindicações, termos tais como "compreende", "constituído", "compreendendo" e semelhantes podem ter o significado atribuído a tais termos na lei da Patente dos EUA; e.g., eles podem significar "inclui", "incluído", "incluindo" e semelhantes; e que termos tais como "consistindo essencialmente de", "consiste essencialmente em" ou "é constituído essencialmente por" têm o significado que lhes é atribuído pela lei da Patente dos EUA, e.g., eles permitem elementos não explicitamente recitados, mas excluem elementos que são encontrados na técnica anterior ou que afectam uma caraterística básica ou nova da invenção.

Estas e outras incorporações são reveladas ou são óbvias a partir de e englobadas pela seguinte Descrição Detalhada.

Descrição Detalhada

Por conveniência, certos termos empregues na especificação, exemplos e parágrafos apensos e nas reivindicações são aqui recolhidos.

Conforme aqui utilizado, o termo "animal" abrange todos os animais vertebrados, incluindo seres humanos. Ele também inclui um animal individual em todas as fases de desenvolvimento, incluindo as fases embrionárias e fetal. Em particular, o termo "animal vertebrado" inclui, mas sem constituir limitação, humanos, caninos (e.g., cães), 10 ΡΕ1888107 felinos (e.g., gatos); equinos (e.g., cavalos), bovinos (e.g., vacas), porcinos (e.g., porcos) ovinos (e.g., ovelhas), caprinos (e.g., cabras), coelhos, bem como aves. O termo "ave" conforme aqui utilizado refere-se a qualquer espécie ou subespécie da classe taxonómica Aves, tais como, mas sem constituir limitação, galinhas (reprodutores, para assar na grelha e poedeiras), perus, patos, um ganso, uma codorniz, faisões, papagaios, tentilhões, falcões, corvos e ratites incluindo avestruz, emu e casuar.

Conforme aqui utilizado, o termo "porco" , "suíno" ou "leitão" pertence a um animal de origem porcina, enquanto "porca" se refere a uma fêmea de idade e capacidade reprodutiva.

Conforme aqui utilizado, o termo "virulento" refere-se a um isolado que retém a sua capacidade de ser infecioso num animal hospedeiro.

Conforme aqui utilizado, o termo "vacina inativada" abrange uma composição de vacina contendo um organismo infecioso ou um patogénio que já não é capaz de replicação ou de crescimento. O patogénio pode ser de origem bacteriana, virai, protozoária, parasítica ou fúngica. A inativação pode ser realizada por uma variedade de métodos, incluindo pressão elevada, tratamento quimico (por exemplo, o tratamento com timerosal ou formalina), sujeição a ultra-sons, radiação, calor ou quaisquer outros meios convencionais suficientes para impedir a replicação 11 ΡΕ1888107 ou crescimento do organismo, mas mantendo a sua imuno-genicidade.

Conforme aqui utilizado, o termo "imunogeni-cidade" significa capaz de produzir uma resposta imunitária num animal hospedeiro contra um imunogénio ou imunogénios. Esta resposta imunitária constitui a base da imunidade protectora eliciada por uma vacina contra um organismo infecioso especifico.

Conforme aqui utilizado, o termo "resposta imunitária" refere-se a uma resposta eliciada num animal. Uma resposta imunitária pode referir-se a imunidade celular (CMI), imunidade humoral ou pode envolver ambas. A presente invenção também contempla uma resposta limitada a uma parte do sistema imunitário. Por exemplo, uma composição de vacina da presente invenção pode induzir especificamente uma resposta do interferão gama aumentada.

Conforme aqui utilizado, o termo "antigénio" ou "imunogénio" significa uma substância que induz uma resposta imunitária especifica num animal hospedeiro. 0 antigénio pode compreender um organismo completo, morto, atenuado ou vivo; uma subunidade ou porção de um organismo; um vetor recombinante contendo um inserto com propriedades imunogénicas; um pedaço ou um fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imunitária na apresentação de um animal hospedeiro; uma proteína, uma glicoproteína, uma lipoproteína, um polipéptido, um péptido, um epitopo, um 12 ΡΕ1888107 hapteno, ou qualquer combinação destes. Alternativamente, o imunogénio ou antigénio pode compreender uma toxina ou antitoxina.

Conforme aqui utilizado, o termo "multivalente" significa quer uma vacina contendo mais do que um antigénio ou provenientes da mesma espécie (e.g., isolados diferentes de Mycoplasma hyopneumoniae), ou provenientes de uma espécie diferente (e.g., isolados de ambas Pasteurella hemo-lytica e Pasteurella multocida), quer uma vacina contendo uma combinação de antigénios de géneros diferentes (por exemplo, uma vacina compreendendo antigénios de Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus e Clostridium) .

Conforme aqui utilizado, o termo "adjuvante" significa uma substância adicionada a uma vacina para aumentar a imunogenicidade da vacina. 0 mecanismo de como um adjuvante opera é fracamente compreendido. Acredita-se que alguns adjuvantes aumentam a resposta imunitária ao liberar lentamente o antigénio, enquanto outros adjuvantes podem mediar os seus efeitos por qualquer um dos seguintes mecanismos: aumentando a infiltração celular, inflamação e tráfico no sitio da injecção, particularmente para células apresentadoras de antigénio (APC); promovendo o estado de ativação de APCs por sobrerregulação de sinais coestimu-latórios ou expressão do complexo maior de histocompati-bilidade (MHC); aumento da apresentação de antigénio; ou indução da liberação de citocina por efeito indireto. 0 13 ΡΕ1888107 adjuvante mais apropriado para um dado imunogénio da vacina dependerá em grande medida do tipo de resposta imunitária que é necessário para a imunidade protectora. A selecção do adjuvante pode ser um tanto empírica. Adjuvantes de vacinas conhecidos incluem, mas sem constituir limitação, emulsões de água em óleo (por exemplo, adjuvante de Freund completo e adjuvante de Freund incompleto) , em particular emulsões de óleo em água, emulsões de água em óleo, de água em óleo em água. Eles incluem também por exemplo saponina, hidróxido de alumínio, sulfato de dextrano, carbómero, alginato de sódio, "AVRIDINE" (N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil)-propanodiamina), óleo de parafina, dipéptido de muramilo, lípidos catiónicos (por exemplo, DMRIE, DOPE e suas combinações) e semelhantes.

Conforme aqui utilizados, os termos "agente de suporte farmaceuticamente aceitável" e "veículo farmaceuti-camente aceitável" são intermutáveis e referem-se a um veículo fluido para a contenção de imunogénios de vacinas que podem ser injectadas num hospedeiro sem efeitos adversos significativos. Os agentes de suporte farmaceuti-camente aceitáveis adequados conhecidos na técnica incluem, mas sem constituir limitação, água estéril, salina, glucose, ou soluções tamponadas. Os agentes de suporte podem incluir agentes auxiliares, incluindo, mas sem constituir limitação, diluentes, estabilizadores (isto é, açúcares e aminoácidos), conservantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes, agentes tamponantes de pH, aditivos aumentadores de viscosidade, corantes e semelhantes. Os 14 ΡΕ1888107 agentes de suporte ou veículos ou excipientes farmaceutica-mente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos de um perito na técnica. Por exemplo, um agente de suporte ou veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma solução 0,9% de NaCl (por exemplo, salina) ou um tampão de fosfato. As doses e os volumes de dose são aqui discutidos na descrição geral e podem também ser determinadas pelo perito na técnica a partir desta revelação, em conjugação com o conhecimento na técnica, sem qualquer experimentação indevida.

Conforme aqui utilizado, o termo "composição de vacina" inclui, pelo menos, um antigénio ou imunogénio num veículo farmaceuticamente aceitável útil para induzir uma resposta imunitária num hospedeiro. As composições de vacina podem ser administradas em dosagens e por técnicas bem conhecidas dos peritos nas técnicas médicas ou veterinárias, tendo em consideração fatores tais como a idade, sexo, peso, espécies e condição do animal receptor, e da via de administração. A via de administração pode ser percutânea, através da administração em mucosas (e.g., oral, nasal, ocular) ou através de uma via parentérica (e.g. intradérmica, intramuscular, subcutânea). Para a administração parentérica do produto para o hospedeiro, pode ser usado quer uma seringa um com uma agulha quer um injector livre de agulha. As composições de vacina podem ser administradas isoladamente, ou podem ser coadministra-das ou sequencialmente administradas com outros tratamentos ou terapias. As formas de administração podem incluir 15 ΡΕ1888107 suspensões e preparações para administração parentérica, subcutânea, intradérmica ou intramuscular (e.g., administração injectável), tais como suspensões estéreis ou emulsões. As composições de vacina podem ser administradas na forma de um spray ou misturadas em alimentos e/ou água ou entregues em mistura com um agente de suporte, diluente ou excipiente adequado tal como água estéril, salina fisiológica (ou soro fisiológico), glucose ou semelhante. As composições podem conter substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponan-tes de pH, adjuvantes, aditivos que reforçam a gelificação ou a viscosidade, conservantes, agentes aromatizantes, corantes e semelhantes, dependendo da via de administração e da preparação desejada. Textos farmacêuticos padrão, tais como "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1990, podem ser consultados para preparar preparações adequadas, sem experimentação indevida. A presente invenção proporciona numa incorporação um novo adjuvante ou emulsão de óleo em água (O/A) que pode compreender: (1) uma solução aquosa contendo um antigénio ou imunogénio de vacina capaz de induzir uma resposta imunitária num hospedeiro; (2) um álcool gordo etoxilado lipofílico não iónico; (3) um óleo mineral; um agente tensioativo hidrofilico não iónico que é um álcool gordo etoxilado. (4) 16 ΡΕ1888107

As emulsões feitas de acordo com a presente invenção baseiam-se numa combinação de pelo menos dois agentes tensioativos escolhidos de entre os membros de dois grupos diferentes de agentes tensioativos (agentes tensioativos lipofilicos e hidrofilicos) , e é possivel utilizar um ou mais tensioativos pertencentes a cada grupo.

Um álcool gordo etoxilado lipofilico pode ser um álcool gordo etoxilado o qual pode compreender cerca de 43% da massa molecular (m/m) ou menos de óxido de etileno (OE).

Um álcool gordo etoxilado hidrofilico pode ser um álcool gordo etoxilado compreendendo mais do que cerca de 43% (m/m) de óxido de etileno (OE).

Para os agentes tensioativos hidrofilicos não iónicos o álcool gordo pode ser um álcool gordo Cg a C22 e vantajosamente seleccionado de entre o grupo constituído por um álcool oleilico, cetilico, estearilico, isostearili-co, laurilico, e suas combinações, vantajosamente um álcool oleilico e mais vantajosamente um álcool oleilico com 5 a 21 OE. 0 grupo de agentes tensioativos hidrofilicos não iónicos inclui os álcoois gordos etoxilados: Brij®76 [Steareth-10], Brij®56 [Ceteth-10], Brij®96/97 [Oleth-10], Brij®98 [Oleth-20], Brij®721 [Steareth-21], Brij®58 [Ceteth-20], Brij®35 [Laureth-23], Brij®78 [Steareth-20], (Uniqema) 17 ΡΕ1888107

Volpo®N5 [Oleth-5], Volpo®CS6 [Ceteareth-6] , Volpo®CS12 [Ceteareth-12], Volpo®CS20 [Ceteareth-20], Volpo®CS25 [Ceteareth-25], Volpo®CS23 [Ceteareth-23] (Croda), BL9-EX [Laureth-9], BC-7 [Ceteth-7], BT-5 [C12-14 Pareth-5], BT-7 [C12-14-Pareth 7], BT-9 [C12-14 Pareth-9], BT-12 [C12-14

Pareth-12], BD-10 [C12-15 Pareth-10], B0-7V [Oleth-7], BC5.5 [Ceteht-6], BL-21 [Laureth-21], BL-25 [Laureth-25], BC-15TX [Ceteth-15], BC-23 [Ceteth-23], BC-25TX [Ceteth- 25], B0-15V [01eth-15], BO-50V [Oleth-50], BB-20 [Beheneth-20] (Nikko Chemicals), e suas combinações.

Para os agentes tensioativos lipofílicos não iónicos, o álcool gordo é um álcool gordo C9 a C22 e vantajosamente seleccionado de entre o grupo constituído por álcool oleílico, cetílico, estearílico, isostearílico, laurílico, e suas combinações, vantajosamente um álcool oleílico, mais vantajosamente um álcool oleílico etoxilado com 1 a 4 OE. O grupo de tensioativos lipofílicos não iónicos inclui os álcoois gordos etoxilados: Brij®30 [Laureth-4], Brij®92/93 [Oleth-2], Brij®72 [Steareth-2], Brij®52 [Ceteth- 2] (Uniqema), Volpo®L3 [C12-13 Pareth-3], Volpo®N3 [Oleth- 3] , Volpo®L4 [C12-13 Pareth-4] (Croda), BS-4 [ Steareth-4], BD-2 [C12-15 Pareth-2], BD-4 [C12-15 Pareth-4], BT-3 [C12-14 Pareth-3] (Nikko Chemicals) e suas combinações.

Os agentes tensioativos da presente invenção podem ter álcool gordo de origem animal ou vegetal. A 18 ΡΕ1888107 mudança de uma origem para a outra pode ser feita simplesmente apenas com ajuste menor na formulação da emulsão.

Uma emulsão de acordo com a invenção pode ter uma concentração global de tensioativos, numa base ponderai por volume de emulsão, de cerca de 0,2% a cerca de 6,5%, em particular desde cerca de 1% a cerca de 6%, vantajosamente desde cerca de 1,5% a cerca de 5%, mais vantajosamente desde cerca de 2% a cerca de 3%.

Tais emulsões têm uma baixa viscosidade e são facilmente injectáveis.

Numa incorporação vantajosa, a presente invenção proporciona uma emulsão de óleo em água (O/A) que pode compreender: (1) uma solução aquosa contendo um antigénio ou imunogénio de vacina capaz de induzir uma resposta imunitária num hospedeiro; (2) um álcool gordo etoxilado lipofílico não iónico; (3) um óleo mineral; (4) um álcool gordo etoxilado hidrofilico não iónico compreendendo mais do que cerca de 43% e menos do que cerca de 71% (m/m) de óxido de etileno; (5) um álcool gordo etoxilado hidrofilico não iónico compreendendo cerca de 71% ou mais (m/m) de óxido de etileno. 19 ΡΕ1888107 0 álcool gordo etoxilado compreendendo mais do que cerca de 43% e menos do que cerca de 71% (m/m) de óxido de etileno é vantajosamente um álcool oleílico etoxilado com 5 a 14 OE. 0 álcool gordo compreendendo cerca de 71% ou mais (m/m) de óxido de etileno é vantajosamente um álcool oleilico etoxilado com 15 OE ou mais.

Nesta incorporação vantajosa, a concentração de álcool gordo etoxilado hidrofilico não iónico é geralmente de cerca de 1,0% a cerca de 5,0%, em particular desde cerca de 1,5% a cerca de 4,5%, mais vantajosamente desde cerca de 2,0% a cerca de 3,5%, expresso como uma percentagem em massa por volume de emulsão (m/v) . Para o álcool gordo etoxilado altamente hidrofilico não iónico a concentração é geralmente desde cerca de 0,01% a cerca de 3,0%, particularmente desde cerca de 0,05% a cerca de 2,5%, mais vantajosamente desde cerca de 0,1% a cerca de 2,0% (m/v). A concentração do álcool gordo etoxilado lipofílico não iónico é geralmente desde cerca de 0,1% a cerca de 2,5%, em particular desde cerca de 0,2% a cerca de 2,0%, vantajosamente desde cerca de 0,2% a cerca de 1,5%, mais vantajosamente desde cerca de 0,2% a cerca de 1,2% (m/v).

Numa forma de realização vantajosa, a presente invenção prevê uma emulsão de óleo em água (O/A) que pode compreender: (1) uma solução aquosa contendo um antigénio ou imunogénio de vacina capaz de induzir uma resposta imunitária num hospedeiro; 20 ΡΕ1888107 (2) um álcool gordo etoxilado lipofílico não iónico; (3) um óleo mineral; (4) um álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico; (5) um copolimero de bloco polioxipropileno-polioxietileno hidrofílico não iónico. O álcool gordo etoxilado hidrofílico é vantajosamente um álcool gordo que compreende mais do que cerca de 43% e menos do que cerca de 71% (m/m) de óxido de etileno, e mais vantajosamente um álcool oleílico etoxilado com 5 a 14 OE. 0 copolimero de bloco POE-POP não iónico pode vantajosamente compreender 70% (m/m) ou mais de óxido de etileno.

Nesta incorporação vantajosa, a concentração de álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico é geralmente de cerca de 1,0% a cerca de 5,0%, em particular desde cerca de 1,5% a cerca de 4,5%, mais vantajosamente desde cerca de 2,0% a cerca de 3,5%, expresso como uma percentagem em massa por volume de emulsão (m/v) . Para o copolimero de bloco POE-POP não iónico a concentração é geralmente desde cerca de 0,01% a cerca de 2,0%, mais particularmente desde cerca de 0,1% a cerca de 1,5% (m/v). A concentração do álcool gordo etoxilado lipofílico não iónico é geralmente desde cerca de 0,1% a cerca de 2,5%, em particular desde cerca de 0,2% a cerca de 2,0%, vantajosamente de cerca de 0,2% a cerca de 1,5%, mais vantajosamente desde cerca de 0,2% até cerca de 1,2% (m/v). 21 ΡΕ1888107

Geralmente, a emulsão de acordo com a invenção pode ter uma temperatura de inversão de fase (TIF) , que é > 25 °C, em intervalos determinados a partir de cerca de 28 °C até cerca de 65 °C, mais particularmente desde cerca de 33 °C a cerca de 60 °C. A TIF é a temperatura à qual uma emulsão de água em óleo vira para uma emulsão de óleo em água ou desfaseia (quebra da emulsão e separação das 2 fases) . O valor TIF pode ser medido por vários meios, por exemplo por aparência visual ou por condutividade. A emulsão é colocada a uma temperatura abaixo da TIF da emulsão, por exemplo cerca de 25 °C em banho-maria. A temperatura é progressivamente aumentada. A mudança do aspecto visual da emulsão é observada em comparação com uma emulsão de controlo, nomeadamente a fluidez, a separação em duas fases, a alteração do aspecto da superfície devida à migração da fase oleosa para a superfície. A temperatura, para a qual esta mudança de aspecto visual foi observada, é o valor TIF da emulsão. Alternativamente, a TIF é determinada pela passagem rápida de um valor de condutividade de cerca de 5-15 miliSiemen/centímetro (mS/cm) (emulsão de óleo em água) para um valor de cerca de 0 mS/cm (emulsão de água em óleo), para salina fisiológica como fase aquosa, medido por uma sonda colocada na emulsão, perto da sua superfície. A temperatura, para a qual a transição foi observada, é o valor TIF da emulsão. Um vulgar perito na técnica será capaz de determinar as combinações de agentes tensioativos e óleo, incluindo as suas respectivas concentrações, a fim 22 ΡΕ1888107 de produzir emulsões de acordo com a invenção, e em particular emulsões que têm um valor TIF dentro dos intervalos definidos acima sem experimentação indevida.

Geralmente, as emulsões de acordo com a presente invenção podem conter, por volume por volume (v/v) de emulsão, desde cerca de 2% a cerca de 50% da fase de óleo, incluindo o ou os óleos e os agentes tensioativos, em particular desde cerca de 4% a cerca de 40%, vantajosamente de cerca de 8% a cerca de 35% e, mais vantajosamente, desde cerca de 15% até cerca de 30% da fase de óleo. Por definição, os intervalos de valores na presente especificação incluem sempre o limite do intervalo, a menos que indicado em contrário. O óleo usado pode ser um óleo mineral, incluindo, mas sem constituir limitação, óleo de parafina tal como óleo isoparafinico e/ou óleo nafténico, esqualano, esqualeno, pristano, poli-isobuteno, hidrogenados poli-isobuteno, polideceno, poli-isopreno, poli-isopropeno e semelhantes. Um óleo mineral vantajosa útil na presente invenção pode incluir um óleo compreendendo uma cadeia de carbono linear ou ramificada tendo um número de átomos de carbono superior a 15, vantajosamente de 15 a 32, e livre de compostos aromáticos. Tais óleos podem, por exemplo, ser os comercializados sob o nome Marcol®52 ou Marcol®82 (Esso) ou "DRAKEOL®6VR "(Penreco). O óleo pode também ser uma mistura de óleos 23 ΡΕ1888107 compreendendo pelo menos 2 óleos seleccionados de entre os óleos aqui descritos, e em qualquer proporção. A mistura de óleos também pode compreender pelo menos um óleo seleccionado entre os óleos acima descritos e pelo menos um óleo vegetal, e este óleo vegetal representa desde cerca de 0,1% a cerca de 33% da fase oleosa, vantajosamente desde cerca de 5% a cerca de 15 % v/v. Estes óleos vegetais são os óleos insaturados ricos em ácido oleico que são biodegradáveis e, vantajosamente, líquidos à temperatura de armazenamento (cerca de +4 graus Celsius) ou, pelo menos, tornam possível dar emulsões que são líquidos a esta temperatura. Por exemplo, o óleo vegetal pode ser óleo de amendoim, óleo de noz, óleo de girassol, óleo de açafroa, óleo de soja, óleo de prímula e semelhantes.

Geralmente, a presente invenção prevê o uso de uma solução aquosa compreendendo um veículo, excipiente ou diluente veterinária ou farmaceuticamente aceitável adequado, incluindo, mas sem constituir limitação, água estéril, salina fisiológica, glucose, tampão e semelhantes. O veículo, excipiente ou diluente também podem incluir polióis, glúcidos ou agentes de tamponamento de pH. O veículo, excipiente ou diluente pode, por exemplo, também compreender compostos aminoácidos, péptidos, antioxidantes, bactericidas, bacteriostáticos. A solução aquosa é adicionada ao óleo e aos agentes tensioativos em quantidade para se obter 100% do volume da emulsão de acordo com a invenção. A presente invenção contempla uma emulsão 24 ΡΕ1888107 compreendendo um óleo de parafina; um álcool oleílico etoxilado com 2-3 OE como agente tensioativo lipofílico não iónico; um álcool oleílico etoxilado com 5-6 OE como agente tensioativo hidrofílico não iónico; e um copolímero de bloco de POE-POP com aproximadamente 70 a 80% de OE e uma MM à volta de 9800-16000 como agente tensioativo hidrofílico não iónico. Em particular, o óleo de parafina é, a uma concentração desde cerca de 5% até cerca de 50% e vantajosamente desde cerca de 15% a cerca de 30% (v/v) ; o álcool oleílico etoxilado com 2-3 OE está, na concentração de 0,1% a 1,5%, vantajosamente de 0,1% a 1,2% (m/v) ; o álcool oleílico etoxilado com 5-6 OE está na concentração de 1 % a 5%, vantajosamente desde 1% a 4% (m/v); e o copolímero de bloco POE-POP com aproximadamente 70 a 80% de OE e uma MM à volta de 9800-16000 está na concentração desde 0,01% a 2%, vantajosamente desde 0,05% a 1,5% (m/v).

Numa segunda incorporação de acordo com a presente invenção, a emulsão compreende um óleo de parafina, um álcool oleílico etoxilado com 2-3 OE como agente tensioativo lipofílico não iónico; um álcool oleílico etoxilado com 10 OE como agente tensioativo hidrofílico não iónico, e um copolímero de bloco de POE-POP com aproximadamente 70 a 80% e de OE e uma MM à volta de 9800-16000 como agente tensioativo hidrofílico não iónico. Em particular, o óleo de parafina está numa concentração de 5% a 50%, vantajosamente de 15% a 30% (v/v); o álcool oleílico etoxilado com 2-3 OE está numa concentração de 0,2% a 3%, vantajosamente de 0,5% a 3% (m/v); o álcool 25 ΡΕ1888107 oleílico etoxilado com 10 OE está numa concentração de 0,2% a 3%, vantajosamente de 0,5% a 3% (m/v); e o copolímero de bloco POE-POP com aproximadamente 70 a 80% de OE e uma MM à volta de 9800-16000 está numa concentração de 0,01% a 2%, vantajosamente de 0,05% a 1,5% (m/v).

Numa terceira incorporação de acordo com a presente invenção, a emulsão compreende um óleo de parafina, um álcool oleílico etoxilado com 2-3 OE como lipofílico não iónico e um álcool oleílico etoxilado com 5-6 OE como agente tensioativo hidrofílico não iónico. Em particular, o óleo de parafina está numa concentração desde 5% a 50%, vantajosamente de 15% a 35% (v/v) ; o álcool oleílico etoxilado com 2-3 OE está numa concentração de 0,1% a 3%, vantajosamente de 0,5% a 2% (m/v); o álcool oleílico etoxilado com 5-6 OE está numa concentração de 1% a 5%, vantajosamente de 2,0% a 4,5% (m/v).

Facultativamente, outros compostos podem ser adicionados como coadjuvantes à emulsão, incluindo, mas sem constituir limitação, alumínio; oligonucleótidos CpG (ODN), em particular, ODN 2006, 2007, 2059, 2216 ou 2135 (R. A. Pontarollo et ai., Vet. Immunol. Immunopath, 84 (2002) 43-59; C. M. Wernette et ai., Vet. Immunol. Immunopath, 84 (2002) 223-236; G. Mutwiri et al., Vet. Immunol. Immunopath, 91 (2003) 89-103; M. Kerkmann et al., J. Immunol., 170 (2003) 4465-4474); polyA-polyU ("Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", editado por Michael F. Powell e Mark J. Newman, Pharmaceutical 26 ΡΕ1888107

Biotechnology, 6: 03); brometo de dimetildioctadecilamónio (DDA) ("Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach”, editado por Michael F. Powell e Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: 157), N,N-dioctadecil-N',N'-bis (2-hidroxietil)propanodiamina (tal como Avridine®) (Ibidem, p. 148), carbómero, quitosana (ver Patente dos EUA com o N° de Série 5 980 912 por exemplo). A presente invenção também fornece um método de fazer uma composição de vacina ou composição imunitária que compreende pelo menos um antigénio ou imunogénio e um adjuvante ou emulsão feita de acordo com a presente invenção. O imunogénio pode ser incorporado durante a formação da emulsão ou, numa incorporação alternativa, o imunogénio pode ser adicionado à emulsão mais tarde como, por exemplo, imediatamente antes de usar. A quantidade total da solução aquosa utilizada pode estar presente na emulsão produzida pela primeira vez. Ou pode ser apenas uma parte desta solução aquosa usada para formar a emulsão, e a quantidade restante de solução aquosa é adicionada com a incorporação do imunogénio. O imunogénio ou antigénio pode estar numa forma liofilizada ou presente em alguma outra forma sólida apropriada e em seguida misturada com a emulsão ou, alternativamente, o antigénio pode estar em solução, em particular numa solução aquosa, e esta solução misturada com a emulsão.

Os agentes tensioativos são vantajosamente 27 ΡΕ1888107 adicionados ou ao óleo ou à solução aquosa de acordo com a sua solubilidade. Por exemplo, os agentes tensioativos lipofilicos não iónicos são adicionados ao óleo de acordo com a invenção, enquanto os agentes tensioativos hidrofilicos não iónicos são adicionados à solução aquosa. A emulsificação pode ser preparada de acordo com métodos convencionais conhecidos de um perito vulgar na técnica. Por exemplo, numa incorporação da presente invenção, a emulsão pode ser preparada a uma temperatura abaixo da TIF da emulsão, em particular à temperatura ambiente, e.g. a cerca de 30 °C. A fase aquosa e a fase oleosa são misturadas em conjunto por uma agitação mecânica, e.g. com uma turbina equipada com um rotor--estator capaz de criar uma força de alto cisalhamento. Vantajosamente, a agitação começa a uma velocidade de rotação baixa e aumenta lentamente em relação à adição progressiva geralmente da solução aquosa no óleo. Vantajosamente a solução aquosa é progressivamente adicionada ao óleo. A proporção de óleo/solução aquosa pode ser adaptada para se obter uma emulsão de água em óleo (A/0) , por exemplo, a uma concentração de cerca de 40% a cerca de 55% de óleo (v/v). Quando a agitação é interrompida, a emulsão muda progressivamente para uma emulsão de 0/A, enquanto se arrefece até à temperatura ambiente (inversão de fase). Após a inversão e se necessário, a emulsão é diluída por adição de uma solução aquosa para se obter a concentração desejada de óleo na emulsão final. A emulsão pode ser armazenada a cerca de 5 °C. 28 ΡΕ1888107

Numa outra incorporação, a emulsão pode ser preparada a uma temperatura superior à TIF da emulsão. Num primeiro passo, a fase aquosa e a fase oleosa são misturadas em conjunto a uma temperatura superior à TIF da emulsão. Vantajosamente a solução aquosa é progressivamente adicionada ao óleo. A proporção de óleo/solução aquosa pode ser adaptada para se obter uma emulsão de água em óleo (A/0) , por exemplo a uma concentração de cerca de 40% a cerca de 55% de óleo (v/v). A emulsificação pode ser feita por uma agitação com baixa ou nenhuma força de cisalhamento, e.g. com um misturador estático ou uma hélice marinha (propulsor) ou com uma turbina a uma velocidade de rotação muito baixa. A emulsão obtida é uma emulsão de água em óleo (A/O) . Num segundo passo, a emulsão é arrefecida progressivamente abaixo da TIF. Durante este passo, a emulsão muda para uma emulsão O/A (inversão de fases). Após a inversão e se necessário, a emulsão é diluida pela adição de uma solução aquosa para se obter a concentração desejada de óleo na emulsão final. A emulsão pode ser armazenada a cerca de 5 °C. O tamanho das goticulas de óleo na emulsão pode ser de cerca de 100 nm até cerca de 500 nm. A emulsão pode ser utilizada, por exemplo, como um adjuvante para formular uma composição de vacina ou uma composição farmacêutica. A emulsão pode também ser usada como um solvente para dissolver um produto seco, especialmente um produto liofi-lizado contendo, por exemplo, microorganismos atenuados ou vetores recombinantes vivos. 29 ΡΕ1888107

Numa incorporação particular, uma pré-emulsão é produzida com apenas uma parte da solução aquosa. Esta pré-emulsão pode ser diluída por adição de uma suspensão de um ingrediente ativo tal como um fármaco ou um imunogénio, vantajosamente um imunogénio, para se obter a composição final. Alternativamente, a pré-emulsão pode ser diluída com uma solução aquosa e utilizada para dissolver um produto seco tal como um produto liofilizado. 0 imunogénio ou antigénio adequado para utilização na presente invenção pode ser seleccionado de entre o grupo constituído por patogénios inativados, patogénios atenuados, subunidades imunogénicas (e.g. proteínas, poli-péptidos, péptidos, epitopos, haptenos), ou vetores de expressão recombinantes, incluindo plasmídios tendo inserções imunogénicas. Numa incorporação da presente invenção, o imunogénio é um microorganismo inativado ou morto. Numa outra incorporação da invenção, a composição de vacina compreende um imunogénio seleccionado do grupo de patogénios aviários, incluindo, mas sem constituir limitação, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, vírus da bronquite infeciosa (VBI ou IBV), vírus da doença de Newcastle (VDN ou NDV) , vírus da síndrome da gota do ovo (EDS), ou vírus da doença bursal infeciosa (VDBI ou IBDV), vírus da influenza aviária, e semelhantes, e suas combinações.

Alternativamente, a composição de vacina compre- 30 ΡΕ1888107 ende um imunogénio seleccionado a partir de um patogénio de felino, tal como, mas sem constituir limitação, herpesvirus felino (HVF ou FHV), calicivirus felino (CVF ou FCV), virus da leucemia felina (VLFe ou FeLV), virus da imunode-ficiência felina (VIF ou FIV), virus da raiva, e semelhantes, e suas combinações.

Numa ainda outra incorporação, uma composição de vacina da presente invenção compreende um imunogénio seleccionado a partir de um patogénio canino, incluindo, mas sem constituir limitação, virus da raiva, herpesvirus canino (HVC ou CHV), parvovírus canino (PVC ou CPV), coronavirus canino, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorjeii, Bordetella bronchiseptica e semelhantes, e suas combinações.

Numa ainda outra incorporação da invenção, a composição compreende um imunogénio seleccionado a partir de um patogénio equino, tal como herpesvirus equino (tipo 1 ou tipo 4), vírus da influenza equina, tétano, vírus West Nile, e similares e/ou as suas combinações.

Numa ainda outra incorporação da invenção, a composição compreende um imunogénio seleccionado a partir de um patogénio de bovino, tais como vírus da raiva, rotavírus bovino, vírus da parainfluenza bovina do tipo 3 (VPIb-3 ou bPIV-3), coronavirus bovino, vírus da diarreia virai bovina (VDVB ou BVDV), vírus da febre aftosa (VFA ou FMDV), vírus sincicial respiratório bovino (VSRB ou BRSV), 31 ΡΕ1888107 vírus da rinotraqueíte infeciosa bovina (RIB ou IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica e semelhantes e suas combinações.

Numa ainda outra incorporação da presente invenção, a composição compreende um imunogénio seleccionado a partir de um patogénio porcino, tal como, mas sem constituir limitação, vírus da gripe suína (VGS ou SIV) , circovírus suíno tipo 2 (CVS-2 ou PCV-2), vírus da síndrome respiratória reprodutiva suína (SRRS ou PRRS), vírus da pseudo-raiva (VPR ou PRV), parvovírus suíno (PVS ou PPV) , VFA, vírus da cólera do porco (VCP ou HCV), Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrlx rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Helicobacter cerdo, Helicobacter pylori e semelhantes, e suas combinações.

Uma incorporação vantajosa da invenção proporciona composições de vacina compreendendo pelo menos um imunogénio e uma emulsão num veículo farmaceuticamente aceitável. Os vírus, bactérias, fungos e semelhantes compreendendo imunogénios podem ser produzidos por métodos de cultura in vitro utilizando meio de cultura apropriado ou linhas celulares hospedeiras e os métodos convencionais bem conhecidos dos vulgares peritos na técnica. Por exemplo, VSRRS podem ser cultivados numa linha celular apropriada, tal como a linha celular MA-104 (ver Patentes dos EUA com os Nos de Série 5 587 164, 5 866 401, 5 840 563, 6 251 404 entre outros) . De um modo semelhante, 32 ΡΕ1888107 CVS-2 pode ser cultivado usando a linha celular PK-15 (ver Patente dos EUA com o N° de Série 6 391 314); VIS pode ser cultivado em ovos (Patente dos EUA com o N° de Série 6 048 537); e Mycoplasma hyopneumoniae pode ser cultivado num meio de cultura apropriado (Patente dos EUA com o N° de Série 5 968 525, US 5 338 543; R. F. Ross et al., Art. Vet. J. Res., 45 (1984) 1899-1905).

Para obter um agente imunológico inativado, ou composição de vacina, o patogénio é vantajosamente inativado após a colheita e, facultativamente, submetido a clarificação por meio de um tratamento químico, utilizando, por exemplo, formaldeído, beta-propiolactona, etilenimina, etilenimina binária (EIB ou BEI), timerosal e semelhantes, e/ou um tratamento físico (e.g. um tratamento térmico ou sujeição a ultra-sons). Métodos para a inativação são bem conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o vírus da SRRS pode ser inativado por tratamento com beta-propio-actona (Plana-Duran et al., Vet. Microbiol., 55 (1997) 361--0) ou por tratamento com EIB (Patente dos EUA com o N° de Série 5 587 164); a inativação do vírus CVS-2 pode ser realizada utilizando o tratamento com etilenimina ou por tratamento com beta-propiolactona (Patente dos EUA com o N° de Série 6 391 314) ; o vírus da gripe suína pode ser inativado com um detergente como Triton, ou com tratamento com formaldeído (Patente dos EUA com o N° de Série 6 048 537); a bactéria Mycoplasma hyopneumoniae pode ser inativada por tratamento com formaldeído (R. F. Ross, supra), por tratamento com etilenimina ou tratamento com 33 ΡΕ1888107 EIB (ver WO 91/18627), ou por tratamento com timerosal (Patente dos EUA com Nos de Série 5 968 525 e 5 338 543) . 0 patogénio inativado pode ser concentrado por técnicas de concentração convencionais, em particular por ultrafiltração, e/ou purificado por meios convencionais de purificação, em particular, utilizando técnicas de croma-tografia, incluindo, mas sem constituir limitação, filtração gel, ultracentrifugação em gradiente de sacarose, ou precipitações seletivas, em particular, utilizando um polietilenoglicol (PEG).

Os imunogénios úteis em composições de vacina de acordo com a presente invenção também incluem vetores de expressão. Um "vetor" refere-se a um plasmídio ou virus de DNA ou RNA recombinante, e.g. poxvirus, adenovirus, herpesvirus, que compreende um polinucleótido heterólogo para ser entregue a uma célula alvo, quer in vitro quer in vivo. 0 polinucleótido heterólogo pode compreender uma sequência de interesse para propósitos de terapia, e podem facultativamente estar sob a forma de uma cassete de expressão. Conforme aqui utilizado, um vetor não precisa de ser capaz de replicação na célula-alvo final ou sujeito. 0 termo inclui vetores de clonagem para a tradução de uma sequência de codificação de polinucleótido. Também estão incluidos os vetores virais. 0 termo "recombinante" significa um polinucleótido de cDNA genómico, de origem semissintética ou sintética, 34 ΡΕ1888107 que ou não ocorre na natureza, ou está ligado a um outro polinucleótido num arranjo não encontrado na natureza.

De acordo com uma outra incorporação da invenção, os vetores de expressão são vetores de expressão utilizados para a expressão in vitro de proteínas num sistema celular apropriado. As proteínas expressas podem ser colhidas em ou a partir do sobrenadante da cultura após ou não após a secreção (se não houver secreção, uma lise celular ocorre tipicamente ou é realizada), facultativamente concentradas por métodos de concentração tais como ultrafiltração e/ou purificadas por meio de purificação, tais como afinidade, permuta iónica ou métodos de cromatografia do tipo filtração gel e formulados numa emulsão de acordo com a presente invenção. A presente invenção também engloba a formulação de composições imunitárias multivalentes ou composições de vacinas de combinação. Por exemplo, os antigénios úteis numa combinação de bacterina bovina feita de acordo com a presente invenção incluem, mas sem constituir limitação, Mycoplasma bovis, Pasteurella sp., particularmente P. mul-tocida e P. haemolytica, Haemophilus sp., particularmente H. somnus, Clostridium sp., Salmonella, Corynebacterium, Streptococcus, Staphylococcus, Moraxella, E. coli e semelhantes. A presente invenção proporciona ainda métodos para induzir uma resposta imunitária num hospedeiro, e.g., 35 ΡΕ1888107 um animal, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma composição imunitária ou uma composição de vacina de acordo com a invenção. As respostas imunitárias eliciadas desta maneira são notavelmente respostas imunes de anticorpo e/ou celulares e, em particular, uma resposta de interferão-gama.

Em particular, a presente invenção proporciona métodos para imunizar contra, ou para prevenir, ou para reduzir os sintomas provocados pela infecçao de um animal com um organismo patogénico (por exemplo, a infecção por um virus, bactéria, fungo, ou parasita protozoário). 0 método da presente invenção é útil em animais vertebrados, incluindo, mas sem constituir limitação, humanos, caninos (e.g., cães), felinos (e.g., gatos), equinos (e.g., cavalos), bovinos (e.g., vacas), ovinos (e.g., carneiros), caprinos (e.g., cabras), suinos (e.g., porcos) e coelhos, bem como em aves de aviário, incluindo, mas sem constituir limitação, galinhas, perus, patos, gansos, codornizes, faisões, papagaios, tentilhões, gaviões, corvos e ratites (avestruz, emu, casuar e semelhantes).

Num aspecto particular da invenção, estes métodos consistem na vacinação de fêmeas grávidas antes do parto pela administração de uma composição de vacina feita de acordo com a invenção. Estes métodos incluem ainda a indução de anticorpos protetores eliciados pelo protocolo de vacinação e a transferência destes anticorpos protetores a partir de fêmeas grávidas vacinadas à sua descendência. A 36 ΡΕ1888107 transferência de tais anticorpos maternos, protege subsequentemente a descendência imediata de doença. A dosagem da composição de vacina feita de acordo com a presente invenção dependerá da espécie, raça, idade, tamanho, história de vacinação e estado de saúde do animal a ser vacinado. Outros fatores como a concentração de antigénio, componentes de vacina adicionais, e via de administração (isto é, administração subcutânea, intradér-mica, oral ou intramuscular) também terão impacto na dosagem eficaz. A dosagem da vacina a administrar é facilmente determinável com base na concentração de antigénio da vacina, na via de administração, e na idade e condição do animal a ser vacinado. Alternativamente, ensaios de imunogenicidade metódicos de diferentes dosagens, assim como estudos da DL5o e outros procedimentos de rastreio podem ser utilizados para determinar a dosagem eficaz para uma composição de vacina de acordo com a

presente invenção sem experimentação indevida. A partir dos exemplos apresentados abaixo, será prontamente evidente qual a dosagem aproximada e qual o volume aproximado que serão adequados para a utilização da composição de vacina aqui descrita. 0 fator crítico é que a dosagem proporciona pelo menos um efeito protetor parcial contra infecção natural, conforme evidenciado por uma redução na mortalidade e morbilidade associadas com infecção natural. 0 volume apropriado é do mesmo modo facilmente verificado por um perito vulgar na técnica. Por exemplo, em espécies aviárias, o volume de uma dose pode ser de cerca de 0,1 mL 37 ΡΕ1888107 a cerca de 0,5 mL e, vantajosamente, desde cerca de 0,3 mL a cerca de 0,5 mL. Para as espécies de felinos, caninos e equinos, o volume de uma dose pode ser desde cerca de 0,2 mL a cerca de 3,0 mL, vantaj osamente desde cerca de 0,3 mL a cerca de 2,0 mL, e mais vantajosamente, desde cerca de 0,5 mL a cerca de 1,0 mL. Para espécies bovinas e porcinas, o volume da dose pode ser desde cerca de 0,2 mL até cerca de 5, 0 mL , vantajosamente desde cerca de 0,3 mL até cerca de 3,0 mL, e mais vantaj osamente desde 0,5 mL até cerca de 2,0 mL.

As vacinações repetidas podem ser vantajosas em intervalos de tempo periódicos para melhorar a resposta imunitária inicialmente ou quando um longo período de tempo tenha decorrido desde a última dose. Numa incorporação da presente invenção, a composição de vacina é administrada na forma de uma injecção parentérica (isto é, subcutânea, intradérmica ou intramuscular). A composição pode ser administrada como uma dose única ou, em incorporações alternativas, administrada em doses repetidas desde cerca de duas a cerca de cinco doses administradas em intervalos de cerca de duas a cerca de seis semanas, vantajosamente desde cerca de duas a cerca de cinco semanas. Contudo, um perito na técnica reconhecerá que o número de doses e o intervalo de tempo entre as vacinações depende de numerosos fatores incluindo, mas sem constituir limitação: a idade do animal vacinado; a condição do animal, em particular na presença de anticorpos maternos; a via de imunização; a quantidade de antigénio disponível por dose; e semelhantes. 38 ΡΕ1888107

Para a vacinação inicial, o periodo será geralmente mais de uma semana e vantajosamente estará entre cerca de duas a cerca de cinco semanas. Para os animais previamente vacinados, pode ser realizada uma vacinação de reforço, antes ou durante a gravidez, com cerca de um intervalo anual. A presente invenção também proporciona a administração de uma composição de vacina utilizando um injector livre de agulha tal como, mas sem constituir limitação, Pigjet®, Avijet®, Dermojet® ou Biojector® (Bioject, Oregon, EUA) . Uma pessoa com perícia vulgar na técnica é capaz de ajustar as especificações do injector conforme requerido no que diz respeito a fatores tais como a espécie do animal a ser vacinado, a idade e peso do animal, e outros semelhantes, sem experimentação indevida.

Numa incorporação da presente invenção, o método compreende uma única administração de uma composição de vacina formulada com uma emulsão de acordo com a invenção. Por exemplo, numa incorporação, a composição de vacina é uma vacina de Mycoplasma hyopneumoniae inativada, enquanto uma incorporação alternativa proporciona uma vacina compreendendo uma composição de vírus CVS2 inativado. Outras composições ou vacinas imunitárias são adequadas para utilização num regime de dose única incluindo, mas sem constituir limitação, vírus da SRRS e VGS inativados. A vacina pode ser administrada também em presença de anticorpos pré-existentes. 39 ΡΕ1888107 A invenção proporciona ainda métodos para tratar um hospedeiro, e.g., um animal, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma composição farmacêutica feita de acordo com a invenção e que compreende pelo menos um imunogénio seleccionado de entre o grupo constituído por proteinas ou péptidos, anticorpos, alergénios, CpG ODN, fatores de crescimento, citocinas, ou antibióticos, e em particular CpG ODN ou citocinas. Estas composições farmacêuticas podem ser utilizadas para melhorar o desempenho de crescimento num animal tal como um frango, um porco, ou uma vaca. A presente invenção diz ainda respeito a um estojo compreendendo um primeiro frasco contendo um ingrediente tal como um imunogénio ou composição farmacêutica e, num segundo frasco, uma emulsão feita de acordo com a presente invenção. 0 imunogénio pode estar numa forma liofilizada, uma forma seca ou em solução aquosa conforme aqui descrito. EXEMPLOS Exemplo 1 Método de Fabrico de Emulsão A emulsão é produzida em dois passos conforme descrito a seguir:

Primeiro Passo:

Um emulsificador Silverson de rotor-estator de 40 ΡΕ1888107 elevado cisalhamento (tipo L4RT com uma cabeça de desintegração com um diâmetro de 10 mm) foi utilizado para produzir as formulações. Para produzir uma emulsão, um volume de fase oleosa foi emulsionado a 35 °C com um volume de fase aquosa N° 1. A fase aquosa foi adicionada à fase oleosa, sob agitação, 5000 rpm (rotação por minuto) durante 1 minuto. A velocidade de rotação foi progressivamente aumentada com o aumento do volume para 8300 rpm durante 1 minuto. Durante este passo, a emulsão era uma emulsão de água em óleo. A emulsão LR4 final é uma emulsão de O/A contendo 20% de fase oleosa. Para a emulsão LR4, a composição das fases foi a seguinte:

Fase oleosa (72 mL): 1,8% m/v, 8,2% m/v, 87,5% v/v, 2,5% v/v 0,58% m/v, QS para 100,0% v/v - 01eth-2 (Brij® 92) - 01eth-5 (Volpo® N5) - Óleo de parafina (Marcol 82®) - Conservante

Fase aquosa N° 1 (108 mL): - Poloxâmero 407 (Lutrol® F127) - Tampão isotónico contendo fosfato de dissódio e monopotássio 0,02 M (pH 7,8)

Uma solução a 5% (m/v) de Lutrol® F127 no mesmo tampão que a vacina, por exemplo, em tampão isotónico contendo fosfato de dissódio e monopotássio 0,02 M (pH 7,8) foi utilizado para preparar a fase aquosa N° 1.

Quando a agitação parou, a emulsão mudou para uma 41 ΡΕ1888107 emulsão de óleo em água. A emulsão foi colocada numa câmara fria a 5 °C durante pelo menos 4 horas. Nesta fase, a emulsão foi um pré-emulsão contendo 40% de fase oleosa.

Segundo Passo: A fase aquosa N° 2 foi preparada com 180 mL de tampão isotónico de fosfato de dissódio e monopotássio 0,02 M pH 7,8 com o ou os imunogénios (imunogénio de Mycoplasma hyopneumoniae inativado, ou imunogénio de CVS-2, conforme descrito infra). A pré-emulsão conforme preparada no primeiro passo foi arrefecida até cerca de 5 °C, diluida por adição de igual volume da fase aquosa N° 2 à mesma temperatura, e misturou-se pela rotação de uma barra magnética durante 1 minuto. A concentração final do agente tensioativo na emulsão LR4 foi 2,18% (m/v) .

Tal como aqui preparadas, as vacinas de LR4 são estáveis durante pelo menos um ano a 5 °C.

Usando o mesmo método de preparação, outras emulsões podem ser obtidas conforme descrito a seguir: LR3 emulsão

Primeiro Passo: A emulsão LR3 final é uma emulsão de O/A contendo 33% de uma fase oleosa. 42 ΡΕ1888107

Fase oleosa (120 mL): 6,24% m/v, 2,7 6% m/v, 8 9, 50% v/v, 1,50% v/v 1,2 0% m/v, QS para 100,0% v/v - Oleth-2 (Brij ® 92) - Oleto-10 (Brij ® 96) - Óleo de parafina (Marcol 82®) - Conservante

Fase aquosa N° 1 (120 mL): - Poloxâmero 407 (Lutrol® F127) - Tampão isotónico contendo fosfato de dissódio e monopotássio 0,02 M (pH 7,8)

Uma solução a 5% (m/v) de Lutrol® F127 no mesmo tampão que a vacina, por exemplo, em tampão isotónico de fosfato de dissódio e monopotássio 0,02 M (pH 7,8) foi utilizada para preparar a fase aquosa N° 1.

Quando a agitação parou, a emulsão virou para uma emulsão de óleo em água. A emulsão foi colocada numa câmara fria a 5 °C durante pelo menos 4 horas. Nesta fase, a emulsão era uma pré-emulsão contendo 50% de fase oleosa.

Segundo Passo: A fase aquosa N° 2 (120 mL) é constituída pelo tampão isotónico contendo fosfato de dissódio e monopotássio 0,02 M (pH 7,8) e o ou os imunogénios. A pré-emulsão preparada como no primeiro passo foi arrefecida até cerca de 5 °C, diluída por adição de metade do volume da fase aquosa N° 2 à mesma temperatura, e misturada pela rotação duma barra magnética durante 1 minuto. A concentração final do agente tensioativo na emulsão LR3 é 3,40% m/v 43 ΡΕ1888107

Tal como aqui preparadas, as vacinas LR3 são estáveis durante pelo menos um ano a 5 °C.

Emulsão BEI A emulsão BEI final é uma emulsão de 0/A contendo 33% de uma fase oleosa.

Fase oleosa (120 mL): - Oleth-2 (Brij® 92) : 3,0% m/v, - Oleth-5 (Volpo® N5) : 9,1% m/v, - Óleo de parafina (Marcol 82®) : 86,4 % v/v - Conservante : 1,5% v/ V Fase aquosa N° 1 (240 mL): - Tampão isotónico contendo fosfato de : QS para 100,0% v/v dissódio e monopotássio 0,02 M (pH 7,8) A fase aquosa N° 1 contém tampão isotónico contendo fosfato de dissódio e monopotássio 0,02 M (pH 7,8) 98,5% v/v e o ou os imunogénios. A emulsão BEI não é diluida antes da utilização. A concentração final do agente tensioativo na emulsão BEI é de 4% m/v.

Exemplo 2:

Estabilidade das emulsões

As composições LR4 e LR3 eram estáveis mesmo na presença de imunogénio (s) concentrado (s) a 21 °C durante pelo menos 9 meses. A distribuição de tamanho de partícula 44 ΡΕ1888107 das emulsões não se alterou durante este período de tempo.

Exemplo 3:

Composição de vacina combinada de Mycoplasma hyopneumoniae e CVS-2 e segurança em leitões

Materiais e Métodos:

Duas vacinas preparadas conforme descrito no Exemplo 1, contendo emulsão ou LR3 ou LR4, 12 Unidades de Antigénio de Mycoplasma hyopneumoniae inativado e 2,4 logio (Unidades de Antigénio) de circovírus suíno tipo 2 inativado/dose. Vinte e quatro (24) leitões de três semanas de idade foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos. 0 Grupo 2 de doze (12) leitões foi vacinado no dia 0 com 4 mL da composição de vacina LR3 por via intramuscular, enquanto o grupo 3 de doze (12) leitões foi vacinado no dia 0 com 4 mL da composição de vacina LR4 por via intramuscular. 0 Grupo 1 corresponde ao grupo de controlo não vacinado. Os leitões são monitorizados diariamente. Duas semanas após a injecção, o local da injecção e as lesões locais são observados.

Tratamento Reações de Choque e Gerais Hipertermia °C Ganho de peso relativo diário médio Tamanho da Reação local (cm3) Grupo 1 (controlo) Nenhuma reação -0,1 ± 0,3 * 6,5 ± 1,9 0,0 ± 0,0 Grupo 2 (LR3) Nenhuma reação 0,6 ± 0,5 6,3 ± 1,3 1,8 ± 2,8 Grupo 3 (LR4) Nenhuma reação 0,1 ± 0,2 6,4 ± 1,7 8,4 ± 11,4 * Média ± Desvio Padrão 45 ΡΕ1888107

Resultados:

Os adjuvantes LR3 e LR4 mostraram ter um bom perfil de segurança.

Exemplo 4:

Resultados serológicos após a administração de uma dose de uma vacina de CVS-2 com a emulsão LR4 como adjuvante

Materiais e Métodos:

Uma vacina preparada conforme descrito no Exemplo 1, contendo emulsão LR4, CpG ODN N° 2216 50 μρ/άοβθ, 1,5 Unidades de Antigénio de Mycoplasma hyopneumoniae inativado e 1,5 logio (Unidades de Antigénio) de circovirus suino tipo 2 inativado/dose. Quarenta (40) leitões, de três semanas de idade e tendo anticorpos maternos pré-existentes elevados, foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos. O Grupo 2 de vinte (20) leitões foi vacinado no dia 0 com 0,5 mL da composição de vacina LR4 por via intradérmica com um injetor livre da agulha. 0 Grupo 1 corresponde ao grupo de controlo não vacinado. Amostras de sangue foram tomadas nos DO, D21, D41, D63, D84, D126, D153 e D180 pós-vacinação para titulação dos anticorpos de ORF2 de CVS-2 por ELISA.

Tratamento DO D21 D41 D63 D84 D126 D153 D180 Grupo 1 3,09 ± 2,57 ± 2,15 ± <1,51 ± <1,51 ± <1,51 ± <1,51 ± <1,51 ± 0,58 * 0,50 0,58 0,48 0,34 0,17 0,05 0,02 Grupo 2 2,91 ± 2,35 ± 2,44 ± 2,67 ± 2,60 ± 2,40 ± 2,48 ± 2,43 ± 0,52 0,52 0,35 0,50 0,49 0,49 0,54 0,54 * Média ± Desvio Padrão (unidades logi0 ) 46 ΡΕ1888107

Resultados:

Conforme demonstrado no quadro, todos os vacinados mostraram uma resposta significativa de anticorpo anti-0RF2 de PCV-2 desde 7 a 180 dias após a vacinação, mesmo em presença de anticorpos maternos no momento da vacinação.

Exemplo 5: Método de Preparação de Helicobacter

Cultura: As culturas bacterianas foram cultivadas a partir de estoques de glicerol utilizando um inoculo de 5-10% em caldo de Brucella suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF). As culturas foram cultivadas em frascos de tampa ventilada numa incubadora de triplo gás (N2 85%, CO2 10%2, C>2 5%) com agitação a cerca de 70 rpm a 37 °C. No momento da inoculação, placas de TSA + sangue de carneiro (SC) 5% foram também consideradas como um teste de diagnóstico para determinar a pureza da amostra. A morfologia colonial era puntiforme e clara. Foi observada alguma hemólise em placas deixadas no incubador durante 3-4 dias. As culturas levaram 24-36 horas a crescer até D06oo>1 · As culturas crescidas foram também consideradas em placas de TSA + SC 5%, e testadas para a produção de catalase e urease (Helicobacter cerdo foi positivo para ambos).

Centrifugação: Culturas crescidas até D06oo>1 foram aliquotadas em garrafas de centrífuga estéril e 47 ΡΕ1888107 centrifugadas a 7500 rpm durante 20 minutos com um rotor Beckman J10 a aproximadamente 8600 g. O sobrenadante foi descartado e os péletes celulares foram lavados com lx salina de tampão fosfato (PBS). Os péletes foram ressus-pensos em PBS e aliquotados em frascos de vacina de 10 mL.

Liofilização: Preparações de antigénio foram liofilizadas durante 36 horas sem estabilizantes ou conservantes. Foram observados bolos bem-formados.

Digestão pela pepsina: Uma solução de pepsina (0,1%) foi preparada em HC1 10 mM e esterilizada por filtração duas vezes com um filtro de 0,2 micrómetros. A preparação de antigénio liofilizado foi digerida com pepsina (1 μς de pepsina foi adicionado para cada mg de massa celular seca) durante 25 horas a 37 °C de balanço suave. Amostras de 100 μΙ; foram espalhadas em placas de TSA + SC 5% (incubadas a 37 °C num incubador microaerofilico de triplo gás) em 18 e 25 horas; nenhum crescimento foi observado após 96 horas, indicando que a digestão de pepsina tem um efeito de inativação.

Neutralização por PBS: As preparações de antigénio tinham um pH de cerca de 2,0 após a digestão da pepsina, de modo que foram neutralizadas com um volume de 2:1 de PBS. Após a neutralização do pH, o pH era cerca de 7,0. 48 ΡΕ1888107

Exemplo 6:

Formulações de preparações de antigénios preparadas a partir de Helicobacter cerdo tratadas com pepsina ou formalina

As vacinas serão formuladas, conforme mostrado no Quadro 1, extemporaneamente por dissolução das bactérias liofilizadas em 10 mL de adjuvante LR2 por frasco. Os valores refletem a concentração de cada ingrediente após a formulação. A emulsão LR2 é equivalente à emulsão LR4 descrita no Exemplo 1. Na emulsão LR2 a concentração final de Lutrol F127 é de 0,20% (m/v) em vez de 0,175% (m/v).

Quadro 1: Formulações de vacinas

Ingrediente Componentes Quantidade de Ingrediente mg/mL Quantidade de Ingrediente mg/dose (2 mL) PBS NaCl 2 4 KCl 0,05 0,1 Na2HP04) 0,2875 0,575 kh2po4 0,05 0,1 H20 desionizada pepsina (solução) 3,5 μg 7,0 μς HC1 0,042 0,084 células Helicobacter 3,5 7

Exemplo 7:

Animais e Métodos para a Vacinação com Vacinas baseadas em H. cerdo

Os animais utilizados neste estudo são porcos convencionais seleccionados que estão livres de VSRRS e 49 ΡΕ1888107 livres de M. hyopneumoniae. Leitões convencionais são selecionados enquanto ainda com suas mães. Todos os pesos dos porcos são registados. Os porcos são divididos em 2 grupos de pelo menos 5 porcos cada uma, com estratificação por peso, sexo e ninhada de origem. Todos os porcos são examinados para garantir o estado de saúde. Apenas os animais clinicamente saudáveis estão incluídos no estudo. Todos os porcos são identificados. Os porcos são vacinados à 1 semana e as 2 semanas de idade, enquanto com as suas mães. Um grupo de porcos é vacinado e um grupo é deixado como controlo não vacinado. Os animais vacinados receberam uma dose (2 mL por dose) por via intramuscular, na forma de 0,5 mL, sobre cada ombro e anca. Os controlos não vacinados não receberam qualquer injecção. Às 3 semanas de idade, todos os porcos são desmamados e desafiados. Cada grupo é alojado em pocilgas separadas numa instalação de isolamento. Os porcos são necropsiados em aproximadamente 28 dias após o desafio. Os porcos de controlo negativo são necropsiados na data de necropsia final. O desenho experimental está resumido na Quadro 2.

Quadro 2: Desenho Experimental

Descrição do Desafio de Nenhum Tratamento Helicobacter desafio Grupo vacinado 5 porcos Controlos negativos 5 porcos 50 ΡΕ1888107

Procedimento de desafio e avaliação: Em caso de doença clínica grave, os tratamentos que sejam considerados necessários para o bem-estar do animal podem ser administrados. O número da etiqueta da orelha de cada animal, data(s) da doença, diagnóstico presuntivo, regime de tratamento e disposição do animal serão registados. Nenhum tratamento é proporcionado após o desafio. Um animal moribundo ou ferido é eutanizado. Um animal não saudável (doença clínica ou lesão) pode ser retirado do estudo.

Serologia e Testes da Pele: O sangue é recolhido a partir da veia cava anterior antes da vacinação, antes do desafio e necropsia. Os níveis de anticorpo de Helicobacter são determinados. Os testes cutâneos são executados.

Parâmetros de Produção: Os porcos são pesados à chegada, antes da vacinação, antes do desafio e em cada necropsia para avaliar o ganho ou perda de peso potencial.

Necropsia: Os porcos são necropsiados em 28 DPI conforme adaptado ao desafio de Helicobacter.

Exemplo 8:

Isolados de Helicobacter

Dois isolados bacterianos (2662 e 1268) foram recuperados a partir de mucosa gástrica de suíno por 51 ΡΕ1888107 cultura microaerofílica e passagem sobre placas de meio de Skirrow.

Na base da localização gástrica (cardiaca e antro), morfologia (Gram-negativo, curto, hastes curvadas "semelhantes a asas de gaivota"), atividade de urease, reatividade com um anticorpo anti-Hp de coelho, ambos os isolados foram atribuídos ao género Helicobacter com base em SDS-PAGE e perfis de Western blotting, foi verificado que o isolado 2 662 era semelhante a Helicobacter pylori e dado o nome "Helicobacter cerdo". 0 isolado 1268 tinha um perfil distinto ao contrário do do 2662.

Exemplo 9:

Carga Bacteriana Medida pela Atividade da Urease Quadro 3: Carga Bacteriana Medida pela Atividade da Urease

Grupos Atividade de Urease na Mucosa Gástrica Nenhuma Fraca Moderada Forte Grupo vacinado 4 * 0 2 - Controlos de Infecção - 1 3 3 * Lesões flagrantes na pars oesophagea

Exemplo 10:

Resposta Inflamatória Gástrica A resposta inflamatória gástrica (Quadro 4) foi "pontuada" para foliculos e infiltrações linfociticas na lamina própria gástrica numa escala de 0, nenhuma, 1, leve, 52 ΡΕ1888107 2, moderada, e 3, grave. A pontuação inflamatória total para cada porco foi calculada como a soma das pontuações histológicas da cárdia gástrica e antro. As pontuações médias de grupo foram calculadas a partir destas.

Quadro 4: Resposta Inflamatória gástrica Número de Grupo Pontuação Total Média Grupo vacinado 3, 6 Grupo de controlo 4,4

Exemplo 11:

Respostas Serológicas

Quadro 5: Respostas Serológicas

Grupos Dia 6 Primeira Dia 14 Segunda Dia 24 Dia 40 vacinação vacinação Grupo vacinado 1,0 1,3 81,0 86,5 Controlos de Infecção 1,0 0,8 1,3 4,5 Suivaxyn Myco hyo + H. cerdo 6,9 11,8 99,9 97,3 Controlos 9,4 6, 6 9,1 9 A vacina de H. cerdo proporcionou bons índices de imunidade protectora com base na intensidade da atividade da urease, avaliação histológica cega de secções de tecido e respostas serológicos fortes. Uma vacina combinada compreendendo Suivaxyn, Mycoplasma hyopneumoniae e H. cerdo deu respostas de anticorpo semelhantes. A invenção é ainda descrita pelos seguintes parágrafos numerados: 53 ΡΕ1888107 1. Um emulsão de óleo em água (0/A) compreendendo : (1) uma solução aquosa contendo um antigénio ou imunogénio de vacina capaz de induzir uma resposta imunitária num hospedeiro; (2) um agente tensioativo lipofilico não iónico que é um gordo etoxilado; (3) um óleo mineral; (4) um álcool gordo etoxilado hidrofilico não iónico. 2. A emulsão do parágrafo 1, em que o álcool gordo etoxilado lipofilico compreende cerca de 43% da massa molecular (m/m) ou menos de óxido de etileno (OE). 3. A emulsão do parágrafo 1, em que o álcool gordo etoxilado hidrofilico compreende mais do que cerca de 43% (m/m) de óxido de etileno (OE). 4. A emulsão do parágrafo 2, em que o álcool gordo etoxilado é um álcool gordo C9 a C22 e vantajosamente seleccionado de entre o grupo constituído por um álcool oleilico, cetilico, estearilico, isostearílico, laurilico, e suas combinações, vantajosamente um álcool oleilico e mais vantajosamente um álcool oleilico etoxilado com 1 a 4 OE. 5. A emulsão do parágrafo 3, em que o álcool 54 ΡΕ1888107 gordo etoxilado é um álcool gordo C9 a C22 e vantajosamente seleccionado de entre o grupo constituído por um álcool oleílico, cetílico, estearílico, isostearílico, laurílico, e suas combinações, vantajosamente um álcool oleílico e mais vantajosamente um álcool oleílico etoxilado com 5 a 21 OE. 6. A emulsão de qualquer um dos parágrafos 1 a 5, em que o agente tensioativo hidrofílico não iónico é um álcool gordo etoxilado. 7. A emulsão do parágrafo 6, em que o álcool gordo etoxilado é Brij® 76, Brij® 56, Brij® 96/97, Brij® 98,

Brij® 721, Brij® 58, Brij® 35, Brij® 78 (Uniqema), Volpo® N5, Volpo® CS6, Volpo® CS12, Volpo® CS20, Volpo® CS25, Volpo® CS23 (Croda), BL9-EX, BC- 7, BT-5, BT-7, BT-9, BT-12, BD-10, B0-7V, BC5.5, BT-5, BL-21, BL-25, BC.15TX BC-23, BC-25TX, B0-15V, BO-50V, BB-20, (Nikko Chemicals) ou qualquer sua combinação. 8. A emulsão de qualquer um dos parágrafos 1 a 7, em que o agente tensioativo lipofílico não iónico é um álcool gordo etoxilado. 9. A emulsão do parágrafo 8, em que o álcool gordo etoxilado é Brij® 30, Brij® 92/93, Brij® 72, Brij® 52 (Uniqema), Volpo® L3, Volpo® N3, Volpo® L4 (Croda), BS-4, BD-2, BD-4, BT-3 (Nikko Chemicals), ou qualquer sua composição. 55 ΡΕ1888107 10. A emulsão de qualquer um dos parágrafos 1 a 9 em que a concentração global de agentes tensioativos, em massa por volume de emulsão é desde cerca de 0,2% a cerca de 6,5%, em particular desde cerca de 1% a cerca de 6%, vantajosamente desde cerca de 1,5% a cerca de 5%, mais vantajosamente desde cerca de 2% a cerca de 3%. 11. Uma emulsão de óleo em água (O/A) compreendendo : (1) uma solução aquosa contendo um antigénio ou imunogénio de vacina capaz de induzir uma resposta imunitária no hospedeiro; (2) um álcool gordo etoxilado lipofilico não iónico; (3) um óleo mineral; (4) um álcool gordo etoxilado hidrofilico não iónico compreendendo mais do que cerca de 43% e menos do que cerca de 71% (m/m) de óxido de etileno (OE); (5) um álcool gordo etoxilado hidrofilico não iónico compreendendo cerca de 71% ou mais (m/m) de óxido de etileno (OE). 12. A emulsão do parágrafo 11, em que o álcool gordo etoxilado hidrofilico não iónico compreendendo mais do que cerca de 43% e menos do que cerca de 71% (m/m) de óxido de etileno (OE) é um álcool oleílico etoxilado com 5 a 14 OE. 56 ΡΕ1888107 13. A emulsão do parágrafo 11 ou 12, em que o álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico compreendendo cerca de 71% ou mais (m/m) de óxido de etileno (OE) é um álcool oleilico etoxilado com 15 OE ou mais. 14. A emulsão de qualquer um dos parágrafos 11 a 13 em que a concentração do álcool gordo etoxilado hidrofilico não iónico compreendendo mais do que cerca de 43% e menos do que cerca de 71% (m/m) de óxido de etileno é desde cerca de 1,0% a cerca de 5,0%, em particular desde cerca de 1,5% a cerca de 4,5%, mais vantajosamente desde cerca de 2,0% a cerca de 3,5%, expresso como uma percentagem em massa por volume de emulsão (m/v). 15. A emulsão de qualquer um dos parágrafos 11 a 14 em que a concentração de álcool gordo etoxilado hidrofilico não iónico compreendendo cerca de 71% ou mais (m/m) de óxido de etileno é desde cerca de 0,01% a cerca de 3,0%, particularmente desde cerca de 0,05% a cerca de 2,5%, mais vantajosamente desde cerca de 0,1% a cerca de 2,0% (m/v) . 16. A emulsão de qualquer um dos parágrafos 11 a 15 em que a concentração do álcool gordo etoxilado lipofilico não iónico é desde cerca de 0,1% a cerca de 2,5%, em particular desde cerca de 0,2% a cerca de 2,0%, vantajosamente desde cerca de 0,2% a cerca 1,5%, mais vantajosamente desde cerca de 0,2% a cerca de 1,2% (m/v). 57 ΡΕ1888107 17. Uma emulsão de óleo em água (0/A) compreendendo (1) uma solução aquosa contendo um antigénio ou imunogénio de vacina capaz de induzir uma resposta imunitária num hospedeiro; (2) um álcool gordo etoxilado lipofílico não iónico; (3) um óleo mineral; (4) um álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico; (5) um copolimero de bloco de polioxietileno-poli-oxipropileno hidrofílico não iónico. 18. A emulsão do parágrafo 17 em que o álcool gordo etoxilado hidrofílico é vantajosamente um álcool gordo etoxilado compreendendo mais do que cerca de 43% e menos do que cerca de 71% (m/m) de óxido de etileno. 19. A emulsão do parágrafo 17 em que o álcool gordo é um álcool oleílico etoxilado com 5 a 14 OE. 20. A emulsão de qualquer um dos parágrafos 17 a 19 em que a concentração de álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico é desde cerca de 1 , 0 % a cerca de 5,0%, em particular desde cerca de 1,5% a cerca de 4, 5%, mais vantajosamente desde cerca de 2, 0% a cerca de 3, 5%, expresso como uma percentagem em massa por volume de emulsão (m/v) . 21. A emulsão de qualquer um dos parágrafos 17 a 58 ΡΕ1888107 20 em que a concentração do copolímero de bloco de polioxietileno-polioxipropileno hidrofílico não iónico é desde cerca de 0,01% a cerca de 2,0%, mais particularmente desde cerca de 0,1% a cerca de 1,5% (m/v). 22. A emulsão de qualquer um dos parágrafos 17 a 21 em que a concentração do álcool gordo etoxilado lipofílico não iónico é desde cerca de 0,1% a cerca de 2,5%, em particular desde cerca de 0,2% a cerca de 2,0%, vantajosamente desde cerca de 0,2% a cerca 1,5%, mais vantajosamente desde cerca de 0,2% a cerca de 1,2% (m/v). 23. A emulsão de qualquer um dos parágrafos 1 a 22, em que a emulsão tem uma temperatura de inversão de fase (TIF) maior do que ou igual a 25 °C. 24. A emulsão do parágrafo 23 em que a TIF é desde cerca de 28 °C até cerca de 65 °C, mais particularmente desde cerca de 33 °C a cerca de 60 °C. 25. A emulsão de qualquer um dos parágrafos 1 a 24, em que a emulsão compreende em volume por volume (v/v) de emulsão, desde cerca de 2% a cerca de 50% da fase de óleo, incluindo o ou os óleos e os agentes tensioativos, em particular desde cerca de 4% a cerca de 40%, vantajosamente desde cerca de 8% a cerca de 35%, mais vantajosamente, desde cerca de 15% a cerca de 30% da fase de óleo. 26. A emulsão do parágrafo 25 em que o óleo é um óleo mineral. 59 ΡΕ1888107 27. A emulsão do parágrafo 26 em que o óleo mineral é um óleo de parafina, tal como óleo isoparafinico e/ou óleo nafténico, esqualano, esqualeno, pristano, poli-isobuteno, poli-isobuteno hidrogenado, polideceno, poli-isopreno, poli-isopropeno e semelhantes. 28. A emulsão do parágrafo 25 ou 26, em que o óleo mineral compreende uma cadeia de carbono linear ou ramificada tendo um número de átomos de carbono superior a 15, vantajosamente de 15 a 32, e livre de compostos aromáticos. 29. A emulsão do parágrafo 28, em que o óleo é comercializado sob o nome Marcol® 52 ou Marcol® 82 (Esso) ou "DRAKEOL® 6VR" (Penreco.). 30. O emulsão de qualquer um dos parágrafos 25 a 29, em que o óleo é uma mistura de óleos compreendendo pelo menos dois óleos em qualquer proporção. 31. A emulsão do parágrafo 30 em que a mistura de óleos compreende pelo menos um óleo vegetal. 32. A emulsão do parágrafo 31 em que o óleo vegetal representa desde cerca de 0,1% a cerca de 33% da fase oleosa, vantajosamente desde cerca de 5% a cerca de 15% v/v. 60 ΡΕ1888107 33. A emulsão do parágrafo 31 ou 32, em que o óleo vegetal é óleo de amendoim, óleo de noz, óleo de girassol, óleo de açafroa, óleo de soja, óleo de onagra e semelhantes. 34. Uma emulsão compreendendo um óleo de parafina; um álcool oleilico etoxilado com 2-3 OE como agente tensioativo lipofilico não iónico, um álcool oleilico etoxilado com 5-6 OE como agente tensioativo hidrofilico não iónico, e um copolimero de bloco de POE-POP com aproximadamente 70 a 80% de OE e uma MM à volta de 9800 a 16000 como agente tensioativo hidrofilico não iónico. 35. A emulsão do parágrafo 34 em que o óleo de parafina está a uma concentração desde cerca de 5% a cerca de 50% e vantajosamente desde cerca de 15% a cerca de 30% (v/v) ; o álcool oleilico etoxilado com 2-3 OE está numa concentração desde 0,1% a 1,5%, vantajosamente desde 0,1% a 1,2% (m/v) ; o álcool oleilico etoxilado com 5-6 OE está numa concentração desde 1% a 5%, vantajosamente desde 1% a 4% (m/v) ; e o copolimero de bloco de POE-POP com aproximadamente 70 a 80% de OE e uma MM à volta de 9800 a 16000 está numa concentração desde 0,01% a 2%, vantajosamente desde 0,05% a 1,5% (m/v). 36. Uma emulsão compreendendo um óleo de parafina, um álcool oleilico etoxilado com 2-3 OE como agente tensioativo lipofilico não iónico; um álcool oleilico etoxilado com 10 OE como agente tensioativo 61 ΡΕ1888107 hidrofilico não iónico; e um copolímero de bloco de POE-POP com aproximadamente 70 a 80% de OE e uma MM à volta de 9800 a 16000 como agente tensioativo hidrofilico não iónico 37. A emulsão do parágrafo 36 em que o óleo de parafina está a uma concentração de 5% a 50%, vantajosamente de 15% a 30% (v/v) ; o álcool oleilico etoxilado com 2-3 OE está numa concentração desde 0,2% a 3%, vantajosamente desde 0,5% a 3% (m/v) ; o álcool oleilico etoxi lado com 10 OE está numa concentração desde 0,2% a 3%, vantajosamente desde 0,5% a 3% (m/v); e o copolímero de bloco de POE-POP com aproximadamente 7 0 a 80% de OE e uma MM à volta de 9800 a 16000 está numa concentração desde 0,01% a 2%, vantajosamente desde 0,05% a 1,5% (m/v). 38. Uma emulsão compreendendo um óleo de parafina, um álcool oleilico etoxilado com 2-3 OE como agente tensioativo lipofílico não iónico e um álcool oleilico etoxilado com 5-6 OE como agente tensioativo hidrofilico não iónico. 39. A emulsão do parágrafo 38 em que o óleo de parafina está numa concentração desde 5% a 50%, vantajosamente desde 15% a 35% (v/v); o álcool oleilico etoxilado com 2-3 OE está numa concentração desde 0,1% a 3%, vantajosamente desde 0,5% a 2% (m/v); o álcool oleilico etoxilado com 5-6 OE está numa concentração desde 1% a 5%, vantajosamente desde 2,0% a 4,5% (m/v). 62 ΡΕ1888107 40. Um método de fabrico duma composição de vacina compreendendo a mistura de um antigénio ou imuno-génio de vacina capaz de induzir uma resposta imunitária num hospedeiro com uma emulsão de qualquer um dos parágrafos 1 a 39. 41. A emulsão de qualquer um dos parágrafos 1 a 39 ou a composição de vacina do parágrafo 40 para utilização na indução de uma resposta imunitária num hospedeiro. 42. Um kit para a realização do método do parágrafo 40 ou a utilização do parágrafo 41 que compreende a emulsão de qualquer um dos parágrafos 1 a 39 ou a composição de vacina do parágrafo 40 e instruções para a execução do método ou do uso.

Lisboa 20 de Julho de 2012

Claims (8)

1. ΡΕ1888107 63 REIVINDICAÇÕES 1. Uma emulsão de óleo em água (0/A) compreendendo : (1) uma solução aquosa contendo um antigénio ou imunogénio de vacina capaz de induzir uma resposta imunitária num hospedeiro; (2) um álcool gordo etoxilado lipofílico não iónico; (3) um óleo mineral; (4) um agente tensioativo hidrofílico não iónico que é um álcool gordo etoxilado.
2. 2. A emulsão da reivindicação 1, em que o álcool gordo etoxilado lipofílico compreende cerca de 43% da massa molecular (m/m) ou menos de óxido de etileno (OE); ou em que o álcool gordo etoxilado lipofílico compreende cerca de 43% da massa molecular (m/m) ou menos de óxido de etileno (OE) e em que o álcool gordo etoxilado é um álcool gordo C9 a C22 e vantajosamente seleccionado de entre o grupo constituído por um álcool oleílico, cetílico, estearílico, isostearílico, laurílico e suas combinações, vantajosamente um álcool oleílico e mais vantajosamente um álcool oleílico etoxilado com 1 a 4 OE; ou em que o álcool gordo etoxilado hidrofílico compreende mais do que cerca de 43% (m/m) de óxido de etileno; ou em que o álcool gordo etoxilado hidrofílico compreende 64 ΡΕ1888107 mais do que cerca de 43% (m/m) de óxido de etileno e em que o álcool gordo etoxilado é um álcool gordo C9 a C22 e vantajosamente seleccionado de entre o grupo constituído por um álcool oleílico, cetílico, estearílico, isostearíli-co, laurílico, e suas combinações, vantajosamente um álcool oleílico e mais vantajosamente um álcool oleílico etoxilado com 5 a 21 OE, ou em que o álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico é Steareth-10, Ceteth-10, Oleth-10, Oleth-20, Steareth-21, Ceteth-20, Laureth-23, Steareth-20, 01eth-5, Ceteareth-6, Ceteareth-12, Ceteareth-20, Ceteareth-25, Ceteareth-23, Laureth-9, Ceteth-7, C12-14 Pareth-5, C12-14 Pareth-7, C12-14 Pareth-9, C12-C14 Pareth-12, C12-15 Pareth-10, 01eth-7, Ceteth-6, Laureth-21, Laureth-25, Ceteth-15, Ceteth-23, Ceteth-25, 01eth-15, Oleth-50, Beheneth-20 ou qualquer sua combinação, ou em que o álcool gordo etoxilado lipofílico não iónico é Laureth-4, 01eth-2, Steareth-2, Ceteth-2, C12-13 Pareth-3, 01eth-3, C12-13 Pareth-4, Steareth-4, C12-15 Pareth-2, C12-15 Pareth-4, C12-14 Pareth-3 ou qualquer sua combinação, ou em que a concentração global de agentes tensioativos, numa base ponderai por volume da emulsão, é desde cerca de 0,2% a cerca de 6,5%, em particular desde cerca de 1% a cerca de 6%, vantajosamente desde cerca de 1,5% a cerca de 5%, mais vantajosamente desde cerca de 2% a cerca de 3%.
3. 3. A emulsão da reivindicação 1, em que o 65 ΡΕ1888107 agente tensioativo hidrofílico não iónico compreende um álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico compreendendo mais do que cerca de 43% e menos do que cerca de 71% (m/m) de óxido de etileno (OE) e um álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico compreendendo cerca de 71% ou mais (m/m) de óxido de etileno (OE).
4. 4. A emulsão da reivindicação 3, em que o álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico compreendendo mais do que cerca de 43% e menos do que cerca de 71% (m/m) de óxido de etileno (OE) é um álcool oleílico etoxilado com 5 a 14 OE; ou em que o álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico compreendendo cerca de 71% ou mais (m/m) de óxido de etileno (OE) é um álcool oleílico etoxilado com 15 OE ou mais; ou em que a concentração do álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico compreendendo mais do que cerca de 43% e menos do que cerca de 71% (m/m) de óxido de etileno é de cerca de 1,0% a cerca de 5,0%, em particular desde cerca de 1,5% a cerca de 4,5%, mais vantajosamente desde cerca de 2,0% a cerca de 3,5%, expresso como uma percentagem numa base ponderai por volume de emulsão (m/v); ou em que a concentração do álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico compreendendo cerca de 71% ou mais (m/m) de óxido de etileno é desde cerca de 0,01% a cerca de 3,0%, particularmente desde cerca de 0,05% a cerca de 2,5%, mais vantajosamente desde cerca de 0,1% a cerca de 2,0% (m/v) ; ou 66 ΡΕ1888107 em que a concentração do álcool gordo etoxilado lipofilico não iónico é desde cerca de 0, 1% a cerca de 2,5%, em particular desde cerca de 0 , 2% a cerca de 2,0%, vantaj osamente desde cerca de 0 ,2% a cerca de 1 R 2- r D o f mais vantaj osamente desde cerca de 0,2% para cerca de 1,2% (m/v) .
5. 5. A emulsão da reivindicação 1, em que a emulsão tem uma temperatura de inversão de fase (TIF) maior do que ou igual a 25 °C; ou em que a emulsão tem uma temperatura de inversão de fase (TIF) maior do que ou igual a 25 °C e em que a TIF é de cerca de 28 °C até cerca de 65 °C, mais particularmente desde cerca de 33 °C a cerca de 60 °C.
6. 6. A emulsão da reivindicação 1, em que a emulsão compreende em volume por volume (v/v) de emulsão, desde cerca de 2% a cerca de 50% da fase de óleo, incluindo o ou os óleos e os agentes tensioativos, em particular desde cerca de 4% a cerca de 40%, vantajosamente de cerca de 8% a cerca de 35% e, mais vantajosamente, desde cerca de 15% a cerca de 30% da fase de óleo; ou em que a emulsão compreende em volume por volume (v/v) de emulsão, desde cerca de 2% a cerca de 50% da fase de óleo, incluindo o ou os óleos e os agentes tensioativos, em particular desde cerca de 4% a cerca de 40%, vantajosamente desde cerca de 8% a cerca de 35% e, mais vantajosamente, desde cerca de 15% a cerca de 30% da fase de óleo e em que o óleo é um óleo mineral; ou 67 ΡΕ1888107 em que a emulsão compreende em volume por volume (v/v) de emulsão, desde cerca de 2% a cerca de 50% da fase de óleo, incluindo o ou os óleos e os agentes tensioativos, em particular desde cerca de 4% a cerca de 40%, vantajosamente desde cerca de 8% a cerca de 35% e, mais vantajosamente, desde cerca de 15% a cerca de 30% da fase de óleo e em que o óleo é um óleo mineral e em que o óleo mineral é um óleo de parafina, tal como óleo isoparaf inico e/ou óleo nafténico, esqualano, esqualeno, pristano, poli-isobuteno, poli-isobuteno hidrogenado, polideceno, poli-isopreno, poli-isopropeno e semelhantes; ou em que a emulsão compreende em volume por volume (v/v) de emulsão, desde cerca de 2% a cerca de 50% da fase de óleo, incluindo o ou os óleos e os agentes tensioativos, em particular desde cerca de 4% a cerca de 40%, vantajosamente desde cerca de 8% a cerca de 35% e, mais vantajosamente, desde cerca de 15% a cerca de 30% da fase de óleo e em que o óleo é um óleo mineral e em que o óleo mineral compreende uma cadeia de carbono linear ou ramificada tendo um número de átomos de carbono maior do que 15, vantajosamente de 15 a 32, e livre de compostos aromáticos, ou em que o óleo é uma mistura de óleos que compreende pelo menos dois óleos, em qualquer proporção, ou em que o óleo é uma mistura de óleos que compreende pelo menos dois óleos em qualquer proporção, e em que a mistura de óleos compreende pelo menos um óleo vegetal, ou em que o óleo é uma mistura de óleos que compreende pelo menos dois óleos em qualquer proporção, e em que a 68 ΡΕ1888107 mistura de óleos compreende pelo menos um óleo vegetal e em que o óleo vegetal representa desde cerca de 0,1% a cerca de 33% da fase oleosa, vantajosamente desde cerca de 5% a cerca de 15% v/v; ou em que o óleo é uma mistura de óleos que compreende pelo menos dois óleos em qualquer proporção, e em que a mistura de óleos compreende pelo menos um óleo vegetal e em que o óleo vegetal é óleo de amendoim, óleo de noz, óleo de girassol, óleo de cártamo, óleo de soja, óleo de estrela da tarde (onográcea) e semelhantes.
7. 7. A emulsão da reivindicação 1, em que o antigénio ou imunogénio de vacina é Mycoplasma hyopneu-moniae, circovirus suino tipo 2 ou Helicobacter pylori.
8. 8. A emulsão da reivindicação 1, a qual compreende ainda um copolímero de bloco de polioxietileno--polioxipropileno hidrofilico não iónico. Lisboa 20 de Julho de 2012 69 ΡΕ1888107 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição US 8251454 A U® 8381314 5 US 8048587 A m ssmms a US 83:38543 A WO 8118827 A US 1O7SOO0SA mo 2005308462 A US 5380912 A US 5587164 A U® 5868401 A US 5840563 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * Ksritonasn i4„ si ai, J, tmmmcí. 2023, «tf, 170, 4485-4474 * Vsccãte õzúgr· The Siásimi assi Αφνδηέ Appfoasb. FhasrasoeiiiícsÍ Btote&bos^ogy. «tf„ g, 0S * Vsegtfne Ossigís: The Ssássog ao8 Aàjumà $$-pKssch. PAsoTiaseoScaS Bsotedsiofogy. «tf. 8.157 * Rase ft F. ti ti. Alt J. Veí Sfes?,, 1884, «dl. 45, 1899-1905 * Piana-Dttrw «ti ai. Víti ttfctatt1 1S97, «tf. 55, 361-370 1 * W«rn2t:te CJL «4 aL Vei. knmmof. kwxmopeték, 200¾ «tf. 84,223-285 * àSMb&irí β. b4 af. ¥et, fmemhfwt, 2003, «á. 91. 89-103 2 Mmwsl Fiset&raeaiag irmiiufisia®?, Oppfci-cca-Raven Fuhísshere, 1889 - Yogel; Poweli. Vacdt» Dsssga Tbs Suburtft «til Actjtwsrô Âppfoscit. Pieman Press» 1SSS, 141 « Remingtofs FhamemutiBal-8àeme&. 1800 * Penteroite RJL ei ai. IM. ifwmiwS. ímmmp^fo, 208¾ «tf, 84,43-58