ES2882374T3 - Vacuna para PCV2 y micoplasma - Google Patents
Vacuna para PCV2 y micoplasma Download PDFInfo
- Publication number
- ES2882374T3 ES2882374T3 ES14794866T ES14794866T ES2882374T3 ES 2882374 T3 ES2882374 T3 ES 2882374T3 ES 14794866 T ES14794866 T ES 14794866T ES 14794866 T ES14794866 T ES 14794866T ES 2882374 T3 ES2882374 T3 ES 2882374T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- vaccine
- pcv2
- group
- dose
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 161
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 title claims abstract description 108
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 title description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 102
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 102
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 102
- 241000204045 Mycoplasma hyopneumoniae Species 0.000 claims abstract description 80
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 37
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims abstract description 34
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims abstract description 31
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims abstract description 27
- 101100382437 Porcine circovirus 2 Cap gene Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 18
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 12
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 9
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 claims description 4
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- -1 Quil-A saponin Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 50
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 32
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 29
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 29
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 26
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 26
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 26
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 22
- 101150009852 ORF2 gene Proteins 0.000 description 19
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 19
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 12
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 12
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 12
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 11
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 4
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 206010033546 Pallor Diseases 0.000 description 4
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N triethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCO ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCO)C=C1 LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010022095 Injection Site reaction Diseases 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000255985 Trichoplusia Species 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000013320 baculovirus expression vector system Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000016253 exhaustion Diseases 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000003243 intestinal obstruction Diseases 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-AAJYLUCBSA-N squalene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-AAJYLUCBSA-N 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(5-bromo-1h-indol-3-yl)oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C=C12 LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N 0.000 description 1
- 229930190951 Achyranthes saponin Natural products 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 1
- 241001061264 Astragalus Species 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036119 Frailty Diseases 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 244000274050 Platycodon grandiflorum Species 0.000 description 1
- 235000006753 Platycodon grandiflorum Nutrition 0.000 description 1
- 229930182432 Polygalasaponin Natural products 0.000 description 1
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 235000006533 astragalus Nutrition 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N fusidic acid Chemical class O[C@@H]([C@@H]12)C[C@H]3\C(=C(/CCC=C(C)C)C(O)=O)[C@@H](OC(C)=O)C[C@]3(C)[C@@]2(C)CC[C@@H]2[C@]1(C)CC[C@@H](O)[C@H]2C IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 239000006218 nasal suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 208000024584 respiratory abnormality Diseases 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 210000004233 talus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQSJDHNNJIQPNW-UHFFFAOYSA-K trisodium;trichloride Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[Cl-] NQSJDHNNJIQPNW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10071—Demonstrated in vivo effect
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Una vacuna de dosis única multivalente, de forma que la dosis de la vacuna comprende: una cantidad inmunógena de un antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 recombinante; de 60 a 180 microgramos de Mycoplasma hyopneumoniae inactivado o atenuado o un lisado o un sonicado de un antígeno de Mycoplasma hyopneumoniae atenuado, inactivado o virulento; un sistema adyuvante de dos componentes, comprendiendo el primer componente un adyuvante de saponina y comprendiendo el segundo componente un adyuvante de aceite en agua; y un vehículo fisiológicamente aceptable; de forma que dicha dosis comprende un volumen de 1 ml; y de forma que dicha dosis provoca una respuesta inmune en un cerdo vacunado con la vacuna, que reduce o previene uno o más de: viremia provocada por PCV2 colonización de virus PCV2 de tejidos linfoides; en comparación con un cerdo que no ha sido vacunado con la vacuna o al que se ha administrado un testigo negativo antes de ser expuesto a una cepa de campo de PCV2.
Description
DESCRIPCIÓN
Vacuna para PCV2 y micoplasma
Introducción
Las enfermedades asociadas con infección por circovirus porcino tipo 2 (PCV2) y Mycoplasma hyopneumoniae suponen un coste anual para la industria porcina de millones de dólares de pérdidas. El síndrome multisistémico de debilidad postdestete (PWMS) está asociado con la infección por PCV2 de cerdos. El PWMS se caracteriza clínicamente por uno o más de debilidad, palidez de la piel, dificultad respiratoria, diarrea e ictericia. En el PWMS se ha observado que aparecen lesiones macroscópicas y microscópicas en múltiples tejidos y órganos de cerdos infectados, siendo los órganos linfoides un sitio común para las lesiones. Las tasas de mortalidad para cerdos infectados con PCV2, especialmente cerdos que exhiben debilidad, es elevada y los cerdos infectados son propensos también a desarrollar infecciones bacterianas secundarias, como enfermedad de láser, pasteruelosis pulmonar, colibacilosis y salmonelosis.
El Mycoplasma hyopneumoniae es un agente causante de la neumonía enzoótica porcina, una enfermedad respiratoria que está ampliamente extendida entre los cerdos y se encuentra frecuentemente en muchas piaras de cerdos. El M. hyopneumoniae ataca las células ciliares y epiteliales en los pulmones, provocando la muerte de las células epiteliales que da lugar a lesiones en los pulmones en un cerdo infectado. La infección de M. hyopneumoniae provoca una reducción significativa del peso en crecimiento de los cerdos y facilita la entrada de PRRSV y otros agentes patógenos respiratorios en los pulmones. Las pérdidas económicas asociadas a la mortalidad aumentada y al rendimiento de crecimiento escaso debidos a la infección de PCV2 y M. hyopneumoniae son por lo tanto una preocupación significativa en la industria porcina.
Una vacuna multivalente premezclada en forma lista para usar que comprenda un antígeno de PCV2 y un antígeno de M. hyopneumoniae que provoque inmunidad contra la infección de PCV2 y la infección de M. hyopneumoniae después de una dosis única de administración de la vacuna sería útil para reducir la morbilidad y la mortalidad asociadas con enfermedades provocadas por estos agentes infecciosos. Eggen et al., Marzo de 2011, describen una vacunación combinada contra M. hyopneumoniae y PCV2 pero no muestran que la vacuna proteja contra infección de PCV y M. hyopneumoniae en cerdos.
Sumario
Se describe una vacuna de dosis única multivalente. Cada dosis de la vacuna comprende una cantidad inmunógena de antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 recombinante; una cantidad inmunógena de antígeno de Mycoplasma hyopneumoniae; un sistema adyuvante de dos componentes y un vehículo fisiológicamente aceptable. El primer componente del sistema adyuvante comprende un adyuvante de saponina y el segundo componente del sistema adyuvante comprende un adyuvante de aceite en agua. El antígeno de M. hyopneumoniae puede ser M. hyopneumoniae inactivado o atenuado o un lisado o tratado con ultrasonidos de un M. hyopneumoniae atenuado, inactivado o virulento. La vacuna puede incluir adicionalmente un detergente no iónico y/o un conservante, como timerosal.
En algunas realizaciones, una dosis de la vacuna comprende de 1 ml a 2 ml. Cada dosis de la vacuna provoca una respuesta inmune en un cerdo vacunado con la vacuna, que reduce o evita uno o más de:
viremia provocada por PCV2
colonización por virus PCV2 de tejidos linfoides,
agotamiento linfoide asociado con PCV2,
indicios clínicos asociados con infección de PCV2, o
lesiones pulmonares provocadas por infección de M. hyopneumoniae
en comparación con un cerdo que no ha sido vacunado con la vacuna o no se le ha administrado un testigo negativo antes de la exposición a una cepa de campo de PCV2 o M. hyopneumoniae. En una realización, la administración de una dosis única de la vacuna a un cerdo reduce la gravedad o previene los estados asociados con una infección de PCV2 que comprende uno o más de debilidad, palidez de la piel, dificultad respiratoria, diarrea e ictericia.
Se describe también un método para reducir o prevenir la infección de PCV2 y/o la infección de M.
hyopneumoniae en un cerdo. El método comprende normalmente administrar al cerdo una dosis única de la vacuna de la descripción. La vacuna es administrada normalmente al cerdo a las 1 o 2 semanas del nacimiento. Se describe también un método para formular una vacuna de dosis única multivalente de la descripción. El método comprende normalmente solubilizar una cantidad inmunógena de antígeno de M. hyopneumoniae en un detergente no iónico; mezclar el antígeno de M. hyopneumoniae solubilizado con saponina para formar una mezcla parcialmente adyuvante; solubilizar una cantidad inmunógena de antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 recombinante en un detergente no iónico; mezclar el antígeno de cápsido solubilizado con la mezcla parcialmente adyuvante para formar una vacuna parcialmente adyuvada y mezclar la vacuna parcialmente adyuvada con un adyuvante de aceite en agua para formar una vacuna de dosis única multivalente.
Breve descripción de las figuras
La FIG. 1 es un gráfico que muestra los valores medios de ELISA OD del grupo 1 (placebo) y del grupo 2 (vacunados) para una exposición posterior de un anticuerpo específico de PCV2 a PCV2
La FIG. 2 es un gráfico que muestra cargas virales medias geométricas (Log) de exposición posterior de lechones del grupo 1 (placebo) y del grupo 2 (vacunados) a PCV2.
La FIG. 3 es un gráfico que muestra las temperaturas rectales medias de una exposición posterior de lechones del grupo 1 (placebo) y del grupo 2 (vacunados) a PCV2.
La FIG. 4 es un gráfico que muestra la distribución de valores de inmunohistoquímica (IHC) tras una tinción con PCV2 en el tejido del nódulo linfático en una exposición posterior de lechones del grupo 1 (placebo) y del grupo 2 (vacunados) a PCV2.
La FIG. 5 es un gráfico que muestra el agotamiento linfoide en una exposición posterior de lechones del grupo (placebo y del grupo 2 (vacunados) a PCV2.
La FIG. 6 es un gráfico que muestra la relación S/P media del grupo 5 (placebo) y del grupo 4 (vacunados) para una exposición posterior de anticuerpo específico PCV2 a PCV2.
La FIG. 7 es un gráfico que muestra las cargas virales medias geométricas (Log) de una exposición de lechones del grupo 5 (placebo) y del grupo 4 (vacunados) a PCV2.
La FIG. 8 es un gráfico que muestra las temperaturas rectales medias de la exposición posteriores de lechones de grupo 5 (placebo) y grupo 4 (vacunados) a PCV2.
La FIG. 9 es un gráfico que muestra la distribución de valores de inmunohistoquímica (IHC) tras una tinción con PCV2 en tejido del nódulo linfático en una exposición posterior de lechones del grupo 5 (placebo) y del grupo 4 (vacunados) a PCV2.
La FIG. 10 es un gráfico que muestra el agotamiento linfoide en una exposición posterior de lechones del grupo 5 (placebo) y del grupo 4 (vacunados) a PCV2.
Descripción detallada
Se han desarrollado sistemas de vacunas para una protección vacunada contra PCV2 y M. hyopneumoniae. Sin embargo, estas vacunas requieren generalmente un procedimiento de vacunación complejo que incluye etapas y/o dosis múltiples que requieren un trabajo y costes adicionales. En un sistema comercial, la vacuna de PCV2 y la vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae se proporcionan en botellas separadas y requieren una etapa de mezcla antes de la administración. Después de mezclar, la preparación de vacuna combinada tiene una estabilidad limitada y debe ser administrada as los cerdos en un período de tiempo limitado, generalmente no más de 4 horas después de la mezcla. La etapa de mezcla introduce el riesgo de contaminación y requiere una labor adicional, en comparación con una vacuna lista para usar (RTU). Se han desarrollado vacunas que contienen antígenos de PCV2, así como antígeno de M. hyopneumoniae previamente mezcladas en una única botella. Sin embargo, estas vacunas previamente mezcladas generalmente requieren un régimen de vacunación de dos dosis para provocar una inmunidad protectora: una vacunación preparatoria en las primeras varias semanas después de nacimiento y una vacunación de refuerzo aproximadamente en el momento del destete y, por lo tanto, no disminuye el número de inyecciones ni se simplifica el procedimiento de vacunación. Muchos de los sistemas de vacunas de dos botellas requieren también un régimen similar de vacunación en dos dosis para provocar la inmunidad protectora.
Se describe una composición inmunógena multivalente que comprende antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 y antígeno de M. hyopneumoniae. La composición inmunógena puede ser adecuadamente formulada en forma de una vacuna multivalente, en particular una vacuna lista para usar (RTU). La vacuna RTU de la descripción se proporciona en una forma premezclada en una botella única para simplificar el procedimiento de vacunación y no requiere etapas de mezcla adicionales típicas de los sistemas de vacunas de dos botellas convencionales o una vacunación de preparación y una vacunación de refuerzo a continuación para provocar la inmunidad protectora. Una dosis única de la vacuna RTU, descrita en la presente memoria descriptiva, se ha encontrado para reducir o evitar la viremia provocada por PCV2, reducir o evitar la colonización vírica de tejidos linfoides, reducir o evitar el agotamiento linfoide asociado a PCV2, reducir o evitar los indicios clínicos asociados a la infección de PCV2 como agotamiento, palidez de la piel, dificultad respiratoria, diarrea y/o ictericia y/o reducir o evitar lesiones pulmonares provocadas por infección de M. hyopneumoniae.
I. Definiciones
Siempre que sea apropiado, los términos usados en singular incluirán también el plural y viceversa. El uso de “uno” en la presente memoria descriptiva significa “uno o más” salvo que se establezca otra cosa o cuando el uso de “uno o más” sea claramente inapropiado. El uso de “o” significa “y/o” salvo que se establezca otra cosa. El uso de “comprenden”, “comprende”, “que comprende”, “incluyen”, “incluye” y “que incluye” son intercambiables y no está previsto que sean limitativos. El término “como” tampoco está previsto que sea limitativo. Por ejemplo, el término “que incluye” puede significar “que incluye, pero sin estar limitado a”.
El término “inmunógeno”, como se usa en la presente memoria descriptiva, significa capaz de producir una respuesta inmune en un animal hospedante frente a un antígeno o antígenos. Esta respuesta inmune forma la base de la inmunidad protectora provocada por una composición inmunógena, como una vacuna, contra un organismo infeccioso específico como PCV2 o M. hyopneumoniae.
El término “vacuna” como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una composición inmunógena que comprende uno o más antígenos que, cuando son administrados a un mamífero, como un cerdo, induce o estimula o provoca respuestas inmunes celulares o humorales para el uno o más antígenos de la vacuna. Una vacuna puede contener un adyuvante para producir una respuesta inmune más robusta en el animal hospedante para el uno o más antígenos.
El término “adyuvante”, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una sustancia usada en combinación con un antígeno o una combinación de antígenos para producir una respuesta inmune más robusta en un mamífero como un cerdo, que el antígeno o la combinación de antígenos solos.
“estimular una respuesta inmune”, “inducir una respuesta inmune” y “provocar una respuesta inmune” se usan de forma intercambiable, salvo que se establezca otra cosa e incluyen, pero sin limitación, inducir, estimular o provocar un efecto terapéutico o profiláctico que está mediado por el sistema inmune de un mamífero, como un cerdo. Más específicamente, la estimulación de una respuesta inmune en el contexto de la invención se refiere a provocar respuestas inmunes celulares o humorales, induciendo así efectos posteriores como producción de anticuerpos, desplazamientos de clases de cadenas pesadas, maduración de ACP y estimulación de células T citolíticas, Células helper T y células de memoria T y B para uno o más antígenos de la vacuna.
“antígeno”, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una sustancia que induce una respuesta inmune específica en un animal hospedante como un cerdo. El antígeno puede comprender un microorganismo completo o virus, una subunidad de un microorganismo o virus, un péptido, polipéptido, glicoproteína, hidrato de carbono, hapteno y sus combinaciones capaces de inducir una respuesta inmune tras la presentación en un animal hospedante en presencia y/o ausencia de un adyuvante.
El término “multivalente”, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una composición inmunógena o vacuna que comprende uno o más antígenos de PCV2 y uno o más antígenos de M. hyopneumoniae.
II. Ejemplos de realizaciones
Se describirán diversas realizaciones en detalle haciendo referencia a los dibujos y tablas. La referencia a varias realizaciones no limita el alcance de las reivindicaciones anejas al presente documento. Adicionalmente, cualquiera de los ejemplos expuestos en esta memoria descriptiva no está concebido como limitantes y exponen meramente algunas de las muchas realizaciones posibles.
Se describe una composición inmunógena multivalente que comprende antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 y antígeno de M. hyopneumoniae. La composición inmunógena puede ser adecuadamente formulada como una vacuna multivalente, en particular una vacuna lista para usar (RTU). Una dosis única de la vacuna RTU de la
descripción comprende una formulación premezclada que contiene una cantidad inmunógena de antígeno PCV, una cantidad inmunógena de antígeno de M. hyopneumoniae y un sistema adyuvante de dos componentes. El antígeno PCV2 comprende antígeno de cápsido ORF2 de PCV2. El antígeno puede ser producido por medio de un vector vial recombinante que comprende una o más secuencias codificadoras de nucleótidos o RF2 de PCV2 bajo el control de un promotor adecuado, de forma que la proteína de cápsido ORF2 de PCV2 es expresada por el vector viral recombinante. Las células adecuadas son infectadas con el vector viral recombinante y las células infectadas son cultivadas y el antígeno de cápsido ORF2 recombinante es expresada por las células infectadas. Preferentemente, las células secretan el antígeno recombinante en la materia sobrenadante para mayor facilidad de recuperación, aunque el antígeno recombinante puede ser recuperado a partir de las células usando métodos convencionales.
La secuencia de nucleótidos ORF2 de PCV2 puede ser amplificada a partir de PCV2, preferentemente un PCV2 virulento, usando PCR. Los cebadores para amplificar ORF2 de PCV2 se describen en los ejemplos posteriores. La secuencia de nucleótidos ORF2 de PCV2 es conocida y los cebadores para amplificar la secuencia de nucleótidos pueden ser identificados y construidos usando métodos convencionales. La secuencia de nucleótidos ORF2 de PCV2 amplificada puede ser transferida en un vector lanzadera adecuado y la parte del vector lanzadera que comprende la secuencia de nucleótidos ORF2 de PCV2 heteróloga puede ser transfectada en un vector viral adecuado. Véanse, por ejemplo, los documento US 8.008.001 y US 8.119.143.
Los vectores virales preferidos incluyen los vaculovirus, aunque debe entenderse que son adecuados otros sistemas de expresión viral. Los vectores de expresión de vaculovirus producen niveles elevados de antígeno viral en células de insectos que incluyen, pero sin limitación, células de Spodoptera, células de Trichoplusia y células High Five, eliminando la necesidad de procedimientos complicados y que requieren tiempo para concentrar el antígeno a partir de células infectadas. Ejemplos de células Spodoptera adecuadas incluyen, pero sin limitación, células Sf-9 y células Sf-21. Ejemplos de células Trichoplusia adecuadas incluyen, pero sin limitación células T.ni. Los sistemas de expresión de vaculovirus están disponibles en el comercio a partir de muchas empresas diferentes, que incluyen el sistema de expresión de vaculovirus Bac-to-Bac HBM TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA) y sistemas de expresión de vaculovirus Bac-to-Bac® (Clontech, Mountain View, CA).
En el vector de vaculovirus, la secuencia de nucleótidos ORF2 de PCV2 está situada bajo el control de un promotor adecuado. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos ORF2 de PCV2 puede estar situada bajo el control del promotor Ph o el promotor P10. En una realización, la secuencia de nucleótidos ORF2 de PCV2 Está insertada en un sitio de inserción en el lugar P10 y/o en el lugar Ph de un genoma de vaculovirus. De esta manera, un vector que comprende dos copias de la secuencia de nucleótidos ORF2 de PCV2 puede ser construido para hacer posible la producción de grandes cantidades de antígeno por las células infectadas. Pueden ser usados otros promotores adecuados, heterólogos o heterogéneos, conocidos por un experto en la técnica. Una descripción detallada de sistema de vectores de expresión de vaculovirus y las condiciones de cultivo celular y técnicas para producir una proteína recombinante usando este sistema de expesión se pueden encontrar, por ejemplo, en la publicación de Hitchman et al., 2009, Baculovirus Expression Systems for Recombinant Protein Production in Insect Cells, Rec. Pat. Biotechnol., 3:46-54, un artículo de examen que describe los principales desarrollos y patentes en relación a los sistemas de expresión de vaculovirus, desde el uso inicial de los vaculovirus como una herramienta de expresión y la publicación Guide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) y Insect Cell Culture Techniques publicados por Invitrogen (Carlsbad, CA), accesible en el sitio http://tools.invitrogen.com/contenl/sis/manuals/bevtest.pdf..
El antígeno del cápsido ORF2 de PCV2 puede ser concentrado purificado a partir del cultivo celular usando métodos convencionales. En una realización, el antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 es concentrado y purificado a partir del cultivo celular mediante filtración y seguidamente centrifugación. En algunas realizaciones, el cultivo celular es centrifugado a 5.000 x g durante al menos 20 minutos. La materia sobrenadante es retenida ya que contiene el antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 secretado por las células. El granulado que contiene las células y el debris celular se vuelve a poner seguidamente en suspensión en un tampón, como un tampón de fosfato y se somete a uno o más ciclos de congelación, descongelación, preferentemente de dos a tres ciclos de congelación-descongelación, para librar el antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 a partir de las células. El granulado puede ser opcionalmente congelado antes de volver a poner en suspensión el granulado en el tampón. Preferentemente, las células en suspensión en el tampón se congelan durante 5 minutos a 24 horas antes de permitir que se descongelen. En una realización, las células congeladas se descongelan a una temperatura de aproximadamente 37° C. El material puede ser centrifugado después de cada ciclo de congelación-descongelación y la materia sobrenadante puede ser retenida. Las materias sobrenadantes pueden ser seguidamente reunidas con la materia sobrenadante de la filtración y centrifugación iniciales para proporcionar antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 concentrado y purificado.
En algunas realizaciones, la vacuna RTU comprende al menos 1 unidad LISA de antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 recombinante por dosis. Una unidad LISA es la dosis protectora mínima de antígeno de cápsido en el animal hospedante (por ejemplo, un cerdo) como se describe adicionalmente en el ejemplo 2. Para determinar las unidades LISA, se establece una curva de referencia para un antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 de
referencia mediante dilución en serie del antígeno de referencia y detectando el antígeno con una concentración normalizada de anticuerpo anti-PCV2 monoclonal. Un ejemplo de un antígeno de referencia es PCV2-Ag-51811. Los anticuerpos anti-PCV2 están disponibles en el comercio, por ejemplo, en la entidad RTI (Brookings, SD). Una vez que se determinan las unidades ELISA del antígeno de referencia, se puede usar la curva estándar para la determinación de la dosis para todas las muestras ensayadas mediante ELISA frente al antígeno de referencia.
En algunas realizaciones, la vacuna comprende al menos de 1 unidad ELISA a 5 unidades ELISA de 1 unidad ELISA a 4 unidades ELISA, de 1 unidad El ISA a 3 unidades ELISA, de 1 unidad ELISA a 2 unidades ELISA de antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 por dosis. Una dosis de la vacuna de la descripción es generalmente de 0,5 ml a 2,0 ml. En una realización, una dosis de la vacuna es de 1,0 ml a 2,0 ml, de 1,0 ml a 1,75 ml, de 1,0 ml a 1,5 ml o de 1,0 ml a 1,25 ml. En una realización, una dosis de la vacuna comprende 1,0 ml.
El antígeno de M. hyopneumoniae comprende un lisado o sonicado inactivado (de células completas o quebradas) de un M. hyopneumoniae inactivado, atenuado o virulento. En algunas realizaciones, el lisado o sonicado comprende un lisado o sonicado de células completas, o una fracción de los mismos, que comprende fracción de membrana y/o proteínas del lisado o sonicado. En algunas realizaciones el antígeno de M. hyopneumoniae comprende M. hyopneumoniae fraccionado. En otras realizaciones, el antígeno de M. hyopneumoniae comprende un sonicado de M. hyopneumoniae. En algunas realizaciones, la vacuna RTU comprende al menos 60 microgramos por dosis. En algunas realizaciones, la vacuna comprende de 6 microgramos a 200 microgramos, de 60 microgramos a 180 microgramos, de 100 microgramos a 200 microgramos, de 100 microgramos a 180 microgramos, de 100 microgramos a 160 microgramos, de 100 microgramos a 140 microgramos de antígeno de Mycoplasma hyopneumoniae por dosis. En una realización, la vacuna comprende al menos 120 microgramos de antígeno de M. hyopneumoniae por dosis. Todavía en otra realización, la vacuna comprende 120 microgramos de antígeno de M. hyopneumoniae por dosis.
El primer componente del sistema adyuvante comprende un adyuvante basado en saponina. Ejemplos de saponinas adecuadas incluyen, pero sin limitación, saponinas de Quilaja, saponinas de Ginseng, saponinas de Panax notoginseng, saponinas de Platycodon grandiflorum, saponinas de Astragalus, saponinas de Achyranthes, y saponinas de Polygala. Otras saponinas útiles como adyuvantes son conocidas y se describen, por ejemplo, en la publicación de Sun et al., 2009, Vaccine, 27:1787-1796. En una realización, la saponina comprende saponina de Quil A o un derivado de la misma que incluyen, pero sin limitación QS-7, QS-17, QS-18, QS-21 o una combinación de las mismas. Las saponinas pueden ser descritas también basadas en el número y la posición de las cadenas de azúcares. La saponina usada en el sistema adyuvante descrito en la presente memoria descriptiva puede ser una saponina de tipo 3- monodesmóxido (MD); 3,28-bidesmósido (BD); 3,6(25)-BD, 3,21-BD, 3,22-BD, 3,26-BD o 3,6,25-tridesmósido (TD). En ciertas realizaciones, la saponina comprende una saponina de tipo 3-MD. En algunas realizaciones, la vacuna comprende de 50 a 200 microgramos de saponina por dosis. En una realización, la vacuna comprende de 75 a 150 microgramos de saponina por dosis. En otra realización, la vacuna comprende de 90 a 110 microgramos de saponina por dosis. Todavía en otra realización, la vacuna comprende 100 microgramos de saponina por dosis.
El segundo componente del sistema adyuvante comprende un adyuvante de emulsión de aceite en agua (O/W). Se puede usar cualquier aceite adecuado en el adyuvante O/W, como un aceite mineral o un aceite no mineral. La fase aceitosa puede contener una mezcla de aceites diferentes, tanto minerales como no minerales. Los adyuvantes O/W comprenden generalmente de 25% a 60% de fase aceitosa y de 40% a 75% de fase acuosa. Ejemplos de adyuvantes de emulsiones O/W adecuados incluyen, pero sin limitación AS03 y AS03 (GSK), MF59 (Novartis), AF03 (Sanofi Pasteur), Montanide (Seppic), Lipovant, AddaVax (InvivoGen), Trigen (Newport Laboratories, Worthington, MN) adyuvante 65. En algunas realizaciones, la vacuna comprende de 5% a 45% w/w de adyuvante O/W. En una realización, la vacuna comprende de 10% a 40% v/v de adyuvante O/W.
La vacuna RTU puede incluir además uno o más conservantes adecuados. Ejemplos de conservantes adecuados incluyen, pero sin limitación timerosal y antibióticos. Ejemplos de antibióticos incluyen, pero sin limitación penicilina, estreptomicina y anfotericina B. En una realización, la vacuna comprende de 10 a 200 unidades de penicilina por ml. En otra realización, a vacuna comprende de 10 a 200 microgramos de estreptomicina por ml. Todavía en otra realización, la vacuna comprende de 0,1 a 1,0 microgramos de anfotericina B por ml. En algunas realizaciones, la vacuna comprende de 0,005% a 0,01% en peso de un conservante. En una realización, el conservante comprende timerosal.
La vacuna de la descripción incluye generalmente un vehículo fisiológicamente aceptable. Un vehículo “fisiológicamente aceptable” es cualquier vehículo que sea adecuad para una administración in vivo (por ejemplo, una administración oral, transdermal o parenteral) o un uso in vitro, es decir un cultivo celular. Los vehículos fisiológicamente aceptables adecuados para una administración in vivo incluyen agua, soluciones tamponadas y soluciones de glucosa o dextrosa, entre otros. Un vehículo adecuado para un cultivo celular es un medio de cultivo celular disponible en el comercio. Los componentes adicionales de la vacuna pueden incluir adecuadamente excipientes como estabilizadores, conservantes, diluyentes, emulsionantes o lubricantes, además del vehículo fisiológicamente aceptable. En particular, los excipientes adecuados incluyen, pero sin
limitación Tween 20, NP-40, DMSO, sacarosa, L-histidina, polisorbato 20 y suero.
Como apreciarán los expertos en la técnica, la vacuna descrita en la presente memoria descriptiva puede ser adecuadamente formulada para que sea compatible con la vía de administración prevista. Ejemplos de vías de administración adecuadas incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradermal, intramuscular, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdermal (tópica), transmucosal y rectal. Una vía de administración adecuada para los cerdos es la intramuscular. Las soluciones o suspensiones usadas para una aplicación parenteral, intradermal o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyentes esterilizado como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol y otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos como alcohol bencílico o metil-parabenes; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes como ácido etilendiaminotetraacético; tampones como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para ajustar la tonicidad como cloruro de sodio dextrosa. El pH de la composición puede ser ajustado con ácidos o bases o como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La administración sistémica de la composición se realiza también adecuadamente por medios transmucosales o transdermales. Para una administración transmucosal o transdermal, se usan en la formulación materiales penetrantes apropiados para la barrera que va a ser atravesada. Estos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para una administración transmucosal, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucolas se puede realizar a través de pulverizaciones nasales o supositorios.
Ejemplos de realizaciones de una vacuna RTU según la descripción se muestran en las tablas 1 y 2.
Tabla 1
Tabla 2
La vacuna de la descripción se proporciona en una forma previamente mezclada y lista para usar para simplificar el procedimiento de vacunación y no requiere etapas de mezcla adicionales típicas de los sistemas de sistemas de vacunas convencionales de dos botellas o una vacunación de preparación seguida de una vacunación de refuerzo, para provocar la inmunidad. En algunas realizaciones, una vacuna RTU de la descripción se formula solubilizando una cantidad inmunógena de antígeno de M. hyopneumoniae en un disolvente no iónico. En algunas realizaciones, la concentración de detergente no iónico es de 0,5% a 2% v/v. En una realización, la concentración de detergente no iónico es de 1% v/v. El antígeno se mezcla con una cantidad de saponina para formar una mezcla parcialmente adyuvada. En una realización, se añade una solución 1% p/v de saponina al antígeno solubilizado a una concentración de 50 microgramos a 150 microgramos de saponina por ml. El cápsido ORF2 de PCV2 recombinante se solubiliza en un detergente no iónico. En algunas realizaciones, la concentración del detergente no iónico es de 0,5% a 2% v/v. En una realización, la concentración del detergente
no iónico es de 1% v/v. Seguidamente se mezcla una cantidad inmunógena del antígeno de cápsido solubilizado con la mezcla parcialmente adyuvada de antígeno de M. hyopneumoniae para formar una vacuna parcialmente adyuvada. La vacuna parcialmente adyuvada se diluye seguidamente con un vehículo fisiológicamente aceptable, como n tampón acuoso, hasta el volumen final y seguidamente se mezcla con un adyuvante de aluminio o un adyuvante O/W para formar la vacuna RTU. Preferentemente, la vacuna RTU comprende al menos 120 microgramos de antígeno de M. hyopneumoniae y al menos 1 unidad ELISA de antígeno de cápsido de PCV ORF2 por dosis. En algunas realizaciones, la vacuna comprende 1 unidad ELISA a 5 unidades ELISA por antígeno de cápsido y de 60 microgramos a 200 microgramos de antígeno de M. hyopneumoniae por dosis. En una realización, la vacuna comprende 1 unidad ELISA a 3 unidades ELISA de antígeno de cápsido y de 60 microgramos a 180 microgramos de antígeno de M. hyopneumoniae por dosis. En algunas realizaciones, la vacuna comprende de 50 microgramos a 150 microgramos de saponina por dosis. En una realización, la vacuna comprende de 90 microgramos a 120 microgramos de saponina por dosis.
Una dosis única de la vacuna RTU de la descripción provoca una respuesta inmune en el cerdo vacunado. La dosis de la vacuna es generalmente de 0,5 ml a 2,0 ml. En una realización, la dosis de la vacuna es de 1,0 ml a 2,0 ml, de 1,0 ml a 1,75 ml, de 1 ml a 1,5 ml o de 1,0 ml a 1,25 ml. En una realización, la dosis de la vacuna comprende 1,0 ml. En algunas realizaciones, la respuesta inmune provocada por una dosis única de la vacuna administrada a un cerdo reduce o evita la viremia provocada por PCV2 en comparación con un cerdo que no ha sido vacunado o al que ha administrado un testigo negativo antes de ser expuesto a una cepa de campo de PCV2 y/o M. hyopneumoniae, como se describe en los ejemplos siguientes. En las realizaciones, la respuesta inmune provocada por una dosis única de vacuna administrada a un cerdo reduce o evita la colonización vírica de los tejidos linfoides, reduce o evita el agotamiento linfoide asociado con PCV2 en comparación con un cerdo que no ha sido vacunado o al que se ha administrado un testigo negativo antes de ser expuesto a una cepa de campo de PCV2 y/o M. hyopneumoniae como se describe en los ejemplos posteriores. En algunas realizaciones, la respuesta inmune provocada por una dosis única de la vacuna administrada a un cerdo reduce o evita los indicios clínicos asociados con una infección de PCV2 como agotamiento, palidez de la piel, dificultad respiratoria, diarrea y/o ictericia, en comparación con un cerdo que no ha sido vacunado o al que se ha administrado un testigo negativo antes de ser expuesto a una cepa de campo de CV2, como se describe en los ejemplos posteriores. En algunas realizaciones, la respuesta inmune provocada por una dosis única de la vacuna administrada a un cerdo, reduce o evita las lesiones pulmonares provocadas por una infección de M. hyopneumoniae, en comparación con un cerdo que no ha sido vacunado o al que se ha administrado un testigo negativo antes de ser expuesto a una cepa de campo de M. hyopneumoniae, como se describe en los ejemplos posteriores.
La vacuna puede ser administrada por vía oral, parenteral, intramuscular, intranasal o intravenosa al cerdo. El suministro oral puede abarcar, por ejemplo, añadir las composiciones a una comida o bebida de los cerdos. En una realización, la vacuna es administrada al cerdo por vía intramuscular. La vacuna es generalmente administrada al cerdo en las 1 o 2 semanas del nacimiento. Cuando la vacuna de la descripción es administrada en las primeras pocas semanas después del nacimiento, el cerdo puede obtener una inmunoprotección contra PCV2 mediante una fase de destete, en el que los lechones resultan ser más susceptibles a la infección de PCV2.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos son ilustrativos y otras realizaciones están en el alcance de la presente descripción.
Ejemplo 1
Producción de Antígeno de cápsido de PCV2.
El gen ORF2 de cápsido o PCV2b fue expresado en el sistema de expresión de vaculovirus Bac-to-Bac® (Invitrogen, Carlsbad, CA). La generación de un vaculovirus recombinante se basó en una transposición específica para el sitio de un cassette de expresión en un vector lanzadera de vaculovirus (bacmid) propagado en E. coli. Se generó un constructo de expresión que contenía dos copias de los genes ORF2 usando plásmido de donante doble pFastBac (Invitrogen). La expresión se controló mediante promotores Pph u Pp10 específicos de vaculovirus. DH10Bac de E. Coli con un vector lanzadera de vaculovirus (bacmid) y plásmido helper proporcionaron la generación de un bacmid recombinante a continuación de una transposición del constructo de expresión doble pFastBac. El bacmid recombinante generó rBav-PCV2 después de una transfección de células de insecto y se produjo proteína ORF2 de cápsido en cultivos celulares.
Extracción de ADN a partir de una amplificación de PCV2b y PCR
El ADN se extrajo de cultivo aislado de PCV2b con un estuche de extracción de ADN (Qiagen). A continuación de la extracción del ADN viral, se realizó la amplificación de PCR para aislar el gen ORF2 de longitud completa
de PCV2b. Se diseñaron cuatro cebadores de PCR diferentes para preparar dos insertos diferentes para los promotores Pph y Pp10. El gen ORF2 es de 702 bp y puede ser dirigido mediante electroforesis sobre gel. La secuencia de nucleótidos del gen ORF2 amplificado (SEQ ID NO:1) se muestra a continuación:
1 ATGACGTATC CAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACC GCCCCCGCAGCCATCTTGGC
61 CAGATCCTCC GCCGCCGCCCCTGGCTCGTC CACCCCCGCCACCGTTACCG CTGGAGAAGG
121 AAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTATCCCGCACCTTCG GATATACTAT CAAGCGAACC
181 ACAGTCAGAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGAT TCAATATTAATGACTTTCTT
241 CCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAG
301 GTTAAGGTTGAATTCTGGCC CTGCTCCCCGATCACCCAGG GTGACAGGGGAGTGGGCTCC
361 AGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCC
421 TATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTAC
481 TTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACT TCCAACCAAACAACAAAAGA
541 AACCAGCTGT GGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCATT
601 GCGTTCGAAAACAGTATAAACGACCAGGAATACAATATCC GTGTAACCATGTATGTACAA
661 TTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTTAA
El producto de PCR del gen ORF2 se purificó mediante electroforesis sobre gel para subclonación PCR. La secuencia de los cebadores se muestra en la Tabla 3
Tabla 3
Subclonación del gen ORF2 en vector lanzadera pCR2.1 TOPO
El producto de PCR del gen ORF2 de PCV2b fue clonado en el vector pCR2.1 TOPO directamente (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se transformaron células TOP 10 de E. coli con el vector. Se extrajo ADN de plásmidos de pCR2.1 TOPO y se purificaron para un secuenciado de ADN para confirmar que el gen ORF2 estaba en marco. Clonación ORF2 en vector de expresión pFastBac-dual
Se preparó un gen ORF2 modificado para inserción a partir de vector lanzadera pCR2.1 TOPO mediante digestión de endonucleasa de restricción. En primer lugar, el pFastBac-dual y el pCR2.1TOPO-ORF2(B/H) se digirió con BamHI y HindIII para la clonación ORF2 en el promotor Pph. Se recogió pFastBac-dual-ORF2(B/H) recombinante para un tratamiento adicional. En segundo lugar, se digirieron pFastBac-dual-ORF2(B/H) y pCR2.1 TOPO-ORF2(X/K) recombinante con Xhol y KpnI para la clonación del promotor ORF2 en promotor Pp10. Después de una selección y confirmación de clon recombinante, las dos copias de los genes ORF2 se insertaron en pFastBac-dual para la producción del vaculovirus recombinante. Se transformaron células de componentes químicos de E. Coli Mech T1 (Invitrogen) con los ADN de plásmido de pFastBac-dual recombinante. El pFastBacdual recombinante con el gen ORF2 se seleccionaron sobre una placa de agar LB con ampicilina (100 pg/ml). La inserción del gen ORF2 se confirmó con digestión de endonucleasa de restricción o amplificación por PCR. La digestión de BamHi/HindlII o Xhol/Kpnl liberó el gen ORF2 a partir del vector pFastBac-dual.
Generación de bacmid recombinante
Después de que se generó constructo de pFastBac-dual recombinante con gen ORF2, el ADN del plásmido purificado se transformó en células DH10Bac de E. Coli para producir un bacmid recombinante mediante transposición. Se usaron células químicamente competentes DH10Bac de eficiencia MAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) para la transformación de pFastBac-dual recombinante y se usó la selección de colonias azules/blancas para identificar las colonias que contenían el bacmid recombinante. El bacmid recombinante se seleccionó también en una placa de agar LB que contenía 50 pg/ml de kanamicina y 7pg/ml de gentamicina. Después de incubar la placa durante 48 h a 37° C, las colonias más grandes y más aisladas se recogieron para una selección adicional.
Las colonias blancas (10) se recogieron y se volvieron a trazar en placas LB de nueva aportación que contenían 50 pg/ml de kanamicina, 7 pg/ml de gentamicina, 10 pg/ml de tetraciclina, 100 pg/ml de Bluo-gal y 40 pg/ml de
IPTG. A partir de una única colonia blanca, se hizo crecer un cultivo líquido que contenía 50 pg/ml de kanamicina, 7 pg/ml de gentamicina y 10 pg/ml de tetraciclina para un aislamiento de ADN de bacmid recombinante con el estuche de ensayo S.N.A.P. MiniPrep Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). El ADN de bacmid recombinante se analizó mediante amplificación por PCR.
El bacmid contenía sitios de cebadura M13 directos (-40) y M13 inversos que flanqueaban el sitio mini-attTn7 con la región de a-complementación lacZ de bacmid que puede ser usada para facilitar el análisis PCR. Para verificar la presencia del gen ORF2 en el bacmid recombinante, se usaron cebadores pUCM13 directos (-20) y pUCM13 inversos o una combinación del cebador pUCM13 directo (-20) o pUCM13 inverso y un cebador que se hibrida con el gen ORF2. Se realizaron múltiples amplificaciones PCR para verificar que el bacmid recombinante con dos copias de genes ORF2 se insertó en el genoma del vaculovirus. Se realizó un PCR de pUCM13F/XHORF2bR para validar que el gen ORF2 estaba aislado entre Pp10 y HSVtk pA. El producto de PCR era de aproximadamente 2,4 KB. Se realizó una PCR de pUCM13R/BHORF2bF para validar que el gen ORF2 estaba insertado entre Pph y SV40 pA. El producto de PCR era de aproximadamente 1,2 kb.
Generación de vaculovirus recombinante mediante transfección de células de insectos
Se usó bacmid recombinante (rBacmid) que contenía el gen ORF2 para transfectar células de insecto Sf9 (Spodoptera frugiperda) para producir vaculovirus recombinante con el gen ORF2. La transfección se realizó en una placa de 6 pocillos con 1 x 106 célula/pocillo. Para cada muestra de transfección, se prepararon ADN de bacmid y complejos de reactivos Cellfectin en tubos esterilizados de 12 x 75 mm como sigue:
Solución A: 100 pl de medio de cultivo (medio SF-900 II SFM, Invitrogen, Grand Island, NY) 9,0 pl (reactivo de cellfectin)
Solución B: 100 pl de medio de cultivo ADN de rBacmid (1,5-12 pg).
Se combinaron solución A y solución B y se incubaron durante 30 minutos a 20° C /- 5° C. Se añadieron 0,8 ml de medio SF-900 a cada tubo antes de añadirlos los complejos en células Sf9. Los complejos de ADN: cellfectin se transfirieron en células Sf9 y se incubaron durante 5 h a 27° C /- 1° C. Los complejos de transfección se separaron del cultivo celular y se añadió cultivo celular de nueva aportación. Las células transfectadas se incubaron a 27° C para la generación de vaculovirus recombinante.
Los vaculovirus recombinantes (rBav) producidos a partir de la transfección de células Sf9 se liberaron en el medio a los 4 o 5 días después de la transfección. Una vez que las células Sf9 aparecían infectadas, los virus se recolectaron del medio de cultivo celular mediante centrifugación a 500 x g durante 10 minutos para separar células y debris grande. Los rBav se amplificaron seguidamente mediante 4 pasadas en células Sf9.
Se infectaron células T.ni (Trichoplusia ni) (Allele Biotechnology, San Diego, CA) con rBAV PCV2 a un MOI de 0,05 a 0,2 y se cultivaron en medio Express Five SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA). El cultivo celular se incubó a 27° C /- 1°C con aireación y agitación. Cuando la densidad celular alcanzó entre 1-6 x 106, se añadieron medios de cultivos celulares de nueva aportación para ajustar la densidad celular a 1-5 x 105. Los medios se añadieron aproximadamente cada 2-6 días. El tiempo desde la incubación hasta la recolecta de las células varió en el intervalo de 6 a 12 días.
El cultivo recolectado se concentró y se purificó por filtración y seguidamente centrifugación. La recolección se filtró a través de un filtro de 10 kd. Cuando se concentró hasta aproximadamente 1/6 del volumen original, el material recolectado concentrado se transfirió a tubos de centrifugación, se centrifugó a 5.000 x g durante 45 minutos y se retuvieron las materias sobrenadantes. Se añadió tampón PB (Tampón de fosfato 0,1 M pH 6,9) a los tubos de centrifugadora que contenían los sedimentos (1/50) del volumen original y los tubos se sometieron a 3 ciclos de congelación y descongelación para liberar el antígeno de cápsido PCV2 a partir de las células T. ni. La congelación se realizó en un congelador a < -75° C en un baño de etanol/hielo seco. El contenido del tubo se congeló durante 5 minutos a 24 horas. La descongelación se hizo en un baño de agua a 37° C ± 1° C.
Las materias sobrenadantes que contenían el antígeno de cápsido PCV2 a partir de la concentración mediante un procedimiento de centrifugación y congelación -descongelación se activaron con etilenoimina binaria (BEI) a 20° C ± 3° C con una mezcla constante durante 48-72 horas. La BEI se inactivó seguidamente con tiosulfato de sodio de 2M a 20° C ± 3° C con mezcla constante durante 2-18 horas.
Ejemplo 2
Producción de una primera realización de una vacuna lista para usar
Un aislado de Mycoplasma hyopneumoniae se cultivó y se recolectó cuando el cultivo alcanzó una concentración
de bacterias de aproximadamente 1 x 107 CCU/ml de medio de cultivo. Las células recolectadas se lavaron tres veces en tampón de tris-cloruro de sodio (TN) [tris-(hidroximetil)aminometano 10 mM; NaCl 140 mM], pH 7,2 y 7,4 y seguidamente se concentró mediante centrifugación. Las células recolectadas se inactivaron mediante rotura por ultrasonidos a través de un sonicador. La concentración de antígeno se ajustó entre 2 y 3 mg por ml con tampón TN, se solubilizó con un detergente no iónico y seguidamente se añadió una cantidad proporcional de saponina Quil-A a antígeno solubilizado. Seguidamente se añadió mertolato a la mezcla desde aproximadamente 1:10.000 hasta aproximadamente 1:20.000 del volumen final de vacuna para formar una mezcla parcialmente adyuvada. La mezcla parcialmente adyuvada contenía al menos 120 pg del M. hyopneumoniae tratado y concentrado y aproximadamente 100 microgramos de saponina por ml.
Se produjo antígeno de cápsido PCV2 inactivado como se describió en el ejemplo 1. Se añadió NP-40 al 1% v/v al antígeno y la mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente para solubilizar el antígeno. Se retiró una muestra para la determinación de la dosis mediante ELISA. El antígeno de referencia para el ensayo ELISA fue PCV2- Ag-05181. Se estableció una curva estándar para el antígeno de referencia diluyendo en serie el antígeno de referencia y detectando el antígeno con anticuerpo anti-PCV2 monoclonal (RTI, Brookings, SD) a una concentración de 0,4 pg/ml. Se definió una unidad ELISA como la dosis protectora mínima de antígeno de cápsido PCV2, determinada mediante vacunación y exposición de PCV2, como se describe, por ejemplo, en los ejemplos 4 y 6. El antígeno de referencia contenía cuatro unidades ELISA/ml. Una vez que se determinaron las unidades ELISA del antígeno de referencia, el número se usó para la determinación de la dosis para todas las muestras ensayadas mediante ELISA frente al antígeno de referencia. Seguidamente se mezcló la mezcla de M. hyopneumoniae parcialmente adyuvada con el antígeno de cápsido PCV2 en una proporción de 120 pg de M. hyopneumoniae tratado y concentrado respecto a 1 unidad de ELISA de antígeno de cápsido PCV2. La solución se mezcló durante al menos una hora y seguidamente se añadió tampón TN para diluir la solución hasta el volumen final y seguidamente se añadió adyuvante Trigen hasta un 15% v/v del volumen final para proporcionar una vacuna que tenía 15% v/v de Trigen y 100 pg de saponina por ml. La vacuna se mezcló durante al menos 2 horas y seguidamente se almacenó a 2-7° C. La Tabla 4 muestra un ejemplo de formulación de la vacuna lista para usar.
Tabla 4
Ejemplo 3
Producción de una segunda realización de vacuna lista para usar
Se preparó una mezcla parcialmente adyuvada que contenía al menos 120 pg de M. hyopneumoniae tratado como se describió en el ejemplo 2. La mezcla de M. hyopneumoniae parcialmente adyuvada se mezcló seguidamente con el antígeno de cápsido PCV2 en una proporción de 120 pg del M. hyopneumoniae tratado y concentrado para 1 unidad ELISA de antígeno de cápsido PCV2. La solución se mezcló durante al menos una hora y seguidamente se añadió tampón TN para diluir la solución hasta el volumen final y se añadió gel 01 Montadine (SEPPIC) hasta un 15% v/v del volumen final, para proporcionar una vacuna que tenía 15% v/v de gel y 100 pg de saponina por ml. La vacuna se mezcló durante al menos 2 horas y seguidamente se almacenó a 2 7° C. La Tabla 5 muestra un ejemplo de formulación de la vacuna lista para usar.
Tabla 5
Ejemplo 4
Eficacia de una dosis única de vacuna lista para usar en lechones contra una exposición a PCV2
Se llevó a cabo una determinación de la eficacia de la vacuna lista para usar del ejemplo 2 en lechones en dos estudios. El primer estudio demostró la eficacia de una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 2contra una exposición a PCV2 virulento aislado en campo. El segundo estudio (Ejemplo 5) demuestra la eficacia de una dosis única de 1 ml de la vacuna del Ejemplo 2 contra una exposición a M. hyopneumoniae. Estos estudios muestran que una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 2 es eficaz contra infecciones de M. hyopneumoniae y PCV2 en lechones.
Se dividieron aleatoriamente 46 lechones derivados de cesárea, desprovistos de calostro (CDCD) (Sexo misto, edad 12 años /- 1 día en los 3 grupos siguientes de tratamiento, como se muestra en la Tabla 6.
Tabla 6
Los lechones del grupo 1 y grupo 2 se vacunaron con una dosis de 1 ml de testigo de placebo o la vacuna lista para usar de PCV2- M. Hyopneumoniae según el ejemplo 2, respectivamente. Todos los lechones fueron observados diariamente durante el período de estudio y se recogieron muestras de sangre de los lechones de los grupos 1, 2 y 3 en el día 0 y semanalmente a lo largo del período de estudio. Los lechones fueron observados en cuanto a cualesquiera anormalidades respiratorias (0 = normal; 1= jadeo/rápido; 2 = disnea), comportamiento (0 = normal; 1= leve a moderadamente aletargado; 2 = gravemente aletargado o yacente), estado corporal (0 = normal, 1= pérdida leve de estado corporal; 2 = pérdida moderada/grave de estado corporal) y el sitio de inyección desde el día 0 hasta el día 27 (no se muestran los datos). No se observaron reacciones en el sitio de la inyección de cualquiera de los lechones. Dos de los lechones del grupo de placebo y dos lechones del grupo de vacuna tenían anormalidades críticas durante el período de observación, pero la necropsia de estos animales no proporcionó evidencia de que la vacuna y/o la vacunación provocará reacciones adversas en el animal hospedante.
Se recogieron muestras de suero previas a la exposición de los lechones en el grupo de placebo (grupo 1) y el grupo de vacuna (grupo 2) y se ensayaron en cuanto a anticuerpos específicos de PCV2 en un ensayo ELISA. Los resultados de este ensayo (no se muestran en los datos) indicaron que solamente tres lechones en el grupo vacunado tuvieron un ensayo positivo para anticuerpo específico de PCV2 durante el período previo a la
exposición. Todos los demás, junto con las muestras del grupo de placebo, fueron negativos en cuanto al anticuerpo específico de PCV2.
En el día 31, los lechones de los grupos 1, 2 y 3 fueron expuestos a una inoculación intranasal de 1 ml por orificio nasal de un aislado de campo de PCV2 proporcionado por Newport Laboratories (Worthington, MN) y 1 ml por vía intramuscular de una dosis 50/50 de la cepa Newport y aislado de PCV2 P127/7/06 (University of Minnesota Veterinary School, St. Paul, MN). Se midieron las temperaturas rectales de los lechones y se registraron en los días -2, -1, 0 y diariamente hasta el día 12 posterior a la exposición. Los pichones del grupo 3 extinguieron el día 28 después de la vacunación. Todos los lechones de los grupos 1 y 2 se extinguieron en el día 59 posterior a la vacunación (4 semanas después de la exposición). Se evaluaron las lesiones pulmonares gruesas, hipertrofia en el tracto traqueobronquial, nódulos linfáticos mesentéricos y subilíacos y las amígdalas. Se examinaron las amígdalas, nódulo linfático mesentérico, nódulo linfático subilíaco y se puntuaron según los procedimientos establecidos por la Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory (ISU VDL). Cada una de las muestras de nódulos linfáticos fue valorada y puntuada como sigue:
Puntuación de supresión de nódulos linfáticos:
0 = negativo
1 = positivo-leve
2 = positivo-moderado
3 = positivo-grave
Puntuación de Inmunohistoquímica de nódulos linfáticos (IHC):
0 = negativo
1 = positivo, < 10% de células con tinción de PCV2
2 = positivo, 10-50% de células con tinción de PCV2
3 = positivo, > 50% de células con tinción de PCV2.
Se analizaron muestras de suero recogidas en los días 0, 7, 14 y 21 posteriores a la vacunación mediante ELISA en cuanto a anticuerpos específicos de PCV2, expresados como relación S/P (la relación S/P < 0,4 se consideró negativa). Las muestras de suero recogidas en los días 31 (día de la exposición), 38, 45, 52 y 59 se analizaron también mediante ELISA en cuanto a anticuerpos específicos de PCV2 (la relación S/P < 0,3 se consideró negativa). Todas las muestras recogidas en el día 0 posterior a la exposición fueron negativas en cuanto a anticuerpos específicos de PCV2. Nueve muestras en el grupo 2 resultaron positivas en el día 7 posterior a la exposición. Todas las muestras de los días 14, 21 y 28 del grupo 2 fueron positivas en cuanto a anticuerpo de PCV2. Todas las muestras de exposición con posterioridad a los días 7 y 14 del grupo 1 fueron negativas. Los valores medios de ELISA OD del grupo 1 (placebo) y el grupo 2 (vacuna) se muestran en la FIG. 1. Los análisis estadísticos pusieron de manifiesto que los títulos en el grupo vacunado aumentaron significativamente a lo largo del tiempo y la velocidad a la que aumentaron los títulos en el grupo vacunado fue significativamente mayor en el grupo de placebo (no se muestran los dato).
Las muestras de suero recogidas en los días 0, 7, 14, 21 y 28 posteriores a la exposición fueron ensayadas mediante qPCR en ISU VDL para determinar la carga vírica. Los resultados se expresaron como el número de copias por ml de las muestras ensayadas. Las cargas virales medias geométricas (Log) del grupo 1 (testigo de placebo) y el grupo 2 (vacuna) se muestran en la FIG. 2. Todas las muestras recogidas en el día 0 fueron negativas. Todas las muestras del grupo 1 resultaron positivas en el día 7 posterior a la exposición, mientras que todas excepto dos muestras del grupo 2 fueron positivas (no se muestran los datos). Además, 11 animales del grupo 2 produjeron resultados de qPCR negativos en el día 28 posterior a la exposición, mientras que solamente 1 animal del grupo 1 fue negativo en el día 28 (no se muestra los datos). La reducción de carga vírica media en el grupo vacunado, en comparación con la de grupos de placebo, estaba por encima de un 97% en el día 7 y por encima de un 99% en los días 14, 21 y 28 posteriores a la exposición. Los análisis estadísticos pusieron de manifiesto que las cargas víricas en el grupo vacunado (grupo 2) eran significativamente inferiores a las del grupo de placebo (grupo 1) en todos los datos de las muestras después de la exposición. Además, la velocidad de disminución de la carga vírica fue significativamente mayor en el grupo vacunado que en el grupo de placebo (no se muestran los datos). Los resultados de qPCR y ELISA mostrados en una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 2 redujeron la viremia en los lechones provocada por la infección de PCV2.
Los lechones en los grupos 1 y 2 fueron ensayados en cuanto a la temperatura desde el día -2 hasta el día 12 posterior a la exposición (del día 29 al día 23 posteriores a la vacunación). La temperatura media tanto en el grupo 1 (placebo) como en el grupo 2 (vacuna) fue elevada en el primer día de toma de la temperatura. No hubo diferencias significativas de la temperatura entre los grupos 1 y 2 desde el día -2 hasta el día 7 posterior a la exposición. Sin embargo, las temperaturas fueron significativamente superiores en el grupo placebo (grupo 1) en comparación con los vacunados (grupo 2) en el día 8 (p = 0,015), día 9 (p= 0,009), día 11 (p= 0,020) y día 12 (p= 0,009), posteriores a la exposición (datos no mostrados). Las temperaturas medias del grupo 1 (placebo) y grupo 2 (vacuna) se exponen en la FIG. 3.
Se realizaron diagnósticos de grandes patologías en el día 28 posterior a la exposición por medio de la entidad Veterinary Resource, Inc. El compendio de la histopatología y el diagnóstico de grandes patologías se muestra en la Tabla 7 (placebo) y Tabla 8 (vacunados). 13 de 20 (65%) lechones del grupo 1 exhibían indicios de grandes patologías congruentes con los indicios clínicos de infección de PCV2. Solamente dos lechones en el grupo 2 tenían una hipertrofia de nódulos linfáticos leve. Estos datos, junto con la diferencia de temperatura significativa entre los lechones del grupo 1 (placebo y el grupo 2 (vacunados), muestran que la administración de una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 2 evitó la colonización del virus de tejidos linfoides, agotamiento linfoide e indicios clínicos provocados por una infección de PCV2 en los lechones.
Tabla 7
MLN: nódulos linfáticos mesentéricos ILN: nódulo linfático ilíaco
TBLN: nódulo linfático traqueobronquial LD: agotamiento linfoide
Tabla 8
Se recogieron amígdalas (t), nodulos linfáticos mesentéricos (MLN), nodulos linfáticos subilíacos (SLN) y nodulos linfáticos traqueobronquiales (TBLN) de todos los lechones en el día de la extinción. Se realizó un análisis inmunohistoquímico (IHC) sobre las muestras. Los resultados se recogen en la Tabla 9. Al comparar la puntuación de IHC entre los dos grupos, se encontraron diferencias altamente significativas en la totalidad de los tejidos examinados; los valores p de MLN, SLN, T y TBLN fueron 0,0001, 0,0034, 0,0008 y 0,0010, respectivamente. Las puntuaciones de los lechones y tejidos individualizados se muestran en la Tabla 7 y 8. Tabla 9
Diecisiete de veinte (85%) de los lechones en el grupo 2 (vacunados) dieron resultado negativo en los ensayos de IHC para todos los tejidos examinados, mientras que 17 de 20 (85%) de los lechones del grupo 1 (placebo) mostraron resultados positivos en el ensayo de IHC. Además, La puntuación total de IHC más elevada de los lechones positivos en el grupo 2 fue de 3, mientras que 12 lechones en el grupo 1 tenían una puntuación de ICH de 4 o más (2 tenían la puntuación máxima de 12). La distribución de las puntuaciones de IHC del grupo 1 y el grupo 2 se muestran en la FIG. 4. Los resultados en la Tabla 9 de la FIG. 4 muestran que una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 2 evitó la colonización de virus de tejidos linfoides en los lechones provocada por infección de PCV2.
Si se comparan las puntuaciones de agotamiento de los grupos 1 y 2, se encuentran diferencias significativas en todos los tejidos examinados; los valores de p fueron 0,003, 0,0003, 0,005 y 0,0008 para MLN, SLN, T y TBLN, respectivamente. Un ocho por ciento (16 de 20) de los lechones en el grupo 1 (placebo) tenían puntuaciones de agotamiento de tejidos linfoides, mientras que un 85% (17 de 20) de los lechones del grupo 2 (vacunados) no tenían puntuaciones de agotamiento linfoide. Tres lechones del grupo 1 tenían una puntuación máxima de 12. La distribución de las puntuaciones se muestra en la FIG. 5. Estos resultados muestran que una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 2 evitó el agotamiento linfoide en los lechones provocado por una infección de PCV2. Ejemplo 5
Eficacia de una dosis única de vacuna lista para usar en lechones contra exposición a M. hyopneumoniae
Se realizó un estudio de la eficacia de la vacuna lista para usar del ejemplo 2 en lechones contra exposición a M. hyopneumoniae. Este estudio conjuntamente con el estudio de exposición a PCV2 en el ejemplo 4 demostró que una dosis única de la vacuna del ejemplo 2 es eficaz contra M. hyopneumoniae y contra infecciones de PCV2 en lechones.
Cuarenta y tres lechones CDCD (sexo mixto, edad de 12 días /- 1 día) se dividieron aleatoriamente en los siguientes grupos de tratamiento que se muestran en la Tabla 10. Los lechones fueron negativos para anticuerpo de M. hyopneumoniae (relación S/P < 0,4).
Tabla 10
Los lechones se vacunaron como se muestra en la Tabla 10 y fueron observados diariamente durante el estudio en cuanto a una salud normal. En el día 33 posterior a la vacunación, los lechones fueron expuestos a un inóculo pulmonar de M. hyopneumoniae (LI37), obtenido del departamento de la entidad Veterinary Microbiology and Preventive Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University. Todos los lechones fueron expuestos por vía intratraqueal con 18 ml de inóculo. Una observación diaria de los lechones mostró que la totalidad tenía un estado de salud normal en toda la duración del estudio, excepto un lechón en el grupo de placebo que se determinó que había muerto de una obstrucción intestinal.
Los lechones se extingueron el día 37 posterior a la exposición y se sometieron a necropsia para valorar las lesiones pulmonares. Las puntuaciones de las lesiones se expresaron como el porcentaje de área superficial pulmonar que mostraba grandes lesiones típicas de una neumonía enzoótica. El método para evaluar las lesiones pulmonares fue adaptado a partir de Pointon et al., 1999, Disease surveillance at slaughter, In: Straw, B.E., D'Allaire, S., Mengeling, W.L., Taylor, D.J. (Eds.), Diseases of Swine, 8th Ed., Iowa State University Press, Ames, Iowa, EE.UU., pág.1111-1132. El pulmón se dividió en siete secciones: apical izquierda (0.1), apical derecha (0,1), cardíaca izquierda (0.1), cardíaca derecha (0.1), difragmática izquierda (0,25), diafragmática derecha (0.25) e intermedia (0.1). Las lesiones pulmonares se valoraron individualmente para cada sección y se expresaron como un porcentaje del pulmón enfermado frente a la sección completa. Cuando se calcula el total de la puntuación de la lesión pulmonar, se le dio a cada sección un coeficiente para representar el porcentaje de cada sección respecto al pulmón completo. Los coeficientes de cada sección se muestran como el número entre paréntesis con anterioridad. La puntuación de la lesión pulmonar media en el grupo vacunado (grupo 2) fue de 1,727%. La puntuación de la lesión pulmonar media en el grupo de placebo (grupo 1) fue de 6,713%. Hubo once lechones en el grupo 2 que no tenían lesión pulmonar, mientras que 18 de 20 (90%) de los lechones en el grupo 1 tenían lesiones pulmonares, con puntuaciones de lesiones que variaban en el intervalo de 1,0% a 16,5%.
Un análisis de la fracción mitigada puso de manifiesto que las puntuaciones de lesiones pulmonares de los lechones del grupo 1 eran significativamente mayores que las de los lechones del grupo 2. Se estimó una fracción mitigada de 0,6409 (95% CI: 0,3523, 0,8818) cuando no se consideró el efecto de las camadas, mientras que se estimó una fracción mitigada de 0,5955 (95% CI: 0,4355, 0,7553) cuando se consideró el efecto de las camadas. Ambas cosas demostraban que la vacuna redujo significativamente las puntuaciones de las lesiones pulmonares en los lechones vacunados en comparación con los lechones del grupo de placebo.
Se recogieron de forma aséptica muestras de tejidos pulmonares que contenían las lesiones, así como una parte del tejido pulmonar aparentemente normal contiguo a las lesiones. Se recogió una muestra del lóbulo apical si no hubo lesión en el pulmón. Cada una de las muestras se mantuvo en un tubo esterilizado con 5 ml de medios de cultivo. Las muestras se analizaron mediante PCR en cuanto a la presencia de M. hyopneumoniae en la muestra. Cinco lechones del grupo vacunado (grupo 2) dieron resultado negativo en el ensayo PCR y dos de ellos fueron sospechosos. El resto de los lechones del grupo 2 fueron positivos. En el grupo 1, 19 de 20 (95%) de los lechones fueron positivos en PCR para M. hyopneumoniae. La lesión pulmonar y los resultados de PCR muestran que una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 2 reduce las lesiones pulmonares provocadas por infección de M. hyopneumoniae.
Ejemplo 6
Eficacia de una dosis única de vacuna lista para usar en lechones expuestos a PCV2.
Se realizó un estudio de la eficacia de la vacuna lista para usar del ejemplo 3 en lechones, en dos estudios. El primer estudio demostró la eficacia de una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 3 contra una exposición a PCV2 virulenta aislada de campo. El segundo estudio demostró la eficacia de una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 3 contra M. hyopneumoniae. Estos estudios muestran que una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 3 es eficaz contra infecciones de M. hyopneumoniae y PCV2 en lechones.
Se dividieron aleatoriamente 46 lechones CDCD (sexo mixto, edad de 12 días /- 1 día) en los tres grupos de tratamiento siguientes, que se muestran en la Tabla 11.
Tabla 11
Los lechones del grupo 5 y del grupo 4 se vacunaron con una dosis de 1 ml de testigo de placebo o la vacuna de PCV2-M. hyopneumoniae lista para usar según el ejemplo 3, respectivamente. Se observó la totalidad de los lechones diariamente durante el período de estudio y se recogieron muestras de sangre de los lechones de los grupos, 3, 4 y 5 en el día 0 y semanalmente durante todo el período de estudio. Los lechones se observaron diariamente en cuanto a anomalías en el estado respiratorio, de comportamiento y corporal y el sitio de inyección desde el día 0 hasta el día 27, como se describe en el ejemplo 4. No se observaron reacciones en el sitio de inyección a partir de cualquiera de los lechones. Un cerdo del grupo vacunado (grupo 4) exhibió inicios clínicos leves durante el período de observación.
En el día 31, los lechones de los grupos 4 y 5 fueron expuestos por inoculación nasal de 1 ml por orificio nasal de un aislado de campo de PCV2 (Newport Laboratories, Worthington, MN) y 1 ml por vía intramuscular de una dosis 50/50 de la cepa Newport y aislado P12 7/7/06 de PCV2 (University of Minnesota Veterinary School, St. Paul, MN). Se midieron las temperaturas rectales de los lechones y se registraron en los días -2, -1, 0 y diariamente hasta el día 12 posterior a la exposición. Los lechones del grupo 3 se extinguieron en el día 28 posterior a la vacunación. La totalidad de los lechones de los grupos 4 y 5 se extinguió en el día 5 posterior a la vacunación (semanas después de la exposición). Se evaluaron y se puntuaron como se describe en el ejemplo 4, las lesiones pulmonares grandes, hipertrofia en nódulos linfáticos traqueobronquiales, mesentéricos y subilíacos y las amígdalas.
Muestras de suero recogidas en los días 0, 7, 14 y 21 después de la vacunación fueron analizadas mediante ELISA en cuanto a anticuerpos específicos de PCV2 como se describe en el ejemplo 4. Muestras de suero recogidas en los días 31 (día de la exposición), 38, 45, 52 y 59 fueron analizadas mediante ELIsA en cuanto a anticuerpos específicos de PCV2 como se describe en el ejemplo 4. Dos lechones del grupo 4 (vacunados) dieron un ensayo positivo en cuanto a anticuerpo específico de PV2 durante el período previo a la exposición. Todos los demás, junto con las muestras recogidos del grupo de placebo (grupo 5) fueron negativos.
Todas las muestras recogidas en el día 0 posterior a la exposición fueron negativas en cuanto a anticuerpos específicos de PCV2. Las muestras recogidas a partir del grupo de placebo (grupo 5) en el día 7 y 14 posterior a la exposición fueron negativas. Siete de los lechones del grupo 4 (vacunados) fueron positivos en el día 7 posterior a la exposición y 19 de los lechones fueron positivos en el día 14 posterior a la exposición. La relación S/P media del grupo 5 (placebo) y el grupo 4 (vacunados) se muestra en la FIG. 6. Un análisis estadístico puso de manifiesto que los títulos en el grupo vacunado aumentaban significativamente a lo largo del tiempo, y la velocidad a la que aumentaban los títulos en el grupo vacunado eran significativamente mayor que en el grupo de placebo (no se muestran datos).
Se ensayaron muestras de suero recogidas en los días 0, 7, 14, 21 y 28 posteriores a la exposición mediante qPCR como se describe en el ejemplo 4. Los resultados se expresaron como el número de copias por ml en las muestras ensayadas. Las cargas virales medias geométricas (Log) del grupo 5 (testigo de placebo) y el grupo 4 (vacunados) se muestran en la FIG. 7. Todas las muestras recogidas en el día 0 fueron negativas. Todas las muestras del grupo 5 resultaron positivas en el día 7 posterior a la exposición, mientras que la totalidad menos una de las muestras del grupo 4 fueron positivas (no se muestran datos). El número medio de copias de los
materiales genómicas de PCV2 en 1 ml de las muestras de suero fue de 12, 589, 912, 1737 y 125 en el grupo vacunado (grupo 4) y en el grupo de placebo (grupo 5) fueron de 239.883, 851.138, 229.086 y 38.018, en los días 7, 14, 21 y 28, respectivamente, posteriores a la exposición. Consecuentemente, la reducción de la carga viral en los vacunados (grupo 4) en comparación con el grupo 5 (placebo) fue de 95% en el día 7 y más de 99% en los días 14, 21 y 28 posteriores a la exposición.
Un análisis estadístico puso de manifiesto que las cargas virales en el grupo vacunado (grupo 4) eran significativamente inferiores a las del grupo de placebo (grupo 5) en todos los datos de las muestras después de la exposición. La carga viral permaneció elevada en el grupo de placebo, como se puso de manifiesto mediante disminuciones no significativas de la carga viral en cada fecha de toma de muestras, mientras que la carga viral cayó significativamente desde el día 7 hasta el día 14 y desde el día 21 hasta el día 28 posteriores a la exposición (no se muestran datos). Los resultados de qPCR y ELISA muestran que una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 3 redujo la viremia en los lechones provocada por infección de PCV2.
Los lechones en los grupos 4 y 5 fueron ensayados en cuanto a la temperatura desde el día -2 hasta el día 12 posterior a la exposición (día 29 a día 43 posteriores a la vacunación). La temperatura media en el grupo 5 (placebo) así como en el grupo 4 (vacunados) fue elevada en el primer día de toma de temperaturas. No hubo diferencias significativas en la temperatura entre los grupos 4 y 5, en los días anteriores a la exposición y los días posteriores a la exposición, excepto en que en el día 2 posterior a la exposición, la temperatura en el grupo de placebo (grupo 5) fue significativamente superior a la del grupo de vacunados (grupo 4), p< 0,05 (datos no mostrados). Las temperaturas medias de los grupos 4 y 5 se muestran en la FIG. 8.
Se realizaron diagnósticos de grandes patologías en el día 28 posterior a la exposición, como se describe en el ejemplo 4. El compendio de los diagnósticos histopatológicos y de grandes patologías se muestra en la Tabla 12 (placebo) y la tabla 13 (vacunados). Doce de los 21 lechones (57%) en el grupo 5 (placebo) exhibieron indicios de grandes patologías congruentes con los indicios clínicos de PCV2. Dieciséis de los 21 lechones en el grupo de vacunados (grupo 4) no tuvieron grandes lesiones. La reducción de grandes lesiones en el grupo de vacunados en comparación con el grupo de placebo fue de más de 41%. Estos datos, junto con la diferencia de temperatura significativa entre los lechones del grupo 5 (placebo) y el grupo 4 (vacunados) muestra que la administración de una única dosis de 1 ml de la vacuna del ejemplo 3 evitó la colonización vírica de tejidos linfáticos, agotamiento linfoide y los indicios clínicos provocados por la infección de PCV2 en los lechones.
Tabla 12
MLN: nódulo linfático mesentérico
ILN: nódulo linfático ilíaco
TBLN: nódulo linfático traqueobronquial
LD: agotamiento linfoide
Tabla 13
Las amígdalas (t), nódulos linfáticos mesentéricos (MLN), nódulos linfáticos subilíacos (SLN) y nódulos linfáticos traqueobronquiales (TBLN) se recogieron de todos los lechones en el día de la extinción. Las muestras se
examinaron y se puntuaron como se describe en el ejemplo 4. Los resultados se recogen en la Tabla 14. Si se compara la puntuación de IHC entre los dos grupos, se encontraron diferencias altamente significativas en todos los tejidos examinados; los valores de p de MLN, SLN, T y TBLN fueron de 0,011, 0,001, 0,0008 y 0,002, respectivamente. Las puntuaciones de los lechones y tejidos individualizados se muestran en las tablas 12 y 13. Tabla 14
Las puntuaciones globales entre el grupo de vacunados y el grupo de placebo son altamente significativas con un valor de P de 0,0002. La distribución de puntuaciones de IHC del grupo 4 y el grupo 5 se muestran en la FIG.
9. Los resultados de la Tabla 14 y la Fig. 9 muestran que una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 3 redujo la colonización vírica de tejidos linfoides en los lechones, provocada por infección de PCV2.
Al comparar las puntuaciones de agotamiento de los grupos 4 y 5, se encontraron diferencias significativas en todos los tejidos examinados, los valores de p fueron de 0,009, 0,002, 0,0007 y 0,0267 para MLN, SLN, T y TBLN, respectivamente (no se muestran datos). La distribución de puntuaciones se muestra en la FIG. 10. Las puntuaciones del agotamiento global entre el grupo de vacunados y de placebo muestra una diferencia altamente significativa con un valor de T de 0,0003. Estos resultados muestran que una única dosis de 1 ml de la vacuna del ejemplo 3 redujo el agotamiento linfoide en los lechones, provocado por infección de PCV2.
Ejemplo 7
Eficacia de una dosis única de vacuna lista para usar de lechones expuestos a M. hyopneumoniae.
Se realizó un estudio de la eficacia de la vacuna lista para usar del ejemplo 3 en lechones contra una exposición a M. hyopneumoniae. Este estudio, conjuntamente con el estudio de exposición a PCV2 del ejemplo 6 , demostró que una dosis única de la vacuna del ejemplo 3 es eficaz contra infecciones de M. hyopneumoniae y PCV2 en los lechones.
Se dividieron aleatoriamente 24 lechones CDCD (sexo mixto, edad de 12 días /- 1 día) divididos en los siguientes grupos de tratamiento mostrados en la Tabla 15. Los lechones fueron negativos a anticuerpos de M. hyopneumoniae (relación S/P < 0,4).
Tabla 15
Los lechones fueron vacunados como se muestra en la Tabla 15 y se observaron diariamente durante el estudio en cuanto a una salud normal. En el día 33 posterior a la vacunación, los lechones fueron expuestos a un inóculo pulmonar de M. hyopneumoniae (LI37) como se describe en el ejemplo 5. Todos los lechones fueron expuestos por vía intratecal a 18 ml de inóculo. La observación diaria de los lechones mostró que tenían un estado de salud normal a lo largo de toda la duración del estudio, excepto un lechón en el grupo de vacunados, que se determinó que había muerto de obstrucción intestinal.
Los lechones se extinguieron en el día 37 posterior a la exposición y se hizo una necropsia para puntuar las lesiones pulmonares. Las puntuaciones de las lesiones se expresaron como el porcentaje de área superficial pulmonar que mostraba grandes lesiones típicas de neumonía enzoótica, como se describió en el ejemplo 5. La puntuación media de las lesiones pulmonares en el grupo de vacunados (grupo 3) fue de 4,34%. La puntuación media de las lesiones pulmonares en el grupo de placebo (grupo 4) fue de 9,70%.
Un análisis de fracción mitigada puso de manifiesto que las puntuaciones de lesiones pulmonares de los lechones de grupo 4 eran significativamente más elevadas que las de los lechones del grupo 3. Se estimó una fracción mitigada de 0,4619 (91% CI: 0,1405, 0,7429) cuando no se consideró el efecto de camada, mientras que se estimó una fracción mitigada de 0,4419 (95% CI: 0,1471, 0,7000) cuando se consideró el efecto de camada. Ambos demostraron que la vacuna del ejemplo 3 redujo significativamente las puntuaciones de lesiones pulmonares en los lechones vacunados, en comparación con los lechones del grupo de placebo.
Las muestras de tejidos pulmonares que contenían lesiones, así como una parte del tejido pulmonar aparentemente normal contiguo a las lesiones, fueron analizadas mediante PCR en cuanto a la presencia de M. hyopneumoniae en la muestra, como se describió en el ejemplo 5. Un lechón del grupo vacunado (grupo 3) fue negativo y 4 fueron sospechosos. El resto de los lechones del grupo 3 fueron positivos. En el grupo 45, 19 de 21 de los lechones (95%) fueron positivos por PCR en cuanto a M. hyopneumoniae, 1 fue negativo y 1 fue sospechoso. Los resultados de lesiones pulmonares y PCR muestran que una dosis única de 1 ml de la vacuna del ejemplo 3 reduce las lesiones pulmonares provocadas por una infección de M. hyopneumoniae.
Aunque se han descrito algunas realizaciones de la invención, pueden existir otras realizaciones. Aunque la memoria descriptiva incluye una descripción detallada, el alcance de la invención está indicado por medio de las siguientes reivindicaciones. Además, aunque la memoria descriptiva ha sido descrita en un lenguaje específico para las características estructurales y/o actuaciones metodológicas, las reivindicaciones no están limitadas por las características o actuaciones anteriormente descritas. En lugar de ello, las características y actuaciones específicas anteriormente descritas se exponen como aspectos y realizaciones ilustrativos de la invención.
Claims (13)
1. Una vacuna de dosis única multivalente, de forma que la dosis de la vacuna comprende:
una cantidad inmunógena de un antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 recombinante;
de 60 a 180 microgramos de Mycoplasma hyopneumoniae inactivado o atenuado o un lisado o un sonicado de un antígeno de Mycoplasma hyopneumoniae atenuado, inactivado o virulento;
un sistema adyuvante de dos componentes, comprendiendo el primer componente un adyuvante de saponina y comprendiendo el segundo componente un adyuvante de aceite en agua; y
un vehículo fisiológicamente aceptable;
de forma que dicha dosis comprende un volumen de 1 ml; y
de forma que dicha dosis provoca una respuesta inmune en un cerdo vacunado con la vacuna, que reduce o previene uno o más de: viremia provocada por PCV2
colonización de virus PCV2 de tejidos linfoides;
en comparación con un cerdo que no ha sido vacunado con la vacuna o al que se ha administrado un testigo negativo antes de ser expuesto a una cepa de campo de PCV2.
2. La vacuna de la reivindicación 1, en la que la cantidad inmunógena de antígeno de M. hyopneumoniae comprende al menos 120 microgramos de antígeno de M. hyopneumoniae por dosis.
3. La vacuna de la reivindicación 1, que comprende de 50 microgramos a 150 microgramos de saponina por dosis.
4. La vacuna de la reivindicación 3, en la que el primer componente del sistema adyuvante comprende saponina Quil-A o un derivado de la misma escogida entre QS-7, QS-17, QS-18, QS-21 o una combinación de los mismos.
5. La vacuna de la reivindicación 1, en la que el segundo componente del sistema adyuvante comprende de 10% a 40% v/v de un adyuvante de aceite en agua por dosis.
6. La vacuna de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un conservante.
7. La vacuna de la reivindicación 6, en que la vacuna comprende de 0,005 a 0,01% en peso de conservante por dosis.
8. La vacuna de la reivindicación 6 o 7, en la que el conservante comprende timerosal.
9. La vacuna de la reivindicación 1, para ser usada en el tratamiento o la prevención de una infección de PCV2 en un cerdo, de forma que dicho tratamiento comprende administrar al cerdo una dosis única de dicha vacuna.
10. La vacuna para ser usada según la reivindicación 9, de forma que la vacuna es administrada al cerdo a las 1 02 semanas de su nacimiento.
11. La vacuna de la reivindicación 1, para ser usada en el tratamiento o en la prevención de una infección de M. hyopneumoniae en un cerdo, que comprende administrar al cerdo una dosis única de la vacuna de la reivindicación 1.
12. La vacuna para ser usada según la reivindicación 11, de forma que la vacuna es administrada al cerdo a las 1 o 2 semanas de su nacimiento.
13. Un método para formular una vacuna de dosis única multivalente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende:
solubilizar una cantidad inmunógena de antígeno de M. hyopneumoniae en un detergente no iónico, mezclar el antígeno de M. hyopneumoniae solubilizado con saponina para formar una mezcla parcialmente adyuvada;
solubilizar una cantidad inmunógena de antígeno de cápsido ORF2 de PCV2 recombinante en un detergente no iónico;
mezclar el antígeno de cápsido solubilizado con la mezcla parcialmente adyuvada para formar una vacuna parcialmente adyuvada;
y mezclar la vacuna parcialmente adyuvada con un adyuvante de aceite en agua para formar la vacuna de dosis única multivalente.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361821011P | 2013-05-08 | 2013-05-08 | |
| PCT/US2014/037246 WO2014182872A1 (en) | 2013-05-08 | 2014-05-08 | Vaccine for pcv2 and mycoplasma |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2882374T3 true ES2882374T3 (es) | 2021-12-01 |
Family
ID=51867734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14794866T Active ES2882374T3 (es) | 2013-05-08 | 2014-05-08 | Vacuna para PCV2 y micoplasma |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9649370B2 (es) |
| EP (1) | EP2994162B1 (es) |
| DK (1) | DK2994162T3 (es) |
| ES (1) | ES2882374T3 (es) |
| PL (1) | PL2994162T3 (es) |
| WO (1) | WO2014182872A1 (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2882374T3 (es) | 2013-05-08 | 2021-12-01 | Pharmgate Biologics Inc | Vacuna para PCV2 y micoplasma |
| KR102600537B1 (ko) | 2014-12-11 | 2023-11-08 | 인터벳 인터내셔널 비.브이. | 즉시 사용가능한 pcv2/m.hyo 혼합 백신에 대한 방법 |
| JP7510874B2 (ja) * | 2017-12-22 | 2024-07-04 | ヒプラ シエンティフィック エセ．エレ．ウ． | マイコプラズマ及びブタサーコウイルスに対する皮内混合ワクチン |
| CN110045117A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-07-23 | 江苏南农高科技股份有限公司 | 猪肺炎支原体固相竞争elisa试剂盒及其制备方法和应用 |
| WO2021018806A1 (en) * | 2019-07-26 | 2021-02-04 | Ceva Sante Animale | Igg-depleted porcine serum and the uses thereof |
| CN112213484A (zh) * | 2020-12-10 | 2021-01-12 | 北京科牧丰生物制药有限公司 | 一种基于elisa法检验猪肺炎支原体灭活疫苗体外效力的方法 |
| CN114134098A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-03-04 | 成都史纪生物制药有限公司 | 一种猪肺炎支原体的灭活方法 |
| CN114470181B (zh) * | 2022-02-21 | 2024-01-09 | 成都依思康生物科技有限公司 | 一种猪圆环病毒2型（pcv2）的复合水佐剂疫苗及其制备方法 |
Family Cites Families (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0571648A1 (en) | 1992-05-26 | 1993-12-01 | Chung-Nan Weng | Vaccine protecting against mycoplasmal pneumonia |
| GB9326253D0 (en) | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
| DE69518316T2 (de) | 1994-05-10 | 2001-03-29 | American Home Products Corp., Madison | Modifizierter,verbesserter,lebender brsv impfstoff |
| AUPN178995A0 (en) * | 1995-03-16 | 1995-04-13 | University Of Melbourne, The | Antigen composition |
| BR9803232A (pt) | 1997-08-26 | 2000-01-11 | Pfizer Prod Inc | Vaicna de neospora. |
| FR2781159B1 (fr) | 1998-07-06 | 2000-10-06 | Merial Sas | Vaccin circovirus et parvovirus porcin |
| UA78180C2 (uk) | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
| US6391314B1 (en) | 1997-10-03 | 2002-05-21 | Merial | Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents |
| US6224882B1 (en) | 1997-11-07 | 2001-05-01 | Protein Science Corp. | Insect cells or fractions as adjuvant for antigens |
| FR2772047B1 (fr) | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| FR2789695B1 (fr) | 1999-02-11 | 2003-03-07 | Merial Sas | Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs |
| US6497883B1 (en) | 1999-06-10 | 2002-12-24 | Merial | Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine |
| US6943152B1 (en) | 1999-06-10 | 2005-09-13 | Merial | DNA vaccine-PCV |
| US7018638B2 (en) | 2000-12-19 | 2006-03-28 | Wyeth | Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine |
| EP1417236A4 (en) | 2001-07-10 | 2010-03-17 | Corixa Corp | COMPOSITIONS AND METHODS FOR ADMINISTRATION OF ENCAPSULATED PROTEINS AND ADJUVANTS IN MICROSPHERES |
| HRP20080235T3 (hr) | 2003-07-24 | 2008-07-31 | Merial Limited | Formulacija vakcine koja sadrži emulziju ulje-u-vodi |
| BRPI0607540B1 (pt) | 2005-04-13 | 2017-05-09 | Merial Ltd | ensaio para a produção de circovírus porcino |
| US7691368B2 (en) | 2005-04-15 | 2010-04-06 | Merial Limited | Vaccine formulations |
| AU2006289102C1 (en) | 2005-09-09 | 2017-11-30 | Intervet International B.V. | PCV-2 vaccine |
| US20080226669A1 (en) | 2005-12-29 | 2008-09-18 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Multivalent pcv2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
| ES2625460T5 (es) | 2006-12-15 | 2020-11-04 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Tratamiento de cerdos seropositivos en anticuerpo anti-PCV2 con antígeno de PCV2 |
| EP1958644A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prevention and treatment of sub-clinical pcvd |
| BRPI0820341B1 (pt) | 2007-11-06 | 2021-11-09 | Zoetis Services Llc | Composição imunogênica para uso na proteção de um animal contra uma doença associada a uma cepa virulenta de mycoplasma hyopneumoniae |
| EP2225367A1 (en) | 2007-12-21 | 2010-09-08 | Wyeth LLC | Methods and compositions for immunizing pigs against porcine circovirus |
| EP2242511A4 (en) * | 2008-01-23 | 2012-10-24 | Boehringer Ingelheim Vetmed | IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE PCV2, AND METHODS FOR PRODUCING SUCH COMPOSITIONS |
| AU2009303845B2 (en) | 2008-10-16 | 2013-09-12 | Zoetis Llc | Torque teno virus (TTV) isolates and compositions |
| TWI627281B (zh) | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物 |
| US9107859B2 (en) * | 2009-09-10 | 2015-08-18 | Merial, Inc. | Vaccine formulations comprising saponin-containing adjuvants |
| TWI442935B (zh) | 2010-12-22 | 2014-07-01 | Sbc Virbac Ltd | 豬第二型環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２）、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用 |
| UA113192C2 (xx) | 2011-12-06 | 2016-12-26 | Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2) | |
| US9120859B2 (en) | 2012-04-04 | 2015-09-01 | Zoetis Services Llc | Mycoplasma hyopneumoniae vaccine |
| UA114503C2 (uk) | 2012-04-04 | 2017-06-26 | Зоетіс Сервісіз Ллс | Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae |
| UA114504C2 (uk) | 2012-04-04 | 2017-06-26 | Зоетіс Сервісіз Ллс | Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs |
| EP2684959A1 (en) | 2012-07-10 | 2014-01-15 | Laboratorios Hipra, S.A. | Vectors for transforming Mycoplasma hyopneumoniae, transformed M.hyopneumoniae strains, and use thereof |
| ES2882374T3 (es) * | 2013-05-08 | 2021-12-01 | Pharmgate Biologics Inc | Vacuna para PCV2 y micoplasma |
| EP3049106A1 (en) | 2013-09-25 | 2016-08-03 | Zoetis Services LLC | Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use |
| US9849168B2 (en) | 2014-01-26 | 2017-12-26 | Jiangsu Academy Of Agricultural Sciences | Attenuated live vaccine against mycoplasmal pneumonia of swine (MPS) and use thereof |
| KR102600537B1 (ko) | 2014-12-11 | 2023-11-08 | 인터벳 인터내셔널 비.브이. | 즉시 사용가능한 pcv2/m.hyo 혼합 백신에 대한 방법 |
-
2014
- 2014-05-08 ES ES14794866T patent/ES2882374T3/es active Active
- 2014-05-08 EP EP14794866.5A patent/EP2994162B1/en not_active Revoked
- 2014-05-08 US US14/889,044 patent/US9649370B2/en active Active
- 2014-05-08 DK DK14794866.5T patent/DK2994162T3/da active
- 2014-05-08 WO PCT/US2014/037246 patent/WO2014182872A1/en not_active Ceased
- 2014-05-08 PL PL14794866T patent/PL2994162T3/pl unknown
-
2017
- 2017-04-10 US US15/483,597 patent/US9956279B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2994162B1 (en) | 2021-04-07 |
| EP2994162A1 (en) | 2016-03-16 |
| US9956279B2 (en) | 2018-05-01 |
| US20160082095A1 (en) | 2016-03-24 |
| PL2994162T3 (pl) | 2021-10-18 |
| US20170216424A1 (en) | 2017-08-03 |
| WO2014182872A1 (en) | 2014-11-13 |
| DK2994162T3 (en) | 2021-06-21 |
| US9649370B2 (en) | 2017-05-16 |
| EP2994162A4 (en) | 2016-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2882374T3 (es) | Vacuna para PCV2 y micoplasma | |
| JP5394750B2 (ja) | 多価ｐｃｖ２免疫原性組成物及び当該組成物を製造する方法 | |
| RU2641970C2 (ru) | Жидкие стабильные вирусные вакцины | |
| TWI479021B (zh) | 第二型豬環狀病毒（ｐｃｖ２）免疫原組合物，及製備該組合物之方法 | |
| ES2905302T3 (es) | Vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae | |
| ES2719483T3 (es) | Vacuna de combinación CVP/Mycoplasma hyopneumoniae/SRRP | |
| ES2688922T3 (es) | Composiciones inmunogénicas que comprenden Lawsonia intercellularis | |
| KR102003620B1 (ko) | Pcv/마이코플라즈마 하이요뉴모니아 조합 백신 | |
| JP6931059B2 (ja) | 豚用混合ワクチン | |
| CN105579060B (zh) | Pcv2b趋异株疫苗组合物以及使用方法 | |
| CN109922825B (zh) | 抗猪细小病毒及猪生殖与呼吸道综合征病毒的疫苗及其制造方法 | |
| JP5789897B2 (ja) | マイコプラズマ・ボビス ワクチン | |
| EP2099927A2 (en) | Methods of reducing porcine circovirus-associated disease outbreaks | |
| JP2013223511A6 (ja) | マイコプラズマ・ボビス ワクチン | |
| JP2011500093A6 (ja) | マイコプラズマ・ボビス ワクチン | |
| BR112020007498A2 (pt) | expressão recombinante da proteína orf2 de pcv2b em células de insetos | |
| KR20150100919A (ko) | 마이코플라스마 항원을 포함하는 면역원성 조성물 | |
| ES2532861T3 (es) | Composiciones inmunogénicas para PCV2 para uso en un método de prevenir una infección por PCV2 | |
| CN102481358A (zh) | 对抗蓝舌病毒的异源性引发-加强免疫疗法 | |
| RU2577127C9 (ru) | Поливалентные иммунногенные композиции pcv2 и способы получения таких композиций | |
| BRPI0519783B1 (pt) | A method for recovering a protein expressed by the open reading frame 2 of PCV2 for the preparation of a composition for invoking an immunity response against PCV2 comprising compositions comprising the material and the use thereof, as well as containers comprising the said compositions, a process for producing a kit AND THE REFERENCE KIT |