BRPI0820341B1 - Composição imunogênica para uso na proteção de um animal contra uma doença associada a uma cepa virulenta de mycoplasma hyopneumoniae - Google Patents
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Abstract
bactéria mycoplasma viva, atenuada, composição de vacina e método para identificar clones de mycoplasma atenuados. a presente invenção refere-se a composições imunogênicas e de vacinas, e métodos para sua preparação e uso, composições estas que são eficazes para proteger contra, minimizar a gravidade de, prevenir e/ou melhorar infecção por m. hyopneumoniae. a administração a um animal de uma ou duas doses de uma composição avirulenta viva de m. hyopneumoniae reforçada com adjuvante aqui descrita é eficaz para proporcionar imunidade ao animal e proteção contra infecção com uma cepa virulenta de m. hyopneumoniae, desta forma reduzindo a gravidade e/ou prevenindo doença causada por uma ou mais cepas virulentas de m. hypneumoniae. são fornecidas também condições que compreendem ainda um ou mais antígenos tais como, por exemplo, uma ou mais bactérias vivas, bacterina, toxóide, e/ou vírus e/ou antigeno viral. são exemplificadas composições imunogênicas que compreendem uma m. hyopneumoniae avirulenta viva reforçada com adjuvante e composições que compreendem uma vacina viva modificada com quimera de circovírus porcino tipo 1-tipo 2 (cpcv1-2) em combinação adicional com uma m. hyopneumoniae avirulenta viva reforçada com adjuvante.
Description
[001] A presente invenção refere-se genericamente aos campos de imunologia e medicina veterinária. Mais especificamente, a presente invenção fornece compoições de M. hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante baseadas em uma cepa J de M. hyopneumoniae, incluindo composições imunogênicas ou de vacina que auxiliam em reduzir a gravidade e/ou prevenir doença causada por uma ou mais cepas virulentas de M. hyopneumoniae. São fornecidas também composições de M. hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante, incluindo composições imunogênicas ou de vacina, que compreendem ainda vacina viva modificada de quimera de Circovírus Porcino Tipo 1- Tipo 2 (cPCV1-2). A administração de uma ou duas doses a um animal de uma composição de M. hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante aqui descrita é eficaz para proporcionar imunidade, includindo imunidade mediada por células e/ou imunidade humoral, contra infecção com uma cepa virulenta de M. hyopneumoniae.
[002] Mycoplasma hyopneumoniae (referida também como M. hyopneumoniae) é um agente etiológico da pneumonia micoplasmática suína. A doença causa tosse crônica, pelo opaco, crescimento retardado e aparência lânguida, durando várias semanas. Lesões características com áreas púrpura a cinza de consolidação, particularmente nos lobos ventral apical e cardíaco são observadas em animais infectados. Embora a doença cause pouca mortalidade, os suínos afetados são frequentemente suscetíveis a infecções secundárias por patógenos oportunistas, resultando em morte ou estresse (R. F. Ross, "Mycoplasmal diseases", páginas 436-444, em A. D. Laman, et al., (editores) "Diseases of Swine", Iowa State University Press, 1986).
[003] Acredita-se que a doença é uma das mais importantes causas de morte associada a doenças em suínos (Whittlestone, páginas 133-176, em Tully e Whitcomb (editores), "The Mycoplasma" Volume 2: "Human and Animal Mycoplasmas", New York, Academic Press, (1979)). A doença resulta geralmente em gnhos de peso ineficientes, e em animais subdesenvolvidos e fracos. Além disso, os suínos afetados são frequentemente suscetíveis a uma infecção secundária por organismos oportunistas (Burch, Pig America páginas 26-27, dezembro de 1982). O impacto econômico da doença é significativo. As perdas econômicas por si só foram estimadas em 200 a 250 milhões de dólares anualmente.
[004] Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria fastidiosa de crescimento lento que carece de uma parede celular. Ela é frequentemente difícil de isolar a partir do do respiratório devido ao fato de que Mycoplasma hyorhinis, um agente secundário comum também ficar localizado no trato respiratório. A doença se dissemina por aerossol, produzido pela tosse, e por contato direto a partir de um suníno portador afetado ou convalescente. Juntar animais infectados com animais não infectados resulta em reinfecção precoce e frequente. A infecção começa frequentemente com infecção de porquinhos por porcas portadoras no parto de leitõezinhos.
[005] Devido a técnicas de manejamento do rebanho, a infecção pode não se tornar evidente até mais tarde na vida. Infecção adicional usualmente é observada depois da desmama quando os porcos são combinados. Doença manifesta é normalmente observada em porcos com uma idade de seis semanas ou mais. Taxas de crescimento e taxas de conversão alimentar são reduzidas acentuadamente em animais afetados. Os tratamentos existentes que usam antibióticos são onerosos e requerem uso prolongado. A reinfecção de animais permenece sendo um problema.
[006] Assim sendo, vacinas são, atualmente, o método mais eficaz para evitar infecçõs e suas consequências. Aconteceram inúmeras tentativas para produzir uma vacina para proteger suínos contra infecção por Mycoplasma hyopneumoniae. Vários pesquisadores descreveram vacinas que compreendem antígenos de superfcíe produzidos de forma recombinante de Mycoplasma hyopneumoniae, Schaller et al., patente no US 4.894.332, expedida em 16 de janeiro de 1990; publicação da patente europeia no 283.840, publicada em 28 de setembro de 1988. A publicação PCT no WO 86/00019, publicada em 3 de janeiro de 1986, descreve uma vacina de Mycoplasma hyopneumoniae que compreende exclusivamente membranas plasmáticas de Mycoplasma hyopneumoniae, isenta de outros componentes celulares. Etheridge et al., Res. Vet. Sci. 33:188 (1982), encontraram proteção completa contra colonização pulmonar por Mycoplasma hyopneumoniae quando uma vacina viva foi dada por via intravenosa, subcutânea, ou intraperitoneal. Kristensen et al., Am. J. Vet. Res. 42:784 (1981), não encontraram qualquer proteção de suínos contra pneumonia micoplasmática depois de injeção de Mycoplasma hyopneumoniae inativada por calor. Ross et al., Am. J. Vet. Res. 45:1899 (1984), descobriram que o uso de extratos de Mycoplasma hyopneumoniae preparados por um procedimento de congelamento/descongelamento para imunizar suínos, proporcionou proteção apenas variável, e em alguns casos, desenvolvimento intesificado de lesões foi notado em suínos imunizados. Estes pesquisadores estudaram também uma vacina de células inteiras, preparada por inativação com formalina. A inativação por formalina obstruiu significativamente a imunogenicidade protetora de Mycoplasma hyopneumoniae, e esta vacina não foi eficaz. Yoshioka et al., patente no US 3.917.819 (expedida em 4 de novembro de 1975) descreve várias vacinas de micoplasma mortas que compreendem micoplasma inativado com formalina, incluindo uma vacina inativada para Mycoplasma hyopneumoniae. Chung-Nan, publicação d patente europeia no 571.648 descreveu uma vacina de M. hyopneumoniae baseada na cepa altamente proliferativa e antigênica PRIT-5.
[007] As vacinas baseadas em cepas virulentas inativadas de Mycoplasma hyopneumoniae estão disponíveis no mercado. A empresa Fort Dodge Animal Health (FDAH) comercializa bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae sob o nome Suvaxyn® e Respifend® Mycoplasma hyopneumoniae para uso como uma vacina para proteger suínos sadios contra sinais clínicos causados por Mycoplasma hyopneumoniae. Esta vacina de bacterina é recomendada como uma vacina de duas doses para porcos com uma idade de pelo menos uma semana, sendo a segunda dose aplicada duas a três semanas depois da primeira vacinação.
[008] A cepa J de M. hyopneumoniae J é uma cepa não patogênica com capacidade reduzida de aderir aos cílios porcinos, e portanto, causar doença. Castro et al., Veterinary Microbiology 116:258-269 (2006) e Vasconcelos et al., J. Bacteriol. 187(16):5568-5577 (2005) (que descreve a sequência genômica completa da cepa J de M. hyopneumoniae (ATCC 25934)). Comparações genômicas entre cepas patogênicas e não patogênicas (cepa J) revelaram variações em proteínas de superfície, incluindo adesina ciliar, imputadas como sendo determinantes de propriedades patogênicas relativas entre cepas de M. hyopneumoniae. Vasconcelos et al. (2006) e Djordjevic et al., Infection and Immunity 72(5):2791-2802 (2004).
[009] M. hyopneumonia expressa, sobre suas lipoproteínas de superfície membranosa celular, particularmente as cepas P46, P65, e P97, que portam determinantes antigênicos específicos da espécie. Recentemente, Bouh et al. descreveram anticorpos monoclonais para P46 e P65 da cepa J referencial de M. hyopneumoniae ATCC 25934 (Clin. Diag. Lab. Immunology 10(3):459-468 (2003)). Blank e Stemke descreveram um mapa físico e genético do genoma da cepa J de M. hyopneumoniae, Can. J. Microbiol. 46:832-840 (2000), e Wilton et al. descreveram a triagem de bibliotecas de expressão geradas a partir da cepa J de M. hyopneumoniae nãopatogênica e a triagem daquelas bibliotecas com antissoro hiperimune porcino contra M. hyopneumoniae.
[010] Há uma necessidade de se obter composições, incluindo composições imunogênicas ou de vacinas, preparadas a partir de Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante, composições estas que proporcionam eficácia contra cepas virulentas de M. hyopneumoniae. A citação de qualquer referência neste relatório descritivo não deve ser julgada como uma admissão que tal referência está disponível como técnica anterior da presente invenção.
[011] A presente invenção fornece composições, incluindo composições imunogênicas ou composições de vacinas, que compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de uma Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva e um adjuvante biologicamente aceitável. As composições aqui descritas eliciam resposta imune contra Mycoplasma hyopneumoniae, prevenindo e/ou minimizando desta forma a gravidade de doença causada por este organismo ou melhorando pelo menos um sintoma associado com a doença.
[012] Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece uma composição para eliciar uma resposta imune anti-Mycoplasma hyopneumoniae em um animal, sendo que a dita composição compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae e um adjuvante biologicamente aceitável.
[013] Em uma modalidade, a composição compreende uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae cujo genoma compreende uma sequência de ácidos nucléicos que tem pelo menos cerca de 90% de homologia com a sequência de ácidos nucléicos de uma cepa referencial J.
[014] Em uma modalidade, a composição compreende uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae cujo genoma compreende uma sequência de ácidos nucléicos que tem pelo menos cerca de 95% de homologia com a sequência de ácidos nucléicos de uma cepa referencial J.
[015] Em uma modalidade, a composição compreende uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae cujo genoma compreende uma sequência de ácidos nucléicos que tem pelo menos cerca de 99% de homologia com a sequência de ácidos nucléicos de uma cepa referencial J.
[016] Em uma modalidade, a composição compreende uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae que tem pelo menos cerca de 70% de identidade polimórfica com uma cepa referencial J.
[017] Em uma modalidade, a composição compreende uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae que tem pelo menos cerca de 85% de identidade polimórfica com uma cepa referencial J.
[018] Em uma modalidade, a composição compreende uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae que tem pelo menos cerca de 95% de identidade polimórfica com uma cepa referencial J.
[019] Em uma modalidade, as homologias percentuais da cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae usada nas composições aqui descritas são determinadas por comparação com uma cepa avirulenta referencial J que tem o número de acesso da ATCC 25934 (Número de Acesso do GenBank AE017243) ou 27715. Em certas modalidades, a cepa referencial pode ser uma cepa que é uma cepa virulenta, por exemplo, aquelas que têm os números de acesso da ATCC 25617 ou 25095.
[020] Em uma modalidade, as identidades polimórficas percentuais da cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae usada nas composições aqui descritas são determinadas por comparação com uma cepa referencial avirulenta J que tem o número de acesso da ATCC 25934 ou 27715. Em certas outras modalidades, a cepa referencial pode ser uma cepa que é uma cepa virulenta, por exemplo, aquelas que têm os números de acesso da ATCC 25617 ou 25095.
[021] Em uma modalidade, a cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae usada nas composições aqui descritas é uma cepa J designada como número de acesso da ATCC 25934 ou 27715.
[022] Em uma modalidade, a cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae usada nas composições aqui descritas é uma cepa J designada como número de acesso da ATCC 27715.
[023] Em uma modalidade, a resposta imune eliciada por uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae protege um animal contra infecção, ou reduz a gravidade de pelo menos um sintoma associado com uma infecção por uma cepa virulenta de Mycoplasma hyopneumoniae.
[024] Em uma modalidade, a administração de uma dose a um animal de uma composição de M. hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante aqui descrita é eficaz para proporcionar imunidade ao animal contra infecção por Mycoplasma.
[025] Em uma modalidade, a administração de duas doses a um animal de uma composição de M. hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante aqui descrita é eficaz para proporcionar imunidade ao animal contra infecção por Mycoplasma.
[026] As composições de vacina de Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante aqui descritas podem ser empregadas adequadamente para uso em suínos contra infecção e doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae e devem encontrar utilidade para controlar e/ou prevenir a disseminação da infecção e doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae em populações suínas.
[027] Asim sendo, as composições imunogênicas ou composições de vacina da presente invenção empregam uma ou mais Mycoplasma hyopneumoniae avirulentas vivas em combinação com um ou mais adjuvantes tais como adjuvantes biologicamente aceitáveis. O adjuvante biologicamente aceitável pode ser, opcionalmente, um ou mais adjuvantes selecionados do grupo que consiste em SP-Oil, SL-CD, um polímero do ácido acrílico (tal como Carbopol®, da Noveon, Inc., Cleveland, OH), e uma mistura de óleo metabolizável tal como um ou mais hidrocarbonetos terpênicos insaturados, por exemplo, esqualeno ou esqualano, e um copolímero em bloco de polioxietileno/polipropileno, tal como Pluronic® (BASF, Florham Park, New Jersey).
[028] A concentração de adjuvante empregada nas composições aqui descritas dependerá da natureza do adjuvante. Os adjuvantes estão tipicamente presentes nas composições aqui descritas em uma concentração final de cerca de 1-50% (v/v) e mais tipicamente, em uma concentração final de cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, ou 30% (v/v). Em composições que compreendem SP-Oil, o adjuvante está tipicamente presente em uma concentração entre 1% e cerca de 25% (v/v), mais tipicamente entre cerca de 5% e cerca de 15% (v/v) tal como, por exemplo, cerca de 10% (v/v). Em composições que compreendem um polímero do ácido acrílico e uma mistura de um óleo metabolizável que compreende um ou mais hidrocarbonetos terpênicos e um copolímero em bloco de polioxietileno/polipropileno, a razão de polímero de ácido acrílico para óleo metabolizável/copolímero em bloco de polioxietileno- polipropileno na mistura é tipicamente uma razão entre cerca de 1:25 e cerca de 1:50 e tipicamente em uma concentração final entre cerca de 1% e cerca de 25% (v/v).
[029] Em uma modalidade, o adjuvante biologicamente aceitável compreende SP-Oil. Em uma modalidade, o SP-Oil está presente em uma concentração entre cerca de 1% e cerca de 25% v/v. Em uma modalidade, o SP-Oil está presente em umaa concentração entre cerca de 5% e cerca de 15% v/v. Em uma modalidade, o SP-Oil está presente em uma concentração de cerca de 10% v/v.
[030] Dentro de certas modalidades, as composições aqui descritas podem empregar, em combinação adicional, uma ou mais bactérias vivas, bacterinas, toxóides e/ou antígenos virais. Assim sendo, dentro de certos aspectos destas modalidades, a composição de M. hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante pode compreender uma quantidade imunologicamente eficaz de Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva e um ou mais adjuvantes biologicamente aceitáveis em combinação adicional com (a) uma ou mais bactérias vivas; (b) uma ou mais bacterinas; (c) um ou mais toxóides purificados de um ou mais patógenos tais como, por exemplo, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae e bactérias leptospiras; e/ou (d) um ou mais antígenos virais, onde o vírus é selecionado no grupo que consiste em vírus influenza suíno (SIV), vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina (PRRSV), PPRS que expressa poxvírus do raccoon e/ou outros antígenos, PPRS que expressa TGEV e/ou outros antígenos, e circovírus porcino (PCV). Dentro de certos aspectos destas modalidades, são aqui identificadas composições, incluindo composições imunogênicas ou composições de vacinas que empregam, em combinação adicional, vacina viva modificada de quimera de Circovírus Porcino Tipo 1-Tipo 2 (cPCV1-2). Dentro destas ou modalidades alternativas, composições, incluindo composições imunogênicas ou de vacinas, podem adicionalmente ou opcionalmente incluir um conservante e stabilizador tal como, por exemplo, SGGK, timerosol e/ou EDTA.
[031] A concentração dessas outras bactérias vivas, bacterina, toxóide, e/ou antígeno viral empregada nas composições aqui descritas dependerá da natureza da bactéria viva, bacterina, toxóide, e/ou antígeno viral e estão tipicamente presentes nas composições aqui descritas. No caso de composições nas quais o outro antígeno é bacteriano, as bactérias estão tipicamente presentes em uma concentração final entre cerca de 0,5 x 105 e 0,5 x 1010 por mililitro. Alternativamente, as bactérias estão presentes em uma concentração final entre cerca de 0,5 x 106 e 0,5 x 109 por mililitro ou em uma concentração final entre cerca de 0,5 x 107 e 0,5 x 108 por mililitro.
[032] Um segundo aspecto da invenção fornece métodos para gerar uma resposta imune contra Mycoplasma hyopneumoniae, ou para proteger um animal contra doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae e/ou para prevenir ou melhorar um surgimento dessa doença entre populações animais administrando uma composição de Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante como aqui descrito. Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece também métodos para intensificar uma resposta imune contra Mycoplasma hyopneumoniae. Tais métodos compreendem as etapas de administrar a um animal, tal como um suíno, em uma ou duas doses, uma composição que compreende uma ou mais cepas avirulentas vivas de Mycoplasma hyopneumoniae com adjuvante.
[033] Em uma modalidade, os métodos da presente invenção usam uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae cujo genoma compreende uma sequência de ácidos nucléicos que tem cerca de 90% homologia com a sequência de ácidos nucléicos de uma cepa referencial J.
[034] Em uma modalidade, os métodos da presente invenção usam uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae cujo genoma compreende uma sequência de ácidos nucléicos que tem cerca de 95% homologia com a sequência de ácidos nucléicos de uma cepa referencial J.
[035] Em uma modalidade, os métodos da presente invenção usam uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae cujo genoma compreende uma sequência de ácidos nucléicos que tem cerca de 99% homologia com a sequência de ácidos nucléicos de uma cepa referencial J.
[036] Em uma modalidade, os métodos da presente invenção usam uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae que tem pelo menos cerca de 70% de identidade polimórfica com uma cepa referencial J.
[037] Em uma modalidade, os métodos da presente invenção usam uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae que tem pelo menos cerca de 85% de identidade polimórfica com uma cepa referencial J.
[038] Em uma modalidade, os métodos da presente invenção usam uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae que tem pelo menos cerca de 95% de identidade polimórfica com uma cepa referencial J.
[039] Em uma modalidade, a cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae usada nos métodos da invenção, como aqui descrito, é uma cepa J designada como número de acesso da ATCC 25934 ou 27715.
[040] Em uma modalidade, a cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae usada nos métodos da invenção, como aqui descrito, é uma cepa J designada como número de acesso da ATCC 27715.
[041] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para intensificar uma resposta imune contra Mycoplasma hyopneumoniae, sendo que o método compreende as etapas de: a) em primeiro lugar, administrar uma primeira composição imunogênica que compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae com adjuvante e com um material adjuvante biologicamente aceitável a um animal; b) em segundo lugar, administrar uma segunda composição imunogênica que compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae com adjuvante e com um material adjuvante biologicamente aceitável a um animal.
[042] Em certas modalidades, dependendo da aplicação precisa contemplada, as composições podem ser administradas por via parenteral, tal como por injeção intramuscular, subcutânea, ou intraperitoneal, ou por aplicação tópica de um creme. Alternativamente, as composições podem ser administradas através de vias de aerossol, intranasal, ou oral, tal como por spray intranasal ou administração oral por distribuição manual ou aplicação em massa.
[043] Um terceiro aspecto da invenção fornece o uso das cepas de Mycoplasma hyopneumoniae aqui descritas e composições que compreendem esssas cepas para a preparação de um medicamento para tratar um animal que sofre de uma infecção por Mycoplasma hyopneumoniae ou que sofre de pelo menos um sintoma associado com uma infecção por Mycoplasma hyopneumoniae.
[044] Estas e outras modalidades, características e vantagens da invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada e das reivindicações apensadas aqui enunciadas abaixo. Todas patentes, pedidos de patente, e outras literatures aqui citadas são aqui incorporadas como referência em sua totalidade. No caso de inconsistências, a presente invenção prevalecerá.
[045] Antes de descrever os presentes métodos e metodologia de tratamento, deve-se entender que esta invenção não está limitada métodos, e condições experimentais específicas descritas, pois tais métodos e condições podem variar. Deve-se entender também que a terminologia aqui utilizada tem o propósito de apenas descrever modalidades específicas, e não pretende ser limitativa.
[046] Como utilizadas neste relatório descritivo e nas reivindicações apensadas, as formas no singular "um", "uma", e "o" e "a" incluem os equivalentes no plural, a menos que o contexto claramente dite o contrário. Assim sendo, por exemplo, as referências "ao método" incluem um ou mais métodos e/ou etapas do tipo aqui descrito e/ou que ficarão evidentes para os versados nessas técnicas após a leitura deste relatório descritivo e assim por diante.
[047] Consequentemente, no presente pedido de patente, podem ser empregadas técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, e de DNA recombinante dentro do conhecimento dos versados nessas técnicas. Tais técnicas estão inteiramente explicadas na literatura. Vide, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (aqui referido como "Sambrook et al., 1989"); "DNA Cloning: A Practical Approach",Volumes I e II (editor D.N. Glover, 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (editor M.J. Gait, 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (editores B.D. Hames & S.J. Higgins (1985)); "Transcription And Translation" (editores B.D. Hames & S.J. Higgins, (1984)); "Animal Cell Culture" (editor R.I. Freshney, (1986)); "Immobilized Cells And Enzymes" (IRL Press, (1986)); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984); F.M. Ausubel et al. (editores), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc. (1994).
[048] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou testes da invenção, os métodos e materiais preferidos serão agora descritos. Todas publicações aqui mencionadas são incorporadas como referência em sua totalidade.
[049] Os termos aqui utilizados têm os significados reconhecidos e conhecidos pelos versados nessas técnicas; entretanto, por conveniência e completude, os termos específicos e seus significados estão enunciados abaixo.
[050] O term "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de uma faixa estatisticamente sifnificante de um valor. Tal faixa pode ficar dentro de uma ordem de magnitude, tipicamente dentro de 50%, mais tipicamente dentro de 20%, mais tipicamente ainda dentro de 10%, e ainda mais tipicamente dentro de 5% de um dado valor ou faixa. A variação permissível englobada pelo termo "cerca de" ou "aproximadamente" depende do sistema específico em estudo, e pode ser facilmente avaliada pelos versados nessas técnicas.
[051] "Adjuvante" significa uma composição de uma ou mais substâncias, que intensifica a antigenicidade da Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva em uma composição, tipicamente uma composição de vacina. Um adjuvante pode servir como um depósito tecidual que libera lentamente o antígeno e tem também um sistema linfóide ativador que intensifica inespecificamente a resposta imune response (Hood, et al., "Immunology", Segunda Edição, Menlo Park, CA: Benjamin/Cummings, 1984. página 384). Frequentemente, uma vacinação primária com um antígeno isoladamente, na ausência de um adjuvante, deixará de eliciar uma resposta imune humoral ou celular. Os adjuvantes incluem, porém sem limitações, adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas na superfície tais como lisolecitina, polióis Pluronic, poliânions, peptídeos, emulsõesem óleo ou hidrocarbonetos, hemocianinas californiana (keyhole), e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como N-acetil-muramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil- sn-glicero-3-hidróxi-fosforilóxi)-etil-amina, BCG (bacilo de Calmette- Guérin) e Corynebacterium parvum. De preferência, o adjuvante é biologicamente aceitável.
[052] Os adjuvantes empregados nas composições aqui descritas são tipicamente "adjuvantes biologicamente aceitáveis", e assim sendo, podem ser usados em combinação com Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva, de tal modo que as composições resultantes possam ser administradas in vivo sem toxicidade concomitante para um animal. São aqui exemplificadas composições que incluem Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva em combinação com um ou mais adjuvantes biologicamente aceitáveis selecionados no grupo que consiste em SP-Oil, SL-CD, Carbopol, e uma mistura de um óleo metabolizável tais como um ou mais hidrocarbonetos terpênicos insaturados, por exemplo, esqualeno ou esqualano, e um copolímero em bloco de polioxietileno/polipropileno, tal como Pluronic®.
[053] Uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae ou uma molécula dela é "antigênica" quando ela é capaz de interagir especificamente com uma molécula de reconhecimento de antígeno do sistema imunológico, tais como imunoglobulina (anticorpo) ou receptor de antígeno de células T. Tipicamente, uma molécula antigênica é um polipeptídeo, ou variante dele, que contém um "epitopo" com pelo menos cerca de cinco e tipicamente pelo menos cerca de 10 aminoácidos. Uma parte antigênica de um polipeptídeo, aqui denominada também "epitopo," pode ser a parte imunodominante para o reconhecimento de receptor de anticorpo ou células T, ou ela pode ser uma parte usada para gerar um anticorpo para a molécula conjugando a parte antigênica com um polipeptídeo veículo para imunização. Uma molécula antigênica não precisa ser em si imunogênica, isto é, capaz de eliciar uma resposta imune sem um veículo.
[054] O termo "pelo menos" significa não menos do que.
[055] Como aqui utilizado, o termo "bacterina" é uma colheita de bactéria que foi inativada e que, em combinação com certos adjuvantes, pode eliciar imunidade protetora para proteger contra doença ou infecção quando administrada a animais.
[056] Os polímeros do ácido acrílico são tipicamente carbômeros. Os carbômeros estão disponíveis no mercado sob o nome comercial "Carbopol" e estão descritos, por exemplo, nas patentes nos US 2.909.462 e 3.790.665, que são aqui incorporadas como referência.
[057] O termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, estabilizador, conservante e/ou veículo no qual o composto ou composição é administrada. Tais veículoes podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem petrolífera, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Água ou soluções salinas aquosas, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, soluções de Ringer e soluções aquosas de dextrose e glicerina são frquentemente empregadas como veículoes, particularmente para soluções injetáveis. O veículo ou diluente dever ser atóxico e não deve afetar a atividade biológica do antígeno/imunógeno. Outras substâncias auxiliares adicionais, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, tensoativos, tampões de pH e similares também podem ser usados nas composições da invenção. Os conservantes podem incluir, por exemplo, timerosol e/ou EDTA. Os veículoes farmacêuticos apropriados estão descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin, 18a Edição. Vários veículoes são bem conhecidos pelos versados nessas técnicas, e a seleção de veículoes específicos está dentro do nível de conhecimento dos versados nessas técnicas.
[058] O termo "unidade formadora de colônias" ou "CFU" ié uma unidade de medição usada para indicar o número de organismos capazes replicação em uma dada amostra. Isto se baseia na teoria que uma colônia é derivada a partir da replicação de um par/agregado ou uma única célula de bactéria.
[059] A "quantidade imunolgicamente eficaz" é a quantidade de Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva que pode eliciar uma resposta imune contra Mycoplasma hyopneumoniae. A "quantidade imunologicamente eficaz" dependerá da espécie, raça, idade, porte, estado de saúde do animal recebedor e será influenciada pela exposição anterior do animal a uma ou mais cepas de Mycoplasma hyopneumoniae e se essa uma ou mais cepas é uma cepa virulenta ou uma cepa avirulenta de Mycoplasma hyopneumoniae. Como aqui utilizada, uma "quantidade imunologicamente eficaz" de Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva, quando empregada em combinação com um adjuvante apropriado, é a quantidade de Mycoplasma hyopneumoniae suficiente para intensificar a imunogenicidade da Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva, e assim sendo, proporcionar imunidade protetora contra desafio com uma cepa de Mycoplasma hyopneumoniae virulenta. Em uma modalidade, uma quantidade imunologicamente eficaz é um mínimo de cerca de 1 x 103 organismos. Emuma modalidade, uma quantidade imunologicamente eficaz fica na faixa entre cerca de 1 x 103 unidades formadoras de colônias/mL (CFU/ml) e cerca de 1 x1011 CFU/ml. Em uma modalidade, uma quantidade imunologicamente eficaz é cerca de 5 x 10 7 CFU/ml.
[060] Como aqui utilizado, o termo "imunogênica" significa que a Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva é capaz de eliciar uma resposta imune humoral e/ou celular. Uma cepa imunogênica também é antigênica. Uma composição imunogênica é uma composição que elicia uma resposta imune humoral e/ou celular quando administrada a um animal.
[061] O termo "composição imunogênica" refere-se a qualquer composição farmacêutica que contém um antígeno, por exemplo, um micro-organismo, composição esta que pode ser usada para eliciar uma resposta imune em um mamífero. A resposta imune pode incluir uma resposta de células T, uma resposta de células B, ou uma resposta de células T e também B. A composição pode servir para sensibilizar o mamífero pela apresentação do antígeno em associação com moléculas de MHC na superfície celular. Além disso, linfócitos T específicos de antígeno ou anticorpos podem ser gerados para permitir a proteção futura de um hospedeiro imunizado. Uma "composição imunogênica" pode conter uma vacina viva, atenuada, ou morta/inativada cque compreende micro-organismos integrais ou uma parte imunogênica derivada deles que induz uma resposta imune mediada por células (células T) ou uma resposta imune mediada por anticorpo (células B), ou ambas, e pode proteger o animal contra um ou mais sintomas associados com a infecção pelo micro-organismo, ou pode proteger o animal contra morte em virtude da infecção com o micro-organismo.
[062] Como aqui utilizado, o termo "isolado" significa que o material referenciado pode ser removido do seu ambiente nativo. Assim sendo, um material biologico isolado pode ser isento de alguns ou todos componentes celulares, isto é, componentes as células nos quais o material nativo ocorre naturalmente (por exemplo, componente citoplasmático ou membrana). Um material é isolado caso ele esteja presente um extrato ou sobrenadante de células. Uma proteína isolada neste caso pode estar associada com outras proteínas ou ácidos nucléicos, ou ambos, com os quais ela está associada na célula, ou com membranas celulares caso ela seja uma proteína associada com membrana. Uma organela, célula ou tecido isolado é removido do local anatômico no qual ele é encontrado em um organismo. Um material isolado pode ser, porém não necessariamente, purificado.
[063] Como aqui utilizado, o termo "MHDCE" designa DNA, célula, equivalentes de Mycoplasma hyopneumoniae e é definido como umidade de medida usada para determinar o número aproximado de organismos Mycoplasma hyopneumoniae presente em uma dada amostra.
[064] O termo "administração parenteral", como aqui utilizado, significa administração por algum outro meio que não através do trato gastrointestinal, particularmente a introdução de substâncias dentro de um organismo por injeção intravenosa, subcutânea, intramuscular, ou intramedular, mas também outras vias de administração que não a administração por via oral e nasal, tal como injeção intraperitoneal ou aplicação tópica.
[065] O termo "identidade polimórfica com uma cepa referencial J" refere-se à similaridade entre o perfil de expressão da proteína de uma cepa não J de Mycoplasma hyopneumoniae e uma cepa referencial J de Mycoplasma hyopneumoniae. A identidade polimórfica pode se basear em uma ou mais características de uma ou mais proteínas, incluindo, porém sem limitações, por exemplo, a quantidade de uma ou mais proteínas do micro-organismo Mycoplasma hyopneumoniae sob investigação, a velocidade de sedimentação de uma ou mais proteínas, ou as mudanças nas características físicas ou bioquímicas de uma ou mais proteínas. O termo pode incluir também similaridade entre as sequências de nucleotídeos que codificam qualquer uma ou mais proteínas de uma cepa não J de Mycoplasma hyopneumoniae e uma cepa referncial J de Mycoplasma hyopneumoniae e inclui quaisquer mutações nestas sequências, incluindo deleções ou substituições. A mudança na sequência de nucleotídeos ou aminoácidos é uma que permite a retenção da natureza avirulenta do organismo Mycoplasma hyopneumoniae. Vários ensaios para observar iregularidades nas sequências de nucleotídeos e aminoácidos são bem conhecidos nessas técnicas. Por exemplo, o tamanho e a estrutura das sequências de ácidos nucléicos ou aminoácidos são observados pelos protocolos Northern, Southern, Western, perfil de SDS-PAGE ELISA, PCR e sequenciamento de DNA, como conhecido pelos versados nessas técnicas (vide, por exemplo, Calus, D. et al. "Veterinary Microbiology", Volume 120, edições 3-4, 10 de março de 2007, páginas 284-291; Scarman, AL, et al. Microbiology, 143:663-673 (1997)). Além disso, outros metodos para observar iregularidades nas sequências de nucleotídeos e aminoácidos tais como análise de polimorfismo por confrmação de filamento único, são bem conhecidos nessas técnicas (vide, por exemplo, patante no US 5.382.510, expedida em 7 de setembro de 1999, e patente no US 5.952.170, expedida em 17 de janeiro de 1995).
[066] O termo "purificado", como aqui utilizado, refere-se ao material que foi isolado sob condições que reduzam ou eliminam a presença de materiais não relacionados, isto é, contaminantes, materiais nativos a partir dos quais o material é obtido. Por exemplo, uma bactéria ou proteína purificada é, tipicamente, substancialmente isenta de célula hospedeira ou componentes da cultura, incluindo cultura de tecidos ou proteínas do ovo, patógenos inespecíficos, e similares. Como aqui utilizado, o termo "substancialmente isenta" é utilizado operacionalmente, no contexto de teste analítico do material. Tipicamente, o material purificado substancialmente isento de contaminantes é pelo menos 50% puro; mais tipicamente pelo menos 90% puro, e ainda mais tipicamente pelo menos 99% puro. A pureza pode ser avaliada por cromatografia, eletroforese em gel, imunoensaio, análise de composição, análise biológica, e outros métodos conhecidos nessas técnicas. Os métodos para purificação são bem conhecidos nessas técnicas. O termo "substancialmente puro" indica que o grau mais alto de pureza que pode ser atingido usando técnicas convencionais de purificação conhecidas nessa área.
[067] Uma "cepa referencial" refere-se a uma cepa de micro organismo, por exemplo, Mycoplasma hyopneumoniae, que é obtida a partir de uma fonte comfiável e que pode ser usada como uma cepa de controle a partir da qual podem ser feitas comparações com outras culturas não estabelecidas ou desconhecidas. Na presente invenção, as cepas referenciais de Mycoplasma hyopneumoniae podem ser cepas J avirulentas que são obtidas na American Type Culture Collection (ATCC) e designadas com os números de acesso da ATCC 25934 e 27715. Na presente invenção, estas "cepas referenciais" que têm os números de acesso da ATCC 25934 ou 27715 também foram usadas para preparar as composições imunogênicas da invenção. Em certas outras modalidades da presente invenção, as cepas referenciais de Mycoplasma hyopneumoniae podem ser obtidas na American Type Culture Collection (ATCC) e são designadas com os números de acesso da ATCC 25617 e 25095.
[068] O termo "SL-CD" refere-se a uma sulfolipo-ciclodextrina que cai dentro da família de adjuvantes ciclodextrina descrita nas patentes nos US 6.610.310 e 6.165.995. Tipicamente, SL-CD é formulada em uma mistura com um óleo metabolizável tal como um ou mais hidrocarbonetos terpênicos insaturados, por exemplo, esqualano e, de preferência, com um surfactante não iônico, tal como monooleato de polioxietileno sorbitano.
[069] O termo "SP-Oil" refere-se a uma adjuvante que é uma emulsão em óleo que compreende: 1% a 3% vol/vol de copolímero em bloco de polioxietileno/polioxipropileno; 2% a 6% vol/vol de esqualano; 0,1% a 0,5% vol/vol de monooleato de polioxietileno sorbitano; e uma solução salina tamponada.
[070] Os termos "vacina" ou "composição de vacina", que são utilizados de forma intercambiável, referem-se a composições farmacêuticas que compreendem pelo menos uma composição imunogênica que induz uma resposta imune em um animal. Uma vacina ou composição de vacina pode proteger o animal contra doença ou possível morte devido a uma infecção, e pode ou não incluir um ou mais componentes adicionais que intensificam a atividade imunológica do componente ativo. Uma vacina ou composição de vacina pode compreender adicionalmente outros componentes típicos em composições farmacêuticas. Uma vacina ou composição de vacina pode compreender adicionalmente outros componentes típicos em vacinas ou composições de vacinas, incluindo, por exemplo, um adjuvante ou um imunomodulador. O componente imunogenicamente ativo de uma vacina pode compreender organismos vivos em sua forma original, ou como organismos atenuados em uma vacina viva modificada, ou organismos inativados por métodos apropriados em uma vacina morta ou inativada, ou vacinas subunitárias que compreendem um ou mais componentes imunogênicos do vírus, ou geneticamente manipuladas, vacinas mutadas ou clonadas preparadas por métodos conhecidos nessas técnicas. Uma vacina ou composição de vacina pode compreender uma ou simultaneamente mais do que um dos elementos descritos acima.
[071] Como aqui utilizado, o termo "virulenta" refere-se à capacidade de uma cepa de Mycoplasma hyopneumoniae causar doença associada à infecção por Mycoplasma hyopneumoniae. A virulência pode ser avaliada observando a progressão da doença no animal. Um exemplo de uma cepa "virulenta" de Mycoplasma hyopneumoniae é aquela exemplificada pela cepa do desafio de Mycoplasma hyopneumoniae, como descrito e usado na presente invenção. Outras cepas virulentas de Mycoplasma hyopneumoniae estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC), designadas como Cepa No 25617 ou 25095. O termo "avirulenta" refere- se a cepas de Mycoplasma hyopneumoniae que carecem de virulênica; isto é, cepas, isolados ou construções avirulentas são não patogênicas e incapazes de causar doença. Como aqui utilizado, o termo "avirulenta" é usado como sinônimo do termo "não virulenta". São aqui exemplificadas composições que empregam a cepa J avirulenta viva cultivada de M. hyopneumoniae J (FCX3-Linhagem 1, que está disponível na American Type Culture Collection (ATCC) como Cepa No 27715). Outra cepa "avirulenta" que também está disponível na ATCC é designada com Cepa No 25934. A cepa J strain designada como número de acesso da ATCC 27715 foi clonada a partir da cepa J parental designada como número de acesso da ATCC 25934, como descrito no catálogo da ATCC.
[072] A presente invenção baseia-se na descoberta que esquemas com uma ou duas doses de uma composição de Mycoplasma hyopneumoniae, incluindo uma composição imunogênica ou uma composição de vacina, usando uma ou mais Mycoplasma hyopneumoniae avirulentas vivas, tal como, por exemplo, a cepa J (FCX3-Linhagem 1; No de Aceso da ATCC 27715) e um ou mais adjuvantes, tipicamente um adjuvante biologicamente aceitável, são eficazes em proteger contra infecção por Mycoplasma hyopneumoniae e/ou prevenir ou melhorar doença associada à infecção por Mycoplasma hyopneumoniae virulenta.
[073] Em uma modalidade, outras cepas avirulentas vivas de Mycoplasma hyopneumoniae, incluindo, porém sem limitações, cepas J, cujo genoma compreende uma sequência de ácidos nucléicos que tem pelo menos cerca de 90% de homologia, ou pelo menos cerca de 95% de homologia, ou pelo menos cerca de 99% de homologia, com uma cepa referencial J, estão contempladas para uso nas composições e métodos da presente invenção.
[074] Em uma modalidade, outras cepas avirulentas vivas de Mycoplasma hyopneumoniae, incluindo, porém sem limitações, epas J que têm pelo menos cerca de 70% de identidade polimórfica, ou pelo menos cerca de 85% de identidade polimórfica, ou pelo menos cerca de 95% de identidade polimórfica, com aquela da cepa referencial J, são contempladas para uso nas composições e métodos da presente invenção.
[075] A cepa referncial J pode ser selecionada entre as cepas de Mycoplasma hyopneumoniae designadas como número de acesso da ATCC 25934 ou 27715.
[076] Em uma modalidade, a cepa avirulenta viva J usada nas composições e métodos da presente invenção é uma cepa J designada como número de acesso da ATCC 25934 ou 27715.
[077] Em uma modalidade, a cepa avirulenta viva J usada nas composições e métodos da presente invenção é uma cepa J designada como número de acesso da ATCC 27715.
[078] São aqui descritas também composiçõs, incluindo composições de vacinas, que empregam uma ou mais cepas avirulentas vivas de Mycoplasma hyopneumoniae em combinação adicional com vacina viva modificada de quimera de Circovírus Porcino Tipo 1-Tipo 2 (cPCV1-2) (vide publicação da patente no US 2003/0170270 e número 2004/0253270) também são eficazes em proteger contra e/ou prevenir ou melhorar doença associada à infecção por Mycoplasma hyopneumoniae virulenta e/ou infecção por Circovírus Porcino virulento.
[079] Em certas modalidades, as composições da invenção compreendem ainda uma ou mais bactérias vivas, bacterina e/ou um ou mais toxóides purificados selecionados no grupo que consiste em Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, e bactérias leptospiras.
[080] Em certas modalidades, as composições da invenção compreendem ainda uma ou mais antígenos virais selecionados no grupo que consiste em antígeno do vírus influenza suíno (SIV), um antígeno do vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina (PRRSV), e antígeno de PPRS que expressa poxvírus do raccoon ou outros antígenos, antígeno de PRRS que expressa TGEV ou outros antígenos, e um antígeno de circovírus porcino (PCV).
[081] Dentro de certas modalidades, a presente invenção é descrita doravante abaixo com referência à proteção contra infecção com um homogeneizado pulmonar designado como LI-34 que contém a cepa virulenta de Mycoplasma hyopneumoniae 11 (vide J. Clin. Microbiol. março de 1999, 37(3):620-7. Contempla-se, entretanto, que as composições aqui descritas devem ser eficazes em proteger contra e/ou prevenir ou melhorar doença ou pelo menos um sintoma associado a uma ampla série de infecções por Mycoplasma hyopneumoniae virulenta. Inúmeros isolados de Mycoplasma hyopneumoniae são conhecidos nessas técnicas e estão disponíveis em vários fornecedores incluindo a American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. Os exemplos destas cepas virulentas incluem, porém sem limitações, números de acesso da ATCC 25095, 27714 e 25617.
[082] As composições, particularmente composições imunogênicas ou composições de vacinas, da presente invenção podem ser preparadas a partir de culturas liofilizadas ou recém-colhidas de Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva por uma ou mais metodologias disponíveis facilmente nessas técnicas. São aqui exemplificadas composições que compreendem a cepa J avirulenta viva de M. hyopneumoniae (FCX3-linhagem 1) que está disponível como número ATCC 27715 (um isolado filtrado e clonado 3 vezes da ATCC Número 25934).
[083] A Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva pode ser cultivada pela metodologia descrita nas patentes nos 5.338.543 e 5.565.205, que são aqui incorporadas na sua totalidade. Mais especificamente, Mycoplasma hyopneumoniae pode ser propagada no meio de tal como meio completo de PPLO (organismo smelhante a pleuropneumonia) (Difco; Becton Dickinson and Company, San Jose, Califórnia). O crescimento do organismo é monitorado por técnicas usuais tais como determinando as unidades mudadoras de cor (CCU), e colhida quando uma titulação suficientemente alta foi atingida. Os estoques podem ser concentrados ainda mais ou liofilizados por métodos convencionais antes da inclusão nas formulações farmacêuticas. Outros métodos, tais como aqueles descritos em Thomas et al., Agri-Practice 7(5):26-30, também podem ser empregados.
[084] As condições sob as quais um isolado de Mycoplasma hyopneumoniae é desenvolvido podem variar dependendo da composição precisa do meio e do isolado específico a ser desenvolvido. Os isolados de Mycoplasma hyopneumoniae são tipicamente desenvolvidos por cerca de 48 horas a cerca de 144 horas, medido a partir do tempo de incubação até o tempo da colheita.
[085] Dependendo da composição precisa a ser formulada, Mycoplasma hyopneumoniae pode ser concentrada, por exemplo, por ultracentrifugação ou ultrafiltração. A Mycoplasma hyopneumoniae concentrada pode ser recuperada por metodologia conhecida nessas técnicas e pode ser misturada com um veículo fisiologicamente aceitável -- tipicamente um meio aquoso, tal como, por exemplo, solução salina, solução salina tamponada com fosfato (PBS), meio essencial mínimo (MEM), ou MEM com tampão HEPES. Ela pode ser então combinada ainda com um adjuvante apropriado, para proporcionar a concentração desejada em base de volume por volume (v/v). As composições podem compreender ainda um ou mais quelantes, tal como EDTA, tipicamente em uma concentração de cerca de 0,05% a cerca de 0,20% (p/v). Alternativamente, a cepa de Mycoplasma hyopneumoniae a ser usada nas composições imunogênicas ou de vacinas pode ser concentrada como descrito acima, ou liofilizada e recolocada em suspensão em um adjuvante apropriado na concentração desejada em uma base de peso por volume (p/v).
[086] Como indicado acima, as composições, incluindo composições imunogênicas ou composições de vacinas da presente invenção compreendem genericamente uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae em combinação com um ou mais adjuvantes, tipicamente um adjuvante biologicamente aceitável.
[087] Para a administração de uma dose, as composições podem contêr uma quantidade de Mycoplasma pneunomoniae avirulenta viva correspondente a cerca de 1 x 108 a cerca de 3 x 1011 MHDCE/mL. Alternativamente, as composições podem contêr uma quantidade de Mycoplasma pneunomoniae avirulenta viva correspondente a cerca de 1 x 109 a cerca de 3 x 109 MHDCE/mL. As composições são formuladas de tal modo que cada dose de administração seja entre cerca de um (1) mL e cerca de cinco (5) mL, ou cerca de dois (2) mL, por animal para administração intramuscular, subcutânea, ou intraperitoneal e entre cerca de um (1) e cerca de dez (10) mL, ou entre cerca de dois (2) e cerca de cinco (5) mlL para administração oral ou intranasal.
[088] Para administração de duas doses, as composições tipicamente contêm uma quantidade de Mycoplasma pneunomoniae avirulenta viva de cerca de 1 x 108 a cerca de 3 x 1011 MHDCE/mL, mais tipicamente cerca de 1 x 109 a cerca de 3 x 109 MHDCE/mL. Em certas modalidades para administração de duas doses, as composições podem contêr uma quantidade de Mycoplasma pneumoniae avirulenta viva que contém cerca de 10 3 CFU/mL a 1011 CFU/mL. As composições são formuladas de tal modo que cada dose da administração seja entre cerca de um (1) mL e cerca de cinco (5) mL, de preferência cerca de dois (2) mL por animal para administração intramuscular, subcutânea, ou intraperitonealmente e entre cerca de um (1) e cerca de dez (10) mL, tipicamente entre cerca de dois (2) e cerca de cinco (5) mL para administração oral ou intranasal.
[089] A mistura de adjuvante para uso nas composições imunogênicas e composições de vacinas da presente invenção intensifica a resposta imune estimulando respostas imunes mediadas por células e/ou locais (IgA secretória). O adjuvante biologicamente aceitável pode ser, por exemplo, um ou mais adjuvantes selecionados no grupo que consiste em SP-Oil, SL-CD, um polímero do ácido acrílico (tal como Carbopol), e uma mistura de um óleo metabolizável tal como um ou mais hidrocarbonetos terpênicos insaturados, por exemplo, esqualeno ou esqualano, e um copolímero em bloco de polioxietileno/polipropileno, tal como Pluronic®. Os adjuvantes podem ser selecionados ainda entre citocinas, tais como IL-12 e IL-18; hidróxido de alumínio; copolímero de etileno e ácido maléico; DEAE dextrana; adjuvante derivado da parede celular de micobactérias; e similares.
[090] A concentração de adjuvante empregada nas composições aqui descritas dependerá da natureza do adjuvante. Os adjuvantes estão tipicamente presentes nas composições aqui descritas em uma concentração final de cerca de 1-50% e mais tipicamente em uma concentração final de cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, ou 30%. A concentração do antígeno no adjuvante pode ser preparada em uma base peso por volume (p/v) ou em uma base volume por volume (v/v). Por exemplo, o antígeno a ser distribuído nas composições da invenção pode ser preparado em uma forma liofilizada, e em seguida, reconstituição no adjuvante diretamente para resultar nas concentrações epsecificadas em uma base de peso por volume. Alternativamente, o antígeno pode ser primeiramente reconstituído em um diluente apropriado (por exemplo, um tampão) ao qual se adiciona então o adjuvante em um volume suficiente para resultar na concentração final desejada de antígeno e também adjuvante em uma base de volume por volume, como descrito acima.
[091] Em certas modalidades, um adjuvante pode ser administrado com o antígeno/imunógeno como uma única composição, ou pode ser administrado antes, concomitantemente, ou depois da administração do antígeno/imunógeno.
[092] A escolha do adjuvante depende da estabilidade do antígeno/imunógeno que contém o adjuvante, da via de administração, o esquema de dosagem, a eficácia do adjuvante para a espécie que está sendo vacinada e deve ser também apropriada para uso em animais ou humanos pelas entidades reguladoras pertinentes.
[093] Em composições que compreendem SP-Oil, o adjuvante está tipicamente presente em uma concentração entre cerca de 1% e cerca de 25% (v/v), mais tipicamente entre cerca de 5% e cerca de 15% (v/v) tal como, por exemplo, cerca de 10% (v/v); em composições que compreendem um polímero do ácido acrílico e uma mistura de um óleo metabolizável eu compreende um ou mais hidrocarbonetos terpênicos e um copolímero em bloco de polioxietileno/polipropileno, tal como Pluronic®, onde a razão de polímero acrílico para a mistura de copolímero em bloco de óleo metabolizável/polioxietileno-polipropileno é tipicamente uma razão entre cerca de 1:25 e cerca de 1:50. Um óleo metabolizável, um copolímero em bloco de polioxietileno-polipropileno, e um polímero do ácido acrílico podem ser empregados na forma de uma emulsão aquosa, onde polímero do ácido são tipicamente empregados em uma concentração entre cerca de 0,5 g/L e cerca de 10 g/L; óleos metabolizáveis são tipicamente empregados em uma concentração entre cerca de 2 mL/L e cerca de 6 mL/L; e copolímeros em bloco de polioxietileno/propileno são tipicamente empregados em uma concentração entre cerca de 1 mL/L e cerca de 3 mL/L.
[094] As misturas de adjuvantes apropriadas exemplificativas incluem, porém sem limitações, misturas de um ou mais polímeros acrílicos com uma mistura de óleo metabolizável, por exemplo, um hidrocarboneto terpênico insaturado ou um pruduto da sua hidrogenação, de preferência esqualano (2,3,10,15,19,23-hexametil- tetracosano) ou esqualano, e um copolímero em bloco de polioxietileno/polioxipropileno. Esse polímero de ácido acrílico pode ser um homopolímero ou um copolímero.
[095] Os polímeros do ácido acrílico são tipicamente Carbômeros. Os Carbômeros estão comercialmente disponíveis sob o nome comercial Carbopol e estão descritos, por exemplo, nas patentes nos US 2.909.462 e 3.790.665, ambas aqui incorporadas como referência.
[096] Os copolímeros em bloco de polioxietileno/polioxipropileno são surfactantes, tipicamente surfactantes líquidos, que auxiliam em colocar componentes sólidos e líquidos em suspensão. Os surfactantes estão disponíveis comercialmente como polímeros sob o nome comercial Pluronic®. O surfactante poloxâmero 401 está comercialmente disponível sob o nome comercial Pluronic® L121.
[097] A mistura adjuvante pode compreender um óleo metabolizável, um polímero do ácido acrílico e um copolímero em bloco de polioxietileno/polioxipropileno formulado como uma emulsão em um meio aquoso. Dentro de certas modalidades, a mistura adjuvante pode incluir um óleo metabolizável e um copolímero em bloco de polioxietileno/polioxipropileno, tal como uma mistura de esqualano e Pluronic® L121 (poloxâmero 401) que pode estar presente em uma quantidade entre cerca de 50 mL/L e cerca de 100 mL/L e o polímero de carbóxi-metileno pode ser Carbopol 934P (Carbâmero 934P), que pode estar presente em uma quantidade de cerca de 2 mL/L.
[098] Os polímeros do ácido acrílico preferidos são aqueles comercializados por B. F. Goodrich como Carbopol 934 P NF e 941 NF, que são polímeros do ácido acrílico reticulados com poli(alil-sacarose) e que têm a fórmula química (CH2CHOOOH)n. Estes polímeros formam géis aquosos que formulam adequadamente com veículos aquosos. Os copolímeros em bloco de polioxietileno/polipropileno podem ser surfactantes não iônicos comercializados pela BASF como Pluronic® L121, L61, L81 or L101.
[099] Dentro de certas modalidades, as composições aqui descritas podem empregar, em combinação adicional, uma ou mais outras bactérias vivas, bacterina, toxóide, e/ou antígeno viral. Assim sendo, dentro de certos aspectos destas modalidades, a composição de M. hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante pode compreender uma quantidade imunizadora de Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva e um ou mais adjuvantes biologicamente aceitável em combinação adicional com (a) uma ou mais bctérias vivas tais como, por exemplo, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, e bactérias leptospira; (b) uma ou mais bacterinas; (c) um ou mais toxóides de um ou mais patógenos, tais como, por exemplo, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, e bactérias leptospira; e/ou (d) um ou mais antígenos virais, onde o vírus é selecionado no grupo que consiste em vírus influenza suíno (SIV; tais como as cepas de SIV H1N1, H1N2, e H3N2), vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcino (PRRSV), PRRS que expressa poxvírus do raccoon e/ou outros antígenos, PRRS que expressão TGEV e/ou outros antígenos, e circovírus porcino (PCV). São aqui exemplificadas composições, incluindo composições de vacinas, que empregam uma ou mais cepas avirulentas vivas de Mycoplasma hyopneumoniae em combinação adicional com vacina viva modificada com circovírus porcino Tipo 1-Tipo 2 (cPCV1-2) (vide publicações de patentes nos US 2003/0170270 e 2004/0253270).
[0100] Dentro destas ou modalidades alternativas, as composições, incluindo composições de vacinas, podem incluir adicionalmente ou opcionalmente um conservante tal como, por exemplo, timerosol e/ou EDTA. Vide também publicações de patentes nos US 2002/0131980 e 2003/0017171, ambas aqui incorporadas como referência em sua totalidade.
[0101] A concentração dessas outras bactérias vivas, bacterinas, toxóides, e/ou antígenos virais empregados nas composições aqui descritas dependerá da natureza da bacterina, toxóide, e/ou antígeno viral e estão tipicamente presentes nas composições aqui descritas em uma concentração final entre cerca de 0,5 x 105 e 0.5 x 1010 por mL. Alternatiivamente, as bactérias estão presentes em uma concentração final entre cerca de 0,5 x 106 e 0,5 x 109 por mL ou entre cerca de 0,5 x 107 e 0,5 x 108 por mL.
[0102] As composições da presente invenção encontrarão utilidades em métodos para proteger um animal contra doença causada por Mycoplasma hyopneumoniae e/ou para prevenir ou melhorar uma eclosão dessa doença entre populações animais pela administração de uma composição de Mycoplasma hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante como aqui descrita. As composições aqui descritas podem ser também empregadas vantajosamente em métodos para intensificarem um animal uma resposta imune, tal como uma resposta imune mediada por células e/ou humoral, contra Mycoplasma hyopneumoniae. Tais métodos compreendem as etapas de administrar a um animal, tipicamente um suíno, em uma ou duas doses, uma composição que compreende uma ou mais cepas avirulentas vivas de Mycoplasma hyopneumoniae com adjuvante. Dependendo da aplicação precisa contemplada, as composições podem ser administradas por via intramuscular, subcutânea, oral, por aerossol, ou intranasal.
[0103] De acordo com os métodos da presente invenção, um esquema de dosagem desejável envolve a administração de uma ou mais doses da composição de vacina desejada ao porco. Tipicamente, quando duas doses são administradas ao animal, as doses são administradas em um intervalo entre cerca de uma (1) semana e intervalo de cerca de quatro (4) semanas, mais tipicamente em intervalo entre cerca de duas (2) semenas e cerca de três (3) semanas. EXEMPLOS
[0104] A presente invenção será mais bem entendida fazendo referência aos seguintes exemplos não limitativos: EXEMPLO 1: Preparação de uma Vacina Avirulenta Viva de M. hyopneumoniae com Adjuvante
[0105] Este exemplo descreve a preparação de uma composição exemplificativa de M. hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante de acordo com a presente invenção.
[0106] Mycoplasma hyopneumoniae pode ser obtida em inúmeros fornecedores facilmente disponíveis. Em uma modalidade aqui descrita, a cepa J da cultura de M. hyopneumoniae avirulenta viva (FCX3- Linhagem 1), foi obtida na American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) como Cepa ATCC No 27715. Qualquer outra cepa avirulenta de M. hyopneumoniae pode ser usada para a preparação das composições, tal como, por exemplo, a cepa J parental designada como número de acesso da ATCC 25934. Em certas outras modalidades, considera-se que qualquer cepa avirulenta viva de Mycoplasma pneumoniae, pode ser modulada, atenuada ou mutada até que a culture seja estabelecidada como sendo avirulenta, como determinado por teste in vitro ou in vivo, usando procedimentos conhecidos pelos versados nessas técnicas. A sequência genômica completa da cepa J ATCC 25934 foi publicada por Vasconcelos et al. (J. Bacteriol. (2005), 187(16):5568-5577) e foi designada com o número de acesso do GenBank AE017243. Várias das sequências associadas à cepa ATCC 25934 podem ser encontradas em PubMed e têm os números de acesso do GenBank AY737012 (gene do RNA ribossômico 16S), AY512905 (gene de adesina, AF013714 (gene da prolipoproteína p65), U02538 (gene de RNAr 23S) e genes homólogos da proteína de rsistência a múltiplos fármacos U02537).
[0107] Cada composição de vacina para o ensaio bactericida foi preparada a partir de um frasco liofilizado de uma cultura de M. hyopneumoniae reidratada com 20 mL de soluça salina normal. As composições de vacinas incluíram uma combinação de 5 mL da cultura reidratada e adjuvante suficiente para adquirir a concentração especificada de adjuvante em um volume final de 10 mL. Uma composição de controle também foi preaprada também combinando 5 mL de cultura reidratada com 5 mL de solução salina normal. Todas composições forma misturadas por 5 minutos antes da amostragem. As amostras foram retiradas de todas composições em 5 minutos (0 hora), 3 horas, e 7 horas depois de misturar. A viabilidade de cada vacina foi determinada por Unidades Formadoras de Colônias (CFU) em cada ponto de amostragem (vide Tabela 1).
[0108] A viabilidade média da cultura do insumo foi determinada tirando a média de todas viabilidades de controle em 0 hora, média 9,09 x 107 CFU/mL. Em comparação, o número mais provável (MPN) foi determinado para culturas de insumo resultando em 1,85 x 108 MPN/mL. A misturação da vacina e a vacinação leva tipicamente menos do que 3 horas; portanto, quando se observa o efeito bactericida de adjuvantes,o ponto no tempo de 3 horas é o mais importante. A tendência para SP-Oil a 5% e 10% na amostragem de 3 horas em comparação com o controle é uma diferença de duas vezes de uma diferença de 4 vezes, respectivamente.
[0109] A vacina A foi preparada reidratando frascos de cultura liofilizada com diluente contendo concentração final de 10% (v/v) de SPOil. A vacina de placebo era solução salina normal estéril. EXEMPLO 2: Eficácia In vivo de Vacinas Avirulentas Vivas de M. hyopneumoniae com Adjuvante em Porcos
[0110] Este exemplo demonstra a eficácia in vivo de composições exemplificativas de vacinas avirulentas vivas de M. hyopneumoniae com adjuvante.
[0111] Um total de 30 porcos com seis semanas de idade foram adquiridos no rebanho de SPF de Fort Dodge Animal Health em Charles City, Iowa. Os porcos foram mantidos com ração sem antibióticos ou promotores de crescimento e receberam água e ração ad libitum. Os animais que receberam composições de vacina e composições de controle foram alojados em salas diferentes e todos os porcos foram mantidos sob condições similares durante os períodos de vacinação, monitoramento, e desafio.
[0112] Os 30 porcos foram divididos aleatoriamente em três (3) da seguinte maneira: um (1) grupo recebeu uma composição de vacina, um (1) grupo recebeu um placebo, e um (1) grupo serviu como um controle ambiental. Os porcos foram agrupados como indicado na Tabela 2. Tabela 2
[0113] Os porcos com quatro a seis semanas de idade foram vacinados por via intramuscular com uma dose de 2 mL da vacina apropriada. O grupo 1 recebeu a vacina A, o group 2 recebeu placebo. Os porcos do grupo 3 não foram vacinados ou desafiados e serviram como controles ambientais. Os porcos do grupo 1 foram vacinados duas vezes, em intervalo de duas semanas. Duas semanas depois da segunda vacinação, todos porcos dos grupos 1 e 2 foram desafiados com um homogeneizado pulmonar (LI-34) contendo uma cepa virulenta de M. hyopneumoniae Cepa 11 (J. Clin. Microbiol., março de 1999; 37(3):620-7). Quatro semanas depois do desafio, todos os porcos dos grupos 1-3 foram necropsiados e as lesões pulmonares foram avaliadas. Preparação de Homogeneizado Pulmonar (LI-34) para Cepa de Desaio de M. hyopneumoniae
[0114] Sete porcos híbridos foram conseguidos na Spring Prairie Colony Farms (Genetipork) e foram inoculados por via intratraqueal com 10 mL de uma diluição 1:30 de um homogeneizado pulmonar bruto a 10% (LI31) da cepa 11 de M. hyopneumoniae. O homogeneizado pulmonar bruto LI31 tinha sido produzido passando o homogeneizador pulmonar contendo M. hyopneumoniae em porcos isentos de patógenos e colhendo os pulmões pneumônicos resultantes no estágio precoce médio da doença. Os homogeneizados pulmonares foram estocados a -70° C até necessários.
[0115] O soro foi coletado depois da chegada na necropsia de todos porcos e avaliado no Laboratório Diagnóstico Veterinário (ISU) (ISU- VDL) para comprovação de anticorpos para TGE (PRCV), SW e PRV. Além disso, analyses ELISA quanto a anticorpos de PRRSV e M. hyopneumaniae foram realizadas e todas amostras foram negativas para todos patógenos respiratórios acima.
[0116] Todos os porcos foram necropsiados. Pentobarbital foi usado para induzir anestesia profunda de porcos até exanguinação. O tórax ventral foi aberrto e as áreas de lesões pneumônicas típicas de M. hyopneurnoniae foram removidas de forma asséptica e colocadas individualmente em recipientes estéreis.
[0117] Uma pequena parte de cada pulmão foi moída e verificada quanto à pureza sobre placas de ágar de sangue, caldo de infusão de coração bovino, e meio Friis. Diluições nos tubos foram realizadas em meio Friis para titular M. hyopneumoniae. Pedaços de pulmões remanescentes foram congelados em tubos de centrífuga de 50 mL a - 70° C até que os resultados da bacteriologia e isolamento de micoplasma isolation fossem conhecidos. Os lobos pulmonares de 3 dos 7 porcos foram usados para produzir o inóculo pulmonar de M. hyopneumoniae.
[0118] Pedaços dos lobos foram descongelados dos porcos nos 329, 331, e 332 e moídos em meio Friis sem antibióticos. A pureza do inóculo pulmonar foi confirmada por cultura em infusão de coração de boi, ágar de sangue e meio Friis. Apenas os micrococos consistentes com contaminação ambiental foram encontrados em uma placa. O inóculo pulmonar foi titulado quanto aos níveis de M. hyopneurnoniae e continham aproximadamente 107 CCU/mL. Uma alíquota foi submetida a ISU-VDL para ensaios de isolamento do vírus para SN, EMS, enterovírus, HEV, PRCV, PRRSV, pseudorraiva, TGE, parvovírus, e rotavírus. Os resultados de todos ensaios foram negativos. O volume final de inóculo pulmonar moído (etiquetado LI 34) foi de 1.780 mL a partir de 178,1 gramas de tecido pulmonar. Isto foi dividido em alíquotas de volumes de 100 X 5 mL e 110 X 10 mL.
[0119] Na segunda fase do estudo, 9 porcos foram usados na determinação da concentração de inóculo pumonar necessária para induzir uma média de 8% de lesões pulmonares pneumônicas em um mínimo de 80% dos porcos. Todos os porcos foram desafiados com a cepa 11 de M. hyopneumoniae LI34 por via intratraqueal como descrito anteriormente. As diluiões dos desafios incluíram 1:30, 1:100, e 1:500.
[0120] Os corpos foram necropsiados. Pentobarbital foi usado para induzir anestesia profunda antes da exanguinação. Os pulmões foram removidos e as lesões pulmonares foram desenhadas sobre diafragmas do pulmão usuais. O soro foi coletado de todos os porcos e foi testado por ELISA quanto a anticorpos para M. hyopneumoniae. Todos os procos eram pouco positivos ou soronegativos quanto a M. hyopneumoniae sugerindo nenhuma exposição anterior a M. hyopneumoniae antes da chegada. Esfregaços traqueais foram coletados de forma asséptica de todos porcos. Pasteurella multocida e Haemophilus parasuis foram isoladas de 4 e 3 porcos, respectivamente. M. hyopneumoniae foi isolada de todos os prcos desafiados. Desenhos dos pulmões foram avaliados com um sistema de análise de Imagens Zelss para determinar a porcentagem de lesões pulmonares pneumônicas. Conclusões
[0121] O desafio dos porcos foi exitoso e uma diluição de 1:100 seria a diluição ótima para usar. A porcentagem média de pneumonia induzida foi 10,17 +/- 6,6, que é mais alta do que a normal; entretanto, isto pode ser atribuído à presença de Pasteurella multocida e/ou parasuis nos porcos. Além disso, 100% dos porcos inoculados com o inóculo do desafio tiveram lesões pulmonares significativas. Na totalidade, estes resultados são razoavelmente típicos daquilo observado nos presentes estudos de M. hyopneumoniae, pelo fato de que há outros patógenos presentes, e há um aumento de pneumonia. Isto pode se dever à interação entre os patógenos e o sistema imunológico. Foram produzidos 1.600 mL de inóculo pulmonar de M. hyopneumoniae para uso em experimentos de desafio experimentais. O inóculo produzirá pelo menos 8% ou mais lesões pulmonares pneumônicas em um mínimo de 80% dos porcos inoculados quando usado em uma diluição 1:100 por via intraqueal.
[0122] A vacina foi titulada antes do dia da vacinação e ensaios bactericidas foram conduzidos para determinar os sistemas adjuvantes apropriados a serem usados (vide Exemplo 1). A partir desta dados, o sistema adjuvante com 10% de SP-Oil foi escolhido para estudo adicional. A viabilidade média por frasco de cultura de insumo foi 3,64 x 109 CFU/frasco.
[0123] No dia da primeira administração, as composições de vacinas foram preparadas da seuinte maneira: Vacina A - cada um de três frascos de cultura de M. hyopneumoniae avirulenta liofilizada foi reidratado com 10 mL do diluente SP-Oil a 10%. Os três frascos de composição de vacina para cada tipo de diluente foram selecionados e deixados misturar por 20 minutos sobre uma placa de agitação com barra de agitação. O placebo foi solução salina normal medida dentro de um frasco estéril para administração. As composições permaneceram sobre gelo durante o curso da vacinação por 2 horas.
[0124] No dia da segunda administração, as composições de vacinas foram preparadas da seguinte maneira: Vacina A - cada um dos três frascos de cultura de M. hyopneumoniae avirulenta liofilizada foi reidratado com l0 mL do Diluente SP-Oil a 10%. Os três frascos de cultura reidratada para cada tipo de diluente foram selecionados e deixados misturar por 20 minutos sobre uma placa de agitação com barra de agitação. O placebo foi solução salina normal medida dentro de um frasco estéril para administração. As composições permaneceram sobre gelo durante o curso da vacinação por 2 horas.
[0125] A concentração de M. hyopneumoniae viável em cada composição foi determinada antes e depois da administração. A viabilidade foi avaliada determinando Unidades formadoras de Colônias (CFU/mL). Um frasco de cultura de insumo liofilizada foi reidratado com l0 mL de solução salina normal, deixado misturando por 20 minutos, e serviu como um controle para o ensaio de viabilidade. Como a primeira viabilidade do controle foi mais baixa do que a viablidade da vacina em teste, durante a segunda administração, dois frascos foram reidratados e selecionados para servir como controle (vide Tabela 3 para observar as viabilidades das vacinas e viabilidades do controle). TABELA 3
[0126] Todos porcos foram observados diariamente quanto a temperaturas e sintomas clínicos começando dois dias antes de cada administração e continuando por sete dias depois de cada administração. Os porcos foram observados quanto a sintomas clínicos, que incluíram, porém sem limitações, tosse, espirro, descarga nasal, depressão, inapetência, e respiração forçada.
[0127] Quatorze dias depois da segunda administração, os porcos no grupo 1 foram desafiados por via intratraqueal com uma cepa virulenta de M. hyopneumoniae.
[0128] No dia do desafio, um insumo de desafio de uma M. hyopneumoniae virulenta do homogeneizador pulmonar (LI-34) congelado (-70 °C), foi descongelado rapidamente sob água quente e diluído (diluição 1:100) com . Os porcos foram sedados com uma mistura de Xylazine-Ketamine-Telazol® consistindo em 50 mg/mL de Xilazina, 50 mg/mL de Cetamina, e 100 mg/mL de Telazol. Cada porco recebeu 10 mL do material de desafio por via intratraqueal. Para assegurar a colocação da agulha, ar foi arrastado para dentro da seringa antes da administração do material de desafio. Todos porcos foram observados diariamente quanto a sintomas clínicos depois do desafio.
[0129] Os porcos foram sangrados para obter soro nos dias 0, 14, 28, e 56. A respsota sorológica dos corpos ao desafio com M. hyopneumoniae foi determinada por ELISA. Quatro semanas depois do desafio, todos porcos dos grupos 1-3 foram sacrificados e os pulmões foram removidos. Os grupos do teste perderam sua identificação e foram pontuados quanto a lesões pulmonares graves. As lesões atípicas de M. hyopneumoniae foram fixadas com formalina para avaliação histopatológica subsequente. Amostras de esfregaços de pulmões afetados foram coletadas para isolamento bacteriano.
[0130] A pontuação de lesões pulmonares médias para os porcos no grupo 1 (5,9%) foi aproximadamente 50% menor do que no grupo de placebo (14,8%). Quando a análise estatística foi ajustada para ninhada, a fração mitigada para o grupo 1 foi uma redução de 69,2% em gravidade de lesões pulmonares em comparação com os controles. Estes dados estão resumidos na Tabela 4. Todos os porcos eram soronegativos no dia da primeira administração, indicando que os porcos eram suscetíveis a infecção por M. hyopneumoniae. Com a exceção de um (1) porco no grupo de SP-Oil, os porcos não foram soro- convertidos depois da primeira vacinação. Todos os porcos que receberam a composição de vacina com adjuvante de SP-Oil desenvolveram uma resposta de anticorpo depois da segunda injeção. A resposta sorológica demonstra que uma resposta imune contra M. hyopneumoniae foi eliciada (vide Tabela 9 para observer os resultados de sorologia). TABELA 4
[0131] A análise estatística dos dados deve atender aos critérios para a fração mitigada (<50% com nível de confiança mais baixo >30%) para redução em lesões pulmonares para uma vacina ser considerada eficaz para M. hyopneumoniae. Na totalidade, estes dados demonstram que uma M. hyopneumoniae avirulenta viva com adjuvante pode ser empregada vantajosamente para eliciar uma resposta imune protetora quando administrada vivo a um animal.
[0132] Embora a invenção tenha sido descrita em cada das suas várias modalidades, deve-se esperar que certas modificações nela podem ser empreendidas e efetuadas pelos versados nessas técnicas sem fugir do verdadeiro espírito e âmbito da invenção, como enunciada no relatório descrtivo acima e como corporificada ainda mais nas reivindicações que se seguem. A presente invenção não está limitada em âmbito pelas modalidades específicas descritas neste relatório descritivo. Na realidade, várias modificações da invenção além daquelas aqui descritas ficarão evidentes para os versados nessas técnicas a partir da descrição precedente e das figuras anexas. Tais modificações pretendem cair dentro do âmbito das reivindicações apensadas. Deve-se entender ainda que todos valores são aproximados, e são fornecidos a título descritivo. Todas patentes e pedidos de patente aqui citados são aqui incorporadas como referência em sua totalidade. EXEMPLO 3: Estudo de Imunogenicidade Preliminar da Fração de Mycoplasma hyopneumoniae da cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae - Quimera de Circuvírus Porcino Tipo 1-Tipo 2 Viva Modificada Vacina Combinada em Porcos com 3-4 Semanas de Idade
[0133] Este exemplo descreve a eficácia de uma vacina combinada que compreende uma cepa J avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae (FCX3-linhagem1) com adjuvante e vacina viva de Quimera de Circovírus Porcino (PCV) Tipo 1-Tipo 2 (cPCV1-2; vide patentes nos US 7.279.166 e 7.276.353) quando administrada por via intramuscular (IM) ou intranasal (IN) em porcos com 3-4 semenas de idade. Esta vacina combinada (PCV/MH) é apropriada para a vacinação de suínos sadios como um auxílio na prevenção e/ou para reduzir a gravidade de doença causada por M. hyopneumoniae e Circovírus Porcino.
[0134] A vacina do teste visada deve conter cerca de 4,0 Log10 de FAID50/dose de vírus vivo modificado cPCV1-2 e 4x108 CFU/dose da cepa J de M. hyopneumoniae (vide King et al, Journal of Comparative Medicine and Vet. Science, 29: 85-89 (1965) e patente número US 4.824.785 para obter o método FAID). A vacina com adjuvante para conter uma concentração final de 10% (v/v) de SP-Oil. A vacina com placebo era Solução Salina Normal estéril.
[0135] Um total de 66 porcos com idade de 3-4 semanas foram empregados neste estudo. 16 porcos receberam administração de 2 mL de vacina viva de PCV/MH por via intramuscular uma vez e desafiados (Grupo 1); 15 porcos receberam administração de 2 mL de vacina viva de PCV/MH por via intramuscular duas vezes (intervalos de duas semanas) e desafiados (Grupo 2); 15 porcos receberam administração de 2 mL (1 mL/narinal) de vacina viva de PCV/MH por via intranasal duas vezes (intervalos de duas semanas) e desafiados (Grupo 3); 15 porcos receberam administração de vacina viva de PCV/MH e desafiados (Grupo 4); e 5 porcos serviram côo controles ambientais (Grupo 5).
[0136] A vacina usada no estudo aqui descrito era uma combinação de antígeno vivo MH liofilizado (lote no 1744-56) e diluente contendo vacina viva de PCV (Lote C108-56). No dia da vacinação, a torta viva liofilizada de MH foi reidratada com diluente contendo vírus PCV vivo (4,0 Log10 FAID50/mL com adjuvante de SP Oil a 10%). A vacina final foi designada Lote no 2315-30. A viabilidade para a fração de MH foi determinada antes e depois da vacinação, 3,18 x 108 CFU/mL (antes) e 1,65 x 108 CFU/mL (depois), respectivamente. A titulação de PCV para a vacina antes e depois da vacinação foi 4,09 Log10 FAID50 e 3,7 Log10 FAID50, respectivamente. A vacina para a segunda vacinação foi preparada como acima e designada Lote 2315-32. A viabilidade para a fração de MH foi 1,24 x 108 CFU/mL e 1,5x 108 CFU/mL antes e depois da vacinação, respectivamente. A viabilidade para a fração de PCV foi 4,36 Log10 FAID50 e 3,83 Log10 FAID50, respectivamente.
[0137] Os porcos foram observados por 7 dias depois da vacinação quanto a quaisquer reações adversas à vacina. Três porcos morreram durante o período de observação depois da vacinação devido a causas não relacionadas a MH ou PCV. Um resumo das observações clínicas a partir do período depois da vacinação pode ser encontrado na Tabela 5. Tabela 5
Continuação 
NA: Não aplicável IN: intranasal IM: intramuscular
[0138] Todos porcos nos Grupos 1-4 foram desafiados com uma cepa virulenta de M. hyopneumoniae (homogeneizado pulmonar porcino contendo MH virulenta (LI-34)). Os porcos do Grupo 1 foram desafiados quatro semanas depois da primeira vacinação. Os porcos dos Grupos 2-4 foram desafiados duas semanas depois da segunda vacinação. Em quatro semanas depois do desafio, todos porcos nos Grupos 1-5 foram necropsiados e as lesões pulmonares foram avaliadas.
[0139] A vacina foi titulada antes do dia de vacinação. A cultura liofilizada de M. hyopneumoniae avirulenta foi re-hidratada no dia da vacinação. A concentração de organismos M. hyopneumoniae na vacina foi de aproximadamente 2 x 108 CFU/mL. Uma amostra de vacina foi retida e um ensaio de viabilidade foi realizado antes e depois da vacinação para confirmar a CFU/mL real. A vacina foi mantida sobre gelo durante o curso da vacinação.
[0140] Todos porcos foram observados diariamente quanto às temperaturas e sinais clínicos começando dois dias antes de cada vacinação, continuando por sete dias depois de cada vacinação. Os porcos foram observados quanto a sintomas clínicosor, que incluíam, porém sem limitações, tosses, espirro, descarga nasal, depressão, inapetência, e respiração forçada. 14 dias depois da segunda vacinação, os porcos nos Grupos 1-4 foram desafiados por via intratraqueal com uma cepa virulenta de M. hyopneumoniae.
[0141] No dia do desafio, o insumo de desafio de M. hyopneumoniae virulanta, um homogeneizado pulmonar congelado (-70 °C) (LI-34) foi descongelado rapidamente sob água morna e diluído (diluição 1:100) usando meio de crescimento estéril de M. hyopneumoniae. Os procos foram sedados com uma mistura de Xylazine-Ketamine-Telazol® compreendendo 50 mg/mL de Xilazina, 50 mg/mL de Cetamina e 100 mg/mL de Telazol. Cada porco recebeu 10 mL do material de desafio por via transtraqueal. Para assegura Ra colocação da agulha, ar foi arrastado para dentro da seringa antes da administração do material de desafio.
[0142] Todos porcos foram observados inteiramente quanto a sinais clínicos depois do deasafio. A observação foi conduzida diariamente quanto a quaisquer sinais clínicos anormais. Os porcos foram sangrados para obter soro (não mais do que 13 mL de sangue total) nos Dias 0, 14, 28, e 56 do estudo. O soro foi coletado, mas não avaliado. ELISA pode ser conduzida para avaliar a resposta sorológica dos porcos usando o soro coletado durante o período de estudo on futuro.
[0143] Quatro semanas depois do desafio, todos porcos dos Grupos 1-5 foram sacrificados e os pulmões foram removidos. Lesões atípicas de M. hyopneumoniae foram fixadas com formalina e as amostras foram examinadas quanto à histopatologia. Amostras de esfegaços de pulmões afetados foram coletadas para isolamento bacteriano. Os porcos que morreram depois do desafio foram necropsiados e as amostras foram coletadas como descrito acima. A eficácia da vacina foi definida como uma pontuação média combinada de lesões pulmonares dos vacinados, que foi 50% menor do que a pontuação média combinada de lesões pulmonares dos controles.
[0144] No dia da necropsia, todos porcos foram sacrificados, as lesões pulmonares foram pontuadas e esfregadas para isolamento bacteriano. As bactérias isoladas a partir dos esfregaços consistiram no seguinte: Staphylococcus heamolyticus, Streptococcus suis (P322), Staphylococcus epidermis, A. pyogenes, aerococus species, S. uberis, Bordetella bronchiseptica (P344) e microbactéria. A análise estatística para as pontuações de lesões pulmonares estão indicadas na Tabela 6. Tabela 6
LCL= Nível de confiança mais baixo MF = Fração mitigada
[0145] A análise estatística dos dados atendeu aos critérios para a fração mitigada (<50%, com LCL >30%) para redução em lesões pulmonares. Este exemplo demonstra (a) a eficácia da vacina de MH/PCV pra a fração MH com duas doses de 2 mL administradas por via IM, a 3,18 x 108 CFU/mL e (b) a segurança da vacina de MH/PCV devido à ausência de de sinais clínicos relacionados a MH ou PCV depois da vacinação. EXEMPLO 4: Estudo de Imunogenicidade da Vacina combinada Viva Modificada de Mycoplasma hyopneumoniae Fração de Cepa Avirulenta Viva de Mycoplasma hyopneumoniae - Quimera de Circovírus Porcino Tipo 1-Tipo 2 em Porcos com 3-4 Semanas de Idade
[0146] Este exemplo descreve um estudo de imunogenicidade que suporta os resultados do estudo apresentado no Exemplo 4 e confirma a eficácia da fração de M. hyopneumoniae da vacina combinada de cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae - vacina viva modificada com quimera de Cirovírus Porcino Tipo 1-Tipo 2 (cPCV1-2) (MH/PCV) quando administrada por via intramuscular. A vacina de MH/PCV aqui descrita pode ser empregada adequadamente para a vacinação de suínos sadios como um auxílio em prevenir e/ou minimizar a gravidade de doença causada por M. hyopneumoniae e Circovírus Porcino.
[0147] Os porcos usados no presente estudo eram soronegativos para M. hyopneumoniae como determinado por ELISA.
[0148] Um total de 79 porcos com três a quatro semanas de idade foram randomizados em quatro grupos. 24 porcos, Grupo 1, foram vacinados com uma única dose da vacina combinada viva de PCV/MH. 24 porcos, Group 2, foram vacinados com a vacina combinada duas vezes em intervalo de duas semanas. 24 porcos, Group 3, foram vacinados com solução salina normal duas vezes em intervalo de duas semanas para servir como controles do desafio. Todas vacinas foram administradas por via intramuscular. Quatro porcos, Grupo 4, não foram vacinados nem desafiados e serviram como controles ambientais.
[0149] A vacina usada no estudo foi uma combinação de antígeno vivo de MH liofilizado (Lote1744-66) e diluente contendo vacina viva de PCV (cPCV1-2 Lote C108-56). No dia da vacinação, a torta de MH viva liofilizada foi reidratada com diluente contendo vírus PCV vivo (3,5 Log10 FAID50/mL com adjuvante de SP-Oil a 10%). A vacina final foi dada do Lote 2315-40. A viabilidade da fração de MH foi determinada antes e depois da vacinação, 2,09 x 108 CFU/mL e 1,56 x 108 CFU/mL, respectivamente. A vacina de placebo foi solução salina normal estéril.
[0150] A vacina para a segunda vacinação foi preparada como acima e dado o Lote no 2315-42. A viabilidade da fração de MH foi 1,05 x 108 CFU/mL e 6,72x 107 CFU/mL antes e depois da vacinação, respectivamente. A viabilidade da fração de diluente com PCV foi 3,44 Log 10 FAID50.
[0151] A vacina foi titulada antes do dia da vacinação. A cultura liofilizada de M. hyopneumoniae avirulenta foi reidratada mo dia da vacinação. Uma amostra de vacina foi retida e um ensaio de viabilidade foi realizado antes e depois da vacinação para determinar CFU/mL. A vacina permaneu sobre gelo durante o curso da vacinação.
[0152] Todos porcos foram observados diariamente quanto a temperaturas e sinais clínicos começando dois antes de cada vacinação, continuando por 7 dias depois de cada vacinação. Os porcos foram observados quanto a sintomas clínicos, que incluíram, porém sem limitações, tosse, espirro, descarga nasal, depressão, inapetência, e respiração forçada.
[0153] Os porcos foram observados por 7 dias depois da vacinação quanto a quaisquer reações adversas à vacina. Três porcos morreram durante o período de observação depois da vacinação, devido a causas não relacionadas à MH ou PCV. Um resumo das observações clínicas a partir do período pós-vacinação está indicado na Tabela 7. Tabela 7
NA: Não aplicável
[0154] Todos porcos nos Grupos 1-3 foram desafiados com uma cepa virulenta de M. hyopneumoniae em aproximadamente 7 semenas de idade. Os porcos do Grupo 1 foram desafiados quatro semanas depois da primeira vacinação. Os porcos nos Grupos 2 e 3 foram desafiados duas semanas depois da segunda vacinação. O insumo de desafio da M. hyopneumoniae virulenta, um homogeneizador pulmonar congelado (-70 °C) (LI-34) foi descongelado rapidamente sob água morna e diluído (diluição 1:100) usando meio de crscimento estéril para M. hyopneumoniae. Os porcos foram sedados com uma mistura de Xylazine-Ketamine-Telazol® compreendendo 50 mg/mL de Xilazina, 50 mg/mL de Cetamina, e 100 mg/mL de Telazol. Cada porco recebeu 10 mL do material do desafio por via transtraqueal.
[0155] Os porcos foram sangrados foram sangrados para obtenção de soro nos dias 0, 14, 28, e 56 do estudo. As amostras de soro coletadas a partir deste estudo podem ser testadas para avaliar a resposta sorológica a M. hyopneumoniae e PCV2 usando métodos ELISA bem conhecidos nessas técnicas. As amostras de soro coletadas a partir do Dia zero depois da vacinação (0DPV) e dia zero depois do desafio (0DPC) podem ser usadas para anticorpos contra M. hyopneumoniae, influenza suína (H1N1), e síndrome reprpdutiva e respiratória porcina (PRRS), usano kits para teste ELISA disponíveis comercialmente.
[0156] Quatro semanas (28 DPC) depois do desafio, todos os porcos dos grupos 1-4 foram sacrificados e os pulmões foram removidos. As pontuações de lesões pulmonares foram registradas e as lesões típicas de M. hyopneumoniae foram fixadas em formalina. As amostras foram examinadas quanto à histopatologia. Amostras de esfregaços de um lobo afetado com M. hyopneumoniae foram coletadas para isolamento bacteriano para detecção de infecções secundárias. Além disso, o fluido de lavagem alveolar brônquica foi coletado. Os pulmões foram lavados com solução salina tamponada com fosfato e o fluido resultante foi fracionado para teste por PCR.
[0157] Para a valiação da redução na gravidade de lesões pulmonares, o estimador foi a estatística de fração mitigada (MF). A fração mitigada foi calculada como:
onde: W1 = estatística da soma de Graduações Wilcoxon nc = número de indivíduos no grupo de controle nv = número de indivíduos no grupo vacinado O intervalo de confianaça de 95% da fração mitigada foi calculado. Para a alegação da redução na gravidade de lesões pulmonares: HO: Mv = Mc HA: Mv Mc onde: Mv = Média da pontuação de lesões pulmonares no grupo vacinado Mc = Média da pontuação de lesões pulmonares no grupo de controle
[0158] A distribuição de frequência das variáveis resultants contínuas foi avaliada usando PROC UNIVARIATE, que realize análise paramétrica e não paramétrica de uma amostra a partir de uma única população (SAS Institute Inc., Cary NC). As transformações Log nas titulações de anticorpo foram empregadas para atender à suposição de normalidade necessária para testes paramétricos. As avaliações basais para avaliar a comparabilidade de grupos para ninhada e sala serãofeitas por qui-quadrado. A gravidade das lesões pulmonares foi comparada entre cada grupo vacinado e o grupo de controle por teste da soma de graduações Wilcoxon (PROC NPAR1WAY com pontuação de lesões pulmonares como a variável dependente e o tratamento foi incluído como uma variável independente. PROC NPAR1WAY, que realiza testes não paramétricos para localização e diferenças de escala sobre uma classsificação unidirecional; PROC NPAR1WAY fornece também uma análise-padrão de variância nos dados brutos e estatística baseada na função de distribuição empírica (SAS Institute Inc., Cary NC).
[0159] Todas análises estatísticas serão realizadas usando o sistema SAS. Nos casos em que a transformção não melhora a distribuição dos resíduos para quaisquer variáveis transformadas como determinadas pelo teste W para normalidade, teste não paramétricos foram empregados conforme necessário. O nível de significância será estabelecido em p<0,05.
[0160] No dia da necropsia todos porcos foram sacrificados, as lesões pulmonares foram pontuadas e esfregadas para isolamento bacteriano. Lavagens bronquioalveolares (BAL) também foram coletadas. As bactérias isoladas a partir dos esfregaços consistiam no seguinte: espécie Actinobacillus, Moraxella osloensis, Streptococcus sanguinis, A. pyogenes e Bordetella bronchiseptica. As amostras de BAL foram testadas quanto a MH por metodologia de PCR; duas amostras do grupo de controle ambiental com lesões registradas, e duas amostras com baixas pontuações de lesões no vacinado e do grupo de controle. As amostras de BAL para ambos porcos do grupo de controle ambiental com lesões foram negativas e ambos porcos nos quais pontuações baixas de lesões no grupo vacinado eram positivos. A análise estatística para as lesões pulmonares está na Tabela 8. Tabela 8
LCL= Nível de confiança mais baixo MF = Fração mitigada
[0161] A análise estatística dos dados atendem aos critérios para a fração mitogada (<50%, with LCL >30%) para redução em lesões pulmonares. A vacina é considerada eficaz para a fração de MH com uma dose de 2 mL administrada por via IM, seja com uma única dose ou dose dupla a 2,09 x 108 CFU/mL. Além disso, a vacina é considerada seura devido à ausência de sinais clínicos relacionados à MH ou PCV depois da vacinação. TABELA 9 RESULTADOS DA SOROLOGIA PARA O EXEMPLO 2
Grupo 1: Vacina com SP Oil (vacinado e desafiado) Group 2: Controle/desafio (não vacinado e desafiado) Group 3: Controle não desafiado (não vacinado e não desafiado)
[0162] ODPV1 e ODPV2: Os números indicam a diluição mais alta que era positiva no teste ELISA depois da primeira dose da vacina (ODPV1) ou depois da segunda dose da vacina (ODPV2).
[0163] ODPC: Os números indicam os resultados de ELISA depois do desafio. O número mais alto indica soroconversão.
[0164] Ontuação de Pulmões: O número indica a porcentagem de lesões nos pulmões dos animais. O número mais alto indica um maior número de lesões pulmonares devido à falta de imunidade protetora. O número mais baixo indica um porco mais sadio com menos lesões devido à indução de uma resposta imune protetora.
Claims (7)
1. Composição imunogênica para uso na proteção de um animal contra uma doença associada a uma cepa virulenta de Mycoplasma hyopneumoniae, a dita composição sendo caracterizada por compreender uma quantidade imunologicamente eficaz de uma cepa avirulenta viva de Mycoplasma hyopneumoniae e SP-Oil, o SP-Oil compreendendo 1% a 3% vol/vol de copolímero em bloco de polioxietileno-polioxipropileno; 2% a 6% vol/vol de esqualano; 0,1% a 0,5% vol/vol de monooleato de polioxietileno sorbitano; e uma solução salina tamponada; em que a cepa viva avirulenta de Mycoplasma hyopneumoniae é uma cepa J designada como ATCC 25934 ou ATCC 27715.
2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender ainda: (a) uma ou mais bactérias vivas, bacterina e/ou um ou mais toxóides purificados selecionados do grupo que consiste em Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae e bactéria leptospira; ou (b) um ou mais antígenos virais selecionados do grupo que consiste em um antígeno do vírus da influenza suína (SIV), um antígeno do vírus da síndrome respiratória e reprodutiva porcina (PRRSV), poxvírus de raccoon que expressa PRRS ou outros antígenos, TGEV que expressa PRRS ou outros antígenos, e um antígeno de circovírus porcino (PCV).
3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de ser para uso na prevenção ou redução de pelo menos um sintoma de uma doença associada a uma cepa virulenta de Mycoplasma hyopneumoniae.
4. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o dito animal é um porco.
5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de ser para uso na prevenção ou melhoria de um surto de Mycoplasma hyopneumoniae.
6. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de ser para uso no aumento de uma resposta imune a Mycoplasma hyopneumoniae, em que o dito aumento compreende a etapa de administração de uma única dose ou de múltiplas doses da dita composição imunogênica a um animal.
7. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de ser para uso na proteção de um animal contra uma doença associada a uma cepa virulenta de Mycoplasma hyopneumoniae, ou para prevenção ou redução de pelo menos um sintoma associado à doença por aumento de uma resposta imune a Mycoplasma hyopneumoniae, em que o dito aumento compreende as etapas de: a) em um primeiro momento, administrar uma primeira composição imunogênica como definida na reivindicação 1 ou 2; b) em um segundo momento, administrar uma segunda composição imunogênica como definida na reivindicação 1 ou 2.
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