TWI513463B - 豬肺炎黴漿菌無毒性之佐劑化活疫苗 - Google Patents

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Description

豬肺炎黴漿菌無毒性之佐劑化活疫苗
概言之，本揭示內容係關於免疫學及獸醫醫學領域。更具體而言，本揭示內容提供基於豬肺炎黴漿菌之J菌株的無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌組合物，其包括免疫原性組合物或疫苗組合物，其有助於降低由一或多種有毒性之豬肺炎黴漿菌株所引起疾病之嚴重性及/或預防該疾病。本發明亦提供進一步包含豬第一型-第二型環狀病毒嵌合體改質活疫苗(cPCV1-2)之無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌組合物(包括免疫原性組合物或疫苗組合物)。向動物投與一次或兩次劑量之本發明所揭示之無毒性的佐劑化活豬肺炎黴漿菌組合物可有效提供免疫(包括細胞介導之免疫及/或體液免疫)以免於被有毒性之豬肺炎黴漿菌株感染。
豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae )(亦稱為豬肺炎黴漿菌(M. hyopneumoniae ))係豬黴漿菌性肺炎之病原體。該疾病造成持續數週之久咳、皮毛暗淡、生長阻滯及外觀生長發育不良。在受感染動物中觀察到紫色至灰色之實質化區域之特徵性損傷(尤其在腹部頂端及心葉中)。儘管該疾病造成較低死亡率，但受侵襲之豬通常易於被機會病原體二次感染，導致死亡或緊迫。(R. F. Ross，Mycoplasmal diseases，第436-444頁，A. D. Laman等人(編輯)，Diseases of Swine,Iowa State University Press,1986)。
該疾病被認為是與疾病有關之豬損失之最重要原因之一(Whittlestone，第133-176頁，Tully及Whitcomb(編輯)，黴漿菌第2卷：Human and Animal Mycoplasmas,New York,Academic Press,(1979))。該疾病通常導致低效率重量獲得者及矮小及多病動物。而且，受侵襲之豬通常易於被機會生物體二次感染(Burch,Pig America，第26-27頁，1982年12月)。該疾病之經濟影響極為顯著。估計每年僅經濟損失即達2至2.5億美元。
豬肺炎黴漿菌係生長緩慢之無細胞壁苛養菌。豬鼻黴漿菌(Mycoplasma hyorhinis )係亦位於呼吸道中之常見第二病原體，其使得通常難以自呼吸道中分離出豬肺炎黴漿菌。該疾病藉由咳嗽所產生之飛沫及藉由與受侵襲或病後帶菌豬直接接觸而傳播。使受感染動物與未受感染動物混合很快且經常導致再感染。感染通常以母豬攜帶者在產小豬時感染小豬開始。
由於豬群管理技術，感染可能直至生命後期才變得明顯。當斷奶後將豬集中時通常會觀察到額外感染。在六週齡或更大的豬中一般會觀察到明顯疾病。在受侵襲動物中生長速率及飼料轉化率明顯降低。使用抗生素之現有治療極為昂貴且需要長期使用。動物再感染仍成問題。
因此，疫苗係目前用於避免感染及其後果之最有效方法。已多次嘗試提供用於保護豬抵抗豬肺炎黴漿菌感染之疫苗。數位研究者曾揭示包含經重組產生之豬肺炎黴漿菌表面抗原之疫苗，Schaller等人，美國專利第4,894,332號(頒佈於1990年1月16日)；歐洲專利公開案第283,840號(公佈於1988年9月28日)。PCT公開案第WO 86/00019號(公佈於1986年1月3日)揭示僅包含豬肺炎黴漿菌質膜而無其他細胞組份之豬肺炎黴漿菌疫苗。Etheridge等人，Res. Vet. Sci. 33:188(1982)發現，當經靜脈內、皮下、或腹膜腔內給與活疫苗時可提供抵抗豬肺炎黴漿菌肺部定植之不完全保護。Kristensen等人，Am. J. Vet. Res. 42:784(1981)發現在注射熱滅活豬肺炎黴漿菌後不提供豬抵抗黴漿菌性肺炎之保護。Ross等人(Am. J. Vet. Res. 45:1899(1984))發現使用藉由冷凍-解凍程序製備之豬肺炎黴漿菌提取物來免疫豬僅提供不確定之保護，且在一些情形下注意到在經免疫豬中損傷發生增多。該等研究者亦對藉由福爾馬林滅活製備之全細胞疫苗進行了研究。福爾馬林滅活顯著阻礙了豬肺炎黴漿菌之保護性免疫原性，且該疫苗無效。Yoshioka等人，美國專利第3,917,819號(頒佈於1975年11月4日)揭示數種包含經福爾馬林滅活之黴漿菌之被殺死黴漿菌疫苗，包括用於豬肺炎黴漿菌之滅活疫苗。中南歐洲專利公開案(Chung-Nan European Patent Publication)第571,648號揭示基於高增殖性及抗原性菌株PRIT-5之豬肺炎黴漿菌疫苗。
基於滅活之有毒性豬肺炎黴漿菌株之疫苗市面有售。富道動物保健公司(Fort Dodge Animal Health)(FDAH)以Suvaxyn及Respifend豬肺炎黴漿菌之名出售豬肺炎黴漿菌菌苗，其用作保護健康豬抵抗由豬肺炎黴漿菌引起之臨床體徵之疫苗。該菌苗疫苗經建議以兩次劑量疫苗用於至少一週齡的豬，在第一次接種疫苗後2至3週給與第二次劑量。
豬肺炎黴漿菌J菌株係非病原性菌株，其黏附於豬纖毛上且因此引起疾病之能力降低。Castro等人，Veterinary Microbiology 116:258-269(2006)及Vasconcelos等人，J. Bacteriol. 187(16):5568-5577(2005)(闡述豬肺炎黴漿菌J菌株(ATCC 25934)之完整基因組序列)。病原性與非病原性菌株(J菌株)之間之基因組比較顯示其表面蛋白(包括纖毛黏附素)具有差異，吾人認為此係豬肺炎黴漿菌株之間相對病原性特性之決定因素。Vasconcelos等人(2006)及Djordjevic等人，Infection and Immunity 72(5):2791-2802(2004)。
豬肺炎黴漿菌在其細胞表面上表現膜狀脂蛋白，尤其P46、P65及P97蛋白，其攜帶物種特異性抗原決定簇。最近，Bouh等人闡述無毒性之活豬肺炎黴漿菌參考J菌株ATCC 25934之P46及P65的單株抗體。Clin. Diag. Lab. Immunology 10(3):459-468(2003)。Blank及Stemke闡述豬肺炎黴漿菌株J基因組之物理及基因圖譜(Can. J. Microbiol. 46:832-840(2000))，且Wilton等人闡述篩選自非病原性豬肺炎黴漿菌J菌株產生之表現庫及用抵抗豬肺炎黴漿菌之豬超免疫抗血清篩選彼等庫。
當前需要自無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌製得之可提供抵抗有毒性之豬肺炎黴漿菌株功效的組合物(包括免疫原性組合物或疫苗組合物)。本文中任一參考文獻之引用皆不應視為承認該參考文獻可作為本發明之先前技術。
本揭示內容提供包含免疫有效量之無毒性之活豬肺炎黴漿菌及生物學上可接受之佐劑之組合物，包括免疫原性組合物或疫苗組合物。本文所揭示之組合物能夠引發抵抗豬肺炎黴漿菌之免疫反應，由此預防由該生物體引起之疾病及/或使其嚴重性降至最低或改善與該疾病有關之至少一種症狀。
因此，在一個態樣中，本發明提供用於在動物中引發抗豬肺炎黴漿菌免疫反應之組合物，該組合物包含免疫有效量之無毒性之活豬肺炎黴漿菌株及生物學上可接受之佐劑。
在一個實施例中，該組合物包含無毒性之活豬肺炎黴漿菌株，該菌株之基因組所包含之核酸序列與參考J菌株之核酸序列具有至少約90%同源性。
在一個實施例中，該組合物包含無毒性之活豬肺炎黴漿菌株，該菌株之基因組所包含之核酸序列與參考J菌株之核酸序列具有至少約95%同源性。
在一個實施例中，該組合物包含無毒性之活豬肺炎黴漿菌株，該菌株之基因組所包含之核酸序列與參考J菌株之核酸序列具有至少約99%同源性。
在一個實施例中，該組合物所包含之無毒性之活豬肺炎黴漿菌株與參考J菌株具有至少約70%之多態一致性。
在一個實施例中，該組合物所包含之無毒性之活豬肺炎黴漿菌株與參考J菌株具有至少約85%之多態一致性。
在一個實施例中，該組合物所包含之無毒性之活豬肺炎黴漿菌株與參考J菌株具有至少約95%之多態一致性。
在一個實施例中，本文所述組合物中所用之無毒性之活豬肺炎黴漿菌株的同源性百分比係藉由與ATCC登錄號為25934(GenBank登錄號AE017243)或27715之無毒性之參考J菌株進行比較來測定。在其他一些實施例中，參考菌株可為有毒性菌株，例如，ATCC登錄號為25617或25095之彼等菌株。
在一個實施例中，本文所述組合物中所用之無毒性之活豬肺炎黴漿菌株的多態一致性百分比係藉由與ATCC登錄號為25934或27715之無毒性之參考J菌株進行比較來測定。在其他一些實施例中，參考菌株可為有毒性菌株，例如，ATCC登錄號為25617或25095之彼等菌株。
在一個實施例中，本文所述組合物中所用之無毒性之活豬肺炎黴漿菌株係ATCC登錄號指定為25934或27715之J菌株。
在一個實施例中，本文所述組合物中所用之無毒性之活豬肺炎黴漿菌株係ATCC登錄號指定為27715之J菌株。
在一個實施例中，藉由無毒性之活豬肺炎黴漿菌株所引發之免疫反應可保護動物抵抗有毒性之豬肺炎黴漿菌株感染或降低與有毒性之豬肺炎黴漿菌株感染有關之至少一種症狀的嚴重性。
在一個實施例中，向動物投與一次劑量之本文所揭示之無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌組合物可有效提供動物免疫以使其免於被黴漿菌感染。
在一個實施例中，向動物投與兩次劑量之本文所揭示之無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌組合物可有效提供動物免疫以使其免於被黴漿菌感染。
本文所揭示之無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌疫苗組合物適宜用於豬中抵抗由豬肺炎黴漿菌引起之感染及疾病且可用於控制及/或預防由豬肺炎黴漿菌引起之感染及疾病在豬群體中傳播。
因此，本揭示內容之免疫原性組合物及疫苗組合物使用一或多種無毒性之活豬肺炎黴漿菌與一或多種諸如生物學上可接受之佐劑等佐劑。生物學上可接受之佐劑可視情況為一或多種選自由下列組成之群之佐劑：SP-油、SL-CD、丙烯酸聚合物(例如卡波普(Carbopol)，Noveon公司，Cleveland,OH)、及諸如一或多種不飽和萜烯烴(例如角鯊烯或角鯊烷)等可代謝油與聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物(例如普羅尼克(Pluronic)(BASF,Florham Park,New Jersey))之混合物。
本文所述組合物中所用佐劑之濃度將端視佐劑之性質而定。佐劑一般而言以約1-50%(v/v)之最終濃度且更一般而言以約10%、15%、20%、25%、或30%(v/v)之最終濃度存在於本文所述之組合物中。在包含SP-油之組合物中，佐劑一般以約1%至約25%(v/v)、更一般而言以約5%至約15%(v/v)(例如，以約10%(v/v))存在。在包含丙烯酸聚合物及包含一或多種萜烯烴之可代謝油與聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物之混合物的組合物中，丙烯酸聚合物與可代謝油/聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物混合物之比一般介於約1:25與約1:50之間且最終濃度一般介於約1%與約25%(v/v)之間。
在一個實施例中，生物學上可接受之佐劑包含SP-油。在一個實施例中，SP-油以介於約1%與約25%v/v之間之濃度存在。在一個實施例中，SP-油以介於約5%與約15%v/v之間之濃度存在。在一個實施例中，SP-油以約10%v/v之濃度存在。
在某些實施例中，本文所揭示之組合物可使用(進一步組合)一或多種其他活細菌、菌苗、類毒素、及/或病毒抗原。因此，在該等實施例之某些態樣中，該無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌組合物可包含免疫有效量之無毒性之活豬肺炎黴漿菌及一或多種生物學上可接受之佐劑與以下之進一步組合：(a)一或多種活細菌；(b)一或多種菌苗；(c)來自一或多種以下病原體之一或多種經純化類毒素，例如，副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis )、多殺巴斯德菌(Pasteurella multocida )、豬鏈球菌(Streptococcus suis )、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae )、支氣管敗血性博德特菌(Bordetella bronchiseptica )、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis )、豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae )及鈎端螺旋體屬細菌(leptospira bacteria)；及/或(d)一或多種病毒抗原，其中該病毒係選自由下列組成之群：豬流感病毒(SIV)、豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)、表現PRRS之浣熊痘病毒及/或其他抗原、表現PRRS之TGEV及/或其他抗原、及豬環狀病毒(PCV)。在該等實施例之某些態樣中，本文所例示之組合物(包括免疫原性組合物或疫苗組合物)使用(進一步組合)豬第一型-第二型環狀病毒嵌合體改質活疫苗(cPCV1-2)。在該等或替代實施例中，包括免疫原性組合物或疫苗組合物之組合物可額外或視情況包括防腐劑及穩定劑，例如，SGGK、硫柳汞及/或EDTA。
本文所述組合物中所用之該等其他活細菌、菌苗、類毒素、及/或病毒抗原的濃度將端視活細菌、菌苗、類毒素、及/或病毒抗原之性質而定且一般存在於本文所述之組合物中。對於其中其他抗原係細菌性抗原之該等組合物而言，細菌一般以介於約0.5×105 至0.5×1010 /毫升間之最終濃度存在。或者，細菌以介於約0.5×106 至0.5×109 /毫升間之最終濃度或以介於約0.5×107 至0.5×108 /毫升間之最終濃度存在。
本發明之第二態樣提供保護動物抵抗由豬肺炎黴漿菌引起之疾病及/或預防或改善該疾病在動物群體中爆發之方法，該方法藉由投與本文所述之無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌組合物來實施。在相關態樣中，本揭示內容亦提供增強對豬肺炎黴漿菌之免疫反應的方法。該等方法包含以一次或兩次劑量向動物(例如豬)投與包含一或多種無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌株之組合物的步驟。
在一個實施例中，本發明方法使用無毒性之活豬肺炎黴漿菌株，該菌株之基因組所包含之核酸序列與參考J菌株之核酸序列具有約90%同源性。
在一個實施例中，本發明方法使用無毒性之活豬肺炎黴漿菌株，該菌株之基因組所包含之核酸序列與參考J菌株之核酸序列具有約95%同源性。
在一個實施例中，本發明方法使用無毒性之活豬肺炎黴漿菌株，該菌株之基因組所包含之核酸序列與參考J菌株之核酸序列具有約99%同源性。
在一個實施例中，本發明方法所使用之無毒性之活豬肺炎黴漿菌株與參考J菌株具有至少約70%之多態一致性。
在一個實施例中，本發明方法所使用之無毒性之活豬肺炎黴漿菌株與參考J菌株具有至少約85%之多態一致性。
在一個實施例中，本發明方法所使用之無毒性之活豬肺炎黴漿菌株與參考J菌株具有至少約95%之多態一致性。
在一個實施例中，本文所述之本發明方法中所用之無毒性的活豬肺炎黴漿菌株係ATCC登錄號指定為25934或27715之J菌株。
在一個實施例中，本文所述之本發明方法中所用之無毒性的活豬肺炎黴漿菌株係ATCC登錄號指定為27715之J菌株。
在一個實施例中，本發明提供增強對豬肺炎黴漿菌之免疫反應的方法，該方法包含以下步驟：
a)　在第一時間向動物投與第一免疫原性組合物，該第一免疫原性組合物包含免疫有效量之經生物學上可接受之佐劑物質佐劑化的無毒性之活豬肺炎黴漿菌株；
b)　在第二時間向動物投與第二免疫原性組合物，該第二免疫原性組合物包含免疫有效量之經生物學上可接受之佐劑物質佐劑化的無毒性之活豬肺炎黴漿菌。
在某些實施例中，端視所預期之精確應用而定，可以非經腸方式投與組合物，例如藉由肌內、皮下、或腹膜腔內注射、或藉由乳膏之局部施用投與。或者，可藉由氣溶膠、鼻內、或經口途徑來投與組合物，例如藉由鼻內噴霧或藉由用手遞送或集體施用(mass application)來經口投與。
本發明之第三態樣提供本文所述豬肺炎黴漿菌株及包含該等菌株之組合物的用途，其係用以製備用於治療受到豬肺炎黴漿菌感染或患有至少一種與豬肺炎黴漿菌感染有關之症狀之動物的藥劑。
自下文所述詳細闡述及隨附申請專利範圍可明確瞭解本發明之該等及其他實施例、特徵及優點。本文所引用之所有專利、專利申請案及其他文獻之全文皆以引用方式併入本文中。在不一致情形下以本揭示內容為準。
在闡述本發明方法及治療方法學之前，應瞭解本發明並不限於所述特定方法及實驗條件，因為該等方法及條件可以變化。亦應理解本文所用之術語僅係出於描述具體實施例之目的，而不意欲加以限制。
除非上下文另外明確指出，否則本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式"一(a、an)"及"該(the)"包括複數個指示物。因此，例如，"該方法"之指示物包括一或多種方法及/或本文所述類型步驟及/或在閱讀本揭示內容後彼等熟習此項技術者顯而易見者等等。
因此，在本申請案中，可使用熟習此項技術者所熟知之習用分子生物學、微生物學及重組DNA技術。文獻中對該等技術進行了充分闡釋。參見，例如，Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual ，第二版(1989)冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，紐約(本文中"Sambrook等人，1989")；DNA Cloning:A Practical Approach ，第I及II卷(D.N. Glover編輯，1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編輯，1984)；Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins編輯，(1985))；Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins編輯，(1984))；Animal Cell Culture (R.I. Freshney編輯，(1986))；Immobilized Cells And Enzymes (IRL出版社，(1986))；B. Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；F.M. Ausubel等人(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology ,John Wiley & Sons公司(1994)。
儘管任何類似或等效於彼等本文所述方法及材料者皆可用於本發明之實踐或測試中，但目前所述係較佳之方法及材料。本文所提及之所有出版物之全文皆以引用方式併入本文中。
定義
本文所用之術語具有彼等熟習此項技術者所公認及習知之含義，然而，為方便及完整起見，下文將對特定術語及其含義予以闡明。
詞語"約(about或approximately)"意指在值的統計學上有意義之範圍內。該範圍可在某數量級內，一般而言在給定值或範圍之50%內，更一般而言在20%內，更一般而言在10%內，且甚至更一般而言在5%內。詞語"約(about或approximately)"所涵蓋之容許變動端視所研究之特定系統而定，且熟習此項技術者可容易地確定。
"佐劑"意指由一或多種能夠增強組合物(一般而言為疫苗組合物)中無毒性之活豬肺炎黴漿菌之抗原性的物質構成之組合物。佐劑可用作緩慢釋放抗原之組織補給站且亦可用作非特異性增強免疫反應之淋巴樣系統激活劑(Hood等人，Immunology ，第二版，Menlo Park，CA:Benjamin/Cummings,1984，第384頁)。在無佐劑存在下用單獨抗原初次接種通常不能引發體液或細胞免疫反應。佐劑包括(但不限於)福氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant)、福氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant)、諸如氫氧化鋁等礦物凝膠、表面活性物質，例如溶血卵磷脂、普羅尼克多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳液、鑰孔蟲戚血蘭素、及潛在有用之人類佐劑，例如N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩胺醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基-正-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩胺醯胺、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩胺醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺、BCG(卡介苗)及小棒桿菌(Corynebacterium parvum )。較佳地，佐劑係生物學上可接受之佐劑。
本文所述組合物中所用之佐劑一般為"生物學上可接受之佐劑"且因此可與無毒性之活豬肺炎黴漿菌組合使用，由此可在活體內投與所得組合物而對動物無伴隨毒性。本文所例示之組合物包括無毒性之活豬肺炎黴漿菌與一或多種生物學上可接受之佐劑的組合，該佐劑係選自由下列組成之群：SP-油、SL-CD、卡波普、及諸如一或多種不飽和萜烯烴(例如角鯊烯或角鯊烷)等可代謝油與聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物(例如普羅尼克)之混合物。
當無毒性之活豬肺炎黴漿菌株或來自其之分子能夠特異性地與免疫系統之抗原識別分子(例如免疫球蛋白(抗體)或T細胞抗原受體)相互作用時，其具有"抗原性"。一般而言，抗原性分子係多肽或其變體，其含有具有至少約5個且一般至少約10個胺基酸之"抗原決定部位"。多肽之抗原性部分在本文中亦稱為"抗原決定部位"，其可為對於抗體或T細胞受體識別呈免疫顯性之部分，或其可為可用於藉由將抗原性部分與用於免疫之載劑多肽偶聯產生該分子之抗體的部分。抗原性分子本身無需具有免疫原性(即，能夠在無載劑存在下引發免疫反應)。
術語"至少"意指不少於。
本文所用之"菌苗"係已經滅活且當其與某些佐劑組合投與給動物時可引發防止疾病或感染之保護性免疫力的細菌收穫物。
丙烯酸聚合物一般為聚羧乙烯製劑。聚羧乙烯製劑可以商品名"卡波普(Carbopol)"購得且闡述於(例如)美國專利第2,909,462號及第3,790,665號中，各該專利案均以引用方式併入本文中。
術語"載劑"係指與化合物或組合物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑、穩定劑、防腐劑及/或媒劑。該等載劑可為無菌液體，例如水及油，油包括石油、動物油、植物油或合成來源之油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。水或諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格溶液(Ringer's solution)等水性生理食鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液經常用作載劑，尤其用於注射溶液。載劑或稀釋劑必須無毒性且必須不影響抗原/免疫原之生物活性。
其他額外輔助物質亦可用於本發明之組合物中，例如潤濕劑或乳化劑、表面活性劑、pH緩衝物質及諸如此類。防腐劑可包括(例如)硫柳汞(thimerosol)及/或EDTA。適宜醫藥載劑闡述於"Remington's Pharmaceutical Sciences"(E.W. Martin，第18版)中。多種載劑已為熟習此項技術者所熟知且具體載劑之選擇在彼等熟習此項技術者之領域內。
術語"菌落形成單位"或"CFU"係用於表示給定樣品中能夠複製之生物體數量的量測單位。此係基於菌落係衍生自細菌之成對/成簇或單細胞之複製作用的理論。
"免疫有效量"係可引發抵抗豬肺炎黴漿菌之免疫反應之無毒性之活豬肺炎黴漿菌的量。"免疫有效量"將端視接受者動物之物種、品種、年齡、大小、健康狀況而定，且會受動物先前曝露過之一或多種豬肺炎黴漿菌株影響，不管該一或多種菌株是有毒性之豬肺炎黴漿菌株還是無毒性之豬肺炎黴漿菌株。當與適宜佐劑組合使用時，本文所用之無毒性之活豬肺炎黴漿菌之"免疫有效量"係足以增強無毒性之活豬肺炎黴漿菌之免疫原性並因此提供抵抗有毒性之豬肺炎黴漿菌株攻擊(challenge)之保護性免疫力之豬肺炎黴漿菌的量。在一個實施例中，免疫有效量最少為約1×103 個生物體。在一個實施例中，免疫有效量介於約1×103 個菌落形成單位/ml(CFU/ML)至約1×1011 CFU/ML之間。在一個實施例中，免疫有效量為約5×107 CFU/ML。
本文所用之術語"免疫原性"意指能夠引發體液及/或細胞免疫反應之無毒性之活豬肺炎黴漿菌。免疫原性菌株亦具有抗原性。免疫原性組合物係當投與給動物時能引發體液及/或細胞免疫反應之組合物。
術語"免疫原性組合物"涉及含有抗原(例如，微生物)之任何醫藥組合物，該組合物可用於在哺乳動物中引發免疫反應。免疫反應可包括T細胞反應、B細胞反應、或T細胞及B細胞反應二者。該組合物可用於藉由提呈抗原與MHC分子於細胞表面上使哺乳動物敏感。另外，可產生抗原特異性T-淋巴細胞或抗體以提供經免疫宿主將來保護。"免疫原性組合物"可含有包含完整微生物或衍生自其之免疫原性部分之活、減毒或被殺死/滅活疫苗，其可誘導細胞介導之(T細胞)免疫反應或抗體介導之(B細胞)免疫反應或二者，且可保護動物免於一或多種與微生物感染有關之症狀，或可保護動物免於由於微生物感染而導致之死亡。
本文所用之術語"經分離的"意指所提及物質係自其天然環境取出。因此，經分離之生物物質可能不含一些或全部細胞組份，即，原始物質在其中天然存在之細胞組份(例如，細胞質或細胞膜組份)。若物質存在於細胞提取物或上清液中，則分離出該物質。經分離蛋白可與其他蛋白或核酸或二者相聯(經分離蛋白在細胞中與該等相聯)或若經分離蛋白為膜相關蛋白則與細胞膜相聯。自解剖部位取出經分離之細胞器、細胞、或組織，在生物體中於解剖部位發現該等經分離物質。經分離物質可經純化，但並非必需。
本文所用之術語"MHDCE"表示豬肺炎黴漿菌DNA細胞等效物且定義為用於測定存在於給定樣品中之豬肺炎黴漿菌生物體之大約數量的量測單位。
本文所用之術語"非經腸投與"意指藉由除藉由胃腸道之外的一些其他手段投與，尤其指藉由靜脈內、皮下、肌內、或髓內注射將物質引入至生物體中，但亦指其他非經口及非經鼻投與途徑，例如腹膜腔內注射或局部施用。
術語"與參考J菌株之多態一致性"係指一種豬肺炎黴漿菌非J菌株與豬肺炎黴漿菌之參考J菌株之蛋白表現性質間之相似性。多態一致性可基於一或多種蛋白之一或多種特徵，包括但不限於(例如)所研究豬肺炎黴漿菌微生物之一或多種蛋白的量或大小、一或多種蛋白之沈降速率、或一或多種蛋白之物理或生物化學特徵之改變。該術語亦可包括編碼一種豬肺炎黴漿菌非J菌株及豬肺炎黴漿菌之參考J菌株之任一或多種蛋白之核苷酸序列間之相似性且包括該等序列中之任何突變，包括缺失或取代。核苷酸或胺基酸序列之改變係容許保留豬肺炎黴漿菌生物體之無毒性性質者。多種用於觀測核苷酸及胺基酸序列擾動之分析法已為熟習此項技術者所熟知。例如，核酸或胺基酸序列之大小及結構可藉由彼等熟習此項技術者所習知之Northern、Southern、Western、SDS-PAGE ELISA性質、PCR及DNA測序方案來觀測(參見，例如，Calus,D.等人，Veterinary Microbiology，第120卷，第3-4期，2007年3月10日，第284-291頁；Scarman,AL等人，Microbiology(1997)，第143卷：663-673)。另外，熟習此項技術者亦熟知用於觀測核苷酸及胺基酸序列擾動之其他方法，例如單鏈構象多態現象分析(參見，例如，頒佈於1999年9月7日之美國專利第5,382,510號及頒佈於1995年1月17日之美國專利第5,952,170號)。
本文所用之術語"經純化的"係指在可減少或消除無關物質存在之條件下分離出之物質，該等無關物質即雜質，包括自其獲得該物質之原始物質。例如，一般而言，經純化之細菌或蛋白實質上不含宿主細胞或培養物組份，包括組織培養物或卵蛋白、非特異性病原體及諸如此類。在物質之分析測試上下文中，本文所用之術語"實質上不含"可以可操作方式使用。一般而言，實質上不含雜質之經純化物質至少50%純淨，更一般而言至少90%純淨，且更一般而言仍至少99%純淨。純度可藉由層析法、凝膠電泳、免疫分析法、組成分析、生物分析法及熟習此項技術者所習知之其他方法來評價。用於純化之方法已為熟習此項技術者所熟知。術語"實質上純淨"表示利用熟習此項技術者所習知之習用純化技術可達成之最高純度。
"參考菌株"係指自可靠來源獲得且可用作對照菌株以供與其他未確定或未知培養物進行比較之微生物菌株(例如，豬肺炎黴漿菌)。在本發明中，豬肺炎黴漿菌之參考菌株可為自美國菌種培養物保藏中心(ATCC)獲得且ATCC登錄號指定為25934及27715之無毒性J菌株。在本發明中，亦已使用ATCC登錄號為25934或27715之該等"參考菌株"來製備本發明之免疫原性組合物。在本發明之其他一些實施例中，豬肺炎黴漿菌之參考菌株可自美國菌種培養物保藏中心(ATCC)獲得且ATCC登錄號指定為25617及25095。
術語"SL-CD"係指硫脂-環糊精(sulpholipo-cyclodextrin)，其屬於闡述於美國專利第6,610,310號及第6,165,995號中之環糊精佐劑家族。一般而言，將SL-CD與諸如一或多種不飽和萜烯烴(例如，角鯊烷)等可代謝油且較佳與諸如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯等非離子型表面活性劑調配於混合物中。
術語"SP-油"係指包含以下之油乳液佐劑：1%至3%vol/vol聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；2%至6%vol/vol角鯊烷；0.1%至0.5%vol/vol聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯；及緩衝鹽溶液。
術語"疫苗"或"疫苗組合物"可互換使用，其係指包含至少一種可在動物中誘導免疫反應之免疫原性組合物的醫藥組合物。疫苗或疫苗組合物可保護動物免於因感染而引起之疾病或可能之死亡，且可包括或不包括一或多種能夠增強活性組份之免疫活性之額外組份。疫苗或疫苗組合物可額外包含更多典型醫藥組合物組份。疫苗或疫苗組合物可額外包含更多典型疫苗或疫苗組合物組份，包括(例如)佐劑或免疫調節劑。疫苗之免疫原性活性組份可包含呈初始形式之完整活生物體、或在改質活疫苗中之減毒生物體、或在已殺死或滅活疫苗中之藉由適當方法滅活之生物體、或包含病毒之一或多種免疫原性組份之亞單位疫苗、或藉由彼等熟習此項技術者所習知之方法製備之基因工程、突變或選殖疫苗。疫苗或疫苗組合物可包含一種或同時包含多於一種上述成份。
本文所用之"有毒性的"係指豬肺炎黴漿菌株引起與豬肺炎黴漿菌感染有關之疾病的能力。毒性可藉由觀察動物之疾病進展來評價。豬肺炎黴漿菌之"有毒性"菌株之實例係藉由本發明中所述及所用之豬肺炎黴漿菌之攻擊菌株所例示者。其他有毒性之豬肺炎黴漿菌株可自美國菌種培養物保藏中心(ATCC)獲得，其稱為菌株號25617或25095。術語"無毒性的"係指缺乏毒性之豬肺炎黴漿菌株。即，無毒性菌株、分離株或構建體係非病原性的且不能引起疾病。本文所用之術語"無毒性的(avirulent)"與術語"非毒性的(non-virulent)"可同義使用。本文所例示之組合物使用豬肺炎黴漿菌無毒性之活培養菌株J(FCX3-Line 1，其以菌株號27715自美國菌種培養物保藏中心(ATCC)獲得)。另一亦可自ATCC獲得之"無毒性"菌株稱為菌株號25934。如ATCC目錄中所述，ATCC登錄號指定為27715之J菌株選殖自ATCC登錄號指定為25934之母體J菌株。
概述
本揭示內容係基於以下發現：一次或兩次劑量方案之豬肺炎黴漿菌組合物(包括免疫原性組合物或疫苗組合物)可有效防止及/或預防或改善與有毒性之豬肺炎黴漿菌感染有關之疾病，該組合物使用一或多種無毒性之活豬肺炎黴漿菌(例如，菌株J(FCX3-Line 1；ATCC登錄號27715))及一或多種佐劑(一般而言為生物學上可接受之佐劑)。
在一個實施例中，其他無毒性之活豬肺炎黴漿菌株(包括但不限於J菌株)亦預期用於本發明之組合物及方法中，該菌株之基因組所包含之核酸序列與參考J菌株具有至少約90%同源性、或至少約95%同源性、或至少約99%同源性。
在一個實施例中，其他無毒性之活豬肺炎黴漿菌株(包括但不限於J菌株)亦預期用於本發明之組合物及方法中，該菌株與參考J菌株具有至少約70%之多態一致性、或至少約85%之多態一致性、或至少約95%之多態一致性。
該參考J菌株可選自ATCC登錄號指定為25934或27715之豬肺炎黴漿菌株。
在一個實施例中，本發明之組合物及方法中所用之無毒性活J菌株係ATCC登錄號指定為25934或27715之J菌株。
在一個實施例中，本發明之組合物及方法中所用之無毒性活J菌株係ATCC登錄號指定為27715之J菌株。
本文亦揭示使用一或多種無毒性之活豬肺炎黴漿菌株與豬第一型-第二型環狀病毒嵌合體改質活疫苗(cPCV1-2)(參見美國專利公開案第2003/0170270號及第2004/0253270號)之進一步組合的組合物(包括疫苗組合物)，其亦可有效防止及/或預防或改善與有毒性之豬肺炎黴漿菌感染及/或有毒性之豬環狀病毒感染有關之疾病。
在某些實施例中，本發明之組合物進一步包含一或多種活細菌、菌苗及/或一或多種經純化類毒素，其選自由下列組成之群：副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、支氣管敗血性博德特菌、豬霍亂沙門氏菌、豬丹毒桿菌及鈎端螺旋體屬細菌。
在某些實施例中，本發明之組合物進一步包含一或多種選自由下列組成之群之病毒抗原：豬流感病毒(SIV)抗原、豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)抗原、表現PRRS之浣熊痘病毒或其他抗原、表現PRRS之TGEV或其他抗原、及豬環狀病毒(PCV)抗原。
在某些實施例中，下文將根據防止稱為LI-34之含有有毒性之豬肺炎黴漿菌株11之肺勻漿感染來闡述本揭示內容(參見J. Clin. Microbiol. 1999年3月；37(3):620-7)。然而，預期本文所揭示之組合物可有效防止及/或預防或改善與多種有毒性之豬肺炎黴漿菌感染有關之疾病或與該疾病有關之至少一種症狀。多種有毒性之豬肺炎黴漿菌分離株已為熟習此項技術者所習知且可自包括美國菌種培養物保藏中心(12301 Parklawn Drive,Rockville,Md. 20852)之多個來源獲得。該等有毒性菌株之實例包括(但不限於)ATCC登錄號25095、27714及25617。
本揭示內容之組合物(尤其免疫原性組合物或疫苗組合物)可藉由一或多種業內易於獲得之方法自無毒性之活豬肺炎黴漿菌之凍乾或新鮮收穫培養物製備。本文所例示之組合物包含可以ATCC號27715(其為ATCC號25934之經過濾及選殖(3次)分離株)獲得之無毒性之活豬肺炎黴漿菌株J(FCX3-line 1)。
無毒性之活豬肺炎黴漿菌可藉由闡述於美國專利第5,338,543號及第5,565,205號中之方法進行培養，每一專利之全文均以引用方式併入本文中。更具體而言，豬肺炎黴漿菌可在諸如PPLO(類胸膜肺炎生物體)完全培養基(Difco;Becton Dickinson and Company,San Jose,California)等培養基中繁殖。藉由標準技術(例如測定顏色變化單位(CCU))來監測生物體之生長並在達成足夠高效價時收穫。可在包括於組合物調配物中之前藉由習用方法將原液進一步濃縮或凍乾。亦可使用(例如)彼等闡述於Thomas等人，Agri-Practice 7(5):26-30中之其他方法。
豬肺炎黴漿菌分離株之生長條件端視培養基之精確組成及所生長之特定分離株而有所變化。豬肺炎黴漿菌分離株一般生長約48小時至約144小時，自培育時間量測至收穫時間。
端視擬調配之精確組成而定，可藉由(例如)超速離心或超濾來濃縮豬肺炎黴漿菌。經濃縮之豬肺炎黴漿菌可藉由熟習此項技術者所習知之方法回收且可與適宜生理學上可接受之載劑混合-一般為水性介質，例如，鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、最低必需培養基(MEM)、或含有HEPES緩衝劑之MEM。隨後可將其與適當佐劑進一步組合以提供基於體積/體積(v/v)之期望濃度。組合物可進一步包含一或多種螯合劑，例如EDTA，其濃度一般為約0.05%至約0.20%(w/v)。或者，可如上所述對擬用於該等免疫原性組合物或疫苗組合物中之豬肺炎黴漿菌株進行濃縮、或凍乾並以基於重量/體積(w/v)之期望濃度再懸浮於適當佐劑中。
如上文所述，本揭示內容之組合物(包括免疫原性組合物或疫苗組合物)通常包含無毒性之活豬肺炎黴漿菌株與一或多種佐劑(一般而言為生物學上可接受之佐劑)。
對於一次劑量投與，組合物可含有對應於約1×108 至約3×1011 MHDCE/ml之量的無毒性之活肺炎黴漿菌。或者，組合物可含有對應於約1×109 至約3×109 MHDCE/ml之量的無毒性之活肺炎黴漿菌。組合物可經調配以使對於經肌內、皮下或腹膜腔內投與而言每一投與劑量介於約一(1)ml與約五(5)ml/動物之間、或介於約二(2)ml/動物之間及對於經口或經鼻投與而言介於約一(1)與約十(10)ml之間、或介於約二(2)與約五(5)ml之間。
對於兩次劑量投與而言，組合物一般含有約1×108 至約3×1011 MHDCE/ml、更一般而言含有約1×109 至約3×109 MHDCE/ml之量的無毒性之活肺炎黴漿菌。在兩次劑量投與之某些實施例中，組合物可含有約103 CFU/ML至1011 CFU/ML之量的無毒性之活肺炎黴漿菌。組合物可經調配以使對於經肌內、皮下或腹膜腔內投與而言每一投與劑量介於約一(1)ml與約五(5)ml/動物之間，較佳為約二(2)ml/動物及對於經口或經鼻投與而言介於約一(1)與約十(10)ml之間、一般而言介於約二(2)與約五(5)ml之間。
用於本揭示內容之免疫原性組合物及疫苗組合物的佐劑混合物可藉由刺激細胞介導及/或局部(分泌型IgA)免疫反應使免疫反應增強。生物學上可接受之佐劑可為(例如)一或多種選自由下列組成之群之佐劑：SP-油、SL-CD、丙烯酸聚合物(例如卡波普)、及諸如一或多種不飽和萜烯烴(例如角鯊烯或角鯊烷)等可代謝油與聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物(例如普羅尼克)之混合物。佐劑可進一步選自細胞因子(例如IL-12及IL-18)；氫氧化鋁；乙烯馬來酸共聚物；DEAE葡聚糖；分枝桿菌細胞壁衍生佐劑；及諸如此類。
本文所述組合物中所用佐劑之濃度將端視佐劑之性質而定。佐劑一般而言以約1-50%之最終濃度且更一般而言以約10%、15%、20%、25%、或30%之最終濃度存在於本文所述之組合物中。抗原於佐劑中之濃度可基於重量/體積(w/v)或基於體積/體積(v/v)配製。例如，本發明組合物中擬遞送之抗原可以凍乾形式製備，隨後將其直接重構於佐劑中產生基於重量/體積之特定濃度。或者，可將抗原首先重構於適當稀釋劑(例如，緩衝劑)中，隨後向其中添加足以達成如上所述基於體積/體積之抗原及佐劑二者的最終期望濃度之體積的佐劑。
在某些實施例中，佐劑可與抗原/免疫原以單一組合物形式投與，或可單獨、與抗原/免疫原同時、或在抗原/免疫原投與之後投與。
佐劑之選擇端視含有佐劑之抗原/免疫原的穩定性、投與途徑、劑量時間表、佐劑對於所接種疫苗物種之功效而定且亦必須為經相關監管機構批准用於動物或人類者。
在包含SP-油之組合物中，所存在之佐劑通常佔約1%至約25%(v/v)、更通常佔約5%至約15%(v/v)(例如，約10%(v/v))；在包含丙烯酸聚合物及包含一或多種萜烯烴之可代謝油與聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物之混合物的組合物中，丙烯酸聚合物與可代謝油/聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物混合物之比通常介於約1:25與約1:50之間。可代謝油、聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物及丙烯酸聚合物可以水包油乳液形式使用，其中丙烯酸聚合物一般以介於約0.5g/l與約10g/l之間之濃度使用；可代謝油一般以介於約2ml/l與約6ml/l之間之濃度使用；且聚氧乙烯-丙烯嵌段共聚物一般以介於約1ml/l與約3ml/l之間之濃度使用。
適宜佐劑混合物實例包括(但不限於)一或多種丙烯酸聚合物與含可代謝油(例如不飽和萜烯烴或其氫化產物，較佳為角鯊烷(2,3,10,15,19,23-六甲基二十四烷)或角鯊烯)與聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物之混合物的混合物。該丙烯酸聚合物可為均聚物或共聚物。
丙烯酸聚合物一般而言為聚羧乙烯製劑。聚羧乙烯製劑可以商品名卡波普(Carbopol)購得且闡述於(例如)美國專利第2,909,462號及第3,790,665號中，各該專利案均以引用方式併入本文中。
聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物為表面活性劑，一般為液體表面活性劑，其有助於懸浮固體及液體組份。表面活性劑可以商品名普羅尼克(Pluronic)以聚合物形式購得。表面活性劑泊洛沙姆401(poloxamer 401)可以商品名普羅尼克(Pluronic)L121購得。
佐劑混合物可包含於水性介質中調配成乳液形式之可代謝油、丙烯酸聚合物及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。在某些實施例中，佐劑混合物可包括可代謝油及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，例如角鯊烷與普羅尼克L121(泊洛沙姆401)之混合物，其含量可以介於約50ml/l與約100ml/l之間，且羧基亞甲基聚合物可為卡波普934P(Carbamer 934P)，其含量可以為約2ml/l。
較佳之丙烯酸聚合物係彼等藉由B. F Goodrich以卡波普934 P NF及941 NF出售者，其為與聚烯丙基蔗糖交聯之丙烯酸聚合物且其化學式為(CH2 CHOOOH)n 。該等聚合物形成適宜用水性載劑調配之水性凝膠。聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物可為由BASF以普羅尼克L121、L61、L81或L101出售之非離子型表面活性劑。
在某些實施例中，本文所揭示之組合物可使用(進一步組合)一或多種其他活細菌、菌苗、類毒素、及/或病毒抗原。因此，在該等實施例之某些態樣中，無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌組合物可包含致免疫量之無毒性之活豬肺炎黴漿菌及一或多種生物學上可接受之佐劑，且進一步組合使用：(a)一或多種活細菌，例如，副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、支氣管敗血性博德特菌、豬霍亂沙門氏菌、豬丹毒桿菌及鈎端螺旋體屬細菌；(b)一或多種菌苗；(c)來自一或多種以下病原體之一或多種經純化類毒素，例如，副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、支氣管敗血性博德特菌、豬霍亂沙門氏菌、豬丹毒桿菌及鈎端螺旋體屬細菌；及/或(d)一或多種病毒抗原，其中該病毒係選自由下列組成之群：豬流感病毒(SIV；例如SIV菌株H1N1、H1N2及H3N2)、豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)、表現PRRS之浣熊痘病毒及/或其他抗原、表現PRRS之TGEV及/或其他抗原、及豬環狀病毒(PCV)。本文所例示之組合物(包括疫苗組合物)使用一或多種無毒性之活豬肺炎黴漿菌株與豬第一型-第二型環狀病毒嵌合體改質活疫苗(cPCV1-2)(參見美國專利公開案第2003/0170270號及第2004/0253270號)之進一步組合。
在該等或替代實施例中，組合物(包括疫苗組合物)可額外或視情況包括防腐劑，例如，硫柳汞及/或EDTA。亦參見美國專利公開案第2002/0131980號及第2003/0017171號，每一專利公開案之全文均以引用方式併入本文中。
本文所述組合物中所用之該等其他活細菌、菌苗、類毒素、及/或病毒抗原的濃度將端視菌苗、類毒素、及/或病毒抗原之性質而定且一般以介於約0.5×105 至0.5×1010 /ml之間之最終濃度存在於本文所述之組合物中。或者，細菌以介於約0.5×106 至0.5×109 /ml之間或介於約0.5×107 至0.5×108 /ml之間之最終濃度存在。
本揭示內容之組合物可用於保護動物抵抗由豬肺炎黴漿菌引起之疾病及/或預防或改善該疾病在動物群體中爆發之方法中，該方法藉由投與本文所述之無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌組合物來實施。本文所述之組合物亦可較佳用於在動物中增強對豬肺炎黴漿菌之免疫反應的方法中，該免疫反應係例如細胞介導之免疫反應及/或體液免疫反應。該等方法包含以一次或兩次劑量向動物(一般為豬)投與包含一或多種無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌株之組合物的步驟。端視所預期之精確應用而定，組合物可經肌內、皮下、經口、藉助氣溶膠、或經鼻投與。
根據本揭示內容之方法，期望劑量方案涉及向豬投與一或多次劑量之期望疫苗組合物。一般而言，在向動物投與兩次劑量之情形中，所投與之兩次劑量相隔約一(1)週至約四(4)週，更一般而言相隔約二(2)週至約三(3)週。
實例
藉由參照以下非限制性實例可更好地理解本揭示內容：
實例1：製備豬肺炎黴漿菌無毒性之佐劑化活疫苗
該實例揭示本揭示內容之實例性無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌組合物的製備。
豬肺炎黴漿菌可自多種易得來源獲得。在本文所述之一個實施例中，豬肺炎黴漿菌無毒性之活培養菌株J(FCX3-Line 1)係以ATCC菌株號27715自美國菌種培養物保藏中心(ATCC;Manassas,VA)獲得。可使用任何其他無毒性之豬肺炎黴漿菌株來製備該等組合物，例如ATCC登錄號指定為25934之母體J菌株。在某些其他實施例中，本發明涵蓋對任何有毒性之活肺炎黴漿菌株實施調節、減毒或突變直至確定培養物無毒性，如使用彼等熟習此項技術者所習知之程序藉由活體外或活體內測試所測定。ATCC 25934 J菌株之全基因組序列已由Vasconcelos等人(J. Bacteriol. (2005),187(16):5568-5577)公佈並指定GenBank登錄號AE017243。可在PubMed中找到與ATCC菌株25934有關之數種序列且具有GenBank登錄號AY737012(16S核糖體RNA基因)、AY512905(黏附基因)、AF013714(前脂蛋白p65基因)、U02538(23S rRNA基因)及U02537(多重抗藥性蛋白同系物基因)。
用於殺菌分析之每一疫苗組合物皆係自一個凍乾小瓶之經20ml生理鹽水再水化之豬肺炎黴漿菌培養物製備。疫苗組合物包括5ml經再水化之培養物及足以在最終10ml體積中獲得規定佐劑濃度之佐劑的組合。對照組合物亦藉由將5ml經再水化之培養物與5ml生理鹽水組合來製備。取樣之前將所有組合物皆混合5分鐘。在摻和後5分鐘(0小時)、3小時及7小時自所有組合物中取樣。每一疫苗之生存能力係藉由每一取樣時刻之菌落形成單位(CFU)來測定(參見表1)。
儲備培養物之平均生存能力係藉由取0小時時所有對照生存能力之平均值來確定，平均值為9.09×107 CFU/ml。相比之下，儲備培養物之最大可能數量(MPN)經測定結果為1.85×108 MPN/ml。疫苗摻和及疫苗接種一般花費小於3小時；因此當觀察佐劑之殺菌效應時，3小時時間點最為重要。與對照相比，在3小時取樣時5%及10%之SP-油分別趨於2倍差異及4倍差異。
疫苗A係藉由用含有最終濃度為10%(v/v)之SP-油之稀釋劑再水化凍乾培養物小瓶來製備。安慰劑疫苗為無菌生理鹽水。
實例2：豬肺炎黴漿菌無毒性之佐劑化活疫苗在豬中之活體內功效
該實例展示實例性無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌疫苗組合物之活體內功效。
自Charles市，Iowa之富道動物保健公司(Fort Dodge Animal Health)之SPF豬群獲得總共30頭四至六週齡的豬。保持豬進食，但無抗生素或生長促進劑且隨意給與水及食物。將接受疫苗組合物及對照組合物之動物圈養於不同室中且在接種疫苗、監測及攻擊時間段期間所有豬在類似條件下餵養。
將30頭豬隨機分配至如下三(3)個群組中：一個(1)群組接受疫苗組合物，一個(1)群組接受安慰劑，且一個(1)群組用作環境對照。如表2中所示對豬進行分群。
用2ml劑量之適當疫苗經肌內給四至六週齡的豬接種疫苗。群組1投與疫苗A，群組2投與安慰劑。來自群組3的豬未接種疫苗或攻擊且用作環境對照。群組1中的豬接種兩次疫苗，相隔兩週。在第二次接種疫苗後兩週，用含有有毒性之豬肺炎黴漿菌株Strain 11(J. Clin. Microbiol.,1999 Mar;37(3):620-7)之肺勻漿(LI-34)攻擊群組1及2中之所有豬。在攻擊後四週時，對群組1-3中之所有豬進行屍體剖檢並評價肺損傷。
用於豬肺炎黴漿菌攻擊菌株之肺勻漿(LI-34)的製備
自Spring Prairie Colony Farms(Genetipork)獲得七頭雜種豬並經氣管內接種10ml 1:30稀釋之豬肺炎黴漿菌株11的10%粗肺勻漿(LI31)。LI31粗肺勻漿已藉由使含有豬肺炎黴漿菌之肺勻漿在不含特定病原體之豬中傳代並在疾病之早中期收穫所得肺炎性肺而製備。將肺勻漿儲存於-70℃下直至需要。
在運抵後及屍體剖檢時採集所有豬之血清並在ISU獸醫診斷實驗室(ISU Veterinary Diagnostic Laboratory：ISU-VDL)評價TGE(PRCV)、SW 及PRV抗體之存在。另外，對PRRSV及豬肺炎黴漿菌抗體實施ELISA且所有樣品對於所有上述呼吸病原體皆呈陰性。
對所有豬進行屍體剖檢。在放血之前使用戊巴比妥(Pentobarbital)來誘導豬深度麻醉。打開腹胸壁並在無菌條件下取出豬肺炎黴漿菌之典型肺炎性損傷區域並分別置於無菌容器中。
將每只肺之一小部分碾碎並在血液瓊脂板、牛心浸出物培養液、及Friis培養基上檢測純度。在Friis培養基中實施試管稀釋以滴定豬肺炎黴漿菌。將剩餘肺片冷凍於-70℃下之50ml離心管中直至獲知細菌學及黴漿菌分離株結果。使用來自7頭豬中之3頭豬的肺葉來產生豬肺炎黴漿菌肺接種物。
解凍來自329、331及332號豬之肺葉厚塊並在不含抗生素之Friis培養基中碾碎。肺接種物之純度藉由在牛心浸出物、血液瓊脂及Friis培養基上之培養物確定。僅在一塊板上發現與環境雜質一致之微球菌。滴定肺接種物之豬肺炎黴漿菌含量並發現含有約107 CCU/ml。使等分試樣經受ISU-VDL以實施針對SN、EMS、腸道病毒、HEV、PRCV、PRRSV、假性狂犬病、TGE、細小病毒、及輪狀病毒之病毒分離分析。所有分析之結果皆為陰性。經碾碎肺接種物(標記為LI 34)之最終體積為1780ml，來自178.1克肺組織。將其等分成100×5ml及110×10ml體積。
在研究之第二階段，使用9頭豬來測定在最少80%的豬中誘導平均8%之肺炎性肺損傷所需要之肺接種物的濃度。如先前所述用LI34豬肺炎黴漿菌株11經氣管內對所有豬進行攻擊。攻擊稀釋包括1:30、1:100及1:500。
對豬進行屍體剖檢。在放血之前使用戊巴比妥來誘導深度麻醉。取出肺並對肺損傷成像於標準肺膜片上。採集所有豬之血清並藉由ELISA對豬肺炎黴漿菌之抗體進行分析。所有豬皆為豬肺炎黴漿菌低陽性或血清陰性，此表明在運抵之前未先前曝露於豬肺炎黴漿菌。在無菌條件下採集所有豬之氣管擦拭物。分別自4及3頭豬分離多殺巴斯德菌及副豬嗜血桿菌。自所有經攻擊之豬分離豬肺炎黴漿菌。用Zelss圖像分析系統對肺成像進行評價以測定肺炎性肺損傷之百分比。
結論
成功地對豬進行了攻擊且1:100稀釋係使用之最佳稀釋。所誘導之肺炎的平均百分比為10.17+/-6.6，此高於正常值，然而此可能歸因於豬中存在多殺巴斯德菌及/或副豬嗜血桿菌。另外，100%之經攻擊接種物接種的豬具有顯著肺損傷。總之，該等結果在吾人於吾人之豬肺炎黴漿菌研究中所觀察到者中相當典型，即若存在其他病原體，肺炎亦增加。此可能係由於病原體與免疫系統之間之相互作用所致。吾人產生了1,600ml豬肺炎黴漿菌肺接種物以用於實驗性攻擊實驗。當以1:100稀釋經氣管內使用時，該接種物將在最少80%之經接種豬中產生至少8%或更高之肺炎性肺損傷。
在接種疫苗之日之前對疫苗進行滴定並實施殺菌分析以確定擬使用之適當佐劑系統(參見實例1)。自該等數據選擇10% SP-油佐劑用於進一步研究。每小瓶儲備培養物之平均生存能力為3.64×109 CFU/瓶。
在第一次投與之日，如下製備疫苗組合物：疫苗A-將三小瓶無毒性之豬肺炎黴漿菌凍乾培養物的每一瓶用10ml 10% SP-油稀釋劑再水化。將每一稀釋劑類型之三小瓶疫苗組合物集中並容許在攪拌板上用攪拌棒混合20分鐘。安慰劑係等分至無菌瓶中用於投與之生理鹽水。在接種疫苗期間將組合物在冰上保留2小時。
在第二次投與之日，如下製備疫苗組合物：疫苗A-將三小瓶無毒性之豬肺炎黴漿菌凍乾培養物的每一瓶用10ml10% SP-油稀釋劑再水化。將每一稀釋劑類型之三小瓶經再水化培養物集中並容許在攪拌板上用攪拌棒混合20分鐘。安慰劑係等分至無菌瓶中用於投與之生理鹽水。在接種疫苗期間將組合物在冰上保留2小時。
在投與之前及之後測定每一組合物中之存活豬肺炎黴漿菌的濃度。藉由測定菌落形成單位(CFU/ml)來評價生存能力。將一小瓶凍乾儲備培養物用10ml生理鹽水再水化，使其混合20分鐘，並用作生存能力分析之對照。由於第一對照生存能力低於測試疫苗生存能力，故在第二次投與期間，將兩小瓶再水化並集中以用作對照(測試疫苗生存能力及對照生存能力參見表3)。
自每次投與之前兩天開始每天觀察所有豬之溫度及臨床症狀且此在每次投與後持續七天。所觀察之豬的臨床症狀包括但不限於咳嗽、噴嚏、流鼻涕、情緒低落、無食欲、及呼吸困難。
在第二次投與後十四天，用有毒性之豬肺炎黴漿菌株經氣管對群組1中的豬進行攻擊。
在攻擊之日，在溫水中將冷凍(-70℃)肺勻漿(LI-34)之有毒性之豬肺炎黴漿菌攻擊原液快速解凍並稀釋(1：100稀釋)。用由50mg/ml甲苯噻嗪(Xylazine)、50mg/ml氯胺酮(Ketamine)、及100mg/ml泰拉瑞(Telazol)組成之甲苯噻嗪-氯胺酮-泰拉瑞TM 混合物使豬鎮靜。每只豬經氣管給與10ml攻擊物質。為確保針放置，在投與攻擊物質之前將空氣抽至注射器中。在攻擊後每天觀察所有豬之臨床症狀。
在第0、14、28及56天抽取豬之血清。藉由ELISA測定豬對豬肺炎黴漿菌攻擊之血清學反應。在攻擊後四週時，將來自群組1-3之所有豬無痛致死並取出肺。測試群組係不知情的並對總肺損傷進行評分。將非典型豬肺炎黴漿菌損傷用福爾馬林固定以用於隨後組織病理學評價。自受侵襲的肺採集擦拭物樣品以用於細菌分離。
群組1中之豬的平均肺損傷分值(5.9%)較安慰劑群組(14.8%)低約50%。當對於同胎幼仔調節統計學分析時，群組1之減輕百分比為與對照相比肺損傷嚴重性降低69.2%。該等數據概述於表4中。在第一次投與之日所有豬皆呈血清陰性，表明該等豬易患豬肺炎黴漿菌感染。除SP-油群組中之一(1)頭豬外，在第一次接種疫苗後豬未發生血清轉化。接受經SP-油佐劑化之疫苗組合物之所有豬皆在第二次注射後產生抗體反應。血清學反應證實引發了對豬肺炎黴漿菌之免疫反應。(血清學結果參見表9)
數據之統計學分析必須符合肺損傷降低之減輕百分比標準(30%<置信下限值<50%)，才能認為疫苗對豬肺炎黴漿菌有效。總之，該等數據展示當將無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌活體內投與至動物中時其可有利地用於引發保護性免疫反應。
儘管在本發明多個實施例之每一者中對本發明進行了闡述，但預期熟習此項技術者可對其實施及完成某些修改，此並不背離如於先前闡述中所給出及如以下申請專利範圍中進一步體現之本發明之真實精神及範圍。本揭示內容之範圍並不限於本文所述之特定實施例。實際上，除彼等本文所述者外，彼等熟習此項技術者根據上文闡述及附圖應易知本發明之各種修改。該等修改意欲屬於隨附申請專利範圍之範圍內。應進一步瞭解所有值皆為近似值，且提供用於闡述。本文所引用之所有專利及專利申請案之全文皆以引用方式併入本文中。
實例3：豬肺炎黴漿菌之無毒性活菌株-豬第一型-第二型環狀病毒嵌合體改質活組合疫苗之豬肺炎黴漿菌部分在3-4週齡豬中之初步免疫原性研究
該實例揭示包含無毒性之佐劑化活豬肺炎黴漿菌J(FCX3-linel)菌株及豬第一型-第二型環狀病毒(PCV)嵌合體活疫苗(cPCV1-2；參見美國專利第7,279,166號及第7,276,353號)之組合疫苗當經肌內(IM)或鼻內(IN)投與時在3-4週齡豬中之功效。該組合疫苗(PCV/MH)適用於給健康豬接種疫苗以助於預防由豬肺炎黴漿菌及豬環狀病毒引起之疾病及/或降低其嚴重性。
目標測試疫苗應含有約4.0Log10 FAID50 /劑量之cPCV1-2改質活病毒及4×108 CFU/劑量之豬肺炎黴漿菌J菌株(FAID方法請參見King等人，Journal of Comparative Medicine and Vet. Science,29:85-89(1965)及美國專利第4,824,785號)。疫苗經佐劑化以含有最終濃度為10%(v/v)之SP-油。安慰劑疫苗為無菌生理鹽水。
在該研究中總共使用66頭3-4週齡之豬。給16頭豬經肌內投與一次2ml PCV/MH活疫苗並進行攻擊(群組1)；給15頭豬經肌內投與兩次2ml PCV/MH活疫苗(相隔兩週)並進行攻擊(群組2)；給15頭豬經鼻內投與兩次2ml(1ml/鼻孔)PCV/MH活疫苗(相隔兩週)並進行攻擊(群組3)；15頭豬未投與PCV/MH活疫苗並進行攻擊(群組4)；且5頭豬用作環境對照(群組5)。
本文所揭示研究中所使用之疫苗係MH凍乾活抗原(批號1744-56)與含有PCV(批號C108-56)活疫苗之稀釋劑的組合。在接種疫苗之日，將凍乾之活MH餅用含有PCV活病毒(4.0Log10 FAID50 /mL，經10%SP油佐劑化)之稀釋劑再水化。最終疫苗指定為批號2315-30。在接種疫苗之前及之後測定MH部分之生存能力，分別為3.18×108 CFU/mL(之前)及1.65×108 CFU/mL(之後)。接種疫苗之前及之後疫苗之PCV效價分別為4.09 Log10 FAID50 及3.7 Log10 FAID50 。如上所述製備用於第二次接種疫苗之疫苗且指定為批號2315-32。接種疫苗之前及之後MH部分之生存能力分別為1.24×108 CFU/mL及1.5×108 CFU/mL。PCV部分之生存能力分別為4.36 Log10 FAID50 及3.83 Log10 FAID50 。在接種疫苗後7天內觀察豬對疫苗之任何不利反應。在接種疫苗後之觀察階段期間三頭豬由於非MH或PCV相關原因而死亡。接種疫苗後階段之臨床觀察的概述參見表5。
用有毒性之豬肺炎黴漿菌株(含有有毒性MH之豬肺勻漿(LI-34))對群組1-4中的所有豬進行攻擊。在第一次接種疫苗後四週對來自群組1的豬進行攻擊。在第二次接種疫苗後兩週對群組2-4中的豬進行攻擊。在攻擊後四週時，對群組1-5中的所有豬進行屍體剖檢並評價肺損傷。
在接種疫苗之日之前滴定疫苗。在接種疫苗之日將無毒性之豬肺炎黴漿菌的凍乾培養物再水化。疫苗中豬肺炎黴漿菌生物體之濃度約為2×108 CFU/ml。保留疫苗樣品並在接種疫苗之前及之後實施生存能力分析以確定實際CFU/ml。在接種疫苗期間將疫苗保存於冰上。
自每次接種疫苗之前兩天開始每天觀察所有豬之溫度及臨床體徵且此在每次接種疫苗後持續七天。所觀察之豬的臨床症狀包括但不限於咳嗽、噴嚏、流鼻涕、情緒低落、無食欲、及呼吸困難。在第二次接種疫苗後14天，用有毒性之豬肺炎黴漿菌株經氣管對群組1-4中的豬進行攻擊。
在攻擊之日，在溫水中將有毒性之豬肺炎黴漿菌攻擊原液(冷凍(-70℃)之肺勻漿(LI-34))快速解凍並使用無菌豬肺炎黴漿菌生長培養基稀釋(1：100稀釋)。用包含50mg/ml甲苯噻嗪、50mg/ml氯胺酮及100mg/ml泰拉瑞之甲苯噻嗪-氯胺酮-泰拉瑞TM 混合物使豬鎮靜。每只豬經氣管給與10ml攻擊物質。為確保針放置，在投與攻擊物質之前將空氣抽至注射器中。
在攻擊後每天大致觀察所有豬之臨床體徵。每天對任何異常臨床體徵實施觀察。在研究第0、14、28及56天抽取豬之血清(不多於13ml全血)。採集血清，但不進行評價。實施ELISA以使用今後研究期間所採集之血清來評價豬之血清學反應。
在攻擊後四週時，將來自群組1-5之所有豬無痛致死並取出肺。將非典型豬肺炎黴漿菌損傷用福爾馬林固定並檢驗樣品之組織病理學。自受侵襲的肺採集擦拭物樣品以用於細菌分離。對攻擊後死亡的豬進行屍體剖檢並如上所述採集樣品。疫苗功效定義為比對照之組合平均肺損傷分值小50%之接種疫苗的組合平均肺損傷分值。
在屍體剖檢之日，將所有豬無痛致死，實施肺損傷評分並擦拭用於細菌分離。自擦拭物分離之細菌由以下組成：溶血性葡萄球菌(Staphylococcus heamolyticus )、豬鏈球菌(P322)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis )、化膿性隱秘桿菌(A. pyogenes )、氣球菌屬(aerococus species )、乳房鏈球菌(S. uberis )、支氣管敗血性博德特菌(P344)及微桿菌屬(Microbacterium)。表6為肺損傷分值之統計學分析。
數據之統計學分析符合肺損傷降低之減輕百分比標準(30%<LCL<50%)。該實例顯示(a)經IM投與兩次2mL劑量之MH/PCV疫苗對於MH部分(3.18×108 CFU/mL)有效且(b)由於在接種疫苗後無與MH或PCV有關之臨床體徵，故MH/PCV疫苗係安全的。
實例4：豬肺炎黴漿菌之無毒性活菌株-豬第一型-第二型環狀病毒嵌合體改質活組合疫苗之豬肺炎黴漿菌部分在3-4週齡豬中之免疫原性研究
該實例揭示之免疫原性研究支持實例4中所呈現之研究的結果並證實當經肌內投與時豬肺炎黴漿菌之無毒性活菌株-豬第一型-第二型環狀病毒(cPCV1-2)嵌合體改質活疫苗組合疫苗(MH/PCV)之豬肺炎黴漿菌部分具有功效。本文所揭示之MH/PCV疫苗適用於給健康豬接種疫苗以助於預防由豬肺炎黴漿菌及豬環狀病毒引起之疾病及/或降低其嚴重性。
本研究中所使用之豬經ELISA測定呈豬肺炎黴漿菌血清陰性。
將總共79頭三至四週齡的豬隨機分配至四個群組中。用單劑量之PCV/MH活疫苗組合給24頭豬(群組1)接種疫苗。用該組合疫苗給24頭豬(群組2)接種疫苗，實施兩次，相隔兩週。用生理鹽水給24頭豬(群組3)接種疫苗以用作攻擊對照，實施兩次，相隔兩週。所有疫苗皆經肌內投與。四頭豬(群組4)未接種疫苗亦未進行攻擊且用作環境對照。
該研究中所使用之疫苗係MH凍乾活抗原(批號1744-66)與含有PCV(cPCV1-2，批號C108-56)活疫苗之稀釋劑的組合。在接種疫苗之日，將凍乾之活MH餅用含有PCV活病毒(3.5Log10 FAID50 /mL，經10% SP油佐劑化)之稀釋劑再水化。最終疫苗指定為批號2315-40。在接種疫苗之前及之後測定MH部分之生存能力，分別為2.09×108 CFU/mL及1.56×108 CFU/mL。安慰劑疫苗為無菌生理鹽水。
如上所述製備用於第二次接種疫苗之疫苗且指定為批號2315-42。接種疫苗之前及之後MH部分之生存能力分別為1.05×108 CFU/mL及6.72×107 CFU/mL。PCV部分稀釋劑之生存能力為3.44Log10 FAID50 。
在接種疫苗之日之前滴定疫苗。在接種疫苗之日將無毒性之豬肺炎黴漿菌的凍乾培養物再水化。保留疫苗樣品並在接種疫苗之前及之後實施生存能力分析以測定CFU/ml。在接種疫苗期間將疫苗保留於冰上。
自每次接種疫苗之前兩天開始每天觀察所有豬之溫度及臨床體徵且此在每次接種疫苗後持續7天。所觀察之豬的臨床症狀包括但不限於咳嗽、噴嚏、流鼻涕、情緒低落、無食欲、及呼吸困難。
在接種疫苗後7天內觀察豬對疫苗之任何不利反應。在接種疫苗後之觀察階段期間三頭豬由於非MH或PCV相關原因而死亡。接種疫苗後階段之臨床觀察的概述參見表7。
在約7週齡時用有毒性之豬肺炎黴漿菌株對群組1-3中之所有豬進行攻擊。在第一次接種疫苗後四週對群組1的豬進行攻擊。在第二次接種疫苗後兩週對群組2及3中的豬進行攻擊。在溫水中將有毒性之豬肺炎黴漿菌攻擊原液(冷凍(-70℃)之肺勻漿(LI-34))快速解凍並使用無菌豬肺炎黴漿菌生長培養基稀釋(1:100稀釋)。用包含50mg/ml甲苯噻嗪、50mg/ml氯胺酮及100mg/ml泰拉瑞之甲苯噻嗪-氯胺酮-泰拉瑞TM 混合物使豬鎮靜。每只豬經氣管給與10ml攻擊物質。
在研究第0、14、28及56天抽取豬之血清。可使用熟習此項技術者所熟知之ELISA方法對自該研究所採集之血清樣品進行測試以評價動物對豬肺炎黴漿菌及PCV2之血清學反應。可使用市售ELISA測試套組來測試自接種疫苗後第0天(0DPV)及攻擊後第0天(0DPC)採集之血清樣品之豬肺炎黴漿菌、豬流感(H1N1)、及豬繁殖與呼吸症候群(PRRS)抗體。
在攻擊後四週(28DPC)時，將來自群組1-4之所有豬無痛致死並取出肺。記錄肺損傷分值並將典型豬肺炎黴漿菌損傷用福爾馬林固定。檢驗樣品之組織病理學。自一隻受豬肺炎黴漿菌侵襲之肺葉採集擦拭物樣品以用於細菌分離以檢測二次感染。另外，採集支氣管肺泡灌洗液。用磷酸鹽緩衝鹽水灌洗肺並將所得流體等分以用於PCR測試。
為對肺損傷嚴重性之降低予以評價，估計量為減輕百分比(MF)統計量。如下計算減輕百分比：
其中：
W1 =魏克森等級和統計量(Wilcoxon Rank sum statistic)
nc =對照群組中個體的數量
nv =接種疫苗群組中個體的數量
計算減輕百分比之95%置信區間。
為主張肺損傷嚴重性降低：
HO:Mv=Mc
HA:Mv Mc
其中：
Mv =接種疫苗群組中肺損傷分值之中值
Mc =對照群組中肺損傷分值之中值
連續結果變量之頻率分佈係使用PROC UNIVARIATE來評定，其對來自單總體之樣品實施參數分析及非參數分析。(SAS Institute公司，Cary NC)。使用抗體效價之對數變換來滿足參數檢驗所需要之正態假設。藉由卡方檢驗來實施基線評價以評價群組對於同胎幼仔及室之可比性。藉由魏克森等級和檢驗(PROC NPAR1WAY，以肺損傷分值作為因變量且所包括之處理作為自變量)對每一接種疫苗群組與對照群組之間之肺損傷嚴重性進行比較。PROC NPAR1WAY實施單向分類之位置尺度差異的非參數檢驗；PROC NPAR1WAY亦基於經驗分佈函數提供原始數據及統計量之方差的標準分析。(SAS Institute公司，Cary NC)。
所有統計學分析皆使用SAS系統實施。在如藉由W正態檢驗所測定對於任何經變換變量變換皆未改良殘差分佈之情形下，視需要使用非參數檢驗。顯著性程度設置為p<0.05。
在屍體剖檢之日，將所有豬無痛致死，實施肺損傷評分並擦拭用於細菌分離。亦採集支氣管肺泡灌洗液(BAL)。自擦拭物分離之細菌由以下組成：放線桿菌屬(Actinobacillusspecies )、奧斯陸摩拉克菌(Moraxella osloensis )、血鏈球菌(Streptococcus sanguinis )、化膿性隱秘桿菌及支氣管敗血性博德特菌。藉由PCR方法測試BAL樣品之MH；來自環境對照群組之兩個樣品被記錄具有損傷且接種疫苗及對照群組中之兩個樣品具有低損傷分值。來自具有損傷之環境對照群組之兩頭豬之BAL樣品係陰性的且在接種疫苗群組中具有低損傷分值的兩頭豬之BAL樣品係陽性的。表8為肺損傷分值之統計學分析。
數據之統計學分析符合肺損傷降低之減輕百分比標準(30%<LCL<50%)。吾人認為經IM投與2mL劑量(單劑量或雙劑量)之疫苗對於MH部分(2.09×108 CFU/mL)有效。另外，由於在接種疫苗後無與MH或PCV有關之臨床體徵，故吾人認為該疫苗係安全的。
ODPV1及ODPV2：數字表示在第一次疫苗劑量(ODPV1)或第二次疫苗劑量(ODPV2)後在ELISA測試中呈陽性之最高稀釋。
ODPC：數字表示攻擊後之ELISA結果。較高數字表示血清轉化。
肺分值：數字表示動物肺中損傷之百分比。較高數字表示由於缺少保護性免疫肺損傷較多。較低數字表示由於誘導了保護性免疫反應較為健康之豬具有較少損傷。

Claims (23)

  1. 一種用於在動物中引發抗豬肺炎黴漿菌免疫反應之組合物，該組合物包含免疫有效量之無致病性之活豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae )菌株及生物學上可接受之佐劑，其中該無致病性之活豬肺炎黴漿菌株係ATCC登錄號指定為25934或27715之J菌株，或為一菌株，其基因組所包含之核酸序列與GenBank登錄號AE017243之豬肺炎黴漿菌參考J菌株之基因組序列具有至少95%同源性，及進一步其中該生物學上可接受之佐劑為SP-油，其包含以下之油乳液：1%至3% vol/vol聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；2%至6% vol/vol角鯊烷；0.1%至0.5% vol/vol聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯；及緩衝鹽溶液。
  2. 如請求項1之組合物，其中該無致病性之活豬肺炎黴漿菌株係ATCC登錄號指定為25934或27715之J菌株。
  3. 如請求項2之組合物，其中該無致病性之活豬肺炎黴漿菌株係ATCC登錄號指定為27715之J菌株。
  4. 如請求項1之組合物，其中該SP-油之含量濃度介於約1%與約25%之間。
  5. 如請求項4之組合物，其中該SP-油之含量濃度係約10%。
  6. 如請求項1之組合物，其進一步包含選自由下列組成之群之一或多種活細菌、菌苗及/或一或多種經純化類毒素：副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis )、多殺巴斯德 菌(Pasteurella multocida )、豬鏈球菌(Streptococcus suis )、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae )、支氣管敗血性博德特菌(Bordetella bronchiseptica )、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis )、豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae )及鈎端螺旋體屬細菌(leptospira bacteria)。
  7. 如請求項1之組合物，其進一步包含一或多種選自由下列組成之群之病毒抗原：豬流感病毒(SIV)抗原、豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)抗原、表現PRRS之浣熊痘病毒、表現PRRS之TGEV、及豬環狀病毒(PCV)抗原。
  8. 如請求項7之組合物，其中該豬環狀病毒(PCV)抗原係豬第一型-第二型環狀病毒(cPCV1-2)嵌合體。
  9. 如請求項1至8中任一項之組合物，其中藉由無致病性之活豬肺炎黴漿菌株所引發之該免疫反應可保護動物抵抗有毒性之豬肺炎黴漿菌株感染、或降低與有毒性之豬肺炎黴漿菌株感染有關之至少一種症狀的嚴重性。
  10. 一種如請求項1至8中任一項之組合物之用途，其係用於製造保護動物抵抗與有毒性之豬肺炎黴漿菌株有關之疾病或預防或減輕與該疾病有關之至少一種症狀的藥物，其中該藥物係投與至該動物。
  11. 如請求項10之用途，其中該藥物係藉由非經腸投與。
  12. 如請求項11之用途，其中該非經腸投與係藉由肌內注射達成。
  13. 如請求項10之用途，其中該藥物係藉由經口投與。
  14. 如請求項13之用途，其中該經口投與係藉由用手遞送或大批施用(mass application)達成。
  15. 如請求項10之用途，其中該藥物係藉由經鼻投與。
  16. 如請求項10之用途，其中該動物係豬。
  17. 一種如請求項1至8中任一項之組合物之用途，其係用於製造預防或改善豬肺炎黴漿菌爆發之藥物，其中該藥物係投與至該動物。
  18. 一種如請求項1至8中任一項之組合物之用途，其係用於製造增強對豬肺炎黴漿菌之免疫反應的藥物，其中該藥物係以單或多劑量投與至該動物。
  19. 如請求項18之用途，其中該無致病性之活豬肺炎黴漿菌株係其基因組所包含之核酸序列與GenBank登錄號AE017243之豬肺炎黴漿菌參考J菌株之基因組序列具有約95%同源性的菌株。
  20. 如請求項18之用途，其中該無致病性之活豬肺炎黴漿菌株係ATCC登錄號指定為25934或27715之J菌株。
  21. 如請求項20之用途，其中該無致病性之活豬肺炎黴漿菌株係ATCC登錄號指定為27715之J菌株。
  22. 如請求項18之用途，其中該藥物係以二劑量投與至該動物。
  23. 如請求項22之用途，其中該第二劑量係於第一劑量後二至三週投與。
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
US8444989B1 (en) * 2008-04-18 2013-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh One dose vaccination against mycoplasma infections of pigs
CA2762587C (en) * 2009-05-19 2017-11-28 Bioproperties Pty Ltd A temperature sensitive vaccine strain of mycoplasma hyopneumoniae and uses thereof
EP2571980A4 (en) * 2010-05-19 2014-02-26 Bioproperties Pty Ltd METHOD RELATED TO A WEAKEN MYCOPLASMA
CN102988978B (zh) * 2011-08-01 2016-02-03 普莱柯生物工程股份有限公司 含有猪圆环病毒2型抗原与副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物及其制备方法与应用
CN103083658B (zh) * 2011-10-27 2015-09-02 普莱柯生物工程股份有限公司 一种用于治疗或预防猪感染性疾病的疫苗佐剂组合物
CN103157100B (zh) * 2011-12-08 2014-09-24 普莱柯生物工程股份有限公司 副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗及其制备方法
CN103157104B (zh) * 2011-12-14 2015-11-18 普莱柯生物工程股份有限公司 猪瘟疫苗的硫代硫酸钠稀释液
CA2866199A1 (en) 2012-03-07 2013-09-12 Ceva Sante Animale Novel veterinary vaccine
UA114503C2 (uk) * 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae
US9120859B2 (en) * 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
UA114504C2 (uk) * 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs
EP2684959A1 (en) * 2012-07-10 2014-01-15 Laboratorios Hipra, S.A. Vectors for transforming Mycoplasma hyopneumoniae, transformed M.hyopneumoniae strains, and use thereof
CN104685057B (zh) * 2012-07-10 2019-04-16 海博莱科学有限公司 用于转化猪肺炎支原体的载体，转化的猪肺炎支原体菌株及其用途
CN103623400B (zh) * 2012-08-24 2016-08-17 普莱柯生物工程股份有限公司 抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物及制备方法
CN103861095B (zh) * 2012-12-11 2016-03-09 普莱柯生物工程股份有限公司 含猪支原体肺炎抗原和猪链球菌病抗原的疫苗组合物及其制备方法和应用
BR112015012711B1 (pt) 2012-12-28 2022-08-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Método para preparar uma composição imunogênica para o tratamento e/ou a profilaxia de infecções por mycoplasma
CN104981252B (zh) 2012-12-28 2019-06-18 勃林格殷格翰动物保健有限公司 包含支原体抗原的免疫原性组合物
WO2014182872A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Protatek International, Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
CN104338128B (zh) * 2013-07-31 2017-09-05 普莱柯生物工程股份有限公司 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
WO2015034903A1 (en) * 2013-09-05 2015-03-12 Zoetis Llc Hendra and nipah virus g glycoprotein immunogenic compositions
CN104248759B (zh) * 2013-11-19 2017-05-10 普莱柯生物工程股份有限公司 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
KR20160099223A (ko) * 2015-02-12 2016-08-22 강원대학교산학협력단 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 백신 및 이의 제조방법
US10279031B2 (en) * 2016-05-11 2019-05-07 Phibro Animal Health Corporation Composition comprising antigens and a mucosal adjuvant and a method for using
US10519199B2 (en) * 2016-08-12 2019-12-31 Innovac Vaccine composition comprising recombinant protein for preventing swine Mycoplasma infection
CN109234418B (zh) * 2018-11-20 2021-08-13 湖南中净生物科技有限公司 一种鉴别猪肺炎支原体野毒株和疫苗株的引物、试剂盒和方法
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
CN112143666B (zh) * 2020-09-07 2023-02-21 华中农业大学 一种猪肺炎支原体弱毒株及其在制备弱毒疫苗中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002010343A2 (en) * 2000-07-27 2002-02-07 Regents Of The University Of Minnesota Temperature-sensitive live vaccine for mycoplasma hyopneumoniae
US20030109473A1 (en) * 2001-07-02 2003-06-12 Pfizer Inc. One dose vaccination with mycoplasma hyopneumoniae
US20030170270A1 (en) * 2001-12-12 2003-09-11 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3917619A (en) 1972-03-06 1975-11-04 Bayer Ag 2-Amino-4,5-dihydropyridine derivatives
JPS5540568B2 (zh) * 1972-10-05 1980-10-18
US4567043A (en) * 1983-06-15 1986-01-28 American Home Products Corporation (Del.) Canine corona virus vaccine
FR2565825B1 (fr) 1984-06-15 1990-07-13 Centre Nat Rech Scient Vaccin contre les maladies dues a des microorganismes tels que des mycoplasmes, sa preparation et membranes de microorganismes en tant que principe actif
US4894332A (en) * 1985-03-27 1990-01-16 Biogen, Inc. DNA sequences coding for Mycoplasma hypopneumoniae surface antigens, methods of use to make the corresponding proteins
JPS62273456A (ja) 1986-05-21 1987-11-27 Tosoh Corp 分析装置用に用いるテストカツプのシ−ル箔破開用シ−ルブレ−カ
JPH0795069B2 (ja) * 1986-05-22 1995-10-11 農林水産省家畜衛生試験場長 マウスＩｇＡ単クローン抗体を用いる豚マイコプラズマ肺炎の診断方法
EP0283840A3 (en) 1987-03-26 1989-08-09 Ml Technology Ventures, L.P. Mycoplasma hyopneumoniae antigen and uses therefor
US5565205A (en) 1990-08-16 1996-10-15 Solvay Animal Health, Inc. Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof
EP0571648A1 (en) 1992-05-26 1993-12-01 Chung-Nan Weng Vaccine protecting against mycoplasmal pneumonia
BE1008978A5 (fr) 1994-12-27 1996-10-01 Solvay Adjuvants pour vaccins.
GB9622159D0 (en) * 1996-10-24 1996-12-18 Solvay Sociutu Anonyme Polyanionic polymers as adjuvants for mucosal immunization
ZA9710606B (en) * 1996-12-05 1998-06-12 Akzo Nobel Nv Non-virulent Mycoplasma synoviae vaccine thereof.
JP2003513935A (ja) * 1999-11-08 2003-04-15 バイオミューン マイコプラズマ・ボビスに対するワクチンおよび使用方法
MY129765A (en) 2000-12-19 2007-04-30 Wyeth Corp Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
US7018638B2 (en) 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
BR0211049A (pt) * 2001-07-02 2004-07-20 Pfizer Prod Inc Método de tratamento ou prevenção de doenças ou disfunções e uso de mycoplasma hyopneumoniae
CN1935258B (zh) * 2001-07-27 2013-04-03 惠氏公司 西尼罗河疫苗
US20030129161A1 (en) 2001-09-17 2003-07-10 Hsien-Jue Chu Interleukin-12 as a veterinary vaccine adjuvant
US7279166B2 (en) * 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
EP1496945A4 (en) * 2002-04-05 2006-11-08 Univ Iowa State Res Found Inc Mycoplasma POLYPEPTIDES
TWI350174B (en) 2003-03-12 2011-10-11 Wyeth Corp Adjuvanted bovine vaccines
RU2278704C2 (ru) * 2004-01-12 2006-06-27 Алексей Борисович Башкиров Метод индукции иммунного ответа организма млекопитающих-2

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002010343A2 (en) * 2000-07-27 2002-02-07 Regents Of The University Of Minnesota Temperature-sensitive live vaccine for mycoplasma hyopneumoniae
US20030109473A1 (en) * 2001-07-02 2003-06-12 Pfizer Inc. One dose vaccination with mycoplasma hyopneumoniae
US20030170270A1 (en) * 2001-12-12 2003-09-11 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID L. ROSE et al., "Taxonomy of Some Swine Mycoplasmas: MycopZasma suipneumoniae Goodwin et al. 1965, a Later, Objective Synonym of Mycoplasma hyopneumoniae Mare and Switzer 1965, and the Status of Mycoplasma flocculare Meyling and Friis 1972", INTERNATIONALJ OURNAL OF SYSTEMATBAICCT ERIOLOGAY, Vol. 29, No. 2, Apr. 1979, p.83-91. *

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Publication number Publication date
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CN101883581A (zh) 2010-11-10

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