TWI528970B - 多價第二型豬環狀病毒(pcv2)免疫組合物及製備該組合物之方法 - Google Patents
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Description
本發明一方面係關於回收由第二型豬環狀病毒(PCV2)之開放編閱架構2(ORF2)表現的蛋白質。更特定而言,該蛋白質為由轉移感染之病毒表現的重組蛋白質,該轉移感染之病毒含有第二型豬環狀病毒,開放編閱架構2的重組密碼序列。更特定而言。容許該轉移感染之病毒將生長培養基中的細胞感染,並回收在上清液中由開放編閱架構2表現的蛋白質,而非從細胞內部回收。再更特定而言,該方法涉及下列步驟:擴大來自第二型豬環狀病毒之開放編閱架構2基因,將該經擴大的部分選殖到第一個載體內,從該第一個載體中切下開放編閱架構2,並將其選殖到轉移載體內,將轉移載體和病毒載體共同轉移感染到在生長培養基中的細胞內,使細胞變成被病毒載體感染,並藉此表現開放編閱架構2,然後回收在上清液中表現之由開放編閱架構2編碼的重組蛋白質。
另一方面,本發明係關於可有效引起對抗PCV2之免疫反應的免疫組合物,以及產生這些免疫組合物的方法。更特定而言,本發明係關於可有效提供免疫反應的免疫學組合物,其保護接受該組合物之動物,並降低或減少與PCV2感染有關之臨床症狀的嚴重性。更特定而言,本發明係關於以蛋白質為基礎的免疫學組合物,其賦予對抗PCV2感染的有效保護。再更特定而言,本發明係關於包括PCV2之ORF2的免疫學組合物,其中PCV2-ORF2的投藥,結果產生了對抗PCV2感染的保護。最特別的是,本發明係關於可有效對接受該免疫組合物的豬賦予有效免疫力的免疫組合物,且其中該組合物包括由PCV2之ORF2表現的蛋白質。
另一方面,本發明亦提供混合疫苗或多價疫苗。更特定而言,本發明提供可有效引起免疫反應的免疫組合物,其對抗PCV2,以及至少一個引起其他豬病之生物的感染。
第二型豬環狀病毒(PCV2)是小型(直徑17-22毫微米)、二十面體無外膜的DNA病毒,其含有單股的環狀基因組。PCV2與第一型豬環狀病毒(PCV1)共享大約80%的序列同一性。然而,與PCV1相反,它通常是無毒力的,被PCV2感染的豬顯示出通常稱為仔豬斷奶後多系統衰竭綜合徵(PMWS)的症狀。PMWS之臨床特徵在於消瘦、皮膚蒼白、發育遲滯、呼吸窘迫、下痢、黃疸和黃疸。在一些受侵襲的豬中,出現所有症狀的混合,而在其他的豬中則僅有這些症狀之一或二。在驗屍期間,顯微和肉眼病灶亦出現在多重組織和器官上,淋巴器官是最常見的病灶位置。已經在PCV2核酸或抗原含量與顯微淋巴病灶的嚴重性之間觀察到極大的關連。被PCV2感染之豬的死亡率可能達到80%。除了PMWS之外,PCV2亦已經與數種其他感染有關,包括假性狂犬病、豬繁殖與呼吸徵候群(PRRS)、格氏病、鏈球菌腦膜炎、沙門氏桿菌病、離乳後的大腸桿菌症、飲食性肝障礙和化膿性支氣管肺炎。
PCV2的開放編閱架構2(ORF2)蛋白質,當在SDS-PAGE凝膠上跑時,具有大約30 kDa之分子量,從前已經利用它作為PCV2疫苗的抗原性組份。獲得用在這類疫苗中之ORF2的典型方法,通常包括擴大編碼ORF2的PCV2 DNA,以ORF2 DNA轉移感染病毒載體,以含有ORF2 DNA的病毒載體感染細胞,容許病毒在細胞內表現ORF2蛋白質,並經由細胞溶解,從細胞中萃取ORF2蛋白質。這些程序通常在以病毒載體感染細胞之後,需花費大約4天。然而,這些程序在萃取程序上是有缺點的,是昂貴且耗費時間的。此外,從細胞中回收的ORF2量並不是很高;結果,需要以大量的病毒載體感染大量的細胞,以便獲得足量的重組表現之蛋白質,用於疫苗及其類似物上。
最近對PCV2免疫的門徑,包括以DNA為基礎的疫苗,如在美國專利第6,703,023號中描述的那些。然而,這類疫苗在賦予對抗PCV2感染和與其有關之臨床症狀的保護性免疫力上是無效的。
豬繁殖與呼吸徵候群(PRRS)是由病毒引起,晚至1991年才首先分離並將其分類為動脈炎病毒(arterivirus)。首先在美國在1980年代中期認知該疾病徵候群,並稱為"神秘豬病"。亦已經叫做藍耳病。最近提議的名稱為豬動脈炎病毒。PRRS的病毒對巨噬細胞有特殊的親和力,特別是在肺中找到的那些。巨噬細胞是身體防禦的一部份。出現在肺中的那些又叫做肺泡巨噬細胞。它們攝取並移除侵入的細菌和病毒,但在PRRS病毒的情況中則否。病毒反而在那些巨噬細胞內繁殖,產生更多的病毒,並殺死巨噬細胞。一旦它進入豬群,便有維持存在並無限期有活性的傾向。高達40%的巨噬細胞被破壞,遂移除大多數的身體防禦機制,並容許細菌和其他病毒增殖及進行破壞。最常見的例子是當生長/肥育豬被PRRS病毒感染時,在地方性動物肺炎的嚴重性上有令人注意的增加。頭一次使整個種畜群感染(特別是在大的豬群中)可能花費一年,雖然該病毒在種畜中似乎很快地散播,但可能在4-5個月才會有至少90%的母豬變成血清-陽性。有一些母豬仍然完好。此外,母豬群在感染1-2年之後,亦常會含有低於20%的血清學陽性動物之情況。然而,這不一定意味著牠們並非仍有免疫力,也不是指牠們已經停止傳遞免疫力給他們的後代。與正在生長的豬(其排泄病毒持續1-2個月)相比較,成年動物排出病毒的時間短很多(14天)。臨床情況可隨著豬群而驚人地改變。作為指標,每三個頭一次接觸PRRS的豬群,就有一個不顯示可辨認的疾病,第二個將顯示輕微的疾病,而第三個則有中等到嚴重的疾病。如此的理由尚未清楚了解。然而,豬群的健康狀況越高,疾病的影響就越不嚴重。可能是病毒正按其倍率突變,使一些品系具有高毒力,而有些則否。PRRS感染所有品系的豬群,包括高或普通健康狀況的,以及室內和室外的豬群,不論大小。
肺炎黴漿菌(M hyo
)是一被分類在黴漿菌科中的小型細菌(400-1200毫微米)。M hyo
與地方性動物肺炎有關,一種在生長和肥育豬中常見的豬呼吸道疾病。M hyo
攻擊氣管和肺上皮細胞的纖毛,引起纖毛停止振動(纖毛靜止),且最後引起肺區域的塌陷。依據疾病的程度,被感染豬的每日活增重可能降低至最高17%。地方性動物肺炎在豬群中是廣泛流傳的,且幾乎出現在每個豬群中。認為M hyo
是助長PRRSV和其他呼吸道病原體進入肺內的主要病原體。已經定出三種不同品系232、J和7448的基因組序列(Minion等人,J.Bacteriol.186:7123-33,2004;Vasconcelos等人,J.Bacteriol.187:5568-77,2005)。
豬增殖性腸炎是生長-肥育和年輕種豬常見的下痢性疾病,其特徵在於迴腸和結腸的增生和炎症。其通常是輕微且自我-限制的,但有時卻引起持續下痢、嚴重的壞死性腸炎或出血性腸炎,且死亡率高。最近,將病因學分類為細胞內的細菌胞內勞森氏菌(Lawsonia intracellularis
)。僅在細胞培養中培養出該生物,而企圖在無細胞培養基中繁殖它則失敗了。藉著將胞內勞森氏菌的純培養物接種在以傳統方式飼養的豬內;產生該疾病的典型病灶,並再度從病灶中分離出胞內勞森氏菌,已經實現了Koch的假定。較普通、非出血形式的疾病經常侵襲18-至36-公斤的豬,且其特徵為突然發生的下痢。糞便是水狀至糊狀的,棕色或些微沾著血的。在大約2天後,豬隻可能排出已經在迴腸中形成的黃色纖維壞死性(fibrinonecrotic)圓柱。大多數受侵襲的豬會自然恢復,但相當多發展成慢性壞死性腸炎,並逐漸消瘦。出血形式的特徵為皮膚蒼白、虛弱並排出出血或黑色、焦油狀的糞便。懷孕的母豬可能會流產。病灶可能出現在下半小腸、盲腸或結腸中的任何地方,但最常見和明顯的是在迴腸。小腸壁變厚,且腸繫膜可能是水腫的。腸繫膜淋巴結變大。小腸黏膜呈現變厚且多皺紋的,可能被棕色或黃色纖維壞死的膜覆蓋,而有時有淤斑出血。黃色壞死圓柱可在迴腸中找到,或通過結腸排出。在慢性案例中的瀰漫性、完全的黏膜壞死,導致小腸變硬,很像花園水管。增殖性黏膜病灶經常是在結腸中,但僅在驗屍時藉著小心檢查才能發現。在出血豐富的形式中,在結腸中有紅或黑色、焦油狀的糞便,且在迴腸中有凝固的血液。
牛病毒性下痢病毒(BVD)和邊界病是兩種病毒,它們是在瘟病病毒(pestivirus)的相同集群中,像是豬瘟(豬瘟)的病毒,但它們主要分別感染牛和綿羊。它們可進入豬種畜群中,並引起呼吸道問題。該疾病並非母豬不孕的主因,但從診斷的觀點來看,仍認為有些許的可能性。
鈎端螺旋體病是接觸傳染的動物疾病,包括人類,由各種免疫學上不同的鈎端螺旋體血清型引起,其中大多數與問號鈎端螺旋體(Leptospira interrogans
)的亞群有關。在豬有五種重要的血清型和群:波莫納鈎端螺旋體(pomona
)、澳洲鈎端螺旋體(australis
)、塔拉索夫鈎端螺旋體(tarassovi
)、犬鈎端螺旋體(canicola
)、出血性黃疸鈎端螺旋體(icterohaemorrhagicae
)和感冒傷寒性鈎端螺旋體(grippotyphosa
)。感染可能是無症狀的,或引起各種症狀,包括食慾不振、發熱、倦怠、黃疸、流產、死產和其他模糊的生殖問題,以及死亡。在急性感染之後,鈎端螺旋體經常局限於腎臟或生殖器官,由局灶性間質性腎炎的零星小灰點組成,並從尿中排毒,有時大量排毒持續數月或數年。因為該生物存活於水表面長時間,該疾病經常是水媒傳播的。在美國該疾病主要是起因於血清型哈究鈎端螺旋體(Leptospira hardjo
)、波莫納鈎端螺旋體和感冒傷寒性鈎端螺旋體。可能不易診斷,因為抗體力價可能是暫時的,在一個月內持續降低。此外,亦可在健康的動物中發現鈎端螺旋體。澳洲鈎端螺旋體血清型布拉提斯拉瓦(Bratislava)最常與生殖問題有關。慢性感染的豬群出現流產,死產和虛弱的小豬。
布氏桿菌病是由布氏桿菌屬的細菌引起,且其特徵在於流產、胎盤滯留、不孕、公豬的睪丸炎,和母豬嚴重的子宮炎。在小豬,該疾病之特徵為後軀麻痺和跛腳。該疾病在豬幾乎完全是由豬布氏桿菌(Brucella suis
)生物型(biovars)1、2和3引起。許多其他的哺乳動物可攜帶並傳播豬布氏桿菌給豬。感染迅速地傳播並在未接種疫苗的豬群中引起許多流產。主要是藉著接觸其他的豬而發生傳染,雖然垂直傳染是有可能的。血清學診斷可能不容易,因為相對上較常見的生物,小腸結腸型耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica
)O:9與布氏桿菌共享共同的抗原,且經常引起偽陽性的結果。死後病灶經常包括子宮炎和睪丸炎,並可包括膿腫,有時在肝臟還有壞死小點。
梭菌是到處都有的革蘭氏陽性細菌,屬於梭菌科,通常在土壤中找到,但也自然地出現在大多數動物的腸道中。豬感染艱難梭狀芽胞桿菌(C.difficile)之特徵在於嚴重的結腸繫膜水腫、下痢和其他組織的水腫,如水胸。豬的梭菌性腸炎是由產氣莢膜梭菌(C.perffingens)引起,其特徵在於慢性腸炎,伴隨有下痢、失重和發燒。被產氣莢膜梭菌A、B和C型感染,引起嚴重的腸炎,痢疾、毒血症,而在幼牛中有高死亡率。B和C型兩者皆產生高度壞死和致命的β毒素,是造成嚴重小腸傷害的主因。該毒素對蛋白水解酵素敏感,而該疾病與小腸中蛋白水解之抑制作用有關。已經提出母豬的初乳,含有胰蛋白酶抑制劑,是年幼小豬感受性的因子。該疾病可能引起小於1週齡小豬的突然死亡,最常見的是在出生3天內。在較大的小豬中,梭菌性腸炎引起小腸變厚,使食物和營養不易吸收。小豬通常因混合感染和缺乏營養而死亡。可能在數小時內死亡,但較不嚴重的病例存活數天,並可能在數天內恢復。出血性腸炎伴隨有黏膜潰瘍,為所有物種中的主要病灶。在肉眼觀察下,受侵襲的腸道部分為深藍-紫色,乍看之下似乎是與腸繫膜扭轉有關的梗塞形成。可針對大量革蘭氏-陽性、桿狀細菌來檢查腸內容物的抹片,並進行過濾以便檢測毒素,然後藉著與專一性抗血清的中和作用確認。
已經懷疑但尚未證實諾維氏梭菌(Clostridium novyi)是餵食高量穀粒食物之牛和豬突然死亡的原因,且其中原先-出現之肝臟病灶是不可檢測的。致命和壞死性毒素(主要是α毒素)傷害肝實質,藉此容許細菌繁殖並產生致命量的毒素。通常突然死亡,沒有明確-定義的症狀。受侵襲之動物有落後獸群的傾向,採俯臥姿,並在數小時內死亡。大部分的病例發生在夏季和早秋,此時肝吸蟲感染正值高峰期。該疾病在1-至4-歲大的綿羊中最為盛行,且僅限於感染肝吸蟲的動物。與急性肝蛭症的區別可能不容易,但動物的甚急性死亡,在驗屍時顯示典型的病灶,應該喚起對傳染性壞死性肝炎的懷疑。最具特色的病灶是在肝臟中灰黃色的壞死小點,其經常依循著幼吸蟲的遷移軌跡。其他共同的發現是變大的心包囊,充滿淡黃色的液體,並在腹膜和胸腔中有過量的液體。在皮下組織中通常有廣泛破裂的微血管,導致鄰近皮膚變成黑色(因此俗稱為黑病)。
在全世界的土壤和動物(包括人類)之腸內容物中發現敗血梭菌(Clostridium septicum)。普通是經由傷口的污染而發生感染,其含有死亡的組織、土壤或一些其他衰弱無力的組織。由意外、去勢、截尾、不衛生地接種疫苗和分娩引起的傷口都可能被感染。一般的症狀,如食慾不振、中毒和高燒,以及局部病灶,在素質性傷害之後數小時至數天內出現。局部病灶是柔軟腫脹的,壓下形成凹窩,並迅速蔓延,因為形成大量的滲出液,其浸潤受侵襲區的皮下和肌肉內之結締組織。氣體的堆積較少見。與撕裂有關的惡性水腫其特徵為明顯的水腫,嚴重的毒血症,並在24-48小時內死亡。
破傷風毒血症是由特殊的神經毒素引起,由在壞死組織中的破傷風梭菌產生。幾乎所有的哺乳動物,包括豬,均易受該疾病感染。雖然破傷風分布在全世界,但有些地區,如美國的北落磯山脈,在土壤中很少發現該生物,在那裡幾乎不知道破傷風。通常,破傷風梭菌在土壤中的出現率,以及人類感染破傷風的發病率,在各大陸較溫暖的地區較高。在土壤和腸道中找到破傷風梭菌,一種厭氧菌,有終端球狀的孢子。在大多數的病例中,其經由傷口被導入組織內,特別是深的穿刺傷,只要有厭氧的環境即可。
沙門氏桿菌屬感染可能在所有年齡的動物中產生下痢,特別是受到壓力、密集飼養或接觸嚴重污染之食物或水源的那些。沙門氏桿菌病是由沙門氏桿菌的許多物種引起,其臨床特徵為下列主要徵候群中的一或多種-敗血症、急性腸炎和慢性腸炎。發生率隨著家畜生產的強化而增加。雖然各種類型的沙門氏桿菌可能引起豬的感染,在豬中發現的典型沙門氏桿菌是豬霍亂沙門氏桿菌(S.choleraesuis)和鼠傷寒沙門氏桿菌(S.typhimurium)。大多數沙門氏桿菌最後的臨床特徵並不是獨特的,而不同物種的沙門氏桿菌在其流行病學上有分歧的傾向。有時質體輪廓和藥物-抗藥性模式,在流行病學研究中是有用的標記。敗血性沙門氏桿菌病通常與豬霍亂沙門氏桿菌有關。被感染的小豬不願意移動、食慾不振、40.5℃-41.6℃的高燒,可能還有淺咳。亦可能發現小豬死亡,並有發紺的末端。豬霍亂沙門氏桿菌是一種罕見的疾病,可能引起肺炎和下痢,且被感染小豬的死亡率通常很高。小腸結腸炎通常與較普通的鼠傷寒沙門氏桿菌有關。感染特徵為黃色或水狀下痢,隨著感染進行,可能含有血或黏液。死亡率低,且常與來自下痢的脫水和鉀缺乏有關。被感染動物的糞便可能污染食物和飲水、來自屠宰場的新鮮或加工肉類、用來當作肥料和飼料的植物和動物產品、牧場和牧地,以及許多惰性材料。雖然很少在飼料中發現豬霍亂沙門氏桿菌。它亦可能直接經由與被感染動物接觸而傳遞。沙門氏桿菌可在潮濕、溫暖的地方存活數個月,如在肥育豬棚或在水井中。囓齒動物和野鳥也是傳染來源。感染的盛行隨著物種和國家而有所改變,而且比臨床疾病的發生率高很多,通常是藉由充滿壓力的狀況而使其加速,如突然缺乏食物、運輸、乾旱、擁擠、分娩,以及投與某些藥物。
大腸桿菌是腸桿菌科(enterobacteriaceae)的細菌,並為天然出現在所有哺乳動物小腸中之細菌的主要類型之一。雖然通常是無害的,但有些大腸桿菌品系可產生一些外-和內-毒素,其引起感染和疾病。對熱-不穩定(LT)和對熱-穩定(ST)的外毒素,由一些品系主動地產生,並為引起腹瀉的原因。類志賀毒素第II型變種(SL T-IIe)、Stx2e和志賀樣毒素(verotoxin)水腫病作用在小動脈壁上,結果導致水腫。內毒素,如脂質A,在乳房炎和泌尿道感染中扮演某個角色。大腸桿菌感染之特徵在於一些不同的徵候群,視所涉及之特殊品系而定,包括下痢、眼窩凹陷、發育遲滯、明顯的體重喪失、生長受阻、抑鬱、腸水腫、乳房炎、膀胱炎、腎盂腎炎和死亡。可藉其細胞壁(O抗原)和細毛(fimbriae)(F抗原)將大腸桿菌分類和編碼。例如,腹瀉通常與大腸桿菌Abbotstown:O147、F4、F5有關,而腸水腫則與F18細毛有關。正確地確認密碼,對於選擇正確疫苗是非常重要的。大腸桿菌感染危及豬的免疫系統,而死亡通常是二次感染和疾病的結果。
豬痘是引起皮膚病灶、丘疹、膿疱和痂的疾病。
附紅血球體症是立克次體(親血球的)疾病,由豬附紅血球體(Eperythrozoon suis)引起,一種細胞外的細菌生物,其附貼在豬紅血球膜上,導致其畸形和損傷。該疾病之特徵為貧血和黃疸(黏膜、鞏膜和內耳變黃色)。它可能導致不佳的懷孕率、其他模糊的生殖問題,甚至死亡。
豬瘟也稱為古典型豬瘟(CSF)或非洲豬瘟(ASF),是由黃病毒科病毒引起的疾病,它是一種有外膜的RNA病毒,或在非洲豬瘟的病例中,為有被膜的DNA病毒,與痘病毒有關。在臨床上,CSF和ASF是不可區別的。第一個症狀是降低活力和睏乏,有一些食慾不振,且豬可能呈現寒顫。在數天內,豬出現明顯的發燒(41-42℃),有時伴隨有皮膚發紅。接下來,豬出現結膜炎和便秘,導致黃色下痢。在豬群中,豬覺得寒冷而經常擠在一起。少數的豬在死亡之前可能抽搐。豬隻開始死亡,皮膚有蔓延的紫斑,且死亡經常出現在感染後10-20天。存活的豬常受到嚴重的生長延遲和弓背的影響。在已確定的豬群中,小豬在懷孕期被母親傳染,結果導致流產、木乃伊化、畸形、死產和產下虛弱的小豬。由感染CSF母豬生下的小豬可能仍然是健康的,但在其一生中持續散佈疾病。
肺炎巴氏桿菌症和鏈球菌,是由敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocidia)和各種鏈球菌引起的,最具代表性的是豬鏈球菌(S.suis)。被病原感染通常代表斷奶後呼吸道徵候群的最終階段。臨床症狀呈現三種形式,急性形式最常與敗血性巴氏桿菌血清型B有關,動物出現呼吸困難、用力呼吸、心跳加劇、高燒(42.2℃)、虛脫而最後死亡。在一些病例中,腹部變成紫色。第二種形式為亞-急性形式,其特徵在於胸膜炎、咳嗽和呼吸困難。豬隻可能喪失大量體重,並可能有極差或沒有生長,在豬流量上造成嚴重的後果。慢性形式出現偶發的咳嗽、心跳加劇和少量或沒有發燒。該形式通常影響10-16週齡的豬。
鏈球菌性腦膜炎引起腦膜的炎症反應,其為覆蓋腦的膜。在吮乳小豬中,通常是由豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis),或有時為諸如大腸桿菌之類的細菌,以及其他的鏈球菌引起。豬鏈球菌有許多血清型。在大多數的國家中,豬鏈球菌第1型在吮乳小豬中是主要的一種,但這在其他國家中則可能不是事實。例如,在丹麥是豬鏈球菌第7型。豬鏈球菌亦引起關節問題,特別是第1和14型。豬鏈球菌可在扁桃腺保留長時間,並可從母豬或從其他小豬傳播給吮乳小豬。母豬在初乳中亦提供不定量的免疫力。在吮乳小豬中的鏈球菌性腦膜炎,在個別小豬中是散發的。當該生物頭一次進入豬群中時,或在其繼發於PRRS之處,在吮乳小豬中鏈球菌性腦膜炎可能惡化。
假性狂犬病,亦稱為豬狂犬病病毒、豬疱疹病毒,其中該病原為有被膜的疱疹DNA病毒。在無經驗的豬群中,新生的豬出現嚴重的中樞神經症狀,從適度到嚴重的協調問題。後軀麻痺可能導致小豬的坐姿像狗。此外,死亡率高。在斷奶的豬隻中,可能降低中樞神經症狀,但可能伴隨有呼吸道症狀的增加。有時,呼吸道疾病與二次感染有關。斷奶的豬可能虛弱並受疾病所苦而吃得很少,且經常是發育受阻的。在生長豬中,中樞神經症狀持續降低,而呼吸道症狀則增加。呼吸道疾病的程度視二次感染的出現和嚴重性而定。在成年豬中,主要是生殖系統症狀。母豬可能流產,而被感染動物在懷孕末期可能產下死胎或虛弱的小豬。在已確定的豬群中,可能有少許的臨床症狀。
豬流感病毒引起豬流感,並屬於流感A型病毒群。在無經驗的獸群中,臨床症狀可能爆炸性地發生,而全部或許多動物同時生病。動物可能出現不活潑、抑鬱、擠成一團/蜂擁和食慾不振。動物常以嘴巴呼吸,並用力呼吸。在移動之後跟著發生咳嗽。其他的臨床症狀包括流鼻涕和腫脹的眼睛,直腸溫度在40.5-41.5℃之間。在種畜群中的高溫可導致流產、不孕、產下小而弱的幼獸,並增加死產。在已確定的獸群中,出現每年重複感染。
結腸炎螺旋體是由多毛結腸短螺旋體(Brachyspira pilosicoli)細菌引起。該感染通常影響10-20週齡的生長/肥育豬。其特徵在於對生長豬為非-致命的消耗性下痢,結果增加了肥育所需的天數。下痢亦導致飼料效率的降低,並產生水狀下痢或鬆散的糞便。大約一半的豬可能顯示出暫時或持續的水狀或黏液樣綠至棕色的下痢,沒有血。臨床症狀較常出現在混合和改變飼料之後10-14天。
豬赤痢是由細菌豬赤痢短螺旋體(Brachyspira hyodysentheriae)引起。目前已知有12種血清型。在已確定之豬群中,臨床症狀包括下痢、在一些豬中迅速喪失體重、被毛外觀、脫水、蒼白的腹部,並在其他豬顯現任何症狀之前有一兩隻豬死亡。在無經驗豬群中關鍵性的爆發,可能影響從吮乳小豬到成年母豬的所有年齡群。
傳染性胃腸炎是由冠狀病毒引起的腸道疾病。它是與豬呼吸道冠狀病毒、流行性下痢病毒和血凝性腦脊髓炎病毒相同的科。一開始的臨床症狀是水狀下痢、嘔吐和食慾不振。小於21天的小豬通常會死亡,離乳豬變成發育遲滯,而生長豬、肥育豬和成豬通常受到輕微的影響,若提供適當的水將會存活。
細小病毒是特徵為豬生殖問題的疾病。病原是小型DAN無-外膜病毒。胎兒是唯一受影響的群體,且對胎兒的影響將視被感染的年齡而定。在10-30天大時,感染導致胎兒的死亡和重吸收。在30-70天之間,感染導致死亡和木乃伊化。而從70天到懷孕末期,感染導致生下虛弱的小豬和木乃伊化。該疾病能夠越過胎盤,然後沿著子宮移往每個胎兒。在母豬中的臨床症狀為死產、木乃伊化的小豬、死胎、不孕,並產生明顯減少的活產後代數目。流產並非細小病毒感染的特徵。
放線桿菌性胸膜肺炎,亦稱為APP和嗜血性胸膜肺炎,是由細菌胸膜肺炎放線桿菌所引起。目前已描述了15種血清型病毒(serovirus),且臨床症狀之嚴重性在不同的血清型病毒之間及其他因素的存在下有所不同。認為血清型病毒1、5、9、10和11是較具毒力的。此外,血清型病毒1、9和11;2、6和8;以及4和7可能有交叉-反應。所有年齡的豬均易感染。臨床症狀為突然生病,結果許多動物躺下,並出現41.5℃的直腸高溫。動物通常食慾不振且不喝水,牠們的末端變成發紺且摸起來冰冷。發紺可能擴散至全身,並在死前發展出嚴重的呼吸困難,常用嘴巴呼吸。可能在口吻部看到染血的泡沫,通常死亡發生在24-48小時內。急性臨床症狀包括群體中高百分比的動物是沮喪的並躺下、40.5-51℃的直腸高溫、食慾不振、嚴重的呼吸窘迫、咳嗽、用嘴巴呼吸、發紺、嘔吐和流產。亞急性臨床症狀包括在豬群中有間歇的咳嗽、普通的食慾不振,且生長減退。變體(Cyrovar)第3型出現關節炎、心內膜炎和膿腫。在受到慢性影響的獸群中,可能未影響每日增重,但可能聽到間歇的咳嗽。
格氏病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)(Hps)引起,其具有至少15種不同的類型。在世界各地均發現它,甚至在極為健康的獸群中亦出現該生物。若使用SPF或MEW技術建立這類獸群,且不含Hps,當牠們首次被污染時可能遭到蹂躪,產生像炭疸的疾病,在母豬有高死亡率。在其中該細菌為地方流行性的大多數獸群中,母豬產生強的母體免疫,其正常留存牠的後代中,直到8至12週齡為止。結果,感染在斷奶仔畜中的影響通常是零或極少的。然而,可能在吮乳小豬中看到疾病。豬隻通常成為亞-臨床的,此時仍受到母體抗體的保護,然後刺激牠們自己的免疫反應。然而,若母體免疫在牠們被感染之前消失,則可能發展出嚴重的疾病。這通常是在斷奶之後。其亦可成為其他主要疾病,特別是地方性動物肺炎(EP)(肺炎黴漿菌)的二次病原體。有時在吮乳小豬中體驗到疾病的爆發,特別是在母豬群中。Hps攻擊關節的平滑表面、小腸的覆蓋部分、肺、心臟和腦,引起肺炎、心包囊感染、腹膜炎和胸膜炎。它是經呼吸傳播的。Hps很少在母豬中引起疾病,除非乾乳期母豬是無經驗的。在母豬中偶而看到跛腳或僵硬、關節和肌腱處稍微腫脹,以及罕有的腦膜炎。在小豬中,急性疾病呈現迅速消沉的豬,有升高的體溫,無食慾,且極為勉強。一項特徵為一次2-3下的短咳。良好吮乳小豬的突然死亡並非不尋常的。亦已知Hps引起關節炎和跛腳的個別病例,伴隨有發燒和無食慾。慢性疾病之特徵在於蒼白和生長不佳的豬。突然死亡亦可能發生。至於斷奶小豬和生長豬,患有格氏症的豬變得迅速消沉,或可能才發現就死亡了。其他的症狀包括升高的體溫、食慾不振、極為勉強、神經症狀,如發作和抽搐,包括腦膜炎,和狀況不良的豬,經常導致消耗和多毛。在幼生長豬中,下列的症狀是最常見的:發燒、輕微的腦膜炎、關節炎、跛腳、肺炎、心包囊感染、腹膜炎和胸膜炎。再者,特徵為一次僅2-3下的短咳。
滲出性皮膚炎是由細菌豬葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)引起的,其正常生活在皮膚上,不會引起疾病。不知為何它有時加劇,並引起皮膚炎,滲露出油膩的液體。其產生毒素,被吸收到系統內,並傷害肝臟及腎臟。在吮乳小豬中,疾病通常限於個別的動物,但在新母豬群和斷奶豬中可能是主要的問題。在剛產下前一窩小豬的幾天內,細菌在母豬的陰道內大量繁殖,使得小豬在出生期間或之後馬上被感染。母豬的症狀包括不常見但局限的病灶,特別是在臉和眼睛後面看到。嚴重受侵襲的小豬將會死亡。病灶通常從在臉部四周或在腿上的小型、暗色、局限之感染區開始。沿著肚子側面和在腿之間的皮膚變成棕色,逐漸牽涉到全身。皮膚起皺紋,伴隨著大面積的剝落,並有油膩的觸感。在嚴重的病例中,皮膚因壞死而變黑,且小豬死亡。若母豬將一些免疫力傳遞給小豬,則看到較局限的圖案,不會擴展的直徑大約5-10毫米之小型有界限病灶。至於斷奶和生長豬,症狀通常在斷奶後大約3天開始,在臉部四周或在腿上有局限的棕色感染區或皮膚炎,在該處的皮膚已經受損。其可能潰瘍。沿著肚子側面和在腿之間的皮膚變成棕色,逐漸牽涉到全身。皮膚起皺紋,伴隨著大面積的剝落,並進行至暗色油膩之質地,在嚴重的病例中變成黑色。這類案例通常因葡萄球菌生物產生的毒素而死亡。在養殖場中,高達15%的族群可能涉及,且脫水是常有的。
豬丹毒是由細菌豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的,在大多數但非全部的豬場中發現。高達50%的動物可能在其扁桃腺中帶原。它總是出現在豬或環境中,因為它經由唾液、糞便或尿排泄。亦在許多其他的物種中發現,包括鳥類和綿羊,並可在豬體外存活數週,而在輕質土中更久。因此,不可能從農場中除去它。被感染的糞便或許是感染的主要來源,特別是在生長和肥育畜欄中。細菌可單獨引起疾病,但同時有病毒感染,如PRRs或流感,可能誘發爆發。疾病較不常見於小於8-12週齡的豬,因為藉著經由初乳而來自母豬之母體抗體提供了保護。最易感染疾病的動物是生長中的豬,未接種疫苗的母豬,和高達第四胎的母豬。該生物在體內繁殖,並侵入血流,產生敗血症。在豬中的繁殖速度和免疫力之水準,可判定臨床症狀。
附紅血球體症(Epe)是由叫做豬附紅血球體之細菌引起的疾病,其附貼在紅血球的表面,有時就破壞它們。豬隻可能變成貧血,而在細胞破壞之後留下的產物可能引起黃疸。在年幼的生長豬中最常看到臨床疾病。然而,它亦可能在種畜群中引起呼吸道問題。母豬可能帶有Epe但仍相當健康,然而,其可能越過胎盤,導致生下虛弱蒼白的小豬。Epe出現在大多數但並非所有的獸群中,但容許它成為致病的,並在一些族群中產生疾病,而在其他族群中則否的機制仍是未知的。疾病的發生率低。
腦心肌炎或EMC,在各種脊椎動物中感染並引起疾病,但豬似乎是最易感染的農場動物。該病毒遍及全世界,但在不同的國家和地區,在致病性和毒力上有差異。在歐洲大部分的國家中,特別是在歐洲的那些,它有相對較輕微或非-致病性的傾向,且很少在豬診斷出該疾病。在澳洲的品系似乎比紐西蘭的那些,對豬的毒力更強得多。在佛羅里達的毒力品系,加勒比海和或許中美洲,使心臟受損並引起死亡,而在美國中西部的那些有引起生殖問題的傾向。當大鼠數目增加至猖獗的程度時,豬便有發生臨床疾病的傾向。可從大鼠或大鼠污染的飼料或水而感染豬。在豬之間似乎不會非常迅速地散播。在受侵襲的獸群中,斷奶和生長中的豬通常沒有臨床症狀。
假性狂犬病(AujeSzky's)症或AD,是豬由疱疹病毒引起的重要疾病。該病毒可在帶原狀態下,持續隱藏在神經內一段長時間,然後再度被活化。一旦進入獸群中,病毒通常保留在那裡,且它可在各種層面持續影響生殖功能。病毒在豬體外可存活高達3週。當有毒力的病毒品系首次影響未接種疫苗的易感染獸群時,便發生疾病的急性爆發。病毒越過子宮和胎盤並感染胎兒。豬是主要的寄主。然而,亦可感染狗和牛,顯示神經症狀並死亡。
豬細胞巨大病毒感染(PCMV)是由在全身組織中找到的疱疹病毒引起的,包括新生小豬的鼻子,在那裡引起炎症反應(鼻炎)。PCMV出現在全世界,並存在於大多數但並非所有的豬群中,且大部分的感染為亞-臨床的,很少有臨床疾病。在英國完成血清學,例如,指出有超過90%的獸群已經暴露在感染之下。由該病毒產生的鼻炎是罕見的,且主要發生在新生小豬,與產生毒素之細菌敗血性巴氏桿菌引起的萎縮性鼻炎無關。因此,在大多數的獸群中,感染是不顯著的,除了有時引起輕微的打噴嚏之外,對豬的健康沒有重大影響。
藍眼病是病毒性疾病,引起神經症狀、生殖障礙和角膜的不透明或變藍。主要在墨西哥看到,但在其他國家也曾有報告。在歐洲沒有看到過。症狀包括無食慾、角膜不透明-結膜炎、神經症狀,如發作和抽搐、犬坐姿、發燒、增加返家、增加斷奶到交配的間隔、死產、木乃伊化的小豬、小豬有高死亡率、腫大的睪丸和喪失性慾。
日本B型腦炎病毒(JE)是由蚊子傳播的病毒,且僅在昆蟲盛行的國家中是重要的。侵襲大多數的家畜。在人類引起腦炎。豬是重要的感染來源。症狀包括木乃伊化或死產的小豬,在小豬為神經症狀,如發作和抽搐,且在小豬中有水腫液。在公豬亦可能引起不孕和腫大的睪丸。
豬流行性下痢(PED)是由略為類似引起TGE者的冠狀病毒引起的。該病毒在歐洲流傳廣泛。病毒傷害腸絨毛,因此使吸收表面減少,喪失液體並脫水。在病毒進入易感染的種畜群之後,在二至三週內發展出強免疫力。然後初乳的免疫力保護小豬。病毒通常自發地從種畜群中消失,特別是小型的獸群(<300隻母豬)。當病毒頭一次進入易感染的族群中時,便發生下痢的急性爆發。在這類病例中,可能侵襲高達100%的母豬,出現輕微至極為水狀的下痢。辨認出兩種臨床特點:PED第I型僅侵襲生長中的豬,而PED第II型侵襲所有年齡,包括吮乳豬和成熟母豬。潛伏期約2天,而下痢則持續7至14天。在吮乳小豬中,疾病可能是輕微或嚴重的,死亡率高達40%。在大型種畜群中,特別是保持大規模的種畜群,並不是所有頭一次被感染的雌性都恢復,而牠們可能會復發。這僅發生在來自無母體抗體之母豬的吮乳小豬,並因此是散發的。
豬呼吸道冠狀病毒感染(PRCV),在十多年或更久以前,首次出現在歐洲的豬隻中。它與TGE病毒有關,但不相同,是另一種冠狀病毒。認為它憑著風在農場之間傳播,故維持獸群遠離它是極為困難的。感染經常發生在2至3週齡的吮乳小豬,但不是很重要。當在慢性呼吸疾病綜合徵中出現其他呼吸道病原體時,它可能對肺組織有影響。母豬通常無症狀,但在其他與咳嗽有關之呼吸道病原體的存在下,可能出現咳嗽。在斷奶和生長豬中,頭一次接觸的獸群,若有任何症狀也是很少。最常見的症狀是短暫的咳嗽,僅持續數小時。
輪狀病毒感染是一種在豬群中廣泛流傳的病毒感染。它出現在大多數但並非所有的豬群中,在成年牲畜中差不多有100%的血清-轉變。更多流行病學的特色為它在豬體外的持久性,它可對抗環境的改變和許多殺菌劑。母體抗體持續3-6週,之後豬成為易受感染的,但接觸不一定會導致疾病。估計在主要被輪狀病毒感染的豬中,僅有10-15%的下痢。在成熟獸群中,疾病在小豬7至10天大之後出現。隨著年齡增長而越來越不重要。然而,若出現致病的大腸桿菌品系,可能發生嚴重的疾病並有重大的死亡率。
狂犬病是由病毒引起,而在豬則被視為罕見的疾病。它在所有物種,包括人類中都是致命的-因此極為重要。在英國沒有狂犬病,但出現在世界上的其他國家中。很少感染小豬和母豬。在母豬、斷乳小豬和生長豬中,疾病突然發生,症狀包括臉部肌肉的神經性痙攣、發作和抽搐、快速地咬、流口水、肌肉發生痙攣,並可能出現後驅麻痺。通常在3天內死亡。
豬水疱病(SVD)是與引起口蹄疫(FMD)之病毒不同的病毒。然而,它在豬身上產生的疾病,在臨床上與FMD無法區別。若突然普遍出現跛腳,且在口鼻部、舌和爪尖有水泡或膿泡,便應認為是該疾病。
結核病侵襲哺乳動物,包括人、鳥類和豬。病原體結核分支桿菌,分成人型、牛型和鳥型。鳥型又叫做鳥分支桿菌(M.avium)或更常稱為鳥/胞內(avian/intracellulare)複合體,因為它不是均一的物種。鳥分支桿菌本身主要感染鳥類,但也在環境中與胞內分支桿菌(M.intracellulare)一起被發現,其主要是腐生的,不需活體。豬很少被人或牛型感染,但經常被鳥/胞內複合體感染。鳥/胞內複合體亦在健康的人中引起亞-臨床非-進行性的感染。主要的關係是它可能在免疫-抑制的人和患有AIDS的人中引起更嚴重的疾病。在大多數國家中,若在屠體頸部發現病灶,整個頭就要廢棄,若在引流腸子的腸繫膜淋巴結中發現病灶,則廢棄內臟。若在體內更廣泛散佈,這很少見,則可能廢棄整個屍體,或煮熟。若肉品檢查員漏掉了小病灶,正常的廚房烹煮將破壞該生物。在所有的豬中,感染在頸部和引流小腸的淋巴結中引起小結節。在絕大多數的病例中,病灶是非-進行性的,不會散播全身,也不會使豬生病且不會排出。沒有臨床症狀,且在感染和未-感染豬之間的效能上並無差異。
豬水疱疹(VES)病毒與引起口蹄疫(FMD)和豬水疱病(SVD)的那些不同,但它在豬身上產生的疾病,在臨床上與FMD和SVD無法區別。不像FMD,它僅影響豬。症狀包括低死亡率,但在吮乳小豬可能有一些死亡。其他的症狀包括流口水、無食慾,並在嘴、鼻、舌和腳周圍有水泡。
水泡性口炎(VS)引起的疾病,主要發生在南美洲和中美洲,偶爾在美國,很少像流行病一樣從北起加拿大延伸到阿根廷那麼南。VS病毒在豬身上產生的疾病,在臨床上與FMD、SVD和VES無法區別。然而,感染的豬最常是亞-臨床的。在所有的豬中,感染的特徵為流口水、腳部病灶和跛腳、降低生長速率、體溫升高至40-41℃(106-107℉),在鼻、唇和奶頭,以及在腳冠周圍上的水泡(膿泡)之外觀,直徑高達30毫米,這可能使豬跛腳。死亡率通常很低,大部分的豬在一到兩週內恢復。
萎縮性鼻炎,進行性和未進行的疾病,其引起鼻子的炎症反應,而它可能是由各種細菌和刺激物引起。在感染進行期間,傷害鼻內精巧的結構和鼻甲骨,使其萎縮並消失。進行性萎縮性鼻炎,是指鼻組織永久萎縮的特定疾病。它是由產生特殊毒素的敗血性巴氏桿菌(PMt)引起。有兩型A和D。在吮乳豬中,第一個症狀是打噴嚏、鼻塞和流鼻涕,但在有少許母體抗體之處的急性爆發時,鼻炎可能嚴重到從鼻子流出血的程度。三至四週齡,並從斷奶開始,有淚液污染和鼻子扭曲與變斷之畸形的證據。受到嚴重影響的豬,可能有進食的問題。有降低很多的每日增重。在嚴重爆發的豬隻中,可能無法生長至上市的體重。
東方馬腦炎病毒(EEEV)是披蓋病毒科(Togaviridae),α病毒(alphavirus)屬的成員。當被感染蚊子叮咬時,EEEV可傳播給馬和人類。除了馬和人類之外,EEEV可在普通的家畜中產生嚴重疾病,如豬和牛。已經從鳥類,如火雞、雉、鵪鶉、駝鳥和鴯鶓等等中,回收EEEV或病毒-專一的抗體。
黴漿菌關節炎是由豬滑液黴漿菌(Mycoplasma hyosynoviae)感染引起的。該關節炎之特徵為一或多個關節的炎症反應,且通常是在所有吮乳和生長豬,以及母豬中。然而,很少發生在小豬。
亦由腺病毒和血凝性腦脊髓炎病毒引起豬的感染。
因此,在此項技藝中,需要獲得ORF2蛋白質,但不需從被感染之細胞中萃取ORF2蛋白質的方法。更需要以足以有效地製備疫苗組合物的量,獲得重組ORF2蛋白質的方法。更需要不需像目前ORF2蛋白質萃取草案所需之複雜且勞力密集的方法,而能夠獲得ORF2蛋白質的方法。最後,關於組合物,在此項技藝中,需要免疫組合物,其賦予對抗PCV2感染的保護性免疫力,並減少與其有關之臨床症狀的嚴重性或預防之。
本發明克服了在先前技藝中固有的問題,並在此項技藝狀態中提供了不同的優點。特定而言,本發明一方面i)藉著容許含有PCV2 ORF2 DNA密碼序列的重組病毒載體,感染培養中的易感染細胞,其中由該重組病毒載體表現ORF2蛋白質,並ii)隨後回收在上清液中的ORF2,提供經改良之產生及/或回收重組PCV2 ORF2蛋白質的方法。已經意外地發現,若容許感染和感染細胞的後續培養往前進行超過典型較早的PCV2 ORF2回收過程,後者得從細胞內萃取PCV2 ORF2,便會釋放大量的ORF2至上清液內。而且,亦已經意外地發現,PCV ORF2蛋白質是強固的,可對抗生產細胞外部的原型降解作用。兩個發現一起,容許從利用含有PCV2 ORF2 DNA並表現PCV2 ORF2蛋白質之重組病毒載體感染的細胞培養上清液中,回收高量的PCV2 ORF2蛋白質。高量的PCV2 ORF2蛋白質意指超過大約20微克/毫升上清液,較佳的是超過大約25微克/毫升,更佳的是超過大約30微克/毫升,再更佳的是超過大約40微克/毫升,再更佳的是超過大約50微克/毫升,再更佳的是超過大約60微克/毫升,再更佳的是超過大約80微克/毫升,再更佳的是超過大約100微克/毫升,再更佳的是超過大約150微克/毫升,最佳的是超過大約190微克/毫升。亦可藉著在實例1至3中描述的方法,達到那些表現比例。
較佳的細胞培養物具有在大約0.3-2.0x106
個細胞/毫升之間的細胞計數,更佳的是從大約0.35-1.9x106
個細胞/毫升,再更佳的是從大約0.4-1.8x106
個細胞/毫升,再更佳的是從大約0.45-1.7x106
個細胞/毫升,而最佳的是從大約0.5-1.5x106
個細胞/毫升。由熟諳此藝者決定較佳的細胞。較佳的細胞是易利用含有PCV2 ORF2 DNA之適當重組病毒載體感染,並表現PCV2 ORF2蛋白質的那些。該細胞最好是昆蟲細胞,更佳的是其包括以商標名Sf+昆蟲細胞販售的昆蟲細胞(Protein Sciences Corporation,Meriden,CT)。
亦由熟諳此藝者決定適當的生長培養基,而較佳的生長培養基是不含血清的昆蟲細胞培養基,如Excell 420(JRH Biosciences,Inc.,Lenexa,KS),及其類似物。較佳的病毒載體包括桿狀病毒,如BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA),特別是在生產細胞為昆蟲細胞時。雖然桿狀病毒表現系統是較佳的,但熟諳此藝者了解其他的表現系統亦可替本發明工作,即表現PCV2 ORF2至細胞培養物的上清液內。這類其他的表現系統可能需要使用信號序列,以便將ORF2表現至培養基內。已經意外地發現當由桿狀病毒表現系統產生ORF2時,不需要任何信號序列,或進一步修飾,使ORF2表現在培養基內。咸相信該蛋白質可獨立地形成類-病毒顆粒(Journal of General Virology第81冊,第2281-2287頁(2000)),並被分泌至培養物上清液中。重組的病毒載體含有PCV2 ORF2 DNA序列,當用來感染易感染細胞時,具有在大約0.03-1.5之間的較佳感染倍率(MOI),更佳的是從大約0.05-1.3,再更佳的是從大約0.09-1.1,而最佳的是從大約0.1-1.0。上文提及之較佳的MOIs是相對於1毫升細胞培養液。較佳的是,在本文中描述之方法,包括以具有在大約0.03-1.5,更佳的是從大約0.05-1.3,再更佳的是從大約0.09-1.1,而最佳的是從大約0.1-
1.0之MOI(感染倍率),含有PCV2 ORF2 DNA並表現PCV2 ORF蛋白質之重組病毒載體,感染0.35-1.9x106
個細胞/毫升,更佳的是大約0.4-1.8x106
個細胞/毫升,再更佳的是大約0.45-1.7x106
個細胞/毫升,而最佳的是大約0.5-1.5x106
個細胞/毫升。
然後在高達10天的期間內培養被感染的細胞,更佳的是從大約2天到大約10天,再更佳的是從大約4天到大約9天,而最佳的是從大約5天到大約8天。較佳的培養條件包括在大約22-32℃之間的溫度下,較佳的是從大約24-30℃,更佳的是從大約25-29℃,再更佳的是從大約26-28℃,而最佳的是大約27℃。較佳的是,在接種之後針對獨特的桿狀病毒-誘導之變化,來觀察Sf+細胞。這類觀察可包括在感染後的期間,監視細胞的密度動向和存活率的降低。發現在感染後3-5天觀察到高峰的病毒力價,並在第5到8天之間,及/或當細胞存活力降低至10%以下時,獲得從細胞中釋放至上清液內的高峰ORF2。
因此,本發明一方面藉著i)容許以具有如上文限定之MOI的重組病毒載體,感染一些培養中的易感染細胞(參見上文),ii)由該重組病毒載體表現ORF2蛋白質,並iii)隨後回收在感染後5-8天之間,及/或細胞存活力降低至10%以下,獲得之細胞上清液中的PCV2 ORF2,提供經改良之產生及/或回收重組PCV2 ORF2蛋白質的方法,最好是以上述之含量。較佳的是,該重組病毒載體是含有PCV2 ORF2 DNA密碼序列的重組桿狀病毒,且該細胞為Sf+細胞。此外,在感染之後的期間,最好就污染的肉眼和顯微證據,或是細胞形態學上的非典型變化,周期性地檢查培養物。應拋棄出現任何污染的任何培養物。較佳的是,所表現之ORF2重組蛋白質被細胞分泌至維持細胞生存的周圍生長培養基內。然後回收在細胞周圍之上清液中的ORF2,而不是從細胞本身中回收。
回收過程最好經由分離步驟,從分離細胞碎屑與在培養基中之經表現ORF2開始。較佳的分離步驟包括過濾、以高達大約20,000xg之速度離心、連續流動離心、使用離子交換或凝膠過濾的層析分離,以及傳統的免疫親和力法。那些方法均為熟諳此藝者已知的,例如(Harris和Angel(編輯),蛋白質純化法-實際方法(Protein purification methOds-a practical approach),IRL press Oxford 1995)。最佳的分離法包括以高達大約20,000xg之速度離心,以及過濾。較佳的過濾法包括死端式微量離心,以及切向流(或交叉流)過濾,包括空心絲過濾死端式微量過濾。其中,死端式微量過濾是較佳的。死端式微量過濾的較佳孔隙尺寸是在大約0.30-1.35微米之間,更佳的是在大約0.35-1.25微米之間,再更佳的是在大約0.40-1.10微米之間,而最佳的是在大約0.45-1.0微米之間。咸相信任何傳統的過濾膜均適合替本發明工作,但較佳的是聚醚碸膜。在過濾步驟期間,移除任何低重量的核酸物種。
因此,本發明更進一步的觀點是藉著i)容許以具有如上文限定之MOI的重組病毒載體,感染一些培養中的易感染細胞(參見上文),ii)由該重組病毒載體表現PCV ORF2蛋白質,iii)回收在感染後5-8天之間,及/或細胞存活力降低至10%以下,獲得之細胞上清液中的PCV2 ORF2,並iv)經由分離步驟分離細胞碎屑與已表現的PCV2 ORF2,提供經改良之產生及/或回收重組PCV2 ORF2蛋白質的方法,最好是以上述的含量。較佳的是,該重組病毒載體是含有PCV2 ORF2 DNA密碼序列的重組桿狀病毒,且該細胞為Sf+細胞。較佳的分離步驟是上述的那些。最好是死端式微量過濾,使用具有在大約0.30-1.35微米之間之孔隙尺寸的膜,更佳的是在大約0.35-1.25微米之間,再更佳的是在大約0.40-1.10微米之間,而最佳的是在大約0.45-1.0微米之間。
為了回收將用在免疫原或免疫組合物,如疫苗上的PCV2 ORF2,最好包含失活步驟,以便使病毒載體失活。"免疫原或免疫組合物"意指物質之組合,其包括至少一個在宿主中誘發免疫反應的抗原,該免疫反應是對感興趣之組合物或疫苗的細胞及/或抗體-調解的免疫反應。通常,"免疫反應"包括但不限於一或多個下列結果:專一地針對感興趣之組合物或疫苗中所含的抗原或抗原們,產生或激活抗體、B細胞、協助者T細胞、抑制性T細胞,及/或胞毒性T細胞及/或yd T細胞。較佳的是,宿主將展現治療性或預防性免疫反應,而得以提高對新感染的抵抗力,及/或降低疾病的臨床嚴重性。將藉著降低或缺少由被感染宿主正常展現的症狀、較快的恢復時間,及/或在被感染宿主中降低的病毒力價,來證明這類保護。因此,本發明亦關於藉著i)容許以具有如上文限定之MOI的重組病毒載體,感染一些培養中的易感染細胞(參見上文),ii)由該重組病毒載體表現PCV ORF2蛋白質,iii)回收在感染後5-8天之間,及/或細胞存活力降低至10%以下,獲得之細胞上清液中的PCV2 ORF2,iv)經由分離步驟分離細胞碎屑與已表現的PCV2 ORF2,並v)使該重組病毒載體失活,產生及/或回收重組PCV2 ORF2蛋白質的方法,最好是以上述的量。
較佳的是,在過濾步驟之前或之後馬上進行該失活作用,在過濾步驟之後是較佳的失活時間。為了本發明,可使用任何傳統的失活方法。因此,可藉著化學及/或物理處理,進行失活作用。在較佳的形式中,判定收穫流體的體積,並使溫度達到大約32-42℃之間,更佳的是在大約34-42℃之間,而最佳的是在大約35-39℃之間。較佳的失活方法包括加入環化二元氮丙啶(BEI),最好是以大約1至大約20 mM的濃度,較佳的是大約2至大約10 mM,更佳的是大約2至大約8 mM,再更佳的是大約3至大約7 mM,而最佳的是大約5 mM。例如,失活包括在流體加入2-溴乙烯胺氫溴化物,最好是大約0.4 M,已經在0.3 N NaOH中將其環化成0.2 M的二元氮丙啶(BEI),得到終濃度大約5 mM的BEI。較佳的是,然後持續攪拌該流體72-96小時,並可將失活的收穫流體冷凍儲存在-40℃或更低,或在大約1-7℃下。在完成失活作用之後,加入硫代硫酸鈉溶液,最好是1.0 M,中和任何殘餘的BEI。較佳的是,與先前為了失活而加入BEI相比較,加入等量的硫代硫酸鈉。例如在加入EBI至終濃度為5 mM的事件中,加入1.0 M硫代硫酸鈉溶液,得到5 mM之最低終濃度,中和任何殘餘的BEI。
因此,本發明更進一步的觀點係關於藉著i)容許以具有如上文限定之MOI的重組病毒載體,感染一些培養中的易感染細胞(參見上文),ii)由該重組病毒載體表現PCV ORF2蛋白質,iii)回收在感染後5-8天之間,及/或細胞存活力降低至10%以下,獲得之細胞上清液中的PCV2 ORF2,iv)經由分離步驟分離細胞碎屑與已表現的PCV2 ORF2,並v)使該重組病毒載體失活,產生重組PCV2 ORF2蛋白質的方法,最好是以上述的量。較佳的是,該重組病毒載體是含有ORF2 DNA密碼序列的桿狀病毒,且該細胞為Sf+細胞。較佳的分離步驟是上述的那些,最好是過濾步驟。較佳的失活步驟是上述的那些。較佳的是,在大約35-39℃之間,並在2至8 mM BEI的存在下,進行失活作用,而更佳的是在大約5 mM BEI的存在下。已經意外地發現,較高濃度的BEI,對PCV2 ORF2蛋白質有負面的影響。
根據本發明更進一步的觀點,上述的方法亦包括在步驟v)之後的中和步驟。該步驟vi)包括加入等量的中和在溶液內之失活劑的製劑。較佳的是,若失活劑是BEI,最好是加入等量的硫代硫酸鈉。因此,根據更進一步的觀點,當失活劑為BEI時,步驟vi)包括加入硫代硫酸鈉溶液,至大約1至大約20 mM的終濃度,較佳的是大約2至大約10 mM,更佳的是大約2至大約8 mM,再更佳的是大約3至大約7 mM,最好是大約5 mM。
在較佳形式,且特別是將在免疫組合物,如疫苗中使用重組PCV2 ORF2蛋白質的形式中,將藉著在錨定依賴性、易感染桿狀病毒的Sf+細胞上繼代,測試每一種收穫的ORF2的失活作用。在該測試的較佳形式中,以1.0毫升失活的PCV2流體接種150平方公分的適當細胞培養物單層,並維持在25-29℃下14天,至少兩次繼代。在維持期結束時,就PCV2 ORF2桿狀病毒典型的致細胞病變作用(CPE),檢查細胞單層。較佳的是,亦使用陽性細胞對照組。這類對照組可包括一個以非-失活參考PCV2 ORF2桿狀病毒接種Sf+細胞的培養物,以及一個燒瓶維持未接種的Sf+細胞。在培養和繼代之後,缺少病毒感染的細胞,在BEI處理病毒流體時,將構成令人滿意的失活測試。以參考病毒接種對照組細胞,應顯示PCV2 ORF2桿狀病毒典型的CPE,而未接種燒瓶應該不顯示任何PCV2 ORF2桿狀病毒CPE的證據。或者,在維持期間結束時,可收集上清液試樣,並接種在Sf+96孔培養盤上,該盤已經裝有Sf+細胞,然後維持在25-29℃下5-6天。然後固定該盤,並以與FITC共軛的抗-PCV2 ORF2抗體染色。藉著IFA顯微鏡檢查CPE和ORF2表現的缺少,在以BEI處理病毒流體時,構成令人滿意的失活測試。以參考病毒接種對照組細胞,應顯示CPE和IFA活性,而未接種的燒瓶則不應顯示任何PCV2 ORF2桿狀病毒CPE的證據,且不含IFA活性。
因此,本發明更進一步的觀點係關於判定重組病毒載體之失活有效性的失活測試,包括步驟:i)使至少一部分含有重組病毒載體的培養流體與失活劑接觸,最好如同上述,ii)加入中和劑中和失活劑,最好如同上述,並iii)藉著如上述之測定,判定殘餘的感染性。
本發明更進一步的觀點係關於建構含有PCV2 ORF2 DNA,並在感染至易感染細胞內時,以高量表現PCV2 ORF2蛋白質之重組病毒載體的方法。意外地發現據此提供之重組病毒載體在感染易感染的細胞之後,以如同上述的高量表現PCV2 ORF2。因此,本發明亦關於產生及/或回收PCV2 ORF2蛋白質之經改良的方法,最好包括下列步驟:建構含有PCV2 ORF2 DNA並表現PCV2 ORF2蛋白質的重組病毒載體。較佳的是,該病毒載體為重組的桿狀病毒。建構據此提供之含有PCV2 ORF2 DNA並表現PCV2 ORF2蛋白質的重組病毒載體之方法的細節,描述如下:藉著將轉移載體轉移感染至病毒載體內,該轉移載體具有已經選殖至其中的ORF2基因,產生用來感染細胞的較佳形式,也就是含有PCV2 ORF2 DNA並表現PCV2 OFR2蛋白質的重組病毒載體。較佳的是,在轉移載體中只有含有ORF2 DNA的部分被轉移感染到病毒載體內。"轉移感染至病毒載體內"一詞意指,並作為"導入"或"選殖"異種DNA至病毒載體內的同義字使用,像是例如導入桿狀病毒載體內。該病毒載體最好但不一定是桿狀病毒。
因此,根據本發明更進一步的觀點,藉著在含有異種PCV2 ORF2 DNA的轉移載體和病毒載體之間的重組作用,產生重組病毒載體,該病毒載體最好是桿狀病毒,更佳的是直線化之缺複製能力的桿狀病毒(如Baculo Gold DNA)。"轉移載體"意指DNA分子,其包括至少一個複製起點、異種基因,在本案例中為PCV2 ORF2,以及容許選殖該異種基因至病毒載體內的DNA序列。容許選殖異種基因至病毒載體內的序列,最好位在該異種基因的側面。再更佳的是,那些位在側面的序列與病毒載體之序列至少一部分是同種的。此時序列的同種性容許兩個分子,病毒載體和轉移載體重組,產生含有異種基因的重組病毒載體。一較佳的轉移載體為pVL1392載體(BD Biosciences Pharmingen),它被設計成與BaculoGold DNA共同-轉移感染至較佳的Sf+細胞株內。該轉移載體最好包括PCV2 oRF2 DNA。共同-轉移感染的構築體約為10,387個鹼基對長。
在更佳的形式中,本發明之方法將始於PCV2 ORF2 DNA的分離。通常,這可來自已知或未知的品系,因為ORF2 DNA似乎是高度保留的,在不同的分離株之間有至少大約95%的序列同一性。為了本發明,可使用此項技藝中已知的任何PCV2 ORF2基因,因為每一個都將在上清液內表現。最好是使用PCR法擴大PCV ORF2 DNA,更佳的是一起導入5'側面Kozak's一致序列(CCGCCAUG)(SEQ ID NO:1)及/或3'側面EcoR1位置(GAATTC)(SEQ ID NO:2)。這樣導入5' Kozak's一致序列,最好移除PCV2 ORF2的天然存在之起始密碼子AUG。最好是在PCV2 ORF2之終止密碼子的下游,導入3' EcoR1位置。更佳的是,在聚A轉錄終止序列的下游導入它,而聚A自己則位在PCV2 ORF2終止密碼子的下游。已經發現Kozak's一致序列的使用,特別是如上述,會增加後續之PCV2 ORF2蛋白質的表現水準。將經擴大之PCV2 ORF2 DNA及這些額外的序列,一起導入載體內。最適合該初步選殖步驟的載體是pGEM-T-Easy載體(Promega,Madison,WI)。最好是在Not1限制位置,從載體中切開包含一些pGEM載體序列(SEQ ID NO:7)的PCV2 ORF2 DNA。然後將所得的DNA選殖到轉移載體內。
因此,在本發明的一項觀點中,提供建構含有PCV2 ORF2 DNA之重組病毒載體的方法。該方法包括下列步驟:i)將重組的PCV2 ORF2選殖到轉移載體內,並ii)將轉移載體含有重組PCV2 ORF2的部分轉移感染到病毒載體內,產生重組的病毒載體。較佳的是,該轉移載體是上述的,或按照上述建構的,或在圖1中舉例出示的。因此,根據更進一步的觀點,用來建構如上述之重組病毒載體的轉移載體,含有SEQ ID NO:7的序列。
根據更進一步的觀點,該方法在步驟i)之前,更包括下列步驟:在活體外擴大PCV2 ORF2 DNA,其中按照上述修飾PCV2 ORF2 DNA的側面序列。在活體外擴大PCV2 ORF2 DNA並修飾該側面序列,在活體外將經擴大之PCV2 ORF2 DNA選殖到轉移載體內的方法,以及適當的轉移載體,已在上文中描述、在圖1中舉例說明,或為熟諳此藝者已知的。因此,根據更進一步的觀點,本發明係關於建構含有PCV2 ORF2 DNA並表現PCV2 ORF2蛋白質之重組病毒載體的方法,包括下列步驟:i)在活體外擴大PCV2 ORF2 DNA,其中修飾該PCV2 ORF2 DNA的側面序列,ii)將經擴大之PCV2 ORF2 DNA選殖到轉移載體內,並iii)將轉移載體或其含有重組PCV2 ORF2 DNA的部分轉移感染至病毒載體內,產生重組的病毒載體。較佳的是,如上述進行PCV2 ORF2 DNA之側面序列的修飾,例如最好如上述藉著導入5' Kozak's序列及/或EcoR1位置。
根據更進一步的觀點,提供產生及/或回收由PCV2之開放編閱架構2表現之重組蛋白質的方法。該方法通常包括下列步驟:i)將重組PCV2 ORF2選殖到轉移載體內,ii)將轉移載體中含有重組PCV2 ORF2的部分轉移感染到病毒內,iii)以經轉移感染之病毒感染在培養基中的細胞,iv)使經轉移感染的病毒從PCV2 ORF2表現重組蛋白質,v)分離細胞與上清液;並vi)從上清液中回收已表現的PCV2 ORF2蛋白質。
在上文中描述了如何將重組的PCV2 ORF2 DNA選殖到轉移載體內的方法。較佳的是,轉移載體含有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7之序列。然而,轉移載體可含有任何未經修飾或經修飾的PCV2 ORF2 DNA,只要該PCV2 ORF2 DNA在轉移感染至重組病毒載體內時,在細胞培養物中表現即可。較佳的是,該重組病毒載體包括SEQ ID NO:8之序列。此外,在上文中詳述了如何感染細胞的方法,最好是如何以限定數目的重組桿狀病毒,其含有PCV2 ORF2 DNA並表現PCV2 ORF2蛋白質,來感染昆蟲細胞。再者,亦在上文中詳述了分離細胞與上清液的步驟,以及回收已表現之PCV2 ORF2蛋白質的步驟。任何在本文中描述的這些特殊處理步驟,均為如上述之產生及/或回收由PCV2之開放編閱架構2表現的重組蛋白質之方法的一部分。較佳的是,該細胞為Sf+細胞。更佳的是,細胞培養物具有在大約0.3-2.0x106
個細胞/毫升之間的細胞計數,更佳的是從大約0.35-1.9x106
個細胞/毫升,再更佳的是從大約0.4-1.8x106
個細胞/毫升,再更佳的是從大約0.45-1.7x106
個細胞/毫升,而最佳的是從大約0.5-1.5x106
個細胞/毫升。較佳的是,當用來感染易感染之細胞時,含有PCV2 ORF2 DNA之重組病毒載體具有在大約0.03-1.5之間的較佳感染倍率(MOI),更佳的是從大約0.05-1.3,再更佳的是從大約0.09-1.1,再更佳的是從大約0.1-1.0,而最佳的是大約0.5。最好是在感染後5-8天之間,及/或細胞存活力降低至10%以下時所獲得之細胞的上清液中回收PCV2 ORF2蛋白質。為了產生PCV2 ORF2蛋白質,最好將細胞培養在25至29℃下。較佳的分離步驟是離心或過濾步驟。
該方法可視需要在將PCV2 ORF2 DNA選殖到轉移載體內之前,包括擴大來自PCV2品系之PCV2 ORF2 DNA的步驟。在較佳的形式中,亦可在經擴大的序列中加入5' Kozak's序列、3'EcoR1位置及其組合,最好是在擴大作用之前或期間。較佳的5' Kozak's序列包括SEQ ID NO:1。較佳的3'EcoR1位置包括SEQ ID NO:2。較佳的PCV2 ORF2 DNA包括核苷酸序列Genbank登錄編號AF086834(SEQ ID NO:3)和SEQ ID NO:4。較佳的重組PCV2 ORF2蛋白質包括SEQ ID NO:5的胺基酸序列,它是由SEQ ID NO:3(Genbank登錄編號AF086834)編碼的蛋白質,以及SEQ ID NO:6的胺基酸序列,它是由SEQ ID NO:4編碼的蛋白質。較佳的培養基是不含血清的昆蟲細胞培養基,更佳的是Excell 420培養基。當進行任意的擴大步驟時,最好是先將經擴大之開放編閱架構2選殖到第一個載體內,從該第一個載體中切下開放編閱架構2,並使用切下來的開放編閱架構選殖至轉移載體內。最適合共同轉移感染的細胞株是Sf+細胞株。最適合共同轉移感染的病毒是桿狀病毒。在該方法的較佳形式中,轉移載體的轉移感染部分包括SEQ ID NO:8。最後,對該方法而言,最好在以病毒感染細胞之後至少5天,回收在細胞培養上清液中的PCV2開放編閱架構2(ORF2)蛋白質。
因此,本發明更進一步的觀點係關於產生及/或回收PCV2開放編閱架構2的方法,包括下列步驟:i)在活體外擴大PCV2 ORF2 DNA,最好是藉著加入5' Kozak's序列及/或3'EcoR1限制位置,ii)將經擴大之PCV2 ORF2選殖到轉移載體內;iii)將轉移載體之含有重組PCV2 ORF2的部分轉移感染到病毒內;iv)以經轉移感染之病毒感染在培養基中的細胞;v)使該經轉移感染的病毒從PCV2 ORF2表現重組蛋白質;vi)分離細胞與上清液;並vii)從上清液中回收已表現的PCV2 ORF2蛋白質。
本發明更進一步的觀點係關於製備包括PCV2 ORF2蛋白質和失活病毒載體之組合物的方法。該方法包括下列步驟:i)將經擴大之PCV2 ORF2選殖到轉移載體內;ii)將轉移載體之含有重組PCV2 ORF2的部分轉移感染到病毒內;iii)以經轉移感染之病毒載體感染在培養基中的細胞;iv)使該經轉移感染的病毒載體從PCV2 ORF2表現重組蛋白質;v)分離細胞與上清液;vi)從上清液中回收已表現的PCV2 ORF2蛋白質;並vii)使重組病毒載體失活。較佳的是,該重組病毒載體是含有PCV2 ORF2密碼序列的桿狀病毒,而該細胞是sf+細胞。較佳的分離步驟是上述的那些,最好是過濾步驟。較佳的失活步驟是上述的那些。較佳的是,在大約35-39℃下,並在2至8 mM BEI的存在下進行失活作用,更佳的是在大約5 mM BEI的存在下。已經意外地發現,較高濃度的BEI對PCV2 ORF2蛋白質有負面的影響,而較低濃度則不能在24至72小時的失活期間內,有效地使病毒載體失活。較佳的是,失活作用進行至少24小時,更佳的是24至72小時。
根據更進一步的觀點,如上述之製備包括PCV2 ORF2蛋白質和失活病毒載體之組合物的方法,在步驟vii)之後亦包括中和步驟。該步驟viii)包括加入等量的中和溶液內之失活劑的製劑。較佳的是,若失活劑為BEI,最好是加入等量的硫代硫酸鈉。因此,根據更進一步的觀點,當失活劑為BEI時,步驟viii)包括加入硫代硫酸鈉溶液,至大約1至大約20 mM之終濃度,更佳的是大約2至大約10 mM,再更佳的是大約2至大約8 mM,再更佳的是大約3到大約7 mM,最佳的是大約5 mM。
根據更進一步的觀點,如上述之製備包括PCV2 ORF2蛋白質和失活病毒載體之組合物的方法,在步驟i)之前,包括下列步驟:在活體外擴大PCV2 ORF2 DNA,其中如上述修飾PCV2 ORF2 DNA的側面序列。在活體外擴大PCV2 ORF2 DNA並修飾側面序列,在活體外將經擴大之PCV2 ORF2 DNA選殖到轉移載體內的方法,以及適當的轉移載體,已在上文中描述、在圖1中舉例說明,或為熟諳此藝者已知的。因此,根據更進一步的觀點,該方法包括下列步驟:i)在活體外擴大PCV2 ORF2 DNA,其中修是該PCV2 ORF2 DNA的側面序列,ii)將經擴大之PCV2 ORF2 DNA選殖到轉移載體內;並iii)將轉移載體或其含有重組PCV2 ORF2 DNA的部分轉移感染到病毒載體內,產生重組的病毒載體;iv)以經轉移感染之病毒感染在培養基中的細胞;v)使該經轉移感染的病毒從PCV2 ORF2表現重組蛋白質;vi)分離細胞與上清液;vii)從上清液中回收已表現的PCV2 ORF2蛋白質;viii)使該重組病毒載體失活,較佳的是在大約1到大約20 mM BEI的存在下,最好是在大約5 mM BEI的存在下;並ix)加入等量的中和劑,中和在溶液內的失活劑,當失活劑為BEI時,較佳的是加入硫代硫酸鈉溶液至大約1至大約20 mM之終濃度,最好是大約5 mM。
在本發明另一項觀點中,提供製備誘發對抗PCV2之免疫反應的組合物,最好是抗原組合物,像是例如疫苗的方法。通常,該方法包括將構築體轉移感染到病毒內的步驟,其中該構築體包括i)得自PCV2之ORF2的重組DNA,ii)以經轉移感染之病毒感染在生長培養基中的細胞,iii)使該病毒從PCV2 ORF2表現重組蛋白質,iv)從上清液中回收已表現的ORF2蛋白質,並v)藉著混合回收的蛋白質與適當之佐劑及/或在藥學上可接受之載劑,製備組合物。
當在本文中使用"佐劑"一詞時,可包括氫氧化鋁和磷酸鋁、皂角苷,例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑。乳劑特別是以輕質液狀石蠟油(歐洲藥典型式);類異戊二烯油,如角鯊烷或角鯊烯油,來自鏈烷,特別是異丁烯或癸烯的低聚作用;含有直線烷基基團之酸或醇的酯類,較特別的是植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯;分支脂肪酸或醇的酯類,特別是異硬脂酸酯為基礎。使用油與乳化劑混合,形成乳劑。乳化劑最好是非離子界面活性劑,特別是脫水山梨糖醇、二縮甘露糖醇(例如無水甘露糖醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸的酯類,可視需要將其乙氧基化,以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物,特別是普羅尼克(Pluronic)產物,尤其是L121。參見Hunter等人,The Theory and Practical Application of Adjuvants(編輯Stewart-Tull,D.E.S.)。John Wiley and Sons,NY,第51-94頁(1995)和Todd等人,Vaccine 15:564-570(1997)。
例如,可能使用在M.Powell和M.Neewman編輯之"疫苗設計、次單元和佐劑方法(Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach)",Plenum Press,1995之第147頁中描述的SPT乳劑,以及同一書中第183頁上描述的乳劑MF59。
佐劑的更多例子是選自丙烯酸或異丁烯酸之聚合物和順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物之共聚物的化合物。便利的佐劑化合物是丙烯酸或異丁烯酸的共聚物,尤其是它與糖類之聚鏈烯基醚或多元醇交聯。這些化合物被叫做卡波姆(carbomer)(Phameuropa第8冊,第2期,1996年6月)。熟諳此藝者亦可參考美國專利第2,909,462號,其描述這類丙烯酸聚合物,與具有至少3個羥基基團之聚羥基化的化合物交聯,更佳的是不超過8個,至少三個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和脂肪族基團取代。較佳的基團是含有從2至4個碳原子的那些,例如乙烯基、烯丙基和其他烯族不飽和基團。不飽和基團本身可含有其他的取代基,如甲基。以卡伯波(Carbopol)之名販售的產物(BF Goodrich,Ohio,USA)是特別適合的。它們與烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交聯。其中,可能提及卡伯波974P、934P和971P。最佳的是使用卡伯波971P。在順丁烯二酸酐和鏈烯衍生物的共聚物中,共聚物EMA(Monsanto)是順丁烯二酸酐與乙烯的共聚物。這些聚合物溶解於水中,導致酸性溶劑,其將被中和至生理學pH值,以便得到佐劑溶液,將會在其中併入免疫原、免疫學或疫苗組合物本身。
更多適當的佐劑包括,但不限於RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、單磷醯基脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、得自大腸桿菌的熱-不穩定之腸毒素(重組或其他的)、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯基二肽等等。
較佳的是,以每個劑量大約100微克到大約10毫克的量加入佐劑。更佳的是,以每個劑量大約100微克到大約10毫克的量加入佐劑。再更佳的是,以每個劑量大約500微克到大約5毫克的量加入佐劑。再更佳的是,以每個劑量大約750微克到大約2.5毫克的量加入佐劑。最佳的是,以每個劑量大約1毫克的量加入佐劑。
因此,根據更進一步的觀點,製備誘發對抗PCV2之免疫反應的抗原組合物,像是例如疫苗的方法,包括i)製備並回收PCV2 ORF2蛋白質,並ii)將其與適當之佐劑混合。較佳的是,該佐劑為卡伯波971P。更佳的是,以每個劑量大約500微克到大約5毫克的量加入卡伯波971P,更佳的是以每個劑量大約750微克到大約2.5毫克的量,而最佳的是每個劑量大約1毫克的量。較佳的是,處理步驟i)包括如針對製備和回收PCV2 ORF2描述的處理步驟。例如,在該方法的較佳形式中,在轉移載體中獲得包括PCV2 ORF2 DNA的構築體。上文描述了適當的轉移載體和製備其之方法。該方法可視需要在將ORF2選殖到轉移載體內之前,含有經由PCR擴大來自PCV2品系之ORF2的步驟。較佳的開放編閱架構序列、Kozak's序列、3'EcOR1位置序列、重組蛋白質序列、轉移感染之構築體序列、培養基、細胞和病毒,如同在先前方法中描述的。該方法的其他任意步驟包括將經擴大之PCV2 ORF2 DNA選殖到第一個載體內,從該第一個載體中切下ORF2 DNA,並使用該切下的PCV2 ORF2 DNA進行選殖到轉移載體內。就像利用其他的方法一樣,最好是在藉著經轉移感染之桿狀病毒感染細胞之後,等待至少5天,然後才從上清液中回收重組ORF2蛋白質。較佳的是,該方法的回收步驟亦包括分離培養基與細胞和細胞碎屑的步驟。這可利用各種方式進行,但為了容易及便利,最好是通過具有孔隙範圍從大約0.45 μM至大約1.0 μM的濾紙過濾細胞、細胞碎屑和生長培養基。最後,對該方法而言,最好在組合物中混合回收之重組PCV2 ORF2蛋白質之前,包括病毒失活步驟。這可利用各種方式進行,但在實行本發明時最好是使用BEI。
因此,根據更進一步的觀點,該方法包括下列步驟:i)在活體外擴大PCV2 ORF2 DNA,其中修飾該PCV2 ORF2 DNA的側面序列,ii)將經擴大之PCV2 ORF2 DNA選殖到轉移載體內;並iii)將該轉移載體或其含有重組PCV2 ORF2 DNA的部分轉移感染到病毒載體內,產生重組的病毒載體,iv)以該轉移感染之病毒感染在培養基中的細胞;v)使該經轉移感染的病毒從PCV2 ORF2表現重組蛋白質;vi)分離細胞與上清液;vii)從上清液中回收已表現的PCV2 ORF2蛋白質;viii)使該重組病毒載體失活,較佳的是在大約1至大約20 mM BEI的存在下,最好是在大約5 mM BEI的存在下;ix)加入等量的中和劑,中和溶液中的失活劑,當失活劑為BEI時,較佳的是加入硫代硫酸鈉溶液至大約1到大約20 mM之終濃度,更佳的是大約5 mM;並x)加入適量的佐劑,較佳的是加入卡伯波,更佳的是卡伯波971P,再更佳的是以上述的量(例如,每個劑量大約500微克至大約5毫克,更佳的是以每個劑量大約750微克到大約2.5毫克的量,而最佳的是以每個劑量大約1毫克的量)。
此外,組合物亦可包括一或多個在藥學上可接受的載劑。當在本文中使用時,"在藥學上可接受之載劑"包括任何和所有的溶劑、分散介質、塗料、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑和抗針菌劑、等張劑、延遲吸收劑及其類似物。據此提供之組合物最好含有從在活體外培養之細胞的上清液中回收的PCV2 ORF2蛋白質,其中以含有PCV2 ORF2 DNA並表現PCV2 ORF2蛋白質的重組病毒載體感染該細胞,且其中以大約2至大約8 mM BEI處理該細胞培養物,最好是以大約5 mM BEI使病毒載體失活,以及相等濃度的中和劑,最好是硫代硫酸鈉溶液,至大約2大約8 mM的終濃度,較佳的是大約5 mM,卡伯波,更佳的是卡伯波971P,最好是以每個劑量大約500微克到大約5毫克的量,再更佳的是以每個劑量大約750微克到大約2.5毫克的量,而最佳的是以每個劑量大約1毫克的量,以及生理鹽水,較佳的是以大約50至大約90%(體積/體積)的量,更佳的是大約60至80%(體積/體積),再更佳的是大約70%(體積/體積)。
因此,更進一步之觀點係關於製備誘發對抗PCV2之免疫反應的抗原組合物,像是例如疫苗的方法,包括下列步驟:i)在活體外擴大PCV2 ORF2 DNA,其中修飾該PCV2 ORF2 DNA的側面序列,ii)將經擴大之PCV2 ORF2 DNA選殖到轉移載體內;並iii)將該轉移載體或其含有重組PCV2 ORF2 DNA的部分轉移感染到病毒載體內,產生重組的病毒載體,iv)以該轉移感染之病毒感染在培養基中的細胞;v)使該經轉移感染的病毒從PCV2 ORF2表現重組蛋白質;vi)分離細胞與上清液;vii)從上清液中回收已表現的PCV2 ORF2蛋白質;viii)使該重組病毒載體失活,較佳的是在大約2至大約20 mM BEI的存在下,最好是在大約5 mM BEI的存在下;ix)加入等量的中和劑,中和溶液中的失活劑,當失活劑為BEI時,較佳的是加入硫代硫酸鈉溶液至大約0.5到大約20 mM之終濃度,更佳的是大約5 mM;x)加入適量的佐劑,較佳的是加入卡伯波,更佳的是卡伯波971P,再更佳的是以上述的量(例如,每個劑量大約500微克至大約5毫克,更佳的是以每個劑量大約750微克到大約2.5毫克的量,而最佳的是以每個劑量大約1毫克的量);並xi)加入生理鹽水,較佳的是以大約50至大約90%(體積/體積)的量,更佳的是大約60至80%(體積/體積),再更佳的是大約70%(體積/體積)。該方法亦可視需要包括加入保護劑。當在本文中使用保護劑時,意指抗-微生物的活性製劑,像是例如健大黴素、硫柳汞及其類似物。特別是對於製備多-劑量組合物而言,最好加入保護劑。以有效防止感興趣之組合物被任何微生物污染,或抑制任何微生物在感興趣之組合物中生長的濃度,加入那些抗-微生物的活性製劑。
再者,該方法亦可包括加入任何穩定劑,像是例如醣類、海藻糖、甘露糖醇、蔗糖及其類似物,以便增加及/或維持產物的壽命。然而,已經意外地發現,不加任何更多的穩定劑,所得的調配物亦具有免疫效力超過至少24個月。
本發明更進一步之觀點係關於起因於上述方法的產物。特定而言,本發明係關於包括重組表現之PCV2 ORF2蛋白質之物質的組合物。此外,本發明亦關於包括從昆蟲細胞培養物之上清液中回收的重組表現之PCV2 ORF2蛋白質之物質的組合物。再者,本發明亦關於包括從昆蟲細胞培養物之上清液中回收的重組表現之PCV2 ORF2蛋白質之物質的組合物。較佳的是,該物質之組合物亦包括適合使病毒載體失活的製劑。較佳的是,該失活劑為BEI。此外,本發明亦關於包括從昆蟲細胞培養物之上清液中回收的重組表現之PCV2 ORF2蛋白質,並包括適合使病毒載體失活之製劑,最好是BEI,以及中和該失活劑的中和劑之物質的組合。較佳的是,當使用BEI作為失活劑時,該中和劑是硫代硫酸鈉。
在本發明另一項觀點中,提供免疫組合物,其誘導免疫反應,且更佳的是賦予對抗PCV2感染之臨床症狀的保護性免疫力。該組合物通常包括由PCV2之開放編閱架構2(ORF2)表現的多肽或其片段,作為該組合物的抗原性組份。
PCV2 ORF2 DNA和蛋白質,當在本文中用來製備組合物,且亦用在據此提供之製程中時,是在PCV2分離株中高度保留的功能部位,並因此任何的PCV2 ORF2,在作為本文中使用之PCV ORF2 DNA及/或多狀的來源時,都將是有效的。較佳的PCV2 ORF2蛋白質是SEQ ID NO:11。較佳的PCV2 ORF2多肽是在本文中以SEQ ID NO:5提供的,但熟諳此藝者了解該序列在序列同種性上,可以有6-10%那麼多的改變,卻仍保有抗原特徵,使其得以用在免疫組合物中。免疫組合物的抗原特徵,可藉著例如由實例4提供之攻毒實驗來評估。此外,與由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之多核苷酸序列編碼的PCV2 ORF2蛋白質相比較,當經修飾之抗原賦予至少70%,較佳的是80%,更佳的是90%保護性免疫力時,仍保留了該經修飾抗原的抗原特徵。當在本文中使用"免疫組合物"時,意指PCV2 ORF2蛋白質在宿主中誘發了"免疫反應",該反應為對PCV2 ORF2蛋白質之細胞及/或抗體-調解的免疫反應。較佳的是,該免疫組合物能夠賦予對抗PCV2感染,以及與其有關之臨床症狀的保護性免疫力。在某些形式中,使用PCV2 ORF2蛋白質的免疫原部分作為組合物中的抗原性組份。當在本文中使用"免疫原部份"一詞時,意指截短的及/或取代的形式,或PCV2 ORF2蛋白質及/或多核苷酸各自的片段。較佳的是,這類截短及/或取代的形式或片段,將包括來自全長ORF2多肽的至少6個相鄰胺基酸。更佳的是,截短及/或取代的形式或片段,將具有來自全長ORF2多肽的至少10個,更佳的是至少15個,而再更佳的是至少19個相鄰胺基酸。就這一點,在本文中以SEQ ID NO:9和10提供兩個較佳的序列。更明瞭這類序列可能是較大片段或截短形式的一部分。在本文中提供之較佳PCV2 ORF2多狀是由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之核苷酸序列編碼。但熟諳此藝者亦了解該序列在序列同種性上,可以有6-20%那麼多的改變,卻仍保有抗原特徵,使其得以用在免疫組合物中。在某些形式中,使用截短或取代形式,或ORF2之片段作為組合物中的抗原性組份。較佳的是,這類截短或取代形式或片段將包括來自全長ORF2核苷酸序列,例如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的至少18個相鄰核苷酸。更佳的是,該截短或取代形式或片段將具有來自全長ORF2核苷酸序列,例如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的至少30個,更佳的是至少45個,而再更佳的是至少57個相鄰核苷酸。
在此項技藝中已知的"序列同一性",意指在二或多個多肽序列或二或多個多核苷酸序列之間的關係,即參考序列和與欲該參考序列進行比較而給予的序列。藉著在將序列最適切地排列成一直線,產生最高程度的序列類似性之後,比較所給之序列與參考序列,藉著判定在這類序列串之間的相配,來判定序列同一性。當進行這類排列時,以位置-對-位置為基礎來探查序列同一性,例如若在某個位置,核苷酸或胺基酸殘基是相同的,則序列在該特定位置是"相同的"。然後將這類位置的總數除以參考序列中核苷酸或殘基的總數,得到序列同一性%。可由已知的方法迅速地計算出序列同一性,包括但不限於在電腦化分子生物學(Computational Molecular Biology),Lesk,A.N.,編輯,Oxford University Press,New York(1988),生物計算:資訊與基因組具體化(Biocomputing:Informatics and Genome Projects),Smith,D.W.編輯,Academic Press,New York(1993);序列數據的電腦分析(Computer Analysis of Sequence Data),第I部,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.編輯,Humana Press,New Jersey(1994);分子生物學的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology),von Heinge,G.,Academic Press(1987);序列分析引子(Sequence Analysis Primer),Gribskov,M.和Devereux,J.編輯,M.Stockton Press,New York(1991);以及Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中描述的那些,將其教學內容以引用的方式併入本文中。設計判定序列同一性的較佳方法,在受試序列之間得到最大的相配。在可公開獲得的電腦程式中,將判定序列同一性的方法成文化,其判定在所給序列之間的序列同一性。這類程式的實例包括,但不限於GCG套裝程式(Devereux,J.編輯,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。可公開獲自NCBI和其他來源的BLASTX程式(BLAST手冊,Altschul,S.等人,NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990),將其教學內容以引用的方式併入本文中)。這些程式使用缺席間隙重,將序列適切地排列,以便在所給予和參考序列之間產生最高程度的序列同一性。舉例來說,具有與參考核苷酸序列有至少例如85%,更佳的是90%,再更佳的是95%"序列同一性"之核苷酸序列的多核苷酸,企圖表示所給之多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同,除了所給之多核苷酸序列可能對每100個參考核苷酸序列之核苷酸,包括高達15個,較佳的是高10個,更佳的是高達5個點突變。換句話說,在對於參考核苷酸序列具有至少有85%,更佳的是90%,再更佳的是95%同一性之核苷酸序列的多核苷酸中,在參考序列中有高達15%,更佳的是10%,再更佳的是5%的核苷酸可能被刪除或以其他核苷酸取代,或可能有參考序列之核苷酸總數的高達15%,更佳的是10%,再更佳的是5%的核苷酸,被插入該參考序列中。參考序列的這些突變可發生在參考核苷酸序列的5'或3'終端位置,或在那些終端位置之間的任何地方,在參考序列中個別地點綴於核苷酸之間,或在參考序列內一或多個相鄰群中。同樣地,具有與參考胺基酸序列有至少例如85%,更佳的是90%,再更佳的是95%序列同一性之所給胺基酸序列的多肽,企圖表示所給之多肽的胺基酸序列與參考序列相同,除了所給之多肽序列可能對每100個參考胺基酸序列之胺基酸,包括高達15個,較佳的是高10個,更佳的是高達5個胺基酸改變。換句話說,獲得對參考胺基酸序列至少有85%,更佳的是90%,再更佳的是95%序列同一性的所給之多肽序列,在參考序列中有高達15%,更佳的是10%,再更佳的是5%的胺基酸殘基可能被刪除或以其他胺基酸取代,或可能有參考序列之胺基酸殘基總數的高達15%,更佳的是10%,再更佳的是5%的胺基酸殘基,被插入該參考序列中。參考序列的這些改變可發生在參考胺基酸序列的胺基或羧基終端位置,或在那些終端位置之間的任何地方,在參考序列中個別地點綴於殘基之間,或在參考序列內一或多個相鄰群中。較佳的是不相同的殘基位置,是因保留性胺基酸置換而有差異。然而,在判定序列同一性時,相配並不含保留性置換。
當在本文中使用時,"序列同種性"意指判定兩個序列之同族關係的方法。欲判定序列同種性,適切地排列二或多個序列,若需要則導入間隙。然而,與"序列同一性"相反,在判定序列同種性時,將保留性置換視為相配。換句話說,獲得多肽或多核苷酸對參考序列有95%序列同種性,在參考序列中有85%,更佳的是95%,再更佳的是95%的胺基酸殘基或核苷酸必須是相配的,或包括利用另一個胺基酸或核苷酸的保留性置換,或可能有參考序列中之胺基酸殘基或核苷酸總數的高達15%,更佳的是10%,再更佳的是5%的胺基酸或核苷酸,不包括保留性置換,被插入該參考序列內。較佳的同種序列包括至少一片50個,更佳的是100個,再更佳的是250個,再更佳的是500個核苷酸。
"保留性置換"意指以具有類似特徵或性質,包括尺寸、忌水性等等的另一個胺基酸殘基或核苷酸,取代一胺基酸殘基或核苷酸,使得整體的功能沒有顯著的改變。
"經分離的"意指"藉著人手"而與其天然狀態有所改變,即若其出現在自然界,則已經改變或從其原始環境中移出,或兩者。例如當在本文中使用該名詞時,天然存在於活生物中的多核苷酸或多肽,不是"經分離的",但與其天然狀態之共存物質分開的相同多核苷酸或多肽就是"經分離的"。
因此,本發明更進一步的觀點係關於可有效降低與PCV2感染有關之臨床症狀的嚴重性的免疫組合物,包括PCV2 ORF2蛋白質。較佳的是,該PCV2 ORF2蛋白質是上述那些中的任一個。較佳的是,該PCV2 ORF2蛋白質為i)包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11之序列的多肽;ii)與i)之多肽至少80%同種的任何多肽;iii)i)及/或ii)之多肽的任何免疫原部份;iv)iii)的免疫原部分,包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11之序列中所含有的至少10個相鄰胺基酸,v)由包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之序列的DNA編碼的多肽,vi)由對v)之多核苷酸至少80%同種的多核苷酸編碼的任何多肽,vii)由v)及/或vi)之多核苷酸編碼之多肽的任何免疫原部分,viii)vii)之免疫原部分,其中編碼該免疫原部分的多核苷酸包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之序列中所含有的至少30個相鄰核苷酸。
那些免疫原部分中任一個,最好都具有由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之序列編碼之PCV2 ORF2蛋白質的免疫原特徵。
根據更進一步的觀點,在免疫組合物中提供的PCV2 ORF2蛋白質,所含有之抗原量可有效誘導想要的免疫反應,即降低起因於PCV2感染之臨床症狀的發生率或減少其嚴重性。較佳的是,所含有之PCV2 ORF2蛋白質的量,至少是0.2微克抗原/毫升之終免疫組合物(微克/毫升),更佳的是從大約0.2到大約400微克抗原/毫升的終免疫組合物,再更佳的是從大約0.3到大約200微克抗原/毫升,再更佳的是從大約0.35到大約100微克/毫升,再更佳的是從大約0.4到大約50微克/毫升,再更佳的是從大約0.45到大約30微克/毫升,再更佳的是從大約0.6到大約15微克/毫升,再更佳的是從大約0.75到大約8微克/毫升,再更佳的是從大約1.0到大約6微克/毫升,再更佳的是從大約1.3到大約3.0微克/毫升,再更佳的是從大約1.4到大約2.5微克/毫升,再更佳的是從大約1.5到大約2.0微克/毫升,而最佳的是大約1.6微克/毫升。
根據更進一步的觀點,所含有之ORF2抗原量為每個劑量終抗原組合物至少0.2微克PCV2 ORF2蛋白質(微克/劑量),如同上述,較佳的是從大約0.2到大約400微克/劑量,更佳的是從大約0.3到大約200微克/劑量,再更佳的是從大約0.35到大約100微克/劑量,再更佳的是從大約0.4到大約50微克/劑量,再更佳的是從大約0.45到大約30微克/劑量,再更佳的是從大約0.6到大約15微克/劑量,再更佳的是從大約0.75到大約8微克/劑量,再更佳的是從大約1.3到大約3.0微克/劑量,再更佳的是從大約1.4到大約2.5微克/劑量,再更佳的是從大約1.5到大約2.0微克/劑量,而最佳的是大約1.6微克/劑量。
用在根據本發明之免疫組合物中的PCV2 ORF2多肽,可利用任何方式衍生,包括PCV2 ORF2的分離和純化、標準蛋白質合成和重組方法學。在上文中描述了獲得PCV2 ORF2多肽的較佳方法,亦在美國專利申請案第11/034,797號中提供,將其教學及內容以引用的方式併入本文中。簡言之,以含有PCV2 ORF2 DNA密碼序列的重組病毒載體感染易感染的細胞,由重組病毒表現PCV2 ORF2多肽,並藉著過濾從上清液中回收已表現的PCV2 ORF2多肽,並藉著任何傳統方法使其失活,最好是使用二元氮丙啶,然後將其中和,中止該失活過程。
因此,根據更進一步的觀點,該免疫組合物包括i)任何上述的PCV2 ORF2蛋白質,最好是以上述之濃度,以及ii)至少一部分表現該PCV2 ORF2蛋白質的病毒載體,最好是重組的桿狀病毒。此外,根據更進一步的觀點,該免疫組合物包括i)任何上述的PCV2 ORF2蛋白質,最好是以上述之濃度,ii)至少一部分表現該PCV2 ORF2蛋白質的病毒載體,最好是重組的桿狀病毒,以及iii)一部分的細胞培養物上清液。
根據PCV2 ORF2蛋白質之產生和回收製程的一特殊具體實施例,通過具有孔隙尺寸最好在大約0.45到1微米之間的膜過濾細胞培養物上清液。因此,更進一步的觀點係關於免疫組合物,其包括i)任何上述的PCV2 ORF2蛋白質,最好是以上述的濃度,ii)至少一部分表現該PCV2 ORF2蛋白質的病毒載體,最好是重組的桿狀病毒,以及iii)一部分細胞培養物;其中大約90%的組份具有小於1微米之尺寸。
根據更進一步的觀點,本發明係關於免疫組合物,其包括i)任何上述的PCV2 ORF2蛋白質,最好是以上述的濃度,ii)至少一部分表現該PCV2 ORF2蛋白質的病毒載體,iii)一部分細胞培養物,以及iv)使重組病毒載體失活的失活劑,最好是BEI,其中大約90%的組份i)至iii)具有小於1微米之尺寸。較佳的是,BEI以有效使桿狀病毒失活的濃度存在。上文描述了有效濃度。
根據更進一步的觀點,本發明係關於免疫組合物,其包括i)任何上述的PCV2 ORF2蛋白質,最好是以上述的濃度,ii)至少一部分表現該PCV2 ORF2蛋白質的病毒載體,iii)一部分細胞培養物,iv)使重組病毒載體失活的失活劑,最好是BEI,以及v)中止由該失活劑調節之失活作用的中和劑,其中大約90%的組份i)至iii)具有小於l微米之尺寸。較佳的是,若失活劑是BEI,則該組合物包括與BEI等量的硫代硫酸鈉。
將多肽併入組合物內,可將其投與易感受PCV2感染的動物。在較佳的形式中,組合物亦可含有熟諳此藝者已知的額外組份(亦參見Remington's Pharmaceutical Sciences.(1990)。第18版Mack Publ.,Easton)。此外,該組合物亦可含有一或多種在獸醫學上可接受的載劑。當在本文中使用時,"在獸醫學上可接受之載劑"包括任何和全部的溶劑、分散介質、塗料、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌和抗真菌劑、等張劑、延遲吸收之製劑,及其類似物。
在較佳的具體實施例中,免疫組合物包括據此提供之PCV2 ORF2蛋白質,最好是以上述之濃度,作為抗原性組份,將其與佐劑,最好是卡伯波,以及生理鹽水混合。
熟諳此藝者將了解,在本文中之組合物可併入已知的注射用、在生理學上可接受的無菌溶液。為了製備可隨即使用的非經腸注射或輸液用的溶液,可迅速獲得等張水溶液,像是例如生理鹽水或與血漿一致的蛋白質溶液。此外,本發明的免疫和疫苗組合物亦可包括稀釋劑、等張劑、穩定劑或佐劑。稀釋劑可包括水、生理鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及其類似物。等張劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖等等。穩定劑包括白蛋白和乙二胺四乙酸的鹼金屬鹽類等等。適當的佐劑則是上述的那些。最好是使用卡伯波,特別是卡伯波971P,最好是以上述的量(例如每個劑量大約500微克到大約5毫克,更佳的是以每個劑量大約750微克到大約2.5毫克,而最佳的是以每個劑量大約1毫克的量)。
因此,本發明亦關於免疫組合物,其包括i)任何上述的PCV2 ORF2蛋白質,最好是以上述的濃度,ii)至少一部分表現該PCV2 ORF2蛋白質的病毒載體,iii)一部分細胞培養物,iv)使重組病毒載體失活的失活劑,最好是BEI,以及v)中止由該失活劑調節之失活作用的中和劑,最好是與BEI等量的硫代硫酸鈉;以及vi)適當的佐劑,最好是以上述含量的卡伯波;其中大約90%的組份i)至iii)具有小於1微米之尺寸。根據更進一步的觀點,該免疫組合物更包括在藥學上可接受的鹽類,最好是為生理學可接受之濃度的磷酸鹽。較佳的是,將該免疫組合物的pH值調整到生理學的pH值,也就是在大約6.5到7.5之間。
因此,本發明亦關於免疫組合物,其每毫升包括i)至少1.6微克上述的PCV2 ORF2蛋白質,ii)至少一部分表現該PCV2 ORF2蛋白質的桿狀病毒,iii)一部分細胞培養物,iv)大約2到大約8 mM的BEI,v)與BEI等量的硫代硫酸鈉;以及vi)大約1毫克的卡伯波971,以及vii)在生理學上可接受之濃度的磷酸鹽;其中大約90%的組份i)至iii)具有小於1微米之尺寸,並將該免疫組合物的pH值調整到大約6.5至7.5。
該免疫組合物更可包括一或多個其他的免疫調節劑,像是例如介白素、干擾素或其他的細胞激動素。免疫組合物亦可包括健大黴素和硫柳汞。在本發明前後文中使用之佐劑和添加物的量與濃度,可由熟諳此藝者迅速地判定,本發明期待包括從大約50微克到大約2000微克佐劑的組合物,且最好是大約250微克/毫升劑量之疫苗組合物。在其他較佳的具體實施例中,本發明期待包括從大約1微克/毫升到大約60微克/毫升之抗生素的疫苗組合物,更佳的是低於大約30微克/毫升之抗生素。
因此,本發明亦關於免疫組合物,其包括i)任何上述的PCV2 ORF2蛋白質,最好是以上述的濃度,ii)至少一部分表現該PCV2 ORF2蛋白質的病毒載體,iii)一部分細胞培養物,iv)使重組病毒載體失活的失活劑,最好是BEI,以及v)中止由該失活劑調節之失活作用的中和劑,最好是與BEI等量的硫代硫酸鈉;vi)適當的佐劑,最好是以上述之含量的卡伯波971,vii)在藥學上可接受之濃度的生理鹽水緩衝溶液,最好是磷酸鹽,以及viii)抗-微生物活性劑;其中大約90%的組份i)至iii)具有小於1微米之尺寸。
已經意外地發現,據此提供的免疫組合物在24個月的期間內是高度穩定的。亦已經發現據此提供的免疫組合物,包括據此提供之表現PCV2 ORF2蛋白質的重組桿狀病毒,其在降低與PCV2感染有關之臨床症狀上是極為有效的。已經意外地發現,包括據此提供之表現PCV2 ORF2蛋白質之重組桿狀病毒的免疫組合物,比包括失活形式之整個PCV2病毒,或經分離之病毒PCV2 ORF2抗原的免疫組合物更有效。特定而言,已經意外地發現表現PCV2 ORF2蛋白質之重組桿狀病毒,在極低濃度下是有效的,這意指最多0.25微克/劑量的濃度。PCV2 ORF2蛋白質令人意外的高免疫效力,可藉著加入卡伯波而使其更增加。
更進一步之觀點係關於包括至少一個劑量的據此提供之PCV2 ORF2蛋白質的免疫組合物的容器,其中一個劑量包括至少2微克PCV2 ORF2蛋白質,較佳的是2至16微克PCV2 ORF2蛋白質。該容器可包括從1至250個劑量的免疫組合物,較佳的是含有1、10、25、50、100、150、200或250個劑量的PCV2 ORF2蛋白質之免疫組合物。較佳的是,每個容器包括一個以上劑量的PCV2 ORF2蛋白質之免疫組合物,更包括抗-微生物的活性製劑。那些製劑為例如抗生素,包括健大黴素和硫柳汞,及其類似物。因此,本發明一方面係關於包括從1到250個劑量的PCV2 ORF2蛋白質之免疫組合物的容器,其中一個劑量包括至少2微克PCV2 ORF2蛋白質和健大黴素及/或硫柳汞,最好是從大約1微克/毫升到大約60微克/毫升的抗生素,較佳的是低於大約30微克/毫升。
更進一步的觀點係關於套組,其包括上述的任何容器,以及說明手冊,包括肌肉內施用至少一個劑量的PCV2 ORF2蛋白質之免疫組合物至小豬內的資訊,減少與PCV2感染有關之臨床症狀的嚴重性。此外,根據更進一步的觀點,該說明手冊包括第二次或更多次投與至少一個劑量的PCV2 ORF2蛋白質之免疫組合物的資訊,其中第二次投藥或任何更多次投藥是超過最初或任何前次投藥至少14天。較佳的是,該說明手冊亦包括投與免疫刺激物的資訊。較佳的是,該免疫刺激物應給予至少兩次。在免疫刺激物的第一和第二次投藥,或任何更多次投藥之間,較佳的是至少3天,更佳的是至少5天,再更佳的是至少7天。較佳的是,在超過最初投與PCV2 ORF2蛋白質之免疫組合物至少10天,更佳的是15天,再更佳的是20天,再更佳的是至少22天,給予免疫刺激物。較佳的免疫刺激物是例如鎖孔血藍蛋白(KLH),最好是以不完全福瑞德氏(Freund's)佐劑乳化(KLH/ICFA)。然而,當然可使用熟諳此藝者已知的任何其他的免疫刺激物。當在本文中使用"免疫刺激物"時,意指任何可誘發普通免疫反應的製劑或組合物,最好是不發動或增加專一的免疫反應,例如對抗特定病原體的免疫反應。進一步教導以適當之劑量投與免疫刺激物。再者,套組亦可包括一容器,其包括至少一個劑量的免疫刺激物,最好是一個劑量的KLH或KLH/ICFA。
此外,亦已經意外地發現,可藉著投與IngelVac PRRS MLV疫苗,進一步提高包括表現PCV2 ORF2蛋白質之重組桿狀病毒的免疫組合物,特別是與卡伯波併用時的免疫原效力(參見實例5)。當出現PRRS感染時,大大地擴大了PCV2臨床症狀和疾病徵候。然而,據此提供之免疫組合物和接種疫苗的策略,大大地減少了該影響,並且比預期得更多。換句話說,當以任何據此提供之PCV2 ORF2免疫組合物和Ingelvac PRRS MLV疫苗(Boehringer Ingelheim)處理動物,最好是豬時,觀察到意想不到的協同效果。
因此,本發明更進一步的觀點係關於上述之套組,包括據此提供之PCV2 ORF2的免疫組合物和說明手冊,其中該說明手冊更包括投與PCV2 ORF2免疫組合物,連同或與包括PRRS抗原,較佳的是佐劑化之PRRS抗原的免疫組合物大約同時的資訊。該PRRS抗原最好是IngelVacPRRS MLV(Boehringer Ingelheim)。
本發明更進一步的觀點亦關於套組,其包括i)含有至少一個劑量的據此提供之PCV2 ORF2的免疫組合物的容器,以及ii)含有包括PRRS抗原,最好是佐劑化的PRRS抗原之免疫組合物的容器。該PRRS抗原最好是IngelVacPRRS MLV(Boehringer Ingelheim)。更佳的是,該套組更包括說明手冊,包括投與兩種醫藥組合物的資訊。較佳的是,它包含在含有PRRS的組合物之前,投與含有PCV2 ORF2之組合物的資訊。
更進一步的觀點,係關於任何據此提供之組合物在作為醫藥品,較佳的是作為獸醫醫藥品,更佳的是作為疫苗的用途。再者,本發明亦關於任何在本文中描述之組合物在製備醫藥品上的用途,該醫藥品係用以減少與PCV2感染有關之臨床症狀的嚴重性。較佳的是,該醫藥品是用來預防PCV2感染,更佳的是在小豬中。
更進一步的觀點係關於(i)預防感染或再-感染PCV3,或(ii)在個體中降低或排除由PCV2引起之臨床症狀的方法,包括對需要其之個體投與任何據此提供之免疫組合物。較佳的是,該個體是豬。較佳的是,肌肉內投與該免疫組合物。較佳的是,投與一或兩個劑量的免疫組合物,其中一個劑量包括至少大約2微克PCV2 ORF2蛋白質,更佳的是大約2到大約16微克,以及至少大約0.1到大約5毫克卡伯波,較佳的是大約1毫克卡伯波。更進一步的觀點係關於如上述之治療方法,其中投與第二次免疫組合物。較佳的是,第二次投藥是利用相同的免疫組合物來進行,最好具有相同量的PCV2 ORF2蛋白質。第二次投藥最好亦以肌肉內給予。較佳的是,第二次投藥在超過最初投藥至少14天進行,更佳的是超過最初投藥至少4週。
根據更進一步的觀點,治療方法亦包括投與免疫刺激物。較佳的是,投與該免疫刺激物至少兩次。在免疫刺激物的第一和第二次投藥之間,較佳的是至少3天,更佳的是至少5天,再更佳的是至少7天。較佳的是,在超過最初投與PCV2 ORF2蛋白質之免疫組合物至少10天,更佳的是15天,再更佳的是20天,再更佳的是至少22天,給予免疫刺激物。較佳的免疫刺激物是例如鎖孔血藍蛋白(KLH),最好是以不完全福瑞德氏佐劑乳化(KLH/ICFA)。然而,當然可使用熟諳此藝者已知的任何其他的免疫刺激物。以適當的劑量投與免疫刺激物,亦在熟諳此藝者的普通知識範圍內。
根據更進一步的觀點,上述之治療方法亦包括投與PRRS抗原。較佳的PRRS抗原為IngelVacPRRS MLV(Boehringer Ingelheim)。較佳的是,在時間上在超過投與PCV2 ORF2蛋白質之免疫組合物,投與該PRRS抗原。
根據更進一步的觀點,本發明提供多價混合疫苗,其包括有效降低PCV2感染之發生率或減少其嚴重性的免疫學製劑,以及至少一種具有免疫原活性之組份,對抗其他在豬引起疾病的生物。
特定而言,有效降低PCV2感染之發生率或減少其嚴重性的免疫學製劑為PCV2抗原。較佳的是,該PCV2抗原是據此提供之PCV2 ORF2蛋白質,或任何上述的免疫組合物,其包括PCV2 ORF2蛋白質。
然而,據此了解PCV2抗原亦意指物質之任何組合物,當投與豬時,該物質包括至少一個可誘導、刺激或提高對抗PCV2感染之免疫反應的抗原。較佳的是,該PCV2抗原是完整的PCV2病毒,最好為失活形式、活的但經修飾或減毒的PCV2病毒、嵌合型病毒,其包括至少一個PCV2的免疫原胺基酸序列,任何其他的多肽或組份,其包括至少一個PCV2的免疫原胺基酸序列。當在本文中使用"免疫原蛋白質"、"免疫原多肽"或"免疫原胺基酸序列"一詞時,意指任何的胺基酸序列,其在宿主中誘發對抗包括該免疫原蛋白質、免疫原多肽或免疫原胺基酸序列之病原體的免疫反應。當在本文中使用"免疫原蛋白質"、"免疫原多肽"或"免疫原胺基酸序列"一詞時,包括任何蛋白質的全長序列、其類似物或其免疫原片段。"免疫原片段"意指一蛋白質中含有一或多個抗原決定位的片段,並因此誘發對抗相關病原體的免疫反應。可使用此項技藝中已熟知的許多抗原決定位作圖技術中的任一種,來確認這類片段。參見,例如分子生物學方法中的抗原決定位作圖草案(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology),第66冊(Glenn E.Morris,編輯,1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。例如,可藉著例如在固體支撐物上同時合成大量的肽,這些肽相當於蛋白質分子的部分,並使該肽與抗體反應,同時該肽仍附接在支撐物上,來判定直線的抗原決定位。這類技術為此項技藝中已知的,並在例如美國專利第4,708,871號;Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002;Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715中描述。同樣的,藉著判定胺基酸的空間構形,例如藉著x-光結晶術和2-維核磁共振,迅速地確認構形上的抗原決定位。參見,例如抗原決定位作圖草案,在前。亦將合成的抗原納入定義內,例如多肽、側面的抗原決定位和其他重組或以合成方式衍生的抗原。參見,例如Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781;Bergmann等人(1996),J.Immunol.157:3242-3249;Suhrbier,A.(1997),Immunol.and Cell Biol.75:402-408;Gardner等人,(1998)12th World AIDS Conference,Geneva,Switzerland,6月28日-7月3日,1998。
根據更進一步的具體實施例,該PCV-2抗原是CircoFLEX(Boehringer Ingelheim Vetmedica inc,St Joseph,MO,USA)、CircoVac(Merial SAS,Lyon,France)、CircoVent (Intervet Inc.,Millsboro,DE,USA)或Suvaxyn PCV-2單劑(Fort Dodge Animal Health,Kansas City,KA,USA)。
對組合物或疫苗的"免疫學或免疫反應"是在宿主中發展出對抗感興趣之組合物或疫苗的細胞及/或抗體-調解之免疫反應。通常,"免疫反應"包括但不限於一或多個下列影響:專一地針對在感興趣之組合物或疫苗中所含有之抗原或抗原們,產生或激活抗體、B細胞、協助者T細胞、抑制性T細胞,及/或胞毒性T細胞及/或yd T細胞。較佳的是,宿主將展現出治療性或預防性的免疫反應,而得以提高對新感染的抵抗力,及/或降低疾病的臨床嚴重性。將藉著降低或缺少與宿主感染有關的上述症狀,來證明這類保護。
較佳的是,引起豬其他疾病之生物係選自下列所組成之群:胸膜肺炎放線桿菌(1);腺病毒(2);α
病毒,如東方馬腦脊髓炎病毒(3);支氣管敗血性博氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)(4);短螺旋體屬(5),較佳的是豬赤痢短螺旋體(6);多毛結腸短螺旋體(7),豬布氏桿菌,較佳的是生物型1、2和3(8);古典型豬瘟病毒(9);梭菌屬(10),較佳的是艱難梭狀芽胞桿菌(11)、產氣莢膜梭菌A、B和C型(12)、諾維氏梭菌(13)、敗血梭菌(14)、破傷風梭菌(15);冠狀病毒(16),較佳的是豬呼吸道冠狀病毒(17);豬附紅血球體(18);豬丹毒桿菌(19);大腸桿菌(20);副豬嗜血桿菌,較佳的是亞型1、7和14(21);血凝性腦脊髓炎病毒(22);日本腦炎病毒(23);胞內勞森氏菌(24);鈎端螺旋體屬(25),較佳的是澳洲鈎端螺旋體(26);犬鈎端螺旋體(27);感冒傷寒性鈎端螺旋體(28);出血性黃疸鈎端螺旋體(29);問號鈎端螺旋體(30);波莫納鈎端螺旋體(31);塔拉索夫鈎端螺旋體(32);分枝桿菌屬(Mycobacterium spp.)(33),較佳的是鳥分枝桿菌(34)、胞內分枝桿菌(35)和牛分枝桿菌(36);肺炎黴漿菌(M hyo)(37);敗血性巴氏桿菌(38);豬細胞巨大病毒(39);豬細小病毒(40);豬繁殖與呼吸徵候群(PRRS)病毒(41);假性狂犬病病毒(42);輪狀病毒(43);沙門氏桿菌屬(44),較佳的是鼠傷寒沙門氏桿菌(45)和豬霍亂沙門氏桿菌(46);豬葡萄球菌(47);葡萄球菌屬(48),較佳的是鏈球菌屬(49),較佳的是豬鏈球菌(50);豬疱疹病毒(51);豬流感病毒(52);豬痘病毒(53);豬痘病毒(54);水泡性口炎病毒(55);豬水疱疹病毒(56);哈究鈎端螺旋體(57)及/或豬滑液黴漿菌(58)。
在下文中提到與豬病原體有關的任何事情時,可以稱呼該病原體,例如M.hyo,或引用可在上文中找到之該病原體後面()內的編號。例如,在提到肺炎黴漿菌時,可用M.hyo或(37)。
因此,本發明係關於用來治療及/或預防豬的組合疫苗,其包括降低PCV2感染之發生率或減少其嚴重性的免疫學製劑,較佳的是PCV2抗原,以及有效治療及/或預防由任何豬病原體(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(25)、(26)、(27)、(28)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)、(34)、(35)、(36)、(37)、(38)、(39)、(40)、(41)、(42)、(43)、(44)、(45)、(46)、(47)、(48)、(49)、(50)、(51)、(52)、(53)、(54)、(55)、(56)、(57)及/或(58)引起之感染的免疫學活性組份,或該豬病原體(群)的免疫活性組份。[combo 1]
。
當在本文中使用"免疫活性組份"時,意指在投與該組份之動物中誘導或刺激免疫反應的組份。根據較佳的具體實施例,該免疫反應係針對該組份或包括該組份之微生物。根據更佳的具體實施例,免疫活性組份是減毒的微生物,包括經修飾的活病毒(MLV)、殺死的-微生物,或至少是微生物的免疫活性部分。
當在本文中使用"微生物的免疫活性部分",意指微生物之含有蛋白質-、糖-及/或糖蛋白的部分,其包括至少一個在投與該組份之動物中誘導或刺激免疫反應的抗原。根據更佳的具體實施例,該免疫反應係針對該微生物的免疫活性部分,或包括該免疫活性部分的微生物。
較佳的是,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(41)引起的感染,或是豬病原體(41)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(37)引起的感染,或是豬病原體(37)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(1)引起的感染,或是豬病原體(1)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(7)引起的感染,或是豬病原體(7)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(24)引起的感染,或是豬病原體(24)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(38)引起的感染,或是豬病原體(38)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(21)引起的感染,或是豬病原體(21)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(40)引起的感染,或是豬病原體(40)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(2)引起的感染,或是豬病原體(2)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(44)引起的感染,或是豬病原體(44)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(50)引起的感染,或是豬病原體(50)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(19),更佳的是(20)及/或(21)引起的感染,或是豬病原體(19),更佳的是(20)及/或(21)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(22)引起的感染,或是豬病原體(22)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(41)和(37)引起的感染,或是豬病原體(41)和(37)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(1)和(41)引起的感染,或是豬病原體(1)和(41)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(1)和(37)引起的感染,或是豬病原體(1)和(37)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(1)、(41)和(37)引起的感染,或是豬病原體(1)、(41)和(37)的免疫活性組份。在較佳的形式中,以卡伯波將該組合佐劑化。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(1)和(21)引起的感染,或是豬病原體(1)和(21)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(21)和(41)引起的感染,或是豬病原體(21)和(42)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(21)和(37)引起的感染,或是豬病原體(21)和(37)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(21)和(38)引起的感染,或是豬病原體(21)和(38)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(7)和(19)引起的感染,或是豬病原體(7)和(19)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(38)和(33),更佳的是(34)、(35)及/或(36)引起的感染,或是豬病原體(38)和(33),更佳的是(34)、(35)及/或(36)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(49),更佳的是(50)和(21)引起的感染,或是豬病原體(49),更佳的是(50)和(21)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(49),更佳的是(50)、(20)和(21)引起的感染,或是豬病原體(49),更佳的是(50)、(20)和(21)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(49),更佳的是(50)、(20)和(21)引起的感染,或是豬病原體(49),更佳的是(50)、(20)和(21)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(49),更佳的是(50)、(20)、(38)和(21)引起的感染,或是豬病原體(49),更佳的是(50)、(20)、(38)和(21)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(49),更佳的是(50)、(20)、(33)和(21)引起的感染,或是豬病原體(49),更佳的是(50)、(20)、(33)和(21)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(49),更佳的是(50)、(20)、(38)、(33)和(21)引起的感染,或是豬病原體(49),更佳的是(50)、(20)、(38)、(33)和(21)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(41)、(40)和(19)引起的感染,或是豬病原體(41)、(40)和(19)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(38)、(4)和(19)引起的感染,或是豬病原體(38)、(4)和(19)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(38)、(4)、(21)和(19)引起的感染,或是豬病原體(38)、(4)、(21)和(19)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(20),更佳的是(20)、(31)和(38)引起的感染,或是豬病原體(20)、(31)和(38)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(5),更佳的是(5)和(24)引起的感染,或是豬病原體(5)和(24)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(1),更佳的是(1)和(5)引起的感染,或是豬病原體(1)和(5)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(41),更佳的是(40)、(27)、(28)、(29)、(31)、(19)和(57)引起的感染,或是豬病原體(41)、(40)、(27)、(28)、(29)、(31)、(19)和(57)的免疫活性組份。
根據其他觀點,更多[combo 1]
的免疫活性組份可有效治療及/或預防由豬病原體(6),更佳的是(6)、(19)、(38)和(58)引起的感染,或是豬病原體(1)和(5)的免疫活性組份。
本發明的一項重要觀點是製備組合疫苗(群)。熟諳此藝者知道可包含在該組合物中的額外組份(亦參見Remington's Pharmaceutical Sciences.(1990).第18版Mack Publ.,Easton)。專家可使用已知的注射用、在生理學上可接受之無菌溶液。為了製備立即可用的非經腸注射或輸液用溶液,可迅速獲得等張水溶液,像是例如生理鹽水或與血漿一致的蛋白質溶液。可以冷凍乾燥或脫水製備物之形式提供醫藥組合物,可在使用之前,在無菌的條件下直接以已知的注射用溶液重建,例如成為套組的一部分。
此外,本發明之免疫和疫苗組合物可包含一或多個在獸醫上可接受的載劑。當在本文中使用時,"在獸醫上可接受之載劑"包括任何和所有的溶劑、分散介質、塗料、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌和抗真菌劑、等張劑、延遲吸收的製劑,及其類似物。
稀釋劑可包括水、生理鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及其類似物。等張劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖等等。穩定劑包括白蛋白和乙二胺四乙酸的鹼金屬鹽類等等。
較佳的佐劑是上述的那些。免疫組合物更可包含一或多個其他的免疫調節劑,像是例如介白素、干擾素或其他的細胞激動素。免疫組合物亦可包括健大黴素和硫柳汞。在本發明之前後文中所使用的佐劑和添加物的含量或濃度,可由熟諳此藝者迅速地判定,本發明期待包括從大約50微克到大約2000微克佐劑的組合物,而更佳的是大約250微克/毫升劑量的疫苗組合物。在另一更佳的具體實施例中,本發明期待包括從大約1微克/毫升到大約60微克/毫升抗生素的疫苗組合物,更佳的是低於大約30微克/毫升的抗生素。
根據更進一步的具體實施例,首先將混合疫苗脫水。若先藉著其他方法將該組合物冷凍乾燥或脫水,然後在接種疫苗之前,以含水(例如生理鹽水、PBS(磷酸緩衝之生理鹽水))或非-含水溶液(例如油乳劑(以礦物油或植物/可代謝油為基礎/單或雙乳劑為基礎)、以鋁為基礎、以卡波姆為基礎的佐劑),將該組合物再-水合。
根據本發明,將有效含量之混合疫苗投與豬,提供了對抗PCV2和上文列舉之至少一種額外病原體引起之微生物學感染的有效免疫力。上文列舉了用以治療和預防微生物學疾病之抗原的較佳組合。
根據更進一步的具體實施例,以大約2至4週的間隔,將1或2個劑量的混合疫苗投與豬。例如,當動物大約2至3週到大約8週大時,進行第一次投藥。在第一次疫苗接種的第一次投藥之後大約1至大約4週,進行第二次投藥。根據更進一步的具體實施例,在投與第二劑之後,以3至12個月的間隔,進行再次的疫苗接種。最好是以6個月到一年為基礎,進行後續疫苗劑量的投藥。在另一較佳的具體實施例中,在大約2至3週齡之前接種疫苗的動物應再度接種疫苗。最好是以一年為基礎,進行後續疫苗劑量的投藥。
混合疫苗的有效量,將視疫苗之成分和投藥計畫而定。通常,當在混合疫苗中使用失活病毒或經修飾的活病毒製備物時,疫苗含有每個劑量含有大約102
至大約109
TCID50
,較佳的是每個劑量大約103
至大約108
TCID50
的量,更佳的是每個劑量大約104
至大約108
TCID50
。一般而言,失活抗原通常以比經修飾之活病毒更高的量來使用。通常,當在混合疫苗中使用細菌抗原時,該疫苗含有每個劑量大約103
至大約109
個菌落形成單位(CFU)的量,較佳的是每個劑量大約104
到大約108
(CFU),更佳的是每個劑量大約106
到大約106
(CFU)。通常以每個劑量至少0.2微克抗原之抗原內含量的量來投與次-單元疫苗,較佳的是大約0.2到大約400微克/劑量,更佳的是大約0.3到大約200微克/劑量,再更佳的是大約0.35到大約100微克/劑量,再更佳的是大約0.4到大約50微克/劑量,再更佳的是大約0.45到大約30微克/劑量,再更佳的是大約0.6到大約15微克/劑量,再更佳的是大約0.75到大約8微克/劑量,再更佳的是大約1.0到大約6微克/劑量,而再更佳的是大約1.3到大約3.0微克/劑量。例如,PCV2 ORF2抗原的抗原內含量,較佳的是據此提供之PCV2 ORF2蛋白質,含有大約2微克到大約150微克,更佳的是大約2微克到大約60微克,再更佳的是大約2微克到大約50微克,再更佳的是大約2微克到大約40微克,再更佳的是大約2微克到大約30微克,再更佳的是大約2微克到大約25微克,再更佳的是大約2微克到大約20微克,再更佳的是大約4微克到大約20微克,而再更佳的是大約4微克到大約16微克。在包含(37)之混合疫苗的案例中,最好是使用至少1至10對數,更佳的是5-10對數,而最佳的是6-8對數。在包含(41)之混合疫苗的案例中,最好使用至少1至10對數,更佳的是3-10對數,而最佳的是5-6對數。
可以皮內、氣管內或陰道內之方式施用根據本發明之組合物。最好是以肌肉內或鼻內之方式施用該組合物。在動物身上,可證明按照上述經由靜脈內或藉著直接注射至標靶組織施用醫藥組合物是有利的。關於系統性施用,靜脈內、血管內、肌肉內、鼻內、動脈內、腹腔內、口服或鞘內路徑是較佳的。更多局部應用可藉著皮下、皮內、皮內、心臟內、葉內、髓質內、肺臟內,或直接或在接近待治療之組織處(結締-、骨-、肌肉-、神經-、表皮組織)完成。依據想要的治療期間和效力,可投與根據本發明之組合物一或多次,亦可間歇地投與,例如按日為基礎,持續數天、週或月,並以不同的劑量。
本發明另一重要的具體實施例,是預防或治療由PCV2,以及一或多種豬致病性微生物(群)引起之疾病的方法,其中以適當之劑量,將PCV2抗原,最好是據此提供之PCV2 ORF2蛋白質,以及更多具有免疫活性之組份,其可有效治療及/或預防由該豬致病性微生物引起之感染,投與需要其之動物。根據更進一步的觀點,該PCV2 ORF2蛋白質,為上述之抗原性組合物的一部分。因此,本發明的另一項觀點係關於混合疫苗,其包括任一據此提供之抗原性組合物,且其包括PCV2 ORF2蛋白質和另一個免疫活性組份,可有效治療及/或預防由該豬致病性微生物引起的感染。
下列實例展示根據本發明之較佳的材料和程序。然而,應了解僅為了解釋而提供這些實例,不應將其視為對本發明之全部範圍的限制。
本實例比較使用本發明之方法和先前技藝中已知的方法,ORF2的相對產量。在300毫升昆蟲不含血清的培養基,Excell 420(JRH Biosciences,Inc.,Lenexa,KS)中,以大約1.0x106
個Sf+細胞/毫升,分別播種四個1000毫升攪拌式燒瓶。種源細胞培養物的身分為Sf+(草地夜蛾)種源細胞株,第19代,批號#N112-095W。用來產製Sf+種源細胞株的細胞係獲自Protein Sciences Corporation,Inc.,Meriden,CT。將用於本實例之Sf+細胞株限制在第19至59代之間。為了本發明,將進行其他的繼代,但為了配合大規模生產的製程,至少繼代至19代或許是必要的,而繼代超過59代可能對表現有影響,雖然沒有進行調查。更詳細地說明,使來自液態氮儲存的原始Sf+細胞培養物在懸浮液形式之Excell 420培養基中生長,在攪拌式燒瓶中恆定地攪拌。使培養物生長在裝有25至150毫升Excell 420不含血清之培養基的100毫升至250毫升中生長。當細胞繁殖至1.0-8.0x106
個細胞/毫升的密度時,以0.5-1.5x106
個細胞/毫升的種植密度,將其分配至新的試管中。使後續擴大的培養物生長在尺寸高達36公升的攪拌式燒瓶中,或高達300公升的不鏽鋼生物反應器中,在25-29℃下持續2-7天。
在播種之後,在27℃下培養燒瓶4小時。然後,以含有PCV2 ORF2基因(SEQ ID NO:4)的重組桿狀病毒播種每個燒瓶。如下產製含有PCV2 ORF2基因的重組桿狀病毒:以PCR擴大得自PCV2之北美品系的PCV2 ORF2基因,使其含有5'Kozak's序列(SEQ ID NO:1)和3'EcoR1位置(SEQ ID NO:2),選殖到pGEM-T-Easy載體(Promega,Madison,WI)內。然後,接著將其切下並繼代選殖到轉移載體pVL1392(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)內。在本文中繼代選殖的部分以SEQ ID NO:7表示。將含有PCV2 ORF2基因的pVL1392質體命名為N47-064Y,然後與BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen)桿狀病毒DNA共同-轉移感染到Sf+昆蟲細胞(Protein Sciences,Meriden,CT)內,產生含有PCV2 ORF2基因的重組桿狀病毒。在本文中以SEQ ID NO:8提供新的構築體。斑點-純化含有PCV2 ORF2的重組桿狀病毒,並在Sf+細胞株上繁殖種源病毒株(MSV),分成數等份並儲存在-70℃下。藉著PCR-RFLP,使用桿狀病毒專一的引子,肯定地確認該MSV為PCV2 ORF2桿狀病毒。以PCV2 ORF2桿狀病毒感染昆蟲細胞,產生MSV或工作種毒株,其表現PCV2 ORF2抗原,可在間接螢光抗體測定中藉著多株血清或單株抗體來檢測。此外,亦藉著N-端胺基酸定序,證實PCV2 ORF2桿狀病毒的身分。亦根據0 C.F.R.113.27(c),113.28和113.55,測試PCV2 ORF2桿狀病毒MSV的純度。以各種感染倍率(MOIs),將每個重組桿狀病毒播種在攪拌式燒瓶中。燒瓶1是以7.52毫升的.088 MOI播種;燒瓶2是以3.01毫升的0.36 MOI播種;燒瓶3是以1.5毫升的0.18MOI播種;而燒瓶4是以0.75毫升的0.09 MOI播種。在本文中以圖1提供流程圖,其解釋使用構築體,PCV2 ORF2重組桿狀病毒的基本步驟。
在以桿狀病毒播種之後,然後在27±2℃下培養7天,在這期間內亦以100 rpm攪拌。燒瓶使用通風的蓋子,容許空氣流動。在接下來的7天中,每隔24小時從每個燒瓶中採集試樣。在萃取之後,離心每個試樣,並分離小球和上清液,然後通過0.45-1.0微米孔隙的膜進行微量過濾。
經由ELISA定量出現在所得試樣中之ORF2的量。利用以0.05 M碳酸緩衝溶液(pH9.6)稀釋至1:6000的捕捉抗體豬抗-PCV2 Pab IgG經純化之蛋白質G(以PBS稀釋1:250),進行ELISA測定。然後將100微升抗體放在微量滴定盤的孔中,密封,並在37℃下培養過夜。然後以沖洗溶液沖洗該盤三次,該沖洗溶液包括0.5毫升吐溫20(Sigma,St.Louis,MO)、100毫升10X D-PBS(Gibco Invitrogen,Carlsbad,CA)和899.5毫升蒸餾水。接著,在各孔中加入250微升阻斷溶液(5克Carnation脫脂牛奶(Nestle,Glendale,CA),在10毫升D-PBS中,加蒸餾水至100毫升)。下一個步驟是沖洗測試培養盤,然後加入預先-稀釋的抗原。藉著在稀釋培養盤的各孔中加入200微升稀釋溶液(0.5毫升吐溫20在999.5毫升D-PBS中),產生預先-稀釋的抗原。然後以1:240之比例和1:480之比例稀釋試樣,然後將這些稀釋試樣各100微升加至稀釋培養盤上方孔之一中(即一個上方的孔接受100微升的1:240稀釋,而另一個接受100微升的1:480稀釋)。藉著從每個連續孔中移出100微升,並將其移至培養盤上的下一個孔中,對培養盤的其餘部分進行連續稀釋。在進行下一次運送之前,混合每個孔。測試培養盤的沖洗包括以沖洗緩衝溶液沖洗該盤三次。然後密封該盤,並在37℃下培養1小時,隨後以沖洗緩衝溶液沖洗三次以上。所使用的檢測抗體為對抗PCV ORF2的單株抗體。以稀釋溶液將其稀釋成1:300,然後在孔中加入100微升稀釋過的檢測抗體。然後密封該盤,並在37℃下培養1小時,隨後以沖洗緩衝溶液沖洗三次。藉著將正常兔子血清(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)加至稀釋溶液中至1%濃度,製備共軛稀釋劑。以共軛稀釋劑稀釋共軛抗體山羊抗-老鼠(H+1)-HRP(Jackson Immunoresearch)至1:10,000。然後將100微升稀釋過的共軛抗體加至各孔中。然後密封該盤,並在37℃下培養45分鐘,隨後以沖洗緩衝溶液沖洗三次。在各孔中加入與等量過氧化酶受質B(KPL)混合的100微升受質(TMB過氧化酶受質,Kirkgaard and Perry Laboratories(KPL),Gaithersberg,MD)。在室溫下培養該盤15分鐘。然後在所有的孔中加入100微升1 N HCL,使反應中止。通過ELISA讀取器跑該培養盤。在下文表1中提供該測定的結果:
這些結果表示當培養時間延長時,在離心細胞和培養基之上清液中的ORF2表現比在離心細胞和培養基之小球中的表現更多。因此,容許ORF2表現進行至少5天,並回收在上清液中的ORF2,比容許表現進行少於5天,並從細胞中回收它更好,提供大為增加的ORF2產量,且有勝過先前方法的顯著改善。
本實例提供了關於在本文中提出申請之發明效力的數據。以大約1.0x106
個Sf+細胞/毫升,播種在含有300毫升Excell 420培養基的1000毫升攪拌式燒瓶中。然後在27℃下培養該燒瓶,並以100 rpm攪拌。隨後,在培養24小時之後,以具有0.1 MOI的10毫升PCV2 ORF2/Bac p+6(含有PCV2 ORF2基因的重組桿狀病毒,在Sf9昆蟲細胞中繼代額外6次)病毒種播種該燒瓶。
在27℃下培養該燒瓶總計6天。在培養之後,離心燒瓶,並收穫所得之上清液的三個試樣,然後使其失活。藉著使其溫度達到37±2℃,使該上清液失活。在第一個試樣中,將在0.3 N NaOH中之2-溴乙烯胺氫溴化物的0.4 M溶液(其已經被環化成0.2 M二元氮丙啶)加至上清液中,得到5mM之BEI的終濃度。在第二個試樣中,將10 mM BEI加至上清液中。在第三個試樣中,不加BEI至上清液中。然後持續攪拌該試樣48小時。加入1.0 M硫代硫酸鈉溶液,得到5 mM之終最低濃度,中和任何殘餘的BEI。然後使用與在實例1中之描述相同的ELISA測定程序,定量每個試樣中ORF2的含量。可在下文表2中看到結果:
本實例證實以BEI中和,不會移除或降解大量的重組PCV2 ORF2蛋白質產物。這可藉著在來自BEI或升高溫度的上清液中沒有大量ORF2流失的事實來證明。熟諳此藝者將承認回收的ORF2是穩定的蛋白質產物。
本實例證實本發明可從重組PCV2 ORF2的小規模產生按比例放大至重組PCV2 ORF2的大規模產生。將在7000毫升Excell 420培養基中之5.0x105
個細胞/毫升的Sf+細胞,種在20000毫升Applikon生物反應器中。然後在27℃下培養該培養基和細胞,並在接下來的68小時中以100RPM攪拌。在第68小時時,將41.3毫升PCV2 ORF2桿狀病毒MSV+3加至7000毫升Excell 420培養基中。然後將所得的混合物加至生物反應器中。在接下來的七天中,在27℃下培養該混合物,並以100 RPM攪拌。從感染後第4天開始,每24小時從生物反應器中取得試樣,並離心每個試樣。保留試樣的上清液,並使用SDS-PAGE密度計定量ORF2的含量。可在下文表3中看到結果:
本實例在與有毒力之PCV2品系接觸之後,測試七種PCV2候選疫苗的效力,並進一步定義效力參數。將108隻剖腹產且不給初乳(CDCD)的9-14日齡之小豬,隨機分成同樣大小的9組。表4陳述本實例的整體研究設計。
七組(第1-7組)接受PCV2 ORF2多肽的給藥,一組作為攻毒對照組,不給予PCV2 ORF2,而另一組則作為完全的陰性對照組,亦不給PCV2 ORF2。在第0天,以指派的疫苗處理第1到7組。第7組的小豬在第14天得到補強處理。在接種疫苗之後觀察小豬的有害事件和注射部位的反應,並在第19天將小豬移到第二個研究場所。在第二個研究場所,將1-8組養在一棟建築物中,而將第9組養在隔開的建築物中。所有的豬在第21和27天都接受鎖孔血藍蛋白(KLH)/不完全福瑞德氏佐劑(ICFA),並在第24天,以有毒力的PCV2對第1-8組攻毒。
在攻毒-前和-後,收集血液試樣進行PCV2血清學分析。在攻毒之後,收集用來判定平均每日增重(ADWG)的體重數據,和臨床症狀,以及用以判定PCV2之鼻腔排毒的鼻拭樣。在第49天,對所有存活的豬進行驗屍,計算肺臟的病變分數,並將選出的組織保存在福馬林中,稍後進行免疫組織化學(IHC)測試。
在第0天對9-14日齡的CDCD豬進行部份盲目的接種疫苗-攻毒可行性研究。在研究中欲包括PCV2 IFA力價1:1000的母豬。此外,母豬的血清學狀態是來自已知為PRRS-陰性的豬群。測試28隻母豬的PCV2血清學狀態。14隻母豬有1000的PCV2力價,並將牠們移到第一個研究場所。藉著剖腹產生下110隻小豬,並在研究第-4天獲得。在第-3天,在第一個研究場所將108隻CDCD豬秤重,掛上耳標以供識別,按重量區隔,並隨機分派至9組之一中,如在上文表4中的陳述。若任何受試的動物滿足登記在本研究中的內含標準,但稍後因任何原因而被排除,研究員將與監視員商量,以便判定是否在最後的分析中使用從該動物中收集到的數據。提供排除登記小豬之日期和排除理由的文件。一開始不排除任何母豬。在第-3天,將可用的110隻豬中總共108隻小豬隨機分派至9組中之一。兩隻最小的豬(第17和19號)不指派組別,若需要可作為額外備用。在研究期間,移除數隻動物。在第-1天豬82號(第9組),第3天豬56號(第6組),第4天豬53號(第9組),第8天豬28號(第8組),第7天豬69號(第8組)和第9天豬93號(第4組),在攻毒之前發現牠們分別死亡。這六隻豬並不包括在最後的研究結果中。將17號的豬(備用豬之一)指派至第9組。剩下備用豬19號,從研究中排除。
對每組提供的調配物如下:第1組設計為投與1毫升病毒ORF2(vORF2),含有16微克ORF2/毫升。這藉著混合10.24毫升病毒ORF2(256微克/25微克/毫升=10.24毫升vORF2)與3.2毫升0.5%卡伯波和2.56毫升pH 7.4的磷酸緩衝之生理鹽水來完成。這產生16毫升調配物,可供第1組使用。第2組設計為投與1毫升vORF2,含有8微克vORF2/毫升。這藉著混合5.12毫升vORF2(128微克/25微克/毫升=5.12毫升vORF2)與3.2毫升0.5%卡伯波和7.68毫升pH 7.4的磷酸緩衝之生理鹽水來完成。這產生16毫升調配物,可供第2組使用。第3組設計為投與1毫升vORF2,含有4微克vORF2/毫升。這藉著混合2.56毫升vORF2(64微克/25微克/毫升=2.56毫升vORF2)與3.2毫升0.5%卡伯波和10.24毫升pH 7.4的磷酸緩衝之生理鹽水來完成。這產生16毫升調配物,可供第3組使用。第4組設計為投與1毫升重組ORF2(rORF2),含有16微克rORF2/毫升。這藉著混合2.23毫升rORF2(512微克/230微克/毫升=2.23毫升rORF2)與6.4毫升0.5%卡伯波和23.37毫升pH 7.4的磷酸緩衝之生理鹽水來完成。這產生32毫升調配物,可供第4組使用。第5組設計為投與1毫升rORF2,含有8微克rORF2/毫升。這藉著混合1.11毫升rORF2(256微克/230微克/毫升=1.11毫升rORF2)與6.4毫升0.5%卡伯波和24.49毫升pH 7.4的磷酸緩衝之生理鹽水來完成。這產生32毫升調配物,可供第5組使用。第6組設計為投與1毫升rORF2,含有8微克rORF2/毫升。這藉著混合0.56毫升rORF2(128微克/230微克/毫升=0.56毫升rORF2)與6.4毫升0.5%卡伯波和25.04毫升pH7.4的磷酸緩衝之生理鹽水來完成。這產生32毫升調配物,可供第6組使用。第7組設計為投與2毫升PCV2完整殺死的細胞疫苗(PCV2 KV),含有MAX PCV2 KV。這藉著混合56毫升PCV2 KV與14毫升0.5%卡伯波來完成。這產生70毫升調配物,可供第7組使用。最後,第組設計為每2毫升劑量以0.5微克/毫升或1.0微克/毫升的KLH。這藉著混合40.71毫升KLH(在0.5微克/毫升下為7.0微克蛋白質/毫升=570毫升(7.0微克/毫升)(x)=(0.5)(570毫升))、244.29毫升pH 7.4的磷酸緩衝之生理鹽水和285毫升福瑞德氏佐劑來完成。表5描述本實例之關鍵活動的時間架構。
在完成研究的生前階段之後,由病理學家藉著免疫組織化學法(IHC)檢查福馬林固定的組織,檢測PCV2抗原,評估血液試樣的PCV2血清學,評估鼻拭樣的PCV2排毒,並判定從第24日至49日的平均每日增重(ADWG)。
從出生到大約11日齡(約在研究第0天),將動物飼養在第一個研究場所五個房間的個別籠子中。每個房間的配置是相同的,並包括堆疊的個別不鏽鋼籠子,有加熱並過濾過的空氣分別供應每個獨立單位。每個房間有獨立的熱源和通風,藉此避免在房間之間空氣的交叉-污染。在第二個研究場所,動物飼養在兩個不同的建築物中。將第9組(完全的陰性對照組)分開飼養在改裝的肥育建築中,而第1-8組則飼養在改裝的養殖建築中。每組飼養在分開的圍欄中(每個圍欄11-12隻豬),且每個圍欄提供每隻豬大約3.0平方英尺。每個圍欄均放在升高的地面上,並有塑膠板條狀的地板。在圍欄下的坑係作為糞便和廢物的容納槽。每個建築物有它自己個別的加熱和通風系統,在建築物之間空氣的交叉-污染只有極少的可能。
在第一個研究場所,以特別調配的牛奶飼量餵食從出生到3週齡的小豬。從第19天(大約4週半),所有小豬都吃固體、特別混合的飼糧。在第二個研究場所,所有小豬均無限制餵食適合其年齡和體重的定製之無藥物市售混合飼糧。在兩個研究場所,均無限制地供應水。
在第-2天,以維生素E處理所有受試豬隻,在第-1天注射鐵劑,並在第16、17、18和19天注射來畜福(NAXCEL)(1.0毫升,肌肉內,在另一隻後腿)。此外,為了各種健康理由,在第3天以鐵劑注射治療52號豬(第9組),在第11天以鐵劑注射治療45號豬(第6組),在第6天以來畜福治療69號豬(第8組),在第14天以地塞米松和青黴素治療74號豬(第3組),並在第13天以地塞米松和青黴素治療51號豬(第1組),並在第14天以來畜福治療。
在兩個研究場所中,豬隻都在獸醫的照料之下。在第0天進行動物的健康檢查,並記錄在健康檢查記錄表格上。在接種疫苗之前,藉著在第0天的觀察判定所有動物均在良好的健康和營養狀態下。在攻毒之前,觀察到所有受試動物均在良好的健康和營養狀態下。屍體和組織均藉著化製處理。將研究動物的最終處置記錄在動物處置記錄上。
在第0天,指派給第1-6組的豬分別在左頸部肌肉內接受1.0毫升PCV2疫苗1-6號,使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和無菌的20g x"針頭。指派給第7組的豬在右頸部肌肉內接受2.0毫升PCV2疫苗7號,使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和無菌的20g x"針頭。
在第21天,所有受試的豬均在右後腿部肌肉內接受2.0毫升KLH/ICFA,使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和無菌的20g x1"針頭。在第27天,所有受試的豬均在左後腿部肌肉內接受2.0毫升KLH/ICFA,使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和無菌的20g x1"針頭。
在第24天,指派給第1-8組的豬在左頸部肌肉內接受1.0毫升PCV2 ISUVDL攻毒材料(5.11對數10
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/毫升),使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和無菌的20g x1"針頭。將另外1.0毫升的相同材料,鼻內投與每隻豬(每個鼻孔0.5毫升),使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和鼻套管。
在第-4天,並從第0天到第19天,每天觀察受試豬隻的整體健康和有害影響。將觀察記錄到臨床觀察記錄上。針對注射部位反應,所有的受試豬隻均從第0天觀察到第7天,第7組更從第14天觀察到第21天。藉著在第-3、24和49天,或在攻毒後發現豬死亡的那天,在校準的磅秤上將每隻豬秤重,判定平均每日增重。將體重記錄在體重表格上。在第-3天,在隨機分組之前,利用重量區隔豬。在第24和49天,利用體重數據判定每隻豬在這些時間點內的平均每日增重(ADWG)。至於在攻毒之後並在第49天之前死亡的豬,調整ADWG使其代表從第24天至死亡那天的ADWG。
為了判定PCV2血清學,在第-3和14天從眼眶靜脈竇中,收集每隻小豬的靜脈全血。對於每隻小豬,藉著將無菌的毛細試管插入一眼的內眥中,並將大約3.0毫升全血引流至4.0毫升血清分離試管(SST)內,從眼眶靜脈竇中收集血液。在第24、31和49天,使用無菌的18g x1"真空採血針頭(Becton Dickinson and Company,Franklin Lakes,New Jersey)、真空採血持針器和13毫升SST,從前腔靜脈中收集每隻豬的靜脈全血。將在每個時間點的血液收集,記錄在試樣收集記錄上。容許在每個SST中的血液凝固,然後離心每個SST,並收穫血清。將收穫的血清移至無菌的壓扣試管中,並儲存在-70±10℃下,直到稍後進行測試為止。由BIVI-R&D員工,就PCV2抗體的存在測試血清試樣。
針對臨床症狀,從第20至49天每天一次觀察豬隻,並將臨床觀察記錄在臨床觀察記錄上。
欲測試PCV2的經鼻排毒,在第24、25天,然後每隔一奇數研究日,直到並包括地49天,盡可能無菌地將無菌的達克龍(dacron)棉棒插入每隻豬左或右鼻孔內(每隻豬一個棉棒),沿著周圍揮動數秒然後取出。然後將每個棉棒放在單獨無菌的壓扣-帽試管中,其中含有1.0毫升EMEM培養基並帶有2% IFBS、500單位/毫升之青黴素、500微克/毫升之鏈黴素,和2.5微克/毫升的兩性黴素B。在試管中折斷棉棒,並密封壓扣試管,適當地標示動物編號、研究編號、採集日期、研究日期和"鼻拭樣"。將密封的壓扣試管儲存在-40±10℃下,直到過夜在冰上運送至BIVI-St.Joseph為止。將鼻拭樣的收集記錄在鼻拭樣收集表格上。BIVI-R&D進行定量病毒分離(VI),測試在鼻拭樣上的PCV2。以對數10
值表示結果。認為1.3對數或更低的為陰性,而任何高於1.3對數的值則為陽性的。
以判定診斷所需的程度,對在第一個研究場所死亡的豬(28、52、56、69、82和93號)進行驗屍。記錄肉眼病灶,且不保留這些豬的任何組織。在第二個研究場所,對在第49天之前死亡的豬(45、23、58、35號),在第49天在安樂死之前發現死亡的豬(2、43號),以及在第49天安樂死的豬進行驗屍。在驗屍記錄表格上記錄任何提及的肉眼病灶和有病灶之肺葉的百分比。
從在第二個研究場所進行驗屍之103隻豬的每一隻中,將扁桃腺、肺、心臟、肝臟、腸繫膜淋巴結、腎臟和鼠蹊淋巴結的組織試樣放在含有經緩衝之10%福馬林的單獨容器中;同時將得自相同前述器官的其他組織試樣放在無菌取樣袋(Whirl-pak)(M-Tech Diagnostics Ltd.,Thelwall,UK)中,並將無菌取樣袋放在冰上。每個容器都適當地標示。將試樣的收集記錄在驗屍報告表格上。然後將福馬林-固定的組織試樣和診斷請託表格交付IHC測試。關於接受試樣、試樣和玻片製作,以及染色技術,根據標準ISU實驗室程序進行IHC測試。以冰袋將在無菌取樣袋中的新鮮試樣運送至研究監視人員,以供儲存(-70±10℃)和可能的未來用途。由病理學家檢查福馬林-固定的組織,藉著IHC檢測PCV2,並使用下列的評分系統評分:0=無;1=少量的陽性染色,少數部位;2=中等的陽性染色,多個部位;3=豐富的陽性染色,散佈在整個組織中。因為病理學家不能肯定地區別鼠蹊LN與腸繫膜LN的事實,將這些組織的結果簡單地標示為淋巴結,而每隻動物兩個組織的每一個均得到最高分。
在下文中提供本實例的結果。注意到第9組中有一隻豬在第0天之前死亡,並有5隻豬在接種疫苗之後死亡(第4組1隻;第6組1隻;第8組2隻;和第9組1隻)。死後檢查指出所有六隻死亡的豬均是因為隱藏的感染,與接種疫苗或PMWS無關。此外,在任何組別中均沒有注意到任何有害事件或注射部位的反應。
在下文表6中提供平均每日增重(ADWG)。第9組,完全的陰性對照組有最高的ADWG(1.06±0.17磅/天),接著是第5組(0.94±0.22磅/天),其接受一劑8微克的rORF2。第3組,接受一劑4微克vORF2,有最低的ADWG(0.49±0.21磅/天),接著是第7組(0.50±0.15磅/天),其接受2劑殺死的疫苗。
在下文表7中提供PCV2血清學結果。所有9組在第-3天時均為PCV2血清陰性的。在第14天,接受vORF2疫苗的組別有最高的力價,接下來是接受rORF2疫苗的組別。第8和第9組在此時仍維持血清陰性。在第24和31天,持續證實接受vORF2疫苗的豬有強的血清學反應,緊接著是接受兩劑死毒疫苗的豬。接受rORF2疫苗的豬較慢產生血清學反應,而第8和第9組的豬持續維持血清陰性。在第49天,證實接受vORF2疫苗、兩劑死毒疫苗和最低劑量rORF2的豬有最強的血清學反應。接受16微克和8微克疫苗的豬,有比攻毒對照組稍高的IFA力價,在第49天,證實第9組有強烈的血清學反應。
在下文表8中提供得自攻毒後之臨床觀察的結果。該結果摘要包括對於異常行為、異常呼吸、咳嗽和下痢的觀察。表9包括得自各組臨床症狀之發生率摘要的結果,而表10包括得自各組在攻毒後死亡率之摘要的結果。在本研究中最常注意到的臨床症狀是異常的行為,將其評分為中等至嚴重的昏睡。接受2劑較低劑量之vORF2的豬、接受16微克rORF2的豬和接受2劑KV疫苗的豬,有≧27.3%的發生率。接受8微克rORF2的豬和完全的陰性對照組沒有異常行為。在本研究中證實沒有任何豬有任何異常的呼吸。在所有組別中經常注意到咳嗽(0至25%),和下痢一樣(0-20%)。沒有注意到任何PMWS特有的臨床症狀。
臨床症狀的整體發生率在各組之間有所不同。接受任何vORF2疫苗的組別,接受16微克rORF2的組別,接受2劑KV疫苗的組別,和攻毒對照組,有最高的整體臨床症狀發生率(36.4%)。完全的陰性對照組,接受8微克rORF2的組別和接受4微克rORF2的組別分別具有0%、8.3%和9.1%的臨床症狀之整體發生率。
整體死亡率在各組之間亦有所不同。接受2劑KV疫苗的組別有最高的死亡率(16.7%);而接受4微克vORF2,16微克rORF2或8微克rORF2的組別,以及完全的陰性對照組均有0%的死亡率。
在下文表11中提供PCV2鼻排毒結果。在第24天的攻毒之後,第7組中的1隻豬在第27天開始排毒。直到第33天,沒有任何其他的組別體驗到排毒。從第35天到第45天,注意到大量的鼻排毒。接受三種VORF2疫苗的任一組,和接受4或8毫克rORF2的組別,有最低PCV2鼻排毒的發生率(9.1%)。攻毒對照組(第8組)有最高排毒率(80%),接著是完全的陰性對照組(第9組),有63.6%的發生率。
在下文表12中顯示各組黃疸發生率、各組胃潰瘍發生率、各組平均肺病灶計分和各組肺病灶發生率的摘要。在研究的接種疫苗之後階段,在第一個研究場所有六隻豬死亡(第4組,N=1;第6組,N=1;第8組,N=2;第9組,N=2)。六隻豬中有四隻在一或多個體腔中有纖維蛋白病灶,一隻豬(第6組)有符合梭菌病的病灶,而一隻豬(第9組)沒有肉眼病灶。在接種疫苗之後的研究期間內死亡的豬,沒有與PMWS相符的病灶。
對在攻毒後死亡的豬和在第49天安樂死的豬進行驗屍。在驗屍時,在任何組別中均沒有出現黃疸和胃潰瘍。至於平均肺病灶%,第9組有最低的平均肺病灶%(0%),接著是第1組,有0.40±0.50%,第5組有0.68±1.15%。第2、3、7和8組有最高的平均肺病灶%(7.27%)。這四組分別包含一隻具有肺病灶71.5%的豬,其歪斜而使這四組有較高的結果。除了注意到第9組有0%肺病灶之外,剩下第8組有36%肺病灶。幾乎所有提到的肺病灶,均描述為紅/紫色且固化的。
在表13中顯示各組IHC陽性發生率結果的摘要。第1組(vORF2-16微克)和第5組(rORF2-8微克)有最低比例的IHC陽性結果(16.7%)。第8組(攻毒對照組)和第9組(完全的陰性對照組)有最高比例的IHC陽性結果,分別為90%和90.9%。
在攻毒之後,第5組,接受1劑8微克rORF2抗原,勝過其他6個疫苗組。第5組有最高的ADWG(0.94±0.22磅/天),異常行為的發生率最低(0%),咳嗽的發生率第二低(8.3%),整體臨床症狀的發生率最低(8.3%),死亡率最低(0%),PCV2之鼻排毒的比例最低(8.3%),平均肺病灶%第二低(0.68±1.15%),且陽性組織的發生率最低(16.7%)。接受各種含量之rORF2抗原的組別,大體上勝過接受各種含量之vORF2的組別和接受2劑死亡的完整細胞PCV2疫苗,後者的表現最差。表14和15含有各組之攻毒後數據的摘要。
本研究的結果指出所有更多在疫苗上的努力應該集中在rORF2疫苗。整體上,在攻毒之後檢測PCV2的鼻排毒,而利用PCV2疫苗的接種疫苗結果降低了排毒。選出之淋巴組織的免疫組織化學,亦提供疫苗效力的良好參數,而在各組之間,並未檢測到在ADWG、臨床症狀和肉眼病灶上有極大的差異。藉著在研究期間的相同時間點,將外來PCV2導入,而使本研究變得更複雜,藉著在第9組,完全的陰性對照組中,PCV2之鼻排毒、PCV2血清轉變和陽性IHC組織而證明。
在本研究中評估七種PCV2疫苗,包括在第0天投與三個不同劑量的vORF2抗原一次,在第0天投與三個不同劑量的rORF2抗原一次,以及在第0天和第14天各投與一劑殺死的完整細胞PCV2疫苗。整體而言,接受1劑含有8微克rORF2抗原之疫苗的第5組,有最佳的結果。第5組有最高的ADWG,最低的異常行為發生率,最低的異常呼吸發生率,第二低的咳嗽發生率,最低的整體臨床症狀發生率,最低的死亡率,最低的PCV2之鼻排毒比例,第二低的平均肺病灶%,和最低的陽性IHC組織發生率。
有趣的是,接受比第5組更高劑量之rORF2抗原的第4組,並未產生像第5組一樣或更佳的效果。第4組有比第5組稍低的ADWG,更高的異常行為發生率,更高的整體臨床症狀發生率,更高的PCV2之鼻排毒比例,更高的平均肺病灶%,和更高比例的陽性IHC組織。並未對這些數據進行統計分析,其可能表示在這兩組之間的差異在統計學上並不顯著,但有觀察到第4組不像第5組那樣好的傾向。
在接種疫苗之後,在第一個研究場所有6隻豬死亡。六隻豬中的四隻係來自第8或第9組,它們不接受疫苗。六隻豬中沒有任一隻證實有與PMWS相符的病灶,沒有報告有有害的事件,且整體上所有七種疫苗似乎在投與大約11日齡之豬時均是安全的。在本研究接種疫苗之後的階段,接受三種劑量之vORF2疫苗或殺死之完整細胞疫苗的豬,有最高的OFAT含量,而第5組在攻毒之前才有所有疫苗組中最低的IFAT含量。
雖然未正式證明,但咸相信在斷奶後很快將PCV2傳染給幼豬的優勢路徑是藉著口鼻直接接觸,而在生產環境中降低PCV2之鼻排毒的有效疫苗,將有助於控制感染的散播。接受三種vORF2抗原含量之一的組別和接受8微克rORF2的組別,具有最低的PCV2之鼻排毒發生率(8.3%)。預期攻毒對照組具有最高的鼻排毒發生率(80%)。
在繼發於PCV2感染之PMWS病豬中的肉眼病灶,通常包括廣泛的淋巴腺病,合併有一或多個下列症狀:(1)間質性肺炎,伴隨有肺葉間的水腫,(2)皮膚蒼白或黃疸,(3)斑駁萎縮的肝臟,(4)胃潰瘍和(5)腎炎。在驗屍時,在任何組別均無看到黃疸、肝炎、腎炎和胃潰瘍,且沒有特別檢查淋巴腺病。在各組之間的平均肺病灶%計分是多變的。接受16微克vORF2抗原的組別具有最低的平均肺病灶%計分(0.40±0.50%),接著是接受8微克rORF2的組別(0.68±1.15%)。如同預期,攻毒對照組具有最高的平均肺病灶%計分(9.88±29.2%)。在全部四組中,因為在這些組中均各有一隻豬具有極高的肺病灶分數,使這四組的平均肺病灶%計分升高。大多數的肺病灶被描述為紅/紫色和固化的。通常,與PMWS有關的肺病灶為褐色和非-可塌陷的,並伴隨有肺葉間的水腫。在本研究中提及的肺病灶與PCV2感染無關,或可能是已經存在的二次肺臟感染原。在本研究的前後文中,肺病灶%計分或許不代表起因於PCV2之肺感染量的實際測量。
其他的研究者已經藉著IHC,證實了在出現PCV2抗原和組織病理學之間的關連。本研究並未進行所選出之組織的組織病理學。第1組(16微克vORF2)和第5組(8微克rORF2)對PCV2抗原有最低的陽性發生率(8.3%),而第9組(完全的陰性對照組-90.9%)和第8組(攻毒對照組-90.0%)對PCV2抗原有最高的陽性發生率。因為本測試的非-主觀性質,IHC結果或許是判斷疫苗效力的最佳參數之一。因此,在本發明的一項觀點中,在面臨PCV2攻毒的CDCD豬模式中,判定1毫升/一個劑量帶有經萃取之PCV2 ORF2(rORF2)抗原的重組產物的最低保護劑量(MPD)。在接受各種含量rORF2抗原的三組中,第5組(8微克rORF2抗原)顯然有最高的保護水準。第5組具有最佳的結果,或關於所有進行檢查的參數,與最受歡迎的結果平手。當在攻毒之後將第5組與其他六個疫苗組做比較時,第5組具有最高的ADWG(0.94±0.22磅/天),最低的異常行為發生率(0%),第二低的咳嗽發生率(8.3%),最低的整體臨床症狀發生率(8.3%),最低的死亡率(0%),最低的PCV2之鼻排毒比例(8.3%),第二低的平均肺病灶%比例(0.68±1.15%),以及最低的陽性IHC組織發生率(16.7%)。
在本發明另一項觀點中,在面臨PCV2攻毒的CDCD豬模式中,判定1毫升/一個劑量之傳統產物的MPD,亦即部分經純化的PCV2 ORF2(vORF2)抗原。在接受各種含量之vORF2抗原的三組中,第1組(16微克vORF2)具有最高的保護水準。第1組在ADWG、平均肺病灶%和IHC方面勝過第2和第3組。第1和第2組(8微克vORF2抗原)關於整體臨床症狀的發生率有相等的效能,第3組(4微克vORF2抗原)有最低的死亡率,而所有三組關於鼻排毒的表現則是相等的。整體上,vORF疫苗不像rORF疫苗那樣好。
在本發明另一項觀點中,在面臨PCV2攻毒的CDCD豬模式中,判定最大劑量2毫升/2劑傳統殺死之PCV2疫苗的效力。在本研究中評估的七種疫苗中,殺死的完整細胞PCV2疫苗效能最差。接受2劑殺死的完整細胞PCV2疫苗的小豬具有最低的ADWG,第二高的異常行為比例(58.3%),第二高的整體臨床症狀發生率(58.3%),最高的死亡率(16.7%),第二高的鼻排毒發生率(41.7%),最高的平均肺病灶%(9.88±29.2%),提及肺病灶的高發生率(75%),以及在組織中有中等的IHC發生率(41.7%)。然而,它仍有效地誘發免疫反應。
在本發明另一項觀點中,評估PCV2的鼻排毒,作為效力參數,並再度證實來自先前研究的先前PCV2效力參數。得自本實例之結果指出PCV2的鼻排毒,發生在鼻內攻毒之後,且PCV2疫苗降低了在攻毒後PCV2的鼻排毒。而且,得自本研究的結果和文獻中的報告指出在未來PCV2疫苗試驗中也應持續評估IHC。
從本研究中產生一些額外的結論,即淋巴腺病是PMWS的特徵之一。PMWS的另一特徵為淋巴耗盡和多核/巨大的組織細胞。此外,在7個PCV2疫苗組中的任一組均沒有注意到任何有害的事件或注射部位的反應,且所有7個PCV2疫苗似乎在投與幼豬時均是安全的。
本實例在接觸PCV2的有毒力品系之後,測試八種PCV2候選疫苗的效力,並再度證實得自較早攻毒研究的PCV2攻毒參數。將一百五十(150)隻剖腹產且不給初乳(CDCD)的6-16日齡之小豬,按體重區隔,並隨機分成同樣大小的10組。表16陳述本實例的整體研究設計。
給予每組的疫苗調配物如下。PCV2疫苗1號,以1x2毫升之劑量投與第1組,是高劑量(每劑16微克/2毫升)的失活重組ORF2抗原,以IMS 1314作為佐劑(16微克rORF2-IMS 1314)。PCV2疫苗2號,以1x2毫升之劑量投與第2組,是高劑量(每劑16微克/2毫升)的部分純化之VIDO R-1產生的PCV2 ORF2抗原,以卡伯波作為佐劑(16微克vORF2-卡伯波)。PCV2疫苗3號,以1x2毫升之劑量投與第3組,是高劑量(每劑16微克/2毫升)的失活重組ORF2抗原,以卡伯波作為佐劑(16微克rORF2-卡伯波)。PCV2疫苗4號,以1x1毫升之劑量投與第4組,是高劑量(每劑16微克/1毫升)的部分純化之VIDO R-1產生的PCV2 ORF2抗原,以卡伯波作為佐劑(16微克vORF2-卡伯波)。PCV2疫苗5號,以1x2毫升之劑量投與第5組,每劑4微克/2毫升的失活重組ORF2抗原,以卡伯波作為佐劑(4微克rORF2-卡伯波)。PCV2疫苗6號,以1x2毫升之劑量投與第6組,是每劑1微克/2毫升的失活重組ORF2抗原,以卡伯波作為佐劑(1微克rORF2-卡伯波)。PCV2疫苗7號,以1x2毫升之劑量投與第7組,是低劑量(每劑0.25微克/2毫升)的失活重組ORF2抗原,以卡伯波作為佐劑(0.25微克rORF2-卡伯波)。PCV2疫苗8號,以1x2毫升之劑量投與第8組,是高劑量(每劑失活前力價>8.0對數/2毫升)的失活傳統之殺死的VIDO R-1產生的PCV2 Struve抗原,以卡伯波作為佐劑(>8.0對數KV-卡伯波)。在第0天,以指派的疫苗處理第1到8組。第1-3組和5-8組在第14天再度接受其各自疫苗的補強。在第4天測試單劑之16微克vORF2-卡伯波的效力,其在第14天不接受補強。在兩次接種疫苗之後觀察小豬的有害事件和注射部位的反應。在第21天將小豬移到第二個研究場所,在那裡將1-9組養在一棟建築物中,而將第10組養在隔開的建築物中。所有的豬在第22和28天都接受以不完全福瑞德氏佐劑乳化的鎖孔血藍蛋白(KLH/ICFA)。在第25天,以大約4對數之有毒力的PCV2病毒對第1-9組攻毒。到第46天,在攻毒對照組發生極少的死亡。當嘗試免疫刺激豬並增加PCV2攻毒材料的毒力時,在第46天以INGEL VACPRRSV MLV(豬繁殖及呼吸疫苗,經修飾的活病毒)處理所有的組別。
收集攻毒-前和-後的血液試樣,進行PCV2血清學。攻毒-之後,收集用來判定平均每日增重(ADWG)的體重數據,和臨床症狀的觀察。在第50天,對所有存活的豬進行驗屍,記錄肉眼病灶,評定病理學的肺臟分數,並將選出的組織保存在福馬林中,以便在稍後藉著免疫組織化學(IHC)檢查,檢測PCV2抗原。
這是在第0天,對6至16日齡之CDCD豬進行的部分盲目的接種疫苗-攻毒可行性研究。在研究中欲包括PCV2 IFA力價1:1000的母豬。此外,母豬的血清學狀態是來自已知為PRRS-陰性的豬群。測試16隻母豬的PCV2血清學狀態,而所有的16隻母豬均具有1000之PCV2力價,並將其移至第一個研究場所。藉著剖腹產生下150隻小豬,並在本研究的第-3天獲得。在第-3天,在第一個研究場所將150隻CDCD豬秤重,掛上耳標以供識別,按重量區隔,並隨機分派至10組之一中,如在上文表16中的陳述。收集每隻豬的血液試樣。若任何受試的動物滿足登記在本研究中的內含標準,但稍後因任何原因而被排除,研究員將和監視員商量,以便判定是否在最後的分析中使用從該動物中收集到的數據。提供排除登記小豬之日期和排除理由的文件。沒有任何滿足內含標準,選用於本研究而被送到第一個研究場所的母豬被排除。沒有小豬從研究中被排除,也沒有在結束之前從研究中移出任何受試動物。表17描述本實例之關鍵活動的時間架構。
在完成研究的生前階段之後,由病理學家藉著免疫組織化學法(IHC)檢查福馬林固定的組織,檢測PCV2抗原,評估血液試樣的PCV2血清學,並判定從第25日至50日的平均每日增重(ADWG)。
從出生到大約11日齡(約在研究第0天),將動物飼養在第一個研究場所七個房間的個別籠子中。每個房間的配置是相同的,並包括堆疊的個別不鏽鋼籠子,有加熱並過濾過的空氣分別供應每個獨立單位。每個房間有獨立的熱源和通風,藉此避免在房間之間空氣的交叉-污染。在第二個研究場所,動物飼養在兩個不同的建築物中。將第10組(完全的陰性對照組)分開飼養在改裝的肥育建築中,而第1-9組則飼養在改裝的分娩建築中。每組飼養在分開的圍欄中(每個圍欄14-15隻豬),且每個圍欄提供每隻豬大約2.3平方英尺。將第2、4和8組關在通道一邊的3個相鄰的圍欄中,而第1、3、5、6、7和9組則關在通道另一邊的6個相鄰的圍欄中。各組分開是因為研究監視員擔憂投與第2、4和8組的疫苗不是完全失活的。每個圍欄均放在升高的地面上,並有塑膠板條狀的地板。在圍欄下的坑係作為糞便和廢物的容納槽。每個建築物有它自己個別的加熱和通風系統,在建築物之間空氣的交叉-污染只有極少的可能。
在第一個研究場所,以特別調配的牛奶飼量餵食從出生到3週齡的小豬。從第21天(大約4週半),所有小豬都吃固體、特別混合的飼糧。在第二個研究場所,所有小豬均無限制餵食適合其年齡和體重的定製之無藥物市售混合飼糧。在兩個研究場所,均無限制地供應水。
在第19、20和21天,所有的小豬均在另一隻後腿肌肉內注射1.0毫升來畜福。此外,為了各種健康理由,在第10天以0.5毫升來畜福肌肉內注射11號豬(第1組)在第10天以1毫升青黴素和1毫升伏得福(PREDEF)2X治療13號豬(第10組),在第11天以1.0毫升來畜福肌肉內注射4號豬(第9組),並在第14天分別以1.0毫升來畜福肌肉內注射1號(第1組)、4號和11號豬。
在兩個研究場所中,豬隻都在獸醫的照料之下。在第-3天進行動物的健康檢查,並記錄在健康檢查記錄表格上。在接種疫苗之前,藉著在第0天的觀察判定所有動物均在良好的健康和營養狀態下。在攻毒之前,觀察到所有受試動物均在良好的健康和營養狀態下。屍體和組織均藉著化製處理。將研究動物的最終處置記錄在動物處置記錄上。
在第0天和第14天,指派給第1-3和5-8組的豬分別在右和左頸部肌肉內接受2.0毫升指派的PCV2疫苗1-4號,使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和無菌的20g x"針頭。指派給第4組的豬,僅在第0天在右頸部肌肉內接受1.0毫升PCV2疫苗2號,使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和無菌的20g x"針頭。
在第22天,所有受試的豬均在左頸部肌肉內接受2.0毫升KLH/ICFA,使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和無菌的20g x1"針頭。在第28天,所有受試的豬均在右後腿部肌肉內接受2.0毫升KLH/ICFA,使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和無菌的20g x1"針頭。
在第25天,指派給1-9組的豬在右頸部肌肉內接受1.0毫升PCV2 ISUVDL攻毒材料(3.98對數10
TCID50
/毫升),使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和無菌的20g x1""針頭。將另外1.0毫升的相同材料,鼻內投與每隻豬(每個鼻孔0.5毫升),使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和鼻套管。
在第46天,所有受試的豬均在右頸部肌肉內接受2.0毫升INGEL VACPRRS MLV,使用無菌的3.0毫升Luer-lock注射筒和無菌的20g x1"針頭。投與PRRSV MLV,企圖增加PCV2攻毒材料的毒力。
在第-3天,並從第0天到第21天,每天觀察受試豬隻的整體健康和有害影響。針對正常或異常行為、呼吸或咳嗽,對每隻豬評分。將觀察記錄到臨床觀察記錄上。針對注射部位反應,所有的受試豬隻均從第0天觀察到第7天,第7組更從第14天觀察到第21天。藉著在第-3、25和50天,或在攻毒後發現豬死亡的那天,在校準的磅秤上將每隻豬秤重,判定平均每日增重。將體重記錄在體重表格上。在第-3天,在隨機分組之前,利用重量區隔豬。在第25和50天,利用體重數據判定每隻豬在這些時間點內的平均每日增重(ADWG)。至於在攻毒之後並在第50天之前死亡的豬,調整ADWG使其代表從第25天至死亡那天的ADWG。
為了判定PCV2血清學,在第-3和14天從眼眶靜脈竇中,收集每隻小豬的靜脈全血。對於每隻小豬,藉著將無菌的毛細試管插入一眼的內眥中,並將大約3.0毫升全血引流至4.0毫升血清分離試管(SST)內,從眼眶靜脈竇中收集血液。在第25、32和50天,使用無菌的18g x1"真空採血針頭(Becton Dickinson and Company,Franklin Lakes,New Jersey)、真空採血持針器和13毫升SST,從前腔靜脈中收集每隻豬的靜脈全血。將在每個時間點的血液收集,記錄在試樣收集記錄上。容許在每個SST中的血液凝固,然後離心每個SST,並收穫血清。將收穫的血清移至無菌的壓扣試管中,並儲存在-70±10℃下,直到稍後進行測試為止。由BIVI-R&D員工,就PCV2抗體的存在測試血清試樣。
針對臨床症狀,從第22至55天每天一次觀察豬隻,並針對正常或異常行為、呼吸或咳嗽評分。將臨床觀察記錄在臨床觀察記錄上。
46號豬(第1組)和98號豬(第9組)在第一個研究場所死亡。將這兩個死亡分類為出血死亡,且未對這兩隻豬進行驗屍。在第二個研究場所中,在攻毒之後且在第50天之前死亡的豬,以及在第50天安樂死的豬都進行驗屍。將提到的任何肉眼病灶和有病灶之肺葉%記錄在驗屍報告表格上。
從在第二個研究場所進行驗屍的每一隻豬中,將扁桃腺、肺、心臟和腸繫膜淋巴結的組織試樣放在含有經緩衝之10%福馬林的單獨容器中;同時將得自相同前述器官的其他組織試樣放在無菌取樣袋(Whirl-pak)(M-Tech Diagnostics Thelwall,UK)中,並將每個無菌取樣袋放在冰上。每個容器都適當地標示。將試樣的收集記錄在驗屍報告表格上。然後將福馬林-固定的組織試樣和診斷請託表格交付IHC測試。關於接受試樣、試樣和玻片製作,以及染色技術,根據標準實驗室程序進行IHC測試。以冰袋將在無菌取樣袋中的新鮮試樣運送至研究監視人員,以供儲存(-70±10℃)和可能的未來用途。
由病理學家檢查福馬林-固定的組織,藉著IHC檢測PCV2,並使用下列的評分系統評分:0=無;1=少量的陽性染色,少數部位;2=中等的陽性染色,多個部位;3=豐富的陽性染色,散佈在整個組織中。為了分析,將0分視為"陰性",並將超過0的分數視為"陽性"。
在下文中提供本實例的結果。注意到在第14和第25天分別有46號和98號豬死亡。將這些死亡分類為出血死亡。11號豬(第1組)在第15天劇喘並有快速的呼吸。另外,所有的豬在該觀察期間內,行為、呼吸和咳嗽均正常,且在任一組中均沒有提到任何全身性的有害事件。在第0天,在接種疫苗之後沒有提到任何注射部位反應。在第14天,在接種疫苗之後,在第15天第1組的14隻豬中有7隻(50%)出現"2"分的腫脹。在第16天第1組的14隻豬中有4隻(28.6%)仍有"2"的腫脹。其他組別在另一次接種疫苗之後沒有體驗到注射部位反應。
在下文表18中提供平均每日增重(ADWG)。從各組結果中排除因出血死亡的46號和96號豬。第4組,接受一劑16微克vORF2-卡伯波,有最高的ADWG(1.16±0.26磅/天),接著是第1、2、3、5、6和10組,具有範圍從1.07±0.23磅/天到1.11±0.26磅/天的ADWGs。第9組有最低的ADWG(0.88±0.22磅/天),接著是第8和第7組,分別有0.93±0.33磅/天和0.99±0.44磅/天的ADWGS。
在下文表19中提供PCV2血清學結果。所有10組在第-3天時均為PCV2血清陰性的。在第14天,全部10組的PCV2力價仍維持極低(50-113之範圍)。在第25天,第8組,接受完整細胞殺死之病毒疫苗,有最高的PCV2力價(4617),接下來是第2組,接受16微克vORF2-卡伯波,第4組,接受單劑的16微克vORF2-卡伯波,和第3組,接受16微克rORF2-卡伯波,分別有2507、1920和1503的力價。在第32天(攻毒後1週),第1-6組和第8組之力價範圍在2360至7619之間;而第7組(0.25微克rORF2-卡伯波)、第9組(攻毒對照組)和第10組(完全的陰性對照組)分別有382、129和78的力價。在第50天(驗屍那天),所有10組均證實為高PCV2力價(1257)。
在第25、32和50天,第3組,接受兩劑16微克rORF2-卡伯波,具有比接受兩劑16微克rORF2-IMS 1314之第1組更高的抗體力價。在第25、32和50天,第2組,接受兩劑16微克vORF2,具有比僅接受1劑相同疫苗之第4組更高的抗體力價。在第25和32天,證實分別接受16、4、1和0.25微克之降低含量rORF2-卡伯波的第3、5、6、7組,有相對應的降低抗體力價。
在下文中提供得自攻毒後之臨床觀察的結果。表20包括對於異常行為、異常呼吸、咳嗽和下痢的觀察。表21包括得自各組臨床症狀之發生率摘要的結果,而表22包括得自各組在攻毒後死亡率之摘要的結果。在接受16微克rORF2-IMS 1314(第1組)、16微克rORF2-卡伯波(第3組)、1微克rORF2-卡伯波(第6組)、0.25微克rORF2-卡伯波(第7組)的豬,和在攻毒對照組(第9組)中的豬,在攻毒後異常行為、呼吸和咳嗽的發生率很低。在接受16微克vORF2-卡伯波(第2組)、單劑16微克vORF2-卡伯波(第4組)、4微克rORF2-卡伯波(第5組)、>8對數KV-卡伯波(第8組)中的豬,和在完全的陰性對照組(第10組)中的豬,在攻毒後異常行為、呼吸和咳嗽的發生率為零。
臨床症狀的整體發生率在各組之間有所不同。接受16微克vORF2-卡伯波(第2組)、單劑16微克vORF2-卡伯波(第4組)的豬,和在完全的陰性對照組(第10組)中的豬,有0%的發生率;接受16微克rORF2-卡伯波(第3組)和1微克rORF2-卡伯波(第6組)的豬有6.7%的發生率;接受16微克rORF2-IMS 1314(第1組)的豬有7.1%的整體發生率;接受4微克rORF2-卡伯波(第5組)、0.25微克rORF2-卡伯波(第7組)和>8對數KV疫苗的豬有13.3%的發生率;而在攻毒對照組(第9組)中的豬有14.3%的發生率。
整體死亡率在各組之間亦有所不同。接受2劑KV疫苗的第8組有最高的死亡率,為20.0%;接著是第9組,攻毒對照組,和第7組,接受0.25微克rORF2-卡伯波,並分別具有14.3%和13.3%的死亡率。第4組,接受單劑16微克vORF2-卡伯波,具有6.7%的死亡率。所有其他的組別,1、2、3、5、6和10均具有0%死亡率。
表20.各組在攻毒後觀察到異常行為、異常呼吸和咳嗽的摘要 1
在每組中證實有任何異常行為持續至少1天的豬總數2
在每組中證實有任何異常呼吸持續至少1天的豬總數3
在每組中證實咳嗽持續至少1天的豬總數
在下文表23中提供各組平均肺病灶百分比和臨時診斷的摘要。第9組,攻毒對照組,有最高的肺病灶百分比,平均為10.81±23.27%,接下來是第7組,接受0.25微克rORF2-卡伯波,並具有6.57±24.74%之平均值,第5組,接受4微克rORF2-卡伯波,並具有2.88±8.88%的平均值,和第8組,接受KV疫苗,並具有2.01±4.98%的平均值。剩下6組具有較低的平均肺病灶百分比,範圍從0.11±0.38%到0.90±0.15%。
肺炎的臨時診斷在各組之間亦有差異。第3組,接受兩劑16微克rORF2-卡伯波,具有最低的肺炎臨時診斷,為13.3%。第9組,攻毒對照組,有50%被臨時診斷為患有肺炎,接下來是第10組,完全的陰性對照組,和第2組,接受兩劑16微克vORF2-卡伯波,有46.7%和40%被臨時診斷為患有肺炎。
第1、2、3、5、9和10組,0%被臨時診斷為PCV2感染;而第8組,接受兩劑KV疫苗,有最高比例被臨時診斷為PCV2感染,20%。第7組,接受兩劑0.25微克rORF2-卡伯波,和第4組,接受一劑16微克vORF2-卡伯波,分別各有13.3%和6.7%被臨時診斷為PCV2感染。
僅在第7組中的一隻豬中診斷出胃潰瘍(6.7%);而其他9組保持沒有胃潰瘍。
在下文表24中顯示各組IHC陽性發生率結果的摘要。第1組(16微克rORF2-IMS 1314)有最低的IHC陽性結果比例,0%的豬對PCV2為陽性,接著是第2組(16微克vORF2-卡伯波)和第4組(單劑16微克vORF2-卡伯波),分別有6.7%和13.3%的IHC比例。第9組,攻毒對照組,有最高的IHC陽性發生率,100%的豬對PCV2均為陽性,接著是第10組,完全的陰性對照組,和第8組(KV疫苗),分別有93.3%和80%的豬對PCV2為陽性。
在本實例中評估七種PCV2疫苗,其包括高劑量(16微克)的rORF2抗原,以IMS 1314作為佐劑投藥兩次;高劑量(16微克)的vORF2抗原,以卡伯波作為佐劑,對一組豬投與一次,並對第二組豬投與兩次;高劑量(16微克)的rORF2抗原,以卡伯波作為佐劑投藥兩次;4微克劑量的rORF2抗原,以卡伯波作為佐劑投藥兩次;1微克劑量的rORF2抗,以卡伯波作為佐劑投藥兩次;低劑量(0.25微克)的rORF2抗原,以卡伯波作為佐劑投藥兩次;以及高劑量(>8對數)殺死的整個細胞PCV2疫苗,以卡伯波作為佐劑。整體上,第1組,接受兩劑16微克rORF2-IMS 1314,稍微比第2道地7組好,其接受含有各種量之vORF2或rORF2抗原,以卡伯波作為佐劑,且比第8組好很多,其接受兩劑殺死的整個細胞PCV2疫苗。第1組有第三高的ADWG(1.80±0.30磅/天),最低的異常行為發生率(0%),最低的異常呼吸發生率(0%),低咳嗽發生率(7.1%),低整體臨床症狀發生率(7.1%),與具有最低死亡率(0%)的其他三組平手,第二低的平均肺病灶%比例(0.15±0.34%),第二低的肺炎(21.4%),和最低的陽性IHC組織發生率(0%)。然而,第1組是唯一提到有注射部位反應的一組,在第二次接種疫苗之後1天,包括50%接種疫苗的豬。其他投與第2到第7組的疫苗,效能比死毒疫苗更好,幾乎和投與第1組的疫苗一樣好。
第8組,接受兩劑死毒PCV2疫苗,以卡伯波作為佐劑,具有在任何疫苗組中最差的結果。第8組具有最低的ADWG(0.93±0.33磅/天),第二高的異常行為比例(6.7%),最高的異常呼吸比例(6.7%),與其他有最高整體臨床症狀發生率(13.3%)的三組平手,具有所有組別中最高的死亡率(20%),並具有任何疫苗組中最高的陽性IHC比例(80%)。擔心殺死的整個細胞PCV2疫苗,在投與第8組之前可能尚未完全失活,其可解釋該組的不良結果。不幸的是,最後的數據不能用來證實該擔憂。整體上,在本實例的前後文中,傳統的死毒PCV2疫苗不能協助降低與PCV2有關的疾病。
如先前提及的,沒有有害事件與受試疫苗有關,除了以IMS 1314作為佐劑的疫苗。在第二次接種疫苗後,提到50%的豬有注射部位反應1天,該疫苗利用IMS 1314調配,並在第二次接種疫苗之後,有28.6%的豬持續2天。在任何接受卡伯波作為佐劑之疫苗的豬中,沒有提到任何反應。任何包括以IMS 1314作為佐劑之疫苗接種的豬的進一步研究,應持續密切地監視豬的注射部位反應。
所有的豬在第-3天,均為對PCV2血清-陰性的,僅第2組在第14天有超過100的力價。在第25天(攻毒日),第8組具有最高的PCV2抗體力價(4619),接著是第2組(2507)。除了第7、9和10組之外,在第32天證實所有組別均有強有力的抗體反應,證實包括第7、9和11組的所有組別均有強有力的抗體反應。
晚期PCV2感染和後續PMWS發展的特徵之一,是斷奶小豬的生長遲緩,而在嚴重的病例中,會注意到體重喪失。各組的平均每日增重,是證實生長遲緩或體重喪失的定量方法。在本實例中,在各組之間的ADWG中沒有極大的差異。第8組有最低的ADWG,0.88±0.29磅/天,而第4組有最高的ADWG,1.16±0.26磅/天。在本研究的前後文中,在各組之間沒有足夠的差異,讓未來的疫苗效力以ADWG為基礎。
除了體重喪失之外,呼吸困難、昏睡、皮膚蒼白,有時黃疸,是與PMWS有關的臨床症狀。在本實例中,各組都很少提到異常行為和異常呼吸及咳嗽。本研究證明,該攻毒模式和攻毒品系,不能產生壓倒性的臨床症狀,而這並非以此為基礎之疫苗效力的強有力參數。
整體而言,在本實例中的死亡率不高,且在攻毒對照組中缺少高死亡率,限制了以該參數作為疫苗效力之基礎。在第46天之前,第4和第7組在15隻豬中各有一隻死亡,第9組在14隻豬中有兩隻死亡,而第8組在15隻豬中有3隻死亡。因為並未證實第9組,攻毒對照組有PCV2之臨床症狀的事實,且在該組中僅有的兩隻死亡發生在第46天,而在第46天對所有豬隻投與豬呼吸及生殖系統徵候群病毒(PRRSV)MLV疫苗。較早的研究已經使用INGEL VACPRRS MLV作為免疫刺激物,激怒與PCV-2有關的PMWS疾病,而在這些較早的研究中死亡率較高。在第46天投與PRRS疫苗之後,很快出現兩隻死亡-第4組有一隻在第46天死亡,而第7組有一隻在第47天死亡-其或許與投與PRRS疫苗無關。在第50天,第8組,接受兩劑死毒疫苗,有最高的死亡率(20%),接著是第9組(攻毒對照組)和第7組(0.25微克rORF2-卡伯波),分別有14.3%和13.3%的死亡率。整體上,在本實例之攻毒後的觀察晚期,對攻毒模式投與PRRS疫苗,並不會明顯地增加死亡率。
在繼發於PCV2感染之PMWS病豬中的肉眼病灶,通常包括廣泛的淋巴腺病,合併有一或多個下列症狀:(1)間質性肺炎,伴隨有肺葉間的水腫,(2)皮膚蒼白或黃疸,(3)斑駁萎縮的肝臟,(4)胃潰瘍和(5)腎炎。在驗屍時(第50天),在任何組別均無看到黃疸、肝炎和腎炎。在第7組的一隻豬中提到胃潰瘍,但沒有特別檢查淋巴腺病。以與PCV2感染相符之病灶的存在為基礎,三組均有一隻豬被臨時診斷為PCV2(PMWS)。第8組,接受兩劑死毒疫苗,有20%被臨時診斷為PCV2,而第7組和第4組分別有13.3%和6.7%被臨時診斷為PCV2。在各組之間的平均肺病灶%計分是多變的。第1、2、3、4、6和10組具有低%的肺病灶計分,範圍從0.11±0.38%到0.90±0.15%。如同預期,第9組,攻毒對照組,有最高的平均肺病灶%計分(10.81±23.27%)。在四組中,因為在這些組中的三隻豬均各有一隻具有極高的肺病灶計分,而使平均肺病灶%計分升高。肺病灶被描述為紅/紫色和固化的。通常,與PMWS有關的肺病灶被描述為褐色和非-可塌陷的,並伴隨有肺葉間的水腫。在本研究中提及的肺病灶與PCV2感染無關,或可能是已經存在的二次肺臟感染原。在本研究的前後文中,肺病灶%計分或許不代表起因於PCV2之肺感染量的實際測量。同樣地,肺炎的臨時診斷可能也已經過度-使用。任何有肺病灶的豬,有些像0.10%那麼小,以肺炎之臨時診斷列表。在本實例中,在組別之間沒有足夠的差異,讓疫苗效力能以肉眼病灶和肺病灶%為基礎。
IHC結果顯示在各組之間的最大差異。第1組(16微克rORF2-IMS 1314)對PCV2抗原有最低的陽性IHC結果(0%);而第9和第10組有最高的陽性IHC結果,分別為100%和93.3%的發生率。第3、5、6和7組,分別接受16、4、1或0.25微克的rORF2抗原,以卡伯波為佐劑,分別有20%、20%、40%和46.7%的IHC陽性率。第2組,接受兩劑16微克的vORF2,以卡伯波作為佐劑,有6.7%的IHC陽性率,而第4組,接受僅一劑的相同疫苗,有13.3%的IHC陽性率。因為本測試的主觀性質,以及IHC結果與預期結果有關連的事實,IHC測試或許是以此為基礎之疫苗效力的最佳參數之一。
因此,在本發明的一項觀點中,在面臨PCV2攻毒的CDCD豬模式中,判定以卡伯波為佐劑之PCV2 ORF2抗原的最低保護劑量(MPD)。第3、5、6和7組分別接受兩劑rORF2抗原,以卡伯波為佐劑,但rORF2抗原的量在各組中有所不同。第3、5、6和7組分別接受16、4、1或0.25微克的rORF2抗原。通常,降低rORF2抗原的量將降低PCV2抗體力價,並增加死亡率、平均肺病灶%和IHC陽性組織的發生率。在接受不同含量之rORF2-卡伯波的四組中,第3和第5組分別接受兩劑16或4微克的rORF2抗原,僅各有20%的IHC陽性率,且均有類似的抗體力價。整體上,以IHC陽性結果為基礎,投與rORF2抗原兩次的最低保護劑量為大約4微克。
在本發明另一項觀點中,評估重組(rORF2)和VIDO R-1(vORF2)PCV2抗原的抗原性。第2組接受兩劑16微克vORF2,而第3組接受兩劑16微克rORF2。兩種疫苗均以卡伯波作為佐劑。發現兩種疫苗均是安全的,且兩者皆有0%死亡率。第2組在第25天有2507之PCV2抗體力價,而第三組有1503之PCV2抗體力價。第3組有比第2組更低的平均肺病灶%計分(0.11±0.38%對0.90±0.15%),但第2組有比第3組更低的IHC陽性發生率(6.7%對20%)。整體而言,兩種疫苗均有類似的抗原性,但vORF2與稍佳的IHC結果有關。
在本發明另一項觀點中,判定兩種不同佐劑(卡伯波和IMS 1314)的適用性。第1和第3組皆接受2劑含有16微克rORF2抗原的疫苗,但第1組接受以IMS 1314作為佐劑的抗原,而第3組接受以卡伯波作為佐劑的抗原。兩組基本上有相同的ADWG,基本上相同的攻毒後之臨床症狀發生率,相同的死亡率,以及基本上相同的平均肺病灶%;但第1組有0%的IHC陽性率,而第3組有20%的IHC陽性率。然而,接受以卡伯波作為佐劑之疫苗的第3組,在第25、32和50天,具有比接受以IMS 1314作為佐劑之疫苗的第1組更高的IFAT PCV2力價。整體上,雖然以IMS 1314作為佐劑的PCV2疫苗提供較佳的IHC結果,但它不能提供對抗PCV2感染的壓倒性地更佳保護,並引起注射部位反應。而以卡伯波作為佐劑的PCV2疫苗效能幾乎像以IMS 1314作為佐劑的疫苗一樣好,但沒有任何有害的事件。
在本發明另一項觀點中,判定將PCV2 ORF2做成1毫升一劑之產物的可行性。第2和第4組兩者均在第0天接受16微克vORF2疫苗,以卡伯波作為佐劑,但第2組在第14天接受第二劑。第4組有比第2組稍微更高的ADWG和更低的平均肺病灶%,但第2組在第25、32和50天有較高的IFAT PCV2力價,以及稍微較低的IHC陽性組織發生率。來自這兩組的所有其他結果均是類似的。整體而言,一劑以卡伯波為佐劑的vORF2,效能類似兩劑相同的疫苗。
圖1為PCV2 ORF2重組桿狀病毒之較佳建構作用的流程圖,以及圖2a和2b分別為如何產生根據本發明之組合物的流程圖。
<110> 美商百靈佳殷格翰家畜藥品公司<120> 多價第二型豬環狀病毒(PCV2)免疫組合物及製備該組合物之方法<130> 34816-CIP1 <140> 095149377 <141> 2006-12-28 <150> 60/755,015 <151> 2005-12-29 <160> 11 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 8 <212> DNA <213> 人造的<220> <223> 這是經修飾的Kozak's序列<400> 1<210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> 人造的<220> <223> 這是重組的Eco R1序列<400> 2<210> 3 <211> 713 <212> DNA <213> 豬環狀病毒<400> 3<210> 4 <211> 713 <212> DNA <213> 豬環狀病毒<400> 4<210> 5 <211> 233 <212> 蛋白質<213> 豬環狀病毒<400> 5 <210> 6 <211> 233 <212> 蛋白質<213> 豬環狀病毒<400> 6<210> 7 <211> 756 <212> DNA <213> 人造的<220> <223> 該序列來自第二型豬環狀病毒開放編閱架構2,連同得自pGEM T-easy載體的部分<400> 7<210> 8 <211> 10387 <212> DNA <213> 人造的<220> <223> 這是第二型豬環狀病毒,ORF2構築體,其包括桿狀病毒和pGEM T-easy密碼序列<400> 8 <210> 9 <211> 20 <212> 蛋白質<213> 豬環狀病毒<400> 9<210> 10 <211> 19 <212> 蛋白質<213> 豬環狀病毒<400> 10<210> 11 <211> 233 <212> 蛋白質<213> 人造的<220> <223> 這是第二型豬環狀病毒,開放編閱架構2的胺基酸序列<400> 11
Claims (31)
- 一種單劑多價混合疫苗,其包含每劑4μg至400μg的第二型豬環狀病毒抗原,其提供保護性免疫力且可有效降低第二型豬環狀病毒感染或減少其嚴重性,以及至少一個可有效對抗引起其他豬病之生物的免疫原活性組份,其中該第二型豬環狀病毒抗原為重組表現的PCV2 ORF2蛋白質。
- 如請求項1之單劑多價混合疫苗,其中該重組表現的PCV2 ORF2蛋白質為桿狀病毒表現的PCV2 ORF2蛋白質。
- 如請求項1之單劑多價混合疫苗,可藉由將一個劑量之該疫苗投予豬隻以有效降低與PCV2病毒感染相關之臨床症狀或減少其嚴重性。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該重組表現的PCV2 ORF2蛋白質為i)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11之序列的多肽;ii)由包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之序列之DNA所編碼的多肽;iii)任何由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之核苷酸序列所編碼的多肽;或iv)任何SEQ ID NO:5提供之多肽。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該重組表現的PCV2 ORF2蛋白質係由經包含PCV2 ORF2 DNA 及表現該PCV2 ORF2蛋白質之重組桿狀病毒載體感染之細胞培養的上清液回收。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該可有效對抗引起其他豬病的生物之免疫原活性組份係選自由下列組成之群的生物之抗原:胸膜肺炎放線桿菌;腺病毒;α病毒,如東方馬腦脊髓炎病毒;支氣管敗血性博氏桿菌;短螺旋體屬,豬赤痢短螺旋體;多毛結腸短螺旋體,豬布氏桿菌,豬布氏桿菌生物型1、2和3;古典型豬瘟病毒;梭菌屬,艱難梭狀芽胞桿菌、產氣莢膜梭菌A、B和C型、諾維氏梭菌、敗血梭菌、破傷風梭菌;冠狀病毒,豬呼吸道冠狀病毒;豬附紅血球體;豬丹毒桿菌;大腸桿菌;副豬嗜血桿菌,副豬嗜血桿菌亞型1、7和14;血凝性腦脊髓炎病毒;日本腦炎病毒;胞內勞森氏菌;鈎端螺旋體屬,澳洲鈎端螺旋體;犬鈎端螺旋體;感冒傷寒性鈎端螺旋體;出血性黃疸鈎端螺旋體;和問號鈎端螺旋體;波莫納鈎端螺旋體;塔拉索夫鈎端螺旋體;分枝桿菌屬,鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌和牛分枝桿菌;肺炎黴漿菌(M hyo);敗血性巴氏桿菌;豬細胞巨大病毒;豬細小病毒;豬繁殖與呼吸徵候群(PRRS)病毒;假性狂犬病病毒;輪狀病毒;沙門氏桿菌屬,鼠傷寒沙門氏桿菌和豬霍亂沙門氏桿菌;豬葡萄球菌;葡萄球菌屬,鏈球菌屬,豬鏈球菌;豬疱疹病毒;豬流感病毒;豬痘病毒;豬痘病毒;水泡性口炎病毒和豬水疱疹病毒。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該可有效對抗引起其他豬病的生物之免疫原活性組份係包含於選自由包括於IngelVac M.hyo及IngelVac PRRS MLV所組成之群的疫苗中之抗原。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該單劑多價混合疫苗係製備用於單劑肌肉內投予小豬。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其包含每劑4μg至200μg之重組表現的PCV2 ORF2蛋白質。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該單劑多價混合疫苗係以一個劑量投予豬隻。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該單劑多價混合疫苗進一步包含失活病毒載體及細胞培養上清液。
- 如請求項11之單劑多價混合疫苗,其中該失活病毒載體係編碼PCV2 ORF2蛋白質之重組桿狀病毒。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該單劑多價混合疫苗包含BEI。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該單劑多價混合疫苗包含BEI及硫代硫酸鈉。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該單劑多價混合疫苗包含佐劑。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該單劑多價混合疫苗包含選自由丙烯酸及甲基丙烯酸或其任何聚合物組成的群之佐劑。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該單劑多價混合疫苗包含每劑約500μg至約5mg之卡伯波(Carbopol)。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該單劑多價混合疫苗在24個月的期間內是穩定的。
- 如請求項1之單劑多價混合疫苗,其中該免疫原活性組份係肺炎黴漿菌及豬繁殖與呼吸徵候群病毒之免疫學活性組份。
- 如請求項1之單劑多價混合疫苗,其中該免疫原活性組份係豬繁殖與呼吸徵候群病毒之免疫學活性組份。
- 如請求項1之單劑多價混合疫苗,其中該免疫原活性組份係肺炎黴漿菌之免疫學活性組份。
- 如請求項19或20之單劑多價混合疫苗,其係用於預防由PCV-2及PRRS所引起的感染。
- 如請求項19或21之單劑多價混合疫苗,其係用於預防由PCV-2及肺炎黴漿菌所引起的感染。
- 如請求項19之單劑多價混合疫苗,其係用於預防由PCV-2、PRRS及肺炎黴漿菌所引起的感染。
- 如請求項1至3中任一項之單劑多價混合疫苗,其中該混合疫苗係在當動物為2至8周齡時投予。
- 一種重組表現的PCV2 ORF2蛋白質與至少一種可有效對抗引起其他豬病的生物之免疫原活性組份於製備單劑多價混合疫苗之用途,該單劑多價混合疫苗包含每劑4μg至400μg的ORF2蛋白質,其提供保護性免疫力且藉由將 單劑之該疫苗投予豬隻可有效減少或降低與PCV2感染有關的臨床症狀之嚴重性。
- 如請求項26之用途,其中該PCV2 ORF2蛋白質係i)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11之序列的多肽;ii)由包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之序列之DNA所編碼的多肽;iii)任何由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之核苷酸序列所編碼的多肽;或iv)任何SEQ ID NO:5提供之多肽。
- 如請求項26或27之用途,其中該可有效對抗引起其他豬病的生物之免疫原活性組份係選自由下列組成之群的生物之抗原:胸膜肺炎放線桿菌;腺病毒;α病毒,如東方馬腦脊髓炎病毒;支氣管敗血性博氏桿菌;短螺旋體屬,豬赤痢短螺旋體;多毛結腸短螺旋體,豬布氏桿菌,豬布氏桿菌生物型1、2和3;古典型豬瘟病毒;梭菌屬,艱難梭狀芽胞桿菌、產氣莢膜梭菌A、B和C型、諾維氏梭菌、敗血梭菌、破傷風梭菌;冠狀病毒,豬呼吸道冠狀病毒;豬附紅血球體;豬丹毒桿菌;大腸桿菌;副豬嗜血桿菌,副豬嗜血桿菌亞型1、7和14;血凝性腦脊髓炎病毒;日本腦炎病毒;胞內勞森氏菌;鈎端螺旋體屬,澳洲鈎端螺旋體;犬鈎端螺旋體;感冒傷寒性鈎端螺旋體;出血性黃疸鈎端螺旋體;和問號鈎端螺旋體;波莫納鈎端螺旋體;塔拉索夫鈎端螺旋體;分枝 桿菌屬,鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌和牛分枝桿菌;肺炎黴漿菌(M hyo);敗血性巴氏桿菌;豬細胞巨大病毒;豬細小病毒;豬繁殖與呼吸徵候群(PRRS)病毒;假性狂犬病病毒;輪狀病毒;沙門氏桿菌屬,鼠傷寒沙門氏桿菌和豬霍亂沙門氏桿菌;豬葡萄球菌;葡萄球菌屬,鏈球菌屬,豬鏈球菌;豬疱疹病毒;豬流感病毒;豬痘病毒;豬痘病毒;水泡性口炎病毒和豬水疱疹病毒。
- 如請求項26或27之用途,其中該可有效對抗引起其他豬病的生物之免疫原活性組份係豬繁殖與呼吸徵候群(PRRS)病毒的抗原。
- 如請求項26或27之用途,其中該可有效對抗引起其他豬病的生物之免疫原活性組份係肺炎黴漿菌(M hyo)的抗原。
- 如請求項26或27之用途,其中該疫苗包含每劑4μg至200μg之該ORF2蛋白質。
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