BR112013007486B1 - composição, vetor recombinante de ndv e uso da referida composição - Google Patents

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Abstract

composição, vetor recombinante de ndv e uso da referida composição a presente invenção engloba vacinas ou composições recombinantes de vírus da doença de newcastle-herpesvírus. a presente invenção engloba vetores recombinantes de ndv que codificam e expressam patógenos, antígenos, proteínas, epítopos ou imunógenos de herpesvírus. tais vacinas ou composições podem ser usadas para proteger animais contra doenças.

Description

COMPOSIÇÃO, VETOR RECOMBINANTE DE NDV E USO DA REFERIDA COMPOSIÇÃO
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica benefício do pedido de patente provisório de número de série US 61/378,575, depositado em 31 de agosto de 2010.
CAMPO DA INVENÇÃO [0002] A presente invenção engloba as vacinas ou composições de Herpesvírus vetorizadas com NDV.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0003] Vários estudos nos últimos anos evidenciaram o potencial do vírus da doença de Newcastle (NDV) para ser usado como um vetor de vacina para doenças aviárias (Krishnamurthy e col., Virology 278, 168-182, 2000; Huang e col., J. Gen. Virol. 82, 1729-1736, 2001; Nakaya e col., J. Virol. 75, 11868-11873, 2001, Park e col., PNAS 103, 82038208, 2006; Veits e col., PNAS 103, 8197-8202, 2006; Ge e col. J. Virol. 81, 150-158, 2007; Romer-Oberdorfer e col. Vaccine 26, 2307-2313, 2008).
[0004] O NDV pertence à família Paramyxovirinae e ao gênero Avulavirus. O NDV se replica nos tratos respiratório e gastrointestinal, no oviduto e, para alguns isolados, no sistema nervoso. A transmissão é aerogênica e por vias oral e fecal. O NDV causa uma doença altamente
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2/76 contagiosa e fatal que afeta todas as espécies de aves, e pode infectar algumas espécies de mamíferos. A doença pode variar de clinicamente inaparente a formas altamente virulentas, dependendo da cepa do vírus e das espécies hospedeiras. O espectro contínuo de virulência apresentado por cepas de NDV permitiu o agrupamento destes em três diferentes patótipos: lentogênico, mesogênico e velogênico (Alexander, D.J., Diseases of Poultry, Iowa State Uni. Press, Ames IA, 541-569, 1997). Cepas lentogênicas normalmente não causam doença em frangos adultos e são amplamente utilizadas como vacinas vivas em indústrias avícolas nos Estados Unidos e outros países. Os vírus de virulência intermediária são denominados mesogênicos, enquanto que os vírus que causam elevada mortalidade são denominados velogênicos. A doença tem uma distribuição mundial e continua a ser a principal ameaça constante para a produção comercial de aves.
[0005] O genoma do NDV é uma cadeia negativa não segmentada de RNA de cerca de 15kb. O RNA genômico contém seis genes que codificam as proteínas a seguir na ordem de: a proteína de nucleocapsídeo (NP), fosfoproteína (P), proteína de matriz (M), proteína de fusão (F), hemaglutinina-neuramimidase (HN) e proteína de polimerase grande (L). Duas proteínas adicionais, V e W, de função
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desconhecida, são produzidas por edição de RNA durante a
transcrição do gene P (Steward e col., 1993, Journal of
General Virology 74:2539-2547).
[0006] O desenvolvimento de métodos para a
recuperação completa de vírus de RNA negativos não segmentados a partir de cDNA clonado, estabelecido nos últimos anos, abriu a possibilidade de manipular geneticamente este grupo de vírus, incluindo NDV (Conzelmann, KK, Ann. Rev. Genet. 32, 123-162, 1998; Roberts e Rose, Virology 247, 1-6, 1998). Esta metodologia de genética molecular única, denominada genética reversa, fornece um meio não só para investigar as funções de vários genes codificados por vírus (Palese e col., PNAS 93, 11354-11358, 1996; Nagai, Y., Rev. Med. Virol. 9, 83-99, 1999), mas também para permitir a utilização desses vírus para expressar genes heterólogos (Bukreyev e col., J. Virol. 70, 6634-6641, 1996.; Mebatsion e col., PNAS 93, 7310-7314, 1996; Schnell e col., PNAS 93, 11359-11365, 1996; Hasan e col, J. Gen. Virol. 78, 2813-2820, 1997, He e col., Virology 237, 249-260, 1997;
Sakai e col., FEBS Lett. 45, 221-226, 1999). Isto proporciona um novo método de geração de vacinas e vetores de vacina melhorados. Recentemente, o NDV foi utilizado como um vetor para a expressão de antígenos da gripe aviária (US 2010/0255029, Merial Limited).
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4/7 6 [0007] A glicoproteína D (gD) de Herpesvirus é essencial para a entrada de FHV-1 (Herpesvírus felino-1) e está envolvida na interação com a célula hospedeira (ligação aos receptores). A proteína gD tem atividades de hemaglutinação nos glóbulos vermelhos de felinos (Maeda e col., Virology 202, 1034-8, 1994,. Maeda e col., Virus Res. 46, 75-80, 1996). A glicoproteína B (gB) de Herpesvírus é essencial para a entrada de FHV e está envolvida no processo de fusão (Spatz e Maes, Virology 197, 125-36, 1993; Maeda e col., Virus Res. 39, 55-61, 1995). Ambas as glicoproteínas podem induzir anticorpos neutralizantes (Horimoto e col., Arch Virol 111, 127-32, 1990).
[0008] Considerando a susceptibilidade dos animais, incluindo de seres humanos, ao Herpesvírus, um meio de prevenção da infecção pelo Herpesvírus e proteção dos animais é essencial. Por conseguinte, existe uma necessidade por uma vacina eficaz contra o Herpesvírus.
[0009] A citação ou a identificação de qualquer documento neste pedido de patente não é uma admissão de que tal documento esteja disponível como estado da técnica para a presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0010] A presente invenção se refere a uma vacina ou composição vetorizada com NDV que compreende um ou mais
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5/76 vetores recombinantes, geneticamente modificados de NDV que expressam e abrigam certos antígenos de Herpesvírus, tal como um antígeno de herpesvírus felino e, opcionalmente, um carreador, adjuvante, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. O NDV pode ser a cepa de NDV AVINEW®, uma vacina viva modificada comercializada pela Merial Limited.
[0011] O antígeno de Herpesvírus pode ser uma
glicoproteína. O antígeno de Herpesvírus pode ser um
antígeno de glicoproteína B (gB) ou glicoproteína D (gD) de
um herpesvírus felino.
[0012] A invenção também se refere a um método de vacinação de um animal que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de uma ou mais vacinas ou composições que podem compreender uma quantidade eficaz de um vetor de NDV recombinante e, opcionalmente, um carreador, adjuvante, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. A administração pode ser via in ovo, oro-nasal, colírio, spray, água potável ou parenteral (subcutânea, intramuscular, transdérmica, intradérmica).
[0013] A presente invenção se refere ainda à administração da vacina ou composição usando protocolo de dose inicial-reforço. A invenção abrange ainda um kit para
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6/76 a realização de um método para suscitar ou induzir uma resposta imune, que pode compreender qualquer uma das composições imunológicas ou vacinas do Herpesvírus recombinante ou composições imunológicas ou vacinas inativadas, e instruções para realização do método.
[0014] Desta forma, é um objeto da presente invenção não englobar no âmbito da invenção qualquer produto, processo de fabricação do produto ou método de utilização do produto previamente conhecidos, de tal forma que os Depositantes reservam-se o direito e por este meio divulgam um aviso legal de qualquer produto, processo ou método previamente conhecido. Nota-se ainda que a presente invenção não tem a intenção de englobar dentro de seu escopo qualquer produto, processo ou fabricação do produto ou do método de utilização do produto, que não corresponde ao relatório descritivo e requisitos de suficiência descritiva do USPTO (35 USC § 112, primeiro parágrafo) ou do EPO (artigo 83 do EPC), de tal forma que os Depositantes reservam-se o direito e decidem divulgar um aviso legal de qualquer produto, processo de fabricação do produto ou método de usar o produto descritos anteriormente.
[0015] Estas e outras concretizações são divulgadas ou óbvias e englobadas pela descrição detalhada a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
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7/76 [0016] A descrição detalhada que se segue, dada a título de exemplo, mas não destinada a limitar a invenção apenas às concretizações específicas descritas, pode ser melhor entendida em conjunto com os desenhos anexos, em que:
[0017] A Figura 1 é uma tabela que mostra a SEQ ID NO atribuída às sequências de DNA e proteína.
[0018] A Figura 2A ilustra um mapa genético do genoma de NDV de comprimento total; a Figura 2B representa um mapa que ilustra o mapa genético de dois vetores de NDV geneticamente modificados com a inserção de gB ou gD de herpesvírus em dois sítios de inserção intergênicos representativos sobre o genoma de NDV de comprimento total; A Figura 2C é um exemplo de diagrama de fluxo do sistema de genética reversa de NDV.
[0019] A Figura 3 descreve a geração de plasmídeo de transcrição de NDV contendo gene gB (plasmídeo pFR14) ou gene gD (plasmídeo pFR16) do herpesvírus felino (FHV).
[0020] A Figura 4 representa os mapas dos
plasmídeos pFR14 e pFR16.
[0021] A Figura 5 mostra a temperatura retal média
de gatos após o desafio. O grupo A é NDV-HV por ON (oro-
nasal), o grupo B é NDV-HV por SC (subcutânea), o grupo C é o controle positivo (vacina contendo cepa F2 de Herpesvírus felino atenuado, Merial Limited) e o grupo D é o controle
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8/76 negativo (sem vacinação).
[0022] A Figura 6 mostra o peso corporal médio dos gatos após o desafio. O grupo A é NDV-HV por ON, o grupo B é NDV-HV por SC, o grupo C é o controle positivo (vacina contendo cepa F2 de Herpesvírus felino atenuado, Merial Limited) e o grupo D é o controle negativo (sem vacinação).
[0023] A Figura 7 ilustra os dados coletados sobre os sinais clínicos dos gatos após o desafio. O grupo A é NDV-HV por ON, o grupo B é NDV-HV por SC, o grupo C é o controle positivo (vacina contendo cepa F2 de Herpesvírus felino atenuado, Merial Limited) e o grupo D é o controle negativo (sem vacinação).
[0024] A Figura 8 ilustra a análise estatística dos sinais clínicos dos gatos após o desafio. O grupo A é NDVHV por ON, o grupo B é NDV-HV por SC, o grupo C é o controle positivo (vacina contendo cepa F2 de Herpesvírus felino atenuada, Merial Limited) e o grupo D é o controle negativo (sem vacinação).
[0025] A Figura 9 representa a excreção viral dos gatos após o desafio. O grupo A é NDV-HV por ON, o grupo B é NDV-HV por SC, o grupo C é o controle positivo (vacina contendo cepa F2 de Herpesvírus felino atenuado, Merial Limited) e o grupo D é o controle negativo (sem vacinação).
[0026] A Figura 10 é a análise estatística da
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9/76 excreção viral dos gatos após o desafio. O grupo A é NDV-HV por ON, o grupo B é NDV-HV por SC, o grupo C é o controle positivo (vacina contendo cepa F2 de Herpesvírus felino atenuado, Merial Limited) e o grupo D é o controle negativo.
[0027] A Figura 11 mostra a evolução do título médio de FHV Ab (anti-gB) por grupo. O grupo A é NDV-HV por
ON, o grupo B é NDV-HV por SC, o grupo C é o controle
positivo (vacina contendo cepa F2 de Herpesvírus felino
atenuado, Merial Limited) e o grupo D é o controle negativo
(sem vacinação).
[0028] A Figura 12 ilustra o alinhamento da
sequência da proteína gB e a porcentagem de identidade de sequência.
[0029] A Figura 13 ilustra o alinhamento da sequência da proteína gD e a porcentagem de identidade de sequência.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0030] Nota-se que na presente descrição e, particularmente, nas reivindicações e/ou parágrafos, os termos tais como compreende, compreendido, compreendendo e similares podem ter o significado que lhes é atribuído na lei de Patentes dos EUA; por exemplo, podem significar inclui, incluído, incluindo e similares; e que os termos tais como consistindo
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10/76 essencialmente de e “consiste essencialmente de” têm o significado que lhes é atribuído na lei de Patentes dos EUA, por exemplo, permitem elementos não explicitamente recitados, mas excluem elementos que se encontram no estado da técnica ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.
[0031] A menos que explicado de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que normalmente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual pertence esta divulgação. Os termos singulares a, um, e o incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra ou destina-se a incluir e a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[0032] Na presente invenção, a cepa AVINEW® é utilizada como o vetor de NDV (US 2010/0255029).
[0033] A presente invenção se refere a uma vacina ou composição que pode compreender uma quantidade eficaz de um ou mais vetores geneticamente modificados de NDV e, opcionalmente, um carreador, adjuvante, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.
[0034] A presente invenção compreende um vetor geneticamente modificado de NDV que expressa uma proteína,
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11/76 polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvirus que suscita uma resposta imunogênica em um animal. A proteína, polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus pode ser uma proteína, polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus felino.
[0035] Tal como utilizado no presente, o termo polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus se refere a qualquer polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno de um herpesvírus. O herpesvírus pode ser um herpesvírus felino, herpesvírus canino, herpesvírus focídeo. O polipeptídeo de herpesvírus pode ser uma glicoproteína de herpesvírus incluindo, mas não se limitando, a proteína gD ou gB de herpesvírus.
[0036] Por animal entendem-se mamíferos, humanos, aves e similares. O animal pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de equinos (por exemplo, cavalo), caninos (por exemplo, cães, lobos, raposas, coiotes, chacais), felinos (por exemplo, leões, tigres, gatos domésticos, gatos selvagens, outros grandes gatos e outros felinos, incluindo leopardos e linces), ovinos (por exemplo, ovelhas), bovinos (por exemplo, gado, vaca, búfalo), suínos (porco), aves (por exemplo, galinha, pato, ganso, peru, codorna, faisão, papagaio, tentilhões, falcão, corvo, avestruz, ema e casuar), primatas (por exemplo, prossímios,
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12/76 társios, macaco, gibão, macaco sem cauda (ape)) e peixes. O termo animal também inclui um animal individual em todas as fases de desenvolvimento, incluindo estágios embrionários e fetais.
[0037] Em uma concretização, a composição imunológica ou vacina de herpesvírus compreende um ou mais vetores geneticamente modificados de NDV, e, opcionalmente, um excipiente, adjuvante, carreador ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. O vetor de
NDV geneticamente modificado pode ser um vetor de expressão de NDV compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína, polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus. A proteína, polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus pode ser uma glicoproteína ou qualquer fragmento da mesma. A proteína, polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus pode ser uma proteína gB ou gD ou qualquer fragmento da mesma.
[0038] Tal como utilizado no presente, o termo antígeno ou imunógeno designa uma substância que induz uma resposta imune específica em um animal hospedeiro. O antígeno pode compreender um organismo inteiro morto, atenuado ou vivo; uma subunidade ou porção de um organismo; um vetor recombinante contendo uma inserção que expressa um epítopo, polipeptídeo, peptídeo, proteína ou fragmento dos
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13/76 mesmos com propriedades imunogênicas; uma parte ou fragmento de ácido nucleico capaz de induzir uma resposta imune sob apresentação a um animal hospedeiro; uma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, um epítopo, um hapteno ou qualquer combinação dos mesmos. Alternativamente, o imunógeno ou antígeno pode compreender uma toxina ou antitoxina.
[0039] O termo proteína ou peptídeo imunogênico tal como utilizado no presente, também inclui peptídeos e polipeptídeos que são imunologicamente ativos no sentido de que, uma vez administrados ao hospedeiro, seja capaz de evocar uma resposta imune do tipo humoral e/ou celular dirigida contra a proteína. De preferência, o fragmento de proteína é tal que possui substancialmente a mesma atividade imunológica que a proteína total. Assim, um fragmento de proteína de acordo com a presente invenção compreende ou consiste essencialmente de ou consiste de pelo menos um epítopo ou determinante antigênico. O termo epítopo, também conhecido como determinante antigênico, é a parte de uma macromolécula reconhecida pelo sistema imune e capaz de induzir uma reação imune do tipo humoral (células B) e/ou do tipo celular (células T).
[0040] O termo proteína ou peptídeo imunogênico contempla ainda deleções, adições e substituições à
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14/76 sequência, desde que o polipeptídeo funcione para produzir uma resposta imunológica tal como definida no presente documento. A este respeito, substituições especialmente preferidas serão geralmente de natureza conservativa em natureza, isto é, aquelas substituições que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos estão geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácidos aspartato e glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) apolares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares não carregados - glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina são por vezes classificados como aminoácidos aromáticos. É razoavelmente previsível que uma substituição isolada de leucina por isoleucina ou valina ou vice-versa; um aspartato por um glutamato ou vice-versa; uma treonina por uma serina ou vice-versa; ou uma substituição conservativa similar de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado, não terá um efeito importante sobre a atividade biológica. Proteínas tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a molécula de referência, mas possuindo pequenas substituições de aminoácidos que não afetam substancialmente a imunogenicidade da proteína estão,
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15/76 portanto, dentro da definição do polipeptídeo de referência.
[0041] O termo epítopo é a parte de uma macromolécula reconhecida pelo sistema imune e capaz de induzir uma reação imune do tipo humoral (células B) e/ou do tipo celular (células T). O termo é também utilizado de forma intercambiável com determinante antigênico ou sítio determinante antigênico. Anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados em um imunoensaio simples, demostrando a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo.
[0042] Uma resposta imunológica a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo a uma composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma resposta imunológica inclui, mas não está limitada, a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos, células B, células T auxiliares e/ou células T citotóxicas, dirigidas especificamente para um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. De preferência, o hospedeiro irá exibir tanto uma resposta imunológica terapêutica quanto protetora, de tal modo que a resistência à nova infecção será aumentada e/ou a gravidade clínica da doença reduzida. Tal proteção será demonstrada tanto por uma redução ou ausência de sintomas normalmente
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16/76 apresentados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou de um título viral reduzido no hospedeiro infectado.
[0043] O termo proteína ou polipeptídeo imunogênico, tal como utilizado no presente documento, refere-se também a uma sequência de aminoácidos que provoca uma resposta imunológica tal como descrita acima. Uma proteína ou um polipeptídeo imunogênico, tal como utilizado no presente documento, inclui a sequência de comprimento total das proteínas, seus análogos ou fragmentos imunogênicos destas. Por fragmento imunogênico entende-se um fragmento de uma proteína que inclui um ou mais epítopos e, assim, induz a resposta imunológica descrita acima. Tais fragmentos podem ser identificados usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopos, bem conhecidas no estado da técnica. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por exemplo, os epítopos lineares podem ser determinados através de, por exemplo, síntese concomitante de um grande número de peptídeos em suportes sólidos, os peptídeos correspondendo às porções da molécula de proteína, e reação dos peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos estão ainda ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas no estado da técnica e estão descritas, por
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17/76 exemplo, na patente US 4,708,871; Geysen e col., 1984; Geysen e col., 1986. Do mesmo modo, os epítopos conformacionais são prontamente identificados por determinação da conformação espacial de aminoácidos, tais como, por exemplo, através de cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.
[0044] Os antígenos sintéticos também estão incluídos na definição, por exemplo, poliepítopos, epítopos flanqueadores e outros antígenos recombinantes ou sinteticamente derivados. Fragmentos imunogênicos, para os fins da presente invenção, normalmente incluirão pelo menos cerca de 3 aminoácidos, cerca de 5 aminoácidos, cerca de 10 a 15 aminoácidos, cerca de 15 a 25 aminoácidos ou mais aminoácidos da molécula. Não existe um limite superior crítico para o comprimento do fragmento, que pode compreender quase o comprimento total da sequência da proteína, ou mesmo uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um epítopo da proteína.
[0045] Assim, uma estrutura mínima de um polinucleotídeo que expressa um epítopo é aquela que compreende ou consiste essencialmente de ou consiste de nucleotídeos para codificar um epítopo ou determinante antigênico da proteína ou polipeptídeo de herpesvírus. Um
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18/76 polinucleotídeo que codifica um fragmento da proteína total ou polipeptídeo compreende ou consiste essencialmente de ou consiste de um mínimo de 15 nucleotídeos, vantajosamente cerca de 30 a 45 nucleotídeos e, preferencialmente, cerca de 45 a 75, pelo menos 57, 87 ou 150 nucleotídeos consecutivos ou contíguos da sequência que codifica a proteína total ou polipeptídeo. Procedimentos de determinação de epítopo, tais como a geração de bibliotecas peptídicas sobrepostas (Hemmer e col., 1998), Pepscan (Geysen e col., 1984; Geysen e col., 1985; Van der Zee R. e col., 1989; Geysen, 1990; Multipin. RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) e algoritmos (De Groot e col., 1999) podem ser usadas na prática da presente invenção, sem experimentação indevida.
[0046] Um polinucleotídeo é uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento que contém desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e análogos em qualquer combinação. Os polinucleotídeos podem ter estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função conhecida ou desconhecida. O termo polinucleotídeo inclui moléculas
helicoidais de fita dupla, única e tripla. A menos que
especificado ou requerido de outra forma, qualquer
concretização da invenção aqui descrita que seja um
polinucleotídeo abrange tanto a forma de dupla fita e cada
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uma das duas formas complementares conhecidas ou previstas
para fazer a forma de dupla fita tanto de DNA, RNA ou
molécula híbrida.
[0047] O termo otimização de códon se refere ao
processo de configuração ótima da sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína, polipeptídeo, antígeno, epítopo, domínio ou fragmento para a expressão/tradução em um hospedeiro selecionado. Em geral, os níveis de expressão gênica dependerão de muitos fatores, tais como sequências promotoras e elementos regulatórios. Um dos fatores mais importantes é a adaptação da utilização de códon do gene transcrito à utilização de códon típico do hospedeiro (Lithwich, G. e Margalit, H., Genome Res. 13, 2665-2673, 2003). Portanto, os genes altamente expressos em genomas procarióticos sob seleção translacional têm uma propensão de uso pronunciado de códon. Isto ocorre porque eles utilizam um pequeno subconjunto de códons que são reconhecidos pelas espécies mais abundantes de RNAt (Ikemura, T., J. Mol. Biol. 151, 389-409, 1981) . A força que modula esta adaptação de códon é chamada de seleção translacional e a sua força é importante em bactérias de crescimento rápido (Rocha, E.P., Genome Res. 14, 2279-2286, 2004; Sharp, P.M. e col., Nucleic Acids Res. 33, 1141-1153) . Se um gene contém códons que são raramente utilizados pelo hospedeiro, seu nível de
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20/76 expressão não será máximo. Esta pode ser uma das limitações de expressão da proteína heteróloga (Gustafsson, C. e col., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004) e do desenvolvimento de vacinas de DNA (Ivory, C. e Chadee, K., Genet. Vaccines Ther. 2, 17, 2004). Um grande número de genes sintéticos foram reprojetados para aumentar o seu nível de expressão. A Base de Dados de Gene Sintético (SGDB) (Wu, G. e col., Nucleic Acids Res. 35, D76-D79, 2007) contém a informação de mais de 200 experimentos publicados sobre genes sintéticos. No processo de criação de uma sequência de ácido nucleico que será inserida em um novo hospedeiro para expressar uma certa proteína em quantidades ótimas, a otimização do uso de códons é geralmente uma das primeiras etapas (Gustafsson, C., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004). A otimização do uso de códons basicamente envolve alterar os códons raros no gene alvo de modo que eles reflitam com maior precisão o uso de códons do hospedeiro, sem modificar a sequência de aminoácidos da proteína codificada (Gustafsson, C., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004). A informação geralmente utilizada para o processo de otimização é, portanto, o DNA ou a sequência da proteína a ser otimizada e uma tabela de utilização de códons (conjunto de referência) do hospedeiro.
[0048] Existem diversos servidores de internet públicos e de aplicações autônomas que permitem algum tipo de
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21/76 otimização de códon por qualquer técnico no assunto. GeneDesign” (Richardson, S.M. e col., Genome Res. 16, 550556, 2006), “Synthetic Gene Designer” (Wu, G. e col., Protein Expr. Purif. 47, 441-445, 2006) e Gene Designer” (Villalobos, A. e col., BMC Bioinformatics 7, 285, 2006) são pacotes que fornecem uma plataforma para a concepção de um gene sintético, incluindo uma etapa de otimização de códon. No que diz respeito aos métodos para otimização do uso de códons disponíveis em cada servidor ou programa, os primeiros programas desenvolvidos utilizaram apenas a abordagem um aminoácido-um códon”. Programas e servidores mais recentes agora incluem outros métodos para criar alguma variabilidade de uso de códon. Esta variabilidade reflete a variabilidade de uso de códon de genes naturais altamente expressos e permite critérios adicionais a serem introduzidos (tais como a prevenção de sítios de restrição) no processo de otimização. A maioria dos aplicativos e servidores de internet descritos no presente fornecem três métodos de otimização de códon: uma otimização completa de todos os códons, uma otimização com base nas frequências relativas de uso de códon do conjunto de referência que usa uma abordagem de Monte Carlo e uma nova abordagem projetada para maximizar a otimização com as mudanças mínimas entre as sequências de consulta e as otimizadas.
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22/76 [0049] Em uma concretização, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína, antígeno, peptídeo, polipeptídeo, fragmento, domínio ou epítopo recombinante é códon-otimizada para a expressão em animais. Em outra concretização, as sequências códon-otimizadas codificam proteínas, antígenos, peptídeos, polipeptídeos, fragmentos, domínios ou epítopos de herpesvírus felino para a expressão animal. Ainda em outra concretização, as sequências códonotimizadas codificam proteínas gB ou gD, antígenos, peptídeos, polipeptídeos, fragmentos, domínios ou epítopos de herpesvírus para a expressão animal.
[0050] Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene, éxons, íntrons, RNAm, RNAt, RNAr, RNAsi, ribozimas, DNAc, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo, uracila, outros açúcares e os grupos de ligação, tais como fluororibose e tiolato, e ramificações de nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos pode ser adicionalmente modificada após polimerização, tal como por conjugação, com
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23/76 um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluídas nesta definição estão tampões, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo e introdução de meios para ligar o polinucleotídeo à proteínas, íons metálicos, componentes de marcação, outros polinucleotídeos ou suporte sólido. Os polinucleotídeos podem ser obtidos por síntese química ou derivados de um microrganismo.
[0051] O termo gene é utilizado amplamente para se referir a qualquer segmento de polinucleotídeo associado a uma função biológica. Assim, os genes incluem íntrons e éxons como na sequência genômica ou apenas as sequências de codificação como no DNAc e/ou nas sequências regulatórias
necessárias para a sua expressão. Por exemplo, o gene
também se refere a um fragmento de ácido nucleico que
expressa RNAm ou RNA funcional, ou codifica uma proteína
específica, e que inclui sequências regulatórias.
[0052] A presente invenção compreende ainda uma
cadeia complementar a um polinucleotídeo que codifica uma proteína, antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus. A cadeia complementar pode ser polimérica e de qualquer comprimento e pode conter desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e análogos, em qualquer combinação dos mesmos.
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24/76 [0053] Os termos proteína, peptídeo, polipeptídeo e fragmento de polipeptídeo são utilizados de forma intercambiável no presente documento para se referir a polímeros de resíduos de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados ou análogos de aminoácidos e pode ser interrompido por porções químicas diferentes de aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ponte dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente bioativo ou de marcação.
[0054] Um polinucleotídeo ou polipeptídeo isolado é um que está substancialmente livre de materiais com os quais está associado no seu ambiente nativo. Por substancialmente livre, entende-se pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou, pelo menos, 95% livre de tais materiais.
[0055] Reações de hibridização podem ser realizadas em condições de diferentes estringências. Condições que aumentam a estringência de uma reação de hibridização são bem conhecidas. Ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook e col., 1989).
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Exemplos de condições relevantes incluem (por ordem de estringência crescente): temperaturas de incubação de 25°C, 37°C, 50°C e 68°C; concentrações de tampão de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (em que SSC é NaCl 0,15 M e tampão de citrato 15 mM) e seus equivalentes utilizando outros sistemas tampão; concentrações de formamida de 0%, 25%, 50%, e 75%; tempos de incubação de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 ou mais etapas de lavagem; tempos de incubação de lavagem de 1, 2 ou 15 minutos; e soluções de lavagem de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC ou água deionizada.
[0056] A presente invenção também engloba polinucleotídeos que codificam variantes e derivados funcionalmente equivalentes dos polipeptídeos de herpesvírus e fragmentos funcionalmente equivalentes destes que podem aumentar, diminuir ou não afetar significativamente as propriedades inerentes dos polipeptídeos codificados deste modo. Estas variantes, derivados e fragmentos funcionalmente equivalentes exibem a capacidade de reter a atividade. Por exemplo, alterações na sequência de DNA que não alteram a sequência de aminoácidos codificada, bem como as que resultam em substituições conservativas de resíduos de aminoácidos, uma ou poucas deleções ou adições de aminoácidos e substituição de resíduos de aminoácidos por análogos de aminoácidos são as que não afetarão
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26/76 significativamente as propriedades do polipeptídeo codificado. Em uma concretização, as variantes possuem pelo
menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%,
pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos
85%, pelo menos 86 %, pelo menos 87%, pelo menos i 88%, pelo
menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%,
pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos
96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99 % de
homologia ou identidade com o polinucleotídeo ou
polipeptídeo de interesse de herpesvírus.
[0057] Em um aspecto, a presente invenção fornece polipeptídeos de herpesvírus, particularmente polipeptídeos gB de herpesvírus. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo que possui uma sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 ou 15 e variante ou fragmento das mesmas.
[0058] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo possuindo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ao polipeptídeo gB de herpesvírus da presente invenção, particularmente ao polipeptídeo possuindo uma sequência tal como estabelecido nas SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 ou 15.
[0059] Em ainda outro aspecto, a presente invenção
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27/76 fornece fragmentos e variantes dos polipeptídeos gB de herpesvirus acima identificados (SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13, ou 15), que podem ser facilmente preparados por uma pessoa versada na técnica utilizando técnicas bem conhecidas de biologia molecular.
[0060] As variantes são polipeptídeos homólogos possuindo uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os polipeptídeos antigênicos da presente invenção, particularmente para a sequência de aminoácidos conforme estabelecida nas SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 ou 15.
[0061] Um fragmento imunogênico de um polipeptídeo gB de herpesvírus inclui pelo menos 8, 10, 15 ou 20 aminoácidos consecutivos, pelo menos 21 aminoácidos, pelo menos 23 aminoácidos, pelo menos 25 aminoácidos ou pelo menos 30 aminoácidos do polipeptídeo gB de herpesvírus, possuindo uma sequência tal como estabelecido nas SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 ou 15 ou variantes das mesmas. Em outra concretização, um fragmento do polipeptídeo gB de herpesvírus inclui um epítopo antigênico específico encontrado em um polipeptídeo gB de herpesvírus de comprimento total.
[0062] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo gB
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28/76 de herpesvírus, tal como um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo possuindo uma sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 ou 15. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo possuindo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo possuindo uma sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NO: 1, 7, 8, 9, 11, 13 ou 15 ou uma variante conservativa, uma variante alélica, um homólogo ou um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos oito ou pelo menos 10 aminoácidos consecutivos de um destes polipeptídeos ou uma combinação destes
polipeptídeos. O polinucleotídeo que codifica o
polipeptídeo gB de herpesvírus pode ser códon-otimizado
para a expressão em uma espécie animal específica.
[0063] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos tal como apresentada nas SEQ ID NO: 2, 3, 10, 12, 14 ou 16 ou uma variante das mesmas. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polinucleotídeo que possui uma sequência tal
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29/76 como estabelecida nas SEQ ID NO: 2, 3, 10, 12, 14 ou 16 ou uma variante das mesmas.
[0064] Em um aspecto, a presente invenção fornece polipeptídeos de herpesvírus, particularmente polipeptídeos gD de herpesvírus. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo que possui uma sequência tal como
estabelecida nas SEQ ID NO : 4, 17, 19, 21, ou 23 e variante
ou fragmento das mesmas.
[0065] Em outro aspecto, a presente invenção
fornece um polipeptídeo possuindo pelo menos 70%, pelo
menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo gD de herpesvírus da presente invenção, em particular os polipeptídeos com uma sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 ou 23.
[0066] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece fragmentos e variantes dos polipeptídeos gD de herpesvírus acima identificados (SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 ou 23) que podem ser facilmente preparados por um técnico no assunto utilizando técnicas bem conhecidas de biologia molecular.
[0067] As variantes são polipeptídeos homólogos possuindo uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de
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30/76 identidade com os polipeptídeos antigênicos da presente
invenção, particularmente à sequência de aminoácidos tal
como estabelecida nas SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 ou 23.
[0068] Um fragmento imunogênico de um polipeptídeo
gD de herpesvírus inclui pelo menos 8, 10, 15 ou 20
aminoácidos consecutivos, pelo menos 21 aminoácidos, pelo menos 23 aminoácidos, pelo menos 25 aminoácidos ou pelo
menos 30 aminoácidos do polipeptídeo gD de herpesvírus
possuindo uma sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 ou 23 ou variante da mesma. Em outra concretização, um fragmento de um polipeptídeo gD de herpesvírus inclui um epítopo antigênico específico
encontrado em um polipeptídeo gD de herpesvírus de
comprimento total.
[0069] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo gD de herpesvírus, tal como um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo possuindo uma sequência tal como estabelecida nas SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 ou 23. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo possuindo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo possuindo uma sequência tal como estabelecida
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31/76 nas SEQ ID NO: 4, 17, 19, 21 ou 23 ou uma variante conservative, uma variante alélica, um homólogo ou um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos 8 ou pelo menos 10 aminoácidos consecutivos de um destes polipeptídeos ou uma combinação destes polipeptídeos. O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo gD de herpesvirus pode ser códon-otimizado para expressão em uma espécie animal específica.
[0070] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo possuindo uma sequência de nucleotídeos tal como estabelecida nas SEQ ID NO: 5, 6, 18, 20, 22 ou 24 ou uma variante da mesma. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo
possuindo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%,
pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%,
98% ou 99% de identidade de sequência com um
polinucleotídeo possuindo uma sequência tal como
estabelecida nas SEQ ID NO: 5, 6, 18, 20, 22 ou 24 ou uma
variante da mesma.
[0071] Em geral, a comparação das sequências de aminoácidos é obtida pelo alinhamento de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de uma estrutura conhecida com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de estrutura desconhecida. Os aminoácidos nas sequências são então
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32/76 comparados e os grupos de aminoácidos que são homólogos são agrupados em conjunto. Este método detecta regiões conservadas dos polipeptídeos e considera as inserções e deleções de aminoácidos. A homologia entre as sequências de aminoácidos pode ser determinada por meio de algoritmos disponíveis comercialmente (ver também a descrição de homologia acima). Além daqueles de outra forma aqui mencionados, é feita menção aos programas BLAST, BLAST gapped, BLASTN, BLASTP e PSI-BLAST, fornecidos pelo National Center for Biotechnology Information. Estes programas são amplamente utilizados na técnica para este fim e podem alinhar regiões homólogas de duas sequências de aminoácidos.
[0072] Alternativamente ou adicionalmente, o termo homologia ou identidade, por exemplo, no que diz respeito a uma sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos, pode indicar uma medida quantitativa de homologia entre duas sequências. A identidade de sequência percentual pode ser calculada como (Nref - Ndlf) * 100/Nref, em que Ndlf é o número total de resíduos não idênticos nas duas sequências quando alinhadas e em que Nref é o número de resíduos em uma das sequências. Assim, a sequência de DNA AGTCAGTC terá uma identidade de sequência de 75% com a sequência AATCAATC (Nref = 8; Ndif = 2).
[0073] Alternativamente ou adicionalmente,
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33/76 homologia ou identidade no que diz respeito às sequências pode se referir ao número de posições com nucleotídeos ou aminoácidos idênticos, dividido pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos na mais curta das duas sequências, em que o alinhamento das duas sequências pode ser determinado de acordo com o algoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur e col., 1983), por exemplo, utilizando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de informação de 4 nucleotídeos e uma penalidade de lacuna de 4, e análise assistida por computador e interpretação dos dados de sequências, incluindo o alinhamento, podem ser convenientemente realizados utilizando programas comercialmente disponíveis (por exemplo, Vetor NTI Software™, Invitrogen Inc. CA, EUA). Quando as sequências de RNA são referidas como sendo similares ou tendo um grau de identidade de sequência ou de homologia com as sequências de DNA, a timidina (T) na sequência de DNA é considerada igual à uracila (U) na sequência de RNA. Assim, as sequências de RNA estão dentro do escopo da presente invenção e podem ser derivadas de sequências de DNA, por timidina (T) na sequência de DNA sendo considerada igual à uracila (U) nas sequências de RNA. E, sem experimentação excessiva, um técnico no assunto pode consultar muitos outros programas ou referências para determinar o
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34/76 percentual de homologia.
[0074] A presente invenção abrange ainda os polinucleotídeos de herpesvírus contidos em uma molécula de vetor ou em um vetor de expressão e ligados operativamente a um elemento promotor e, opcionalmente, a um intensificador.
[0075] Um vetor se refere a um plasmídeo, bacteriófago ou vírus de DNA ou RNA recombinante, que compreende um polinucleotídeo heterólogo a ser distribuído para uma célula alvo, seja in vitro ou in vivo. O polinucleotídeo heterólogo pode compreender uma sequência de interesse para fins de prevenção ou terapia, e pode estar opcionalmente sob a forma de um cassete de expressão. Tal como utilizado no presente documento, um vetor não precisa ser capaz de replicação na célula alvo ou indivíduo final. O termo vetor inclui vetores para clonagem, assim como vetores virais.
[0076] O termo geneticamente modificado ou recombinante designa um polinucleotídeo de origem semissintética ou sintética que tanto não ocorre na natureza ou está ligado a outro polinucleotídeo em um arranjo não encontrado na natureza.
[0077] Heterólogo significa derivado de uma entidade geneticamente distinta do restante da entidade à qual está sendo comparada. Por exemplo, um polinucleotídeo
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35/76 pode ser incorporado por meio de técnicas de engenharia genética em um plasmídeo ou vetor derivado de uma fonte diferente e é, assim, um polinucleotídeo heterólogo. Um promotor removido da sua sequência de codificação nativa e ligado operativamente a uma sequência de codificação diferente da sequência nativa é um promotor heterólogo.
[0078] Os polinucleotídeos da presente invenção podem compreender sequências adicionais, tais como sequências de codificação adicionais dentro da mesma unidade de transcrição, controlando os elementos tais como promotores, sítios de ligação ao ribossomo, 5'UTR, 3'UTR, finalizadores de transcrição, sítios de poliadenilação, unidades de transcrição adicionais sob o controle do mesmo ou de um promotor diferente, sequências que permitem clonagem, expressão, recombinação homóloga e transformação de uma célula hospedeira, e qualquer construção tal como pode ser desejável para fornecer as concretizações da presente invenção.
[0079] Os elementos para a expressão de um polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus estão vantajosamente presentes em um vetor da invenção. Na forma mínima, este compreende, consiste essencialmente de ou consiste de um códon de iniciação (ATG), um códon de parada e um promotor e, opcionalmente, também uma sequência
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36/76 de poliadenilação para determinados vetores, tais como plasmídeos e certos vetores virais. Quando o polinucleotídeo codifica um fragmento de polipeptídeo, por exemplo, um peptídeo de herpesvírus, vantajosamente, no vetor, um ATG é posicionado em 5' do quadro de leitura e um códon de parada é posicionado em 3'. Outros elementos para controlar a expressão podem estar presentes, tais como sequências intensificadoras, sequências de estabilização, tais como íntron e ou sequências 5' ou 3' não traduzidas e sequências de sinal que permitem a secreção da proteína.
[0080] Os métodos para preparar e/ou administrar um vetor ou recombinantes ou plasmídeos para a expressão de produtos de genes da presente invenção, seja in vivo ou in vitro podem ser qualquer método desejado, por exemplo, um
método que é por ou análogo aos métodos descritos em
documentos citados em: Patentes US Nos. 4,603,112; US
4,769, 330; US 4,394,448; US 4,722, 848; US 4,745,051; US
4,769, 331; US 4,945,050; US 5,494, 807; US 5,514,375; US
5,744, 140; US 5,744,141; US 5,756, 103; US 5,762,938; US
5,766, 599; US 5,990,091; US 5,174, 993; US 5,505,941; US
5,338, 683; US 5,494,807; US 5,591, 639; US 5,589,466; US
5,677, 178; US 5,591,439; US 5,552, 143; US 5,580,859; US
6,130, 066; US 6,004,777; US 6,130, 066; US 6,497,883; US
6,464, 984; US 6,451,770; US 6,391, 314; US 6,387,376; US
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6,376,473; US 6,368,603; US 6,348,196; US 6, 306,400; US
6,228,846; US 6,221,362; US 6,217,883; US 6, 207,166; US
6,207,165; US 6,159,477; US 6,153,199; US 6, 090,393; US
6,074,649; US 6,045,803; US 6,033,670; US 6, 485,729; US
6,103,526; US 6,224,882; US 6,312,682; US 6, 348,450; US
6,312,683 e US 6,596,279; Pedido de patente US N° de série
12/753,597, WO 90/01543; W0 91/11525; WO 94/16716, WO
96/39491, WO 98/33510, EP 265785, EP 0 370 573.
[0081] A presente invenção também diz respeito a uma composição ou vacina compreendendo vetores, tais como vetores de expressão. A composição ou vacina pode compreender, consistir essencialmente de ou consistir de um ou mais vetores, por exemplo, vetores de expressão, tais como vetores de expressão ín vivo compreendendo, consistindo essencialmente de ou consistindo de (ou expressando) um ou mais dos polipeptídeos, antígenos, epítopos ou imunógenos de herpesvírus. O vetor contém e expressa um polinucleotídeo que compreende, consiste essencialmente de ou consiste de um polinucleotídeo que codifica (ou expressa) um antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus, em um carreador, adjuvante, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.
[0082] De acordo com outra concretização, o vetor ou vetores na composição ou vacina compreendem, ou
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38/76 consistem essencialmente de ou consistem de polinucleotídeo(s) que codifica(m) uma ou mais proteínas ou fragmento(s) da mesma de um polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus. A composição ou vacina da presente invenção compreende, consiste essencialmente de ou consiste de um ou mais vetores compreendendo, consistindo essencialmente de ou consistindo de e, vantajosamente, também expressando in vivo sob condições apropriadas ou condições adequadas ou em uma célula hospedeira adequada, polinucleotídeos de isolados de herpesvírus diferentes que codificam as mesmas proteínas e/ou proteínas diferentes. A invenção é também dirigida a misturas de vetores que contêm, consistem essencialmente de ou consistem de codificação para, e expressam, diferentes proteínas, polipeptídeos, antígenos, epítopos ou imunógenos de herpesvírus, por exemplo, um polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus de diferentes espécies, tais como, mas não limitado, aos felinos, humanos, caninos, equinos, bovinos (por exemplo, gado), suínos ou aves.
[0083] O termo plasmídeo abrange qualquer unidade de transcrição de DNA que compreende um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção e os elementos necessários para a sua expressão in vivo em uma célula ou células do hospedeiro desejado ou alvo; e, a este respeito, nota-se
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39/76 que um plasmídeo super enrolado e todos os seus topoisômeros, plasmídeos de abertura circular, bem como as formas lineares do plasmídeo, destinam-se a estar dentro do escopo da presente invenção.
[0084] Cada plasmídeo compreende ou contém ou consiste essencialmente de, além do polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína, antígeno, epítopo ou imunógeno recombinante, opcionalmente fundido com um polinucleotídeo que codifica uma sequência, variante, análogo ou fragmento de peptídeo heterólogo, ligado operativamente a um promotor ou sob o controle de um promotor ou dependente de um promotor. Em geral, é vantajoso empregar um promotor forte que seja funcional nas células eucarióticas. O promotor forte preferido é o promotor precoce imediato do citomegalovírus (CMV-IE) de origem humana ou murina ou, opcionalmente, tendo outra origem, tal como rato ou porquinho da índia. O promotor IE de CMV pode compreender o segmento promotor atual, que pode ou não estar associado com o segmento intensificador. Pode ser feita referência à EP-A-260 148, EP-A-323 597, patentes US 5,168,062, US 5,385,839 e US 4,968,615, bem como pedido PCT WO 87/03905. O promotor IE de CMV é vantajosamente um CMV-IE humano (Boshart e col., 1985) ou CMV-IE murino.
[0085] Em termos mais gerais, o promotor é tanto de
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40/76 origem viral quanto celular. Um promotor viral forte diferente de CMV-IE que pode ser empregado de forma útil na prática da presente invenção é o promotor precoce/tardio do vírus SV40 ou o promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous. Um promotor celular forte que pode ser empregado de forma útil na prática da presente invenção é o promotor de um gene do citoesqueleto, tal como, por exemplo, o promotor de desmina (Kwissa e col., 2000) ou o promotor de actina (Miyazaki e col., 1989).
[0086] Subfragmentos funcionais destes promotores, isto é, porções destes promotores que mantêm uma atividade promotora adequada, estão incluídos no escopo da presente invenção, por exemplo, promotores de CMV-IE truncados, de acordo com a publicação internacional WO98/00166 ou patente US 6,156,567. Um promotor na prática da presente invenção consequentemente inclui derivados e subfragmentos de um promotor de comprimento total que mantenha uma atividade promotora adequada e, portanto, funcione como um promotor, de preferência uma atividade promotora substancialmente semelhante à do promotor atual ou de comprimento total a partir do qual o derivado ou subfragmento é derivado, por exemplo, semelhante à atividade dos promotores de CMV-IE truncados da patente US 6,156,567 para a atividade de promotores de CMV-IE de comprimento total. Assim, um
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41/76 promotor de CMV-IE na prática da presente invenção pode compreender ou consistir essencialmente de ou consistir da porção do promotor do promotor de comprimento total e/ou da porção intensificadora do promotor de comprimento total, bem como os derivados e subfragmentos.
[0087] De preferência, os plasmídeos compreendem ou consistem essencialmente de outros elementos de controle de expressão. É particularmente vantajoso incorporar sequência(s) estabilizante(s), por exemplo, sequência(s) de íntron, de preferência o primeiro íntron do CMVh-IE (publicação internacional WO 89/01036), o íntron II do gene β-globina de coelho (van Ooyen e col., 1979).
[0088] Tal como para o sinal de poliadenilação (poli A), para os plasmídeos e vetores virais diferentes de poxvírus, o uso pode ser feito mais do sinal de poli(A) do gene de hormônio de crescimento bovino (bGH) (ver Patente US 5, 122,458) ou do sinal de poli(A) do gene β-globina de coelho ou do sinal de poli(A) do vírus SV40.
[0089] De acordo com outra concretização da presente invenção, os vetores de expressão são vetores de expressão usados para expressão in vitro de proteínas em um sistema celular adequado. As proteínas expressas podem ser coletadas no, ou a partir do sobrenadante de cultura após ou não a secreção (se não houver secreção uma lise celular
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42/76 tipicamente ocorre ou é realizada), opcionalmente concentradas por métodos de concentração, tais como a ultrafiltração e/ou purificadas por meio de purificação, tais como métodos de cromatografia por afinidade, troca iônica ou do tipo filtração em gel.
[0090] Uma célula hospedeira designa uma célula procariótica ou eucariótica que foi geneticamente modificada ou que é capaz de ser geneticamente modificada pela administração de um polinucleotídeo exógeno, tal como um plasmídeo ou vetor recombinante. Ao referir-se às células geneticamente modificadas, o termo se refere tanto à célula originalmente alterada quanto à descendência da mesma. As células hospedeiras incluem, mas não estão limitadas, a células de rim de hamster bebê (BHK), células de carcinoma de cólon (Caco-2), células COS7, células MCF7, células MCF-1OA, linhagens de rim canino Madin-Darby (MDCK), células de pulmão de martas (Mv1Lu), células MRC-5, células U937, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de macaco Vero (linhagem de células com origem do rim de um macaco verde Africano), codorna (linhagem de células de músculo de codorna QM7), linhagem de células de galinha DF1 e células VERO. Os polinucleotídeos compreendendo uma sequência desejada podem ser inseridos em um vetor de clonagem ou expressão adequado, e o vetor por
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43/76 sua vez pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação. Os polinucleotídeos podem ser introduzidos em células hospedeiras por quaisquer meios conhecidos no estado da técnica. Os vetores que contêm os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer um de uma variedade de meios adequados, incluindo a absorção direta, endocitose, transfecção, f-acoplamento, eletroporação, transfecção utilizando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano ou outras substâncias; bombardeamento de microprojéteis; lipofecção, e infecção (quando o vetor é infeccioso, por exemplo, um vetor retroviral). A escolha de introduzir vetores ou polinucleotídeos dependerá frequentemente das características da célula hospedeira.
[0091] Em uma concretização da presente invenção, o vetor é um vetor de vírus da doença de Newcastle (NDV) tal como descrito no pedido de patente US 2010/0255029 (incorporado ao presente como referência em sua totalidade). O vírus da doença de Newcastle designado como paramixovírus aviário 1 (APMV1, família Paramyxoviridae, subfamília Paramyxovirinae, gênero Avulavirus) é um patógeno aviário, cuja cepas de ocorrência natural exibem uma ampla gama de severidade da doença. O NDV é particularmente vantajoso
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44/76 como um vetor de vacina para uso veterinário, uma vez que o próprio vetor serve como uma vacina de aves necessária. Patótipos de cepa NDV são assintomáticos entéricos (por exemplo, Ulster 2C, Queensland V4), lentogênicos (por exemplo, Hitchner B1, F (por exemplo, Asplin), La Sota), mesogênicos (por exemplo, cepa H, Mukteswar, Roakin, Beaudette C) ou velogênicos (por exemplo, Texas GB, papagaio NY 70181, Italien, Milano, Herts 33/56). As vantagens das vacinas de herpesvírus com base no vetor de NDV incluem, mas não estão limitadas, a (1) induzir uma imunidade ampla, incluindo respostas humoral, celular e de mucosa, (2) não expressam as proteínas NP e M e, portanto, são compatíveis com a estratégia de DIVA (diferenciar os animais infectados dos animais vacinados), (3) induzem um rápido início da imunidade, (4) bivalentes e (5)
representam um risco menor de produção para o meio ambiente
do que as vacinas inativadas, em caso de liberação
acidental.
[0092] Algumas características do NDV sugerem que o
NDV recombinante (NDVr) ou NDV geneticamente modificado expressando uma proteína estranha seriam candidatos muito bons à vacinas. O NDV cresce a títulos muito elevados em muitas linhagens celulares e ovos, e induz fortes respostas imunes humorais e celulares in vivo. O NDV infecta
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45/76 naturalmente as vias respiratórias e as superfícies das mucosas do trato digestivo, de modo que é especialmente útil liberar antígenos protetores dos patógenos das doenças respiratórias tais como FHV. Além disso, as vacinas vivas de NDV comercialmente disponíveis são largamente utilizadas nos Estados Unidos e na maioria dos outros países. As vacinas baseadas em recombinantes de NDV vivo também podem ter vantagens em relação a outros vetores de vacinas recombinantes vivos. Em primeiro lugar, a proteína estranha ao organismo é expressa com apenas poucas proteínas de NDV. Em contraste, vetores de poxvírus e herpesvírus expressam um grande número de proteínas adicionais dos seus genomas de grandes dimensões. Para a geração de respostas imunes específicas em aplicações de vacina, pode ser vantajoso ter apenas um número limitado de proteínas expressas. Em segundo lugar, o NDV se replica no citoplasma das células infectadas sem uma fase de DNA, o que elimina o problema da integração do genoma viral no DNA da célula hospedeira. O vírus não sofre recombinação genética detectável.
[0093] Em uma concretização, o vetor de NDV é NDV AVINEW®, tal como descrito no pedido de patente US 2010/0255029. O vetor de NDV também pode ser o vetor da patente US 5,118,502, em particular a cepa depositada como ATCC No. VR 2239.
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46/76 [0094] Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica ou vacina para induzir uma resposta imunológica em um animal hospedeiro inoculado com a vacina ou composição, a vacina ou composição incluindo um ou mais vetores virais recombinantes AVINEW modificados. Em ainda outro aspecto da presente invenção, o vetor viral AVINEW recombinante ou geneticamente modificado inclui, dentro de uma região não essencial do genoma do vírus, uma sequência de DNA de herpesvírus que codifica uma proteína antigênica de herpesvírus derivada de um patógeno, em que a composição ou vacina, quando administrada a um hospedeiro, é capaz de induzir uma resposta imunológica específica para a proteína codificada pelo patógeno. A composição compreende opcionalmente um carreador, ou veículo, ou adjuvante, ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.
[0095] O termo região não essencial se refere a uma região de um genoma de vírus que não é essencial para a replicação e propagação do vírus na cultura de tecidos, e cuja deleção ou inativação pode reduzir a virulência em uma variedade de sistemas animais. Qualquer região não essencial ou parte dela pode ser deletada do genoma de AVINEW ou uma sequência estranha pode ser inserida na mesma, e a viabilidade e estabilidade do AVINEW geneticamente modificado resultante
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47/76 da deleção ou inserção pode ser usado para determinar se uma região deletada ou parte da mesma é realmente não essencial. Em outra concretização, a região não essencial do genoma de AVINEW é a região entre o gene P e o gene M ou a região entre o gene M e o gene F do genoma de AVINEW. Em uma concretização, a região não essencial está localizada a montante do gene NP no genoma de AVINEW. Em outra concretização, a região não essencial está localizada a jusante do gene L no genoma de AVINEW. Em ainda outra concretização, a região não essencial é uma região não codificante ou intergênica. Neste aspecto, a região não codificante ou intergênica pode ser uma região entre os genes NP e P, entre os genes P e M, entre os genes M e F ou entre os genes F e HN no genoma AVINEW. Em outra concretização, a região não essencial pode estar na região de 1nt-121nt, 1591nt-1886nt, 3074nt-3289nt, 4384nt-4543nt, 6205nt-6411nt, 8262nt-8380nt ou 14995nt-15186nt da SEQ ID NO: 27.
[0096] Um aspecto da presente invenção diz respeito a vetores de NDV geneticamente modificados ou recombinantes expressando antígenos de herpesvírus. O antígeno pode ser glicoproteína de herpesvírus, tais como as proteína gB ou gD acima mencionadas. O vetor de NDV geneticamente modificado pode compreender um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais antígenos de herpesvírus. Em outro
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48/76 aspecto, o vetor de NDV-herpesvírus geneticamente modificado compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam um antígeno gB de Herpesvírus ou variante do mesmo, um antígeno gD de Herpesvírus ou variante do mesmo ou uma combinação destes.
[0097] Em uma concretização, a presente invenção prevê a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação para a liberação e a expressão de uma proteína, antígeno, epítopo ou imunógeno em uma célulaalvo. A determinação da quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz é experimentação de rotina para um técnico no assunto. Em outra concretização, a formulação compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que expresse um antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus e um carreador, veículo, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em outra concretização, o carreador, veículo, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável facilita a transfecção e/ou melhora a conservação do vetor ou da proteína.
[0098] Os carreadores, ou veículos, ou adjuvantes, ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos para os técnicos no assunto. Por exemplo, um carreador, ou veículo, ou adjuvante, ou
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49/76 excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser água estéril, uma solução de NaCl a 0,9% (por exemplo, salina) ou um tampão fosfato. Outro carreador, ou veículo, ou adjuvante, ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável que pode ser usado para os métodos da presente invenção inclui, mas não está limitado, a poli-(L-glutamato) ou polivinil pirrolidona. O carreador, veículo, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser qualquer composto ou combinação de compostos que facilitem a administração do vetor (ou da proteína expressa a partir de um vetor da presente invenção in vitro); vantajosamente, o carreador, veículo, adjuvante ou excipiente pode facilitar a transfecção e/ou a melhorar a conservação do vetor (ou proteína). As doses e os volumes de dose são discutidos no presente documento na descrição geral e também podem ser determinados por um técnico no assunto a partir desta divulgação, lida em conjunto com o conhecimento do estado da técnica, sem qualquer experimentação excessiva.
[0099] Os lipídeos catiônicos que contêm um sal de amônio quaternário, mas não exclusivamente apropriados para plasmídeos, são aqueles possuindo a seguinte fórmula:
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50/76
CH3
I +
R1 — o — ch2— CH-CH2 —N — R2—X
I I
OR1 CH3 em que R1 é um radical alifático de cadeia linear saturado ou insaturado possuindo de 12 a 18 átomos de carbono, R2 é outro radical alifático contendo 2 ou 3 átomos de carbono e X é um grupo amino ou hidroxila, por exemplo, o DMRIE. Em outra concretização, o lipídeo catiônico pode ser associado a um lipídeo neutro, por exemplo, o DOPE.
[0100] Entre estes lipídeos catiônicos, preferência é dada a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3 bis(tetradeciloxi)-l-propano-amônio; WO96/34109), vantajosamente associado a um lipídeo neutro, vantajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr, 1994) para formar DMRIE-DOPE.
[0101] A mistura de plasmídeo com o adjuvante é formada de forma extemporânea e/ou simultaneamente com a administração da preparação ou imediatamente antes da administração da preparação; por exemplo, pouco antes ou logo antes da administração, a mistura de plasmídeoadjuvante é formada, vantajosamente, de modo a dar tempo suficiente antes da administração para a mistura formar um
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51/76 complexo, por exemplo, entre cerca de 10 e cerca de 60 minutos antes da administração, tal como cerca de 30 minutos antes da administração.
[0102] Quando DOPE está presente, a razão molar DMRIE:DOPE pode ser de cerca de 95:cerca de 5 a cerca de 5:cerca de 95 ou cerca de l: cerca de 1, por exemplo, 1:1.
[0103] A razão em peso de adjuvante DMRIE ou DMRIEDOPE:plasmídeo pode ser entre cerca de 50:cerca de 1 e cerca de 1:cerca de 10, tal como cerca de 10:cerca de 1 e cerca de 1:cerca de 5 e, vantajosamente, de cerca de 1:cerca de 1 e cerca de 1:cerca de 2, por exemplo, 1:1 e 1:2.
[0104] Em outra concretização, um carreador, adjuvante, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma emulsão de água-emóleo. Exemplos de emulsões apropriadas incluem emulsões de vacina água-em-óleo à base de óleo que sejam estáveis e fluidas a 4°C contendo: de 6 a 50% v/v de uma fase aquosa contendo antígeno, de preferência de 12 a 25% v/v, de 50 a 94% v/v de uma fase oleosa contendo, no total ou em parte, um óleo não-metabolizável (por exemplo, óleo mineral, tal como óleo de parafina) e/ou óleo metabolizável (por exemplo, óleo vegetal, ou ácido graxo, poliol ou ésteres de álcool), de 0,2 a 20% p/v de tensoativos, de preferência de 3 a 8%
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52/76 p/v, sendo este último no total ou em parte, ou em uma mistura tanto de ésteres de poliglicerol, referidos ésteres de poliglicerol sendo de preferência (poli)ricinoleatos de poliglicerol ou óleos de rícino polioxietileno ou outros óleos de rícino polioxietileno hidrogenados. Exemplos de tensoativos que podem ser utilizados em uma emulsão de águaem-óleo incluem os ésteres de sorbitano etoxilados (por exemplo, monooleato de polioxietileno sorbitano (20) (TWEEN 80®), disponível pela AppliChem, Inc., Cheshire, CT) e os ésteres de sorbitano (por exemplo, monooleato de sorbitano (SPAN® 80), disponível pela Sigma Aldrich, St. Louis, MO).
Além disso, no que diz respeito a uma emulsão de água-emóleo, ver também a patente US 6, 919, 084. Em algumas concretizações, a fase aquosa contendo antígeno compreende uma solução salina compreendendo um ou mais agentes tamponantes. Um exemplo de uma solução tampão adequada é salina tamponada com fosfato. Em uma concretização, a emulsão água-em-óleo pode ser uma emulsão tripla água/óleo/água (A/O/A) (ver, por exemplo, a Patente US 6,358,500). Exemplos de outras emulsões adequadas estão descritas na Patente US 7,371,395.
[0105] As composições imunológicas e vacinas de acordo com a presente invenção podem compreender ou consistir essencialmente de um ou mais adjuvantes. Os
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53/76 adjuvantes adequados para uso na prática da presente invenção são: (1) os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico, anidrido maleico e os polímeros derivados de alquenila, (2) as sequências de imunoestimulação (ISS), tais como sequências de oligodesoxirribonucleotídeos com uma ou mais unidades CpG não-metiladas (Klinman e col., 1996; W098/16247), (3) uma emulsão de óleo em água, tal como a emulsão SPT descrita na página 147 de “Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”, publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, e a emulsão MF59 descrita na pág. 183 do mesmo trabalho, (4) os lipídeos catiônicos que contêm um sal de amônio quaternário, por exemplo, DDA (5) citocinas, (6) hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, (7) saponina ou (8) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado como referência no presente pedido de patente ou (9) quaisquer combinações ou misturas destes.
[0106] A emulsão de óleo em água (3), que é especialmente adequada para os vetores virais, pode basear-se em: óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopeia europeia), óleo de isoprenóides, tais como esqualeno, óleo resultante da oligomerização de alquenos, por exemplo, isobuteno ou deceno, ésteres de ácidos ou de álcoois que têm um grupo alquila de cadeia linear, tais como óleos vegetais, oleato de etila,
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54/76 propileno glicol, di(caprilato/caprato), tri(caprilato/ caprato) de glicerol e dioleato de propileno glicol, ou ésteres de ácidos ou álcoois graxos ramificados, especialmente ésteres de ácido isoesteárico.
[0107] O óleo é usado em combinação com emulsificantes para formar uma emulsão. Os emulsificantes podem ser tensoativos aniônicos, tais como: ésteres de, por um lado, sorbitano, manida (por exemplo, oleato de anidromanitol), glicerol, poliglicerol ou propilenoglicol e, por outro lado, ácidos oleico, isoesteárico, ricinoleico ou hidroxiesteárico, os referidos ésteres sendo
opcionalmente etoxilados ou blocos de copolímero de
polioxipropileno-polioxietileno, tal como Pluronic, por
exemplo, L121.
[0108] Entre os polímeros adjuvantes de tipo (1) , é
dada preferência a polímeros de ácido acrílico ou
metacrílico reticulado, especialmente reticulados por éteres polialquenila de açúcares ou poliálcoois. Estes compostos são conhecidos sob o nome de carbômero (Pharmeuropa, vol. 8, n. 2, junho de 1996) . Um técnico no assunto pode também se referir à Patente US 2,909,462, a qual fornece tais polímeros acrílicos reticulados por um composto de polihidroxila possuindo pelo menos três grupos hidroxila, de preferência não mais do que oito de tais grupos, os átomos
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55/76 de hidrogênio de pelo menos três grupos hidroxila sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados que possuem pelo menos dois átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinílicos, alílicos e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem também conter outros substituintes, tais como metila. Os produtos vendidos sob o nome Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EUA), são especialmente adequados. Eles são reticulados por alil sacarose ou alil pentaeritritol. Entre eles, é feita referência ao Carbopol 974P, 934P e 971P.
[0109] Com relação aos copolímeros alquenilderivados de anidrido maleico, é dada preferência aos EMA (Monsanto), que são copolímeros de anidrido maléico-etileno de cadeia linear ou reticulados e são, por exemplo, reticulados por éter divinílico. Também é feita referência
a J. Fields e col., 1960.
[0110] No que diz respeito à estrutura, os
polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e EMA são de
preferência formados por unidades básicas com a seguinte fórmula:
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56/76
R, R2
Figure BR112013007486B1_D0001
CÕOH COOK em que:
- RI e R2, que podem ser iguais ou diferentes, representam H ou CH3
- X = 0 ou 1, de preferência, x = 1
- y = 1 ou 2, com x + y = 2.
[0111] Para EMA, x=0ey=2e para carbômeros x = y = 1.
[0112] Estes polímeros são solúveis em água ou em solução salina fisiológica (20 g/1 de NaCl) e o pH pode ser ajustado para 7,3 a 7,4, por exemplo, por soda (NaOH) , para fornecer a solução de adjuvante, em que o(s) vetor(es) de expressão pode(m) ser incorporado(s) . A concentração de polímero na composição imunológica ou de vacina final pode variar entre 0,01 e 1,5% p/v, 0,05% a 1% p/v ou 0,1 a 0,4% p/v.
[0113] A citocina ou citocinas (5) podem estar na forma de proteína na composição imunológica ou de vacina ou pode(m) ser co-expressa(s) no hospedeiro com o imunógeno ou imunógenos ou epítopo(s) da mesma. Preferência é dada para a co-expressão da citocina ou citocinas, seja pelo mesmo
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57/76 vetor como aquele que expressa o imunógeno ou imunógenos ou epítopo(s) do mesmo ou por um vetor separado do mesmo.
[0114] A presente invenção compreende a preparação de certas composições de combinação; por exemplo, por mistura dos componentes ativos, vantajosamente em conjunto e com um adjuvante, carreador, citocina e/ou diluente.
[0115] As citocinas que podem ser utilizadas na presente invenção incluem, mas não estão limitadas, a fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), fator estimulante de colônia de granulócito/macrófago (GM-CSF), interferon a (IFNa), interferon β (IFNe), interferon γ, (IFN-γ), interleucina la (IL-la), interleucina 1β (IL-Ιβ), interleucina 2 (IL-2), interleucina 3 (IL-3), interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), interleucina 6 (IL-6), interleucina 7 (IL-7), interleucina 8 (IL-8), interleucina 9 (IL-9), interleucina 10 (IL-10), interleucina 11 (IL-11), interleucina 12 (IL-12), fator de necrose tumoral a (TNFa), fator de necrose tumoral β (TNFe) e fator de crescimento de transformação β (TGFe). Entende-se que as citocinas podem ser coadministradas e/ou sequencialmente administradas com a composição imunológica ou de vacina da presente invenção. Assim, por exemplo, a vacina da presente invenção também pode conter uma molécula de ácido nucleico exógeno que expressa in vivo uma citocina apropriada, por exemplo, uma
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58/76 citocina correspondente a esse hospedeiro a ser vacinado, ou em que uma resposta imunológica deve ser provocada (por exemplo, uma citocina de felino para preparações a serem administradas a um felino).
[0116] Em outra concretização, a composição da
presente invenção pode ser preparada utilizando o
procedimento químico ou físico, tal como descrito por
Stauffer e col. (Patentes recentes em Anti - Infective Drug
Discovery, 1, 291-296, 2006). Algumas das técnicas de
inativação estão resumidas na tabela abaixo.
Química Física Combinado
Ácido ascórbico Ácido ascórbico + UV
b-Propiolactona Aquecimento Beta Propiolactona + UV
b-aminofenilcetona Pressão Formalina + Aquecimento
Dietilpirocarbonato UV Formalina + UV
Etilenimina Detergentes não-iônicos Aquecimento + Baixa pressão
Formalina/Formaldeído Pressão + Aquecimento ou Resfriamento
Fenol Psoraleno + UV
[0117] A composição imunológica e/ou a vacina de acordo com a presente invenção compreendem ou consistem essencialmente de ou consistem de uma quantidade eficaz para induzir uma resposta protetora ou terapêutica de um ou
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59/76 mais vetores de expressão e/ou polipeptídeos, tal como discutido no presente; e uma quantidade eficaz pode ser determinada a partir desta divulgação, incluindo os documentos incorporados na presente invenção, e do conhecimento do estado da técnica, sem experimentação indevida.
[0118] As composições ou vacinas da presente invenção podem ser administradas a um animal in ovo, por meio de água potável, oro-nasal, sprays, aerossóis, instilação intranasal, colírios, bico de imersão, por perfuração nas asas, injeção transdérmica, subcutânea ou intramuscular. Vantajosamente, as vacinas são administradas por via oro-nasal, subcutânea, colírio, spray ou água potável.
[0119] A presente invenção contempla, pelo menos, uma administração a um animal de uma quantidade eficiente da composição terapêutica feita de acordo com a presente invenção. A composição terapêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada por um aparelho sem agulha (como, por exemplo, com um Pigjet, Dermojet, Biojector, Vetjet ou aparelho Vitajet (Bioject, Oregon, EUA)).
[0120] Em uma concretização da presente invenção, um regime de dose inicial-reforço pode ser empregado, o qual é compreendido por pelo menos uma administração primária e pelo
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60/76 menos uma administração de reforço com pelo menos uma proteína, polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno comum. A composição imunológica ou de vacina utilizada na administração primária tem uma natureza diferente daquelas utilizados como reforço. No entanto, deve-se notar que a mesma composição pode ser usada como a administração primária e a administração de reforço. Este protocolo de administração é chamado de dose inicial-reforço (prime-boost) .
[0121] Em outro aspecto do protocolo de dose inicial-reforço da presente invenção, uma composição que compreende a vacina ou composição de herpesvírus-NDV Avinew geneticamente modificada é administrada seguido pela administração da vacina ou composição que compreende um vetor viral recombinante que contém e expressa um antígeno de herpesvírus in vivo ou uma vacina viral inativada ou composição que compreende o antígeno de herpesvírus, ou uma vacina ou composição que compreende uma subunidade de herpesvírus (proteína) ou uma vacina ou composição de plasmídeo de DNA que contém ou expressa um antígeno de herpesvírus. Da mesma forma, um protocolo de dose inicialreforço pode compreender a administração de vacina ou composição que compreende um vetor viral recombinante que contém e expressa um antígeno de herpesvírus in vivo, ou uma vacina viral inativada ou composição que compreende o
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61/76 antígeno de herpesvirus, ou uma vacina ou composição que compreende uma subunidade de herpesvírus (proteína) ou uma vacina ou composição de plasmídeo de DNA que contém ou expressa um antígeno de herpesvírus, seguido pela administração de uma composição que compreende a vacina ou composição de herpesvírus-NDV Avinew geneticamente modificado. Deve-se notar que tanto as administrações primárias quanto as secundárias podem compreender a composição que compreende a vacina ou composição de herpesvírus-NDV Avinew geneticamente modificada. Deve-se ainda notar que, tanto as administrações primária e secundária podem compreender uma ou mais composições compreendendo os vetores NDV-HV geneticamente modificados da presente invenção.
[0122] Um protocolo dose inicial-reforço compreende pelo menos uma administração inicial e pelo menos uma administração de reforço usando pelo menos um antígeno comum. A vacina ou composição usada na administração inicial pode ser de natureza diferente daquelas utilizadas como uma vacina ou composição de reforço posterior. A administração de dose inicial pode compreender uma ou mais administrações. De modo semelhante, a administração de reforço pode compreender uma ou mais administrações.
[0123] As várias administrações são realizadas,
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preferencialmente, de cerca de 1 a cerca de 6 semanas de
intervalo ou cerca de 2 a cerca de 4 semanas de intervalo.
Repetições de reforço a cada 2 a 6 semanas ou um reforço
anual são também contemplados. Os animais tem, preferencialmente, pelo menos um dia de idade no momento da primeira administração.
[0124] A composição imunológica e/ou vacina contém por dose de cerca de 104 a cerca de 1011, vantajosamente de cerca de 105 a cerca de 1010 e, mais vantajosamente, entre cerca de 106 e cerca de 109 partículas virais de adenovírus recombinante expressando um antígeno, epítopo ou imunógeno de herpesvírus. No caso de composição imunológica e/ou vacina com base em um poxvírus, uma dose pode estar entre cerca de 102 pfu (unidades formadoras de placa) e cerca de 109 pfu. A composição imunológica e/ou vacina contém por dose de cerca de 102 a cerca de 107, vantajosamente, de cerca de 103 a cerca de 105 pfu de poxvírus ou herpesvírus recombinante expressando o antígeno, epítopo ou imunógeno
de herpesvírus.
[0125] O vetor viral pode ser um vetor de expressão
atenuada de avipox. Em uma concretização, o vetor de
expressão avipox pode ser um vetor fowlpox, por exemplo,
TROVAC®. Em outra concretização, o vetor de expressão avipox pode ser um vetor canarypox, por exemplo, ALVAC®. O antígeno,
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63/76 epítopo ou imunógeno de herpesvirus pode ser uma glicoproteína de herpesvírus, tais como gB ou gD. Outros vírus que podem ser utilizadas nos métodos da invenção incluem, mas não estão limitados, a vírus vaccinia, tal como um vírus vaccinia atenuado, por exemplo, NYVAC, adenovírus e herpesvírus.
[0126] A eficácia das vacinas pode ser testada cerca de 2 a 4 semanas após a última imunização por desafio dos animais com uma cepa virulenta de herpesvírus. Ambas as cepas homóloga e heteróloga podem ser utilizadas para o desafio de testar a eficácia da vacina. O animal pode ser desafiado por spray, via intranasal, colírio, óculo-nasal, via IM, intratraqueal e/ou oral. O desafio viral pode ser de cerca de 103 a cerca de 108, em um volume dependendo da via de administração. Por exemplo, se a administração for por spray, uma suspensão viral é transformada em aerossol para gerar gotas de cerca de 1 a 100 pm, se a administração for intranasal, intra-traqueal ou oral, o volume do vírus de desafio é de cerca de 0,05 a cerca de 5 ml. O volume da dose de composições para espécies-alvo, por exemplo, o volume de dose das composições de felino, pode ser cerca de 50 pl para ín ovo, cerca de 20 a cerca de 50 pl para colírio, cerca de 0,25 ml até cerca de 1 ml para spray. Os animais podem ser observados diariamente durante 14 dias após o desafio para os
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64/76 sinais clínicos e mortalidade. Além disso, os grupos de animais podem ser sacrificados e avaliados para achados patológicos. Amostras de orofaringe, traqueia ou cloaca podem ser coletadas de todos os animais após o desafio para a detecção de vírus. A presença ou a ausência de antígenos virais nos tecidos pode ser avaliada por imuno-histoquímica, isolamento viral ou por titulação, ou por detecção de ácidos nucleicos, tais como a reação em cadeia de polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR). Amostras de sangue podem ser coletadas após o desafio e podem ser analisadas para a presença de anticorpos vírus-específicos anti-herpesvírus gB ou gD.
[0127] Deve ser entendido por um técnico no assunto que a divulgação do presente documento é dada a título de exemplo e a presente invenção não está limitada ao mesmo. A partir da presente divulgação e do conhecimento da técnica, o técnico no assunto pode determinar o número de administrações, a via de administração e as doses a serem usadas para cada protocolo de imunização, sem qualquer experimentação excessiva.
[0128] Outra concretização da invenção é um kit para a realização de um método de indução de uma resposta imunológica ou protetora contra herpesvírus em um animal, compreendendo uma composição imunológica ou vacina
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65/76 recombinante de NDV ou uma composição imunológica ou vacina de herpesvírus inativado e instruções para realizar o método de distribuição de uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune no animal.
[0129] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes.
EXEMPLOS [0130] A construção de inserções, plasmídeos e vetores virais recombinantes de DNA foi realizada usando as técnicas convencionais de biologia molecular conhecidas no estado da técnica, por exemplo, descrito por J. Sambrook e col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) .
Exemplo 1 - Construção dos plasmídeos de transcrição de NDV contendo gene gB (plasmídeo pFR14) e gene gD (plasmídeo pFR16) de herpesvírus felino (FHV) [0131] O gene gB de FHV inserido no genoma do NDV foi códon-otimizado para a expressão em mamíferos. O gene gB de FHV sintético (SEQ ID NO: 2) foi clonado em um vetor baseado em pBR322, resultando no plasmídeo pFR13, que contém um cassete de inserção tal como mostrado na Figura 3. O plasmídeo PFR13 foi digerido com PacI e FseI, gerando um fragmento PacI-FseI de 3105 pb de tamanho. O plasmídeo pIV029
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66/76 (US2010/0255029) foi digerido com PacI e FseI, gerando um fragmento FseI-PacI de 19140 pb de tamanho. Os dois fragmentos foram ligados para gerar o plasmídeo pFR14 (Figura 4).
[0132] O gene gD de FHV inserido no genoma do NDV foi códon-otimizado para a expressão em mamíferos. O gene gD de FHV sintético (SEQ ID NO: 5) foi clonado em um vetor baseado em pBR322, resultando no plasmídeo pFR15, que contém um cassete de inserção tal como mostrado na Figura 3. O plasmídeo pFR15 foi digerido com PacI e Fsel, gerando um fragmento PacI-FseI de 1373 pb de tamanho. O plasmídeo pIV029 foi digerido com PacI e FseI, gerando um fragmento FseI-PacI de 19140 pb de tamanho. Os dois fragmentos foram ligados para gerar o plasmídeo pFR16 (Figura 4).
Exemplo 2 - Geração e caracterização do vetor de NDV expressando gene GB de FHV (vAVW07) [0133] O NDV é um vírus de RNA negativo e a geração do vírus NDV geneticamente modificado necessita de um sistema de genética reversa. A transcrição de um RNA viral genômico de comprimento total e a expressão concomitante de proteínas
NP, P e L permitem a montagem de RNP e a transcrição de RNA
positivo em genoma de RNA negativo. Isto inicia o ciclo de
replicação normal do vírus NDV e permite a geração de
partículas infecciosas (ver Figura 2).
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67/76 [0134] Para gerar o vetor de NDV geneticamente modificado expressando o gene gB de FHV, os reagentes e condições a seguir foram usados. Plasmídeo pFR14 (ver Exemplo 1) foi utilizado como o plasmídeo de transcrição. Os plasmídeos pIV32, pIV33 e pIV34 (US2010/0255029) foram utilizados como os plasmídeos de expressão para as proteínas NP, P e L, respectivamente. O plasmídeo pNS151 (US2010/0255029) foi utilizado como o plasmídeo de T7 RNA polimerase. Estes cinco plasmídeos foram co-transfectados em conjunto em células de ovário de hamster chinês (CHO), tal como mostrado esquematicamente na Figura 2C. Após 72 horas, os sobrenadantes de CHO foram inoculados em ovos embrionados com 10 dias de idade para amplificar o vírus. Depois de 3 dias, o fluido alantóico foi colhido e verificado para atividade de hemaglutinação (HA) usando glóbulos vermelhos de galinha. As partículas infecciosas de gB NDV-FHV foram obtidas com sucesso. O RNA foi extraído utilizando o kit de extração de RNA viral QuiaAMP (Qiagen). RT-PCR foi realizada utilizando o kit One-Step RT-PCR (Qiagen). O resultado do sequenciamento mostrou que o gene gB é 100% idêntico à sequência original do gene gB clonado no plasmídeo de transcrição. O vetor viral gB de NDV-FHV recombinante é designado vAVW07.
Exemplo 3 - Geração e caracterização do vetor de NDV
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expressando gene gD de FHV (vAVW08) de NDV geneticamente
[0135] Para gerar vetor
modificado expressando o gene gD de FHV, os seguintes
reagentes e condições foram usados. Plasmídeo pFR16 (ver Exemplo 1) foi usado como o plasmídeo de transcrição. Os plasmídeos pIV32, pIV33 e pIV34 (US2010/0255029) foram utilizados como os plasmídeos de expressão para as proteínas NP, P e L, respectivamente. O plasmídeo pNS151 (US2010/0255029) foi utilizado como o plasmídeo de T7 RNA polimerase. Estes cinco plasmídeos foram co-transfectados em conjunto em células de ovário de hamster chinês (CHO), tal como mostrado esquematicamente na Figura 2C. Após 72 horas de transfecção das células CHO, os sobrenadantes de CHO foram inoculados em ovos embrionados com 10 dias de idade para amplificar o vírus. Depois de 3 dias, o fluido alantóico foi coletado e verificado para atividade de hemaglutinação (HA) usando glóbulos vermelhos de galinha. As partículas infecciosas de gD NDV-FHV foram obtidas com sucesso.
[0136] O RNA foi extraído usando um kit de extração de RNA viral QuiaAMP (Qiagen). RT-PCR foi realizada utilizando o kit One-Step RT-PCR (Qiagen). Dois iniciadores foram utilizados na reação de RT-PCR:
FR09: CGCAGCTGCAATCAATTCAG (SEQ ID NO: 25)
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69/76
FR10: TGGGTGGACAGGGATCTGCT (SEQ ID NO: 26) [0137] O resultado do sequenciamento mostrou que o gene gD é 100% idêntico à sequência original do gene gD clonado no plasmídeo de transcrição. O vetor viral gB de NDV-HV recombinante é designado como vAVW08.
Exemplo 4 - Avaliação clínica da vacina de NDV-HV em gatos [0138] Trinta e dois gatos SPF (livres de patógeno específico) de 9-11 semanas foram incluídos no estudo. Os gatos foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos de 8 gatos (grupos A a D) de acordo com a ninhada, sexo e idade usando uma tabela de randomização com 4 elementos. Os gatos foram cuidados e alojados de acordo com os locais de criação e procedimentos de bem-estar animal.
[0139] O modelo experimental é apresentada na Tabela 1.
Tabela 1. Modelo experimental para a vacinação em gatos
Grupo Gato SPF de 9-11 semanas Tratamento em DO (V1) e D28 (V2) 1 ml Desafio Acompanhamento clínico Excreção viral Sorologia
A (NDV-HV por ON) 8 NDV-HV* 1ml por ON** FHV 1 mL por via oculonasal no D45 (~2sem. após V2) Sinais clínicos típicos: diariamente de D45 a D59 peso corporal: D45, D49, D51, D53, D55, D57 Esfreguaço nasal: D45 D47 D49 D51 D53 D55 D57 gB ELISA: D0 D28 D45 D59
B (NDV-HV por SC) 8 NDV-HV* 1ml por SC**
C (controle positivo)*** 8 controle positivo 1 dose por
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SC** e D5 9 D59
D (controle) 8 nenhum
• = NDV-HV=gB de NDV-HV e gD de NDV-HV, ambas a
107'8 EID50/ml ** ON = oro-nasal, SC = subcutâneo *** Controle positivo = vacina contendo cepa F2 de herpesvírus felino atenuado, Merial Limited.
[014 0] Em D0 e D2 8, vacinas de gB NDV-HV e gD NDVHV foram diluídas 1/25 e 1/35, respectivamente, de modo a atingir um título de 107,8 EID50/ml para ambas as vacinas. Em seguida, cada gato do grupo A recebeu sob anestesia geral 1 ml da vacina NDV-HV (gB de NDV-HV e gD de NDV-HV) por via oro-nasal (0,25 ml por narina e 0,5 ml na boca). Os gatos do grupo B receberam 1 ml da vacina NDV-HV por via subcutânea entre as escápulas. Os gatos do grupo C receberam uma dose da vacina controle por via subcutânea entre as escápulas. Os gatos do grupo D não foram vacinados.
[0141] Em D45, cada gato foi administrado sob anestesia geral com 1 ml de cepa de desafio 105,56 CCID50/ml (0,25 ml por narina e 0,25 ml por olho) diluída 1/50.
[0142] O teste de temperatura retal é mostrado na Figura 5. O grupo A é NDV-HV por ON, o grupo B é NDV-HV por
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SC, o grupo C é o controle positivo (vacina contendo cepa F2 de herpesvírus felino atenuado, Merial Limited), o grupo D é o controle (sem vacinação). O resultado mostrou que no grupo controle, 7/8 gatos apresentaram hipertermia. Nos grupos de vacinação, não houve hipertermia com controle positivo e NDV-HV por ON, houve hipertermia em 4/8 gatos vacinados com NDV-HV por via SC.
[0143] O resultado de peso corporal está representado na Figura 6 e Tabela 2. Todos os gatos ganharam peso durante a fase de imunização e o crescimento foi semelhante entre os grupos.
[0144] No pós-desafio (pc), no grupo D, todos os gatos perderam peso entre o dia 4 pc ao dia 8 pc. Alguns gatos (3 de 8) perderam peso até o dia 10 pc. Em seguida, todos os gatos ganharam peso. Durante o período de monitoramento pós-desafio, uma perda de peso >5% foi registrada em 6 de 8 gatos em uma ou duas ocasiões. No grupo C, a perda de peso foi observada em 6 de 8 gatos entre o dia 4 pc e o dia 6 pc ou dia 8 pc. Esta perda de peso foi >5% em quatro gatos. No grupo B, todos os gatos perderam peso entre o dia 4 e o dia 6 pc ou dia 8 pc. Uma perda de peso >5% foi observada uma vez em apenas dois gatos.
Tabela 2. Perda de peso observada durante o período de
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72/76 monitoramento pós-desafio
Grupo # gatos com perda de peso (# gatos com perda de peso > 5%) Perda de peso média observada
Entre D49 e D51 Entre D51 e D53
A (NDV-HV por ON) 5/8 (1/8) + 1% + 0%
B (NDV-HV por SC) 6/8 (2/8) -1% -3%
C (controle positivo) 6/8 (4/8) -3% -2%
D (controles) 8/8 (6/8) -2.5% -7%
[0145] A Figura 7 mostra as pontuações clínicas médias por grupo após desafio e Tabela 3 resume os sintomas clínicos observados. O grupo A é NDV-HV por ON, o grupo B é NDV-HV por SC, o grupo C é o controle positivo (vacina contendo cepa F2 de Herpesvírus felino atenuado, Merial Limited), o grupo D é o controle (sem vacinação). No grupo D, todos os gatos desenvolveram sinais clínicos após o desafio. No grupo A, um gato não mostrou qualquer sinal clínico pós-desafio e 3 gatos apresentaram apenas ligeira secreção nasal por um dia ou secreção ocular leve por 2 dias. Os outros gatos do grupo A, os gatos do grupo B e os gatos do grupo C apresentaram sinais clínicos menos graves e mais transitórios que os gatos no grupo D.
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Tabela 3. Resumo dos sinais clínicos observados por grupo após o desafio
C--jpe Secreção nasal (abundante) Secreção ocular (abundante) espirro lesse Apatia
=L gato Dccrrên cia gato a occrrên cia =t gato a occrrên cia =t gato a ocerrên cia a gato occrrên cia
rí. 6/8 1-6 5/8 1-7 1/8 1 0/8 NA 0/8 NÃ
(3/8) (1-2) (1-4)
3 O 3-21 O 2-6 6/8 2-2 2/8 1 0/8 KÀ
(3/8) (1-5) (6/8) (1-3)
c □ 1-11 ·□ f-D 1-7 4/8 1 0/8 NA 0/8 NÃ
(7ZS) (1-7) (4/8) (2-4)
3 3 /O 8-10 o /o 3-9 O/o 2-6 3/8 1 1/8 2
(8/8) (3-3) (6/8) (2-5)
[0146] A Figura 8 mostra a distribuição de pontuação clínica global, por grupo. A pontuação clínica média global foi: 7,5 no grupo A, 18,6 no grupo B, 17,4 no grupo C e 33,8 no grupo D. Houve uma diferença significativa entre o grupo D e os três grupos vacinados. Houve uma diferença significativa na pontuação clínica global entre os três grupos vacinados (ANOVA, p = 0,018). Os gatos do grupo A mostraram uma redução significativa na pontuação clínica global comparado aos gatos dos grupos B e
C. Não houve diferença significativa para a pontuação clínica global entre os grupos B e C.
[0147] A Figura 9 mostra a excreção viral média por grupo pós-desafio e a Tabela 4 resume a ASC média por
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74/76 grupo. O grupo A é NDV-HV por ON, o grupo B é NDV-HV por SC, o grupo C é o controle positivo (vacina contendo a cepa F2 de Herpesvírus felino atenuado, Merial Limited), o grupo D é o controle (sem vacinação).
Tabela 4. Área sob a curva (ASC) média por grupo
Grupo ASC média
A 47,2
B 48,3
C 49,9
D 59,6
[0148] Nenhum gato eliminou Herpesvírus felino antes do desafio. Após o desafio, FHV foi isolado em todos os gatos. No grupo D, a excreção aumentou rapidamente e atingiu um pico no dia 4 pós-desafio, em seguida diminuiu regularmente até o dia 14 pós-desafio. No dia 14 pósdesafio, 5 de 8 gatos ainda excretavam baixa quantidade de vírus. Nos grupos vacinados, a excreção viral atingiu um pico no dia 4 pós-desafio nos grupos B e C ou no dia 6 pósdesafio no grupo A, depois diminuiu mais rapidamente do que no grupo D. No dia 14 pós-desafio, nenhum gato eliminou vírus.
[0149] A Figura 10 mostra a distribuição de pontuação de excreção viral global por grupo. A excreção viral foi significativamente reduzida nos grupos vacinados
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75/76 em comparação com o grupo D (sem vacinação). Embora os gatos do grupo A tenham excretado vírus depois do que os outros grupos vacinados, não houve diferença estatisticamente significativa sobre a excreção viral entre os três grupos vacinados (ANOVA, p = 0,464).
[0150] Os dados de sorologia (Ab anti-gB de FHV) são mostrados na Figura 11. O grupo A é NDV-HV por ON, o grupo B é NDV-HV por SC, o grupo C é o controle positivo (vacina contendo cepa F2 de Herpesvírus felino atenuado, Merial Limited), o grupo D é o controle (sem vacinação). Todos os gatos foram soronegativos para gB-FHV no D0. Todos os gatos no grupo D permaneceram soronegativos até ao dia desafio. Todos os gatos no grupo D foram positivos para Ab gB de FHV após D28. Uma injeção de NDV-HV por via SC ou ON foi suficiente para induzir uma soroconversão em todos os gatos. O desafio induziu um efeito de reforço em todos os vacinados e a produção de Ab de FHV em todos os gatos controle. Os dados sorológicos correlacionam-se bem com os resultados clínicos.
[0151] Tendo, assim, descrito em detalhes as concretizações preferidas da presente invenção, deve ser entendido que a invenção definida pelos parágrafos acima não deve ser limitado aos detalhes específicos estabelecidos na descrição acima, visto que muitas
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6/7 6 variações aparentes dos mesmos são possíveis sem se afastar do espírito ou do escopo da presente invenção.
[0152] Todos os documentos citados ou referenciados nos documentos citados no pedido, e todos os documentos citados ou referenciados aqui (documentos aqui citados), e todos os documentos citados ou referenciados nos documentos aqui citados, juntamente com quaisquer instruções, descrições, especificações de produtos e folhetos de produto do fabricante para quaisquer produtos mencionados aqui ou em qualquer documento aqui incorporado por referência, são aqui incorporados por referência, e podem ser empregados na prática da invenção.
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Claims (2)

REIVINDICAÇÕES
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FIGURA 1(1/2)
SEQ ID NO: ΊΊΡΟ GENE I proteína proteína gB de FHV 2 DNA DNAgB de FHV códon-otimizado 3 DNA DNA gB de FHV do tipo selvagem (GenBank N° FJ478159 que codifica AAB28559.3) 4 proteína proteína gD de FHV (GenBank N°AAB30980.1) 5 DNA DNAgD de FHV códon-otimizado 6 DNA DNA gD de FHV do tipo selvagem (GenBank N° FJ478159) 7 proteína proteína gB do acesso GenBank N° 1911192A (herpesvirus felino) (99,2%) 8 proteína proteína gB do acesso GenBank N° AAB28559 (herpesvirus felino) (100%) 9 proteína proteína gB do acesso GenBank N° AAB24381 (herpesvirus felino) (99,6%) IO DNA DNA gB do acesso GenBank N S49775 que codifica AAB24381 11 proteína proteína gB do acesso GenBank N AAK51052 (herpesvirus canino) (71,7%) 12 DNA DNA gB do acesso GenBank N AF361073 que codifica AAK51052 13 proteína proteína gB do acesso GenBank N° AAT93732 (herpesvirus canino) (71,6%) 14 DNA DNA gB do acesso GenBank N° AY582737 que codifica AAT93732 15 proteína proteína gB do acesso GenBank N CAA92272 (herpesvirus focideo) (70,2%) 16 DNA DNA gB do acesso GenBank N Z68147 que codifica CAA92272 17 proteína proteína gD do acesso GenBank Nu BAA44951 (herpesvirus felino) (100%) 18 DNA DNA gD do accsso GenBank N° D42113 que codifica BAA44951 19 proteína proteína gD do accsso GenBank N° AAB67058 (herpesvirus canino) (39,4%) 20 DNA DNA gD do accsso GenBank N CHU84223 que codifica AAB67058 21 proteína proteína gD do accsso GenBank N ΑΛΚ51062 (herpesvirus canino) (39,4%) 22 DNA DNA gD do accsso GenBank N AF361076 que codifica AAK51062 23 proteína proteína gD do accsso GenBank N” CAC51465 (herpesvirus focideo) (37,9%) 24 DNA DNAgD do accsso GenBank NAJ290955 que codifica CAC5I465___
1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende:
(i) um único vetor recombinante de vírus da doença de Newcastle (NDV) que codifica um antígeno da glicoproteína B (gB) de Herpesvírus felino e um antígeno de glicoproteína D (gD) de Herpesvírus felino, ou um primeiro vetor recombinante de NDV que codifica o antígeno gB de Herpesvírus felino e um segundo vetor de NDV recombinante que codifica o Herpesvírus felino gD; e (ii) um veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.
2. Composição, de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o antígeno gB de Herpesvírus felino consiste na sequência SEQ ID NO:1, ou em que o antígeno gD de Herpesvírus felino consiste na sequência SEQ ID NO: 4; ou em que os antígenos gB e gD de Herpesvírus felino consistem nas sequências SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:4, respectivamente.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o antígeno gB de Herpesvírus felino é codificado por uma sequência de polinucleotídeos que consiste em uma SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3; ou em que o antígeno gD de Herpesvírus felino é codificado por uma sequência de polinucleotídeos que consiste em uma SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6; ou em que os antígenos gB e gD de Herpesvírus felino são codificados pelas sequências de polinucleotídeos que consistem nas SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6, respectivamente.
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2/3
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de ser preferencialmente uma vacina.
5. Vetor recombinante de NDV caracterizado pelo fato de que codifica um antígeno gB de Herpesvírus, um antígeno gD de Herpesvírus ou uma combinação dos mesmos.
6. Vetor recombinante de NDV, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o antígeno gB de Herpesvírus felino consiste na sequência de SEQ ID NO:1; ou em que o antígeno gD de Herpesvírus felino consiste
na sequência de SEQ ID NO:4; ou em que os antígenos gB e gD de Herpesvírus felino consistem nas sequências SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:4, respectivamente. 7. Vetor recombinante de NDV, de acordo com a
reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o antígeno gB de Herpesvírus felino é codificado por uma sequência de polinucleotídeos que consiste na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3; ou em que o antígeno gD de Herpesvírus felino é codificado por uma sequência de polinucleotídeos que consiste na SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6; ou em que os antígenos gB e gD de Herpesvírus felino são codificados pelas sequências de polinucleotídeos que consistem nas SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6, respectivamente.
8. Uso de uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para induzir uma resposta protetora em um animal contra Herpesvírus.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado
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3/3 pelo fato de que o medicamento é produzido para via oronasal, colírio, spray, água potável, in ovo, intramuscular, subcutânea, intradérmica ou transdérmica.
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2/18
FIGURA 1(2/2) 25 oligo Iniciador FR09 26 oligo Iniciador FRIO 27 DNA sequência gcnômica de NDV AV1NEW
NP P M F
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