JP6931327B2 - Fmdv組換えワクチンおよびその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年9月23日に出願された米国仮特許出願第62/054,073号に対する優先権を主張する。
本発明は、動物において口蹄疫ウイルス(FMDV)感染と闘うための組成物に関する。本発明は、FMDV抗原を含む医薬組成物、FMDVに対するワクチン接種の方法ならびにそのような方法および組成物による使用のためのキットを提供する。
FMDはその短い潜伏期間、その高い伝染性の性質、口および足での潰瘍の形成ならびに時に若年の動物の死によって特徴付けられる。FMDは、多数の動物種、具体的にはウシ(cattle)、ブタ(pig)、ヒツジ(sheep)およびヤギ(goat)を冒す。この疾患の原因となる病原体は、ピコルナウイルス(Picornaviridae)科のアフトウイルス(Aphthovirus)属に属するリボ核酸(RNA)ウイルスである(Cooper et al., Intervirology, 1978, 10, 165-180)。現在、口蹄疫ウイルス(FMDV)の少なくとも7種の型が公知である:ヨーロッパ型(A、OおよびC)、アフリカ型(SAT1、SAT2およびSAT3)ならびにアジア型(アジア1)。多数の亜型もまた識別されている(Kleid et al. Science (1981), 214, 1125-1129)。
母体由来抗体(MDA)がFMDに対するワクチン接種への仔ウシ(2歳未満のウシ(cattle))の応答を阻害できることが報告されている(Graves, 1963, Journal of Immunology 91:251-256、Brun et al., 1977, Developments in Biological Standardisation, 25:117-122)。
抗原性ポリペプチドならびにその断片および変種または組換えウイルスベクターは、ワクチンおよび/または医薬組成物に製剤化されてよい。そのようなワクチンまたは組成物は、動物にワクチン接種されるために使用されてよく、同種および異種FMDV株に対する防御を提供する。
例示の方法によって示され、記載の具体的な実施形態だけに本発明を限定することを意図しない次の詳細な記載は、添付の図面と合わせて参照すると、最も良く理解することができる。
いくつかの実施形態ではワクチンは、米国特許第7371395号に記載の水中油(O/W)乳剤などのアジュバントをさらに含む。
さらに他の実施形態ではアジュバントはEMULSIGEN、水酸化アルミニウム、サポニンおよびCpGまたはこれらの組合せを含む。
「動物」によって哺乳動物、鳥類などが意図される。動物または宿主は、哺乳動物およびヒトを含む。動物は、ウマ(例えばウマ(horse))、イヌ(canine)(例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル)、ネコ(feline)(例えばライオン、トラ、イエネコ、野生のネコ、他の大きなネコならびにチーターおよびオオヤマネコを含む他のネコ(feline))、ヒツジ(例えばヒツジ(sheep))、ウシ(例えばウシ(cattle)、雌ウシ)、ブタ(swine)(例えばブタ(pig))、ヤギ(例えばヤギ(goat))、鳥類(例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミューおよびヒクイドリ)、霊長類(例えば原猿類、メガネザル、サル、テナガザル、類人猿)ならびに魚類からなる群から選択されてよい。用語「動物」は、胚性および胎生段階を含む発達のすべての段階における個々の動物も含む。
他に説明する場合を除いて、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。単数形語「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに他を示す場合を除いて複数の参照物を含む。同様に語「または(or)」は、文脈が明らかに他を示す場合を除いて「および(and)」を含むことが意図される。
本発明は、FMDV抗原、エピトープまたは免疫原をコードするポリヌクレオチドへの相補鎖をさらに含む。相補鎖は、ポリマー性で任意の長さであってよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび類似物を任意の組合せで含有してよい。
「単離された」生物学的構成成分(核酸またはタンパク質またはオルガネラなど)は、構成成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的構成成分、例えば他の染色体および染色体外DNAおよびRNA、タンパク質およびオルガネラから実質的に分離されたまたは精製された構成成分を指す。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準的精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。用語は、組換え技術および化学合成によって調製された核酸およびタンパク質も包含する。
別の態様では本発明は、FMDV空カプシドまたはFMDV VLP(ウイルス様粒子)の温度および/または酸安定性を改善することに関する。空カプシドの温度および/または酸安定性は、ジスルフィド架橋の形成によって有利に確実にされる。
さらに、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ(swine)由来のFMDVポリペプチドのホモログは、本発明の範囲内であることが意図される。本明細書において使用される用語「ホモログ」は、オルソログ、類似物およびパラログを含む。用語「類似物」は、同じまたは類似の機能を有するが、無関係の生物において別々に進化した2個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。用語「オルソログ」は、異なる種由来だが種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した2個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。通常オルソログは、同じまたは類似の機能を有するポリペプチドをコードする。用語「パラログ」は、ゲノム内の重複によって関連する2個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。パラログは、通常異なる機能を有するが、これらの機能は関連している場合がある。野生型FMDVポリペプチドの類似物、オルソログおよびパラログは、翻訳後修飾によって、アミノ酸配列差異によってまたは両方によって野生型FMDVポリペプチドから異なっていてよい。具体的には本発明のホモログは、一般に、野生型FMDVポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の全体または一部と少なくとも80〜85%、85〜90%、90〜95%または95%、96%、97%、98%、99%配列同一性を表し、類似の機能を表すであろう。変種は、対立遺伝子の変種を含む。用語「対立遺伝子の変種」は、タンパク質のアミノ酸配列において変化をもたらし、天然集団内に存在する多型(例えばウイルス種または変種(variety))を含有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。そのような天然対立遺伝子の変動は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおいて典型的には1〜5%の相違を生じる場合がある。対立遺伝子の変種は、多数の異なる種における目的の核酸配列の配列決定によって同定でき、これはこれらの種における同じ遺伝子の遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを使用することによって容易に実行され得る。天然対立遺伝子の変動の結果であり、目的の遺伝子の機能活性を変更しない、任意のおよびすべてのそのような核酸変動ならびに生じるアミノ酸多型または変動は、本発明の範囲内であることが意図される。
本発明は、ベクター分子または発現ベクターに含有され、プロモーターエレメントにおよび任意選択でエンハンサーに作動可能に連結されたFMDVポリヌクレオチドをさらに包含する。
用語「組換え」は、天然に存在しないまたは天然に見出されない配置で別のポリヌクレオチドに連結されている半合成または合成由来ポリヌクレオチドを意味する。
「異種性」は、それが比較される他の実体とは遺伝的に異なる実体由来であることを意味する。例えばポリヌクレオチドは、遺伝子工学技術によって異なる供給源由来のプラスミドまたはベクター中に置き換えられる場合があり、異種性ポリヌクレオチドである。その天然コード配列から除去され、天然配列以外のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、異種性プロモーターである。
本発明は、有効量の組換えFMDV抗原および薬学的または獣医学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを含み得る、ヒツジ、ウシ、ヤギおよびブタ(swine)ワクチンまたは医薬もしくは免疫学的組成物に関する。
本明細書に記載の主題は、高度に免疫原性であり動物を同種および異種FMDV株からのチャレンジに対して防御するバキュロウイルス/昆虫細胞発現系において調製されたFMDV抗原に関連する組成物および方法にある程度方向付けられている。
本発明は、有効量の組換えFMDV抗原および薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルを含み得るFMDVワクチンまたは組成物に関する。一実施形態では組換えFMDV抗原は、昆虫細胞においてバキュロウイルス発現ベクターによって発現される。別の実施形態では、FMDVワクチンまたは組成物は、FMDV抗原を発現する組換えウイルスベクターを含む。
本発明の一実施形態は、FMDV空カプシドを含むワクチンまたは組成物に関する。別の実施形態では、本発明は、FMDV空カプシドを発現するウイルスベクターを含むワクチンまたは組成物に関する。FMDV空カプシドは、領域P1、2A/2B’/3B’および3CのcDNAの発現によって得られる。FMDV空カプシドまたはFMDV VLP(ウイルス様粒子)は、熱および/または酸(低PH)安定性が増強されるように修飾されてよい。
本発明は、ウイルスの天然配列と比較して修飾されているヌクレオチド配列、具体的にはcDNAおよびアミノ酸配列にも関する。本発明は、修飾ヌクレオチド配列の発現産生物ならびにこれらの修飾を組み入れるFMDV抗原およびウイルスにも関する。
本発明は、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ(swine)などの動物において免疫原性応答を誘発する任意のFMDVポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原を包含する。FMDVポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原は、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ(swine)などの動物において応答を誘発、誘導するまたは刺激するこれだけに限らないがタンパク質、ペプチドまたはその断片などの任意のFMDVポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原であってよい。
一実施形態では1つまたは複数のFMDV抗原(複数可)をコードしている核酸分子は、FMDV P1領域をコードしているcDNAおよびFMDVのFMDV 3CプロテアーゼをコードしているcDNAである。
一実施形態ではFMDV抗原は、P1−3Cポリペプチドであってよい。別の実施形態では、FMDV抗原はP1のみまたはP1−2A/2B1であってよい。さらに別の実施形態では、FMDV抗原は、VP0−VP3であってよい。別の実施形態では、FMDV抗原はVP4−VP2であってよい。さらに別の実施形態では、FMDV抗原は、3Cであってよい、または昆虫細胞における発現のために最適化された5’UTRを有する3Cであってよい。一実施形態ではP1−2A/2B1および3Cポリペプチドの両方は、単一の構築物を使用して昆虫細胞において発現されてよく、発現は1つまたは複数のプロモーター配列によって制御されてよい。別の実施形態では、FMDV抗原は修飾P1またはVP2である。
本発明は、有効量の組換えFMDV抗原またはFMDV抗原を発現する組換えウイルスベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルを含み得るFMDVワクチンに関する。
別の実施形態では、薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルは、油中水乳剤であってよい。さらに別の実施形態では、油中水乳剤は、水中油乳剤であってよい。
一態様では本発明は、FMDVポリペプチド、具体的には配列番号1、2、4、5、6、8、10、12、13または16に記載の配列を有するヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ(swine)ポリペプチドおよびその変種または断片を提供する。
別の態様では本発明は、本発明の抗原性ポリペプチド、具体的には配列番号1、2、4、5、6、8、10、12、13または16に記載の配列を有するポリペプチドに対し、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
変種は、配列番号1、2、4、5、6、8、10、12、13または16に記載のアミノ酸配列に少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する相同性ポリペプチドである。
FMDVポリペプチドの免疫原性断片は、配列番号1、2、4、5、6、8、10、12、13もしくは16に記載の配列を有するFMDVポリペプチドまたはその変種の少なくとも8個、10個、15個または20個の連続するアミノ酸、少なくとも21個のアミノ酸、少なくとも23個のアミノ酸、少なくとも25個のアミノ酸または少なくとも30個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、FMDVポリペプチドの断片は、全長FMDVポリペプチドにおいて見出される具体的な抗原性エピトープを含む。
別の態様では本発明は、配列番号3、7、9、11、14、15、17、18、19もしくは20に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその変種を提供する。さらに別の態様では本発明は、配列番号3、7、9、11、14、15、17、18、19もしくは20に記載の配列を有するポリヌクレオチドの1つまたはその変種に対し、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。
本発明のさらなる実施形態によると、発現ベクターは、プラスミドベクターまたはDNAプラスミドベクター、具体的にはin vivo発現ベクターである。具体的、非限定的例ではpVR1020または1012プラスミド(VICAL Inc.;Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, Hum Gene Ther, 7(10): 1205-17;例えば、米国特許第5,846,946号および第6,451,769号を参照されたい)は、ポリヌクレオチド配列の挿入のためのベクターとして利用され得る。pVR1020プラスミドは、pVR1012由来であり、ヒトtPAシグナル配列を含有する。一実施形態ではヒトtPAシグナルは、Genbank受入番号HUMTPA14の下のアミノ酸M(1)からアミノ酸S(23)までを含む。別の具体的非限定的な例では、ポリヌクレオチド配列の挿入のためのベクターとして利用されるプラスミドは、Genbank受入番号U28070の下のアミノ酸M(24)からアミノ酸A(48)までのウマIGF1のシグナルペプチド配列を含有してよい。実行において参考にされ得るおよび用いられ得るDNAプラスミドについての追加的情報は、例えば米国特許第6,852,705号、第6,818,628号、第6,586,412号、第6,576,243号、第6,558,674号、第6,464,984号、第6,451,770号、第6,376,473号および第6,221,362号において見出される。
「宿主細胞」は、遺伝的に変更されたまたは組換えプラスミドもしくはベクターなどの外来性ポリヌクレオチドの投与によって遺伝的に変更され得る原核または真核細胞を記す。遺伝的に変更された細胞に関する場合、用語は元の変更された細胞およびその後代の両方を指す。
一実施形態では組換えFMDV抗原は、昆虫細胞において発現される。
一実施形態では、本明細書に開示の主題は、有効量の組換えFMDV抗原またはFMDV抗原を発現する組換えウイルスベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルを含んでよい有効量のワクチンをヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ(swine)に、投与することを含む、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ(swine)にワクチン接種する方法に方向付けられている。
本発明の一実施形態では方法は、本発明による乳剤と製剤化されたワクチン組成物の単回投与を含む。例えば、一実施形態では免疫学的またはワクチン組成物は、ポリペプチドおよびVLP(ウイルス様粒子)もしくは空カプシドを含むバキュロウイルス発現FMDV抗原、またはFMDV抗原を発現している組換えウイルスベクターを含む。電子顕微鏡検査は、バキュロウイルス発現ベクターで形質転換された昆虫細胞がFMDV VLPまたはFMDV空カプシドを産生することを示し、それにより本発明による免疫学的またはワクチン組成物はFMDV VLPもしくはFMDV空カプシドを含むものを包含する。
一実施形態では、本明細書で開示の主題は、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターによって産生されたFMDV抗原またはFMDV抗原を発現している組換えウイルスベクターをヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ(swine)に投与することを含む、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ(swine)にワクチン接種する方法に方向付けられている。
一実施形態では、本明細書で開示の主題は、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターによって産生されたFMDV抗原またはFMDV抗原を発現している組換えウイルスベクターを単離すること、および任意選択で薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルと組み合わせることを含む、ワクチンまたは組成物を調製する方法に方向付けられている。
同種および異種両方のFMDV株は、ワクチンの有効性を検査するためのチャレンジのために使用される。投与は、皮下または筋肉内であってよい。投与は無針であってよい(例えばPigjetまたはBioject)。
初回−追加免疫プロトコールにおいて使用される本発明の組換え抗原性ポリペプチドを含む組成物は、薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤、アジュバントまたは賦形剤に含有される。本発明の手順は、ヒツジ、ウシ、ヤギもしくはブタ(porcine)FMDVから動物を防御するおよび/または感染動物における疾患の進行を予防する。
一実施形態では、本明細書に開示の主題は、感染した動物とワクチン接種動物との間の識別(DIVA)のための検出方法を提供する。
一実施形態では、本明細書に開示の主題は、組換えFMDV免疫学的組成物もしくはワクチン、または不活性化FMDV免疫学的組成物もしくはワクチン、組換えFMDVウイルス性組成物もしくはワクチンのいずれか1つおよび方法を実施するための説明書を含んでよい免疫応答を誘発または誘導する方法を実施するためのキットに方向付けられている。
本発明の別の実施形態は、本発明のFMDV抗原を含む組成物またはワクチンおよび組換えFMDVウイルス性免疫学的組成物もしくはワクチンおよび、動物において免疫応答を誘発するための有効量での送達の方法を実施するための説明書を含む、動物においてFMDVに対する免疫学的または防御的応答を誘導する方法を実施するためのキットである。
本発明の別の実施形態は、本発明のFMDV抗原を含む組成物またはワクチンおよび不活性化FMDV免疫学的組成物もしくはワクチンおよび、動物において免疫応答を誘発するための有効量での送達の方法を実施するための説明書を含む、動物においてFMDVに対する免疫学的または防御的応答を誘導する方法を実施するためのキットである。
続く実施形態は、本発明により包含される。一実施形態では、FMDV抗原またはその断片もしくは変種および薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルを含む組成物が開示される。別の実施形態では、FMDV抗原を発現する組換えウイルスベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルを含む組成物が開示される。別の実施形態では、FMDV抗原またはその断片もしくは変種がヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ(swine)FMDV抗原の少なくとも15個のアミノ酸を含む免疫原性断片を含む、上に記載の組成物が開示される。一実施形態では、FMDV抗原またはその断片もしくは変種が部分的に精製されている上記組成物が開示される。一実施形態では、FMDV抗原またはその断片もしくは変種が実質的に精製されている上記組成物が開示される。
有利には、アジュバントを含むプラスミド混合物は、即座に、有利には調製物の投与と同時にまたは調製物の投与の直前に形成される;例えば投与の直前またはこれに先立って、プラスミドアジュバント混合物は形成され、有利には混合物が複合体を形成するために投与の前に十分な時間、例えば投与に先立つおよそ30分間などの投与に先立つ約10から約60分間が与えられるようにされる。
DMRIEまたはDMRIE−DOPEアジュバント:プラスミド質量比は、約10:約1から約1:約5、および約1:約1から約1:約2、例えば1:1から1:2などの約50:約1から約1:約10の間であってよい。
構造に関して、アクリルまたはメタクリル酸ポリマーおよびEMAは、好ましくは次の式:
式中:
− R1およびR2は、同じまたは異なっていてよく、HまたはCH3を表す
− x=0または1、好ましくはx=1
− x+y=2でy=1または2。
EMAについて、x=0およびy=2ならびにカルボマーについてx=y=1。
本発明は、そのような組合せ組成物を;例えば活性構成成分を、有利にはアジュバント、担体、サイトカインおよび/または希釈剤と合わせて、混合することによって、調製することを包含する。
本発明は、ここに次の非限定的例の方法によりさらに記載される。
バキュロウイルス/昆虫細胞系でのFMDV抗原の構築および発現
血清型A FMDVの陽性株RNAゲノムは、2個の非コード領域に隣接された単一のORF(1662アミノ酸)からなる。ORFは、3個の部分を有する。第1の部分は成熟および切断後に4個のカプシド構成成分(VP4、VP2、VP3およびVP1)の発現を導くポリタンパク質P1−2Aである。第2の部分は2個のタンパク質(2Bおよび2C)を含有し、RNA合成および細胞膜小胞増殖に関与するP2である。第1の部分は、4個のタンパク質(3A、3B、3Cおよび3D)を含有するP3である。3Cは、ポリタンパク質の切断に関与する主なものである。3Dは別のプロテアーゼであり、3A/3Bは膜足場(anchorage)、病態形成、RNA合成およびキャプシド形成に関与する。P1−2Aおよび3Cは、FMDVカプシド粒子またはFMDV VLPを構成するすべてのタンパク質の発現および切断のために必要である(図2を参照されたい)。潜在的機能性ドメインを下の表1に示す。
ジスルフィド架橋の作製(+最適化翻訳開始コンテクスト(context))および対応する組換えバキュロウイルスBacMEB097の生成のためにVP2(H93C)中に変異を有するFMDV A24 Cruzeiro株のポリタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドpMEB097の構築
プラスミドpMEB097の生成
FMDV A24 Cruzeiro株のポリタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドを含有するプラスミドpMEB096をプラスミドpMEB097を生成するために変異導入した。プラスミドpMEB097は、VP2(H93C)またはP1(H179C)に変異を含有する修飾ポリタンパク質(配列番号2)をコードするポリヌクレオチド(配列番号3)を含有している。修飾ポリタンパク質(配列番号2)は、ヒスチジンのシステインによる置換をVP2の93位またはP1の179位に含有している。
プラスミドpMEB097(図3を参照されたい)を、相同組換えによってポリヘドリンプロモーターの調節下で、FMDV A24 Cruzeiro株のFMDV P1/2A/2B’3B’/3C遺伝子(VP2の93位にシステインを有する)をコードする組換えバキュロウイルスを生成するために使用した。ATCC由来のスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(Sf)9昆虫細胞をプラスミドpMEB097およびBsu36Iトリプルカット(triple−cut)直鎖化AcNPV DNAで、製造者のプロトコール(Baculogold、Pharmingen)に従って同時トランスフェクトした。同時トランスフェクション上清からの組換えバキュロウイルスを2回プラーク精製した。クローン5個を28℃、25cm2単層フラスコ規模で増幅した(継代1)。クローン5個をSf9昆虫細胞で増幅し、組換えクローンをFMDV A24血清型に特異的であるモノクローナル抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。クローン2は、良好なレベルの発現を示した。このクローンを28℃、50mL規模で三角フラスコ(懸濁物)、105rpmでさらに増幅した(継代2)。200mL規模での第3継代(継代3)をタンパク質発現のために使用するウイルス保存物を得るために実施した。次いでこのウイルス保存物をプラークアッセイによって滴定した。ウイルス保存物の獲得は、2%FCSを補充したSF900III培地を使用して実施した。滴定後、組換えバキュロウイルス保存物(継代3)を無血清培地でのタンパク質産生のために使用した。
昆虫細胞(Sf9−Invitrogen)を生成されたバキュロウイルスBacMEB097によって、およびBacMEB084(変異を含まない参照として)によって感染効率(MOI)1pfu/mlで感染させた。昆虫細胞を105rpmでFCSを含まないSf900II培地中、4日間、28℃で増殖させた。上清をおよそ4倍に濃縮し:A=無処置、B=1時間、56℃、C=HClをpH5未満になるまで添加、のとおり処置した。
さらに、VLPの安定性は、1時間、56℃での処置(カラム「B」)および培地の酸性化(カラム「C」)後に見られたとおり、BacMEB097中の変異によってもたらされたジスルフィド架橋の形成で明らかに増加した。
結論として、トランスファープラスミドpMEB097で生成されたバキュロウイルスBacMEB097は、Sf9昆虫細胞におけるFMDVカプシド発現およびプロセシングを誘導する。これらのFMDV発現カプシドは、FMDV様ビリオンの特徴的形態を有するVLPに自己集合した。ジスルフィド架橋の形成に関与する変異は、BacMEB084(FMDV A24 Cruzeiro株のポリタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドを含有するプラスミドpMEB096を含有している)によって得られたVLPと比較して、VLPの安定性を増加させた(熱処置または酸性化後)。
ジスルフィド架橋の作製(+最適化翻訳開始コンテクスト)およびFMDVカプシドタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスBacMEB099の生成のために、VP2(S93C)に変異を有するFMDV O1 manisa株のポリタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドpMEB099の構築
FMDV O1 manisa株のポリタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドを含有するプラスミドpMEB095をプラスミドpMEB099を生成するように変異導入した。プラスミドpMEB099は、VP2(S93C)またはP1(S179C)に変異を含有している修飾ポリタンパク質(配列番号6)をコードするポリヌクレオチド(配列番号7)を含有している。修飾ポリタンパク質(配列番号6)は、VP2の93位またはP1の179位にセリンのシステインによる置換を含有する。
カプシドタンパク質のVLPへの正しい集合を電子顕微鏡検査によって評価した(図6B)。25〜30nmの粒子は、31nmの一定の大きさの丸から正二十面体の非常に均一な形態を示し、染色剤の浸透によって特徴付けられ、それによりFMDV様と解釈された。粒子の数は1mlあたり約108個と推定された。
結論として、トランスファープラスミドpMEB099で生成されたバキュロウイルスBacMEB099は、Sf9昆虫細胞におけるFMDVカプシド発現およびプロセシングを誘導した。これらのFMDV発現カプシドは、FMDV様ビリオンの特徴的形態を有するVLPに自己集合した。
(例1.3)
ジスルフィド架橋の作製(+最適化翻訳開始コンテクスト)およびFMDVカプシドタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスの生成のために、FMDV Iraq株のポリタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドpMEB106および、VP2に変異を有するFMDV Asia株のポリタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドpMEB104の構築
FMDV Iraq株のP1(179位のC)に変異を含有する修飾ポリタンパク質(配列番号8)をコードしているポリヌクレオチド(配列番号9)およびFMDV Asia株のP1(179位のC)に変異を含有している修飾ポリタンパク質(配列番号10)をコードしているポリヌクレオチド(配列番号11)を含有するプラスミドを例1.1に概説の手順により構築した。
トランスファープラスミドpMEB106で生成されたバキュロウイルスBacMEB106は、Sf9昆虫細胞でのFMDVカプシド発現およびプロセシングを誘導した。トランスファープラスミドpMEB104で生成されたバキュロウイルスBacMEB104は、Sf9昆虫細胞でのFMDVカプシド発現およびプロセシングを誘導した。これらのFMDV発現カプシドは、FMDV様ビリオンの特徴的形態を有するVLPに自己集合した。
バキュロウイルス発現「ケージ」FMDV VLPの安定性
大規模(150L)にFMDV VLPを産生する能力を実証した。150Lバッチ、製造規模で増殖させた場合、バキュロウイルス発現コバレントケージおよび野生型A24 FMDV−VLPの十分な力価が得られた(log10CCID507.14/mL)(CCID:細胞培養感染用量)。驚くべきことに、試料加熱後でさえ多量の安定FMD VLPが存在した(加熱2.14log10 CCID50/mlに対して、非加熱2.19log10 CCID50/ml)(図8を参照されたい)。さらに図8に示すとおり、EM計数は、4Lおよび150Lバッチの両方から優れた数のVLPを明らかにした。
バキュロウイルス、ウキクサおよびカナリアポックス発現FMDVでのウシ(cattle)のワクチン接種、および続く病原性チャレンジ
この研究の目的は、ウシ(cattle)において、TS6アジュバント中に製剤化された3種の実験用FMD A24 Cruzeiro抗原のFMD病原性チャレンジに対する有効性を検査することであった。
FMDVチャレンジ研究におけるさまざまな実験用FMD A24 Cruzeiroワクチン(バキュロウイルス発現野生型FMDV)のウシ(cattle)における防御の評価
研究の目標は、TS6/サポニンアジュバント中に製剤した3個の実験用FMD A24 Cruzeiro抗原のFMD病原性チャレンジに対する有効性を、ウシ(cattle)において検査することであった。バキュロウイルス(BacMEB084、ろ過または非ろ過)またはカナリアポックスウイルスのいずれかで発現されたFMD A24 Cruzeiro抗原を含有するワクチンをD0にウシに投与した。ワクチン防御をD21に実施した病原性FMDV A24 Cruzeiroチャレンジに対して(関連ヨーロッパ薬局方研究書により)評価した。
バキュロウイルスを使用する実験用FMDV製剤の仔ブタにおける免疫原性
この研究の目的は、バキュロウイルスにおいて発現され、TS6またはTS6+サポニン中に製剤化された4種のFMDV抗原の免疫原性を評価することであった。ワクチンを次の割合で調製した(表4.1)。
バキュロウイルス発現A24 FMDV VLPの酸および熱安定性
A24 FMDV VLPを酸および熱処置に供し、それらの安定性をEM(図13)およびELISA分析(図14)を使用して評価した。図に示すとおり、コバレントケージVLPは、低pHおよび熱の両方に顕著に耐性であったが野生型VLPはそうではなかった。さらに、図15および表6に示すとおりコバレントケージVLPは、5℃で保存した場合にそれらの野生型対応物と比較して経時的に顕著により安定であった。
バキュロウイルスFMD O1 Manisa(修飾、コバレントケージ)で製剤化されたワクチンの通常飼育の仔ブタでの免疫原性
研究の目的は、TS6中に製剤化された2種のバキュロウイルスFMD O1−Manisa抗原および1種のアデノウイルスベクターFMDV O1−Manisaの通常飼育のブタ(pig)における安全性および有効性を評価することであった。各製剤を3週間離した2回注射で投与した(D0−D21)。ブタ(pig)はD0に11〜12週齢であり、ワクチンの2mL筋肉内感染を受けた。安全性を局所および全身反応のモニタリングを通じて評価した。有効性を血清学的(血清中和力価)モニタリング(D−1、D20、D43)および細胞免疫(CMI)アッセイ(D27、D43)を通じて評価した。
図22は、特異的IFNγ分泌細胞がG1およびG2>G4>G3の順ですべてのワクチン接種群において検出されたことを示している。G1とG2との間に差異はない。特異的IFNγ分泌細胞は、G3においてよりもG1およびG2において顕著に高かった。
バキュロウイルス発現FMDV−VLP(修飾、コバレントケージ)/TS6ワクチン接種群(G1およびG2)の両方における特異的IFNγ分泌細胞、特異的IgG分泌形質細胞および特異的IgG分泌メモリーB細胞の高いレベルは、FMDV感染に対する良好なレベルの防御を示している。
(例9)
Iraq 22 BacMEB106(コバレントケージ)安定性
ブタ(pig)におけるAsia ShamirコバレントケージおよびIraq A22コバレントケージ血清学研究
研究の目的は、バキュロウイルスにおいて産生されたFMD Asia1 ShamirおよびFMD A22 Iraq VLP抗原の通常飼育のブタ(pig)における免疫原性を評価することであった。Asia1 Shamir抗原の2バッチおよびA22 Iraq抗原の2バッチをTS6製剤において検査した。各製剤を3週間離した2回注射でブタ(pig)に投与した(D0−D21)。ブタ(pig)はD0に8〜9週齢であった。免疫原性を血清学的モニタリング(D−1、D20、D42)および細胞免疫(CMI)アッセイ(D26、D41)を通じて評価した。
VLP Asia1 Shamir(G1およびG3)でワクチン接種したすべてのブタ(pig)は、1.20Log10 PD50近くの平均力価で1回目のワクチン接種に明らかに抗体応答した。さらに2回目のワクチン接種後にほとんどのブタ(pig)が1.8Log10 PD50の力価を超えて明らかな追加免疫効果があった。対照(G5)およびほとんどのA22 Iraqワクチン接種ブタ(pig)(G2およびG4)は、追加免疫ワクチン接種後でさえAsia1 Shamirに対していかなる抗体応答率も示さなかった。
ヒトアデノウイルス5ベクター組換えFMDVの構築
この研究の目的は、コドン最適化FMDV構造タンパク質および血清型A24 CruzeiroについてのC142T部位変異を有する非最適化3C プロテアーゼを発現しているアデノウイルス組換え体を生成することである。FMDV抗原は、FMDVカプシド前駆体(VP1、VP2(H93C部位変異を有する、コバレントケージ)、VP3、VP4、2Aおよび全2Bコドン最適化)ならびに非最適化部分的3BならびにC142T部位変異を有する全長3Cプロテアーゼ(配列番号16)を含有する。
HEK293細胞(ATCC)を10%ウシ胎児血清(Moregate Batch #81827101)を含むMEM(Gibco #11095)中、37℃、5%CO2で維持した。これらの細胞を組換えアデノウイルスvAD3027をレスキューし、ウイルス保存物を作るために使用した。
発現クローンをGateway technology(Invitrogen)を使用するデスティネーション(destination)ベクターでのエントリー(entry)ベクターのLR組換えによって生成した。組換えアデノウイルスvAD3027をトランスフェクション試薬でのHEK293細胞中の直鎖化発現クローンのトランスフェクションによって生成した。レスキュー後、各ウイルスを凍結融解周期および遠心分離による細胞デブリの清澄化によって回収した。継代のために、各ウイルスをHEK293細胞の単層に接種し、感染およそ3〜4日後、ウイルスを凍結融解周期および遠心分離による清澄化によって回収した。5回継代を−80℃で保存するウイルス保存物を作るために実行した。
ブタ(pig)におけるワクチン接種後の種々の口蹄疫ウイルス(FMDV)ワクチン候補の血清学評価
(例12.1)
FMDV A24ワクチンの血清学評価
研究の目的は、ブタ(pig)でのワクチン接種後のさまざまなアジュバントと併せた(または併せない)、ヒトアデノウイルス5−ベクターFMDVワクチンおよびバキュロウイルス発現FMD A24組換えVLP(コバレントケージ)ワクチンを含む種々のFMDV A24ワクチン製剤の免疫原性を評価することである。
通常飼育で飼育された仔ブタ60頭(およそ1カ月齢)をブタ(pig)4〜7頭をそれぞれ含む9個の処置群の1個にそれぞれ無作為化した。得られた群構成を下の表11に示す。
すべての仔ブタから血液試料を0日目(ワクチン接種前)、7、15、21日目(ワクチン接種前)、28、35および42日目に回収した。42日目にすべての仔ブタからの血清試料を血清ウイルス中和(SVN)によってFMDV抗体について検査した。vAD3027構築物でワクチン接種されたものおよび対照(群6〜9)からの試料をすべての回収日にSVNアッセイに供した。
FMDV SVN結果を図23に示す。結果は、FMD A24組換えVLPワクチンおよびヒトアデノウイルス5ベクターFMDVワクチンの両方が動物において免疫応答を誘導したことを実証した。103.9VLPの低用量でFMD A24組換えVLPワクチンは、動物において良好な免疫応答を誘導した。ヒトアデノウイルス5ベクターFMDVワクチンでワクチン接種した動物(群6〜7)は、低用量FMD A24組換えVLPワクチンでワクチン接種したものよりもより高い抗体応答を二用量ワクチン接種レジメン後に有した。驚くべきことに、ウイルスベクターFMDVワクチンおよびBacA24 VLPワクチンでの異種性初回−追加免疫レジメンは、同じワクチンでの初回−追加免疫よりも強い免疫応答を実証した。
結果は、すべての対照およびBacA24VLP製剤ワクチンでワクチン接種した仔ブタが42日目のSN抗体力価(≦0.6Log10)でアデノウイルスに対して陰性であったことを示した。群6および7におけるvAD3027でワクチン接種したすべての動物は、1.8から3.0の間の力価範囲で抗体陽転した一方で、群8では仔ブタの50%が抗体陽転した。全体として群6の動物は、アデノウイルスに対するさらに高い抗体応答を有した。
FMDV O1 Manisa、AsiaおよびIraqワクチンの血清学評価
この研究の目的は、ブタ(pig)でのワクチン接種後のさまざまなアジュバントと併せた(または併せない)、ヒトアデノウイルス5−ベクターFMDVワクチンならびにバキュロウイルス発現FMD O1 Manisa、AsiaおよびIraq組換えVLP(コバレントケージ)ワクチンを含む種々のFMDV O1 Manisa、AsiaおよびIraqワクチン製剤の免疫原性を評価することである。
研究設計は例12.1に記載のとおりである。ワクチン接種動物からの血液試料を例12.1に記載のとおり種々の段階で採取し、血清学的に検査した。結果は、本発明の組成物またはワクチンが、免疫原性であり、動物に防御を提供することを示している。
通常飼育のブタ(swine)およびウシ(cattle)ならびにMDA陽性ブタ(swine)およびウシ(cattle)におけるワクチン接種後の種々の口蹄疫ウイルス(FMDV)ワクチン候補の血清学評価および有効性
本研究の目的は、免疫応答を増加させるために通常飼育のブタ(swine)またはウシ(cattle)において、ならびにMDAを克服し、免疫応答を増加させるためにMDA陽性ブタ(pig)およびウシ(cattle)において、2種の異種性ワクチンの初回−追加免疫投与(2回投与)または2種の異種性ワクチンの同時投与(1回投与)を評価することである。異種性ワクチンは、同じFMDV血清型由来のカプシドを発現するFMDV VLPワクチンまたはFMDVウイルスベクターワクチンなどの異なる型のワクチンであってよい。異種性ワクチンは、A24、O1 Manisa、AsiaまたはIraq株などの異なるFMDV血清型のカプシドを発現する同じ型のワクチンであってもよい。異種性ワクチンは、A24、O1 Manisa、AsiaまたはIraq株などの異なるFMDV血清型のカプシドを発現している異なる型のワクチンであってもよい。異種性ワクチンは、A24、O1 Manisa、AsiaまたはIraq株などの異なるFMDV血清型のカプシドを発現する異なる型のワクチンすなわちFMDV VLPワクチンまたはFMDVウイルスベクターワクチンであってもよい。
動物は、ワクチン接種後に同種または異種FMDV株でチャレンジされる。
組成物またはワクチンによって誘導された防御有効性を通常飼育の動物またはMDV陽性動物においてワクチン接種チャレンジによってFMDV病原体に対して評価する。防御効果を臨床観察ならびに/または組織および血液での特異的病原体のウイルスロードによって評価する。ワクチン接種動物から血液試料を種々の段階で採取し、血清学的に検査する。結果は本発明の組成物またはワクチンが、免疫原性であり、通常飼育の動物およびMDV陽性動物において防御を提供することを示している。
Claims (20)
- 口蹄疫ウイルス(FMDV)抗原またはFMDV抗原を発現する組換えウイルスベクターを含むワクチン組成物であって、前記FMDV抗原は配列番号2、6、8、10または16に記載の配列を有するポリペプチドを含む、ワクチン組成物。
- ウイルスベクターがアデノウイルスである、請求項1に記載のワクチン組成物。
- FMDV抗原が修飾P1ポリペプチドである、請求項1または2に記載のワクチン組成物。
- FMDV抗原が、配列番号3、7、9、11、17または20に記載の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされている、請求項1から3のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
- 薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルをさらに含む、請求項1から4のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
- 配列番号2、6、8、10または16に記載の配列を有するFMDV抗原をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド。
- ポリヌクレオチドが配列番号3、7、9、11、17または20に記載の配列を有する、請求項6に記載のプラスミド。
- ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結されている、請求項6または7に記載のプラスミド。
- FMDV VLPを発現する安定に形質転換された昆虫細胞であって、前記FMDV VLPは配列番号2、6、8、10または16に記載の配列を有するポリペプチドを含む、昆虫細胞。
- 1つまたは複数のFMDV抗原をコードし、発現する1つまたは複数の異種性ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターであって、前記FMDV抗原は配列番号2、6、8、10または16に記載の配列を有するポリペプチドを含む、組換えウイルスベクター。
- アデノウイルスである、請求項10に記載の組換えウイルスベクター。
- FMDV抗原が、配列番号3、7、9、11、17または20に記載の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされている、請求項10または11に記載の組換えウイルスベクター。
- 昆虫細胞において発現された実質的に精製されたFMDV VLPであって、配列番号2、6、8、10または16に記載の配列を有するポリペプチドを含む、FMDV VLP。
- 請求項1から5のいずれか1項に記載のワクチン組成物、または請求項10から12のいずれか1項に記載のウイルスベクター、または請求項13に記載のFMDV VLPの少なくとも1回の投与を含む、FMDV感染に感受性である非ヒト動物にワクチン接種するまたは非ヒト動物においてFMDVに対する免疫応答を誘発する方法。
- 初回−追加免疫投与レジメンを含む、請求項14に記載の方法。
- 初回−追加免疫レジメンが、FMDVから非ヒト動物を防御するためおよび/または感染非ヒト動物において疾患進行を予防するために、請求項1に記載のワクチン組成物の初回投与、およびFMDV抗原をin vivoで発現するためのポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを含む組成物の追加免疫投与を含む、請求項15に記載の方法。
- 初回−追加免疫レジメンが、FMDVから非ヒト動物を防御するためおよび/または感染非ヒト動物において疾患進行を予防するために、FMDV抗原をin vivoで発現するためのポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを含む組成物の初回投与、および請求項1に記載のワクチン組成物の追加免疫投与を含む、請求項15に記載の方法。
- 同じまたは異なるFMDVワクチン組成物の1回または複数回の投与を含む、請求項14に記載の方法。
- FMDVワクチン組成物が、in vitroで発現されたFMDV VLPおよびin vivoでFMDV抗原を発現するウイルスベクターを含む、請求項18に記載の方法。
- 母体由来抗体陽性(MDA陽性)非ヒト動物をFMDV感染に対して防御する、請求項14から19のいずれか1項に記載の方法。
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