WO2016027135A1 - VACUNA EMULSIONADA PARA OBTENER FORMULACIONES DE INMUNOGLOBULINAS IgY CONCENTRADAS; PROCESOS Y USOS DE LAS MISMAS. - Google Patents

VACUNA EMULSIONADA PARA OBTENER FORMULACIONES DE INMUNOGLOBULINAS IgY CONCENTRADAS; PROCESOS Y USOS DE LAS MISMAS. Download PDF

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José Andrés MORALES GARZON
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    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to the field of veterinary medicine, in particular to the treatment of diseases in animals, and more specifically to the prevention or treatment of Respiratory and Reproductive Syndrome or PRRS (for its acronym in English, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) ) in pigs, Porcine Epidemic Diarrhea (DEP), white spot syndrome in shrimp, bovine mastitis, infections caused by Actinnobac ⁇ llus pleuropneumoniae in pigs, coccidiosis in birds and poisoning caused by fungal toxins, through administration of a concentrated immunoglobulin formulation of avian origin, obtained from egg yolk from previously hyperimmunized hens with an emulsified vaccine formulation comprising antigens, a light mineral oil and a particulate adjuvant consisting of particles of a biodegradable polymer.
  • PRRS Respiratory and Reproductive Syndrome
  • PRRS for its acronym in English, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
  • PRRS Respiratory and Reproductive Syndrome
  • PRRS
  • Vaccination is one of the many tools used daily on farms, There are others such as biosecurity measures to prevent the entry of pathogens from other farms, the application of hygiene guidelines and the management of animals to reduce the spread of diseases among animals of the same farm, strict control of food, or the creation of a comfortable environment for farm animals.
  • PED Porcine Epidemic Diarrhea
  • WSSV white spot syndrome virus
  • bovine coronavirus and rotavirus Another disease is caused by the white spot syndrome virus (WSSV), the main shrimp pathogen and responsible for large production losses and profits in this industry worldwide. So far there is no effective treatment to control the infection.
  • the treatment of diseases caused by bovine coronavirus and rotavirus is also of interest.
  • Act ⁇ nobac ⁇ llus pleuropneumon ⁇ ae a bacterium responsible for respiratory problems in pigs with worldwide distribution, knowing each other for 50 years, and having a high incidence since the 80s, being frequent in fattening units.
  • Trichothecenes toxins produced by several Fusarium fungi, particularly Fusar ⁇ um gram ⁇ nearum and Fusar ⁇ um sporotrichioid.es. They are produced in crops and enter the food through contaminated ingredients. Trichothecenes are proven tissue irritants and their intake is mainly associated with oral lesions, dermatitis and intestinal irritation. The main physiological response to these mycotoxins is loss of appetite. Trichothecenes are strong suppressor mycotoxins that affect the immune cellular response with a direct impact on the medulla, spleen, lymphoid tissues, thymus and intestinal mucosa, where actively dividing cells are injured.
  • the first form of protection is achieved through vaccines that can be of different kinds: live, lyophilized, or dead microorganisms in oily emulsions, and recently the creation of cloned and recombinant vaccines.
  • vaccines can be of different kinds: live, lyophilized, or dead microorganisms in oily emulsions, and recently the creation of cloned and recombinant vaccines.
  • Each of them has advantages and disadvantages in terms of protection, immune response and duration of protection.
  • Vaccination and vaccines In: Veterinary Immunology. 5 to Ed. Me. Graw-Hill Pp. 285-305).
  • the second form of protection also called passive immunity involves the transmission of specific antibodies against infectious agents to a host.
  • antibodies are made mainly in mammals and less frequently in birds.
  • the types of antibodies that are regularly made in mammals are monoclonal and polyclonal, and polyclonal in birds ⁇ Larsson, et al 1993. Chicken antibodies: taking advantage of evolution. A review Poultry Sci. 72: 1807-1812).
  • the Gallus gallus domesticus species is the only species from which antibodies are obtained in a more accessible and highly defined manner.
  • the main serum antibody present in this species is IgG although IgG is transported to the egg in a manner similar to the transfer of IgG from mammals through the placenta.
  • immunoglobulin Y (IgY) is found in higher concentration in the yolk, however small amounts of IgY are also found in the white. It has even been found that the amounts of IgY are higher in the yolk than in the chicken's serum ⁇ Larsson, et al 1993. Chicken antibodies: taking advantage of evolution. A reviéw Poultry Sel. 12: 1807-1812).
  • IgY Due to its phylogenetic difference with mammalian antibodies, IgY shows no cross reaction with mammalian antibodies.
  • egg yolk antibodies immunoglobulins
  • diagnostic and therapy tools Schott, et al. 1989.
  • Ig's have presented several advantages when used in immunodiagnostics.
  • yolk Ig's have been used to detect several viruses by ELISA, immunodiffusion, immunofluorescence and complement fixation techniques.
  • Ig Given its low isoelectric point compared to human Ig, it has been used in electrophoresis assays for the quantification of serum immunoglobulins of several animals ⁇ Altschuh, D. et al. 1984.
  • IgY have been used as immunotherapy in different fields of science such as the administration of oral egg yolk immunoglobulins has prevented rotavirus infections in mice, cattle, and pigs among others ⁇ Ikemori , Y. et al. 1992. Protection of neonatal calves against fatal enteric colibacillosis by administration of egg yolk powder from hens immmunized w ⁇ th K99-pylated enterotoxigenic Escherichia coli. Am. J.Vet. Res .53: 2005-2008; Kuroki r M. et al 1994. Passive protection against bovine rotavirus in calves by specific immunoglobulins from chicken egg yolk. Arch. Virol. 138: 143-148; Marquart, R. 1998. Antibody-loaded eggs for piglets: prevention of baby pigs from diarrhea. Proc. 2 nd International Symposium on Egg Nutrition and Newly Emerging Ovo-Technologies. Alberta, Canada).
  • RNA viruses such as PRRS virus or PED virus
  • lack of control is due in large part to its high mutation rate. This is a common feature among RNA viruses a consequence of the lack of proofreading activity of RNA polymerase. Then, this failure together with the rapid kinetics of virus replication increase the risk of mutation and emergence of quasi-species (Manreetpal Singh Brar, Mang Shi, Raymond Kin-Hi Hui and Frederick Chi-Ching (2014) Leung mail Genomic Evolution of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Isolates Revealed by Deep Sequencing. PLOS one).
  • PRRS virus The genetic variation of the PRRS virus has been reported to be between 0.48 and 1.32% (Murtaugh M., (2012) Use and interpretation of sequencing inf PRRSV control programs. Alien D. Leman Swaine Conference. Veterinary Continuing Education). These characteristics of the PRRS virus explain the inadequate protection that has been obtained by vaccines.
  • immunoglobulins obtained from egg yolk has already been used in various applications in animal health and prophylaxis and even in humans.
  • the research carried out by Akita and Nakai demonstrate that the protective function of IgY against infectious agents is attributed primarily to its ability to prevent colonization or neutralize toxins.
  • an objective of the present invention relates to obtaining concentrated IgY immunoglobulin formulations of avian origin, effective and safe against various agents that infect animals, including for example the PRRS virus, the epidemic diarrhea virus Swine (DEP), White Spot Syndrome Baculov ⁇ rus Complex virus, the bacteria that cause bovine mastitis, Actinnobacillus pleuropneumoniae and coccidiosis, as well as poisoning caused by trichothecenes, because its feasibility could directly affect a significant decrease in The expenses associated with vaccination processes and, more importantly, would greatly reduce the productive losses associated with these diseases.
  • PRRS virus the epidemic diarrhea virus Swine (DEP)
  • EDP epidemic diarrhea virus Swine
  • White Spot Syndrome Baculov ⁇ rus Complex virus the bacteria that cause bovine mastitis, Actinnobacillus pleuropneumoniae and coccidiosis, as well as poisoning caused by trichothecenes
  • emulsified vaccine comprising antigens from one or several strains of PRRS virus, light mineral oil and a particulate adjuvant that It consists of particles, micro-particular or nano-particles of a biodegradable polymer.
  • the inventors of the present application have successfully achieved the objective of the present invention and have surprisingly found that with expected antigens from one or more different strains of the PRRS virus, the expected cross-protection against other strains of the same virus can be generated. induce the generation of immunoglobulins capable of neutralizing a greater number of circulating PRRS viruses in the field.
  • the emulsified vaccine formulation must also include a light mineral oil, such as Marcol and a particulate adjuvant consisting of particles, micro-particles or nano-particles of a biodegradable polymer to enhance vaccination, preferably using a linear polysaccharide composed of randomly distributed chains of ⁇ - (1-4) D-glucosamine (deacetylated units) and N-acetyl-D-glucosamine (acetylated unit), such as Chitosan.
  • a light mineral oil such as Marcol
  • a particulate adjuvant consisting of particles, micro-particles or nano-particles of a biodegradable polymer to enhance vaccination, preferably using a linear polysaccharide composed of randomly distributed chains of ⁇ - (1-4) D-glucosamine (deacetylated units) and N-acetyl-D-glucosamine (acetylated unit), such as Chitosan.
  • the laying birds are immunized to obtain, through the egg yolk, neutralizing IgY immunoglobulins against infectious agents or toxins, which after an extraction method, slipping and concentration, where they are used minimum quantities, a concentrated formulation of said IgY immunoglobulins capable of achieving unexpected protection of up to approximately 100% is finally obtained, in addition to regularizing the level of S / P in already infected farms.
  • the invention has the additional advantage of stabilizing the herd, flock, flock or banks, reducing the circulation of infectious agents. Also, using the concentrated formulation of origin In addition to the invention as a program, the generation of subpopulations to maternity is reduced and at weaning the seroconversion of fattening animals is delayed.
  • the concentrated formulation of avian origin of the invention comprising concentrated IgY immunoglobulins can be used at any productive stage of the animals without generating adverse or undesirable effects.
  • the concentrated formulation of avian origin of the invention is highly concentrated and protects against higher challenges of the infectious agent or toxins. There is evidence of protection against challenges from 10 to seven (10,000,000), which is far superior to what is already known in the state of the art (WO 2007/061281 A2).
  • neutralizing immunoglobulins can be concentrated against circulating field infectious agents or toxins, so that a concentrate can be formulated where only 1 ml or 3 ml is applied per dose, while the application of vaccines and state-of-the-art products, is up to 5 ml and even more up to 10 ml, and even more than 10 ml (WO 2007/061281 A2).
  • the reduction in the volume of application is beneficial in several aspects. First because the application is made simple, and second because it reduces production costs and third, because transport to different areas takes up less space.
  • the doses of 1 ml or up to 3 ml that can be achieved thanks to the concentrated immunoglobulin (IgY) formulation of the present invention obviously follow an immunization schedule and, even without being a vaccine itself, it can work as such and control infected animals.
  • the concentrated formulation of avian origin of the invention falls within the passive immunity platform, because it contains neutralizing immunoglobulins against infectious agents or toxins.
  • Figure 1 shows the results of titration by MNT of different samples of eggs collected from birds immunized with different vaccines.
  • Group A was vaccinated with 2 vaccines made with mineral oil each containing 3 strains of PRRS virus and applied alternately in a monthly manner.
  • Group B was vaccinated with 1 vaccine made with mineral oil and chitosan, which contains 6 different strains of PRRS virus and was applied monthly.
  • Group C was vaccinated with a vaccine made with marcol and chitosan, which contains 6 different strains of the PRRS virus and was applied monthly.
  • Figure 2 shows the average IgY antibody titer in the yolk using three types of vaccine formulations.
  • Group A was vaccinated with 2 vaccines made with mineral oil each containing 3 strains of PRRS virus and applied alternately in a monthly manner.
  • Group B was vaccinated with 1 vaccine made with mineral oil and chitosan, which contains 6 different strains of PRRS virus and was applied monthly.
  • Group C was vaccinated with a vaccine made with marcol and chitosan, which contains 6 different strains of the PRRS virus and was applied monthly.
  • Figure 3 shows the increase in the immunoglobulin titer after applying the concentration process.
  • Egg yolk immunoglobulins were extracted, one part was quantified by the MNT method and the rest was subjected to the concentration process.
  • Group A was vaccinated with 2 vaccines made with mining oil each containing 3 strains of the PRRS virus and applied alternately in a monthly manner.
  • Group B was vaccinated with 1 vaccine made with mineral oil and chitosan, which contains 6 different strains of PRRS virus and was applied monthly.
  • Group C was vaccinated with a vaccine made with marcol and chitosan, which contains 6 different strains of the PRRS virus and was applied monthly.
  • Figure 4 shows the gradual decrease in antibody levels in the females of the breeding herd after receiving the concentrated formulation.
  • Figure 5 shows the monitoring of mortality from week 3 to 26.
  • the groups that were treated with the formulation of concentrated IgY immunoglobulins of avian origin of the invention are highlighted in a more intense blue box (groups from 07 to 16).
  • Figure 6 presents a graph with the mortality percentages of each group evaluated, which highlights those that were treated with the concentrated formulation of avian origin of the invention.
  • An emulsified vaccine composed of antigens is generated to produce neutralizing antibodies and not only against a strain of a certain infectious agent or toxin, but against several circulating field strains (epidemiological surveillance) or toxins.
  • RNA viruses derived from our research it was observed that not all strains of a circulating virus can be neutralized with antibodies generated from the antigens of a specific strain. The same goes for vaccines against viruses, because when vaccinated with a heterologous strain, the protection is partial.
  • the strains were selected by cross-sectional MNT (microneutralization) tests. This test consists in testing the level of neutralization of immunoglobulins, obtained using a vaccine with defined strains, against new isolates of the infectious agent. In our work in the laboratory, we have determined that if the new isolation presents titres less than 1: 160 in the MNT then that strain is considered as a candidate to be included in a new vaccine.
  • our vaccine has contained some strains that confer a broad neutralization spectrum against the strains of circulating infectious agents in Mexico.
  • the neutralization spectrum of the present invention could also be extended and adapted against other strains of circulating infectious agents in other countries or in other regions.
  • the infectious agent strains can be field isolates obtained from serum or tissue of diseased animals.
  • the basis for selection lies in the cross-microneutralization test between the different strains isolated, with the Ig 's contained in the product and generated from the selected strains.
  • PRRS virus In the case of PRRS virus they can be replicated in the MARC-145 cell line and no more than five are performed Passes of the working seed virus, to avoid attenuation. Selected antigens are inactivated with 0.1% formalin or by another method described in the state of the art. In our laboratory we have determined that the antigen mixture must each have a minimum titre of DI de5o 10 4 / ml.
  • the formulation of the emulsified vaccine to immunize birds also includes antigens of one or more carefully selected strains, a light mineral oil and a particulate adjuvant consisting of particles, micro-particles or nano-particles of a polymer Biodegradable to enhance vaccination, in particular a linear polysaccharide composed of randomly distributed chains of ⁇ - (1-4) D-glucosamine (deacetylated units) and N-acetyl-D-glucosamine (acetylated unit), such as Chitosan, is preferred.
  • a linear polysaccharide composed of randomly distributed chains of ⁇ - (1-4) D-glucosamine (deacetylated units) and N-acetyl-D-glucosamine (acetylated unit), such as Chitosan
  • the water-in-oil type vaccine formulation may contain about 50% to 70% and preferably about 60% to 67% of Marcol, about 20% to 40% and preferably about 28% to 35% of water with virus antigens PRRS; approximately 5% to 15% of each strain of the PRRS virus selected based on the criteria explained above, approximately 2% to 5% of Sorbitan polyoxyethylene monoleate (Tween 80), approximately 2% to 8% of Sorbitan Sorbitan Monooleate ( Span 80) and an adjuvant such as a linear polysaccharide composed of randomly distributed chains of ⁇ - (1-4) D-glucosamine (deacetylated units) and N-acetyl-D-glucosamine (acetylated unit), particularly 4 to 6% of chitosan .
  • each component is added one by one under the system of stirring for 1 to 5 minutes, adding in the end the chitosan.
  • the vaccine is applied to pathogen-free posture birds, with 0.5 ml, once a month, by subcutaneous administration from week 8 to age 60, to finally obtain a neutralizing immunoglobulin (IgY) formulation of field infectious agents or toxins from egg yolk.
  • IgY neutralizing immunoglobulin
  • the level of antibodies for each of the infectious agent strains is evaluated by micrononeutralization (MNT) of the egg yolk samples collected from the vaccinated flock.
  • MNT micrononeutralization
  • the eggs of the immunized birds are harvested and they are subjected to a process of extraction, delipulation and concentration of immunoglobulins from the egg yolk.
  • the following steps are performed to perform the extraction and concentration of neutralizing IgY immunoglobulins of infectious agents or toxins from egg yolk.
  • the egg yolk is diluted 1: 4 or 1: 8 (without the white) with 0.01% sodium azide and stored in refrigeration at least throughout the day, preferably 12 to 24 hours. Subsequently, the supernatant is separated and 1 to 15% hydroxypropylmethylcellulose phthalate (HPMCP) is added in a proportion of 0.25 ml per 100 ml of yolk. Let stand for at least 24 hours The lipid layer that forms on top of the solution is separated and the aqueous part is filtered, then PEG, preferably 8000, is added in a proportion of 5-30% P / V, mixed and allowed to stand. at least for 4 hours, but preferably it is left overnight at 4 ° C. It is then centrifuged for 20 to 30 minutes and the supernatant is removed. The resulting tablet is solubilized with PBS IX or TRIS buffer, at a volume equivalent to 10% of the original volume.
  • PBS IX or TRIS buffer at a volume equivalent to 10% of the original volume.
  • a biodegradable polymer such as a linear polysaccharide composed
  • the treatment dose of the concentrated formulation of the The invention can be 1 ml and a maximum of 3 ml, which manages to neutralize the field varieties of the infectious agents or toxins of the invention, unexpectedly offering protection of up to 100% in animals, in addition to regularizing the level of S / P on already infected farms, as shown below.
  • the present invention relates to an emulsified vaccine formulation
  • an emulsified vaccine formulation comprising antigens, a light mineral oil, preferably Marcol and a particulate adjuvant consisting of particles, micro-particles or nano-particles of a biodegradable polymer, such as for example the linear polysaccharide composed of randomly distributed chains of ⁇ - (1-4) D-glucosamine (deacetylated units) and N-acetyl-D-glucosamine (acetylated unit), preferably Chitosan.
  • the vaccine formulation of the present invention comprises one or more emulsifiers, such as Sorbitan polyoxyethylene monoleate (Tween 80), Sorbitan Sorbitan Monooleate (Span 80), or a mixture thereof.
  • the antigens may come from one or several different strains of one or more infectious agents or toxins, such as viruses, batteries or protozoa, more particularly PRRS virus, PED virus, White spot Syndrome Baculovirus Complex virus, of Rotav ⁇ rus spp. or Coronav ⁇ rus spp. , and more particularly of PRRS viruses that have a nucleotide sequence of the ORF5 gene selected from the group consisting of SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6 and SEQ. ID. NO: 7, and also of the Diarrhea virus Swine epidemic (DEP).
  • infectious agents or toxins such as viruses, batteries or protozoa
  • PRRS virus PED virus, White spot Syndrome Baculovirus Complex virus, of Rotav ⁇ rus spp. or Coronav ⁇ rus spp.
  • PRRS viruses that have a nucleotide sequence of the ORF5
  • the antigens can also come from one or several bacteria, such as Salmonella spp., From those selected from the group consisting of: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalact ⁇ ae, Escher ⁇ ch ⁇ a col ⁇ , Corynebacter ⁇ um pyogenes and Mycoplasma bov ⁇ s, or also of Act ⁇ nobac ⁇ onia e pleuropneon ⁇ a.
  • Salmonella spp. from those selected from the group consisting of: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalact ⁇ ae, Escher ⁇ ch ⁇ a col ⁇ , Corynebacter ⁇ um pyogenes and Mycoplasma bov ⁇ s, or also of Act ⁇ nobac ⁇ onia e pleuropneon ⁇ a.
  • the antigens can also come from one or several protozoa selected from the group consisting of: E ⁇ mer ⁇ a tenella, E ⁇ mer ⁇ a acervul ⁇ na and E ⁇ mer ⁇ a maxim, or from toxins produced by fungi, such as trichothecenes and more particularly from 4-deoxynivalenol (DON).
  • the antigens can come from one or several different strains of one or several viruses, one or several bacteria or one or several protozoa, such as for example antigens that come from Escher ⁇ ch ⁇ a col ⁇ , Salmonella spp., Clostr ⁇ d ⁇ um perfr ⁇ ngens, Rotav ⁇ rus spp. . and Coronav ⁇ rus spp.
  • the antigens can also come from the group consisting of Escher ⁇ ch ⁇ a col ⁇ , Rotav ⁇ rus spp. and Coronav ⁇ rus spp.
  • the emulsified vaccine formulation of the invention may contain viral strains selected for having a serological titer of less than 1: 160, evaluated by cross microneutralization using a pool of immunoglobulins obtained with the current vaccine.
  • the emulsified vaccine formulation of the invention may contain a mixture of antigens with titers greater than DIE5 or 10 4 / ml.
  • the present invention also relates to the use of the emulsified vaccine formulation in the preparation of a concentrated IgY immunoglobulin composition useful for the treatment of Respiratory Syndrome and Reproductive (PRRS) in pigs, the treatment of Porcine Epidemic Diarrhea (DEP) in pigs, the treatment of white spot syndrome in shrimp, the treatment of bovine mastitis, the treatment of infections caused by Actinnobac ⁇ llus pleuropneumoniae in pigs, the treatment of coccidiosis in birds, the treatment of intoxications caused by trichothecenes, particularly where trichothecene is 4-deoxynivalenol (DON), respectively, where the emulsified vaccine formulation is administered subcutaneously to laying birds.
  • PRRS Respiratory Syndrome and Reproductive
  • PDP Porcine Epidemic Diarrhea
  • DON 4-deoxynivalenol
  • the present invention relates to a process for the extraction and concentration of immunoglobulins from egg yolks from previously hyperimmunized hens with the vaccine formulation of the present invention, characterized by the following steps:
  • the yolk is diluted 1: 4 or 1: 8 (without the white) with 0.01% sodium azide and stored in refrigeration for at least 24 hours.
  • HPMCP hydroxypropylmethylcellulose phthalate
  • PEG preferably PEG 8000 in a proportion of 5-30% P / V, is added, mixed and allowed to stand for at least 4 to 12 hours at 4 ° C.
  • the present invention is directed to a concentrated formulation of IgY immunoglobulins of avian origin obtained by the process for extraction, ellippization and concentration of immunoglobulins from egg yolk from hens previously hyperimmunized with the emulsified vaccine of the invention.
  • Said concentrated formulations of avian origin of the invention may further comprise approximately 70% to 85% water and / or approximately 0.001% to 0.03% preservatives.
  • the IgY immunoglobulin concentrated formulation is characterized in that it comprises 0.8% to 5% of neutralizing concentrated IgY immunoglobulins of the virus that causes PRRS.
  • the present invention also relates to the use of the concentrated formulation of IgY immunoglobulins of avian origin of the invention in the preparation of a medicament for the treatment of Respiratory and Reproductive Syndrome (PRRS) in pigs, Porcine Epidemic Diarrhea (PED) in pigs, white spot syndrome in shrimp, bovine mastitis, Actinobacillus pleuropneumoniae infections in pigs, coccidiosis in birds, and trichothecene poisonings, particularly those caused by trichothecenes such as 4- Deoxinivalenol (DON), where the medication can be administrated by the parenteral route of administration, preferably by the intramuscular route or is administrable orally and with food, as the case may be.
  • the following examples show the results of the application of the concentrated formulation of the invention in pigs. However, such examples are provided for the purpose of illustration and not limitation.
  • Two vaccines were made that contained three strains each of the PRRS virus, using a formulation without marcol and without chitosan. These vaccines were applied to the birds on a monthly and alternate basis; that is, one month was administered one and the next the other and so on.
  • the eggs of the immunized birds were harvested and subjected to an immunoglobulin extraction process from the egg yolk, as described above.
  • Figure 1 shows the results of this experiment (group A), in which the low yield of PRY virus neutralizing IgY immunoglobulins of the previously obtained formulation can be seen, which is unable to carry out an efficient treatment in pigs suffering from Respiratory and Reproductive Syndrome, as it is necessary to use volumes greater than 5 mL and that protects titers of 10 4 .
  • this experiment proved to be complicated and problematic because of the management of two vaccines.
  • a vaccine was prepared containing six different strains of the PRRS virus, using a formulation without marcol and with chitosan, which was administered to the birds through a monthly immunization schedule.
  • the eggs of the immunized birds were harvested and subjected to an immunoglobulin extraction process from the egg yolk, as described above.
  • a vaccine was formulated again, but now using Marcol as a light mineral oil and chitosan as a particulate adjuvant. This time, 6 PRRS virus strains antigens were included in a single vaccine.
  • the eggs of the immunized birds were harvested and subjected to an immunoglobulin extraction process from the egg yolk, as described above.
  • the finished immunoglobulin product was analyzed. Posture birds were immunized, the eggs of the immunized birds were harvested and the egg yolks were subjected to a process of extraction and concentration of immunoglobulins, as described above.
  • the vaccines with which the flocks were immunized were the same as those presented in examples 1 to 3, but in this case, the lot size was increased to 10,000 eggs per flock.
  • immunoglobulins (IgY type) in females of the reproductive herd.
  • the presence of antibodies against the PRRS virus was monitored longitudinally by evaluating sera from 30 randomly selected sows from a full-cycle farm with 500 sows, located in the western part of the Mexican Republic. This farm produces piglets negative to the PRRS virus, which are contaminated throughout the productive life.
  • the breeding herd was treated with a 1 ml application of the concentrated IgY immunoglobulin formulation of avian origin of the invention, intramuscularly every 4 months and repeated 15 days later. Subsequently, weekly applications were made at 70 and 85 days gestation.
  • the bristle foot sows were monitored bimonthly to determine viral movement. Blood samples were taken from the same 30 initially selected animals.
  • the ELISA technique (IDEXX, PRRS X3) was used, which is an indirect way to measure the effectiveness of treatment with concentrated IgY.
  • the kit measures the levels of IgG type antibodies generated by the pig in response to a viremia. Therefore, if the pig is infected it will produce antibodies of the IgG type in response and S / P values will be obtained above the cut-off point, but if there is no viremia the kit will yield S / P values lower than the cut-off point.
  • the cut-off point of the ELISA was 0. S / P.
  • Figure 4 shows that the treatment applied to the herd gradually reduces antibody levels as bimonthly monitoring is carried out and therefore it is demonstrated that the PRRS virus was neutralized by the applied immunoglobulins (of the IgY type), limiting the infection in this way. It is important to note that surprisingly our product neutralized the virus in such a way that after 6 months there was no longer a reinfection of the PRRS virus. The same is proven because there was a substantial difference in the productive parameters of negative and positive farms.
  • immunoglobulins IgY
  • a treatment with the concentrated formulation of avian origin of the invention was applied.
  • a dose of 3 mL was applied intramuscularly.
  • clinical data were observed and the amount of circulating virus in the pigs was also quantified.
  • concentrated IgY immunoglobulins reduces piglet mortality
  • the formulation of concentrated IgY immunoglobulins of avian origin of the invention was applied to weaned pigs and intended for fattening. Throughout the production time, mortality was recorded under different treatment systems.
  • the farm under study is located in the central western region of the Mexican Republic and with 1100 sows in its breeding herd and a weekly production of 500 piglets.
  • the farm has a history of endemic PRRS infection, even though several control strategies have been implemented.
  • the application of the modified live virus vaccine against PRRS every 3 months is included in the brood.
  • Figure 5 shows the monitoring of mortality from week 3 to 26.
  • the groups that were treated with the formulation of concentrated IgY immunoglobulins of avian origin of the invention are highlighted in a more intense blue box (groups from 07 to 16).
  • the average mortality percentage of the untreated groups was the highest (25.06%), then the groups that received the conventional treatment (21.2% on average) were located and the best treatment was that of the concentrated IgY immunoglobulin formulation of avian origin of our invention, where an average mortality percentage of 10.27% was obtained. That is, with the use of IgY immunoglobulins, a survival of almost 90% of the treated animals is achieved. It represents 10% more than what was achieved by the vaccination method.
  • Figure 6 shows a graph of the cumulative mortality percentages of each group evaluated, which highlights those that were treated with the concentrated formulation of avian origin of the invention.

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Abstract

La presente invención se relaciona con una terapia para el tratamiento o prevención de diversas enfermedades en animales, con base en la administración de una formulación de inmunoglobulinas altamente concentradas de origen aviar, obtenida de la yema de huevo proveniente de gallinas hiperinmunizadas previamente con una formulación de vacuna que comprende antígenos de agentes infecciosos o toxinas, un aceite mineral ligero y un adyuvante particulado.

Description

VACUNA EMULSIONADA PARA OBTENER FORMULACIONES DE INMUNOGLOBULINAS IgY CONCENTRADAS; PROCESOS Y USOS DE LAS
MISMAS .
CAMPO TECNICO DE LA INVENCION
La presente invención se relaciona con el campo de la medicina veterinaria, en particular con el tratamiento de enfermedades en animales, y más específicamente con la prevención o tratamiento del Síndrome Respiratorio y Reproductivo o PRRS (por las siglas del Inglés, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) en los porcinos, la Diarrea Epidémica Porcina (DEP) , el síndrome de la mancha blanca en camarón, mastitis bovina, las infecciones producidas por Actínobacíllus pleuropneumoníae en porcinos, las coccidiosis en aves y las intoxicaciones producidas por toxinas de los hongos, mediante la administración de una formulación de inmunoglobulinas concentrada de origen aviar, obtenida de yema de huevo proveniente de gallinas previamente hiperinmunizadas con una formulación de vacuna emulsionada que comprende antígenos, un aceite mineral ligero y un adyuvante particulado que consiste en partículas de un polímero biodegradable.
ANTECEDENTES
La sanidad de los animales es la clave principal para obtener alimentos sanos y de calidad. Es por ello que el control de las enfermedades y el empleo de todas las herramientas disponibles para ello resulta ser de suma importancia. La vacunación es una herramienta más de las muchas que se emplean diariamente en las granjas, existiendo otras como medidas de bioseguridad para evitar la entrada de patógenos provenientes de otras explotaciones, la aplicación de pautas de higiene y el manejo de los animales para reducir la diseminación de enfermedades entre los animales de la misma explotación, control estricto de la alimentación, o la creación de un ambiente confortable para los animales de la granja.
No obstante a la fecha existen enfermedades que no ha sido posible controlar de manera adecuada. Dentro de estas enfermedades se encuentran las producidas por los virus, tal como la ocasionada por el virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo del Cerdo, que es una enfermedad severa en los porcinos, la cual fue reportada en los Estados Unidos en 1987 y posteriormente se identificó en muchos otros países europeos. En 1991, en Holanda se reportó el aislamiento del agente etiológico llamándole virus Lelystad y debido a la sintomatología que presentaban los cerdos se le conocía como Síndrome Respiratorio y/o Aborto Epidémico del Cerdo.
Otra enfermedad viral que no ha sido posible controlar es la Diarrea Epidémica Porcina (PED), la cual es una enfermedad viral exclusiva de los porcinos, muy contagiosa y en la mayoría de las veces ocasiona la muerte. Esta enfermedad afecta el sistema digestivo y los lechones mueren en un periodo de 3 -5 días a causa de la diarrea y deshidratación .
Otra enfermedad más es la ocasionada por el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) , principal patógeno del camarón y responsable de grandes pérdidas de producción y ganancias en esta industria a nivel mundial. Hasta ahora no existe ningún tratamiento efectivo para controlar la infección. El tratamiento de las enfermedades causadas por coronavírus y rotavírus bovino también resulta de interés .
Por otra parte encontramos las enfermedades ocasionadas por bacterias, tal como la mastitis bovina que produce una inflamación de la glándula mamaria y sus tejidos secretores, reduciendo la producción del volumen de leche y alterando su composición, e incluso su sabor, además de elevar su carga bacteriana normal. De acuerdo con su duración, se puede clasificar en aguda o crónica. En relación a sus manifestaciones clínicas, puede ser clínica o subclínica. Esta enfermedad provoca graves pérdidas económicas a la industria lechera.
También encontramos las enfermedades provocadas por el Actínobacíllus pleuropneumoníae, bacteria responsable de problemas respiratorios en porcinos con distribución mundial, conociéndose desde hace 50 años, y teniendo una elevada incidencia desde los años 80, siendo frecuente en unidades de engorde. Responsable primario de la Pleuroneumonía porcina, así como agente involucrado directamente dentro del Complejo Respiratorio Porcino. Es una enfermedad de elevada diseminación, altamente contagiosa y en muchas ocasiones letal en porcinos desde el destete al sacrificio. Provoca en el 30-50% de los porcinos una pleuritis fibrinosa con adherencias costales bastante características y elevada mortalidad en cuadros agudos, con elevado retraso del crecimiento en las formas crónicas. Además se ha encontrado que el Actínobacíllus pleuropneumoníae está involucrado en cuadros de otitis media, artritis y osteomielitis.
El tratamiento de las enfermedades causadas por E. colí, Salmonella spp. y Clostrídíum perfríngens también es de interés para la salud de los animales . Por otra parte, tenemos la coccidiosis que es una enfermedad infecciosa producida por parásitos de vida intracelular estricta de los géneros Eímería spp. e Isospora spp. Las coccidias son omnipresentes pues existen en la mayoría de las instalaciones pecuarias alrededor del mundo. Estos parásitos pueden infectar a una gran variedad de animales incluyendo humanos, aves, rumiantes, cerdos, perros, gatos y otros animales domésticos, sin embargo, en la mayoría de los casos las coccidias son especies específicas.
Adicionalmente otro problema de salud que enfrenta la industria pecuaria son las ocasionadas por tricotecenos , toxinas producidas por varios hongos Fusarium, particularmente Fusaríum gramínearum y Fusaríum sporotrichioid.es . Se producen en cosechas y entran al alimento a través de ingredientes contaminados. Los Tricotecenos son irritantes tisulares comprobados y su ingesta se asocia principalmente con lesiones orales, dermatitis e irritación intestinal. La principal respuesta fisiológica a estas micotoxinas es la pérdida del apetito. Los tricotecenos son micotoxinas supresoras fuertes que afectan la respuesta celular inmune con un impacto directo sobre la médula, el bazo, los tejidos linfoides, el timo y la mucosa intestinal, en donde se lesionan las células que se dividen activamente.
Para el control preventivo de todas estas enfermedades, existen básicamente dos formas de protección. Se les puede exponer a antígenos derivados de un agente infeccioso para estimular una reacción inmunitaria protectora o bien se les puede administrar un anticuerpo preformado que se haya obtenido de algún sujeto inmune. La primera forma de protección se logra por medio de vacunas que pueden ser de diferentes clases: microorganismos vivos, liofilizados , o muertos en emulsiones oleosas, y recientemente la creación de vacunas clonadas y recombinantes . Cada una de ellas presenta ventajas y desventajas en cuanto a protección, respuesta inmune y duración de la protección. Sin embargo, se ha encontrado que en algunos casos se presentan lesiones indeseadas en el huésped a causa del virus vacunal {Tizará, I.R. 1998. Vacunación y vacunas In: Inmunología Veterinaria. 5a Ed. Me. Graw-Hill. Pp.285-305) .
La segunda forma de protección también llamada inmunidad pasiva involucra la transmisión de anticuerpos específicos contra agentes infecciosos a un huésped.
Tradicionalmente, a nivel de investigación, los anticuerpos son elaborados principalmente en mamíferos y en menor frecuencia en aves. Los tipos de anticuerpos que regularmente se elaboran en mamíferos son monoclonales y policlonales , y policlonales en aves {Larsson, et al 1993. Chicken antibodies : taking advantage of evolution . A review Poultry Sci.72: 1807-1812) .
En el caso de las aves, la especie Gallus gallus domesticus (gallos y gallinas) es la única especie de la cual se obtienen anticuerpos en forma más accesible y de manera altamente definida. El principal anticuerpo sérico presente en dicha especie es la lgG aunque la lgG es transportada al huevo de una manera similar a la transferencia de la lgG de mamíferos a través de la placenta.
En el huevo, la inmunoglobulina Y (IgY) se encuentra en mayor concentración en la yema, no obstante también se encuentran pequeñas cantidades de IgY en la clara. Incluso se ha encontrado que las cantidades de IgY son mayores en la yema que en el suero de la gallina {Larsson , et al 1993. Chicken antibodies : taking advantage of evolutíon. A revíew Poultry Sel.12: 1807- 1812) .
Para tener una noción de la cantidad de anticuerpos que elaboran las gallinas, basta señalar que una ponedora produce aproximadamente de 5 a 6 huevos por semana con un volumen de yema de aproximadamente de 15 mi, por lo tanto, en una semana una gallina puede llegar a producir anticuerpos en yema equivalente a 90 a 100 mi de suero o 180 a 200 mi de sangre completa. Esto al compararse contra los 20 mi de sangre completa que otorga un conejo inmunizado por semana permite apreciar claramente la eficiente productividad de los anticuerpos en yema de huevo. Obviamente si se utilizan animales más grandes como caballos o vacas, la cantidad de suero y de anticuerpos seria mayor que en el huevo, pero además de que el procedimiento es costoso también es más doloroso para los animales.
Entre las ventajas de los anticuerpos de yema de huevo de gallina se encuentran:
1. No fijan el complemento.
2. No se unen a la Proteina A de Staphílococcus aureus.
3. No reacciona con el Factor Reumatoide.
. Debido a su diferencia filogenética con los anticuerpos de mamíferos, la IgY no muestra reacción cruzada con los anticuerpos de mamíferos.
5. Bajo costo de obtención.
En años recientes se han empleado los anticuerpos de yema de huevo ( inmunoglobulinas ) como herramientas de diagnóstico y terapia (Schmidt, et al. 1989) . Es así que aprovechando su diferencia filogenética con las inmunoglobulinas de mamíferos, las Ig's han presentado varias ventajas cuando se han usado en inmunodiagnóstico . Por ejemplo, las Ig's de yema se han empleado para detectar varios virus mediante las técnicas de ELISA, inmunodifusión, inmunofluorescencia y fijación de complemento. Dado su bajo punto isoeléctrico comparado con la Ig de humanos, se ha empleado en ensayos de electroforesis para la cuantificación de inmunoglobulinas en suero de varios animales {Altschuh, D. et al. 1984. Determínatíon of IgG and IgM levéis in serum by Rocket Immunoelectrophoresís usíng yolk antibodies from ímmunízed chickens. J. Immunolog. Methods . 69:1-7; Larsson, A. et al. 1988. Chícken antibodies: a tool to avoid false positive results by rheumatoid factor in látex fixation tests. J. Immunol . Methods. 108:205-208; Larsson, A. et al. 1992. Chícken antibodies: a tool to avoid interference by complement activation in ELISA. J. Immunol. Methods. 156: 79-83.; Larsson, et al 1993. Chícken antibodies : taking advantage of evolution . A review Poultry Sci.72: 1807-1812; Schader R. et al 1996. The production of avian (Egg yolk) antibodies : IgY. Atla.24: 925-934) .
En cuanto a su aplicación terapéutica, las IgY se han empleado como inmunoterapia en diferentes campos de la ciencia como por ejemplo la administración de inmunoglobulinas de yema de huevo por vía oral ha prevenido infecciones por rotavirus en ratones, bovinos, y porcinos entre otros {Ikemori, Y. et al. 1992. Protection of neonatal calves against fatal enteric colibacillosis by administration of egg yolk powder from hens ímmunízed wíth K99-píllated enterotoxígeníc Escherichia coli . Am. J.Vet. Res .53 : 2005-2008 ; Kuroki r M. et al 1994. Passive protection against bovine rotavirus in calves by specific immunoglobulins from chicken egg yolk. Arch. Virol. 138: 143-148; Marquart, R. 1998. Antibody-loaded eggs for piglets : prevention of baby pigs from diarrhea . Proc. 2nd International Symposium on Egg Nutrition and Newly Emerging Ovo-Technologies . Alberta , Canadá) .
Incluso las inmunoglobulinas IgY de yema de huevo se han empleado como antivenenos contra víboras y escorpiones los cuales se pueden inyectar para neutralizar las toxinas sin riesgo de las reacciones anafilácticas comunes encontradas con los antivenenos elaborados en caballo {Larsson , et al 1993. Chícken antibodies : taking advantage of evolutíon . A revíew Poultry Scí.72: 1807-1812) . Una aplicación más ha sido para prevenir la caries en humanos provocada por Streptococcus mutans {Hatta, H. et al. 1997. Passive immunization Against Dental Plaque Formation in Humans : Effect of a Mouth Rinse containing Egg Yolk Antibodies (IgY) Specific to Streptococcus mutans.
Caries. Res.31: 268-274) .
En el caso de las enfermedades en animales antes mencionadas, a lo largo del tiempo se han desarrollado numerosas medidas de control y prevención debido a la extensión y repercusión económica de dichas enfermedades . Entre las estrategias para combatirlas se encuentran las vacunas inactivadas y las vacunas a virus vivo . Sin embargo, ninguna de estas estrategias ha sido 100% eficaz .
En el caso específico de los virus de RNA como el virus del PRRS o el virus de PED la falta de control se debe en gran parte a su alto índice de mutación. Esta es una característica en común entre los virus de RNA a consecuencia de la falta de actividad de proofreading de la RNA polimerasa. Entonces, esta falla junto con la rápida cinética de replicación del virus incrementan el riego de mutación y surgimiento de cuasiespecies (Manreetpal Singh Brar, Mang Shi, Raymond Kin-Hi Hui and Frederick Chi-Ching (2014) Leung mail Genomic Evolution of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Isolates Revealed by Deep Sequencing. PLOS one) . Se ha reportado que la variación genética del virus de PRRS es entre 0.48 y 1.32 % (Murtaugh M. , (2012) Use and interpretation of sequencing inf PRRSV control programs . Alien D. Leman Swaine Conference . Veterinary Continuing Education) . Estas características del virus de PRRS explican la inadecuada protección que se ha obtenido por vacunas .
Una de las estrategias que se ha utilizado para prevenir las enfermedades ocasionadas por estos virus son las autovacunas, lo cual implica desarrollar vacunas no sólo por país, sino por regiones, de lo contrario la prevención por estos medios resulta ser insuficiente.
También se ha observado que en el caso del virus causante del PRRS se logra neutralizar utilizando inmunoglobulinas provenientes del suero de mamífero (US 5,846,805). Estos resultados enseñan que las inmunoglobulinas son una alternativa para el tratamiento de virus de RNA. Sin embargo, el problema con esta alternativa es que los anticuerpos obtenidos de esta manera son inviables.
La aplicación de inmunoglobulinas obtenidas a partir de la yema de huevo (IgY) ya ha sido utilizada en diversas aplicaciones en salud y profilaxis animal e incluso en humanos . Las investigaciones realizadas por Akita y Nakai (Akita, E., Nakai , S. (2000). Egg nutrition and biotechnology, CAB International, New York, p.301), demuestran que la función protectora de IgY contra agentes infecciosos es atribuida principalmente por su capacidad para prevenir la colonización o neutralizar las toxinas .
Por lo anterior, un objetivo de la presente invención se refiere a la obtención de formulaciones de inmunoglobulinas IgY concentrada de origen aviar, efectivas y seguras contra diversos agentes que infectan a los animales, incluyendo por ejemplo el virus PRRS, el virus de la Diarrea Epidémica Porcina (DEP) , el virus Whíte Spot Syndrome Baculovírus Complex, las bacterias que provocan la mastitis bovina, el Actínobacíllus pleuropneumoníae y las coccidiosis, asi también como las intoxicaciones provocadas por tricotecenos , debido a que su factibilidad podría incidir directamente hacia una disminución importante en los gastos asociados a procesos de vacunación y de manera más importante aún, disminuirían fuertemente las pérdidas productivas asociadas a dichas enfermedades .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Con el fin de alcanzar el objetivo de la presente invención, se evaluó experimentalmente la capacidad de una formulación que comprende inmunoglobulinas IgY concentradas y específicas para neutralizar al virus de PRRS, obtenida a partir de yema de huevo proveniente de gallinas previamente hiperinmunizadas con una formulación de vacuna emulsionada que comprende antígenos provenientes de una o varias cepas del virus del PRRS, aceite mineral ligero y un adyuvante particulado que consiste en partículas, micro-particular o nano- partículas de un polímero biodegradable .
Los inventores de la presente solicitud han logrado exitosamente el objetivo de la presente invención y han encontrado sorprendentemente que con antígenos de una o más cepas diferentes del virus del PRRS, cuidadosamente seleccionadas, se puede generar la esperada protección cruzada contra otras cepas del mismo virus e inducir la generación de inmunoglobulinas capaces de neutralizar un mayor número de virus de PRRS circulantes en el campo . La formulación de vacuna emulsionada, además debe incluir un aceite mineral ligero, como por ejemplo Marcol y un adyuvante particulado que consiste en partículas, micro- partículas o nano-partículas de un polímero biodegradable para potenciar la vacunación, preferentemente empleando un polisacárido lineal compuesto de cadenas distribuidas aleatoriamente de β-(1-4) D-glucosamina (unidades deacetiladas ) y N-acetil-D-glucosamina (unidad acetilatada) , tal como Chitosan.
Con una formulación de vacuna emulsionada así preparada se inmuniza a las aves de postura para obtener, a través de la yema de huevo, inmunoglobulinas IgY neutralizantes contra agentes infecciosos o toxinas, las cuales tras un método de extracción, deslipidización y concentración, donde se utilizan cantidades mínimas, se obtiene finalmente una formulación concentrada de dichas inmunoglobulinas IgY capaces de lograr una protección inesperada de hasta aproximadamente el 100%, además de regularizar el nivel de S/P en granjas ya infectadas.
La invención presenta la ventaja adicional de estabilizar a la piara, parvada, rebaño o bancos, reduciendo la circulación de los agentes infecciosos. Así también, usando la formulación concentrada de origen aviar de la invención como programa, se reduce la generación de subpoblaciones a la maternidad y al destete se logra retrasar la seroconversión de los animales de engorda .
A la fecha las inmunoglobulinas evaluadas han provenido de suero de mamífero y solamente han sido probadas por ejemplo en un modelo experimental desafiando con la misma cepa del virus con el que se vacunaron. Es decir, a diferencia de la presente invención, a las vacunas del estado de la técnica se les ha probado únicamente la protección homologa (WO 02/067985) .
Además, la formulación concentrada de origen aviar de la invención, que comprende inmunoglobulinas IgY concentradas puede utilizarse en cualquier etapa productiva de los animales sin generar efectos adversos o indeseables .
La formulación concentrada de origen aviar de la invención se encuentra altamente concentrada y protege contra desafíos más altos del agente infeccioso o toxinas . Se cuenta con evidencias de protección contra desafíos de 10 a la siete (10,000,000), lo cual resulta muy superior a lo ya conocido en el estado de la técnica (WO 2007/061281 A2 ) .
Adicionalmente a lo anterior, mediante los procesos de la presente invención se logra concentrar las inmunoglobulinas (IgY) neutralizantes contra los agentes infecciosos circulantes de campo o toxinas, de tal manera que se puede formular un concentrado donde se aplica únicamente 1 mi ó 3 mi por dosis, mientras que la aplicación de las vacunas y productos del estado de la técnica, es hasta de 5 mi y más aún hasta 10 mi, e incluso más de 10 mi (WO 2007/061281 A2 ) . La reducción en el volumen de aplicación es beneficiosa en varios aspectos. Primero porque la aplicación se hace sencilla, y segundo porque se reduce costos de producción y tercero, porque el transporte a diferentes áreas ocupa menor espacio.
Las dosis de 1 mi o hasta 3 mi que se pueden lograr gracias a la formulación concentrada de inmunoglobulinas (IgY) de la presente invención, según la gravedad, obviamente, siguen un esquema de inmunización y, aún sin ser propiamente una vacuna, puede funcionar como tal y controlar los animales infectados. La formulación concentrada de origen aviar de la invención entra dentro de la plataforma de inmunidad pasiva, porque contiene inmunoglobulinas neutralizantes contra agentes infecciosos o toxinas .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra los resultados de titulación por MNT de diferentes muestras de huevo colectado de aves inmunizadas con vacunas diferentes. El grupo A fue vacunado con 2 vacunas elaboradas con aceite mineral cada una de ellas conteniendo 3 cepas del virus de PRRS y aplicadas de maneara alternativa mensualmente. El grupo B fue vacunado con 1 vacuna elaborada con aceite mineral y chitosan, la cual contiene 6 cepas diferentes del virus de PRRS y fue aplicada mensualmente. El grupo C fue vacunado con una vacuna elaborada con marcol y chitosan, la cual contiene 6 cepas diferentes del virus de PRRS y fue aplicada mensualmente. Estos resultados indican que los títulos de anticuerpos IgY producidos por la vacuna que contuvo seis cepas del virus PRRS, utilizando una formulación con marcol y chitosan resulta ser la que induce mayor cantidad de anticuerpos contra el Síndrome Respiratorio y Reproductivo del cerdo.
La Figura 2 muestra el promedio del título de anticuerpos IgY en la yema utilizando tres tipos de formulaciones de vacuna. El grupo A fue vacunado con 2 vacunas elaboradas con aceite mineral cada una de ellas conteniendo 3 cepas del virus de PRRS y aplicadas de maneara alternativa mensualmente. El grupo B fue vacunado con 1 vacuna elaborada con aceite mineral y chitosan, la cual contiene 6 cepas diferentes del virus de PRRS y fue aplicada mensualmente. El grupo C fue vacunado con una vacuna elaborada con marcol y chitosan, la cual contiene 6 cepas diferentes del virus de PRRS y fue aplicada mensualmente .
La Figura 3 muestra el incremento en el título de inmunoglobulinas después de aplicar el proceso de concentración. Se extrajeron inmunoglobulinas de yema, una parte se cuantificó por el método de MNT y el resto se sometió al proceso de concentración. El grupo A fue vacunado con 2 vacunas elaboradas con aceite minera cada una de ellas conteniendo 3 cepas del virus de PRRS y aplicadas de maneara alternativa mensualmente. El grupo B fue vacunado con 1 vacuna elaborada con aceite mineral y chitosan, la cual contiene 6 cepas diferentes del virus de PRRS y fue aplicada mensualmente. El grupo C fue vacunado con una vacuna elaborada con marcol y chitosan, la cual contiene 6 cepas diferentes del virus de PRRS y fue aplicada mensualmente. La Figura 4 muestra la disminución paulatina de los niveles de anticuerpos en las hembras del hato reproductor tras recibir la formulación concentrada.
En la figura 5 se muestra el monitoreo de la mortalidad a partir de la semana 3 y hasta la 26. Los grupos que fueron tratados con la formulación de inmunoglobulinas IgY concentrada de origen aviar de la invención se resaltan en un cuadro azul más intenso (grupos del 07 al 16) .
La Figura 6 presenta una gráfica con los porcentajes de mortalidad de cada grupo evaluado, en donde se destacan aquéllos que fueron tratados con la formulación concentrada de origen aviar de la invención.
DESCRIPCION DETALLADA
Inmunización de aves de postura para obtener inmunoglobulinas (IgY) neutralizantes contra agentes infecciosos o toxinas .
Se genera una vacuna emulsionada compuesta de antigenos para producir anticuerpos neutralizantes y no sólo contra una cepa de un determinado agente infeccioso o toxina, sino contra varias cepas circulantes de campo (vigilancia epidemiológica) o toxinas.
Lo anterior es muy importante para el caso de los virus de RNA, porque derivado de nuestra investigación se observó que no todas las cepas de un virus circulante pueden ser neutralizadas con anticuerpos generados a partir de los antigenos de una cepa en especifico. Lo mismo sucede con las vacunas contra virus, pues cuando se vacuna con una cepa heteróloga, la protección es parcial. En el caso de los microorganismos, se seleccionaron las cepas mediante pruebas de MNT (microneutralización) cruzada. Esta prueba consiste en probar el nivel de neutralización de las inmunoglobulinas , obtenidas utilizando una vacuna con cepas definidas, contra los nuevos aislamientos del agente infeccioso. En nuestro trabajo en el laboratorio, hemos determinado que si el nuevo aislamiento presenta títulos menores a 1:160 en la MNT entonces se considera a esa cepa como candidata para incluirse en una nueva vacuna. Por lo tanto, a la fecha nuestra vacuna ha contenido algunas cepas que confieren un espectro de neutralización amplio contra las cepas de los agentes infecciosos circulantes en México. Sin embargo, esto no limita a la invención y no debe entenderse que la invención se refiere a una vacuna que únicamente incluye las cepas seleccionadas, porque las cepas del agente infeccioso podrán ir variando conforme se vaya monitoreando la circulación en campo de cepas nuevas, las cuales pueden incluirse posteriormente en la vacuna para mantener la protección en los animales. También podría ampliarse el espectro de neutralización de la presente invención y adecuarse contra otras cepas de agentes infecciosos circulantes en otros países o en otras regiones .
Las cepas del agente infeccioso pueden ser aislamientos de campo obtenidos a partir de suero o tejido de animales enfermos. La base para la selección, como mencionamos, radica en la prueba de microneutralización cruzada entre las diferentes cepas aisladas, con los Ig' s contenidos en el producto y generados a partir de las cepas seleccionadas.
En el caso del virus de PRRS se pueden replicar en la línea celular MARC-145 y no se realizan más de cinco pases del virus de la semilla de trabajo, para evitar la atenuación. Los antigenos seleccionados se inactivan con formol al 0.1% o por otro método descrito en el estado de la técnica. En nuestro laboratorio hemos determinado que la mezcla de los antigenos debe tener cada uno un titulo mínimo de DI∑5o 104/ml.
Considerando lo anterior, la formulación de la vacuna emulsionada para inmunizar a las aves comprende además de antígenos de una o varias cepas cuidadosamente seleccionadas, un aceite mineral ligero y un adyuvante particulado que consiste en partículas, micro-partículas o nano-partículas de un polímero biodegradable para potenciar la vacunación, en particular se prefiere un polisacárido lineal compuesto de cadenas distribuidas aleatoriamente de β-(1-4) D-glucosamina (unidades deacetiladas ) y N-acetil-D-glucosamina (unidad acetilatada) , tal como Chitosan.
La formulación de la vacuna de tipo agua en aceite, puede contener aproximadamente 50% a 70% y preferentemente aproximadamente 60% a 67% de Marcol, aproximadamente 20% a 40% y preferentemente aproximadamente 28% a 35% de agua con antígenos del virus PRRS; aproximadamente 5% a 15% de cada cepa del virus PRRS seleccionada con base en los criterios antes explicados, aproximadamente 2% a 5% de Monooleato de polioxietileno Sorbitan (Tween 80), aproximadamente de 2% a 8% de Sorbitán Monooleato de Sorbitan (Span 80) y un adyuvante como un polisacárido lineal compuesto de cadenas distribuidas aleatoriamente de β-(1-4) D- glucosamina (unidades deacetiladas) y N-acetil-D- glucosamina (unidad acetilatada) , particularmente 4 a 6% de chitosan. Para la preparación de la vacuna, cada componente se adiciona uno por uno bajo sistema de agitación durante 1 a 5 minutos, adicionando al final el chitosan .
La vacuna se aplica a las aves de postura libres de patógenos, con 0.5 mi, 1 vez al mes, por la vía de administración subcutánea desde la semana 8 y hasta la 60 de edad, para finalmente obtener una formulación de inmunoglobulinas (IgY) neutralizantes de los agentes infecciosos de campo o toxinas a partir de la yema de huevo .
En particular, el nivel de anticuerpos para cada una de las cepas del agente infeccioso es evaluado por micrononeutralización (MNT) de las muestras de yema de huevo colectadas de la parvada vacunada. El titulo serológico mínimo debe cumplir el criterio de 1:160.
Tras la inmunización, se cosechan los huevos de las aves inmunizadas y los mismos se someten a un proceso de extracción, deslipidización y concentración de inmunoglobulinas a partir de la yema de huevo.
Proceso de extracción, deslipidización y concentración de inmunoglobulinas IgY.
Se realizan los siguientes pasos para realizar la extracción y concentración de las inmunoglobulinas IgY neutralizantes de agentes infecciosos o toxinas a partir de la yema de huevo .
La yema de huevo se diluye 1:4 ó 1:8 (sin la clara) con azida de sodio al 0.01 % y se almacena en refrigeración por lo menos durante toda el día, preferentemente de 12 a 24 horas. Posteriormente, el sobrenadante se separa y se agrega 1 al 15% de hidroxipropilmetilcelulosaftalato (HPMCP) en proporción de 0.25 mi por cada 100 mi de yema. Se deja reposar por lo menos 24 horas. La capa de lipidos que se forma en la parte superior de la solución es separada y la parte acuosa se filtra, luego se le adiciona PEG, preferentemente 8000, en una proporción del 5-30% P/V, se mezcla y se deja reposar al menos durante 4 horas, pero de preferencia se deja toda la noche a 4°C. Después se centrifuga por 20 a 30 minutos y se retira el sobrenadante. La pastilla resultante se solubiliza con PBS IX o buffer TRIS, a un volumen equivalente al 10% del volumen original.
Terapias con la formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de la invención.
La formulación resultante del proceso de extracción, deslipidización y concentración de las inmunoglobulinas IgY neutralizantes de agentes infecciosos o toxinas, obtenida a partir de la yema de huevo de gallinas previamente hiperinmunizadas con una vacuna emulsionada que comprende antigenos, un aceite mineral ligero y un adyuvante particulado que consiste en partículas, micro- partículas o nano-partículas de un polímero biodegradable, tal como un polisacárido lineal compuesto de cadenas distribuidas aleatoriamente de β-(1-4) D- glucosamina (unidades deacetiladas ) y N-acetil-D- glucosamina (unidad acetilatada) (Chitosan) , puede comprender: aproximadamente 0.8% a 5% de inmunoglobulinas IgY concentradas contra patógenos o toxinas de la invención, preferentemente 1% de inmunoglobulinas IgY concentradas, aproximadamente 80% a 90% de agua y aproximadamente 0.001% a 0.03% de conservadores. La dosis de tratamiento de la formulación concentrada de la invención puede ser de 1 mi y de 3 mi como máximo, la cual logra neutralizar las variedades de campo los agentes infecciosos o toxinas de la invención, ofreciendo inesperadamente una protección de hasta el 100% en animales, además de regularizar el nivel de S/P en granjas ya infectadas, tal como se muestra más adelante.
Considerando lo descrito anteriormente, en una primera modalidad, la presente invención se refiere a una formulación de vacuna emulsionada que comprende antigenos, un aceite mineral ligero, preferentemente Marcol y un adyuvante particulado que consiste en partículas, micro-partículas o nano-partículas de un polímero biodegradable, tal como por ejemplo el polisacárido lineal compuesto de cadenas distribuidas aleatoriamente de β-(1-4) D-glucosamina (unidades deacetiladas ) y N-acetil-D-glucosamina (unidad acetilatada) , preferentemente Chitosan. Además, la formulación de vacuna de la presente invención, comprende uno o más emulsionantes, tal como Monooleato de polioxietileno Sorbitan (Tween 80), Sorbitán Monooleato de Sorbitan (Span 80), o una mezcla de los mismos.
Los antígenos pueden provenir de una o varias cepas diferentes de uno o varios agentes infecciosos o de toxinas, tales como por ejemplo virus, baterías o protozoos, más particularmente del virus del PRRS, del virus de PED, del virus Whíte spot Syndrome Baculovirus Complex, de Rotavírus spp. o de Coronavírus spp. , y más particularmente de los virus de PRRS que tienen una secuencia de nucleótidos del gen ORF5 seleccionada del grupo que consiste de SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6 y SEQ. ID. NO: 7, y también del virus de la Diarrea Epidémica Porcina (DEP) . También los antigenos puede provenir de una o varias bacterias, tal como de Salmonella spp., de las seleccionadas del grupo que consiste en: Staphylococcus aureus , Streptococcus agalactíae, Escheríchía colí, Corynebacteríum pyogenes y Mycoplasma bovís, o también de Actínobacíllus pleuropneumoníae . Los antigenos además pueden provenir de uno o varios protozoarios seleccionados del grupo que consiste en: Eímería tenella , Eímería acervulína y Eímería máxima, o de toxinas producidas por hongos, tales como tricotecenos y más particularmente de 4- deoxinivalenol (DON) . Más aun, los antigenos pueden provenir de una o varias cepas diferentes de uno o varios virus, una o varias bacterias o uno o varios protozoarios, tal como por ejemplo de antigenos que provienen de Escheríchía colí, Salmonella spp., Clostrídíum perfríngens , Rotavírus spp. y Coronavírus spp. En particular, los antigenos también pueden provenir del grupo que consiste de Escheríchía colí, Rotavírus spp. y Coronavírus spp.
La formulación de vacuna emulsionada de la invención puede contener cepas virales seleccionadas por tener un titulo serológico menor a 1:160, evaluado por microneutralización cruzada utilizando un pool de inmunoglobulinas obtenidas con la vacuna en curso.
Asimismo, la formulación de vacuna emulsionada de la invención puede contener una mezcla de antigenos con títulos mayores a DIE5o 104/ml.
De acuerdo con el o los antígenos seleccionados, la presente invención también se refiere al uso de la formulación de vacuna emulsionada en la elaboración de una composición concentrada de inmunoglobulinas IgY útil para el tratamiento del Síndrome Respiratorio y Reproductivo (PRRS) en porcinos, el tratamiento de Diarrea Epidémica Porcina (DEP) en porcinos, el tratamiento del síndrome de la mancha blanca en camarón, el tratamiento de mastitis bovina, el tratamiento de infecciones producidas por Actínobacíllus pleuropneumoniae en porcinos, el tratamiento de coccidiosis en aves, el tratamiento de intoxicaciones provocadas por tricotecenos , particularmente en donde el tricoteceno es 4-deoxinivalenol (DON) , respectivamente, en donde la formulación de vacuna emulsionada es administrable por la vía subcutánea a las aves de postura .
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un proceso para la extracción y concentración de inmunoglobulinas a partir de yema de huevo de gallinas previamente hiperinmunizadas con la formulación de vacuna de la presente invención, caracterizado por los siguientes pasos :
a) Se diluye la yema 1:4 ó 1:8 (sin la clara) con azida de sodio al 0.01 % y se almacena en refrigeración por lo menos durante 24 horas.
b) Se separa el sobrenadante y se agrega hidroxipropilmetilcelulosaftalato (HPMCP) al 1-15% en proporción de 0.25 mi por cada 100 mi de yema. Se deja reposar por lo menos 24 horas.
c) Se separa la capa de lípidos que se forma en la parte superior de la solución y se filtra la parte acuosa .
d) Se adiciona PEG, preferente PEG 8000 en una proporción del 5-30% P/V, se mezcla y se deja reposar al menos durante 4 a 12 horas a 4°C.
e) Se centrifuga por 20 a 30 minutos y se quita el sobrenadante . f) La pastilla resultante se solubiliza con PBS IX o buffer TRIS, a un volumen equivalente al 10% del volumen original, mantener el pH en 7.
En una modalidad adicional, la presente invención se dirige a una formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar obtenida por el proceso para extracción, deslipidización y concentración de inmunoglobulinas a partir de yema de huevo proveniente de gallinas previamente hiperinmunizadas con la vacuna emulsionada de la invención. Dichas formulaciones concentradas de origen aviar de la invención puede comprender además aproximadamente de 70% a 85% de agua y/o aproximadamente de 0.001% a 0.03% de conservadores. En particular, la formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY está caracterizada porque comprende 0.8% a 5% de inmunoglobulinas IgY concentradas neutralizantes del virus que causa el PRRS .
Además, según el o los antigenos seleccionados, la presente invención también se refiere al uso de la formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del Síndrome Respiratorio y Reproductivo (PRRS) en porcinos, la Diarrea Epidémica Porcina (DEP) en porcinos, el síndrome de la mancha blanca en camarón, mastitis bovina, las infecciones producidas por Actínobacíllus pleuropneumoníae en porcinos, la coccidiosis en aves y las intoxicaciones provocadas por tricotecenos , particularmente las provocadas por tricotecenos como 4-deoxinivalenol (DON) , en donde el medicamento puede ser administrable por la vía de administración parenteral, preferentemente por la vía intramuscular o es administrable vía oral y con el alimento, según sea el caso. Los siguientes ejemplos muestran los resultados de la aplicación de la formulación concentrada de la invención en porcinos. No obstante, dichos ejemplos son proporcionados con el fin de ilustración y no de limitación.
EJEMPLO 1
Se elaboraron dos vacunas que contuvieron tres cepas cada una del virus PRRS, utilizando una formulación sin marcol y sin chitosan. Estas vacunas se aplicaron a las aves de manera mensual y alternadas; es decir, un mes se administró una y al siguiente la otra y asi sucesivamente .
Tras la inmunización, se cosecharon los huevos de las aves inmunizadas y se sometieron a un proceso de extracción de inmunoglobulinas a partir de la yema de huevo, tal como antes fue descrito.
Como resultado de la inmunización anterior, se obtuvo una formulación con inmunoglobulinas IgY neutralizantes de virus del PRRS, pero cuya concentración fue baja.
La figura 1 muestra los resultados de este experimento (grupo A) , en los que se puede apreciar el bajo rendimiento de inmunoglobulinas IgY neutralizantes de virus del PRRS de la formulación previamente obtenida, la cual es incapaz de llevar a cabo un tratamiento eficiente en porcinos que padecen del Síndrome Respiratorio y Reproductivo, pues es necesario emplear volúmenes mayores a 5 mL y que proteja a títulos de 104. Además, este experimento resultó ser complicado y problemático por el manejo de dos vacunas. EJEMPLO 2
Se elaboró una vacuna conteniendo seis cepas diferentes del virus PRRS, utilizando una formulación sin marcol y con chitosan, la cual fue administrada a las aves mediante un esquema de inmunización mensual.
Tras la inmunización, se cosecharon los huevos de las aves inmunizadas y se sometieron a un proceso de extracción de inmunoglobulinas a partir de la yema de huevo, tal como antes fue descrito.
Como resultado de la inmunización anterior, el rendimiento mejoró con respecto al experimento del ejemplo 1, pero no fue suficiente (Ver figura 1, grupo B) .
Como resultado de este experimento, se encontró que el rendimiento de inmunoglobulinas IgY neutralizantes de virus del PRRS es inadecuado para llevar a cabo un tratamiento efectivo en porcinos que padecen del Síndrome Respiratorio y Reproductivo.
EJEMPLO 3
Se formuló nuevamente una vacuna, pero ahora utilizando Marcol como aceite mineral ligero y chitosan como adyuvante particulado. Esta vez, se incluyeron antígenos de 6 cepas del virus PRRS en una sola vacuna.
Tras la inmunización, se cosecharon los huevos de las aves inmunizadas y se sometieron a un proceso de extracción de inmunoglobulinas a partir de la yema de huevo, tal como antes fue descrito.
Nuestros resultados indican que los títulos de anticuerpos se incrementan hasta 2 veces respecto a lo obtenido con la formulación del experimento del ejemplo 2 (ver figura 1, grupo C) . Las figuras 1 y 2 muestran los resultados de este experimento, en los que se puede apreciar que el rendimiento de inmunoglobulinas IgY neutralizantes de virus del PRRS se incrementa significativamente cuando se utiliza una formulación con marcol y chitosan, lo cual resulta adecuado para llevar a cabo un tratamiento efectivo en porcinos que padecen del Síndrome Respiratorio y Reproductivo. EJEMPLO 4
En este ejemplo se analizó el producto terminado de inmunoglobulinas. Se inmunizaron aves de postura, se cosecharon los huevos de las aves inmunizadas y las yemas de huevo se sometieron a un proceso de extracción y concentración de inmunoglobulinas, tal como antes fue descrito. Las vacunas con las que se inmunizaron a las parvadas fueron las mismas que se presentaron en los ejemplos 1 a 3, pero en este caso, se incrementó el tamaño del lote a 10,000 huevos por parvada.
Nuestros resultados indican que el proceso de concentración, descrito anteriormente, incrementa los títulos de anticuerpos respecto a lo obtenido sin dicho proceso. El incremento en la concentración va de 1.6 a 2.1 veces (figura 3). Como resultado de este experimento, se encontró que el rendimiento de inmunoglobulinas IgY neutralizantes de virus del PRRS es adecuado para llevar a cabo un tratamiento efectivo en porcinos que padecen del Síndrome Respiratorio y Reproductivo, utilizando un volumen menor para alcanzar la protección. EJEMPLO 5
Aplicación de inmunoglobulinas (tipo IgY) en las hembras del hato reproductor .
Se realizó un seguimiento longitudinal de la presencia de anticuerpos contra el virus de PRRS mediante la evaluación de sueros de 30 cerdas seleccionadas aleatoriamente a partir de una granja de explotación de ciclo completo con 500 cerdas, situada en el occidente de la República Mexicana. Esta granja produce lechones negativos al virus de PRRS, que se contaminan a lo largo de la vida productiva.
El hato reproductor fue tratado con una aplicación de 1 mi de la formulación de inmunoglobulinas IgY concentrada de origen aviar de la invención, por vía intramuscular cada 4 meses y una repetición 15 días después . Posteriormente se realizaron aplicaciones semanales a los 70 y 85 días de gestación.
Las cerdas del pie de cria fueron monitoreadas de forma bimestral para determinar el movimiento viral. Se tomaron muestras de sangre de los mismos 30 animales seleccionados inicialmente . Para la evaluación, se utilizó la técnica de ELISA (IDEXX, PRRS X3 ) , que es una manera indirecta para medir la efectividad del tratamiento con IgY concentradas. El kit mide los niveles de anticuerpos del tipo IgG que genera el cerdo en respuesta a una viremia . Por lo tanto, si el cerdo está infectado producirá anticuerpos del tipo IgG como respuesta y se obtendrán valores de S/P por arriba del punto de corte, pero si no hay viremia el kit arrojará valores S/P inferiores al punto de corte. El punto de corte de la ELISA fue de 0. S/P. En la figura 4 se muestra que el tratamiento aplicado al hato reduce los niveles de anticuerpos de manera paulatina a medida que se realiza el monitoreo bimestral y por ende se demuestra que el virus de PRRS fue neutralizado por las inmunoglobulinas aplicadas (del tipo IgY) , limitando de esta manera la infección. Es importante señalar que sorpresivamente nuestro producto neutralizó al virus de tal manera que al cabo de 6 meses ya no se registró una reinfección del virus de PRRS. Esto mismo se prueba porque se registró una diferencia sustancial en los parámetros productivos de granjas negativas y positivas .
EJEMPLO 6
Aplicación de inmunoglobulinas (IgY) concentradas en lechones
En el presente ejemplo se muestran los resultados de evaluación de disminución de la viremia en lechones clínicamente afectados por el virus de PRRS. Los lechones no presentaron viremia durante la etapa de maternidad (primeras 3 semanas). Sin embargo, hubo evidencia clínica de viremia alrededor de las 6-8 semanas de edad. Esto se comprobó mediante la técnica de PCR en tiempo real, en donde se generaron 5 pools de sueros de animales virémicos; cada pool integrado por sueros de 5 porcinos diferentes (un total de 25 porcinos evaluados) . Como se observa en la tabla, la carga viral alcanzó títulos entre 6.16 X 105 y 2.24 X 107. Identificación Carga Viral Carga viral después del inicial Tratamiento
Destete 6 6. .16X105 NEGATIVO
Destete 6 4. .98X106 NEGATIVO
Destete 7-8 5. .54X104 NEGATIVO
Destete 7-8 2. .24X107 NEGATIVO
Destete 7-8 1. .21X107 NEGATIVO
Una vez que se confirmó la viremia, se les aplicó un tratamiento con la formulación concentrada de origen aviar de la invención. Se aplicó una dosis de 3 mL por vía intramuscular. Para evaluar la eficacia del tratamiento, se observaron los datos clínicos y además se cuantificó la cantidad de virus circulante en los porcinos .
Los resultados del monitoreo a los 10 días posteriores a la aplicación de la formulación de inmunoglobulinas IgY concentrada de origen aviar de la invención evidenció que el 100% de las muestras fueron negativas a la presencia de material genético del virus PRRS en suero.
Con los resultados obtenidos, se demuestra que la aplicación de un programa con inmunoglobulinas en el pie de cría evita la circulación viral y puede neutralizar la viremia en lechones de destete con cargas de 107 partículas virales por mL.
EJEMPLO 7
El uso de inmunoglobulinas IgY concentradas reduce la mortalidad de lechones La formulación de inmunoglobulinas IgY concentrada de origen aviar de la invención fue aplicada a porcinos destetados y destinados para engorda. Durante todo el tiempo de producción se registró la mortalidad bajo diferentes sistemas de tratamiento.
La granja en estudio se ubica en la región centro occidente de la república mexicana y con 1100 cerdas en su hato reproductor y una producción semanal de 500 lechones. La granja tiene antecedentes de infección endémica de PRRS, aun cuando se han implementado varias estrategias de control. Se tiene un sistema de autoreemplazo, en el cual se considera la introducción de cerdas cada 4 meses . En el pie de cria se incluye la aplicación de la vacuna a virus vivo modificado contra PRRS cada 3 meses.
En el presente ejemplo se hizo un monitoreo semanal y se calculó el porcentaje de mortalidad tanto en el destete (semanas 3 a 9) como en el periodo de engorda (semana 10 a 26) .
Se compararon dos tratamientos . Uno basado en vacuna viva y otro con la formulación de inmunoglobulinas IgY concentrada de origen aviar de la invención, además también se consideró un bloque control sin tratamiento. Cada tratamiento estuvo integrado por diferentes grupos que fueron evaluados de manera independiente: los grupos del 01 al 06 corresponden a lechones tratados de forma convencional (vacuna viva) y los grupos del 07 al 16 fueron los que recibieron dos dosis de la formulación de inmunoglobulinas IgY concentrada de origen aviar de la invención, en tanto los grupos 17, 18 y 19 no fueron tratados . Tipo de Descripción Grupos que t atamiento tratamiento recibieron el tratamiento
Vacuna a virus Aplicación de la 6, Del 01 al 06 vacuna a los 21
vivo modificado
días de edad y 3
meses .
Inmunoglobulinas Dos aplicaciones 10, Del 07 al 16
3 mi c/u, semana
Altamente
10 después del
Concentradas de destete .
Origen Aviar
especificas para
PRRS (tipo IgY)
Control sin Sin tratamiento 3, Del 17 al 19 tratamiento
En la figura 5 se muestra el monitoreo de la mortalidad a partir de la semana 3 y hasta la 26. Los grupos que fueron tratados con la formulación de inmunoglobulinas IgY concentrada de origen aviar de la invención se resaltan en un cuadro azul más intenso (grupos del 07 al 16) .
El porcentaje de mortalidad promedio de los grupos no tratados fue el más alto (25.06%), en seguida se ubica a los grupos que recibieron el tratamiento convencional (21.2% en promedio) y el mejor tratamiento fue el de la formulación de inmunoglobulinas IgY concentrada de origen aviar de nuestra invención, donde se obtuvo un porcentaje promedio de mortalidad del 10.27%. Es decir, que con el uso de las inmunoglobulinas IgY se alcanza una supervivencia de casi el 90% de los animales tratados que representa 10% más de lo alcanzado por el método de vacunación .
En la figura 6 se presenta una gráfica de los porcentajes de mortalidad acumulada de cada grupo evaluado, en donde se destacan aquéllos que fueron tratados con la formulación concentrada de origen aviar de la invención.
Los resultados del uso de inmunoglobulinas del tipo IgY concentradas muestran una reducción significativa en los porcentajes de mortalidad asociados al virus de PRRS . Aún más, se observó que el estado de salud y productividad de estos animales también mejoró, a diferencia de los grupos que recibieron la vacuna. Es importante señalar que esta es la primera vez que se evidencia el uso de inmunoglobulinas aviares para el tratamiento en lechones .
Estos resultados son muy significativos, pues el programa con la formulación de inmunoglobulinas IgY concentrada de origen aviar de la invención en lechones no sólo disminuye el porcentaje de mortalidad, sino que además brinda la posibilidad de obtener otras mejoras en los parámetros productivos .
Por lo anterior, se apreciará que aunque las modalidades especificas de la invención se han descrito en la presente para propósitos de ilustración, pueden hacerse varias modificaciones sin desviarse de la naturaleza y alcance de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones anexas .

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una formulación de vacuna emulsionada que comprende: (i) antigenos, (ii) un aceite mineral ligero y (iii) un adyuvante particulado que se selecciona del grupo que consiste en partículas, micro-partículas o nano-partículas de un polímero biodegradable.
2. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los antígenos provienen de una o varias cepas diferentes de uno o varios virus .
3. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el virus es el virus del PRRS .
. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque las cepas aisladas del virus de PRRS tienen una secuencia de nucleótidos del gen ORF5 seleccionada del grupo que consiste de SEQ . ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 3, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6 y SEQ. ID. NO: 7.
5. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el virus es el virus de la Diarrea Epidémica Porcina (DEP) .
6. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el virus es el virus Whíte spot Syndrome Baculovírus Complex .
7. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los antigenos provienen de una o varias cepas diferentes de una o varias bacterias .
8. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque los antigenos provienen de una o varias cepas diferentes de una o varias bacterias seleccionadas del grupo que consiste en: Staphylococcus aureus , Streptococcus agalactíae, Escheríchía colí, Corynebacteríum pyogenes y Mycoplasma bovís.
9. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque los antigenos provienen de una o varias cepas diferentes de Actínobacíllus pleuropneumoníae .
10. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los antigenos provienen de una o varias cepas diferentes de uno o varios protozoarios .
11. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque los antigenos provienen de una o varias cepas diferentes de uno o varios protozoarios seleccionados del grupo que consiste en: Eimeria tenella , Eímería acervulína y Eímería máxima.
12. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los antigenos provienen de toxinas producidas por hongos.
13. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los antigenos provienen de una mezcla de antigenos de una o varias cepas diferentes de uno o varios virus, una o varias bacterias o uno y varios protozoarios.
14. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los antigenos provienen de Escheríchía colí , Salmonella spp. , Clostridium perfringens , Rotavírus spp y Coronavírus spp.
15. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los antigenos provienen de Escheríchía colí , Rotavírus spp. y Coronavírus spp.
16. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque los antigenos provienen de cepas virales seleccionadas por tener un titulo serológico menor a 1:160, evaluado por microneutralización cruzada utilizando un pool de inmunoglobulinas obtenidas con la vacuna en curso.
17. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque contiene una mezcla de antigenos con títulos mayores a DI∑5o 104/ml.
18. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
17, caracterizada porque el aceite mineral ligero es Marcol .
19. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
18, caracterizada porque el adyuvante particulado es Chitosan .
20. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
19, caracterizada porque además comprende un agente emulsionante .
21. La formulación de vacuna emulsionada de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el agente emulsionante se selecciona del grupo que consiste en: Monooleato de polioxietileno Sorbitan (Tween 80), Sorbitán Monooleato de Sorbitan (Span 80) o una mezcla de los mismos.
22. Uso de la formulación de vacuna emulsionada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la elaboración de una composición concentrada de inmunoglobulinas IgY útil para el tratamiento del Síndrome Respiratorio y Reproductivo (PRRS) en porcinos.
23. Uso de la formulación de vacuna emulsionada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 5 en la elaboración de una composición concentrada de inmunoglobulinas IgY útil para el tratamiento de Diarrea Epidémica Porcina (DEP) en porcinos.
24. Uso de la formulación de vacuna emulsionada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 6 en la elaboración de una composición concentrada de inmunoglobulinas IgY útil para el tratamiento del síndrome de la mancha blanca en camarón.
25. Uso de la formulación de vacuna emulsionada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 7 a 8 en la elaboración de una composición concentrada de inmunoglobulinas IgY útil para el tratamiento de mastitis bovina .
26. Uso de la formulación de vacuna emulsionada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 7 y 9 en la elaboración de una composición concentrada de inmunoglobulinas IgY útil para el tratamiento de infecciones producidas por Actínobacíllus pleuropneumoníae en porcinos.
27. Uso de la formulación de vacuna emulsionada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 10 y 11 en la elaboración de una composición concentrada de inmunoglobulinas IgY útil para el tratamiento de coccidiosis en aves.
28. Uso de la formulación de vacuna emulsionada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 12 en la elaboración de una composición concentrada de inmunoglobulinas IgY útil para el tratamiento de intoxicaciones provocadas por tricotecenos .
29. El uso de conformidad con la reivindicación 28 en donde el tricoteceno es 4-deoxinivalenol (DON) .
30. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, en donde la formulación de vacuna emulsionada comprende Marcol como aceite mineral ligero .
31. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30, en donde la formulación de vacuna emulsionada comprende Chitosan como adyuvante particulado.
32. El uso de conformidad con las reivindicaciones 1 a 31, en donde la formulación de vacuna emulsionada es administrable por la vía subcutánea a las aves de postura.
33. Un proceso para la extracción, deslipidización y concentración de inmunoglobulinas a partir de yema de huevo proveniente de gallinas hiperinmunizadas con la formulación de vacuna emulsionada según las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) Se diluye la yema 1:4 ó 1:8 (sin la clara) con azida de sodio al 0.01 % y se almacena en refrigeración por lo menos durante todo el día.
b) Se separa el sobrenadante y se agrega hidroxipropilmetilcelulosaftalato (HPMCP) del 1 al 15% en proporción de 0.25 mi por cada 100 mi de yema. Se deja reposar por lo menos 24 horas.
c) Se separa la capa de lipidos que se forma en la parte superior de la solución y se filtra la parte acuosa
d) Se adiciona PEG en una proporción del 5 al 30% P/V, se mezcla y se deja reposar al menos durante 4 a 12 horas a 4°C.
e) Se centrifuga por 20 a 30 minutos y se quita el sobrenadante.
f) La pastilla resultante se solubiliza con PBS o buffer TRIS, a un volumen equivalente al 10% del volumen original .
34. El proceso para la extracción, deslipidización y concentración de inmunoglobulinas de conformidad con la reivindicación 33, en donde la yema 1:4 ó 1:8 (sin la clara) diluida con azida de sodio al 0.01% en el paso (a), se almacena en refrigeración de 12 a 24 horas.
35. El proceso para la extracción, deslipidización y concentración de inmunoglobulinas de conformidad con la reivindicación 33, en donde en el paso (d) se adiciona PEG8000 en una proporción del 5 al 30% P/V, se mezcla y se deja reposar al menos durante 4 a 12 horas a 4°C.
36. Una formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar obtenida por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35.
37. La formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque comprende de 0.8% a 5% de inmunoglobulinas IgY neutralizantes del virus que causa el PRRS .
38. La formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque comprende 1% de inmunoglobulinas IgY neutralizantes del virus que causa el PRRS.
39. La formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, caracterizada porque además comprende de 70% a 85% de agua.
40. La formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, caracterizada porque además comprende de 0.001% a 0.03% de conservadores .
41. Uso de la formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del Síndrome Respiratorio y Reproductivo (PRRS) en porcinos.
42. Uso de la formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar de conformidad con la reivindicación 36 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de Diarrea Epidémica Porcina (DEP) en porcinos .
43. Uso de la formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar de conformidad con la reivindicación 36 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del síndrome de la mancha blanca en camarón.
44. Uso de la formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar de conformidad con la reivindicación 36 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de mastitis bovina.
45. Uso de la formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar de conformidad con la reivindicación 36 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de infecciones producidas por Actínobacíllus pleuropneumoníae en porcinos.
46. Uso de la formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar de conformidad con la reivindicación 36 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de coccidiosis en aves.
47. Uso de la formulación concentrada de inmunoglobulinas IgY de origen aviar de conformidad con la reivindicación 36 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de intoxicaciones provocadas por tricotecenos .
48. El uso de conformidad con la reivindicación 47 en donde el tricoteceno es 4-deoxinivalenol (DON) .
49. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41, 42, 44, 45, 47 y 48, en donde el medicamento es administrable por la vía de administración parenteral .
50. El uso de conformidad con la reivindicación 49, en donde el medicamento es administrable por la vía intramuscular.
51. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43, y 46, en donde el medicamento es administrable vía oral y con el alimento.
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