WO2020009216A1 - ＳｓｅＪタンパク質を用いたサルモネラワクチン - Google Patents

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infection
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江口　正浩
スワルミサ デビ アリバム
小川　洋介
善弘 下地
優美子 枡鏡
マトゥロバ マルタ エリスマイヤー
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国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a Salmonella vaccine comprising a combination of a SseJ protein derived from a genus Salmonella and a killed bacterium.
  • Vaccines have been tried to prevent infection with Salmonella spp. For example, it has been reported that, in the oral infection of Salmonella, protection against infection is exhibited by using live bacteria such as attenuated strains as an immunogen. Vaccine development using this attenuated strain has an idea based on immunological and bacteriological findings and an excellent strategy for achieving the objective, but involves the risk of side reactions and the return of virulence. There is a problem.
  • Attenuated strain vaccines are not currently available on the market, and killed vaccines consisting of formalin or heat-sterilized Salmonella spp. Are used exclusively (for example, bovine Salmonella bivalent vaccine (Scientific Feed Research Co., Ltd.) Place), chicken salmonella inactivated 3 blends / KS (Kyoritsu Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • Patent Literature 1 also describes that in an attenuated vaccine, the SPI-2 III secretion system is a target for gene knockout (paragraph 0004). It has been described that deletion of a protein that constitutes the SPI-2 III secretion system of Salmonella sp. Impairs replication of Salmonella sp. "ABSTRUCT” and "IMPORTANCE” on page 1).
  • a vaccine comprising a combination of a protein secreted from Salmonella spp. Cultured under specific conditions and a killed bacterium exhibits an excellent protective effect against Salmonella spp. (Patent Document 2). However, no specific secreted protein exhibiting the infection protective effect is disclosed.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to identify a Salmonella secretory protein that is effective as a component of a Salmonella vaccine. It is a further object of the present invention to provide a vaccine having an excellent protective effect against Salmonella using the identified secreted protein.
  • SseJ protein which is one of a group of proteins constituting the SPI-2 III type secretion system of Salmonella spp.
  • SseJ protein which is one of a group of proteins constituting the SPI-2 III type secretion system of Salmonella spp.
  • SseJ protein When administered alone, While it does not show significant protection against Salmonella infection, it surprisingly shows a very good protection against Salmonella infection when administered in combination with killed Salmonella. was found to be effective. Therefore, the present inventors have found that a combination of SseJ protein and killed Salmonella spp. Can be a salmonella vaccine having both high safety and excellent effects, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following aspects.
  • a vaccine for protecting a living body from salmonellosis comprising a combination of an SseJ protein derived from Salmonella spp. Or an immunogenic fragment thereof and killed Salmonella spp.
  • [2] A method for protecting a living body from salmonellosis, which comprises administering the vaccine according to [1] to a living body infected with Salmonella spp.
  • the vaccine of the present invention which comprises a combination of SseJ protein derived from Salmonella sp. And a killed Salmonella sp. As an active ingredient, can provide an extremely high survival rate even when infected with Salmonella sp. Was completed.
  • SseJ protein since SseJ protein has been positioned as a target excluded from vaccine development in the first place (Patent Document 1, Non-patent Document 1), in the present invention, SseJ protein is used as a vaccine in combination with killed Salmonella spp. It is surprising that the effectiveness of the above was found. In addition, when the SseJ protein and killed bacteria were each administered alone, all the individuals died, or considering that the survival rate was extremely low, the effect of the vaccine of the present invention combining the two was considered.
  • the present invention provides a vaccine for protecting a living body from salmonellosis, comprising a combination of a SseJ protein derived from Salmonella spp. And a killed Salmonella spp. As an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for protecting a living body from salmonellosis, which comprises administering the vaccine to a living body infected with Salmonella.
  • Salmonellosis in the present invention means an infection caused by Salmonella spp.
  • Salmonella spp examples of “Salmonella spp.” That cause salmonellosis include, but are not limited to, Salmonella Typhimurium, Salmonella Choleraesuis, Salmonella Dublin, Salmonella Enteritidis, Salmonella Gallinrum, and Salmonella Pullorum belonging to Salmonella enterica subsp. Enterica.
  • a multivalent vaccine can be produced using two or more Salmonella species.
  • SseJ protein derived from Salmonella spp. which is one of the active ingredients of the vaccine of the present invention, is one of a group of proteins constituting the SPI-2 III type secretion system of Salmonella spp.
  • a typical amino acid sequence of the SseJ protein derived from a genus Salmonella belonging to Salmonella enterica subsp. Enterica is shown in SEQ ID NO: 2, and a typical base sequence of a DNA encoding the protein is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the SseJ protein is the same in Salmonella enterica subsp., But it should be understood that, in nature, the amino acid sequence of the protein and the nucleotide sequence of its gene may vary.
  • immunogenic fragment refers to a fragment of the SseJ protein that can induce an immune response in a living body.
  • SseJ protein or an immunogenic fragment thereof can be prepared as a recombinant protein or a natural protein by methods well known in the art.
  • a DNA encoding the SseJ protein for example, a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a DNA encoding a fragment of the protein is inserted into an appropriate expression vector, and this vector is inserted into an appropriate expression vector.
  • purification means include, but are not limited to, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration, affinity chromatography, and the like.
  • the SseJ protein or a fragment thereof is expressed in a host cell (for example, Escherichia coli) as a recombinant protein to which a plurality of histidines are added or as a fusion protein with a glutathione-S-transferase protein
  • the expressed set is used.
  • the recombinant protein can be purified using a nickel column or a glutathione column. After purification of the fusion protein, the region other than the target protein or fragment can be removed by cutting with thrombin or factor Xa as necessary.
  • a natural protein can be prepared by a method known to those skilled in the art, for example, by contacting an extract or culture supernatant of Salmonella with an affinity column to which an antibody against the SseJ protein is bound.
  • the antibody used for the affinity column may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the ⁇ killed '' of Salmonella spp. Used in combination with the SseJ protein or an immunogenic fragment thereof is, for example, heat treatment, treatment with a chemical disinfectant, radiation or ultraviolet irradiation. It can be prepared by irradiation, treatment with a mutation promoting substance, or the like. In the preparation of killed bacteria, heat treatment or treatment with a chemical disinfectant, formalin, is preferably used.
  • the killed bacteria may be a mixture of different Salmonella spp. (Eg, a mixture of Salmonella spp. Of different species or different serotypes). This makes it possible to broaden the range of Salmonella spp. That can be protected against infection.
  • the vaccine of the present invention is the SseJ protein derived from Salmonella spp. And the killed Salmonella sp.
  • the vaccine of the present invention is the SseJ protein derived from Salmonella spp. And the killed Salmonella sp.
  • the form of a single preparation containing both as active ingredients, in the form of a combination preparation of a preparation containing a protein secreted from Salmonella as an active ingredient and a preparation containing dead bacteria of Salmonella as an active ingredient It means that there may be.
  • the form of a single agent includes a form of killed Salmonella spp. That expresses the SseJ protein.
  • the vaccine of the present invention may contain a pharmacologically acceptable carrier in addition to the above active ingredients.
  • Such carriers include, for example, sterile water or physiological saline, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavors, fragrances, excipients, vehicles, preservatives Binders, diluents, tonicity agents, soothing agents, bulking agents, disintegrants, buffers, coatings, lubricants, colorants, sweeteners, thickeners, flavoring agents, solubilizing agents or Other additives may be mentioned, but are not limited thereto.
  • the active ingredient can be in various forms such as injections, aerosols, capsules, tablets, powders, granules, and the like, depending on the method of administration and the purpose of treatment.
  • an adjuvant can be further added to enhance an immune response.
  • the adjuvant include Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, oil adjuvant, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, saponin, vitamin E, and the like, but are not particularly limited as long as the effect is exhibited.
  • ⁇ The“ living body ”to which the vaccine of the present invention is administered means living animal and human bodies.
  • the animal is not particularly limited as long as it is an animal that can be infected with Salmonella spp., And may be a domestic animal, a pet animal (pet), an experimental animal, or an animal for any other use. It may be.
  • animals include, but are not limited to, cows, pigs, horses, sheep, goats, chickens, ducks, geese, ducks, quails, pheasants, pigeons, turkeys, guinea fowls, dogs, cats, and the like.
  • the vaccine of the present invention can be administered to a living body by a known administration route including subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, oral, and intranasal administration to impart immunity to the living body.
  • a known administration route including subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, oral, and intranasal administration to impart immunity to the living body.
  • each preparation may be administered simultaneously, or may be administered with a time lag within a range that does not diminish the effect of the combination.
  • the dose of the vaccine of the present invention may be any amount that can induce an immune response in a living body, and includes the age and weight of animals and humans, the type of animal, and the type of pathogenic bacteria (for example, differences in the degree of pathogenicity, etc.). ) And the method and route of administration.
  • One dose of the secretory protein as an active ingredient is usually 0.05 ⁇ g to 1500 ⁇ g, preferably 5 ⁇ g to 500 ⁇ g.
  • the dose of the killed bacteria as an active ingredient at one time is generally 10 3 to 10 10 , preferably 10 6 to 10 9 , as the number of killed bacteria.
  • Administration may be performed a plurality of times, in which case the administration interval is usually 1 to 2 weeks.
  • Example 1 Purification of SseJ protein PCR was performed using DNA of Salmonella Typhimurium x3306 strain as a template and primers (forward: CACCATGCCATTGAGTGTTGGACA / SEQ ID NO: 3, reverse: TTATTCAGTGGAATAATGATGAGCT / SEQ ID NO: 4).
  • the PCR product was cloned using the TOPO cloning method, and then the recombinant SseJ protein was highly expressed in E. coli.
  • pET151 / D-TOPO His Tag (6x) on the N-terminal side
  • Pre-culture (static culture) was performed overnight in 5 mL of LB medium (containing ampicillin), followed by shaking culture in 100 mL of LB medium until the absorbance (600 nm) became 0.3, and then IPTG was added and cultured for 6 hours. After the culture, the cells were collected and disrupted by ultrasonication. After that, it was dissolved in an urealysis buffer, the SseJ protein was adsorbed on a nickel column, and eluted with an imidazole elution buffer.
  • Example 2 Salmonella oral infection experiment using mice Salmonella Typhimurium x3306 strain, Salmonella Choleraesuis ATCC7001 strain, Salmonella Dublin 5230 strain killed bacteria (10 5 CFU) and purified recombinant SseJ protein (10 ⁇ g) together with incomplete adjuvant BACB / c mice (female 5 weeks old) were immunized subcutaneously, and immunized again about 2 weeks later.
  • Salmonella Typhimurium x3306 strain Salmonella Choleraesuis ATCC7001 strain, and Salmonella Dublin 5230 strain were cultured at 10 6 CFU (LD 50 is 10 4 ), 10 6 CFU (LD 50 is 5 ⁇ 10 4 ), and 10 6 CFU (LD 50 5x10 4 ) Orally infected.
  • LD 50 10 4
  • 10 6 CFU LD 50 is 5 ⁇ 10 4
  • 10 6 CFU LD 50 5x10 4
  • Orally infected Six hours before the infection, the mice were fasted, and thereafter, 50 ⁇ l of 10% sodium bicarbonate was orally administered, and the above-mentioned Salmonella spp. Were infected orally.
  • secretion protein alone (10 ⁇ g) killed bacteria alone (10 5 CFU), or untreated verification were also performed.
  • mice were infected with Salmonella Choleraesuis ATCC7001 or Salmonella Dublin 5230, the group treated with the combination of SseJ protein and killed bacteria showed a significant protective effect compared to the other groups ( (FIG. 2B, FIG. 2C).
  • amino acid sequence of the SseJ protein used as a vaccine is common to Salmonella belonging to Salmonella enterica subsp. It can be applied to Salmonella Enteritidis, Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum, etc., and is considered to be effective against all serotypes of Salmonella.
  • Attenuated strain vaccines are known as Salmonella vaccines that have a high protective effect on infection, but are not commercially available due to safety issues. From the viewpoint of safety, vaccines using killed bacteria or specific proteins are desirable.
  • the vaccine of the present invention which utilizes a combination of the SseJ protein and killed bacteria, is highly safe and can exert an excellent infection protective effect against animals such as domestic animals and humans against infection with Salmonella spp. Therefore, the vaccine of the present invention can be used particularly in the agricultural and medical fields.

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Abstract

サルモネラ属菌由来のSseJタンパク質をサルモネラ属菌の死菌との組み合わせで生体に投与すると、それぞれ単独の場合と比較して、サルモネラ属菌の感染に対して極めて優れた防御効果を発揮することを見出した。これにより、高い安全性を有し、かつ、サルモネラ症からの防御能に優れたワクチンが提供された。

Description

ＳｓｅＪタンパク質を用いたサルモネラワクチン
　本発明は、サルモネラ属菌由来のSseJタンパク質と死菌との組み合わせを含むサルモネラワクチンに関する。
　畜産業におけるサルモネラ症の発生は経済的損失が極めて大きいことから、家畜・家禽に対する感染予防対策は重要である。しかしながら、現在まで、国内の家畜・家禽のサルモネラ症の発生は、完全には抑えられていない。
　サルモネラ属菌の感染予防には、ワクチンの利用が試みられている。例えば、サルモネラ経口感染において、弱毒株などの生菌を免疫原として利用すると、感染防御を示すことが報告されている。この弱毒株を用いたワクチン開発は、免疫学・細菌学的な知見に基づく着想と目的達成に向けた優れた戦略性を有しているが、副反応や病原性の復帰の危険性を伴うという問題がある。
　このため弱毒株ワクチンは、現在、市販されておらず、専ら、ホルマリンや熱により殺菌したサルモネラ属菌からなる死菌ワクチンが利用されている（例えば、牛サルモネラ2価ワクチン（株式会社　科学飼料研究所）、鶏サルモネラ不活化3混・KS（共立製薬株式会社））。
　一方、弱毒株を利用しないワクチンとして、特定の条件で培養したサルモネラ属菌の培養上清を利用したワクチンも報告されている。例えば、特許文献１では、SPI-2（Salmonella　Pathogenicity　Island-2）III型分泌系が誘導される条件下において、低マグネシウム・低リン酸の培地で培養したサルモネラ属菌の培養上清が、鳥類に感染したサルモネラ属菌の全身への拡がりに対して防御効果を有することが開示されている。ただし、当該文献では、SPI-2　III型分泌系を欠損させたサルモネラ菌を、同じ条件で培養した培養上清でも、同様の効果があることから、SPI-2　III型分泌系自体は、当該培養上清におけるワクチンとして有効成分ではないと評価されている（「図面の簡単な説明」の図２の項）。また、特許文献１では、弱毒化ワクチンにおいては、SPI-2　III型分泌系は、遺伝子ノックアウトの標的であることも記載されており（段落０００４）、非特許文献１においても、SseJタンパク質などのサルモネラ属菌のSPI-2　III型分泌系を構成するタンパク質を欠損させると、サルモネラ属菌の宿主における複製が減退することから、当該欠損がワクチン開発において重要であることが記載されている（第１頁の「ABSTRUCT」および「IMPORTANCE」の項など）。
　また、本発明者は、特定の条件下で培養されたサルモネラ属菌から分泌されるタンパク質と死菌との組み合わせからなるワクチンが、サルモネラ属菌に対して優れた感染防御効果を示すことを明らかにしている（特許文献２）。しかしながら、当該感染防御効果を示す具体的な分泌タンパク質は開示されていない。
特表2010-501599号公報 国際公開2016-017620号公報
Figueira　R.　et　al.,　mBio,　Volume　4,　Issue　2,　(2013)
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、サルモネラワクチンの成分として有効なサルモネラ属菌の分泌タンパク質を同定することにある。さらなる本発明の目的は、同定した分泌タンパク質を利用して、サルモネラ属菌に対して優れた感染防御効果を有するワクチンを提供することにある。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、サルモネラ属菌のSPI-2　III型分泌系を構成するタンパク質群の一つであるSseJタンパク質が、単独投与の場合には、サルモネラ属菌の感染に対して有意な防御効果は示さない一方、サルモネラ属菌の死菌と組み合わせで投与した場合には、驚くべきことに、サルモネラ属菌の感染に対して極めて優れた防御効果を発揮することを見出した。このため、本発明者らは、SseJタンパク質とサルモネラ属菌の死菌との組み合わせが、高い安全性と優れた効果を兼ね備えたサルモネラワクチンとなりうることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、より詳しくは以下の態様を提供するものである。
　［１］サルモネラ属菌由来のSseJタンパク質またはその免疫原性断片とサルモネラ属菌の死菌との組み合わせを含む、サルモネラ症から生体を防御するためのワクチン。
　［２］［１］に記載のワクチンをサルモネラ属菌に感染する生体に投与する、サルモネラ症から生体を防御する方法。
　サルモネラ属菌由来のSseJタンパク質とサルモネラ属菌の死菌との組み合わせを有効成分とする本発明のワクチンは、生体へ投与することにより、サルモネラ属菌が感染した場合でも極めて高い生存率をもたらすことができた。上記の通り、SseJタンパク質は、そもそもワクチン開発において除外される対象として位置づけられてきたことから（特許文献１、非特許文献１）、本発明において、サルモネラ属菌の死菌との組み合わせでワクチンとしての有効性が見出されたこと自体、驚くべきことである。また、SseJタンパク質や死菌をそれぞれ単独で投与した場合には、全ての個体が死亡するか、または、生存率が非常に低かったことを考慮すれば、両者を組み合わせた本発明のワクチンによる効果は、驚くべき相乗効果であると言える。さらに、上記タンパク質や死菌を単独投与した場合には、個体が死亡する前から異常な症状が認められたが、それらの組み合わせに係る本発明のワクチンの投与では、このような異常な症状は認められなかった。この事実も、本発明のワクチンの優れた作用を裏付けるものである。
精製した組換えSseJタンパク質を検出した電気泳動写真である。 SseJタンパク質および死菌の組み合わせ（図中の「SseJ　&　HKB（ST）」）を免疫したマウスにおける、Salmonella　Typhimurium　x3306株の感染からの防御効果を示すグラフである。SseJタンパク質単独投与（図中の「SseJ」）および死菌単独投与（図中の「HKB（ST）」）の結果も併せて示した。対照としては、無処置の結果を示した。マウスは、1群で4匹使用した。 SseJタンパク質および死菌の組み合わせ（図中の「SseJ　&　HKB（SC）」）を免疫したマウスにおける、Salmonella　Choleraesuis　ATCC7001株の感染からの防御効果を示すグラフである。SseJタンパク質単独投与（図中の「SseJ」）および死菌単独投与（図中の「HKB（SC）」）の結果も併せて示した。対照としては、無処置の結果を示した。マウスは、1群で4匹使用した。 SseJタンパク質および死菌の組み合わせ（図中の「SseJ　&　HKB（SD）」）を免疫したマウスにおける、Salmonella　Dublin　5230株の感染からの防御効果を示すグラフである。SseJタンパク質単独投与（図中の「SseJ」）および死菌単独投与（図中の「HKB（SD）」）の結果も併せて示した。対照としては、無処置の結果を示した。マウスは、1群で4匹使用した。
　本発明は、サルモネラ属菌由来のSseJタンパク質とサルモネラ属菌の死菌との組み合わせを有効成分とする、サルモネラ症から生体を防御するためのワクチンを提供する。また、本発明は、当該ワクチンをサルモネラ属菌に感染する生体に投与する、サルモネラ症から生体を防御する方法を提供する。
　本発明における「サルモネラ症」とは、サルモネラ属菌により引き起こされる感染症を意味する。サルモネラ症を引き起こす「サルモネラ属菌」としては、例えば、Salmonella　enterica　subsp.　entericaに属するSalmonella　Typhimurium、Salmonella　Choleraesuis、Salmonella　Dublin、Salmonella　Enteritidis、Salmonella　Gallinarum、Salmonella　Pullorumが挙げられるが、これらに制限されない。本発明のワクチンの製造においては、2種以上のサルモネラ属菌を利用して多価のワクチンとすることも可能である。
　本発明のワクチンの有効成分の一つである「サルモネラ属菌由来のSseJタンパク質」は、サルモネラ属菌のSPI-2　III型分泌系を構成するタンパク質群の一つである。Salmonella　enterica　subsp.　entericaに属するサルモネラ属菌由来SseJタンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：２に、当該タンパク質をコードするDNAの典型的な塩基配列を配列番号：１に示す。基本的に、SseJタンパク質のアミノ酸配列は、Salmonella　enterica　subsp.において一致しているが、自然界においては、当該タンパク質のアミノ酸配列やその遺伝子の塩基配列に変異が生じうることは、理解されたい。また、「免疫原性断片」とは、SseJタンパク質の断片であって、生体内において免疫応答を誘導することができる断片を意味する。
　SseJタンパク質またはその免疫原性断片は、当技術分野で周知の方法により、組換えタンパク質または天然タンパク質として調製することができる。組換えタンパク質は、例えば、SseJタンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：1記載の塩基配列を含むDNA）または当該タンパク質の断片をコードするDNAを適切な発現ベクターに挿入し、このベクターを適切な宿主細胞に導入し、当該宿主細胞の抽出物または培養上清から精製することにより調製することができる。精製手段としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに制限されない。また、SseJタンパク質またはその断片を宿主細胞（例えば、大腸菌など）で、複数のヒスチジンが付加された組換えタンパク質として、またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として発現させる場合、発現された組換えタンパク質は、ニッケルカラムまたはグルタチオンカラムを用いて精製することができる。融合タンパク質の精製後に、トロンビンまたは第Xa因子で必要に応じて切断することにより、目的のタンパク質や断片以外の領域を除去することができる。天然のタンパク質は、当業者に公知の方法、例えば、SseJタンパク質に対する抗体が結合したアフィニティカラムに、サルモネラ属菌の抽出物または培養上清を接触させることにより、調製することができる。アフィニティーカラムに利用する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。
　本発明のワクチンにおいて、SseJタンパク質またはその免疫原性断片との組み合わせで利用されるサルモネラ属菌の「死菌」は、サルモネラ属菌を、例えば、加熱処理、化学消毒剤処理、放射線あるいは紫外線の照射、変異促進物質処理などにより調製することができる。死菌の調製においては、好適には、加熱処理または化学消毒剤であるホルマリンによる処理が用いられる。死菌は、異なるサルモネラ属菌の混合物（例えば、異なる種や異なる血清型のサルモネラ属菌の混合物）であってもよい。これにより感染防御可能なサルモネラ属菌の範囲を広げることが可能である。
　本発明のワクチンにおいて、サルモネラ属菌由来のSseJタンパク質とサルモネラ属菌の死菌との「組み合わせを含む」とは、本発明のワクチンが、サルモネラ属菌由来のSseJタンパク質とサルモネラ属菌の死菌の双方を有効成分として含む単剤の形態であっても、サルモネラ属菌から分泌されるタンパク質を有効成分として含む製剤とサルモネラ属菌の死菌を有効成分とする製剤との併用剤の形態であってもよいことを意味する。また、単剤の形態には、SseJタンパク質を発現させたサルモネラ属菌の死菌の形態が含まれる。
　本発明のワクチンにおいては、上記有効成分以外に、薬理学的に許容される担体を含むことができる。このような担体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤などが挙げられるが、これらに制限されない。上記有効成分は、投与方法や治療目的などに応じて、注射剤、エアロゾル剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などの各種形態とすることができる。
　また、本発明のワクチンにおいては、免疫応答を増強させるために、さらにアジュバントを添加することができる。アジュバントとしては、例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、オイルアジュバント、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、ビタミンEなどが挙げられるが、効果を発揮する限り特に制限はない。
　本発明のワクチンを投与する「生体」とは、生きた動物およびヒトの身体を意味する。動物としては、サルモネラ属菌が感染し得る動物であれば特に制限はなく、家畜であってもよく、愛玩動物（ペット）であっても、実験動物であっても、それ以外の用途の動物であってもよい。動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、カモ、ウズラ、キジ、ハト、七面鳥、ホロホロ鳥、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらに制限されない。
　本発明のワクチンは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、経口、鼻腔内を含む公知の投与経路で生体に投与し、生体に免疫を付与することができる。本発明のワクチン製剤が併用剤の場合には、各製剤は、同時に投与されてもよく、また、併用の効果を減殺しない範囲内で時間差をおいて投与されてもよい。
　本発明のワクチンの投与量は、生体における免疫応答を誘導し得る量であればよく、動物やヒトの年齢や体重、動物の種類、病原細菌の種類（例えば、病原性の高さの違いなど）、並びに、投与の方法や経路などにより変動し得る。有効成分たる分泌タンパク質の1回の投与量は、通常、0.05μg～1500μgであり、好ましくは5μg～500μgである。有効成分たる死菌の1回の投与量は、死菌数として、通常、103～1010であり、好ましくは106～109である。投与は、複数回に渡って行ってもよく、その場合の投与間隔は、通常、1～2週間である。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　［実施例１］SseJタンパク質の精製
　Salmonella　Typhimurium　x3306株のDNAを鋳型として、プライマー（フォワード:CACCATGCCATTGAGTGTTGGACA／配列番号：３、リバース:TTATTCAGTGGAATAATGATGAGCT／配列番号：４）を用いてPCRを行った。
　PCR産物をTOPOクローニング法を用いてクローニングし、その後、大腸菌内において組換えSseJタンパク質を高発現させた。プラスミドとしてはpET151/D-TOPO（N末側にHis　Tag(6x)）を使用した。
　5mLのLB培地（アンピシリン入り）にて前培養（静置培養）を一晩行い、その後、100mLのLB培地にて吸光度（600nm）0.3になるまで振盪培養後、IPTGを加え6時間培養した。培養後、菌体を回収し、超音波処理による菌体破砕を行った。その後、urea　lysisバッファーにて溶解し、ニッケルカラムにSseJタンパク質を吸着させ、イミダゾール溶出バッファーにて溶出した。
　これにより得られたSseJタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、その後、Coomassie　Brilliant　Blue染色を行った（図1）。
　［実施例２］マウスを用いたサルモネラ経口感染実験
　Salmonella　Typhimurium　x3306株、Salmonella　Choleraesuis　ATCC7001株、Salmonella　Dublin　5230株の死菌（105CFU）および精製した組換えSseJタンパク質（10μg）をインコンプリートアジュバントと共に、BACB/cマウス（メス5週令）の皮下に免疫し、約2週間後に再度免疫した。免疫後2週間後に、Salmonella　Typhimurium　x3306株、Salmonella　Choleraesuis　ATCC7001株、Salmonella　Dublin　5230株を、それぞれ106 CFU（LD50は104）、106 CFU（LD50は5x104）、106 CFU（LD50は5x104）経口感染させた。感染6時間前にマウスを絶食させ、その後10%重曹を50μl経口投与し、上記サルモネラ属菌をそれぞれ経口から感染させた。対照として、分泌タンパク質単独（10μg）、死菌単独（105CFU）、または無処置での検証も併せて行った。
　その結果、Salmonella　Typhimurium　x3306株をマウスに感染させた場合、無処置群は、感染後3日目から毛艶の悪化、5日目から元気消失が認められた。また、SseJタンパク質免疫群および死菌免疫群においても感染後5日目から毛艶の悪化、7日目から元気消失が認められた。無処置、SseJタンパク質投与群のマウスは感染後6日目から死亡し、感染後13日目までには全匹死亡した。死菌免疫群では、感染後14日目から死亡し、感染18日までに、75%のマウス死亡した。一方、SseJタンパク質と死菌との組み合わせを投与した群は、感染後30日目まで75%のマウスが生存した（図2A）。
　Salmonella　Choleraesuis　ATCC7001株またはSalmonella　Dublin　5230株をマウスに感染させた場合も同様に、SseJタンパク質と死菌との組み合わせを投与した群は、他の群と比較して有意な感染防御効果を示した（図2B、図2C）。
　以上の結果から、経口感染防御には、SseJタンパク質と死菌との組み合わせが極めて有効であることが判明した。
　なお、ワクチンとして用いたSseJタンパク質のアミノ酸配列は、Salmonella　enterica　subsp.　entericaに属するサルモネラ属菌に共通していることから、本発明のワクチンは、Salmonella　Typhimurium、Salmonella　Choleraesuis、およびSalmonella　Dublin以外にも、Salmonella　Enteritidis、Salmonella　Gallinarum、Salmonella　Pullorumなどへも適用でき、また、あらゆる血清型のサルモネラに対しても有効であると考えられる。
　感染防御効果の高いサルモネラ属菌ワクチンとしては、弱毒株ワクチンが知られているが、安全性などの問題から市販されていない。安全性の観点からは、死菌や特定のタンパク質を利用したワクチンが望ましい。SseJタンパク質と死菌との組み合わせを利用する本発明のワクチンは、安全性が高く、かつ、家畜などの動物やヒトに対するサルモネラ属菌の感染に対して優れた感染防御効果を発揮しうる。従って、本発明のワクチンは、特に、農業や医療の分野において利用可能である。
配列番号：３、４
・人工的に合成したプライマー配列

Claims (2)

  1. 　サルモネラ属菌由来のSseJタンパク質またはその免疫原性断片とサルモネラ属菌の死菌との組み合わせを含む、サルモネラ症から生体を防御するためのワクチン。
  2. 　請求項１に記載のワクチンをサルモネラ属菌に感染する生体に投与する、サルモネラ症から生体を防御する方法。
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GENG, SHIZHONG ET AL.: "Virulence determinants of Salmonella Gallinarum biovar Pullorum identified by PCR signature-tagged mutagenesis and the spiC mutant as a candidate live attenuated vaccine", VETERINARY MICROBIOLOGY, vol. 168, 2014, pages 388 - 394 *

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