CN102428099A

CN102428099A - 运载新城疫病毒的禽疫苗

Info

Publication number: CN102428099A
Application number: CN2010800221593A
Authority: CN
Inventors: M·巴布洛特; F·雷纳尔; F-X·勒格罗斯
Original assignee: Merial Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2010-04-02
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2030-04-02
Also published as: MX2011010406A; CN103585643A; MX347997B; US10350286B2; EP2998315B1; EP2998315A2; WO2010115133A8; CA2757030A1; CN102428099B; EP2414386B1; WO2010115133A2; EP2414386A2; DK2414386T3; JP2015232022A; WO2010115133A3; DK2998315T4; EP2998315B2; DK2998315T3; US20170224807A1; EP2998315A3

Abstract

本发明包括经加工的新城疫病毒(NDV)疫苗或组合物。疫苗或组合物可为重组疫苗。本发明也包括编码及表达禽病原体抗原，更特别禽流感蛋白，表位或免疫原的重组载体。该疫苗或组合物可用于保护动物，尤其是禽，免于疾病。

Description

运载新城疫病毒的禽疫苗

【援引加入】

本申请要求2009年4月3日提交的US临时申请系列No.61/166,481的权利。

【技术领域】

本发明包括运载NDV的禽疫苗或组合物，尤其是禽流感疫苗。疫苗可为经加工的禽疫苗。

【背景技术】

近年的几项研究点燃了新城疫病毒(NDV)用作禽疾病的疫苗载体的潜力(Krishnamurthy et al.，Virology 278，168-182，2000；Huanget al.，J.Gen.Virol.82，1729-1736，2001；Nakaya et al.，J.Virol.75，11868-11873，2001；Park et al.PNAS 103，8203-8208，2006；Veits et alPNAS 103，8197-8202，2006；Ge et al.J.Virol.81，150-158，2007；Romer-

et al.Vaccine 26，2307-2313，2008)。

NDV属于副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)和禽副粘病毒属(Avulavirus)。NDV在呼吸和消化道中，在输卵管中，及对于一些分离物，在神经系统中复制。传播是产气的，且通过口及粪便途径。NDV导致高度接触传染及致死的疾病，其影响全部物种的鸟，及可感染一些哺乳动物种。疾病可从临床不明显变化到高度强毒形式，依赖于病毒株和宿主物种。由NDV株显示的毒力的连续谱致使将它们分为3种不同致病型组：缓发型，中发型及速发型(Alexander，D.J.，Diseases of Poultry，Iowa State Uni.Press，Ames IA，541-569，1997)。缓发型株通常不在成年鸡中导致疾病，且在美国和其他国家在家禽工业中作为活疫苗广泛使用。中间毒力的病毒称之为中发型，而导致高死亡率的病毒称之为速发型。疾病具有世界性分布，且对商业家禽生产保持恒定的主要威胁。

NDV基因组是约15kb的RNA的非-分段的阴性链。基因组RNA含有编码依序以下蛋白的6个基因：核壳蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，血细胞凝集素-神经酰胺酶(HN)和大聚合酶蛋白(L)。P基因转录期间通过RNA编辑产生未知的功能的2种额外的蛋白，V和W(Steward et al.，1993，Journal of GeneralVirology 74：2539-2547)。

近年建立了自克隆的cDNA完全恢复非-分段的阴性RNA病毒的方法的开发，开启了遗传操作此病毒组，包括NDV的可能性(Conzelmann，K.K.，Ann.Rev.Genet.32，123-162，1998；Robertsand Rose，Virology 247，1-6，1998)。此独特分子遗传方法，称之为“反向遗传学”，提供不仅研究各种病毒-编码的基因的功能的手段(Paleseet al.，PNAS 93，11354-11358，1996；Nagai，Y.，Rev.Med.Virol.9，83-99，1999)，而且允许使用这些病毒来表达异源基因(Bukreyev etal.，J.Virol.70，6634-6641，1996；Mebatsion et al.，PNAS 93，7310-7314，1996；Schnell et al.，PNAS 93，11359-11365，1996；Hasanet al.，J.Gen.Virol.78，2813-2820，1997；He et al.，Virology 237，249-260，1997；Sakai et al.，FEBS Lett.45，221-226，1999)。此提供产生改善的疫苗和疫苗载体的新方法。

2个独立小组在1999年同时报道了基于NDV的缓发型疫苗株(LaSota)自克隆的cDNA恢复系统(Peeters et al.，1999；Romer-Oberdorfer et al.，1999)。在第1报道的系统中，将自LaSota株(ATCC-VR699)的全长NDV cDNA组装进含有T7DNA-依赖性-RNA聚合酶启动子的pOLTV5转录载体。将NDV转录酶复合物的个体克隆(NP，P和L)在真核表达载体中克隆。共转染流程在感染的单层细胞中产生了几个感染中心(Peeters et al.，J.Virol.73，5001-5009，1999)。第2系统报道了自克隆的cDNA的缓发型NDV的恢复，基本上使用组装全长反基因链表达质粒及支持质粒的相同的策略(Romer-Oberdorfer et al.，Journal of General Virology，80，2987-2995，1999)。最近开发其他系统来恢复NDV的缓发型HitchnerB1(Nakaya等人，2001)或LaSota株(Huang等人，2001)。可对于重组体中发型NDV的恢复有用的系统仅被Krishnamurthy等人描述(2000)。此系统利用痘苗病毒重组(MVA)和用于转染的HEP-2细胞。使用中发型株Beaudette C的全长克隆和自相同的株的支持质粒(N，P和L)用于转染。将编码CAT报告子基因的额外的转录单元放置在HN和L基因之间。表达CAT基因的rNDV的生长延迟及病毒衰减。CAT报告子基因在细胞培养中稳定地表达几代。

禽流感(AIV)，有时称之为禽流感(Avian flu)，且通常认识为鸟流感，指由适应于鸟的流感病毒导致的流感。AIV是分段的，单-链，负义RNA病毒，属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，及分类为A型流感病毒。A型病毒是动物和人流感的最频繁的病原。此类型在主要基于2种表面脂质-包裹的膜蛋白，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)分化的许多株或亚型中发生。HA，辅助病毒进入宿主细胞，及NA辅助后代病毒从感染的细胞释放(de Jong et al.，J Clin Virol.35(1)：2-13，2006)。A型病毒流感基于它们的特定HA和NA含量分为亚型。有16种不同HA亚型，及9种不同NA亚型。许多不同HA和NA蛋白的组合是可能的。流感A病毒亚型根据它们的HA和NA表面蛋白命名。例如，“H7N2病毒”指具有H7亚型的HA蛋白和自N2亚型的NA蛋白的流感A亚型。类似地，“H5N1”病毒具有H5亚型的HA和自N1亚型的NA。H5N1亚型特别相关于新近在亚洲，俄罗斯，中东，欧洲和非洲的暴发(Olsen et al.，Science21；312(5772)：384-8，2006)。

流感A病毒可感染人，猪，马，海豹，鲸，家禽，猫，狗，雪貂及其他动物，但野生鸟是它们的天然的宿主。水生鸟构成主要流感携带者，由此病毒系进化及适应它们的宿主，例如，人，猪及马流感。宿主特异性不是绝对的，且物种间传播可发生，如通过高度病原性禽流感(HPAI)H5N1亚型感染人，猫，狗和猪物种的能力例证。

高度病原性流感A病毒亚型H5N1病毒是全球关心的作为潜在流行病威胁的新出现的禽流感病毒。H5N1已经在越来越多的贯穿亚洲，欧洲和非洲的国家杀了几百万家禽。不像B型流感，A型流感经历抗原位移(至少2种不同株的病毒组合而形成新亚型)，且流行病学家，感染性疾病研究者，及其他健康专家急切关注，人流感病毒和禽流感病毒(尤其H5N1)的共-存在可提供遗传物质在物种-特异性病毒之间交换的机会，可能创建容易传染和对人致死的新强毒流感株(FoodSafety Research Information Office.″A Focus on Avian Influenza″.Created May 2006，Updated November 2007)。

由于在1997年发生首次H5N1暴发，已有越来越多的HPAI H5N1鸟-至-人传播导致临床严重的和致死的人感染。但是，因为有鸟和人之间存在的显著物种屏障，病毒不容易跨到人。尽管自其被发现，几百万的鸟已被所述病毒感染，在印度尼西亚，老挝，越南，罗马尼亚，中国，土耳其和俄罗斯总共仅约200人死于禽流感。

考虑到动物，包括人对AIV的的感受性，防止AIV感染及保护动物的手段是必要的。因此，有对抵抗流感的有效疫苗的需求。

本申请中任何文献的引用或鉴定不是认可该文献可作为本发明的现有技术。

【发明概述】

本发明部分基于申请人的发现，由新城疫病毒(NDV)的向肠AVINEW

株表达的AIV血凝素基因在禽中是高度免疫原性的。

本发明涉及运载NDV的禽疫苗或组合物，其可包含有效量的具有固有肠向性的经加工的NDV载体，其包含及表达某些禽抗原，更特别禽流感抗原，及药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质。向肠NDV可为由Merial Limited商业化的AVINEW修饰的活疫苗的NDV株。

禽流感抗原可为血凝素。禽流感HA抗原可为自H5亚型的HA。

本发明也涉及免疫接种禽的方法，包括给禽施用有效量的疫苗，其可包含有效量的重组NDV载体和药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质。施用可通过卵内，眼滴，喷雾，饮用水或肠胃外(皮下，肌内，经皮)施用。

本发明涉及修饰Avinew NDV的基因组来产生经加工的AvinewNDV的方法，其中方法包括在Avinew NDV基因组的非必要区内将分离的多核苷酸导入Avinew NDV基因组。非必要区可为编码非必要蛋白的开放阅读框或开放阅读框的非-必要的部分；或位于NP基因上游的非翻译(或非-编码)区，或2个基因(基因间区)之间，或自AvinewNDV基因组的L基因的下游。

本发明还涉及使用初施-追施流程施用疫苗或组合物。本发明涉及在施用可包含有效量的经加工的NDV载体和药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质的本发明的疫苗之前，用禽流感疫苗初施禽。或者，本发明还涉及在施用禽流感疫苗之前，用本发明的疫苗(表达至少一种禽流感抗原的经加工的NDV载体和药学或兽医学可接受的载体)初施。

本发明还包括实施引发或诱导免疫应答的方法的试剂盒，其可包含：任何一种重组流感免疫学组合物或疫苗，或灭活的免疫学组合物或疫苗，及用于实施方法的使用说明。

因此，本发明的目的是不在本发明之内包括任何之前知道的产品，制造产品的方法，或使用产品的方法，以至于申请人保留权益及由此公开放弃任何之前知道的产品，处理或方法。还应注意，本发明不旨在在本发明的范围之内包括不符合书面描述及启动USPTO(35U.S.C.§112，第1段落)或EPO(EPC的第83条)要求的任何产品，处理或产品的制造或使用产品的方法，以至于申请人保留权益及由此公开放弃任何之前描述的产品，制造产品的方法，或使用产品的方法。

这些和其他实施方式被以下详述公开或显而易见和含盖。

【附图说明】

以下详述，通过例的方式给出，但不旨在单独限制本发明到描述的特定实施方式，可通过附图最好理解，其中：

图1A描绘全长NDV基因组的遗传图谱；图1B描绘显示有流感HA插入到2个代表性转基因插入位点到全长NDV基因组的2种经加工的NDV的遗传图谱的图谱；图1C是NDV反向遗传学系统的流程图的例；图1D描绘使用NDV反向遗传学恢复经加工的NDV感染性粒子的方式。

图2描绘将AVINEW全基因组克隆到用于反向遗传学开发的转录质粒和允许容易转基因克隆的独特限制性位点(PacI&FseI)插入到P和M基因之间的示意图。

图3描绘质粒pIV029的质粒图谱。

图4a～4o提供质粒pIV0291的插入子序列。斜体字指非AVINEW序列，及加下划线的斜体字指P和M基因之间的内部PacI-FseI插入，斜体字指HDV核酶(3’端)及加下划线的斜体字指T7启动子(5’端)和终止子(3’端)。在图谱中指出转录开始序列(GS＝基因开始)和转录终止序列(GE＝基因结束)，及给序列加了下划线。环绕的T(图4c中的第3190位)指环绕的核苷酸(在PacI-FseI插入之前)：这是组装的AVINEW

基因组进转录载体的T(SEQ ID NO：24的第3190位)(T来自用于创建PacI和FseI限制性位点的引物)。在共有AVINEW

基因组(SEQ ID NO：1)中，在对应第3150位的核苷酸是C。

图5描绘质粒pIV32的质粒图谱。

图6描绘质粒pIV33的质粒图谱。

图7描绘质粒pIV034的质粒图谱。

图8描绘质粒pNS151的质粒图谱。

图9描绘将AIV HA基因经NDV插入盒导入NDV基因组的示意方法。

图10描绘质粒pIV039的质粒图谱。

图11A和11B描绘由经加工的NDV vAVW02的HA表达。将不含有插入子的vAVW01用作阴性对照。通过病毒-接种的含胚的蛋的尿囊液中(图11A中的左图)或自感染的CHO细胞裂解物(图11A的右图)的蛋白印迹或通过感染的CHO细胞中的免疫荧光(图11B)使用对感染的CHO细胞的抗-H5阳性鸡血清检测HA表达。

图12显示分配给DNA和蛋白序列的SEQ ID NO的表。

图13描绘免疫接种的SPF层的不同组的一日龄鸡后代中的抗-NDV和抗-AI(针对H5N1 Cl2或H5N9LP抗原)母源的抗体(MDA)HI滴度。

图14描绘评估SPF鸡中由经加工的NDV诱导的禽流感保护的疫苗接种/攻击时间线及流程。

图15显示在日龄用vAVW01(v01或01；无插入的基因)或vAVW03(v03或03；AI HA插入子)免疫接种的无MDA(SPF)或NDV MDA(21A)，或NDV和H5MDA或H5仅MDA(21B)鸡的死亡率的动力学表。

图16描绘自用vAVW01或vAVW03免疫接种的无(SPF)或有MDA的鸡中的口(&C)和泄殖腔(B&D)拭子的AIV脱落的比较。C和D中的结果表示为在不同时间点攻击之后，vAVW01-免疫的鸡的HPAI H5N1攻击脱落和vAVW03-免疫的鸡的那些的平均水平之间的以log10的比。

图17描绘疫苗接种(D21)之后和攻击(D35)之后对vAVW03-诱导的AIV HI滴度(使用H5N9(A)或H5N1分化体2.2(B)抗原)的NDV MDA效应(SPF：无MDA；NDV：抗-NDV MDA)。书写在图上的编号对应于测试的阳性血清/总和的编号。在NDV MDA存在下，相比无NDV MDA的SPF鸡中的结果，AIV HI滴度在疫苗接种之后更高且在攻击之后不增加。

图18描绘在无MDA(SPF)，AI H5N9和NDV MDA(H5N9+NDV)，NDV MDA(NDV)或AI H5N1(H5N1)MDA；NDV MDA的鸡中用vAVW01或vAVW03疫苗接种后(在D0)D21NDV HI滴度对由vAVW01或vAVW03诱导的NDV HI滴度水平不具有负面效应。

图19描绘在D0和D21用AVINEW(G1)，vAVW02(G2)和vAVW03(G3)2次疫苗接种后的NDV HI滴度。

图20描绘在D0和D21用vAVW02(G2)或vAVW03(G3)2次疫苗接种后的AI H5N1HI滴度。

图21描绘在D0和D21用vAVW02(G2)或vAVW03(G3)2次疫苗接种后的AI H5N1SN滴度。

图22A和22B分别描绘通过vAVW03的1次(在D0)或2次(在D0和D14)眼滴剂施用诱导的NDV HI滴度和AIV SN滴度。

图23A～23D描绘自未疫苗接种的(组1)或免疫接种的(组2：在D0，1次施用vAVW03；组3：在D0和D14 2次施用vAVW03；组4：在D0用vFP89和在D14用vAVW03初施-追施)在第28天用HPAIH5N1分离物攻击的俄国小鸭的口咽(A和C)和泄殖腔(B和D)拭子中的病毒载量(A和B)及阳性样品的百分率(C和D)的动力学。

图24A～24D描绘自未疫苗接种的(组1)或免疫接种的(组2：1次施用vAVW03在D0；组3：2次施用vAVW03在D0和D14；组4：在D0用vFP89和在D14用vAVW03初施-追施)在第42天用HPAIH5N1分离物攻击的俄国小鸭的口咽(A和C)和泄殖腔(B和D)拭子中的病毒载量(A和B)及阳性样品的百分率(C和D)的动力学。

图25提供在氨基酸水平禽流感HA蛋白和序列同一性百分率之间的序列比对。

图26提供在核酸水平禽流感HA蛋白和序列同一性百分率之间的序列比对。

【发明详述】

需知，在此公开中和特别在权利要求和/或段落中，术语例如“包括(comprises)”，“包括(comprised)”，“包括(comprising)”等可具有美国专利法中规定的含义；例如，它们可表示“包括(includes)”，“包括(included)”，“包括(including)”，等；及that术语例如“基本上由...组成(consisting essentially of)”和“基本上由...组成(consists essentially of)”具有美国专利法中规定的含义，例如，它们允许因素不明确地叙述，但排除见于现有技术或影响本发明的基本或新特征的因素。

除非另外解释，本文所用的全部技术和科学术语与本公开所属领域普通技术人员通常理解的具有相同的含义。除非背景明显另外指示，单数术语“a”，“an”和“the”包括复数个指示物。类似地，词汇“或”旨在包括“及”，除非背景明显另外指示。

在本发明中，将AVINEW疫苗株用作载体。AVINEW是世界上广泛使用的活NDV疫苗(Merial Limited)。此疫苗株①天然地无毒力及呈现双呼吸和肠向性。此外，AVINEW株属于可感染鸭的NDV基因组(II类，基因型I)。相比LaSota(其向性基本上针对呼吸道)，其不诱导呼吸性副反应。

本发明涉及可包含有效量的经加工的NDV载体和药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质的禽疫苗。

本发明包括任何表达在动物，例如禽中引发免疫原性应答的蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原的经加工的NDV载体。蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原可为流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原，例如但不限于在动物，例如禽中引发，诱导或刺激应答的蛋白，多肽，肽或其片段。

说道“动物”期望是哺乳动物，鸟，等。动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可选自马(例如，马)，狗(例如、狗、狼、狐、山狗、豺)，猫(例如，狮、虎、家养猫、野生猫、其他大猫、及其他猫包括猎豹和山猫)，绵羊(例如，绵羊)，牛(例如，牛)，猪(例如，猪)，禽(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和鹤鸵)，灵长类动物(例如，狐猴、跗猴、猴、长臂猿、猿)和鱼。术语“动物”也包括在全部发育阶段，包括胚胎和胚胎阶段的个体动物。

在一实施方式中，禽流感免疫学组合物或疫苗包含经加工的载体和药学或兽医学可接受的赋形剂，载体或媒质。经加工的载体可为可包含编码流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原的多核苷酸的NDV表达载体。流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原，可为血凝素，基质蛋白，神经氨酸酶，非结构性蛋白，核蛋白，聚合酶或其任何片段。

在另一实施方式中，流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原可源于经流感或禽流感株感染的禽。禽流感蛋白，抗原，表位或免疫原可为血凝素(HA)例如但不限于HA前体，H1，H2，H3，H4，H5，H6，H7，H8，H9，H10，H11，H12，H13，H14，H15或H16蛋白，基质蛋白(例如但不限于基质蛋白M1或M2)，神经氨酸酶(例如但不限于NA1，NA2，NA3，NA4，NA5，NA6，NA7，NA8或NA9)，非结构性(NS)蛋白(例如但不限于NS1或NS2)，核蛋白(NP)和聚合酶(例如但不限于PA聚合酶，PB1聚合酶1或PB2聚合酶2)。

禽流感抗原可为血凝素，例如H5HA。在一实施方式中，H5分离自H5N1A/火鸡/土耳其/1/2005(分化体2.2)，A/鸡/印度尼西亚/7/2003(分化体2.1)，A/鸭/老挝/3295/2006(分化体2.3)，A/鸡/西爪哇/PWT-WIJ/2006(分化体2.1)株。

在另一实施方式中，禽流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原可源于经源自任何亚型的新近分离物的流感或禽流感株感染的禽。

本文使用的术语“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特定免疫应答的物质。抗原可包含杀死的，衰减的或活的全生物；生物的亚单位或部分；含有表达有免疫原性性质的表位，多肽，肽，蛋白或其片段的插入子的重组载体；呈递给宿主动物后能诱导免疫应答的核酸的碎片或片段；蛋白，多肽，肽，表位，半抗原，或其任何组合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。

本文使用的术语“免疫原性蛋白或肽”也包括免疫学活跃的肽和多肽，意为一旦施用到宿主，其能引发针对蛋白的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选蛋白片段为其与总蛋白具有基本上相同的免疫学活性。由此，根据本发明的蛋白片段包含至少一个表位或抗原决定簇，或基本上由其组成或由其组成。术语表位，也称为抗原决定簇，是被免疫系统识别的及能诱导体液类型(B细胞)和/或细胞类型(T细胞)的免疫反应的大分子的部分。

术语“免疫原性蛋白或肽”还涵盖序列的缺失，添加和置换，只要多肽如本文定义发挥产生免疫学应答的功能。在这点上，特别优选的置换会通常是性质上保守的，即，在氨基酸家族内发生的那些置换。例如，氨基酸通常分为的4个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非-极性--丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及(4)不带电的极性--甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，胱氨酸，丝氨酸苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有时分类为芳族氨基酸。可合理预测，用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸，或反之；用谷氨酸单独取代天冬氨酸或反之；用丝氨酸单独取代苏氨酸或反之；或用结构上相关的氨基酸的氨基酸的类似保守性取代，不会对生物学活性具有主要效应。因此，与参照分子具有基本上相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白的免疫原性的少数氨基酸置换的蛋白在参照多肽的定义内。

术语表位是被免疫系统识别的及能诱导体液类型(B细胞)和/或细胞类型(T细胞)的免疫反应的大分子的部分。该术语也与″抗原决定簇″或″抗原决定簇位点″互换使用。认识相同的表位的抗体可在显示一种抗体阻断另一抗体与靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中鉴定。

对组合物或疫苗的″免疫学应答″是在宿主中发展的对目标组合物或疫苗的细胞和/或抗体-介导的免疫应答。通常，″免疫学应答″包括但不限于一种或更多以下效应：特别针对包括在目标组合物或疫苗中的抗原的抗体，B细胞，辅助性T细胞，和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主会展示治疗性或保护性免疫学应答，以至于对新感染的抗性会增强和/或疾病的临床严重性减小。该保护会展示为：由感染的宿主正常显示的症状的减小或缺乏，更快恢复时间和/或感染的宿主中降低的病毒滴度。

本文使用的术语″免疫原性″蛋白或多肽也指引发以上描述的免疫学应答的氨基酸序列。本文使用的″免疫原性″蛋白或多肽包括蛋白的全长序列，其类似物，或其免疫原性片段。说道″免疫原性片段″是指包括一种或更多表位，由此引发上述免疫学应答的蛋白的片段。该片段可使用本领域熟知的任意数的表位标位技术鉴定。见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66(Glenn E.Morris，Ed.，1996)。例如，线性表位可如下测定，例如，在固体支持物上同时合成大量肽，对应蛋白分子的部分的肽，及使肽与抗体反应而肽仍附接到支持物。该技术本领域已知及描述于，例如，U.S.专利No.4,708,871；Geysen等人，1984；Geysen等人，1986，全部通过引用整体并入本文。类似地，通过测定氨基酸的空间构象，例如通过，例如，x-射线晶体学和2维核磁共振容易鉴定构象表位。见，例如，Epitope Mapping Protocols，见上。尤其可应用于小泰勒虫(T.parva)蛋白的方法完全描述于PCT申请系列No。PCT/US2004/022605，通过引用整体并入本文。

合成抗原也包括在定义内，例如，多表位，侧接表位，及其他重组体或合成来源的抗原。见，例如，Bergmann等人，1993；Bergmann等人，1996；Suhrbier，1997；Gardner等人，1998。免疫原性片段，为本发明的目的，会通常包括分子的至少约3个氨基酸，优选至少约5个氨基酸，更优选至少约10～15个氨基酸，及最优选约15～25个氨基酸或更多氨基酸。片段长度无关键上限，其可包含蛋白序列的几乎全长，或甚至包含蛋白的至少一个表位的融合蛋白。

因此，表达表位的多核苷酸的最小结构是其包含编码流感蛋白或多聚蛋白的表位或抗原决定簇的核苷酸，或基本上由其组成或由其组成。编码总蛋白或多聚蛋白的片段的多核苷酸，更有利地，包含编码总蛋白或多聚蛋白的序列的最小15个核苷酸，有利地约30～45个核苷酸，及优选约45～75，至少57，87或150个连续或连续的核苷酸，或基本上由其组成或由其组成。表位确定方法，例如，产生重叠肽库(Hemmer等人，1998)，Pepscan(Geysen et al.，1984；Geysen et al.，1985；Van der Zee R.et al.，1989；Geysen，1990；Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot等人，1999)和在PCT申请系列No.PCT/US2004/022605，均通过引用并入本文，无需过度实验而可用于本发明的实践。也可谘询本文引用的及合并的其他文献有关测定免疫原或抗原的表位由此编码该表位的核酸分子的方法。

“多核苷酸”是含有以任何组合的脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和类似物的任何长度的核苷酸的聚合物形式。多核苷酸可具有3维结构，及可实施知道的或未知的任何功能。术语“多核苷酸”包括双-，单链和三-链化的螺旋分子。除非别有指定或需要，本文所述的发明的任何实施方式是包括双链形式和已知或预测组成DNA，RNA或杂交体分子的双链形式的各2个互补形式的多核苷酸。

术语“密码子优化”指最佳配置编码用于在选定的宿主表达/翻译的蛋白，多肽，抗原，表位，结构域或片段的核酸序列的过程。一般而言，基因表达水平依赖于许多因素，例如启动子序列和调控元件。最重要因素之一是将转录物基因的密码子利用适应到宿主的典型密码子利用(Lithwich，G.and Margalit，H.，Genome Res.13，2665-2673，2003)。因此，原核生物基因组中在翻译选择下高度表达的基因具有显著的密码子使用偏好。这是因为它们使用被最丰富的tRNA物种识别的小子集的密码子(Ikemura，T.，J.Mol.Biol.151，389-409，1981)。调节此密码子适应的力称为翻译选择，且其强度在快速-生长细菌中重要(Rocha，E.P.，Genome Res.14，2279-2286，2004；Sharp，P.M.et al.，Nucleic Acids Res.33，1141-1153)。如果基因含有宿主罕见使用的密码子，其表达水平不会最大。此可为异源蛋白表达(Gustafsson，C.etal.，Trends Biotechnol.22，346-353，2004)和DNA疫苗开发(Ivory，C.and Chadee，K.，Genet.Vaccines Ther.2，17，2004)的限制之一。已重新设计大量合成基因来增加它们的表达水平。合成基因数据库(SGDB)(Wu，G.et al.，Nucleic Acids Res.35，D76-D79，2007)含有自多于200个公布的对于合成基因的实验的信息。在会插入新宿主来以最佳量表达某些蛋白的核酸序列的设计过程中，密码子利用优化通常是第1步骤之一(Gustafsson，C.，Trends Biotechnol.22，346-353，2004)。密码子利用优化基本上涉及改变靶基因中的罕见密码子，从而无需修饰编码的蛋白的氨基酸序列而使它们更紧密反映宿主的密码子利用(Gustafsson，C.，Trends Biotechnol.22，346-353，2004)。通常用于优化处理的信息因此是待优化的DNA或蛋白序列及宿主的密码子利用表(参照组)。

有几个公共网页服务器和独立申请允许由本领域技术人员一些密码子优化。‘GeneDesign’(Richardson，S.M.et al.，Genome Res.16，550-556，2006)，‘Synthetic Gene Designer’(Wu，G.et al.，ProteinExpr.Purif.47，441-445，2006)和‘Gene Designer’(Villalobos，A.etal.，BMC Bioinformatics 7，285，2006)是提供用于合成基因设计，包括密码子优化步骤的平台的包装。有关可在各服务器或程序中得到的密码子利用优化的方法，开发的第1个程序仅使用‘一个氨基酸-一个密码子’方法。更新近程序和服务器现在还包括创建一些密码子利用变异性的方法。此变异性反映天然高度表达的基因的密码子利用变异性及致使在优化过程中导入额外的标准(例如限制性位点的回避)。本文所述的多数申请及网页服务器提供3种密码子优化方法：全部密码子的完全优化，使用Monte Carlo方法的基于参照组的相对密码子利用频度的优化，和设计为用查询及优化的序列之间的最小变化最大化优化的新方法。在本文中的一实施方式中，编码NDV的蛋白补体的序列是用于在禽细胞中表达而优化的密码子，在优选的实施方式中，编码NDV P，L和NP的核酸序列是用于在禽细胞中表达而优化的密码子。在再一实施方式中，编码重组蛋白，抗原，肽，多肽，片段，结构域或表位的核酸序列是用于在禽中表达优化的密码子。在另一实施方式中，密码子优化的序列编码用于禽表达的AIV蛋白，抗原，肽，多肽，片段，结构域或表位。在再一实施方式中，密码子优化的序列编码用于禽表达的AIV HA和/或N蛋白，抗原，肽，多肽，片段，结构域或表位。

以下是多核苷酸的非限制性例：基因或基因片段，外显子，内含子，mRNA，tRNA，rRNA，siRNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分支的多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，尿嘧啶，其他糖和连接基，例如氟核糖和硫醇盐，及核苷酸分支。核苷酸序列可还在聚合之后修饰，例如通过与标记组分缀合。包括在此定义中的其他类型的修饰是加帽，一个或更多天然存在的核苷酸用类似物置换，及多核苷酸附接到蛋白，金属离子，标签组分，其他多核苷酸或固体支持物的手段的导入。多核苷酸可通过化学合成得到或源自微生物。

本发明还包括编码流感蛋白，抗原，表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可为聚合物及任何长度，及可含有以任何组合的脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和类似物。

术语“蛋白”，“肽”，“多肽”和“多肽片段”在本文使用互换来指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可为线性或分支的，其可包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，及其可由非氨基酸的化学部分打断。术语也包括已天然地或通过干扰修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成，糖基化，脂质化，乙酰化，磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标签或生物活性组分缀合。

“分离的”多核苷酸或多肽是基本上无在其天然环境中与其相联的物质的多核苷酸或多肽。基本上无，是指至少50％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％无这些物质。

杂交反应可在不同“严格度”条件下进行。熟知增加杂交反应的严格度的条件。见例如，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第2版(Sambrook等人，1989)。关联条件的例包括(为了增加严格度)：25℃，37℃，50℃和68℃的温育温度；10×SSC，6×SSC，1×SSC，0.1×SSC的缓冲液浓度(其中SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)和使用其他缓冲液系统的它们的相当体；0％，25％，50％和75％的甲酰胺浓度；温育时间自5分钟到24小时；1，2或更多次洗涤步骤；1，2或15分钟的洗涤温育时间；及6×SSC，1×SSC，0.1×SSC或去离子水的洗涤溶液。

本发明还包括编码流感多肽的功能性地相当的变体和衍生物和可增强，降低或不显著影响由此编码的多肽的固有性质的功能性地相当体片段的多核苷酸。这些功能性地相当的变体，衍生物和片段显示保留流感活性的能力。例如，不改变编码的氨基酸序列的DNA序列的变化，以及导致氨基酸残基的保守性置换，一个或更少氨基酸缺失或添加，及氨基酸残基被氨基酸类似物置换的那些是不会显著影响编码的多肽的性质的那些。保守性氨基酸置换是甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸/甲硫氨酸；赖氨酸/精氨酸；及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。在一实施方式中，变体与目标流感多核苷酸或多肽具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同源性或同一性。

一方面，本发明提供流感多肽，特别禽流感多肽。在另一方面，本发明提供具有SEQ ID NO：15，17，19，21或23所示的序列的多肽，及其变体或片段。

在另一方面，本发明提供多肽与本发明的禽HA多肽，特别与具有SEQ ID NO：15，17，19，21或23所示的序列的多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性。

在再一方面，本发明提供以上鉴定的流感多肽的片段和变体(SEQID NO：15，17，19，21和23)，其可由本领域技术人员使用良好-知道的分子生物学技术容易制备。

变体是具有与本发明的抗原性多肽，特别与SEQ ID NO：15，17，19，21或23所示的氨基酸序列具有至少约75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列的同源多肽。

流感多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO：2，4，5，8，10，12或14所示的序列的流感多肽的至少8，10，15或20个连续氨基酸，至少21个氨基酸，至少23个氨基酸，至少25个氨基酸，或至少30个氨基酸，或其变体。在另一实施方式中，流感多肽的片段包括见于全长流感多肽的特定抗原性表位。

在另一方面，本发明提供编码流感HA多肽的多核苷酸，例如编码具有SEQ ID NO：15，17，19，21或23所示的序列的多肽的多核苷酸。在再一方面，本发明提供编码与具有SEQ ID NO：15，17，19，21或23所示的序列的多肽，或保守性变体，等位基因变体，同源物或包含这些多肽之一的至少8或至少10连续氨基酸的免疫原性片段，或这些多肽的组合具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的多肽的多核苷酸。编码流感HA多肽的多核苷酸可经密码子-优化用于在特定动物种中表达。HA蛋白可在自高度病原性禽流感序列(多碱性氨基酸：RERRRKKR-SEQ ID NO：25)到低病原性禽流感序列(RETR-SEQ ID NO：26)的切割位点修饰。

在另一方面，本发明提供具有如SEQ ID NO：14，16，18，21，22所示的核苷酸序列，或其变体的多核苷酸。在再一方面，本发明提供与具有SEQ ID NO：14，16，18，21，22所示的序列的多核苷酸之一，或其变体具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的多核苷酸。

为本发明的目的，通过当比对以最大化重叠及同一性而最小化序列间隔时比较序列来测定序列同一性或同源性。尤其是，序列同一性可使用许多数学算法之任何测定。用于比较2个序列的数学算法的非限制性例是如在Karlin等人，1993中修饰的Karlin等人，1990的算法。

用于序列比较的数学算法的另一例是Myers等人，1988的算法。该算法合并入ALIGN程序(2.0版)，其为GCG序列比对软件包装的部分。当利用用于比较氨基酸序列的ALIGN程序时，可使用PAM120加权残基表，12的间隔长度罚分，及4的间隔罚分。用于鉴定局部序列相似性区和比对的再一有用的算法是描述于Pearson等人，1988的FASTA算法。

一般而言，氨基酸序列的比较通过将已知的结构的多肽的氨基酸序列与未知结构的多肽的氨基酸序列比对来实现。然后比较序列中的氨基酸及同源的氨基酸组分在一组。此方法检测多肽的保守的区及解释氨基酸插入和缺失。氨基酸序列之间的同源性可通过使用可商购的算法(也见以上同源性描述)测定。除了本文另外提及的那些之外，提及由美国生物技术信息中心提供的程序BLAST，空位BLAST，BLASTN，BLASTP和PSI-BLAST。这些程序在本领域中为此目的广泛使用，和可比对2个氨基酸序列的同源区。

套件中的全部搜索程序，空位比对常规整合到数据库搜索本身。如果需要，空位可关闭。长度1的间隔的默认罚分(Q)，对于蛋白和BLASTP是Q＝9，及对于BLASTN是Q＝10，但可在任何整数中变化。对于延伸间隔(R)的默认每-残基罚分，对于蛋白和BLASTP是R＝2，及对于BLASTN是R＝10，但可在任何整数中变化。可使用Q和R的值的任何组合以便比对序列，以最大化重叠及同一性而最小化序列间隔。默认氨基酸比较矩阵是BLOSUM62，但可利用其他氨基酸比较矩阵例如PAM。

替代性地或额外地，术语“同源性”或“同一性”，例如，有关核苷酸或氨基酸序列，可指2个序列之间的同源性的定量测量。百分率序列同一性可计算为(N_ref-N_dif)*100/N_ref，其中N_dif是当比对时2个序列中非-同一残基的总数，且其中N_ref是序列之一中的残基数。因此，DNA序列AGTCAGTC会与序列AATCAATC(N_ref＝8；N_dif＝2)具有75％的序列同一性。

替代性地或额外地，“同源性”或“同一性”有关序列可指具有同一核苷酸或氨基酸的位置数除以2个序列中较短者的核苷酸或氨基酸数，其中2个序列的比对可根据Wilbur和Lipman算法测定(Wilbur等人，1983，通过引用并入本文)，例如，使用20个核苷酸的窗口大小，4个核苷酸的字长，及4的间隔罚分，及包括比对的序列数据的计算机-辅助的分析和解析可使用可商购的程序(例如，Vector NTI软件TM，Invitrogen Inc.CA，USA)便利地进行。当说到RNA序列类似，或与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性，DNA序列中的胸苷(T)认为是等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。由此，RNA序列在本发明的范围内，且可源于DNA序列，通过DNA序列中的胸苷(T)认为是等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。

并且，无需过度实验，本领域技术人员可借助许多其他程序或参照用于测定百分率同源性。

本发明还包括含有在载体分子或表达载体内和运作性连接到启动子元件和任选地连接到增强子的流感多核苷酸。

“载体”指包含待体外或体内递送到靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒，噬菌体或病毒。异源多核苷酸可包含预防或治疗目的的目标序列，及可任选地以表达盒形式。如本文使用，载体不需能在最后靶细胞或受试者中复制。术语包括用于克隆的载体以及病毒载体。

术语“经加工的”或“重组的”是指不天然存在或以不见于天然的排列连接到另一多核苷酸的半合成，或合成起源的多核苷酸。

“异源”是指源于自相比较的其余实体遗传不同的实体。例如，多核苷酸可通过遗传加工技术合并到源自不同来源的质粒或载体，且由此是异源多核苷酸。自其天然编码序列移出的且运作性连接到非天然序列的编码序列的启动子是异源启动子。

本发明的多核苷酸可在相同的转录单元内包含附加序列，例如额外的编码序列，控制元件例如启动子，核糖体结合位点，5’UTR，3’UTR，转录终止子，多聚腺苷酸化位点，在相同的或不同启动子控制下的额外的转录单元，允许克隆，表达，同源重组，及宿主细胞转化的序列，及可期望提供本发明的实施方式的任何该构建体。

本发明的载体中有利地存在用于表达流感多肽，抗原，表位或免疫原的元件。以最小方式，此包含起始密码子(ATG)，终止密码子和启动子，及任选地用于某些载体的多聚腺苷酸化序列，例如质粒和某些病毒载体，例如，非痘病毒的病毒载体，基本上由其组成或由其组成。当多核苷酸有利地，在载体中编码多聚蛋白片段，例如流感肽时，ATG放置在阅读框的5′处，和终止密码子放置在3′处。可存在用于控制表达的其他元件，例如增强子序列，稳定化序列，例如内含子及或未翻译的5‘或3‘序列和允许蛋白分泌的信号序列。

制造和/或施用用于体内或体外表达本发明的基因的基因产物的载体或重组体或质粒的方法可为任何期望的方法，例如，方法是通过或类似于公开于下列文献，或公开于下列文献中引用的文献的方法：美国专利No.4,603,112；4,769,330；4,394,448；4,722,848；4,745,051；4,769,331；4,945,050；5,494,807；5,514,375；5,744,140；5,744,141；5,756,103；5,762,938；5,766,599；5,990,091；5,174,993；5,505,941；5,338,683；5,494,807；5,591,639；5,589,466；5,677,178；5,591,439；5,552,143；5,580,859；6,130,066；6,004,777；6,130,066；6,497,883；6,464,984；6,451,770；6,391,314；6,387,376；6,376,473；6,368,603；6,348,196；6,306,400；6,228,846；6,221,362；6,217,883；6,207,166；6,207,165；6,159,477；6,153,199；6,090,393；6,074,649；6,045,803；6,033,670；6,485,729；6,103,526；6,224,882；6,312,682；6,348,450；6,312,683，及6,596,279；1986年10月16日提交的美国专利申请系列No.920,197；WO 90/01543；W091/11525；WO 94/16716；WO 96/39491；WO 98/33510；EP 265785；EP 0 370 573；Andreansky等人，1996；Ballay等人，1993；Felgner等人，1994；Frolov等人，1996；Graham，1990；Grunhaus等人，1992；Ju等人，1998；Kitson等人，1991；McClements等人，1996；Moss，1996；Paoletti，1996；Pennock等人，1984；Richardson(Ed)，1995；Smith等人，1983；Robertson等人，1996；Robinson等人，1997；及Roizman，1996。本文引用的及通过引用文献并入本文的，除了提供本发明的实践中有用的载体的例之外，也可提供用于待由在本发明的组合物中或在本发明的组合物中包括的载体表达的非-流感肽或其片段的源。

本发明也涉及包含载体，例如表达载体的制备物，例如，预防剂或治疗组合物。制备物可包含一种或更多包含一种或更多流感多肽，抗原，表位或免疫原，基本上由其组成或由其组成(及有利地表达)的载体，例如，表达载体，例如体内表达载体，基本上由其组成或由其组成。载体在药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质中含有及表达包含编码(及有利地表达)流感抗原，表位或免疫原的多核苷酸，基本上由其组成或由其组成的多核苷酸。由此，根据本发明的实施方式，制备物中的其他载体包含编码，及在适当的环境下，载体表达一种或更多流感多肽，抗原，表位或免疫原(例如，血凝素，神经氨酸酶，核蛋白)或其片段的其他蛋白的多核苷酸，或基本上由其组成或由其组成，。

根据另一实施方式，制备物中的载体包含编码流感多肽，抗原，表位或免疫原的一种或其更多蛋白或片段的多核苷酸，表达多核苷酸的载体，或基本上由其组成或由其组成。本发明的制备物包含至少2种包含自编码相同的蛋白和/或不同蛋白的不同流感分离物的多核苷酸，基本上由其组成或由其组成，及有利地在适当的条件或适合的条件下或在适合的宿主细胞中体内表达的载体，基本上由其组成或由其组成。制备物含有一种或更多载体包含流感多肽，抗原，融合蛋白或其表位，基本上由其组成或由其组成多核苷酸编码，及有利地体内表达。本发明也针对载体混合物，其含有，基本上由其组成或由其组成，编码，及表达，不同流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原，例如，自不同物种例如但不限于人，马，猪，海豹，鲸，除了包括鸡，火鸡，鸭和鹅的禽物种之外的流感多肽，抗原，表位或免疫原。

术语质粒覆盖任何DNA转录单元，其包含：根据本发明的多核苷酸和在期望的宿主或靶细胞内体内表达必需的元件；及，在这点上，需知，超螺旋的质粒和全部其拓扑异构体，开环质粒，以及质粒的线性形式，旨在在本发明的范围内。

各质粒包含或含有或基本上由其组成，除了编码重组蛋白，抗原，表位或免疫原的异源多核苷酸之外，任选地与编码异源肽序列，变体，类似物或片段的多核苷酸融合，运作性连接到启动子或在启动子控制下或依赖于启动子。一般而言，有利地采用在真核细胞中发挥功能的强启动子。优选的强启动子是人或鼠起源，或任选地具有另一起源例如大鼠或豚鼠的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)。CMV-IE启动子可包含实际启动子段，其可或可不相联于增强子段。可参考EP-A-260 148，EP-A-323 597，美国专利No.5,168,062，5,385,839和4,968,615，以及参考PCT申请No WO87/03905。CMV-IE启动子有利地是人CMV-IE(Boshart等人，1985)或鼠CMV-IE。

在更通常情况下，启动子是病毒或细胞起源的。可在本发明的实践中有用地采用的非CMV-IE的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期启动子或Rous肉瘤病毒的LTR启动子。在本发明的实践中有用地采用的强细胞启动子可为细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动子(Kwissa等人，2000)，或肌动蛋白启动子(Miyazaki等人，1989)。

这些启动子的功能亚片段，即，维持充足的启动活性的这些启动子的部分，包括在本发明内，例如根据PCT申请No.WO98/00166或美国专利No.6,156,567的截短的CMV-IE启动子可用于本发明的实践。在本发明的实践中启动子随之包括维持充足的启动活性和因此发挥启动子的作用，优选基本上类似于衍生出衍生物或亚片段的实际或全长启动子的启动活性，例如，类似于美国专利No.6,156,567的截短的CMV-IE启动子的活性，类似于全长CMV-IE启动子的活性的全长启动子的衍生物及亚片段。由此，在本发明的实践中CMV-IE启动子可包含全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分，以及衍生物及亚片段，或基本上由其组成或由其组成。

优选地，质粒包含其他表达控制元件，或基本上由其组成。特别有利地合并稳定化序列，例如，内含子序列，优选hCMV-IE的第1内含子(PCT申请No.WO89/01036)，兔β-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人，1979)。

作为质粒和非痘病毒的病毒载体的多聚腺苷酸化信号(多聚A)，可利用牛生长激素(bGH)基因的聚(A)信号(见美国专利No.5,122,458)，或兔β-珠蛋白基因的聚(A)信号或SV40病毒的聚(A)信号。

根据本发明的另一实施方式，表达载体是用于在适当的细胞系统中体外表达蛋白的表达载体。表达的蛋白可在分泌之后或非在分泌之后(如果无分泌，细胞裂解一般发生或进行)在培养上清中或自培养上清收获，任选地通过浓缩方法例如超滤浓缩和/或通过纯化手段，例如亲和性，离子交换或凝胶过滤-类型层析方法纯化。

“宿主细胞”表示已遗传改变的，或能通过施用外源多核苷酸，例如重组质粒或载体遗传改变的原核生物或真核细胞。当指遗传改变的细胞时，术语兼指原本改变的细胞和其后代。有利的宿主细胞包括，但不限于，幼仑鼠肾(BHK)细胞，结肠癌(Caco-2)细胞，COS7细胞，MCF-7细胞，MCF-10A细胞，Madin-Darby狗肾(MDCK)系，貂肺(Mv1Lu)细胞，MRC-5细胞，U937细胞和VERO细胞。包含期望的序列的多核苷酸可插入适合的克隆或表达载体，及载体，进而可导入用于复制和扩增的适合的宿主细胞。可通过任何本领域知道的手段将多核苷酸导入宿主细胞。可通过许多适当的手段之任何将含有目标多核苷酸的载体导入宿主细胞，包括直接摄取，胞吞，转染，f-交配，电穿孔，采用氯化钙，氯化铷，磷酸钙，DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微投射物轰击；脂转染；及感染(其中载体是感染性的，例如，反转录病毒载体)。引导载体或多核苷酸的选择会常常依赖于宿主细胞的特征。

在本发明的一实施方式中，载体是新城疫病毒(NDV)载体。也称之为禽副粘病毒1的新城疫病毒(APMV1，副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)，禽副粘病毒属(Avulavirus))是禽病原体，其天然存在的株呈现广范围的疾病严重性。NDV作为用于兽医学使用的疫苗载体特别有利，因为载体本身作为需要的家禽疫苗。NDV株致病型是无症状肠性(例如Ulster2C，Queensland V4)，缓发型(例如，Hitchner B1，F(例如，Asplin)，La Sota)，中发型(例如，株H，Mukteswar，Roakin，Beaudette C)或速发型(例如，Texas GB，NY parrot 70181，Italien，Milano，Herts33/56)的。基于NDV载体的禽流感载体疫苗的优势包括，但不限于，(1)诱导广免疫，包括体液，细胞和粘膜应答(2)不表达NP和M蛋白，由此与DIVA(区分自免疫接种的动物感染的)策略相容，(3)诱导免疫的快速发作，(4)二价，和(5)产生位置相比意外释放中灭活的疫苗对环境风险更少。

NDV的某些特征提示，表达外源病毒蛋白的重组NDV(rNDV)或经加工的NDV会是非常良好的疫苗候选体。NDV在许多细胞系和蛋中生长到非常高滴度，及其引发强体液和细胞免疫应答体内。NDV天然地感染经呼吸道和食道粘膜表面，因此，递送呼吸性疾病病原体，例如AIV的保护性抗原尤其有用。此外，在美国和多数其他国家广泛使用可商购的活NDV疫苗。基于活NDV重组体的疫苗也可相比其他活重组疫苗载体具有优势。首先，外源蛋白随仅少量NDV蛋白表达。相反，痘和疱疹病毒载体自它们的大-尺寸基因组表达大量的额外的蛋白。对于疫苗应用中特定免疫应答的产生，可有利地使仅有限数量的蛋白表达。第2，NDV无DNA期地在感染的细胞的细胞质中复制，其消除病毒基因组整合到宿主细胞DNA的问题。病毒不经历可检测的遗传重组。

反向遗传学的另一应用是开发如本文所述的更有效和更佳NDV疫苗。当前NDV疫苗利用天然存在的缓发型株，例如Hitchner B1和LaSota。如其他活衰减的疫苗所面对的，当前NDV疫苗仍可由于毒力逆转而导致疾病。NDV疫苗株作为载体的选择是重要的，由于以Hitchner B1NDV株报道的首次数据是令人失望的。其后，以LaSotaNDV株获得的数据是鼓舞人心，且基于此株的疫苗候选体现场用于中国和墨西哥。

本发明描述了申请人利用NDV AVINEW疫苗株作为用于将源于重组体的抗原递送到禽的载体。更特别抗原可为禽流感病毒(AIV)抗原。AVINEW是全世界使用的由Merial Ltd.开发的活NDV疫苗。此疫苗株天然地无毒力，且呈现双呼吸和肠向性。禽中的趋异向性可给重组NDV(rNDV)或经加工的NDV疫苗提供独特生物学特征，其利用AVINEW

主链用于在禽中基因递送，有关自母源抗体(MDA)到NDV本身的干涉。该对MDA的抗性可允许可固有地具有显著水平的NDV-特异性MDA和另外反抗更常规重组NDV免疫的商业和野生型禽的活跃的免疫。

此外，AVINEW

株属于可感染鸭的NDV基因组或类型(2类，基因型I)。相比LaSota(其向性基本上针对呼吸道)，AVINEW

株不诱导呼吸性副反应。

在一实施方式中，NDV载体是NDV AVINEW

。NDV载体也可为美国专利No.5,118,502的载体，尤其是作为ATCC No.VR 2239保藏的株。

本发明的一实施方式提供AVINEW的基因组DNA序列及编码的蛋白序列。AVINEW NDV株的基因组DNA序列具有SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列。AVINEW基因组cDNA序列(SEQ ID NO：1)不同于VG/GA序列(GenBank登录No.EU289028)。AVINEW(SEQID NO：1)和VG/GA(EU289028)基因组序列之间的序列同一性是89.6％。Avinew株和VG/GA株的蛋白之间的氨基酸序列同一性是：对于NP蛋白(Avinew的SEQ ID NO：3和GenBank No.ABZ80386)是95.9％，对于P蛋白(Avinew v.的SEQ ID NO：5 GenBankABZ80387)是89.7％，对于M蛋白(Avinew v.的SEQ ID NO：7GenBank No.ABZ80388)是94.2％，对于F蛋白(Avinew v.的SEQID NO：9GenBank No.ABZ80389)是92.4％，对于HN蛋白(Avinewv.的SEQ ID NO：11 GenBank No.ABZ80390)是88.1％，及对于L蛋白(Avinew v.的SEQ ID NO：13 GenBank No.ABZ80391)是96.9％。Avinew株及VG/GA株的基因之间的核酸序列同一性是：对于NP基因(Avinew v.的SEQ ID NO：2EU289028的122～1591bp)是90.6％，对于P基因(Avinew v.的SEQ ID NO：4EU289028的1887～3074bp)是88.6％，对于M基因(Avinew v.的SEQ ID NO：6EU289028的3290～4384bp)是90.1％，对于F基因(Avinew v.的SEQ ID NO：8EU289028的4544～6205bp)是90.0％，对于HN基因(Avinew v.的SEQ ID NO：10EU289028的6412～8145bp)是84.7％，及对于L基因(Avinew v.的SEQ ID NO：12EU289028的8381～14995bp)是90.9％。完全基因组和个体基因序列与其他可得到的NDV参照序列的比较显示，AVINEW NDV株与澳大利亚缓发型株98-1154和Queensland V4遗传紧密相关。NDV 98-1154全基因组序列示于GenBank AY935491。ANIVEW(SEQ ID NO：1)和AY935491基因组序列之间的序列同一性是98.8％。Avinew株和VG/GA株的蛋白之间的氨基酸序列同一性是：对于NP蛋白(Avinewv.的SEQ ID NO：3 GenBank No.AAX45376)是99.8％，对于P蛋白(Avinew v.的SEQ ID NO：5 GenBank No.AAX45377)是97.7％，对于M蛋白(Avinew v.的SEQ ID NO：7 GenBank No.AAX45378)是98.4％，对于F蛋白(Avinew v.的SEQ ID NO：9 GenBank No.AAX45379)是98.7％，对于HN蛋白(Avinew v.的SEQ ID NO：11GenBank No.AAX45380)是92.4％，及对于L蛋白(Avinew v.的SEQ ID NO：13 GenBank No.AAX45381)是99.5％。Avinew株及VG/GA株的基因之间的核酸序列同一性是：对于NP基因(Avinew v.的SEQ ID NO：2AY935491的122～1591bp)是99.0％，对于P基因(Avinew v.的SEQ ID NO：4AY935491的1887～3074bp)是98.2％，对于M基因(Avinew v.的SEQ ID NO：6AY935491的3290～4384bp)是98.6％，对于F基因(Avinew v.的SEQ ID NO：8AY935491的4544～6205bp)是98.8％，对于HN基因(Avinew v.的SEQ ID NO：10AY935491的6412～8154bp)是93.1％，及对于L基因(Avinew v.的SEQ ID NO：12AY935491的8381～14995bp)是98.8％。对于Queensland V4，仅部分序列可在GenBank得到。

在另一实施方式中，本发明提供具有SEQ ID NO：1，2，4，6，8，10，12或24所示的序列，及其变体或片段的多核苷酸。本发明还包括与本文所述的多核苷酸的互补链。在再一实施方式中，本发明提供具有SEQ ID NO：3，5，7，9，11或13所示的序列的多肽，及其变体或片段。

在另一方面，本发明提供具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：24所示的序列的AVINEW的基因组cDNA。在再一实施方式中，多核苷酸是具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：24所示的序列的多核苷酸的反向互补链。在再一实施方式中，本发明的多核苷酸或多核苷酸的反向互补链与具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：24所示的序列的多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性。

在一实施方式中，本发明提供编码AVINEW多肽的多核苷酸的片段，例如编码具有SEQ ID NO：3，5，7，9，11或13所示的序列的多肽的多核苷酸。在再一方面，本发明提供编码与具有SEQ ID NO：3，5，7，9，11或13所示的序列的多肽，或保守性变体，等位基因变体，同源物或包含这些多肽之一的至少8或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段，或这些多肽的组合具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的多肽的多核苷酸。

在另一方面，本发明提供具有SEQ ID NO：1，2，4，6，8，10，12或24所示的核苷酸序列的多核苷酸，或其变体。在再一实施方式中，多核苷酸是具有SEQ ID NO：1，2，4，6，8，10，12或24所示的序列的多核苷酸的反向互补链。在再一方面，本发明提供与具有SEQ ID NO：1，2，4，6，8，10，12或24所示的序列的多核苷酸之一，或其变体具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的多核苷酸或多核苷酸的反向互补链。

一方面，本发明涉及用于在用疫苗或组合物接种的宿主动物中诱导免疫学应答的药物组合物或疫苗，组合物包括药物可接受的载体和修饰的AVINEW重组病毒。在本发明的再一方面，经加工的AVINEW病毒，在病毒基因组的非必要区内，包括编码源自病原体的抗原性蛋白的异源DNA序列，其中当疫苗施用给宿主时，能诱导特异于由病原体编码的蛋白的免疫学应答。

术语“非必要区”指对于病毒在组织培养中的复制和繁殖不是必要的及其缺失或灭活可减少在各种动物系统中的毒力的病毒基因组区。任何非必要区或其部分可自AVINEW基因组缺失或外源序列可插入其中，及由缺失或插入所致的经加工的AVINEW的活力和稳定性可用于确定是否删除的区或其部分的确非必要。在另一实施方式中，AVINEW基因组的非必要区是AVINEW基因组的P基因和M基因之间的区，或M基因和F基因之间的区。在再一实施方式中，非必要区可在SEQ ID NO：1的第3075～第3289核苷酸或第4385～第4543核苷酸，SEQ ID NO：24的第3115～第3353核苷酸或第4449～第4607核苷酸的区内。

本发明的一方面涉及表达禽抗原的NDV载体。抗原可为禽流感抗原。禽流感抗原可为血凝素，例如H5HA。

本发明也涵盖表达禽流感基因的NDV载体，例如：兼有自HPAIV野生鸟分离物的野生型及突变的HA开放阅读框(ORF)，A/斑头雁/青海/3/2005(H5N1)插入到LaSota NDV疫苗株的P和M基因之间的基因间区的表达H5亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)的NDV的构建体(例如，Ge et al.，Journal of Virology，Jan.2007，vol.81，no.1，pp.105-158)，以登录号No.AF375823提交到GenBank的表达流感病毒的新城疫病毒(NDV)疫苗株Hitchner B1的完全cDNA克隆(见，例如，Nakaya et al.，Journal of Virology，Dec.2001，pp.11868-11873)，表达HPAIV A/鸡/越南/P41/05(H5N1)的H5蛋白的NDV重组体(NDVH5Vm)(见，例如，

et al.，Vaccine.2008 May2；26(19)：2307-13.Epub 2008 Mar 18)，使用有自禽流感病毒(AIV)A/鸡/NY/13142-5/94(H7N2)的血凝素(HA)基因插入的缓发型副粘病毒1型载体(NDV B1株)构建的rNDV-AIV-H7(见，例如，Swayneet al.，Avian Diseases 47：1047-1050，2003)，通过反向遗传学构建的亚型H5的NDV-表达禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)(见，例如，Veitset al.，PNAS，May 23，2006，vol.103，no.21，pp.8197-8202)和基于缓发型NDV疫苗株Clone 30的AIV A/鸡/越南/P41/2005(H5N1)的表达HA基因的重组NDV-H5(见，例如，Veits et al.，Vaccine(2008)26，1688-1696)。

在本发明的再一实施方式中，也涵盖表达NDV基因的禽流感病毒，例如代替表达H7禽流感病毒血凝素的胞外域的H5N1禽流感病毒或二价疫苗的神经氨酸酶蛋白表达NDV的血凝素-神经氨酸酶基因的胞外域的嵌合禽流感病毒到成融及衰减的NDV基因(含仅其胞外域，具有源自NDV的F蛋白的跨膜和细胞质结构域)(见，例如，Parket al.，PNAS，May 23，2006，vol.103，no.21，pp.8203-8308)。

在一实施方式中，本发明用于将治疗有效量的用于递送和表达蛋白，抗原，表位或免疫原的制剂施用到靶细胞。预防性地或治疗有效量的确定是本领域普通技术人员的常规实验。在另一实施方式中，制剂包含：包含表达流感抗原，表位或免疫原的多核苷酸表达载体的和药学或兽医学可接受的载体，媒质或赋形剂。在另一实施方式中，药学或兽医学可接受的载体，媒质或赋形剂辅助转染和/或改善载体或蛋白的保存。

本领域技术人员熟知药学或兽医学可接受的载体或媒质或赋形剂。例如，药学或兽医学可接受的载体或媒质或赋形剂可为无菌水，0.9％NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本发明的方法的其他药学或兽医学可接受的载体或媒质或赋形剂包括，但不限于，聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学或兽医学可接受的载体或媒质或赋形剂可为辅助载体施用的任何化合物或化合物的组合(或自本发明的载体外表达的蛋白)；有利地，载体，媒质或赋形剂可辅助转染和/或改善载体(或蛋白)的保存。本文在一般描述中讨论了剂量体积，且也可由本领域技术人员自本公开以及本领域中的知识，无需任何过度实验确定。

有利地但不排他性地适于质粒的含有季铵盐的阳离子脂质，有利地是具有以下式的那些：

其中R1是具有12～18个碳原子的饱和的或不饱和的直链脂肪族自由基，R2是含有2或3个碳原子的另一脂肪族自由基，且X是胺或羟基，例如DMRIE。在另一实施方式中阳离子脂质可与中性脂质，例如DOPE相联。

这些阳离子脂质中，偏好DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(十四烷基氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，有利地与中性脂质关联，有利地为DOPE(二油酰-磷脂酰-乙醇胺；Behr，1994)，以形成DMRIE-DOPE。

有利地，无准备地及有利地与施用制备物同时或在施用制备物之前不久形成具有佐剂的质粒混合物；例如，在施用之前不久或之前，形成质粒-佐剂混合物，有利地为了施用之前给足够的时间用于混合物形成复合物，例如施用之前约10和约60分钟之间，例如施用之前约30分钟。

当DOPE存在时，DMRIE∶DOPE摩尔比有利地为约95∶约5～约5∶约95，更有利地约1∶约1，例如，1∶1。

DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂∶质粒重量比可为约50∶约1和约1∶约10之间，例如约10∶约1和约1∶约5之间，及有利地约1∶约1和约1∶约2之间，例如，1∶1和1∶2之间。

在另一实施方式中，药学或兽医学可接受的载体，赋形剂或媒质可为油包水乳剂。适合的油包水乳剂的例包括基于油的油包水疫苗乳剂，其稳定和于4℃流动，其含有：6～50v/v％的含有抗原的水相，优选12～25v/v％，50～94v/v％的含有(总共或部分)非-可代谢的油(例如，矿物油例如石蜡油)和/或可代谢的油(例如，植物油或脂肪酸，多元醇或醇酯)的油相，0.2～20p/v％的表面活性剂，优选3～8p/v％，后者总共或部分，或以混合物是聚甘油酯，所述聚甘油酯优选为聚甘油(聚)蓖麻油酸酯，或聚氧乙烯蓖麻毒素油或氢化的聚氧乙烯蓖麻毒素油。可用于油包水乳剂的表面活性剂的例包括乙氧基化的山梨糖醇酐酯(例如，聚氧乙烯(20)单油酸山梨糖醇酐(Tween 80

)，可得自AppliChem，Inc.，Cheshire，CT)和山梨糖醇酐酯(例如，单油酸山梨糖醇酐(Span 80

)，可得自Sigma Aldrich，St.louis，MO)。此外，有关油包水乳剂，也见US专利No.6,919,084，例如，其实施例8，通过引用并入本文。在一些实施方式中，含有抗原的水相包含盐溶液包含一种或更多缓冲剂。适合的缓冲溶液的例是磷酸盐缓冲的盐水。在有利的实施方式中，油包水乳剂可为水/油/水(W/O/W)三层乳剂(见，例如，美国专利No.6,358,500，通过引用并入本文)。其他适合的乳剂的例描述于美国专利No.7,371,395，通过引用并入本文。

免疫学组合物和疫苗根据本发明可包含一种或更多佐剂，或基本上由其组成。本发明的实践中使用的适合的佐剂是：(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，马来酐和烯基衍生聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如具有一个或更多非-甲基化的CpG单元的寡脱氧核苷酸序列(Klinman等人，1996；WO98/16247)，(3)水包油乳剂，例如描述于由M.Powell，M.Newman，Plenum Press 1995出版的“VaccineDesign，The Subunit and Adjuvant Approach”的p 147的SPT乳剂，及描述于相同的文章的p 183的MF59乳剂，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如，DDA(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)引用的及通过引用合并到本申请的任何文献中讨论的其他佐剂，或(9)其任何组合或混合物。

水包油乳剂(3)，其尤其适于病毒载体，可基于：轻液体石蜡油(欧洲药典类型)，类异戊二烯油，例如角鲨烷，角鲨烯，由烯，例如异丁烯或癸烯的寡聚化产生的油，具有直链烷基的酸或醇的酯，例如植物油，油酸乙酯，丙二醇，二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或分支的，脂肪醇或酸的酯，尤其是异硬脂酸酯。

油与乳化剂联用而形成乳剂。乳化剂可为非离子表面活性剂，例如：一方面是山梨糖醇酐的酯，二缩甘露醇(例如无水甘露糖醇油酸酯)，甘油，聚甘油或丙二醇，而另一方面是油酸，异硬脂酸，蓖麻油酸或羟基硬脂酸，所述酯任选地是乙氧基化的，或聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如Pluronic，例如，L121。

类型(1)佐剂聚合物中，偏好交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其通过糖或多元醇的聚烯基醚的交联。这些化合物已知名称为卡波姆(Pharmeuropa，vol.8，No.2，1996年6月)。本领域技术人员也可参考美国专利No.2,909,462，其提供通过具有至少3个羟基，优选不多于8个该基团，被具有至少2个碳原子的不饱和的，脂肪族自由基取代的至少3个羟基的氢原子的聚羟基化合物交联的该丙烯酸聚合物。优选的自由基是含有2～4个碳原子的那些，例如乙烯基，烯丙基和其他乙烯键合地不饱和基团。不饱和的自由基也可含有其他取代基，例如甲基。尤其适合以名称卡波泊尔售的产品(BF Goodrich，Ohio，USA)。它们通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基季戊四醇交联。它们之中，参考卡波泊尔974P，934P和971P。

有关马来酐-烯基衍生共聚物，偏好EMA(Monsanto)，其是直链或交联的乙烯-马来酐共聚物，且它们，例如，通过二乙烯基醚交联。也参考J.Fields等人，1960。

有关结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选通过具有以下式的基本单元形成：

其中：

●R1和R2，其可相同或不同，代表H或CH3

●x＝0或1，优选x＝1

●y＝1或2，且x+y＝2。

对于EMA，x＝0和y＝2，而对于卡波姆x＝y＝1。

这些聚合物在水或生理学盐溶液(20g/l NaCl)中是可溶性的，且pH可例如，通过苏打(NaOH)调至7.3～7.4，以提供可合并表达载体的佐剂溶液。最终免疫学或疫苗组合物中的聚合物浓度可跨0.01和1.5％w/v之间，0.05～1％w/v或0.1～0.4％w/v。

细胞因子(5)可在免疫学或疫苗组合物中为蛋白形式，或可在宿主中与免疫原或其表位共-表达。偏好通过与表达免疫原或其表位的载体相同的载体，或通过其独立的载体的细胞因子的共-表达。

本发明包括制备该组合组合物；例如通过混合活性组分，有利地与佐剂，载体，细胞因子和/或稀释剂一起。

可用于本发明的细胞因子包括，但不限于，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，干扰素α(IF

α)，干扰素β(IF

β)，干扰素γ，(IF

γ)，白细胞介素-1

(IL-α)，白细胞介素-β(IL-

β)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-3(IL-3)，白细胞介素-4(IL-4)，白细胞介素-5(IL-5)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-7(IL-7)，白细胞介素-8(IL-8)，白细胞介素-9(IL-9)，白细胞介素-10(IL-10)，白细胞介素-11(IL-11)，白细胞介素-12(IL-12)，肿瘤坏死因子α(TNFα)，肿瘤坏死因子β(TN

β)，及转化生长因子β(TG

β)。需知，细胞因子可与本发明的免疫学或疫苗组合物共-施用和/或依次施用。由此，例如，本发明的疫苗也可含有体内表达适合的细胞因子，例如，与此待疫苗接种或待引起免疫学应答的宿主匹配的细胞因子(例如，用于待施用给禽的制备物的禽细胞因子)的外源核酸分子。

在另一实施方式中，本发明的组合物可使用由Stauffer等人描述的化学或物理方法(对于Anti-Infective Drug Discovery，1，291-296，2006的新近专利)制备。一些灭活技术总结在下表中。

化学	物理	组合的
			抗坏血酸		抗坏血酸+UV
b-丙内酯	加热	β丙内酯+UV
			b-氨基苯酮	压力	福尔马林+加热
焦碳酸二乙酯	UV	福尔马林+UV
			乙烯亚胺	非离子去污剂	加热+低压力
福尔马林/甲醛		压力+加热或冷
			苯酚		补骨脂素+UV

在一实施方式中，疫苗施用给禽，例如鸡，鸭，鹅，火鸡，珠鸡，鹧鸪或鸵鸟。鸡包括，但不限于商业层，种畜，适合烤焙的小鸡，宠物鸡，及雏鸡。鸭包括，但不限于，北京鸭，俄国鸭，杂种鸭和野生鸭。在禽是鸭或大于鸡的禽的实施方式中，可考虑更大剂量。例如，在施用通过眼滴剂的实施方式中，剂量接近约1只鸡剂量，2只鸡剂量，3只鸡剂量，4只鸡剂量，5只鸡剂量，6只鸡剂量，7只鸡剂量，8只鸡剂量，9只鸡剂量和有利地10只鸡剂量，而如果需要，剂量达约20～达约100只鸡剂量。为容易参照，5.5log₁₀ 50％蛋感染剂量(EID₅₀)是约1只鸡剂量。

在另一实施方式中，剂量可以平均胚胎感染剂量(EID₅₀)计。在一实施方式中，剂量可为约10¹EID₅₀，约10²EID50，10³EID₅₀，约10⁴EID₅₀，约10⁵EID₅₀，约10⁶EID₅₀，约10⁷EID₅₀，或约10⁸EID₅₀。

根据本发明的免疫学组合物和/或疫苗包含有效量，或基本上由其组成或由其组成以引发如本文讨论的一种或更多表达载体和/或多肽的保护性或治疗性应答；且，有效量可从本公开确定，包括本文合并的文献，及本领域的知识，无需过度实验。

有利地，当抗原是血凝素时，剂量以血凝单元(HAU)或以μg测量。在有利的实施方式中，剂量可为约100血凝单元(HAU)/剂量，约1000HAU/剂量或约10000HAU/剂量。在某些实施方式中，剂量在1和100μg之间。剂量体积可为约0.02ml和2ml之间，有利地0.03ml和1ml之间，更有利地在0.03ml和0.5ml之间和在尤其有利的实施方式中，体积可为约0.03ml～约0.3ml。

可将本发明的疫苗卵内，经饮用水，喷雾，气雾剂，鼻内滴注，眼滴，浸喙，通过翼网穿刺，经皮，皮下或肌内注射施用于禽。有利地，疫苗由皮下，卵内，眼滴，喷雾或饮用水施用。

在再一实施方式中，疫苗可在孵化之前卵内1～3天施用，或给1日龄，2日龄，3日龄，4日龄，5日龄，6日龄，7日龄，8日龄，9日龄，10日龄，11日龄，12日龄，13日龄，14日龄，15日龄，16日龄，17日龄，18日龄，19日龄，20日龄或21日龄鸡。

在本发明的一实施方式中，可采用初施-追施方案，其包括使用至少一种常见的蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原至少一次初次施用和至少一次追加施用。初次施用中使用的免疫学组合物或疫苗在性质上不同于作为追加使用的那些。但是，需知，可将相同的组合物用作初次施用及追加。此施用流程称为“初施-追施”。

在本发明的初施-追施流程的另一方面，施用包含经加工的禽流感Avinew NDV疫苗或组合物的组合物，然后施用包含含有及体内表达禽流感抗原的重组病毒载体的疫苗或组合物，或包含禽流感抗原的灭活的病毒疫苗或组合物，或包含禽流感亚基(蛋白)的疫苗或组合物，或含有或表达禽流感抗原的DNA质粒疫苗或组合物。同样，初施-追施流程可包括施用：包含含有及体内表达禽流感抗原的重组病毒载体的疫苗或组合物，或包含禽流感抗原的灭活的病毒疫苗或组合物，或包含禽流感亚基(蛋白)的疫苗或组合物，或含有或表达禽流感抗原的DNA质粒疫苗或组合物，然后施用包含经加工的禽流感AvinewNDV疫苗或组合物的组合物。还需知，初次及二次施用可包括包含经加工的禽流感Avinew NDV疫苗或组合物的组合物。

初施-追施流程包含使用至少一种常见的抗原的至少一次初次施用和至少一次追加施用。初次施用中使用的疫苗或组合物可在性质上不同于作为后期追加疫苗或组合物使用的那些。初次施用可包含一次或更多施用。类似地，追加施用可包含一次或更多施用。

各种施用优选隔约1～约6周进行，或隔约2～约4周。也涵盖每2～6周重复的追加或每年追加。动物优选在第1次施用时间至少1日龄。

免疫学组合物和/或疫苗含有每剂量约10⁴～约10¹¹，有利地约10⁵～约10¹⁰和更有利地约10⁶～约10⁹表达流感抗原，表位或免疫原的重组腺病毒的病毒粒子。在基于痘病毒的免疫学组合物和/或疫苗的情况中，剂量可为约10²pfu和约10⁹pfu之间。免疫学组合物和/或疫苗含有每剂量约10²～约10⁷，有利地约10³～约10⁵pfu的表达流感抗原，表位或免疫原的痘病毒或疱疹病毒重组体。

在禽免疫学组合物或疫苗是灭活的禽病毒的实施方式中，灭活的禽病毒可源于产生油-乳剂中使用的各种种病毒，疫苗可包括Ulster2C，B1，LaSota或Roakin。灭活的禽流感病毒也可为典型灭活的，含有在含胚的SPF蛋繁殖的H5N9欧亚分离物A/鸡/意大利22A/98的全病毒β-丙内酯(BPL)-灭活的疫苗(H5N9-其)。其他灭活的疫苗，辅佐的，包括基于通过遗传加工衍生的亚型H5N2和H5N9或重组H5N3病毒的野生病毒(后者含有A/鸡/越南/C58/04(H5N1)的修饰的HA基因，A/鸭/德国/1215/73(H2N3)的神经氨酸酶基因和A/PR/8/34(H1N1)的内部基因)的可商购的全病毒制备物(Fort Dodge AnimalHealth，Intervet International，Merial Italia)。

病毒载体可为衰减的禽痘病毒表达载体。在一实施方式中，禽痘病毒表达载体可为鸡痘病毒载体，例如，TROVAC

。在另一实施方式中，禽痘病毒表达载体可为金丝雀痘病毒载体，例如，ALVAC。流感抗原，表位或免疫原可为血凝素，例如H5。鸡痘病毒载体可为vFP89(见，US 2008/0107681和US 2008/0107687)或vFP2211(见，US2008/0107681和US 2008/0107687)。金丝雀痘病毒载体可为vCP2241(见，US 2008/0107681和US 2008/0107687)。可用于本发明的方法的其他病毒包括，但不限于，痘苗病毒，例如衰减的痘苗病毒，例如NYVAC，腺病毒及疱疹病毒。

可在通过用流感的强毒株，例如，流感H5N1，H5N8或H5N9株攻击动物，例如禽最后免疫后约2～4周测试疫苗的功效。同源和异源株可用于攻击，以测试疫苗功效。动物可通过喷雾，鼻内，眼滴，眼-鼻，IM，气管内和/或经口攻击。攻击病毒可以依赖于施用途径的体积为约10³～约10⁸EID₅₀。例如，如果施用是通过喷雾，将病毒悬浮液气雾化以产生约1～100μm滴，如果鼻内，气管内或口腔施用，攻击病毒体积为约0.05～约5ml。用于靶标物种的组合物的剂量体积，例如，禽组合物的剂量体积，可为：对于卵内是约50μl，对于眼滴是约20～约50μl，对于喷雾是约0.25ml～约1ml。动物可攻击后每天观察临床体征和死亡率14天。此外，可将几组动物安乐死及评价病理学现象。可自攻击后的全部动物收集口咽，气管或泄殖腔拭子用于病毒检测。组织中病毒抗原的存在或缺失可通过免疫组织化学，病毒分离或滴定，或核酸检测，例如反-转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)来评价。可在攻击后收集血样品和可分析抗-流感H5N1病毒-特异性抗体的存在与否。

本领域技术人员理解，本文公开仅旨在例示，而本发明不限于此。从本文的公开及本领域的知识，本领域技术人员可确定用于各免疫流程的施用数，施用途径，及剂量，无需任何过度实验。

本发明涵盖给动物至少一次施用有效量的根据本发明制造的治疗组合物。此施用可经各种途径，包括但不限于肌内(IM)，真皮内(ID)或皮下(SC)注射或经鼻内，卵内或口服施用。根据本发明的治疗组合物也可由无针设备施用(例如用Pigjet，Dermojet，Biojector，Vetjet或Vitajet设备(Bioject，Oregon，USA))。在一实施方式中，动物是禽。

本发明的另一实施方式是用于实施针对流感在动物中诱导免疫学或保护性应答的方法的试剂盒，其包含重组NDV免疫学组合物或疫苗或灭活的流感免疫学组合物或疫苗和用于实施以有效量递送以在动物中引发免疫应答的方法的使用说明。

本发明通过以下非限制性实施例进一步阐述。

【实施例】

DNA插入子，质粒和重组病毒载体的构建使用由J.Sambrook等人描述的标准分子生物学技术进行(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，1989)。

【实施例1：AVINEW

(NDV)株的反向遗传学的开发和表达异源基因的NDV突变体的产生】

此实施例的目的在于开发AVINEW NDV株的反向遗传学以产生表达异源基因的经加工的NDV突变体。

NDV是含有图1A所示的6种主要基因(NP，P，M，F，HN和L)的阴性RNA病毒。遗传修饰的NDV病毒的产生需要反向遗传学系统。反向遗传系统已被申请人基于NDV的AVINEW疫苗株开发。此系统允许产生表达外源基因，例如图1B中所示的流感的血凝素(HA)的修饰的新城疫病毒。

【实施例1.1：全AVINEW NDV基因组克隆到转录质粒及序列分析】

为测序AVINEW NDV株的基因组的目的，需要将AVINEW株的全基因组克隆进指定为“转录质粒”的质粒(见1.图1C中)。转录质粒允许产生对应于NDV的AVINEW株的整个基因组的正RNA。通过连续接合一组10个重叠的自AVINEW提取的RNA通过反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)扩增的cDNA片段AVINEW基因组克隆的策略显示于图2。此最终质粒指定的pIV029(见图3)含有AVINEW的完全基因组序列，其T7RNA聚合酶转录信号在控制下(位于上游的T7启动子)及被用于切割在真NDV基因组末端的RNA然后是T7终止子的丁型肝炎病毒(HDV)核酶终结。限制性位点插入P和M基因之间，以允许转基因的插入(见图2和3)。

对AVINEW

株的整个基因组测序。AVINEW基因组的长度是15186bp，其被预期基于核壳蛋白结合基序，6个核苷酸的倍数。

pIV029的插入子的标注的序列显示于图4A～4O，且质粒图谱显示于图3。在图4A～4O中，Avinew株的6个开放阅读框(ORF)(NP，P，M，F，HN和L)翻译成它们的氨基酸序列。各ORF侧翼有用GS和GE指出的“基因开始”上游和“基因结束”下游序列。指出了T7启动子和T7终止子序列。

【实施例1.2：含有AVINEW NDV的NP，P和L基因的表达质粒的构建】

在反向遗传学系统中，需要构建指定为“表达质粒”的在T7RNA聚合酶启动子控制下编码核壳(NP)，磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)的质粒(见图1C)。这3种蛋白与病毒RNA相联而形成代表NDV的最小感染性单元的核糖核蛋白(RNP)。由NP，P和L蛋白组成的复合物呈现RNA依赖性RNA聚合酶活性。

构建表达质粒pIV32(图5)，pIV33(图6)和pIV34(图7)及分别含有AVINEW的NP，P和L基因，在T7RNA聚合酶启动子和口蹄疫病毒(FMDV)内部核糖体进入位点(IRES)控制下。

【实施例1.2.1：含有AVINEW NDV的NP基因的表达质粒pIV32的构建】

表达质粒pIV32图谱显示于图5。此质粒含有在T7RNA聚合酶启动子和口蹄疫病毒(FMDV)内部核糖体进入位点(IRES)控制下编码新城疫病毒AVINEW

疫苗株的核壳(NP)基因的开放阅读框(ORF)的核苷酸序列。NDV ORF NP(1467bp，SEQ ID NO：2)编码489个氨基酸多肽(SEQ ID NO：3)。蛋白NP是核壳的主要结构组分。蛋白是约58kDa。总2600NP分子紧密壳体化基因组RNA。NP与几种其他病毒编码的蛋白相互作用，其全部涉及控制复制(NP-NP，NP-P，NP-(PL)和NP-V)。与NDV基因组RNA关联的NP和蛋白P和L构成NDV核糖核蛋白(RNP)复合物，其是NDV基因组的感染性形式。

【实施例1.2.2：含有AVINEW NDV的P基因的表达质粒pIV33的构建】

表达质粒pIV33的图谱显示于图6。此质粒含有在T7RNA聚合酶启动子和口蹄疫病毒(FMDV)内部核糖体进入位点(IRES)控制下编码新城疫病毒AVINEW

疫苗株的磷蛋白(P)基因的ORF的核苷酸序列。此质粒设计来使用反向遗传方法产生重组NDV AVINEW

作为疫苗载体。

NDV ORF P(1185bp，SEQ ID NO：4)编码395个氨基酸多肽：结构磷蛋白(P)(SEQ ID NO：5)。此蛋白具有53～56kDa的分子量，如通过SDS-PAGE测定。蛋白P对于RNA聚合酶复合物的活性是必要的，其与大亚基L形成。尽管聚合酶的全部催化性活性相关于L亚基，其功能需要与特异性相互作用。P与蛋白L和NP关联和与NDV基因组RNA构成NDV核糖核蛋白(RNP)复合物，其为NDV基因组的感染性形式。

此外，P基因编码具有在SDS-PAGE上明显的36～38kDa的分子量的蛋白V(未知的功能)。P和V蛋白共享相同的氨基末端，但它们在它们的C-端分歧。此差异通过RNA-编辑机理产生，其中一个非-模板化的G残基插入源于P-基因的mRNA。未编辑的转录物编码P蛋白，而编辑的转录物编码V蛋白。作为磷蛋白，P和V在它们的全长度富含丝氨酸和苏氨酸残基。此外，V蛋白在C-末端富含半胱氨酸残基。同样，P基因编码蛋白W(未知的功能)，具有在SDS-PAGE上明显的28～33kDa的分子量。此蛋白也通过RNA-编辑机理产生，其中代替1个非-模板G残基而2个插入源于P-基因的mRNA。

【实施例1.2.3：含有AVINEW NDV的L基因的表达质粒pIV034的构建】

表达质粒pIV34的图谱显示于图7。此质粒含有在T7RNA聚合酶启动子和口蹄疫病毒(FMDV)内部核糖体进入位点(IRES)控制下编码新城疫病毒AVINEW

疫苗株的大聚合酶蛋白(L)基因的ORF的核苷酸序列。此质粒设计来使用反向遗传方法产生重组NDVAVINEW

作为疫苗载体。

NDV L基因(6612bp，SEQ ID NO：12)编码2204个氨基酸多肽，其为L蛋白(SEQ ID NO：13)。副粘病毒科(Paramyxoviridae)，如其他非-分段的阴性链RNA病毒，具有由2个亚基，大蛋白L和磷蛋白P组成的RNA-依赖性RNA聚合酶。L蛋白赋予RNA聚合酶对复合物的活性，而P蛋白作为转录因子发挥作用。蛋白L与蛋白P和NP关联，且与NDV基因组RNA构成NDV核糖核蛋白(RNP)复合物，其为NDV基因组的感染性形式。

【实施例1.3：允许T7RNA聚合酶的表达的表达质粒的构建】

反向遗传学系统需要T7RNA聚合酶在NDV病毒会再生的细胞中表达(见图1C)。不同系统可用于表达T7RNA聚合酶，包括使用重组病毒(例如禽痘病毒)作为载体，使用组成性表达酶或使用表达质粒瞬时表达的细胞。选择后者方案，及构建在HCMV IE启动子下编码T7RNA聚合酶的表达质粒(指定为pNS151)。T7RNA聚合酶允许不仅NP，P和L蛋白自上述表达质粒的转录/表达，而且将NDV基因组(显示于转录质粒)转录进正义RNA。质粒的图谱显示于图8。

【实施例1.4：使用反向遗传学系统的NDV病毒的恢复】

将上述5种质粒(含有NDV基因组的一种转录质粒，表达NDV NP，P和L的3种表达质粒，及表达T7聚合酶的表达质粒)一起共-转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。图1C是解释反向遗传学系统的机理的示意图。如方案显示，在进入细胞后，T7RNA聚合酶表达，其然后自转录质粒将NDV基因组转录成正义RNA(RNA(+))基因组以及自个体表达质粒转录成NP，P和L基因。然后NP，P和L蛋白转录物作为表达的NP，P和L蛋白翻译，然后与基因组RNA(+)组装及形成RNP。此RNP复合物合成负义RNA基因组(RNA(-))，其然后起始辅助感染性粒子产生的NDV病毒的正常复制循环。可将例如由蛋尿囊液提供的胰蛋白酶或其他外源蛋白酶加入培养基来切割产生的病毒的F蛋白。

使用此系统，成功地获得AVINEW NDV的感染性粒子。简言之，将需要的不同质粒(pIV029，pIV32，pIV33，pIV034和pNS151)转染进CHO细胞。72小时后，CHO上清液接种到10日龄含胚的蛋，以扩增病毒。3天后，收获尿囊液及使用鸡红血细胞检查血凝活性(HA)。获得的反向遗传学AVINEW突变体指定为vAVW01。其含有与AVINEW亲本病毒相同的序列，除了导入P和M基因之间的2个独特限制性位点(PacI和FseI)之外(见图2)。

【实施例1.5：使用反向遗传学系统的表达外源基因的NDV病毒的产生】

为了产生表达外源抗原的修饰的NDV病毒，需要选择插入的座位。可选择不同座位，包括NP基因的上游和2个基因之间。在此实施例中，选择AVINEW

NDV的P和M基因之间的位点来插入外源基因，如显示于图9。外源基因需要随着需要的“开始”和“停止”转录序列插入，及插入的核苷酸数需要设计为修饰的NDV基因组中的核苷酸总数保持6的倍数。

此实施例详细描述了表达自禽流感的血凝素(HA)基因的AVINEW突变体的产生。HA基因首先插入允许外源基因插入的转移质粒，及侧接序列插入pIV029的PacI和FseI独特限制性位点。转移质粒的结构示于图9(在框内)。其从左到右含有：PacI位点，自PacI位点的P下游的3’UTR，P的基因结束(或STOP)序列，P/M基因间，M的基因开始(或开始)序列，M的5‘UTR，多克隆位点，P的3’UTR(自PacI位点的上游)和FseI位点。如图9中所示将HA基因克隆进转移质粒的多克隆位点，然后全PacI/FseI插入子克隆进pIV029的相同的限制性位点(图3)以产生含有外源基因的转录质粒。该转录质粒的例(pIV039)显示于图10。在此例中，将在切割位点修饰的编码A/鸡/印度尼西亚/7/2003高度病原性H5N1禽流感病毒的HA基因的氨基酸序列的合成基因插入转录质粒。

通过反向遗传学伴随产生AVINEW突变体需要的4种额外的表达质粒使用转录质粒pIV039(见实施例1.4)而产生表达自A/鸡/印度尼西亚/7/2003高度病原性(HP)H5N1禽流感(AI)病毒的HA基因的指定为vAVW02的AVINEW

突变体。

相同的方法用于产生表达自不同HPAI H5N1或低病原性AI(LPAI)H9N2的HA基因的不同AVINEW突变体。给自不同H5N1和H9N2AI分离物的插入子HA基因的序列分配如显示于图12的SEQ ID NO，及在序列表中包括DNA和蛋白序列。随着申请提交的电子提交的序列表的内容通过引用整体并入本文。

上述过程成功地用于恢复表达自不同HPAI H5N1或低病原性AI(LPAI)H9N2的HA基因的感染性AVINEW突变体(见表1)。

表1.产生的及表达自不同禽流感分离物的合成HA基因的不同Avinew突变体。自HPAI H5N1的全部HA基因在切割位点突变以便匹配LPAI H5分离物的切割位点的序列

名称	插入子	禽流感株	AI的HA亚型和分化体
				vAVW01	-	-	-
vAVW02	H5	A/鸡/印度尼西亚/7/2003	H5N1分化体2.1
				vAVW03	H5	A/火鸡/土耳其/1/2005	H5N1分化体2.2
vAVW04	H5	A/鸭/老挝/3295/2006	H5N1分化体2.3
				vAVW05	H9	A/鸡/伊朗/AV1221/1998	H9N2
vAVW06	H9	A/鸡/伊朗/AV1221/1998(突变的)	H9N2
				vAVW09	H5	A/鸡/西爪哇/PWT-WIJ/2006	H5N1分化体2.1

【实施例1.6：使用反向遗传学系统的表达外源基因的NDV病毒的产生和表征】

全部经加工的AVINEW突变体通过随后在含胚的蛋上传代来扩增及表征。重组病毒生长到类似于原AVINEW

病毒的滴度(8～10log10EID50/ml)提示，外源基因插入对含胚的蛋中病毒的复制无显著冲击。在含胚的蛋上第2或第3代中获得的感染性滴度的例显示于表2。

通过对感染的CHO细胞的间接免疫荧光和通过对尿囊液和对CHO感染的细胞裂解物的免疫印迹(蛋白印迹或WB)确认H5转基因的表达(对于vAVW02，例如见图11A和11B)。预期H5的电泳图谱。由于尿囊液中蛋白酶的存在，检测适当的HA切割产物，称之为HA1(50kDa)和HA2(28kDa)。在用蛋-生长的病毒感染的CHO细胞中(在胰蛋白酶缺失下)，申请人仅检测HA0形式(75kDa)(图11A)。

通过免疫电子显微镜检使用vAVW02作为例确认在NDV病毒粒子表面外源HA蛋白的表达(见图2B)。

表2.产生的及表达自不同禽流感分离物的合成HA基因的Avinew突变体的产率及表达控制。

【实施例2：鸡研究1：由经加工的AVINEW突变体在鸡中诱导的免于新城疫的保护和ND和AI HI滴度】

此研究的目的是确证外源基因插入AVINEW株的基因组不降低保护鸡免于新城疫(ND)的能力。疫苗接种方案显示于图3A的上图。由AVINEW疫苗和2种经加工的AVINEW突变体诱导的保护的百分率(不含有任何插入子的vAVW01(见表1)和含有HPAI H5N1HA插入子的vAVW03)显示于图3A的下表。类似水平的ND保护被2个测试剂量的3次疫苗诱导展示，在测试的条件，HA插入对载体保护免于由Herts33株的速发型NDV攻击的能力无负面影响。

【实施例3：由经加工的AVINEW突变体在有或无针对NDV和/或AI的母源抗体(MDA)的SPF鸡中诱导的免于H5N1HPAI的保护】

【实施例3.1：鸡研究2：由在SPF鸡中一次施用经加工的AVINEW突变体诱导的免于匈牙利(2006)H5N1HPAI分离物的保护】

在SPF(无特定病原体)鸡中评价经加工的AVINEW突变体vAVW03针对HPAI H5N1攻击的功效。用10⁵EID50通过眼滴(ED)和鼻内(IN)途径(D0)疫苗接种8只一日龄SPF鸡。疫苗接种之后4(D28)和6(D42)周进行H5N1攻击(6log10的H5N1分化体2.2A/鸭/匈牙利/11804/2006分离物/鸟)。攻击之后追踪鸡2周。结果显示于表3和表A。

表3：鸡研究2：自评价由经加工的vAVW03突变体针对HPAIH5N1(A/鸭/匈牙利/11804/2006)攻击在SPF鸡中诱导的保护性功效的疫苗接种-攻击研究的临床保护的结果

MTD：至死亡的平均时间(天)

表A：鸡研究2：自评价由经加工的vAVW03突变体针对HPAIH5N1(A/鸭/匈牙利/11804/2006)攻击在SPF鸡中诱导的保护性功效的疫苗接种-攻击研究的免于脱落的保护的结果

使用从攻击后2，4和7天(dpc)取的口腔和泄殖腔拭子的实时PCR的脱落评价

在D28和D42分别诱导全和部分(75％)临床保护。脱落可检测的量的攻击病毒的鸡的数在疫苗接种的组中降低。此外，分别在D28和D42攻击之后，在疫苗接种的组(2和4)中在2dpc的脱落水平大于3log10，和约2log10低于对照组。总之，这些结果表明表达HPAIHA基因的Avinew载体在SPF鸡中是保护性的。

【实施例3.A：鸡研究A：由一次施用经加工的AVINEW突变体在SPF鸡中诱导的免于埃及(2006)H5N1HPAI分离物的保护】

在SPF(无特定病原体)鸡中评价经加工的AVINEW突变体vAVW03针对埃及HPAI H5N1攻击的功效。10只一日龄SPF鸡用10⁶EID50通过眼滴(ED)和鼻内(IN)途径(D0)疫苗接种。疫苗接种之后3(D21)周进行H5N1攻击(6log10的H5N1分化体2.2A/鸡/埃及/06959-NLQP/2006分离物/鸟)。攻击之后追踪鸡2周。结果显示于表B。

表B：鸡研究A：自评价由经加工的vAVW03突变体针对HPAIH5N1(A/鸡/埃及/06959-NLQP/2006)攻击在SPF鸡中诱导的保护性功效的疫苗接种-攻击研究的临床保护的结果

在D21针对此埃及HPAI H5N1分离物诱导优良的(90％)临床保护确认，表达HPAI HA基因的Avinew载体在SPF鸡中诱导保护。

【实施例3.B：鸡研究B：由1或2次施用经加工的AVINEW突变体或初施-追施方案在SPF鸡中诱导的免于匈牙利(2006)H5N1HPAI分离物的保护】

在SPF(无特定病原体)鸡中评价用针对匈牙利(2006)HPAIH5N1攻击的灭活的疫苗1次，2次施用或初施-追施方案之后经加工的AVINEW突变体vAVW03的功效。将8只一日龄SPF鸡/组用10⁵EID50通过眼滴(ED)和鼻内(IN)途径在D0(组2，3和4)和在D14(组3)疫苗接种。自组3的鸡接受用H5N9A/鸡/意大利/A22/1998LPAI分离物(0.5ml/鸡)制造的灭活的疫苗。在第2次疫苗接种后4(D42)周进行H5N1攻击(6log10的H5N1分化体2.2A/鸭/匈牙利/11804/2006分离物/鸡)。攻击之后追踪鸡2周。结果显示于表C。

表C：鸡研究B：自评价由包括针对HPAI H5N1(A/鸭/匈牙利/11804/2006)攻击的vAVW03突变体的不同疫苗接种方案在SPF鸡中诱导的保护性功效的疫苗接种-攻击研究的保护结果

^*MTD，至死亡的平均时间(天)

^**dpc，攻击后天数

^***灭活的(或杀死的)AI H5N9疫苗用H5N9A/鸡/意大利/A22/1998LPAI分离物制备

在3个免疫接种的组中诱导优良的临床保护。也由疫苗接种诱导鸡中脱落的数以及攻击病毒的脱落的水平的减小。在鸡中自接受初施-追施方案的组4得到最佳保护性表现。这些结果确认，表达HPAI HA基因的Avinew载体在SPF鸡中诱导保护和表明保护水平可通过初施-追施策略改善。

【实施例3.C：鸡研究C：由包括经加工的AVINEW突变体的不同疫苗接种方案在SPF鸡中诱导的免于变体埃及(2008)H5N1HPAI分离物的保护】

在一日龄SPF(无特定病原体)鸡中评价包括在针对使用自2008(A/鸡/埃及/1709-6/2008)的变体埃及分离物的HPAI H5N1攻击的不同疫苗接种方案(见表D)中的经加工的AVINEW突变体vAVW03的功效。疫苗接种方案显示于表D。vAVW03疫苗以10⁶EID₅₀/100μL的剂量通过眼内(50μL)和鼻内(50μL)途径在D0(组2和3)和在D14(组2和4)施用。自组3的鸡接受用含有HA(在切割位点修饰的)和自H5N1分化体2.3A/鸭/安徽/1/2006LPAI分离物(0.5ml/鸡)的NA的反向遗传学H5N1株制造的灭活的疫苗。自组4的鸡在D0通过自在Marek氏病疫苗稀释剂(Merial氏专利物质)中稀释的H5N8HPAI A/火鸡/爱尔兰/1378/1983分离物(TROVAC-AIV H5疫苗，见US 2008/0107681和US 2008/0107687)表达HA的鸡痘重组vFP89的皮下途径(颈项)接受商业剂量(约3.5log10TCID50/200μL)。在第2次疫苗接种后2周(D28)进行H5N1攻击(5log10的H5N1分化体2.2A/鸡/埃及/1709-6/2008分离物/鸟)。攻击之后追踪鸡10天。结果显示于表D。

表D：鸡研究C：自评价由包括针对HPAI H5N1(A/鸡/埃及/1709-6/2008)攻击的vAVW03突变体的不同疫苗接种方案在SPF鸡中诱导的保护性功效的疫苗接种-攻击研究的临床保护的结果

^*H5N1抗原由A/火鸡/土耳其/1/2005抗原制备；SD标准偏差

^**MTD，至死亡的平均时间(天)

由不同疫苗接种方案诱导的HI滴度显示于表D。如所预期，用灭活的疫苗追加后在组3中得到更高HI滴度。在3个免疫接种的组中诱导优良的临床保护(93～100％)。值得提及的是，A/鸡/埃及/1709-6/2008分离物(可在GenBank得到的HA蛋白序列：ACD65000.1)是最近在埃及出现的H5N1抗原性变体之一，且针对其，商品化的灭活的H5疫苗相比针对更老埃及株提供更少保护。这些结果确认，表达HPAI HA基因的Avinew载体在SPF鸡中诱导针对抗原性变体H5N1埃及分离物的保护。

【实施例3.2：鸡研究3：由经加工的AVINEW突变体在有和无NDV和/或AI MDA的鸡中诱导的免于H5N1HPAI的保护】

研究目的是评价在SPF鸡中由表达H5N1HPAI HA基因的AVINEW突变体vAVW03诱导的HPAI H5N1保护水平和评价针对NDV载体和/或针对AI的母源抗体(MDA)的可能的干涉。

为了评价MDA对AI保护的效应，将SPF种畜用如显示于表4的不同疫苗接种方案免疫。有3组的种畜：第1组(G1)针对NDV疫苗接种(3次施用AVINEW和1次施用灭活的(或杀死的)疫苗)和AI(3次施用基于H5N9A/鸡/意大利/A22/1998LPAI分离物的灭活的疫苗)；第2组(G4)仅针对NDV疫苗接种(与组1相同的免疫方案)和第3组(G5)仅用AI疫苗接种(2次施用基于含有自A/鹅/广东/1996分离物的HA和NA基因的H5N1突变体的灭活的疫苗)(见表4中细节)。

表4.用于产生有ND和/或AI MDA的一日龄鸡的SPF种畜的疫苗接种方案

^*L＝活NDV疫苗AVINEW；K＝杀死的NDV疫苗(Gallimune407)

^**灭活的(或杀死的)AI H5N9疫苗用H5N9A/鸡/意大利/A22/1998LPAI分离物制备

^***灭活的(或杀死的)AI H5N1疫苗用含有自H5N1A/鹅/广东/1996HPAI分离物的HA和NA基因的AI突变体制备

鸡从由这些免疫的种畜产的蛋孵化，且将由这些有MDA的鸡中的vAVW03诱导的HPAI H5N1功效与在无MDA的SPF鸡中诱导的相比较。

图13显示在孵化自描述于表4的免疫的种畜的一日龄鸡中观察到的平均NDV和AI HI滴度(以log2)。NDV滴度在自ND-免疫接种的种畜的两组(G1和G4)中非常高。用H5N1分化体2.2(A/鸭/匈牙利/11804/2006)和H5N9(A/鸡/意大利/A22/1998)抗原测量的AI HI滴度在用灭活的H5N1疫苗免疫接种的G5种畜的鸡后代中更高。这些结果确认了孵化自免疫接种的SPF种畜的日龄鸡的血清中预期的MDA的存在。

图14描绘用于有或无MDA的SPF鸡的免疫及攻击流程的时间线。将自规则SPF畜群或自免疫接种的SPF种畜的一日龄鸡通过眼鼻途径用10⁵EID50的表达自A/火鸡/土耳其/1/2005HPAI H5N1分离物(10只动物)的HA基因的vAVW03或用不含有任何HA插入子的vAVW01免疫及将其用作对照(10动物)。疫苗接种后3周，全部鸡用6log10的HPAI H5N1A/鸭/匈牙利/11804/2006分离物通过眼球内途径攻击。观察鸡的攻击之后2周期间的临床体征和死亡率。表5总结疫苗接种方案和禽流感保护结果。

表5.在SPF鸡中和有各种MDA的鸡中由表达H5N1HA的AVINEW

突变体(vAVW03)诱导的AI保护

组

MDA

种畜

疫苗

死亡率

MDT^*

％保护

1

-

SPF

vAVW01

10/10

3.8

0％

2

-

SPF

vAVW03

1/10

11

90％

3

H5N9+ND

G1

vAVW01

7/10

7.3

30％

4

H5N9+ND

G1

vAVW03

2/9

10

78％

5

ND

G4

vAVW01

10/10

3.6

0％

6

ND

G4

vAVW03

0/10

-

100％

7

H5N1

G5

vAVW01

1/10

8

90％

8

H5N1

G5

vAVW03

0/10

-

100％

^*MDT＝平均死亡时间(天)

用vAVW01(组1和5)免疫接种的无AI MDA的鸡的快速死亡率(3.6～3.8天的平均死亡时间)确认了攻击(见表5和图15)。在一日龄SPF鸡中1次粘膜施用vAVW03后的HPAI H5N1保护水平保护了90％的鸡。意外地，孵化自用仅NDV免疫接种(组6)的种畜(表4中的G4)的全部vAVW03-免疫的鸡被保护免于HPAI攻击，表明无对AI保护的抗-载体NDV MDA干涉。AIV MDA的效应更难评定，由于在对照组(组3和7)中攻击之后仅7和1/10鸡死亡；但是用vAVW03免疫接种的(组4)7/9的鸟被保护，表明在NDV和AI MDA二者存在下可诱导保护。攻击之后死亡的免疫接种的鸡相比未疫苗接种的鸟在更晚时间死亡(见表5的平均死亡时间，及图15的死亡率动力学)。表6显示口或泄殖腔脱落呈阳性的鸡的数，图16显示攻击之后口(16A)和泄殖腔(16B)脱落的动力学。对于口(16C)和泄殖腔(16D)拭子的在vAVW01/vAVW03中的脱落水平之间的比也显示于图16。vAVW03-免疫接种的鸡脱落低得多的病毒及相比vAVW01-免疫接种的鸡攻击之后阳性拭子的数更低。

表6：在H5N1HPAI攻击后2，4和7天(dpc)口和泄殖腔拭子中通过靶向基质基因的实时反转录酶PCR(RRT-PCR)评价8个所测组中的H5N1脱落。

^*v01＝vAVW01和v03＝vAVW03

图17描绘在疫苗接种之后(D21)和攻击之后(D35)对vAVW03-诱导的AIV HI滴度的NDV MDA效应(使用H5N1分化体2.2(A/鸭/匈牙利/11804/2006)和H5N9(A/鸡/意大利/A22/1998)抗原)。在NDV MDA(NDV)存在下，在第21天(在疫苗接种之后和攻击之前)，疫苗接种之后有更高平均AIV HI滴度和针对两种抗原的更高有可检测的HI滴度的鸡的数。在第35天(在攻击后)，AIV攻击后在用仅NDV免疫接种的种畜的后代中无AIV HI滴度追加，且10/10的鸡被保护(对比SPF组中的9/10)。在无MDA的SPF鸡中，攻击之后AIV HI滴度的明显的增加提示，在这些鸡中攻击病毒多少复制。结果提示在有NDV MDA的鸡中意料不到的更佳AIV抗体诱导和保护。

图18描绘疫苗接种后(D21)的NDV HI滴度。在第21天，vAVW01-诱导的NDV滴度通常高于由vAVW03诱导的那些。在第21天，在有(自G1(H5+NDV)或G4(NDV)种畜)或无(自SPF或G5(H5N1)种畜)NDV MDA的鸡中有关NDV HI滴度无差异，表明NDV MDA不干扰vAVW01或vAVW03-诱导的NDV HI滴度。

总之，此研究的结果明显指示，给一日龄鸡一次粘膜施用相对低剂量(5log10EID50)的AVINEW加工的突变vAVW03诱导了优良的免于HPAI H5N1攻击的保护水平。存在抗-载体(NDV)MDA对AI保护无负面影响。相反及意外地，当NDV MDA存在于一日龄鸡时，在vAVW03疫苗接种的时间，保护和AI抗体数据提示更佳AI保护。这些结果也显示AI保护可在兼有NDV和AI母源抗体的鸟中被vAVW03诱导。

【实施例4：由经加工的AVINEW突变体在小鸭中诱导的免于H5N1HPAI的保护】

鸭可被NDV天然地感染及代表禽流感A病毒的携带者。它们可在甚至用高度病原性株AI感染后不必然显示临床体征，但可将病毒传播给高度易感的鸡。这是为何鸭称为AI的特洛伊木马的原因。此研究的目的是研究在鸭中使用经加工的NDV作为流感的载体疫苗的可能性。

【实施例4.1：在14日龄俄国小鸭中的鸭研究1】

研究目标是比较(1)免疫原性和(2)由表达自2种不同H5N1分化体的合成HA基因的2种AVINEW加工的突变体(vAVW02表达分化体2.1A/鸡/印度尼西亚/7/2003的HA基因和vAVW03表达自分化体2.2A/火鸡/土耳其/1/2005的HA)诱导的H5N1功效与在常规俄国小鸭中的亲本Avinew株。

【实施例4.1.1：鸭研究1：在小鸭中经加工的AVINEW突变体的免疫原性】

测试一日龄俄国小鸭的NDV和AIV血清学，而在7/10小鸭意外地发现对NDV呈血清阳性，平均HI滴度是3.9log2。全部血清对于AI HI测试是阴性的。在13日龄在10只鸭中进行另一采血给出阴性ND HI滴度，且当鸭是14日龄时研究开始。设置3组，在各组中，10只免疫接种，及7只接触对照小鸭。在疫苗接种日(D0和D21)分离接触体，且在以下日返回组。包括5个未疫苗接种的对照的第4组(见表7)。

表7：鸭研究1：用于评估表达HA的AVINEW突变体的免疫原性的组设置

对于使用MDCK细胞-适应的M611804H5N1HPAI匈牙利株的NDV和AI HI测试和AI SN测试，在D0，D21和D42进行采血。在免疫接种的动物中在D4，D7和D12和在接触动物中在D7和D12获取喉和泄殖腔拭子用于NDV-特异性实时PCR(引物M4100和M4220及探针M4169)(Wise等人(2004)J.Clin Microbiol 42，329-348)。

结果显示，观察不到不利的反应，表明3种疫苗在这些实验条件下是安全的。对于PCR和血清学，自组4的全部样品(未疫苗接种的对照)是阴性的。对于PCR和血清学，在组1～3中自未疫苗接种的接触鸟的全部样品是阴性的，表明疫苗不从疫苗接种的鸟扩展到接触体。NDV HI滴度显示于图19。在D21，G1的HI滴度(3.6log2；100％≥3log2)相比G2(100％＜3log2)和G3(3/10≥3log2)的那些显著更高(ANOVA；p＝0.004)。但是，在第2次施用后3周，平均NDV HI滴度在3个免疫接种的组中类似(ANOVA；p＝0.682)(在组1，2和3中分别5.1，5.7和6.1log2)。

AI H5N1HI滴度显示于图20。在第1次疫苗接种后D21在自G2和G3的鸭中观察不到可检测的HI滴度(＜3log2)，除了G2中的1只鸭具有4log2HI滴度之外。在第2次施用后，全部鸭的HI滴度是≥3log2，有约4log2的平均滴度。由2种AVINEW突变体vAVW02和03在两个时间诱导的AI HI滴度无显著差异。

AI H5N1血清中和(SN)滴度显示于图21。在第1次疫苗接种后D21在自G2和G3的鸭中观察不到可检测的SN滴度(＜2log2)，除了G3中的2只鸭具有2或3log2SN滴度之外。在第2次施用后，全部鸭的HI滴度≥4log2，有约6.2log2的平均滴度。由2种AVINEW突变体vAVW02和03在两个时间诱导的AI HI滴度无显著差异。

NDV PCR：NDV PCR的结果显示于表8。在组1和3中在第1次和第2次疫苗接种后仅少数鸭发现呈阳性。全部阳性样品来自喉拭子，除了在D28组3中的一个拭子之外。在第2次施用AVINEW后D25的2只鸭阳性是在D3和D7第1次施用后的仅鸟阳性。尽管诱导抗-ND和抗-AI抗体，在组2中全部样品是阴性的。

表8：鸭研究1：在喉和泄殖腔拭子中NDV实时PCR测试的结果(阳性鸭/总的数)

^*全部阳性样品来自喉拭子，除了在G3中在D28的3只阳性鸟中的1只，其泄殖腔拭子是阳性的。

总之，研究确认了AVINEW的安全性，且显示，HA基因插入到AVINEW-AI突变体在小鸭中不诱导不利的反应。AVINEW在第1次施用后相比2个测试的AVINEW-AI突变体诱导显著更高的NDV HI滴度，提示，HA基因的插入稍微损伤NDV复制。在全部鸭中需要10个鸡剂量的AVW-AI突变体的2次眼滴施用来诱导阳性NDV和AI HI滴度，以及AI SN滴度。尽管存在自2种不同分化体的HA基因(vAVW02中分化体2.1的和vAVW03中的分化体2.2)，针对2种测试的AVINEW-AI突变体的分化体2.2H5N1抗原的免疫原性无差异。仅用AVINEW和vAVW03免疫接种的少数鸟主要脱落病毒到喉拭子。但是，此脱落不足以给接触小鸭传播疫苗病毒，其在全研究期间保持阴性。此研究的一些鸭随后用H5N1匈牙利分离物攻击；攻击结果显示于实施例4.1.2。

【实施例4.1.2：鸭研究1：由经加工的AVINEW突变体在俄国小鸭中诱导的H5N1保护】

在少数用vAVW02或vAVW03免疫接种的鸭中进行H5N1攻击研究(见实施例4.1.1)。将通过含vAVW02或03的眼滴剂两次免疫接种的鸭中的4只在9周龄进行攻击。将组1的2只鸭(AVINEW)用作阴性对照。在vAVW02和03免疫接种的组中，平均H5HI滴度是5.5log2(4只鸭5log2和4只鸭6log2)和平均SN滴度是4.0log2(1只鸭3log2SN滴度，6只鸭4log2SN滴度和1只鸭5log2SN滴度)。通过IM施用4.7log10EID50的HPAI H5N1A/鸭/匈牙利/11804/2006(M611804)株来攻击8只免疫接种的及2只对照鸭。在攻击之后第2，7和10天获取泄殖腔和喉拭子及以尸检在心脏，胰腺，脑和脾脏采样和通过PCR及组织病理学测试。

结果总结于表9。2只对照在感染后48小时之内死亡。通过PCR，口鼻及泄殖腔拭子以及脑，胰腺，心脏和脾脏对于H5N1呈阳性。不同器官的组织病理学显示过急性H5N1感染的迹象。在10天观察时期期间在8只免疫接种的鸭中观察不到临床体征。仅在攻击后第3天，在8只免疫接种的鸭中的3只(G2中2只和G3中1只)的喉拭子中检测到脱落。这些阳性鸭之一(G3中的1只)对于泄殖腔拭子中的AI PCR也呈阳性。全部其他拭子和器官是阴性。无损伤见于免疫接种的鸭的器官。

表9：鸭研究1：由AVINEW载体疫苗在14日龄俄国小鸭中诱导的保护的结果的总结

结果显示，IM攻击在2只对照鸟中非常严重。在8只通过含表达自H5N1分离物的合成H5基因的AVINEW载体疫苗的眼滴剂两次免疫接种的鸭中观察到全临床和部分脱落保护。

【实施例4.2：在一日龄俄国小鸭中的鸭研究2】

此实施例中鸭研究的目的是在日龄俄国小鸭中比较由1或2次施用表达自分化体2.2A/火鸡/土耳其/1/2005的合成HA基因的vAVW03AVINEW突变体诱导的免疫原性(实施例4.2.1)和功效(实施例4.2.2)。

【实施例4.2.1：鸭研究2：在一日龄小鸭中经加工的AVINEW突变体的免疫原性】

此研究中使用的动物是全部发现对于NDV(HI)和AIV(HI和SN)血清学阴性的一日龄俄国小鸭。设置3组，各组有10只免疫接种的及5只接触对照小鸭。在疫苗接种日(D0和D21)分离接触体及在以下日返回组。包括5只未疫苗接种的对照的第3组(见表10)。通过含有6.5log10EID50vAVW03的50μl眼滴剂在D0(组1和2)和在D14(仅组2)疫苗接种自组1和2的10只免疫接种的小鸭。

表10：鸭研究2：用于评估1或2次施用表达HA的AVINEW突变体vAVW03的免疫原性的组设置

组	Nb鸭	疫苗	疫苗接种时间
				1	10vacc.+5接触	vAVW03	D0
2	10vacc.+7接触	vAVW03	D0+D14
				3	5	-	-

在D0，D14和D35进行采血及使用MDCK细胞-适应的M6 11804H5N1 HPAI匈牙利株用HI测试测试NDV(La Sota抗原)和通过SN测试测试AI(M6 11804HPAI H5N1匈牙利/2006抗原)抗体。

观察不到不利的反应，确认vAVW03对于日龄俄国小鸭的安全性。NDV HI滴度和AI SN滴度分别显示于图22A和B。在D14，在第1次施用vAVW03后2周，仅10/20的免疫接种的鸭有可检测的NDV HI滴度(≥3log2)和仅8/20有可检测的H5N1SN滴度(≥1log2)。在D35，HI和SN滴度在第2次施用vAVW03后在组1保持类似地低(用NDV HI测试6/10阳性(2.9log2的平均值)和用SN H5N1测试8/10阳性(1.3log2的平均值))及在组2增加。自对照组(组3)的全部样品对于NDV HI测试和H5N1SN测试二者是阴性的。自组1和2中的未疫苗接种的接触鸭的全部血清也对于NDV HI和H5N1SN是阴性，除了组2中的血清转化为NDV(3log2)和SN H5N1(1log2)的一只鸭之外。此提示，vAVW03疫苗在组2中自免疫接种的扩展到5只未疫苗接种的接触体中的1只。此研究的一些鸭随后用H5N1匈牙利分离物攻击；攻击结果显示于实施例4.2.2。

结果显示，在一日龄小鸭中确认vAVW03的安全性。在一日龄俄国小鸭中1次眼滴施用6.5log10EID50的vAVW03仅在40～50％鸟中诱导了可检测的低NDV HI滴度和H5N1SN滴度。在第2次眼滴施用vAVW03后观察到NDV和SN H5N1滴度的清楚的追加效应。与在D0和D14免疫接种两次的组2的鸭接触的1只未疫苗接种的鸭中低抗-NDV和抗-H5N1抗体的检测提示，相比之前研究，水平传播可在测试的条件下以低频度发生。

【实施例4.2.2：鸭研究2：经加工的AVINEW-AI突变体在一日龄小鸭中的AI H5N1功效】

在用表达分化体2.2的HA基因的vAVW03AVINEW-AI突变体免疫接种一次或两次的少数鸭中进行H5N1攻击研究(见实施例4.2.1)。

在5周龄攻击自组1(在D0经1次施用)和2(在D0和D14经2次施用)的5只鸭以及与组1和2的鸟接触的2只未疫苗接种的鸭及自组3的2只未疫苗接种的鸭。通过口鼻施用4.7log10EID50的HPAI H5N1A/鸭/匈牙利/11804/2006(M611804)株攻击10只免疫接种的，4只接触体及2只对照鸭。在第4天和第7天和死亡日获取泄殖腔和喉拭子。攻击之后10天或在死亡时间，以尸检采样心脏，胰腺，脑，肝和脾脏和通过PCR及组织病理学测试。

个体结果显示于表11。自组2的2只对照在感染后48小时内死亡。通过PCR，口鼻及泄殖腔拭子以及脑，胰腺，心脏和脾脏对于H5N1呈阳性。不同器官的组织病理学显示过急性H5N1感染的迹象。在10天观察时期在组1和2的10只免疫接种的鸭中观察不到临床体征。组1中的1只鸭(#402)无可检测的NDV和H5N1抗体，而另一鸭(#403)仅具有低NDV HI滴度。此结果表明，这些抗体测试对于临床保护可不是完全预测性的。在D4，在组1的5只鸭中的3只(2个拭子中2只和仅喉拭子中1只)和组2的仅1只鸭(仅喉拭子)中检测到脱落。在D7，组1和组2的仅1只鸭对于喉拭子脱落呈阳性。全部其他拭子和器官是阴性。无损伤见于免疫接种的鸭的器官。与组1和组2的免疫接种的鸟保持接触的全部未疫苗接种的鸭在2或3天内死亡，及通过PCR分析在它们的拭子和器官中呈阳性，作为自组3的对照鸭，除了自组2的1只完全被保护的接触鸭(#429)之外。有趣的是，仅接触鸭在攻击时间显示低水平的NDV和H5N1抗体，提示，疫苗已自疫苗接种的鸭传播到此接触鸭。此鸭不显示任何临床体征且在其拭子和器官中通过PCR呈阴性。进行攻击之后死亡的鸭的不同器官中组织病理学损伤的研究，其包括的：脑(初期淋巴细胞脑炎)，肝(具有薄壁组织的多重病灶坏死的急性，浆液性肝炎)，心脏(间质水肿，心肌中的瘀点)，胰腺(贫血，间质水肿)，小肠(充血，粘液膜中的水肿)，脾脏(充血，马尔皮吉体中的淋巴细胞耗尽)，肺(充血，间质水肿，初期病灶间质肺炎)，气管(粘液膜中的水肿)。结果显示包括脑炎，水肿，充血及不同器官中肝脏细胞坏死的弱组织病理学变化。

表11：鸭研究2：在日龄俄国小鸭中用vAVW03给予一次(D0)或两次(D0和D14)进行的鸭研究2中的保护的个体结果。^*T＝阳性喉拭子；C＝阳性泄殖腔拭子

结果显示，口鼻攻击非常严重，尽管使用相对低的剂量(4.7log10EID50)，提示，此匈牙利H5N1分离物(分离自鸭)具有高水平的对于俄国鸭的毒力。在全部免疫接种的鸭，甚至在日龄，攻击之前5周仅接受1次施用vAVW03的那些及具有低或不可检测的NDV HI或H5N1SN滴度的鸭中观察到全临床保护。相比仅接受一次施用的组1(3/5)，在接受2次疫苗施用的组2中观察到更低数的鸭脱落(1/5)。有趣的是，仅攻击之前具有可检测的NDV和H5N1抗体滴度的接触鸭可能由于vAVW03疫苗从疫苗接种的鸭的水平传播而被完全保护。

【实施例4.3：在一日龄俄国小鸭中的鸭研究3】

此实施例中鸭研究的目的是确认在一日龄SPF俄国小鸭中由vAVW03单独或与针对另一H5N1 HPAI分离物的其他疫苗相关诱导的H5N1保护。

研究设计显示于表12。将单vAVW03施用的免疫原性与2次施用vAVW03和由在D0用TROVAC-AIV H5载体疫苗(美国批准的表达HPAI H5N8A/火鸡/爱尔兰/1378/1983分离物的天然HA基因的鸡痘病毒重组体vFP89)使用10个鸡剂量(约4.5log10TCID50/剂量)通过皮下途径初施，然后是在D14通过粘膜途径施用vAVW03组成的异源初施-追施方案(细节见表12)比较。在D28和D42，将各组5只鸭用法国HPAI H5N1分化体2.2A/天鹅/法国/06299/06分离物(10⁶EID50/鸭)攻击。

表12：鸭研究3设计及保护的结果

^*vAVW03由眼-鼻途径以50μl疫苗悬浮液(矿物质水用作稀释剂)施用；TROVAC-AIV H5由皮下途径以0.2ml疫苗悬浮液(Marek氏疫苗稀释剂用作稀释剂)施用。

^**vAVW03的剂量以log10EID50表示及TROVAC-AIV H5的剂量以log10TCID50表示；TROVAC-AIV H5的剂量对应于此疫苗的商业批的10个鸡剂量

^***攻击株是HPAI H5N1分化体2.2A/天鹅/法国/06299/06分离物；通过眼鼻途径施用6log10EID50；MTD：至死亡的平均时间(天)

全部非-免疫接种的鸭显示临床体征及在攻击之后4天内死亡。无疫苗接种的鸭显示临床体征或死亡(见表12)。将口咽和泄殖腔拭子在攻击之后不同时间采样(攻击后2.5，4.5，6.5，9.5和11.5天)。通过基于M的实时RTPCR基于Spackman et al(2002)J Clin Microbiol40：3256-3260测量病毒载量。在D28和D42的攻击结果分别表示在图23a～d和24a～d。

脱落数据明显表明，疫苗接种的鸭相比非-免疫接种的对照脱落更少病毒，及阳性鸟的百分率也在D28(图23a～d)和D42(图24a～d)攻击之后减少。自组2和3的样品之间无差异，表明在1日龄一次vAVW03施用与在D0和D14以这些条件2次vAVW03免疫提供相同的保护。相比组2和3的那些，在自接受异源初施-追施方案的组4的鸭中的阳性的百分率以及病毒载量更低，尤其对于在D28攻击。这些结果表明，用表达自vAVW03之前施用的相同的亚型的另一HA基因的鸡痘病毒重组体初施相比1或2次施用vAVW03改善保护水平。

分别在D28和D42使用HPAI H5N1(接近于攻击株的法国分离物06167i H5N1分化体2.2.1)作为抗原攻击之前(D28和D40)和之后(D42和D57)采样的血清中测量AI HI滴度(见表13)。仅组4的少数鸭在D28具有可检测的HI滴度。感兴趣地注意到，尽管在攻击时间缺失针对AI的可检测的血清转化，全部免疫接种的鸭被保护抵抗严重的HPAI攻击。此结果确认前者表明，HI测试不可用于预测该经加工的NDV AI疫苗的功效。

在D28攻击之后14天，HPAI H5N1HI滴度，在组2和3中，从在D28的0增加到在D42的7.2log2，然而在组4中，它们从2.3(D28)增加到6.0(D42)。组4中相比组2和3中攻击之后HI滴度的更低增加提示，攻击病毒在此组中复制更少。在D28攻击之后脱落数据中观察到该组4的鸭中攻击病毒复制的降低(见以上和图23a～d)。

表13：鸭研究3。攻击之前和之后的平均AI HI滴度(log2)

总之，在D28和D42进行1(D0)或2(D0和D14)次粘膜递送vAVW03施用到一日龄俄国小鸭保护它们免于HPAI H5N1攻击。用表达自H5N8分离物的HA的鸡痘重组体异源初施，之后vAVW03施用改善抵抗在D28早期攻击的保护。

【实施例4.4：鸭研究4：一日龄俄国小鸭中免疫的持续时间】

此实施例中鸭研究的目的是评价由一次施用vAVW03诱导的免疫或由鸭研究3中测试的异源TROVAC-AIV H5/vAVW03初施-追施方案诱导的免疫的持续时间。

表14：鸭研究4设计及临床保护的结果

¹用于在D65+在D86攻击的鸭的数(至死亡的平均时间(天))

²vAVW03通过眼-鼻途径用50μl疫苗悬浮液(矿物质水用作稀释剂)施用；TROVAC-AIV H5由皮下途径用0.2ml疫苗悬浮液施用；灭活的疫苗是含有包括自分化体2.3A/鸭/安徽/1/2006分离物的HA(在切割位点修饰的)和NA基因的Re5反向遗传学H5N1分离物的商品化的油-辅佐的灭活的疫苗。

³vAVW03的剂量表达以log10EID50表示及TROVAC-AIV H5的剂量以log10TCID50表示；TROVAC-AIV H5的剂量对应于商业批的此疫苗的10个鸡剂量。

⁴针对病态保护的鸟的数-针对死亡率/总保护的鸟的数(MTD：至死亡的平均时间(天))。

⁵攻击株是HPAI H5N1分化体2.2A/天鹅/法国/06299/06分离物；通过眼鼻途径施用6log10EID50。

无鸟在攻击之前针对HP H5N1 06167i分化体2.2.1抗原(接近于攻击株)发展可检测的AI HI抗体。

这些后期攻击由于它们诱导100％病态及杀死多数未疫苗接种的对照鸭而有效(仅1只患病鸟在D86后期攻击中生存；见表14)。用vAVW03免疫接种的多数鸟被保护；仅1/8显示弱临床体征及在D65攻击时生存，及1/9显示临床体征及在D86攻击时死亡。自初施-追施(在D2是TROVAC AIV-H5和在D15是vAVW03)组的全部鸟在两次攻击中生存；仅1只鸟在早先(D65)攻击时显示临床体征。自用灭活的Re5疫苗免疫接种的组4中无鸟显示临床体征或死亡。

在攻击之后也研究口咽和泄殖腔脱落。全部对照鸟以高水平(分别通过口咽和泄殖腔途径6.8和4.9相当的EID50/mL)脱落病毒及持续至少9.5天(对于幸存者)。在组2和3中，脱落水平更低(分别约1和2log10更低)，且其相比对照组更快降低。组4中的脱落特征接近于组3中观察到的那些。

结果，一次施用vAVW03到俄国小鸭(2日龄)提供良好水平的保护性免疫达84日龄。用鸡痘载体然后是NDV载体初施-追施方案提供相比一次施用NDV载体更佳的保护性免疫应答和与灭活的Re5疫苗类似的保护性应答。

【实施例4.5：鸭研究5：北京小鸭中的vAVW003功效】

此研究的目的是评价vAVW03在北京鸭中针对HPAI H5N1攻击的功效。如显示于表15对7日龄北京小鸭疫苗接种。攻击株是HPAIH5N1分化体2.2A/火鸡/土耳其/1/2005分离物；使用分别在D28和D42通过眼鼻途径施用的6和7log10EID50。攻击之后记录临床体征(病态)和死亡(死亡率)。攻击之后使用实时RT-PCR在攻击后2，5和8天(dpc)取的颊和泄殖腔拭子中测量脱落。研究设计及保护结果显示于表15。

表15：鸭研究5：设计及保护结果

¹vAVW03由眼-鼻途径用50μl疫苗悬浮液(矿物质水用作稀释剂)施用；TROVAC-AIV H5由皮下途径用0.2ml疫苗悬浮液(Marek氏疫苗稀释剂用作稀释剂)施用。

²vAVW03的剂量以log10EID50表示及TROVAC-AIV H5的剂量以log10TCID50表示；TROVAC-AIV H5的剂量对应于商业批的此疫苗的10个鸡剂量

³vFP89：鸡痘病毒载体AIV H5(见，US 2008/0107681和US2008/0107687)。

⁴Re5：基于含有自HPAI H5N1A/鸭/安徽/1/2006(分化体2.3)的修饰的HA基因和NA基因的反向遗传学株的油-辅佐的灭活的疫苗。

⁵对于在2，5或8dpc的颊或泄殖腔拭子的阳性鸡数。

结果表明，北京鸭相对耐受H5N1攻击，由于仅约一半的非-免疫接种的鸟在攻击之后显示临床体征或死亡。不过，多数它们脱落可检测的量的病毒，指示攻击株的活跃的复制。全部免疫接种的鸭在两个攻击日被临床保护，及脱落病毒的鸟的数相比未疫苗接种的对照降低。这些结果表明在北京小鸭中显著保护可被vAVW03诱导。

【实施例4.6：鸭研究6：在有NDV MDA的一日龄北京小鸭中的vAVW003功效】

鸭研究6的目的是评价在产自用含有NDV抗原的灭活的combo疫苗免疫接种的种禽的北京鸭种由一次施用vAVW03诱导的HPAIH5N1功效，以便评价NDV MDA对vAVW03-诱导的功效的效应。将有NDV MDA的2日龄北京小鸭用于此研究。也使用SPF俄国小鸭以确证攻击。研究设计及保护数据显示于表16。

表16：鸭研究6设计及免于HPAI H5N1攻击的保护结果

^*ON＝眼-鼻

^**攻击株是HPAI H5N1分化体2.2A/天鹅/法国/06299/06分离物；通过眼鼻途径在D24施用6log10EID50；MTC：至临床体征的平均时间(天)；MTD：至死亡的平均时间(天)

通过非-免疫接种的俄国小鸭用作对照的快速死亡率(攻击后3.5天全部死亡)确认HPAI H5N1攻击。但是，非-免疫接种的北京鸭更耐受H5N1攻击得多，由于攻击后6.5天仅3/5显示临床体征，和仅1/5死亡。针对病态的部分保护(67～89％)被vAVW03诱导，及在北京小鸭中无明显的剂量-或施用途径-效应。

全部对照北京鸭通过口咽途径脱落病毒。疫苗接种的组中的脱落在载量，时间及阳性鸟的数中降低。

此研究显示可用一次施用vAVW03在有NDV MDA的北京鸭中诱导AI保护。

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