ES2636464T3 - Herpesvirus aviares recombinantes multivalentes y vacunas para inmunizar especies aviares - Google Patents

Herpesvirus aviares recombinantes multivalentes y vacunas para inmunizar especies aviares Download PDF

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Abstract

Un herpesvirus aviar recombinante, que comprende al menos dos secuencias de nucleótidos recombinantes, codificando cada secuencia de nucleótidos recombinante un péptido antigénico distinto procedente de un patógeno aviar, en donde cada una de dichas al menos dos secuencias de nucleótidos recombinantes está insertada en una región no codificadora distinta del genoma viral elegida entre la región situada entre UL44 y UL45, la región situada entre UL45 y UL46, la región situada entre US10 y SORF3, y la región situada entre SORF3 y US2.

Description

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DESCRIPCION
Herpesvirus aviares recombinantes multivalentes y vacunas para inmunizar especies aviares Campo de la invencion
La presente invencion se refiere en general al campo de las preparaciones de vacunas. La presente invencion se refiere espedficamente a herpesvirus recombinantes multivalentes en los que se han insertado al menos dos genes extranos y sus usos para inducir simultaneamente una inmunidad protectora frente a una pluralidad de enfermeda- des aviares.
Antecedentes de la invencion
La carne y los huevos de aves de corral son importantes fuentes de alimentos, cuyo consumo aumenta continua- mente debido al crecimiento de la poblacion humana y su gran relacion calidad-precio. La reciente epidemia de gripe aviar centro la opinion publica en la salud de las aves de corral, asf como en la inocuidad y seguridad de los alimentos. La tecnologfa de las vacunas para aves de corral se convirtio en una preocupacion mundial.
Los vectores virales que expresan protemas patogenas se usan comunmente como vacunas para aves de corral contra patogenos dianas. Las vacunas que incluyen dichos vectores virales inducen la expresion de protemas patogenas extranas dentro de las celulas infectadas y por tanto inducen la inmunidad correspondiente por linfocitos T.
Es bien sabido que todos los herpesvirus, incluyendo el herpesvirus de pavo (HVT, por sus siglas en ingles) y el virus de la enfermedad de Marek (MDV, por sus siglas en ingles), pueden sobrevivir permanentemente en el cuerpo de un animal infectado en estado de infeccion latente o persistente. En consecuencia, se han desarrollado herpesvirus recombinantes, en los que se ha integrado un gen extrano procedente de un patogeno, para ser utilizados como vacunas vectorizadas virales, aumentando la duracion de la inmunidad en un animal inmunizado.
La estructura genomica del HVT, su amplio uso como vacuna contra el MDV y su capacidad para permanecer persistente en pollos, hacen de este virus un vector atractivo para la produccion de vacunas recombinantes para aves de corral.
Se han desarrollado preparaciones de vacunas para conseguir vacunaciones aviares eficaces, utilizando herpesvirus recombinantes que incorporan un gen que codifica un antfgeno extrano. Dichas preparaciones de vacunas permiten la vacunacion tanto contra el MDV (el vector) como otra enfermedad aviar, por medio de la secuencia de DNA extra- na insertada.
Aunque dichas preparaciones de vacunas proporcionan resultados eficaces para la vacunacion de especies aviares contra muchas enfermedades mortales, se puede producir competencia e inmunosupresion entre patogenos cuando las aves son inyectadas con dos o mas herpesvirus recombinantes, albergando cada uno un gen de antfgeno extrano diferente.
Por tanto, se estudiaran particularmente herpesvirus recombinantes multivalentes (es decir, que albergan al menos dos genes de antfgenos diferentes) para inmunizar simultaneamente frente a diferentes enfermedades. Sin embargo, hasta ahora, los HVT recombinantes (rHVT) que expresan multiples genes extranos resultaron ser inestables y todos o parte de los genes extranos se delecionan durante el pase repetido en celulas de cultivo. Por consiguiente, dichos vectores de virus multivalentes inestables no pueden utilizarse como vacunas eficaces.
En consecuencia, se necesitan vectores virales recombinantes multivalentes estables, que permitan la coexpresion de los genes extranos en celulas infectadas.
Sumario de la invencion
El trabajo realizado por la sociedad solicitante ha conducido al descubrimiento sorprendente de que se puede usar un conjunto de sitios de insercion particulares en un genoma de herpesvirus para insertar y expresar establemente dos o mas genes de antfgenos, proporcionando con ello vectores virales multivalentes eficaces para la vacunacion aviar. Mas particularmente, la sociedad solicitante ha encontrado que se pueden usar simultaneamente algunos sitios de insercion para incorporar genes de antfgenos distintos, proporcionando vectores virales recombinantes multi- valentes estables.
Por tanto, la presente invencion se refiere a un herpesvirus aviar recombinante, que comprende al menos dos se- cuencias de nucleotidos recombinantes, codificando y expresando cada secuencia de nucleotidos recombinante en celulas de especies aviares un peptido antigenico, en donde dichas al menos dos secuencias de nucleotidos recombinantes estan insertadas en distintas regiones no codificadoras del genoma viral elegido entre la region situada entre UL44 y UL45, la region situada entre UL45 y UL46, la region situada entre US10 y SORF3 y la region situada entre SORF3 y US2.
En una realizacion preferida, se inserta una secuencia de nucleotidos recombinante en la region situada entre UL45 y UL46, y se inserta una secuencia de nucleotidos recombinante en la region situada entre UL44 y UL45, entre US10 y SORF3 o entre SORF3 y US2. Como se ilustra en la solicitud, dichas construcciones de herpesvirus aviar recombinante proporcionan una expresion particularmente estable y eficaz de los dos peptidos antigenicos correspondien- tes en celulas aviares infectadas.
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En particular, ventajosamente, las dos o mas secuencias de nucleotidos recombinantes se coexpresan en celulas de fibroblastos de embriones de pollo (CEF, por sus siglas en ingles), incluso despues de 10 o mas pases, y preferible- mente incluso despues de 15 pases.
De acuerdo con la invencion, las secuencias de nucleotidos recombinantes estan ventajosamente bajo el control de promotores particulares. Los promotores se eligen preferiblemente entre promotor de beta-actina (Bac) de pollo, promotor Pec, promotor inmediato-temprano (ie)1 de citomegalovirus de murido (Mcmv, por sus siglas en ingles), promotor de citomegalovirus humano (Hcmv, por sus siglas en ingles), promotor del virus de simio (SV)40 y promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en ingles) o cualquiera de sus fragmentos que retenga una acti- vidad promotora. Preferiblemente, cada secuencia de nucleotidos recombinante esta bajo el control de un promotor distinto.
De acuerdo con la invencion, los genes extranos se eligen ventajosamente entre un peptido antigenico de paramixo- virus aviar tipo 1 y preferiblemente la protema F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV, por sus siglas en ingles), un peptido antigenico del virus de la enfermedad de Gumboro, preferiblemente la protema VP2 del virus de la bursitis infecciosa (IBDV, por sus siglas en ingles), un peptido antigenico del virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV, por sus siglas en ingles), preferiblemente la protema gB, un peptido antigenico de Mycoplasma gallisepticum, preferiblemente la protema 40K, y un peptido antigenico del virus de la gripe aviar, preferiblemente una protema de superficie hemaglutinina (HA).
En una realizacion preferida, el herpesvirus aviar recombinante comprende una primera secuencia de nucleotidos recombinante que codifica un primer peptido antigenico insertado en la region no codificadora situada entre UL44 y UL45 y una segunda secuencia de nucleotidos recombinante que codifica un segundo peptido antigenico insertado en la region no codificadora situada entre UL45 y UL46, entre US10 y SORF3 o entre SOrF3 y US2.
En otra realizacion preferida, el herpesvirus aviar recombinante comprende una primera secuencia de nucleotidos recombinante que codifica un primer peptido antigenico insertado en la region no codificadora situada entre UL45 y UL46, y una segunda secuencia de nucleotidos recombinante que codifica un segundo peptido antigenico insertado en la region no codificadora situada entre US10 y SORF3 o entre SORF3 y US2.
En una realizacion mas preferida, el herpesvirus aviar recombinante comprende una primera secuencia de nucleotidos recombinante que codifica un primer peptido antigenico insertado en la region no codificadora situada entre US10 y SORF3 y una segunda secuencia de nucleotidos recombinante que codifica un segundo peptido antigenico insertado en la region no codificadora situada entre SORF3 y US2.
Un objeto mas de la invencion se refiere a una vacuna multivalente para inmunizar especies aviares, tales como aves de corral, que comprende una cantidad inmunizante eficaz de herpesvirus aviar recombinante de la invencion. Esta vacuna se puede usar para inmunizar especies aviares, tales como aves de corral.
Tambien se describe en la presente memoria un antisuero dirigido contra el herpesvirus aviar obtenido inmunizando especies aviares con una cantidad eficaz del herpesvirus aviar recombinante de la invencion y recuperando el antisuero despues de extraer sangre al ave.
La invencion se refiere ademas a un metodo de inmunizacion de un ave que comprende administrar a dicha ave una cantidad inmunizante eficaz de la vacuna de acuerdo con la invencion.
La invencion proporciona ademas un kit de vacunacion para inmunizar especies aviares que comprende una cantidad eficaz de la vacuna de la invencion, y un medio para administrar dichos componentes a dicha especie.
La invencion se puede usar en cualquier ave, para la vacunacion contra cualquier patogeno aviar.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 ilustra el diagrama esquematico del genoma del HVT. Estan marcadas las posiciones de los genes largos unicos (UL, por sus siglas en ingles) a saber UL44, UL45 y UL46 y las posiciones de los genes cortos unicos (US, por sus siglas en ingles), a saber US10, SORF3 y US2. Las secuencias de nucleotidos recombinantes pueden estar insertadas en sitios Sfil generados por PCR entre UL44 y UL45 y/o entre UL45 y UL46 y/o entre US10 y SORF3 y/o entre SORF3 y US2.
Las Figuras 2A y 2B ilustran diagramas esquematicos del genoma del HVT que integran diferentes agrupamientos de secuencias de nucleotidos y promotores, de acuerdo con realizaciones particulares de la invencion.
La Figura 3 muestra la tincion por inmunofluorescencia de los CEF infectados con los HVT recombinantes dobles de acuerdo con las realizaciones de la invencion (FW129 y FW141) que coexpresan NDV-F e IBDV-VP2 (celulas infec- tadas con rHVT/ND/IBD). La expresion de la protema VP2 fue detectada por el Mab anti-VP2 (R63) y Alexa Flour 546. La expresion de la protema F fue detectada por suero de conejo anti-F n° 35 y Alexa Flour 488. Los resultados muestran que ambas celulas infectadas con FW129 o FW141 expresan tanto la protema NDV-F insertada como la protema IBDV-VP2 insertada.
Las Figuras 4A y 4B son analisis de transferencia de Western que muestran la expresion de la protema VP2 y/o la protema F en celulas de CEF infectadas con los rHVT de la invencion. Como se muestra en la Figura 4A, se observo
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una banda de proteinas de 60 kilodaltones (kDa) solo en la pista con celulas infectadas con rHVT/ND/IBD, que era el tamano esperado de la proteina F (-^).
No habia banda en la pista de rHVT/44-45BacVP2 (FW123). Como se muestra en la Figura 4B, la proteina VP2 se observo a 38 kilodaltones (kDa) en las pistas de cada rHVT/ND/IBD ).
Por el contrario, no habfa banda en la pista de rHVT/45-46 PecF (FW029). La proteina de 38 kDa es la VP2 madura (A. A. Azad et al., 1987, Virol. 161: 145-152, K. J., Fahey et al., 1985 J. Gen. Virol. 66: 1479-1488). Los rHVT dobles de la invencion expresaban tanto NDV-F como IBDV-VP2.
Las Figuras 5A a 5D muestran los resultados de un analisis de transferencia de Southern para la verificacion de la estructura genomica de FW129 purificado (rHVT/45-46 PecF/44-45 RSV VP2), indicando que HVT/ND/IBD recombi- nante doble de la invencion tema la estructura genomica esperada. Mas precisamente, los resultados de la transferencia de Southern mostraron que:
- un fragmento de 2077 pb estaba hibridado con una sonda para VP2 en el DNA de cada HVT FW129 re- combinante doble (columnas 1, 2 y 3, Figura 5A). En contraste, no se detecto ninguna banda en p45/46Pec F (Figura 5A).
- un fragmento de 2744 pb estaba hibridado con una sonda para F en el DNA de cada HVT FW129 recom- binante doble (columnas 1, 2 y 3, Figura 5C). No se detecto ninguna banda en p45/46 Sfil.
- los fragmentos de 2077 pb y 1228 pb estaban hibridados con una sonda para IS44/45 en el DNA de cada HVT FW129 recombinante doble (columnas 1, 2 y 3, Figura 5B). No se detecto ninguna banda para el marcador molecular lambda HindIII digerido (columna M, Figura 5B).
- los fragmentos de 2744 pb y 770 pb estaban hibridados a la sonda para IS45/46 en el DNA de cada HVT FW129 recombinante doble (columnas 1, 2 y 3, Figura 5D).
Las Figuras 6A y 6B muestran los resultados de un analisis de transferencia de Western para verificar la estabilidad de HVT FW129 recombinante en pases sucesivos, lo que indica que despues de 15 pases la proteina F y la proteina VP2 se expresaron establemente en CEF infectados con el rHVT FW129 de la invencion.
Las Figuras 7A a 7D muestran los resultados de un analisis de transferencia de Southern para verificar la estabilidad de los HVT recombinantes despues de 15 pases (Figura 7A). Los resultados de la transferencia de Southern muestran que un fragmento de 2077 pb estaba hibridado a una sonda para VP2 en el DNA de FW129. El fragmento de 2334 pb estaba hibridado a una sonda para VP2 en el DNA de FW130. Por el contrario, no se detecto ninguna banda en p45/46Pec F (Figura 7C). Los resultados de la transferencia de Southern muestran que un fragmento de 2744 pb estaba hibridado a la sonda para F en el DNA de cada HVT FW129 y FW130 recombinantes dobles. No se detecto ninguna banda en el p45/46 Sfil (Figura 7B). Los resultados de la transferencia de Southern muestran que fragmentos de 2077 pb y 1228 pb estaban hibridados a la sonda para IS44/45 en el DNA de FW129 y que fragmentos de 2334 pb y 1022 pb estaban hibridados a una sonda para IS44/45 en el DNA de FW130. Un fragmento de 1350 pb estaba hibridado a una sonda para IS44/45 en p45/46 PecF, que no contema ningun gen en el sitio IS44/45 (Figura 7D). Los resultados de la transferencia de Southern muestran que fragmentos de 2744 pb y 770 pb estaban hibridados a la sonda para IS45/46 en el DNA de cada HVT FW129 y FW130 recombinantes dobles. La transferencia de Southern con la sonda para 44/45 y la sonda para 45/46 mostro el gen VP2 o el gen F mantenidos establemente en el sitio de insercion 44/45 o 45/46 respectivamente en FW129 y FW130. Estos resultados indican que despues de 15 pases la proteina F y la proteina VP2 se expresaban establemente en CEF infectados con el rHVT FW129 de la invencion.
Las Figuras 8A y 8B muestran los resultados comparativos de los tttulos anti-NDV (Figura 8A) y de los tttulos anti- IBDV (Figura 8B) obtenidos de pollos inoculados con los HVT recombinantes dobles (FW122, FW137, FW129, FW130, FW135) en comparacion con los tttulos obtenidos de pollos inoculados solo con los HVT recombinantes (FW029 y FW023 respectivamente).
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere generalmente a herpesvirus recombinantes multivalentes y a su uso para inmunizar especies aviares contra al menos dos enfermedades al mismo tiempo. De acuerdo con la invencion, se insertan se- cuencias de DNA extranas en sitios de insercion particulares dentro del genoma de rHV, proporcionando construc- ciones estables y eficaces adecuadas para su uso en composiciones o metodos de vacunas.
La presente descripcion se entendera mejor con referencia a las siguientes definiciones:
Definiciones
En el contexto de la invencion, el termino "reconstruido" o "recombinante" con relacion a una secuencia, designa una secuencia, un acido nucleico o una unidad que no existe de forma natural y/o que ha sido modificado geneticamente usando tecnologfa de DNA recombinante (tambien denominada clonacion genica o clonacion molecular).
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El termino "recombinante" con relacion a un herpesvirus se refiere a un herpesvirus cuyo genoma ha sido modificado por insercion de al menos un acido nucleico heterologo, es decir, un acido nucleico (por ejemplo, DNA) que no se encuentra de forma natural en el genoma del herpesvirus o que se encuentra de forma natural en dicho genoma pero en una forma diferente o en una posicion diferente. Se entendera que el herpesvirus recombinante se puede fabricar por una variedad de metodos, y una vez fabricado, se puede reproducir sin el uso de tecnologfa de DNA recombinante adicional. Por tanto, la estructura del "herpesvirus recombinante" se describe en terminos de insercion de DNA.
En la presente descripcion, los terminos "acido nucleico", "secuencia nucleica" y "secuencia de nucleotidos" se usan indistintamente y se refieren a una molecula de acido nucleico que tiene una secuencia determinada, que puede ser de desoxirribonucleotidos y/o de ribonucleotidos. La secuencia de nucleotidos se puede preparar en primer lugar, por ejemplo, por tecnicas recombinantes, enzimaticas y/o qmmicas, y posteriormente se replican en una celula hospe- dante o en un sistema in vitro. Una secuencia de nucleotidos comprende preferiblemente un marco de lectura abierto que codifica un peptido. La secuencia de nucleotidos puede contener otras secuencias tales como un terminador de la transcripcion, un peptido de senal, un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, por sus siglas en ingles), un intron, etc. Preferiblemente, un marco de lectura abierto (ORF) en un acido nucleico recombinante no contiene un intron.
El termino "region no traducida" como se utiliza en la presente memoria se refiere a una region de nucleotidos que no tenga ORF y no defina una secuencia de aminoacidos de protema que se exprese por traduccion, o una region de nucleotidos en la que el ORF no esta implicado en ninguna transcripcion, traduccion o expresion de protemas.
El termino "especie aviaf se pretende que abarque toda clase de aves, tales como pajaros de la clase de Aves, es decir, animales vertebrados que tienen plumas, alas, son bfpedos, endotermicos y ponen huevos. En el contexto de la invencion, aviar o especies aviares se refieren mas particularmente a aves con intereses economicos y/o agrono- micos, tales como aves de corral (tales como pollos y pavos), aves acuaticas (tales como patos y gansos) y aves ornamentales (tales como cisnes y psitacidas).
El termino "vacuna" como se usa en la presente memoria, designa un agente que se puede usar para causar, esti- mular o amplificar una respuesta inmunitaria en un organismo.
Virus
Los virus para uso en la presente invencion son los que pertenecen generalmente al genero de herpesvirus aviares.
Por ejemplo, los herpesvirus aviares para uso en la presente invencion incluyen, aunque sin limitacion, un herpesvirus de pavos (HVT), un virus de la enfermedad de Marek de serotipo 2, preferiblemente la cepa SB1 del virus de la enfermedad de Marek de serotipo 2, o un virus de la enfermedad de Marek de serotipo 1, preferiblemente la cepa CVI988/Rispens del virus de la enfermedad de Marek de serotipo 1. Los herpesvirus preferidos de la invencion pro- ceden de serotipos o cepas que no son patogenos para las especies aviares diana.
Herpesvirus aviares recombinantes multivalentes
Un objeto de la invencion se refiere a herpesvirus aviares recombinantes adecuados para inmunizar especies aviares contra al menos dos enfermedades, con la estabilidad mejorada por medio de pases. Los inventores han identifi- cado sitios de insercion particulares que, en combinaciones, proporcionan una estabilidad mejorada para genes de antfgenos extranos.
Por tanto, un objeto de la invencion se refiere a un herpesvirus aviar recombinante, que comprende al menos dos secuencias de nucleotidos recombinantes, codificando cada secuencia de nucleotidos recombinante un peptido anti- genico distinto, en el que dichas al menos dos secuencias de nucleotidos recombinantes estan insertadas en regio- nes no codificadoras distintas del genoma viral elegidas entre la region situada entre UL44 y UL45, la region situada entre UL45 y UL46, la region situada entre US10 y SORF3 y la region situada entre SORF3 y US2.
La posicion de las regiones no codificadoras citadas es conocida en la tecnica y se puede encontrar, por ejemplo, en Kingham et al. ("The genoma of herpesvirus of turkeys: comparative analysis with Marek’s disease viruses" - Journal of General Virology (2001) 82, 1123-1135).
Por ejemplo, con referencia a un genoma completo FC126 (GenBank: AF291866.1), la region situada entre UL44 y UL45 corresponde a los nucleotidos 94243-94683 del genoma del HVT, la region situada entre UL45 y UL46 corres- ponde a los nucleotidos 95323-95443 del genoma de HVT, la region situada entre US10 y SORF3 corresponde a los nucleotidos 138688-138825 del genoma de HVT y la region situada entre SORF3 y US2 corresponde a los nucleotidos 139867-140064 del genoma de HVT.
El acido nucleico de interes para la insercion en el genoma del herpesvirus puede ser homologo o heterologo res- pecto al herpesvirus. El acido nucleico codifica tfpicamente un antfgeno de un patogeno y puede proceder u obtener- se de cualquier organismo patogeno capaz de causar una infeccion en especies aviares. Tfpicamente, los acidos nucleicos clonados proceden de patogenos que causan enfermedades que tienen un impacto economico en la in- dustria avfcola. Ejemplos de patogenos que causan infeccion en las aves incluyen virus, bacterias, hongos, protozoos, etc.
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La secuencia de nucleotidos homologa o heterologa para insercion en el genoma viral puede ser, por tanto, cualquier secuencia que codifique un peptido antigenico de un agente patogeno de aves. La secuencia de acidos nucleicos de acuerdo con la presente invencion puede proceder de cualquier fuente, por ejemplo, viral, procariota, eucariota o sintetica. Tfpicamente, las secuencias de nucleotidos codifican un peptido inmunogeno de un patogeno, y preferi- blemente representan protemas de superficie, protemas secretadas o protemas estructurales de dicho patogeno, o sus fragmentos.
La secuencia de nucleotidos puede codificar, por ejemplo, un peptido antigenico procedente del virus de la gripe aviar, paramixovirus aviar tipo 1, tambien denominado virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), metaneumovirus aviar, virus de la enfermedad de Marek, virus de la enfermedad de Gumboro, tambien denominado virus de la bursitis infecciosa (IBDV), virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILVT), virus de la bronquitis infecciosa (IBV), microorga- nismos que infectan especies aviares tales como Escherichia coli, especies de Salmonella, Pasteurella multocida, Riemerella anatipestifer, Ornitobacterium rhinotracheale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Myco- plasmas o coccidios.
Preferiblemente, las secuencias de nucleotidos insertadas en el genoma viral se eligen entre la protema F de NDV, la protema VP2 de IBDV, la protema gB de ILTV, la protema 40K de Mycoplasma gallisepticum y la protema de superficie hemaglutinina (HA) del virus de la gripe aviar.
Varias combinaciones de peptidos antigenicos pueden presentar gran interes, dependiendo de varios factores, tales como las especies aviares, pafs de crianza, condiciones de crianza, etc. Por ejemplo, en una realizacion, el herpesvirus aviar recombinante multivalente de la invencion incorpora en su genoma la secuencia de nucleotidos que codifica la protema F de NDV y la secuencia de nucleotidos que codifica la protema VP2 de IBDV.
De acuerdo con una realizacion particular, se pueden insertar tres o mas secuencias de nucleotidos en el genoma viral. El herpesvirus recombinante de la invencion puede expresar dos o mas antfgenos de un mismo patogeno.
Las secuencias de nucleotidos homologas o heterologas que codifican los antfgenos de interes pueden estar unidas operativamente a un promotor y ademas insertadas en el genoma viral. El promotor utilizado puede ser un promotor sintetico o natural, endogeno o heterologo.
El promotor no esta limitado siempre que pueda actuar eficazmente en celulas de aves infectadas con rHVT. Por tanto, la eleccion de un promotor se extiende a cualquier promotor eucariota, procariota o viral capaz de dirigir la transcripcion genica en celulas aviares infectadas por el rHVT.
Preferiblemente, los promotores se eligen entre el promotor de beta-actina (Bac) de pollo, el promotor Pec, el promotor ie1 de citomegalovirus de muridos (Mcmv), el promotor de citomegalovirus humano (Hcmv), el promotor del virus de simio (SV)40 y el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), o cualquiera de sus fragmentos que retenga una actividad promotora.
La secuencia de acidos nucleicos de un promotor de Bac de pollo se muestra en SEQ ID NO: 1, la secuencia de un promotor Pec se muestra en SEQ ID NO: 2, la secuencia de un promotor ie1 de Mcmv se muestra en SEQ ID NO: 3, la secuencia de un promotor de Hcmv se muestra en SEQ ID NO: 4, la secuencia de un promotor de SV40 se muestra en SEQ ID NO: 5 y la secuencia de un promotor de RSV se muestra en SEQ ID NO: 6.
Debe observarse que para su uso en la presente invencion los expertos en la tecnica conocen y/o pueden dise- nar/analizar variantes de dichas secuencias que codifican promotores funcionales.
En un herpesvirus recombinante preferido de la invencion, al menos uno de los acidos nucleicos comprende un promotor Pec o de Bac para dirigir la expresion del peptido antigenico.
Construccion multivalente
La clonacion de genes y la construccion de plasmidos son muy conocidas por una persona experta en la tecnica y pueden ser realizadas esencialmente por tecnicas estandar de biologfa molecular (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, N.Y. 2001).
Con el fin de construir un herpesvirus recombinante multivalente de la presente invencion, inicialmente, se propaga el herpesvirus en una celula hospedante adecuada y a continuacion se obtiene el DNA genomico. El hospedante y las condiciones para la propagacion del virus se seleccionan segun sea apropiado. Como celulas hospedantes, se prefieren las celulas procedentes de pollo y se pueden usar CEF (fibroblastos de embrion de pollo), celulas de rinon de pollo y similares. Se pueden cultivar en un medio de cultivo, tal como medio de cultivo MEM de Eagle, Leibowitz- L-15/McCoy 5A (mezcla 1:1) a aproximadamente 37°C durante 3 a 4 dfas.
El DNA se extrae de las celulas infectadas con virus cultivadas como anteriormente de acuerdo con un metodo con- vencional. Despues de que se desnaturaliza la protema en el tampon de lisis y se elimina, el DNA se extrae con fe- nol y etanol.
Tfpicamente, los virus recombinantes se pueden preparar por recombinacion homologa entre el genoma viral y una construccion (por ejemplo, un plasmido) que comprenda el acido nucleico que se va a insertar, flanqueado por nucleotidos del sitio de insercion para permitir la recombinacion.
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Plasmido con secuencia de los sitios de insercion
Una posibilidad para insertar un gen extrano en una de las regiones no traducidas del genoma viral de acuerdo con la invencion puede ser clonar en primer lugar una secuencia que contiene la region no traducida diana en un plasmido u otro vector adecuado. De acuerdo con la invencion, dicha secuencia se selecciona entre la secuencia de la region situada entre UL44 y UL45, la secuencia de la region situada entre UL45 y UL46, la secuencia de la region si- tuada entre US10 y SORF3 y la secuencia de la region situada entre SORF3 y US2.
Ejemplos de plasmidos comprenden pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC18, pUC19, pUC7, pUC8 y pUC9, ejemplos de fagos comprenden fago lambda y fago M13, y ejemplo de cosmidos comprende pHC79.
La secuencia de la region no traducida se integra en el plasmido de acuerdo con un metodo de clonacion convencio- nal. Las secuencias de la region de insercion tienen preferiblemente una longitud suficiente de modo que, por insercion del acido nucleico, las secuencias que flanquean el acido nucleico tienen una longitud apropiada de forma que permiten la recombinacion homologa in vivo con el genoma viral. Preferiblemente, las secuencias flanqueantes ten- dran al menos aproximadamente una longitud de 50 nucleotidos.
Con el fin de insertar una o mas secuencias extranas en la region no traducida, la mutacion se puede realizar en un sitio espedfico de la region no traducida para formar un nuevo sitio de escision para las enzimas de restriccion. Un metodo para realizar la mutacion puede ser un metodo convencional, y se puede usar un metodo comunmente utili- zado por un experto en la tecnica, tal como mutagenesis in vitro y PCR. Por tanto, en el metodo de PCR, se lleva a cabo una mutacion tal como la delecion, sustitucion o adicion de 1 a 2 nucleotidos en el cebador de PCR, y el ceba- dor se utiliza entonces para crear una mutacion.
Plasmido que contiene ademas secuencia(s) de nucleotidos extrana(s) diana(s)
Las secuencias de nucleotidos y promotores, para su insercion en el virus, se insertan ademas en la region de insercion del genoma viral en el plasmido.
Mas precisamente, las secuencias de nucleotidos y promotores se introducen en un fragmento de DNA del herpesvirus genomico que contiene secuencias de la region de insercion, subclonadas en el plasmido.
Si se desea, se puede preparar un plasmido, que contenga dos o mas secuencias de acidos nucleicos extranas, por ejemplo procedentes del mismo o diferentes patogenos, estando flanqueadas dichas secuencias por secuencias de la regiones de insercion, tal como se describe en la presente memoria.
Genoma viral que comprende una secuencia de nucleotidos extrana en un sitio de insercion
Los plasmidos, en los que se ha insertado al menos una secuencia de nucleotidos en la region no traducida obtenida como anteriormente, se pueden introducir en una celula infectada por HVT o celulas transfectadas con genoma de HVT usando electroporacion, fosfato de calcio, un metodo basado en lipofectina o similar. Cuando la cantidad del plasmido que se va a introducir esta en el intervalo de 0,1 a 1000 |jg, se consigue en las celulas una alta eficacia de generacion de los virus recombinantes por recombinacion entre las regiones homologas del DNA del HVT y el plas- mido.
Produccion del herpesvirus recombinante multivalente
El herpesvirus multivalente de la invencion se puede obtener cotransfectando en el mismo cultivo celular un plasmido que contiene, como se ha descrito anteriormente, una secuencia del sitio de insercion en la que esta integrada una secuencia de nucleotidos extrana y un herpesvirus recombinante que contiene, como se ha descrito anteriormente, el mismo sitio de insercion libre de secuencia de nucleotidos extrana y un segundo sitio de insercion en el que esta integrada una secuencia de nucleotidos extrana distinta. Esta cotransfeccion da como resultado la recombinacion del DNA plasirndico en el genoma viral.
De otro modo, el herpesvirus multivalente de la invencion se puede obtener cotransfectando en el mismo cultivo celular dos plasmidos, conteniendo cada uno una secuencia del sitio de insercion distinta en la que esta integrada una secuencia de nucleotidos extrana distinta y un herpesvirus que contiene, como se ha descrito anteriormente, los mismos sitios de insercion libres de la secuencia de nucleotidos extrana. La cotransfeccion da como resultado la recombinacion de ambos DNA plasmfdicos en el genoma viral.
El virus recombinante multivalente resultante se puede seleccionar genotfpicamente o fenotfpicamente usando tecni- cas conocidas de seleccion, por ejemplo, por hibridacion, detectando la actividad enzimatica codificada por un gen cointegrado junto con las secuencias de acidos nucleicos recombinantes o detectando inmunologicamente el peptido antigenico expresado por el herpesvirus recombinante. El herpesvirus recombinante seleccionado se puede cultivar a gran escala en un cultivo celular despues de lo cual se pueden recoger los herpesvirus recombinantes que contie- nen peptidos.
Construcciones multivalentes preferidas
Un objeto de la invencion es proponer herpesvirus recombinantes multivalentes que presentan al menos dos secuencias de nucleotidos extranas, estando insertadas cada una en un sitio de insercion particular, de manera ade- cuada para codificar y expresar los peptidos antigenicos correspondientes en celulas aviares.
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Entre la pluralidad de realizaciones posibles basadas en las combinaciones de los sitios de insercion dianas y las secuencias de nucleotidos recombinantes preferidas, y opcionalmente los promotores preferidos, la sociedad solici- tante ha encontrado sorprendentemente que combinaciones particulares presentan un alto nivel de estabilidad, per- mitiendo su uso para preparar vacunas multivalentes mejoradas.
Basandose en esta observacion, un objetivo de la invencion es proponer herpesvirus aviares recombinantes multivalentes espedficos con un alto nivel de estabilidad.
Los herpesvirus aviares recombinantes multivalentes preferidos de la invencion comprenden dos secuencias de nucleotidos recombinantes, codificando cada secuencia de nucleotidos recombinante un peptido antigenico distinto y estando insertada en una region no codificadora distinta del genoma viral elegida entre la region situada entre UL44 y UL45, la region situada entre UL45 y UL46, la region situada entre US10 y SORF3 y la region situada entre SORF3 y US2.
Los peptidos antigenicos preferidos de la invencion se eligen entre la protema F de NDV, la protema VP2 de IBDV, la protema gB de ILTV, la protema 40K de Mycoplasma gallisepticum y la protema de superficie HA del virus de la gripe aviar.
Ventajosamente, los promotores usados con las secuencias de nucleotidos insertadas en el sitio de insercion entre UL44 y UL45 se eligen entre el promotor Pec, el promotor ie1 de Mcmv, el promotor de Hcmv, el promotor de SV40 y el promotor de RSV, o cualquiera de sus fragmentos que retenga una actividad promotora. En realidad, la sociedad solicitante ha encontrado sorprendentemente que el promotor de Bac insertado entre UL44 y UL45 no permite la expresion estable de un gen extrano. Sin embargo, el promotor de Bac, insertado en la region entre UL45 y UL46 permite la expresion estable.
De acuerdo con una primera realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende, insertado entre UL45 y UL46, una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, pre- feriblemente bajo el control del promotor Pec, e insertada entre UL44 y UL45 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de SV40 (FW130).
De acuerdo con una segunda realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec, y en el sitio de insercion entre UL44 y UL45 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de RsV (FW129).
De acuerdo con una tercera realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec, y en el sitio de insercion entre UL44 y UL45 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv (FW141).
De acuerdo con una cuarta realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec, y en el sitio de insercion entre SORF3 y US2 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv (FW144).
De acuerdo con una quinta realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec, y en el sitio de insercion entre SORF3 y US2 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac (FW146).
De acuerdo con una sexta realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL44 y UL45 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec, y en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv (FW143).
De acuerdo con una septima realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL44 y UL45 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv, y en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac (FW142).
De acuerdo con una octava realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre SORF3 y US2 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec, y en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de
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nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac (FW147).
De acuerdo con una novena realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmented, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac, y en el sitio de insercion entre SORF3 y US2 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv (FW145).
De acuerdo con una decima realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac, y en el sitio de insercion entre SORF3 y US2 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de SV40 (FW149).
De acuerdo con una undecima realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de SV40, y en el sitio de insercion entre SORF3 y US2 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac (FW148).
De acuerdo con una duodecima realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec, y en el sitio de insercion entre US10 y SORF3 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv (FW153).
De acuerdo con una decimotercera realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec, y en el sitio de insercion entre US10 y SORF3 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac (FW154).
De acuerdo con una decimocuarta realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac, y en el sitio de insercion entre US10 y SORF3 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv (FW155).
De acuerdo con una decimoquinta realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac, y en el sitio de insercion entre US10 y SORF3 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec (FW156).
De acuerdo con una decimosexta realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre US10 y SORF3 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec, y en el sitio de insercion entre SORF3 y US2 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv (FW157).
De acuerdo con una decimoseptima realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre US10 y SORF3 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv, y en el sitio de insercion entre SORF3 y US2 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac (FW158).
De acuerdo con una decimoctava realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre US10 y SORF3 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac, y en el sitio de insercion entre SORF3 y US2 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv (FW159).
De acuerdo con una decimonovena realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre US10 y SORF3 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv, y en el sitio de insercion entre SORF3 y US2 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec (FW160).
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De acuerdo con una vigesima realizacion, el herpesvirus aviar recombinante comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus frag- mentos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv, y en el sitio de insercion entre US10 y SORF3 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec (FW161).
Cultivos celulares
Los virus recombinantes resultantes de la presente invencion pueden propagarse en cultivos celulares en los que puedan propagarse y crecer dichos virus recombinantes. Despues de que se consigue el crecimiento requerido de los virus las celulas se pueden retirar de los pocillos usando un raspador o con tripsina y las celulas infectadas se pueden separar del lfquido sobrenadante por centrifugacion.
En realizaciones preferidas de la invencion se pueden usar, como las celulas hospedantes para la propagacion de herpesvirus recombinantes CEF, huevo embrionado, celula de rinon de pollo y similares. Los virus recombinantes multivalentes de la presente invencion se pueden cultivar en un medio de cultivo, tal como medio de cultivo MEM de Eagle, Leibowitz-L-15/McCoy 5A (mezcla 1:1) a aproximadamente 37°C durante 3 a 4 dfas. Las celulas infectadas asf obtenidas se ponen en suspension en un medio de cultivo que contiene dimetilsulfoxido (DMSO) al 10% y se conservan congeladas bajo nitrogeno lfquido.
Ventajosamente, los herpesvirus multivalentes recombinantes de la invencion presentan un alto nivel de estabilidad por medio de pases, que corresponde a una coexpresion de las secuencias de nucleotidos recombinantes en celulas de especies aviares incluso despues de 10 o mas pases. En el contexto de la invencion un "pase" o "pase de celulas" significa un cultivo de celulas en condiciones adecuadas para permitir su crecimiento y mantenerlas vivas hasta que son confluentes del 90% al 100%. La etapa de pase consiste en transferir un pequeno numero de celulas del cultivo confluente previo a un nuevo medio de cultivo. Una parte almuota del cultivo confluente previo, que contiene unas cuantas celulas, se puede diluir en un gran volumen de medio de nueva aportacion. En el caso de cultivos ad- herentes, las celulas se pueden retirar primero, por ejemplo usando una mezcla de tripsina y EDTA, o cualquier en- zima adecuada, antes de usar un numero reducido de celulas retiradas para sembrar un nuevo medio de cultivo.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la invencion, las celulas CEF transfectadas con herpesvirus aviares recombinantes de la invencion todavfa coexpresan los peptidos antigenicos correspondientes despues de al menos 10 pases. En otras palabras, las celulas CEF resultantes de 10 o mas pases de celulas CEF transfectadas con herpesvirus aviares recombinantes de la invencion, y mas particularmente resultantes de 15 pasajes, contienen todavfa las secuencias de nucleotidos extranas del herpesvirus aviar recombinante usado para la transfeccion inicial de celulas y expresan los al menos dos peptidos antigenicos correspondientes. En el contexto de la invencion, se considera que las celulas de dicho pase todavfa expresan los peptidos antigenicos si el nivel de produccion es superior al 80% del nivel de produccion del primer pase, y preferiblemente superior al 85%.
Composiciones de vacunas multivalentes
La invencion se refiere tambien a una vacuna multivalente para inmunizar especies aviares, tales como aves de corral, que comprende una cantidad inmunizante eficaz de un herpesvirus aviar recombinante multivalente de la inven- cion.
Preferiblemente, las vacunas de la invencion son capaces de causar o estimular o amplificar la inmunidad contra al menos dos patogenos elegidos entre paramixovirus aviar de tipo 1, virus de la enfermedad de Gumboro, virus de la laringotraqueitis infecciosa, Mycoplasma gallisepticum y virus de la gripe aviar. Las vacunas de la invencion com- prenden una cantidad inmunologicamente eficaz de un herpesvirus recombinante multivalente como se ha descrito anteriormente, en un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Un herpesvirus recombinante multivalente de acuerdo con la invencion se puede usar preferiblemente como una vacuna viva aunque otras alternativas como vacunas inac- tivadas o vacunas atenuadas estan dentro de la capacidad de un experto en la tecnica.
La vacuna de acuerdo con la presente invencion puede comprender ademas un disolvente adecuado, tal como por ejemplo un tampon acuoso o un tampon de fosfato. Preferiblemente, la vacuna tambien comprende aditivos. Los aditivos de la presente invencion se pueden obtener a partir de cualquiera de un numero de fuentes que incluyen diversas protemas y peptidos procedentes de animales (por ejemplo, hormonas, citoquinas, factores coestimulado- res) y nuevos acidos nucleicos procedentes de virus y otras fuentes (por ejemplo, RNA bicatenario, CpG), y similares, que se administran con la vacuna en una cantidad suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria. Ademas, cualquier numero de combinaciones de las sustancias mencionadas anteriormente puede proporcionar un efecto de inmunopotenciacion y, por tanto, puede formar un inmunopotenciador de la presente invencion.
Las vacunas de la presente invencion se pueden formular adicionalmente con uno o mas aditivos para mantener la isotonicidad, el pH fisiologico y la estabilidad, por ejemplo, un tampon, tal como solucion salina fisiologica (0,85%), solucion salina tamponada con fosfato (PBS), tampones de citrato, tris(hidroximetil)-aminometano (TRIS), solucion salina tamponada con Tris y similares, o un antibiotico, por ejemplo, neomicina o estreptomicina, etc.
La via de administracion puede ser cualquier via que incluya administracion oral, ocular (por ejemplo, por gotas para ojos), oculo-nasal usando vacunacion por aerosol, intranasal, cloacal en alimentacion, en agua, o por pulverizacion, in ovo, topicamente o por inyeccion (por ejemplo, Intravenosa, subcutanea, intramuscular, intraorbital, intraocular,
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intradermica y/o intraperitoneal). El experto adaptara facilmente la formulacion de la composicion de vacuna para cada tipo de via de administracion.
]Cada dosis de vacuna puede contener una dosis adecuada suficiente para provocar una respuesta inmunitaria pro- tectora en especies aviares. La optimizacion de dicha dosis es bien conocida en la tecnica. La cantidad de antfgeno por dosis se puede determinar por metodos conocidos usando reacciones antigeno/anticuerpo, por ejemplo por el metodo ELISA.
Las vacunas de la invencion se pueden administrar como dosis unicas o en dosis repetidas, dependiendo del proto- colo de vacunacion.
Las vacunas de la presente invencion son ademas ventajosas porque confieren a las especies de aves hasta un 80% de proteccion contra los patogenos aviares dianas despues de 3 semanas de la vacunacion.
La presente invencion se refiere ademas al uso de la vacuna como se ha descrito anteriormente para inmunizar especies aviares, tales como aves de corral, y al metodo para inmunizar especies aviares por administracion de una cantidad inmunologicamente eficaz de la vacuna de acuerdo con la invencion. La vacuna se puede administrar ven- tajosamente por via intradermica, subcutanea, intramuscular, oral, in ovo, por administracion mucosal o por adminis- tracion oculo-nasal.
La presente invencion se refiere ademas a kits de vacunacion para inmunizar especies aviares que comprenden una cantidad eficaz de la vacuna multivalente que se ha descrito antes y un medio para administrar dichos componentes a dichas especies. Por ejemplo, dicho kit comprende un dispositivo de inyeccion lleno con la vacuna multivalente de acuerdo con la invencion e instrucciones para inyeccion intradermica, subcutanea, intramuscular o in ovo. Alternati- vamente, el kit comprende un dispositivo de pulverizacion/aerosol o de gotas para los ojos lleno con la vacuna multivalente de acuerdo con la invencion e instrucciones para la administracion oculo-nasal, oral o mucosal.
La presente invencion se explicara ahora con mas detalle con referencia a los siguientes experimentos y ejemplos, pero no debe interpretarse que la presente invencion esta limitada por estos experimentos y ejemplos.
Experimentos
En los experimentos se han usado varios herpesvirus recombinantes (monovalentes o multivalentes de acuerdo con la invencion), designados como sigue (HVT/primer sitio de insercion-primer gen extrano/segundo sitio de insercion- segundo gen extrano):
FW122: HVT/45-46 Hcmv VP2 Bac F
FW123: HVT/44-45 Bac VP2,
FW125: HVT/45-46 Bac F/44-45 Hcmv VP2
FW129: HVT/45-46 PecF/44-45 Rsv VP2
FWI30: HVT/45-46 PecF/44-45 SV40 VP2
FW135: HVT/45-46 sv40 F/44-45 Bac VP2
FW137: HVT/45-46 Pec F sv40 VP2
FWI41: HVT/45-46 PccF/44-45 Mcmv iclVP2
FW142: HVT/45-46 Bac VP2/44-45 Mcmv iel F
FW144: HVT/45-46 Pec F/87-88 Mcmv iel VP2
FWI45: HVT/45-46 Bac VP2/87-88 Mcmv iel F
FW023: HVT/45-46 Bac VP2
FW029: HVT/45-46 Pec F
Experimento 1: Construccion de vectores de homologia
La construccion del plasmido se realizo esencialmente por tecnicas estandares de biologia molecular (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001). Los fragmentos de restriccion de DNA se sometieron a electroforesis en geles de agarosa y se purificaron con el kit Plasmid plus Midi (QIAGEN, n° de Catalogo 12945)
Construccion de p44/45d46Sfi
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Basandose en la informacion del gen homologo gC (gCh) de MDV serotipo 1 (Coussens et al., J. Virol. 62: 23732379, 1988) y su fragmento BamHI-B adyacente (publicacion de patente japonesa no examinada n° H6-292583), se preparo por PCR un fragmento de DNA que tema un sitio Sfil entre los dos ORF, UL44h y UL45h, y se clono en pUCl8. En primer lugar, se preparo DNA de HVT a partir de celulas CEF infectadas con la cepa HVT FC126 de acuerdo con el metodo de Lee et al., (J. Gen. Virol., 51: 245-253, 1980). Utilizando el DNA del HVT obtenido como molde, la PCR se realizo con dos pares de cebadores.
El primer par era la SEQ ID NO: 7 (5'-CCCCGAATTCATGGAAGAAATTTCC-3') y SEQ ID NO: 8 (5'- CGCGGGCCAATAAGGCCAACATCGGGACGTACATC-3').
El segundo par era la SEQ ID NO: 9 (5'-GCGCGGCCTTATTGGCCTTAAATACCGCGTTTGGAG-3') y SEQ ID NO: 10 (5'-CCCCAAGCTTTCAAGTGATACTGCGTGA-3').
Usando como molde la mezcla de los dos productos de PCR obtenidos, se llevo a cabo otra PCR con las SEQ ID NO.7 y SEQ ID NO.10 para generar un fragmento que tema un sitio SfiI entre los dos ORF, UL44h y UL45h.
El fragmento resultante se digirio despues con EcoRI y HindIII y se ligo a pUC18, que habfa sido digerido con EcoRI y HindIII. El plasmido obtenido se denomino p44/45Sfi.
Para la construccion del HVT recombinante doble en el que estaban insertados dos genes en UL44/45 y UL45/46, respectivamente, se deleciono el gen UL46 de p44/45Sfi. El p45/46Sfi (patente de EE.UU. 7.569.365) digerido con EcoRI y SfiI se ligo con el enlazador dSfiI-EcoRI, dando como resultado el plasmido p44/45d46. El plasmido p44/45Sfi escindido con SphI y PstI se ligo con p44/45d46 escindido con las mismas enzimas, dando como resultado el plasmido p44/45d46Sfi.
Construccion de pHVT 87-88
El DNA del HVT se preparo a partir de celulas CEF infectadas con la cepa HVT FC126 de acuerdo con el metodo de Lee et al., (J. Gen. Virol., 51: 245-253, 1980). Utilizando como molde el DNA del HVT obtenido, la PCR se realizo con dos pares de cebadores. Cada cebador fue disenado basandose en la informacion de GenBank X68653.1. Se preparo por PCR un fragmento de DNA que tema un sitio SfiI entre dos ORF, US2 (HVT088) y SORF3 (HVT087) y se clono en pUC18.
El primer par era la SEQ ID NO.11 (5'-GGGAATTCGAAGAGCCCCCGCGGACGCATG-3') y la SEQ ID NO. 12 5'(- CCGCTAGCGGCCGCAAGTTCCTTCACCATGACCAG-3').
El segundo par era la SEQ ID NO 13 (5'-GCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCCGTAGCATAAAGACGCAGG-3') y la SEQ N° 14 (5'-CCAAGCTTCTAGTACATATATATACATGAC-3')
El primer fragmento resultante se digirio con EcoRI y NheI. El segundo fragmento resultante se digirio con NheI y HindIII. Estos fragmentos escindidos se integraron en pUC18 escindido con EcoRI y HindIII, dando como resultando el plasmido pHVT 87-88.
Construccion de pHVT 86-87
El DNA del HVT se preparo a partir de celulas CEF infectadas con la cepa HVT FC126 de acuerdo con el metodo de Lee et al. (J. Gen. Virol., 51: 245-253, 1980). Utilizando como molde el DnA del HVT obtenido, la PCR se realizo con dos pares de cebadores. Cada cebador fue disenado basandose en la informacion de GenBank X68653.1. Se prepa- ro por PCR un fragmento de DNA que tema un sitio SfiI entre dos ORF, US10 (HVT086) y SORF3 (HVT087) y se clono en pUC18.
El primer par era la SEQ ID NO. 15 (5'-GGGGGAATTCATTATCCCATCTAACAGTTATATACG-3') y la SEQ ID NO.16 (5'-GCCGCTAGCGGCCGCCTTTATTAACAACCTTAC-3').
El segundo par era la SEQ ID NO. 17 (5'-GCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCCGTTTATTCTATGTAAGAC-3') y la SEQ ID NO 18 (5'-CCCAAGCTTAAGTTCCTTCACCATG-3').
El primer fragmento resultante se digirio con EcoRI y NheI. El segundo fragmento resultante se digirio con NheI y HindIII. Estos fragmentos escindidos se integraron en pUC18 escindido con EcoRI y HindIII, dando como resultado el plasmido pHVT 86-87.
Construccion del vector de homolog^a
Promotor ie1 de Mcmv sintetizado qu^micamente
El promotor ie1 de Mcmv (SEQ ID NO. 19) se sintetizo basandose en la informacion de 4191-4731pb en GenBank L06816.1 descrito por Koszinowski, U. H. El promotor ie1 de Mcmv sintetizado se diseno para que se anadieran sitios BglI-PstI delante de el y se anadieran sitios XbaI-NotI al final.
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SEQ ID NO.19: GGCCAATAAG GCTGCAGTAC TGAGTCATTA GGGACTTTCC AATGGGTTTT GCCCAGTACA TAAGGTCAAT AGGGGTGAAT CAACAGGAAA
GTCCCATTGG AGCCAAGTAC ACTGAGTCAA TAGGGACTTT CCATTGGGTT
TTGCCCAGTA CAAAAGGTCA ATAGGGGGTG AGTCAATGGG TTTTTCCCAT
TATTGGCACG TACATAAGGT CAATAGGGGT GAGTCATTGG GTTTTTCCAG
CCAATTTAAT TAAAACGCCA TGTACTTTCC CACCATTGAC GTCAATGGGC
TATTGAAACT AATGCAACGT GACCTTTAAA CGGTACTTTC CCATAGCTGA
TTAATGGGAA AGTACCGTTC TCGAGCCAAT ACACGTCAAT GGGAAGTGAA
AGGGCAGCCA AAACGTAACA CCGCCCCGGT TTTCCCCTGG AAATTCCATA TTGGCACGCA TTCTATTGGC TGAGCTGCGT TCTACGTGGG TATAAGAGGC
GCGACCAGCG TCGGTACCGT CGCAGTCTTC GGTCTGACCA CCGTAGAACG
CAGAGCTCCT CGCTGCAGGC GGCCGCTCTA GA
Construccion de p44/45 Mcmv ie1 VP2 SPA
El p44-45d46Sfi escindido con Sfil se desfosforilo usando fosfatasa alcalina Shewanella sp. S1B1 Recombinant (PAP) (Funakoshi N° DE110). El fragmento se ligo con p45/46BacVP2 escindido con Bgll, dando como resultado el plasmido, p44/45d46 BacVP2. El promotor ie1 de Mcmv sintetizado (Bgll/Xbal) se ligo con p44/45d46 BacVP2 escindido con EcoRV y Xbal, y p44/45d46 Bac VP2 escindido con EcoRV y Bgll, dando como resultado p44/45d46 Mcmv ie1 VP2. Se integro la senal de poliA corta sintetizada (SPA: SEQ lD NO. 20 CTGCAGGCGGCCGCTCTAGAGTCGACA
ATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCCAATAAGGCC) en p44/45d46 Mcmv ie1 VP2 escindida con Sall y Sfil, dando como resultado el plasmido de homologia p44/45d46 Mcmv ie1 VP2 SPA.
Experimento 2: Purificacion del HVT recombinante en CEF transfectado con cada vector de transferencia
]Se preparo el DNA viral de la cepa FC126 de HVT de tipo natural (wt-HVT), tal como ha sido descrito por Morgan et al., (Avian Diseases, 34: 345-351, 1990). Los DNA virales de FW029 (rHVT/45-46PecF) y FW023 (rHVT/45- 46BacVP2) se prepararon por el metodo similar. El primer patron doble de rHVT fue que las celulas CEF fueron transfectadas con el DNA de wt-HVT preparado y p45/46SV40VP2 PecF (ex. FW137). El segundo patron fue que las celulas CEF fueron transfectadas con el DNA de FW029 preparado y p44/45 Mcmv ie1 VP2 (ex. FW141). El ter- cer patron fue que las celulas CEF fueron transfectadas con el DNA de FW023 preparado y p44/45 Mcmv ie1 F (ex. FW142). El cuarto patron fue que las celulas CEF fueron transfectadas con el DNA de FW029 preparado y pHVT87- 88Bac VP (ex. FW144). El quinto patron fue que las celulas CEF fueron transfectadas con el DNA de FW023 preparado y pHVT87-88Pec F (ex. FW145). Estos virus recombinantes resultantes se purificaron en placas mediante pla- cas de tincion con el anticuerpo anti-NDV-F y el anticuerpo anti-lBDV-VP2.
Brevemente, se pusieron en suspension 107 celulas CEF primarias en 100 pL de MEF-1 (Lonza LNJVD-1004) y se co-transfectaron con 1 pg del vector de homologia, por ejemplo, p44/45 Mcmv ie 1F y pHVT Bac VP2 y 2 pg de DNA del HVT, por ejemplo, FC126, FW029 y FW023 por electroporacion. La electroporacion se realizo en Nucleofector ll. Las celulas transfectadas se diluyeron en 20 mL de L-15 de Leibovitz (GlBCO BRL, N° de cat. 41300-39), medio 5A de McCoy (GlBCO BRL, n° de catalogo 21500-061) (1:1) y se extendio suero de ternera al 4% (solucion denominada medio LM (+)),100 pL por pocillo de placa de 96 pocillos.
lncubando a 37°C en CO2 al 5% hasta que las placas se hicieron visibles, las celulas se retiraron de las placas por tripsinizacion, se diluyeron en celulas CEF secundarias recien preparadas, se transfirieron por igual a dos placas de 96 pocillos y se incubaron durante 3 dias para visualizar las placas. Una de las dos placas fue tenida luego con el anticuerpo monoclonal anti-VP2 R63 (ATCC N°: HB-9490) como anticuerpo primario. Despues de detectar el pocillo que contenia las placas recombinantes tenidas, se recuperaron celulas del pocillo correspondiente de la otra placa, se diluyeron en celulas CEF secundarias recien preparadas y se transfirieron por igual a dos placas de 96 pocillos para completar la primera ronda de purificacion. Se repitio el procedimiento de purificacion hasta que cada placa obtenida estuviera tenida positivamente por el anticuerpo monoclonal R63. Posteriormente, el candidato de rHVT doble se tino por el anticuerpo anti-NDV-F 3-1G/5 (Morrison, T.G., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 1020-1024,
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1987) o suero de conejo anti-F. Finalmente, la expresion de protemas de cada una de las placas del rHVT candidato se confirmo por tincion con IFA doble. Los CEF infectados por cada rHVT se fijaron con una mezcla fna de acetona- metanol (2:1), se lavaron con PBS, se hicieron reaccionar con una mezcla de anticuerpos (suero de conejo anti-F diluido 1:1000 N° 35 y Mab R63 de raton anti-VP2) a 37°C en 60 minutos . Despues de lavar 3 veces con PBS, las celulas reaccionaron con una mezcla de anticuerpos fluorescentes (anti-conejo Alexa Fluor488 diluido 1:1000 y anti- raton Alexa Fluor546 proporcionados por Invitrogen) a 37°C en 60 minutos. Despues del lavar 3 veces con pBs, se observaron por microscopia de fluorescencia con 400 aumentos. La expresion de la protema VP2 fue detectada por el MAb Mab (R63) anti-VP2 y Alexa Flour 546. La expresion de la protema F se detecto por suero de conejo anti-F N° 35 y Alexa Flour 488. Cuando en todas las placas se expresaron tanto F como VP2, los inventores llegaron a la conclusion que se habfa completado la purificacion. La Figura 3 muestra algunos ejemplos de IFA dual.
El HVT recombinante purificado se denomino rHVT/ND/IBD.
La Tabla 1 siguiente muestra la expresion de la VP2 y la protema F obtenidas de los diferentes rHVT/ND/IBD. La cepa FW023 (HVT/45-46 Bac VP2) corresponde a un herpesvirus recombinante monovalente utilizado como control para la expresion de VP2, y la FW029 (hVt/45-46 PecF) corresponde a un herpesvirus recombinante monovalente utilizado como control para la expresion de la protema F.
Tabla 1. Expresion de los genes insertados NDV-F e IBDV-VP2 por rHVT/ND/IBD (Deteccion de fluorescencia)
Virus
Anticuerpo primario
Antisuero anti-F
Anticuerpo monoclonal anti-VP2 (R63) de conejo PBS
FW137
+w +w -
FW129
+ + -
FW130
+ + -
FW141
+ + -
FW142
+ + -
FW144
+ + -
FW145
+ + -
FW029
+ - -
FW023
- + -
FC126
- - -
Ninguno
- - -
+: Detectado, + w: Debilmente detectado, -: no detectado
Experimento 3: Coexpresion de dos protemas en CEF infectados con HVT recombinantes dobles
Se infectaron con HVT recombinantes 2 mL que conteman 2 x 105 celulas CEF, y se incubaron a 37°C en CO2 al 5%2 durante 3 dfas.
A continuacion, el cultivo se centrifugo a 300 g durante 3 minutos y las celulas precipitadas se volvieron a poner en suspension en 100 pL. A la suspension celular se anadio tampon Laemmli (100 jL). La mezcla resultante se hirvio a continuacion durante 5 minutos y 5 pL de la misma se sometieron a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 10%. Las protemas electroforetizadas se transfirieron desde el gel de SDS a una membrana de PVDF (Immobilon-P, Millipore), que se bloqueo en polvo de leche sin grasa al 1% p/v en PBS a temperatura ambiente durante una hora.
Para la deteccion de F (Figura 4A), la membrana tratada se hizo reaccionar luego con el antisuero de conejo anti-F N° 35 en una dilucion de 500 veces a temperatura ambiente durante una hora, se lavo tres veces con PBS y se incubo durante una hora con el antisuero de cabra anti-conejo biotinilado.
Para la deteccion de VP2 (Figura 4B), la membrana tratada se hizo reaccionar luego con el Mab R63 anti-VP2 en una dilucion de 500 veces a temperatura ambiente durante una hora, se lavo tres veces con PBS y se incubo durante una hora con el antisuero de cabra anti-raton biotinilado.
Despues de lavar tres veces con PBS, se incubo la membrana durante una hora con un complejo de avidina- fosfatasa alcalina, se lavo tres veces con PBS y una vez con TBS (solucion salina tamponada con Tris), y se hizo reaccionar con BCIP-NBT (un sustrato de fosfatasa alcalina). Como se muestra en la Figura 4A, se observo una banda de protema de 60 kilodaltones (kDa) solamente en la pista con celulas infectadas con rHVT/ND/IBD, que era el tamano esperado de la protema F (^). No habia banda en la pista de rHVT/44-45Bac VP2 (FW123).
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Se observo la proteina VP2 mostrada en la Figura 3B a 38 kilodaltones (kDa) en las pistas de cada rHVT/ND/IBD
). Por el contrario, no habia banda en la pista de rHVT/PecF (FW029) (Fig. 1 B). El peso molecular de 38 kDa es de la protema VP2 madura (A. A. Azad et al., 1987, Virol. 161: 145-152, K. J., Fahey et al., 1985 J. Gen. Virol. 66: 1479-1488).
Los HVT recombinantes dobles de acuerdo con la invencion expresaban tanto NDV-F como IBDV VP2.
Experimento 4: Verificacion de la estructura genomica Analisis de transferencia de Southern
El rHVT/ND/IBD purificado se propago en celulas CEF de un matraz de 25 cm2 para obtener las placas confluentes. Las celulas se recuperaron de las placas por raspado, se transfirieron a tubos Falcon y se sometieron a centrifugacion a 300 x g durante 5 minutos. Las celulas recogidas se lavaron con PBS, se volvieron a poner en suspension en 0,6 mL de PBS y 0,4 mL de tampon de lisis (TritonX-100 al 1,25%, 2-ME 250 mM y EDTA 50 mM en PbS) y se lisa- ron por agitacion con vortice durante 3 minutos. Los lisados se centrifugaron luego a 600 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y los hquidos sobrenadantes se transfirieron a tubos Falcon de 15 mL. Los virus se recogieron por centrifugacion a 20.400 x g durante 20 minutos. Los sedimentos resultantes se pusieron luego en suspension en 0,33 mL de una solucion de nucleasa (Tris-Cl 12,5 mM (pH 7,5), 1 pg/mL de DNasa I y 1 pg/mL de RNasa A), se incubaron a 37°C durante 30 minutos y se interrumpieron incubando a 55°C durante 30 minutos con 83 pL de solucion de SDS-proteasa (EDTA 50 mM, SDS al 5%, 0,5 mg/mL de proteasa K y 2-mercaptoetanol 28,5 mM). La mez- cla obtenida se trato dos veces con fenol-cloroformo y se anadio NaCl a la fase acuosa hasta la concentracion final de 0,2 M. El DNA viral se precipito anadiendo 2,5 volumenes de etanol enfriado con hielo, se lavo con etanol al 70% y se sometio a centrifugacion a 20.400 x g durante 20 minutos a 4°C. Despues del secado al aire, los sedimentos se disolvieron en tampon TE (Tris-Cl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM).
El DNA viral en tampon TE se digirio con Xhol, SphI y Smal y se sometio a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Los fragmentos de DNA electroforetizados en el unico gel se transfirieron simultaneamente a dos membranas de nilon (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edicion, 6.35, Sambrook, J., and Russell, D.W. Cold Spring Harbor Laboratory). Despues de fijar el DNA por coccion, el DNA inmovilizado se hibrido con una sonda marcada con DIG, "sonda para VP2" o "sonda para IS44/45" que se preparo con el kit de smtesis de sonda DIG para PCR (ROCHE DIAGNOSTICS, N° catalogo 1636090). Ademas, el DNA viral en tampon TE se digirio con XhoI y SphI, y se hibrido con una sonda marcada con DIG, "sonda para F", "sonda para IS45/46" por el mismo procedimiento mencionado anteriormente. La sonda para VP2 se preparo con VP2 STC-F (SEQ ID nO: 21) y VP2 STC-R (SEQ ID NO: 22) como cebadores y p45/46BacVP2-STC como molde. La sonda para F se preparo con F-F (SEQ ID NO. 23) y F-R (SeQ ID N° 24) como cebadores y p45/46PecF como molde. La sonda para IS45/46 se preparo con 45/46-F (SEQ ID NO. 25) y 45/46-R (SEQ ID NO. 26) como cebadores y pNZ45/46Sfi como molde. La sonda para IS44/45 se preparo con 44/45-F (SEQ ID NO: 27) y 44/45-R (SEQ ID NO: 28) como cebadores y pNZ44/45d46Sfi como molde.
VP2 STC-F
(SEQ ID NO: 21) 5'-CACCGTCCTCAGCTTACCCACATC-3'
VP2 STC-R
(SEQ ID NO: 22) 5'-ACGACGGATCCTGTTGCCACTCT-3'
NDV-F-F
(SEQ ID NO: 23) 5'-CTAGCAGTGGCAGTTGGGAAGAT-3'
NDV-F-R
(SEQ ID NO: 24) 5'-GTTAAGGCAGGGGAAGTGATTTGT-3'
45/46-F
(SEQ ID NO. 25) 5'-GGGGAAGTCTTCCGGTTAAGGGAC-3'
45/46-R
(SEQ ID NO: 26) 5'-GGTGCAATTCGTAAGACCGATGGG-3'
44/45-F
(SEQ ID NO: 27) 5'-GTACTATAGAATGTGTTCC-3'
44/45-R
(SEQ ID NO: 28) 5'-GTATCCAACGCCTCAAGATC-3'
Los resultados de la transferencia de Southern mostraron (Figuras 5A-5D) que un fragmento de 2077 pb estaba hi- bridado con la sonda para VP2 en el DNA de FW129. En contraste, no se detecto ninguna banda en p45/46Pec F.
Ademas, el fragmento de 2744 pb estaba hibridado con la sonda para F en el DNA de cada HVT recombinante do- ble. No se detecto ninguna banda en p45/46SfiI.
Los fragmentos de 2077 pb y de 1228 pb estaban hibridados con la sonda para IS44/45 en el DNA de FW129. El fragmento de 1350 pb estaba hibridado con la sonda IS44/45 en p45/46 PecF, y no estaba insertado ningun gen en el sitio IS44/45. Los fragmentos de 2744 pb y 770 pb estaban insertados con la sonda para IS45/46 en el DNA de cada HVT recombinante doble. La Figura 5A-5D indico que los recombinantes dobles hVt/ND/IBD obtenidos tienen la estructura genomica esperada.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Experimento 5: Estabilidad de los HVT recombinantes en los pases Analisis de transferencia de Western
Los HVT recombinantes dobles se sometieron a pases en serie (hasta 15 veces) en fibroblastos de embriones de pollo (CEF). A continuacion, los lisados celulares se aplicaron a analisis de transferencia de Western. En un primer panel (Figura 6A), la mancha de transferencia se hizo reaccionar con un suero de conejo anti-F (N° 35). En un se- gundo panel (Figura 6B) la mancha de transferencia se hizo reaccionar con un Mab (R63) anti-VP2. Sin tratamiento: CEF no infectado. M: Patrones de precision mas protema Bio Rad N° 161-0374
Despues de 15 pases, F y VP2 se expresaron establemente en CEF infectados con HVT recombinante doble. Sin embargo, FW137 no expreso ninguna senal de los antigenos F y VP2 despues de 15 pases indicando que es ines- table el HVT recombinante que tiene dos genes en un solo sitio.
Analisis de transferencia de Southern
M: Marcador molecular lambda HindIII digerido TP-24: plasmido de transferencia p44-45d46SV40VP2 TP-25: plasmido de transferencia p44-45d46RsvVP2
Cada rHVT/ND/IBD se sometio a pases quince veces en celulas CEF y se sometio a analisis de transferencia de Southern como se describe en el Experimento 4. Los resultados fueron los mismos que los obtenidos en el Experimento 4, lo que indica que el virus recombinante era estable incluso despues de 15 pases.
Los resultados de la transferencia de Southern mostraron, Figura 7A, que un fragmento de 2077 pb estaba hibridado con la sonda para VP2 en el DNA de FW129. El fragmento de 2334 pb estaba hibridado con la sonda para VP2 en el DNA de FW130. En contraste, no se detecto ninguna banda en p45/46Pec F.
La Figura 7C muestra que un fragmento de 2744 pb estaba hibridado con la sonda para F en el DNA de cada HVT recombinante doble. No se detecto ninguna banda en el p45/46 Sfil.
La Figura 7B muestra que los fragmentos de 2077 pb y 1228 pb estaban hibridados con la sonda para IS44/45 en el DNA de FW129, y los fragmentos de 2334 pb y 1022 pb estaban hibridados con la sonda para IS44/45 en el DNA de FW130. Un fragmento de 1350 pb estaba hibridado con la sonda para IS44/45 en p45/46 PecF, que no contema ningun gen en el sitio IS44/45.
La Figura 7D muestra que los fragmentos de 2744 pb y 770 pb estaban hibridados con la sonda para IS45/46 en el DNA de cada HVT recombinante doble.
La transferencia de Southern con la sonda 44/45 y la sonda 45/46 mostro que el gen VP2 o el gen F se manteman establemente en el sitio de insercion 44/45 o 45/46 respectivamente en FW129 y FW130.
Experimento 6: Tftulo de ELISA de anti-NDV e IBDV en polios inoculados con HVT recombinantes dobles
Se inocularon subcutaneamente 3.000 UFP/200 pL/ave de cada rHVT/ND/IBD en la parte trasera de diez pollos Ii- bres de patogenos espedficos (SPF) de un dfa (LineM, Japan Biological Laboratories) usando una jeringa de calibre 20. Tres semanas posteriores a la vacunacion, se recogio suero de las aves vacunadas. El titulo de anticuerpos anti- NDV se midio por un kit ELISA comercial (IDEXX, kit ELISA para diagnosticar la enfermedad de Newcastle). El anti- cuerpo anti-IBDV se titulo por un kit ELISA comercial, Flock Check Infectious Bursal Disease Antibody Test Kits (IDEXX Laboratory, Inc.). A los pollos del grupo de control negativo (no inmunitario) no se les administro ninguna vacuna.
La Figura 8A muestra el cambio del titulo anti-NDV. La Figura 8B muestra el cambio del titulo anti-IBDV. El HVT recombinante doble que utiliza dos sitios indujo establemente titulos tanto de anti-NDV como de anti-IBDV.
Experimento 7: Eficacia de rHVT/ND/IBD en pollos SPF contra el NDV
La eficacia de rHVT/ND/IBD (FW130, FW135, FW137, FW129) como vacuna contra la ND se evaluo utilizando el ensayo de eficacia como una vacuna contra la enfermedad de Newcastle.
3,000 UFP/200|jL/ave de rHVT/ND se inocularon subcutaneamente en la parte trasera de diez pollos SPF de un dfa (LineM, Japan Biological Laboratories) usando una jeringa de calibre 20. Tres semanas despues de la vacunacion, se recogio el suero de las aves vacunadas y se midio el titulo de anticuerpos anti-NDV por un kit ELISA comercial (IDEXX, kit ELISA para diagnosticar la enfermedad de Newcastle).
Los pollos del grupo de control positivo fueron vacunados cuando teman 14 dfas con una vacuna viva de NDV comercial de acuerdo con la recomendacion del vendedor. A los pollos del grupo de control negativo no se les administro ninguna vacuna.
Cuando teman 43 dfas (42 dfas despues de la vacunacion), los pollos de los siete grupos fueron inoculados con 103 dosis infectiva de 50% de los huevos (abreviadamente EID50 por sus siglas en ingles) de NDV-TexasGB, la cepa estandar para la prueba de virulencia en Estados Unidos, intramuscularmente hasta la region femoral. Los pollos
sometidos a la prueba de virulencia se observaron diariamente para verificar la mortalidad y para detectar cualquier smtoma de la enfermedad de Newcastle.
Tabla 2. Experimented de la prueba de virulencia con NDV virulento en pollos SPF vacunados con rHVT/ND/IBD
Vacunacion
Dosis (UFP/pollo) Numero de pollos Numero de smto- mas/total (%) Tftulo HI (ELISA) al salir del cascaron Tftulo de ELISA en la prueba de virulencia
FW130
3000 10 0/10 (0) 0 0,649
FW135
3600 10 2/10 (20) 0,085
FW137
3600 10 3/10 (30) 0,050
FW129
3000 10 0/10 (0) 0,233
FW029
4000 10 0/10 (0) 0,544
Vacuna viva comer- cial contra NDV
En la etiqueta 10 0/10 (0) 1,089
Controles con prueba de virulencia
N/A 10 11/12 (92) 0,089
Controles sin prueba de virulencia
N/A 10 0/5 (0) N/A
5 Como se muestra en la Tabla 2, los pollos vacunados con rHVT/ND/IBD de la invencion no mostraron signos clmicos
y el tftulo de ELISA en el dfa de la prueba de virulencia fue significativamente elevado. Como se esperaba, tanto los pollos vacunados con FW137 (donde dos secuencias de nucleotidos recombinantes estaban insertadas en el mismo sitio de insercion) o FW135 (en donde el promotor de Bac estaba insertado entre UL44 y UL45) muestran signos clmicos y el tftulo de ELISA era debil.
10 Experimento 8: Eficacia del rHVT/ND/IBD en pollos SPF contra el IBDV.
La eficacia de FW129 y FW141 (HVT/45-46 PecF/44-45 Mcmv ie1 VP2) como vacuna para la IBD se evaluo median- te la prueba de virulencia con IBDV STC.
En primer lugar, se inocularon 2.000 UFP de rHVT/ND/IBD en huevos de pollo embrionarios SPF el dfa 18 o subcu- taneamente en la parte posterior de pollos SPF de un dfa. Cuando teman tres semanas, los pollos vacunados fueron 15 sometidos a la prueba de virulencia por via oral con 1035 EID50/ave de IBDV STC. Una semana mas tarde, todos los
pollos fueron pesados y necropsiados para recuperar las bolsas de Fabricio, que se observaron para detectar cualquier lesion causada por la bursitis Infecciosa.
La proteccion se evaluo por dos criterios que son los siguientes: (1) La relacion en peso entre la bolsa y el cuerpo (mdice B/B) no fue estadfsticamente diferente de la de los pollos no vacunados, no sometidos a la prueba de virulen- 20 cia. (2) No se detecto ninguna malformacion de la bolsa de Fabricio, tales como edematizacion, hemorragia, exuda- do amarillento, decoloracion, atrofia o exudado gelatinoso. Los resultados se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3. Experimentos de la prueba de virulencia con IBDV virulento en pollos SPF vacunados con rHVT/ND/IBD
Vacunacion
N° de protegido/total
Vacuna
Via (%)
FW129
SQ 7/8 (88%)
FW141
SQ 8/8 (100%)
FW023
SQ 8/8 (100%)
FW129
In ovo 8/10 (80%)
FW141
In ovo 9/10 (90%)
FW023
In ovo 9/10 (90%)
Ninguna
N/A 0/4 (0%)
Ninguna
N/A 5/5 (100%)
Mas del 80% de todos los polios vacunados estaban protegidos contra la prueba de virulencia con la cepa IBDV STC, lo que indica que rHVT/ND/IBD puede inducir inmunidad protectora en pollos contra el IBDV virulento.
Experimento 9: Ensayo de prueba de virulencia con IBDV a las 8 semanas en pollos MDA+
5 Grupos:
G1: NINC (ni vacunados ni sometidos a la prueba de virulencia)
G2: NICC (no vacunados y sometidos a la prueba de virulencia)
G3: FW141 G4: FW144
10 G5: FW 023 (control positivo)
Polluelos
Aves con anticuerpos derivados maternalmente (abreviadamente MDA+ por sus siglas en ingles) (capas), 16 a 17 aves/grupo en cada grupo.
Se inocularon subcutaneamente tres mil UFP de vacunas en la parte trasera de 16 a 17 pollos MDA+ de un dfa. 15 Cuando teman 8 semanas, los pollos vacunados fueron sometidos a la prueba de virulencia por via oral con 103 do- sis infectiva en 50% de cultivo de tejidos (abreviadamente TCID50 por sus siglas en ingles/ave de IBDV STC. Una semana mas tarde, todos los pollos fueron pesados y necropsiados para recuperar las bolsas de Fabricio, que se observaron para detectar cualquier lesion causada por la bursitis Infecciosa.
La proteccion se evaluo por los dos criterios siguientes: (1) La relacion en peso entre la bolsa y el cuerpo (mdice 20 B/B); (2) No se detecto malformacion de la bolsa de Fabricio como edematizacion, hemorragia, exudado amarillento,
decoloracion, atrofia o exudado gelatinoso. Los resultados se resumen en la Tabla siguiente.
n indice B/B Muertos Lesionados % de proteccion
NINC
16 1,00 0 0/16 -
NICC
16 0,44 1 16/16 0
FW141
16 0,94 0 2/16 88
FW144
16 0,93 1 5/16 69
FW023
17 0,98 0 3/17 82
Estos resultados muestran que la vacuna multivalente de la invencion causa una proteccion eficaz in vivo contra el IBDV.
25 Experimento 10: Ensayo de prueba de virulencia de NDV a las 8 semanas en pollos MDA+
Grupo
G1: control de la prueba de virulencia G2: FW141 G3: FW144 30 G4: FW145
G5: FW 029 (control positivo)
Polluelos
Aves MDA+ (capas), 17 aves/grupo en cada grupo.
Se inocularon subcutaneamente tres mil UFP de vacunas en la parte trasera de 17 pollos MDA+ de un dfa. Cuando 35 teman 8 semanas, los pollos vacunados fueron sometidos a la prueba de virulencia con 103 EID50 de NDV-
TexasGB, la cepa estandar para la prueba de virulencia en Estados Unidos, intramuscularmente hasta la region femoral. Los pollos sometidos a la prueba de virulencia se observaron diariamente para verificar la mortalidad y para detectar cualquier smtoma de la enfermedad de Newcastle. Los resultados se presentan a continuacion.
Inmunizados Sometidos a la prueba de virulencia Muertos Smtoma* % de proteccion
Control con prueba de virulencia
17 13 13 0 0,0
FW141
17 15 1 0 93,3
FW144
17 15 3 1 73,3
FW145
17 13 0 0 100,0
Inmunizados Sometidos a la prueba de virulencia Muertos Smtoma* % de proteccion
FW029
17 16 3 0 81,3
* Algunos smtomas del NDV sin muerte
Estos resultados muestran que la vacuna multivalente de la invencion causa proteccion eficaz in vivo contra el NDV y el IBDV. La proteccion es fuerte y estable.

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Un herpesvirus aviar recombinante, que comprende al menos dos secuencias de nucleotidos recombinantes, codi- ficando cada secuencia de nucleotidos recombinante un peptido antigenico distinto procedente de un patogeno aviar, en donde cada una de dichas al menos dos secuencias de nucleotidos recombinantes esta insertada en una region no codificadora distinta del genoma viral elegida entre la region situada entre UL44 y UL45, la region situada entre UL45 y UL46, la region situada entre US10 y SORF3, y la region situada entre SORF3 y US2.
  2. 2. El herpesvirus aviar recombinante de la reivindicacion 1, en donde los peptidos antigenicos procedentes de pato- genos aviares son protemas de superficie, protemas secretadas o protemas estructurales de dichos patogenos, o sus fragmentos antigenicos.
  3. 3. El herpesvirus aviar recombinante de la reivindicacion 1, en donde las secuencias de nucleotidos recombinantes codifican peptidos antigenicos elegidos entre un peptido antigenico de paramixovirus aviar de tipo 1, preferiblemente la protema F del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) o uno de sus fragmentos antigenicos, un peptido antigenico del virus de la enfermedad de Gumboro, preferiblemente la protema VP2 del virus de la bursitis infecciosa (IBDV) o uno de sus fragmentos antigenicos, un peptido antigenico del virus de la laringotraqueftis infecciosa (ILTV), preferiblemente la protema gB o uno de sus fragmentos antigenicos, un peptido antigenico de Mycoplasma gallisep- ticum, preferiblemente la protema 40K o uno de sus fragmentos antigenicos, y un peptido antigenico del virus de la gripe aviar, preferiblemente una protema de superficie hemaglutinina (HA) o uno de sus fragmentos antigenicos.
  4. 4. El herpesvirus aviar recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una primera secuencia de nucleotidos recombinante que codifica un primer peptido antigenico insertado en la region no codificadora situada entre UL45 y UL46 y una segunda secuencia de nucleotidos recombinante que codifica un segundo peptido antigenico insertado en la region no codificadora situada entre UL44 y UL45, o entre US10 y SORF3, o entre SORF3 y US2.
  5. 5. El herpesvirus aviar recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada secuencia de nucleotidos recombinante esta bajo el control de un promotor distinto.
  6. 6. El herpesvirus aviar recombinante de la reivindicacion 5, en donde los promotores que controlan las secuencias de nucleotidos recombinantes se eligen entre el promotor de beta-actina (Bac) de pollo, el promotor Pec, el promotor inmediato-temprano (ie)1 de Cytomegalovirus de muridos (Mcmv), el promotor del citomegalovirus humano (Hcmv), el promotor del virus de simios (SV)40 y el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), o cualquier de sus frag- mento que retenga una actividad promotora.
  7. 7. El herpesvirus aviar recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende insertada entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica un primer peptido antigenico bajo el control del promotor Pec, e insertada entre UL44 y UL45, una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica un segundo peptido antigenico, preferiblemente bajo el control del promotor de RSV o de SV40 o ie1 de Mcmv.
  8. 8. El herpesvirus aviar recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende insertada entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica un primer peptido antigenico e insertada entre SORF3 y US2, una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica un segundo peptido antigenico.
  9. 9. El herpesvirus aviar recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende insertada entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDv, o uno de sus fragmentos antigenicos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac, e insertada entre UL44 y UL45 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV o uno de sus fragmentos antigenicos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv.
  10. 10. El herpesvirus aviar recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos antigenicos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac y en el sitio de insercion entre SORF3 y US2 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos antigenicos, preferiblemente bajo el control del promotor Pec.
  11. 11. El herpesvirus aviar recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende en el sitio de insercion entre UL45 y UL46 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema VP2 de IBDV, o uno de sus fragmentos antigenicos, preferiblemente bajo el control del promotor de Bac y en el sitio de insercion entre SORF3 y US2 una secuencia de nucleotidos recombinante que codifica la protema F de NDV, o uno de sus fragmentos antigenicos, preferiblemente bajo el control del promotor ie1 de Mcmv.
  12. 12. El herpesvirus aviar recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un herpesvirus recombinante de pavos (rHVT).
  13. 13. Una vacuna multivalente que comprende una cantidad inmunizante eficaz de herpesvirus aviar recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
  14. 14. Un herpesvirus aviar recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para uso para inmunizar a un ave, tal como un ave de corral, contra un patogeno.
  15. 15. Una vacuna multivalente de la reivindicacion 13, para su uso en un metodo para vacunar un ave simultaneamen- te contra al menos dos patogenos.
  16. 16. Un kit de vacunacion para inmunizar especies aviares, que comprende los siguientes componentes:
    5 a. una cantidad eficaz de la vacuna de la reivindicacion 13, y
    b. un medio para administrar dichos componentes a dichas especies.
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