JP4625915B2 - Rnaウイルスの新規レスキュー方法 - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は、モノネガウイルス(Mononegavirales)ウイルスと呼称される目の非分節の(nonsegmented)負センスの一本鎖RNAウイルスを産生するための改良方法に関する。好ましい態様は、麻疹ウイルス(MV)、RSウイルス(RSV)およびヒトパラインフルエンザウイルス(PIV)のような弱毒化および/もしくは感染性ウイルスのようなウイルスの産生方法に関する。該組換えウイルスはcDNAクローンから製造することができ、こうして、定義された変化をゲノム中に有するウイルスを得ることができる。
【0002】
(発明の背景)
エンベロープをもつ(enveloped)負センスの一本鎖RNAウイルスが独特に組織化かつ発現されている。負センスの一本鎖ウイルスのゲノムRNAは、ヌクレオキャプシドの情況で、2種の鋳型機能(すなわちメッセンジャーRNA(mRNA)の合成のための鋳型、およびアンチゲノム(+)鎖の合成のための鋳型として)を供給する。負センスの一本鎖RNAウイルスは、それら自身のRNA依存性RNAポリメラーゼをコードしかつパッケージングする。メッセンジャーRNAは、感染した細胞の細胞質にウイルスが侵入すると合成されるにすぎない。ウイルスの複製はmRNAの合成後に起こり、そしてウイルスタンパク質の継続的合成を必要とする。新たに合成されたアンチゲノム(+)鎖は、(−)鎖のゲノムRNAのさらなるコピーの発生のための鋳型としてはたらく。
【0003】
ポリメラーゼ複合体は、ゲノムの3’端、とりわけプロモーター領域のシスに作用するシグナルをかみあわせる(engaging)ことにより転写および複製を起動かつ達成する。その後、ウイルス遺伝子が、その3’からその5’端まで一方向的にゲノム鋳型から転写される。それらの上流の隣接物(すなわち核タンパク質遺伝子(N))に関して常により少ない、下流の遺伝子(例えばポリメラーゼ遺伝子(L))から作成されるmRNAが存在する。従って、該ゲノムの3’端に関して遺伝子の位置に従ったmRNAの豊富の勾配が常に存在する。
【0004】
こうした非分節RNAウイルスの分子遺伝学的分析は、最近まで困難と判明していた。なぜなら、裸のゲノムRNAもしくはトランスフェクションされたプラスミドから細胞内で産生されるRNAは感染性でないからである(ボイヤー(Boyer)とヘンニ(Haenni)、1994)。この技術的問題は、組換えの非分節の負鎖RNAウイルスの単離を可能にする便利なcDNAレスキュー技術の開発により克服された(パットナイク(Pattnaik)ら、1992;シュネル(Schnell)、メバトゥション(Mebatsion)とコンゼルマン(Conzelmann)、1994)。これらの多様な負鎖ウイルスのレスキューのための技術は共通のテーマに従い、それぞれ首尾よくレスキューするための識別性の必須成分を有する(バロン(Baron)とバレット(Barrett)、1997;コリンズ(Collins)ら、1995;ガルシン(Garcin)ら、1995;ホフマン(Hoffman)とバネリエー(Banerjee)、1997;ローソン(Lawson)ら、1995;ラデケ(Radecke)ら、1995;シュナイダー(Schneider)ら、1997;ヘ(He)ら、1997;シュネル(Schunell)、メバトゥション(Mebatsion)とコンゼルマン(Conzelmann)、1994;ホエラン(Whelan)ら、1995)。ゲノムcDNAプラスミドのトランスフェクション後に、ファージT7 RNAポリメラーゼ、およびベクターにコードされるリボザイム配列[RNAを切断して3’末端を形成する]の組み合わせられた作用により、ゲノムRNAの正確な一コピーが産生される。このRNAは、コトランスフェクションされた発現プラスミドにより最初は供給されるウイルスタンパク質によりパッケージングおよび複製される。麻疹ウイルス(MV)のレスキュー系(ラデケ(Radecke)ら、1995)の場合には、T7 RNAポリメラーゼならびにMVのタンパク質N(ヌクレオキャプシドタンパク質)およびP(リンタンパク質ポリメラーゼサブユニット)を発現する安定な細胞系が製造された。従って、適切に配置されたT7ポリメラーゼプロモーターを含有するMVゲノムcDNAクローン、およびMVポリメラーゼ遺伝子(L)を含有する発現プラスミドを用いてこの細胞系をコトランスフェクションすることにより、MVのレスキューを達成し得る。
【0005】
成功裏の麻疹ウイルスcDNAレスキューは、明らかに、1)T7 RNAポリメラーゼによるゲノムRNAの正確な完全長の合成およびリボザイム配列による3’端のプロセシング;2)複製を開始するのに適切なレベルでのウイルスのN、PおよびLタンパク質の合成;3)転写的に活性かつ複製応答能のあるヌクレオキャプシド構造へのゲノムRNAの新たなパッケージング;ならびに4)複製が進行するのに十分なレベルでの新たに形成されたヌクレオキャプシドからのウイルス遺伝子の発現、を包含する多数の分子事象がトランスフェクション後に起こることを必要とする。成功裏のレスキューでどの段階が律速であることができるかは正確には決定されていないが、しかし、レスキューの効率は、潜在的に、上に挙げられた段階のいずれか一を刺激することにより向上させることができる。
【0006】
本発明は、MVのような所望の組換えRNAウイルスを回収する能力の向上を探求する。所望のウイルスの本来のゲノムおよびアンチゲノムをコードするポリヌクレオチドがますます改変される際に、複製するウイルスをレスキューから得る能力が低下するかも知れないことが提起されている。従って、本発明は、こうした障害物を克服することを探求する。なぜなら、これらの方法は、レスキュー処置から所望の組換えウイルスを得る見込みを本質的に向上させ得るからである。
【0007】
(発明の要約)
本発明は、(a)最低1個の宿主細胞中で、(i)モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに(ii)被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低1種の単離された核酸分子を含んで成る最低1種の発現ベクターを含んで成るレスキュー組成物のトランスフェクションを;これらのベクターの共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で宿主細胞中で実施すること;(b)トランスフェクションされたレスキュー組成物を、組換えウイルスの回収を増大させるのに十分な条件下で有効な熱ショック温度に加熱すること;ならびに、場合によっては(c)生じる組換えウイルスを収穫すること、を含んで成る、モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)からの組換えウイルスの生産方法を提供する。
【0008】
付加的な一方法は、a)最低1個の宿主細胞中で、(i)モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに(ii)被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る最低1種の単離された核酸分子を含んで成る最低1種の発現ベクターを含んで成るレスキュー組成物のトランスフェクションを、前記ベクターの共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で実施すること;b)トランスフェクションされたレスキュー組成物を最低一層のベロ細胞上に移すこと;ならびに、場合によっては組換えウイルスを収穫すること、を含んで成る、組換えモノネガウイルス目(Order Mononegavirales)ウイルスを生産することに関する。
【0009】
本発明のさらなる局面は、上の方法の重なり合わない段階を好ましい態様と一緒に組み合わせてさらなる改良された方法を創製する方法に関する。
【0010】
代替の態様において、本発明は、弱毒化、感染性、もしくは双方であるモノネガウイルス目(Order Mononegavirales)のRNAウイルスの作成方法を提供する。付加的な態様は、本発明の方法から産生されたウイルス、ならびにこうしたウイルスを含有するワクチンに関する。こうしたウイルスはヒト、またはマウスもしくはウシのような非ヒトであることができることが注目される。
【0011】
上に同定された態様および本明細書で詳細に論考される付加的な態様は、本発明の目的を表す。
【0012】
(発明の詳細な記述)
上に簡潔に示されたとおり、本発明は組換えRNAウイルスの新規製造方法に関する。当該技術分野におけるこうした方法は「レスキュー」もしくは逆遺伝学的方法と称される。多様な非分節の負鎖ウイルスのための例示的なレスキュー方法は、以下の参考文献として引用される刊行物、すなわちバロン(Baron)とバレット(Barrett)、1997;コリンズ(Collins)ら、1995;ガルシン(Garcin)ら、1995;ヘ(He)ら、1997;ホフマン(Hoffman)とバネリェー(Banerjee)、1997;ローソン(Lawson)ら、1995;ラデケ(Radecke)とビレター(Billeter)、1997;ラデケ(Radecke)ら、1995;シュナイダー(Schneider)ら、1997;シュネル(Schnell)、メバトゥション(Mebatsion)とコンゼルマン(Conzelmann)、1994;ホエラン(Whelan)ら、1995に開示される。レスキューに関する付加的刊行物は、MVおよびパラミクソウイルス亜科(Paramyxovirinae)の他のウイルスについての公開された国際特許出願第WO 97/06270号およびRSVのレスキューについての公開された国際特許出願第WO 97/12032号を包含し;これらの出願はこれにより引用により組み込まれる。
【0013】
ゲノムcDNAプラスミドのトランスフェクション後、ファージT7 RNAポリメラーゼ、およびベクターにコードされるリボザイム配列[RNAを切断して3’末端を形成する]の組み合わせられた作用により、ゲノムRNAの正確な一コピーが産生される。このRNAは、コトランスフェクションされた発現プラスミドにより最初は供給されるウイルスタンパク質によりパッケージングかつ複製される。MVのレスキュー系(ラデケ(Radecke)ら、1995)の場合には、T7 RNAポリメラーゼならびにMVのタンパク質N(ヌクレオキャプシドタンパク質)およびP(リンタンパク質)を発現する安定な細胞系が製造された。従って、適切に配置されたT7ポリメラーゼプロモーターを含有するMVゲノムcDNAクローン、およびMVポリメラーゼ遺伝子(L)を含有する発現プラスミドを用いてこの細胞系をコトランスフェクションすることにより、MVのレスキューを達成し得る。
【0014】
最初のいくつかのレスキュー方法の一は麻疹ウイルスについて開示された。麻疹ウイルス(MV)は、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)のモルビリウイルス属(Morbillivirus)の一メンバーであり、そして、MVは、この科の全メンバーと同様、非分節の負センスのRNAゲノムを含有するエンベロープをもつウイルスである(ラム(Lamb)とコラコフスキ(Kolakofsky)、1996)。この科のウイルスの分子遺伝学的分析は最近まで困難と判明していた。なぜなら、裸のゲノムDNA、もしくはトランスフェクションされたプラスミドから細胞内で産生されたRNAは感染性でないからである(ボイヤー(Boyer)とヘンニ(Haenni)、1994)。この技術的問題は、組換えの負鎖RNAウイルスの単離を可能にする便利なcDNAレスキュー技術の開発により克服された(パットナイク(Pattnaik)ら、1992;ラデケ(Radecke)とビレター(Billeter)、1997;シュネル(Schnell)、メバトゥション(Mebatsion)とコンゼルマン(Conzelmann)、1994)。
【0015】
これらのレスキュー方法の基本的一段階およびその中の組成物の簡潔な概要を以下にさらに記述する。すなわち
負センスの一本鎖RNAウイルスゲノムの転写および複製は、リボ核タンパク質コア(ヌクレオキャプシド)に作用する多量体タンパク質の酵素的活性により達成される。裸のゲノムRNAは鋳型として作用し得ない。代わりに、これらのゲノム配列は、それらがNタンパク質によりヌクレオキャプシド構造中に完全に被包化される場合にのみ認識される。ゲノムおよびアンチゲノム末端プロモーター配列が認識されて転写もしくは複製経路を開始するのはその情況においてのみである。
【0016】
全部のパラミクソウイルスは、これらのポリメラーゼ経路を進行させるために3種のウイルスタンパク質、N、PおよびLを必要とする。RSVを包含するニューモウイルスもまた、転写経路を効率的に進行させるのに転写伸長因子M2を必要とする。おそらくウイルスにコードされるNS1およびNS2タンパク質、ならびにおそらく宿主細胞にコードされるタンパク質を包含する付加的な補助因子もまたある役割を演じているかも知れない。
【0017】
簡潔には、全部のモノネガウイルス目(Mononegavirales)のレスキュー方法を以下のとおり要約し得る。すなわち、それぞれは、適するDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター(例えばT7 RNAポリメラーゼプロモーター)と、適する転写ベクター(例えば、増殖可能な細菌プラスミド)中に挿入される自己切断性リボザイム配列(例えばδ型肝炎リボザイム)との間に置かれた所望のウイルスゲノムのクローン化されたDNA同等物を必要とする。この転写ベクターは容易に操作可能なDNA鋳型を提供し、RNAポリメラーゼ(例えばT7 RNAポリメラーゼ)は、正確なもしくはほぼ正確な5’および3’末端をもつウイルスのアンチゲノム(もしくはゲノム)の一本鎖RNAの一コピーをそれから忠実に転写し得る。ウイルスゲノムDNAのコピー、ならびに隣接するプロモーターおよびリボザイム配列の向きが、アンチゲノムもしくはゲノムRNA同等物が転写されるかどうかを決定する。裸の一本鎖ウイルスのアンチゲノムもしくはゲノムRNA転写物の機能的ヌクレオキャプシド鋳型、すなわち、ウイルスのヌクレオキャプシド(NもしくはNP)タンパク質、ポリメラーゼ会合型リンタンパク質(P)ならびにポリメラーゼ(L)タンパク質への被包化に必要とされるウイルス特異的なトランスに作用するタンパク質が、新たなウイルスの子孫のレスキューにもまた必要とされる。これらのタンパク質は、このヌクレオキャプシドの鋳型を転写および複製の達成に従事させるに違いない、活性のウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼを含んで成る。レスキューに選択されるある種のウイルスは、転写伸長因子のような付加的タンパク質を必要とすることができる。
【0018】
従って、各方法においてレスキュー組成物を使用することができる。こうした組成物は当該技術分野で公知である。以下の記述は、本発明の方法で使用し得るレスキュー組成物の制限とならない。レスキュー組成物は、これらのベクターの共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で、宿主細胞中に;(i)モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに(ii)被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低1種の単離された核酸分子を含んで成る最低1種の発現ベクターを含んで成る。
【0019】
該単離された核酸分子は、モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスの最低1種のゲノムもしくはアンチゲノムをコードする配列を含んで成る。ウイルスの分類学に関する国際委員会(the International Committee on the Taxonomy of Viruses)による1993年の改訂された再分類に基づき、モノネガウイルス(Mononegavirales)と呼称されるひとつの目が確立された。この目は、負の極性の(負センスの)一本鎖の非分節RNAゲノムを含む、エンベロープをもつウイルスの3科を含有する。これらの科は、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)およびフィロウイルス科(Filoviridae)である。パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)は2亜科、パラミクソウイルス亜科(Paramyxovirinae)およびニューモウイルス亜科(Pneumovirinae)にさらに分割されている。パラミクソウイルス亜科(Paramyxovirinae)は、3属、レスピロウイルス属(Respirovirus)(以前はパラミクソウイルス属(Paramyxovirus)として知られていた)、ルブラウイルス属(Rubulavirus)およびモルビリウイルス属(Morbillivirus)を含有する。ニューモウイルス亜科(Pneumovirinae)はニューモウイルス属(Pneumovirus)を含有する。
【0020】
該新規分類は、形態学的基準、ウイルスゲノムの構成、生物学的活性、ならびに遺伝子および遺伝子産物の配列の関連に基づく。パラミクソウイルス亜科(Paramyxovirinae)のエンベロープをもつウイルスのあいだの形態学的な識別する特徴は、ヌクレオキャプシドの大きさおよび形状(直径18nm、長さ1μm、5.5nmのピッチ)であり、これは左旋性らせんの対称を有する。生物学的基準は、1)一属のメンバー間での抗原の交差反応性、ならびに2)レスピロウイルス属(Respirovirus)、ルブラウイルス属(Rubulavirus)でのノイラミニダーゼ活性の存在、およびモルビリウイルス属(Morbillivirus)でのその非存在、である。加えて、ルブラウイルス(Rublaviruses)での余分な遺伝子(SH)の存在がそうであるように、P遺伝子のコーディング能力の変動が考慮される。
【0021】
ニューモウイルスは、それらが細いヌクレオキャプシドを含有するためにパラミクソウイルス亜科(Paramyxovirinae)と形態学的に識別し得る。加えて、ニューモウイルスは、タンパク質をコードするシストロンの数(ニューモウイルスで10個対パラミクソウイルス亜科(Paramyxovirinae)で6個)、およびパラミクソウイルス亜科(Paramyxovirinae)のものと非常に異なる接着タンパク質(G)に大きな差異を有する。パラミクソウイルスおよびニューモウイルスは、機能が対応するようである6種のタンパク質(N、P、M、G/H/HN、FおよびL)を有するとは言え、後者の2種のタンパク質のみが2亜科の間で有意な配列の関連を示す。いくつかのニューモウイルスタンパク質、すなわち非構造タンパク質NS1およびNS2、小疎水性タンパク質SH、ならびに第二のタンパク質M2は、パラミクソウイルスの大部分で対照物を欠く。若干のパラミクソウイルスのタンパク質、すなわちCおよびVは、ニューモウイルスの対照物を欠く。しかしながら、ニューモウイルスおよびパラミクソウイルスの基本的なゲノムの構成は同一である。同じことがラブドウイルスおよびフィロウイルスについてもまた真実である。表1は、各属の例と一緒にこれらのウイルスの現在の分類学的分類を提示する。
表1
モノネガウイルス目(Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスの分類
パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)
パラミクソウイルス亜科(Paramyxovirinae)
レスピロウイルス属(Respirovirus)(以前はパラミクソウイルス属(Paramyxovirus)として知られていた)
センダイウイルス(マウスパラインフルエンザタイプ1)
ヒトパラインフルエンザウイルス(PIV)タイプ1および3
ウシパラインフルエンザウイルス(BPV)タイプ3
ルブラウイルス属(Rubulavirus)
SV5(SV5)(イヌパラインフルエンザウイルスタイプ2)
流行性耳下腺炎ウイルス
ニューカッスル病ウイルス(NDV)(トリパラミクソウイルス1)
ヒトパラインフルエンザウイルス(PIV−タイプ2、4aおよび4b)
モルビリウイルス属(Morbillivirus)
麻疹ウイルス(MV)
イルカモルビリウイルス
イヌジステンパーウイルス(CDV)
小反芻動物病ウイルス
アザラシジステンパーウイルス
牛疫ウイルス
ニューモウイルス亜科(Pneumovirinae)
ニューモウイルス属(Pneumovirus)
ヒトRSウイルス(RSV)
ウシRSウイルス
マウス肺炎ウイルス
シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス
ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)
リッサウイルス属(Lyssavirus)
狂犬病ウイルス
ベシクロウイルス属(Vesiculovirus)
水疱性口内炎ウイルス(VSV)
エフェメロウイルス属(Ephemerovirus)
ウシ流行熱ウイルス
フィロウイルス科(Filoviridae)
フィロウイルス属(Filovirus)
マールブルグウイルス
上に示されるとおり、該単離された核酸分子は、モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスの最低1種のゲノムもしくはアンチゲノムをコードする配列を含んで成る。単離された核酸分子は、ゲノム、アンチゲノムもしくはそれらの改変されたバージョン(version)をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。一態様において、該ポリヌクレオチドは、操作可能に連結されたプロモーター、所望のゲノムもしくはアンチゲノム、および転写ターミネーターをコードする。
【0022】
本発明の好ましい一態様において、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの挿入、再配列、欠失もしくは置換により野性型RNAウイルスから改変されているゲノムもしくはアンチゲノムをコードする。本来のゲノムおよびアンチゲノムをコードするポリヌクレオチドがますます改変される際に、複製するウイルスをレスキューから得る能力が消失するかも知れないことが提起されている。こうした場合、本発明はとりわけ価値がある。なぜなら、これらの方法は組換えウイルスのレスキューの見込みを本質的に向上し得るからである。ゲノムもしくはアンチゲノム配列は、ヒトもしくは非ヒトのウイルスのもの由来であり得る。ポリヌクレオチド配列は、2種もしくはそれ以上の供給源からのゲノムもしくはアンチゲノムを組換え的に結合することから形成されたキメラゲノムをコードしてもまたよい。例えば、AグループのRSVからの1種もしくはそれ以上の遺伝子が、BグループのRSVの対応する遺伝子の代わりに挿入されるか;または、ウシPIV(BPIV)、PIV−1もしくはPIV−2からの1種もしくはそれ以上の遺伝子が、PIV−3の対応する遺伝子の代わりに挿入されるか;または、RSVがPIVの遺伝子に取って代わることができる、などである。付加的な態様においては、該ポリヌクレオチドは、ヒト、ウシもしくはマウスのウイルスであるモノネガウイルス目(Order Mononegavirales)のRNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする。本発明の方法により形成される組換えウイルスは、診断的研究でのツールまたは治療的もしくは予防的ワクチンとして使用し得るため、該ポリヌクレオチドは、野性型もしくは弱毒化された形態の選択されたRNAウイルスをコードしてもまたよい。多くの態様において、該ポリヌクレオチドは、弱毒化された感染性の形態のRNAウイルスをコードする。とりわけ好ましい態様において、該ポリヌクレオチドは、これにより引用により組み込まれる公開国際特許出願第WO 98/13501号により記述されるような、3’のゲノムプロモーター領域に最低1個の弱毒化突然変異を有しかつRNAポリメラーゼ遺伝子中に最低1個の弱毒化突然変異を有するモノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする。
【0023】
組換えウイルスを産生する多様な必要性は変動することができる。従って、いずれかの特定の科、すなわちパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)もしくはフィロウイルス科(Filoviridae)からもうひとつのウイルスを選択することができる。
【0024】
上述されたような、改変された形態の所望のゲノムおよびアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列に加え、ポリヌクレオチド配列は、1種もしくはそれ以上の異種遺伝子と一緒に所望のゲノムもしくはアンチゲノムをコードしてもまたよい。異種遺伝子は所望されるように変動し得る。異種遺伝子は、所望の組換えウイルスの応用に依存して、補助因子、(インターロイキンのような)サイトカイン、Tヘルパーエピトープ、制限マーカー、アジュバントもしくは多様な微生物病原体(例えばウイルス、細菌もしくは真菌)のタンパク質、とりわけ保護的免疫応答を導き出すことが可能なタンパク質をコードしてよい。異種遺伝子はまた、遺伝子治療に使用される作用物質を提供するのに使用してもよい。好ましい態様において、異種遺伝子は、組換えウイルスの予防的もしくは治療的特徴を改良するのに選択される、インターロイキン−12のようなサイトカインをコードする。
【0025】
ウイルス性病原体の治療における改良されたワクチンおよび増大された順応性に対する現在の必要性のいくつかを考慮すれば、単離された核酸分子は、CDV、VSV、MV、RSV、PIV、流行性耳下腺炎ウイルスおよび狂犬病ウイルスより成る群から選択されるRNAウイルスをコードするポリヌクレオチドを含んで成る。MV、RSV、PIVおよびBPVより成る群が、この組のRNAウイルスのなかでさらに好ましい。
【0026】
弱毒化ウイルスを使用する態様については、改変ウイルスを生じさせるための弱毒化突然変異の基本的導入方法と一緒に、多数の形態のこうしたウイルスが当該技術分野で公知である。化学的突然変異誘発物質が添加されている細胞培養物中でのウイルスの成長の間の化学的突然変異誘発、次いで、温度感受性および/もしくは低温適応突然変異を選択するための至適以下の(suboptimal)温度での継代にかけられるウイルスの選択、細胞培養物中で小さなプラークを生じさせる突然変異体ウイルスの同定、ならびに宿主域突然変異について選択するための異種宿主による継代のような慣習的手段が使用される。弱毒化突然変異の代替の一導入手段は、部位特異的突然変異誘発を使用して予め決められた突然変異を作成することを含んで成る。1種もしくはそれ以上の突然変異を導入してよい。その後、これらのウイルスの生物学的活性の減弱化についてそれらを動物モデルでスクリーニングする。弱毒化ウイルスをヌクレオチド配列決定にかけて、弱毒化突然変異の部位の位置を突き止める。
【0027】
レスキューを実施するために必要とされる多様なトランスに作用するタンパク質もまた当該技術分野で公知である。麻疹ウイルスのレスキューに必要とされるトランスに作用するタンパク質は、被包化タンパク質N、ならびにポリメラーゼ複合体タンパク質、PおよびLである。PIV−3については、被包化タンパク質はNPと呼称され、また、ポリメラーゼ複合体タンパク質はまたPおよびLとも称される。RSVについては、ウイルス特異的なトランスに作用するタンパク質は、N、PおよびL、ならびにRSVをコードする転写伸長因子である付加的タンパク質M2を包含する。
【0028】
ウイルスのトランスに作用するタンパク質は、必要とされるタンパク質をコードする1種もしくはそれ以上の発現ベクター(例えばプラスミド)から生じさせ得るとは言え、必要とされるトランスに作用するタンパク質のいくつかもしくは全部は、安定な形質転換体としてこれらのウイルス特異的遺伝子および遺伝子産物を含有かつ発現するよう工作された選択された宿主細胞内で産生させることができる。
【0029】
発現ベクター、ならびに被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする単離された核酸分子の選択は、所望のウイルスの選択に依存して変動し得る。選択された条件下での宿主細胞における転写ベクター(1種もしくは複数)とのそれらの共発現および組換えウイルスの産生を可能にするために、発現ベクターが調製される。
【0030】
レスキューのための典型的な(とは言え必ずしも独占的でない)環境は、適切な哺乳動物細胞の環境を包含し、ここで、ウイルスゲノムのcDNAを含有する転写ベクターからアンチゲノム(もしくはゲノム)の一本鎖RNAの転写を駆動するようにT7ポリメラーゼが存在する。このウイルスアンチゲノム(もしくはゲノム)のRNA転写物は、共転写的にもしくはその後すぐにのいずれかで、ヌクレオキャプシドタンパク質により機能的鋳型に被包化され、そして、必要とされるウイルス特異的なトランスに作用するタンパク質をコードするコトランスフェクションされた発現プラスミドから付随して産生される必要とされるポリメラーゼ成分により束縛される。これらの事象および過程は、ウイルスmRNAの前もって必要な転写、新たなゲノムの複製および増幅、ならびにそれにより新規ウイルス子孫の産生すなわちレスキューにつながる。
【0031】
狂犬病、VSV、SV5およびセンダイのレスキューのためには、T7ポリメラーゼは組換えワクシニアウイルスVTF7−3により提供される。しかしながら、この系は、物理的もしくは生化学的手段、またはポックスウイルスに対し良好な宿主でない細胞もしくは組織中での反復する継代により、レスキューされるウイルスがワクシニアウイルスから分離されることを必要とする。MVのcDNAのレスキューに関しては、T7ポリメラーゼならびにウイルスのNおよびPタンパク質を発現する細胞系を創製することにより、この要件が回避される。ゲノム発現ベクターおよびL遺伝子発現ベクターをヘルパー細胞系中にトランスフェクションすることにより、レスキューが達成される。好ましくは、ヘルパー細胞系は、哺乳動物細胞中で子孫のウイルスをほとんどもしくは全く産生せず、そして所望のRNAウイルスもしくはウイルス類をレスキューするために活用し得る。T7ポリメラーゼ、例えばMVA/T7(以下に記述される)の供給源としてヘルパーウイルスを使用し得る。必要な被包化タンパク質の同時の発現後に、合成の完全長のアンチゲノムウイルスRNAが被包化され、複製され、そしてウイルスのポリメラーゼタンパク質により転写され、そして複製されたゲノムが感染性のビリオン中にパッケージングされる。こうしたアンチゲノムに加え、今や、センダイおよびPIV−3についてゲノム類似物が成功裏にレスキューされている(加藤(Kato)ら、および公開された国際特許出願第WO 98/53708号)。
【0032】
上に示されたとおり、MVA/T7(ワクシニアウイルスの弱毒化突然変異体)は、RNAウイルスレスキューのレスキューで使用することができる改変ヘルパーウイルスの一例である。一般に、改変ヘルパーウイルスは、非許容細胞系中で減少されたウイルス活性を示すか、もしくはウイルス活性を示さないように野性型ウイルスから変えられているウイルスである。MVAの特徴は、改変ヘルパーウイルスで好ましい特徴を確立する。ワクシニアウイルスのMVA株は、より細胞障害性の株に対する魅力的な一代替を提供する。MVAは、トルコおよびドイツにおける天然痘根絶プログラムの間に、ニワトリ胚線維芽細胞での細胞障害性ワクシニアアンカラウイルスの連続的継代(>570)により開発された。それは生物安全性レベル(Biosafety Level)−1病原体にまで格下げされており、そして、ワクチン接種されていない実験室労働者により使用されてよい。MVAは、30,000を越える塩基対の喪失をもたらす6個の大きな欠失(ゲノムの>15%)を含有する(アントワヌ(Antoine)ら、1998)。MVAは、制限された数の細胞系中で複製し(キャロル(Carroll)とモス(Moss)、1997;ドレクスラー(Drexler)ら、1998)、そして、非許容細胞中でウイルスの形態形成の後期段階で封鎖されている(サッター(Sutter)とモス(Moss)、1992)。さらに、MVAは、野性型株で観察される重症の細胞障害性の影響(CPE)を誘発しない。他の宿主が制限されるポックスウイルス(例えば、NYVAC、ALVACおよび鶏痘)を上回るMVAの主要な一利点は、ウイルスDNA複製、および従ってほとんど全部の遺伝子分類(初期、中期および後期)の転写が損なわれないことである。全部の分類のプロモーター下で外来遺伝子を効率的に発現することができる。バクテリオファージT7−遺伝子1を発現する2種の組換えMVAが報告されている。MVA/T7ハイブリッドウイルスは、7.5Kの弱い初期/後期プロモーター(サッター(Sutter)ら、1995)もしくは11Kの強い後期プロモーター(ワイアット(Wyatt)ら、1995)のいずれかの調節下に、組込まれた一コピーのT7遺伝子−1を含有する。双方が、一過性発現系で負鎖RNAウイルスを遺伝子的にレスキューするためのヘルパーウイルスとして使用されている(コリンズ(Collins)ら、1995;レイラー(Leyrer)ら、1998;シュナイダー(Schneider)ら、1997;バロン(Barron,M.D.)とバレット(Barrett,T.)Rescue of rinderpest virus from a cloned cDNA.Journal of Virology.71(2):1265−71、1997年2月;ダーバン(Durbin,A.P.)、ホール(Hall,S.L.)、シュー(Siew,J.W.)、ホワイトヘッド(Whitehead,S.S.)、コリンズ(Collins,P.L.)とマーフィ(Murphy,B.R.)Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA.Virology.235(2):323−332;ヘ(He)ら、1997)。
【0033】
MVA/T7のような弱毒化ヘルパーウイルスのようなヘルパーウイルスの使用の利益にもかかわらず、MVA/T7もしくは別のヘルパーウイルスの同時発生的複製周期は、異種組換えウイルスのレスキューに必要とされる遺伝的事象を抑制するかも知れない。従って、本発明の好ましい態様においては、ヘルパーウイルスを使用する場合、DNA合成阻害剤もまた使用する。本態様はレスキュー系の改良をもたらす。DNA合成阻害剤は、ヘルパーウイルスのDNA合成もまた阻害(もしくは本質的に阻害)する一方でレスキューを生じさせる。AraC(シトシンβ−D−アラビノフラノシド)およびヒドロキシ尿素のような例示的DNA合成阻害剤は、ウイルスの生活環の決定的に重要な一点でヘルパーウイルスの複製周期を封鎖する。中期および後期のウイルス遺伝子転写は発生期のウイルスゲノムのみで開始するため、これら2種の遺伝子分類は、AraCもしくはヒドロキシ尿素による封鎖の結果として表立ったものではない(silent)。AraCはDNAへの取込みにより複製を封鎖する一方、ヒドロキシ尿素はデオキシリボヌクレオチドの細胞のプールを還元するリボヌクレオチド還元酵素を阻害する。利用可能な多くの付加的DNA合成阻害剤が存在する。付加的DNA合成阻害剤は細胞のDNA合成を封鎖することが知られているが、しかし、それらはMVA複製の封鎖での使用に推奨されない。これらは、DNAポリメラーゼ阻害剤(アフィジコリンのような)、トポイソメラーゼ阻害剤(カンプトテシンのような例はタイプIトポイソメラーゼを封鎖し;ノボビオシンおよびナリジクス酸はタイプIIトポイソメラーゼを封鎖する)、ならびにDNAジャイレース阻害剤(ヘリキノマイシンのような)を包含する。細胞のDNA合成を封鎖するDNA合成阻害剤は、複製機能を実施するため細胞の酵素に甚だしく依存するヘルパーウイルスにとってより効果的であるとみられる。
【0034】
遺伝子レスキュー事象の間にDNA合成阻害剤を使用することの明白な一利点は、改変ヘルパーウイルスでのレスキューされるRNAウイルスの汚染が非常にわずかであるかもしくは全くないはずであることである。MVAにおいては、被許容細胞における複製周期が形態形成の非常に後期の段階で停止され、非感染性であるウイルス粒子をもたらす。半許容細胞の感染は制限されたウイルス成長をもたらし、これは、遺伝子レスキュー実験では禁忌を示される。AraCもしくはヒドロキシ尿素により封鎖されて、後期のタンパク質合成の付随する阻害はウイルス粒子の完全な非存在をもたらす。レスキューされたウイルスは、ヘルパーウイルスの成長に対し許容性である細胞系中で直接増幅される。トランスフェクションに使用されるDNA合成阻害剤の量は、ヘルパーウイルスの成長を分析するための試験実験により容易に決定される。
【0035】
ウイルスcDNAの組換えRNAウイルスへの転化に必要とされる分子事象は、一般に、T7ポリメラーゼによる転写、および、3種もしくはそれ以上のウイルスのトランスに作用する因子(MVの場合、N、PおよびL)による負もしくは正いずれかの鎖の完全長のゲノムの複製を必要とすることが理解されている。同時発生的なMVA複製は、レスキュー事象全体での細胞内および細胞外の供給源(resources)の枯渇をもたらし、おそらく若干の程度までそれを傷つける。中期および後期遺伝子の発現の封鎖は、これらの供給源の保存をもたらし、そして、おそらく、阻害剤の存在下での遺伝子のレスキューが高められる一理由である。
【0036】
ウイルス感染により誘導される細胞障害性の影響(CPE)は、野性型ウイルスに感染した細胞に比較してMVAに感染した細胞で顕著に低下される。それは、DNA合成阻害剤で処理された、MVAに感染した細胞でさらに低下される。感染した細胞の寿命の伸長はより広範な外来遺伝子の発現を可能にする。これは、改良された遺伝子レスキューについての別の有利な成分かも知れない。
【0037】
T7発現を駆動するための他のプロモーター(強い初期、初期/中期、中期もしくは初期/後期)の使用は、好ましくはDNA複製阻害剤の存在下で、遺伝子レスキューを高める可能性がある。ワクシニアウイルスのプロモーターは本発明の方法に適する。
【0038】
宿主細胞を、その後、最低2種の上述された発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクションする。宿主細胞は、感染性の弱毒化ウイルスを生じるようにこれらのベクターの共発現を可能にする条件下で培養する。
【0039】
その後、レスキューされた感染性ウイルスを、最初にインビトロ手段により、その所望の表現系(温度感受性、低温適応、プラークの形態、ならびに転写および複製の減弱)について試験する。シスに作用する3’のゲノムプロモーター領域での突然変異もまた、ミニレプリコン系を使用して試験する。ミニレプリコン系では、必要とされるトランスに作用する被包化およびポリメラーゼ活性が、野性型もしくはワクチンのヘルパーウイルス、または、N、Pおよび遺伝子特異的弱毒化突然変異をもつ多様なL遺伝子を発現するプラスミドにより提供される(ラデケ(Radecke)ら(1995)およびシドゥ(Sidhu)ら(1995))。
【0040】
弱毒化された表現系のレスキューされたウイルスが存在する場合は、適切な動物モデルを用いて攻撃実験を実施する。非ヒトの霊長類は、ヒト疾患の病状についての好ましい動物モデルを提供する。これらの霊長類を、最初に、弱毒化された組換え的に発生されたウイルスで免疫し、その後、野性型形態の該ウイルスで攻撃する。
【0041】
本発明のレスキュー方法で使用し得る宿主細胞は、所望の組換えウイルスの産生に必要な必須の構成要素のベクターからの発現を許容するものである。こうした宿主細胞は、原核生物細胞もしくは真核生物細胞、および好ましくは脊椎動物細胞から選択し得る。一般に、好ましい宿主細胞は、ヒト胚腎細胞のようなヒト細胞由来である。ラデケ(Radecke)ら 1995は、293 3−46と呼称されるヒト胚腎細胞系由来である宿主細胞の使用を開示する。ベロ細胞、ならびに多くの他の型の細胞もまた宿主細胞として使用し得る。以下は、適する宿主細胞の例である。すなわち、(1)ヒト二倍体一次細胞系:例えばWI−38およびMRC5細胞;(2)サル二倍体細胞系:例えばFRhL−胎児アカゲザル肺細胞;(3)準一次連続(quasi-primary continues)細胞系:例えばAGMK−アフリカミドリザル腎細胞;(4)ヒト293細胞(制限された(qualified))ならびに(5)CHO、MDCK(メイディン−ダービイ(Madin−Derby)イヌ腎)、一次ニワトリ胚線維芽細胞のような他の潜在的細胞系。二者択一的に好ましい態様においては、細胞によるDNAの取込みを増大させるためにトランスフェクション促進試薬が添加される。これらの試薬の多くは当該技術分野で既知である。リポフェクテース(LIPOFECTACE)(ライフ テクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ゲイタースバーグ)およびエフェクティーン(EFFECTENE)(キアジェン(Qiagen)、カリフォルニア州ヴァレンシア)が普遍的な例である。リポフェクテース(Lipofectace)およびエフェクティーン(Effectene)は双方とも陽イオン性脂質である。それら双方はDNAをコートし、かつ、細胞によるDNAの取込みを高める。リポフェクテース(Lipofectace)はDNAを取り巻くリポソームを形成する一方、エフェクティーン(Effectene)はDNAをコートするがしかしリポソームを形成しない。
【0042】
本発明で使用されるRNAウイルスの多くはヒト病原体であるため、こうした例では霊長類細胞が好ましく使用される。イヌジステンパーウイルスおよび非ヒトの哺乳動物を感染させる他のモルビリウイルスのような例外が存在する。これらのウイルスの全部は真核生物細胞のみを感染させる。麻疹ウイルスは主として霊長類の細胞型に限定される。若干の真核生物細胞系はウイルスの増殖について他者よりも良好にはたらき、また、若干の細胞系はいくつかのウイルスについて全くはたらかない。生存可能なウイルスのレスキューを容易に検出することができるために、検出可能な細胞障害性の影響を生じさせる細胞系が使用される。麻疹、および潜在的に他のウイルスの場合には、該ウイルスがベロ細胞上で迅速に広まりそして容易に検出可能なプラークを作成するため、トランスフェクションされた細胞をベロ細胞上で成長させる。これは本発明の別の重要な特徴である。一般に、選択されたウイルスの成長に対し許容性である宿主細胞を使用する。若干の例では、宿主細胞は「補完(complementing)細胞型」である。麻疹ウイルスの場合には、293−3−46細胞(ラデケ(Radecke)ら、1995)が、麻疹ウイルスのNおよびP遺伝子、ならびにT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を発現するため、それらを使用する。他の系は、全部の必要なウイルスタンパク質が発現プラスミドおよびT7 RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスにより提供されるため、この制限を有しない。
【0043】
転写ベクターおよび発現ベクターは、宿主細胞中での発現のために設計されたプラスミドベクターであり得る。被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低1種の単離された核酸分子を含んで成る発現ベクターは、同一の発現ベクターもしくは最低2種の異なるベクターからこれらのタンパク質を発現することができる。これらのベクターは基本的なレスキュー方法から公知であり、また、それらは本発明の改良された方法での使用のため変えられる必要はない。
【0044】
本発明の改良された一方法においては、有効な熱ショック温度を使用する。有効な熱ショック温度は、組換えウイルスのレスキューの実施に示唆される標準温度より上の温度である。多くの例において、有効な熱ショック温度は37℃より上である。あるレスキュー方法を有効な熱ショック温度で実施する場合、該レスキュー方法は、温度の増大の非存在下でレスキューが実施される場合の組換えウイルスの回収のレベルを越えた所望の組換えウイルスの回収の増大を生じさせる。有効な熱ショック温度および曝露時間は、使用されるレスキュー系に依存して変動してよい。こうした温度および時間の変動は、選択されたウイルスゲノムもしくは宿主細胞型の差異から生じる可能性がある。該温度は変動してよいとは言え、有効な熱ショック温度は、特定の組換えウイルスを用いていくつかの試験レスキュー処置を実施すること、そして温度および曝露の時間を変動させる際の所望の組換えウイルスの回収率のパーセントを確立することにより、容易に確かめ得る。確実に、レスキューを実施するためのいずれの温度範囲の上端も、トランスフェクションの成分が破壊される、もしくはトランスフェクションで機能するそれらの能力が激減もしくは減少される温度である。
【0045】
温度範囲の例示的一覧を下に示す。すなわち
38℃から約50℃まで、39℃から約49℃まで、39℃から約48℃まで、約40℃から約47℃まで、約41℃から約47℃まで、約41℃から約46℃まで、約42℃から約46℃までがより好ましい。あるいは、43℃、44℃、45℃および46℃の熱ショック温度がとりわけ好ましいことが言及される。
【0046】
以下により束縛されることなく、レスキューの間の熱ショック温度に上昇された温度を使用することは、熱ショックタンパク質(hspと称される)に関連した細胞応答および合成を誘発することが、これにより理論づけられる。熱ショックが、細胞のストレス応答、および熱ショックタンパク質(hsp)と呼ばれる一群の多機能タンパク質の合成を誘導することが認識される(クレイグ(Craig)、1985;グンター(Gunther)とウォルター(Walter)、1994;リンドクィスト(Lindquist)、1986)。hspの多く(しかし全部ではない)は、高度に誘導可能な遺伝子によりコードされ、そして、これらのタンパク質はストレスからの細胞の回収を助けるために、上昇されたレベルで合成される。誘導可能なhspは基礎レベルの細胞中にもまた存在し、これらのタンパク質が正常の細胞機能で演じる多様な役割を示す。hspのいくつかは、それらが適正なタンパク質のフォールディングの補助で重要な役割を演じるため、シャペロンともまた呼ばれる(ゲティング(Gething)、1996;マーティン(Martin)とハートル(Hartl)、1997)。hspに帰される他の機能は、細胞中でのタンパク質転送(trafficking)、酵素およびタンパク質の機能の調節、DNA複製への参画、ならびにウイルスの複製および病因論での関与における役割を包含する(フランケ(Franke)、ヤウン(Yaun)とルバン(Luban)、1994;フリードマン(Friedman)ら、1984;ゲティング(Gething)、1996;グリック(Glick)、1995;フ(Hu)、トフト(Toft)とゼーガー(Seeger)、1997;ルント(Lund)、1995;マーティン(Martin)とハートル(Hartl)、1997;プラット(Pratt)、1992;サントロ(Santoro)、1996)。
【0047】
哺乳動物の熱ショックタンパク質70(hsp70)のファミリーは、大きさがおよそ70kDのタンパク質の関連する一群である。主要な誘導可能な形態のhsp70(hsp72)は、72kDの見かけの分子量を有する。73kDのhsp70タンパク質(hsp73)は構成的に細胞中で発現され、そして熱ショックコグネイトタンパク質(hsc73、(グンター(Gunther)とウォルター(Walter)、1994))と命名されている。これらのタンパク質は上に挙げられた機能のいくつかに参画し、また、熱ショックに応答して本来の(レスキューされない)CDV遺伝子発現を増大させる宿主細胞因子の一として関係している。Hsp72のアイソフォームは、高められたウイルス転写活性を含有するCDVヌクレオキャプシドの画分とともに共精製する(オグルスビー(Oglesbee)ら、1996)。
【0048】
本明細書に記述されるようなわれわれの例示的結果を考慮すれば、CDV遺伝子発現、および本明細書に記述される方法に従ってレスキューすることができる他のウイルスについての遺伝子発現に対する熱ショック温度の影響は、少なくとも部分的にHsp70の誘導によることを推測し得る。従って、本発明の代替の態様は、hsp、とりわけHsp72のようなHsp70の誘導を達成することが可能である有効な熱ショック温度の使用に関する。
【0049】
選択された熱ショック温度を確立するための試験の実施においては、熱ショック処置を実施するための所望の時間もまた選択し得る。有効な熱ショック温度を適用するのに十分な時間は、レスキューを実施するために示唆される標準温度を越える温度の増大の非存在下でレスキューを実施する場合の組換えウイルスの回収のレベルを越える、所望の組換えウイルスの回収の増大がそれにわたって存在する時間である。時間の適切な長さはレスキュー系に基づいて変動してよい。時間のこうした変動は、選択されたウイルスゲノムもしくは宿主細胞型の差異からもまた生じる可能性がある。時間が変動してよいとは言え、有効な熱ショック温度を適用するための時間の量は、特定の組換えウイルスを用いて数回の試験レスキュー処置を実施すること、そして、温度および時間を変動させた際の所望の組換えウイルスの回収率もしくは回収パーセントを確立することにより容易に確かめることが可能である。確実に、レスキューの実施で使用されるいずれかの時間変数の上端は、トランスフェクションの成分が破壊される、またはトランスフェクションで機能するそれらの能力が激減もしくは減少される時間の量である。熱ショック処置のための時間の量は、組換えウイルスの回収の所望の増大が得られる限りは、数分から数時間まで変動してよい。
【0050】
有効な熱ショック温度へのトランスフェクションされた細胞の曝露の時間は各レスキュー系とともに変動する可能性があるとは言え、曝露時間の範囲(分)の例示的一覧を以下に示す。すなわち
約5から約300まで、約15から約300まで、15から約240まで、約20から約200まで、約20から約150まで、約30から約150までが最も好ましい範囲である。
【0051】
所望の組換えウイルスの改良された回収のレベルを決定するために多数の手段を使用し得る。本明細書の実施例に示されるとおり、組換えウイルスのレスキューをモニターするのに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)レポーター遺伝子を使用し得る。レポーター遺伝子の対応する活性は、組換えウイルスの発現の基礎および改良されたレベルを確立する。他の方法は、得られた組換えウイルスのプラークの数を検出すること、そしてレスキューされたウイルスの産生を配列決定により確認することを包含する。改良された回収は、最低約25%もしくは最低約40%の増大を示すはずである。好ましくは、回収される組換えウイルスの増大は約2倍である。組換えウイルスの量の約5ないし10倍の増大が観察されている。
【0052】
所望の組換えウイルスの改良された回収のレベルの決定のために示唆される一方法は、多数の同一にトランスフェクションされた細胞培養物を調製すること、そしてそれらを多様な条件の熱ショック(時間および温度が変動する)に曝露すること、そしてその後37℃の一定温度でトランスフェクションされかつ維持された対照細胞と比較することを必要とする。トランスフェクション後72時間で、トランスフェクションされた細胞を、約75%コンフルエントなベロ細胞(もしくは該組換えウイルスのプラーク形成の測定に選択すべき細胞型)の単層を含有する10cmプレートに移し、そしてプラークが見えるまでインキュベーションを継続する。その後、プラークを計数し、そして対照細胞から得られた値と比較する。至適の熱ショック条件はプラークの数を最大にするはずである。
【0053】
本発明の別の態様において、宿主細胞(1個もしくは複数)中に存在するようなトランスフェクションされたレスキュー組成物を、プラーク拡大(plaque expansion)段階もしくは増幅段階にさらす。本発明の本局面は、組換えモノネガウイルス目(Mononegavirales)ウイルスを産生するための改良されたレスキュー方法を提供し、この方法は、(a)1個の宿主細胞中で、(i)モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに(ii)被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低1種の単離された核酸分子を含んで成る最低1種の発現ベクターを含んで成るレスキュー組成物のトランスフェクションを、前記ベクターの共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で実施すること;(b)トランスフェクションされたレスキュー組成物を、最低一層のプラーク拡大細胞(PE細胞)上に移すこと;ならびに、(c)場合によっては組換えウイルスを収穫すること、を含んで成る。しばしば、トランスフェクションの実施で使用される宿主細胞は、所望の組換えウイルスの成長に好都合でない。トランスフェクションされた細胞からの組換えウイルスの回収は、天然のウイルスもしくは組換えウイルスが高められた成長を示すプラーク拡大細胞を選択することにより改良し得る。当該技術分野で既知の多様なプレートもしくは容器のいずれかをプラーク拡大段階に使用し得る。好ましくは、レスキュー組成物を含有するトランスフェクションされた細胞をPE細胞の単層上に移す。とりわけ、PE細胞の該層は最低約50%コンフルエントであるべきである。あるいは、PE細胞は最低約60%コンフルエント、もしくは最低約75%コンフルエントでさえある。プラーク拡大を達成するためには、PE細胞の表面積がトランスフェクションされたウイルスを調製するために使用される表面積よりも大きいようなPE細胞の容器に、トランスフェクションされた細胞を移す。2:1から100:1までの高められた表面積比を所望されるとおり使用し得る。最低10:1の高められた表面積が好ましい。プラーク拡大細胞は、こうした細胞における天然のもしくは組換えウイルスの成功裏の成長に基づいて選択する。ベロ細胞は、本明細書で論考される例示的実験で十分にはたらき、そして、従って、それらはPE細胞として好ましい。
【0054】
付加的な改良されたレスキュー方法は、ベロ細胞でのプラーク拡大もしくは熱ショック処理の前もしくはそれらと同時にトランスフェクション培地を置き換えることにより達成する。培地交換は、プラーク拡大もしくは熱ショック温度の前の多様な時点で起こり得るが;しかしながら、トランスフェクションされた細胞のインキュベーションの約4ないし約20時間後の培地の交換を開始点として後に続き得、そしてその後、その後に所望されるとおり、該レスキュー方法の試験実験を実施することから補正し得る。
分節の一本鎖のRNAウイルス
本発明の重要な局面の一は、非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスの回収でのこれらの改良された方法の応用であるとは言え、本発明の方法は、分節の負センスの一本鎖RNAウイルスを包含する多くの型のRNAウイルスのレスキューを高めるのに有用であり得る。ウイルスの分類学に関する国際委員会(the International Committee on the Taxonomy of Viruses)による1993年の改訂された再分類に基づけば、後者の群のウイルスは3科のウイルスに属し、それらは、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)およびアレナウイルス科(Arenaviridae)である。
オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)
インフルエンザ属(Influenzavirus)A、B
脊椎動物、インフルエンザA型ウイルス
インフルエンザ属(Influenzavirus)C
脊椎動物、インフルエンザC型ウイルス
「命名されていないトゴトウイルスグループ(unnamed,Thogoto−like viruses)」属
脊椎動物:トゴトウイルス
ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)
ブニヤウイルス属(Bunyavirus)
脊椎動物:ブニヤンベラウイルス
ナイロウイルス属(Nairovirus)
脊椎動物:ナイロビヒツジ病ウイルス
フレボウイルス属(Phlebovirus)
脊椎動物:シシリアサチショウバエウイルス
ハンタウイルス属(Hantavirus)
脊椎動物:ハンタンウイルス
トスポウイルス属(Tospovirus)
植物:トマト黄化えそウイルス
アレナウイルス科(Arenaviridae)
アレナウイルス属(Arenavirus)
脊椎動物:リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス
テヌイウイルス属(Tenuivirus)
植物:イネ縞葉枯ウイルス
これらの分節ウイルスの科から、ヒトに対する潜在的な健康の危険を提示するウイルスがとりわけ興味深い。逆遺伝学(もしくはレスキュー)は、ビリオンRNAを活性の転写酵素複合体と集成してゲノムに複製を開始させることにより組換えインフルエンザA型の産生経路を提供した(江波(Enami)とパレイス(Palase))。該方法は、cDNAコピーのインビトロ転写、(天然のもしくは突然変異された)所望のウイルス遺伝子分節をvRNAのコピーに創製すること、そしてウイルスを回収することを必要とする。vRNAを、(精製されたビリオンから得られた)RNPタンパク質と混合し、そしてその後ヘルパーウイルス(例えば、所望の組換えウイルスに対応する野性型ウイルス)とともに細胞にトランスフェクションする。例えば、組換えインフルエンザA型の調製において、インフルエンザA型ウイルスを使用して、トランスフェクションされたRNA遺伝子を複製するタンパク質を提供する。組換えウイルスおよびヘルパーウイルスの混合物を形成する。ヘルパーウイルスは大過剰で存在するため、抗体選択系のような強い選択系を使用して子孫を選択的に分離する(江波(Enami)とパレイス(Palase)、1991)。本発明の熱ショック処置を使用して、生じる混合物の体積、ならびに、適切なレスキュー組成物にさらすことにより得られた組換えウイルス、RNA、RNP、およびヘルパーウイルスを用いて共感染を実施する場合の活性の転写酵素複合体のようないずれかの付加的成分の量を増大させ得る。
【0055】
とりわけ、本発明の熱ショック処置は、10種のインフルエンザA型ウイルスにコードされるタンパク質のcDNAクローンを発現するワクシニア−T7ポリメラーゼによりCOS−細胞中で合成のインフルエンザ様のCAT:RNAミニゲノムをパッケージングすることによりウイルス様粒子を製造するのに使用される処置の効率を向上させるのにもまた使用し得る(メナ(Mena)ら、1996)。付加的な一態様において、本発明の熱ショック処置は、ブニヤンベラブニヤウイルスの分節の負鎖のRNAゲノムのレスキューについてのヘルパーに依存しない系の効率の向上で使用し得る(ブリジェン(Bridgen)とエリオット(Eliott)、1996)。本系は、(分節のインフルエンザウイルスのレスキューについて記述されるものよりもむしろ)非分節の負センスのRNAウイルスのレスキュー実験に使用されるものに類似である。3種のブニヤンベラブニヤウイルスのRNAゲノムの分節の完全長のcDNAコピーを含有するプラスミドが構築され、そして、正確なゲノム末端をもつRNAのゲノムのコピーを生じさせるように、T7プロモーターおよびリボザイム配列により隣接された。T7ポリメラーゼおよび組換えのブニヤンベラブニヤウイルスタンパク質を発現する細胞をこれらのプラスミドでトランスフェクションした場合、完全長のアンチゲノムRNAが転写されかつ細胞内で被包化され、そしてこれらは順に複製されそして感染性のブニヤウイルス粒子にパッケージングされた。
【0056】
CDVのLポリメラーゼ活性がhsp72により刺激される(オグルスビー(Oglesbee)ら、1996)ことを示す結果と組み合わせられた、熱ショックが組換えMVのレスキューを高めかつMVミニレプリコンからのCATレポーター遺伝子の発現を増大させるという本明細書に記述される観察結果は、hsp72の誘導が本明細書に記述される熱ショックの影響の本質的原因であるかも知れないという確信を生じさせる。この可能性を、CATミニレプリコン実験の間に発現ベクターからhsp72の遺伝子の一を発現させることにより検査した。エピトープに標識をつけられたバージョンのhspタンパク質の発現がウェスタンブロット分析により確認された(実施例6)。hsp発現ベクターの存在は、トランスフェクションされた細胞でのCATレベルを20倍まで増加させた(実施例6)。これらの結果は、hsp72の高レベル発現がウイルスレスキューの効率を増大させるかも知れないことを示唆する。さらに、これらの結果は、高レベルのhsp72を発現する安定な細胞系がレスキューに好都合かも知れないことを意味する。理想的には、安定な細胞系は、hsp72遺伝子の発現の量を調節し得るような誘導可能なプロモーターからhsp72を発現するとみられる。これは、レスキューを最大限にしかつまたhsp遺伝子の構成的な高レベル発現の細胞系に対するいかなる潜在的な毒性の影響も回避するとみられる、誘導時間の持続期間および誘導レベルの選択を可能にするとみられる。
【0057】
本発明の方法から産生される組換えウイルスを診断および治療の応答に使用し得る。好ましくは、本発明の方法から産生される組換えウイルスは、単独で、または医薬、抗原、免疫剤もしくはアジュバントとともに、ウイルス性疾患の予防もしくは改善におけるワクチンとして使用される。これらの有効成分は、慣習的手段、すなわち、希釈剤もしくは製薬学的に許容できる担体を使用することにより処方かつ送達し得る。
【0058】
以下の実施例は具体的説明として提供され、そして、上述されるような本発明を制限するとして解釈されるべきでない。
実施例
方法および材料
細胞、ウイルスおよびトランスフェクション
293−3−46細胞(ラデケ(Radecke)ら、1995)および293細胞(グレアム(Graham)ら、1977)を、10%ウシ胎児血清(FBS)で補充されたダルベッコの改変最小必須培地(DMEM)中で維持した。293−3−46細胞は、1mlあたり1.5mgのG418(ジェネティシン、ギブコ(Gibco)−BRL)を含有する培地での選択を用いて成長させた。ベロ細胞は5%FBSを含有するDMEM中で成長させ、また、HeLa懸濁細胞は10%FBSで補充された最小必須培地(SMEM)中で成長させた。MV(エドモンストン(Edmonston)B型)は、以前に記述されたとおり(ウデム(Udem)、1984)HeLa懸濁培養物中で増殖させた。
【0059】
トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法(アウスベル(Ausubel)ら、1987;グレアム(Graham)とファン・デル・エプ(van der Eb)、1973)を使用して実施した。トランスフェクションに使用された293−3−46もしくは293細胞は、6穴プレートに植え付け、そして約50〜75%コンフルエントまで成長させた。細胞は、トランスフェクションの1〜3時間前は、G418を欠く4.5mlの新鮮な培地で養った。水中225μlの最終体積中で適切なDNAを組み合わせること、次いで25μlの2.5M CaCl2を添加することにより、トランスフェクション混合物を調製した。250μlの2×HEPES緩衝生理的食塩水(280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4、50mM HEPES、pH7.05)をゆっくりと添加しつつ、DNA−カルシウム混合物を穏やかにボルテックス攪拌した。沈殿を室温で20分間そのままにさせ、その後細胞に添加した。細胞を一夜(14〜16時間)インキュベーションし、その後トランスフェクション培地を除去し、そして細胞をすすぎかつG418を欠く新鮮な培地で養った。トランスフェクション培地を除去した後に、細胞あたり5プラーク形成単位(pfu)で、トランスフェクションされた細胞の感染を実施した。感染は、培地を交換する前に2時間インキュベーションした。この時点で、熱ショックされるはずであった細胞を含有する皿をパラフィルムで覆い、そして44℃の水浴に移し、そして37℃のインキュベーターに移す前に3時間インキュベーションした。細胞は、一過性の遺伝子発現の分析のためにトランスフェクションの開始48時間後に収穫したか、またはレスキュー実験のために72時間(もしくは別に本明細書に示されるとおり)で収穫した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)アッセイを、既に記述されたとおり(シドゥ(Sidhu)ら、1995、およびパークス(Parks)とシェンク(Shenk)、1996)実施した。
【0060】
単層の上で培地を反復してピペットで出し入れして細胞をはがしかつ単層を小さな凝集塊に砕くことにより、ウイルスのレスキューのため収穫された細胞をウェルから取り出した。細胞解離剤は使用しなかった。10cm皿上の10mlの培地中で成長するベロ細胞のコンフルエント近くの単層上に、細胞および5mlの培地を直ちに分配した。4ないし5日後にプラークが見え、そして単層をプラーク計数のため染色したか、もしくは収穫して組換えウイルスストックを調製した。
【0061】
RNAトランスフェクションは、以下の改変を伴い、DNAについて上述されたとおり実施した。メガスクリプト(Megascript)キット(アンビオン(Ambion))のT7 RNAポリメラーゼ試薬を使用して、トランスフェクションのためのRNAをインビトロで調製した。RNA−リン酸カルシウム沈殿を293細胞とともに5〜6時間インキュベーションし、そしてその後除去した。トランスフェクションおよび感染は、トランスフェクション培地へのウイルスの添加により同時に実施した。トランスフェクション−感染培地を交換した後に、適切な細胞サンプルを43〜44℃で熱ショックした。トランスフェクション/感染の開始後24〜48時間で細胞を収穫した。
組換えDNA
完全長のMVのcDNAプラスミド(p(+)MV)およびMVのL遺伝子発現プラスミド(pEMC−La)は、ビレター(Martin Billeter)およびラデケ(Frank Radecke)(ラデケ(Radecke)ら、1995)により恵与された。CATミニレプリコンの調製法は記述されている(シドゥ(Sidhu)ら、1995)。熱ショックされた293−3−46細胞から抽出されたRNAからのcDNAを増幅することにより、hsp70発現プラスミドをクローン化した(ハント(Hunt)と森本(Morimoto)、1985)。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、Taq DNAポリメラーゼ、およびタイタン(Titan)キット試薬(ベーリンガー マンハイム(Boehringer Mannheim)で見出されるPwo DNAポリメラーゼを含有する高忠実度酵素混合物を用いて、逆転写PCR(RT/PCR)反応を実施した。hsp70のcDNAを発現プラスミドpCGN(田中(Tanaka)とヘル(Herr)、1990)にクローン化して、アミノ末端のコーディング領域にインフルエンザHAエピトープ標識(tag)を含有する発現構築物を生じさせた。
DNA配列決定
RT/PCRにより増幅されたDNAを配列決定することにより、MVの配列を決定した。グアニジウム−イソチオシアナート−フェノール−クロロホルム抽出法(コムチンスキ(Chomczynski)とサッキ(Sacchi)、1987)により、MVに感染した細胞からのRNAを調製し、そして、タイタン(Titan)キット(ベーリンガー マンハイム(Boehringer Mannheim))中の試薬を使用してRT/PCRを実施した。増幅されたDNAは低融点アガロースゲルでゲル精製した。色素ターミネーター反応(アプライド バイオシステムズ(Applied Biosystems))を使用してPCRフラグメントを配列決定し、そしてABI プリズム[Prism](商標)自動シークェンサー(パーキン−エルマー(Perkin−Elmer))で分析した。プラスミドDNAの配列の確認もまた自動シークェンサーで実施した。
実施例1
cDNAレスキュープロトコル
本プロトコルを図1に要約する。
【0062】
トランスフェクションを開始する前日に、10%ウシ胎児血清(FBS)および1.5mg/mlのG418抗生物質で補充されたDMEMを使用して、293−3−46細胞を6穴プレートに分割する。翌日の使用が期待される場合は、1個のコンフルエントの10cmプレートを6穴皿で分割する。組換えウイルスの回収の見込みを増大させるため、レスキュー実験あたり12個のウェルをトランスフェクションする。
【0063】
トランスフェクションの約1ないし3時間前に、10%FBS(G418なし)で補充された4.5mlのDMEMで各ウェル中の培地を置き換え、そしてその後トランスフェクションを開始する。
リン酸カルシウム沈殿:
225μlの体積中の水およびDNAを滅菌の5mlポリプロピレンチューブ中で組み合わせる。1トランスフェクションあたりに5μgのp(+)MVおよび100ngのL発現プラスミド(pEMC−La)を使用する。25μlの2.5M CaCl2を添加しかつ混合する。チューブを穏やかにボルテックス攪拌しながら250μlの2×HBSを一滴ずつ添加する。HBSを添加した後、チューブを室温で15〜20分間そのままにする(HBSは、2×HEPES緩衝生理的食塩水、すなわち280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4、50mM HEPES、pH7.05である(アウスベル(Ausubel)ら、1987))。大量の母型(master)トランスフェクション混合物を作成するよりもむしろ各ウェルについて個々のトランスフェクションを設定することが役立つ。沈殿を一滴ずつ培地に添加し、そして細胞を約12ないし16時間、一夜インキュベーションする。
【0064】
その後、培地を除去しかつ細胞を洗浄する。細胞はHEPES/生理的食塩水溶液(150mM NaCl、50mM HEPES、1mM MgCl2、pH7.2)で2回すすぐ。細胞をインキュベーションする前に、5mlの培地(DMEM、10%FBS、G418なし)を添加する。
【0065】
熱ショック:上述されたとおり新鮮な培地を添加した後に、6穴プレートをパラフィルムで封止し、そして蓋のついたタッパーウェア(Tupperware)容器に移す。該容器を43〜44℃の水浴に沈めそして3時間インキュベーションする。この熱ショック段階の後にパラフィルムをプレートから除去し、そして細胞を37℃のインキュベーターに移す。細胞はトランスフェクションの開始後合計で約72時間インキュベーションする。
【0066】
インキュベーションが完了した後、ベロ細胞を用いてプラーク拡大段階を実施する。ベロ細胞は、1枚の10cmプレートを4もしくは5枚の10cmプレートに分割することにより、使用前日に調製する。一夜インキュベーションの後の細胞は約75%コンフルエントである。トランスフェクションされたウェル1個あたり1枚のベロ細胞のプレートが存在するように十分なプレートを準備する。トランスフェクションの開始後約72時間で、トランスフェクションされた293−3−46細胞の各ウェルを、ベロ細胞を含有する10cmプレートに移す。5mlの培養培地を細胞上で反復してピペットで出し入れしてそれらをウェルから移動させかつ単層を小さな細胞凝集塊に砕くことにより、293−3−46細胞を移動させる。細胞の溶解を回避するがしかし細胞を移動させるのに十分力強くピペットで出し入れせよ。その後、トランスフェクションされた細胞凝集塊を含有する5mlの培養培地を、既に10mlの培養培地を含有するベロ細胞の10cmプレートに分配する。レスキュー系に依存して、プラークを可視化するのに十分な時間(約4〜5日)を与えるべきである。細胞を掻き取りかつそれらを遠心分離により収集することにより、組換えウイルスを収穫する。細胞を、血清を欠く1mlの血清を含まないDMEM(ギブコ(Gibco)−BRL)に再懸濁し、そして1回凍結融解してウイルスを遊離させる。
実施例2
本実施例では、実施例1に記述されたレスキュー方法を、熱ショックを適用しなかった対照と一緒に6回反復した。6回の独立したレスキュー実験からの結果を図5に示す。全部の実験で使用されたMVのcDNAはエドモンストン(Edmonston)B型配列(ラデケ(Radecke)ら、1995)を含有した。上述されたとおりトランスフェクションを実施し、そして熱ショックインキュベーションは44℃で3時間であった。実験1でプラスもしくはマイナスのプラークを評価し(scored)、そして残存する実験でプラークを計数した。本実施例で実施された実験は以下を示した。すなわち
慣習的レスキュー技術(ラデケ(Radecke)ら、1995)の2点の改変、すなわち1回の熱ショック段階および1回のプラーク拡大段階は、それぞれ、組換えウイルスを産生したトランスフェクションされた培養物の数の大きな増大で有効であった。これらの改変を使用する前には、トランスフェクションされた培養物の約2〜3%のみが組換えウイルスを産生した。上の処置において、トランスフェクションされた培養物の50から約90%までが組換えウイルスを産生した。
実施例3
プラーク拡大の改変
実施例1のレスキュープロトコルのプラーク拡大段階は、以下の型の実験から確立した。それらは熱ショック処理の非存在下で実施する。
【0067】
ラデケ(Radecke)ら(1995)により概説された手順に従いつつ、実施例2のプラーク拡大段階を伴わずに実験を実施した。これらの実験では、トランスフェクションされた細胞を、6穴皿中の1個のウェルから1枚の10cmプレートに移して、4〜5日の付加的な細胞成長およびプラークが発生するための追加の時間を可能にした。この処置を使用してはプラークが検出されなかった。第二の型の実験においては、トランスフェクションされた細胞を掻き取りおよび遠心分離により収穫し、そして血清を含まないOPTIMEM(ライフ テクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ゲイタースバーグ)培地に再懸濁した。細胞を1回の凍結融解周期にさらしてウイルスを遊離させ、そして、この細胞ライセートを、約75%コンフルエントであったベロ細胞を含有する1枚の10cm皿に適用した。4ないし5日後、ベロ細胞をプラークについて検査した。培養物の約2〜3%が麻疹ウイルスプラークについて陽性であった。実施例2に概説されたプラーク拡大プロトコルに従い、記述されたとおりの2%の成功率を上回る10〜20倍の向上が達成された。細胞が、実施例2に示されたようなプラーク拡大段階に先立ち凍結融解周期にさらされていないことが重要なようである。
実施例4
熱ショックはミニレプリコンからの発現を増大させる
熱ショック後の向上されたレスキューの結果の潜在的なメカニズムを検査するため、MVミニレプリコンからの遺伝子発現に対する熱ショックの影響を試験した(結果については図2を参照されたい)。ミニレプリコンのプラスミド(pMV107CAT)は、MVの末端により隣接されるCAT遺伝子の負センスのRNAのコピーの、T7 RNAポリメラーゼ媒介性の合成を指図するように設計した(シドゥ(Sidhu)ら、1995)。本プラスミドを使用して、ミニレプリコンRNAの細胞内合成のために293−3−46細胞をトランスフェクションした。293−3−46細胞におけるミニレプリコンRNAの複製および発現は、感染により提供されるMVタンパク質での補完(complementation)により実施したか、もしくは、(該細胞がNおよびPタンパク質双方を提供するため)L発現プラスミドで補完した。293−3−46細胞をMV−CATミニレプリコンプラスミドDNA(1μg)で一夜トランスフェクションした。若干のトランスフェクション(レーン3および7)はLの補完を提供するためにMVのL遺伝子発現プラスミド(100ng)もまた受領した。トランスフェクションの約14時間後に培地を交換し、そして、該細胞を、細胞あたり5pfu(プラーク形成単位)でMVに2時間感染させた(レーン4および8)。感染後、培地を交換し、そして適切な細胞培養物(レーン5〜8)を44℃で3時間熱ショックした。トランスフェクションの開始48時間後に細胞を収穫し、そしてCATアッセイを上の方法に記述されるとおり実施した。
【0068】
該ミニレプリコンの発現に対する熱ショックの影響を検査する場合、熱ショックを使用するレスキューはCAT遺伝子活性の強い増大を生じさせた(図2)。図2に示される実験はミニレプリコンDNAを用いて実施し、また、細胞をトランスフェクション48時間後に収穫したことを除いてレスキュー実験に類似に実施した。トランスフェクション培地の除去後、トランスフェクションされた細胞を細胞あたり5pfuで感染させることにより、ウイルスによる補完を実施した。L発現プラスミドでの補完はミニレプリコンDNAでのコトランスフェクションにより単純に行った。この結果は、いずれの形態の補完を使用した場合にも熱ショックが発現を刺激することを示す。複数の実験において、L発現プラスミドでの補完により生じられたCAT発現は、熱ショックにより2から10まで倍増大した(レーン3および7を比較せよ)。同様に、CAT活性は、ウイルス補完を使用した場合にもまた増大し、そして約5倍の増強をもたらした(レーン4および8)。期待されたとおり、CATプラスミド(レーン1および5)もしくはL補完の供給源(レーン2および6)を受領しなかった陰性対照のトランスフェクションは、非常に低レベルの背景CAT活性を生じた。
実施例5
ミニレプリコンの増大された発現が熱ショック後により高レベルのT7ポリメラーゼ活性に関連づけ得た可能性が存在した。より高いT7ポリメラーゼ活性は、熱ショック後の293−3−46細胞での該遺伝子の増大された発現から生じるかも知れなかった。T7ポリメラーゼ遺伝子は293−3−46細胞中でCMVの前初期プロモーター/エンハンサーから発現され(ラデケ(Radecke)ら、1995)、また、CMVプロモーター/エンハンサーは熱ショックに応答することが示されている(アンドリュース(Andrews)、ニューバウンド(Newbound)とレアモア(Lairmore)、1997)。この可能性を排除するために、細胞をミニレプリコンRNAでトランスフェクションし、そして実施例4で使用されたような熱ショック処理にかけた。加えて、本実施例では、熱ショックの影響が293−3−46細胞系中に存在するMV遺伝子の増大された発現に関連付けられた可能性を排除するために、RNAトランスフェクションを293細胞で実施した(グレアム(Graham)ら、1977)。293−3−46細胞はいかなるMV遺伝子も安定に発現しない。本実験で使用されたトランスフェクションプロトコルは、RNAトランスフェクションを適応させるように改変した(上の方法のセクションを参照されたい)。5μgのRNAをリン酸カルシウム処置によりトランスフェクションした。培地にトランスフェクション混合物を添加した直後にウイルスを添加することにより、適切な細胞のMV感染を実施した。細胞に沈殿を添加した後に、MV(細胞あたり5fpu、図3のレーン3および6)を培養培地に添加して直ちに感染を開始し、それがヌクレオキャプシド中にパッケージングされ得る前に細胞内のRNA分解の機会を小さくした。5〜6時間のトランスフェクション−感染のインキュベーション後に培地を交換し、そして、適切な細胞サンプルを、37℃に戻す前に44℃で2時間熱ショックした。CATアッセイのため、トランスフェクション−感染の開始24〜48時間後に細胞抽出物を調製した。
【0069】
RNAトランスフェクションからの結果はDNAトランスフェクションの結果に類似であった。熱ショックは、感染した細胞でのCATの発現を本質的に増大させた(図3、レーン3および6を比較せよ)。ミニレプリコンRNA(レーン1および4)もしくはウイルス補完(レーン2および5)を受領しなかった細胞ではCAT活性は観察されなかった。RNAトランスフェクションの結果は、増大されたT7 RNAポリメラーゼ活性が、図2に示されるDNAトランスフェクション実験での熱ショックの影響の原因であった可能性もまた排除する。
実施例6
ミニレプリコン発現のHsp70による刺激
オグルスビー(Oglesbee)らは、誘導可能なhsp70のアイソフォームhsp72がCDVヌクレオキャプシドとともに共精製すること、および、これらのヌクレオキャプシドは高められたインビトロ転写活性を示すことを決定した(オグルスビー(Oglesbee)、リングラー(Ringler)とクラコウカ(Krakowka)、1990;オグルスビー(Oglesbee)ら、1996)。hsp72が上の実施例で観察された熱ショックの影響に関与したかどうかを評価するため、実施例1の熱ショック処理の代わりにhsp70遺伝子の過剰発現を本質的に用いた実験を実施した(結果を図4に示す)。誘導可能なhsp70のcDNA(ハント(Hunt)と森本(Morimoto)、1985、ウ(Wu)ら、1985)を、実施例2に従った熱ショックされた細胞から調製されたRNAからクローン化した。該cDNAを、fluエピトープ標識と一緒にCMV発現ベクター、プラスミドpCGN(田中(Tanaka)、1990)にクローン化した。hsp70遺伝子のアミノ末端コーディング領域を、配列YPYDVPDYAを有するインフルエンザHAエピトープ標識に融合した(田中(Tanaka)および375−386.、1990)。HAエピトープを含有するアミノ末端をもつhsp70タンパク質を発現するようにhsp70のcDNAをクローン化した。このプラスミドの使用は、内在性のhsp70アイソフォームの背景の存在下でさえ、インフルエンザ標識に対する抗体を使用してhsp70のcDNAの発現をたどることを可能にする。トランスフェクションされた細胞から調製された全細胞抽出物を、エピトープ標識に特異的な抗体を使用するウェスタンブロッティング(パークス(Parks)とシェンク(Shenk)、1996)により分析した(図4A)。トランスフェクションされた細胞からの抽出物のウェスタン分析は、発現プラスミド(図4A)が、わずかにより大きい70kDの標識されたポリペプチドを生じさせることを示した。
【0070】
L発現プラスミドおよびミニレプリコンDNAと一緒のhsp70発現ベクターでの293−3−46細胞のコトランスフェクションは、CATの増大された発現をもたらした(図4Bを参照されたい)。この一過性アッセイ系においては、hsp70の過剰発現は低レベルのL補完を20倍程度増大させた。hsp70発現ベクターにより誘導されたCAT発現のこの増大は明白に特異的であった。なぜなら、それはLポリメラーゼプラスミドの存在を必要とし、かつ、Lが非存在であるかもしくはCATプラスミドがトランスフェクションから省かれる場合に観察された背景のCAT活性を増大しないからである。これらの結果は、hsp70がミニゲノム発現に対する熱ショックの影響の少なくとも部分的原因であることを強く示唆する。
実施例7
ベロ細胞におけるミニレプリコン発現の熱ショックレスキュー
実施例4に対する追跡として、293−3−46細胞をベロ細胞により置き換えた。
材料:ベロ細胞のトランスフェクション実験のため、麻疹タンパク質N、PおよびLをプラスミドDNAにより提供し、また、T7 RNAポリメラーゼをMVA/T7(ワイアット(Wyatt)ら)感染により提供する。トランスフェクションは、100ngのミニレプリコン、400ngのNプラスミド、300ngのPプラスミド、および以下の表2に示されたとおりのLプラスミドの量を包含した。陰性対照トランスフェクションはLプラスミドの支持を欠いた。加えて、トランスフェクション試薬としてリポフェクテース(LIPOFECTACE)(ライフ テクノロジーズ インク(Life Technologies,Inc.)、メリーランド州ゲイタースバーグから購入された)を用いてベロ細胞をトランスフェクションした。各試験について、トランスフェクション反応あたり2プラーク形成単位(PFU)のMVA/T7(ワイアット(Wyatt)ら)を使用する。2体積のリポフェクテース(LIPOFECTACE)を試験して、効率的なベロ細胞トランスフェクションに対する至適の量を決定した。トランスフェクションは、2種の異なる量のLタンパク質発現プラスミドを用いて実施する。熱ショックのためには、細胞を44℃の水浴に3時間移す。対照細胞は熱ショックしない。
MVA/T7:MVA/T7は、11Kの強い後期プロモーターの調節下に、組込まれた一コピーのT7遺伝子−1を含有するハイブリッドウイルスである(ワイアット(Wyatt)ら 1995)。
実験プラスミド:
Lプラスミドはラデケ(Radecke)とビレター(Billeter)により提供された。基本的に、ラデケ(Radecke)ら(1995)により開示されたクローニング方法により、麻疹L遺伝子をpEMCプラスミドベクター(モス(Moss)ら、1990)にクローン化してプラスミドpEMC−Laを生じさせた。このベクターは、クローン化された遺伝子の真核生物細胞中での発現を助長するための内部リボソーム侵入部位および3’端のポリ−A配列を包含する。同一のベクターを使用して、NおよびP遺伝子のそれぞれのついてのベクターを調製した。NおよびPタンパク質のコーディング領域は、麻疹ウイルスゲノムのcDNAからPCRにより増幅し(ラデケ(Radecke)ら、1995)、その後、ベクターpEMCのNcoI部位とBamHI部位との間にクローン化してpT7−NおよびpT7−Pを生じさせた。
熱ショックのためのベロ細胞のプロトコル:
リポフェクテース(LIPOFECTACE)およびエフェクティーン(EFFECTENE)について
リポフェクテース(LIPOFECTACE):
ベロ細胞がおよそ50〜80%コンフルエントになるまでそれらを6穴培養皿で成長させる。この段階でそれらはなお迅速に分割しかつ健全であり、また、より高い細胞密度はトランスフェクション、MVA/T7感染および熱ショックの間に被られる細胞死を相殺するのを助けるため、約75%コンフルエントの細胞が望ましい。トランスフェクションのためのDNA−脂質混合物は、微小遠沈管中でDNA(N、P、LおよびMVミニレプリコン)ならびに200μlの血清を含まないDMEMを組み合わせることにより調製する。DNA−培地混合物にリポフェクテース(LIPOFECTACE)(実験に依存して12もしくは15μl)を添加し、そして穏やかに混合し、次いで室温で20分インキュベーションする。インキュベーションの終了時に、DNA−リポフェクテース(LIPOFECTACE)混合物を、適切な量のMVA/T7を含有する800μlの血清を含まないDMEMと組み合わせて、細胞あたりおよそ2PFUの最終量を生じさせる。ベロ細胞培養物から培地を除去し、そしてDNA、リポフェクテース(LIPOFECTACE)およびMVA/T7を含有するトランスフェクション混合物で置き換える。5%CO2に設定された37℃のインキュベーター中で細胞を2〜6時間インキュベーションする。ベロ細胞については、このインキュベーションは2〜3時間で至適であると思われる。このインキュベーション期間の終了時に、10%ウシ胎児血清で補充された1mlのDMEMを細胞に添加し、そして適切な細胞培養物を44℃で2〜3時間熱ショックにかける(3時間がベロ細胞に至適なようである)。熱ショックを実施するために、6穴プレートをジップロック(Ziplock)プラスチック袋に移し、そしてその後44℃の水浴に沈める。2〜3時間の熱ショック期間の終了時に、細胞をプラスチック袋から取り出し、そして一夜インキュベーションのため37℃のインキュベーターに戻す。翌日、培地を、10%ウシ胎児血清を含有する2mlの新鮮なDMEMで置き換える。トランスフェクション後およそ48時間で、細胞を収穫してCATアッセイのための抽出物を調製するか、もしくは、細胞を収穫し、そしてベロ細胞の単層を含有する10cm皿に移してプラーク拡大を可能にする。
【0071】
細胞をその後CAT活性について分析した。12μlのリポフェクテース(LIPOFECTACE)および100ngのLプラスミドの条件下で使用された場合、CAT活性は熱ショックにより約7倍刺激された。15μlのリポフェクテース(LIPOFECTACE)および100ngのLプラスミドの条件下で使用された場合は、CAT活性が熱ショックにより約2倍刺激された。以下の表2を参照されたい。
【0072】
【表1】
【0073】
実施例8
ベロ細胞における熱ショックレスキューのためのトランスフェクション促進試薬の比較
上の実験を、リポフェクテース(LIPOFECTACE)もしくはエフェクティーン(EFFECTENE)(キアジェン インク(Qiagen Inc.)、カリフォルニア州ヴァレンシア)のいずれかを使用して反復した。
【0074】
エフェクティーン(EFFECTENE)についてのプロトコルは、DNA−脂質混合物の調製を除き本質的に同一である。DNAは、エフェクティーン(EFFECTENE)試薬とともに供給される緩衝生理的食塩水100μlと混合する。その後、8μlのエフェクティーン(EFFECTENE)濃縮試薬を添加し、そして該混合物を室温で5分間インキュベーションする。次に、25μl(もしくは図で指定された量)のエフェクティーン(EFFECTENE)を添加し、そして該混合物を追加の15分間インキュベーションする。15分のインキュベーション後に、DNA−エフェクティーン(EFFECTENE)複合体を、細胞あたりおよそ2PFUを提供するように、十分なMVA/T7を含有する900μlの血清を含まない培地と混合する。この段階で、細胞へのDNA−MVA/T7混合物の適用および全部のその後の段階は、リポフェクテース(LIPOFECTACE)についてたどられた段階に同一である。
【0075】
結果を以下の表3aおよび3bに示す。(Lipo=リポフェクテース(LIPOFECTACE))。トランスフェクション後2時間で熱ショックを実施した場合は、ミニレプリコン活性が増大した。
【0076】
【表2】
【0077】
【表3】
【0078】
実施例9
改変緩衝液技術を用いるベロ細胞のトランスフェクション
材料:BESは:{N,N−ビス[2−ヒドロキシエチル]−2−アミノエタンスルホン酸}である。
BES/リン酸カルシウム処置を使用するレスキューのためのベロ細胞のトランスフェクション
ベロ細胞は、それらがおよそ50〜80%コンフルエントになるまで6穴培養皿で成長させる。この段階でそれらはなお迅速に分割しかつ健全であり、また、より高い細胞密度は、トランスフェクション、MVA感染および熱ショックの間に被られる細胞死を相殺するのを助けるため、細胞は約75%コンフルエントである。トランスフェクションの日、細胞をウェルあたり4.5mlの培地で養い、そして37℃(もしくは、温度感受性のウイルスをレスキューする場合は、温度についてより低い)および3%CO2に設定されたインキュベーターに移す。われわれにより慣例に使用される培地は、10%ウシ胎児血清で補充されたDMEMである(他の培地が役に立つことができる)。細胞を養ったおよそ2ないし4時間後にトランスフェクションを開始する。トランスフェクションのためのDNA−リン酸カルシウム沈殿を5mlのポリプロピレンチューブ中で調製する。N、PおよびLのための発現プラスミドならびにMVレプリコンを包含するレスキューのためのDNAを、225μlの最終体積まで水と組み合わせる。次に、25μlの2.5M CaCl2を添加し、そしてチューブを穏やかに混合する。DNA−CaCl2混合物の全部を調製した後に、250μlの2×BES緩衝生理的食塩水(2×BBS:280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4、50mM BES、pH6.95−6.98)を添加することにより沈殿を調製する。2×BBSは、BBS添加の間継続的に穏やかにボルテックス攪拌しつつ、各チューブに1滴ずつ添加する。2×BBSを添加した後に、チューブを室温で20分インキュベーションする。室温インキュベーションの終了時に、500μlの沈殿を細胞に1滴ずつ添加し、そしてプレートを穏やかに揺すって培地との沈殿の混合を確実にする。沈殿を添加した後に、およそ2プラーク形成単位(pfu)のMVA/T7もしくはMVA/T7−GK16を培地に直接添加し、そしてプレートを穏やかに揺すって混合する。GK16を使用する場合は、DNA合成阻害剤をこの段階で培地に添加する。シトシンアラビノシド(araC)もしくはヒドロキシ尿素(HU)のいずれかを、それぞれ1mlあたり20μgもしくは10mM培地に添加する。トランスフェクション後3時間で、細胞をプラスチックのジップロック袋に移し、そして熱ショックのため44℃に設定された水浴に沈める。細胞を44℃で2〜3時間(より持続される3時間が最良に作用するとみられる)インキュベーションし、その後、一夜インキュベーションのため、3%CO2に設定されたインキュベーターに戻す。翌日、培地およびトランスフェクション成分を細胞から除去し、そしてhepes緩衝生理的食塩水(20mM Hepes、150mM NaCl、1mM MgCl2)で細胞を2回洗浄し、その後新鮮な培地を添加する。MVA/T7−GK16に感染した培養物にAraCもしくはHUを補給する。細胞を、標準的な37℃および5%CO2に設定されたインキュベーター中で追加の1日インキュベーションする(温度感受性ウイルスをレスキューしている場合は、新鮮な培地の添加後に、細胞を適切なより低温で2日インキュベーションし得る)。その後、トランスフェクションされた細胞をウイルスのレスキューのプラーク拡大段階のために収穫するか、もしくは、収穫してCATアッセイのため細胞抽出物を調製する。トランスフェクションされた細胞を培地中に掻き取り、そして、50%コンフルエントのベロ細胞の単層(もしくは選択すべき他の許容細胞型)を含有する10cmプレートもしくはT25フラスコのいずれかに移す。共培養される細胞を37℃(もしくは上に示されたような適切な温度)で4ないし6時間インキュベーションし、その後培地を交換する。この段階での培地の交換は、トランスフェクションされた細胞がDNA合成阻害剤を含有した場合に、プラーク拡大段階の間の共培養物中での細胞の成長の阻害を回避するために不可欠である。プラーク拡大段階を開始した後およそ4ないし5日にプラークが見え、そして細胞を収穫してレスキューされたウイルスの凍結融解ライセートストックを生じさせ得る。CATアッセイの結果を以下の表4aおよび4bに示す。BES/リン酸カルシウム処置は活性を高めた。
【0079】
【表4】
【0080】
【表5】
【0081】
上のトランスフェクション技術については、チェン(Chen)ら、1987およびトグノン(Tognon)ら、1996を参照されたい。
実施例10
DNA合成阻害剤、および強い初期/後期プロモーターの制御下にバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを合成する組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)の使用に基づく改良されたレスキュー
前述に基づき、ヘルパーMVA/T7のウイルスDNA複製を特異的に阻害することにより、われわれは、1.全部のMVA/T7の成長を封鎖する、2.感染した細胞でのCPEをさらに低下させる、そして3.RNAウイルスの遺伝子レスキューの効率を高めることが可能であることが提案された。阻害剤(シトシンβ−D−アラビノフラノシド、AraCおよび/もしくはヒドロキシ尿素)は、ウイルスのDNA合成、そしてその後ウイルスの中期および後期の遺伝子発現を封鎖する。強い合成の初期/後期ワクシニアウイルスプロモーターの転写制御下に単一コピーのT7遺伝子−1を含有する組換えMVA/T7(MVGK16)を工作した。予備研究[ここでは、麻疹ミニゲノムおよび完全長の麻疹のcDNAの遺伝子レスキューのためのヘルパーウイルスとしてMVGK16を使用した]は、AraCもしくはヒドロキシ尿素での感染した細胞の処理が異種ウイルスの遺伝子レスキューの増強をもたらすことを示した(データは示されない)。プラスミドおよびウイルス。われわれは、この研究に、ワクシニアウイルスのpSC65発現/組換えプラスミドを選んだ。このプラスミドは、遺伝子的に工作されたウイルスの初期/後期プロモーターの調節下の外来遺伝子の発現を見込み;それは、ウイルスの7.5Kプロモーターの調節下にlacZ選択マーカーもまた提供する。T7遺伝子−1(モファット(Moffatt)ら、1984)を、pT7−neo(リー(Sally Lee)博士、ワイス−レダリー ヴァクシンズ(Wyeth−Lederle Vaccines)により提供された)からBamHIフラグメントとして摘出し、そしてpSC65(シャクラバルティ(Chakrabarti)ら、1997)のBglII部位にサブクローニングしてpGK16.2を生じさせた(図6)。色素ターミネーター循環配列決定および377ABI DNAシークェンサー(アプライド バイオシステムズ(Applied Biosystems))を使用して、組換えプラスミドを配列決定した。
【0082】
細胞あたり0.5プラーク形成単位(PFU)に等しい感染多重度(MOI)で、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF;スパファス(Spafas))をMVAに感染させ、そしてドタップ(DOTAP)トランスフェクション促進試薬(ベーリンガー マンハイム(Boehringer Mannheim))を使用してpGK16.2でトランスフェクションした。MVAのDNAでの相同的組換えは、ウイルスのtk遺伝子の中断、ならびにT7遺伝子−1およびlacZの挿入をもたらす。X−gal比色プラークアッセイを使用して、組換えウイルス(MVGK16)をCEF細胞上で連続して3回プラーク精製した。組換えMVGK16は、T7ポリメラーゼおよびワクシニアウイルスに対するウサギポリクローナル抗血清での免疫染色により明示されるとおり、3回の連続するプラーク精製および4回のCEFでの増幅を通じて安定であった(データは示されない)。
遺伝子レスキュー。T7転写のための初期/後期プロモーターを含有する発現系MVA/GK16で、上のBES/リン酸カルシウム処置を反復した。BES/リン酸カルシウムのための上のレスキュープロトコルに対する改変を本明細書に示す。GK16を使用する場合、DNA合成阻害剤をこの段階で培地に添加する。シトシンアラビノシド(araC)もしくはヒドロキシ尿素(HU)のいずれかを、それぞれ1mlあたり20μgもしくは10mMで培地に添加する。3%CO2に設定されたインキュベーター中で細胞を一夜インキュベーションする。BESの実施例についての上のプロトコルに従うことにより、トランスフェクションおよび熱ショックを完了する。AraCもしくはHUは、MVA/GK16に感染した培養物に補給する。標準的な37℃および5%CO2に設定されたインキュベーター中で、細胞を追加の1日インキュベーションする(温度感受性ウイルスをレスキューしている場合は、新鮮な培地の添加後に、細胞を適切なより低温で2日インキュベーションし得る)。その後、トランスフェクションされた細胞をプラーク拡大段階のために収穫する。トランスフェクションされた細胞を培地中に掻き取り、そして、50%コンフルエントのベロ細胞の単層(もしくは選択すべき他の許容細胞型)を含有する10cmプレートもしくはT25フラスコのいずれかに移す。共培養される細胞を37℃(もしくは適切な温度)で4ないし6時間インキュベーションし、その後培地を交換する。トランスフェクションされた細胞がDNA合成阻害剤を含有した場合にこの段階で培地を交換することはとりわけ重要である。プラーク拡大段階の間の共培養物での細胞の成長の阻害は望ましくない。プラーク拡大段階を開始した後およそ4ないし5日でプラークが見えるはずであり、そして細胞を収穫してレスキューされたウイルスの凍結融解ライセートストックを生じさせ得る。
遺伝子レスキュー実験。上のプロトコルは、レスキューの陽性の表示を伴うウェルの数の一貫した向上をもたらした。以下の表5を参照されたい。実験は、ベロ細胞での組換えウイルスの第一継代後にプラス(+)もしくはマイナス(−)を評価する。陽性ウェル中のプラーク数は1から50までの範囲にわたった。全部の実験は、一夜トランスフェクション、およびMVA/T7−GK16を使用した場合はその後24時間インキュベーション期間の間に、培地中に20μg/mlのAraCを含有した。第9日の実験については、araC DNA合成阻害剤の代わりに10mMのヒドロキシ尿素を用いた。
【0083】
【表6】
【0084】
以下に、本明細書に組み込まれた参考文献の一覧を提供する。
【0085】
【表7】
【0086】
【表8】
【0087】
【表9】
【0088】
【表10】
【0089】
【表11】
【0090】
【表12】
【0091】
【表13】
【図面の簡単な説明】
【図1】 発明にかかる、改変レスキュー処置の流れ図を描く。本処置は、熱ショック段階の使用、およびベロ細胞の単層へトランスフェクションされた細胞を移すことを包含する。
【図2】 発明にかかる、CATアッセイの使用による実施例4からのミニレプリコン遺伝子発現に対する熱ショックの影響を示すオートラジオグラムである。
【図3】 発明にかかる、実施例5のミニレプリコンRNAトランスフェクション実験のCATアッセイの結果を示すオートラジオグラムである。
【図4A】 発明にかかる、hsp70によるミニレプリコン遺伝子発現の刺激に関する、実施例6の実験でのCMV発現ベクターから発現されるエピトープ標識に特異的な抗体を使用するウェスタンブロットである。
【図4B】 発明にかかる、hsp70発現ベクター、ミニレプリコンDNAおよびL発現プラスミドでの293−3−46細胞のコトランスフェクションからのCATアッセイの結果を示すオートラジオグラムである。
【図5】 発明にかかる、実施例2に記述されるような熱ショックの影響を試験するため実施した6回の独立したレスキュー実験からのプラークカウントを描く表(表1)である。熱ショック処置の利点が明確に示される。
【図6】 発明にかかる、実施例10からのT7遺伝子−1を含有するプラスミドpGK16.2の図である。
Claims (48)
- a)最低1個の宿主細胞中で、(i)モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに(ii)被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードするもう1種の単離された核酸分子(1種もしくは複数)を含んで成る最低1種の発現ベクターを含んで成るレスキュー組成物の培地中でのトランスフェクションを、前記ベクター類の共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で実施すること;ならびに、
b)トランスフェクションされたレスキュー組成物を、組換えウイルスの回収を増大させるのに十分な条件下で有効な熱ショック温度に加熱すること、
を含んで成る、組換えモノネガウイルス目(Mononegavirales)ウイルスの産生方法。 - 組換えウイルスを収穫することをさらに含んで成る、請求項1記載の方法。
- 有効な熱ショック温度が37℃より上である、請求項1記載の方法。
- 有効な熱ショック温度が、37℃から50℃までの範囲にある、請求項1記載の方法。
- 有効な熱ショック温度が、38℃から49℃までの範囲にある、請求項1記載の方法。
- 有効な熱ショック温度が、39℃から48℃までの範囲にある、請求項1記載の方法。
- 有効な熱ショック温度が、41℃から47℃までの範囲にある、請求項1記載の方法。
- トランスフェクションされた細胞が、有効な熱ショック温度に5ないし300分間さらされる、請求項1記載の方法。
- トランスフェクションされた細胞が、有効な熱ショック温度に15ないし240分間さらされる、請求項1記載の方法。
- トランスフェクションされた細胞が、有効な熱ショック温度に15ないし200分間さらされる、請求項1記載の方法。
- 段階(b)の後に、トランスフェクションされたレスキュー組成物がベロ細胞の最低一層上に移される、請求項1記載の方法。
- ベロ細胞の層が単層である、請求項11記載の方法。
- モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)のRNAウイルスがヒト、ウシもしくはマウスのウイルスである、請求項1記載の方法。
- モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が、1種以上のゲノムもしくはアンチゲノムの供給源のキメラである、請求項1記載の方法。
- モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が、弱毒化ウイルスもしくは感染性の形態の該ウイルスをコードする、請求項1記載の方法。
- モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が、感染性の形態の該ウイルスをコードする、請求項1記載の方法。
- モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が、弱毒化ウイルスをコードする、請求項1記載の方法。
- モノネガウイルス目(Order Mononegavirales)の非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が、感染性の弱毒化ウイルスをコードする、請求項1記載の方法。
- RNAウイルスがパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)のウイルスである、請求項1記載の方法。
- RNAウイルスがラブドウイルス科(Rhabdoviridae)のウイルスである、請求項1記載の方法。
- RNAウイルスがフィロウイルス科(Filoviridae)のウイルスである、請求項1記載の方法。
- RNAウイルスが、MV、RSV、PIVおよびBPVより成る群から選択されるウイルスである、請求項1記載の方法。
- RNAウイルスがMVウイルスである、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドが、RSVウイルスより成る群から選択されるRNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードし、かつ、被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質がN、P、LおよびM2である、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドがMVのゲノムもしくはアンチゲノムをコードし、かつ、被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質がN、PおよびLである、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドがPIV−3のゲノムもしくはアンチゲノムをコードし、かつ、被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質がNP、PおよびLである、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞が原核生物細胞である、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞が真核生物細胞である、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞が脊椎動物細胞である、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞が大腸菌(E.coli)である、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞がヒト細胞由来である、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞がヒト胚細胞由来である、請求項1記載の方法。
- 宿主細胞がヒト胚腎細胞由来である、請求項1記載の方法。
- トランスフェクションされたレスキュー組成物を有効な熱ショック温度に加熱した後、該トランスフェクションされたレスキュー組成物を、プラーク拡大細胞の最低一層上に移すことを、さらに含んで成る、請求項1記載の方法。
- プラーク拡大細胞の層が単層である、請求項34記載の方法。
- 組換えウイルスを収穫することをさらに含んで成る、請求項34記載の方法。
- プラーク拡大細胞が最低50%コンフルエントである、請求項34記載の方法。
- プラーク拡大細胞が最低60%コンフルエントである、請求項34記載の方法。
- プラーク拡大細胞が最低75%コンフルエントである、請求項34記載の方法。
- トランスフェクションされた細胞が、プラーク拡大細胞の表面積がトランスフェクションされたウイルスを調製するために使用される表面積よりも大きいプラーク拡大細胞の1個もしくはそれ以上の容器上に置かれる、請求項34記載の方法。
- プラーク拡大細胞がベロ細胞である、請求項34記載の方法。
- 転写ベクターがT7ポリメラーゼ遺伝子をさらに含んで成る、請求項1記載の方法。
- レスキュー組成物が、未改変もしくは改変ヘルパーウイルスをさらに含んで成る、請求項1記載の方法。
- ヘルパーウイルスが、非分節の負センスの一本鎖RNAウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列の転写にT7ポリメラーゼ遺伝子を提供し、ここで、該レスキュー組成物が改変ヘルパーウイルスをさらに含んで成る、請求項43記載の方法。
- T7ポリメラーゼ遺伝子が後期プロモーターもしくは初期/後期プロモーターの調節制御下にある、請求項42記載の方法。
- T7ポリメラーゼ遺伝子が初期/後期プロモーターの調節下にある、請求項45記載の方法。
- トランスフェクションがDNA合成阻害剤の存在下で実施される、請求項42記載の方法。
- トランスフェクションのための宿主細胞がベロ細胞である、請求項1記載の方法。
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