KR100579662B1 - 리보핵산 바이러스의 신규 구제방법 - Google Patents

리보핵산 바이러스의 신규 구제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 모노네가비랄레스 바이러스로 명명되는 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 개선된 생산방법에 관한 것이고, 이는 이러한 바이러스를 홍역 바이러스(MV) 및 호흡기 합포체 바이러스(RSV)와 같은 약독화 및/또는 감염성 바이러스로서 생산하는 방법에 관한 양태를 포함한다. 모노네가비랄레스 목으로부터 재조합 바이러스를 생산하는 한 방법은 (a) 적어도 하나의 숙주 세포에서, (ⅰ) 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터와 (ⅱ) 캡시드화, 전사 및 복제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 구제 조성물의 형질감염을 이러한 벡터의 동시발현과 재조합 바이러스의 생산을 허용하기에 충분한 조건하에서 실행하고; (b) 재조합 바이러스의 회수를 증가시키기에 충분한 조건하에서 형질감염된 구제 조성물을 효과적인 열 쇼크 온도로 가열하며; 임의로 (c) 생성된 재조합 바이러스를 수확하는 단계를 포함한다.
모노네가비랄레스 바이러스, 재조합 바이러스, 열 쇼크, 구제

Description

리보핵산 바이러스의 신규 구제방법{NOVEL METHODS FOR RESCUE OF RNA VIRUSES}
본 발명은 모노네가비랄레스(Mononegavirales) 바이러스로 명명되는 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 개선된 생산방법에 관한 것이다. 바람직한 양태는 홍역 바이러스(MV), 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 및 인간 파라인플루엔자 바이러스(PIV)와 같은 약독화 바이러스 및/또는 감염성 바이러스와 같은 바이러스의 생산방법에 관한 것이다. 재조합 바이러스는 cDNA 클론으로부터 제조될 수 있고, 따라서 게놈에서 일으키고자 하는 변화가 일어난 바이러스가 수득될 수 있다.
엔벌로핑(enveloped) 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스는 특이하게 조직되고 발현된다. 네가티브-센스 일본쇄 바이러스의 게놈 RNA는 뉴클레오캡시드와 관련하여 두가지 주형 기능을 한다: 메신저 RNA(mRNA)의 합성을 위한 주형으로서 및 안티게놈(+) 가닥의 합성을 위한 주형으로서. 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스는 이들 자신의 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 암호화하고 팩키징한다. 메신저 RNA는 바이러스가 감염된 세포의 세포질에 진입할 때만이 합성된다. 바이러스 복제는 mRNA의 합성 후에 일어나고 바이러스 단백질의 연속 합성을 요한다. 새로 합성되는 안티게놈 (+) 가닥은 (-) 가닥 게놈 RNA의 추가 카피를 생성하기 위한 주형으로서 작용한다.
폴리머라제 복합체가 작용하여 게놈의 3' 말단, 특히 프로모터 영역에서 시스-작용 시그널을 관여시킴으로써 전사와 복제를 달성한다. 이어서 바이러스 유전자는 이의 3'에서 이의 5' 말단으로 일방향으로 게놈 주형으로부터 전사된다. 항상 이들의 상류 유전자(즉, 핵단백질 유전자(N))에 비해 하류 유전자(예, 폴리머라제 유전자(L))로부터 mRNA가 덜 제조된다. 그러므로, 항상 게놈의 3' 말단에 대한 유전자의 위치에 따라서 mRNA 다량의 구배가 존재한다.
이러한 비단편화 RNA 바이러스의 분자 유전학적 분석은 네이키드 게놈 RNA 또는 형질감염된 플라스미드로부터 세포내에서 생산된 RNA가 감염성이 아니기 때문에 최근까지 어려웠다(Boyer and Haenni, 1994). 이러한 기술상의 문제점은 재조합 비단편화 네가티브-가닥 RNA 바이러스의 분리를 허용하는 우수한 cDNA 구제 기술의 개발로 극복되었다(Pattnaik 등, 1992; Schnell, Mebatsion and Conzelmann, 1994). 이러한 상이한 네가티브-가닥 바이러스의 구제 기술은 각각 성공적인 구제를 위해 차별화되는 필수 요소를 가지면서 공통의 주제를 따른다(Baron and Barrett, 1997; Collins 등, 1995; Garcin 등, 1995; Hoffman and Banerjee, 1997; Lawson 등, 1995; Radecke 등, 1995; Schneider 등, 1997; He 등, 1997; Schnell, Mebatsion and Conzelmann, 1994; Whelan 등, 1995). 게놈 cDNA 플라스미드의 형질감염 후에, 게놈 RNA의 정확한 카피가 파지 T7 RNA 폴리머라제와 RNA를 절단하여 3' 말단을 형성하는 벡터-암호화 리보자임 서열의 복합작용으로 생산된다. 이 RNA 는 팩키징되고 동시형질감염된 발현 플라스미드에 의해 초기에 공급되는 바이러스 단백질에 의해 복제된다. 홍역 바이러스(MV) 구제 시스템(Radecke 등, 1995)의 경우에, T7 RNA 폴리머라제와 MV 단백질 N(뉴클레오캡시드 단백질) 및 P(인단백질 폴리머라제 서브유니트)를 발현하는 안정한 세포주가 제조된다. 따라서, MV 구제는 적절하게 위치하는 T7 폴리머라제 프로모터를 함유하는 MV 게놈 cDNA 클론과 MV 폴리머라제 유전자(L)를 함유하는 발현 플라스미드로 이 세포주를 동시형질감염시킴으로써 달성될 수 있다.
성공적인 홍역 바이러스 cDNA 구제는 확실히 형질감염 후에 일어나는 여러 분자적 사건이 필요한데, 이는: 1) T7 RNA 폴리머라제와 리보자임 서열에 의해 진행하는 3' 말단에 의한 게놈 RNA의 정확한 완전한 길이 합성; 2) 복제를 개시하기 위한 적당한 수준으로 바이러스 N, P 및 L 단백질의 합성; 3) 게놈 RNA의 전사-활성 및 복제-경쟁 뉴클레오캡시드 구조로의 새로운 팩키징; 및 4) 복제를 진행하기 위한 충분한 수준으로 새로 형성되는 뉴클레오캡시드로부터 바이러스 유전자의 발현을 포함한다. 성공적인 구제에서 정확하게 무슨 단계가 속도-결정할 수 있는지는 결정되지 않았지만, 구제 효율은 전술한 단계 중 하나를 촉진함으로써 매우 향상될 수 있다.
본 발명은 MV와 같은 목적하는 재조합 RNA 바이러스를 회수하는 능력을 향상시키고자 한다. 구제로부터 복제 바이러스의 수득 능력은 목적하는 바이러스의 네이티브 게놈과 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 상당히 변형되기 때문에 감소할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 이러한 장애를 극복하고자 하는 데 이러한 방법은 구제 과정으로부터 목적하는 재조합 바이러스를 수득할 가능성을 실질적으로 향상시킬 수 있기 때문이다.
발명의 요약
본 발명은: (a) 적어도 하나의 숙주 세포에서, (ⅰ) 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터와
(ⅱ) 캡시드화, 전사 및 복제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 구제 조성물의 형질감염을 이러한 벡터의 동시발현과 재조합 바이러스의 생산을 허용하기에 충분한 조건하에 실행하고; (b) 형질감염된 구제 조성물을 재조합 바이러스의 회수를 증가시키기에 충분한 조건하에서 효과적인 열 쇼크 온도로 가열하며; 임의로, (c) 생성된 재조합 바이러스를 수확하는 단계를 포함하는, 모노네가비랄레스 목으로부터 재조합 바이러스의 생산방법을 제공한다.
부가적인 방법은 a) 적어도 하나의 숙주 세포에서, (ⅰ) 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터와 (ⅱ) 캡시드화, 전사 및 복제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 구제 조성물의 형질감염을 벡터의 동시발현과 재조합 바이러스의 생산을 허용하기에 충분한 조건하에 실행하고; b) 형질감염된 구제 조성물을 Vero 세포의 적어도 한 층으로 전달하며; 임의로, 재조합 바이러스를 수확하는 단계를 포함하는, 재조합 모노네가비랄레스 바이러스의 생산에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일면은 상기 방법의 중복되지 않는 단계를 바람직한 양태와 조합하여 더욱 개선된 방법을 형성하는 방법에 관한 것이다.
대안의 양태에서, 본 발명은 약독화, 감염성 또는 두가지 모두인 모노네가비랄레스 목의 RNA 바이러스의 제조방법을 제공한다. 기타 양태는 본 발명의 방법으로 생산되는 바이러스와 이러한 바이러스를 함유하는 백신에 관한 것이다. 이러한 바이러스는 인간 또는 쥐 또는 소와 같은 비-인간일 수 있음을 주지한다.
본원에서 상세히 설명하는 앞서 지적한 양태와 기타 양태는 본 발명의 목적을 설명한다.
도 1은 변형된 구제 과정의 순서도를 나타낸다. 이 과정은 열 쇼크 단계와 형질감염시킨 세포를 Vero 세포의 단층으로 전달하는 단계의 사용을 포함한다.
도 2는 실시예 4의 미니레플리콘 유전자 발현에 끼치는 열 쇼크의 효과를 CAT 분석을 사용하여 보여주는 방사선 사진이다.
도 3은 실시예 5의 미니레플리콘 RNA 형질감염 실험의 CAT 분석결과를 보여주는 방사선 사진이다.
도 4a는 hsp70에 의한 미니레플리콘 유전자 발현의 자극에 관한 실시예 6의 실험에서, CMV 발현 벡터로부터 발현되는 에피토프 태그에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯이다.
도 4b는 293-3-46 세포를 hsp70 발현 벡터, 미니레플리콘 DNA 및 L 발현 플라스미드로 동시형질감염시킨 CAT 분석결과를 보여주는 방사선 사진이다.
도 5는 실시예 2에 설명된 열 쇼크의 효과를 시험하기 위해 실행되는 6개의 독립 구제 실험으로부터 플라크 카운트를 나타내는 표(표 1)이다. 열 쇼크 과정의 장점을 확실히 보여준다.
도 6은 실시예 10의 T7 유전자-1을 함유하는 플라스미드 pGK16.2의 도면이다.
앞서 간략하게 인지한 바와 같이, 본 발명은 재조합 RNA 바이러스의 신규 생산방법에 관한 것이다. 당분야에서 이러한 방법은 "구제" 또는 역 유전학적 방법으로 명명된다. 상이한 비단편화 네가티브-가닥 바이러스를 위한 구제방법의 예시는 다음 참조문헌에 기재되어 있다: Baron and Barrett, 1997; Collins 등, 1995; Garcin 등, 1995; He 등, 1997; Hoffman and Banerjee, 1997; Lawson 등, 1995; Radecke and Billeter, 1997; Radecke 등, 1995; Schneider 등, 1997; Schnell, Mebatsion and Conzelmann, 1994; Whelan 등, 1995. 구제에 대한 기타 공보물은 MV와 파라믹소비리내(Paramyxovirinae) 아과의 기타 바이러스에 대해서는 공개 국제 특허 출원 WO 97/06270 및 RSV 구제에 대해서는 공개 국제 특허 출원 WO 97/12032를 포함하고; 이들은 본원에 참조로 인용된다.
게놈 cDNA 플라스미드의 형질감염 후에, 게놈 RNA의 정확한 카피가 파지 T7 RNA 폴리머라제와 RNA를 절단하여 3' 말단을 형성하는 벡터-암호화 리보자임 서열 의 복합작용으로 생산된다. 이 RNA는 팩키징되고 동시형질감염된 발현 플라스미드에 의해 초기에 공급된 바이러스 단백질에 의해 복제된다. MV 구제 시스템의 경우에(Radecke 등, 1995), T7 RNA 폴리머라제와 MV 단백질 N(뉴클레오캡시드 단백질) 및 P(인단백질)를 발현하는 안정한 세포주가 제조된다. 따라서, MV 구제는 이러한 세포주를 적절하게 위치하는 T7 폴리머라제 프로모터를 함유하는 MV 게놈 cDNA 클론과 MV 폴리머라제 유전자(L)를 함유하는 발현 플라스미드로 동시형질감염시킴으로써 달성될 수 있다.
초기 몇몇 구제방법 중의 하나는 홍역 바이러스에 대해 기재되어 있다. 홍역 바이러스(MV)는 파라믹소비리대(Paramyxoviridae) 과에서 모빌리바이러스(Morbillivirus) 속의 멤버이고, 이 과의 모든 멤버와 마찬가지로, MV는 비단편화 네가티브-센스 RNA 게놈을 함유하는 엔벌로핑 바이러스이다(Lamb and Kolakofsky, 1996). 이 바이러스 과의 분자 유전학적 분석은 네이키드 게놈 RNA 또는 형질감염된 플라스미드로부터 세포내에서 생산되는 RNA가 감염성이 아니기 때문에(Boyer and Haenni, 1994) 최근까지 어려웠다. 이러한 기술상의 문제점은 재조합 네가티브-가닥 RNA 바이러스의 분리를 허용하는 우수한 cDNA 구제 기술의 개발로 극복되었다(Pattnaik 등, 1992; Radecke and Billeter, 1997; Schnell, Mebatsion and Conzelmann, 1994).
이러한 구제방법의 기본 단계의 간략한 개요와 그의 조성물은 추가로 하기에 설명되어 있다:
네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스 게놈의 전사와 복제는 리보핵단백질 코 어(뉴클레오캡시드)에 작용하는 다량체 단백질의 효소 활성을 통해 달성된다. 네이키드 게놈 RNA는 주형으로서 작용할 수 없다. 대신, 이러한 게놈 서열은 이들이 N 단백질에 의해 뉴클레오캡시드 구조로 완전히 캡시드화될 때만이 인식된다. 이 상황에서만이 게놈 및 안티게놈 말단 프로모터 서열을 인식하여 전사 또는 복제 경로가 개시된다.
모든 파라믹소바이러스는 이러한 폴리머라제 경로가 진행되기 위해서 세가지 바이러스 단백질 N, P 및 L을 요한다. RSV를 포함한 뉴모바이러스 또한 전사 경로가 효율적으로 진행되도록 하기 위해서는 전사 연장 인자인 M2를 요한다. 아마도 바이러스-암호화 NS1 및 NS2 단백질과 아마도 숙주세포 암호화 단백질을 포함한 기타 보조인자 또한 소정의 역할을 할 수 있다.
간략하게, 모든 모노네가비랄레스 구제방법은 다음과 같이 요약될 수 있다: 각각은 적당한 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 프로모터(예, T7 RNA 폴리머라제 프로모터)와 적당한 전사 벡터(예, 증식성 박테리아 플라스미드)에 삽입되는 자가-절단 리보자임 서열(예, 간염 델타 리보자임) 사이에 위치하는 목적하는 바이러스 게놈의 클로닝된 DNA 동등물을 요한다. 이 전사 벡터는 RNA 폴리머라제(예, T7 RNA 폴리머라제)가 정확한 또는 거의 정확한 5' 및 3' 말단을 갖는 바이러스 안티게놈(또는 게놈)의 일본쇄 RNA 카피를 충실하게 전사할 수 있는 쉽게 조작할 수 있는 DNA 주형을 제공한다. 바이러스 게놈 DNA 카피와 플랭킹 프로모터 및 리보자임 서열의 배향이 안티게놈 또는 게놈 RNA 동등물의 전사 여부를 결정한다. 새로운 바이러스 자손의 구제를 위해 네이키드 일본쇄 바이러스 안티게놈 또는 게놈 RNA 전사체를 기능성 뉴클레오캡시드 주형으로 캡시드화하기 위해 필요한 바이러스-특이적 트랜스-작용 단백질(바이러스 뉴클레오캡시드(N 또는 NP) 단백질, 폴리머라제-결합 인단백질(P) 및 폴리머라제(L) 단백질) 또한 필요로 한다. 이러한 단백질은 전사와 복제를 달성하기 위해 이러한 뉴클레오캡시드 주형을 사용해야만 하는 활성 바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 포함한다. 구제를 위해 선택되는 특정의 바이러스는 전사 연장 인자와 같은 기타 단백질을 요할 수 있다.
따라서, 각 방법에서 당사자는 구제 조성물을 사용할 것이다. 이러한 조성물은 당분야에 익히 공지되어 있다. 하기 설명은 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 구제 조성물을 제한하지 않는다. 구제 조성물은 (ⅰ) 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터와 (ⅱ) 캡시드화, 전사 및 복제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 이러한 벡터의 동시발현과 재조합 바이러스의 생산을 허용하는 충분한 조건하 숙주 세포에 포함한다.
분리된 핵산 분자는 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 적어도 하나의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 서열을 포함한다. International Committee on the Taxonomy of Viruses에 의해 1993년에 수정된 재분류법에 따라, 모노네가비랄레스로 명명되는 목이 확립되었다. 이 목은 음의 극성(네가티브-센스)을 지닌 일본쇄 비단편화 RNA 게놈으로 엔벌로핑된 바이러스의 3과를 함유한다. 이러한 과는 파라믹소비리대, 랩도비리대(Rhabdoviridae) 및 필로비리대(Filoviridae)이다. 파라믹소비리대 과는 두 아과인 파라믹소비리내와 뉴모비리내(Pneumovirinae)로 더 세분된다. 파라믹소비리내 아과는 세 속인 레스피로바이러스(Respirovirus, 구 파라믹소바이러스(Paramyxovirus)), 루불라바이러스(Rubulavirus) 및 모빌리바이러스를 함유한다. 뉴모비리내 아과는 뉴모바이러스(Pneumovirus) 속을 포함한다.
신 분류법은 형태학적 기준, 바이러스 게놈의 조직, 생물학적 활성 및 유전자와 유전자 산물의 서열 연관성을 기준으로 한다. 파라믹소비리내 아과의 엔벌로핑 바이러스 중에서 형태학적으로 구별되는 특징은 좌선형 나선 대칭을 가지는 뉴클레오캡시드(직경 18 mm, 길이 1 ㎛, 피치 5.5 nm)의 크기와 모양이다. 생물학적 기준은: 1) 속 멤버들 사이에 항원 교차-반응성과 2) 레스피로바이러스, 루불라바이러스 속의 뉴라민분해효소 활성의 존재 및 모빌리바이러스 속의 이의 부재이다. 또한, 루불라바이러스의 잉여 유전자(SH)의 존재와 같은 P 유전자의 암호화 능력에서의 다양성이 고려된다.
뉴모바이러스는 이들이 좁은 뉴클레오캡시드를 함유하기 때문에 형태학상으로 파라믹소비리내와 구별될 수 있다. 또한, 뉴모바이러스는 단백질-암호화 시스트론의 수(뉴모바이러스에서 10개 대 파라믹소비리내에서 6개)와 파라믹소비리내의 단백질과는 매우 상이한 부착 단백질(G)이 주로 상이하다. 파라믹소바이러스와 뉴모바이러스가 기능면에서 동등한 것 같은 6종의 단백질(N, P, M, G/H/HN, F 및 L)을 가지지만, 후자의 두 단백질만이 두 아과 사이에 상당한 서열 연관성을 보인 다. 다수의 뉴모바이러스 단백질은 대부분의 파라믹소바이러스에서 대응물인 비구조적 단백질 NS1과 NS2, 작은 소수성 단백질 SH 및 두번째 단백질 M2가 부족하다. 일부 파라믹소바이러스 단백질, 즉 C와 V는 뉴모바이러스에서 대응물이 부족하다. 그러나, 뉴모바이러스와 파리믹소바이러스의 기본 게놈 조직은 동일하다. 랩도바이러스와 필로바이러스도 이와 같다. 표 1은 이러한 바이러스의 현 분류학적 분류를 각 속의 예와 함께 나타낸다.
표 1
모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 분류
파라믹소비리대 과
파라믹소비리내 아과
레스피로바이러스 속(구 파라믹소바이러스)
센다이 바이러스(Sendai virus, 마우스 파라인플루엔자 바이러스 1형)
인간 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 1 및 3형
소 파라인플루엔자 바이러스(BPV) 3형
루불라바이러스 속
시미안 바이러스 5(Simian virus 5(SV5), 개 파라인플루엔자 바이러스 2형)
귀밑샘염 바이러스
뉴캐슬병 바이러스(NDV, 조류 파라믹소바이러스 1)
인간 파라인플루엔자 바이러스(PIV-2, 4a 및 4b형)
모빌리바이러스 속
홍역 바이러스(MV)
돌고래 모빌리바이러스
개 디스템퍼 바이러스(CDV)
페스트-데스-페티츠-루미난츠 바이러스(Peste-des-petits-ruminants virus)
포신 디스템퍼 바이러스(Phocine distemper virus)
우역 바이러스
뉴모비리내 아과
뉴모바이러스 속
인간 호흡기 합포체 바이러스(RSV)
소 호흡기 합포체 바이러스
마우스의 폐렴 바이러스
칠면조 리노트라체티스 바이러스(rhinotracheitis virus)
랩도비리대 과
리사바이러스(Lyssavirus) 속
광견병 바이러스
베시큘로바이러스(Vesiculovirus) 속
수포성구내염 바이러스(VSV)
에피머로바이러스(Ephemerovirus) 속
소 일과열 바이러스
필로비리대 과
필로바이러스 속
마르부르그 바이러스(Marburg virus)
전술한 바와 같이, 분리된 핵산 분자는 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 적어도 하나의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 서열을 포함한다. 분리된 핵산 분자는 이의 게놈, 안티게놈 또는 변형된 버전을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 기능적으로 결합된 프로모터, 목적하는 게놈 또는 안티게놈 및 전사 종결자를 암호화한다.
본 발명의 바람직한 양태에서 폴리뉴클레오타이드는 야생형 RNA 바이러스로부터 뉴클레오타이드 삽입, 재배열, 결실 또는 치환에 의해 변형된 게놈 또는 안티게놈을 암호화한다. 구제로 복제 바이러스를 수득하는 능력은 네이티브 게놈과 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 상당히 변형되기 때문에 감소할 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 예에서, 본 발명은 이들 방법이 재조합 바이러스 구제의 가능성을 실질적으로 증가시킬 수 있기 때문에 특히 가치있다. 게놈 또는 안티게놈 서열은 인간 또는 비-인간 바이러스의 서열로부터 유도될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 2 이상의 기원으로부터의 게놈 또는 안티게놈을 재조합으로 결합시킴으로써 형성되는 키메릭 게놈을 암호화할 수 있다. 예를 들면, RSV의 A 그룹으로부터 1 이상의 유전자를 RSV의 B 그룹의 상응하는 유전자 대신 삽입하거나; 소 PIV(BPIV), PIV-1 또는 PIV-2로부터 1 이상의 유전자를 PIV-3의 상응하는 유전자 대신 삽입하거나; RSV가 PIV 등의 유전자를 대신할 수 있다. 추가 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 인간, 소 또는 쥐 바이러스인 모노네가비랄레스 목의 RNA 바이러스에 대한 게놈 또는 안티게놈을 암호화한다. 본 발명의 방법에 의해 형성되는 재조합 바이러스는 진단학 연구에서의 도구로 또는 치료용 또는 예방용 백신으로 사용될 수 있기 때문에, 폴리뉴클레오타이드는 또한 선택된 RNA 바이러스의 야생형 또는 약독화형을 암호화할 수 있다. 다수의 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA 바이러스의 약독화 감염형을 암호화한다. 특히 바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 3' 게놈 프로모터 영역에 적어도 하나의 약독화 돌연변이와 RNA 폴리머라제 유전자에 적어도 하나의 약독화 돌연변이가 일어난 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하고, 이는 본원에 참조로 인용되는 공개 국제 특허 출원 WO98/13501에 설명되어 있다.
재조합 바이러스의 생산에 대한 여러 필요성은 다양할 수 있다. 따라서, 당사자는 특정의 과: 파라믹소비리대 과, 랩도비리대 과 또는 필로비리대 과로부터 1 이상의 바이러스를 선택할 수 있다.
전술한 바와 같이 폴리뉴클레오타이드 서열이 목적하는 게놈 및 안티게놈의 변형된 형태를 암호화하는 것 외에도, 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 1 이상의 이종 유전자와 함께 목적하는 게놈 또는 안티게놈을 암호화할 수 있다. 이종 유전자는 필요에 따라 다양할 수 있다. 목적하는 재조합 바이러스의 적용에 따라, 이종 유전자는 보조인자, 사이토킨(예, 인터류킨), T-헬퍼 에피토프, 제한 마커, 보조제 또는 상이한 미생물 병원체(예, 바이러스, 박테리아 또는 진균류)의 단백질, 특히 보호 면역반응을 도출할 수 있는 단백질을 암호화할 수 있다. 이종 유전자는 또한 유전자 치료를 위해 사용되는 제제를 제공하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 이종 유전자는 재조합 바이러스의 예방적 또는 치료적 특징을 개선하기 위해 선택되는 인터류킨-12와 같은 사이토킨을 암호화한다.
개선된 백신과 바이러스 병원체 처리에 있어서 향상된 융통성에 대한 현재의 몇몇 필요성 측면에서, 분리된 핵산 분자는 CDV, VSV, MV, RSV, PIV, 귀밑샘염 바이러스 및 광견병 바이러스로 이루어진 그룹에서 선택되는 RNA 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. RNA 바이러스의 이 세트 중에서 더 바람직한 것은 MV, RSV, PIV 및 BPV로 이루어진 그룹이다.
약독화 바이러스를 사용하는 양태를 위한, 이러한 바이러스의 여러 유형이 변형된 바이러스를 생성하기 위해 약독화 돌연변이를 일으키는 기본적인 방법과 함께, 당분야에 익히 공지되어 있다. 화학적 돌연변이 원인을 첨가한 세포 배양액에서 바이러스가 성장하는 동안 화학적 돌연변이 유발, 이어서 최적 이하의 온도에서 계대시켜 온도 감수성 및/또는 저온 적응 돌연변이를 선택하는 바이러스의 선택, 세포 배양액에서 작은 플라크를 생성하는 돌연변이체 바이러스의 동정 및 숙주 범위 돌연변이로 선택한 이종 숙주를 통한 계대와 같은 통상의 수단이 사용된다. 약독화 돌연변이를 일으키는 대안의 수단은 특정부위의 돌연변이 유발을 이용하여 예정된 돌연변이를 일으키는 단계를 포함한다. 1 이상의 돌연변이가 일어날 수 있다. 이어서 이러한 바이러스는 동물 모델에서 이들의 생물학적 활성의 약독화를 위 해 스크리닝된다. 약독화 바이러스를 뉴클레오타이드 서열분석하여 약독화 돌연변이의 부위를 정한다.
구제를 실행하기 위해 필요한 다양한 트랜스-작용 단백질이 또한 당분야에 익히 공지되어 있다. 홍역 바이러스 구제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질은 캡시드화 단백질 N과 폴리머라제 복합 단백질 P 및 L이다. PIV-3의 경우, 캡시드화 단백질은 NP로 명명되고, 폴리머라제 복합 단백질은 또한 P와 L로서 언급된다. RSV의 경우, 바이러스-특이적 트랜스-작용 단백질은 N, P 및 L과 추가의 단백질인 M2, RSV-암호화 전사 연장 인자를 포함한다.
필요한 트랜스-작용 단백질의 일부 또는 전부가 안정한 형질변환체로서 이러한 바이러스-특이적 유전자와 유전자 산물을 함유하고 발현하도록 공학처리된 선택된 숙주 세포내에서 생산될 수 있지만, 바이러스 트랜스-작용 단백질은 필요한 단백질을 암호화하는 1 이상의 발현 벡터(예: 플라스미드)로부터 생성될 수 있다.
발현 벡터와 캡시드화, 전사 및 복제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자의 선택은 목적하는 바이러스의 선택에 따라 다양할 수 있다. 발현 벡터는 숙주 세포에서 전사 벡터(들)로의 이들의 동시발현과 선택된 조건하에서 재조합 바이러스의 생산을 허용하도록 제조된다.
구제를 위한 통상의(반드시 제한적이지는 않다) 환경은 T7 폴리머라제가 존재하여 바이러스 게놈 cDNA-함유 전사 벡터로부터 안티게놈(또는 게놈) 일본쇄 RNA의 전사를 유도하는 적당한 포유류 세포 환경을 포함한다. 동시전사적으로 또는 그 직후에, 이 바이러스 안티게놈(또는 게놈) RNA 전사체는 뉴클레오캡시드 단백질에 의해 기능성 주형으로 캡시드화되고 필요한 바이러스-특이적 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 동시형질감염된 발현 플라스미드로부터 동시에 생산되는 필요한 폴리머라제 성분에 의해 사용된다. 이러한 사건과 과정은 바이러스 mRNA의 필수 전사, 복제 및 새로운 게놈의 증폭으로 결국, 새로운 바이러스 자손의 생산, 즉 구제를 유도한다.
광견병, VSV, SV5 및 센다이의 구제를 위해, T7 폴리머라제가 재조합 백시니아 바이러스 VTF7-3에 의해 제공된다. 그러나, 이 시스템은 구제된 바이러스가 백시니아 바이러스로부터 물리적 또는 생화학적 수단에 의해 또는 폭스바이러스를 위한 양호한 숙주가 아닌 세포 또는 조직에서의 반복 계대에 의해 분리될 것을 요한다. MV cDNA 구제를 위해, 이 필요사항은 T7 폴리머라제와 바이러스 N 및 P 단백질을 발현하는 세포주를 형성함으로써 회피된다. 구제는 게놈 발현 벡터와 L 유전자 발현 백터를 헬퍼 세포주로 형질감염시킴으로써 달성된다. 바람직하게는, 헬퍼 세포주는 포유류 세포에서 자손 바이러스를 거의 또는 전혀 생산하지 않고 목적하는 RNA 바이러스(들)를 구제하기 위해 이용될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 T7 폴리머라제, 예를 들면 MVA/T7(하기에 설명)의 기원으로서 사용될 수 있다. 필요한 캡시드화 단백질의 동시 발현 후에, 합성된 완전한 길이의 안티게놈 바이러스 RNA가 바이러스 폴리머라제 단백질에 의해 캡시드화, 복제, 전사되고 복제된 게놈은 감염성 비리온으로 팩키징된다. 이러한 안티게놈 외에, 게놈 유사체도 현재 센다이 및 PIV-3에 대해 성공적으로 구제되었다(Kato 등, 및 공개 국제 특허 출원 WO98/53708).
전술한 바와 같이, MVA/T7(백신 바이러스의 약독화 돌연변이체)은 RNA 바이러스 구제의 구제에 사용될 수 있는 변형된 헬퍼 바이러스의 예이다. 일반적으로, 변형된 헬퍼 바이러스는 야생형 바이러스로부터 변형되어 비허용 세포주에서 감소되거나 전혀 바이러스 활성을 보이지 않는 바이러스이다. MVA의 특징은 변형된 헬퍼 바이러스에서 바람직한 특징을 확립한다. 백시니아 바이러스의 MVA 계통은 더 많은 세포변성 계통에 매혹적인 대안을 제공한다. MVA는 터키와 독일에서 병아리 태 섬유아세포에서 세포변성 백시니아 Ankara 바이러스의 연속 계대(>570)에 의한 천연두 근절 프로그램 중에 개발되었다. 이는 Biosafety Level-1 병원체로 격하되었고, 비백신접종 실험실 작업자에 의해 사용될 수 있다. MVA는 6개의 주요 결실(게놈의 >15%)이 일어나 30,000개 이상의 염기쌍 손실을 초래한다(Antoine 등, 1998). MVA는 한정된 수의 세포주에서 복제하고(Carroll and Moss, 1997; Drexler 등, 1998), 비허용 세포에서 바이러스 형태발생 후기에 블로킹된다(Sutter and Moss, 1992). 또한, MVA는 야생형 계통에서 관찰되는 심각한 세포변성 효과(CPE)를 유도하지 않는다. 다른 숙주-제한 폭스바이러스(예: NYVAC, ALVAC 및 계두)에 비해 MVA의 주요 장점은 바이러스 DNA 복제와 이에 따른 거의 모든 유전자 클래스의 전사(초기, 중기 및 후기)가 손상되지 않는 것이다. 외래 유전자는 모든 클래스의 프로모터 하에서 효율적으로 발현될 수 있다. 박테리오파지 T7 유전자-1을 발현하는 두 재조합 MVA가 보고되었다. MVA-T7 하이브리드 바이러스는 7.5K의 약한 초기/후기 프로모터(Sutter 등, 1995) 또는 11K의 강력 후기 프로모터(Wyatt 등, 1995)의 제한 하에 T7 유전자-1의 1개의 통합 카피를 함유한다. 둘 모두 일시 발현 시스템 에서 헬퍼 바이러스로 사용되어 네가티브-가닥 RNA 바이러스를 유전적으로 구제한다(Collins 등, 1995; Leyrer 등, 1998; Schneider 등, 1997; Barron, M. D. and Barrett, T. Rescue of rinderpest virus from a cloned cDNA. Journal of Virology. 71(2): 1265-71, 1997 Feb.; Durbin, A. P., Hall, S. L., Siew, J. W., Whitehead, S. S., Collins, P. L., and Murphy, B. R. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235(2): 323-332, 1997.; He 등, 1997).
MVA-T7처럼 약독화 헬퍼 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스를 사용하는 장점에도 불구하고, MVA-T7 또는 기타 헬퍼 바이러스의 동시 복제 사이클은 이종 재조합 바이러스의 구제를 위해 필요한 유전적 사건을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서, 헬퍼 바이러스가 사용되면 DNA 합성 저해제 또한 사용된다. 이 양태는 구제 시스템을 개선한다. DNA 합성 저해제는 또한 헬퍼 바이러스의 DNA 합성을 저해(또는 실질적으로 저해)하면서 일어나는 구제를 허용한다. AraC(사이토신 베타-D-아라비노퓨라노사이드) 및 하이드록시우레아와 같은 예시적인 DNA 합성 저해제는 바이러스 생존 사이클의 중대한 시점에서 헬퍼 바이러스의 복제 사이클을 차단한다. 중기 및 후기 바이러스 유전자 전사는 발생기 바이러스 게놈에서만 개시되기 때문에, 이러한 두 유전자 클래스는 AraC 또는 하이드록시우레아에 의한 차단으로 잠복한다. AraC는 DNA로의 도입에 의해 복제를 차단하고, 반면 하이드록시우레아는 데옥시리보뉴클레오타이드의 세포 풀을 환원시키는 리보뉴클레오타이드 환원효소를 억제한다. 이용가능한 여러 기타 DNA 합성 저해제가 있다. 기타 DNA 합성 저해제는 세포 DNA 합성을 차단하는 것으로 공지되어 있지만 이들을 MVA 복제를 차단하는 데 사용은 권장되지 않는다. 이들은: DNA 폴리머라제 저해제(예: Aphidicolin), 토포이소머라제 저해제(예: 캠프토테신은 토포이소머라제 Ⅰ형을 차단하고; Novobiocin 및 Nalidixic acid는 토포이소머라제 Ⅱ형을 차단한다) 및 DNA Gyrase 저해제(예: Heliquinomycin)를 포함한다. 세포 DNA 합성을 차단하는 DNA 합성 저해제는 세포 효소에 매우 의존하여 복제 기능을 수행하는 헬퍼 바이러스에 더욱 효과적일 것이다.
유전적 구제 사건 중에 DNA 합성 저해제를 사용하는 확실한 장점은 변형된 헬퍼 바이러스에 의한 구제된 RNA 바이러스의 오염이 거의 또는 전혀 없을 거라는 것이다. MVA에서, 비허용 세포에서의 복제 사이클은 형태발생의 매우 후기에서 정지되어 비감염성 바이러스 입자가 초래된다. 반-허용 세포의 감염은 유전적 구제 실험에서 금기시되는 제한된 바이러스 성장을 초래한다. AraC 또는 하이드록시우레아에 의한 차단 하에서, 후기 단백질 합성의 동시 억제는 바이러스 입자의 완전한 부재를 초래한다. 구제된 바이러스는 헬퍼 바이러스의 성장을 허용하는 세포주에서 직접적으로 증폭된다. 형질감염을 위해 사용되는 DNA 합성 저해제의 양은 헬퍼 바이러스의 성장을 분석하는 시험으로 쉽게 결정된다.
바이러스 cDNA의 재조합 RNA 바이러스로의 전환을 위해 필요한 분자적 사건은 일반적으로 T7 폴리머라제에 의한 전사와 3 이상의 바이러스 트랜스-작용 인자(MV의 경우에 N, P 및 L)에 의한 네가티브- 또는 포지티브-가닥 완전한 길이 게놈의 복제를 포함하는 것으로 이해된다. 동시에 일어나는 MVA 복제는 구제 사건 중에 아마도 어느 정도까지는 이와 타협하면서 세포내 및 세포외 자원의 고갈을 초래한다. 중기 및 후기 유전자의 발현을 차단하면 이러한 자원의 보존을 초래하고, 아마도 이는 저해제의 존재하에 유전적 구제가 향상되는 한 이유일 것이다.
바이러스 감염에 의해 유도되는 세포변성 효과(CPE)는 야생형 바이러스-감염 세포와 비교하여 MVA-감염 세포에서 현저하게 감소한다. 이는 DNA 합성 저해제로 처리된 MVA-감염 세포에서 더욱 감소한다. 감염된 세포의 수명 연장은 더 다양한 외래 유전자의 발현을 허용한다. 이는 개선된 유전적 구제의 또다른 장점 요소일 수 있다.
T7 발현을 유도하기 위한 다른 프로모터(강력한 초기, 초기/중기, 중기 또는 초기/후기)의 사용은 바람직하게는 DNA 복제 저해제의 존재하에 유전적 구제를 향상시킬 수 있다. 백시니아 바이러스의 프로모터는 본 발명의 방법에 적당하다.
이어서 숙주 세포를 전술한 적어도 두개의 발현 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨다. 숙주 세포를 이러한 벡터의 동시발현을 허용하는 조건하에서 배양하여 감염성 약독화 바이러스를 생산한다.
이어서 구제된 감염성 바이러스를 먼저 시험관내 수단에 의해 이의 목적하는 표현형(온도 감수성, 저온 적응성, 플라크 형태학 및 전사와 복제 약독화)에 대해 시험한다. 시스-작용 3' 게놈 프로모터 영역에서의 돌연변이를 또한 필요한 트랜스-작용 캡시드화 및 폴리머라제 활성이 야생형 또는 백신 헬퍼 바이러스에 의해 또는 유전자-특이적 약독화 돌연변이를 지니는 N, P 및 상이한 L 유전자를 발현하는 플라스미드에 의해 제공되는 미니레플리콘 시스템을 사용하여 시험한다(Radecke 등 (1995) 및 Sidhu 등 (1995)).
구제된 바이러스의 약독화 표현형이 존재하면, 감염 실험을 적당한 동물 모델로 실행한다. 비-인간 영장류는 인간 질병의 발병에 대한 바람직한 동물 모델을 제공한다. 이러한 영장류를 우선 약독화된 재조합 생성 바이러스로 면역시킨 다음, 바이러스의 야생형으로 감염시킨다.
본 발명의 구제 방법에 사용될 수 있는 숙주 세포는 목적하는 재조합 바이러스의 생산을 위해 필요한 필수요소인 벡터로부터 발현을 허용하는 것들이다. 이러한 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포 및 바람직하게는 척추동물 세포로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 태아 신장 세포와 같은 인간 세포로부터 유도된다. Radecke 등(1995)은 293-3-46으로 명명되는 태아 신장 세포주로부터 유도된 숙주 세포의 사용을 기재하고 있다. Vero 세포와 여러 기타 유형의 세포 또한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 다음은 적당한 숙주 세포의 예이다: (1) Human Diploid Primary Cell Lines: 예를 들면, WI-38 및 MRC5 세포; (2) Monkey Diploid Cell Line: 예를 들면, FRhL- Fetal Rhesus Lung 세포; (3) Quasi-Primary Continues Cell Line: 예를 들면, AGMK- 아프리카 사바나원숭이 신장 세포; (4) Human 293 세포(적격화) 및 (5) 기타 잠재 세포주, 예를 들면, CHO, MDCK(Madin-Darby Canine Kidney), 주로 병아리 태 섬유아세포. 대안의 바람직한 양태에서, 형질감염 촉진제가 첨가되어 세포에 의한 DNA 흡수를 증가시킨다. 여러 이러한 시약이 당분야에 공지되어 있다. LIPOFECTACE(Life Technologies, Gaithersburg, MD)와 EFFECTENE(Qiagen, Valencia, CA)는 통상의 예이다. Lipofectace와 Effectene는 모 두 양이온 지질이다. 이들은 모두 DNA를 코팅하고 세포에 의한 DNA 흡수를 향상시킨다. Lipofectace는 DNA를 둘러싸는 리포솜을 형성하고 반면 Effectene는 DNA를 코팅하지만 리포솜을 형성하지는 않는다.
본 발명에 사용되는 여러 RNA 바이러스가 인간 병원체이기 때문에, 바람직하게는 영장류 세포가 이러한 예에서 사용된다. 비-인간 포유류를 감염시키는 개 디스템퍼 바이러스 및 기타 홍역바이러스와 같은 예외도 있다. 모든 이러한 바이러스는 진핵세포만을 감염시킨다. 홍역 바이러스는 주로 영장류 세포형에 한정된다. 어떤 진핵 세포주는 바이러스를 증식시키는 데 다른 것들보다 잘 작용하고 어떤 세포주는 일부 바이러스에 대해 전혀 작용하지 않는다. 생존가능한 바이러스의 구제를 쉽게 검출할 수 있도록 검출 가능한 세포변성 효과를 양산하는 세포주가 사용된다. 홍역과 잠재적으로 기타 바이러스의 경우에, 형질감염된 세포는 바이러스가 Vero 세포에서 신속하게 퍼져 쉽게 검출가능한 플라크를 형성하기 때문에 Vero 세포상에서 성장한다. 이는 본 발명의 또 다른 중요한 특징이다. 일반적으로, 선택된 바이러스의 성장을 허용하는 숙주 세포가 사용된다. 일부 예에서, 숙주 세포는 "상보 세포형"이다. 홍역 바이러스의 경우에, 293-3-46 세포(Radecke 등, 1995)가 이들이 홍역 바이러스의 N 및 P 유전자와 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 발현하기 때문에 사용된다. 기타 시스템은 이러한 제한을 하지 않는데 이는 모든 필요한 바이러스 단백질이 발현 플라스미드와 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 백시니아 바이러스에 의해 제공되기 때문이다.
전사 벡터와 발현 벡터는 숙주 세포에서 발현을 목적으로 하는 플라스미드 벡터일 수 있다. 캡시드화, 전사 및 복제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터는 동일한 발현 벡터 또는 적어도 두개의 상이한 벡터로부터 이러한 단백질을 발현할 수 있다. 이러한 벡터는 일반적으로 기본 구제 방법으로부터 공지되어 있고, 이들은 본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위해 변형될 필요 없다.
본 발명의 일 개선된 방법에서, 효과적인 열 쇼크 온도가 사용된다. 효과적인 열 쇼크 온도는 재조합 바이러스의 구제를 실행하기 위해 제안된 표준 온도 이상의 온도이다. 다수의 예에서, 효과적인 열 쇼크 온도는 37℃ 이상이다. 구제 방법이 효과적인 열 쇼크 온도에서 실행되면, 구제 방법은 구제가 온도가 상승하지 않고 실행될 때의 재조합 바이러스의 회수 수준 이상으로 목적하는 재조합 바이러스의 회수를 증가시킨다. 효과적인 열 쇼크 온도와 노출시간은 사용되는 구제 시스템에 따라 다양할 수 있다. 이러한 온도와 시간 변수는 선택된 바이러스 게놈 또는 숙주 세포형의 차이로부터 유도될 수 있다. 온도가 다양할 수 있지만, 효과적인 열쇼크 온도는 특정의 재조합 바이러스로 다수의 시험 구제 과정을 실행하고 온도와 노출시간이 변하는 것에 따라 목적하는 재조합 바이러스의 회수 속도%를 정함으로써 쉽게 확인할 수 있다. 확실히, 구제를 실행하기 위한 온도 범위의 상한은 형질감염의 성분이 파괴되거나 형질감염 작용에서 이들의 능력이 손실되거나 감소하는 온도이다.
온도 범위의 예시 목록은 하기에 보여진다:
38℃ 내지 약 50℃, 39℃ 내지 약 49℃, 39℃ 내지 약 48℃, 약 40℃ 내지 약 47℃, 약 41℃ 내지 약 47℃, 약 41℃ 내지 약 46℃, 약 42℃ 내지 약 46℃가 더 바람직하다. 이와 달리, 43℃, 44℃, 45℃ 및 46℃의 열 쇼크 온도가 특히 바람직함이 주지된다.
하기에 구애됨이 없이, 구제 중에 승온의 열 쇼크 온도 사용이 열 쇼크 단백질(hsp로 언급)과 관련된 세포 반응과 합성을 촉발함이 이론화된다. 열 쇼크가 세포 스트레스 반응과 열 쇼크 단백질(hsp)(Craig, 1985; Gunther and Walter, 1994; Lindquist, 1986)로 불리는 다기능 단백질 그룹의 합성을 유도함이 감지된다. 전부는 아니지만 다수의 hsp가 고 유도성 유전자에 의해 암호화되고 이러한 단백질은 상승한 수준으로 합성되어 스트레스로부터 세포 회복을 돕는다. 유도성 hsp는 또한 세포에 기저 수준으로 존재하며, 이는 이들 단백질이 정상 세포 기능에 작용하는 다양한 역할의 징표이다. 일부 hsp는 또한 샤프롱이라고 불리는데 이는 이들이 적당한 단백질 폴딩을 보조하는 데 중요한 역할을 하기 때문이다(Gething, 1996; Martin and Hartl, 1997). hsp가 기여하는 기타 기능은 세포에서의 단백질 트래픽킹, 효소 및 단백질 기능의 조정, DNA 복제에의 참여 및 바이러스 복제 및 발병에의 관여에서의 역할을 포함한다(Franke, Yaun and Luban, 1994; Friedman 등, 1984; Gething, 1996; Glick, 1995; Hu, Toft and Seeger, 1997; Lund, 1995; Martin and Hartl, 1997; Pratt, 1992; Santoro, 1996).
포유류 열 쇼크 단백질 70(hsp 70) 계통은 크기가 대략 70 kD인 단백질의 관련 그룹이다. hsp 70의 주로 유도될 수 있는 형태(hsp 72)는 분명히 72 kD 분자량을 가진다. 73 kD hsp 70 단백질(hsp73)은 세포에서 구조적으로 발현되고 열 쇼크 동종 단백질(hsc73, (Gunther and Walter, 1994))이라고 명명되었다. 이러한 단백질은 전술한 몇몇 기능에 참여하고 열 쇼크에 반응하여 네이티브(비-구제) CDV 유전자 발현을 증가시키는 숙주 세포 인자의 하나로 포함되어 왔다. Hsp72 아이소폼은 증가한 바이러스 전사 활성을 가지는 CDV 뉴클레오캡시드의 일부로 동시정제된다(Oglesbee 등, 1996).
본원에 설명된 것처럼 당사자의 예시 결과로, CDV 유전자 발현과 본원에 설명된 방법에 따라 구제될 수 있는 기타 바이러스에 대한 유전자 발현에 끼치는 열 쇼크 온도의 효과가 적어도 부분적으로는 Hsp70의 유도에 기인하는 것이라고 추론할 수 있다. 따라서, 본 발명의 대안의 양태는 특히 Hsp70과 Hsp72와 같은 hsp의 유도를 실행할 수 있는 효과적인 열 쇼크 온도의 사용에 관한 것이다.
선택된 열 쇼크 온도를 확인하기 위한 시험의 실행에서, 당사자는 또한 열 쇼크 과정을 실행하기 위한 목적하는 시간을 선택할 수 있다. 효과적인 열 쇼크 온도를 적용하는 충분한 시간은 구제를 실행하기 위해 제안된 표준 온도 이상으로 온도가 증가하지 않고 구제를 실행할 때 재조합 바이러스의 회수 수준 이상으로 목적하는 재조합 바이러스의 회수가 증가하는 시간이다. 적당한 시간은 구제 시스템에 따라 다양할 수 있다. 이러한 시간 변수는 또한 선택된 바이러스 게놈 또는 숙주 세포형의 차이점으로부터 유도될 수 있다. 시간이 다양할 수 있지만, 효과적인 열쇼크 온도를 적용하기 위한 시간은 특정의 재조합 바이러스로 여러 시험 구제 과정을 실행하고 온도와 시간이 변하는 것에 따라 목적하는 재조합 바이러스의 회수 속도%를 결정함으로써 쉽게 확인될 수 있다. 확실히, 구제를 실행하는 데 사용되는 시간 변수의 상한은 형질감염의 성분이 파괴되거나 형질감염에서 작용하는 이들의 능력이 결실되거나 감소하는 시간이다. 열 쇼크 과정을 위한 시간은 수분 내지 수시간으로 다양할 수 있고, 재조합 바이러스 회수의 목적하는 만큼의 증가가 일어난다.
형질감염된 세포의 효과적인 열 쇼크 온도로의 노출 시간이 각 구제 시스템에 따라 다양할 수 있지만, 노출시간 범위의 예시 목록(분)은 하기에 나타나 있다:
약 5 내지 약 300, 약 15 내지 약 300, 15 내지 약 240, 약 20 내지 약 200, 약 20 내지 약 150, 약 30 내지 약 150이 가장 바람직한 범위이다.
여러 수단이 목적하는 재조합 바이러스의 향상된 회수 수준을 측정하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 예로 언급한 것처럼, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 리포터 유전자가 재조합 바이러스의 구제를 모니터하는 데 사용될 수 있다. 리포터 유전자의 해당하는 활성은 기준과 재조합 바이러스 발현의 향상 수준을 정한다. 다른 방법은 수득된 재조합 바이러스의 플라크 수의 검출과 서열분석에 의한 구제된 바이러스 생산의 확인을 포함한다. 향상된 회수는 적어도 약 25% 또는 적어도 약 40%의 증가를 보여야 한다. 바람직하게는, 회수된 재조합 바이러스의 증가는 약 2배이다. 재조합 바이러스 양의 약 5배 내지 10배 증가가 관찰되었다.
목적하는 재조합 바이러스의 향상된 회수 수준을 측정하기 위해 설명된 방법은 동일하게 형질감염시킨 여러 세포 배양액을 제조하고 이들을 상이한 조건의 열쇼크(시간과 온도 변수)에 노출시킨 다음, 형질감염시켜 37℃의 일정 온도에서 유 지한 대조 세포와 비교하는 단계를 포함한다. 형질감염 72시간 후에, 형질감염시킨 세포를 약 75% 융합성 Vero 세포(또는 재조합 바이러스의 플라크 형성을 측정하기 위해 선택된 세포형)의 단층을 함유하는 10 cm 플레이트에 전달하고 플라크가 가시화될 때까지 배양을 계속한다. 이후에, 플라크를 카운트하고 대조 세포로부터 얻어진 수치와 비교한다. 최적 열 쇼크 조건은 플라크의 수를 최대로 해야한다.
본 발명의 다른 양태에서, 숙주 세포(들)에 존재하는 형질감염시킨 구제 조성물을 플라크 확장 단계 또는 증폭 단계에 가한다. 본 발명의 이러한 일면은 (a) 숙주 세포에서, (ⅰ) 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터와 (ⅱ) 캡시드화, 전사 및 복제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 구제 조성물의 형질감염을 벡터의 동시발현과 재조합 바이러스의 생산을 허용하기에 충분한 조건하에서 실행하고; (b) 형질감염된 구제 조성물을 플라크 확장 세포(PE 세포)의 적어도 한 층으로 전달한 다음; (c) 임의로, 재조합 바이러스를 수확하는 단계를 포함하는, 재조합 모노네가비랄레스 바이러스의 생산을 위한 개선된 구제 방법을 제공한다. 종종, 형질감염을 실행하는 데 사용되는 숙주 세포는 목적하는 재조합 바이러스의 성장에 권장되지 않는다. 형질감염된 세포로부터 재조합 바이러스의 회수는 네이티브 바이러스 또는 재조합 바이러스가 향상된 성장을 보이는 플라크 확장 세포를 선택함으로써 향상할 수 있다. 당분야에 공지된 다양한 플레이트 또는 용기 중 어느 것이라도 플라크 확장 단계를 위해 사용될 수 있다. 바 람직하게는, 구제 조성물을 함유하는 형질감염된 세포를 PE 세포의 단층으로 전달한다. 특히, PE 세포의 층은 적어도 약 50% 융합성이어야 한다. 이와 달리, PE 세포는 적어도 약 60% 융합성 또는 심지어 적어도 약 75% 융합성이다. 플라크 확장을 달성하기 위해, 형질감염된 세포를 PE 세포의 용기에 전달하여 PE 세포의 표면적이 형질감염된 바이러스를 제조하는 데 사용되는 표면적보다 크게 한다. 2:1 내지 100:1의 증가한 표면적비가 필요에 따라 사용될 수 있다. 적어도 10:1의 증가한 표면적이 바람직하다. 플라크 확장 세포는 네이티브 또는 재조합 바이러스의 이러한 세포에서의 성공적인 성장을 근거로 선택된다. Vero 세포는 본원에 설명된 예시 실험에서 잘 작용하고, 따라서 이들은 PE 세포로서 바람직하다.
또한, 개선된 구제 방법은 Vero 세포로의 플라크 확장 또는 열 쇼크 과정에 앞서 또는 이와 동시에 형질감염 배지를 교체함으로써 달성된다. 배지 교체는 플라크 확장 또는 열 쇼크 온도 전에 다양한 시점에서 일어날 수 있지만; 형질감염시킨 세포의 배양 약 4 내지 약 20시간 후 배지 교체를 출발점으로 따르고 이어서 필요에 따라 이후에 구제 방법의 시험 런의 실행으로부터 조절될 수 있다.
단편화 일본쇄 RNA 바이러스
본 발명의 중요한 일면 중 하나가 비단편화 네가티브 센스 일본쇄 RNA 바이러스의 회수에 이러한 개선된 방법의 적용이지만, 본 발명의 방법은 단편화 네가티브 센스 일본쇄 RNA 바이러스를 포함한 여러 유형의 RNA 바이러스의 구제를 향상시키는 데 유용할 수 있다. Internationl Committee on the Taxonomy of Viruses에 의해 1993년에 개정된 재분류법에 따르면, 바이러스의 후자 그룹은 오르토믹소비리 대(Orthomyxoviridae), 부니야비리대(Bunyaviridae) 및 아레나비리대(Arenaviridae)인 바이러스의 세 과에 속한다.
오르토믹소비리대 과
인플루엔자바이러스 A, B 속
척추동물, 인플루엔자 A 바이러스
인플루엔자바이러스 C 속
척추동물, 인플루엔자 C 바이러스
"비명명 토고토(Thogoto)-유사 바이러스"속
척추동물: 토고토 바이러스
부니야비리대 과
부니야바이러스(Bunyavirus) 속
척추동물: 부니얌베라(Bunyamwera) 바이러스
나이로바이러스(Nairovirus) 속
척추동물: 나이로비면양병(Nairobi sheep disease)
플레보바이러스(Phlebovirus) 속
척추동물: 모래파리 열 시실리안(sandfly fever Sicilian) 바이러스
한타바이러스(Hantavirus) 속
척추동물: 한탄(Hantaan) 바이러스
토스포바이러스(Tospovirus) 속
식물: 토마토황화괴저 바이러스
아레나비리대 과
아레나바이러스(Arenavirus) 속
척추동물: 림프구성 맥낙뇌막염 바이러스
테누이바이러스(Tenuivirus) 속
식물: 줄무늬잎마름병 바이러스
이러한 단편화 바이러스과로부터, 인간에게 잠재적으로 건강상 해가 되는 바이러스가 특정의 관심사다. 역 유전학(또는 구제)은 비리온 RNA를 복제를 개시하는 게놈에 대한 활성 트랜스크립타제 복합체와 조립함으로써(Enami and Palase) 재조합 인플루엔자 A를 생산하는 경로를 제공했다. 이 방법은 cDNA 카피의 시험관내 전사, vRNA의 카피에 네이티브 또는 돌연변이된 목적하는 바이러스 유전자 단편형성 및 바이러스의 회수를 포함한다. vRNA를 RNP 단백질(정제된 비리온으로부터 수득)과 혼합한 다음 헬퍼 바이러스(예, 목적하는 재조합 바이러스에 상응하는 야생형 바이러스)로 세포에 형질감염시킨다. 예를 들면, 재조합 인플루엔자 A의 제조에서, 인플루엔자 A 바이러스를 사용하여 형질감염시킨 RNA 유전자를 복제하는 단백질을 제공한다. 재조합 바이러스와 헬퍼 바이러스의 혼합물이 형성된다. 헬퍼 바이러스가 과량으로 존재하기 때문에, 항체 선택 시스템과 같은 강력한 선택 시스템을 사용하여 선택적으로 자손을 분리한다(Enami and Palase, 1991). 본 발명의 열 쇼크 과정은 생성된 혼합물의 용적과 동시감염이 헬퍼 바이러스로 실행될 때 RNA, RNP 및 활성 트랜스크립타제 복합체와 같은 부가 성분의 적당한 구제 조성물을 가함으로써 수득되는 재조합 바이러스의 양을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 열 쇼크 과정은 또한 10 인플루엔자 A 바이러스-암호화 단백질의 cDNA 클론을 발현하는 백신 T7 폴리머라제로 COS-1 세포에서 합성 인플루엔자-유사 CAT:RNA 미니게놈을 팩키징함으로써(Mena 등, 1996) 바이러스-유사 입자를 생산하는 데 사용되는 과정의 효율을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 열 쇼크 과정은 부니얌베라 부니야바이러스(Bridgen and Eliott, 1996)의 단편화 네가티브-가닥 RNA 게놈의 구제를 위한 헬퍼 독립 시스템의 효율을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 이 시스템은 비단편화 네가티브 센스 RNA 바이러스 구제 실험에 사용된 것들과 유사하다(단편화 인플루엔자 바이러스의 구제를 위해 설명된 것보다는). 3 부니얌베라 부니야바이러스 RNA 게놈 단편의 완전한 길이 cDNA 카피를 함유하는 플라스미드를 작제하고 T7 프로모터와 리보자임 서열로 플랭킹시켜 정확한 게놈 말단을 갖는 RNA의 게놈 카피를 생성한다. T7 폴리머라제와 재조합 부니얌베라 부니야바이러스 단백질을 발현하는 세포가 이러한 플라스미드로 형질감염되면 전체 길이의 안티게놈 RNA가 전사되고 세포내 캡시드화되고 이어서 이들이 복제되어 감염성 부니야바이러스 입자로 팩키징된다.
열 쇼크가 재조합 MV의 구제를 향상시키고 MV 미니레플리콘으로부터 CAT 리포터 유전자의 발현을 증가시킨다는 본원에 설명되어 있는 관찰은 CDV L 폴리머라제 활성이 hsp72(Oglesbee 등, 1996)에 의해 자극받음을 나타내는 결과와 함께 hsp72의 유도가 본원에 설명되어 있는 열 쇼크의 효과에 대한 실질적인 이유가 될 수 있다고 생각하게 하였다. 이 가능성을 hsp72에 대한 유전자 중 하나를 CAT 미니레플리콘 실험 중에 발현 벡터로부터 발현시킴으로써 시험한다. hsp 단백질의 에피 토프-태그 버전의 발현은 웨스턴 블롯 분석(실시예 6)에 의해 확인된다. hsp 발현 벡터의 존재는 형질감염된 세포에서 CAT 수준을 20배까지 증가시킨다(실시예 6). 이러한 결과는 hsp72의 고수준 발현이 바이러스 구제 효율을 증가시킬 수 있음을 설명한다. 또한, 이러한 결과는 고수준의 hsp72를 발현하는 안정한 세포주가 구제를 위해 선호될 수 있음을 의미한다. 이상적으로, 안정한 세포주는 유도성 프로모터로부터 hsp72를 발현하여 hsp72 유전자의 발현 양이 조절될 수 있도록 할 것이다. 이는 구제를 최대화하고 또한 hsp 유전자의 구조적 고-수준 발현의 세포주에 끼치는 잠재적 독성 효과를 회피하는 유도시간과 유도수준의 선택을 허용할 것이다.
본 발명의 방법으로 제조된 재조합 바이러스는 진단 및 치료 적용에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법으로 제조된 재조합 바이러스는 단독으로 또는 약제, 항원, 면역화제 또는 보조제와 배합하여 바이러스 질병의 예방 또는 치료에서 백신으로서 사용된다. 이러한 활성 제제를 제형하여 통상적인 수단인 희석제 또는 약학적으로 허용되는 담체를 사용하여 전달할 수 있다.
하기 실시예는 설명의 방법으로 제공되고, 본 발명을 상기 설명으로 제한하지 않아야 한다.
방법 및 재료
세포, 바이러스 및 형질감염.
293-3-46 세포(Radecke 등, 1995)와 293 세포(Graham 등, 1977)를 10% 태 소 혈청(FBS)으로 보충된 Dulbecco의 변형된 최소 필수 배지(DMEM)에 유지한다. 293-3-46 세포가 ㎖당 G418(Geneticin, Gibco-BRL) 1.5 mg을 함유하는 배지에서 선택적으로 성장한다. Vero 세포는 5% FBS를 함유하는 DMEM에서 성장하고, HeLa 현탁 세포는 10% FBS로 보충된 최소 필수 배지(SMEM)에서 성장한다. MV(Edmonston B)를 전술한 HeLa 현탁 배양액에서 증식시킨다(Udem, 1984).
형질감염을 칼슘-포스페이트 침전법을 사용하여 실행한다(Ausubel 등, 1987; Graham and van der Eb, 1973). 형질감염을 위해 사용되는 293-3-46 또는 293 세포를 6 웰 플레이트에 시딩하고 약 50-75% 융합까지 성장시킨다. 세포에 형질감염 1-3시간 전에 G418이 결핍된 신선한 배지 4.5 ㎖를 공급한다. 적당한 DNA를 수중 최종 용적 225 ㎕로 배합한 다음 2.5 M CaCl2 25 ㎕를 첨가하여 형질감염 혼합물을 제조한다. DNA-칼슘 혼합물을 부드럽게 와동시키면서 2X HEPES 완충 식염수(280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4, 50 mM HEPES, pH 7.05) 250㎕를 서서히 첨가한다. 침전물을 실온에서 20분 동안 정치한 다음 세포에 첨가한다. 세포를 밤새(14-16시간) 배양한 다음, 형질감염 배지를 제거하고 세포를 세정하며 G418이 결핍된 신선한 배지를 공급한다. 형질감염된 세포의 감염을 형질감염 배지를 제거한 후에 세포당 5 플라크 형성 단위(pfu)로 실행한다. 감염체를 배지를 교체하기 2시간 전에 배양한다. 이 때, 열 쇼크를 가할 세포를 함유하는 디시를 파라필름으로 랩핑하여 44℃의 수조에 전달하고 3시간 동안 배양한 다음 37℃의 배양기로 전달한다. 세포를 일시 유전자 발현의 분석을 위해 형질감염 개시 48시간 후에 수확하거나 구제 실험 동안 72시간(또는 본원에 달리 명시된 것처럼)에 수확한다. 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 분석을 전술한 바와 같이 실행한다(Sidhu 등, 1995 및 Parks and Shenk, 1996).
바이러스 구제 동안 수확한 세포를 단층 위에 배지를 반복 피펫팅함으로써 웰로부터 제거하여 세포를 분리하고 단층을 작은 덩어리로 파괴시킨다. 세포 해리제는 사용되지 않는다. 세포와 배지 5 ㎖를 즉시 10 cm 디시상 배지 10 ㎖에서 성장하고 있는 Vero 세포의 거의-융합성 단층으로 분배한다. 4 내지 5일 후에, 플라크가 가시화되고 단층을 플라크 카운트를 위해 염색하거나 수확하여 재조합 바이러스 스톡을 제조한다.
RNA 형질감염을 하기처럼 수정하여 DNA에 대해 전술한 바와 같이 실행한다. 형질감염을 위한 RNA를 Megascript kit(Ambion)에서 T7 RNA 폴리머라제 시약을 사용하여 시험관내 제조한다. RNA-칼슘 포스페이트 침전물을 5-6시간 동안 293 세포와 함께 배양한 다음 제거한다. 형질감염과 감염은 바이러스의 형질감염 배지로의 첨가에 의해 동시에 실행된다. 형질감염-감염 배지를 교체한 후에, 적당한 세포 샘플에 43-44℃에서 열 쇼크를 가한다. 세포를 형질감염/감염의 개시 24-28시간 후에 수확한다.
재조합 DNA
완전한 길이 MV cDNA 플라스미드(p(+) MV)와 MV L 유전자 발현 플라스미드(pEMC-La)가 Martin Billeter와 Frank Radecke(Radecke 등, 1995)에 의해 풍부하게 제공되었다. CAT 미니레플리콘의 제조가 설명되었다(Sidhu 등, 1995). hsp70 발현 플라스미드를 열 쇼크를 가한 293-3-46 세포로부터 추출된 RNA로부터 cDNA(Hunt and Morimoto, 1985)를 증폭시킴으로써 클로닝한다. 역 전사-PCR(RT/PCR) 반응을 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase, Taq DNA 폴리머라제 및 Titan kit 시약에서 발견되는 Pwo DNA 폴리머라제(Boehringer Mannheim)를 함유하는 고 적합성 효소 혼합물로 실행한다. hsp70 cDNA를 발현 플라스미드 pCGN(Tanaka and Herr, 1990)으로 클로닝하여 아미노 말단 암호화 영역에 인플루엔자 HA 에피토프 태그를 함유하는 발현 작제물을 생성한다.
DNA 서열분석
MV 서열을 RT/PCR에 의해 증폭된 DNA 서열분석으로 결정한다. MV 감염된 세포로부터의 RNA를 구아니디늄 이소티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출법(Chomczynski and Sacchi, 1987)으로 제조하고 RT/PCR을 Titan kit에서 시약을 사용하여 실행한다(Boehringer Mannheim). 증폭된 DNA를 저 용융 아가로스 겔에서 겔 정제한다. PCR 단편을 염색 종결자 반응(Applied Biosystems)을 사용하여 서열분석하고 ABI PrismTM 자동화 서열분석기로 분석한다(Perkin-Elmer). 플라스미드 DNA의 서열확인 또한 자동화 서열분석기로 실행한다.
실시예 1
cDNA 구제 프로토콜
이 프로토콜은 도 1에 요약되어 있다.
형질감염을 시작하기 전날에, 293-3-46 세포를 10% 태 소 혈청(FBS)과 G418 항생물질 1.5 mg/㎖로 보충된 DMEM을 사용하여 6 웰 플레이트에 분배한다. 1 융합성 10 cm 플레이트를 다음날 사용할거라면 6-웰 디시에 분배한다. 구제 실험 마다 12 웰을 형질감염시켜 재조합 바이러스의 회수 가능성을 증가시킨다.
형질감염 약 1 내지 3시간 전에, 각 웰에 배지를 10% FBS(G418 없이)로 보충된 DMEM 4.5 ㎖로 교체한 다음 형질감염을 개시한다.
칼슘-포스페이트 침전:
용적 225 ㎕로 물과 DNA를 살균 5 ㎖ 폴리프로필렌관에서 합한다. p(+) MV 5 ㎍과 L 발현 플라스미드(pEMC-La) 100 ng을 형질감염마다 사용한다. 2.5 M CaCl2 25 ㎕를 첨가하고 혼합한다. 2XHBS 250 ㎕를 적가하면서 관을 부드럽게 와동시킨다. HBS를 첨가한 후에, 관을 실온에서 15-20분 동안 정치한다(HBS는 2X HEPES 완충 식염수이다: 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4, 50 mM HEPES, pH 7.05)(Ausubel 등, 1987). 큰 마스터 형질감염 혼합물을 제조하기 보다는 각 웰마다 개별 형질감염을 세팅하는 것이 유리하다. 침전물을 배지에 적가하고 세포를 밤새 약 12 내지 16시간 동안 배양한다.
이어서 배지를 제거하고 세포를 세척한다. 세포를 HEPES/식염수 용액(150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.2)으로 2회 세정한다. 세포를 배양하기 전에, 배지(DMEM, 10% FBS, G418 없음) 5 ㎖를 첨가한다.
열 쇼크: 전술한 바와 같이 신선한 배지를 첨가한 후에, 6-웰 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 뚜껑이 있는 Tupperware 용기에 전달한다. 용기를 43-44℃ 수 조에 침수시켜 3시간 동안 배양한다. 이러한 열 쇼크 단계 후에, 파라필름을 플레이트로부터 제거하고 세포를 37℃ 배양기에 전달한다. 세포를 형질감염을 시작한 지 총 약 72시간 동안 배양한다.
배양을 완료한 후에, 플라크 확장 단계를 Vero 세포로 실행한다. Vero 세포를 사용하기 하루 전날 하나의 10 cm 플레이트를 4 또는 5개의 10 cm 플레이트에 분배함으로써 제조한다. 밤새 배양한 후에, 세포는 약 75% 융합성이다. 형질감염된 웰 마다 1 플레이트의 Vero 세포가 존재하도록 충분한 플레이트를 준비한다. 형질감염 개시 약 72시간 후에, 형질감염된 293-3-46 세포의 각 웰을 Vero 세포를 함유하는 10 cm 플레이트에 전달한다. 293-3-46 세포를 세포에 배양액 배지 5 ㎖의 반복 피펫팅으로 전달하여 이들을 웰로부터 제거하고 단층을 작은 세포 덩어리로 파괴한다. 세포 용해를 회피하기 위해 부드럽게 피펫팅하지만 세포를 제거하도록 충분히 강하게 피펫팅한다. 이어서 형질감염시킨 세포 덩어리를 함유하는 배양액 배지 5 ㎖를 이미 배양액 배지 10 ㎖를 함유하는 Vero 세포의 10 cm 플레이트에 분배한다. 구제 시스템에 따라, 당사자는 플라크를 가시화하기에 충분한 시간, 약 4-5일을 허용할 것이다. 재조합 바이러스를 세포를 스크랩핑함으로써 수확하고 이들을 원심분리에 의해 수집한다. 세포를 혈청이 결핍된 무혈청 DMEM(Gibco/BRL) 1 ㎖에 재현탁시키고 1회 냉동-해동시켜 바이러스를 방출시킨다.
실시예 2
이 실험에서, 실시예 1에 설명된 구제 방법을 열 쇼크를 적용하지 않은 대조구와 함께 6회 반복한다. 6회 독립 구제 실험의 결과는 도 5에 나타나 있다. 모든 실험에서 사용된 MV cDNA는 Edmonston B 서열(Radecke 등, 1995)을 함유한다. 형질감염을 전술한 바와 같이 실행하고 열 쇼크 배양을 44℃에서 3시간 동안 실행한다. 실험 1은 플라크를 플러스 또는 마이너스로 기록하고, 나머지 실험에서는 플라크를 카운트한다. 이 실시예에서 실행된 실험은 하기를 나타낸다:
통상의 구제 기술의 두가지 변형인(Radecke 등, 1995), 열 쇼크 단계 및 플라크 확장 단계는 각각 재조합 바이러스를 생산하는 여러 형질감염된 배양액을 상당히 증가시키는 데 효과적이다. 이러한 변형을 적용하기 전에는, 형질감염된 배양액의 약 2-3% 만이 재조합 바이러스를 생산했다. 상기 과정에서, 형질감염된 배양액 50 내지 약 90%가 재조합 바이러스를 생산한다.
실시예 3
플라크 확장 변형
실시예 1의 구제 프로토콜에서 플라크 확장 단계는 열 쇼크 없이 실행되는 하기 유형의 실험으로부터 정해진다.
실험을 Radecke 등(1995)에 의해 약술된 하기 과정에 따라 실시예 2의 Plaque Expansion 단계 없이 실행한다. 이러한 실험에서, 형질감염된 세포를 6-웰 디시의 웰로부터 10 cm 플레이트로 전달하여 4-5일의 추가 세포 성장과 플라크가 발달할 추가 시간을 허용한다. 이 과정을 사용하면 플라크가 검출되지 않는다. 실험의 두번째 유형에서, 형질감염된 세포를 스크랩핑과 원심분리로 수확하고 무혈청 OPTIMEM(Life Technologies, Gaithersburg MD) 배지에 재현탁한다. 세포를 1회 냉동-해동 사이클에 가하여 바이러스를 방출하고, 이 세포 용해물을 약 75% 융합성인 Vero 세포를 함유하는 10 cm 디시에 적용한다. 4 내지 5일 후에, Vero 세포를 플라크에 대해 시험한다. 배양액의 약 2-3%가 홍역 바이러스 플라크에 대해 양성이었다. 실시예 2에 약술된 Plaque Expansion 프로토콜을 수행한 결과, 바로 앞서 설명한 2% 성공율보다 10-20배 향상되었다. 세포를 실시예 2에 보여진 것처럼 플라크 확장 단계 전에 냉동-해동 사이클에 가하지 않는 것이 중요한 것 같다.
실시예 4
열 쇼크는 미니레플리콘으로부터 발현을 증가시킨다
열 쇼크 후에 향상된 구제 결과의 가능한 메카니즘을 시험하기 위해, MV 미니레플리콘으로부터의 유전자 발현에 끼치는 열 쇼크의 효과를 시험한다(결과는 도 2 참조). 플라스미드 미니레플리콘(pMV107CAT)은 MV 말단에 의해 플랭킹된 CAT 유전자의 네가티브-센스 RNA 카피의 T7 RNA 폴리머라제-매개 합성을 디자인한다(Sidhu 등, 1995). 이 플라스미드는 미니레플리콘 RNA의 세포내 합성을 위해 293-3-46 세포를 형질감염시키는 데 사용한다. 293-3-46 세포에서 미니레플리콘 RNA의 복제 및 발현이 감염에 의해 제공된 MV 단백질로 보완함으로써 또는 L 발현 플라스미드로 보완함으로써 실행하고 이는 세포가 N과 P 단백질 모두를 제공하기 때문이다. 293-3-46 세포를 MV-CAT 미니레플리콘 플라스미드 DNA(1 ㎍)로 밤새 형질감염시킨다. 일부 형질감염(레인 3 및 7)은 또한 MV L 유전자 발현 플라스미드(100 ng)를 수용하여 L 보완을 제공한다. 형질감염 약 14시간 후에, 배지를 교체하고 세포를 MV로 2시간 동안 세포마다 5 pfu(플라크 형성 단위)로 감염시킨다(레인 4 및 8). 감염 후에, 배지를 교체하고 적당한 세포 배양액(레인 5-8) 에 44℃에서 3시간 동안 열 쇼크를 가한다. 세포를 형질감염을 시작한 지 48시간 후에 수확하여 CAT 분석을 상기 방법에 설명된 것처럼 실행한다.
미니레플리콘의 발현에 끼치는 열 쇼크의 효과를 시험할 때, 열 쇼크를 사용하는 구제는 CAT 유전자 활성의 상당한 증가를 일으킨다(도 2). 도 2에 나타난 실험을 미니레플리콘 DNA로 실행하고 세포를 형질감염 48시간 후에 수확하는 것을 제외하고 구제 실험과 유사하게 실행한다. 바이러스에 의한 보완은 형질감염 배지의 제거 후에 세포마다 5 pfu로 형질감염된 세포를 감염시킴으로써 실행된다. L 발현 플라스미드로의 보완은 미니레플리콘 DNA로 동시형질감염시킴으로써 간단히 실행된다. 결과는 열 쇼크가 보완의 형태가 사용될 때 발현을 자극함을 나타낸다. 여러 실험에서, L 발현 플라스미드로의 보완에 의해 생성되는 CAT 발현은 열 쇼크에 의해 2-10배 증가한다(레인 3과 7을 비교). 유사하게, CAT 활성 또한 바이러스 보완이 이용되면 증가하고 약 5배 증가(레인 4와 8)를 초래한다. 생각했던 것처럼, CAT 플라스미드(레인 1과 5) 또는 L 보완의 기원(레인 2와 6)을 수용하지 않는 네가티브 대조 형질감염은 기본 CAT 활성의 매우 저수준을 생성한다.
실시예 5
미니레플리콘의 증가된 발현이 열 쇼크 후에 고수준의 T7 폴리머라제 활성과 관련있을 수 있을 가능성이 있다. T7 폴리머라제 고활성은 열 쇼크 후에 293-3-46 세포에서 유전자의 증가된 발현으로부터 초래될 수 있다. T7 폴리머라제 유전자는 CMV 즉시 초기 프로모터/인핸서로부터 293-3-46세포에서 발현되고(Radecke 등, 1995) CMV 프로모터/인핸서는 열 쇼크에 반응하는 것으로 보여진다(Andrews, Newbound and Lairmore, 1997). 이 가능성을 배제하기 위해, 세포를 미니레플리콘 RNA로 형질감염시키고 실시예 4에 사용된 것처럼 열 쇼크를 가한다. 또한, 이 예에서, 열 쇼크의 효과가 293-3-46 세포주에 존재하는 MV 유전자의 증가된 발현과 관련있다는 가능성을 배제하기 위해, RNA 형질감염을 293 세포에서 실행한다(Graham 등, 1977). 293-3-46 세포는 어느 MV 유전자도 안정하게 발현하지 않는다. 이 실시예에 사용되는 형질감염 프로토콜을 RNA 형질감염을 달성하도록 변형한다(상기 문단의 방법 참조). RNA 5 ㎍을 칼슘-포스페이트 과정으로 형질감염시킨다. 적당한 세포의 MV 감염을 형질감염 혼합물이 배지에 첨가된 후 즉시 바이러스를 첨가함으로써 실행한다. 세포에 침전물을 첨가한 후에, MV(세포마다 5 pfu, 도 3의 레인 3과 6)를 배양 배지에 첨가하여 이들이 뉴클레오캡시드로 팩키징될 수 있기 전에 세포내 RNA 분해의 가능성을 줄이기 위해 즉시 감염을 개시한다. 형질감염-감염 배양 5-6시간 후에, 배지를 교체하고 37℃로 돌아가기 전에 적당한 세포 샘플에 44℃에서 2시간 동안 열 쇼크를 가한다. CAT 분석을 위해 형질감염-감염 시작 24-28시간 후에 세포 추출액을 제조한다.
RNA 형질감염의 결과는 DNA 형질감염의 결과와 유사하다. 열 쇼크는 감염된 세포에서 CAT의 발현을 실질적으로 증가시킨다(도 3, 레인 3과 6을 비교). CAT 활성은 미니레플리콘 RNA(레인 1과 4) 또는 바이러스 보완(레인 2와 5)을 수용하지 않는 세포에서 관찰되지 않았다. RNA 형질감염은 또한 증가된 T7 RNA 폴리머라제 활성이 도 2에 보여진 DNA 형질감염 실험에서 열 쇼크의 효과에 대한 이유일 가능성을 배제한다.
실시예 6
Hsp70에 의한 미니레플리콘 발현의 자극
Oglesbee 등은 유도성 hsp70 아이소폼인 hsp72가 CDV 뉴클레오캡시드로 동시정제되고 이러한 뉴클레오캡시드가 시험관내에서 향상된 전사 활성을 보인다고 밝혔다(Oglesbee, Ringler and Krakowka, 1990; Oglesbee 등, 1996). hsp72가 상기 실시예에서 관찰되는 열 쇼크 효과와 관련있는지를 평가하기 위해, 본질적으로 실시예 1의 열 쇼크 대신 hsp70 유전자의 과발현을 대용하는 실험을 실행한다(결과는 도 4에 나타나 있다). 유도성 hsp70 cDNA(Hunt and Morimoto, 1985, Wu 등, 1985)는 실시예 2에 따라 열 쇼크를 가한 세포로부터 제조된 RNA로부터 클로닝된다. cDNA는 CMV 발현 벡터, 플라스미드 pCGN(Tanaka, 1990)으로 인플루엔자 에피토프 태그와 함께 클로닝된다. hsp 70 유전자의 아미노-말단 암호화 영역을 Y P Y D V P D Y A 서열을 가지는 인플루엔자 HA 에피토프 태그(Tanaka and 375-386, 1990)와 융합시킨다. hsp70 cDNA가 클로닝되어 HA 에피토프를 함유하는 아미노 말단을 갖는 hsp70 단백질을 발현한다. 이 플라스미드의 사용은 내생성 hsp70 아이소폼의 백그라운드 존재하에서도 인플루엔자 태그에 대한 항체를 사용하여 hsp70 cDNA의 발현을 수행하도록 한다. 형질감염된 세포로부터 제조된 전체 세포 추출액을 에피토프 태그에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅(Parks and Shenk, 1996)에 의해 분석한다(도 4a). 형질감염된 세포로부터의 추출액의 웨스턴 분석은 발현 플라스미드(도 4a)가 70 kD 보다 약간 큰 태그 폴리펩타이드를 생산함을 보여준다.
L 발현 플라스미드와 미니레플리콘 DNA와 함께 hsp70 발현 벡터로의 293-3- 46 세포의 동시형질감염은 CAT의 증가된 발현을 초래한다(참조 도 4b). 이 일시 분석 시스템에서, hsp70의 과발현은 20배 만큼이나 저수준의 L 보완을 증가시킨다. hsp70 발현 벡터에 의해 유도되는 CAT 발현의 이러한 증가는 확실히 특이적인데 이는 이들이 L 폴리머라제 플라스미드의 존재를 요하고 L이 부재하거나 CAT 플라스미드가 형질감염으로부터 생략될 때 관찰되는 기본 CAT 활성을 증가시키지 않기 때문이다. 이러한 결과는 hsp70이 적어도 부분적으로 미니게놈 발현에 끼치는 열 쇼크의 효과에 대해 책임이 있음을 강력하게 설명한다.
실시예 7
Vero 세포에서 미니레플리콘 발현의 열 쇼크 구제
실시예 4처럼, 293-3-46 세포를 Vero 세포로 대체한다,
재료: Vero 세포 형질감염 실험을 위해, 홍역 단백질 N, P 및 L이 플라스미드 DNA에 의해 제공되고 T7 RNA 폴리머라제는 MVA/T7(Wyatt 등) 감염에 의해 제공된다. 형질감염은 미니레플리콘 100 ng, N 플라스미드 400 ng, P 플라스미드 300 ng 및 하기 표 2에 나타난 L 플라스미드의 양을 포함한다. 네가티브 대조 형질감염은 L 플라스미드 지지체가 결핍되었다. 또한, Vero 세포를 형질감염제로서 LIPOFECTACE(Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD로부터 구입)로 형질감염시킨다. 각 시험을 위해, 형질감염 반응 마다 MVA/T7(Wyatt 등) 2 플라크-형성 단위(PFU)가 사용된다. LIPOFECTACE 2 용적을 시험하여 효율적인 Vero 세포 형질감염을 위한 최적량을 결정한다. 형질감염을 L 단백질 발현 플라스미드의 두 상이한 양으로 실행한다. 열 쇼크를 위해, 세포를 44℃ 수조에 3시간 동안 전달한다. 대조 세포에는 열 쇼크를 가하지 않는다.
MVA/T7: MVA/T7은 11K 강력한 후기 프로모터(Wyatt 등, 1995)의 조절하에 T7 유전자-1의 한개의 통합된 카피를 함유하는 하이브리드 바이러스이다.
발현 플라스미드:
L 플라스미드가 Radecke and Billeter에 의해 제공된다. 기본적으로, 홍역 L 유전자는 Radecke 등(1995)에 의해 기술된 클로닝 방법으로 pEMC 플라스미드 벡터(Moss 등, 1990)로 클로닝되어 플라스미드 pEMC-La를 생성한다. 이 벡터는 내부 리보솜 진입 영역과 3' 말단 폴리-A 서열을 포함하여 진핵세포에서 클로닝 유전자의 발현을 촉진한다. 동일한 벡터가 N과 P 유전자 각각에 대한 벡터를 제조하는 데 사용된다. N 및 P 단백질 암호화 영역은 홍역 바이러스 게놈 cDNA(Radecke 등, 1995)로부터 PCR에 의해 증폭된 다음 벡터 pEMC의 NcoI와 BamHI 영역 사이에서 클로닝되어 pT7-N과 pT7-P를 생성한다.
열 쇼크를 위한 Vero 세포 프로토콜:
LIPOFECTACE AND EFFECTENE에 대해
LIPOFECTACE:
Vero 세포를 이들이 대략 50-80% 융합일 때까지 6-웰 배양 디시에서 성장시킨다. 약 75% 융합성의 세포가 바람직한데, 이는 이 단계에서 이들이 여전히 신속하게 분열되고 건강하기 때문이며, 세포 고밀도는 형질감염, MVA/T7 감염 및 열 쇼크 중에 일어나는 세포사의 상쇄를 돕는다. 형질감염을 위한 DNA-지질 혼합물을 DNA(N, P, L 및 MV 미니레플리콘)와 무혈청 DMEM 200 ㎕를 마이크로퓨지 관에서 합 하여 제조한다. LIPOFECTACE(실험에 따라 12 또는 15 ㎕)을 DNA-배지 혼합물에 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 실온에서 20분 배양한다. 배양 후반에, DNA-LIPOFECTACE 혼합물을 적당량의 MVA-T7을 함유하는 무혈청 DMEM 800 ㎕와 합하여 세포마다 대략 2 PFU의 최종량을 제조한다. 배지를 Vero 세포 배양액으로부터 제거하고 DNA, LIPOFECTACE 및 MVA/T7을 함유하는 형질감염 혼합물로 대체한다. 세포를 2-6시간 동안 5% CO2로 세팅한 37℃ 배양기에서 배양한다. Vero 세포를 위해, 이 배양은 2-3시간이 최적인 것 같다. 이 배양 기간 후반에, 10% 태 소 혈청으로 보충된 DMEM 1 ㎖를 세포에 첨가하고 적당한 세포 배양액에 2-3시간 동안 44℃에서(Vero 세포를 위해서는 3시간이 최적인 것 같다) 열 쇼크를 가한다. 열 쇼크를 실행하기 위해, 6-웰 플레이트를 Ziplock 플라스틱 백에 전달한 다음 44℃ 수조로 침수시킨다. 2-3시간 열 쇼크 시간의 후반에, 세포를 플라스틱 백으로부터 제거하고 밤새 배양을 위해 37℃ 배양기로 돌려보낸다. 다음날, 배지를 10% 태 소 혈청을 함유하는 신선한 DMEM 2 ㎖로 대체한다. 형질감염 대략 48시간 후에, 세포를 수확하여 CAT 분석을 위한 추출액을 제조하거나 세포를 수확하여 Vero 세포의 단층을 함유하는 10 cm 디시에 전달하여 플라크 확장을 허용한다.
이어서 세포를 CAT 활성에 대해 분석한다. CAT 활성은 LIPOFECTACE 12 ㎕와 L 플라스미드 100 ng의 조건하에서 사용될 경우 열 쇼크에 의해 약 7배 자극된다. CAT 활성은 LIPOFECTACE 15 ㎕와 L 플라스미드 100 ng의 조건하에 사용될 경우 열 쇼크에 의해 약 2배 자극된다. 하기 표 2를 참조하라.
레인 1 2 3 4 5 6 7 8 9 13 11 12
L ng 0 100 200 0 100 200 0 100 200 0 100 200
상대활성 - 1.0 0.2 - 4.7 0.1 - 7.0 5.4 - 10.3 4.1
Lipofectace(㎕) 12 12 12 15 15 15 12 12 12 15 15 15
열 쇼크 열 쇼크 없음 3시간 동안 열 쇼크

실시예 8
Vero 세포에서 열 쇼크 구제를 위한 형질감염 촉진제의 비교
상기 실험을 LIPOFECTACE 또는 EFFECTENE(Qiagen Inc., Valencia, CA)를 사용하여 반복한다.
EFFECTENE을 위한 프로토콜은 DNA-지질 혼합물의 제조를 제외하고 본질적으로 동일하다. DNA를 EFFECTENE 시약이 공급된 완충 식염수 100 ㎕와 혼합한다. 이어서 EFFECTENE 축합제 8 ㎕를 첨가하고 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양한다. 이어서 EFFECTENE 25 ㎕(또는 도면에 명시된 양)를 첨가하고 혼합물을 추가 15분 동안 배양한다. 15분 배양 후에, DNA-EFFECTENE 복합체를 충분한 MVA/T7을 함유하는 무혈청 배지 900 ㎕와 혼합하여 세포마다 대략 2 PFU를 제공한다. 이 단계에서, DNA-MVA/T7 혼합물의 세포로의 적용과 모든 후속 단계는 LIPOFECTACE에 대한 단계와 동일하다.
결과는 하기 표 3a와 3b에 나타나 있다.
(Lipo=LIPOFECTACE). 미니레플리콘 활성은 열 쇼크가 형질감염 2시간 후에 실행될 때 증가한다.
레인 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
상대활성 - 1.0 - 0.2 0.9 0.2 - 7.2 - 5.4 5.2 5.0
시약 (㎕) 15 15 8 8 25 6 15 15 8 8 25 6
L 플라스미드 - + - + + + - + - + + +
시약 Lipo Effectene Lipo Effectene
처리 열 쇼크 없음 2시간 동안 열 쇼크

레인 3 4 5 6 7 8
상대 활성 .8 .9 .0 .2
시약 ㎕ 5 5 5
시약 Lipo Effectene
처리 6시간 동안 열 쇼크

실시예 9
변형된 완충액 기술로 Vero 세포 형질감염
재료: BES는 {N,N-비스[2-하이드록시에틸]-2-아미노에탄설폰산}이다.
BES/칼슘 포스페이트 과정을 사용하는 구제를 위한 Vero 세포의 형질감염
Vero 세포를 이들이 대략 50-80% 융합일 때까지 6-웰 배양 디시에서 성장시킨다. 세포는 이 단계에서 이들이 여전히 신속하게 분열되고 건강하기 때문에 약 75% 융합성이고, 세포 고밀도가 형질감염, MVA 감염 및 열 쇼크 중에 일어나는 세포사의 상쇄를 돕는다. 형질감염시키는 날에, 세포에 웰당 배지 4.5 ㎖를 공급하고 37℃(또는 온도 민감성 바이러스를 구제한다면 더 저온)와 3% CO2로 세팅한 배양기 에 전달한다. 당사자에 의해 통상으로 사용되는 배지는 10% 태 소 혈청으로 보충된 DMEM이다(기타 배지도 이용될 것이다). 세포를 공급한 지 대략 2 내지 4시간 후에, 형질감염이 개시된다. 형질감염을 위한 DNA-칼슘 포스페이트 침전물을 5 ㎖ 폴리프로필렌 관에서 제조한다. 구제를 위해 N, P 및 L에 대한 발현 플라스미드와 MV 미니레플리콘을 포함한 DNA를 최종 용적 225 ㎕로 물과 합한다. 다음에, 2.5 M CaCl2 25 ㎕를 첨가하고 관을 부드럽게 혼합한다. 모든 DNA-CaCl2 혼합물을 제조한 후에, 침전물을 2X BES-완충 식염수(2XBBS: NaCl 280 mM, Na2HPO4 1.5 mM, BES 50 mM, pH 6.95-6.98) 250 ㎕를 첨가함으로써 제조한다. 2XBBS를 각 관에 적가하면서 BBS 첨가하는 동안 연속적으로 부드럽게 와동시킨다. 2XBBS를 첨가한 후에, 관을 실온에서 20분 동안 배양한다. 실온 배양 후반에, 침전물 500 ㎕를 세포에 적가하고 플레이트를 부드럽게 요동시켜 침전물과 배지의 혼합을 보장한다. 침전물을 첨가한 후에, MVA/T7 또는 MVA/T7-GK16 대략 2 플라크 형성 단위(pfu)를 배지에 직접 첨가하고 플레이트를 부드럽게 요동시켜 혼합한다. GK16을 사용하면, DNA 합성 저해제가 이 단계에서 배지에 첨가된다. 사이토신 아라비노사이드(araC) 또는 하이드록시우레아(HU)를 배지에 각각 ㎖당 20 ㎍ 또는 10 mM을 첨가한다. 형질감염 3시간 후에 세포를 플라스틱 집락(ziplock) 백에 전달하고 열 쇼크를 위해 44℃로 세팅한 수조에 침수시킨다. 세포를 44℃에서 2-3시간(3시간 이상의 연장이 최적 작업인 것 같다) 동안 배양한 다음 밤새 배양을 위해 3% CO2로 세팅한 배양기에 다시 전달한다. 다음날, 배지와 형질감염 성분을 세포로부터 제거하고 세포를 hepes-완충 식염수(Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM)로 2회 세척한 다음 신선한 배지를 첨가한다. AraC 또는 HU를 MVA/T7-GK16으로 감염된 배양액에 충진한다. 세포를 표준 37℃와 5% CO2로 세팅한 배양기에서 하루 더 배양한다(온도 감수성 바이러스가 구제된다면 세포는 신선한 배지를 첨가한 후에 대략 더 저온에서 2일 동안 배양될 수 있다). 이어서 형질감염된 세포를 바이러스 구제를 위한 플라크 확장 단계를 위해 수확하거나 CAT 분석을 위한 세포 추출액을 제조하기 위해 수확한다. 형질감염된 세포를 배지로 스크랩핑하고 10 cm 플레이트 또는 Vero 세포(또는 기타 허용되는 세포형 선택)의 50% 융합성 단층을 함유하는 T25 플라스크에 전달한다. 동시배양된 세포를 37℃(또는 전술한 적당한 온도)에서 4 내지 6시간 동안 배양한 다음 배지를 교체한다. 이 단계에서 배지의 교체는 형질감염된 세포가 DNA 합성 저해제를 함유할 때 필수적이어서 플라크 확장 단계 중에 동시배양액에서 세포 성장의 억제를 회피한다. 플라크 확장 단계 개시 대략 4 내지 5일 후에, 플라크가 가시화되고 세포를 수확하여 구제된 바이러스의 냉동-해동 용해물 스톡을 생성할 수 있다. CAT 분석의 결과는 하기 표 4a와 4b에 나타나 있다. BES/칼슘 포스페이트 과정은 활성을 증가시킨다.



레인 1 2 3 4 5 6
상대 활성 0.11 1.0 0.16 1.76 0.16 2.93
DNA 양 100 ng MVCAT 400 ng N 300 ng P 100 ng L 200 ng MVCAT 800 ng N 600 ng P 200 ng L 400 ng MVCAT 1600 ng N 1200 ng P 400 ng L
L 플라스미드 - + - + - +
시약 LIPOFECTACE
처리 열 쇼크

레인 7 8 9 10 11 12
상대 활성 0.22 4.50 0.18 7.24 0.28 2.50
DNA 양 100 ng MVCAT 400 ng N 300 ng P 100 ng L 200 ng MVCAT 800 ng N 600 ng P 200 ng L 400 ng MVCAT 1600 ng N 1200 ng P 400 ng L
L 플라스미드 - + - + - +
시약 BES/칼슘 포스페이트
처리 열 쇼크

상기의 형질감염 기술은 Chen 등, 1987과 Tognon 등, 1996을 참조하라.
실시예 10
DNA 합성 저해제와 강력한 초기/후기 프로모터의 조절 하에 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 합성하는 재조합 Modified Vaccinia Virus Ankara(MVA)의 사용을 기본으로 하는 개선된 구제
선행설명을 근거로, 헬퍼 MVA/T7의 바이러스 DNA 복제를 특이적으로 억제함으로써 본 발명자는: 1. 모든 MVA/T7 성장을 차단하고, 2. 감염된 세포에서 CPE를 더욱 감소시키며, 3. RNA 바이러스의 유전적 구제 효율을 향상시킬 수 있음을 가정 한다. 저해제(사이토신 베타-D-아라비노퓨라노사이드, AraC 및/또는 하이드록시우레아)는 바이러스 DNA 합성, 이어서 바이러스 중기 및 후기 유전자 발현을 차단한다. 강력한 합성 초기/후기 백시니아 바이러스 프로모터의 전사 조절하에 T7 유전자-1의 단일 카피를 함유하는 재조합 MVA/T7(MVGK16)을 공학처리한다. MVGK16이 홍역 미니게놈과 총 길이의 홍역 cDNA의 유전적 구제를 위한 헬퍼 바이러스로서 사용되는 예비 연구는 감염된 세포의 AraC 또는 하이드록시우레아로의 처리가 이종 바이러스의 유전적 구제를 향상시킴을 보여준다(데이타를 도시하지 않았다).
플라스미드 및 바이러스 . 이 연구를 위해 당사자는 백시니아 바이러스 pSC65 발현/재조합 플라스미드를 선택했다. 이 플라스미드는 유전공학 처리된 바이러스 초기/후기 프로모터의 조절하에 외래 유전자의 발현을 허용하고; 이는 또한 바이러스 7.5 K 프로모터의 조절하에 lacZ 선택 마커를 제공한다. T7 유전자-1(Moffatt 등, 1984)은 BamHI 단편으로서 pT7-neo(Dr. Sally Lee, Wyeth-Lederle Vaccines에 의해 제공)로부터 절단되고 pSC65(Chakrabarti 등, 1997)의 BglⅡ 영역으로 아클로닝되어 pGK16.2를 생성한다(도 6). 재조합 플라스미드를 염색 종결자 사이클 서열분석과 377 ABI DNA 서열분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 서열분석한다.
병아리 태 섬유아세포(CEF; Spafas)를 세포마다 0.5 플라크 형성 단위(PFU)와 동등한 감염 다중성(MOI)으로 MVA로 감염시키고 DOTAP 형질감염-촉진제(Boehringer Mannheim)를 사용하여 pGK16.2로 형질감염시킨다. MVA DNA로의 이종성 재조합은 바이러스 tk 유전자의 방해와 T7 유전자-1과 lacZ의 삽입 을 초래한다. 재조합 바이러스(MVGK16)를 연속으로 3회 CEF 세포에서 X-gal 측색 플라크 분석을 사용하여 플라크 정제한다. 재조합 MVGK16은 T7 폴리머라제와 백신 바이러스에 대한 토끼 폴리클로날 항혈청으로 면역염색함으로써 입증되는 것처럼 CEF상 3 연속 라운드 플라크 정제와 4 라운드 증폭에 걸쳐 안정하다(데이타는 도시하지 않음).
유전적 구제 . 상기의 BES/칼슘 포스페이트 과정을 T7 전사를 위한 초기/후기 프로모터를 함유하는 발현 시스템 MVA/GK16으로 반복한다. BES/칼슘 포스페이트를 위한 상기의 구제 프로토콜의 수정은 본원에 설명되어 있다. GK16을 사용하면, DNA 합성 저해제를 이 단계에서 배지에 첨가한다. 사이토신 아라비노사이드(araC) 또는 하이드록시우레아(HU)를 배지에 각각 ㎖당 20 ㎍ 또는 10 mM 첨가한다. 세포를 3% CO2로 세팅한 배양기에서 밤새 배양한다. 형질감염과 열 쇼크는 BES 실시예를 위한 상기 프로토콜에 따라 완료된다. AraC 또는 HU를 MVA/GK16으로 감염된 배양액에 충진한다. 세포를 표준 37℃와 5% CO2로 세팅한 배양기에서 하루 더 배양한다(온도 감수성 바이러스가 구제되면 세포는 신선한 배지를 첨가한 후에 적당한 저온에서 2일 배양할 수 있다). 이어서 형질감염된 세포를 플라크 확장 단계를 위해 수확한다. 형질감염된 세포를 배지로 스크랩핑하고 10 cm 플레이트 또는 Vero 세포(또는 기타 허용되는 세포형 선택)의 50% 융합성 단층을 함유하는 T25 플라스크에 전달한다. 동시배양된 세포를 37℃(또는 적당한 온도)에서 4 내지 6시간 배양한 다음 배지를 교체한다. 형질감염된 세포가 DNA 합성 저해제를 함유하면 이 단계에서 배지의 교 체가 특히 중요하다. 플라크 확장 단계 중에 동시배양액에서 세포 성장의 억제는 바람직하지 않다. 플라크 확장 단계 억제 대략 4 내지 5일 후에, 플라크는 가시화되고 세포를 수확하여 구제된 바이러스의 냉동-해동 용해물 스톡을 생성할 수 있을 것이다.
유전적 구제 실험. 상기 프로토콜은 구제의 포지티브 지표로 다수의 웰에서 일관된 향상을 초래한다. 하기 표 5를 참조하라. 실험은 Vero 세포에서의 재조합 바이러스의 1회 계대 후에 플러스(+) 또는 마이너스(-)로 기록된다. 포지티브 웰에서 플라크 수는 1 내지 50 범위이다. 모든 실험은 MVA/T7-GK16이 사용될 때 밤새 형질감염과 후속 24시간 배양 중에 배지에서 AraC 20 ug/㎖를 함유한다. 실험 9일에, 10 mM 하이드록시우레아가 araC DNA 합성 저해제를 대신한다.
샘플 1일 9일 10일 16일 23일 30일 T7 공급원
1 + + - - - + MVA/T7
2 - + - + + + MVA/T7
3 + - - _ - + MVA/T7
4 - - - - - + MVA/T7
5 + + - - - + MVA/T7
6 - + - - - - MVA/T7
7 + + + - + + MVAGK16
8 + + + + + + MVAGK16
9 + - + _ + - MVAGK16
10 + + + - + + MVAGK16
11 + + + + + + MVAGK16
12 + + - - + + MVAGK16
본원에 참조로 인용되는 참조문헌 리스트가 하기에 제공된다.


참조문헌
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Figure 112000025596483-pct00002
Figure 112000025596483-pct00003
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Figure 112000025596483-pct00005
Figure 112000025596483-pct00006
Figure 112000025596483-pct00007

Claims (50)

  1. a) 숙주 세포에서 (ⅰ) 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사 벡터, 및 (ⅱ) 캡시드화, 전사 및 복제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 1 이상의 분리된 핵산 분자(들)를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 구제 조성물의 형질감염을 벡터의 동시발현과 재조합 바이러스의 생산을 허용하기에 충분한 조건하에 배지에서 실행하는 단계; 및
    b) 재조합 바이러스의 회수를 증가시키기에 충분한 조건하에서 37 내지 50℃의 효과적인 열 쇼크 온도로 형질감염된 구제 조성물을 가열하는 단계
    를 포함하는 재조합 모노네가비랄레스 바이러스의 생산방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 재조합 바이러스를 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 효과적인 열 쇼크 온도가 38℃ 내지 49℃ 범위인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 효과적인 열 쇼크 온도가 39℃ 내지 48℃ 범위인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 효과적인 열 쇼크 온도가 41℃ 내지 47℃ 범위인 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 형질감염된 세포를 5 내지 300분 동안 효과적인 열쇼크 온도로 처리하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 형질감염된 세포를 15 내지 240분 동안 효과적인 열 쇼크 온도로 처리하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 형질감염된 세포를 15 내지 200분 동안 효과적인 열 쇼크 온도로 처리하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, (b) 단계 후에 형질감염된 구제 조성물을 Vero 세포의 적 어도 한 층에 전달하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, Vero 세포의 층이 단층인 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 모노네가비랄레스 목의 RNA 바이러스가 인간, 소 또는 쥐 바이러스인 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 1 이상의 게놈 또는 안티-게놈원의 키메라인 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 약독화 바이러스 또는 감염성 형태의 바이러스를 암호화하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 감염성 형태의 바이러스를 암호화하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 약독화 바이러스를 암호화하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 모노네가비랄레스 목의 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 감염성, 약독화 바이러스를 암호화하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, RNA 바이러스가 파라믹소비리대 과의 바이러스인 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, RNA 바이러스가 랩도비리대 과의 바이러스인 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, RNA 바이러스가 필로비리대 과의 바이러스인 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, RNA 바이러스가 MV(홍역 바이러스; Measles Virus), RSV(인간 호흡기세포융합 바이러스; Human Respiratory Syncytial Virus), PIV(인간 파라인플루엔자 바이러스; Human Parainfluenza Virus) 및 BPV(소 파라인플루엔자 바이러스; Bovine Parainfluenza Virus)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이러스인 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, RNA 바이러스가 바이러스 MV(Measles Virus)인 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 RSV 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하고 캡시드화, 전사 및 복제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질이 N(뉴클레오캡시드; Nucleocapsid), P(인단백질; Phosphoprotein), L(폴리머라제; Polymerase) 및 M2(RSV-encoded transcription elongation factor)인 방법.
  25. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 MV의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하고 캡시드화, 전사 및 복제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질이 N, P 및 L인 방법.
  26. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 PIV-3의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하고 캡시드화, 전사 및 복제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질이 NP(PIV-3의의 eNcapsidating Protein), P 및 L인 방법.
  27. 제 1 항에 있어서, 숙주 세포가 원핵세포인 방법.
  28. 제 1 항에 있어서, 숙주 세포가 진핵세포인 방법.
  29. 제 1 항에 있어서, 숙주 세포가 척추동물 세포인 방법.
  30. 제 1 항에 있어서, 숙주 세포가 대장균인 방법.
  31. 제 1 항에 있어서, 숙주 세포가 인간 세포로부터 유도되는 방법.
  32. 제 1 항에 있어서, 숙주 세포가 태아 세포로부터 유도되는 방법.
  33. 제 1 항에 있어서, 숙주 세포가 태아 신장 세포로부터 유도되는 방법.
  34. 삭제
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  40. 삭제
  41. 삭제
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  44. 제 1 항에 있어서, 전사 벡터가 T7 폴리머라제 유전자를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제 1 항에 있어서, 구제 조성물이 변형되지 않거나 변형된 헬퍼 바이러스를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 헬퍼 바이러스가 비단편화 네가티브-센스 일본쇄 RNA 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사를 위한 T7 폴리머라제 유전자를 제공하고 구제 조성물이 변형된 헬퍼 바이러스를 추가로 포함하는 방법.
  47. 제 45 항에 있어서, T7 유전자가 후기 프로모터 또는 초기/후기 프로모터의 조절 제어하에 있는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, T7 유전자가 초기/후기 프로모터의 조절하에 있는 방법.
  49. 제 44 항에 있어서, 형질감염이 DNA 합성 저해제의 존재하에 실행되는 방법.
  50. 제 1 항에 있어서, 형질감염을 위한 숙주 세포가 Vero 세포인 방법.
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