MXPA00011420A

MXPA00011420A - Metodos novedosos para el rescate de los virus del arn

Info

Publication number: MXPA00011420A
Authority: MX
Inventors: Christopher L Parks; Mohinderjit S Sidhu; Stephen A Udem; Gerald R Kovacs
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1998-06-03
Filing date: 2000-11-21
Publication date: 2001-04-01
Also published as: IL140033A; EP1090108B1; JP2002517189A; AU761234B2; CA2333313C; BR9910929A; KR100619319B1; CN1303426A; EP1995310B1; JP4625915B2; CN1196780C; MX228492B; EP1995310A1; EP1090108A1; CA2333313A1; AU4414499A; KR100579662B1; KR20060021943A; DK1090108T3; DE69943215D1

Abstract

La presente invención se refiere a métodos mejorados para producir virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentados, del Orden designado virus Mononegavirales, que incluyen las modalidades que se refieren a los métodos de producción de tales virus como virus atenuados y/o infecciosos, tales como el virus del Sarampión (MV) y el virus sincitial respiratorio (RSV). Un método para producir un virus recombinante del Orden Mononegavirales comprende (a) en al menos una célula huésped, conducir o llevar a cabo la ftransfección de una composición de rescate la cual comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula deácido nucléico aislada la cual comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del Orden Mononegavirales y (ii) al menos un vector de expresión el cual comprende al menos una mólecula deácido núcleico aislada que codifica las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación;en una célula huésped bajo condiciones suficientes para permitir la coexpresión de estos vectores y la producción del virus recombinante;(b) calentar la composición de rescate transfectada a una temperatura de choque termino efectiva bajo condiciones suficientes para incrementar la recuperación del virus recombinante;y opcionalmente, (c) colectar el virus recombinante resultan

Description

MÉTODOS NOVEDOSOS PARA EL RESCATE DE LOS VIRUS DEL ARN Campo de la Invención Esta invención se refiere a métodos mejorados para producir virus de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentados, del Orden designado de los virus Mononegavirales. Las modalidades preferidas se refieren a métodos de producción de tales virus como virus atenuados y/o infecciosos, tales como el virus del Sarampión (MV) , el virus sincitial respiratorio (RSV) y el virus de la parainfluenza Humana (PTV) . Los virus recombinantes pueden ser preparados a partir de clones de ADNc, y, en consecuencia, se pueden obtener cambios definidos en el genoma.

Antecedentes de la Invención Los virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, con envoltura, son organizados y expresados de manera única. El ARN genómico de los virus de una sola hebra, de sentido negativo, sirve para dos funciones de molde en el contexto de una nucleocápsida: como un molde para la síntesis de los ARNs mensajeros (ARNms) y como un Ref.124996 molde para la síntesis de la hebra de antigenoma (+) . Los virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, codifican y empacan su propia Polimerasa de ARN dependiente del ARN. Los ARNs mensajeros son sintetizados solamente una vez que el virus se ha introducido al citoplasma de la célula infectada. La replicación viral ocurre después de la síntesis de los ARNms y requiere la síntesis continua de las proteínas virales. La hebra antigenoma (+) sintetizada recientemente sirve como el molde para generar copias adicionales del ARN genómico de una hebra (-) . El complejo de polimerasa actúa y logra la transcripción y replicación por el acoplamiento de las señales de actuación cis en el extremo 3' del genoma, en particular, la región promotora. Los genes virales son transcritos entonces desde el molde del genoma unidireccionalmente desde su extremo 3' hasta su extremo 5' . Siempre existe menos ARNm hecho de los genes corriente abajo (por ejemplo, el gen de polimerasa (L) ) con relación a sus externos corriente arriba (es decir, el gen de nucleoproteína (N) ) . Por lo tanto, siempre existe un gradiente de abundancia del ARNm de acuerdo con la posición de los genes con relación al extremo 3' del genoma. El análisis genético molecular de tales virus de ARN no segmentados tuvo una dificultad probada hasta hace poco a causa de que ARN genómico puro o el ARN producido intracelularmente a partir de un plásmido transfectado es no infeccioso (Boyer y Haenni, 1994) . Este problema técnico ha sido superado por medio del desarrollo de la tecnología de rescate del ADNc inteligente que permite el aislamiento de los virus del ARN de hebra negativa, no segmentados, recombinantes (Pattnai y colaboradores, 1992; Schnell, Mebatsion, y Conzelmann, 1994). Las técnicas para el rescate de estos virus de hebra negativa diferentes siguen un tema común, cada uno teniendo componentes de requisito distintivos para el rescate exitoso (Barón y Barrett, 1997; Collins y colaboradores, 1995; Garcin y colaboradores, 1995; Hoffman y Banerjee, 1997; Lawson y colaboradores, 1995; Radecke y colaboradores, 1995; Schneider y colaboradores, 1997; He y colaboradores, 1997; Schnell, Mebatsion y Conzelmann, 1994; Whelan y colaboradores, 1995) . Después de la transfección de un plásmido de ADNc genómico, una copia exacta del ARN del genoma es producido por la acción combinada de la polimerasa del ARN del fago T7 y una secuencia del ribozima codificada por el vector que segmenta el ARN para formar las terminales 3' . Este ARN es empacado y replicado por las proteínas virales suministradas inicialmente por los plásmidos de expresión cotransfectados. En el caso del sistema de rescate del virus del Sarampión (MV) (Radecke y colaboradores, 1995), una línea celular estable fue preparada, la cual expresa la polimerasa del ARN de T7 y las proteínas N (proteína de la nucleocápsida) y las proteínas P (subunidad de la polimerasa de la fosfoproteína) de las proteínas MV. Así, el rescate de MV puede ser logrado por la cotransfección de esta línea celular con un clon del ADNc genómico de MV que contiene un promotor de la polimerasa de T7 colocado apropiadamente y un plásmido de expresión que contiene el gen de la polimerasa de MV (L) . El rescat exitoso del ADNc del virus del sarampión requiere aparentemente que numerosos eventos ocurran después de la transfección, incluyendo: 1) la síntesis de longitud completa, exacta, del ARN del genoma por la polimerasa del ARN de T7 y el procesamiento del extremo 3' por la secuencia del ribozima; 2) la síntesis de las proteínas N, P, y L virales a los niveles apropiados para iniciar la replicación; 3) el empaque de novo del ARN genómico en las estructuras de la nucleocápsida competentes en la replicación y activas transcripcionalmente; y 4) la expresión de los genes virales a partir de las nucleocápsidas formadas recientemente a niveles suficientes para que la replicación esté en progreso. No se ha determinado exactamente que pasos pueden ser limitativos de la velocidad en el rescate exitoso, pero la eficiencia del rescate puede ser mejorada potencialmente por la estimulación de cualquiera de los pasos mencionados anteriormente . La presente invención se busca que mejore la capacidad para recuperar los virus de ARN recombinantes, tales como el MV. Se admite que la capacidad para obtener el virus de replicación del rescate puede disminuir cuando el polinucleótido, el cual codifica el genoma natural y el antigenoma de un virus deseado, es modificado crecientemente. En consecuencia, la presente invención busca superar tal obstáculo puesto que estos métodos pueden mejorar substancialmente la probabilidad de obtener un virus recombinante deseado a partir de un procedimiento de rescate.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un método para producir un virus recombinante del Orden de los Mononegavirales que comprende: (a) en al menos una célula huésped, conducir la transfección de una composición de rescate la cual comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula de ácido nucleico aislada la cual comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del Orden de los Mononegavirales y (ii) al menos un vector de expresión el cual comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislada que codifica las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación; en una célula huésped bajo las condiciones suficientes para permitir la coexpresión de estos vectores y la producción del virus recombinante; (b) calentar la composición de rescate transfectada a una temperatura de choque térmico efectiva bajo condiciones suficientes para incrementar la recuperación del virus recombinante; y opcionalmente, (c) colectar el virus recombinante resultante. Un método adicional se refiere a la producción de virus Mononegavirales recombinantes; a) en al menos una célula huésped, llevar a cabo la transfección de una composición de rescate la cual comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del orden de los Mononegavirales y (ii) al menos un vector de expresión el cual comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislado la cual comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación bajo condiciones suficientes para permitir la coexpresión de los vectores y la producción del virus recombinante; b) transferir la composición de rescate transfectada sobre al menos una capa de células Vero; y opcionalmente, colectar el virus recombinante. Los aspectos adicionales de la presente invención se refieren a métodos que combinan los pasos de no superposición de los métodos anteriores, en compañía de las modalidades preferidas, para crear métodos mejorados adicionalmente. En las modalidades alternativas, esta invención proporciona un método para fabricar virus de ARN del Orden de los Mononegavirales los cuales son atenuados, infecciosos o ambos. Las modalidades adicionales se refieren a los virus producidos a partir de los métodos de esta invención, así como las vacunas que contienen tales virus. Se debe señalar que tales virus pueden ser humanos o no humanos, tales como los de murino o de bovino. Las modalidades identificadas anteriormente y las modalidades adicionales, las cuales son descritas con detalle aquí, representan los objetos de esta invención.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra un diagrama de flujo del procedimiento de rescate modificado. Este procedimiento incluye el uso de un paso de choque térmico y la transferencia de las células transfectadas a una monocapa de las células Vero. La Figura 2 es un autorradiografía que muestra el efecto del choque térmico sobre la expresión del gen de minirreplicón del Ejemplo 4 a través del uso de los ensayos de CAT. La Figura 3 es un autorradiografía que muestra los resultados de los ensayos de CAT para los experimentos de transfección del ARN del minirreplicón del Ejemplo 5. La Figura 4A es un Manchado de Western utilizando un anticuerpo específico para una etiqueta de epítope, el cual es expresado a partir de un vector de expresión de CMV, en los experimentos del Ejemplo 6 que se refieren a la estimulación de la expresión del gen de minirreplicón por los hsp70. La Figura 4B es un autorradiografía que muestra los resultados del ensayo de CAT a partir de la cotransfección de las células 293-3-46 con el vector de expresión de hsp70, el ADN del minirreplicón y el plásmido de expresión L. La Figura 5 es una tabla (Tabla 1) que muestra los conteos de la placa de seis experimentos de rescate independientes que fueron efectuados para probar el efecto del choque térmico como se describió en el Ejemplo 2. La ventaja del procedimiento del choque térmico es mostrado claramente . La Figura 6 es un diagrama del plésmido pG 16.2 que contiene el gen-1 de T7 del Ejemplo 10.

Descripción Detallada de la Invención Como se señaló brevemente, la presente invención se refiere a un método novedoso de producción del virus del ARN recombinante. Tales métodos en la técnica son referidos como el "rescate" de los métodos genéticos inversos. Los métodos de rescate ejemplares para diferentes virus de hebra negativa, no segmentados, son descritos en las siguientes publicaciones referidas: Barón y Barrett, 1997; Collins y colaboradores, 1995; Garcin y colaboradores, 1995; He y colaboradores, 1997; Hoffman y Banerjee, 1997; Lawson y colaboradores, 1995; Radecke y Billeter, , 1997; Radecke y colaboradores, 1995; Schneider y colaboradores, 1997; Schnell, Mebatsion, y Conzelmann, 1994; Whelan y colaboradores, 1995. Las publicaciones adicionales sobre el rescate incluyen la solicitud de patente internacional publicada WO 97/06270 para MV y otros virus de. la subfamilia Paramyxovirinae, y para el rescate de RSV, la solicitud de patente Internacional publicada WO 97/12032; estas publicaciones son incorporadas aquí para referencia.

Después de la transfección de un plásmido de ADNc genómico, una copia exacta del ARN del genoma es producida por la acción combinada de la polimerasa del ARN del fago T7 y una secuencia de ribozima codificada con el vector que segmenta el ARN para formar las terminales 3' . Este ARN es empacado y replicado por las proteínas virales suministradas inicialmente por los plásmidos de expresión cotransfectados. En el caso del sistema de rescate de MV (Radecke y colaboradores, 1995) , una línea celular estable fue preparada, la cual expresa la polimerasa del ARN de T7 y las proteínas N (proteína de la nuclecápsida) y P (fosfoproteína) de MV. Por consiguiente, el rescate de MV puede ser logrado por la cotransfección de esta línea celular con un clon del ADNc genómico de MV que contiene un promotor de polimerasa de T7 colocado apropiadamente y un plásmido de expresión que contiene el gen de polimerasa de MV (L) . Uno de los primeros rescates novedosos se describió para el virus del Sarampión. El virus del sarampión (MV) es un miembro del género de Morbillivirus en la familia Paramyxoviridae, y de manera semejante a todos los elementos de esta familia, el MV es un virus envuelto que contiene un genoma de ARN de sentido negativo, no segmentado (Lamb y Kolakofsky, 1996) . El análisis genético molecular de esta familia de virus tuvo una dificultad probada hasta hace poco, a causa de que el ARN genómico puro o el ARN producido intracelularmente a partir de un plásmido transfectado no es infeccioso (Boyer y Haenni, 1994). Este problema técnico ha sido superado por medio del desarrollo de la tecnología de rescate del ADN inteligente o ingeniosa que permite el aislamiento de los virus de ARN de hebra negativa, recombinante (Pattnaik y colaboradores, 1992; Radecke y Billeter, 1997; Schnell, Mebatsion, y Conzelmann, 1994). Una revisión breve de los pasos básicos de estos métodos de rescate y las composiciones en los mismos, se describe de manera adicional en seguida. La transcripción y replicación de los genomas virales del ARN de una sola hebra, de sentido negativo, es lograda por medio de la actividad enzimática de una proteína multimérica que actúa sobre el núcleo de ribonucleoproteína (nucleocápsida) . El ARN genómico pµro no puede servir como un molde. En lugar de esto, estas secuencias genómicas son reconocidas solamente cuando las mismas son encapsidadas completamente por la proteína N en la estructura de la nucleocápsida. Es solamente en este contexto que las secuencias promotoras terminales genómicas y antigenómicas se reconoce que inician las rutas de transcripción o replicación.

Todos los paramyxovirus requieren tres proteínas virales N, P y L, para que procedan estas rutas de la polimerasa. Los pneumovirus, incluyendo el RSV, también requieren el factor de alargamiento de la transcripción, M2, para que la ruta transcripcional proceda eficientemente. Los cofactores adicionales también pueden desempeñar un papel, incluyendo quizás las proteínas de NS1 y N?2 codificadas por el virus, así como quizás • las proteínas codificadas por la célula del huésped. Brevemente, todos los métodos de rescate de los Mononegavirales pueden ser resumidos como sigue: Cada uno requiere un equivalente del ADN clonado del genoma viral deseado colocado entre un promotor de la polimerasa de ARN dependiente del ADN, adecuado (por ejemplo, el promotor de la polimerasa del ARN de T7) y una secuencia del ribozima de autosegmentación (por ejemplo el ribozima delta de la hepatitis) el cual es insertado en un vector de transcripción adecuado (por ejemplo un plásmido bacteriano propagable) . Este vector de transcripción provee el molde del ADN manipulable fácilmente a partir del cual la polimerasa del ARN (por ejemplo, la polimerasa del ARN de T7) puede transcribir fielmente una copia del ARN de-, una sola hebra del antigenoma (o genoma) viral con las terminales 5' y 3', precisas, o casi precisas. La orientación de la copia del ADN genómico viral y las secuencias del promotor de flanqueo y del ribozima determinan si los equivalentes de ARN del genoma o antigenoma son transcritos. También son requeridas para el rescate de la nueva progenie del virus las proteínas de actuación trans específicas para el virus necesarias para encapsidar las transcripciones del ARN del genoma o antigenoma viral de una sola hebra, puro, en moldes de nucleocápsida funcionales: la proteína de la nucleocápsida viral (N o NP), la fosfoproteína asociada con la p'olimerasa (P) y la proteína de la polimerasa (L) . Estas proteínas comprenden la polimerasa del ARN dependiente del ARN viral, activo, la cual debe acoplarse con este molde de la nuclecápsida para lograr la transcripción y la replicación. Ciertos virus seleccionados para el rescate pueden requerir proteínas adicionales, tales como un factor de alargamiento de la transcripción. En consecuencia, en cada método se podría emplear una composición de rescate. Tales composiciones son bien conocidas en la técnica. La siguiente transcripción no es limitativa de las composiciones de rescate las cuales pueden ser empleadas en los métodos de esta invención. La composición de rescate comprende (i) un vector de. la transcripción que comprende una molécula de ácido nucleico aislada la cual comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del Orden de los Mononegavirales y (ii) al menos un vector de expresión el cual comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislada que codifica las proteínas de accionamiento trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación; en una célula huésped bajo condiciones suficientes para permitir la coexpresión de estos vectores y la producción del virus recombinante. - La molécula del ácido nucleico aislado comprende una secuencia que codifica al menos un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del Orden de los Mononegavirales. Basado en la reclasificación revisada en 1993 por el Comité Internacional sobre la Taxonomía de los virus, un Orden, designado Mononegavirales, ha sido establecido. Este Orden contiene tres familias de virus envueltos con los genomas de ARN no segmentados, de una sola hebra, de polaridad negativa (sentido negativo) . Estas familias son Paramyxoviridae, Rhabdoviridae y Filoviridae. La familia de Paramyxoviridae ha sido dividida adicionalmente en dos subfamilias. Paramyxovirinae y Pneumovirinae. La subfamilia Paramyxovirinae contiene tres géneros, Respirovirus (conocida inicialmente como Paramyxovirus), Rubulavirus y Morbillivirus. La subfamilia Pneumovirinae contiene el género Pneumovirus.

La nueva clasificación está basada en los criterios morfológicos, la organización del genoma viral, las actividades biológicas y la capacidad de relación de la secuencia de los genes y los productos genéticos. La característica distintiva morfológica entre los virus envueltos para la subfamilia de Paramyxovirinae es el tamaño y la forma de las nucleocápsidas (diámetro de 18 nm, 1 µm de longitud, espaciado de 5.5 nm) , los cuales tienen una simetría helicoidal a mano izquierda. Los criterios biológicos son: 1) la reactividad cruzada entre los elementos del género, y 2) la presencia de la actividad de la neuraminidasa en los géneros Respirovirus, Rubulavirus y su ausencia en el género Morbillivirus. Además, las variaciones en el potencial de codificación del gen P son consideradas, como lo es la presencia de un gen extra (SH) en los Rubulavirus. Los pneumorivus pueden ser distinguidos de los Paramyxovirinae morfológicamente a causa de que los mismos contienen nucleocápsidas estrechas. Además, los pneumovirus tienen diferencias principales en el número de cistrones de codificación de las proteínas (10 en los neumovirus contra 6 en los Paramyxovirinae) y una proteína de fijación . (G) que es muy diferente de los Paramyxovirinae. Aunque los paramyxovirus y pneumovirus tienen seis proteínas que parece que corresponden en su función (N, P, M, G/H/HN, F y L) , solamente las dos últimas proteínas exhiben una capacidad de relación de secuencias significativas entre las dos subfamilias. Varias proteínas pneumovirales carecen de contrapartes en la mayoría de los paramyxovirus, especialmente las proteínas no estructurales NS1 y NS2, la proteína hidrofóbica pequeña SH, y una segunda proteína M2. Algunas proteínas paramyxovirales, especialmente C y V carecen de contrapartes en los pneumovirus. Sin embargo, la organización genómica básica de los pneumovirus y los paramyxovirus es la misma. Esto mismo es verdadero para los rhabdovirus y los filovirus. La Tabla 1 presenta la clasificación taxonómica común de estos virus, junto con los ejemplos de cada género.

Tabla 1 Clasificación de los Virus del ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentados, del Orden de los Mononegavirales Familia Paramyxoviridae Subfamilia Paramyxovirinae Género Pespirovirus (conocido inicialmente como Paramyxovirus) Virus Sendai (tipo 1 del virus de la parainfluenza del ratón) tipos 1 y 3 del Virus de parainfluenza humana (PIV) tipo 3 del virus de la parainfluenza del bovino Género Rubulavirus Virus 5 del simio (SV5) (tipo 2 del virus de la parainfluenza Canina) Virus de las paperas Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (Paramixovirus 1 de las aves) virus de parainfluenza humana (tipos 2, 4a y 4b de PIV) Género Morbillivirus Virus del sarampión (MV) Morbillivirus del Delfín virus del moquillo canino (CDV) virus de la peste de los rumiantes pequeños) (Peste-des-petits-ruminants) virus del moquillo de los focinos virus de la fiebre biliosa hematúrica Subfamilia Pneumovirinae Género Pneumovirus virus sincitial respiratorio humano (RSV) virus sincitial respiratorio de bovino Virus de Pneumonía de los ratones virus de rhinotracheitis del pavo Familia Rhabdoviridae Género Lyssavirus Virus de la rabia Genero de Vesiculovirus Virus de estomatitis vesicular (VSV) Género Ephemerovirus Virus de la fiebre efímera de los bovinos Familia Filoviridae Género Filovirus Virus Marburg Como se señaló anteriormente, la molécula del ácido nucleico aislada comprende una secuencia la cual codifica al menos un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del Orden de los Mononegavirales. La molécula de ácido nucleico aislada puede comprender una secuencia de polinucleótidos la cual codifica un genoma, antigenoma o una versión modificada de la misma. En una modalidad, el polinucleótido codifica un promotor enlazado operativamente, el genoma o el antigenoma deseado y un terminador transcripcional. En una modalidad preferida de esta invención el polinucleótido codifica un genoma o antigenoma que ha sido modificado a partir de un virus de ARN del tipo silvestre por una inserción, rearreglo, deleción o substitución de nucleótidos. Se admite que la capacidad para obtener un virus de replicación de rescate puede disminuir cuando el polinucleótido que codifica el genoma natural y el antigenoma es modificado crecientemente. En tales casos, la presente invención es particularmente valiosa puesto que estos métodos pueden mejorar substancialmente • la probabilidad de rescate del virus recombina'nte. La secuencia del genoma o antigenoma puede ser derivada de un virus humano o no humano. La secuencia de polinucleótidos también, puede codificar un genoma quimérico formado de la unión de manera recombinante de un genoma o antigenoma desde dos o más fuentes. Por ejemplo, uno o más genes del grupo A del RSV son insertados en lugar de los genes correspondientes del grupo B del RSV; o uno o más genes de los bovinos PIV (BPIV) , PIV-1 o PIV-2 son insertad s en lugar de los genes correspondientes de PIV-3; o RSV puede reemplazar los genes de PIV y etcétera. En las modalidades adicionales, el polinucleótido codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN del Orden de los Mononegavirales el cual es un virus humano, de bovino a de murino. Puesto que los virus recombinantes formados por los métodos de esta invención pueden ser empleados como herramientas en los estudios de búsqueda de diagnóstico o como vacunas terapéuticas o profilácticas, el polinucleótido también puede codificar una forma del tipo silvestre o una forma atenuada del virus de ARN seleccionado. En muchas modalidades, el polinucleótido codifica una forma infecciosa, atenuada, del virus de ARN. En las modalidades preferidas particularmente, el polinucleótido codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, - no segmentado, del orden de los Mononegavirales que 'tiene al menos una mutación atenuante en la región promotora genómica 3' y que tiene al menos una mutación atenuante en el gen de la polimerasa del ARN, como se describió por la solicitud de patente internacional publicada WO 98/13501, la cual es incorporada por el presente para referencia. Las diversas necesidades de producción de un virus recombinante pueden variar. En consecuencia, se pueden seleccionar uno o más virus de cualquier Familia particular: la Familia Paramyxoviridae, la Familia Rhabdoviridae o la Familia Filoviridae. Además de las secuencias de polinucleótidos que codifican las formas modificadas del genoma y antigenoma deseados como se describieron anteriormente, la secuencia de polinucleótidos también puede codificar el genoma o antigenoma deseados en compañía de uno o más genes heterólogos. Los genes heterólogos pueden variar cuando se desee. Dependiendo de la aplicación del virus recombinante deseado, el gen heterólogo puede codificar un cofactor, citosina (tal como una interleucina) , un epítope del Auxiliador T, un marcador de la restricción, adyuvante o auxiliar, o una proteína de un patógeno microbiano diferente (por ejemplo virus, bacteria y hongo) , especialmente las proteínas capaces de ocasionar una respuesta inmune protectora. El gen heterólogo también puede ser utilizado para proveer agentes los cuales son utilizados para la terapia genética. En las modalidades preferidas, los genes heterólogos codifican las citosinas, tales como la interleucina-12, las cuales son seleccionadas para mejorar las características profilácticas o terapéuticas del virus recombinante. En vista de algunas de las necesidades actuales de vacunas mejoradas y de una flexibilidad incrementada en el tratamiento de los patógenos virales, la molécula de ácido nucleico aislada comprende un polinucleótido el cual codifica un virus de ARN seleccionado del grupo que consiste de los virus de CDV, VSV, MV, RSV, PIV, de las paperas y el virus de la rabia. Las preferencias adicionales entre este conjunto de virus del ARN es. el grupo que consiste de MV, RSV, PIV y BPV. Para las modalidades que emplean virus atenuados, numerosas formas de tales virus son bien conocidas en la técnica, en compañía de los métodos básicos para introducir las mutaciones atenuantes para generar un virus modificado. Se utilizan medios convencionales, tales como la mutagénesis química durante el crecimiento del virus en los cultivos celulares a los cuales un mutágeno químico ha sido agregado, seguido por la selección del virus que ha sido sometido a una pasada a una temperatura subóptima para seleccionar mutaciones adaptadas al frío y/o sensibles a la temperatura, la identificación de los virus mutantes que producen placas pequeñas en el cultivo celular, y el paso a través de huéspedes heterólogos para seleccionar las mutaciones de la gama de los huéspedes. Un medio alternativo para la introducción de mutaciones atenuantes comprende fabricar mutaciones predeterminadas utilizando la mutagénesis dirigida al sitio. Se pueden introducir una o más mutaciones. Estos virus son seleccionados entonces para la atenuación de su actividad biológica en un modelo de animal. Los virus atenuados son sometidos al secuenciamiento de nucleótidos para localizar los sitios de las mutaciones atenuantes. Las diversas proteínas de actuación trans requeridas para efectuar el rescate son bien conocidas en el arte. Las proteínas de actuación trans requeridas para el rescate del virus del sarampión son la proteína N de encapsidación, y las proteínas complejas de la polimerasa, P y L. Para PIV-3, la proteína de encapsidación está diseñada como NP, y las proteínas del complejo de la polimerasa también son referidas como P y L. Para el RSV, las proteínas de actuación trans especificadas para el virus incluyen N, P y L, más una proteína adicional, M2, el factor de alargamiento de la transcripción codificada por RSV. Las proteínas de actuación trans viral pueden ser generadas a partir de uno o más vectores de expresión (por ejemplo plásmidos) que codifican las proteínas requeridas, aunque algunas o la totalidad de las proteínas de actuación trans requeridas pueden ser producidas dentro de la célula huésped seleccionada para que contenga y exprese estos genes específicos del virus y los productos genéticos como agentes transformantes estables. La selección del vector de expresión así como la molécula de ácido nucleico aislada la cual codifica las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación pueden variar dependiendo de la selección del virus deseado. Los vectores de la expresión son preparados para permitir su coexpresión con el (los) vector(es) de la transcripción en la célula huésped y la producción del virus recombinante bajo las condiciones seleccionadas.

Las circunstancias típicas (aunque no necesariamente exclusivas) para el rescate incluyen medios de células de mamífero apropiado en los cuales la polimerasa de T7 está presente para impulsar la transcripción del ARN de una sola hebra antigenómica (o-genómica) a partir del vector de transcripción que contiene el ADNc genómico viral. Ya sea cotranscripcionalmente o brevemente después de esto, esta transcripción - del antigenoma (o genoma) viral es encapsidada en los moldes funcionales por la proteína de la nucleocápsida y está unida o acoplada por los componentes de la polimerasa requeridos producidos concurrentemente a partir de los plásmidos de expresión cotransfectados que codifican las proteínas de actuación trans específicas para el virus requerido. Estos eventos y procesos conducen a la transcripción prerrequerida de los ARNms virales, la replicación y amplificación de los nuevos genomas, y, por medio de esto, a la producción de la progenie viral novedosa, es decir, al rescate. Para el rescate de los virus de la rabia, de VSV, de SV5 y de Sendai, la polimerasa de T7 es provista por el virus VTF7-3 de vaccinia recombinante. Este sistema, .sin embargo, requiere que el virus rescatado sea separado del virus de vaccinia por medios físicos o bioquímicos o por el paso repetido en las células o los tejidos que no son un buen huésped para el poxvirus. Para el rescate del ADNc de MV, este requerimiento es evitado creando una línea celular que expresa la polimerasa de T7, así como las proteínas virales N y P. El rescate es logrado por la transfección del vector de expresión del genoma y el vector de expresión del gen L en la línea celular auxiliadora. Preferentemente, la línea celular auxiliadora produce un virus pequeño o sin progenie en las células de mamífero y puede ser explicado para el rescate del virus o los virus de ARN deseados. El virus auxiliador puede ser utilizado como una fuente de la polimerasa T7, por ejemplo MVA/T7 (descrita posteriormente) . Después de la expresión simultánea de las proteínas de encapsidación necesarias, el ARN viral antigenómico de longitud total, sintético, es encapsidado, replicado y transcrito por las proteínas de la polimerasa virales y los genomas replicados son empacados en los viriones infecciosos. Además de tales antigenomas, los análogos de los genomas han sido rescatados ahora exitosamente para Sendai y PIV-3 (Kato y colaboradores, y la solicitud de patente internacional publicada WO 98/53708) . Como se señaló anteriormente, el MVA/T7 .(un mutante atenuado del virus de vaccinia) es un ejemplo de un virus auxiliador modificado el cual puede ser empleado en el rescate de un virus de ARN. En general, el virus auxiliador modificado es un virus el cual ha sido alterado desde un virus del tipo silvestre para exhibir una actividad viral reducida, o ninguna actividad, en las líneas celulares no permisivas. Las características del MVA establecen las características preferidas en un virus auxiliador modificado. La cepa MVA del virus de vaccinia proporciona una alternativa atractiva a las cepas más citopáticas. El MVA fue desarrollado durante el programa de erradicación de la viruela en Turquía y Alemania' por las pasadas en serie (>570) del virus de Ankara de vaccinia citopático en los fibroblastos del embrión de los pollos. El mismo se ha degradado descendentemente a un patógeno del Nivel de Bioseguridad, y puede ser utilizado por los trabajadores de laboratorio no vacunados. El MVA contiene seis deleciones mayores (> 15% del» genoma) conduciendo a una pérdida de arriba de 30,000 pares base (Antoine y colaboradores, 1998). El MVA se replica en un número limitado de las líneas celulares (Carrol y Moss, 1997; Drexler y colaboradores, 1998), y es bloqueado en una etapa final en la morfogénesis viral en las células no permisivas (Sutter y Moss, 1992) . Además, el MVA no induce el efecto citopático severo (CPE) observado con las cepas del tipo silvestre. Una ventaja principal del MVA sobre otros poxvirus restringidos al huésped (por ejemplo NYVAC, ALVAC, y fowlpox o epitelioma contagioso) es que la replicación del ADN viral, y por consiguiente la transcripción de casi todas las clases de genes (inicial, intermedio y final) no está dañada. Los genes extraños pueden ser expresados eficientemente bajo todas las clases de los promotores. Dos MVAs recombinantes que expresan el gen 1 de T7 del bacteriófago han sido reportados. Los virus híbridos de MVA/T7 contienen una copia integrada del gen 1 de T7 bajo la regulación de ya sea el promotor inicial/final débil de 7.5K (Sutter y colaboradores, 1995) o el promotor final fuerte de 11K (Wyatt y colaboradores, 1995) . Ambos han sido utilizados como virus auxiliadores en los sistemas de expresión temporal para rescatar genéticamente los virus de ARN de una hebra negativa (Collins y colaboradores, 1995; Leyrer y colaboradores, 1998; Schneider y colaboradores, 1997; Barron, M.D. y Barrett, T. Rescue of rinderpest virus from a cloned cADN. Journal of Virology. 71 (2) : 1265-71, febrero de 1997; Durbin, A. P., Hall, S. L., Siew, J. W., Whitehead, S.S., Collins, P.L., y Murphy, B. R. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from ADNc. Virology, 235(2): 323-332, 1997; He y colaboradores, 1997) ) . A pesar de los beneficios de emplear un virus auxiliador, tal como un virus auxiliador semejante a MVA/T7, el ciclo de replicación concurrente de MVA/T7 u otro virus auxiliador puede suprimir los eventos genéticos que son requeridos para el rescate de un virus recombinante heterólogo. En consecuencia, en las modalidades preferidas de esta invención, cuando un virus auxiliador es empleado, también se utiliza un inhibidor de la síntesis del ADN. Esta modalidad conduce a una mejora del sistema de rescate. Un inhibidor de la síntesis del ADN permite que ocurra el rescate mientras que también se inhibe (o se inhibe substancialmente) la síntesis del ADN del virus auxiliador. Los inhibidores de la síntesis de ADN ejemplares, tales como AraC (citosina beta-D-arabinofuranosida) y la hidroxiurea, bloquean el ciclo de replicación del virus auxiliador en un punto crucial en el ciclo de vida viral. Puesto que la transcripción genética viral intermedia y final solamente se inicia sobre los genomas virales nacientes, estas dos clases de genes son seleccionadas como un resultado del bloqueo por AraC o hidroxiurea. El AraC bloquea la replicación por la incorporación en el ADN, mientras que la hidroxiurea inhibe la reductasa del ribonucleótido reduciendo el grupo o conjunto celular de, los desoxirribonucleótidos. Existen muchos inhibidores de la síntesis del ADN adicionales. Los inhibidores de la síntesis del ADN adicionales se sabe que bloquean- la síntesis del ADN celular pero los mismos no son recomendados para su uso en el bloqueo de la replicación del MVA. Estos incluyen: los inhibidores de la Polimerasa del ADN (semejantes al Aphidicolin), los inhibidores de la Topoisomerasa (los ejemplos semejantes a la camtotecina bloquean las topoisomerasas del tipo I; la Novobiocina y el ácido nalidíxico bloquean las topoisomerasas del tipo II), y los inhibidores de Girasa del ADN (semejantes a la Heliquinomicina) . Los inhibidores de la síntesis del ADN los cuales bloquean la síntesis del ADN celular podrían ser más efectivos para los virus auxiliadores que son ampliamente dependientes de las enzimas celulares para efectuar funciones de replicación. Una ventaja clara de utilizar los inhibidores de la síntesis del ADN durante un evento de rescate genético es que existe muy poco o nada de contaminación del virus de ARN rescatado con un virus auxiliador modificado. En el MVA, el ciclo de replicación en las células no permisivas es detenido en las etapas más tardías en la morfogénesis que conducen a partículas virales que no son infecciosas. La infección de las células semipermisivas conduce a un crecimiento viral limitado, el cual está contraindicado en los experimentos de rescate genéticos. Bajo el bloqueo por el AraC o la hidroxiurea, la inhibición concomitante de la síntesis de la proteína final conduce a la ausencia completa de partículas virales. El virus rescatado es amplificado directamente en una línea celular que es permisiva para el crecimiento del virus auxiliador. Las cantidad de los inhibidores de la síntesis del ADN utilizadas para la transfección son determinadas fácilmente por los experimentos de prueba para analizar el crecimiento del virus auxiliador. Los eventos moleculares requeridos para la conversión de un ADNc viral en un virus de ARN recombinante se entiende generalmente que involucran la transcripción por la polimerasa de T7 y la replicación de cualquier genoma de longitud completa de una sola hebra, negativo o positivo, por tres o más factores de actuación trans virales (N, P, y L, en el caso del MV) . La replicación del MVA concurrente conduce al agotamiento de los recursos intracelulares y extracelulares de principio a fin del evento de rescate, comprometiéndola probablemente a algún grado. El bloqueo de la expresión de los genes intermedios y finales conduce a la conservación de estos recursos, y quizás es una razón por la cual es mejorado el rescate genético en la presencia de los inhibidores. El efecto citopático (CPE) inducido por la infección viral es reducido marcadamente en las células infectadas por el MVA cuando se compara con las células infectadas por el virus del tipo silvestre. El mismo, es reducido adicionalmente en las células infectadas por el MVA tratadas con los inhibidores de la síntesis del ADN. La extensión de la vida de las células infectadas permite la expresión de una variedad más amplia de genes extraños. Este puede ser otro componente ventajoso para los rescates genéticos mejorados. El uso de otros promotores (muy iniciales, iniciales/intermedios, intermedios y/o iniciales/finales) para impulsar la expresión de T7 pueden mejorar los rescates genéticos, preferentemente en la presencia de los inhibidores de la replicación del ADN. Los promotores del virus de vaccinia son adecuados para los métodos' de esta invención. Las células huésped son entonces transformadas o transfectadas con al menos dos vectores de la expresión descritos anteriormente. Las células huésped son cultivadas bajo condiciones las cuales permiten la coexpresión de estos vectores para producir el virus atenuado infeccioso.

El virus infeccioso rescatado es probado entonces para verificar su fenotipo deseado (sensibilidad ,a la temperatura, adaptación al frío, morfología de la placa, cualquier atenuación de la transcripción y replicación), primero por medios in vitro. Las mutaciones en la región promotor genómica 3' de actuación cis o cis-accionante también son probadas utilizando el sistema de minirreplicón en donde las actividades de la polimerasa y la encapsidación de actuación trans requeridas son provistas por los virus auxiliadores de la vacuna o del tipo silvestre, o por los plésmidos que expresan N, P y diferentes genes L que colectan las mutaciones atenuantes específicas para el gen (Radecke y colaboradores (1995) y Sidhu y colaboradores (1995)). Si el fenotipo atenuado del virus rescatado está presente, se llevan a cabo experimentos de estimulación con un modelo de animal apropiado. Los primates no humanos proporcionan el modelo animal preferido para la patogénesis de la enfermedad humana. Estos primates son inmunizados primero con el virus generado recombinantemente, atenuado, luego estimulados con la forma del tipo silvestre del virus. Las células huésped las cuales pueden ser empleadas en los métodos de rescate de esta invención son aquellos los cuales permiten la expresión de los vectores de los constituyentes requeridos necesarios para la producción del virus recombinante deseado. Tales células huésped pueden ser seleccionadas de una célula procariótica o de una célula eucariótica, y preferentemente una célula de vertebrado. En general, las células huésped preferidas son derivadas de una célula humana, tales como una célula del riñon embrionaria humana. Radecke y colaboradores 1995 describen el uso de una célula huésped la cual es derivada de una línea celular del riñon embrionaria humana designada como 293 3-46. Las células Vero, así como muchos otros tipos de células, también pueden ser utilizadas como las células huésped. Los siguientes son ejemplos de las células huésped adecuadas: (1) Líneas de las Células Primarias Diploides Humanas: por ejemplo las células WI-38 y MRC5; (2) la Línea Celular Diploide del Mono: por ejemplo FRhL -las células del Pulmón de Rhesus Fetal; (3) la Línea Celular Continua Casi Primaria: por ejemplo las células del riñon del mono verde africano - AGMK; (4) las células 293 humanas (calificadas) y (5) otras líneas celulares potenciales, tales como, CHO, MDCK (Riñon Canino de Madin-Darby) , los fibroblastos del embrión del pollo primario. En las modalidades preferidas alternativamente, un reactivo que facilita la transfección es agregado para incrementar la absorción del ADN por las células. Muchos de estos reactivos son conocidos en la técnica. La LIPOFECTACE (Life Technologies, Gaithersburg, MD) y EFFECTENE (Qiagen, Valencia, CA) son ejemplos comunes. La Lipofectace y Effectene son ambos lípidos catiónicos. Ellos tanto recubren el ADN como mejoran la absorción del ADN por las células. La Lipofectace forma un liposoma que rodea el ADN mientras que el Effectene recubre el ADN pero no forma un liposoma. Puesto que muchos de los virus del ARN empleados en esta invención son patógenos humanos, una célula de primate es empleada preferentemente en tales casos. Existen excepciones tales como el virus del moquillo canino y otros morbillivirus que infectan a los mamíferos no humanos. La totalidad de estos virus infectan solamente a las células eucarióticas. El virus del sarampión está restringido principalmente a los tipos de células de primates. Algunas líneas celulares eucarióticas trabajan mejor que otras para la propagación de los virus y algunas líneas celulares no trabajan para nada en algunos de los virus. Se utiliza- una línea celular que produce un efecto citopático detectable para que el rescate del virus disponible pueda ser detectado fácilmente. En el caso del virus del sarampión y potencialmente otros virus, las células transfectadas se hacen crecer sobre las células Vero a causa de que el virus se dispersa rápidamente sobre las células Vero y hace fácilmente detectables a las placas. Esta es otra característica importante de la invención. En general, una célula huésped la cual es permisiva para el crecimiento del virus seleccionado es empleada. En algunos casos, la célula huésped es de un "tipo de célula de complemento". En el caso del virus dei Sarampión, las células 293-3-46 (Radecke y colaboradores, 1995) son utilizadas a causa de que las mismas expresan los genes N y P del virus del Sarampión, así como el gen de la polimerasa del ARN de T7. Otros sistemas no tienen esta limitación a causa de que todas las proteínas virales necesarias son provistas por los plásmidos de la expresión y el virus de vaccinia los cuales expresan la polimerasa del ARN del T7. El vector de la transcripción y el vector de la expresión pueden ser los vectores de los plásmidos diseñados para la expresión en la célula huésped. El vector de la expresión que comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislada que codifica las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación,- la transcripción y la replicación pueden expresar estas proteínas a partir del mismo vector de la expresión o de al menos dos diferentes vectores. Estos vectores son conocidos generalmente de los métodos de rescate básicos, y los mismos no necesitan ser alterados para su uso en los métodos mejorados de esta invención. En un método mejorado de la presente invención, se utiliza una temperatura de choque térmico efectiva. Una temperatura de choque térmico efectiva es una temperatura arriba de la temperatura estándar sugerida para efectuar el rescate de un virus recombinante. En muchos casos, una temperatura de choque térmico efectiva está arriba de 37 °C. Cuando un método de rescate es llevado a cabo a una temperatura de choque térmico efectiva, el método, de rescate genera un incremento en la recuperación del virus recombinante deseada sobre el nivel de recuperación del virus recombinante cuando el rescate es efectuado en la ausencia del incremento en la temperatura. La temperatura del choque térmico y el tiempo de exposición efectivos se pueden hacer variar con base en el sistema de rescate utilizado. Tales variaciones de la temperatura y el tiempo pueden resultar de las diferencias en el genoma viral seleccionado o el tipo de la célula huésped. Aunque la temperatura puede variar, una temperatura de choque térmico efectiva puede ser averiguada fácilmente llevando a cabo varios procedimientos de rescate de prueba con un virus recombinante particular, y estableciendo un porcentaje de la velocidad de recuperación del virus recombinante deseado cuando se hacen variar la temperatura y el tiempo de la exposición. Ciertamente, el extremo superior de cualquier intervalo de temperatura para efectuar el rescate es la temperatura a la cual los componentes de la transfección son destruidos o su capacidad para funcionar en la transfección es agotada o disminuida. Una lista ejemplar de intervalos de temperatura se muestran en seguida: desde 38 °C hasta aproximadamente 50 °C, desde 39 °C hasta aproximadamente 49 °C, desde 39 °C hasta aproximadamente 48 °C, desde aproximadamente 40 °C hasta aproximadamente 47 °C, desde aproximadamente 41 °C hasta aproximadamente 47 °C, desde aproximadamente 41 °C hasta aproximadamente 46 °C, con desde aproximadamente 42 °C hasta aproximadamente 46 °C que es el más preferido. Alternativamente, se debe señalar que las temperaturas de choque térmico de 43 °C, 4 °C, 45 °C y 46 °C son preferidas particularmente. Sin que esté limitado por lo siguiente, se tiene la teoría de que empleando una temperatura elevada para la temperatura de choque térmico durante el rescate, se desencadena una respuesta celular y la síntesis asociada con las proteínas del choque térmico (referido como hsps) . Se reconoce que el choque térmico induce la respuesta de la tensión celular y la síntesis de un grupo de proteínas multifuncionales llamadas las proteínas del choque térmico (hsps) (Craig, 1985; Gunther y Walter, 1994; Lindquist, 1986) . Muchas, pero no la totalidad, de las hsps son codificadas por los genes altamente inducibles y estas proteínas son sintetizadas a niveles elevados para ayudar a la célula a recuperarse de la tensión. Los hsps indu?ibles también están presentes en la células a niveles básales indicativos de varios papeles que estas proteínas desempeñan en la función celular normal. Algunas de las hsps también son llamadas chaperonas o acompañantes a causa de que las mismas desempeñan un papel importante . en auxiliar apropiadamente el pliegue de la proteína (Gething, 1996; Martin y Hartl, 1997). Otras funciones atribuidas al hsps incluyen papeles en la traficación de la proteína en la célula, la modulación de la función de las enzimas y la proteína, la participación en la replicación del ADN, y el involucramiento en la replicación viral y la patogénesis (Franke, Yaun, y Luban, 1994; Friedman y colaboradores, 1994; Gething, 1996; Glick, 1995; Hu, Toft, y Seeger, 1997; Lund, 1995; Martin y Hartl, 1997; Pratt, 1992; Santoro, 1996) . La proteína 70 del choque térmico (hsp70) de los mamíferos es un grupo relacionado de proteínas de aproximadamente 70 kD de tamaño. La forma inducible principal de la hsp70 (hsp72) tiene un peso molecular aparente de 72 kD. La proteína hsp70 de 73 kD (hsp73) es expresada en la célula constitutivamente y ha sido llamada una proteína análoga a la del choque térmico (hsc73, (Gunther y Walter, 1994) ) . Estas proteínas participan en algunas de las funciones mencionadas anteriormente y han sido implicadas como uno de las factores de la célula huésped que incrementan la expresión del gen de CDV natural (no rescatado) en respuesta al choque térmico. La isoforma del Hsp72 se copurifica con la fracción de las nucleocápsidas de CDV que contienen la actividad transcripcional viral mejorada (Oglesbee y colaboradores, 1996) . En vista de los resultados ejemplares de la invención que se describen aquí, se puede inferir que el efecto de la temperatura de choque térmico sobre la expresión del gen de CDV y la expresión del gen para otros virus los cuales pueden ser rescatados de acuerdo con los métodos descritos aquí, se debe, al menos en parte, a la inducción de los Hsp70s. En consecuencia, las modalidades alternativas de esta invención se refieren al uso de una temperatura de choque térmico efectiva la cual es capaz de efectuar la inducción de los hsps, especialmente un Hsp 70, tal como el Hsp 72. En la conducción de las pruebas para establecer la temperatura del choque térmico seleccionada, se puede también seleccionar un tiempo deseado para efectuar el procedimiento del choque térmico. Un tiempo suficiente para aplicar la temperatura del choque térmico efectiva es el tiempo sobre el cual existe un incremento en la recuperación del virus recombinante deseado sobre el nivel de recuperación del virus recombinante cuando el rescate es efectuado en la ausencia de un incremento en la temperatura sobre la temperatura estándar sugerida para conducir el rescate. El intervalo de tiempo apropiado puede variar con base en el sistema de rescate. Tal variación en el tiempo también puede resultar de las diferencias en el genoma viral seleccionado o el tipo de la célula huésped. Aunque el tiempo puede variar, la cantidad de tiempo para aplicar una temperatura de choque térmico efectiva puede ser averiguada fácilmente llevando a cabo varios procedimientos de rescate de prueba con un virus recombinante particular, y estableciendo una velocidad o porcentaje de recuperación del virus recombinante deseado cuando la temperatura y el tiempo se hacen variar. Ciertamente, el límite superior de cualquier tiempo variable utilizado para efectuar el rescate es la cantidad de tiempo a la cual los componentes de la transfección son destruidos o su capacidad para funcionar en la tic-nsfección es agotada o disminuida. La cantidad de tiempo para el procedimiento de choque térmico puede variar desde varios minutos hasta varias horas, siempre que el incremento deseado en la recuperación del virus recombinante sea obtenida. Aunque el tiempo de exposición de las células transfectadas con respecto a la temperatura de choque térmico efectiva puede variar con cada sistema de rescate, una lista ejemplar de intervalos de tiempo de la exposición (es minutos) es mostrada en seguida: desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 300, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 300, desde 15 hasta aproximadamente 240, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 200, desde aproximadamente. 20 hasta aproximadamente 150, con desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 150 que es el intervalo más preferido.

Se pueden emplear numerosos medios para determinar el nivel de la recuperación mejorada del virus recombinante deseado. Como se señaló en los ejemplos de aquí, un gen reportero de cloranfenicol acetil transferasa (CAT) puede ser utilizado para verificar el rescate del virus recombinante. La actividad correspondiente del gen reportero establece la línea base y el nivel mejorado de la expresión del virus recombinante. Otros métodos incluyen la detección del número de placas del virus rec?mbinante obtenido y la verificación de la producción del virus rescatado por el secuenciamiento. La recuperación mejorada debe exhibir un incremento de al menos aproximadamente 25% o de al menos aproximadamente 40%. Preferentemente, el incremento en el virus recombinante recuperado es de aproximadamente 2 veces . Aproximadamente un incremento de 5 a 10 veces en la cantidad del virus recombinante ha sido observado. Un método sugerido para la determinación del nivel de recuperación mejorado del virus recombinante deseado involucra la preparación de un número de cultivos celulares transfectados idénticamente y la exposición de ellos a diferentes condiciones de choque térmico (tiempo y temperatura variables), y luego comparando con las células de control transfectadas y mantenidas a una temperatura constante de 37 °C. A las 72 horas después de la transfección, las células transfectadas son transferidas a una placa de 10 cm que contiene una monocapa de aproximadamente 75 % de confluencia con las células Vero (o el tipo de células de elección para la determinación de la formación de la placa del virus recombinante) y continuando la incubación hasta que las placas sean visibles. Después de esto, las placas son contadas y comparadas con los valores obtenidos de las células de control. Las condiciones óptimas del choque térmico deben maxímizar el número de las placas. En otra modalidad de la presente invención, la composición de rescate transfectada, cuando está presente en la(s) célula (s) huésped, es sometida a un paso de expansión de la placa o un paso de amplificación. Este aspecto de la presente invención proporciona un método de rescate mejorado para producir un virus de Mononegavirales recombinante, tal método comprende; (a) en una ?élula huésped, llevar a cabo la transfección de una composición de rescate la cual comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del orden de los Mononegavirales y (ii) al menos un vector de expresión el cual comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislada que codifica las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación bajo condiciones suficientes para permitir la coexpresión de los vectores y la producción del virus recombinante; (b) transferir la composición de rescate transfectada sobre al menos una capa de las células de expansión de la placa (células PE); y (c) opcionalmente, colectar el virus recombinante. Frecuentemente, la célula huésped empleada para llevar a cabo la transfección no es favorable para el crecimiento del virus rec?mbinante deseado. La recuperación del virus recombinante a partir de las células transfectadas puede ser mejorada por la selección de una célula de expansión de la placa en la cual el virus natural o el virus recombinante exhiben un crecimiento mejorado. Cualquiera de las varias placas o recipientes conocidos en la técnica pueden ser empleados como se utilizaron para el paso de expansión de la placa. Preferentemente, las células transfectadas que contienen la composición de rescate son transferidas sobre una monocapa de las células de PE. En particular, la capa de las células de PE debe ser de al menos una confluencia de aproximadamente 50%. Alternativamente, las células de PE son de al menos aproximadamente 60% de confluencia o aún de al menos aproximadamente 75% de confluencia. Para lograr la expansión de la placa, las células transfectadas son transferidas a los recipientes de las células de PE de tal modo que el área superficial de las células de PE sea mayor que el área superficial utilizada para preparar el virus transfectado. Una relación del área superficial mejorada desde 2:1 hasta 100:1 puede ser empleada cuando se desee. Un área superficial mejorada de al menos 10:1 es preferida. Las células de expansión de la placa son seleccionadas con base en el crecimiento exitoso del virus natural o recombinante en tales células. Las células Vero trabajaron bien en los experimentos ejemplares descritos aquí, y, en consecuencia, las mismas son preferidas como las células de PE. Los métodos de rescate mejorados, adicionales, son logrados reemplazando el medio de la transfección previo a, o simultáneamente con, una expansión de la placa con las células Vero o un procedimiento de choque térmico. El remplazo del medio puede ocurrir varias veces antes de la expansión de la placa o la temperatura de choque térmico; sin embargo, el reemplazo del medio después de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 20 horas de incubación de las células transfectadas, puede ser seguido como un punto de partida y luego se ajusta cuando se desee después de esto a partir de llevar a cabo corridas, de prueba del método de rescate.

Virus del ARN de una sola hebra, segmentados Aunque uno de los aspectos importantes de la presente invención es la aplicación de estos métodos mejorados en la recuperación de los virus del ARN, de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentados, los métodos de esta invención pueden ser útiles para el mejoramiento del rescate de muchos tipos de virus del ARN, incluyendo los virus del ARN, de una sola hebra, dé sentido negativo, segmentados. Con base en la reclasificación revisada en 1993 por el Comité Internacional sobre la Taxonomía de los Virus, el último grupo de virus al cual pertenecen las tres familias de los virus son la Orthomyxoviridae, la Bunyaviridae y la Arenaviridae.

Familia Orthomyxoviridae Género Influenzavir?s A, B Vertebrados, virus A de la influenza Género Influenzavirus C Vertebrados, virus C de la influenza Género "sin nombre, virus semejantes a Thogoto" Vertebrados: Virus Thogoto Familia Bunyaviridae Género B?nyavirus Vertebrados: virus Bunyamwera Género Nairovirus Vertebrados: enfermedad de las ovejas de Nairobi Género Phlebovirus Vertebrados: virus Siciliano de la fiebre del mosquito simúlido Género Hantavirus Vertebrados: virus de Hantaan Género To povírus Plantas: virus del secado por manchas del tomate Familia Arenaviridae Género Arenavirus Vertebrados: virus de coriomeningitis linfocítica Género Tenuivir?s Plantas: virus de las tiras del arroz A partir de estas familias de virus segmentados, los virus que presentan riesgos de salud potenciales son de interés particular. Las características genéticas inversas (o de rescate) han provisto una ruta para producir la influenza A recombinante por la semejanza del ARN del virión con un complejo de transcriptasa activa para el genoma, para iniciar la replicación (Enami y Palase) . El método involucra la transcripción in vitro de una copia de ADNc, la creación de un segmento del gen del virus deseado, natural o mutado, en una copia del ARNv y la recuperación del virus. El ARNv es mezclado con las proteínas de RNP (obtenidas de los viriones purificados) y luego transfectadas en una célula con un virus auxiliador (por ejemplo un virus del tipo silvestre que corresponde al virus recombinante deseado) . Por ejemplo, en la preparación de la Influenza A recombinante, el virus de la influenza A es empleado para proporcionar proteínas las cuales replican el gen de ARN transfectado. Una mezcla del virus recombinante y el virus auxiliador es formada. Puesto que el virus auxiliador está presente con un gran exceso, un sistema de selección fuerte, tal como un sistema de selección del anticuerpo, es empleado para separar selectivamente la progenie (Enami y Palase, 1991). El procedimiento de choque térmico de la presente invención puede ser empleado para incrementar el volumen de la mezcla resultante y la cantidad del virus recombinante obtenido sometiendo la composición de rescate apropiada, del ARN, los RNPs y cualesquiera componentes adicionales tales como los complejos de la transcriptasa activa cuando la coinfección es llevada a cabo con el virus auxiliador.

Específicamente, el procedimiento de choque térmico de la presente invención también puede ser empleado para mejorar la eficiencia del procedimiento utilizado para producir partículas semejantes a un virus empacando el minigenoma de CAT:ARN semejante a la influenza sintética en las células de COS-1, por los clones del ADNC que expresan la polimerasa de T7 de vaccinia de 10 proteínas codificadas con el virus de la influenza A (Mena y colaboradores, 1996) . En una modalidad adicional, el procedimiento de choque térmico de la presente invención puede ser empleado para mejorar la eficiencia de un sistema independiente auxiliador para el rescate de un genoma del ARN de hebra negativa, segmentado, del bunyavirus de Bunyamwera (Bridgen y Elliot, 1996) . Esta invención es similar a una utilizada para los experimentos de rescate del virus del ARN de sentido negativo, no segmentados (en lugar de aquellos descritos para el rescate de los virus de la influenza segmentados) . Los plásmidos que contienen las copias del ADNc de longitud total de los tres segmentos del genoma del ARN del bunyavirus de Bunyamwera fueron construidos y estuvieron flanqueados por las secuencias del ribozima y el promotor T7 para generar las copias genómicas de los ARNs con las terminales genómicas precisas. Cuando las células que expresan la polimerasa de T7 y las proteínas del bunyavirus de Bunyamwera recombinante fueron transfectadas con estos plásmidos, los ARNs del antigenoma de longitud completa fueron transcritos y encapsidados intracelularmente y estos a su vez fueron replicados y empacados en las partículas del bunyavirus infecciosas. Las observaciones descritas aquí de que el choque térmico mejora el rescate del MV recombinante e incrementa la expresión del gen reportero de CAT a partir de los minirreplicones de MV, combinado con los resultados que indican que la actividad de la polimerasa L dé CDV es estimulada por el hsp72 (Oglesbee y colaboradores, 1996), ocasiona una creencia de que la inducción de hsp72 puede ser responsable substancialmente del efecto del choque térmico descrito aquí. Esta posibilidad se examinó expresando uno de los genes para el hsp72 desde un vector de la expresión durante los experimentos del minirreplicón de CAT. La expresión de una versión etiquetada con el epítope de la proteína de hsp fue confirmada por el análisis del manchado de western (Ejemplo 6) . La presencia del vector de expresión de hsp incrementó los niveles de CAT en las células transfectadas en hasta 20 veces (Ejemplo 6) . Estos resultados sugieren que el nivel de expresión elevado del hsp72 puede incrementar la eficiencia .del rescate del virus. Además, estos resultados implican que una línea celular estable que expresa niveles elevados del hsp72 puede ser favorable para el rescate. Idealmente, la línea celular estable podría expresar el hsp72 desde un promotor inducible de tal modo que la cantidad de expresión del gen de hsp72 pudiera ser regulada. Esto podría permitir la selección de un período del tiempo de inducción y el nivel de inducción que podría maximizar el rescate y también evitar cualesquiera efectos potencialmente tóxicos para la línea celular de la expresión de alto nivel constitutiva del gen de hsp. Los virus recombinantes preparados a partir de los métodos de la presente invención pueden ser empleados para las aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. Preferentemente, los virus recombinantes preparados a partir de los métodos de la presente invención son utilizados, solos o en conjunción con las substancias farmacéuticas, los antígenos, los agentes de inmunización o los auxiliares, como las vacunas en la prevención o el mejoramiento de la enfermedad viral. Estos agentes activos pueden ser formulados y suministrados por los medios convencionales, es decir utilizando un diluyente o un portador aceptable farmacéuticamente. Los siguientes ejemplos son provistos a manera de ilustración, y no deben ser interpretados como limitativos de la invención como se describió aquí anteriormente.

EJEMPLOS MÉTODOS Y MATERIALES Células, virus y transfección Las células 293-3-46 (Radecke y colaboradores, 1995) y las células 293 (Graham y colaboradores, 1977) fueron mantenidas en un medio esencial mínimo modificado de Dulbecco DMEM) suplementado con 10% de suero de bovino fetal (FBS) al 10%. Las células 293-3-46 se hicieron crecer con la selección en el medio que contiene el G418 (Geneticina, Gilbo-BRL) a 1.5 mg por ml. Las células Vero se hicieron crecer en DMEM que contiene 5 % de FBS, las células en suspensión Hela se hicieron crecer en un medio esencial mínimo (SMEM) suplementado con 10% de FBS. El MV (Edmonston B) se propagó en los cultivos en suspensión de Hela como se describió inicialmente (Udem, 1984). Las transfecciones se efectuaron utilizando el método de precipitación del fosfato de calcio (Ausubel y colaboradores, 1987; Graham y van der Eb, 1973) . Las células 293-3-46 o 293 utilizadas para la transfección fueron sembradas sobre placas de 6 cavidades y se hicieron crecer hasta una confluencia de aproximadamente 50-75%. Las células fueron alimentadas 1-3 horas antes de la transfección con 4.5 ml del medio fresco que carece de G418. Las mezclas de la transfección fueron preparadas combinando los ADNs apropiados en un volumen final de 225 µl en agua seguido por la adición de 25 µl de CaCl2 2.5M. La mezcla de calcio-ADN se agitó en forma de remolino suavemente mientras que se agregan lentamente 250 µl de la solución salada amortiguada con HEPE? 2X (280 nM de NaCl, 1.5 mM Na2HP04, 50 mM HEPES, pH 7.05). Al precipitado se le permitió reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos luego se agregó a las células. Las células fueron incubadas toda la noche (14-16 horas), luego se removió el medio de la transfección y las células fueron enjuagadas y alimentadas con el medio fresco que carece de G418. La infección de las células transfectadas se efectuó con 5 unidades formadoras de la placa (pfu) por célula después de la remoción del medio de la transfección. Las infecciones fueron incubadas 2 horas antes de reemplazar el medi,o. En este tiempo, los discos o placas que contienen las células que se sometieron al choque térmico fueron envueltas en una película de parafina y se transfirieron a un baño a 44 °C y se incubaron 3 horas antes de ser transferidas a un incubador a 37 °C. Las células fueron colectadas a las 48 horas después del inicio de la transfección para el análisis de la expresión del gen temporal o se colectaron a las 72 horas (como se señaló anteriormente aquí) para los experimentos de rescate. Los ensayos de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) fueron efectuados como se describió previamente (Sidhu y colaboradores, 1995, y Parks y Shenk, 1996) . Las células colectadas para el rescate del virus fueron removidas de las cavidades por el pipeteo repetido del medio sobre la monocapa para desunir las células y romper la monocapa en terrones pequeños. No se utilizó ningún agente de disociación. Las células y 5 ml del medio fueron distribuidos inmediatamente sobre una monocapa casi confluente de las células Vero que crecen en 10 ml del medio sobre un disco o plato de 10 cm. Cuatro a cinco días más tarde, las placas fueron visibles y las monocapas fueron teñidas para el conteo de las placas o se colectaron para preparar una materia prima del virus recombinante. Las transfecciones del ARN fueron efectuadas como se describió anteriormente para el ADN con la sigµiente modificación. El ARN para la transfección se preparó in vitro utilizando los reactivos de la polimerasa del ARN del T7 en el juego o conjunto de Megascript (Ambion) . Los precipitados del fosfato de calcio-ARN fueron incubados con las células 293 durante 5-6 horas y luego se remueven.. La transfección y la infección se llevaron a cabo simultáneamente por la adición del virus al medio de la transfección. Después del reemplazo del medio de transfección-infección, las muestras de las células apropiadas fueron sometidas a un choque térmico a 43-44 °C. Las células fueron colectadas a las 24-28 horas después del inicio de la transfección/infección.

ADN Recombmante El plásmido del ADNc del MV de longitud total (p( + )MV) y el plásmido de la expresión del gen L de MV (pEMC-La) fueron provistos generosamente por Martin Billeter y Frank Radecke (Radecke y colaboradores, 1995) . La preparación del multirreplicón CAT ya ha sido descrita (Sidhu y colaboradores, 1995) . El plásmido de expresión de hsp70 fue clonado por la amplificación del ADNc (Hunt y Monmoto, 1985) a partir del ARN extraído de las células 293-3-46 sometidas a un choque térmico. La reacción de transcripción inversa-PCR (RT/PCR) se efectuó con la mezcla de la enzima de alta afinidad que contiene la Transcriptasa Inversa del Virus de la Leucemia del Murino de Moloney, la polimerasa del ADN de Taq y la polimerasa del ADN de Pwo encontrada en los reactivos del juego o conjunto Titán (Boehpnger Mannheim) . El ADNc del hsp70 se clonó en el pCGN del plásmido de expresión (Tanaka y Herr, 1990) para generar una construcción de la expresión que contiene la etiqueta del epítope del HA de la influenza en la región de codificación amino terminal.

Secuenciamiento del ADN La secuencia de MV se determinó por el secuenciamiento del ADN amplificado por RT/PCR. El ARN de las células infectadas con MV se preparó por el método de extracción de isotiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo (Chomczynski y Sacchi, 1987) y la RT/PCR se efectuó utilizando los reactivos en el juego o conjunto Titán (Boheringer Mannheim) . El ADN amplificado se purificó en un gel en los geles de agarosa de fusión baja. El fragmento de PCR se secuenció utilizando las reacciones del terminador del teñido (Applied Biosystems) y se analizó sobre un secuenciador automatizado de ABI PrismR (Perkin-Elmer) . La confirmación de la secuencia de los ADNs del pl?smido también se efectuó con el secuenciador automatizado.

Ejemplo 1 Protocolo de Rescate del ADNc Este protocolo se resume en la Figura 1.

El día antes del inicio de la transfección, las células 293-3-46 son divididas en cajas de seis cavidades utilizando el DMEM suplementado con 10% de suero de bovino fetal (FBS) y 1.5 mg/ml del antibiótico G418. Una placa de 10 cm confluente es dividida sobre un disco o caja de seis cavidades si se espera el uso al siguiente día. Doce cavidades por experimento de rescate son transfectados para incrementar la probabilidad de recuperar el virus recombinante. A aproximadamente una a tres horas antes de la transfección, el medio se reemplaza en cada cavidad con 4.5 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS (No G418), y luego se inicia la transfección.

Precipitado de Fosfato de Calcio: El Agua y el ADN en un volumen de 225 µl se combinan en un tubo de polipropileno de 5 ml estéril. Cinco (5) µg de p(+)Mv y lOOng del plásmido de expresión L (pEMC-La) son utilizados por transfección. Veinticinco (25) µl del CaCl2 2.5M son agregados y mezclados. Doscientos cincuenta (250) µl de 2XHBS son agregados por goteo mientras que se agita en forma de remolino suavemente el tubo. Después de agregar el HBS, los tubos permanecen a temperatura ambiente durante 15-20 minutos (el HBS es 2X con la solución salmuera amortiguada con HEPES: 280 mM de NaCl, 1.5 mM de Na2HP04, 50 mM HEPES, pH 7.05 (Ausubel y colaboradores, 1987) . Es útil ajustar las transfecciones individuales para cada cavidad en lugar de hacer una mezcla de transfección maestra grande. El precipitado es agregado por goteo al medio y las células son incubadas toda la noche durante aproximadamente 12 a 16 horas. Luego el medio es removido y las células son lavadas. Las células son enjuagadas dos veces 'con una solución salada/HEPES (150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.2). Previo a la incubación de las células, se agregan 5 ml del medio (DMEM, 10% FBS, sin G418) .

CHOQUE TÉRMICO: Después de agregar el medio fresco como se describió anteriormente, la placa de seis cavidades es sellada con parafina y transferida a un recipiente Tupperware con una tapa. El recipiente es sumergido ,en un baño de agua a 43-44 °C y se incuba durante 3 horas. Después de esta paso de choque térmico la película de parafina es removida de la placa y las células son transferidas a un incubador a 37 °C. Las células son incubadas durante un total de aproximadamente 72 horas después del inicio de la transfección. Después de completar la incubación, se lleva a cabo un paso de expansión de la placa con las células Vero.

Las células Vero son preparadas el día antes de su uso por la separación o división de una placa de 10 cm en cuatro o cinco placas de 10 cm. Después de la incubación toda la noche, las células tiene una confluencia de aproximadamente el 75%. Suficientes placas son preparadas de modo que exista una placa da células Vero por cavidad transfectada. Aproximadamente a las 72 horas después del inicio de la transfección, cada cavidad de las células 293-3-46 transfectadas es transferida a una caja de 10 cm que contiene las células Vero. Las células 293-3-46 son transferidas por el pipeteo repetido de 5 ml del medio de cultivo sobre las células para desalojarlas de la cavidad y romper la monocapa en terrones celulares pequeños. Se pipetea suavemente para evitar la lisis celular pero con suficiente fuerza para desalojar las células. Los 5 ml del medio de cultivo que contienen los terrones celulares transfectados son distribuidos entonces en la caja de.10 cm de las células Vero que ya contienen 10 ml del medio de cultivo. Dependiendo del sistema de rescate, se debe permitir un intervalo de tiempo suficiente, de aproximadamente 4-5 días, para visualizar las placas. El virus recombinante es colectado por el raspado de . las células y colectándolas por centrifugación. Las células son resuspendidas en 1 ml del DMEM libre del suero (Gibco/BRL) que carece del suero y se congelan-licúan una vez para liberar el virus.

Ejemplo 2 En este ejemplo, el método de rescate descrito en el Ejemplo 1 fue repetido seis veces, en compañía de un control en el cual no se aplicó el choque térmico.- Los resultados de los seis experimentos de " rescate independientes se muestran en la Figura 5. El ADNc del MV utilizado en todos los experimentos contuvo las secuencias B de Edmonston (Radecke y colaboradores, 1995) . Las transfecciones fueron efectuadas como se describió anteriormente y la incubación para el choque térmico fue de 3 horas a 44 °C. El Experimento 1 fue evaluado con las placas marcadas con más o menos, y en los experimentos restantes las placas fueron contadas. Los experimentos llevados a cabo en este ejemplo revelaron lo siguiente: Las dos modificaciones de la técnica de rescate convencional (Radecke y colaboradores, 1995), un paso de choque térmico y un paso de expansión de la placa, fueron cada uno efectivos en incrementar ampliamente el número de cultivos transfectados los cuales produjeron el virus recombinante. Antes de emplear estas modificaciones, solo de manera aproximada 2-3% de los cultivos transfectados produjeron el virus recombinante. En el procedimiento anterior, desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 90% de los cultivos transfectados produjeron el virus recombinante.

Ejemplo 3 Modificación de la Expansión de la Placa El paso de expansión de la placa en el protocolo de rescate en el Ejemplo 1 se estableció a partir del siguiente tipo de experimentos, los cuales son llevados a cabo en la ausencia de un tratamiento de choque térmico. Los experimentos se efectuaron sin el paso de Expansión de la Placa del Ejemplo 2, mientras que se siguen los procedimientos descritos por Radecke y colaboradores (1995) . En estos experimentos, las células transfectadas fueron transferidas desde una cavidad en un disco de seis cavidades a una caja de 10 cm para permitir 4-5 días de crecimiento celular adicional y de tiempo adicional para que se desarrollen las placas. No se detectaron placas utilizando este procedimiento. En el segundo tipo .del experimento, las células transfectadas fueron colectadas por el raspado y la centrifugación y se resuspendieron en un medio OPTIMEM libre de suero (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Las células fueron sometidas a un ciclo de congelamiento-licuado para liberar el virus, y este lisado celular se aplicó a un disco de 10 cm que contiene las células Vero que fueron de una confluencia de aproximadamente 75%. Cuatro a cinco días más tarde, las células Vero fueron examinadas para verificar si existen placas. Aproximadamente 2-3 % de los cultivos fueron positivos para la existencia de placas del virus - del sarampión. Siguiendo el protocolo de Expansión de' la Placa descrito en el Ejemplo 2, se logró una mejora de 10-20 veces sobre la tasa de éxito del 2% ya descrita. Parece importante que las células no sean sometidas a un ciclo de congelamiento-licuado previo al paso de expansión de la placa, como se muestra en el Ejemplo 2.

Ejemplo 4 El choque térmico incrementa la expresión de los minirreplicones Para examinar los mecanismos potenciales para los resultados del rescate mejorado después del choque térmico, el efecto del choque térmico sobre la expresión del gen a partir de un minirreplicón de MV fue probado (véase la Figura 2 para los resultados) . El minirreplicón del plásmido (pMV107CAT) fue diseñado para la síntesis mediada por la polimerasa del ARN de T7 directa de una copia del ARN de sentido negativo del gen de CAT flanqueado por las terminales de MV (Sidhu y colaboradores, 1995) . Este plásmido fue utilizado para transfectar las células 293-3-46 para la síntesis intracelular del ARN del minirreplicón. La replicación y la expresión del ARN del minirreplicón en las células 293-3-46 se llevó a cabo por el complemento con las proteínas de MV provistas por la infección, o complementada con un plásmido de expresión L a causa de que las células proporcionan las proteínas tanto de N como de P. Las células 293-3-46 fueron transfectadas toda la noche con el ADN del plásmido del minirreplicón de MV-CAT (1 µg) . Algunas transfecciones (fajas 3 y 7) también recibieron el plásmido de la expresión del gen L de MV (100 ng) para proporcionar el complemento de L. Aproximadamente 14 horas después de la transfección, el medio fue reemplazado y las células fueron infectadas con el MV durante 2 horas (fajas 4 y 8) con 5 pfu (unidades formadoras de la placa) por célula. Después de la infección, el medio se remplazó y los cultivos celulares apropiados (fajas 5-8) se sometieron a choque térmico a 44 °C durante 3 horas. Las células fueron colectadas a las 48 horas después del inicio de la transfección y los ensayos de CAT fueron efectuados como se describió en los Métodos anteriores.

Cuando se examina el efecto del choque térmico sobre la expresión del minirreplicón, el rescate que emplea el choque térmico produjo un incremento fuerte en la actividad del gen de CAT (Figura 2). Los experimentos mostrados en la Figura 2 fueron efectuados con el ADN del minirreplicón y se llevaron a cabo similarmente a los experimentos de rescate, excepto que las células fueron colectadas 48 horas después de la transfección.- El complemento por el virus se efectuó por la infecci'ón de las células transfectadas con 5 pfu por célula después de la remoción del medio de transfección. El complemento con un plásmido de expresión L se hizo simplemente por la cotransfección con el ADN del minirreplicón. Los resultados indican que el choque térmico estimula la expresión cuando cualquier forma del complemento fue utilizada. En los experimentos múltiples, la expresión de CAT generada por el complemento con* el plásmido de expresión L se incrementó desde 2-10 veces por el choque térmico (compárense las fajas 3 y 7) . De manera similar, la actividad de CAT también fue incrementada cuando el complemento viral fue utilizado y condujo a aproximadamente una mejora de 5 veces (fajas 4 y 8). Como se esperaba, las transfecciones .del control negativo que no recibieron el plásmido de CAT (fajas 1 y 5) o una fuente del complemento L (fajas 2 y 6) produjo niveles muy bajos de la actividad de CAT del fondo.

Ejemplo 5 Existió la posibilidad de que la expresión incrementada del minirreplicón pudiera estar relacionada con un nivel más elevado de la actividad de la polimerasa de T7 después del choque térmico. La actividad de la polimerasa de T7 más elevada podría resultar de la expresión incrementada del gen en las células 293-3-46 después del choque térmico. El gen de la polimerása de T7 es expresado desde el mejorador/promotor inicial inmediato de CMV en las células 293-3-46 (Radecke y colaboradores, 1995) y el promotor/mejorador de CMV se ha mostrado que responde al choque térmico (Andrews, Newbound, y Lairmore, 1997) . Para eliminar esta posibilidad, las células fueron transfectadas con el ARN del minirreplicón y se sometieron a un tratamiento de choque térmico como se utilizó en el Ejemplo 4. Además, en este ejemplo, para eliminar la posibilidad de que el efecto del choque térmico estuviera relacionado con la expresión incrementada de los genes de MV presentes en la línea celular de 293-3-46, las transfecciones del ARN fueron efectuadas en 293 células (Graham y colaboradores, 1977). Las células 293-3-46. no expresan establemente ninguno de los genes de MV. El protocolo de transfección utilizado en este experimento fue modificado para acomodar la transfección del ARN (véase la sección de Métodos anterior) . Cinco µg del ARN se transfectaron por el procedimiento del fosfato de calcio. La infección del MV de las células apropiadas se efectuó agregando el virus inmediatamente después que la mezcla de transfección se agregó al medio. Después de agregar el precipitado a las células, el MV (5 pfu por célula, fajas 3 y 6 de la Figura 3) fue agregado al medio de cultivo para iniciar la infección inmediatamente para reducir- la probabilidad de la degradación del ARN intracelular antes de que el mismo pudiera ser empacado en las nuclecápsidas. Después de 5-6 horas de incubación de la transfección-infección, el medio se reemplazó y las muestras de las células apropiadas se sometieron al choque térmico 2 horas a 44 °C, antes de ser regresadas a 37 °C. Los extractos celulares fueron preparados 24-28 horas después del inicio de la transfección-infección para los ensayos de CAT. Los resultados de la transfección del ARN fueron similares a los resultados de la transfección del ADN. El choque térmico incrementó substancialmente la expresión del CAT en las células que fueron infectadas (Figura 3, compárense las fajas 3 y 6) . No se observó ninguna actividad de CAT en las células que no recibieron el .ARN del minirreplicón (fajas 1 y 4) o ningún complemento viral (fajas 2 y 5) . Los resultados de la transfección del ARN también eliminan la posibilidad de que la actividad de la polimerasa del ARN de T7 incr=gpíitada fuera responsable del efecto del choque té mi^^ en el experimento de la transfección del ADN mostrada en la Figura 2.

Ejemplo 6 Estimulación de la expresión del minirreplicón por Hsp70.

Oglesbee y colaboradores han determinado que la isoforma de hsp70 inducible, la hsp72, se copurifica con las nucleocápsidas de CDV y que estas nucleocápsidas exhiben una actividad transcripcional in vitro mejorada (Oglesbee, Ringler, y Krakowka, 1990; Oglesbee y colaboradores, 1996) . Para evaluar si el hsp72 estuvo involucrado en el efecto del choque térmico que fue observado en los ejemplos anteriores, se llevaron a cabo experimentos que substituyeron esencialmente la sobreexpresión del gen de hsp70 para el tratamiento del choque térmico del Ejemplo 1 (los resultados son mostrados en la Figura 4). El ADNc del hsp70 inducible (Hunt y Morimoto, 1985, Wu y colaboradores, 1985) se clonó a partir del ARN preparado de las células sometidas al choque térmico de acuerdo con el Ejemplo 2. El ADNc se clonó en un vector de expresión de CMV, el pCGN del plásmido (Tanaka, 1990), en compañía de una etiqueta del epítope de flu. La región de codificación del extremo o terminal de amino del gen hsp 70 se fusionó a la etiqueta del epítope HA de la influenza (Tanaka y colaboradores, 375-386, 1990), que tiene la secuencia Y P Y D V P D Y A . El ADNc del hsp70 fue clonado para expresar la proteína de hsp70 con una terminal o extremo de amino que contiene el epítope de HA. El uso de este plásmido permite seguir la expresión del ADNc del hsp70 utilizando el anticuerpo contra la' etiqueta de la influenza aún en la presencia del fondo de las isoformas del hsp70 endógenas. Los extractos celulares totales preparados a partir de las células transfectadas fueron analizados por el manchado de Western (Parks y Shenk, 1996) utilizando un anticuerpo específico para la etiqueta del epítope (Figura 4A) . El análisis de Western de los extractos de las células transfectadas mostraron que el plásmido de la expresión (Figura 4A) produce un polipéptido etiquetado ligeramente más grande que 70 kD. La cotransfección de las células 293-3-46 con el vector de expresión de hsp70 en compañía del plásmido de expresión y el ADN del minirreplicón condujo a la expresión incrementada de CAT (Véase la Figura 4B) . En este sistema de ensayo temporal, la sobreexpresión del hsp70 incrementó el nivel bajo del complemento L en tanto como 20 veces. Este incremento en la expresión de CAT inducida por el vector de la expregión del hsp70 es aparentemente % específica a causa de que la misma requiere la presencia del plásmido de la polimerasa L y no incrementa la actividad de CAT del fondo observada cuando L está ausente o el plásmido del CAT es omitido de la transfección. Estos resultados sugieren fuertemente que el hsp70 es al menos responsable en parte del efecto del choque térmico sobre la expresión del minigenoma.

Ejemplo 7 Rescate por Choque Térmico de la Expresión del Minirreplicón en las Células Vero Se repitió el procedimiento del Ejemplo 4, las células 293-3-46 fueron reemplazadas por las células Vero.

Materiales: Para los experimentos de transfección de las células Vero, las proteínas N, P y L del Sarampión son provistas por los ADNs del plásmido y la polimerasa del ARN del T7 es provista por la infección del MVA/T7 (Wyatt y colaboradores) . La transfección incluyó 100 ng del minirreplicón, 400 ng del plásmido N, 300 ng del plásmido P, y las cantidades del plásmido L como se muestran en la Tabla 2 posterior. Las transfecciones de control negativas carecieron del soporte del plásmido L. Además, las células Vero fueron transfectadas con LIPOFECTACE (comprado de Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) como un reactivo de transfección. Para cada prueba, 2 unidades de formación de la placa (PFU) del MVA/T7 (Wyatt y colaboradores) por reacción de transfección, son utilizadas. Dos volúmenes de LIPOFECTACE fueron probados para determinar la cantidad óptima para la transfección de las células Vero eficientes. La transfección es efectuada con dos diferentes cantidades del plásmido de la expresión de la proteína L. Para el choque térmico, las células son transferidas a un baño de agua a 44 °C durante 3 horas. Las células de control no son sometidas al choque térmico.

MVA/T7: El MVA/T7 es un virus híbrido que contiene una copia integrada del gen 1 de T7 bajo la regulación del promotor final fuerte de 11K (Wyatt y colaboradores, 1995) . Plásmidos de expresión: El plásmido L fue provisto por Radecke y Billeter. Básicamente, el gen L del sarampión se clonó en el vector del plásmido de pEMC (Moss y colaboradores, 1990) por los métodos de clonación descritos por Radecke y colaboradores, (1995) para generar el pEMC-La del plásmido. Este vector incluye un sitio de entrada del ribosoma interno y una secuencia de ^oli-A del extremo 3' para facilitar la expresión de los genes clonados en las células eucarióticas. El mismo vector es utilizado para preparar los vectores para cada uno de los genes N y P. Las regiones de codificación de las proteínas N y P fueron amplificadas por el PCR a partir del ADNc genómico del virus del sarampión (Radecke y colaboradores, 1995) luego se clonó entre los sitios de Ncol y BamHI del pEMC del vector para generar pT7-N y pT7-P.

Protocolo de las Células Vero para el Choque Térmico: Para LIPOFECTACE Y EFFECTENE LIPOFECTACE: Las células Vero se hicieron crecer en cajas o discos de cultivo de seis cavidades hasta que las mismas tiene una confluencia de aproximadamente 50-80%. Las células a aproximadamente una confluencia del 75% son deseables, a causa de que en esta etapa las mismas todavía se están dividiendo rápidamente y están sanas, y la densidad celular más elevada ayuda a neutralizar la muerte celular incurrida durante la transfección, la infección. por MVA/T7 y el choque térmico. La mezcla de lípidos-ADN para la transfección es preparada combinando los ADNs (N, P, L y el minirreplicón de MV) y 200 µl del DMEM libre del suero en un tubo de máquina microcentrífuga. El LIPOFECTACE (12 o 15 µl dependiendo del experimento) se agregó a la mezcla del medio del ADN y se mezcló suavemente seguido por una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, la mezcla de ADN-LIPOFECTACE se combinó con 800 µl del DMEM libre de suero que contiene la cantidad apropiada del MVA/T7 para dar una cantidad final de aproximadamente 2 PFU por célula. El medio es removido de los cultivos de las células Vero y se reemplaza con la mezcla de transfección que contiene el ADN, el LIPOFECTACE y el MVA/T7. Las células son incubadas en un incubador a 37 °C fijado al 5% de C02 durante 2-6 horas. Para las células Vero, esta incubación parece que va a ser óptima a las 2-3 horas. Al final de este período de incubación, 1 ml del DMEM suplementado con 10% de suero de bovino fetal es agregado a las células y los cultivos celulares apropiados son sometidos al choque térmico durante 2-3 horas a 44 °C (3 horas parecen óptimas para las células Vero) . Para efectuar el choque térmico, la caja de 6 cavidades es transferida a una bolsa de plástico Ziplock y luego se sumerge en un baño de agua a 44 °C. Al final del período de choque térmico de 2-3 horas, las células son removidas de la bolsa de plástico y regresadas al incubador a 37 °C para la incubación toda la noche. El siguiente día, el medio es reemplazado con 2 ml del DMEM fresco que contiene 10% de suero de bovino fetal. Aproximadamente 48 horas después de la transfección, las célulajfPson colectadas para preparar el extracto para los ensayos de CAT o las células son colectadas y transferidas a una caja o disco de 10 cm que contiene una monocapa de las células Vero para permitir la expansión de la placa. Las células fueron analizadas entonces para verificar la actividad de CAT. La actividad de CAT fue estimulada aproximadamente 7 veces por el choqué térmico cuando se utiliza bajo las condiciones de 12 µl del LIPOFECTACE y 100 ng del plásmido L. La actividad de CAT fue estimulada aproximadamente 2 veces por el choque térmico cuando se utiliza bajo las condiciones de 15 µl del LIPOFECTACE y 100 ng del plásmido L. Véase la Tabla 2 en seguida.

.Tabla 2 Ejemplo 8 Comparación de los Reactivos para Facilitar la Transfección para el Rescate del choque Térmico en las Células Vero El experimento anterior se repitió utilizando ya sea LIPOFECTACE o EFFECTENE (Qiagen Inc., Valencia, CA) . Para el EFFECTENE el protocolo es esencialmente idéntico excepto para la preparación de la mezcla de lípidos-ADN. El ADN es mezclado con 100 µl de la solución salada amortiguada provista con el reactivo de EFFECTENE. Luego 8 µl del reactivo de condensación de EFFECTENE son agregados y la mezcla es incubada durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación se agregan 25 µl (o la cantidad especificada en. la Figura) del EFFECTENE y la mezcla es incubada durante unos 15 minutos adicionales. Después de 15 minutos de incubación, el complejo de ADN-EFFECTENE es mezclado con 900 µl del medio libre de suero que contiene suficiente MVA/T7 para proporcionar aproximadamente 2 PFU por célula. En esta etapa, la aplicación de la mezcla de ADN-MVA/T7 a las células y todos los pasos subsiguientes es idéntica a los pasos' seguidos por LIPOFECTACE. Los resultados se muestran posteriormente en las Tablas 3a y 3b. (Lipo=LIPOFECTACE) . La actividad del minirreplicón se incrementó cuando el choque térmico se efectuó a las 2 horas después de la transfección.

Tabla 3a Tabla 3b Ejemplo 9 Transfección de las células Vero con una Técnica Amortiguadora Modificada Materiales: BES es: {ácido N,N-bis [2-hidroxietil] -2-aminoetansulfónico} Transfección de las células Vero para el rescate utilizando el procedimiento de BE?/Fosfato de calcio Las células Vero se hicieron crecer en discos o cajas de cultivo de seis cavidades hasta que las mismas tienen una confluencia de aproximadamente 50-80%. Las células tienen una confluencia de alrededor del 75% a causa de que en esta etapa las mismas se estén dividiendo rápidamente y están sanas, y la densidad celular más elevada ayuda a la neutralización de la muerte celular incurrida durante la transfección, la infección por MVA y el choque térmico. El día de la transfección, las células son alimentadas con 4.5 ml del medio por cavidad y se transfirieron a un incubador fijado a 37 °C (o inferior para la temperatura si se rescata un virus sensible a la temperatura) y 3% de C02. El medio utilizado rutinariamente en los experimentos es el DMEM suplementado con 10% de suero de bovino fetal (otros medios también trabajarán bien) . Aproximadamente dos a cuatro horas después de la alimentación de las células, la transfección es iniciada. Los precipitados de fosfato de calcio-ADN para la transfección son preparados en tubos de polipropileno de 5 ml. Los ADNs para el rescate, incluyendo los plásmidos de la expresión para N, í^ y L y el minirreplicón de MV son ^& combinados con agua a un volumen final de 225 µl. A continuación, 25 µl de 2.5 M de CaCl2 son agregados y los tubos son mezclados suavemente. Después de la preparación de todas las mezclas de A£>N CaCl2, los precipitados son preparados por la adición de 250 µl de la solución salada amortiguada con BES 2X (2XBBS: 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HP04, 50 mM BES, pH 6.95-6.98). El 2XBBS es agregado por goteo a cada tubo mientras que se agita en forma de ' remolino continuamente durante la adición del BBS. Después de agregar el 2XBBS, los tubos son incubados 20 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación a temperatura ambiente, los precipitados de 500 µl son agregados a las células por goteo y la placa se somete a vibración suave para asegurar el mezclado de los precipitados con el medio. Después de la adición de los precipitados, aproximadamente dos unidades formadoras de la placa (pfu) del MVA/T7 o MVA/T7-GK16 son agregadas directamente al medio y la placa se somete a una vibración suave para el mezclado. Cuando se utiliza el GK16, un inhibidor de la síntesis del ADN es agregado al medio en esta etapa. Ya sea la citosina arabinosida (araC) o la hidroxiurea (HU) es agregada al medio a 20 µg por ml o 10 mM, respectivamente. A las 3 horas después de la transfección, las células son transferidas a una bolsa $ ziplock de plástico y se sumergieron en un baño de agua fijado a 44 °C para el choque térmico. Las células son incubadas a 44 °C durante 2-3 horas (en el intervalo de 3h más prolongado parece que trabaja mejor) luego se transfiere de regreso al incubador fijado al 3 % de C02 para la incubación toda la noche. El siguiente día, los componentes del medio y de la transfección son removidos de las células y las células son lavadas 2X con la solución salada amortiguada con hepes (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2) luego se agrega un medio fresco. El AraC o el Hu es rellenado en los cultivos que fueron infectados con el MVA/T7-GK16. Las células son incubadas un día adicional en un incubador fijado a 37 °C estándar y 5% de C02 (si un virus sensible a la temperatura está siendo rescatado, las células pueden ser incubadas 2 días a la temperatura inferior apropiada después de agregar el medio fresco) . Las células transfectadas son colectadas entonces para un paso de expansión de la placa para el rescate del virus o son colectadas para preparar los extractos celulares para los ensayos de CAT. Las células transfectadas son raspadas del medio y transferidas ya sea a una caja de 10 cm o a un recipiente T25 que contiene una monocapa del 50% de confluencia de las células Vero (u otro tipo de célula permisiva de elección) . Las células cocultivadas son incubadas a 37 °C (o a la temperatura apropiada que se señaló anteriormente) 4 hasta seis horas, luego se reemplaza el medio. El reemplazo del medio en esta etapa es esencial cuando las células transfectadas contuvieron inhibidores de la síntesis del ADN para inhibir el crecimiento celular en el cocultivo durante el paso de expansión de la placa. Aproximadamente a los cuatro a cinco días después del inicio del paso de expansión de la placa, las placas son visibles y las células pueden ser colectadas para generar una materia prima del lisa'do para congelamiento-licuado del virus rescatado. Los resultados del ensayo de CAT son mostrados en las Tablas 4a y 4b posteriores. El procedimiento del BES/fosfato de calcio mejoró la actividad.

Tabla 4a Tabla 4b Para las técnicas de transfección de lo que se mencionó anteriormente, véase Chen y colaboradores, 1987 y Tognon y colaboradores, 1996.

Ejemplo 10 Rescate Mejorado basado en ei uso de los inhibidores de la síntesis del ADN y un Virus de Vaccinia Ankara Modificado (MVA) recombinante que sintetiza la p'olimerasa del ARN de T7 del bacteriófago bajo el control de un promotor inicial/final fuerte Con base en los anterior, se postuló que por la inhibición específica de la replicación del ADN viral del MVA/T7 auxiliador se podría: 1. Bloquear todo el crecimiento del MVA/T7, 2. Reducir adicionalmente el CPE en las células infectadas, y 3. Mejorar la eficiencia d los rescates genéticos de los virus del ARN. Los inhibidores (citosina beta-D-arabinofuranosida, AraC y/o hidroxiurea) bloquean la síntesis del ADN viral, y subsiguientemente la expresión del gen intermedia y final, viral. Un MVA/T7 recombinante (MVGK16) se diseñó para que contenga una sola copia del gen 1 de T7 bajo el control transcripcional del promotor del virus de vaccinia inicial/final, sintético, fuerte. Los estudios preliminares, en donde el MVGK16 fue utilizado como un virus^. auxiliador para el rescate genético de los minigenomas del sarampión y los ADNcs del sarampión de longitud completa, han indicado que el tratamiento de las células infectadas con AraC o hidroxiurea conduce a un mejoramiento del rescate genético del virus heterólogo (datos no mostrados).

Plásmidos y Virus . Para este estudio se eligió el plásmido de expresión/recombinación pSC65 del virus de vaccinia. Este plásmido permite la expresión de los genes extraños bajo la regulación de un promotor inicial/final viral, diseñado genéticamente; el mismo también proporciona un marcador de selección de lacZ bajo la regulación del promotor de 7.5K viral. El gen 1 de T7 (Moffatt y colaboradores, 1984) fue escindido del pT7-neo (provisto por el Dr. Sally Lee, Wyeth-Lederle Vaccines) como un fragmento de BamHI y se subclonó en el sitio de BglII de pSC65 (Chakrabarti y colaboradores, 1997), para generar PGK16.2 (Figura 6). Los plásmidos recombinantes fueron secuenciados utilizando un secuenciamiento del ciclo terminador del tinte y el secuenciador del ADN 377ABI (Applied Biosystems). Los fibroblastos del embrión del pollo (CEF; Spafas) fueron infectados con MVA en una multiplicidad de sitios de infección (MOI) igual a 0.5 unidades formadoras de la placa (PFU) por célula y se transfectaron con pGK16.2 utilizando el reactivo que facilita la transfección de DOTAP (Boehringer Mannheim) . La recombinación homologa con el ADN de MVA conduce a la interrupción del gen tk viral y a la inserción del gen 1 de T7 y lacZ. Los virus recombinantes (MVGK16) fueron purificados en la placa tres veces consecutivamente sobre las células CEF utilizado un ensayo de placa colorimétrica X-gal. El MVGK16 recombinante fue estable a tra és de tres rondas consecutivas de purificación de la placa y cuatro rondas de amplificación sobre CEFs como se evidenció por el inmunoteñido con el antisuero policlona] de conejo contra la polimerasa de T7 y el virus de vaccinia (datos no mostrados) .

Rescates genéticos . El procedimiento del Fosfato de Calcio/BES anterior fue repetido con el sistema de expresión MVA/GK16, el cual contiene el promotor inicial/final para la transcripción de T7. Las modificaciones al protocolo de rescate anterior para el Fosfato de Calcio/BES son señaladas aquí. Cuando se utiliza el GK16, un inhibidor de la síntesis del ADN es agregado al medio en esta etapa. Se agregan al medio ya sea la citosina arabinosida (araC) o la hidroxiurea (HU) a 20 µg por ml o lOmM, respectivamente. Las células son incubadas toda la noche en un conjunto incubador a 3% de C02. La transfección y el choque térmico son complementados siguiendo el protocolo anterior para el Ejemplo de BES. El araC o el HU son rellenados en los cultivos que fueron infectados con el MVA/GK16. Las células son incubadas un día adicional en un conjunto incubador a 37 °C y 5% de C02 estándares (si un virus sensible a la temperatura está siendo rescatado de las células que pueden ser incubadas 2 días en la temperatura inferior apropiada después de la adición- del medio fresco) . Las. células transfectadas son colectadas entonces para un paso de expansión de la placa. Las células transfectadas son retiradas por raspado hacia el medio y se transfieren ya sea a una caja de 10 cm o a un recipiente T25 que contiene una monocapa del 50% de confluencia de las células Vero (u otro tipo de célula permisiva de elección) . Las células cocultivadas son incubadas a 37 °C (o la temperatura apropiada) 4 a seis horas, luego el medio es reemplazado. Es particularmente importante reemplazar el medio en esta etapa cuando las células transfectadas contuvieron inhibidores de la síntesis del ADN. La inhibición del crecimiento celular en el cocultivo durante el paso de expansión de la placa no es deseada. En aproximadamente cuatro a cinco días después de iniciar el paso de expansión de la placa, las placas deben ser visibles y las células pueden ser colectadas para generar una materia prima del lisado para el congelamiento-licuado del virus rescatado.

Experimentos de rescate genético. El protocolo anterior condujo a una mejora consistente en el número decavidades con una indicación positiva del rescate. Véase la Tabla 5 posterior. Los experimentos son marcados con. más ( +) o menos (-) después de la primera pasada del virus recombinante sobre las células Vero. Los números de la placa en las cavidades positivas variaron desde 1 hasta 50. Todos los experimentos contuvieron 20 ug/ml de AraC en el medio durante la transfección toda la noche y un período de incubación de 24 horas subsiguiente cuando se utilizó el MVA/T7-GK16. Para el experimento en el Día 9, la hidroxiurea 10 mM fue substituida por el inhibidor de la síntesis del ADN de araC.

Tabla 5 En seguida se provee una lista de referencias las cuales son incorporadas aquí. REFERENCIAS Andrews, J. M., Newbound, G. C, and Laipnore, M. D. (1997). Trapscriptispal modulation of viral repórter gene constructs following induction of the cellular stress response. Nucleic Acids Research 25, 1082-1084. Antoine, G., Scheiflinger, F.. Dorner, F., and Falkner, F.G. The complete genomic sequence of the modified vaccinia virus Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. Virology. 244(2):365-96, mayo 1988.

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Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un virus de Mononegavirales recombinante, caracterizado porque comprende : a) en al menos una célula huésped, llevar a cabo la transfección, en el medio, de una composición de rescate la cual comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula de ácido nucleico aislada la cual comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del Orden de Mononegavirales y (ii) al menos un vector de expresión el cual comprende una o más molécula (s) de ácido nucleico aislada (s) que codifican las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación; bajo condiciones suficientes para permitir la coexpresión de los vectores y la producción del virus recombinante; y b) calentar la composición de rescate transfectada a una temperatura de choque térmico efectiva bajo condiciones suficientes para incrementar la recuperación del virus recombinante.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende colectar el virus recombinante.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura del choque térmico efectiva está arriba de 37 °C.

4. El método de conformidad 'con la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura del choque térmico efectiva está en el intervalo desde 37 °C hasta aproximadamente 50 °C.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura del choque térmico efectiva está en el intervalo desde 38 °C hasta aproximadamente 49 °C.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura del choque térmico efectiva está en el intervalo desde 39 °C hasta aproximadamente 48 °C.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura del choque térmico efectiva está en el intervalo desde 41 °C hasta aproximadamente 47 °C.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células transfectadas son sometidas a la temperatura del choque térmico efectiva de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 300 minutos.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células transfectadas son sometidas a la temperatura de choque efectiva durante aproximadamente 15 hasta aproximadamente 240 minutos.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células transfectadas son sometidas a la temperatura de choque térmico efectiva durante aproximadamente 15 hasta aproximadamente 200 minutos.

11. El método de conformidad con . la reivindicación 1, caracterizado porque después del paso (b) la composición de rescate transfectada es transferida sobre al menos una capa de las células Vero.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la capa de las células Vero es una monocapa.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus del ARN del Orden de Mononegavirales es un virus humano, de bovino o de murino.

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del Orden de Mononegavirales, es una quimera de más de una fuente de genoma o antigenoma.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula del ácido nucleico aislado que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del Orden de los Mononegavirales, codifica un virus atenuado o una forma infecciosa del virus.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del Orden de los Mononegavirales, codifica una forma infecciosa del virus.

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del orden de los Mononegavirales, codifica un virus atenuado.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico aislada que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del Orden de los 'Mononegavirales, codifica un virus atenuado, infeccioso.

19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus de ARN es un virus de la Familia de Paramyxoviridae.

20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus de ARN es un virus de la Familia de Rhabdoviridae.

21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus de ARN es un virus de la Familia de Filoviridae.

22. El método de conformidad 'con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus de ARN es un virus seleccionado del grupo que consiste de MV, RSV, PIV y BPV.

23. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus de ARN es un MV del virus.

24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido codifica el genoma o el antigenoma de un virus de ARN seleccionado del grupo que consiste de los virus de RSV y las proteínas de actuación trans necesarias para . la encapsidación, la transcripción y la replicación son N, P, L y M2.

25. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido codifica el genoma o antigenoma de MV y las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación son N, P y L.

26. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido codifica el genoma o el antigenoma de PIV-3 y las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, transcripción y replicación son NP, P y L.

27. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula huésped es una célula procariótica.

28. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula huésped es una célula eucariótica.

29. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula huésped es una célula de vertebrado.

30. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula huésped es una de E. coli.

31. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula huésped es derivada de una célula humana.

32. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula huésped es derivada de una célula embriónica humana.

33. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula huésped es derivada de una célula del riñon embrionario humano.

34. Un virus recombinante, caracterizado porque se prepara de conformidad con el método de la reivindicación 1.

35. Una composición, caracterizada porque comprende (i) un virus recombinante preparado a partir, del método de conformidad con la reivindicación 1 y (ii) un portador aceptable farmacéuticamente.

36. Un método para producir un virus de Mononegavirales recombinante, caracterizado porque comprende : a) en al menos una célula huésped, llevar a cabo la transfección de una composición de rescate la cual comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula de ácido nucleico aislada la cual comprende un polinucleótido que codifica un genoma o antigeno'ma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del Orden de los Mononegavirales y (ii) al menos un vector de expresión el cual comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislada que codifica las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación; bajo condiciones suficientes para permitir la coexpresión de los vectores y la producción del virus recombinante; y b) transferir la composición de rescate transfectada sobre al menos una capa de las células de expansión de la placa.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la capa de células de expansión de la placa es una monocapa.

38. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque además comprende colectar el virus recombinante.

39. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque las células de expansión de la placa son de una confluencia de al menos aproximadamente 50%.

40. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque las células de expansión de la placa son de una confluencia de al menos aproximadamente 60%.

41. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque las células de expansión de la placa son de una confluencia de al, menos aproximadamente 75%.

42. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque las células transfectadas son colocadas en uno o más recipientes de. las células de expansión de la placa de tal modo que el área superficial de las células Vero sea mayor que el área superficial utilizada en la generación del virus transfectado.

43. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque las células de expansión de la placa son las células Vero.

44. El método de conformidad con - la reivindicación 1, caracterizado porque el vector de transcripción comprende además un gen de polimerasa de T7.

45. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición de rescate comprende además un virus auxiliador modificado o no modificado.

46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el virus auxiliador proporciona un gen de la polimerasa de T7 para la transcripción de la secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma del virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, en donde la composición de rescate comprende además un virus auxiliador modificado.

47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el gen de T7 está bajo el control regulatorio de un promotor final o un promotor inicial/final.

48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el gen T7 está bajo la regulación de un promotor inicial/final.

49. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la transfección es conducida en la presencia de un inhibidor de la síntesis del ADN.

50. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula huésped para la transfección es una célula Vero. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos mejorados para producir virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentados, del Orden designado virus Mononegavirales, que incluyen las modalidades que se refieren a los métodos de producción de tales virus como virus atenuados y/o infecciosos, tales como el virus del Sarampión (MV) y el virus sincitial respiratorio '(RSV) . Un método para producir un virus recombinante del Orden Mononegavirales comprende (a) en al menos una célula huésped, conducir o llevar a cabo la transfección de una composición de rescate la cual comprende (i) un vector de transcripción que comprende una molécula de ácido nucleico aislada la cual comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma de un virus de ARN de una sola hebra, de sentido negativo, no segmentado, del Orden Mononegavirales y (ii) al menos un vector de expresión el cual comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislada que codifica las proteínas de actuación trans necesarias para la encapsidación, la transcripción y la replicación; en una célula huésped bajo condiciones suficientes para permitir la coexpresión de estos vectores y la producción del virus recombinante; (b) calentar la composición de rescate transfectada a una temperatura de choque térmico efectiva bajo condiciones suficientes para incrementar la recuperación del virus recombinante; y opcionalmente, (c) colectar el virus recombinante resultante.