KR20000052920A - 알엔에이 바이러스의 감염 클론과 이들로부터 유도된 백신 및 진단 에세이 방법 - Google Patents
알엔에이 바이러스의 감염 클론과 이들로부터 유도된 백신 및 진단 에세이 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 최소한 약 15 kb의 게놈을 가지는 양성 가닥 RNA 바이러스의 게놈을 기초로 한 감염 클론을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 RNA 바이러스의 게놈을 기초로 한 감염 클론을 생산하기 위한 방법을 제공하며 이 방법은 재조합 핵산으로 숙주 세포를 형질감염하여 감염 클론을 선택하는 단계로 이루어지되 여기서, 상기 숙주 세포는 본질적으로 상기 바이러스에 감염되지 않는다. 또한, 본 발명은 변성된 RNA 바이러스와 백신 및 이로부터 유도된 진단 에세이를 제공한다.
Description
DNA 재조합 기술은 DNA 수준에서 핵산을 변성시키는 것을 목적으로 하는 매우 다양하고 강력한 분자 생물학 기술이며 분자 수준에서 게놈을 분석하고 변성할 수 있게 하였다. 이러한 점에서 바이러스는 이들의 게놈이 작다는 이유로 상기한 바와 같은 조작에 특히 유용하다. 그러나, 비레트로바이러스성 RNA 바이러스는 이들의 복제 과정에서 DNA 중간단계를 거치지 않기 때문에 이들 바이러스에는 DNA 재조합 기술을 바로 적용할 수 없다. 이러한 바이러스에 있어서는 변성된 바이러스를 만들 수 있는 이들의 게놈에 DNA 재조합 기술을 적용하기 전에 감염 클론(예를 들면 DNA 복제물이나 시험관 내에서 전사된 RNA 복제물 또는 이들의 유도체 등)이 개발되어야만 한다. 감염 클론은 전체 길이의 cDNA로 형질감염된 세포에서 감염 전사물을 생체 내 합성한 후에 바이러스의 전체 길이(게놈 길이) cDNA(RNA로부터의 DNA 복제물의 광역 센스에서와 mRNA로부터의 DNA 복제물의 정밀 센스에서 사용된)를 구성하여 유도될 수 있지만 감염 전사물은 전체 바이러스 게놈으로 이루어진 시험관 내에서 결찰된 부분 길이의 cDNA 절편으로부터 시험관내 전사에 의해 얻어질 수 있다. 어느 경우에서든 전사된 RNA는 cDNA에 삽입된 모든 변성을 담지하며 이렇게 변성된 바이러스를 재전달하는데 이용될 수 있다.
감염 cDNA 클론과 감염성 시험관 내 전사물이 12kb 정도 또는 그보다 약간 큰 게놈을 가지는 수많은 양성 가닥 RNA 바이러스 (Boyer and Haenni, Virology 198, 415-426)에 대하여 제조되었다. Pestiviruses의 바이러스 게놈 길이는 현재까지는 감염 클론(Moormann et al., J. Vir. 70:763-770)이 제조된 가장 긴 양성 가닥 바이러스 RNA 게놈으로 보인다. 게놈의 길이와 관련하여는 박테리아 내에서 길고 안정한 cDNA 클론을 얻어서 유지하여야 하는 어려움 뿐만 아니라 바이러스 복제와 연결된 정상 결합 바이러스 단백질의 도움 없이 숙주 세포 내에서의 복제가 이루어져야만 하는 초기 RNA 전사물의 감염성이라는 문제가 있다. 성공적인 감염을 얻기 위하여는 바이러스 전사물이 바이러스성 코드 단백질, 특히 바이러스 리플리카제 및 번역 구조물과 같은 숙주 세포 성분과 반응하여야만 하므로 바이러스 전사물의 구조는 가능한 한 비리온 RNA의 구조에 가까워야만 한다. 게놈의 3'쪽에서 전사된 서브게놈 메신저 RNA의 메카니즘에 의해 복제되는 양성 가닥 RNA 바이러스와 복제 단계에서 수개의 구조 단백질과 게놈의 일부 만으로 이루어진, 원상태의 캡시드 또는 비어 있는 쉘 입자 등의 결손 간섭 입자를 생성하는 양성 가닥 RNA 바이러스에서 또 다른 문제가 발견될 수 있다. 불완전한 바이러스 RNA 절편의 존재나, 또는 예를 들면 전사될 바이러스 RNA나 복제성 중간체 RNA와 반응하거나 간섭하여 그 구조를 파괴하는 매트릭스 또는 뉴클리오캡시드 단백질의 존재는 전체 길이의 RNA 가닥 합성을 방해하게 되어 게놈 길이 RNA를 가지는 감염 바이러스를 생성할 수 없게 될 것이다.
소위 돼지 생식 호흡증 바이러스(PRRSV, 게놈 길이 15.2 kb)로 불리우는 렐리스테드 바이러스(LV)는 말 동맥염 바이러스(EAV, 게놈 길이 12.7 kb), 락테이트 탈수소효소 상승 바이러스(LDV, 게놈 길이 14.2 kb 이상) 및 원숭이 출혈열 바이러스(SHFV, 게놈 길이 약 15 kb 이상)(Meulenberg et al., 1993a; Plagemann and Moennig, 1993) 등으로 이루어지는 Arteriviridae류 중 하나이다.
최근 바이러스 분류학 국제 위원회는 Coronaviridae(게놈 길이 28 내지 30 kb)와 Toroviridae(게놈 길이 26 내지 28 kb)와 함께 상기한 바이러스류를 새로운 목의 바이러스 Nidovirales에 통합하기로 결정하였다. Nidovirales목은 양성 가닥 RNA 게놈을 가지며 복제 단계에서 서브게놈 RNA의 3'의 포개진 세트를 합성하는 외피가 있는 RNA 바이러스이다. 코로나바이러스와 아테리바이러스의 서브게놈 RNA는 바이러스 게놈의 5' 말단에서 유도된 리더 서열을 가진다(Spaan et al., 1988; Plagemann and Moennig, 1993). 토로바이러스의 서브게놈 RNA는 리더 서열이 없다(Snijder and Horzinek, 1993). RNA 의존성 RNA 폴리머라제를 코드하는 ORF 1a와 1b가 게놈 RNA로부터 발현되는 반면, 구조 단백질을 코드하는 Nidovirales 게놈의 3' 말단의 더 작은 ORF는 서브게놈 mRNA로부터 발현된다.
PRRSV(렐리스테드 바이러스)는 1991년에 Wensvoort 등에 의해 처음 단리되었으며 지금은 돼지의 생식 호흡증(PRRS)으로 알려진 새로운 질병의 원인물질인 것이 증명되었다. 이 질병의 주요 증상은 돼지의 호흡 장애와 암컷 돼지의 유산이다. 1987년 미국과 1991년 유럽에서 처음 관찰된 바와 같은 대량의 발병이 소멸되기는 하였으나, 이 바이러스는 미국, 유럽 및 아시아에서 여전히 가축의 경제적 손실을 유발하고 있다. PRRSV는 선택적으로 폐포 마크로파지에서 자란다(Wensvoort et al., 1991). CL2621 등의 몇몇 세포계와 원숭이 신장 세포계 MA-104에서 클론된 다른 세포계(Benfield et al., 1992; Collins et al., 1992; Kim et al., 1993) 또한 이 바이러스에 감염될 수 있다. 일부 잘 알려진 PRRSV 균주로는 기탁번호 CNCM I-1102, I-1140, I-1387, I-1388, ECACC V93070108, 또는 ATCC VR 2322, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 및 VR 2402 하의 균주가 있다. PRRSV의 게놈은 전체 또는 일부가 서열화되어(Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al., 1993a, Murthaugh et al., 1995) RNA 의존성 RNA 폴리머라제(ORF 1a 및 1b) 뿐만 아니라 GP2(ORF2), GP3(ORF3), GP4(ORF4) 및 GP5(ORF5)로 명명된 4개의 당단백질을 포함한 6개의 구조 단백질, 글리코실화되지 않은 막 단백질 M(ORF6) 및 뉴클리오캡시드 단백질 N(ORF7)을 코드한다(Meulenberg et al., 1995, 1996; van Nieuwstadt et al., 1996). PRRSV의 유럽 및 미국 균주에 대한 면역학적 특성화와 뉴클레오티드 서열화에서는 구조 바이러스 단백질에 위치한 PRRSV 균주 내에서 미세한 항원성 차이가 확인되었다(Nelson et al., 1993; Wensvoort et al., 1992; Murtaugh et al., 1995).
돼지는 구강 경로에 의해 PRRSV에 감염될 수 있다. 폐 속의 바이러스는 폐포 마크로파지에 위치하여 이들 세포 내에서 9 시간 이내에 PRRSV의 복제를 완료한다. PRRSV는 12 시간 이내에 폐에서 폐 림프절로, 3일 이내에 말초 림프절, 골수 및 비장으로 옮겨간다. 이 부위에서는 몇 개의 세포 만이 바이러스 항원에 대해 양성을 나타낸다. 이 바이러스는 적어도 21일 동안 또는 때때로 그보다 더 오랫동안 혈액 중에 존재한다. 7일 후에 PRRSV에 대한 항체가 혈액에서 발견된다. PRRS에 감염된 돼지 내에서 바이러스와 항체의 공존은 항체가 있음에도 불구하고 바이러스 감염이 낮은 수준이지만 오랜 시간 동안 지속될 수 있음을 나타낸다. 적어도 7주 동안 폐 속의 폐포 세포 개체군은 정상적인 SPF 폐와는 달랐다.
PRRSV는 구강 경로에 의해 돼지에 감염되기 위하여 그 외피를 필요로 하므로 돼지의 정상적인 면역 반응은 특히 1 이상의 외피 단백질에 대한 항체를 중성화하는 과정을 수반하는데 이러한 항체는 바이러스를 비감염성이 되게 할 수 있다. 그러나, 폐포 마크로파지에서라면 바이러스도 때때로 당단백질 중 어느 하나를 부분적으로 함유하는 M 및/또는 N 단백질에 의해 단백질 막으로 싸여진 RNA로 구성된 원상태의 캡시드를 생산한다. 이러한 불완전한 바이러스 입자 또는 (부분적으로) 원상태 캡시드의 세포 내외의 존재는 전자 현미경으로 관찰할 수 있다. 종종 핵산이 없는 원상태의 캡시드가 발견되기도 한다. 원상태의 캡시드는 혈류에 의해 몸 전체에 분포되어 비장, 림프절 및 골수 내의 마크로파지에 의해 혈액으로부터 취해진다. 이러한 원상태의 그러나 감염성의 바이러스 캡시드는 돼지가 생산하는 항체에 의해 중성화될 수 없는데, 따라서 항체 존재 하에서의 바이러스 감염의 지속성을 설명할 수 있다. 이러한 방법으로 감염된 골수 세포에서 얻어진 마크로파지 소산물은 몸체의 새로운 부위로 바이러스 감염을 퍼뜨린다. 골수 마크로파지 계통 세포가 모두가 감염되는 것은 아니므로 말초 부위의 소수의 마크로파지 만이 감염되어 바이러스를 생산한다. ORF7 단백질 만으로 이루어진 PRRSV 캡시드는 다른 바이러스 단백질 없이, 예를들면 키메릭 의사광견병-ORF7 벡터 바이러스를 가지는 마크로파지의 감염에 의해 생성될 수 있다. PRV 바이러스는 PRRSV의 ORF7 유전정보를 가지도록 조작되었다. 감염 18시간 후, 감염된 세포의 세포질은 PRRS 바이러스 뉴클레오캡시드 크기를 가지는 다수의 작고 비어 있는 구형 구조를 포함하였다.
본 발명은 RNA 바이러스와 RNA 바이러스에서 얻어진 감염 클론에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 RNA 바이러스의 감염 클론을 이용하고 변성하여 얻어질 수 있는 백신 및 진단 에세이 방법에 관한 것이다.
도 1은 LV의 게놈 길이 cDNA 클론의 구성을 나타낸 것이다. 상부(A)는 pGEM-4Z 내에서 미리 서열화된(Meulenberg et al., 1993a) cDNA 클론의 융합을 나타낸다. 클론의 pABV 수와 사용된 제한 부위를 나타내었다. 블랙 박스는 다음의 클로닝 단계에서 융합되는 cDNA 클론 부분을 나타낸다. R.T.으로 표시된 밝은 회색 박스는 RT-PCR에 의해 새로 제조된 cDNA 클론이며, 진한 회색 상자는 PCR에 의해 생성된 새로운 cDNA 클론이다. 하부 (B)는 저복제수 벡터 pOK12 내의 거대 cDNA 클론 pABV331/369, pABV384, pABV368, 및 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 함유하는 5' 말단 클론 pABV396과 폴리 (A) 꼬리를 가지는 3' 말단 클론 pABV395의 조합을 나타낸 것이다. pOK12의 다중 클로닝 부위 내외부의 제한 부위를 표시하였다. 제한 엔도뉴클레아제 부위는 다음과 같다; A, ApaI; Ap, ApoI; B, BamHI; Bg, BglII ; Bs, BspE1; Bc, BclI; E, EcoRI; Ec, EcoRV; H, HindIII; K, KpnI; N, NarI; Nc, NcoI; S, SacII; Sp, SpeI; Sa, SalI; Sc, ScaI; P,
PstI; Pm, PmlI; X, XbaI; Xh, XhoI.
도 2는 클론된 전체 길이 LV cDNA의 터미널 서열과 이 cDNA 클론으로부터 전사된 감염 RNA를 나타낸 것이다. 게놈 길이 cDNA 클론은 PvuI으로 선형화시키고 T7 RNA 폴리머라제를 가지는 합성 캡 아나로그 m7G(5')ppp(5')G의 존재 하에 전사하였다. 얻어진 RNA는 5' 말단에 여분의 1 뉴클레오티드(G)와 3' 말단에 여분의 2 뉴클레오티드 (GC)를 함유하여야 한다. RNA의 화살표는 확실한 LV RNA 서열에 해당하는 5'와 3' 터미널 뉴클레오티드에 해당한다.
도 3은 돼지 폐포 마크로파지 (A)와 CL2621 세포 (B)에서의 LV 야생형 바이러스 TH, LV4.2.1, 및 재조합 바이러스 vABV414와 vABV416의 성장 곡선이다. BHK-21 세포 내에서 제조된 재조합 바이러스 vABV414와 vABV416을 직접 (BHK), 또는 돼지 폐포 마크로파지 (PAM) 내에서의 증식 후에 사용하였다. TH 바이러스는 돼지 폐포 마크로파지 (PAM)에서 제조된 반면, LV4.2.1은 CL2621 세포 (CL)에서 제조되었다. 세포 배양물을 MOI 0.05에서 지시된 바이러스로 감염하여 지시된 시점에 회수하였다. 바이러스 역가(TCID50/㎖)를 종말점 희석법에 의해 돼지 폐포 마크로파지 또는 CL2621 세포에 대해 결정하였다.
도 4는 LV의 감염 cDNA 클론 내로의 독특한 PacI과 SwaI 부위의 삽입을 나타낸 것이다. PacI과 SwaI 부위는 상기 재료 및 방법란에 상세히 기재한 바와 같이 PCR 지향성 돌연변이에 의해 만들어졌다. PacI과 SwaI 부위를 함유하는 cDNA 절편을 지시된 그의 독특한 HpaI 및 XbaI 부위를 이용하여 pABV414에서 교환하였다. 그 결과 pABV437과 pABV442가 각각 얻어졌다.
본 발명에서는 이제까지 감염 클론을 얻은 양성 가닥 RNA 바이러스의 최대 게놈 길이를 훨씬 능가하는 게놈 길이를 가지는 바이러스로부터 유도된 감염 클론을 제공한다. 본 발명의 실험 부분에서는 게놈 길이가 15.2 kb인 PRRSV에 기초하여 유도된 감염 클론의 생산을 기재하였으나, 이 클론은 게놈 길이가 약 15 kb인 LDV와 SHFV, 그 게놈이 약간 더 작기는 하지만 EAV 및 Coronaviridae 또는 Toroviridae 등의 더 큰 게놈 길이를 가지는 바이러스로부터도 얻어질 수 있다.
본 발명은 또한 불완전한 바이러스 RNA 절편 또는, 예를들면 RNA 전사물을 전사하기 위한 바이러스 RNA나 복제성 중간체 RNA와 반응하거나 간섭하여 그구조를 분쇄하여 전체 길이 RNA 가닥 합성과 감염 바이러스의 생성을 방해하는 매트릭스 또는 뉴클리오캡시드 단백질의 존재와 관련된 바이러스 RNA 가닥 합성에서 부딪히는 문제를 피하여 감염 클론을 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 야생형 바이러스에 본질적으로 감염되지 않는 숙주 세포를 상기 바이러스의 게놈에 기초한 재조합 핵산으로 형질감염하고 이 바이러스에 감염된 세포를 통과하거나 또는 동시배양하여 상기 숙주 세포로부터 감염성의 제 2 세대 바이러스를 얻는 감염 클론을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 본질적으로 감염되지 않는 세포는 이 분야에서 바이러스의 복제에 일반적으로 사용되는 세포와 비교하여 이 바이러스에 약간 또는 전혀 감염되지 않을 수 있지만 다른 바이러스 균주에는 완전히 감염될 수 있다. 본 발명은 야생형 바이러스에 감염되지 않는 숙주 세포를 형질감염하여 RNA 절편과 바이러스 RNA 가닥 합성을 방해하는 매트릭스 또는 뉴클리오캡시드 단백질로 이루어진 원상태의 캡시드 또는 불완전한 바이러스 입자의 생성을 제거한 감염 클론을 생산하는 방법을 제공한다. 감염 바이러스는 이 바이러스에 감염되어 있는 세포에 통과시켜서 형질감염된 숙주세포로 부터 얻어진다. 실험부에서는 어떻게 이러한 방법으로 PRRSV의 감염 클론을 얻는지에 대하여 기재하였으나, 이 방법은 다른 양성 가닥 RNA 바이러스에도 적용할 수 있다.
또한, 본 발명은 DNA 재조합 기술을 적용하여 변성된 감염 클론을 생산하는 가능성을 제공한다. 이러한 변성 방법으로는 이 분야에서 알려진 DNA 재조합 기술에 의해 얻어질 수 있는 단일 또는 다중 돌연변이, 치환, 결실이나 삽입 또는 이들의 조합 등이 있다. 따라서, 본 발명은 RNA 바이러스를 연구하여 백신을 제조하는데 사용될 수 있는 변성된 RNA 바이러스를 제공한다.
본 발명은 감염 클론이 기초한 바이러스에 의해 유발된 질병에 대한 단일 목적 백신으로서 사용될 수 있는, 예를들면 PRRSV와 같은 Arteriviridae에서 유도된 감염 클론을 제공한다. 예를들면 PRRSV에 기초한 감염 클론은 PRRSV의 독성 마커 또는 혈청반응 마커를 연구하는데 사용될 수 있다. 일예로 기지의 PRRSV 혈청반응 마커가 ORF2 내지 7에 의해 코드된 PRRSV의 구조 단백질 상에 위치한다면 ORF 1a와 1b에 의해 코드된 단백질에서도 발견될 수 있다. 독성 마커가 PRRSV의 비구조 단백질을 코드하는 ORF 1a와 1b에 존재한다면 ORF2 내지 7에 의해 코드된 단백질 상에서 발견될 수 있다. 이러한 마커들과 관련하여 감염 클론의 게놈을 변성하므로써 그의 제 1 세대 균주 보다 독성이 훨씬 적거나 없는 PRRSV, 및/또는 백신처리된 것과 야생형 바이러스에 감염된 돼지 간의 혈청반응 차별화를 제공할 수 있는 혈청반응 마커를 삭제 또는 삽입하여 변성된 PRRSV를 얻을 수 있다. 이러한 변성은 예를들면 ORF7 N 단백질을 코드하는 핵산 서열이 ATCC VR 2332 또는 LDV의 ORF7 단백질로 치환된 PRRSV 감염 클론에 의해 제공된다.
본 발명은 또한 다양한 항원에 대하여 전달 시스템 또는 바이러스 벡터 백신으로 이용될 수 있는, 예를들면 PRRSV와 같은 Arteriviridae에서 유도된 감염 클론을 제공한다. 이 클론들에는 연구 중인 바이러스의 서열과 일치하지 않는 이종 핵산 서열이 삽입된다. 이들 이종 핵산 서열은 예를들면 선택된 항원을 코드하는 서열로부터 유도될 수 있다. 이 항원은 병원체에 대한 면역성을 유발할 수 있는 단백질 또는 펩티드이다. 이 바이러스는 마크로파지와 골수 내의 마크로파지 계통 세포를 감염하고 생성된 세포를 통해서 항원을 함유하는 바이러스를 퍼뜨리므로 이러한 바이러스 벡터 백신은 면역계 중심 세포를 감염시키고 나아가서 항원을 제공할 수 있다. 이 벡터 백신 바이러스는 나뭇가지 모양의 마크로파지, 쿠퍼(Kuppfer) 세포 또는 면역계의 다른 세포와 같은 세포들을 제공하는 항원을 감염하여 (불완전하게) 외피로 싸인 바이러스 입자나 원상태의 캡시드 입자로 할 수 있다. 원상태의 캡시드 또는 불완전한 바이러스 입자로의 감염은 지속적인 감염을 일으키므로 면역학적 효능 촉진 효과는 항원이 선택된 병원체에 대한 (낮은 수준에서의 연속적인 자극으로 인한) 지속적인 면역성을 일으키게 될 것이다. 본 발명자들은 다른 병원성 개체 또는 물질의 에피토프에 대한 정보를 구축하여 이 바이러스를 항원 담체로서 이용할 수 있다. 외래 에피토프 정보를 운반하는 수개의 상기한 벡터 백신 바이러스를 혼합하여 일시에 투여할 수 있다. 이것은 한 병원체의 여러 가지 상이한 항원에 대한 활성 면역성 또는 여러 개의 상이한 병원체에 대한 활성 면역성을 제공한다.
본 발명은 이중 목적의 백신으로 사용될 수 있는, 예를들면 PRRSV와 같은 Arteriviridae에서 유도된 감염 클론을 제공한다. 예를들면 PRRSV에 기초한 감염 클론은 간단히 벡터 백신 발생물과 PRRS에 대한 단일 목적 백신의 발생물에 대한 발생물을 결합하므로써 PRRSV 및 또다른 병원체를 방어하는 백신을 만드는데 이용될 수 있다. 돼지를 감염시키는 것으로 알려진 다양한 기타 호흡 병원체에서 유도된 PRRS 백신 항원에 삽입하여 돼지의 호흡 질환을 막을 수 있는 특별한 이중 목적의 백신을 개발할 수 있다.
본 발명은 상기 백신이 주변에 확산될 수 없다는 점에서 안전한 단일 목적 또는 이중 목적의 백신이나 벡터 백신을 제공한다. 이 백신의 안전성(비확산성)은 외피에 싸인 감염 바이러스를 생산하는데 필요한 상기한 바이러스 단백질의 정보를 삭제하여 보장될 수 있다. 이 바이러스는 단백질을 본질적으로 발현하는 세포계에서 번식되어야만 한다. 이 상보 세포계 내에서 복제하는 바이러스는 완전한 외피를 가지며 돼지의 마크로파지를 감염시킬 수 있다. 한차례의 복제 사이클 이후에 외피 단백질에 대한 정보를 잃어버린 2세대 바이러스는 더 이상 외피에 싸인 바이러스로서 다른 세포를 감염시킬 수 없다. 체 내에서 마크로파지의 감염은 원상태의 캡시드 또는 불완전한 바이러스 입자로써 여전히 가능하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 변성된 RNA 바이러스로 감염된 세포 배양물로부터 수확될 수 있는 바이러스 항원 및 단백질을 제공한다. 상기한 항원은 ELISA와 같은 진단 에세이 방법이나 또는 이 분야의 전문가들에게 잘 알려진 다른 종류의 진단 에세이 방법에 이용될 수 있다. 이러한 에세이는 1차 진단을 위한 표준 시험으로서 사용되거나 또는 본 발명에 따른 변성된 RNA 바이러스에 기초한 식별물 또는 마커 백신으로 백신처리된 동물 개체군에 적용될 수 있는 수반 시험으로서 사용될 수 있다.
실 험
감염 RNA를 시험관 내에서 전사할 수 있는 cDNA 클론을 제조하는 것은 양성 가닥 RNA 바이러스의 분자 유전학적 분석을 위해 기본적이다. 이 기술은 RNA 게놈이 mRNA로서 작용하고 적당한 숙주 세포 내에 삽입될 때 완전한 감염 사이클을 개시할 수 있는 양성 가닥 RNA 바이러스에 적용할 수 있다. 수많은 바이러스에 대하여 감염 클론이 언급되어 왔으며 바이러스 단백질의 유전적 발현, 복제 및 작용과 RNA 바이러스의 재조합에 대한 연구들을 촉진하고 있다(Boyer and Haenni, 1994). 또한, 이 클론들은 새로운 바이러스 벡터와 백신의 개발을 위해 이용될 수 있다. 이제까지 Arteriviruses에 대한 감염 cDNA 클론이 논의된 적은 없었다. 본 발명에서는 PRRSV의 감염 클론의 생성과 키메릭 PRRSV 바이러스의 생성에 있어서 그 최초의 적용을 기재하였다.
재료 및 방법
세포와 바이러스
PRRSV(또는 LV)의 Ter Huurne 균주(파리의 CNCM에 기탁, 기탁번호 I-1102)는 1991년에 단리되어(Wensvoort et al., 1991) 1차 폐포 마크로파지나 CL2621 세포에서 증식되었다. Ter Huurne 균주(TH)의 패시지 6 뿐만 아니라 연속적 패시지에 의해 CL2621 세포 상에서의 생육에 적응된 상기 균주의 유도체 LV4.2.1도 이 연구에서 이용되었다. 폐포 마크로파지는 RPMI 1640 성장 배지(Flow)에서 유지된 반면, CL2621 세포는 Hank의 최소 기본 배지(Gibco-BRL/Life technologies)에서 유지되었다. BHK-21 세포는 듈베코의 최소 기본 배지에서 유지되었다. 형질감염 실험에서는 Liljestrom과 Garoff (1993)의 방법에 따라 BHK-21 세포를 Glasgow 최소 기본 배지(Gibco-BRL/Life technologies)에서 배양하였다.
바이러스 RNA의 단리
세포 내 RNA를 이미 언급(Meulenberg et al., 1993a)된 바와 같이 감염 다중도 1의 PRRSV로 감염한 지 24시간 후에 폐포 마크로파지 또는 CL2621로부터 단리하였다. 비리온 게놈 RNA를 단리하기 위하여 van Nieuwstadt et al.(1996)에 기재된 바와 같이 비리온을 슈크로스 그래디언트 상에서 정제하고 TNE(0.01M Tris-HCl, pH 7.2, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA)에 재현탁하였다. 1 ㎖의 프로테이나제 K 완충액(100 mM Tris-HCl, pH 7.2, 25 mM EDTA, 300 mM NaCl, 2％(w/v) SDS)과 0.4 ㎎의 프로테이나제 K(Boehringer Mannheim)를 정제된 PRRSV 비리온 1㎖ (108TCID50)에 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 37℃에서 30분동안 항온처리하였다. RNA를 페놀/클로로포름(1:1) 용액으로 한 번 추출하고 에탄올로 침전하였다. 이 RNA를 -20℃에 저장하였다. 상기 RNA 제조물의 1/10을 예비 전사(RT) 반응에 사용하였다.
PRRSV 게놈의 5' 및 3' 터미널의 클로닝
단일 가닥화된 cDNA 과정(SLIC; Edwards et al., 1991)에 변성된 단일 가닥 결찰을 이용하여 PRRSV의 바이러스 게놈의 5' 말단을 클론하였다. 상기한 바와 같이 준비된 비리온 RNA 1/10을 게놈의 뉴클레오티드 1232 내지 1251에 상보하는 프라이머 11U113 (5' TACAGGTGCCTGATCCAAGA 3')과 함께 RT 반응에 사용하였다. RT 반응은 이미 설명된 바와 같이(Meulenberg et al., 1993b) 최종부피를 20㎕로 하여 실시되었다. 이어서, 6M NaOH 2 ㎕를 RT 반응에 첨가하여 37℃에서 30분 동안 RNA를 가수분해하였다. 단일 가닥 cDNA는 Boehringer Mannheim의 고순도 PCR 프로덕트 정제 키트를 이용하여 정제되었다. 정제된 cDNA를 에탄올로 침전시키고 TE에 재현탁하여 앵커 프라이머 ALG3 (5' CACGAATTCACTATCGATTCTGGAT CCTTC 3')에 결찰하였다. 이 프라이머는 EcoRI, ClaI 및 BamHI 부위를 가지며 그의 3' 말단은 자기 결찰을 막기 위한 아미노 블로킹기로 변성되어 있다. 단일 가닥 cDNA 생성물을 실온에서 하룻밤 동안 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl2, 10 ㎍/㎖ BSA, 25 ％ PEG, 1.0 mM 헥사민 코발트클로라이드, 40 μM ATP, 및 0.5 ㎕ (10U) T4 RNA 리가제 (New England Biolabs) 용액 중에서 4 pmol ALG3에 결찰하였다. 결찰 반응물의 1/3은 프라이머 LV69(5' AGGTCGTCGACGGGCCCCGT GATCGGGTACC 3') 및 ALG4 (5' GAAGGATCCAGAATCGATAG 3')로의 PCR에서 템플레이트로 이용되었다. 프라이머 LV69는 LV 게놈의 뉴클레오티드 594 내지 615에 상보하는 반면, ALG4는 앵커 프라이머 ALG3에 상보한다. PCR 조건은 Meulenberg et al. (1993b)에 기재된 바와 같으며 얻어진 생성물은 EcoRI과 SalI으로 분해되어 pGEM-4Z에서 클론되었다. 세포 내 LV RNA로부터 LV 게놈의 5' 터미널을 클론하기 위하여 유사한 방법을 사용하였다. 이 실험에 있어서는 LV로 감염된 CL2621 세포에서 단리된 전체 세포 내 RNA 10 ㎍이 사용되었다. 5' cDNA 클론이 서열화되었고 공개된 PRRSV 서열(Meulenberg et al., 1993a)과 비교하여 뉴클레오티드 10개의 길이를 가지는 클론 pABV387이 다음 실험에 사용되었다.
긴 폴리(A) 꼬리를 가지는 3' 말단 cDNA 클론은 LV RNA를 EcoRI, XbaI 및 PvuI 부위가 있는 프라이머 LV76(5' TCTAGGAATTCTAGACGATCG(T)403')으로 역전사하여 구성되었다. 역전사 반응에 이어, 폴리(T) 범위를 제외하고 LV76과 동일한 프라이머 LV75(5' TCTAGGAATTCTAGACGATCGT 3')와 LV 게놈의 뉴클레오티드 14566- 14585에 해당하며 HpaI 부위를 가지는 센스 프라이머 39U70R(5' GGAGTGGTTAACCT CGTCAA 3')을 이용한 PCR을 실시하였다. 얻어진 PCR 생성물을 HpaI과 EcoRI으로 분해하여 동일한 효소로 제한된 cDNA 클론 pABV39에 클론하였다(도 1). 45 A (pABV382) 및 109 A (pABV392)의 폴리(A) 범위와 올리고뉴클레오티드 서열화에 의해 확인된 바와 같은 정확한 게놈 cDNA 서열을 함유하는 2개의 cDNA 클론을 전체 길이의 게놈 cDNA 클론을 구성하는데 사용하였다.
서열 분석
올리고뉴클레오티드 서열을 PRISMTMReady Reaction Dye DeoxyTMTerminator Cycle Sequencing Kit와 Applied Biosystem사의 자동 시퀀서를 이용하여 결정하였다.
PRRSV의 전체 길이 게놈 cDNA 클론의 구성
LV 게놈(Meulenberg et al., 1993a)의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위하여 먼저 생성된 cDNA 클론을 도 1에 나타낸 바와 같이 편리한 제한 부위에 함께 결찰하였다. 플라스미드 pABV254를 pABV 클론 25, 11, 12 및 100으로부터 구성하여 사전 시험에 사용하였다(den Boon et al., 1996). Sambrook et al. (1989)에 따라 표준 클로닝 방법을 실시하였다. 그 결과, 높은 복제수의 플라스미드 pGEM-4Z 내에 LV의 오버랩핑 cDNA 서열을 함유하는 3개의 플라스미드를 얻었다. 플라스미드 pABV331과 pABV369는 LV 게놈의 뉴클레오티드 5 내지 6015로 이루어진다. 뉴클레오티드 차이는 해당 영역 내에 서열된 1 세트의 6개 cDNA 클론 내에서 1 : 1의 비율로 포지션 3462에서 발견되었다. 이러한 뉴클레오티드 차이가 ORF1A 내의 포지션 1084에서 아미노산 치환을 일으켰다(Pro 대신 Leu). 본 발명에서는 감염성에 대한 이 아미노산의 영향을 예측할 수 없었기 때문에 EcoRV(뉴클레오티드 3403)와 SacII(뉴클레오티드 3605) 부위에서 교환하여 pABV331 내에서 Leu 코딩 cDNA 절편을 클론하여 pABV369를 얻었다. 플라스미드 pABV384는 LV 게놈의 뉴클레오티드 5168 내지 9825로 이루어진다. 플라스미드 pABV20과 pABV5와 중복하는 적당한 cDNA 클론이 아직 없고 이 클론은 최종적으로 pABV331과 pABV369의 cDNA 서열에 융합되므로 2개의 새로운 cDNA 절편을 RT-PCR에 의해 생산하였다. 뉴클레오티드 5169-5186에 해당하는 센스 프라이머 LV59 (5' TCGGAATCTAGATCTCACGTGGTGCAGCTGCTG 3')와 뉴클레오티드 6078 내지 6097에 상보하는 안티센스 프라이머 61U303 (5' CATCAACACCTGTGCAGACC 3')이 PCR에 이용되었다. 뉴클레오티드 5936-5955에 위치한 센스 프라이머 61U526R (5' TTCCTT CTCTGGCGCATGAT 3')과 뉴클레오티드 6727 내지 6745에 상보하는 LV60 (5' GTACTGGTACCGGATCCGTGAGGATGTTGC 3')이 다른 PCR에 이용되었다. 상기한 2개의 PCR 절편은 LV59에 결합된 XbaI 부위, 내부의 ApoI 부위(뉴클레오티드 6006) 및 프라이머 LV60에 결합된 뉴클레오티드 6740의 BamHI 부위를 이용하여 함께 pABV20에 결찰되었다. 얻어진 새로운 cDNA 절편은 완전히 서열화되었는데 공지의 서열(Meulenberg et al., 1993a)과의 아미노산 차이를 일으키는 어떠한 돌연변이도 없었다. 플라스미드 pABV368은 PRRSV 게놈의 뉴클레오티드 8274 내지 13720을 포함한다. pGEM-4Z 내의 cDNA 절편의 또 다른 결찰은 불안정한 클론을 생성하므로 pABV331/369, pABV384 및 pABV368의 삽입물은 pOK12 (Viera and Messing, 1991) 내의 5' 및 3' cDNA 절편에 결찰되었다. 플라스미드 벡터 pOK12는 pGEM-4Z 보다 더 낮은 복제수를 가지므로 외래의 거대 cDNA 서열의 클로닝에 더욱 적당할 것으로 기대된다. 가능한 한 낮은 복제수를 유지하기 위하여 플라스미드들을 15㎍/㎖의카나마이신 존재 하에 32℃에서 배양된 Escherichia coli 균주 DH5a에 형질전환하였다. 먼저 pABV382 ((A)45)와 pABV392 ((A)109)의 cDNA 절편을 EcoRI으로 분해하고 이 부위를 클레노우 폴리머라제 (Pharmacia)로 변성시켜 둔단하여 잘라낸 다음, BamHI으로 분해하였다. 이 절편들을 BamHI과 FspI으로 분해된 pOK12에서 클론하고 후자의 부위를 둔단시켜 pABV394와 pABV395를 얻었다. 이러한 방법으로 pOK12에 존재하는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 제거하였다. 다음으로, pABV368과 pABV384의 cDNA 절편을 BclI 부위(뉴클레오티드 13394), ScaI 부위 (뉴클레오티드 8657) 및 측면 또는 벡터 서열 내의 BamHI 및 BglII 부위를 이용하여 3' 말단 cDNA 클론에 결찰하였다. 그 결과, 플라스미드 pABV401과 pABV402를 얻었다(도 1).
LV 게놈의 5' 터미널에 직접 융합된 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 함유하는 5' cDNA 클론을 프라이머 LV83 (5' GAATTCACTAGTTAATACGACTCACTATAGATGATGT GTAGGGTATTCC 3') 및 LV69와 함께 PCR에 의해 pABV387로부터 증식하였다. LV83은 5'에서 3' 순으로 EcoRI과 SpeI 부위, T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열, 전사 개시를 위한 단일 G 및 LV 게놈의 뉴클레오티드 1 내지 19로 이루어진다. 상기 PCR 절편을 pOK12의 EcoRI과 SalI 부위에서 클론하여 pABV396을 얻었다. pABV396의 정확한 서열을 올리고뉴클레오티드 서열화에 의해 확인하였다. 다음으로, pABV331과 pABV369의 LV cDNA 절편을 ApaI과 BamHI으로 절단하고 ApaI과 BamHI으로 분해된 pABV369에 결찰하였다. 마지막으로, T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 SpeI 부위 상부와 이 바이러스 게놈의 포지션 5168의 독특한 PmlI 부위를 이용하여 상기 5' cDNA 절편을 pABV401과 pABV402에 클론하였다. 이러한 방법으로 모균주와 유사한 바이러스와 외래 오픈 리딩 프레임으로 이루어진 키메릭 바이러스에 해당하는 게놈 길이의 cDNA 클론을 얻었다.
PacI 및/또는 SwaI 부위를 함유하는 돌연변이 바이러스의 제조
ORF7 유전자의 게놈 길이 cDNA 클론 직하부 내에 독특한 PacI 부위를 삽입하기 위하여 안티센스 프라이머 LV 112 (5' CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCAC CCTGA 3')를 가지는 센스 프라이머 LV108 (5' GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGT AAAAACCAGAGCC 3')과 LV75를 가지는 센스 프라이머 LV111 (5' TCAGGGTGCAAGTTAA TTAAACAGTCAGGTGAATGG 3')을 이용하여 PCR에서 뉴클레오티드 14987과 14988의 T와 A를 둘다 A로 치환하였다. 마찬가지로 PCR에 의해 프라이머 LV108과 LV110 (5' CCTGACTGTCAATTTAAATTGCACCCTGAC 3') 및 프라이머 LV109 (5' GTCAGGGTGCAA TTTAAATTGACAGTCAGG 3') 및 LV11을 이용하여 포지션 14980의 G를 T로 교환하고 포지션 14985의 T를 A로 교환하여 독특한 SwaI 부위를 만들었다. PCR 절편을 제조된 PacI 및 SwaI 부위와 측방의 HpaI과 XbaI 부위를 이용하여 pABV395에 결찰하여, 각각 pABV427과 pABV426을 얻었다. 그리고나서 동일한 독특한 HpaI과 XbaI 부위를 이용하여 이 절편을 pABV414에 삽입하여 pABV437과 pABV442를 얻었다(도 4). pABV437과 pABV422의 전사물로부터 회수된 바이러스에서 마커 돌연변이를 검출하기 위하여 감염된 돼지 폐포 마크로파지의 상징액으로부터 RNA를 단리하였다. 이 RNA를 역전사-PCR에 이용하여 프라이머 LV76, LV75 및 39U70R을 가지는 약 0.6kb의 절편(뉴클레오티드 14576-가변 길이의 폴리 A 꼬리 정도)을 증폭시켰다. PCR 절편을 PacI 또는 SwaI으로 분해하여 유전 마커가 있는지를 확인하였다.
RNA의 시험관 내 전사와 형질감염
LV의 전체 길이 게놈 cDNA 절편을 함유하는 플라스미드 pABV414, pABV416을 폴리(A) 범위의 직하부에 위치하는 PvuI으로 선형화하였다. Semliki Forest 바이러스 (SFV) 발현 벡터 pSFV1 (Meulenberg et al., 1997)의 ORF4로 이루어진 플라스미드 pABV296을 SpeI으로 선형화하여 시험관 내 전사와 형질감염 실험의 대조용으로 하였다. 선형화된 플라스미드를 에탄올로 침전하고 Liljestrom and Garoff (1991 and 1993)에서 SFV에 대하여 기재된 방법에 따라 이 플라스미드 1.5 ㎍을 T7 RNA 폴리머라제 (플라스미드 pABV414, pABV416) 또는 Sp6 RNA 폴리머라제 (pABV296)와 함께 시험관 내 전사에 이용하였다. 시험관 내에서 전사된 RNA를 이소프로판올로 침전하고 70％ 에탄올로 세척하여 사용할 때까지 -20℃에 저장하였다. BHK-21 세포를 M6 웰(약 106세포/웰)에 도포하고 Liljestrom and Garoff (1993)에 기재된 바와 같이 최적 조건에서 10 ㎕ 리포펙틴과 혼합된 RNA 2.5㎍으로 형질감염하였다. 임의로 RNA를 전기이동에 의해 BHK-21 세포에 삽입하였다. 이 경우에는 시험관 내에서 전사된 RNA 10㎍ 또는 세포내 LV RNA 10㎍을 Liljestrom and Garoff (16)의 전기이동 조건을 이용하여 약 107BHK-21 세포에 형질감염하였다. 형질감염 24 시간 후에 배지를 수거하여 감염 바이러스를 얻기 위해 CL2621 세포로 옮겼다. 형질감염 및 감염된 세포를 기본적으로 Wensvoort et al. (1986)에 기재된 바와 같이 면역 퍼옥시다제 단층 에세이(IPMA)에 의해 LV-특이성 단백질의 발현에 대해 시험하였다. GP3, GP4, M 및 N 단백질(van Nieuwstadt et al., 1996)에 대한 모노클로날 항체(MAbs) 122.13, 122.59, 122.9 및 122.17을 IPMA의 염색에 사용하였다.
결 과
LV의 게놈 RNA의 5' 터미널 서열의 재구성
결절된 5' 말단을 가지는 시험관 내에서 전사된 RNA의 감염성이 보고된 바 있으나(Davis et al., 1989, Klump et al., 1990), 감염 클론을 얻기 위해서는 최대한의 5' 및 3' 말단을 포함하는 전체 바이러스 서열이 필요하다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다. LV 게놈의 5' 말단을 클론하기 위하여 단일 가닥 cDNA에 대한 변성된 단일 가닥 결찰(SLIC; Edwards et al., 1991) 방법이 사용되었다. LV로 감염된 CL2621 세포에서 단리된 세포내 RNA와 정제된 비리온에서 유래한 LV RNA 모두 ORF1A의 5' 말단에 상보하는 프라이머 LV69를 이용하여 역전사되었다. 제1 가닥 cDNA 생성물을 3' 말단이 자기 결찰에 대해 차단된 앵커 프라이머 ALG3에 결찰하였다. 결찰된 생성물을 PCR에 의해 증식시켜 클론하였다. LV 세포내 RNA에서 유도되어 2개의 독립 PCR로부터 얻어진 12개의 클론과 비리온 RNA에서 유도되어 2개의 독립 PCR로부터 얻어진 14개의 클론을 서열화하였다. 이들 26개의 cDNA 클론 가운데 22개의 클론은 이미 공지(Meulenberg et al., 1993a)된 cDNA 서열과 비교하여 10 개의 뉴클레오티드(5' ATG ATGTGTA 3')를 포함하는 반면, 4개의 클론은 이 추가 서열의 5' 말단에 1 내지 3개의 뉴클레오티드가 없었다(표 1). 이러한 사실은 이들 10개의 뉴클레오티드가 LV 게놈의 최대한도의 5' 말단이며 따라서 이들이 게놈 길이 cDNA 클론에 결합되었음을 나타낸다.
LV의 게놈 길이 cDNA 클론의 구성
LV의 게놈 길이 cDNA 클론을 구성하기 위하여 이전에 단리하여 서열화한 cDNA(Meulenberg et al., 1993a)를 도 1에 나타낸 전략에 따라 공유하는 제한효소 부위에 결합하였다. 또한, 새로운 cDNA 절편을 생성하여 게놈 길이 cDNA 클론을 모았다. 클론 pABV5와 pABV20에서 유래한 cDNA 서열을 결찰할 수 있도록 뉴클레오티드 5168-6740까지의 1개의 cDNA 절편을 RT-PCR에 의해 제조하였다. 시험관 내 전사에서 T7 RNA 폴리머라제 프로모터는 PCR에 의해 LV 게놈의 5' 터미널에 직접 연결되었고 pABV396에서 클론된 새로운 cDNA 절편은 게놈 길이 cDNA 클론에 삽입되었다. 6개의 새로운 각각의 cDNA 클론 상의 뉴클레오티드 3420 내지 3725의 재서열화에서는 ORF1a의 아미노산 1084에서 Leu와 Pro가 1 : 1의 비율로 존재하는 것으로 나타났다. 최종 게놈 길이 cDNA 클론으로부터 전사된 RNA의 감염성에 대한 상기 아미노산의 영향을 예측할 수 없으므로 본 발명자들은 둘다 사용하여 상기 클론을 구성하였다. 3' 말단에는 2개의 상이한 cDNA 클론이 사용되었다. 먼저 최대 20 A의 폴리 (A) 꼬리를 함유하는 3' 말단 cDNA 클론(Meulenberg et al., 1993a)을 단리하였다. 그러나, LDV(Chen et al., 1994)와 같은 관련된 바이러스의 폴리 (A) 꼬리의 길이에 대하여 보고된 연구들을 보면 전체 폴리 (A) 길이는 훨씬 더 길 것으로 기대된다. 따라서, 새로운 3' 말단 cDNA 클론은 40개의 T 잔기를 포함하는 프라이머 LV76을 이용하여 제조되었다. 상기 cDNA 클론을 서열화하였는데 이 클론은 40 내지 109 A 잔기를 포함하였다. 가장 긴 폴리 (A) 범위(109 A 잔기; pABV392)를 함유하는 cDNA 클론은 게놈 길이 cDNA 클론에 이용되었다. 기다란 동종 폴리머 다발은 E. coli에서 플라스미드의 복제를 방해할 수 있기 때문에(Deng and Wu, 1981) 본 발명에서는 다음의 클로닝 단계에서 사용하기 위해 45 A 잔기를 가지는 제2 클론, pABV382를 선택하였다. 먼저, 복제수가 높은 플라스미드에서 게놈 길이 cDNA 클론의 지속은 이들 클론들(Lai et al., 1991; Rice et al., 1987; Sumiyoshi et al., 1992)로부터 합성된 전사물의 감염성 손실을 일으키는 돌연변이 또는 결실의 축적을 유도하는 것이 관찰되었다. pGEM-4Z에서 5'와 3' 말단에 pABV 클론 331/369, 384 및 368의 더 큰 cDNA 절편을 결찰하려고 하였을 때 플라스미드의 불안정성이 관찰되었는데 따라서 본 발명에서는 최종적으로 낮은 복제수 벡터 pOK12(Viera and Messing, 1991)에서 이 클론들을 서로 융합하였다. 그 결과, 사용된 성장 조건 하에서 E. coli에서 안정하게 증식될 수 있는 게놈 길이 cDNA 클론 pABV414/415 및 pABV416을 얻었다. 45 또는 109 A 잔기를 함유하는 게놈 길이 cDNA 클론들의 안정성의 차이는 관찰되지 않았다.
LV RNA의 감염성
LV는 선별적으로 돼지 폐포 마크로파지에서 자란다. 이제까지 세포계 CL2621이나 원숭이 신장 세포계 MA104에서 유도된 다른 클론들은 LV 증식을 위해 보여졌던 세포계이다(Benfield et al., 1992; Collins et al., 1992; Kim et al., 1993). 그러므로, LV RNA의 형질감염에 대한 최적 조건을 결정하기 위하여 CL2621 세포가 사용되었다. LV로 감염된 CL2621 세포로부터 단리된 RNA를 리포펙틴, 리포펙타민, DEAE-덱스트란 및 전기이동 등의 상이한 방법을 이용하여 서로 다른 양의 CL2621 세포로 형질감염하였다. 세포는 형질감염 이후 7일까지 세포병원학 효과와 플라크가 검사되었으나 감염 바이러스의 이러한 징후는 확인할 수 없었다. 또한, LV-특이성 MAb를 이용한 IPMA에서도 LV-특이성 항원을 검출할 수 없었다. pABV296으로부터 시험관 내 전사된 RNA를 이 실험의 대조용으로 사용하였다. 플라스미드 pABV296은 발현벡터 pSFV1(Meulenberg et al., 1997)에 삽입된 GP4를 코드하는 OFR4로 이루어진다. pABV296 RNA의 형질감염 효율은 IPMA에서 형질감염된 세포를 GP4-특이성 MAb로 염색하여 시험되었다. 0.01％ 양성 CL2621 세포에 달하는 높은 값의 형질감염 효율이 전기이동에 의해 얻어진 한편, 80 내지 90％의 양성 세포가 BHK-21 세포를 이용한 유사한 조건에서 얻어졌다. 이러한 결과는 CL2621 세포는 형질감염 실험에 적당하지 않지만 BHK-21 세포(야생형 바이러스에 감염되지 않는)는 놀라웁게도 아주 적당한 것을 의미한다. 따라서, BHK-21 세포가 LV RNA의 감염성 시험에 이용되었다. LV로 감염된 CL2621 세포에서 단리된 RNA 2 ㎍을 SFV(Liljestrom and Garoff, 1993)에 대하여 기재된 조건에 따라 리포펙틴을 함유하는 약 106BHK-21에 형질감염하였다. 형질감염 24 시간 후에 세포를 LV의 N 단백질에 대한 LV-특이성 MAb 122.17로 염색하였다. 약 3 내지 10개의 세포가 양성으로 염색되었으나 감염 중심이나 세포 스프레드에 세포를 제공하는 플라크는 관찰되지 않았다. pABV296으로부터 전사된 대조 RNA의 형질감염에서는 이 조건을 이용하여 60 내지 70％의 양성 BHK-21 세포가 얻어졌다. 세포내 LV RNA와 pABV296 RNA로 형질감염된 BHK-21 세포의 상징액을 CL2621 세포에 옮겼다. 3-4일 후에 pABV296 RNA로 형질감염된 BHK-21 세포에서 얻어진 상징액과 항온처리한 세포에서가 아니라 세포내 LV RNA로 형질감염된 BHK -21 세포에서 얻어진 상징액과 항온처리된 세포에서 플라크가 관찰되었다. 이 플라크는 IPMA에서 LV-특이성 MAb에 양성으로 염색되었다. LV의 정제된 비리온으로부터 단리된 RNA를 사용하였을 때 비숫한 결과가 얻어졌다. 또한, 세포를 전기이동에 의해 감염하였을 때 양성으로 염색된 세포의 수는 2 내지 4배 증가하였다. 이러한 결과는 이들이 틀림없이 LV에 대한 수용체가 없기 때문에 LV가 BHK-21 세포를 감염시킬 수 없음을 나타낸다. 그러나, 일단 게놈 RNA가 BHK-21 세포에 삽입되면 새로운 감염 바이러스 입자가 생겨서 배지로 분비된다. 이미 형질감염된 BHK-21 세포를 원상태의 캡시드이거나 전체 또는 부분적으로 외피에 싸인 입자인 상기 입자들로 재감염할 수는 없다.
감염 RNA의 시험관 내 합성
(본질적으로 야생형 PRRSV에 감염되지 않는) BHK-21 세포는 세포 내 LV RNA에서 바이러스를 회수하는데 특히 적절하지만 민감한 CL2621 세포는 적당하지 않으므로 BHK-21 세포를 게놈 길이 cDNA 클론으로부터 전사된 RNA가 감염성이 있는지를 시험하는데 사용하였다. 플라스미드 pABV414/416을 PvuI으로 선형화하고 T7 RNA 폴리머라제를 이용하여 시험관 내에서 전사하였다. 전사된 RNA가 3' 말단에 2개 비바이러스성 뉴클레오티드를 포함하여(도 2) PvuI 부위는 폴리(A) 범위의 직하부에 위치하였다. 또한, 전사물은 5' 말단에 비바이러스 G를 포함하여야만 하는데, 이것은 T7 RNA 폴리머라제의 전사 개시부위이다. CL2621 세포에서 다음 바이러스 회수를 위한 양성 대조용으로서 사용되는 세포 내 LV RNA 2㎍ 및, BHK-21 세포로의 RNA 형질감염에 대한 양성 대조용이며 CL2621 세포에서의 다음 바이러스 회수를 위한 음성 대조용인 pABV296 RNA와 함께 시험관 내에서 전사된 RNA 약 2.5㎍을 BHK-21 세포에 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 24 시간 후에 세포의 상징액을 모으고 이 세포를 고정하여 IPMA에서 N-특이성 MAb 122.17로 염색하였다. 세포 내 LV RNA로 형질감염된 BHK-21 세포가 있는 웰에서는 단지 몇 개의 양성 세포 만이 관찰된 반면, pABV414/416으로부터 전사된 RNA로 형질감염된 BHK-21이 있는 웰에서는 800 내지 2700의 양성 세포가 관찰되었다. 감염 바이러스가 이 세포에서 방출되었는지를 확인하기 위하여 상징액을 CL2621 세포를 감염하는데 사용하였다. 세포 내 LV RNA와 pABV414/415의 전사물로 형질감염된 BHK-21 세포의 상징액으로 감염된 CL2621 배양물에서 플라크가 생성되었다. 이 플라크들은 N, M, GP4, 및 GP3단백질에 대한 MAb로 IPMA에서 양성으로 염색되었는데 이것은 이들 단백질이 모두 적절하게 발현되었음을 나타낸다. pABV296으로부터 전사된 RNA로 형질감염된 BHK-21 세포의 상징액과 함께 항온처리된 CL2621 배양물에서는 플라크와 IPMA에서의 염색이 관찰되지 않았다. 그러므로, 이러한 결과는 게놈 길이 cDNA 클론 pABV414와 pABV416으로부터 전사된 RNA의 BHK-21 세포로의 형질감염이 감염성 LV의 생성과 방출을 유발하였음을 명백히 입증하는 것이다. 또한, pABV414와 pABV416의 전사물을 리포펙틴 대신에 전기이동에 의해 BHK-21 세포에 형질감염하였을 때 LV-특이성 MAb로의 양성 염색 세포가 2 내지 4배 증가하였다. 상기한 전기이동된 BHK-21 세포 상징액 중의 재조합 바이러스의 역가는 약 105TCID50/㎖였다.
Ter Huurne 및 LV4.2.1과 비교한 감염성 복제 바이러스의 성장 곡선:
회수된 바이러스의 성장 특성화
초기 형질감염 및 감염 실험에서는 vABV414와 vABV416으로 표시되는 회수된 재조합 바이러스가 돼지 폐포 마크로파지에서는 감염시키고 동등하게 잘 자라지만 세포 내 LV RNA로 형질감염된 BHK-21 세포에서 회수된 바이러스 보다 CL2621 세포 상에서 성장이 늦다고 제시되었다. 상기한 세포 내 LV RNA는 CL2621 상의 성장에 적응된 LV4.2.1로 감염된 CL2621 세포에서 단리되었다. vABV414와 vABV 416의 성장 특성을 더 자세히 연구하기 위하여 CL2621 세포와 돼지 폐포 마크로파지에서 성장 곡선을 결정하여 돼지 폐포 마크로파지 상에만 통과시킨 야생형 LV (TH)의 성장 곡선과 CL2621 세포 상에서 성장한 LV4.2.1의 성장곡선과 비교하였다. 2개의 재조합 바이러스는 BHK-21로부터 직접 유도되었는지 또는 돼지 폐포 마크로파지 상에 다시 통과되었는지에 상관없이 동등하게 잘 자라서 그 성장률에 차이가 없었다 (도 3). 돼지 폐포 마크로파지에서의 역가(7.1-7.9 TCID50/㎖)는 감염 후 약 32 시간에 피크인 반면, CL2621에서의 역가는 더 낮고 감염 96 시간 후에 조차도 피크가 나타나지 않았다. TH 바이러스는 재조합물과 같은 비숫한 성장 특성을 가졌다. 반대로, CL2621에 적응된 바이러스 LV4.2.1은 바이러스 vABV414, vABV416 및 TH 보다 CL2621 세포 상에서 더 빨리 자랐다(도 3). 요약하면, 이러한 결과는 재조합 바이러스의 성장 특성이 TH 바이러스와 유사하다는 것을 증명하는 것이다. 감염 클론을 구성하는데 사용된 cDNA 서열이 1세대의 "적응되지 않은 " TH 바이러스에서 유도되었기 때문에 이같이 예측되었다.
LV의 감염 클론 내로의 유전 마커의 삽입
게놈 길이 cDNA 클론이 돌연변이 LV 바이러스를 제조하는데 사용될 수 있음을 증명하기 위하여 독특한 PacI과 SwaI 부위를 PCR에 따른 돌연변이에 의해 ORF7 유전자의 직하부에 삽입하였다(도 4). PacI 부위를 함유하는 게놈 길이 cDNA 클론 pABV437 및 SwaI 부위를 함유하는 게놈 길이 cDNA 클론 pABV442로부터 전사된 RNA를 BHK-21 세포에 형질감염시키고 형질감염 24 시간 후에 그 상징액을 돼지 폐포 마크로파지와 CL2621 세포에 옮겨서 감염 바이러스를 제조하였다. 회수된 바이러스 vABV437과 vABV442는 1세대 바이러스 vABV414와 같은 돼지 폐포 마크로파지와 CL2621 세포에서 유사한 성장 특성을 나타내었다(데이타는 제시되지 않았음.). 약 0.6 kb(뉴클레오티드 14576-폴리(A) 꼬리)의 특정 영역을 vABV414 및 vABV416으로 감염된 돼지 폐포 마크로파지의 상징액에서 단리된 바이러스 RNA의 역전사와 PCR에 의해 증식하였다. PacI으로의 분해는 이 제한 부위가 vABV437에서 유도된 절편 내에 실제로 존재하지만 vABV414에서 유도된 절편 내에는 없음을 입증하였다. 마찬가지로 vABV442 내에 SwaI 부위가 존재하는 것이 증명되었다(데이타는 제시되지 않았음.). 그러므로, 본 발명에서는 야생형 바이러스로의 오염 가능성을 배제할 수 있으며 vABV437과 vABV442의 동일성을 확인하였다.
결 론
오늘날의 DNA 재조합 기술은 분자 수준에서 게놈을 분석하고 변성할 수 있게 하여 이들의 구성과 발현에 대한 깊은 통찰을 할 수 있도록 하였다. RNA 바이러스의 경우에 있어서 이것은 감염성 전사물이 합성될 수 있는 게놈 길이 cDNA 클론의 생성을 필요로 한다. 대부분의 경우, 감염 클론을 구성하는데 있어서의 선행 조건은 바이러스 RNA 복제에 결정적일 것으로 보이는 각각의 바이러스 게놈의 터미널 서열을 확인하는 것이다. 이전의 연구에서는 LV가 3' 말단에 폴리(A) 꼬리를 가지는 것으로 나타났다(Meulenberg et al., 1993a). 현재는 LV 게놈의 5' 말단이 정확히 결정되었다. 바이러스 게놈 RNA 또는 mRNA의 5' 말단을 결정하기 위한 여러 가지 방법들이 알려져 있으나 이들 중 대부분은 중요한 한계가 있다. 플라바이러스(flaviruse)와 페스티바이러스(pestiviruse)에 대하여는 게놈 RNA의 원형화에 기초한 방법이 사용되었다. 그러나, 이 방법은 게놈의 5' 말단과 3' 말단 사이의 경계를 정의하기 위한 수반 분석을 필요로 한다. cDNA 말단의 5' 급속 증식법(5' RACE)은 터미널 데옥시리보뉴클레오티드 트랜스퍼라제(TdT)를 가지는 동종의 폴리머성 꼬리를 제 1가닥 cDNA 가닥에 첨가하는데 기초한다. 그러나, 테일링 반응은 비효율적인 편이고 또한 이 방법은 꼬리의 제1 뉴클레오티드가 바이러스 서열인지 또는 효소적으로 첨가된 꼬리의 기존 일부인지를 결정할 수 없기 때문에 추가적인 분석을 필요로 한다. 본 발명에서는 특정한 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 제 1 가닥 프라이머 연장 생성물에 결찰하고 PCR에 의해 증폭하여 바이러스 게놈의 최대 5' 말단을 결정하였다. 공지된 서열과 관련하여 10 뉴클레오티드(ATGATGTGTA)가 여러 개의 클론에서 발견되었으므로 이들이 바이러스 게놈의 최대 5' 말단 뉴클레오티드일 것으로 추정되었다. 전체적으로 EAV (207 뉴클레오티드; den Boon et al., 1991), SHFV (208 뉴클레오티드; Zeng et al., 1995)의 리더와 길이가 비슷하고 LDV (155 뉴클레오티드; Chen et al., 1994)의 리더 보다는 긴 221 뉴클레오티드의 리더 서열을 얻었다. 그러나, 상기한 아테리바이러스의 리더 서열 간에는 의미있는 동종성은 없었다.
최대한도의 5' 말단을 게놈 길이 cDNA에 결합하여 감염 클론을 만들었다. 감염 클론의 제조와 관련한 가장 큰 문제는 정확한 5'와 3' 터미널을 제조하여야 하는 것뿐만 아니라 박테리아 내에서 클론될 때 바이러스 서열의 안정성이다. pGEM-4Z에 게놈 길이 cDNA 클론을 조립하려는 초기 시도는 실패하였지만, 15,207 뉴클레오티드의 LV의 긴 게놈 cDNA 절편은 복제수가 낮은 플라스미드 pOK12에서 안정하며 이제까지 제조된 양성 RNA 가닥 바이러스의 가장 긴 감염성 클론이다. 게놈 길이 cDNA 클론의 전사물은 5' 캡(cap) 구조와 그 5' 말단에 여분의 비바이러스성 G 및 그 3' 말단에 비바이러스성 CG를 포함하지만 이러한 부가물은 이들의 감염성을 파괴하지 않는다. 몇몇 연구자들은 5' 또는 3' 말단의 확실하지 않은 외부 서열이나 불완전한 캡핑으로 인한 전체 길이 cDNA 클론에서 전사된 RNA의 감소된 초기 감염을 보고하였다. 캡 구조가 없는 LV 전체 길이 cDNA의 전사물은 감염성이 없다. 감염성 cDNA 클론 전사물의 감염성을 항상 이 바이러스에 민감한 세포계에서 시험하였지만, 본 발명자들은 상기한 RNA를 CL2621 세포에 형질감염하여 게놈 길이 cDNA 클론 또는 CL2621 세포에서 단리된 LV RNA로부터의 전사물의 감염성을 증명할 수 없었다. 이것은 CL2621 세포 내에서의 불충분한 형질감염 효율 때문인 것으로, 바이러스 게놈의 절편 만을 함유하는 원상태의 캡시드와 같은 결함성 방해 입자로 CL2621 세포를 재감염하여 발생한 불완전한 RNA 절편 또는 캡시드 단백질의 방해나 상호작용에 의해 바이러스 RNA 합성이 방해된다. 그러나, 전체 길이 cDNA 클론과 세포 내 LV RNA로부터의 전사물을 BHK-21에 형질감염하여 CL2621 세포에서 분리될 수 있는 감염성 바이러스를 제조 및 배출하였다. 원상태의 캡시드에 의한 BHK-21 세포의 재감염은 일어나지 않으므로 전체 길이 바이러스 RNA 합성은 방해되지 않는다. 특이적 감염성은 시험관 내에서 전사된 RNA 1 ㎍ 당 대략 400 내지 1500 양성 세포인 반면, LV 세포내 RNA 1 ㎍ 당 2 내지 5 양성 세포가 얻어졌다. 그러나, LV에 감염된 CL2621 세포로부터 단리된 세포 내 RNA의 매우 작은 분획 만이 게놈 LV RNA를 나타내었으므로 이러한 특이적 감염성은 비교될 수 없다. 또한, 형질감염에 사용된 비리온에서 단리된 게놈 RNA의 양이 너무 적어서 정확한 정량을 할 수 없다.
또한, BHK-21 세포는 감염성 바이러스의 제조와 반드시 연관되어 있지는 않은 LV-특이성 MAb를 이용한 IPMA에서 항원 제조에 성공하였다. 이것은 2 ㎍의 세포 내 LV RNA로 형질감염된 BHK-21 세포의 상징액이 전체 길이 cDNA 클론의 전사물 2.5 ㎍으로 형질감염된 BHK-21 세포의 상징액 보다 CL2621 세포 상에서 에세이된 플라크 생성 단위의 더 높은 역가를 함유한다는 사실로부터 명백하다. 폴리(A) 꼬리의 길이가 바이러스 전사물의 감염성에 영향을 준다는 것이 수많은 바이러스에 대해 이미 알려져 있지만(Holy and Abouhaidar, 1993; Sarow, 1989), 본 발명에서는 45 또는 109 잔기의 꼬리를 함유하는 게놈 cDNA 클론들에서 얻어진 전사물들에서 감염성의 어떠한 차이도 발견하지 못하였다. 45 A 잔기의 꼬리는 해당하는 전사물의 안정성을 변화시키는 한계 길이를 넘는 것일 수 있다. 본 발명자들은 ORF1의 아미노산 1084에서 클론 차이를 발견하였는데, PRO와 LEU의 비율이 1:1이었다. 이러한 PRO 또는 LEU 코돈을 함유하는 전체 길이 cDNA 클론의 전사물은 BHK-21 세포의 감염성에서 어떠한 차이도 나타내지 않았으므로 상기 아미노산은 감염성에 영향을 미치지 않았다.
게놈 길이 감염성 클론을 PRRSV 균주 ATCC VR2332의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 키메릭 바이러스 제조에 이용하였다. 또한 게놈 길이 감염성 클론을 마우스 바이러스 LDV의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 키메릭 바이러스 제조에 이용하였다. 키메릭 바이러스는 균주 특이성 MAb를 가지는 제 1세대 바이러스와 구별되지만, 이들은 PRRSV의 Ter Huurne 균주의 N (ORF7) 단백질과 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체로 염색되지 않는다. 또한, PRRSV N 단백질이 LDV N 단백질로 치환된 키메릭 바이러스는 PRRSV N 단백질과 반응하는 돼지 회복기 항체와 반응하지 않는다. 모든 PRRSV에 감염된 돼지는 PRRSV N 단백질에 대한 항체가 생기므로 상기한 키메릭 바이러스는 PRRSV에 대한 새로운 살아있는 백신을 이용하는 앞으로의 계획에 이용될 수 있으며 특히 그의 숙주 세포인 폐포 마크로파지를 목표로 하는 벡터 시스템으로서 이용될 수 있다. 이러한 점에서 죽은 바이러스나 재조합 서브유니트로의 방어를 논하려는 초기의 시도는 실망스러운 것임을 언급해야만 하겠다. 구입가능한 PRRS에 대한 최근의 단지 유효한 백신은 US 균주(Gorcyca et al., 1995)에 기초한 변성된 살아있는 백신이다. 그러나, 이 변성된 살아있는 제품으로 백신처리된 돼지는 야생 바이러스에 감염된 돼지와 구별할 수가 없다. 따라서, PRRSV의 감염 클론은 게놈의 부위 지향적 돌연변이에 의해 이른바 마커 백신을 제공하므로 혈청 항체의 차이에 근거하여 백신처리된 돼지는 야생형 바이러스에 감염된 돼지와 구분될 수 있다. 본 발명에 기재된 LV의 감염 클론은 양성 가닥 RNA 바이러스의 이제까지 개발된 가장 긴 감염 클론이며 아테리바이러스류의 최초의 것이다. 상기 PRRSV의 감염 클론의 제조는 이 바이러스의 질병 발생론, 숙주 친화성 및 복제와 전사에 대한 연구에 새로운 기회를 열어 놓게 되었다. 아테리바이러스와 코로나바이러스는 공통 5' 리더를 함유하는 서브 게놈 RNA의 소위 포개어진 세트(Spaan et al., 1988; Plagemann and Moennig, 1991)의 생성을 포함하는 리더 프라임드(primed) 전사라고 일컬어지는 특이한 전사 기전을 공유한다. 상기한 리더 프라임드 전사는 복잡한 공정으로 아직 잘 알려져 있지 않다. 리더 프라임드 전사의 기초적인 기전을 설명하기 위한 코로나바이러스 바이러스학에 대한 연구는 이탈한 간섭 RNA의 cDNA의 분석 및 부위 지향적 돌연변이에 제한되는데, 왜냐하면 게놈의 거대한 크기(28 내지 30 kb)가 전염성 클론의 구성을 방해하기 때문이다. PRRSV의 전염성 클론은 아테리바이러스와 코로나바이러스의 흥미를 자아내는 전사 및 복제 메카니즘을 연구하고 해결하기 위한 모델 시스템으로서 유용하다.
바이러스는 마크로파지와 골수의 마크로파지 계통 세포 및 면역계의 다른 세포를 감염시키고 그의 제 2 세대 세포에 항원을 함유하는 바이러스를 퍼뜨리기 때문에 PRRSV에서 유도된 감염성 클론은 PRRSV 게놈에 삽입된 외래 항원에 대한 전달계 또는 벡터 백신 바이러스로 이용될 수 있다. ORF7의 절편 또는 아테리바이러스나 PRRSV의 N 단백질을 함유하는 항원에 있어서, 이 항원들은 감염된 세포의 세포막 바깥쪽에서 (ove)발현되어 면역반응을 더욱 강화하게 된다. 이러한 면역학적 촉진 효과는 항원에 대한 지속적인(낮은 수준에서의 연속적인 자극으로 인하여) 면역성을 유발하게 될 것이다. 본 발명에서는 다른 병원성 개체 또는 물질의 에피토프에 대한 정보를 구축하여 상기 바이러스를 항원 운반체로서 사용할 수 있다. 외래 에피토프 정보를 운반하는 여러 개의 변성된 PRRS 바이러스를 혼합하여 일시에 투여할 수 있다. 이렇게 하여 하나의 병원체의 여러 가지 상이한 에피토프에 대한 면역성을 활성화하거나 또는 여러 개의 상이한 병원체에 대한 활성 면역성을 제공할 수 있다. 변성된 PRRSV 백신의 안정성(비분계(非分界) 등과 같은)은 외피로 싸인 감염 바이러스를 생산하는데 요구되는 이들 바이러스 단백질의 정보를 삭제하므로써 보장될 수 있다. 이 바이러스는 그 외피 단백질을 조직적으로 발현하는 세포계에서 증식되어야만 한다. 이러한 상보성 세포계에서 복제하는 바이러스는 완전한 외피를 가지며 돼지에서 마크로파지를 감염시킬 수 있다. 1회의 복제 사이클 이후에 외피 단백질에 대한 정보를 잃어버린 제 2 세대 바이러스는 완전히 외피에 싸여진 바이러스로서 더 이상 다른 세포를 감염시킬 수 없다. 체 내에서 마크로파지의 감염은 원상태의 캡시드로도 가능하다. 이러한 방법으로 백신은 백신처리된 동물에게 제공되며 다른 동물에게 전염되지 않을 것이다.
참고문헌
| 서 열1)클론 번호 |
| ATGATGTGTAGGG..... 22TGATGTGTAGGG..... 1GATGTGTAGGG..... 2ATGTGTAGGG..... 1 |
1) 밑줄친 뉴클레오티드는 이전에 단리되어 서열화된 cDNA 클론 (Meulenberg et al., 1993a)에서 발견되지 않는 추가 서열이다.
Claims (20)
- 전체 길이 DNA 복제물, 시험관 내에서 전사된 RNA 복제물 또는 이들의 유도체 중 적어도 하나로 이루어진 재조합 핵산을 제조하는 것으로 이루어지되, RNA 바이러스가 약 15 kb 이상의 게놈을 가지는 것인 양성 가닥 RNA 바이러스의 게놈에 기초한 감염 클론을 제조하는 방법.
- 전체 길이 DNA 복제물, 시험관 내에서 전사된 RNA 복제물 또는 이들의 유도체 중 적어도 하나로 이루어지는 재조합 핵산을 제조하고 상기 재조합 핵산으로 숙주 세포를 형질감염하여 감염 클론을 선택하는 것으로 이루어지되, 상기 숙주 세포가 본질적으로 상기 바이러스에 감염되지 않는 것인 RNA 바이러스의 게놈에 기초한 감염 클론을 제조하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 바이러스가 약 15 kb 이상의 게놈을 가지는 양성 가닥 RNA 바이러스인 것인 감염 클론을 제조하는 방법.
- 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 숙주 세포가 BHK-21 세포인 것인 감염 클론을 제조하는 방법.
- 제 1항 또는 제 4항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의해 얻어지는 감염 클론으로 이루어진 재조합 핵산.
- 제 5항에 있어서, Nidovirales에서 선택된 바이러스의 게놈에 기초한 감염 클론으로 이루어지는 것인 재조합 핵산.
- 제 6항에 있어서, Arteriviridae에서 선택된 바이러스의 게놈에 기초한 감염 클론으로 이루어지는 것인 재조합 핵산.
- 제 7항에 있어서, 상기 바이러스가 PRRSV인 것인 재조합 핵산.
- 제 5항 내지 제 8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 독성 마커 및/또는 혈청학적 마커를 코드하는 핵산 서열이 변성되는 것인 재조합 핵산.
- 제 9항에 있어서, 상기 마커를 코드하는 핵산 서열이 구조 바이러스 단백질을 코드하는 오픈 리딩 프레임 내에 위치하는 것인 재조합 핵산.
- 제 10항에 있어서, 1개의 오픈 리딩 프레임이 Arteriviridae의 ORF7인 것인 재조합 핵산.
- 제 5항 내지 제 8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1개의 오픈 리딩 프레임이 Arteriviridae의 ORF7으로 치환되는 것인 재조합 핵산.
- 제 5항 내지 제 12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1 이상의 추가 이종성 핵산 서열이 삽입되는 것인 재조합 핵산.
- 제 13항에 있어서, 상기 이종 핵산 서열이 항원을 코드하는 것인 재조합 핵산.
- 제 5항 내지 제 14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 오픈 리딩 프레임이 변성되는 것인 재조합 핵산.
- 제 5항 내지 제 15항 중 어느 하나의 항에 따른 재조합 핵산으로 이루어진 변성된 RNA 바이러스.
- 제 16항에 따른 변성된 RNA 바이러스로 이루어진 백신.
- 제 16항에 따른 변성된 RNA 바이러스로 감염된 세포.
- 제 18항에 따른 세포 배양물에서 얻어진 단백질 및/또는 항원.
- 제 19항에 따른 단백질 및/또는 항원을 이용한 진단방법.
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