UA72433C2 - Infectious clones of rna-viruses and vaccines, and also diagnostic analyses developed on their base - Google Patents
Infectious clones of rna-viruses and vaccines, and also diagnostic analyses developed on their base Download PDFInfo
- Publication number
- UA72433C2 UA72433C2 UA99052951A UA99052951A UA72433C2 UA 72433 C2 UA72433 C2 UA 72433C2 UA 99052951 A UA99052951 A UA 99052951A UA 99052951 A UA99052951 A UA 99052951A UA 72433 C2 UA72433 C2 UA 72433C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- virus
- rna
- nucleic acid
- cells
- recombinant nucleic
- Prior art date
Links
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 97
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 77
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 135
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims abstract description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 8
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001018 virulence Effects 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 130
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 93
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 84
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 47
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 47
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 21
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 21
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 21
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 12
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 11
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 101100237844 Mus musculus Mmp19 gene Proteins 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 8
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 5
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 5
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 5
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 4
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 4
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 101100191372 Arabidopsis thaliana PRK5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100114828 Drosophila melanogaster Orai gene Proteins 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 244000089409 Erythrina poeppigiana Species 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 101000690503 Homo sapiens Protein argonaute-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 241000710788 Lelystad virus Species 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000005308 Orsa Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 1
- 102100026791 Protein argonaute-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000269435 Rana <genus> Species 0.000 description 1
- 235000009776 Rathbunia alamosensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000711517 Torovirus Species 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000219873 Vicia Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000016063 arterial thoracic outlet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003323 beak Anatomy 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 244000309457 enveloped RNA virus Species 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 description 1
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- -1 or for example Proteins 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- AHLBNYSZXLDEJQ-FWEHEUNISA-N orlistat Chemical compound CCCCCCCCCCC[C@H](OC(=O)[C@H](CC(C)C)NC=O)C[C@@H]1OC(=O)[C@H]1CCCCCC AHLBNYSZXLDEJQ-FWEHEUNISA-N 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Даний винахід стосується області РНК-вірусів і інфекційних клонів, отриманих із РНК-вірусів. Крім того даний винахід стосується вакцин і діагностичних аналізів, розроблювальних шляхом використання і модифікації таких інфекційних клонів РНК-вірусів.
Технологія рекомбінантних ДНК являє собою надзвичайно різноманітні і потужні методи молекулярної біології, здійснювані за допомогою модифікації нуклеїнових кислот на рівні ДНК, і дозволяє аналізувати і модифікувати геноми на молекулярному рівні. Відповідно до цього, віруси, через малий розмір їх геному, є особливо відповідними для таких маніпуляцій. Однак, техніка рекомбінантних ДНК не може бути безпосередньо застосована до неретровірусних РНК-вірусів, оскільки реплікація цих вірусів не включає стадію проміжних ДНК. У випадку таких вірусів, перед застосуванням технології рекомбінантних ДНК, повинні бути розроблені інфекційні клони (наприклад, ДНК-копії або іп міго-транскрибовані РНК-копії або їх похідні), які можуть бути введені в геном цих вірусів для генерування модифікованого вірусу. Інфекційні клони можуть бути отримані за допомогою конструювання повнорозмірної (що має довжину геному) КкКДНК (це поняття використовується в даному описі в широкому значенні і включає ДНК-копію РНК, а не тільки ДНК-копію мРНК) досліджуваного вірусу, після чого інфекційний транскрипт синтезується іп мімо у клітинах, трансфекованих повнорозмірною КДНК, але, при цьому, інфекційні транскрипти можуть бути також отримані шляхом іп міїго- транскрипції з іп міго-лігованих фрагментів КДНК, які складають повний вірусний геном. В усіх випадках, транскрибована РНК несе всі модифікації, які були введені в кДНК, і може бути використана для подальшого переносу модифікованого таким чином вірусу.
Інфекційні кДНК-клони і інфекційні іп міго-транскрипти були генеровані для великої кількості РНК-вірусів із позитивним ланцюгом (див. огляд Воуег 8: Наеппі, Мігоїоду 198, 415-426), які мають геном розміром аж до 12 т.п.о. або трохи більше. Довжина вірусного гена Резіїмігизе5 на сьогоднішній день є найбільшим геномом РНК- вірусу з позитивним ланцюгом, із якого були отримані інфекційні клони (Моогтапп еї аї., 9.Міг.70:763-770).
Проблеми, пов'язані з довжиною вірусного геному, полягають не тільки у важкості одержання і збереження довгих і стабільних кКДНК-клонів у бактеріях, але також і в інфекційності вихідного РНК-транскрипта, реплікація якого у клітині-хазяїні повинна бути здійснена без допомоги звичайно асоційованих вірусних білків, зв'язаних із реплікацією вірусу. Для досягнення успішного зараження, вірусні транскрипти повинні взаємодіяти з білками, які кодуються вірусом, цілком ймовірно, із вірусною репліказою і компонентами клітини-хазяїна, такими як, трансляційний комплекс; а тому структура вірусних транскриптів повинна, по можливості, найбільш точно імітувати структуру РНК-віриону. Додаткові проблеми можуть виникнути в зв'язку з тими РНК-вірусами з позитивним ланцюгом, які реплікуються згідно з механізмом субгеномної інформаційної РНК, транскрибованої з 3З-кінця геному і з тими РНК-вірусами з позитивним ланцюгом, які генеруються в процесі реплікації дефектних частинок, що інтерферують, таких як, "голі" капсиди або "порожні" вірусні частинки з оболонкою, які містять декілька структурних білків, і тільки частину геному. Присутність неповних фрагментів вірусної РНК або, наприклад, матриксних або нуклеокапсидних білків, які взаємодіють або інтерферують із транскрибуємою вірусною РНК або з репликативною проміжною вірусною РНК, і руйнуючих її структуру, буде призводити до припинення синтезу повнорозмірного ланцюга РНК, і, тим самим, до продукування інфекційного вірусу, який містить повну геномну РНК.
Лелістадський вірус (ЇМ), називаний також вірусом репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (РЕКЗУ, довжина геному 15,2т.п.0о.), є членом родини Агіегімігідае, яка також включає вірус артриту коней (ЕАМ, довжина геному 12,7т.п.о.), вірус підвищення рівня лактат-дегідрогенази (ГОМ, довжина геному, принаймні, 14,2т.п.0.), і вірус геморагічної лихоманки мавп (ЗНЕМ, довжина геному приблизно 15 т.п.о.) (Мешепрбего ес! а!., 1993а; Ріадетапп 5 Моеппід, 1993).
Нещодавно, Міжнародний комітет по таксономії вірусів вирішив включити цю родину в новий ряд вірусів,
Ммідомігаіез, разом із вірусами Согопамігідае (довжина геному 28-30т.п.о.) і Тогомігідае (довжина геному від 26 до 28т.п.0о.). Ряд Мідомігаез являє собою РНК-віруси з оболонкою, які містять геном РНК із позитивним ланцюгом, і синтезують 3'-гніздову серію субгеномних РНК в процесі реплікації. Субгеномні РНК коронавірусів і артеривірусів містить лідерну послідовність, яка починається з 5-кінця вірусного геному (Зраап еї аї., 1988;
Ріадетапп « Моеппід, 1993). Субгеномні РНК торовірусів не мають лідерної послідовності (Зпі)дег «5 Ноггіпек, 1993). Відкриті рамки зчитування (ОРС) Та і 10, які кодують РНК-залежну РНК-полімеразу, експресуються з геномною РНК, тоді як, більш дрібні ОРС у 3! кінця геномів Мідомігаіе5, які кодують структурні білки, експресуються із субгеномних мРНК.
РЕКФБМУ (лелістадський вірус) був уперше виділений у 1991 році Ууепзмоогі еї аї, (1991) і було показано, що він є етнологічним агентом, який викликає нове невідоме захворювання, таке як, репродуктивно-респіраторний синдром свиней (РКК5) , Основними симптомами захворювання є утруднення дихання у свиней і викидні у свиноматок. Хоча основні спалахи цього захворювання, які спостерігалися вперше в США в 1987р. і в Європі в 1991р., носили обмежений характер, цей вірус усе ще викликає економічні втрати в поголів'я свиней у США,
Європі і Азії. РККЗМ переважно розвивається в альвеолярних макрофагах легень (Умепзмоогі еї аї!., 1991).
Декілька клітинних ліній, таких як СІ 2621, і інші клітинні лінії, клоновані з клітинної лінії нирок мавп МА-104 (Веппеїйй еї аї!., 1992, Соїп5 еї аї., 1992; Кіт еї аї!., 1993), також є сприйнятливі до цього вірусу. Деякі добре відомі штами РКК5ЗУ є доступними під реєстраційними номерами СМСМ 1-1102,1-1140, 1-1387,1-1388, ЕСАСС
М93070108, або АТСС МЕ 2332, МЕ 2385, МК 2386, МЕ 2429, МК 2474 і МК 2402. Геном РЕКЗМ був цілком або частково секвенований (СопеїІтапп еї а!., 1993; Мешепрбега еї а!., 1993а, Мип-пацонп еї аї., 1995)., і цей геном, крім РНК-залежньї РНК-полімерази (ОРС Та і 15), кодує: шість структурних білків, із яких чотири оболонкових глікопротеїна позначені СР» (ОРС2), СРз (ОРСЗ), сРа (ОРСА4) і СР» (ОРСБ); неглікозилований мембранний білок М (ОРСб); і нуклеокапсидний білок М (ОРС7) (Мешепрбего еї аї., 1995, 1996; мап Мієшхуєайії єї аї., 1996).
Імунологічна характеризація і нуклеотидне секвенування штамів ЕР ії 05 РАВ5М дозволили ідентифікувати серед штамів РАВ5М невеликі антигенні різниці, локалізовані в структурних вірусних білках (Ме!зоп еї а)ї., 1993;
Мепзмооїї еї аїі., 1992; Мипацон еї а!., 1995).
Свині можуть бути інфіковані РАА5М шляхом ороназального введення. Вірус в легенях поглинається альвеолярними макрофагами легень, і реплікація вірусу РАВ5МУ у цих клітинах завершується через 9 годин.
За 12 годин РАН5М із легень потрапляє в легеневі лімфатичні вузли, а через З дні він потрапляє в периферичні лімфовузли, кістковий мозок, і в селезінку. В цих ділянках, лише декілька ліній клітин давали позитивне забарвлення на вірусний антиген. Цей вірус є присутнім у крові протягом, принаймні, 21 дня, а часто і більш тривалий час. Через 7 днів, у крові виробляються антитіла проти РАН5М. Спільна присутність вірусу і антитіла в РАН5МУ-інфікованих свиней вказує на те, що, незважаючи на присутність антитіла, вірусна інфекція зберігається протягом тривалого періоду часу, хоча і на низькому рівні. Протягом, принаймні, 7 тижнів, популяція альвеолярних клітин у легенях відрізняється від популяції в нормальних легенях 5РЕ.
Для інфікування свиней вірусом РАНЗМ ороназальним способом і продукування нормальної імунної відповіді у свиней потрібна присутність вірусної оболонки, яка, крім іншої дії, викликає продукування нейтралізуючих антитіл, спрямованих проти одного або декількох оболонкових білків; такі антитіла можуть робити вірус неінфекційним. Проте, після поглинання альвеолярними макрофагами, цей вірус також продукує "голі" капсиди, сконструйовані з РНК, інкапсулованої білками: М та/або М, які іноді містять один із глікопротеїнів. Внутрішньоклітинна і позаклітинна присутність цих неповних вірусних частинок або (іноді) голих капсидів може бути продемонстрована за допомогою електронної мікроскопії. В деяких випадках, можуть бути виявлені голі капсиди без нуклеїнової кислоти, що міститься в них. Голі капсиди поширюються по організму з кровотоком, і поглинаються з крові макрофагами селезінки, лімфатичних вузлів і кісткового мозку. Ці "голі", але інфекційні вірусні капсиди не можуть бути нейтралізовані антитілами, вироблюваними організмом свині, чим і пояснюється персистентність вірусної інфекції в присутності антитіл. Таким чином, потомство макрофагів від інфікованих клітин кісткового мозку поширює вірусну інфекцію на нові ділянки організму тварин. Оскільки не всі клітини лінії диференційовання макрофагів кісткового мозку є інфікованими, то лише невелика кількість макрофагів у периферичних ділянках є інфікована і продукує вірус. Капсиди РЕКЗУ, які складаються тільки з білків ОРС7, можуть бути утворені у відсутності інших вірусних білків, наприклад, шляхом інфікування макрофагів химерним веісгорним вірусом "псевдорабівірус-ОРС7". Вірус РЕМ був підданий маніпуляції так, щоб він містив ОРС7-генетичну інформацію РЕКБЗМ. Через 18 годин після інфікування, цитоплазма інфікованих клітин містить велику кількість невеликих порожніх сферичних структур, які мають розмір нуклеокапсидів вірусу РЕК5.
Таким чином даний винахід відноситься до інфекційного клону, який походить від вірусу з довжиною геному, що значно перевищує максимальну довжину геному РНК-вірусів із позитивним ланцюгом, із яких дотепер одержували інфекційні клони. В експериментальній частині даної заявки описано одержання інфекційного клону, на основі або клону, який походить, від вірусу РЕКБУ, із довжиною геному 15,2т.п.0., однак, такі клони можуть бути також отримані з вірусів ГОМ ії ЗНЕМ, що також мають довжину геному від приблизно 15т.п.о., і з вірусу ЕАМ, хоча довжина його геному значно менша/ а також із вірусів із більш довгим геномом, таких як, Согопамігідає або Тогомігідає.
Даний винахід також стосується способу продукування інфекційних клонів, який дозволяє уникнути проблем, які виникають при синтезі вірусного ланцюга РНК, і зв'язаних із присутністю фрагментів неповної вірусної РНК, або наприклад, матриксних або нуклеокапсидних білків, які взаємодіють або інтерферують із
РНК-транскриптом, які транскрибуються, або з репликативною проміжною РНК, і руйнуючи її структуру, що перешкоджає синтезу повнорозмірного РНК-ланцюга, і, тим самим, продукуванню інфекційного вірусу. Даний винахід стосується способу генерування інфекційних клонів шляхом трансфекцкії клітин-хазяїв, які є, в основному, не сприйнятливими до інфікування вірусом дикого типу, рекомбінантною нуклеїновою кислотою, отриманою на основі геному зазначеного вірусу, із наступним "порятунком" потомства інфекційного вірусу з зазначеної клітини-хазяїна шляхом його пасививання на клітини або шляхом спільного культивування з клітинами, які є сприйнятливими до цього вірусу. В порівнянні з клітинами, які звичайно використовуються для реплікації досліджуваних вірусів, клітини, що є, в основному, не сприйнятливими, можуть бути лише злегка сприйнятливими, або зовсім не сприйнятливими до досліджуваного вірусу, але вони можуть бути абсолютно сприйнятливими до інших вірусних штамів. Даний винахід стосується способу продукування інфекційних клонів шляхом трансфекції клтин-хазяїв, які не є сприйнятливими до інфікування вірусом дикого типу, що дозволяє уникнути генерування голих капсидів або неповних вірусних частинок, які містять РНК-фрагменти і матриксні або нуклеокапсидні білки, які перешкоджають синтезу вірусного РНК-ланцюга. "Порятунок" інфекційного вірусу з трансфекованих таким чином клітин-хазяїв здійснюють шляхом пасивування на клітини, які є сприйнятливими до цього вірусу. В експериментальній частині описаний спосіб такого одержання інфекційного клону РЕКЗБУ, але цей спосіб може бути також застосований до інших РНК-вірусів із позитивним ланцюгом.
Даний винахід також передбачає можливість генерування модифікованого інфекційного клону шляхом застосування технології рекомбінантних ДНК. Такими модифікаціями можуть бути одиночні або множинні мутації, заміни, делеції або інсерції, або їх комбінації, які можуть бути здійснені з використанням технології рекомбінантних ДНК, відомої фахівцям. Таким чином, даний винахід стосується модифікованих РНК-вірусів, які можуть бути використані для дослідження РНК-вірусів і для виготовлення вакцин.
Даний винахід також стосується інфекційних клонів, які походять, наприклад, від Апегімігідає, такого як,
РЕКФБУ, який може бути використаний в якості моновакцини проти захворювання, що викликається вірусом, на основі якого був отриманий цей клон. Так, наприклад, інфекційний клон на основі РЕЕЗМ може бути використаний для дослідження маркерів вірулентності або серологічних маркерів РЕК5БМ. Відомими серологічними маркерами РЕКБ5М є, наприклад, маркери, локалізовані, наприклад, на будь-якому із структурних білків РЕКЗМ, що кодуються ОРС2-7, але вони можуть бути також виявлені в білках, що кодуються ОРС Та і 15. Маркери вірулентності присутні в ОРС Та і 10, які кодують неетруктурні білки РЕКБУ, але вони можуть бути також виявлені в білках, які кодуються ОРС2-7. Шляхом модифікації геному інфекційного клону, що стосується цих маркерів, можна одержати РЕБКБУ, який не є або є значно менше вірулентним, ніж його батьківський штам, талабо цей штам модифікують шляхом делеції або введення серологічних маркерів так, щоб можна було здійснювати серологічну диференціацію між вакцинованими свинями і свинями, інфікованими вірусом дикого типу. Такі модифікації здійснюють, наприклад, із використанням інфекційних клонів РЕК5БМ, у яких нуклеотидну послідовність, яка кодує ОРС7-білок М, замінюють ОРС7-білюом АТСС УК2332 або І БМ.
Даний винахід також стосується інфекційних клонів, наприклад, клонів, які походять від вірусів Апегімігідає, таких як, РЕКБМ, які можуть бути використані в якості системи доставки або в якості вірусної векторної вакцини для широкого ряду антигенів. В таких клонах присутні гетерологічні послідовності нуклеїнових кислот, які не відповідають патогенній послідовності досліджуваного вірусу. Ці гетерологічні послідовності нуклеїнових кислот можуть, наприклад, походити від послідовностей, які кодують будь-який обраний антиген. Таким антигеном є білок або пептид, який може індукувати імунітет проти патогена. Оскільки цей вірус інфікує макрофаги, і клітини лінії диференціювання макрофагів у кістковому мозку поширюють антиген-вміщуючий вірус через своє клітинне потомство, то ця вірусна векторна вакцина інфікує клітини, які є центральними стосовно імунної системи, і може презентувати антигени для подальшого процесування. Векторна вірусна вакцина інфікує антигенпрезентуючі клітини подібно дендритним макрофагам або клітинам Купфера або іншим клітинам імунної системи, і може здійснювати це як (неповністю) вірусна частинка з оболонкою або як гола капсидна частинка. Оскільки інфікування голим капсидом або неповною вірусною частинкою забезпечує персистентну інфекцію, то імунологічний бустер-ефект буде викликати тривалий (через безперервну стимуляцію на низькому рівні) імунітет проти патогенів, із яких були відібрані антигени. Цей вірус може бути використаний в якості антигену-носія шляхом введення інформації для епітопів інших патогенних мікроорганізмів або речовин. Деякі з таких векторних вакцинних вірусів, що несуть чужорідну епітопну інформацію, можуть бути змішані і введені одночасно. Це дозволяє забезпечувати активний імунітет проти декількох різних антигенів одного патогена, або активний імунітет проти декількох різних патогенів.
Даний винахід також стосується інфекційних клонів, наприклад, отриманих від вірусу Апегімігідае, такого як, РЕКБЗМ, який може бути використаний в якості вакцини подвійного призначення. Так, наприклад, інфекційний клон на основі РЕМ може бути використаний для створення вакцини з метою захисту від
РЕКФБМУ і від іншого патогена, просто шляхом розробки векторної вакцини разом із розробкою одноцільової вакцини спрямованої проти РЕК5. Спеціальна вакцина подвійного призначення може бути розроблена так, щоб вона забезпечувала захист проти респіраторного захворювання у свиней шляхом введення в РЕК5- вакцини антигенів, які походять від будь-яких інших респіраторних патогенів широкого ряду, які, як відомо, інфікують свиней.
Даний винахід також стосується вакцин, як одного призначення, так і подвійного призначення або до векторних вакцин, які є безпечними в тому значенні, що вони не можуть впливати на навколишнє середовище.
Безпека вакцини (яка не впливає на навколишнє середовище) може бути забезпечена шляхом видалення інформації, яка відноситься до вірусних білків, і яка є необхідною для продукування інфекційного вірусу з оболонкою. Цей вірус повинен розмножуватися в клітинній лінії яка конститутивно експресує зазначений білок. Вірус, який реплікується в цій комплементарній клітинній лінії, має повну оболонку, і здатний інфікувати макрофаги у свиней. Після одного циклу реплікації, вірусне потомство, що не містить інформації для білка оболонки, більше не здатне інфікувати інші клітини, на відміну від вірусу з оболонкою. Інфікування макрофагів, які знаходяться в організмі ще можливо під дією голого капсиду або неповної вірусної частинки.
Даний винахід також стосується вірусних антигенів і білків, які можуть бути зібрані з клітинних культур, інфікованих модифікованими РНК-вірусами даного винаходу. Такі антигени можуть бути використані для діагностичних аналізів, таких як, ЕГІЗА або діагностичних аналізів іншого типу, відомих експерту в даній області. Ці аналізи можуть бути використані у вигляді незалежних тестів для первинної діагностики або у вигляді супровідних тестів, застосовуваних для популяцій тварин, які були вакциновані ідентифікувальною або маркерною вакциною, отриманою на основі РНК-вірусів даного винаходу.
Експериментальна частина
Продукування кДНК-клонів, із яких інфекційні РНК можуть бути транскрибовані іп міго, стало головним інструментом для молекулярно-генетичних аналізів вірусів, які містять РНК із позитивним ланцюгом. Ця технологія може застосовуватися до вірусів, які містять РНК із позитивним ланцюгом, і РНК-геном яких може функціонувати як мРНК і ініціювати повний цикл інфікування після його введення в клітини-хазяїни. Для ряду вірусів були описані інфекційні клони, що полегшило дослідження з генної експресії, реплікації, функціонуванню вірусних білків, і рекомбінації РНК-вірусів (див.огляд Воуег 8. Наєппі, 1994). Крім того, ці клони можуть бути використані для розробки нових вірусних векторів і вакцин. Інфекційний кКДНК-клон для
Апегімгизед не був описаний дотепер. У даній заявці описане продукування інфекційного клону РЕКЗМ і його перше застосування для одержання химерних вірусів РККБМУ.
Матеріали і методи Клітини і віруси
Штам Тег Нишгпе РЕКБЗМ (або ІМ) (депонований у СМОМ, Париж, під номером доступу 1-1102) був виділений у 1991р. (Ууепзуоогі еї аї!., 1991), ії культивований у первинних альвеолярних макрофагах або в клітинах СІ 2621. У цьому дослідженні використовували пасаж 6 штама Тег Нишигпе (ТН), а також похідний штам ГМ4.2.1, який був адаптований для росту на клітинах СІ/2621 шляхом серійного пасивування.
Альвеолярні макрофаги підтримували - на ростовому середовищі АРМІ-1640 (Ріому), а клітини СІ 2621 підтримували на мінімальному підтримуючому середовищі Хенкса (сСірсо ВЕІЛіїте Тесппоіодіе5). Клітини
ВНК2І1 підтримували на мінімальному підтримуючому середовищі Дульбекко. Для експериментів по трансфекції, клітини ВНК-21 культивували на мінімальному підтримуючому середовищі Глазго (сірсо ВЕ Л те
Тесппо!одіе5) відповідно до методу Г евігот і сзагої(1993).
Виділення вірусних РНК
Внутрішньоклітинну РНК виділяли з альвеолярних макрофагів або клітин СІ 2621, через 24 години після інфікування вірусом РЕКЗМ при множинності зараження 1, як описано раніше (Мешепбегод еї а!., 1993а). Для виділення геномної РНК віриону, віриони були очищені на градіантах сахарози як описано Міетувзвіайі і ін. (1996) і ресуспендовані в ТМЕ (0,01М Трис-НСЇІ, рН 7,2, 0,1М Масі, 1мМ ЕОТА). 1мл протеїназного буфера К (100мММ Трис-НСІ, рН 7,2,25мММ ЕОТА, 300мМ масі, 295 (мас/об.) ДСН) і 0,4мг протеїнази К (Воепгіпдег
Мапппеїт) додавали до їмл очищених вірионів РЕВБ5М (108 ТСІЮОзо). Цю реакційну суміш інкубували при 377 протягом 30 хвилин. РНК екстрагували один раз сумішшю фенолу і хлороформу (1 1), і осаджували етанолом.
РНК зберігали в етанолі при - 20"С. Одну десяту частину цього препарату використовували в реакціях зворотної транскрипції (КТ).
Клонування 5'- і 3'-кінців геному РКАЗМ 5-кінець вірусного геному РКЕКБЗМ клонували з використанням модифікованого методу одноланцюгового лігування в одноланцюгову КДНК (ЗГІС; Едулагаз еї а!., 1991). Одну десяту частину віриону РНК, отриману як описано вище, використовували в реакції КТ з праймером 110113 (5'-ТАСАООТОССТОАТССААСА 3), комплементарним нуклеотидам 1232-1251 геному. Реакцію КТ здійснювали в кінцевому об'ємі 20мкл, як було описано раніше (Мешепбегд еї а!І., 19935). Потім 2мкл 6М Маон додавали до КТ-реакційної суміші, Її РНК гідролізували протягом 30 хвилин при 37"С. Одноланцюгову кКДНК очищали з використанням набору
Воепгіпдег Мапппіет для високого ступеня очищення РСК-продукту. Очищену кКДНК осаджували етанолом, ресуспендували в ТЕ, і лігували з якірним праймером А! 3 (Б-САССААТТСАСТАТСОАТТСТОСАТССТТОС 3). Цей праймер містить Есокі-, Сіа)ї, і Ватні-сайти, а його
З3-кінець модифікований аміно-блокувальною групою для попередження самолігування. Одноланцюговий
КДНК-продукт був лігований із 4Апмоль АГОЗ3 у 50мм Трис-НСЇІ (рн 8,0), 10мм Мпеїі», 10мкг/мл В5А, 2595 ПЕГ, 1,0й0мм гексамінхпориду кобальту, 40мкМ АТР, і 0,5мкл (1бод.) РНК-лігази Т4 (Мем Еподіапа Віоїар5), протягом ночі при кімнатній температурі. Одну третину реакційної суміші для лігування використовували в якості матриці для РСК із використанням праймерів Гм69 (5-АСатсатовАс,асавассссатаАтТ-СОааатТАСО-3)) і
АЇ с4 (5-СААОСАТССАСААТСОСАТАС). Праймер І М69 комплементарний нуклеотидам 594-615 геному ІМ, а праймер АГс4 комплементарний якірному праймеру АГО3. Умови РСЕ були описані Мешепрбего еї а!., (19936), і отриманий продукт був гідролізований ферментами ЕсокКі! і баїї і клонований у рОЕМ-47. Аналогічну стратегію використовували для клонування 5'-кінців І М-геному з внутрішньоклітинної РНК ІМ. З цих експериментів було використано 1Омкг повної клітинної РНК, виділеної з клітин СІ 2621, інфікованих ІМ. 5'-
КДНК-клони секвенували, і один клон, рАВУ387, який містить подовження у 10 нуклеотидах, у порівнянні з опублікованою послідовністю РЕКБМУ (Мешепрбего еї а!., 1993а), використовували для проведення наступних експериментів.
З' кінець кКДНК-кпону, який містить довгий роїу (А)-хвіст, конструювали за допомогою зворотної транскрипції РНК ІМ із використанням праймера ГМ76 (5'-ТСТАаСААТТСТАСАССОСАТСОЇ(Т)3), який містить
Есові-, Хвраї-, і РмиІ-сайти. Після реакції зворотної транскрипції проводили РСК із використанням праймера
І М75 (Б-ТСТАВСААТТСТАСАСОСАТСИТ-3), який ідентичний праймеру І М76, за винятком роїу(Т)-хвоста; і праймера 39070Кк (5-24(1:АСаТОаСаНнНААССТСатсСАА-3), значеннєвого праймера, відповідного нуклеотидам 14566-14585 геному ГМ і який містить НраІ-сайт. Отримані РСОК-продукти гідролізували ферментами Нра! і
ЕсокіІ і клонували в КДНК-клон рАВМУ39, рестриктований тими ж ферментами (фіг.1). Два клони кДНК, які містять роїу(А)-хвіст із 45А (рАВМ382) і 109А (рАВМ392) і правильну геномну кКДНК-послідовність, як було оцінено за допомогою олігонуклеотидного секвенування, використовували для конструювання повнорозмірного геномного кКДНК-клону.
Аналіз послідовності
Олігонуклеотидні послідовності визначали з використанням набору для секвенування РКІЗМ'"" Неаду
Веасіюп Буе Оеєоху"м Тегтіпайог Сусіе Зедшиепсіпд Кії і автоматичного секвенатору Арріїеа Віозувіетв.
Конструювання повнорозмірньк геномних кКДНК-клонів РКК5У
КДНК-кпони, генеровані раніше для визначення нуклеотидної послідовності геному ЇМ (Мешепрбего еї аї., 1993а), лігували разом у відповідних рестрикційних сайтах, вказаних на фіг.1. Плазміду рАвВМ254 конструювали з клонів рАВМ 25, 11, 12 і 100, і використовували в попередньому дослідженні (деп Вооп еї аї., 1996), Стандартні процедури клонування здійснювали як описано Затрьгоок і ін. (1989). В результаті були отримані три плазміди, які містять кКДНК-послідовності ЇМ, які перекриваються, у висококопійній плазміді рОЕМ-47. Плазміди рАВМ331 і рАВУ369 складалися з нуклеотидів 5-6015 геному ІМ. В серії з 6 незалежних
КДНК-клонів, які були секвеновані в цій області, була виявлена різниця в нуклеотидах положення 3462 у відношенні 1:1. Ця різниця в нуклеотидах призводила до заміни амінокислоти в положенні 1084 у ОРС 1А (І е!и замість Рго). Оскільки неможливо було передбачити вплив цієї амінокислоти на інфекційність, то був також клонований Геи-кодуючий кКДНК-фрагмент у рАВМ331 шляхом заміни в ЕсоРМ-(нуклеотид 3403) і ЗабсіІ- (нуклеотид 3605) сайті, що призводило до одержання плазміди рАВУ369. Плазміда рАВУЗ384 складається з нуклеотидів 5168-9825 геному М. Оскільки поки не існує відповідного КДНК-клону, який перекривався б з плазмідами рАВМ20 і рАВМ5, і який можна було б, у кінцевому рахунку лігувати з КДНК-послідовностями рАВМ331 і рАВМ369, то були генеровані два нових КкДНК-фрагменти за допомогою КЕТ-РСЕ. В одній РСЕ використовували значеннєвий праймер ГМ59 (5- ТСБСААТСТАСАТСТСАСООЯТОаСсТаСАаСТОасСтТОа 3), що відповідає нуклеотидам 5169-5186, і антизначеннєвий праймер 610303 (5-ОАТСААСАССТОТОаСАСАСС 31), комплементарний нуклеотидам 6078-6097. В іншій РСК використовували значеннєвий праймер 610526 (5'-
ТТССтТТІСТСТ-СбСОСАТОАТ 3), що відповідає нуклеотидам 5936-5955, і праймер 1М60 (5- атТАСТОИаТАССОваАтТоСаТтаАдсаАТатТОсС 3), комплементарний нуклеотидам 6727-6745. Ці два РСВ- фрагменти лігували разом у рАВМ20 із використанням Хба!-сайта, введеного в І М59, внутрішнього Аро!-сайта (нуклеотиди 6006), і Ватні-сайта в нуклеотиді 6740, який був також введений у праймер І М60. Новий кКДНК- фрагмент був цілком секвенований і не містив ніякої мутації, яка призводила б до різниці в амінокислотах у порівнянні з опублікованою послідовністю (Мешепрбего еї а!., 1993а). Плазміда рАВУ368 включала нуклеотиди 8274-13720 геному РККБЗМ. Оскільки додаткове лігування кКДНК-фрагментів у рОЕМ-47 призводило до одержання нестабільних клонів, то вставки рАВу331/369, рАВУ384 і рАВМ368 лігували з 5- і 3 кДНК- фрагментами в рокК12 (мМміега 5 Меззіпо, 1991). Передбачалося, що плазмідний вектор є більш відповідним для клонування чужорідних послідовностей кКДНК великого розміру, оскільки він є більш низкокопійним, ніж РОЕМ- 47. Плазміди переносили в штам ОНбо: Е.соїї, культивований при 32"С в присутності 15мкг/мл канаміцину для збереження, по Можливості, низької кількості копій. Спочатку, КДНК-фрагменти рАВУ382 ((А)«5) і ОАВМ392 ((А)тое) вирізали шляхом гідролізу ферментом ЕсокКІ, і цей сайт модифікували полімеразою Кленова
(Рпагтасіа) для затуплення кінців із наступним гідролізом ферментом Ватні. Ці фрагменти клонували в рокКт12, пдролізований ферментами Ватні і Е5рі, де останній сайт був також модифікований для затуплення кінця, і одержували рАвВУ394 і рАВУ395. Аналогічним способом був видалений промотор РНК-полімерази 17, присутній у рОК!1 Після цього, КДНК-фрагменти рАВУЗ6б8 і рвму384 лігували з 3 кінцем кДНК-кітонів з використанням ВсіІ-сайта (нуклеотид 13394), зеа!І-сайта (нуклеотид 8657) і Ватні- і ВоП-сайтів у фрланкуючих або векторних послідовностях. В результаті цього були отримані плазміди рАВМ401 і рАВМ402 (фіг.1). 5-КДНК-клон, який містить промотор РНК-полімерази 17, безпосередньо лігований із 5'-кінцем геному ІМ, ампліфікували за допомогою РСК із рАВМ387 з використанням праймерів 1М83 (5-
СААТТСАСТАСТТААТАСЯАСТСАСТА-ТАСАТОАТОТОТАСОСТАТТОС 3) і 1М69. /ЇМ83 складається з (у напрямку 5'-»3) ЕсоВіІ- і 5реІ-сайта, промоторної послідовності РНК-полімерази Т7, проте С для ініціації транскрипції, і нуклеотидів 1-19 геному ГМ. РСОК-фрагмент клонували в ЕсокіІ- і ЗаіІ-сайт роКт12, в результаті чого одержували плазміду рАВМ396. Правильність послідовності рАВМ396б оцінювали шляхом олігонуклеотидного секвенування. Потім, кКДНК-фрагменти ІМ плазміди рАВУ331 і рАВМ369 вирізали ферментами Араї і Ватні, і лігували в рАВУ396, гідролізовану ферментами Араї і Ватні. І нарешті, отримані 5-КДНК-фрагменти кпонували в рАВМ401 і рАВМ402 із використанням Зре!І-сайта, розташованого вище промотора РНК-полімерази 17, і унікального Ріпі-сайта в положенні 5168 вірусного геному. Таким чином,
КДНК-клони, які мають довжину, рівну довжині геному, були отримані як клони, що відповідають вірусам, подібним батьківському штаму, і химерним вірусам, які містять чужорідні відкриті рамки зчитування.
Продукування мутантних вірусів, які містять Расі!- та/або ЗулаІ-сайти Для введення унікального Рад-сайта в
КДНК-клон геномної довжини безпосередньо нижче гена ОРС7, обидва нуклеотиди Т і А в положеннях 14987 і 14988 заміняли на нуклеотид А в реакції РСК із використанням значеннєвого праймера ІМ108 (5- ссАа,атТааТМоСсТСатСсААатАТИВССИИСТАААААССАаА-ЯСС 3) з антизначеннєвим праймером ІМ 112 (5-
ССАТТСАССТОАСТатТТААТТААСТТаСАСССТад 3), і значеннєвого праймера ГМ111 (5-
ТСАВОСТОСААСТТААТТАААСАСТСАООСТОААТОСО 3)С І М75. Аналогічно, унікальний ЗулхаІ-сайт створювали шляхом заміни С в положенні 14980 на Т, а Т в положенні 14985 на А з допомогою РОК із використанням праймерів ГМ108 і ІМ110 (5-ЯСТОАСТаТСААТТТАААТТОСАСССТОАС 3) і праймерів ІМ109 (5- атАс,аатасСААТТТАААТТОАСАатсСАСЦа 3) і ГМ111. РОК-фрагменти лігували в рАВМ395 з використанням створених Расі- і ЗмаІ-сайтів, і фланкуючих Нра!- і Храї-сайтів, в результаті чого одержували плазміди рАВМ427 і рАВМ426, відповідно. Потім цей фрагмент вбудовували в плазміду рРАВМА14 з використанням тих же самих унікальних Нраї!- і ХраІ-сайтів, в результаті чого одержували плазміди рАВМ437 і рАВМ442 (див. фіг.4). Для детекції мутації маркерів у вірусі, виділеному з транскриптів рАВМ437 і рАВМА422, РНК виділяли із супернатантів альвеолярних макрофагів інфікованих свиней. Цю РНК використовували в РСК із зворотною транскриптазою для ампліфікації фрагмента, який має приблизно 0,6бт.п.о. (який простягається від нуклеотиду 14576 до роїу(А)-хвоста різної довжини) з використанням праймерів ГМ76, 1 М75 і 39070К. Присутність генетичного маркера детектували шляхом гідролізу РСКЕ-фрагментів ферментами Расі або 5маї.
Іп міго-транскрипція і трансфекція РНК
Плазміди рАВМ414, рАВМ416, які містять повнорозмірний геномний кКДНК-фрагмент ІМ, лінеаризували ферментом Рмиї, і цей фрагмент був розташований безпосередньо нижче роїу (А) хвоста. Плазміду рАВМ296, яка складалася з ОРСА у експресувальному векторі вірусу лісів Семлікі О5ЕМІ (Мешепрегод еї аї., 1997), лінеаризували ферментом Зреї, і ця плазміда слугувала в якості контролю в експериментах по іп міїго- транскрипції і трансфекції. Лінеаризовані плазміди осаджували етанолом, і 1,5мкг цих плазмід використовували для іп міго-транскрипції РНК-полімерази Т7 (плазміди рАВМ414, ОАВМ416) або РНК- полімерази 5рб (рАВМ296) у відповідності із способами, описаними для 5ЕМ | ЦШевігот « Сагоїї (1991 і 1993). Іп міго-транскрибовану РНК осаджували ізопропанолом, промивали 7095 етанолом, і берегли при -207С аж до її використання. Клітини ВНК-21 висівали в лунки Мб (приблизно 1092 клітин/лунку), і трансфекували 2,5 мікрофамами РНК, змішаними з 1О0мкл ліпофектину в оптимальній кількості, як описано І ПЦШевігот 5 багої (1993). Альтернативно, РНК вводили в клітини ВНК-21 шляхом електропорації. У цьому випадку, 1Омкг іп міго- транскрибованої РНК або 1Омкг внутрішньоклітинної РНК М трансфекували приблизно в 107 клітин ВНК-21 з використанням умов електропорації, описаних І Певігот 8 сзагоїї (16). Середовище збирали через 24 години після трансфекції, і переносили в клітини СІ/ 2621 для "порятунку" інфекційного вірусу. Трансфековані і інфіковані клітини тестували на експресію І М-специфічних білків за допомогою імунопероксидазного аналізу моношару клітин (ІРМА), в основному, як описано М/епзмоогі і ін. (1986). Моноклональні антитіла (Марз) 122,13, 122,59, 122,9 і 122,17, спрямовані проти білків сРз, Ра, М і М (мап Міетиувіайї еї а!., 1996), були використані для забарвлення в ІРМА.
Результати
Реконструювання 5'-кінцевої послідовності геномної РНК М
Хоча інфекційність іп міго транскрибованих РНК із зрізаними 5'-кінцями була описана в літературі (Оамів еї а!., 1989, Кіштр еї аїЇ.,, 1990), проте, в основному, варто визнати, що для одержання інфекційних клонів необхідна повна вірусна послідовність, що включає самі крайні 5'- і 3"-кінці. Для клонування 5'-кінця геному ЇМ використовували модифікований метод одноланцюгового лігування в одноланцюгову кДНК (5ГІС; Еджмагав єї а!.,, 1991). Внутрішньоклітинну РНК, виділену з клітин СІ 2621, інфікованих Г М і РНК ГУ, виділену з очищених вірионів, піддавали зворотній транскрипції з використанням праймера І М69, комплементарного 5'-кінцю ОРС 1А. Продукт першого ланцюга кКДНК лігували з якірним праймером АГО3, 3'-кінець якого блокували щоб уникнути самолігування. Ліговані продукти ампліфікували за допомогою РОК і клонували. Дванадцять клонів, які походять від внутрішньоклітинної РНК Г/М, і отриманих в результаті проведення двох незалежних РСЕ, і чотирнадцять клонів, які походять від РНК віриону, і отриманих в результаті проведення двох незалежних
РСЕ, були секвеновані З цих 26 кДНК-клонів, 22 клони містили подовження у 10 нуклеотидах (5
АТОАТОТОИТА 3) у порівнянні з кКДНК-послідовністю, опублікованою раніше (Мешепрбего еї а!., 199738), а в 4 клонах були відсутні від одного до трьох нуклеотидів у 5'-кінця цієї додаткової послідовності (таблиця 1). Цей факт наводить на думку, що зазначені десять нуклеотидів являють собою самий крайній 5'-кінець геному ІМ, а тому ці нуклеотиди були включені у КкДНК-клон геномної довжини.
Конструювання кДНК-клонів ІМ, що мають довжину, рівну довжині геному
Для конструювання кКДНК-клону ЇМ, що має довжину, рівну довжині геному, кКДНК, які були виділені і секвеновані раніше (Мешепрбего еї аї., 1993а), приєднували в загальних рестрикційних ферментних сайтах у відповідності із стратегією, проілюстрованою на фіг.1. Крім того, для складання кДНК-клонів геномної довжини були сконструйовані нові КДНК-фрагменти. Один кКкДНК-фрагмент, який охоплює нуклеотиди 5168-6740, був створений за допомогою КТ-РСК з метою лігування кДНК-послідовностей із клонів рАВУ5 і рАВУ20. Промотор
РНК-полімерази Т7 для іп мійго-транскрипції був приєднаний безпосередньо до 5'-кінця геному ЇМ за допомогою РСК, і цей новий КДНК-фрагмент, клонований у рАВМ396, вставляли в кКДНК клон з геномною довжиною. Повторне секвенування нуклеотидів 3420-3725 на шести нових і незалежних кДНК-клонах вказувало на те, що амінокислоти 1084 у ОРСТа, ГГ ец і Рго, присутні у співвідношенні 1:1. Оскільки неможливо передбачити вплив цих амінокислот на інфекційність РНК, транскрибованої з кінцевого КДНК-клону геномної довжини, то для конструювання цього клону були використані обидва з них. На 3'-кінці були використані два різних КДНК-клони. Спочатку був виділений 3'-кінець кДНК- клонів, які містять роїу (А)-хвости максимально з 20
А (Мешепбего еї а!., 1993а). Проте, виходячи з даних досліджень по визначенню довжини роїу(А)-хвостів родинних вірусів, таких як, ГОМ (Спеп еї а!., 1994), передбачалося, що цілий роїу(А)-хвіст значно довший. Тому були отримані нові 3-кінцеві КДНК-клони з використанням праймера І М76, який містить подовження із 40 залишків Т. Ці КкКДНК-клони секвенували, в результаті чого було виявлено, що вони містять подовження з 40- 109 залишків А. Для одержання кДНК-клону геномної довжини використовували кКДНК-клон, який містить найбільш довгий роїу(А)-хвіст (109 залишків А; рАВМ392). Оскільки довгі гомополімерні хвости можуть перешкоджати реплікації плазміди в Е.соїї (Оепд 8 Ми, 1981), то для використання в наступних стадіях клонування, був також відібраний другий клон, рАВМ382, який містить 45 залишків А. Проведені раніше спостереження показали, що збереження кКДНК-клонів геномної довжини у висококопійних плазмідах сприяє акумуляції мутацій або розподілів, які призводять до втрати інфекційності транскриптів, синтезованих із цих клонів (І аї еї аї., 1991, Вісе еї аї., 1987, З, итіуозпї еї аї!., 1992). При спробі лігувати більш великі фрагменти
КДНК клонів 331/339, 384 і 368 рАВМ у 5'- і 3-кінці в РОЕМ-47 спостерігалася також нестабільність плазмід, а тому, ці клони, у кінцевому рахунку, були з'єднані один з одним у низькокопійному векторі роК12 (Міега 85
Меззіпо, 1991). В результаті цього були отримані кДНК-клони геномної довжини рАВМА414/415 і 416, які можуть бути стабільно розмножені в Е.соїї у використовуваних умовах культивування. Будь-якої різниці в стабільності
КДНК-клонів геномної довжини, що містять 45 або 109 залишків А, не спостерігалося.
Інфекційність РНК М
ЇМ зростає переважно у свинячих альвеолярних макрофагах. Дотепер, клітинна лінія СІ 2621 або інші клони, які походять від клітинних ліній нирки мавпи МА104, являють собою лінії, які, як було вказано, поширюють ІМ (ВепйеїЇй еї а!., 1992; СоЦШп5 еї а!Ї., 1992; Кіт еї аІ., 1993). Отже, клітини СІ 2621 були використані з метою визначення оптимальних умов для трансфекції РНК ГМ. РНК, виділену із І М-інфікованих клітин СІ 2621, трансфекували в клітини СІ 2621 у різних дозах із застосуванням різних методів, таких як, методи з використанням ліпофектину, ліпофектаміну, ОЕАЕ-декстрану, і електропорація. Клітини скринували на цитопатичну дію і наявність бляшок через 7 днів після трансфекції, але ці ознаки інфекційного вірусу не були виявлені. Крім того, Ї М-специфічні антигени не могли бути детектовані в ІРМА з використанням /мМ- специфічних Маб. РНК, транскрибована іп міго із рРАВМ296, була використана в цих експериментах в якості контролю. Плазміда рАВМ296 складається з гена ОРС4, кодуючого ОРаи, і вбудованого у експресувальний вектор рЗЕМ1 (Мешепрегд еї аїЇ., 1997). Ефективність трансфекції РНК рАВМ296 тестували шляхом забарвлення трансфекованих клітин у ІРМА із використанням сР.и, - специфічних Мар. Найбільш висока ефективність трансфекції отримана для 0,0195 позитивних клітин С12621, була досягнута шляхом електропорації, тоді як, 80-9095 позитивних клітин одержували з використанням умов, аналогічних тим, які були використані для клітин ВНК-21. Ці результати вказують на те, що клітини СІ 2621 не придатні для експериментів по трансфекції, тоді як клітини ВНК-21 (не сприйнятливі до інфікування вірусом дикого типу) зненацька виявилися дуже відповідними для цієї мети. Тому для тесту на інфекційність РНК ЇМ були використані клітини ВНК-21. 2мкг РНК, виділених із клітин ІМ-інфікованих СІ 2621, трансфекували приблизно в 106 клітин ВНК-21 із використанням ліпофектину відповідно до умов, описаних для ЗЕМ (ійевзігот 8 сагої, 1993). Через двадцять чотири години після трансфекції, клітини забарвлювали І М-специфічними Маб 122.17, спрямованими проти білка М вірусу ГМ. Приблизно 3-10 окремих клітин давали позитивне забарвлення, але інфекційних центрів або бляшок, які, як передбачалося, передаються від клітини до клітини, не спостерігалося.
Трансфекція контрольних РНК, транскрибованих із РАВМ296 з використанням цих умов, призводила до одержання 60-7095 позитивних клітин ВНК-21. Супернатант клітин ВНК-21, трансфекованих внутрішньоклітинною РНК ЇМ і РНК рАВМ296, переносили на клітини СІ 2621. Через 3-4 дня, бляшки спостерігалися в клітинах, які були інкубовані із супернатантом від клітин ВНК-21, трансфекованих внутрішньоклітинною РНК ГУ, але не спостерігалися в клітинах, які були інкубовані з супернатантом від клітин
ВНК-21, трансфекованих РНК рАВМ296. Бляшки були позитивно забарвовані І М-слецифічними таб у ІРМА.
Аналогічні результати були отримані у випадку використання РНК, виділеної з очищених вірионів ІМ. Крім того, кількість позитивно забарвлених штамів клітин зростала в 2-4 рази у тому випадку, коли клітини були трансфековані шляхом електропорації. Ці дані вказують на те, що вірус ІМ не інфікує клітини ВНК-21, оскільки в них, цілком ймовірно, відсутній рецептор для ГМ. Проте, після введення геномної РНК в клітини ВНК-21, продукувалися нові інфекційні вірусні частинки, які виділялися в середовище. | знову, повторне інфікування вже трансфекованих клітин ВНК-21 цими частинками, що є "голими" капсидами або частинками з повною або неповною оболонкою, виявилося неможливим.
Іп міго-синтез інфекційної РНК
Оскільки клітини ВНК-21 є, в принципі, не сприйнятливими до РЕЕБМУ дикого типу, і особливо відповідними для "порятунку" вірусу від внутрішньоклітинної РНК ГМ, на відміну від сприйнятливих клітин СІ 2621, то клітини
ВНК-21 були використані для тесту, проведеного з метою визначення, чи є РНК, транскрибована з кДНК-клонів геномної довжини, інфекційною. Плазміди рАВМ414/416 були лінеаризовані ферментом Руці і транскрибовані іп міго з використанням РНК-полімерази 17. Руці-сайт був локалізований безпосередньо нижче роїу(А)-хвоста, так, що транскрибована РНК містила 2 невірусних нуклеотиди в 3'-кінця (фіг.2). Крім того, транскрипти повинні містити невірусний с у 5'-кінця, який є сайтом ініціації транскрипції РНК-полімерази 17. Приблизно 2,5мкг іп міго-транскрибованої РНК трансфекували в клітини ВНК-21 разом з 2мкг внутрішньоклітинної РНК ІМ, використовуваної в якості позитивного контролю для наступного "порятунку" вірусу в клітинах СІ 2621 і РНК рАВМ296, використовуваної в якості позитивного контролю для трансфекції РНК у клітини ВНК-21, і в якості негативного контролю для наступного "порятунку" вірусу в клітинах СІ 2621. Через 24 години після трансфекції, супернатант клітин збирали, і клітини фіксували і забарвлювали в ІРМА з використанням М- специфічних Маб 122,17. У лунках з клітинами ВНК-21, які були трансфековані внутрішньоклітинною РНК ІМ, спостерігалося лише декілька позитивних клітин, тоді як в лунках з клітинами ВНК-21, які були трансфековані
РНК, транскрибованою з рАвВМ414/416, спостерігалося 800-2700 позитивних клітин. Для того, щоб перевірити, чи виділяється інфекційний вірус із клітин, для інфікування клітин СІ 2621 використовували супернатанти.
Бляшки продукувалися у культурах С1І2621, які були інфіковані супернатантом від клітин ВНК-21, трансфекованих внутрішньоклітинною РНК ІМ і транскриптами рАВУ414/415. Наявність бляшок, забарвлених позитивно в ІРМА з використанням моноклональних антитіл проти білків М, М, РА і ОРЗ, дає підставу припустити, що всі ці білки були експресовані належним чином. В культурах СІ 2621, інкубованих із супернатантом від клітин ВНК-21, трансфекованих РНК, транскрибованою з рАВМ296, ні бляшок, ні забарвлення не спостерігалося. Тому, ці результати ясно свідчать про те, що трансфекція РНК, транскрибованою з повнорозмірних геномних КДНК-клонів рАвВМА14 і рАВМА16, у клітини ВНК-21 призводить до продукування і вивільнення інфекційного ІМ. Більш того, у випадку, коли транскрипти рАВМмА14 і рАВМУ416 трансфековані в клітини ВНК-21 шляхом електропорації, а не з використанням ліпофектину, то спостерігалося 2-4-кратне збільшення клітин, які позитивно забарвлюються І М-специфічними Мар. Титр рекомбінантних вірусів у супернатанті від цих підданих електропорації клітин ВНК-21 складав приблизно 105 ТСІЮво/мл. Криві росту інфекційного вірусу, що реплікуються, порівнювали з кривими росту для Тег Ништпе і М4.2.1:
Характеристики росту "врятованого" вірусу
Попередні експерименти по трансфекції і інфікуванню дозволили припустити, що врятовані рекомбінантні віруси, позначені МАВМ4А14 і МАВМА16, інфікують і зростають однаково добре у свинячих альвеолярних макрофагах, тоді як, на клітинах СІ 2621, вони зростають повільніше, ніж вірус, врятований із клітин ВНК-21, трансфекованих внутрішньоклітинною РНК ІМ. Цю внутрішньоклітинну РНК ЇМ виділяли з клітин СІ 2621, інфікованих І М4.2.1, які були адаптовані для росту на СІ 2621. Для більш ретельного дослідження здатності до росту МАВМА14 і МАВУ416, для клітин СІ 2621 і для свинячих альвеолярних макрофагів були побудовані криві росту, і ці криві порівнювали з кривими росту для ЇМ дикого типу, що був лише пасажований на свинячі альвеолярні макрофаги (ТТН), і з кривими росту для вірусу І М4.2.1, культивованого на клітинах СІ 2621.
Швидкості росту цих двох рекомбинантних вірусів не відрізнялися один від одного, і ці віруси розвивалися однаково добре незалежно від того, чи походять вони безпосередньо від ВНК-21, або вони були, крім того, пасажовані на свинячі альвеолярні макрофаги (фіг.3). Титри (7,1-7,9 ТСІЮво/мл) у свинячих альвеолярних макрофагах досягали пікових значень через 32 години після інфікування, тоді як титри в СІ 2621 зростали повільніше, і не досягали пікових значень навіть через 96 годин після інфікування. ТН-вірус мав такі ж характеристики росту, як і рекомбінанти. На противагу цьому, СІ 2621 адаптований вірус І М4.2.1 зростав на клітинах СІ 2621 швидше, ніж віруси мАВМ414, МмАвВМА16 і ТН (фіг.3). В цілому, ці результати свідчать про те, що характеристики росту рекомбінантних вірусів аналогічні характеристикам росту вірусу ТН. Цього треба було очікувати, оскільки КДНК-послідовність, яка була використана для конструювання інфекційних клонів, була отримана від батьківського "не адаптованого" вірусу ТН.
Введення генетичного маркера в інфекційний клон М
Для демонстрації того, що кКДНК-клон геномної довжини може бути використаний для продукування мутантних вірусів ІМ, унікальні Расі- і м/аІ-сайти були введені безпосередньо нижче гена ОРС7 за допомогою
РСА-спрямованого мутагенезу (фіг4). У тому випадку, коли РНК, транскрибовану з повнорозмірного геномного кКДНК-клону рАВМ437, який містить Рай-сайт, і КДНК-клон рАВМ442, який містить Зма!І-сайт, трансфекували в клітини ВНК-21, і супернатант від цих клітин переносили на свинячі альвеолярні макрофаги і клітини СІ 2621 через 24 години після трансфекції, то продукувався інфекційний вірус. Врятовані віруси
МАВМ437 і «МАВУ442 мали характеристики росту у свинячих альвеолярних макрофагах і в клітинах СІ 2621, аналогічні характеристикам росту батьківського вірусу МАВМА14 (дані не наводяться). Специфічна область приблизно в 0,бт.п.о. (нуклеотиди 14576 - роїу(А)-хвіст) була ампліфікована за допомогою зворотної транскрипції і РОК вірусної РНК, виділеної із супернатанту свинячих альвеолярних макрофагів, інфікованих
МАВМ414 і МАВМ416. Гідроліз ферментом Расі показав, що цей рестрикційний сайт дійсно є присутнім у фрагменті, який походить від МАВМУ437, але відсутній у фрагменті, який походить від МАВМА14. Аналогічним чином була продемонстрована присутність Зу/аІ-сайта в МАВМ442 (дані не наводяться). Таким чином, можна виключити можливість забруднення вірусом дикого типу, що підтверджує ідентичність ХАВМ437 і мАВМУ442.
Обговорення
Сучасна технологія рекомбінантних ДНК дає можливість аналізувати і модифікувати геноми на молекулярному рівні, і, тим самим, більш глибоко вивчити їх організацію і експресію. У випадку РНК-вірусів, для цього потрібно створення кКДНК-клонів геномної довжини, із яких можуть бути синтезовані інфекційні транскрипти. У більшості випадків, попередньою умовою для конструювання інфекційних клонів є ідентифікація послідовностей на кінцях відповідного вірусного геному, що, мабуть, мають вирішальне значення для реплікації вірусної РНК. У попередньому дослідженні було показано, що І М містить роїу (А) -хвіст у 3"-кінця (Мешепбего еї аї., 1993а). У даній роботі була точно визначена послідовність 5'-кінця геному ГМ.
Хоча було описано декілька способів визначення 5'-кінця геномної вірусної РНК або мРНК, проте, більшість із цих способів мають істотні обмеження. У випадку флавівірусів і пестивірусів був використаний спосіб, який заснований на циркуляризації геномної РНК. Проте, цей спосіб вимагає проведення додаткових аналізів для визначення границі між 5'- і 3'-кінцями геному. Метод швидкої 5-ампліфікації кінців КДНК (5 КАСЕ) заснований на додаванні гомополімерного хвоста під дією термінальної дезоксирибонуклеотид-трансферази (Тат) до першого ланцюга кДНК. Проте, ця реакція приєднання хвоста не є досить ефективною, і крім того, цей спосіб вимагає додаткових аналізів, оскільки неможливо зробити висновок про те, чи представляє перший нуклеотид хвоста вірусну послідовність, або він є вже частиною ферментативно доданого хвоста. У даному дослідженні була визначена сама крайня частина 5'-хвоста вірусного геному шляхом лігування олігонуклеотиду, який має конкретно певну послідовність, із продуктом подовження першого ланцюга праймера, і шляхом ампліфікації за допомогою РСЕ. Подовження в 10 нуклеотидів (АТОАТОТОТА) у порівнянні з опублікованою послідовністю було виявлено у декількох незалежних клонах, і тому було зроблене припущення, що вони являють собою найбільш крайні 5'-кінцеві нуклеотиди вірусного геному. Усе це разом дає лідерну послідовність у 221 нуклеотидів, які по своїй довжині аналогічні лідерній послідовності ЕАМ (207 нуклеотидів; деп Вооп еї аї., 1991), БНЕМ (208 нуклеотидів 7епд еї аї., 1995), але є більш довгими, ніж лідерна послідовність ГОМ (155 нуклеотидів; Спеп еї аї.,, 1994). Проте, не існує будь-якої гомології між лідерними послідовностями цих артерівірусів.
Найбільш крайня ділянка 5'-кінця була введена в КкДНК геномної довжини для створення інфекційного клону. Головні проблеми, які виникають при генеруванні інфекційних клонів, зв'язані зі стабільністю вірусних послідовностей при клонуванні в бактерії, а також при генеруванні правильних 5'- і 3-кінців. Хоча початкові спроби складання кКДНК-клону геномної довжини в рОЕМ-47 виявилися невдалими, проте, геномний кДНК- фрагмент із довжиною в 15207 нуклеотидів від ЇМ залишався стабільним у низькокопійній плазміді роК12 і дотепер, поки не вдалося генерувати найбільш довгий інфекційний клон РНК-вірусу з позитивним ланцюгом.
Транскрипти кКДНК-клонів геномної довжини містили 5'-кеп-структуру і додатковий невірусний Со на 5'-кінці і невірусні СО на 3'-кінці, але ці подовження не елімінували їх інфекційності. Декілька проведених досліджень виявили зниження початкової інфекційності РНК, транскрибованих із повнорозмірних кДНК-клонів, що було обумовлено додатковими не автентичними послідовностями або на 54 або на 3'-кінці або неповним утворенням кеп-структури. Транскрипти повнорозмірної кДНК ГУ, у якої були відсутні кеп-структури, були не інфекційними. Оскільки інфекційність транскриптів інфекційних кКДНК-клонів майже завжди тестували в клітинних лініях, які є сприйнятливими до вірусу, ми не могли продемонструвати інфекційність транскриптів від
КДНК-клонів геномної довжини або РНК ГУ, виділеної з клітин СІ 2621 шляхом трансфекції цих РНК у клітини
СІ 2621. Це було обумовлено недостатньою ефективністю трансфекції в клітинах СІ 2621, в результаті чого синтез ланцюга вірусної РНК утруднюється, мабуть, через взаємодію з неповними РНК-фрагментами або капсидними білками в результаті повторного інфікування клітин СІ 2621 дефектними інтерферувальними частинками такими як, "голі" капсиди, які містять тільки фрагменти вірусного геному. Проте, трансфекція транскриптів від повнорозмірних кКДНК-клонів і внутрішньоклітинної РНК ІМ у клітини ВНК-21 призводила до продукування і вивільнення інфекційного вірусу, який може бути "врятований" у клітинах СІ 2621. Повторного інфікування клітин ВНК-21 "голими" капсидами не відбувається, а тому перешкоди для синтезу повнорозмірної вірусної РНК не виникає. Специфічна інфекційність складає приблизно 400-1500 позитивних клітин на одинмкг у іп міго-транскрибованої РНК, тоді як, для одногомкг внутрішньоклітинної РНК ЇМ було отримано 2-5 позитивних клітин. Проте, ці специфічні інфекційності не можуть дорівнюватися, оскільки геномну РНК М представляє дуже невелика фракція внутрішньоклітинної РНК, виділеної з І М-інфікованих клітин СІ 2621. Крім того, кількість геномної РНК, виділеної з вірионів, які були використані для трансфекції, було занадто мало для проведення точної кількісної оцінки.
Крім того, клітини ВНК-21 оцінювали на продукування антигену в ІРМА з використанням І М-специфічних
Мар, що необов'язково корелює з продукуванням інфекційного вірусу. Це очевидно з того факту, що супернатант клітин ВНК-21, трансфекованих 2мкг внутрішньоклітинної РНК ІМ, містив більш високі титри бляшкоутворюючих одиниць оцінених для клітин СІ 2621, ніж супернатант від клітин ВНК-21, трансфекованих 2,5мкг транскрипту повнорозмірних кКДНК-клонів. Хоча раніше, для ряду вірусів було показано, що довжина роїу(А)-хвоста впливає на інфекційність вірусних транскриптів (Ноїу 5 Арошпаїдег, 1993; Загом/, 1989), проте, ми не спостерігали якоїсь різниці в інфекційності між транскриптами від геномних кКДНК-клонів, які містять хвіст із 45 або 109 залишків. Можливо, що хвіст із залишків 45А, в основному, являє собою граничну довжину, нижче якої стабільність відповідних транскриптів змінюється. У цьому клоні була виявлена різниця в амінокислоті 1084 у ОРСТа, яка дає Рго і Ге у співвідношенні 1:11. Ця амінокислота не впливає на інфекційність, оскільки транскрипти повнорозмірних нДНК-клонів, які містять цей кодон Ге або Рго, не виявляють будь-якої різниці у інфекційності клітин ВНК-21.
Інфекційний клон геномної довжини використовували для генерування химерного вірусу, що експресує нуклеокапсидний білок РЕЕ5М штама АТСС МК2332. Крім того, інфекційний клон геномної довжини використовували для генерування химерного вірусу, що експресує нуклеокапсидний білок мишиного вірусу
ГОМ. Химерні віруси можна відрізнити від батьківських вірусів за допомогою використання штам-специфічних
Мар, оскільки вони не забарвлюються моноклональними антитілами, які специфічно реагують із білком М (ОРС7) штаму Тег Ниите РЕКБМУ. Крім того, химерний вірус, у якому білок М вірусу РЕКЗМ замінений на білок
М вірусу ГОМ, не реагує з антитілами свиней-конвалесцентів, які реагують із білююм М РЕКБУ. Оскільки всі
РАА5БМУ-інфіковані свині виробляють антитіла, спрямовані проти білка М РЕКЗУ, то химерні віруси можуть бути використані у майбутньому для розробки нових "живих" вакцин проти РЕКБУ, і крім того, вони можуть бути використані в якості векторної системи, яка специфічно спрямована на свою нову клітину-хазяїна, альвеолярний макрофаг легень. У цьому зв'язку слід зазначити, що початкові спроби забезпечити імунітет з використанням "вбитого" вірусу або рекомбінантних субодиниць, виявилися невдалими. Єдиною ефективною вакциною проти РКК5, що є на сьогоднішній день, є модифікована "жива" вакцина, отримана на основі штаму (Согсуса еї аї;, 1995). Проте, свиней, вакцинованих цим модифікованим "живим" продуктом, неможливо вщрізнити від свиней, інфікованих вірусом дикого типу. Тому, інфекційний клон РЕКЕЗМ був включений у так називану маркерну вакцину за допомогою сайт-направленого мутагенезу геному, так, щоб вакцинованих свиней можна було відрізнити від свиней, заражених вірусом дикого типу, виходячи з різниць у їх сироваткових антитілах.
Інфекційний клон ІМ, описаний у даній заявці, є найбільш довгим інфекційним клоном, який коли-небудь, був отриманий від РНК-вірусу з позитивним ланцюгом і є першим у родині артерівірусів. Генерування цього інфекційного клону з РЕКЗМ відкриває нові можливості для вивчення патогенезу, кола хазяїв (тропизму), а також реплікації і транскрипції цього вірусу., Артерівіруси і коронавіруси мають загальний специфічний механізм транскрипції", називаний також транскрипцією за участю лідерної послідовності в якості затравки, де зазначений механізм передбачає генерування так називаної "гніздової" серії субгеномних РНК, які містять загальну 5'-лідерну послідовність (Зраап еї аї., 1988; Ріадетапп 5 Мдеппід, 1991). Транскрипція за участю лідерної послідовності в якості затравки є складним процесом, що ще цілком не вивчений. Дослідження вірусологів, що спеціалізуються в області коронавірусів, спрямовані на виявлення розглянутого механізму транскрипції за участю лідерної послідовності в якості затравки, обмежені аналізами і сайт-направленим мутагенезом кКДНК дефектних інтфферувальних РНК, оскільки великий розмір геному (28-30 т.п.о.) утруднює конструювання інфекційного клону. Інфекційний клон від РЕК5М може бути використаний в якості системи- моделі для вивчення і виявлення невідомого механізму транскрипції і реплікації артерівірусів і коронавірусів.
Інфекційні клони, які походять від РЕКБУ, можуть бути також використані в якості системи доставки або векторного вакцинного вірусу для чужорідних антигенів, введених у геном-РЕКЗУ, оскільки цей вірус інфікує макрофаги і клітини лінії диференціювання макрофагів у кістковому мозку, а також інші клітини імунної системи, і сприяє розподілу антиген-вміщуючого вірусу по клітинах їх потомства. У конкретному прикладі антигенів, які містять фрагменти білка ОРС7 або білка М Агпегімігизе5 або РЕЕКЗУ, ці антигени будуть (понад) експресуватися на зовнішній поверхні клітинної мембрани інфікованої клітини, і тим самим ще більш підсилювати імунну відповідь. Такий імунологічний бустер-ефект буде продукувати Тривалий (завдяки постійній стимуляції на низькому рівні) імунітет проти патогенів. Можна використовувати вірус в якості антигену-носія при збиранні інформації для епітопів інших патогенних організмів або речовин. Декілька модифікованих вірусів РАК5, які несуть чужорідну епітопну інформацію, можуть бути змішані і введені
Одночасно. Це забезпечує активний імунітет проти декількох різних епітопів одного патогена, або активний імунітет проти декількох різних патогенів. Безпека вакцин на основі модифікованого РЕКЗМ (таких, які не забруднюють навколишнє середовище) може бути забезпечена шляхом видалення інформації, що Стосується тих вірусних білків, які необхідні для продукування інфекційного вірусу з Оболонкою. Цей вірус повинний бути розмножений у клітинній лінії, яка конститутивно експресує цей білок оболонки. Вірус, який реплікується в цій комплементарній клітинній лінії, має цілу оболонку і здатний інфікувати макрофаги у свиней. Після одного циклу реплікації, потомствений вірус, у якого відсутня інформація, що стосується білка оболонки, більше не здатний інфікувати інші клітини у відмінність від вірусу з цілою оболонкою. Інфікування макрофагів у даному організмі все ще можливе за допомогою голого капсиду. Таким чином, ця вакцина буде зберігатися у вакцинованій тварині, і не буде поширюватися на інших тварин.
Напису до малюнків
Фіг.1. Конструювання кКДНК-клону ІМ геномної довжини. Верхня частина (А) ілюструє злиття кКДНК-клонів, які були попередньо секвеновані (Мешепбего еї а!Ї,, 1993а) у рРОСЕМ-47. Зазначено число використовуваних рАВМ-кпонів і рестрикційних сайтів. Чорні блоки представляють ті частини кКДНК-клонів, які були ; злиті в наступній стадії клонування. Світло-сірі блоки, позначені КТ, являють собою кДНК-клони, генеровані за допомогою КТ-РСЕ, а темно-сірий блок являє собою новий кКДНК-клон, генерований за допомогою РСЕ.
Нижня частина (В) ілюструє складання більш великих КДНК-клонів рАВуМ331/369, рАВУЗ384 і рАВМ368 із 5- кінцевим клоном рАВу396б, що містить промотор РНК-полімерази 177, і 3'і-кінцевим клоном рАВМЗ395, який містить роїу(А)-хвіст, у низькокопійному векторі рОоК12. Також зазначені рестрикційні сайта усередині і поза сайту множинного клонування роК12. Далі представлені сайта рестрикції ендонуклеазою: А, Араї; Ар, Арої; У,
Ватні; Ва, Воїї!; Вз, ВерЕЇ; Вс, Всії; Е, ЕсокКіІ; Ес, ЕсокУ; Н, Ніпайі; К, Крпі; М, Маг; Мс, Мсої; 5, заа І; 5р, зреї;
За, Заї!; с, зеаї; Р, Раїі; Рт, Рипії; Х, Хваї; Хи, ХноЇ.
Фіг.2. Кінцеві послідовності клонованої повнорозмірної кДНК Г/М і інфекційної РНК, транскрибованої з цього
КДНК-клону. кКДНК-клони геномної довжини лінеаризувапи ферментом Руці і транскрибували в присутності синтетичного кеп-аналогу т/с(5)ррр(5)с із РНК-полімеразою 77. Отримана РНК повинна містити один додатковий нуклеотид (с) у 5-кінця і два додаткових нуклеотиди (С) у З3' кінця. Стрілки в РНК відповідають 5'- і 3'--кінцевим нуклеотидам, що відповідає автентичній РНК-послідовності І М.
Фіг.3. Криві росту ТН вірусу ЇМ дикого типу і І М4.2.1 і рекомбінантні віруси мАВМ/414 і МАВМА416 в альвеолярних макрофагах свиней (А) і клітинах СІ 2621 (В). Рекомбінантні віруси МАВМ414 і МАВМА16, продуковані в клітинах ВНК-21, були використані або безпосередньо (ВНК), або після розмноження в альвеолярних макрофагах свиней (РАМ). Вірус ТН одержували в альвеолярних макрофагах свиней (РАМ), а
ІГМ4.2.1 одержували в клітинах С12621 (СІ). Клітинні культури інфікували зазначеними вірусами при множинності зараження 0,05 і збирали в зазначені інтервали часу. Титри вірусу (ТСІО5зо/мл) визначали для альвеолярних макрофагів свиней або клітин СІ 2621 шляхом титрування в кінцевій точці.
Фіг.4. Введення унікальних Расі- і ЗмлаІ-сайтів в інфекційний кДНК-клон ІМ. Расі- і млаІ-сайти створювали за допомогою РСК-спрямованого мутагенезу, як докладно описано в главі "Матеріали і методи". кКДНнК- фрагменти, які містять Расі- і Зу/аІ-сайти, були замінені в рАВМА14 із використанням її унікальних Ньагї- і Хьаї!- сайтів, які зазначені. В результаті були отримані рАВМУ437 і рАВМ442 відповідно.
ЛІТЕРАТУРА
Веппеїй, О.А. , Е. Меїзоп, Е. СоїПп5, 9У.Е., Нагті5, Ї, собуаї, 5.М., Кобізоп, О., Спгізнапзоп, МУ.Т., Моїтізоп,
А.В., Согсуса, О.Е., апа Спіадек, ОМУ.. (1992). Спагасіегігайноп ої вм/іпе іпТепійу апа гезрігаюгу зупаготе міги5 (Ізоїаїе АТСС-УН2332) 9. Меї. Оіадп. Іпумезі. 4,127-133.
Воуєг, у., апа Наеєппі, А. (1994) Іптесійив (гапвсгірів апа соМА сіопев ої АМА мігизез. Мігоіоду, 198, 415-426.
Спеп, 7, Раарего, К.5., апа Ріадетапп, Р.С.М/. (1994) Оеєїептіпайоп ої (Ше 5 епа ої (Ше Іасіа(е денуйгодепазе-еЇІємайпд-мігиз депоте Бу їмо іпдерепаєпі арргоаспез. .). Сеп. Міга. 75, 925-930.
СоїІйпе5, 9У.Е., Вепіпєїа, О.А., СПгівйпапбвоп, МУУ.Т., Наїтів, .Ії., Неппіпд5,; 9У.С., Зпам, О.Р., Сюуаї, 5.М.,
МеСиПоцой, 5., Могтізоп, В.В., доо, Н.5., Сбогсуса, О.Е., Спіадек, ОМ. (1992). Ізоїайоп ої 5міпе іп'епійу апа гезрігаюгу зупаготе мігиз (Ізоїаге АТОС-МА-2332) іп Мопп Атеїіса апа ехрегітепіа! гергодисіоп ої (|йе аізеазе іп дпоюбіоїіс рідв. у. ої Меї. Оіадп. Іпмеві. 4, 117-126.
СопеІтапп, К.К., Мі5зег, И., мап М/оепзеї, Р., апа Тієї, Н.Ю. (1993). МоїІесшаг спагасіегігайоп ої рогсіпе гергодисіїме апа гезрігаюгу зупаготе мігив, а тетрбег ої (пе Апегімігив дгоир. Мігоїоду 193, 329-339. деп Вооп, .А., Раарего. К.5., Мешепрбрего, 9.).М., Маззепааїг, А.Г.М., Ріадетапп, Р.С-МУ., Схограіепуа, А.Е., апа -Зпі)дег, Е.). (1995) Ргосевзвіпд апа емоїшіоп ої Ше М-іегтіпаї! гедіоп ої пе апегімігив геріїсазе ОВРІа ргоївіп: ідепійісайоп ої їмо рараїпіїКе сузієїпе ргоїеазезв. 9. Міго!. 69:4500-4505.
Оамів, М.Г., УМІШів, І М.,-Зтій, 9У.Р., апа допп5 п, В.Е. (1989). Іп міго зупіпевзів ої іп'есйіоиз Мепегивєїап едціпе епсерпаїїйіз мігиз АМА ої ап іпзесі мігив. Ргос. МайАсай. 5сі. ОБА 83, 63-66.
Оепо, В., апа Ми, В. (1981). Ап ітргомей ргоседиге юг шйігіпу (ептіпа! (гапеїегазе ю ада потороїутегв Ю
Ше З'їептіпі ої ОМА. Мисієїс Асіаз Нез.9, 4173-4188.
Еймагав, У.8.0.М., Оеєїогі, 9., апа Маїеї, У. (1991) Оіїдодеохупрописієоїіде Іїдайноп ю в5іпдіє-зігапаєд СсОМА»5;
А пем/ 0! юг сіопіпд 5 епаз ої тАМАв апа ог сопігисіїпд СОМА Іргагез ру іп міо атрійісайоп. Мисієїс Асіаз
Вез. 19, 5227-5232.
Согсуса, 0., ЗсПіевіпдег, К., Спіадек, О., єї а!., (1995) Ргос. Ат. Авзос. ог Зм/іпе Ргасі., Опата, МЕ, 1-22.
Ноуу, 5., апа Арошйаїдаг, М.С. (1993). Ргодисіоп ої іп'єсіоиз іп міо ігапесірів їот а шІ-Іепдій сіомег уеПому товзаїс міги5 СОМА сіопе. 17. еп. Мігої., 74, 781-784.
Кіт, Н.5., Кмлапо, 9., апа Мооп, І.У. (1993). Епнапсед, геріїсайоп ої рогсіпе гергодисіїме апа гезрігаюгу зупаготе мігив іп а пПотодепеосив зирроршайоп ої МА-104 сеї Іїпе. Агсп. Міго. 133, 477-483.
Кіштр, М.М., Вегдтапп, І., МиПег, В.С., Атеїів, О., апа Капаоїї, В. (1990) Сотрієїе писієоїде зедиепсе ої іп'есіоиз сохзаєкКіє-мігиз ВЗ СОМА: Тмо іпійа! 5'игідіпе гезідоез аге гедаїпей аигіпоу ріиз-віїгапа АМА зупінезвів. у.
Мігої. 64, 1573-1583.
Іаї, С.9., 2пао, В., Нотгі, Н., апа Вгау, М. (1991) Іптесіои5 КМА ігапзсіреа їот 5іаріу сіопей їшІ-І(епа(й СсОМА ої депдиє їуре 4 мігив. Ргос. Маї). Асай. 5со-і. ОБА 88, 5139-5143.
Ціевзігот, Р. апа Сагоїї, Н. (1991). А пем/ депегайоп ої апітаї! сеї! ехргезвіоп месіог5 разей оп Ше Зетіїкі
Еогеві мігив геріїсоп. Віоїтесппої. 9, 1356-1361.
Ціезігот, Р., апа Сагоїї, Н. (1993) Ехргезвіоп ої ргоїєїп5 ивіпд Зетіїкі Рогеві мігив месіогв, р.16.хх.І-16.хх.00
Іп: Ситепі ргоїосої5 іп МоіІесшіаг Віоіоду, Е.М. А!йзибеї, А. Вгепі, А.Е. Кіпозіоп, Ю.О. Мооге, 9У.А. тій, 9.а.
Зеіїдтап апа К. 5ігпипі (Еав.). Стеєпе Рибіїзпіпд аззосіасез апа УмМієу іпіегзсіеєпсе, Мем Могк.
Мешепрбего, 9.9У.М., Ниївзі, М.М., де Меїег, Е.9У., Моопеп, Р.І..9.М., деп Везіеп, А., де Кіпсумег, Е.Р., УМепвмоотпі, а., апа Мооптапп, В.).М. (1993а). І еіувіай міпив, Ше сайзаїйме адепі ої рогсіпе ерідетіс аропіоп апа гезрігайгу зупаготе (РЕАВЗФ) із геіаїейд ю ГОМ апа ЕАМ. Мігоіоду 192, 62, 74.
Мешепрбего, .).М., де Меї|ег, Е.)., апа Моогтапп, В.У.М. (19935). Зирдепотіс АМАЗз ої І еіузіай мігив сопіаїп а сопзегмей іппсе(оп зедиепсе. «.). ої сеп. Міго. 74, 1697-1701.
Мешепрбрега, 9.9У.М., Реїєгзеп-деп Вевіеп, А., де Кіпумег, Е.Р., Моогптапп, К.У.М., Уумепзмооп, с (1995).
Спагасієгігайоп ої ргоїєїп5 епсодей Бу ОВЕ: 2 Юю 7 ої І віузіай мігив. Мігоїоду 206, 155-163.
Мешепрбрего, 9.9У.М., апа Реїегзеп-деп Вевзіеп (1996) Ідепійісайоп апа сНагасіегігайоп ої а віхій взіпсшгаї! ргоївїп ої І віувіай мігив: Тне діусоргоївєїп СР; епсодей Бу ОНР із іпсогрогаїеа іп мігив5 рапісіев. Мігоіоду, іп ргезв.
Мешепрбего еї а!., 1997
Мигпацои, М.Р., ЕіІат, М.В., апа Какасі (1995) Сотрагізоп ої пе вігисішга! ргоїєїп содіпд зедоепсев ої Ше
МУВ-2332 апа І віувіай мігив вігаіпо ої їе РАВНФ5 мігив. Агеп. Мігої., 140, 1451-1460.
Меївоп, Е.А., Спгівіорпег-Неппіпд5, у., Огему, Т., Мепзмоогі, б., СоїІп5, У.Е., апа Вепібеїй, О.А. (1993).
ОінНегепійацйоп ої Опіеай 5іаїез апа Еигореап ізоїас(ез ої рогсіпе гергодисіїме апа гезрігаюгу зупаготе міг ру топосіопаї апіїродієв. 9. ої Сіїп. Місгто9уріо. 31, 3184-3189.
Ріадетапп, Р.С.МУу., апа Моеппід, М. (1991). І асіаге депудгодепазе-єїЇІемаїйпд міги5, едиїпе апепіїв мігив5, апа вітіап петогптадіс Гемег мігив: а пежм дгоир ої розійме-5ігапа АМА мігизевз. Адм. іп Мігив5. Нев. 41, 99-192.
Кісе, С.М., Гемів, В., бігаийвв5., уУ.Н., апа Ниапо, Н.М. (1987). Ргодисіюп ої іп'есіцов5 АМА ігапвгегірів їот
Зіпаріз мігив СОМА сіопев: тарріпд ої Ієїпа! тиайопв5, гезсцєе ої а Іетрегайшге-вепв5ййме тагкег, апа іг-міго тиадепевів (о депегасе деїйпейа тшапів. 17. Міго!., 61, 3809-3819.
Затогоок, )., Епівси, Е.Р., апа Мапіаїїв, Т. (1989). МоіІесшаг Сіопіпд, А ІГарогаїгу Мапиа!. Соїй Зрііпод
Нартог Габр., Соїа Зріїпд Нагбог МУ.
Затому, Р. (1989) Воїеє ої З'єпа зедиепсез іп іпгесіїмну ої роїїо-мігив (гапвсгпіріє таде іп міїго. «У. Мігої., 63. 467-470.
Зпі)дег, Е.У., апа Ноггіпек, М.С. (1993). Тогомігизез: геріїсайоп, емоїшіоп апа сотрагізоп мій ощтег тетбрегв5 ог Ше согопамігив-ЇїКе зирепатіу. у. Сеп. Міго!., 74, 2305-2316.
Зраап, М/.).М., Самапасдн, О., апа Ноггіпек, М.С. (1988) Согопамігизев: бБігисішге апа депоте ехргезвіоп. .).
Сееп. Мігоїі. 69, 2939-2952.
Зитіуовпі, Н., Ноке, С.Н., апа Ттепі, О.М. (1992). Іп'єсйоиз дарапезе епсернаїйіз міпиз АМА сап ре зупіпевігей їот іп міїго-їїдагеа соМА (етріагезв. у". Мігої., 66, 5425-5431. мап Мієшувіаді, А.Р., Мешепрего, 9.).М., мап Евзеп-гапарегдеп, А., Ресегзеп-деп Везієеп, А., Вепає, К..,,
Моогптапп, В.У.М., апа М/епвмооїї, С. (1996). Ргоїєїп5 епсодей Бу ОАЕ: З апа 4 ої Пе депоте ої І еіузіай мігив (Апегімігідає) аге вігписшга! ргоїеїп5 ої Пе мігіоп. 17. Мігої., 70, 4767-4772.
Мієга, 9., апа Мезвіпо, 9. (1991) Меж риОС-депмуеа сіопіпд месіог5 м/п аїйегепі зеІесіаріє тапегз апа ОМА геріїсайоп огідіп5. Сепе, 100, 189-194.
Умепзмоогі, о., де Кісумег, Е.Р., І ційге, Е.А., ае Вевхієп, А., Нагтів, І, СоїІпв5, 9У.Е., Спгізбйапбзоп, М/.Т., апа
Спіадек, 0. (1992) Апіідепіс сотрагізоп ої І віувісай мігив5 апа зм/пе іпгепіїйу апв гезрігаюгу (5ІНБ) мігпив. У. Меї
Оіадп. Іпмезі. 4, 134-138.
Муепвмсогі, С., Тегрзіга, С, Воопзіга, у)., Віоетгаайд, М., апа Мап 7аапе, 0. (1986) Ргодисійоп ої топосіопаї! апіїродієз адаїпві зм/іпе Гемег мігив апа (Пеїг изе іп Іарогаїогу діадпозів. Меї. Місгобіо!. 12, 101-108.
УМепзмоопі, б., Тегрб5іга, С, Рої, У.М.А., Тег І аак., Е.А., Віоетгаай, М., ае Кіпумег, Е.Р., Кгадієп, С, мап
Вийеп, Г., аДеп Ве:іеп, А., УМадепааг, Р., Вгоекпиі)5еп, У.М., Моопеп, Р.Г.9У.М., 2еївіга, Т., ае Воег, Е.А., тірреп,
Н.у., де допо, М.Р., мап 7 Мей, Р., Сгеєпіапа, с5.9).А., мап Сеппер, 9.А., Моєїв, М.ТИ., Мегпеїдеп, У.Н.М., апа
ВгаатеКатр, 9. (1991). Музіегу зм/Іпе аізеазе іп Ше МешШепапазвз: (Шїе ізоїайоп ої І еізузіай міги5. Меї. Омаїї. 13, 121-130. 7епдуд, Ї, Содепу, Е.К., Меїймеп, 5.1, апа Вііпіоп, М.А (1995) Апаїувів ої вітіап петоггпадіс Темег мігив (ЗНЕМ) зирдепотіс АМАв, |ппсіоп зедиєпсез апа 5" Ісадег. Мігоїюду 207, 543-548.
Таблиця 1
Нуклеотидна послідовність 5'-кінцевих клонів ЇМ
Послідовність 1)
АТСАТОТОТАССО......
ТОАТСТОТАСОО.....
САТОТОТАССОО.....
АТОТОТАСОО..... 1) Підкреслені нуклеотиди являють собою додаткові послщовності, що не були виявлені в КДНК-клонах, і не були виділені і секвенвані раніше (Мешепбего еї а1., 1993а). дме й зо | мамам) і І Ї пс: гЗввввавюснї Н ве, нини а З І : : | Стоомаввоввсввте ги : ! ! зм В : ше и : - у ККЗ ко « ка Є знаний ще ї за т имя 1 ди синя зі шу і МЕТА ть КУ У ій ні кій ніні ііі кріпленні інфекдійніюлни Яіяія дв змен
Фіг не ик . сх Ідцінчіє пронехриной ТУ Й ке ї сс ветч я ЕЕКІВ КЕ ОКІ ТЕК Є пеня яння ННЯ ХХХ Всіх Ікотстколесвмогчи з й І | тванскритцв т Шо що пк п нн
Інфекційні клюви леитидського ЗЩуСу І аМмЕво А х
ЯК ЯМІ, я ла. Й пон
А РАМ бр ! і і -
Ще Куй ще КП, нн, і кі р м нн !
В А. Ше я '
В щ і
ЕЕ Ж і « ря 2: ' ш пі: НК УХ ше ях, жна і ої рю
Ті реж сеавужанк
Н й в се С 1 і іа і
Я Година після інфікування КЛИНКИ п дп дня тент ртіткдя у рініцеті утво інт тітвсттіндат печін дет, з жом ох Я в 8бюо в Клітина СТБ нин ті - ш- Повним
Н рана ПИТ ж шк і
Н в одйлсн шт ї и о ЕЙ : - й Як ятати Птн з 7 Жити в 7 рт г. поши : -6 р
Ж ще 7 Шо теку і тні 1 ї хх евВМаЛАТаНКХ ! пнлляннн вика вднеХ. 1 і плей АВК АХУ ! Години після інфікування те жвенНемх
Й є в «о ЕІ во пе моло й ВинзхіднУМа
ФІГ
Нрії раї и 1 . шк Расубнай
Е
1 . шо й Еш е панк нн ЕТ нею 853 й ОС утя рАВУ4З7ІрАВУааЇ ! . Ті ететтноннкя В ТОВ сн
Claims (14)
1. Спосіб генерування інфекційного клону на основі геному РНК-вірусу з позитивним ланцюгом родини АпПегіміпдає, який включає продукування рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що включає принаймні одну повнорозмірну ДНК-копію, або іп міго-транскрибовану РНК-копію вказаного РНК-вірусу з позитивним ланцюгом родини Апегпмігідає і, крім того, включає відбір інфекційних клонів шляхом трансфекції клітини-хазяїна вказаною рекомбінантною нуклеїновою кислотою, в результаті чого вказана клітина-хазяїн є, по суті, не сприйнятливою до інфікування зазначеним вірусом.
2. Спосіб згідно з п. 1, де зазначеною клітиною-хазяїном є клітина ВНК-21.
3. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка включає інфекційний клон, отриманий способом згідно з п. 1 або 2.
4. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти згідно з п. 3, де вказаним вірусом є РАВ5БУ.
5. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти згідно з п. З або 4, де послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує маркер вірулентності та/або серологічний маркер, є модифікованою.
6. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти згідно з п. 5, де послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує зазначений маркер, розташована усередині будь-якої із відкритих рамок зчитування, кодуючих структурні вірусні білки.
7. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти згідно з п.б, де одна з відкритих рамок зчитування являє собою ОРС7 будь-якого вірусу з Апегімігідає.
8. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти згідно з п. 6 або 7, де одна з відкритих рамок зчитування замінена на ОРС7 вірусу Апегімігідає.
9. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти згідно з будь-яким із пп. 3-8, в яку вставлена принаймні одна додаткова гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти.
10. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти згідно з п. 9, де вказана гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти кодує антиген.
11. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти згідно з будь-яким із пп. 3-10, де відкрита рамка зчитування є модифікованою .
12. Модифікований РНК-вірус, що включає рекомбінантну нуклеїнову кислоту згідно з будь-яким із пп. 3-11.
13. Вакцина, що включає модифікований РНК-вірус згідно з п. 12.
14. Клітина, інфікована модифікованим РНК-вірусом згідно з п. 13.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96203024A EP0839912A1 (en) | 1996-10-30 | 1996-10-30 | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| PCT/NL1997/000593 WO1998018933A1 (en) | 1996-10-30 | 1997-10-29 | Infectious clones of rna viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA72433C2 true UA72433C2 (en) | 2005-03-15 |
Family
ID=8224533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA99052951A UA72433C2 (en) | 1996-10-30 | 1997-10-29 | Infectious clones of rna-viruses and vaccines, and also diagnostic analyses developed on their base |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6268199B1 (uk) |
| EP (2) | EP0839912A1 (uk) |
| JP (1) | JP3921552B2 (uk) |
| KR (1) | KR100437254B1 (uk) |
| CN (1) | CN1138859C (uk) |
| AT (1) | ATE366314T1 (uk) |
| AU (1) | AU719991B2 (uk) |
| BR (1) | BR9712592A (uk) |
| CA (1) | CA2272046C (uk) |
| CZ (1) | CZ294781B6 (uk) |
| DE (1) | DE69737886T2 (uk) |
| DK (1) | DK0935660T3 (uk) |
| ES (1) | ES2290973T3 (uk) |
| HU (1) | HUP9903829A3 (uk) |
| ID (1) | ID22208A (uk) |
| MY (1) | MY117686A (uk) |
| PL (1) | PL191258B1 (uk) |
| PT (1) | PT935660E (uk) |
| SI (1) | SI0935660T1 (uk) |
| SK (1) | SK286231B6 (uk) |
| UA (1) | UA72433C2 (uk) |
| WO (1) | WO1998018933A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA979732B (uk) |
Families Citing this family (79)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0839912A1 (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| US20040224327A1 (en) * | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| EP0974660A1 (en) * | 1998-06-19 | 2000-01-26 | Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) | Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic assays |
| US7132106B2 (en) * | 1998-12-22 | 2006-11-07 | Pfizer Inc. | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| NZ513289A (en) * | 1998-12-22 | 2003-04-29 | Pfizer Prod Inc | Infectious cDNA clone of north american procine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| US7618797B2 (en) | 1998-12-22 | 2009-11-17 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| US7691389B2 (en) | 1998-12-22 | 2010-04-06 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| JP3961222B2 (ja) | 1999-03-08 | 2007-08-22 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハー | Ｐｒｒｓｖワクチン |
| DK2251419T3 (da) | 1999-04-22 | 2012-07-02 | Us Agriculture | Porcint reproduktions- og respirations-syndrom-vaccine baseret på isolat JA-142 |
| CA2396454A1 (en) * | 2000-01-26 | 2001-08-02 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Recombinant attenuation of prrsv |
| EP1156111A1 (en) * | 2000-05-19 | 2001-11-21 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Chimeric arterivirus-like particles |
| DK1857122T3 (da) | 2001-06-05 | 2011-03-21 | Curevac Gmbh | Stabiliseret mRNA med forøget G/C-indhold, kodende for et viralt antigen |
| DE10162480A1 (de) | 2001-12-19 | 2003-08-07 | Ingmar Hoerr | Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen |
| US6841364B2 (en) | 2002-01-22 | 2005-01-11 | Protatek International, Inc. | Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof |
| DE10229872A1 (de) | 2002-07-03 | 2004-01-29 | Curevac Gmbh | Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA |
| DE10347710B4 (de) | 2003-10-14 | 2006-03-30 | Johannes-Gutenberg-Universität Mainz | Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung |
| BRPI0510928A (pt) | 2004-06-18 | 2007-11-13 | Univ Minnesota | identificação de organismos viralmente infectados e vacinados |
| KR100872840B1 (ko) | 2004-07-09 | 2008-12-22 | (주)씨아이디 | 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 전체-길이의감염성이 있는 cDNA 클론 및 이의 용도 |
| US20060020227A1 (en) * | 2004-07-20 | 2006-01-26 | Moore Thomas E | Collection means and a method for collecting cord blood |
| US7632636B2 (en) | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
| ES2343201T3 (es) | 2005-01-13 | 2010-07-26 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vacunas contra el srrp. |
| EP1856141A1 (en) * | 2005-02-25 | 2007-11-21 | Pfizer Products Inc. | N protein mutants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus |
| ES2386973T3 (es) | 2005-06-24 | 2012-09-10 | Regents Of The University Of Minnesota | Virus PRRS, clones infecciosos, mutantes de los mismos, y métodos de utilización |
| CN101300363A (zh) * | 2005-08-30 | 2008-11-05 | 内布拉斯加大学董事会 | 用于用具有改善的免疫原性的prrsv抗原免疫接种动物的方法和组合物 |
| DE102005046490A1 (de) | 2005-09-28 | 2007-03-29 | Johannes-Gutenberg-Universität Mainz | Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen |
| EP2046954A2 (en) | 2006-07-31 | 2009-04-15 | Curevac GmbH | NUCLEIC ACID OF FORMULA (I): GIXmGn, OR (II): CIXmCn, IN PARTICULAR AS AN IMMUNE-STIMULATING AGENT/ADJUVANT |
| WO2008153572A1 (en) * | 2007-06-15 | 2008-12-18 | Protatek International, Inc. | Construction of chimera prrsv, compositions and vaccine preparations |
| US7666585B2 (en) | 2007-06-15 | 2010-02-23 | Protatek International, Inc. | Construction of chimera PRRSV, compositions and vaccine preparations |
| JP2010531143A (ja) * | 2007-06-25 | 2010-09-24 | サウス ダコタ ステート ユニバーシティー | 組換え北アメリカ１型ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス及び使用方法 |
| WO2009030254A1 (en) | 2007-09-04 | 2009-03-12 | Curevac Gmbh | Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation |
| WO2009095226A2 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-06 | Curevac Gmbh | Nucleic acids of formula (i) (nuglxmgnnv)a and derivatives thereof as an immunostimulating agent/adjuvant |
| MX2011002046A (es) * | 2008-08-25 | 2011-04-21 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Vacuna contra sindrome disgenesico y respiratorio porcino altamente patogeno (hp prrs). |
| WO2010037408A1 (en) | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Curevac Gmbh | Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof |
| AR078253A1 (es) | 2009-09-02 | 2011-10-26 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad |
| US20110053829A1 (en) | 2009-09-03 | 2011-03-03 | Curevac Gmbh | Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids |
| US8968746B2 (en) | 2010-07-30 | 2015-03-03 | Curevac Gmbh | Complexation of nucleic acids with disulfide-crosslinked cationic components for transfection and immunostimulation |
| EP2600901B1 (en) | 2010-08-06 | 2019-03-27 | ModernaTX, Inc. | A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof |
| HRP20220796T1 (hr) | 2010-10-01 | 2022-10-14 | ModernaTX, Inc. | Ribonukleinske kiseline koje sadrže n1-metil-pseudouracil i njihove uporabe |
| UA108902C2 (uk) | 2010-11-10 | 2015-06-25 | Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування | |
| UA112860C2 (uk) | 2011-02-17 | 2016-11-10 | Бьорінгер Інгельхайм Ветмедіка Гмбх | Спосіб одержання prrsv у комерційному масштабі |
| MY161198A (en) | 2011-02-17 | 2017-04-14 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Novel european prrsv strain |
| CA2831613A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Moderna Therapeutics, Inc. | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
| DK2714071T3 (da) | 2011-05-24 | 2019-09-16 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Individualiserede vacciner mod cancer |
| EP2737058A1 (en) | 2011-07-29 | 2014-06-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | INFECTIOUS cDNA CLONE OF EUROPEAN PRRS VIRUS AND USES THEREOF |
| US9187731B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-11-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells |
| US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| EP3492109B1 (en) | 2011-10-03 | 2020-03-04 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
| RS63244B1 (sr) | 2011-12-16 | 2022-06-30 | Modernatx Inc | Kompozicije modifikovane mrna |
| WO2013113326A1 (en) | 2012-01-31 | 2013-08-08 | Curevac Gmbh | Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen |
| WO2013143555A1 (en) | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Biontech Ag | Rna formulation for immunotherapy |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
| WO2013151664A1 (en) | 2012-04-02 | 2013-10-10 | modeRNA Therapeutics | Modified polynucleotides for the production of proteins |
| US9303079B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-04-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
| US9120859B2 (en) | 2012-04-04 | 2015-09-01 | Zoetis Services Llc | Mycoplasma hyopneumoniae vaccine |
| UA114503C2 (uk) | 2012-04-04 | 2017-06-26 | Зоетіс Сервісіз Ллс | Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae |
| UA114504C2 (uk) | 2012-04-04 | 2017-06-26 | Зоетіс Сервісіз Ллс | Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs |
| WO2013173443A1 (en) | 2012-05-17 | 2013-11-21 | Zoetis Llc | Effective vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) virus prior to weaning |
| PL2922554T3 (pl) | 2012-11-26 | 2022-06-20 | Modernatx, Inc. | Na zmodyfikowany na końcach |
| AU2013351542B2 (en) | 2012-11-28 | 2018-08-09 | BioNTech SE | Individualized vaccines for cancer |
| WO2014150822A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use |
| US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
| WO2014180490A1 (en) | 2013-05-10 | 2014-11-13 | Biontech Ag | Predicting immunogenicity of t cell epitopes |
| KR20160044566A (ko) | 2013-08-21 | 2016-04-25 | 큐어백 아게 | 호흡기 세포융합 바이러스 |
| EP3052106A4 (en) | 2013-09-30 | 2017-07-19 | ModernaTX, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
| SG11201602503TA (en) | 2013-10-03 | 2016-04-28 | Moderna Therapeutics Inc | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
| CA2925021A1 (en) | 2013-11-01 | 2015-05-07 | Curevac Ag | Modified rna with decreased immunostimulatory properties |
| CA2930042C (en) | 2013-12-20 | 2022-06-21 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prrs virus variant, european prrs virus cdna clone, and uses thereof |
| EP3129050A2 (en) | 2014-04-01 | 2017-02-15 | CureVac AG | Polymeric carrier cargo complex for use as an immunostimulating agent or as an adjuvant |
| JP6398454B2 (ja) * | 2014-08-13 | 2018-10-03 | セイコーエプソン株式会社 | 圧電駆動装置、ロボット、及び、それらの駆動方法 |
| WO2016045732A1 (en) | 2014-09-25 | 2016-03-31 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Stable formulations of lipids and liposomes |
| WO2016128060A1 (en) | 2015-02-12 | 2016-08-18 | Biontech Ag | Predicting t cell epitopes useful for vaccination |
| US9920302B2 (en) | 2015-08-31 | 2018-03-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Pestivirus vaccines for congenital tremors |
| WO2017059902A1 (en) | 2015-10-07 | 2017-04-13 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | 3' utr sequences for stabilization of rna |
| WO2017106079A1 (en) | 2015-12-14 | 2017-06-22 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Hybrid core feline vaccines |
| CA3032891A1 (en) | 2016-08-05 | 2018-02-08 | Hipra Scientific, S.L.U. | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus cdna clone and uses thereof |
| KR102602018B1 (ko) | 2016-12-14 | 2023-11-15 | 조에티스 서비시즈 엘엘씨 | 젖떼기 전, 유럽의 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (prrs) 균주 바이러스에 대한 효과적인 백신접종 |
| BR112020013426A2 (pt) * | 2018-02-28 | 2020-12-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | métodos para identificação de um vírus em uma amostra e para detecção de ácidos nucleicos virais em uma amostra de cultura de células |
| CN116716322B (zh) * | 2023-05-12 | 2024-05-31 | 中山大学 | 一种denv-3全长感染性克隆及其构建方法与应用 |
Family Cites Families (98)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3137631A (en) * | 1959-12-01 | 1964-06-16 | Faberge Inc | Encapsulation in natural products |
| US3359457A (en) * | 1963-10-14 | 1967-12-19 | Triplett Electrical Instr Co | Device for overload protection of electrical equipment |
| US3959457A (en) * | 1970-06-05 | 1976-05-25 | Temple University | Microparticulate material and method of making such material |
| US4015100A (en) * | 1974-01-07 | 1977-03-29 | Avco Everett Research Laboratory, Inc. | Surface modification |
| US4122167A (en) * | 1977-02-09 | 1978-10-24 | Merck & Co., Inc. | Respiratory synctial vaccine |
| US4205060A (en) * | 1978-12-20 | 1980-05-27 | Pennwalt Corporation | Microcapsules containing medicament-polymer salt having a water-insoluble polymer sheath, their production and their use |
| US4224412A (en) * | 1979-05-01 | 1980-09-23 | Dorofeev Viktor M | Living virus culture vaccine against canine distemper and method of preparing same |
| DD145705A1 (de) | 1979-08-31 | 1981-01-07 | Peter Solisch | Herstellungsverfahren von organspezifischen retrovirusimmunpraeparaten fuer prophylaxe,therapie und diagnostik |
| US4554159A (en) * | 1981-11-12 | 1985-11-19 | Institute Merieux | Vaccine and method of immunizing against herpes simplex virus (types 1 and 2) |
| US4452747A (en) * | 1982-03-22 | 1984-06-05 | Klaus Gersonde | Method of and arrangement for producing lipid vesicles |
| US4468346A (en) * | 1983-10-27 | 1984-08-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Monoclonal antibodies to porcine immunoglobulins |
| DE3405100A1 (de) * | 1984-02-14 | 1985-08-14 | Drägerwerk AG, 2400 Lübeck | Pt-katalysator auf einem traeger als luftreinigungsmittel |
| US4744933A (en) * | 1984-02-15 | 1988-05-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Process for encapsulation and encapsulated active material system |
| US5008050A (en) * | 1984-06-20 | 1991-04-16 | The Liposome Company, Inc. | Extrusion technique for producing unilamellar vesicles |
| US4921706A (en) * | 1984-11-20 | 1990-05-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Unilamellar lipid vesicles and method for their formation |
| US4606940A (en) * | 1984-12-21 | 1986-08-19 | The Ohio State University Research Foundation | Small particle formation and encapsulation |
| US5206163A (en) * | 1985-07-08 | 1993-04-27 | Chiron Corporation | DNA encoding bovine diarrhea virus protein |
| US4753884A (en) * | 1986-01-28 | 1988-06-28 | Novagene, Inc. | Pseudorabies virus mutants, vaccines containing same, methods for the production of same and methods for the use of same |
| FR2602791B1 (fr) * | 1986-08-18 | 1988-11-10 | Ministere Agri Direction Quali | Procede de culture du virus de la rhinotracheite infectieuse de la dinde, et vaccin prepare a partir du virus ainsi obtenu |
| NZ222465A (en) | 1986-11-07 | 1992-11-25 | Pasteur Institut | Nanb (non a, non b hepatitis viral) antigen |
| US5009956A (en) * | 1987-02-24 | 1991-04-23 | Univ Minnesota | Phospholipase A2-resistant liposomes |
| DE3833925A1 (de) | 1988-03-11 | 1989-09-21 | Inst Angewandte Biotechnologie | Verfahren und herstellung von virus und viralem antigen und vorrichtung hierzu |
| US5213759A (en) * | 1988-05-05 | 1993-05-25 | Elopak Systems A.G. | Sterilization |
| US4927637A (en) * | 1989-01-17 | 1990-05-22 | Liposome Technology, Inc. | Liposome extrusion method |
| US4944948A (en) * | 1989-02-24 | 1990-07-31 | Liposome Technology, Inc. | EGF/Liposome gel composition and method |
| US5132117A (en) * | 1990-01-11 | 1992-07-21 | Temple University | Aqueous core microcapsules and method for their preparation |
| AU7007491A (en) * | 1990-02-02 | 1991-08-08 | Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern | Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses |
| CA2290906C (en) * | 1991-06-06 | 2003-04-01 | Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut | Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits |
| US6080570A (en) * | 1991-08-26 | 2000-06-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Method of producing a vaccine for Swine Infertility and Respiratory Syndrome |
| US6042830A (en) * | 1992-08-05 | 2000-03-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Viral agent associated with mystery swine disease |
| US5846805A (en) * | 1991-08-26 | 1998-12-08 | Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. | Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells |
| MX9204885A (es) * | 1991-08-26 | 1994-05-31 | Boehringer Animal Health Inc | Composicion de vacuna que comprende virus del sindrome de infertilidad y respiratorio de los cerdos. |
| DE69214657T4 (de) | 1991-08-26 | 2003-07-17 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas) |
| US6982160B2 (en) * | 1991-08-26 | 2006-01-03 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunogenic compositions that include SIRS virus |
| WO1993006211A1 (en) | 1991-09-16 | 1993-04-01 | Collins James E | Vaccine for mystery swine disease and method for diagnosis thereof |
| CA2121241C (en) | 1991-10-14 | 2007-12-04 | Nicolaas Visser | Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic |
| FR2686097B1 (fr) * | 1992-01-14 | 1994-12-30 | Rhone Merieux | Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie. |
| US5338543A (en) * | 1992-02-27 | 1994-08-16 | Ambico, Inc. | Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine |
| TW289731B (uk) * | 1992-07-09 | 1996-11-01 | Akzo Nv | |
| US6592873B1 (en) * | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
| US5695766A (en) | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
| US6251397B1 (en) * | 1992-10-30 | 2001-06-26 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same |
| US6773908B1 (en) * | 1992-10-30 | 2004-08-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US6380376B1 (en) * | 1992-10-30 | 2002-04-30 | Iowa State University Research Foundation | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
| US5419907A (en) * | 1992-11-10 | 1995-05-30 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Pathogenic porcine respiratory coronavirus |
| AU681874B2 (en) * | 1993-02-08 | 1997-09-11 | Bayer Corporation | Process for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus and its use in vaccines |
| ES2074950B1 (es) | 1993-09-17 | 1996-03-16 | Iberica Cyanamid | Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda. |
| EP0659885A1 (en) * | 1993-12-21 | 1995-06-28 | Akzo Nobel N.V. | Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity |
| DE4407489A1 (de) * | 1994-03-07 | 1995-09-14 | Bayer Ag | Vakzine zur Prävention von Respirations- und Reproduktionserkrankungen des Schweines |
| ATE206455T1 (de) * | 1994-04-11 | 2001-10-15 | Akzo Nobel Nv | Europäische vakzinstämme des fortplanzungs- atmungs-syndromsvirus des schweins |
| DE69530227T2 (de) | 1994-04-15 | 2004-04-01 | Temple University | Methode zum einkapseln mittels eines wässrigen lösungsmittels und mikrokapseln |
| DK53595A (da) * | 1994-05-13 | 1995-11-14 | Iberica Cyanamid | Rekombinante PRRSV-proteiner, diagnostiske kits og vaccine indeholdende sådanne rekombinante PRRSV-proteiner |
| PT783321E (pt) * | 1994-08-05 | 2006-08-31 | Univ Minnesota | Sequencia nucleotidica viral vr-2332 e metodos de utilizacao |
| DE69632658T2 (de) * | 1995-03-14 | 2005-06-09 | Akzo Nobel N.V. | Expression in der selben Zelle von Polypeptide vom schweinen reproduktiven und respiratorischen Syndrom |
| US5690940A (en) * | 1995-06-21 | 1997-11-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Low pathogencity PRRS live virus vaccines and methods of preparation thereof |
| ES2102971B1 (es) | 1996-01-25 | 1998-03-01 | Hipra Lab Sa | Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion. |
| CZ273798A3 (cs) | 1996-03-01 | 1999-02-17 | Schering Corporation | Vakcína a způsob ochrany proti reprodukčnímu a respiračnímu syndromu vepřů |
| US5866401A (en) * | 1996-03-01 | 1999-02-02 | Schering Corporation | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine |
| US6015663A (en) * | 1996-03-01 | 2000-01-18 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Restriction enzyme screen for differentiating porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains |
| US5976537A (en) * | 1996-07-02 | 1999-11-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine |
| DE69704011T2 (de) | 1996-10-09 | 2001-06-07 | Akzo Nobel Nv | Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Sweins (PRRSV) |
| US20040224327A1 (en) * | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| EP0839912A1 (en) | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| WO1998035023A1 (en) | 1997-02-07 | 1998-08-13 | Origen, Inc. | Method for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus for use as vaccines and diagnostic assays |
| PT980387E (pt) * | 1997-05-06 | 2007-07-31 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Sítios antigénicos de prrsv que identificam sequências peptídicas do vírus prrsv para utilização em vacinas ou em ensaios de diagnóstico |
| US6140486A (en) | 1997-06-04 | 2000-10-31 | Calgene Llc | Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants |
| WO1998055626A2 (en) | 1997-06-05 | 1998-12-10 | Origen, Inc. | Recombinant porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) for use as a vaccine |
| US6391314B1 (en) * | 1997-10-03 | 2002-05-21 | Merial | Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents |
| US7211379B2 (en) * | 1997-10-03 | 2007-05-01 | Merial Sas | Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2 |
| US7691389B2 (en) * | 1998-12-22 | 2010-04-06 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| US7132106B2 (en) * | 1998-12-22 | 2006-11-07 | Pfizer Inc. | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| US7618797B2 (en) * | 1998-12-22 | 2009-11-17 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| NZ513289A (en) | 1998-12-22 | 2003-04-29 | Pfizer Prod Inc | Infectious cDNA clone of north american procine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| FR2789695B1 (fr) * | 1999-02-11 | 2003-03-07 | Merial Sas | Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs |
| JP3961222B2 (ja) * | 1999-03-08 | 2007-08-22 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハー | Ｐｒｒｓｖワクチン |
| DK2251419T3 (da) * | 1999-04-22 | 2012-07-02 | Us Agriculture | Porcint reproduktions- og respirations-syndrom-vaccine baseret på isolat JA-142 |
| US20040213805A1 (en) * | 1999-10-12 | 2004-10-28 | Verheije Monique Helene | Deletions in arterivirus replicons |
| US20020012670A1 (en) * | 2000-01-26 | 2002-01-31 | Knut Elbers | Recombinant attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV) |
| WO2001059077A1 (en) | 2000-02-08 | 2001-08-16 | Regents Of The University Of Minnesota | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of use |
| EP1156111A1 (en) | 2000-05-19 | 2001-11-21 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Chimeric arterivirus-like particles |
| US7018638B2 (en) * | 2000-12-19 | 2006-03-28 | Wyeth | Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine |
| EP1397498A1 (en) | 2001-05-21 | 2004-03-17 | ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. | Delections in arterivirus replicons |
| US7279166B2 (en) * | 2001-12-12 | 2007-10-09 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
| US6841364B2 (en) * | 2002-01-22 | 2005-01-11 | Protatek International, Inc. | Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof |
| ATE557082T1 (de) * | 2002-04-05 | 2012-05-15 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Sequenz positionen zur anpassung bei prrsv |
| US7335361B2 (en) * | 2003-06-09 | 2008-02-26 | Animal Technology Institute Taiwan | Fusion antigen used as vaccine |
| US7722878B2 (en) | 2004-06-17 | 2010-05-25 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PRRSV subunit vaccines |
| BRPI0510928A (pt) * | 2004-06-18 | 2007-11-13 | Univ Minnesota | identificação de organismos viralmente infectados e vacinados |
| US20060063151A1 (en) * | 2004-09-21 | 2006-03-23 | Michael Roof | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
| US7632636B2 (en) * | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
| ES2343201T3 (es) | 2005-01-13 | 2010-07-26 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vacunas contra el srrp. |
| CN103641920B (zh) | 2005-11-29 | 2016-08-17 | 衣阿华州立大学研究基金公司 | 猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的保护性抗原决定子的鉴定及其用途 |
| WO2008109237A2 (en) | 2007-02-13 | 2008-09-12 | Washington State University Research Foundation | Macrophage cell-lines for propagation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus |
| WO2008121958A1 (en) | 2007-04-02 | 2008-10-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Use of prrsv vaccines to reduce pcv2 viremia |
| US20100003278A1 (en) * | 2008-07-03 | 2010-01-07 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunological Compositions Effective for Lessening the Severity or Incidence of PRRSV Signs and Methods of Use Thereof |
| MX2011002046A (es) | 2008-08-25 | 2011-04-21 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Vacuna contra sindrome disgenesico y respiratorio porcino altamente patogeno (hp prrs). |
| US20100129398A1 (en) * | 2008-11-26 | 2010-05-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Materials and Methods for Control of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome |
| EP2558118B1 (en) | 2010-04-16 | 2019-06-05 | Universiteit Gent | Cross-protecting vaccine for porcine reproductive and respiratory syndrome virus |
-
1996
- 1996-10-30 EP EP96203024A patent/EP0839912A1/en not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-10-29 PL PL333070A patent/PL191258B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-10-29 CN CNB97180706XA patent/CN1138859C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 ZA ZA9709732A patent/ZA979732B/xx unknown
- 1997-10-29 MY MYPI97005141A patent/MY117686A/en unknown
- 1997-10-29 CA CA2272046A patent/CA2272046C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 SI SI9730768T patent/SI0935660T1/sl unknown
- 1997-10-29 AU AU58828/98A patent/AU719991B2/en not_active Expired
- 1997-10-29 HU HU9903829A patent/HUP9903829A3/hu unknown
- 1997-10-29 DK DK97954491T patent/DK0935660T3/da active
- 1997-10-29 JP JP52032198A patent/JP3921552B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 SK SK547-99A patent/SK286231B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-10-29 AT AT97954491T patent/ATE366314T1/de active
- 1997-10-29 CZ CZ19991564A patent/CZ294781B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-10-29 EP EP97954491A patent/EP0935660B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 BR BR9712592-0A patent/BR9712592A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-10-29 WO PCT/NL1997/000593 patent/WO1998018933A1/en active IP Right Grant
- 1997-10-29 ID IDW990271A patent/ID22208A/id unknown
- 1997-10-29 US US09/297,535 patent/US6268199B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 DE DE69737886T patent/DE69737886T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 KR KR10-1999-7003788A patent/KR100437254B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-10-29 UA UA99052951A patent/UA72433C2/uk unknown
- 1997-10-29 ES ES97954491T patent/ES2290973T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-29 PT PT97954491T patent/PT935660E/pt unknown
-
2001
- 2001-06-05 US US09/874,626 patent/US20020098573A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-12-30 US US10/750,410 patent/US20040197872A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-09-29 US US11/239,529 patent/US8546124B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-09-30 US US14/041,560 patent/US20140030290A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA72433C2 (en) | Infectious clones of rna-viruses and vaccines, and also diagnostic analyses developed on their base | |
| JP3816126B2 (ja) | 組換え伝染性非セグメント化陰性鎖ｒｎａウイルス | |
| JP4608210B2 (ja) | キメラアルファウイルスレプリコン粒子 | |
| CA2366072C (en) | Prrsv vaccines | |
| JP2005515755A5 (uk) | ||
| ZA200707216B (en) | Replication-deficient RNA viruses as vaccines | |
| Tang et al. | Toward a poliovirus-based simian immunodeficiency virus vaccine: correlation between genetic stability and immunogenicity | |
| KR100710519B1 (ko) | 일본뇌염 바이러스의 신규한 전체-길이의 게놈 ＲＮＡ 및상기 ＪＥＶ 게놈 ＲＮＡ에 대한 감염성이 있는 ＪＥＶｃＤＮＡ 및 이것의 용도 | |
| US20040224327A1 (en) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof | |
| EP3865180A1 (en) | Live recombinant measles virus expressing coronavirus antigens - its use in eliciting immunity against coronaviruses | |
| US20080131459A1 (en) | Full-Length Infectious Cdna Clone for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus(Prrsv) and Uses Thereof | |
| MXPA99003967A (en) | Infectious clones of rna viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |