ES2290973T3 - Clones infecciosos de virus de rna y vacunas y ensayos diagnosticos derivados de estos. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION COMPRENDE UN PROCEDIMIENTO PARA GENERAR UN CLON INFECCIOSO, BASADO EN EL GENOMA DE UN VIRUS DE ARN DE HEBRA POSITIVA, QUE PRESENTA UN GENOMA DE AL MENOS APROX. 15 KB. LA INVENCION COMPRENDE ASIMISMO UN PROCEDIMIENTO PARA GENERAR UN CLON INFECCIOSO BASADO EN EL GENOMA DEL VIRUS DE ARN, CONSISTIENDO DICHO PROCEDIMIENTO EN SELECCIONAR CLONES INFECCIOSOS MEDIANTE TRANSFECCION DE UNA CELULA HUESPED CON DICHO ACIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, DE FORMA QUE DICHA CELULA HUESPED NO SEA DE POR SI SUSCEPTIBLE A LA INFECCION POR DICHO VIRUS. LA INVENCION PROPORCIONA TAMBIEN VIRUS DE ARN MODIFICADOS Y VACUNAS Y ENSAYOS DIAGNOSTICOS DERIVADOS DE LOS MISMOS.
Description
Clones infecciosos de virus de RNA y vacunas y
ensayos diagnósticos derivados de éstos.
La invención hace referencia al campo de los
virus de RNA y clones infecciosos obtenidos de virus de RNA.
Además, la invención hace referencia a las vacunas y ensayos
diagnósticos obtenidos mediante el uso y modificación de tales
clones infecciosos de virus de RNA.
La ingeniería genética comprende técnicas de
biología molecular extremadamente variadas y potentes con la
finalidad de modificar ácidos nucleicos a nivel de DNA y hace
posible analizar y modificar genomas a nivel molecular. A este
respecto los virus, debido al pequeño tamaño de su genoma, son
particularmente aptos para tales manipulaciones. Sin embargo, la
ingeniería genética no puede aplicarse inmediatamente a virus de RNA
que no sean retrovirus debido a que estos no presentan una fase
intermedia de DNA en su replicación. Para tales virus deben
desarrollarse clones infecciosos, (por ejemplo, como una copia de
DNA o como una copia de RNA transcrita in vitro o como
derivada de éstos) previamente a la aplicación de técnicas de
ingeniería genética a su genoma para producir virus modificados.
Los clones infecciosos pueden obtenerse a partir de la construcción
de un cDNA completo (longitud genómica) del virus estudiado,
utilizado aquí en el sentido amplio de una copia de DNA del RNA y
no en el sentido estricto de una copia de DNA del mRNA, tras la cual
se sintetiza un transcrito infeccioso in vivo en células a
las que se ha transfectado el cDNA completo, aunque los transcritos
infecciosos pueden también obtenerse mediante transcripción in
vitro a partir de fragmentos de cDNA de longitud parcial
ligados in vitro que forman el genoma viral completo. En
todos los casos, el RNA transcrito contiene todas las
modificaciones que se han introducido en el cDNA y puede utilizarse
para realizar más pases del virus modificado de este modo.
Se han generado clones de cDNA y transcritos
in vitro infecciosos para un número elevado de virus de RNA
de cadena positiva (para revisión véase Boyer y Haenni, Virology
198, 415-426) con un genoma de hasta 12 kb o
ligeramente superior. El genoma viral de los pestivirusparece ser
hasta el momento el genoma viral de RNA de cadena positiva más
largo a partir del que se han preparado clones infecciosos
(Moormann. et al., J. Vir. 70:763-770). Los
problemas asociados a la longitud del genoma no residen sólo en la
dificultad de obtención y mantenimiento de clones de cDNA largos y
estables en bacterias, sino también en la infectividad del
transcrito de RNA inicial, del que la replicación en la célula
huésped se alcanza sin la ayuda de las proteínas virales
normalmente asociadas vinculadas a la replicación viral. Para
alcanzar una infección con éxito los transcritos virales deben
interaccionar con proteínas codificadas por virus, más
particularmente con la replicasa viral, y con componentes de la
célula huésped tales como el mecanismo de traducción; en
consecuencia la estructura de los transcritos virales tiene que
mimetizar a la de los viriones de RNA lo mejor posible. Otros
problemas pueden presentarse con aquellos virus de RNA de cadena
positiva que se replican mediante mecanismos de RNA mensajeros
subgenómicos transcritos a partir del extremo 3' del genoma y con
aquellos virus de RNA de cadena positiva que generan durante la
replicación partículas defectuosas obstructoras, tales como cápsides
desnudas o procápsides, que abarcan varias estructuras proteicas,
aunque son solamente una parte del genoma. La presencia de
fragmentos de RNA viral incompletos o de, por ejemplo, proteínas de
la matriz o de la nucleocápside que interfieren o interaccionan con
el RNA viral que se transcribe o con RNA intermedio replicativo, y
que alteran su estructura, impedirá la síntesis completa de cadenas
de RNA y, de este modo, la obtención de virus infecciosos que
contengan RNA de longitud genómica.
El virus Lelystad (LV), también denominado virus
del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (VSRRP, longitud
genómica de 15,2 Kb) es un miembro de la familia
Arteriviridae que comprende también el virus de la arteritis
equina (VAE, longitud genómica de 12,7 kb), el virus elevador de la
lactato deshidrogenasa (LDV, de longitud genómica de al menos 14,2
kb) y el virus de la enfermedad hemorrágica del simio (SHFV, de
longitud genómica aproximadamente de 15 kb) (Meulenberg et
al., 1993a; Plagemann y Moennig, 1993).
Recientemente, el Comité Internacional de
Taxonomía de Virus ha decidido incorporar esta familia en un nuevo
orden de virus, el orden Nidovirales, junto con las familias
Coronaviridae (longitud genómica de 28 a 30 kb) y
Toroviridae (longitud genómica de 26 a 28 kb). El orden
Nidovirales representa virus de RNA con envoltura que
contienen una cadena positiva de RNA genómico y sintetizan una serie
de RNA subgenómicos anidados en 3' durante la replicación. Los RNA
subgenómicos de los coronavirus y los arterivirus contienen una
secuencia líder derivada del extremo 5' del genoma viral (Spaan
et al., 1988; Plagemann y Moennig, 1993). Los RNA
subgenómicos de los torovirus carecen de secuencia líder (Snijder y
Horzinek, 1993). Mientras que los ORF 1a y 1b, que codifican la RNA
polimerasa dependiente de RNA, se expresan a partir del RNA
genómico, los ORF más pequeños situados en el extremo 3' de los
genomas de Nidovirales, que codifican proteínas
estructurales, se expresan en los mRNA subgenómicos.
El VSRRP (virus Lelystad) fue asilado por
primera vez por Wensvoort et al. (1991) y se demostró que era
el agente causal de una nueva enfermedad, ahora conocida como el
síndrome reproductivo y respiratorio porcino (SRRP). Los síntomas
principales de la enfermedad son problemas respiratorios en cerdos y
abortos en las cerdas. Aunque los brotes más importantes, como los
observados al principio en EE. UU. en 1987 y en Europa en 1991, han
disminuido, estos virus todavía causan pérdidas económicas en piaras
en los EE. UU., Europa y Asia. El VSRRP se reproduce
preferentemente en los macrófagos de los alvéolos pulmonares
(Wensvoort et al., 1991). Unas pocas líneas celulares, tales
como la CL2621 y otras clonadas a partir de la línea celular
MA-104 del riñón del mono (Benfield et al.,
1992; Collins et al., 1992; Kim et al., 1993) son
también sensibles al virus. Algunas cepas bien conocidas de VSRRP
se designan con los números de accesión CNCM I-1102,
I-1140, I-1387,
I-1388, ECACC V93070108 o ATCC VR 2332, VR 2385, VR
2386, VR 2429, VR 2474 y VR 2402. El genoma de VSRRP fue
secuenciado completa o parcialmente (Conzelmann et al., 1993;
Meulenberg et al.; 1993a, Murthaugh et al, 1995) y
codifica, además de la RNA polimerasa dependiente de RNA (ORF 1a y
1b), seis proteínas estructurales de las cuales cuatro son
glucoproteínas de envoltura denominadas GP_{2} (ORF2), GP_{3}
(ORF3), GP_{4} (ORF4) y GP_{5} (ORF5), una proteína M de
membrana no glucosilada (ORF6) y la proteína N de la nucleocápside
(ORF 7) (Meulenberg et al. 1995, 1996; van Nieuwstadt et
al., 1996). La caracterización inmunológica y la secuenciación
de nucleótidos de cepas europeas y estadounidenses de VSRRP han
identificado diferencias antigénicas mínimas en las proteínas
virales estructurales entre diferentes cepas de VSRRP (Nelson et
al., 1993; Wensvoort et al., 1992; Murtaugh et
al., 1995).
Los cerdos pueden adquirir la infección por
VSRRP por vía oronasal. El virus es fagocitado por los macrófagos
alveolares en los pulmones y la replicación se completa en estas
células al cabo de nueve horas. El VSRRP es transportado desde los
pulmones hacia los ganglios linfáticos pulmonares en 12 horas y
hacia los ganglios linfáticos periféricos, la médula ósea y el bazo
en un periodo de tres días. En estos emplazamientos sólo algunas
células resultan positivas al realizar una tinción para la detección
de antígenos virales. El virus se encuentra presente en sangre
durante al menos 21 días y con frecuencia más tiempo. Después de
siete días pueden encontrarse anticuerpos contra VSRRP en sangre.
La existencia conjunta de virus y anticuerpos en cerdos infectados
por VSRRP demuestra que la infección viral puede persistir durante
un largo período, aunque a niveles bajos, a pesar de la presencia
del anticuerpo. Durante al menos siete semanas la población de
células alveolares en los pulmones es diferente a la de los
pulmones de animales libres de patógenos específicos.
EL VSRRP precisa su envoltura para infectar a
los cerdos por vía oronasal de modo que la respuesta inmunitaria
normal del cerdo conlleva, entre otras cosas, la producción de
anticuerpos neutralizantes dirigidos contra una o varias proteínas
de la envoltura; tales anticuerpos pueden convertir al virus en no
infectivo. Sin embargo, una vez se encuentra en los macrófagos
alveolares, el virus produce también cápsides desnudas, formadas por
RNA encapsidado por proteínas M o N y que a veces contienen
parcialmente cualquiera de las glucoproteínas. La presencia intra-
o extracelular de estas partículas virales incompletas o cápsides
(parcialmente) desnudas intra y extracelularmente puede demostrarse
mediante microscopía electrónica. A veces se encuentran cápsides
desnudas sin contenido de ácido nucleico. Las cápsides desnudas se
distribuyen por el cuerpo mediante el torrente circulatorio y son
fagocitadas por los macrófagos en el bazo, los ganglios linfáticos y
la médula ósea. Estas cápsides virales desnudas, pero infecciosas,
no pueden ser neutralizadas por los anticuerpos producidos por el
cerdo y de este modo se explica la persistencia de la infección
viral en presencia de anticuerpos. De esta manera, la generación de
macrófagos procedentes de células infectadas de la médula ósea
distribuye la infección viral a nuevos emplazamientos en el cuerpo.
Debido a que no todas las células de la médula ósea precursoras de
los macrófagos están infectadas, sólo una pequeña cantidad de
macrófagos que llegan a tejidos periféricos están infectados y
producen virus. Las cápsides del VSRRP formadas solamente por
proteínas ORF7 pueden formarse en ausencia de otras proteínas
virales, como por ejemplo mediante infección de macrófagos por un
vector viral quimérico pseudorabia-ORF7 El virus
PRV se manipuló genéticamente de manera que contuviera la
información genética del ORF7. Después de 18 horas de la infección,
el citoplasma de la célula infectada contiene una gran cantidad de
pequeñas estructuras esféricas vacías del tamaño de la nucleocápside
del virus SRRP.
La presente invención proporciona así un clon
infeccioso derivado de un virus con una longitud genómica que
excede con gran diferencia la longitud genómica máxima de los virus
de RNA de cadena positiva de los que se han obtenido los clones
infecciosos. La parte experimental de esta aplicación describe la
generación de un clon infeccioso basado y derivado del VSRRP con
una longitud genómica de 15,2 kb, pero tales clones pueden
obtenerse también del LDV y del SHFV que poseen también una longitud
genómica de aproximadamente 15 kb y del VAE, aunque su genoma es
ligeramente más pequeño, y de virus de longitud genómica
superior.
La invención proporciona también un método para
generar clones infecciosos eludiendo los problemas que presenta la
síntesis de cadenas de RNA viral asociados con la presencia de
fragmentos incompletos de RNA viral o de, por ejemplo, proteínas de
la matriz o de la nucleocápside que interfieren o interaccionan con
el transcrito de RNA que se transcribe o con RNA intermedio
replicativo y alteran su estructura, que impiden la síntesis de
cadenas completas de RNA y, de este modo, la generación de virus
infecciosos. La invención proporciona un método para generar clones
infecciosos mediante la transfección de una célula huésped, que
básicamente no es vulnerable a la infección por la cepa salvaje del
virus, con un ácido nucleico recombinante derivado del genoma de
dicho virus, seguido de la recuperación de la progenie de virus
infecciosos de dicha célula huésped mediante la realización de
pases o el cocultivo con células sensibles al virus. Las células que
básicamente son insensibles al virus que se estudia pueden serlo
sólo ligeramente o bien ser totalmente insensibles al virus, en
comparación con las células utilizadas normalmente para la
replicación del virus en cuestión, pero sí pueden ser totalmente
sensibles a otras cepas del virus. La invención proporciona un
método para generar clones infecciosos mediante la transfección de
células huésped que no son vulnerables a la infección con el virus
natural para, de esta forma, evitar la generación de cápsides
desnudas o partículas virales incompletas formadas por fragmentos
de RNA y proteínas de la matriz o la nucleocápside que interfieran
en la síntesis de cadenas de RNA viral. Los virus infecciosos son
recuperados de las células huésped transfectadas de este modo
mediante pases en células que son sensibles al virus. En la parte
experimental se describe cómo se obtiene de este modo un clon
infeccioso del VSRRP, aunque el método es también aplicable a otros
virus de RNA de cadena positiva de la familia
Arteriviridae.
La presente invención proporciona ahora también
la posibilidad de generar un clon infeccioso modificado a través de
la aplicación de técnicas de ingeniería genética. Tales
modificaciones pueden ser mutaciones simples o múltiples,
sustituciones, deleciones o inserciones, o combinaciones de éstas,
que pueden practicarse mediante cualquier método de ingeniería
genética conocido en esta disciplina. La presente invención
proporciona así virus de RNA modificados que pueden utilizarse para
investigar virus de RNA y para preparar vacunas.
La presente invención proporciona ahora también
clones infecciosos, derivados por ejemplo de los
Arteriviridae, como el VSRRP, que pueden utilizarse como una
vacuna monovalente contra la enfermedad causada por el virus en el
que se basa el clon infeccioso. Por ejemplo, el clon infeccioso
basado en el VSRRP puede utilizarse ahora para estudiar los
marcadores de virulencia o marcadores serológicos del VSRRP. Los
marcadores serológicos conocidos del VSRRP se encuentran por
ejemplo en cualquier proteína estructural del VSRRP codificada por
los ORF 1a y 1b. Los marcadores de virulencia están presentes en
los ORF 1a y 1b que codifican las proteínas no estructurales del
VSRRP, pero pueden hallarse en cualquiera de las proteínas
codificadas por el ORF 2 al ORF 7. Modificando el genoma del clon
infeccioso con respecto a estos marcadores es posible obtener VSRRP
no virulento o mucho menos virulento que la cepa parental o VSRRP
modificado mediante deleción o introduciendo marcadores serológicos
que permitan una diferenciación serológica entre cerdos vacunados y
cerdos infectados por los virus naturales. Tales modificaciones las
proporcionan, por ejemplo, los clones infecciosos del VSRRP, en los
que la secuencia de ácido nucleico del ORF7 que codifica la proteína
N se sustituye por el ORF7 de la proteína del ATCC VR2332 o del
LDV.
La presente invención proporciona ahora también
clones infecciosos derivados de los Arteriviridae, tales
como el VSRRP, que pueden utilizarse como sistema de administración
o vacuna de vector viral para una gran variedad de antígenos. En
tales clones se insertan las secuencias de ácido nucleico heterólogo
que no corresponden a la secuencia del virus estudiado. Tales
secuencias de ácido nucleico heterólogo pueden ser, por ejemplo,
derivadas de secuencias que codifican cualquier antígeno que se
elija. Este antígeno es una proteína o péptido que puede inducir la
inmunidad frente a un microorganismo patógeno. Puesto que el virus
infecta macrófagos y células precursoras de los macrófagos en la
médula ósea, y el virus que contiene el antígeno se distribuye en
las células de la progenie, esta vacuna de vector viral infecta las
células más importantes del sistema inmunitario y puede presentar
los antígenos para que siga el proceso. El vector vírico vacunal
infecta las células presentadoras de antígeno, como los macrófagos
dendríticos o las células de Kuppfer u otras células del sistema
inmunitario, y puede hacerlo en forma de partícula viral con
envoltura incompleta o como una partícula de cápside desnuda.
Debido a que la infección por una cápside desnuda o una partícula
viral incompleta asegura una infección persistente, el efecto de
refuerzo inmunológico dará lugar a una inmunidad de por vida
(gracias a la estimulación continua a niveles bajos) contra el
microorganismo patógeno del que se seleccionaron los antígenos. Es
posible utilizar el virus como vehículo de antígenos al construir en
su interior la información para los epítopos de otros
microorganismos o sustancias patógenos. Muchos de estos vectores
víricos vacunales portadores de la información de los epítopos
pueden mezclarse y administrarse al mismo tiempo. Esto hace posible
la inmunidad activa contra varios antígenos diferentes de un
microorganismo patógeno o la inmunidad activa contra varios
microorganismos patógenos diferentes.
La presente invención proporciona ahora también
clones infecciosos derivados de los Arteriviridae, tales
como el VSRRP, que pueden ser utilizados como vacuna divalente. Por
ejemplo, el clon infeccioso basado en el VSRRP puede usarse para
elaborar una vacuna que proteja contra el VSRRP y contra otro
microorganismo patógeno, combinando simplemente el desarrollo de la
vacuna vector con el desarrollo dirigido hacia una vacuna
monovalente contra el SRRP. Es posible desarrollar una vacuna
divalente específica que proteja frente a la enfermedad
respiratoria en los cerdos mediante la inserción de antígenos
derivados de cualquiera, entre una amplia variedad, de los
microorganismos patógenos del sistema respiratorio conocidos en la
vacuna contra el SRRP.
La invención también proporciona vacunas, ya
sean monovalentes, divalentes o vectores vacunales, que son seguras
en el sentido de que las vacunas no pueden desecharse liberándolas
al medio ambiente. La seguridad de una vacuna (no desechable) puede
asegurarse mediante la eliminación de la información de las
proteínas necesarias para producir virus infecciosos con envoltura.
Estos virus deben propagarse en una línea celular que exprese la
proteína de forma constitutiva. Los virus que se replican en esta
línea celular complementaria poseen una envoltura completa y son
capaces de infectar a los macrófagos en el cerdo. Después de un
ciclo de replicación, la progenie del virus, que carece de la
información para la proteína de la envoltura, no podrá infectar
otras células como un virus con envoltura. Aun así, la infección de
macrófagos en el cuerpo es posible todavía en forma de cápsides
desnudas o partículas virales incompletas.
La invención proporciona también antígenos y
proteínas virales que pueden ser obtenidos a partir de cultivos
celulares infectados por los virus de RNA modificados de acuerdo con
la invención. Tales antígenos pueden utilizarse en pruebas
diagnósticas como el ELISA u otros tipos de pruebas diagnósticas
conocidas por los expertos. Estas pruebas pueden utilizarse como
pruebas únicas para el diagnóstico principal o como pruebas
complementarias que se aplican en poblaciones animales que han sido
vacunadas con una vacuna marcadora o discriminante basada en los
virus de RNA modificados de acuerdo con la invención.
La producción de clones de cDNA a partir de los
cuales se transcriben RNA infecciosos in vitro se ha
convertido en una herramienta esencial en el análisis genético
molecular de los virus de RNA de cadena positiva. Esta tecnología
se aplica a virus de RNA de cadena positiva, cuyos genomas de RNA
pueden funcionar como mRNA e iniciar un ciclo infeccioso completo
tras su introducción en el interior de células huésped adecuadas. Se
han descrito clones infecciosos para varios virus que facilitan los
estudios sobre la expresión genética, la replicación, la función de
las proteínas virales y la recombinación de virus de RNA (para
revisión véase Boyer y Haenni, 1994). Además, estos clones pueden
contemplarse para el desarrollo de nuevos vectores virales y
vacunas. Hasta el momento, no se ha descrito un clon infeccioso de
cDNA de los Arterivirus. Presentamos aquí la generación de un clon
infeccioso del VSRRP y su primera aplicación en la producción de
virus VSRRP quiméricos.
La cepa Ter Huurne del VSRRP (o LV)
(depositada con número de accesión I-1102 en la
CNCM, París) se aisló en 1991 (Wensvoort et al., 1991) y se
cultivó en macrófagos primarios alveolares o en células CL2621. En
este estudio se empleó el pase número 6 de la cepa Ter Huurne
(TH), así como el derivado de esta cepa, LV4.2.1, que se adaptó
para su cultivo en células CL2621 mediante pases seriados. Los
macrófagos alveolares se mantuvieron en medio de cultivo RPMI 1640
(Flow), mientras que las células CL2621 se mantuvieron en medio
esencial mínimo de Hank (Gibco-BRL/Life
technologies). Las células BHK-21 se mantuvieron en
medio mínimo esencial Dulbecco. Para los experimentos de
transfección, las células BHK-21 fueron cultivadas
en medio mínimo esencial Glasgow (GIBCO-BRL/Life
Technologies Ltd), de acuerdo con el método de Liljeström y Garoff
(1993).
El RNA intracelular se aisló de macrófagos
alveolares o de células CL2621 24 horas después de la infección por
VSRRP a una multiplicidad de infección de 1, como se ha descrito
anteriormente (Meulenberg et al., 1993a). Para la obtención
de RNA genómico de virión, se purificaron viriones en gradientes de
sacarosa como fue descrito por van Nieuwstadt et al. (1996)
y se resuspendieron en TNE (Tris-HCl 0,01 M, pH 7,2;
NaCl 0,1 M; EDTA 1 mM). Se añadió 1 ml de tampón de Proteinasa K
(Tris-Hcl 100 mM, pH 7,2, EDTA 25 mM, NaCl 300 mM,
SDS 2% (p/v)) y 0,4 mg de Proteinasa K (Boehringer Mannheim) a 1 ml
de viriones del VSRRP purificados (10^{8} TCID_{50}). Esta
mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 30 minutos. El RNA se
extrajo una vez con fenol/cloroformo (1:1) y se precipitó con
etanol. El RNA se almacenó en etanol a -20ºC. Una décima parte de
esta preparación de RNA se utilizó en reacciones de transcripción
inversa (TI).
El extremo 5' del genoma viral del VSRRP se
clonó utilizando un procedimiento de ligación entre un ligando
monocatenario modificado y un cDNA monocatenario (SLIC; Edwards
et al., 1991). Una décima parte del RNA del virión,
preparado como se ha descrito anteriormente, se utilizó en una
reacción de TI con el cebador 11U113 (5' TACAGGTGCCTGATCCAAGA 3'),
complementario a los nucleótidos del 1232 al 1251 del genoma. La
reacción de TI se llevó a cabo con un volumen final de 20 \mul,
como se ha descrito anteriormente (Meulenberg et al.,
1993b). Posteriormente se añadieron 2 \mul de NaOH 6 M a la
reacción de TI y el RNA se hidrolizó a 37ºC durante 30 minutos. El
cDNA monocatenario se purificó utilizando el equipo "High Pure PCR
Product Purification" de Boehringer Mannheim. El cDNA purificado
se precipitó con etanol, se resuspendió en TE y se ligó a un cebador
de anclaje ALG3 (5' CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC 3'). Este
cebador contiene un sitio EcoRI, ClaI y BamHI
y su extremo 3' está modificado con un grupo amino bloqueante para
impedir la autoligación. El producto de cDNA monocatenario se ligó
a 4 pmol de ALG3 en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0),
MgCl_{2} 10 mM, BSA 10 \mug/ml, PEG 25%, cloruro de cobalto de
hexamina 1,0 mM, ATP 40 \muM y RNA ligasa T4 0,5 \mul (10 U)
(New England Biolabs) durante la noche a temperatura ambiente. Un
tercio de la reacción de ligación se utilizó como molde en una PCR
con los cebadores LV69 (5' AGGTCGTCGACGGGCCCCGTGATCGGGTACC 3') y
ALG4 (5' GAAGGATCCAGAATCGATAG 3'). El cebador LV69 es
complementario a los nucleótidos del 594 al 615 del genoma de LV,
mientras que ALG4 es complementario al cebador de anclaje ALG3. Las
condiciones en la PCR fueron las mismas que las descritas en
Meulenberg et al. (1993b) y el producto obtenido fue digerido
con EcoRI y SalI y se clonó en
pGEM-4Z. Se utilizó una estrategia similar para
clonar el extremo 5' del genoma de LV a partir de RNA intracelular
del LV. Se utilizaron 10 \mug de RNA celular total aislado de las
células CL2621 infectadas por LV. Los clones de cDNA 5' se
secuenciaron y uno de los clones, pABV387, que contenía una
extensión de 10 nucleótidos en comparación con la secuencia del
VSRRP publicada (Meulenberg et al., 1993a), se utilizó en
otros experimentos.
Un clon de cDNA 3' que contenía una cola de
poli(A) larga se construyó mediante transcripción inversa de
RNA del LV con un cebador LV76 (5'
TCTAGGAATTCTAGACGATCG(T)_{40} 3') que contiene unos
sitios EcoRI, XbaI y PvuI. Después de la
reacción de transcripción inversa se continuó con una PCR utilizando
cebadores LV75 (5' TCTAGGAATTCTAGACGATCGT 3'), que es idéntico al
LV76 excepto por la secuencia poli (T) y 39U70R (5'
GGAGTGGTTAACCTCGTCAA 3'), un cebador directo que corresponde a los
nucleótidos del 14566 al 14585 del genoma del LV que contiene un
sitio HpaI. Los productos resultantes de la PCR se digirieron
con HpaI y EcoRI y se clonaron en un clon de cDNA
pABV39 en el que se usaron las mismas enzimas de restricción (Fig.
1). Se utilizaron dos clones de cDNA que contenían un tramo de
poli(A) de 45 A (pABV382) y 109 A (pABV392) y la secuencia de
DNA genómica correcta, como se comprobó mediante la secuenciación
de nucleótidos, para construir un clon de cDNA genómico
completo.
Las secuencias de oligonucleótidos se
determinaron mediante el equipo "PRISM^{TM} Ready Reaction Dye
Deoxy^{TM} Terminator Cycle Sequencing" y el secuenciador
automático de Applied Biosystems.
Los clones de cDNA generados anteriormente para
determinar la secuencia de nucleótidos del genoma del LV (Meulenberg
et al., 1993a) se ligaron conjuntamente a lugares de
restricción adecuados, como se muestra en la figura 1. Se construyó
un plásmido pABV254 a partir de los clones pABV 25, 11, 12 y 100 y
se utilizó en un estudio previo (den Boon et al., 1996). Se
llevaron a cabo procedimientos de clonación estándar de acuerdo con
Sambrook et al. (1989). Éstos dieron como resultado tres
plásmidos que contenían secuencias de cDNA del LV solapadas en un
plásmido pGEM-4Z de elevado número de copias. Los
plásmidos pABV331 y pABV369 estaban formados por los nucleótidos
del 5 al 6015 del genoma del LV. Se encontró una diferencia en el
nucleótido de la posición 3462 en una proporción de 1:1 en un
conjunto de 6 clones de cDNA independientes que se secuenciaron en
esta región. Esta diferencia en el nucleótido dio lugar a una
sustitución de un aminoácido en la posición 1084 (Leu en vez de
Pro). Puesto que no era posible predecir la influencia de este
aminoácido en la infectividad, también se clonó el fragmento de DNA
que codifica la Leu en el pABV331 mediante intercambio en los sitios
EcoRV (nucleótido 3403) y SacII (nucleótido 3605),
que dio como resultado el pABV369. El plásmido pABV384 está formado
por los nucleótidos del 5168 al 9825 del genoma del LV. Puesto que
no existía ningún clon de cDNA adecuado disponible aún que se
hubiera solapado con los plásmidos pABV20 y pABV5 y pudiera
fusionarse finalmente con las secuencias de cDNA de pABV331 y
pABV369, se generaron dos nuevos fragmentos de cDNA mediante
RT-PCR. El cebador directo LV59 (5'
TCGGAATCTAGATCTCACGTGGTGCAGCTGCTG 3') que corresponde a los
nucleótidos del 5169 al 5186 y el cebador inverso 61U303 (5'
CATCAACACCTGTGCAGACC 3') complementario a los nucleótidos del 6078
al 6097 se utilizaron en una PCR. El cebador directo 61U526R (5'
TTCCTTCTCTGGCGCATGAT 3') localizado en los nucleótidos del 5936 al
5955 y el LV60 (5' GTACTGGTACCGGATCCGTGAGGATGTTGC 3') complementario
a los nucleótidos del 6727 al 6745 se utilizaron en otra PCR. Estos
dos fragmentos de la PCR se ligaron conjuntamente en pABV20
utilizando el sitio XbaI incorporado en LV59, el sitio
interno ApoI (nucleótido 6006) y el sitio BamHI en el
nucleótido 6740, que se incorporó también en el cebador LV60. El
nuevo fragmento de cDNA se secuenció completamente y no contenía
ninguna mutación que diera como resultado una diferencia en los
aminoácidos con respecto a la secuencia publicada (Meulenberg et
al., 1993a). El plásmido pABV384 abarca los nucleótidos del
8274 al 13720 del genoma del VSRRP. Los insertos de pABV331/369,
pABV384 y pABV368 se ligaron a los fragmentos 5' y 3' de cDNA en el
pOK12 (Viera y Messing, 1991), ya que la ligación de fragmentos de
ADNc en el pGEM-4Z dio lugar a clones inestables.
Se asume que el vector plasmídico pOK12 es más apropiado para el
clonaje de secuencias de cDNA foráneo de gran longitud, debido a
que posee un número de copias inferior al pGEM-4Z.
Los plásmidos se introdujeron por transformación de la cepa DH5a de
Escherichia coli y las células se cultivaron a 32ºC en
presencia de 15 \mug/ml de Kanamicina para mantener el número de
copias lo más bajo posible. En primer lugar, los fragmentos de cDNA
del pABV382 ((A)_{45}) y del pABV392 ((A)_{109})
se escindieron mediante digestión con EcoRI, se modificó
este sitio con polimerasa Klenow (Pharmacia) hasta obtener un
extremo romo y se digirió posteriormente con BamHI. Estos
fragmentos fueron clonados en pOK12 digerido con BamHI y
FspI, el último sitio también modificado hasta conseguir un
extremo romo, dando lugar a pABV394 y pABV395. De esta manera se
eliminó el promotor de la RNA polimerasa T7 presente en el pOK12.
Posteriormente los fragmentos de cDNA de pABV368 y pABV384 se
ligaron a los clones de cDNA del extremo 3' utilizando el sitio
Bc1I (nucleótido 13394), el sitio ScaI (nucleótido
8657) y los sitios BamHI y Bg1II en secuencias
flanqueantes o secuencias vector. Esto dio lugar a los plásmidos
pABV401 y pABV402 (Fig. 1).
Un clon de cDNA 5' que contenía el promotor de
la RNA polimerasa T7 directamente fusionado con el extremo 5' del
genoma del LV se amplificó mediante PCR a partir de pABV387 con los
cebadores LV83 (5' GAATTCACTAGT
TAATACGACTCACTATAGATGATGTGTAGGGTATTCC 3') y LV69. El LV83 está compuesto (en dirección 5' a 3') de un sitio EcoRI y SpeI, una secuencia promotora de la RNA polimerasa T7, una G para el inicio de la transcripción y los nucleótidos del 1 al 19 del genoma del LV. El fragmento de la PCR se clonó en los sitios EcoRI y SalI del pOK12, dando como resultado pABV396. La secuencia correcta del pABV396 se comprobó mediante secuenciación de oligonucleótidos. Posteriormente, los fragmentos cDNA del LV de pABV331 y pABV369 se escindieron con ApaI y BamHI y se ligaron a pABV396, digerido con ApaI y BamHI. Finalmente, los fragmentos de cDNA 5' resultantes se clonaron en el pABV401 y pABV402, utilizando el sitio SpeI en dirección 5' desde el promotor de la RNA polimerasa T7 y el único sitio Pm1I en la posición 5168 del genoma viral. De esta manera, se obtuvieron clones de cDNA de longitud igual al genoma, como corresponde a virus que se asemejan a la cepa parental y a virus quiméricos que constan de marcos de lectura abiertos foráneos.
TAATACGACTCACTATAGATGATGTGTAGGGTATTCC 3') y LV69. El LV83 está compuesto (en dirección 5' a 3') de un sitio EcoRI y SpeI, una secuencia promotora de la RNA polimerasa T7, una G para el inicio de la transcripción y los nucleótidos del 1 al 19 del genoma del LV. El fragmento de la PCR se clonó en los sitios EcoRI y SalI del pOK12, dando como resultado pABV396. La secuencia correcta del pABV396 se comprobó mediante secuenciación de oligonucleótidos. Posteriormente, los fragmentos cDNA del LV de pABV331 y pABV369 se escindieron con ApaI y BamHI y se ligaron a pABV396, digerido con ApaI y BamHI. Finalmente, los fragmentos de cDNA 5' resultantes se clonaron en el pABV401 y pABV402, utilizando el sitio SpeI en dirección 5' desde el promotor de la RNA polimerasa T7 y el único sitio Pm1I en la posición 5168 del genoma viral. De esta manera, se obtuvieron clones de cDNA de longitud igual al genoma, como corresponde a virus que se asemejan a la cepa parental y a virus quiméricos que constan de marcos de lectura abiertos foráneos.
Para introducir un único sitio PacI en el
clon de cDNA de longitud igual al genoma directamente en dirección
3' del gen ORF7 se reemplazaron la T y la A de los nucleótidos 14987
y 14988 por una A en una PCR utilizando el cebador directo LV108
(5' GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC 3') con el cebador
inverso LV112 (5' CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCTGA 3'), y el
cebador directo LV111 (5' TCAGGGTGCAAGTTAATTAAACAGTCAGGTGAATGG 3')
con el LV75.
De forma similar, se creó un único sitio
SwaI cambiando la G de la posición 14980 por una T y la T de
la posición 14985 por una A mediante PCR usando los cebadores LV108
y LV110 (5' CCTGACTGTCAATTTAAATTGCACCC
TGAC 3') y los cebadores LV109 (5' GTCAGGGTGCAATTTAAATTGACAGTCAGG 3') y LV111. Los fragmentos de la PCR se ligaron en el pABV395 utilizando los sitios PacI y SwaI creados y los sitios flanqueantes HpaI y XbaI, dando como resultado pABV437 y pABV442 (véase la Fig. 4).
TGAC 3') y los cebadores LV109 (5' GTCAGGGTGCAATTTAAATTGACAGTCAGG 3') y LV111. Los fragmentos de la PCR se ligaron en el pABV395 utilizando los sitios PacI y SwaI creados y los sitios flanqueantes HpaI y XbaI, dando como resultado pABV437 y pABV442 (véase la Fig. 4).
Para detectar la mutación marcadora en el virus
recuperado de los transcritos de pABV437 y pABV422 se separó el RNA
del sobrenadante de macrófagos alveolares porcinos infectados. Este
RNA se utilizó en una PCR de transcripción inversa para amplificar
un fragmento de aproximadamente 0,6 kb (tramo de nucleótidos
comprendido entre el 14576 hasta la cola de poli(A) de
longitud variable) con los cebadores LV76, LV75 y 39U70R. La
presencia del marcador genético se detectó mediante la digestión de
los fragmentos de PCR con PacI o SwaI.
Los plásmidos pABV414 y pABV416 que contienen el
fragmento de cDNA genómico completo del LV se linearizaron con
PvuI, el cual se localiza directamente en dirección 3' del
tramo de poli(A). El plásmido pABV296, formado por el ORF4
del vector de expresión pSFV1 del virus Semliki Forest (SFV)
(Meulenberg et al., 1997), se linearizó con SpeI y sirvió
como control para experimentos de transcripción y transfección in
vitro. Los plásmidos linearizados se precipitaron con etanol y
1,5 \mug de estos plásmidos se utilizaron para una transcripción
in vitro con RNA polimerasa T7 (plásmidos pABV414 y pABV416)
o RNA polimerasa Sp6 (pABV296), de acuerdo con los métodos
descritos para el SFV por Liljeström y Garoff (1991 y 1993). El RNA
transcrito in vitro se precipitó con isopropanol, se lavó
con etanol al 70% y se almacenó a -20ºC hasta su uso. Se sembraron
células BHK-21 en pocillos M6 (aproximadamente
10^{6} células / pocillo) y se transfectaron con 2,5 \mug de
RNA mezclados con 10 \mul de lipofectina en optimem como
describieron Liljeström y Garoff (1993). Alternativamente, se
introdujo el RNA en las células BHK-21 mediante
electroporación. En este caso, se transfectaron aproximadamente
10^{7} células BHK-21 con 10 \mug de RNA
transcrito in vitro o 10 \mug de RNA intracelular del LV
en condiciones de electroporación como las descritas por Liljeström
y Garoff (16). El medio se recogió después de 24 horas de la
transfección y fue transferido a células CL2621 para recuperar el
virus infeccioso. En las células transfectadas e infectadas se
determinó la expresión de proteínas específicas de LV mediante un
ensayo de inmunoperoxidasa en monocapa (IPMA), básicamente como
describieron Wensvoort et al., (1986). Los anticuerpos
monoclonales (Mabs) 122.13, 122.59, 122.9 y 122.17, dirigidos contra
las proteínas GP_{3,} GP_{4,} M y N (van Nieuwstadt et
al., 1996)se usaron en la IPMA para la tinción.
Aunque se ha descrito la infectividad de los RNA
transcritos in vitro con extremos 5' truncados (Davis et
al. 1989; Klump et al., 1990) generalmente se admite que
para obtener clones infecciosos se requiere toda la secuencia
viral, incluidos los extremos 5' y 3' más externos. Para clonar el
extremo 5' del genoma del LV se utilizó un procedimiento de
ligación entre un ligando monocatenario modificado y un cDNA
monocatenario (SLIC; Edwards et al., 1991). Ambos RNA
intracelulares aislados de células CL2621 infectadas por el LV y
por RNA de LV procedente de viriones purificados se sometieron a
transcripción inversa utilizando un cebador LV69 complementario al
extremo 5' de ORF1A. El primer producto de cadena cDNA se ligó a un
cebador de anclaje ALG3 cuyo extremo 3'estaba bloqueado para evitar
la autoligación. Los productos ligados se amplificaron mediante PCR
y se clonaron. Se secuenciaron doce clones derivados de RNA
intracelular de LV obtenidos de dos PCR independientes y catorce
clones derivados del RNA de virión obtenidos mediante dos PCR
independientes. De estos 26 clones de cDNA, 22 clones contenían una
extensión de 10 nucleótidos (5' ATGATGTGTA 3') en comparación con la
secuencia del DNA publicada anteriormente (Meulenberg et
al., 1993a), mientras que cuatro clones que carecían de uno a
tres nucleótidos en el extremo 5' de esta secuencia adicional (Tabla
1). Este hecho nos lleva a la conclusión de que estos 10
nucleótidos representan el extremo 5' más externo del genoma de LV y
por lo tanto se incorporaron en el clon de cDNA de longitud
genómica.
Unos clones de cDNA aislados y secuenciados
previamente (Meulenberg et al., 1993a) se unieron en los
sitios compartidos para las enzimas de restricción, de acuerdo con
la estrategia representada en la Figura 1, con el fin de construir
un clon de cDNA de longitud genómica del LV. Además se generaron
nuevos fragmentos de cDNA para ensamblar los clones de cDNA de
longitud genómica. El fragmento de cDNA correspondiente al tramo de
nucleótidos del 5168 al 6740 se creó mediante RT-PCR
para hacer posible la ligación de secuencias de cDNA de los clones
pABV5 y pABV20. Un promotor de la RNA polimerasa T7 para
transcripción in vitro se unió directamente al extremo 5'
del genoma del LV mediante PCR y este nuevo fragmento de ADNc,
clonado en pABV396, se inserto en el clon de cDNA de longitud
genómica. La resecuenciación de los nucleótidos del 3420 al 3725 en
seis clones de cDNA nuevos e independientes indicaban que en el
aminoácido 1084 del ORF1a la Leu y la Pro estaban presentes en una
proporción de 1:1. Puesto que no era posible predecir la influencia
de este aminoácido en la infectividad del RNA transcrito del clon
final de cDNA de longitud genómica, se utilizaron ambos para
construir el clon. En el extremo 3' se utilizaron dos clones
diferentes de cDNA. Los autores habían aislado previamente clones
de cDNA del extremo 3' que contenían colas de poli(A) de cómo
máximo 20 A (Meulenberg et al., 1993a). Sin embargo, en
vista de los estudios presentados sobre la longitud de las colas de
poli(A) de virus relacionados, tales como el LDV (Chen et
al., 1994), se preveía que la cola de poli(A) entera
fuera mucho más larga. Por lo tanto, se generaron clones de cDNA del
extremo 3' utilizando el cebador LV76 que contenía una secuencia de
40 residuos de T. Estos clones de cDNA se secuenciaron y contenían
secuencias de 40 a 109 residuos de A. El clon de cDNA que contenía
la secuencia de poli(A) más larga (109 residuos de A;
pABV392) se utilizó para la creación del clon de cDNA de longitud
genómica. Puesto que los tramos largos homopoliméricos podían
interferir con la replicación de los plásmidos en E. coli
(Den y Wu, 1981), los autores seleccionaron también un segundo
clon, pABV382, que contenía 45 residuos de A para su uso en
posteriores fases de la clonación. Se había observado previamente
que el mantenimiento de clones de cDNA de longitud genómica en
plásmidos de elevado número de copias da lugar a la acumulación de
mutaciones o deleciones, lo que resulta en una pérdida de
infectividad de los transcritos sintetizados a partir de estos
clones (Lai et al., 1991; Rice et al.,1987; Sumiyoshi
et al., 1992). Los autores también observaron la
inestabilidad de los plásmidos al tratar de ligar los fragmentos de
cDNA más largos de los clones pABV 331/369, 384 y 368 al extremo 5'
y 3'en pGEM-4Z y en consecuencia los autores
fusionaron finalmente estos clones entre ellos en vectores de bajo
número de copias pOK12 (Viera y Messing, 1991). Esto resultó en los
clones de cDNA de longitud genómica pABV414/415 y 416, los cuales
podían propagarse de manera estable en E. coli en las
condiciones de cultivo utilizadas. Entre los clones de cDNA de
longitud genómica que contenían 45 o 109 residuos de A no se observó
ninguna diferencia en la estabilidad.
El LV se multiplica preferiblemente en los
macrófagos alveolares porcinos. Hasta la fecha, la línea celular
CL2621 u otros clones derivados de la línea celular MA104 del riñón
del mono son líneas celulares que han demostrado que propagan el LV
(Benfield et al. 1992; Collins et al.,1992; Kim et
al., 1993). Por lo tanto, las células CL2621 se utilizaron para
determinar las condiciones óptimas para la transfección del RNA de
LV. El RNA aislado de las células CL2621 infectadas por LV se
transfectó a células CL2621 en dosis diferentes utilizando métodos
distintos, tales como la lipofectina, la lipofectamina, DEAE
dextrano y electroporación. Se realizó una determinación
sistemática del efecto citopático en las células y de halos de lisis
hasta 7 días tras la transfección, aunque estos signos de los virus
infecciosos no pudieron detectarse. Además, no se detectó ningún
antígeno específico de LV en IPMA utilizando AcM específicos para
LV. El RNA transcrito in vitro del pABV296 se utilizó como
control en estos experimentos. El plásmido pABV296 está formado por
el gen ORF4 que codifica la GP_{4} insertado en el vector de
expresión pSFV1 (Meulenberg et al., 1997). La eficiencia de
transfección del RNA de pABV296 se determinó mediante la tinción de
las células transfectadas en IPMA con AcM específicos para
GP_{4}. La eficiencia de transfección mayor, con un resultado
positivo del 0,01% de células CL2621, se obtuvo mediante
electroporación, mientras que el 80-90% de células
positivas se obtuvieron utilizando condiciones similares con
células BHK-21. Estos resultados indicaban que las
células CL2621 no eran apropiadas para los experimentos de
transfección, mientras que las células BHK-21 (no
vulnerables a la infección por el virus natural) sorprendentemente
parecían ser muy apropiadas. Por lo tanto, las células
BHK-21 se utilizaron para determinar la infectividad
del RNA del LV. Dos \mug de RNA aislado de las células CL2621
infectadas por LV se transfectaron a 10^{6} células
BHK-21 aproximadamente con lipofectina de acuerdo
con las condiciones descritas para el SFV por Liljeström y Garoff
(1993). Pasadas 24 horas tras la transfección las células se
tiñeron con el AcM 122.17 específico para LV dirigido contra la
proteína N del LV. Entre 3 y 10 células individuales produjeron una
tinción positiva, pero no se observaron centros infecciosos o halos
de lisis que sugirieran una diseminación de una célula a otra. La
transfección del RNA control transcrito de pABV296 resultó en un
60-70% de células BHK-21 positivas
utilizando estas condiciones. El sobrenadante de las células
BHK-21 transfectadas con RNA intracelular del LV y
el RNA de pABV296 se transfirieron a células CL2621. Después de
tres o cuatro días, se observaron halos de lisis en las células que
se incubaron con el sobrenadante de las células
BHK-21 transfectadas con RNA intracelular del LV,
pero no en aquellas incubadas con sobrenadante de las células
BHK-21 transfectadas con RNA de pABV296. Las placas
produjeron una tinción positiva con AcM específicos para LV en
IPMA. Se obtuvieron resultados similares al utilizar RNA aislado de
viriones purificados de LV. Aún es más, el número de células con
tinción positiva aumentó de dos a cuatro veces al transfectar las
células mediante electroporación. Estos datos indican que el LV no
puede infectar las células BHK-21, porque lo más
probable es que éstas carezcan del receptor para el LV. Sin embargo,
una vez se ha introducido el RNA genómico en las células
BHK-21, se producen nuevas partículas de virus
infecciosos y se excretan al medio. La reinfección de células
BHK-21 ya transfectadas con estas partículas, ya
sean cápsides desnudas o partículas con envoltura total o parcial,
no es posible de nuevo.
Ya que las células BHK-21
-básicamente no sensibles al VSRRP natural- fueron específicamente
apropiadas para la recuperación de virus del RNA intracelular de LV
y las células sensibles CL2621 no lo fueron, las células
BHK-21 se utilizaron para determinar si el RNA
transcrito de los clones de cDNA de longitud genómica era
infeccioso. Los plásmidos pABV414/416 se linearizaron con
PvuI y se transcribieron in vitro utilizando RNA
polimerasa T7. El sitio PvuI se localiza directamente en
dirección 3' del tramo de poli(A), de manera que el RNA
transcrito contiene dos nucleótidos no virales en el extremo 3'
(Fig. 2). Además, los transcritos deben contener una G no viral en
el extremo 5' que es el sitio de inicio de la transcripción de la
RNA polimerasa T7. Aproximadamente, se tranfectaron 2,5 \mug de
RNA transcrito in vitro a células BHK-21
junto con 2 \mug de RNA intracelular de LV como control positivo
para la subsiguiente recuperación de virus en células CL2621 y RNA
de pABV296 como control positivo para la transfección de RNA a
células BHK-21 y control negativo para la
subsiguiente recuperación de virus en células CL2621. El
sobrenadante de las células se recogió 24 horas después de la
transfección y las células se fijaron y se tiñeron en IPMA con los
AcM 122.17 específicos para la proteína N. Mientras que sólo se
observaron unos pocos resultados de células positivas en los
pocillos con las células BHK-21 que se
transfectaron con RNA intracelular de LV, se observaron entre 800 y
2700 resultados de células positivas en pocillos con células
BHK-21 transfectadas con RNA transcrito de
pABV414/415. Con el fin de comprobar si el virus infeccioso era
liberado de las células, se utilizaron los sobrenadantes para
infectar células Cl2621. Se produjeron halos de lisis en los
cultivos de CL2621 que se infectaron con el sobrenadante procedente
de células BHK-21 transfectadas con RNA intracelular
de LV y transcritos de pABV414/415. Los halos de lisis con tinción
positiva en IMPA con AcM contra las proteínas N, M, GP_{4} y
GP_{3} sugerían que todas estas proteínas se expresaban
adecuadamente. En los cultivos de CL2621 incubados con el
sobrenadante de las células BHK-21 transfectadas
con el RNA transcrito de pABV296 no se observaron halos de lisis o
tinción en IMPA. Por lo tanto, estos resultados muestran claramente
que la transfección del RNA transcrito de los clones de cDNA de
longitud genómica pABV414 y pABV416 a las células
BHK-21 da lugar a la producción y liberación de LV
infeccioso. Además, cuando los transcritos de pABV414 y pABV416 se
transfectaron a las células BHK-21 mediante
electroporación, en vez de lipofectina, se obtuvo un aumento de dos
a cuatro veces en la cantidad de células que en presencia de AcM
específicos para LV produjeron resultados positivos en la tinción.
El título de los virus recombinantes en el sobrenadante de estas
células BHK-21 electroporadas era de 10^{5}
TCID_{50}/ml, aproximadamente.
Los experimentos iniciales de transfección e
infección sugerían que los virus recombinantes recuperados,
designados vABV414 y vABV416, infectan y crecen satisfactoriamente
por igual en macrófagos alveolares porcinos, pero crecen más
lentamente en células CL2621 que el virus recuperado de las células
BHK-21 transfectadas con RNA intracelular de LV.
Este RNA intracelular de LV, que se había adaptado para el cultivo
en CL2621, se aisló de células CL2621 infectadas con LV4.2.1. Para
estudiar las propiedades del crecimiento de vABV414 y vABV416 más a
fondo se determinaron las curvas de crecimiento en células CL2621 y
en macrófagos alveolares porcinos y se compararon con las del LV
natural, del que solo se habían realizado pases en macrófagos
alveolares porcinos (TH), y con las del LV4.2.1 cultivado en
células CL2621. Las tasas de crecimiento de los dos virus
recombinantes no diferían, presentaban un crecimiento satisfactorio
equivalente, independientemente de si derivaban directamente de
BHK-21 o de más pases en macrófagos alveolares
porcinos (Fig. 3). Los títulos (7,1-7,9
TCID_{50}/ml) en macrófagos alveolares porcinos ofrecían un pico
alrededor de las 32 h postinfección, mientras que los títulos en
CL2621 crecieron más lentamente y no se registró un pico ni siquiera
a las 96 horas postinfección. El virus TH presentaba
características de crecimiento similar a las de los recombinantes.
Por el contrario, los virus LV4.2.1 adaptados a CL2621 crecían más
rápidamente en células CL2621 que los virus vABV414, vABV416 y TH
(Fig. 3). En resumen, estos resultados demuestran que las
propiedades de crecimiento de los virus recombinantes son similares
a las de los virus TH. Este hecho era de prever, ya que
la secuencia de cDNA utilizada para construir los clones infecciosos derivaba del virus TH parental "no adaptado".
la secuencia de cDNA utilizada para construir los clones infecciosos derivaba del virus TH parental "no adaptado".
Para demostrar que el clon de longitud genómica
puede utilizarse para generar virus LV mutantes se introdujo un
único sitio PacI y SwaI directamente en dirección 3'
del gen ORF7 mediante mutagénesis dirigida por PCR (Fig. 4). El
virus infeccioso se produjo cuando el RNA transcrito del clon cDNA
de longitud genómica pABV437 que contenía el sitio PacI y el
pABV442 que contenía el sitio SwaI se transfectaron en las
células BHK-21 y el sobrenadante se transfirió a
macrófagos alveolares porcinos y a células CL2621 después de 24 h
de la transfección. Los virus recuperados vABV437 y vABV442, poseían
propiedades de crecimiento similar a las del virus parental vABV414
en macrófagos alveolares porcinos y en células CL2621 (datos
omitidos). Una región específica de 0,6 kb aproximadamente
(nucleótidos entre 14576 hasta la cola de poli(A)) se
amplificó mediante transcripción inversa y PCR del RNA viral
aislado del sobrenadante de macrófagos alveolares porcinos
infectados por vABV414 y vABV416. La digestión con PacI
mostró que, de hecho, este sitio de restricción estaba presente en
el fragmento derivado de pABV437, pero faltaba del fragmento
derivado de vABV414. De forma similar se demostró la presencia del
sitio SwaI en vABV442 (datos omitidos). Los autores fueron
capaces de excluir de este modo la posibilidad de una contaminación
por el virus natural y por lo tanto confirmaron la identidad de
vABV437 y vABV442.
La ingeniería genética moderna nos permite
analizar y modificar genomas a nivel molecular y, de este modo,
adquirir una visión más profunda de su organización y expresión. En
el caso de los virus de RNA se requiere la generación de clones de
cDNA de longitud genómica, a partir de los cuales se pueden
sintetizar transcritos infecciosos. En la mayoría de los casos un
prerrequisito para la construcción de clones infecciosos es la
identificación de las secuencias terminales de los genomas virales
respectivos, que son cruciales probablemente para la replicación
del RNA viral. En un estudio previo se demostró que el LV contiene
una cola de poli(A) en el extremo 3' (Meulenberg et
al., 1993a). En el trabajo actual se determinó exactamente el
extremo 5' del genoma de LV. Aunque se han descrito varios métodos
para determinar el extremo 5' de los RNA o mRNA genómicos virales,
la mayoría de ellos tienen limitaciones importantes. Para los virus
flavivirus y pestivirus se ha utilizado un método que está basado
en la circularización del RNA genómico. Sin embargo, este método
necesita análisis adicionales para definir el borde entre los
extremos 5' y 3' del genoma. El método de amplificación rápida 5'
de los extremos del cDNA (5' RACE) se basa en la adición de una cola
homopolimérica en la primera hebra de la cadena de cDNA con una
desoxirribonucleótido transferasa terminal (TdT). Sin embargo, la
reacción de adición de la cola es bastante ineficiente y este
método requiere también análisis adicionales, ya que no se puede
concluir si el primer nucleótido de la cola representa la secuencia
viral o bien ya formaba parte de la cola añadida enzimáticamente.
Los autores han definido en este estudio el extremo 5' más externo
del genoma viral mediante la ligación de un oligonucleótido que
posee una secuencia especificada con un primer producto de
extensión de la primera cadena por el cebador y la amplificación
mediante PCR. Se encontró una extensión de diez nucleótidos
(ATGATGTGTA) en varios clones independientes con respecto a la
secuencia publicada y por lo tanto, se asumió que representaban los
nucleótidos del extremo 5' más externos del genoma viral. En
conjunto, esto da lugar a una secuencia líder de 221 nucleótidos,
similar en longitud a la secuencia líder del VAE (207 nucleótidos;
Chen et al., 1991) o SHFV (208 nucleótidos; Zeng et
al., 1995), pero más larga que la secuencia líder del LDV (155
nucleótidos; Chen et al., 1994). Sin embargo, no existe una
homología significativa entre las secuencias líder de estos
arterivirus.
El extremo 5' más externo se incorporó en el
cDNA para crear un clon infeccioso. Los problemas principales para
la generación de clones infecciosos conciernen a la estabilidad de
las secuencias del virus al clonarse en bacterias, así como a la
generación de unas terminaciones 5' y 3' correctas. Aunque los
intentos iniciales para ensamblar un clon de cDNA de longitud
genómica en pGEM-4Z fracasaron, el fragmento de cDNA
genómico del LV de 15207 nucleótidos de longitud permaneció estable
en el plásmido de bajo número de copias pOK12, y es el clon
infeccioso más largo de un virus de RNA de cadena positiva generado
hasta el momento. Los transcritos de los clones de cDNA de longitud
genómica contenían una estructura de casquete en 5', una G extra no
viral en el extremo 5' y una CG no viral en el extremo 3', aunque
estas extensiones no eliminaban su infectividad. Varios
investigadores han descrito una infección inicial reducida de RNA
transcrito a partir de clones de cDNA completo debida a secuencias
ajenas y no auténticas, ya sea en el extremo 5' o 3', o a un proceso
de encasquetamiento incompleto. Los transcritos de cDNA completo
del LV que carecían de una estructura de casquete no eran
infecciosos. Mientras que la infectividad de los transcritos de
clones de cDNA infecciosos se ha determinado siempre en líneas
celulares que son sensibles al virus, los autores fueron incapaces
de demostrar la infectividad de los transcritos a partir de clones
de cDNA de longitud genómica o RNA de LV aislado a partir de células
CL2621 mediante transfección de estos RNA a células CL2621. Este
hecho se debió a la escasa eficiencia de transfección en células
CL2621, en las que la síntesis de cadenas de RNA viral es
obstaculizada, probablemente por la interferencia o interacción de
fragmentos de RNA incompletos o proteínas de la cápside resultantes
de la reinfección de las células CL2621 por partículas defectuosas
obstructoras, tales como las cápsides desnudas que contienen
solamente fragmentos del genoma viral. Sin embargo, la transfección
de transcritos de clones de cDNA completo y de RNA intracelular de
LV en BHK-21 desembocó en la producción y liberación
de virus infecciosos, que pudieron recuperarse en células CL2621.
No es posible obtener la reinfección de células
BHK-21 mediante cápsides desnudas y por lo tanto no
se obstaculiza la síntesis de RNA viral completo. La infectividad
específica era aproximadamente de 400 a 1500 células positivas por
\mul de RNA transcrito in vitro, mientras que se
obtuvieron de 2 a 5 células positivas por \mul de RNA intracelular
de LV. Sin embargo, estas infectividades específicas no pueden
compararse, ya que sólo una fracción muy pequeña del RNA
intracelular aislado de células CL2621 infectadas por LV
representan RNA genómico de LV. Aún es más, la cantidad de RNA
genómico aislado a partir de viriones que se utilizó para las
transfecciones era demasiado pequeña para permitir una determinación
cuantitativa exacta.
Además, las células BHK-21 se
puntuaron según la producción de antígeno en IPMA con AcM
específicos para LV, que no está correlacionado necesariamente con
la producción de virus infecciosos. Este hecho era evidente debido
a que el sobrenadante de las células BHK-21
transfectadas con 2 \mug de RNA intracelular de LV contenía un
título mayor de unidades formadoras de halos de lisis, obtenido en
ensayo con células CL2621, que el sobrenadante de células
BHK-21 transfectadas con 2,5 \mug de transcrito de
clones de cDNA completo. Aunque se había demostrado previamente
para varios virus que la longitud de la cola de poli(A)
influía en la infectividad de los tránscritos virales (Holy y
Abouhaidar, 1993; Sarow, 1989), no se observó ninguna diferencia en
la infectividad entre transcritos de clones de cDNA genómico que
contenían una cola de 45 o 109 residuos. Sería posible que una cola
de 45 residuos de A estuviera por encima del límite de longitud por
debajo del cual la estabilidad de los transcritos correspondientes
se altera. Los autores encontraron una diferencia entre clones en el
aminoácido 1084 del ORF1a, produciendo Pro y Leu en una proporción
de 1:1. Este aminoácido no tenía influencia sobre la infectividad,
ya que los transcritos de clones de cDNA completo que contenían este
codón para Leu o Pro no manifestaban ninguna diferencia en la
infectividad de células BHK-21.
El clon infeccioso de longitud genómica se
utilizó para generar un virus quimérico que expresara la proteína
de la nucleocápside de la cepa ATCC VR2332 del VSRRP. Además, el
clon infeccioso de longitud genómica se utilizó para generar un
virus quimérico que expresara la proteína de la nucleocápside del
virus LDV del ratón. Los virus quiméricos pueden diferenciarse de
los virus parentales empleando AcM, puesto que estos primeros no
producen una tinción con anticuerpos monoclonales específicamente
reactivos a la proteína N (ORF7) de la cepa Ter Huurne del VSRRP.
Aún es más, el virus quimérico, en el cual la proteína N de VSRRP se
substituye por la proteína N de LDV, no es reactivo a los
anticuerpos del cerdo en fase convaleciente reactivos a la proteína
N del VSRRP. Ya que todos los cerdos infectados por el VSRRP
desarrollan anticuerpos dirigidos contra la proteína N del VSRRP,
los virus quiméricos se utilizarán en proyectos futuros que usen
bacterias vivas nuevas contra VSRRP y usen este virus como sistema
vector dirigido específicamente hacia su célula huésped, el
macrófago alveolar de los pulmones. A este respecto, debe
mencionarse que los intentos iniciales de conferir protección con
virus muertos o subunidades recombinantes defraudaron. Hasta la
fecha, la única vacuna efectiva contra el SRRP disponible es una
vacuna viva modificada, basada en una cepa estadounidense (Gorcyca,
et al., 1995).
Sin embargo, los cerdos vacunados con este
producto vivo modificado no pueden discriminarse de los cerdos
infectados por el virus salvaje. El clon infeccioso del VSRRP provee
de este modo la llamada vacuna marcadora mediante la mutagénesis
dirigida del genoma, tal que los cerdos vacunados pueden ser
distinguidos de los cerdos infectados por virus salvaje atendiendo
a la diferencia en los anticuerpos séricos.
El clon infeccioso del LV descrito aquí es el
clon infeccioso más largo desarrollado de un virus de RNA de cadena
positiva y el primero de la familia Arteriviridae. La
generación de este clon infeccioso del VSRRP abre nuevas
oportunidades para los estudios dirigidos a la patogenia, tropismo
por el huésped, replicación y transcripción del virus. Los
arterivirus y coronavirus comparten un mecanismo de transcripción
específico al que se hace referencia también como "leader
primed transcription", que incluye la generación del llamado
conjunto anidado de RNA subgenómicos que contienen un líder 5' común
(Spaan et al., 1998; Plagemann y Moennig, 1991). Esta
"leader primed transcription" es un proceso complejo,
que todavía no se entiende totalmente. Los estudios de los
virólogos sobre coronavirus para elucidar el mecanismo subyacente
de la "leader primed transcription" se limitan a
análisis y mutagénesis dirigida de cDNA de RNA defectuosos
obstructores, ya que el gran tamaño del genoma (28 a 30 kb) ha
impedido la construcción de un clon infeccioso. El clon infeccioso
del VSRRP es útil como sistema modelo para estudiar y averiguar el
fascinante mecanismo de la transcripción y la replicación de
arterivirus y coronavirus.
Los clones infecciosos derivados del VSRRP
pueden también utilizarse como un sistema de administración o como
vector vírico vacunal para antígenos foráneos insertados en el
genoma de VSRRP, ya que el virus infecta macrófagos y células
precursoras de los macrófagos en la médula ósea y otras células del
sistema inmunitario, y distribuye el virus que contiene el antígeno
a través de su progenie celular. En el ejemplo específico de
antígenos que contienen fragmentos del ORF7 o proteína N de
Arterivirus o de VSRRP, estos antígenos serán
(sobre)expresados en la parte externa de la membrana celular
de la célula infectada, y por ello mejoran la respuesta inmunitaria.
Tales efectos de refuerzo del sistema inmunitario producirán una
inmunidad frente a patógenos de por vida (debido a la estimulación
continua a bajo nivel). Es posible utilizar el virus como un
portador de antígeno mediante la construcción de la información de
epítopos o de otros organismos patógenos o sustancias en su
interior. Varios virus del SRRP modificados portadores de
información de epítopos foráneos pueden mezclarse y administrarse
en una sola vez. Esto da lugar a la inmunidad activa contra varios
epítopos diferentes de un patógeno, o a la inmunidad activa contra
varios patógenos diferentes. La seguridad de las vacunas del VSRRP
modificado (tales como las no desechables) puede asegurarse mediante
la eliminación de la información de aquellas proteínas virales
necesarias para producir virus infecciosos con envoltura. Este virus
debe propagarse en una línea celular que exprese de forma
constitutiva esa proteína de la envoltura. Los virus que se replican
en esta línea celular complementaria poseen una envoltura completa
y pueden infectar macrófagos en el cerdo. Después de un ciclo de
replicación, los virus de la progenie, al carecer de la información
para la proteína de la envoltura, ya no son capaces de infectar a
otras células como un virus con envoltura completa. La infección de
macrófagos en el cuerpo todavía es posible en forma de cápsides
desnudas. De esta manera, la vacuna controlará la infección en el
animal que ha sido vacunado y no se propagará a otros animales.
Figura 1. Construcción de un clon de cDNA de
longitud genómica del LV. La parte superior (A) muestra la fusión
entre los clones de cDNA, que se han secuenciado previamente
(Meulenberg et al., 1993a) en pGEM-4Z. Se
indican los números de pABV de los clones y los sitios de
restricción que se utilizaron. Los recuadros negros representan
aquellas partes de los clones de cDNA que se fusionan en la
siguiente fase de clonación. Los recuadros de color gris claro,
indicados con R.T., son clones de cDNA nuevos generados mediante
RT-PCR; el recuadro gris oscuro representa un clon
de cDNA nuevo generado mediante PCR. La parte inferior (B) muestra
el ensamblaje de los clones de cDNA de mayor tamaño pABV331/369,
pABV384 y pABV368 con el clon del extremo 5' pABV396, que contiene
un promotor de la RNA polimerasa T7, y el clon del extremo 3'
pABV395, que contiene una cola de poli(A), en el vector de
bajo número de copias pOK12. Se indican los sitios de restricción
dentro y fuera del sitio de clonación multiple de pOK12. Los sitios
de restricción para la endonucleasa son los siguientes: A,
ApaI; Ap, ApoI; B, BamHI; Bg, BglII;
Bs, BspE1; Bc, BclI; E, EcoRI; Ec,
EcoRV; H, HindIII; K, KpnI; N, NarI;
Nc, NcoI; S, SacII; Sp, SpeI; Sa, SalI;
Sc, ScaI; P, PstI; Pm, PmlI; X, XbaI;
Xh, XhoI.
Figura 2. Secuencias terminales de cDNA completo
del LV y RNA infeccioso transcrito de este clon de cDNA. Se
linearizaron clones de cDNA de longitud genómica con PvuI y
se transcribieron en presencia del análogo sintético de casquete
m^{7}G(5')ppp(5')G con la RNA polimerasa T7. El RNA
resultante debe contener un nucleótido (G) extra en el extremo 5' y
dos nucleótidos extra (GC) en el extremo 3'. Las flechas en el RNA
indican los nucleótidos terminales 5'y 3' que corresponden a la
secuencia de RNA del LV auténtica.
Figura 3. Curvas de crecimiento del virus
natural TH del LV, LV4.2.1, y de los virus recombinantes vABV414 y
vABV416 en macrófagos alveolares porcinos (A) y células CL2621 (B).
Los virus recombinantes vABV414 y vABV416 producidos en células
BHK-21 se utilizaron directamente (BHK), o se
utilizaron después de la multiplicación en macrófagos alveolares
porcinos (PAM), mientras que el LV4.2.1 se preparó en células CL2621
(CL). Los cultivos celulares se infectaron con los virus indicados
a una MOI (multiplicidad de infección) de 0,05 y se recogieron en
los intervalos de tiempo indicados. Los títulos de virus
(TCID_{50}/ml) se determinaron en macrófagos alveolares porcinos
o células CL2621 mediante diluciones finales.
Figura 4. Introducción de un único sitio
PacI y SwaI en el clon de cDNA infeccioso de LV. Los
sitios PacI y SwaI se crearon mediante mutagénesis
dirigida por PCR, como se describe en detalle en Materiales y
Métodos. Los fragmentos de cDNA que contienen los sitios PacI
y SwaI se intercambiaron en pABV414 usando sus sitios únicos
HpaI y XbaI, los cuales se indican. Esto dio como
resultado pABV437 y pABV442, respectivamente.
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\vskip1.000000\baselineskip
- 1)
- Los clones que se muestran representan secuencias adicionales aisladas y secuenciadas previamente, que no se encontraban en los clones de cDNA (Meulenberg et al., 1993a).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Edelhertweg 15
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Lelystad
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROVINCIA: Lelystad
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: HOLANDA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL (ZIP): 8219 PH
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Johanna Jacoba Maria Meulenberg
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Laagte Kadijk 17B
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Amsterdam
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROVINCIA: Holanda Septentrional
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Holanda
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1018 BB
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Johannes Maria Antonius Pol
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Jol 30-05
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Lelystad
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- REGIÓN: Lelystad
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Holanda
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 8243 HA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Bos-de Ruijter, Judy Norma Aletta
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Pymient Hof 45
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Almere-Buiten
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Holanda Septentrional
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Holanda
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1339 HD
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Clones infecciosos de virus de RNA y vacunas y ensayos diagnósticos derivados de éstos.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 22
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO DE LECTURA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO: disquete extraíble
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con ordenador IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: NÚMERO DE SOLICITUD: NL PCT/NL97/00593
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACAGGTGCC TGATCCAAGA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACGAATTCA CTATCGATTC TGGATCCTTC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGTCGTCGA CGGGCCCCGT GATCGGGTAC C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGGATCCA GAATCGATAG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTAGGAATT CTAGACGATC G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTAGGAATT CTAGACGATC GT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE ID. DE SEC. NÚM.: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGTGGTTA ACCTCGTCAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGGAATCTA GATCTCACGT GGTGCAGCTG CTG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCAACACC TGTGCAGACC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCCTTCTCT GGCGCATGAT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTACTGGTAC CGGATCCGTG AGGATGTTGC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATTCACTA GTTAATACGA CTCACTATAG ATGATGTGTA GGGTATTCC
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID DE SEC. NÚM.: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGTGGTTA ACCTCGTCAA GTATGGCCGG TAAAAACCAG AGCC
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATTCACCT GACTGTTTAA TTAACTTGCA CCCTGA
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGGGTGCA AGTTAATTAA ACAGTCAGGT GAATGG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTGACTGTC AATTTAAATT GCACCCTGAC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCAGGGTGC AATTTAAATT GACAGTCAGG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGATGTGTA
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGATGTGTA GGG
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGATGTGTAG GG
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGTGTAGG G
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGTGTAGGG
\hfill10
Claims (14)
1. Un método para generar un clon infeccioso en
base al genoma de un virus de RNA de cadena positiva de la familia
Arteriviridae, dicho método comprende la producción de un
ácido nucleico recombinante que consta al menos de una copia
completa de DNA o una copia de RNA transcrito in vitro de
dicho virus de RNA de cadena positiva, además de la selección de
clones infecciosos mediante la transfección de una célula huésped
con dicho ácido nucleico recombinante, en que dicha célula huésped
no es vulnerable a la infección por dicho virus.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en que dicha célula huésped es una célula
BHK-21.
3. Un ácido nucleico recombinante que comprende
un clon infeccioso que es un clon infeccioso de cDNA obtenido
mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1 o 2.
4. Un ácido nucleico recombinante de acuerdo con
la reivindicación 3, en que dicho virus es el VSRRP.
5. Una molécula de ácido nucleico que comprende
un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en el
se ha modificado una secuencia de ácido nucleico que codifica un
marcador de virulencia o un marcador serológico.
6. Una molécula de ácido nucleico recombinante
de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la secuencia de ácido
nucleico que codifica dicho marcador se ubica dentro de cualquiera
de los marcos abiertos de lectura que codifican proteínas virales
estructurales.
7. Una molécula de ácido nucleico recombinante
de acuerdo con la reivindicación 6, en el que uno de los marcos de
lectura es el ORF7 de cualquier miembro de la familia
Arteriviridae.
8. Una molécula de ácido nucleico recombinante
de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, en la que un ORF7 de la
familia Arteriviridae sustituye a un marco abierto de
lectura.
9. Una molécula de ácido nucleico recombinante
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 5 a la 8,
en la que se inserta al menos una secuencia de ácido nucleico
heterólogo adicional.
10. Una molécula de ácido nucleico recombinante
de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicha secuencia de
ácido nucleico heterólogo codifica un antígeno.
11. Una molécula de ácido nucleico recombinante
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 5 a la 10,
en la que se ha modificado un marco abierto de lectura.
12. Un virus de RNA modificado derivado de un
ácido nucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 5 a la 11.
13. Una vacuna que comprende un virus de RNA
modificado de acuerdo con la reivindicación 12.
14. Una célula infectada con un virus de RNA de
acuerdo con la reivindicación 13.
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