CN101454442A - 嵌合体prrsv的构建，组合物及疫苗的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供北美猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的嵌合复制子，该复制子包括PRRSV的无毒株的5’序列和PRRSV的有毒株的3’序列。另外还提供一种通过嵌合复制子制备减毒PRRSV的方法。此外也提供一种包含复制子或减毒病毒的组合物。同样也提供疫苗以及对猪进行预防接种使其免于感染PRRSV的方法。

Description

嵌合体PRRSV的构建，组合物及疫苗的制备
技术领域
[0001]本发明涉及分子病毒学。特别地，本发明包括减弱猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的毒性的方法以及包含减毒PRRSV的病毒组合物。
背景技术
[0002]猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)是经济上影响养猪业的最显著的疾病，该病毒导致美国每年约56亿美元的损失。该疾病的初级症状是母猪及小母猪的繁殖问题，包括晚期流产，死胎和木乃伊胎，以及自出生时已被感染(born viremic)并通常无法存活的小型体弱幼猪。另外，幼龄猪的症状表现为呼吸疾病，该呼吸疾病导致发烧，嗜睡，呼吸困难，食欲低，生长缓慢及偶发性死亡，并通常结合其他呼吸性病原体。无论是通过自然交配还是人工受精，感染公猪的精液都可以将疾病感染给母猪及小母猪。
[0003]PRRSV，上述症状的祸端，同样也与引发一些其他的猪类疾病，例如多系统衰竭综合症(PMWS)，猪呼吸综合症(PRCD)的病原体交织在一起。猪呼吸综合症是由PRRSV引起的免疫抑制而导致的，PRRSV针对(targets)宿主免疫系统的巨噬细胞。
[0004]PRRSV属于动脉炎病毒科，其与冠状病毒科同属套式病毒目。PRRSV为正链RNA病毒，其由7到10个开放阅读框(ORFs)编码并且侧面有5’和3’末端非翻译区(UTRs)。据认为UTRs包含顺式调控元件以使染色体组和亚基因组RNA进行复制和转录。PRRSV病毒粒子由六个结构蛋白(由第2至第7个ORFs编码)组成。ORF5的产物在病毒进入细胞的过程中扮演很重要的角色并且可以模拟中和免疫。ORF5序列表现为染色体中最可变的区域(the most variableregion)，其有助于形成病毒的不同的遗传变异和抗原变异。PRRSV的遗传变异性使研制抗PRRSV及其相关症状的有效的疫苗变得更为复杂。
[0005]现有商用PRRSV疫苗，包括减毒活疫苗和灭活病毒疫苗。不幸的是，这些疫苗在进行预防接种的牲畜体内无法显示足够的免疫保护。减毒活疫苗的安全性也同样被本领域质疑。另外，现有的疫苗对基因多样性PRRSV株的异源攻击(heterologous challenge)提供很低的保护。此外，现有的疫苗无法区分自然感染和疫苗株系。急需在安全、功效及识别方面都具备重大改善的疫苗。
[0006]在细胞培养传代过程中，病毒毒性的减弱在很多方面逆向影响了源于减毒病毒的疫苗的功效。一方面，疫苗病毒的复制能力在适应度选择(fitness selection)下受到影响。另一方面，由于RNA病毒的高突变速度，通过细胞培养而产生的高度弱化形成了抗原变异。因此，传统的疫苗并没有针对其他形式的遗传变异(diversified)PRRSV分离株的交叉保护。需要一种减毒病菌，其具有生长的特点和抗原能力以针对PRRSV的同源株系和异源株系进行保护。
发明内容
[0007]发明人发现了PRRSV染色体组中编码PRRSV的毒力因子的区域。该发现为发明人研制弱化PRRSV的分离毒性株系的新方法提供了基础。在该方法中，使用无毒性株系的相应区域置换病毒的毒性区域以制备嵌合病毒。该嵌合病毒在宿主动物中是非致病性的，但其可刺激对同源和异源PRRSV攻击的保护性免疫应答。该方法提供了可供选择的连续传代(serially-passaged)减毒病毒疫苗。与传统疫苗的不同之处在于，此处所描写的疫苗组合物针对变异的PRRSV分离株具有交叉保护。
[0008]在一个方面，本发明提供一种嵌合PRRSV复制子。该复制子包含一个来自PRRSV的非毒性株系的5’序列和一个来自PRRSV的毒性株系的3’序列。5’序列包括ORF1，ORF2，一部分的ORF3，或其组合，3’序列包括了使得复制子可以形成相对毒性株系来说弱化的感染性病毒颗粒的充分完整的基因组。
[0009]在另外一个方面，本发明提供一种制备感染性减毒嵌合PRRSV的方法。该方法包括用复制子转染细胞，该复制子包含来自PRRSV的无毒性株系的5’序列和来自PRRSV的毒性株系的3’序列。5’序列包括ORF1，ORF2，一部分的ORF3，或其组合，3’序列包括使得复制子可以形成感染性病毒颗粒的充分完整的基因组。该方法还包括在适宜于制备感染性病毒颗粒的条件下培育细胞及回收(recovering)病毒颗粒的步骤，在此，回收的病毒相对PRRSV的毒性株系来说毒性有所弱化。
[0010]在其他方面，本发明包括通过上述方法制备而成的减毒病毒，包含减毒病毒或复制子的组合物，以及包含该组合物的疫苗。
[0011]本发明的其他方面通过详细说明以及附图变得清楚明了。
附图说明
[0012]图1为嵌合PRRSV复制子的结构的示意图，该复制子包含遗传标记(PSA)，来自克隆pB13117的5’序列，一个来自PRRSV的毒性野分离株(a virulent field isolate)的3’序列。
[0013]图2为柱状图，其显示了接种后第49天由PRRSV感染而导致的总体的(in gross)肺部损伤的减少，其中用PRRSV毒性株系(NADC-20或MN184)攻击使用本发明的嵌合病毒“PRRSPTK-3”和作为对照的非毒性株系ptkPRRS对猪进行过预防接种的猪体内。
[0014]图3显示了使用本发明的嵌合病毒“PRRSPTK-3”和非毒性株系ptkPRRS进行预防接种的猪的血清内PRRSV-特异性抗体随着时间通过S/P值的增长有所增加。
[0015]图4A显示使用本发明的嵌合病毒“PRRSPTK-3”与非毒性株系ptkPRRS的组合对猪进行预防接种，相比未经过预防接种的猪，经过预防接种的猪随着时间的增长重量增加较多。
[0016]图4B是柱状图，其显示了使用本发明的嵌合病毒“PRRSPTK-3”和非毒性株系ptkPRRS的组合对猪进行预防接种之后感染毒性株系PRRSV而引起的重量增长。
[0017]图5显示了随着时间的增长使用本发明的嵌合病毒“PRRSPTK-3”和非毒性株系ptkPRRS的组合进行预防接种的猪的体温，以及未经过预防接种的猪的体温。
具体实施方式
[0018]本发明涉及用于制备减毒感染性PRRSV嵌合体的嵌合PRRSV复制子。另外，本发明涉及制备该种株系的方法以及该种株系在疫苗中的应用。在此所述的“PRRSV复制子”为DNA分子或RNA分子，或者可以从一个复制源点进行复制的DNA或RNA区域，例如，质粒，cDNA克隆或载体。术语“复制子”包括经由体外技术从PRRSV病毒染色体RNA而形成的cDNA，通过染色体RNA反转录获得的cDNA、具有该cDNA的载体、通过RT-PCR或限制性核酸内切酶消化而形成的cDNA片段以及包含合成的编码序列或非编码序列的重组核酸序列。该复制子可以进行体内RNA复制并形成感染性PRRSV病毒颗粒。通过宿主细胞RNA聚合酶体外或体内转录的复制子可以完成宿主细胞内的病毒性感染性循环(viral infectious cycle)。
[0019]该复制子包括来自PRRSV的非毒性株系的5’序列和来自PRRSV的毒性株系的3’序列。“PRRSV的非毒性株系的5’序列”指与SEQ ID NO：1中前13117个碱基对相同或相应的序列的任一部分。例如，对于SEQ ID NO：1，ORF1a跨越核苷酸192-7798，ORF1b跨越核苷酸7797-12181，ORF2跨越核苷酸12183-12953，并且ORF3的部分序列跨越核苷酸12806-13117。本领域认为，如果使用其他的PRRSV的非毒性株系，OFR1-3的序列可以不同。5’序列适宜源自任何减毒PRRSV株系中，例如ptkPRRS(SEQ ID NO：1)，ptkPRRS-1(SEQ ID NO2)，美国专利6,841,364中所述的非毒性株系，表现出弱化毒性的连续传代株系，或者其他本领域已知的非毒性株系。3’序列从毒性株系中得来，例如，CSFV野生分离株(field isolated)PRRSV，3’序列为嵌合体提供所有必须的序列以制备感染性病毒颗粒，即，其完整的基因组。通过已知的方式从感染的猪的血清中分离出来的株系是合适的毒性株系。例如包括被命名为“MN-184”，“NADC-20”和VR-2332的株系。
[0020]病毒的毒性意为病毒和其它与其密切相关的病毒比较，其在宿主中产生致病性的能力。对于PRRSV来说，“毒性”株系引发疾病，例如，流产，早衰(early furrowing)，增加的死产量，木乃伊胎，断奶前死亡(preweaning mortality)，感染母猪的不育，总的肺部损害和肺炎，哺乳期和生长期的猪的死亡率的增加，以及对二级感染易感性的增加。“非毒性”株系意为毒性已经减弱的株系，例如，与毒性株系相比，减少了猪被PRRSV感染而引起的症状。适宜地，通过与对照比较，根据总的组织病理学改变(例如，肺部损伤)的减少和/或疾病症状的减轻来评价非毒性株系的毒性弱化的程度。PRRSV的症状包括，但不局限于，例如发烧，呼吸困难，嗜睡，用力呼吸(forced expiration)，打喷嚏，咳嗽，双眼浮肿，或粗糙的毛发。评价症状的方法已为本领域所知。可以通过肺部损伤的减轻，如下列实施例中所述，来测量PRRSV毒性株系的弱化程度。适宜地，相对于未接种控制(non-vaccinated control)，肺部损伤的数量减少至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少100％，至少200％。
[0021]嵌合体的毒性可以被合适地与PRRSV的毒性“亲本”株相比，并且毒性减少的克隆可以被选为合适的疫苗候选。例如，通过如实施例8中所述的方法，例如检查被嵌合PRRSV株系感染的猪的肺部损伤、生长性能、血清转化现象和体温，比照野生分离株(field isolate)测量嵌合PRRSV的毒性。也可以采用任何其他合适的测量毒性的方法。
[0022]PRRSV嵌合体包括5’和3’序列，该5’序列和3’序列的结合完成了全长的感染复制子(infectious replicon)，例如，ORF1-7。当然，完整的感染复制子可能包括插入或缺失，该插入或缺失不影响复制子形成感染颗粒的性能，并且这些插入和缺失会在不影响功能的前提下改变完整复制子中核苷酸的数量或序列。例如，如果来自非毒性株系的5’序列包括5’不翻译区域(UTR)，ORF1a和ORF1b，那么来自野生分离株(field isolate)的3’序列就包括ORF2-7和3’UTR形成完整复制子的序列。另外一个例子，如果5’序列编码与SEQ ID NO：1相应的完整序列的核苷酸1-8000，那么3’序列就包括核苷酸8001-15521。5’和3’序列的任何结合都可被构建，所形成的嵌合体的毒性可以通过标准方法进行测量。“衍生自”参考序列的序列意为使用毒性或非毒性PRRSV的分离株作为模板的合成肽或聚核苷酸或通过分子生物方法形成的序列。
[0023]美国专利6,841,364中描述了制备PRRSV的非毒性感染克隆的方法，将其全部内容引入本文作为参考。该专利描述其他的克隆的同时还描述了ptkPRRS(SEQ ID NO：1)。下列实施例描述了复制子的构造，复制子可以形成减毒PRRSV，该减毒PRRSV部分基于其序列。然而，当然可以使用PRRSV的毒性和非毒性株系的任意结合进行操作，使得在最终形成的PRRSV的嵌合体中获得所需的特性。最终形成的嵌合复制子包括所有制备感染性病毒颗粒所必需的核苷酸和氨基酸，例如ORF1-7。当然，本发明的复制子可为任意长度，并包括插入或缺失，该插入或缺失并不影响复制子制备感染性病毒颗粒的能力。“感染性”病毒颗粒为具有进入细胞并在细胞内复制所必需的所有组合物的病毒。
[0024]另外，PRRSV复制子进一步适宜包含遗传标记序列。“遗传标记序列”为可以在不改变病毒基因表达的情况下插入PRRSV基因组的序列，该序列可以用于识别复制子或子代病毒。标记序列的识别适宜通过本领域已知的序列的分离及接下来的测序或限制酶消化和片段可视化技术得以完成。应了解，本发明的PRRSV的DNA的基因修饰可被用作区分工程PRRSV与分离株或商业疫苗株系的方法。为了进行晚期的区分，可通过合适的方法将遗传标记序列加入工程复制子中。设想的特殊实施方案包括遗传标记的PRRSV复制子，该复制子包含由ORF5中的替换所形成的MluI位点，由3’UTR中的插入所形成的NdeI位点，由ORF1和ORF2的接合处(junction)的插入或ORF7的3’端或ORF2的5’部位或ORF4的中间部位中序列的缺失所形成的PacI、SwaI、AscI或VspI位点，如美国专利6,841,364中所述。在本发明的操作中，任何合适的限制性消化位点或多接头(polylinker)都可用于“标记”嵌合PRRSV DNA。
[0025]在另外一个实施方案中，本发明提供包含上述复制子的细胞。该细胞不限于任何特殊的细胞类型，但是其必须可以表达复制子以在合适的条件下制备感染性RNA或病毒颗粒。该细胞可以是许可的细胞(permissive)和/或易感细胞(susceptible)。“许可的”细胞是可以被病毒利用的，在引入病毒RNA或感染性cDNA之后进行复制并形成病毒颗粒的细胞。许可的细胞可能有也可能没有对于病毒的细胞表面受体。另一方面，“易感”细胞是具有对于病毒的细胞表面受体，并且其可被病毒利用以完成增殖和感染的多重周期(multiple cycles)。例如合适的细胞包括，但不局限于，猿细胞系和猪细胞。猿肾脏细胞株适用于体外使用。这些细胞株，非洲绿猴连续细胞株(African GreenMonkey continuous cell line)MA-104，及其子代细胞系(progeny line)Marc145可以商业获得。PRRSV显示出对肺泡巨噬细胞在体内的向性(tropism)，并且这些细胞同样适合PRRSV在体外的扩增(multiplicity)。
[0026]在另外一个实施方案中，本发明提供制备减毒感染性PRRSV病毒的方法。该方法包括下列步骤：通过上述复制子转染细胞，在适宜制备感染性病毒颗粒的条件下孵育细胞，以及回收病毒颗粒。复制子在体外进入细胞的传送方式(delivery methods)已为本领域所知，其包括，但不局限于，转染(包括显微注射，电穿孔，磷酸钙沉淀、使用二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)之后再使用聚乙二醇，direct sonic loading，脂质体介导转染和受体介导转染)，通过病毒载体的转导，和/或任何上述方法的结合。可以从细胞中回收病毒颗粒的方法已为本领域所知，例如，实施例5中的方法。细胞在允许复制子表达的条件下培养。具有代表性的，标准的培养条件是可行的(sufficient)。
[0027]在另一个实施方案中，从嵌合复制子制备而来的减毒病毒与PRRSV的毒性株系具有相似的生长动力学。可以在滴度(titer)处于参考株系的10％范围之内时，通过测量随时间变化的病毒滴度(titer)在体外监控病毒的“实质相同的生长动力学”。嵌合病毒的生长动力学很适合与衍生嵌合体的毒性株系比较(compared to)。
[0028]包括嵌合复制子或减毒病毒的组合物也属于本发明的范畴。具有代表性的，该组合物包括复制子或嵌合病毒和生理上可接受的载体(physiologically acceptable vehicle)。“生理上可接受的”载体为任意适合体内给药(administration)(例如，口服，经皮的或非胃肠道的给药)或例如细胞培养的体外应用的载体。适用于体内给药的生理上可接受的载体包括，水、缓冲溶液和葡萄糖溶液等等。适用于细胞培养的载体为商用细胞培养基。组合物中除了生理上可接受的载体和复制子或减毒病毒之外，附加成分适宜包括赋形剂(excipients)，例如稳定剂，防腐剂，稀释剂，乳化剂或润滑剂。特别地，合适的赋形剂包括，但不局限于，Tween 20，DMSO，蔗糖，L-组氨酸，聚山梨醇酯20和血清。
[0029]本发明的一些实施方案提供在哺乳动物中激发免疫应答的方法。哺乳动物优选猪种。“激发免疫应答”包括，但不局限于，诱导治疗作用或预防作用，该治疗作用和预防作用通过哺乳动物的免疫系统调节(mediated)。更加特别地，在本发明中，激发免疫应答涉及诱发细胞免疫应答和体液免疫应答，从而诱导下游作用(downstreameffects)，例如抗体的产生、抗体重链种类转换，APCs的成熟，以及溶细胞性T细胞、T辅助细胞、T记忆细胞以及B记忆细胞的刺激。根据本发明，与毒性株系相比，通过嵌合病毒刺激的免疫应答更适宜促进哺乳动物症状的减少。
[0030]据技术人员所了解，组合物的配制适宜与其给药途径一致。合适的给药途径的例子包括胃肠外，例如静脉注射，皮内注射，皮下注射；口服(例如吸入)；经皮(局部)；透粘膜给药；以及直肠给药。对于猪的合适的给药途径是肌肉注射。胃肠外，皮内注射或皮下注射所使用的溶液或悬浮液可以包含下列成分：经消毒的稀释剂例如注射用水，盐溶液，难挥发(fixed)油，聚乙二醇，丙三醇，丙二醇或其他的合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；络合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如醋酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节肌肉张力的试剂例如氯化钠或右旋糖。可以通过酸或碱调节组合物的pH值，例如盐酸或氢氧化钠。也可以通过透粘膜给药(transmucosal)的方法或经皮给药(transdermal)的方法实现组合物的全身给药。对于透粘膜给药或经皮肤给药，在配制过程中需要使用适用于渗透屏障(barrier)的渗透剂(penetrants)。该渗透剂已为本领域广泛所知，其包括，例如对于透粘膜给药，去污剂，胆汁盐，以及夫西地酸的衍生物(fusidic acid derivatives)。可以通过使用鼻喷雾法或栓剂实现透粘膜给药。
[0031]本发明的组合物适合配制(formulated as)疫苗。本处所述的“疫苗”意为，在向一个对象给药时，可以诱导所述的细胞免疫应答或体液免疫应答的组合物。疫苗的效果可以通过与未经过预防接种或在使用野生分离株(field strain)攻击前经过负对照(negative control)给药的相似的猪做比较，如下列实施例中所述，根据总的组织病理学改变(例如，肺部损伤，心肌炎，淋巴腺炎，脑炎和鼻炎)的减少和/或疾病症状的减轻来评价。PRRSV的症状包括，但不局限于，例如，发烧，呼吸困难，嗜睡，用力呼吸，打喷嚏，咳嗽，双眼肿胀，或者粗糙的毛发。疫苗的效果可以通过肺损伤的减少进行检测。适宜的，相对于未接种对照(non-vaccinated control)，肺部损伤的数量减少至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少100％，至少200％。
[0032]合适的疫苗组合物包括根据本发明制备的感染性PRRSV复制子，或RNA，或从感染性PRRSV复制子体外制备的抗原肽。另外，合适的疫苗组合物还包括使用本发明的复制子制备的减毒全活(whole live)病毒。合适的疫苗还包括两种或多种使用本发明的复制子制备的活的减毒嵌合病毒(whole live attenuated chimeric viruses)的组合。疫苗组合物可能包含水介质(aqueous medium)，药学可接受的(pharmaceutically acceptable)惰性赋形剂(inert excipient)例如乳糖、淀粉、碳酸钙和柠檬酸钠。疫苗组合物可能也含有佐剂，例如福氏(Freud’s)佐剂。疫苗可以单独给药，也可以与适用于猪给药的生理上可接受的载体组合给药。疫苗可以口服，非胃肠道给药，肌肉内注射，鼻内给药或静脉注射。口服可能包括，例如，将组合物添加至哺乳动物的饲料或饮用水中。决定疫苗用量多少的因素包括，例如，哺乳动物的体重和年龄。通过非胃肠道给药或静脉给药的组合物也可能包含乳化剂或悬浮剂或稀释剂以控制疫苗的给药和剂量。疫苗适宜以每次约1×104至1×106个病毒粒子通过肌肉内注射给药。
[0033]下列实施例有助于对本发明进行更深的理解。其中所述的特殊的材料和条件仅以对本发明进行进一步说明使用，并不限制其合理范围。
实施例
[0034]实施例1.在感染性非毒性PRRSV克隆中添加遗传标记序列。
将遗传标记，PacI/SwaI/AscI(PSA)多接头(polylinker)(SEQ IDNO：3)在不改变病毒基因表达的条件下插入病毒基因组ORF1b与2之间，以此鉴别PRRSV野生分离株中的疫苗病毒。使用ptkPRRS克隆(SEQ ID NO：1，见美国专利6,841,364)构建修饰的病毒基因组。使用下列两个引物对进行PCR扩增，SF7682/PSA1R(SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：5)和PSA2F/Sp2R(SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：7)。使用限制性核酸内切酶PmeI/PacI和PacI/XhoI分别消化所得到的PCR产物，使用琼脂糖凝胶对其进行纯化。使用PmeI和XhoI消化ptkPRRS质粒DNA并使用琼脂糖凝胶对其进行纯化。使用消化的质粒DNAptkPRRS，SF7628/PSA1R片段和PSA2F/Sp2R片段进行连接反应。新形成的重组感染性克隆被称作ptkPRRS-1(SEQ ID NO：2)，其中PSA多接头位于ORF1和ORF2之间。为了确认遗传标记的存在，使用下列引物对进行PCR扩增，PSA多接头/SR12709(SEQ ID NO：8/SEQ IDNO：9)。另外，使用限制性核酸内切酶PacI，AscI和SwaI消化重组的质粒DNA并验证修饰的PRRSV，ptkPRRS-1，在病毒基因组中包括遗传标记PSA。
[0035]实施例2.在pBluescript SK(+)中亚克隆PRRSV的非毒性株系的5’序列(13117bp)。
构建克隆ptkPRRS-1的亚克隆，通过使用ptkPRRS-1中唯一的限制性核酸内切酶位点SpeI除去病毒基因组中的3’端。使用NotI和SpeI消化克隆ptkPRRS-1的质粒DNA，在琼脂糖凝胶上对含有ORF1，ORF2和ORF3的部分序列(13117bp，SEQ ID NO：10)的5’端片段进行纯化。将纯化的片段克隆至质粒载体pBluescript SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA)中。该重组克隆被称作pB13117，其被用于作为主要成分构建PRRSV的嵌合感染性克隆的骨架。
[0036]实施例3.在载体pCR-Blunt中亚克隆PRRSV的野生分离株的3’序列。
使用QIAamp病毒RNA试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从猪血清或细胞培养物上清液中提取病毒RNA。将猪血清和病毒感染的细胞培养物上清液和带有RNA的AVL缓冲液添加至微离心分离管(560μl的AVL缓冲液和140μl的样品，两者成比例)中。使用脉冲涡旋(pulse-vortexing)搅拌15sec之后，在室温下对裂解液(lysis)孵育10min，再将560μl的乙醇添加到样品中。简单混合之后，将样品装载至柱中并在8000rpm条件下离心分离1min(重复此步骤直至所有的裂解液都被装载)。先后使用AW1和AW2缓冲液清洗带有样品的柱。最后，使用洗脱缓冲液将RNA洗脱出来并将其储存在-80℃条件下。使用SuperScript II逆转录试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)和锚定引物(anchor primer)SP2R(SEQ ID NO：7)合成cDNA第一链。根据厂商公开的方法并使用cDNA第一链和引物，用Pfu Turbo HotstartDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)对目标基因组区域(targetgenomic region)进行PCR扩增。特别的，使用合成的正向引物SpeF(SEQ ID NO：11)和锚定引物Sp2R(SEQ ID NO：7)从两个野生分离株：MN-184的一部分，SEQ ID NO：12，或新的野生分离株的一部分，SEQ ID NO：17，对结构蛋白编码区域进行扩增，该结构蛋白编码区域覆盖部分ORF3到ORF7。根据厂商(Invitrogen，Carlsbad，CA)所述的步骤直接将经过凝胶纯化的PCR产物克隆至pCR-Blunt载体中。该克隆被称作pCR-Blunt-3-7。
[0037]实施例4.PRRSV的嵌合全长复制子的构建。
使用限制性核酸内切酶SpeI和XhoI(New England Biolabs，MA)分别消化pB13117克隆和pCR-Blunt-3-7克隆。在琼脂糖凝胶上分离消化的重组质粒DNAs，对目标DNA条带进行剪切并通过QIEX II凝胶纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。使用纯化的DNA，消化的pB 13117DNAs和从pCR-Blunt-3-7中释放出的病毒基因组的3’端的DNA片段进行图1中所述的连接反应。两个被命名为pPRRSPTK-3(SEQ ID NO：13)和pPRRSPTK-6(SEQ ID NO：14)的完整的cDNA克隆，通过该步骤得以构建。pPRRSPTK-3包括野生分离株MN-184(SEQ ID NO：12)的3’序列，pPRRSPTK-6包括新的野生分离株(SEQ ID NO：17)的3’序列。通过限制性核酸内切酶消化重组质粒DNA和DNA序列进一步表征(characterized)上述两个克隆。
[0038]实施例5.Marc145细胞中嵌合PRRSV的形成。
嵌合感染性PRRSV克隆的DNA在体外转录。使用合成的RNA转染Marc145细胞。克隆之后，使用限制性核酸内切酶XhoI使两个全长的克隆，pPRRSPTK-3和pPRRSPTK-6线性化(linearized)。在琼脂糖凝胶上检测线性的模板DNA，确认剪切完全。使用纯化的DNA通过mMESSAGE mMACHINE试剂盒(Ambion，Austin，TX)进行体外转录。在微离心分离管中使用2×NTP/CAP，10×反应缓冲液，酶混合物，GTP和线性模板DNA进行转录反应。混合均匀之后，将反应在37℃条件下孵育2小时。使用氯化锂(LiCl)沉淀除去未并入(unincorporated)的核苷酸和大多数的蛋白质，RNA被重新悬浮在去核酸酶水中。使用紫外吸收法(UV absorbance)对通过体外转录合成的RNA进行定量，使用琼脂糖凝胶对其进行定性。最后将RNAs储存至-80℃条件下以便进行RNA体外转染。在转染的前一天使用6孔板(Corning Corp.)准备Marc-145细胞。第二天使用DMRIE-C反应物(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行转染。简要的，OPTI-MEM(1ml)去血清培养基与3μl的DMRIE-C反应物通过简短涡流搅拌混合。将体外转录的RNA(5μl)添加至上述混合物中并在室温下进行短暂孵育。将转染混合物移置经过1×PBS清洗的单层细胞(cell monolayer)上。在37℃、5％ CO2的条件下孵育3小时之后，将转染混合物吸出(aspiratedoff)，使用含有2％ PBS的EMEM培养基(Invitrogen)补充入细胞培养皿。允许细胞生长(proceed)最多六天以观察细胞病变效应(CPE)表面迹象。为了形成感染性PRRSV的第一代，使用500μl的细胞上清液在T75瓶中在同样的培养条件下感染新鲜的Marc145细胞。收获表现出80％的CPE的细胞培养物上清液并将其储存在-80℃条件下。构建形成两个嵌合PRRSVs，其为PRRSPTK-3和PRRSPTK-6。
[0039]实施例6.嵌合PRRSV中遗传标记的稳定性。
使用Qiagen Viral RNA分离试剂盒(QIAgen，Valencia，CA)从细胞培养物上清液中提取出病毒RNA。使用锚定引物Sp2R在Superscript II逆转录试剂盒中合成第一链cDNA。使用Pfu TurboHotstart DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)对目标基因组区域进行PCR扩增。特别的，使用合成的正向引物SpeF和锚定引物Sp2R对覆盖ORF3至ORF7的结构蛋白编码区域进行扩增。当嵌合病毒在Marc145细胞中被传代10代之后，收集细胞上清液以分离病毒RNA基因组。使用特别的引物对PSAF，SEQ ID NO：15(CCTTAATTAATTTAA ATGGCGCGCC)和SR12709，SEQ ID NO：16(CCCCGTCATGCGCAGGTT GTGTAG)进行PCR。PCR产物在琼脂糖凝胶上约为550bp。使用PRRSV的野生分离株作为不经过PCR扩增的负对照。另外，对细胞上清液的RT-PCR产物进行测序以确认嵌合病毒。从接种后10至14天收集的血清中可以分离出进入猪体内的嵌合PRRSV。进入宿主动物体内之后可以确定PRRSV基因组中遗传标记PSA的稳定性。嵌合PRRSV在病毒生存能力(viral viability)和特异性方面都与亲代PRRSV相似。对于PRRSPTK-3病毒滴度(viral titer)可达5.686(log TCID50/ml)，对于PRRSPTK-6病毒滴度可达5.435(log TCID50/ml)。
[0040]实施例7.宿主动物内嵌合PRRSV的毒性。
在宿主动物内测定嵌合PRRSV的毒性。在第一个测定中，使用PRRSPTK-3和ptkPRRS(每种剂量为5×104)的组合对5只猪通过肌肉注射进行预防接种，另外5只猪作为对照。在第二个测定中，使用PRRSV的PRRSPTK-3和PRRSPTK-6(每种剂量为5×105)的组合对5只猪通过肌肉注射进行预防接种，另外5只猪作为对照。预防接种后14天，对所有的猪进行解剖并根据临床病理学所确定的标准确定肺部损伤分值(scores)。作为正对照，使用亲代PRRSV攻击5只猪。攻击之后14天确定肺部损伤的分值(scores)。表1中列出的结果证明，遗传修饰的嵌合PRRSV在猪体内为非毒性的。
表1：预防接种的猪的肺部损伤分值
 
根据接种菌株划分的猪的组 动物数量 肺部损伤分值(％)
PRRSPTK-3/PtkPRRS    5 0.30
PRRSPTK-3/PRRSPTK-6  5 0.04
MN-184 5 61.00
NADC-20 5 75.25
负对照 5 0.02
[0041]实施例8。宿主动物中嵌合PRRSV的免疫原性
使用PRRSPTK-3和ptkPRRS的组合对猪进行预防接种以测试嵌合PRRSV的免疫原性。将20只猪分为4组，每组5只猪。使用PRRSptk-3和ptkPRRS(每种剂量为5×104)对1组和2组的猪进行预防接种，3组和4组的猪不经过预防接种。预防接种后第35天，使用毒性异源PRRSV NADC-20攻击1组和3组的猪，使用PRRSV MN-184攻击2组和3组的猪。攻击后14天之后，表征所有的猪都对毒性病毒攻击的响应。
[0042]A.肺部损伤分值。预防接种之后第49天，通过基于总的肺部损伤、显微检验和免疫组织检验的验尸确定肺部损伤分值。图2显示了每组的平均分值。经过预防接种的猪无论是同源攻击还是异源攻击其肺部损伤分值都比未经过预防接种的对照猪的肺部损伤分值明显减少：对于异源攻击分别为1.07％相比较于61％，对于同源攻击分别为3.15％相比较于75.25％。结果显示，嵌合PRRSV可以保护猪不受病毒PRRSV的感染，并且不引发PRRS临床症状。
[0043]B.生长性能。进行预防接种后第0天、第35天、第49天对动物称重。攻击前后分别计算出平均日增长量。如图4中所示，经过预防接种的组明显避免了猪由于攻击而体重减轻的现象，其日增长量为1.01磅/日，而未经过预防接种的猪的日增长量仅为0.73磅/日。在使用病毒PRRSV攻击之前，经过预防接种的猪与未经过预防接种的对照的猪的日增长量并无不同。
[0044]C.通过预防接种宿主动物内的血清转化。预防接种之后连续五个星期每个星期收集血清样本，并根据提供商(IDEXX Inc.Maine)的说明书进行ELISA测试。如图3中所示，每个组每个时间点的S/P值对预防接种后的天数作图。通过使用0.4的S/P截距(cut-offvalue)，预防接种14天之后所有经过预防接种的猪都转化为PRRSV-特殊抗体阳性。结果显示，被测试的疫苗为产生免疫原性的，并可在宿主动物中刺激体液免疫应答。
[0045]D.体温曲线。攻击前一天及攻击后14天连续每天记载每个动物的直肠温度。如图5中所示，攻击5天之后经过预防接种的猪与对照的猪相比，体温较高，但是攻击12天之后，经过预防接种的猪的体温比对照的猪的体温低。
[0046]E.嵌合PRRS病毒的分离。通过对血清样品进行定量实时PCR扩增评价(evaluate)病毒血症。用两种嵌合PRRS的组合，PRRSPTK-3/ptkPRRS和PRRSPTK-3/PRRSPTK-6，分别给八只猪预防接种。如表2中所示，在预防接种0天所有的猪均为血清阴性，预防接种后第14天所有的猪均为血清阳性，该现象说明，嵌合PRRSV株系保持了修饰的活的减毒PRRSV的复制特性。预防接种后第42天，所有的猪都呈血清阴性。这些结果表明，被测试的嵌合PRRS病毒可以保持复制能力和有限病毒血症持续时间(limited viremic duration)。
表2：使用嵌合株系的宿主动物体内的病毒血症
Figure A200780000572D00191
[0047]本发明的组合物和方法已经通过实施方案加以叙述，很显然对于本领域技术人员来说，可以对此处的组合物和方法以及方法的步骤或步骤的顺序加以变化而不偏离发明的概念，精神和范围。更特别的，很明显可以使用一些化学和物理相关的试剂代替此处所述的试剂并得到相同或相似的结果。该对于本领域技术人员明显的相似的替换或修改被认为属于本发明的精神，范围和概念。另外，此处所引用或描述的所有专利和出版物以其全部内容并入本申请作为参考。
[0048]在说明书和附加的权利要求中，除非正文明确另外规定，所使用的单数“一种”、“一个”和“该”都包含其复数指示物。因此，例如，一种包含“聚核苷酸”的组合物包括两个或多个聚核苷酸的混合物。同样需要注意的是，术语“或”在普遍情况下包含“和/或”的意思，除非正文明确另外规定。在说明书中提及的所有的出版物，专利和专利申请可表示本发明所属范畴的普通技术水平。所有的出版物、专利和专利申请通过在此引用其相同的范围被清楚的合为一体，正像每个单独的出版物或专利申请被明确单独引用。为防止本公开(disclosure)和同类专利、出版物和参考书目的冲突，应对照本公开。
[0049]同样需要特定理解的是，此处所叙述的任何数值都包括从其下限值到其上限值的任意值，例如，从所列举的最低值到最高值中所有可能的数值组合都被认为在本发明中所清楚陈述。
[0050]因此，本发明在提供其他内容的同时也提供PRRSV的非毒性嵌合体和其制备方法。本发明的各种特性和优势在权利要求书中阐明。
<110>普泰克国际有限公司
<120>嵌合体PRRSV的构建，组合物及疫苗的制备
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<170>PatentIn version 3.3
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<211>15543
<212>DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒克隆ptkPRRS
<400>1
Figure A200780000572D00211
Figure A200780000572D00221
Figure A200780000572D00231
Figure A200780000572D00241
Figure A200780000572D00251
Figure A200780000572D00261
Figure A200780000572D00271
Figure A200780000572D00281
Figure A200780000572D00291
Figure A200780000572D00311
<210>2
<211>15564
<212>DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒克隆ptkPRRS-1
<400>2
Figure A200780000572D00312
Figure A200780000572D00321
Figure A200780000572D00331
Figure A200780000572D00341
Figure A200780000572D00351
Figure A200780000572D00361
Figure A200780000572D00371
Figure A200780000572D00381
Figure A200780000572D00411
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PSA连接剂
<400>3
Figure A200780000572D00421
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SF7682引物
<400>4
<210>5
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PSA1R引物
<400>5
Figure A200780000572D00423
<210>6
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PSA2F引物
<400>6
Figure A200780000572D00424
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Sp2R引物
<400>7
Figure A200780000572D00431
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PSA多接头引物
<400>8
Figure A200780000572D00432
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SR12709引物
<400>9
<210>10
<211>13117
<212>DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒克隆部分序列
<400>10
Figure A200780000572D00434
Figure A200780000572D00441
Figure A200780000572D00451
Figure A200780000572D00471
Figure A200780000572D00481
Figure A200780000572D00491
Figure A200780000572D00501
Figure A200780000572D00511
Figure A200780000572D00521
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SpeF引物
<400>11
<210>12
<211>2483
<212>DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒MN-184部分序列
<400>12
Figure A200780000572D00523
Figure A200780000572D00531
Figure A200780000572D00541
<210>13
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<212>DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒克隆(PTKPRRS-3)
<400>13
Figure A200780000572D00551
Figure A200780000572D00561
Figure A200780000572D00571
Figure A200780000572D00581
Figure A200780000572D00601
Figure A200780000572D00621
Figure A200780000572D00631
Figure A200780000572D00641
<210>14
<211>15566
<212>DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒克隆(PTKPRRS-6)
<400>14
Figure A200780000572D00642
Figure A200780000572D00651
Figure A200780000572D00671
Figure A200780000572D00681
Figure A200780000572D00691
Figure A200780000572D00701
Figure A200780000572D00711
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Figure A200780000572D00731
Figure A200780000572D00751
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>15
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SR12709引物
<400>16
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<212>DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒野生分离株部分序列
<400>17
Figure A200780000572D00754
Figure A200780000572D00761
Figure A200780000572D00771

Claims (25)

1、一种嵌合PRRSV复制子，其包括：
a)来自PRRSV的非毒性株系的5’序列，该5’序列包含ORF1，ORF2，部分ORF3或其组合；和
b)来自PRRSV的毒性株系的3’序列，其中复制子可以制备相比较于毒性株系毒性减弱的感染性病毒颗粒。
2、根据权利要求1所述的复制子，其进一步包括标记序列。
3、根据权利要求2所述的复制子，其中该标记序列被插入至ORF1b和ORF2之间。
4、根据权利要求2或3所述的复制子，其中该标记序列包含SEQID NO：3。
5、根据权利要求2至4任一项所述的复制子，其包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：13的简并变异体。
6、根据权利要求2至4任一项所述的复制子，其包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：14的简并变异体。
7、一种包含如权利要求1至6任一项所述的复制子的细胞。
8、一种包含如权利要求1至6任一项所述的复制子的组合物。
9、一种制备嵌合PRRSV病毒的方法，其包括：
a)使用复制子转染细胞，该复制子包含来自PRRSV的非毒性株系的5’序列以及来自PRRSV的毒性株系的3’序列，该5’序列包含ORF1，ORF2，部分ORF3或其组合；
b)在适宜制备感染性病毒颗粒的条件下孵育细胞；和
c)回收病毒颗粒，
其中回收的病毒颗粒与PRRSV的毒性株系相比毒性减弱。
10、根据权利要求9所述的方法，其中该5’序列来自ptkPRRS(SEQID NO：1)或ptkPRRS的简并变异体。
11、根据权利要求9所述的方法，其中5’序列来自ptkPRRS-1(SEQID NO：2)或ptkPRRS-1的简并变异体。
12、根据权利要求9至11任一项所述的方法，其中回收病毒的生长速度与毒性株系的生长速度相似。
13、根据权利要求9所述的方法，其中该复制子是包含SEQ ID NO：13(pPRRSPTK-3)或SEQ ID NO：13的简并变异体的核苷酸序列。
14、根据权利要求9所述的方法，其中该复制子是包含SEQ ID NO：14(pPRRSPTK-6)或SEQ ID NO：14的简并变异体的核苷酸序列。
15、根据权利要求9至14任一项所述的方法制备的减毒病毒。
16、一种由权利要求1至6任一项所述的复制子编码的病毒。
17、一种包含权利要求15或16所述的病毒的组合物。
18、一种包含由SEQ ID NO：13或其简并变异体编码的病毒的组合物。
19、一种包含由SEQ ID NO：14或其简并变异体编码的病毒的组合物。
20、一种组合物，其包括：
由SEQ ID NO：13或其简并变异体编码的病毒；和
由SEQ ID NO：14或其简并变异体编码的病毒。
21、根据权利要求17至20任一项所述的组合物，其还包含PRRSV病毒的非毒性株系。
22、一种在哺乳动物体内刺激免疫应答的方法，其包括以有效诱导免疫应答的剂量的如权利要求17至21任一项所述的组合物对哺乳动物给药。
23、根据权利要求22中所述的方法，其中该哺乳动物为猪。
24、一种疫苗，其包含如权利要求8或17至21任一项所述的组合物。
25、一种对猪进行预防接种的方法，其包括以有效诱导免疫应答的剂量的如权利要求24所述的疫苗对猪给药。
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