DE10003372A1

DE10003372A1 - Rekombinante Attenuation von PRRSV

Info

Publication number: DE10003372A1
Application number: DE2000103372
Authority: DE
Inventors: Knut Elbers; Stefan Pesch; Heike Dreier
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH; Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH; Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2000-01-26
Filing date: 2000-01-26
Publication date: 2001-08-02

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf lebende PRRS-Viren, die durch Mutationen vom Aminosäuren an einem spezifischen Ort des von ORF 1b codierten viralen Proteins attenuiert sind. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Nucleotid-Sequenzen, welche diese Viren codieren, auf Verfahren zur Erzeugung solcher Viren, und auf deren Verwendung zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur Vorbeugung und Behandlung von Infektionen mit PRRS.

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf lebende PRRS-Viren, die durch Mutationen von Aminosäuren an spezifischen Orten des von ORF 1b codierten viralen Proteins attenuiert sind. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Nucleotid- Sequenzen, welche diese Viren codieren, auf Verfahren zur Erzeugung solcher Viren, und auf deren Verwendung zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur Vorbeugung und Behandlung von Infektionen mit PRRS.

Hintergrund der Erfindung

"Mystery Swine Disease" (zu Deutsch "Rätselhafte Schweineerkrankung"), später umbenannt in Schweine-Reproduktions- und Respirationssyndrom (PRRS, steht für Englisch "porcine reproductive and respiratory syndrome"), wird von einem umhüllten positivsträngigen RNA-Virus aus der Arteriviridae-Familie verursacht (E. J. Snijder 1998). Vor etwa 10 bis 15 Jahren tauchten offenbar unabhängig voneinander in den USA und in Europa zwei verschiedene PRRS- Virenstämme auf. Die Krankheit ist heutzutage in vielen Schweine produzierenden Ländern Nordamerikas, Europas und Asiens endemisch. Sie stellt bei Schweinen eine Hauptursache von Zuchtverlusten und Erkrankungen der Atemwege dar. Die Häufigkeit der Infektion in den USA wird auf bis zu 70% geschätzt.

Das Virus wird durch Einatmung, Nahrungsaufnahme, Geschlechtsverkehr, Bisswunden oder Nadelstichen übertragen. Es repliziert sich in Schleimhäute-, Lungen- oder regionalen Makrophagen.

Subklinisch führt die Erkrankung zu Resolution oder andauernder Infektion. Andauernd infizierte Tiere scheiden das Virus in Mund-/Rachen-Flüssigkeiten, Blut, Kot, Urin und Samenflüssigkeit aus. Bei Säuen beziehen sich klinische Symptome auf Abort oder vorzeitigen Wurf von schwachen lebendgeborenen Schweinen, auf totgeworfene Schweine und autolysierte Föten. Infizierte neugeborene Schweine weisen eine hohe Sterblichkeit auf oder leiden an Lungenentzündung. Die nachfolgende Pflege von Ferkeln und Aufzucht von Schweinen erfährt Komplikationen durch Lungenentzündung, damit einhergehende bakterielle Infektionen und erhöhte Sterblichkeit. Eber neigen zu Fieber und morphologischen Veränderungen bei der Samenflüssigkeit.

Wie bei allen Arteriviridae ist das Genom des PRRS-Virus ein positiv einzelsträngiges RNA-Molekül von etwa 15 Kilobasen. Es codieren die offenen Leseraster (ORF, steht für Englisch "open reading frame") 1a und 1b Replicasen, die ORFs 2 bis 6 putative Glycoproteine (gp 1 bis 4), ORF 6 ein Membranprotein (M) und ORF 6 ein Nucleocapsid-Protein (N).

In den ursprünglichen Beschreibungen von PRRS-Infektion in den USA (Isolat ATCC VR-2332, hinterlegt am 18. Juli 1991 bei der Americn Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA, Gendatenbank U 87392 U00153) und in Europa (WO-92/21375, Isolat Lelystad Agent (CDI-NL-2.91), hinterlegt am 5. Juni 1991 beim Institut Pasteur, Paris, Zugriffsnummer I-1102) wurden Viren identifiziert, die genomische und serologische Unterschiede aufwiesen. Vergleiche zeigten auf, dass beide einen gemeinsamen Vorfahren hatten, welcher divergierte, bevor in den späten Achtzigerjahren die klinische Erkrankung beschrieben wurde. Berichtet wurde über Genom-Sequenzen voller Länge bei einer Anzahl von PRRS- Viren und vollständigen proteincodierenden Strukturbereichen davon (Snijder et al. 1998; Meulenberg et al. 1993b; Conzelmann et al. 1993; Murtaugh et al. 1995; Kapur et al. 1996).

Das PRRS-Virus kann in vitro repliziert werden in Makrophagen aus Schweinelungen, in Monozyten, Gliazellen und zwei als CL-2621 und MARC-145 bekannten Subpopulationen von MA-104-Zellen (Affenembryo-Nierenzellen) [K. D. Rossow, "Porcine reproductive and respiratory syndrome", Vet. Pathol. 35: 1-20 (1998)]. Ebenfalls verfügbar sind rekombinante Mittel zur Erzeugung von infektiösen PRRS-Klonen (EP-0839912-A1).

Zum Schutz von Schweinen sind Impfstoffe aus lebenden attenuierten PRRS-Viren im Handel erhältlich (RespPRRS/Ingelvac^(R) PRS MLV, von Boehringer Ingelheim).

Impfstoffe aus getöteten Viren (inaktivierten vollständigen Viren) oder Impfstoffe aus Untereinheiten (auf herkömmliche Weise gereinigte oder heterolog exprimierte, gereinigte virale Proteine) sind den Impfstoffen aus lebenden Viren in der Wirksamkeit zur Herbeiführung einer vollständig schützenden Immunantwort, sogar in Gegenwart von Zusatzstoffen, meist unterlegen. Für das PRRS-Virus wurde aufgezeigt, dass im Vergleich zu den gegenwärtig verfügbaren Impfstoffen aus getöteten Viren die Impfstoffe aus attenuierten Viren eine Immunität gegen die Erkrankung induzieren, welche länger hält und wirksamer ist (Snijder et al., weiter oben angegeben). Die gegenwärtigen Impfstoffe aus lebenden PRRS-Viren sind auf herkömmliche Weise attenuiert, indem das Virus reihenweise Passagen durch geeignete Wirtszellen unterzogen wird, bis die Pathogenität verlorengeht (EP- 0529584-B1). Die gegenwärtigen Impfstoffe aus lebenden PRRS-Viren bieten noch viel Raum für Verbesserungen. Zum einen verhindern sie die Wiederinfektion nicht. Zum zweiten ermöglichen sie keine serologische Unterscheidung zwischen geimpften Tieren und vom Feld-Virus infizierten Tieren. Am wichtigsten ist jedoch, dass Impfstoffe aus lebenden vollständigen Mikroorganismen, obschon sie attenuiert sind, mit gravierenden Sicherheitsproblemen einhergehen können. Dies gilt insbesondere für RNA-Viren wie das PRRS-Virus, denen man hohe Mutationsraten zuschreibt wegen der unpräzisen Replikation des RNA-Genoms, die sich aus dem Fehlen einer Lesekontrolle durch das RNA-Replikationsenzym ergibt.

Eine potentielle Reversion von lebenden attenuierten Viren kann für geimpfte Tiere eine ernste Gefahr darstellen. Für auf herkömmliche Weise abgeleitete attenuierte Viren, bei denen die Attenuation durch herkömmliche Mehrfach-Passage herbeigeführt wird, bleiben der molekulare Ursprung wie auch die genetische Stabilität unbekannt, und der Ausbruch von Revertanten ist nicht voraussehbar.

Impfstoffe aus lebenden Viren mit definierten Mutationen als Basis der Attenuation würden ermöglichen, die Nachteile der gegenwärtigen Erzeugung von Impfstoffen aus attenuierten Viren zu vermeiden. Ein weiterer Vorteil der genannten attenuierenden Mutationen liegt bei deren bekannter molekularer Einmaligkeit, was ermöglicht, sie als unterscheidungskräftige Marker für attenuierte Pestiviren zu verwenden und sie von den Feld-Pestiviren zu unterscheiden.

Demnach bestand das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende technische Problem darin, Orte zur spezifischen Attenuation von PRRS-Viren zu identifizieren. Wenn einmal solche Orte identifiziert sind, können sichere und ortspezifisch attenuierte Viren erzeugt werden. Solche Viren sind zur Herstellung eines sicheren Impfstoffes aus lebenden Viren zur Verwendung bei der Vorbeugung und/oder Behandlung von PRRS-Infektionen verwendbar.

Beschreibung der Erfindung

Die Lösung des vorgenannten technischen Problems wird mit der Beschreibung und den in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausbildungen erreicht.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass PRRS-Viren einen spezifischen Ort aufweisen, der auf einem einzelnen viralen Protein liegt, welches eine hohe Neigung zur Reversion zu den Aminosäuren des ursprünglichen virulenten Feld- Stammes VR-2332 an dieser Position hat. Der Evolutionsdruck an diesem Ort, der von nun an als "virulenzspezifischer Ort" bezeichnet wird, oder auf den einfach als "erfindungsgemässen Ort" oder gerade nur als "Ort" hingewiesen wird, ist enorm. Für zwei revertante Stämme von RespPRRS war es zum ersten Mal möglich nachzuweisen, dass an diesem virulenzspezifischen Ort die Aminosäuren- Mutation zur Aminosäure des ursprünglichen virulenten Feld-Isolats hin unabhängig von der Geographie sowohl in den USA als auch in Europa erfolgte.

Die Aminosäure- und Nucleotid-Sequenz des auf herkömmliche Weise attenuierten Virus RespPRRS wurde mit dem ursprünglichen Feld-Isolat VR-2332 verglichen. Zur Identifikation des virulenzspezifischen Ortes wurden die beiden erwähnten virulenten Revertanten miteinander und mit VR-2332 bzw. RespPRRS verglichen.

Dies ermöglichte die Identifikation des virulenzspezifischen Ortes auf einem einzelnen viralen Protein, das an der Virulenz von PRRS-Viren beteiligt ist. Folglich bezieht sich ein Aspekt der Erfindung auf lebende PRRS-Viren, die nicht RespPRRS sind und weniger virulent sind als das PRRS-Virus ATCC VR- 2332, und die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Protein enthalten, das codiert wird vom offenen Leseraster 1b, wie es als Beispiel in Abb. 1 für diesen Stamm VR-2332 beschrieben ist oder diesem bei anderen PRRS-Stämmen entspricht, wobei zumindest eine der Aminosäuren an den identifizierten spezifischen Virulenz-Orten nicht identisch ist mit zumindest einer der Aminosäuren des Stammes VR-2332 an den entsprechenden Positionen.

Abb. 1 liefert Informationen, die für alle PRRS-Stämme stellvertretend sind, und ermöglicht, die Erfindung zu veranschaulichen und die bevorzugten Aminosäuren und bevorzugten Orte in allen PRRS-Viren zu identifizieren, auch wenn sie anders numeriert sein sollten. Die Identifikation dieser Positionen erfolgt, indem in einem PRRS-Stamm von Belang und im aufgelisteten Referenz-Stamm beibehaltene, charakteristische, identische Aminosäuren identifiziert werden und danach die Position des Ortes beim Virus von Belang in bezug auf den Ort in Abb. 1 bestimmt wird.

Eines dieser Orte wurde identifiziert als bezogen auf das Protein, das vom viralen ORF 1b codiert wird, welches als Beispiel in Abb. 1 für VR-2332 veranschaulicht wird.

Bei einer bevorzugten Ausbildung bezieht sich die Erfindung auf lebende PRRS-Viren, die nicht RespPRRS sind und weniger virulent sind als das PRRS- Virus ATCC-Nr. VR-2332, und die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Protein enthalten, wie es als Beispiel in Abb. 1 für VR-2332 beschrieben ist oder diesem bei anderen PRRS-Stämmen entspricht, wobei zumindest eine der Aminosäuren in Position 936 bis 956 mit der Aminosäure bzw. den Aminosäuren des Stammes VR-2332 an der entsprechenden Position bzw. den entsprechenden Positionen nicht identisch ist.

"Erfindungsgemässes lebendes PRRS-Virus" bezieht sich auf ein PRRS- Virus, wie es von E. J. Snijder et al. (weiter oben angegeben) definiert ist und das fähig ist, Schweine zu infizieren und sich in Schweinen zu replizieren.

Das auf herkömmliche Weise attenuierte RespPRRS-Virus wird ausdrücklich einem Disclaimer unterstellt. Es ist kein erfindungsgemässes Virus und wird ausdrücklich aus dem Schutzbereich der Ansprüche ausgeschlossen. Das RespPRRS-Virus ist im Handel erhältlich bei Boehringer Ingelheim Vetmedica Company (Ingelvac^(R) PRS MLV). Seine Sequenz ist grösstenteils öffentlich zugänglich (Gendatenbank AJ 223082).

Der Ort und die Aminosäuren, die für die vorliegende Erfindung von besonderem Belang sind, sind in keiner Weise auf die genaue Position beschränkt, wie sie für den Stamm VR-2332 definiert ist, sondern sie werden lediglich als Beispiel verwendet, um auf die bevorzugten Aminosäuren hinzuweisen, die sich an dieser Position befinden oder dieser Position bei anderen PRRS-Stämmen entsprechen. Für davon verschiedene PRRS-Viren kann die Numerierung der Positionen der bevorzugten Aminosäuren eine andere sein, eine Fachperson auf dem Gebiet der molekularen Biologie der Viren der Arteriviridae-Familie wird jedoch diese bevorzugten Aminosäuren anhand deren Position in bezug auf die anderen beibehaltenen Aminosäuren der genannten Proteine leicht erkennen.

Der Terminus "weniger virulent als das PRRS-Virus VR-2332" ist im Sinne eines Vergleichs klinischer Symptome des Virus von Belang mit denen des VR-2332 zu verstehen. Eine bevorzugte Vorgehensweise, um zu bestimmen, ob ein PRRS-Virus weniger virulent ist als das PRRS-Virus VR-2332, wird im Beispiel 1 aufgelistet. Es kann sein, dass nicht alle möglichen bevorzugten Aminosäuren- Mutationen am virulenzspezifischen Ort zur Reduktion der Virulenz herangezogen werden können. Die Vorgehensweise des Beispiels 1 stellt einen präzisen und einfachen experimentellen Aufbau zur Verfügung, um festzustellen, ob ein lebendes PRRS-Virus, welches das erfindungsgemässe Protein enthält, weniger virulent ist als das virulente Feld-Isolat VR-2332.

Der virulenzspezifische Ort wurde durch die Reversion zumindest einer der Aminosäuren vom attenuierten Virus zur Aminosäure des VR-2332 identifiziert. Diese bestimmte Aminosäure ist Teil einer grösseren sekundären Peptidstruktur wie α-Helix oder β-Faltblatt oder β-Haarnadelmotiv oder andere. Demnach ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass benachbarte Aminosäuren ebenfalls an der Regulation der Virulenz dieses Proteins beteiligt sind. Eine Fachperson auf dem Gebiet der Proteinchemie würde demnach damit rechnen, dass die Wahrscheinlichkeit hoch ist, innerhalb der Nachbarschaft von 10 Aminosäuren zur Rechten und zur Linken der ursprünglich identifizierten Position der Aminosäuren weitere Aminosäuren mit an der Virulenz beteiligten Eigenschaften zu identifizieren. Der typische Bereich von Peptidmotiven in Proteinen liegt bei 10 bis 20 Aminosäuren. Folglich umfassen erfindungsgemäss bevorzugte Viren das als Beispiel in Abb. 1 beschriebene oder diesem bei anderen Stämmen entsprechende Protein, wobei der virulenzspezifische Ort 10 Aminosäuren aufwärts und 10 Aminosäuren abwärts von der ursprünglich identifizierten Position der Aminosäure umfasst. Mehr bevorzugt sind diejenigen unter den vorstehend erwähnten Viren, bei denen der virulenzspezifische Ort 5 Aminosäuren aufwärts und 5 Aminosäuren abwärts von der ursprünglich identifizierten Position der Aminosäure umfasst. Am meisten bevorzugt sind diejenigen unter den vorstehend erwähnten Viren, bei denen der virulenzspezifische Ort 3 Aminosäuren aufwärts und 3 Aminosäuren abwärts von der ursprünglich identifizierten Position der Aminosäure umfasst.

Mit der erfindungsgemässen Lehre ist es möglich, aus virulenten Feld- Stämmen attenuierte PRRS-Stämme zu erzeugen, indem die Aminosäuren am virulenzspezifischen Ort mutiert werden. Weiterhin stellt sich jedoch das Sicherheitsproblem, das mit der hohen Mutationsfrequenz in RNA-Viren einhergeht. Dieses Problem kann sehr weitgehend entschärft werden, indem spezifische Aminosäuren am virulenzspezifischen Ort des Virenproteins deletiert werden. Somit bezieht sich die Erfindung auf PRRS-Viren der im vorstehenden erwähnten Art, die dadurch gekennzeichnet sind, dass zumindest eine der Aminosäuren am virulenzspezifischen Ort des Virenproteins deletiert ist.

Der Terminus "deletiert" ist als Abwesenheit im Sinne eines Vergleichs mit der bzw. den in der Abbildung an dieser Position bzw. an diesen Positionen angezeigten Aminosäuren zu verstehen.

Bei einer mehr bevorzugten Ausbildung bezieht sich die Erfindung folglich auf ein lebendes PRRS-Virus, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Protein enthält, wie es als Beispiel in Abb. 1 für ATCC VR-2332 beschrieben ist oder diesem bei anderen PRRS-Stämmen entspricht, wobei zumindest eine der Aminosäuren in Position 936 bis 956 deletiert ist.

Bezüglich des virulenzspezifischen Ortes auf dem bestimmten Protein des PRRS-Virus wurde bei einem bevorzugten Beispiel nachgewiesen, dass zumindest eine Aminosäure unter hohem Mutationsdruck steht und an den Virulenz- Eigenschaften von Revertanten des Feld-Stammes VR-2332 beteiligt ist. Diese einzelne Aminosäure-Position stellt eine am meisten bevorzugte Ausbildung der Erfindung dar.

Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung bei einer am meisten bevorzugten Ausbildung auf ein lebendes PRRS-Virus, das nicht RespPRRS ist und weniger virulent ist als ATCC VR-2332, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Protein enthält, wie es als Beispiel in Abb. 1 für ATCC VR-2332 beschrieben ist oder diesem bei anderen PRRS-Stämmen entspricht, wobei die Aminosäure in Position 946 mit der Aminosäure des Stammes VR-2332 an der entsprechenden Position nicht identisch ist.

Aus den im vorstehenden dargelegten Gründen ist es sicherer und bevorzugt, die Reversion von geänderten Aminosäuren zum virulenten Typus zu vermeiden, indem die zur Reversion neigende Aminosäure einfach deletiert wird.

Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung bei dieser am meisten bevorzugten Ausbildung auf ein lebendes PRRS-Virus, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Protein enthält, wie es als Beispiel in Abb. 1 für den genannten Stamm VR-2332 beschrieben ist oder diesem bei anderen PRRS-Stämmen entspricht, wobei die Aminosäure in Position 946 deletiert ist, d. h. in anderen Worten, im Sinne eines Vergleichs mit dieser Position in VR-2332 oder anderen PRRS-Viren abwesend ist.

Die erfindungsgemässe Lehre ermöglicht nun der Fachperson, durch Rekombination infektiöse Klone von PRRS-Viren zu erzeugen, die weniger virulent sind als VR-2332 und zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung aus lebenden Viren verwendbar sind. Alle Information, die erforderlich ist, um rekombinante infektiöse Klone von positivsträngigen RNA-Viren zu produzieren, ist beim Stand der Technik verfügbar und leicht zu haben, insbesondere in bezug auf das PRRS-Virus. Beispielsweise liefert die Europäische Patentanmeldung EP-0839912 von Meulenberg et al., auf deren Gesamtheit mit diesem Literaturnachweis verwiesen wird, eine klare Lehre zur Herstellung von rekombinanten lebenden PRRS-Viren. Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung bei einem weiteren Aspekt davon auf Nucleotid-Sequenzen, die ein erfindungsgemässes Virus codieren. Weit der genetische Code degeneriert ist, ergibt sich die Translation einer identischen Aminosäure aus einer Vielfalt von Nucleotidvarianten. Diese degenerierten Varianten sind ebenfalls in der Erfindung inbegriffen.

Wie in den einleitenden Seiten erwähnt, ist es für die Verwaltung der Gesundheit von Schweinen wichtig, zwischen dem weniger virulenten Impfstoff aus lebenden Viren der Arzneimittelzusammensetzung und den Vireninfektionen mit dem virulenten Wildtyp unterscheiden zu können. Dies ist oft schwierig, insbesondere wenn klinische Symptome einer Feld-Infektion nicht besonders spezifisch sind oder mit anderen Infektionen überlagert sind, oder wenn die für die Beobachtung und Auswertung verfügbare Zeitdauer kurz ist. Die rekombinante Erzeugung der Viren von Belang lässt auch Raum für die Einführung von Modifikationen des genetischen Codes zur Erstellung eines serologischen Markers und/oder eines Virulenzmarkers. Ein serologischer Marker bezieht sich auf ein antigenisch detektierbares Molekül wie ein Peptid, Protein oder Glycoprotein, das aus infizierten Zellen oder Körperflüssigkeiten isoliert werden kann, wie beispielsweise aber ohne Beschränkung darauf, aus Rachen- oder Nasen- Flüssigkeiten oder Urin. Ein Virulenzmarker ist als ein Marker im genetischen Code zu verstehen, der durch rekombinante analytische Methoden identifiziert werden kann, wie beispielsweise aber ohne Beschränkung darauf, durch PCR- und herkömmliche Sequenzierung. Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung bei einer bevorzugten Ausbildung auf eine erfindungsgemässe Nucleotid-Sequenz, wobei die Nucleotid-Sequenz modifiziert worden ist, um einen Virulenzmarker und/oder einen serologischen Marker zu codieren. Als Virulenzmarker und serologische Marker besonders verwendbar sind die Mutationen oder Deletionen, die zum Zwecke der Attenuation der Virulenz eingeführt werden. Indem man diese Mutationen an den offenbarten virulenzspezifischen Orten verfolgt, wird es möglich, frühzeitig den Ausbruch von möglicherweise virulenten Revertanten vorzusehen.

Mehr bevorzugt ist es, wenn die erfindungsgemässen Nucleotid- Sequenzen solcher Art sind, dass die Nucleinsäure, welche den genannten Marker codiert, innerhalb einem beliebigen der offenen Leseraster, welche virale Strukturproteine codieren, positioniert ist.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung eines erfindungsgemässen infektiösen lebenden attenuierten PRRS-Virus, wobei dieses Verfahren umfasst, eine rekombinante Nucleinsäure der im vorstehenden erwähnten Art zu produzieren, die zumindest eine DNA-Kopie voller Länge oder eine in vitro transkribierte RNA-Kopie oder ein Derivat der einen oder anderen davon enthält.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Verwendung von erfindungsgemässen Viren. Mit der Verfügbarkeit der erfindungsgemässen lebenden PRRS-Viren wurde es möglich, diese zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur Vorbeugung und Behandlung von Infektionen mit PRRS zu verwenden. Die definierte molekulare Basis deren Attenuation verleiht ihnen eine Überlegenheit gegenüber den gegenwärtigen auf herkömmliche Weise attenuierten Viren. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von erfindungsgemässen Viren, welche Deletionen an virulenzspezifischen Orten aufweisen, weil Deletionen weniger zur Reversion neigen.

Eine "Arzneimittelzusammensetzung" besteht im wesentlichen aus einem oder mehrere Ingredienzen, die fähig sind, physiologische d. h. immunologische Funktionen des Organismus, dem erstere verabreicht wird, oder von in oder an dessen Oberfläche lebenden Organismen zu verändern, die aber nicht auf Antibiotika und Parasitenbekämpfungsmittel beschränkt sind, wie auch aus anderen Bestandteilen, die zugesetzt werden, um gewisse Zwecke zu erreichen, wie beispielsweise aber ohne Beschränkung darauf, Verarbeitungsmerkmale, Sterilität, Stabilität, Möglichkeit der Verabreichung der Zusammensetzung über enterale oder parenterale Wege wie ein oraler, intranasaler, intravenöser, intramuskulärer, subcutaner, intradermaler oder anderer geeogneter Weg, Toleranz nach der Verabreichung, Eigenschaften der kontrollierten Abgabe.

Literaturnachweis

1. Snijder E. J., Meulenberg J. J. M., 1998 "The molecular biology of arteriviruses" Jounal of General Virology May 79/5: 961-971
2. Meulenberg J. J. M., Hulst M. M. et al., 1993b "Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome" Virology 192: 62-72
3. Conzelmann K. K., Visser N., Van Woensel P., Thiel H. J., 1993 "Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group" Virology 103: 329-339
4. Murtaugh M. P., Elam M. R., Kakach L. T., 1995 "Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus" Archives of Virology 140: 1451-1460
5. Kapur V., Elam M. R., Pawtovich T. M., Murtaugh M. P., 1996 "Genetic variation in porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the midwestern United States" Jounal of General Virology 77: 1271-1276
6. Rosskow K. D., 1998 "Porcine reproductive and respiratory syndrome" Vet. Pathol. 35: 1-120

Beispiele Beispiel 1 Feststellung der Attenuation

Dieses Beispiel liefert eine klare Anleitung zum Vergleichen des Virulenzcharakters zweier verschiedener Stämme von PRRS-Viren.

An jedem Versuch sind zumindest 10 junge Sauen pro Gruppe beteiligt, die von einer PRRS-freien Farm kommen.

Es wird durch Untersuchung sichergestellt, dass die Tiere keine für das PRRS-Virus spezifische Serum-Antikörper haben und für das PRRS-Virus negativ sind. Alle am Versuch teilnehmenden Tiere sind desselben Ursprungs und derselben Zucht. Die Zuteilung der Tiere zu den Gruppen erfolgt statistisch zufällig.

Die Belastungsinfektion findet beim 90. Tag der Trächtigkeit durch intranasales Auftragen von 1 ml PRRS-Virus mit 10⁵ TDCID₅₀ (dritte Passage) pro Nasenloch statt. Es gibt zumindest drei Gruppen für jeden Untersuchungsgang: eine Gruppe für die Belastungsinfektion mit VR-2332; eine Gruppe für die Belastungsinfektion mit dem möglicherweise attenuierten Virus; und eine Gruppe strikt als Referenz.

Gültigkeit der Untersuchung ist gegeben, wenn die Tiere der strikten Referenz während der Zeitdauer der Untersuchung für das PRRS-Virus negativ bleiben und bei der mit VR-2332 herausgeforderten Gruppe im Vergleich zur strikten Referenz eine um zumindest 25% kleinere Anzahl von lebenden gesunden Ferkeln geworfen werden.

Attenuation, in anderen Worten: verminderte Virulenz, wird definiert als die statistisch signifikante Änderung eines odere mehrerer den Reproduktionserfolg bestimmender Parameter. Bevorzugt wird eine signifikante Abnahme bei der Untersuchungsgruppe in bezug auf zumindest einen der nachstehenden Parameter:

- Frequenz der Totwürfe
- Abort an oder vor dem 112. Tag der Trächtigkeit
- Anzahl der mumifizierten Ferkel
- Anzahl der lebenden und schwachen Ferkel
- Sterblichkeitstziffer vor der Entwöhnung

oder auch eine signifikante Zunahme bei der Untersuchungsgruppe in bezug auf zumindest einen der nachstehenden Parameter:

1. Anzahl entwöhnter Ferkel pro Sau
- - Anzahl lebend und gesund geworfener Ferkel pro Sau im Vergleich zu der mit VR-2332 infizierten Gruppe.

Claims

1. Lebendes PRRS-Virus, das nicht RespPRRS ist und weniger virulent ist als das PRRS-Virus ATCC-Nr. VR-2332, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein enthält, wie es als Beispiel in Abb. 1 für diesen Stamm VR-2332 beschrieben ist oder diesem bei anderen PRRS-Stämmen entspricht, wobei zumindest eine der Aminosäuren in Position 936 bis 956 mit der Aminosäure bzw. den Aminosäuren des Stammes VR-2332 an der entsprechenden Position bzw. den entsprechenden Positionen nicht identisch ist.

2. Lebendes PRRS-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein enthält, wie es als Beispiel in Abb. 1 für diesen Stamm VR-2332 beschrieben ist oder diesem bei anderen PRRS-Stämmen entspricht, wobei zumindest eine der Aminosäuren in Position 936 bis 956 deletiert ist.

3. Lebendes PRRS-Virus, das nicht RespPRRS ist und weniger virulent ist als das PRRS-Virus VR-2332, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein enthält, wie es als Beispiel in Abb. 1 für diesen Stamm VR-2332 beschrieben ist oder diesem bei anderen PRRS-Stämmen entspricht, wobei die Aminosäure in Position 946 mit der Aminosäure des Stammes VR-2332 an der entsprechenden Position nicht identisch ist.

4. Lebendes PRRS-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein enthält, wie es als Beispiel in Abb. 1 für diesen Stamm VR-2332 beschrieben ist oder diesem bei anderen PRRS-Stämmen entspricht, wobei die Aminosäure in Position 946 deletiert ist.

5. Nucleotid-Sequenz, die für ein Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.

6. Nucleotid-Sequenz nach Anspruch 5, wobei die Nucleotid-Sequenz modifiziert worden ist, um einen Virulenzmarker und/oder einen serologischen Marker zu codieren.

7. Nucleotid-Sequenz nach Anspruch 6, wobei die Nucleinsäure, welche den genannten Marker codiert, innerhalb einem beliebigen der offenen Leseraster, welche virale Strukturproteine codieren, positioniert ist.

8. Verfahren zur Erzeugung eines infektiösen lebenden attenuierten PRRS- Virus, wobei dieses Verfahren umfasst, eine rekombinante Nucleinsäure zu produzieren, die zumindest eine DNA-Kopie voller Länge oder eine in vitro transkribierte RNA-Kopie oder ein Derivat der einen oder anderen davon enthält, wobei die Nucleotid-Sequenz eine Nucleotid-Sequenz nach einem der Ansprüche 5 bis 7 ist.

9. Verwendung eines Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur Vorbeugung und Behandlung von Infektionen mit PRRS.