SK10932002A3

SK10932002A3 - Živý oslabený PRRS vírus obsahujúci ORF 1a, 1b a 2, nukleotidová sekvencia kódujúca vírus, spôsob generovania infekčného živého oslabeného PRRS vírusu, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie

Info

Publication number: SK10932002A3
Application number: SK1093-2002A
Authority: SK
Inventors: Knut Elbers; Stefan Pesch; Heike Rengbers
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Priority date: 2000-01-26
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2002-11-06
Also published as: EP1254213A2; CA2396454A1; HUP0204176A2; EA200200743A1; WO2001055353A2; PL356274A1; CZ20022554A3; MXPA02007198A; WO2001055353A3; KR20030032910A; AU2001228502A1; CN1406277A; BR0107827A; AR027291A1; JP2003520601A; HUP0204176A3

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka živých PRRS vírusov, ktoré sú oslabené prostredníctvom aminokyselinových mutácií v špecifických miestach vírusového proteínu, ktoré sú kódované otvoreným čítacím rámcom (ORF) vybraným zo skupiny obsahujúcej ORF 1a, ORF 1b a/alebo ORF 2. Vynález sa týka aj nukleotidových sekvencii kódujúcich uvedené vírusy, spôsobov generovania takýchto vírusov a ich použitia na prípravu farmaceutického prostriedku na profylaxiu a liečenie PRRS infekcií.

Doterajší stav techniky

Záhadné ochorenie ošípaných, neskôr premenované na reproduktívny a respiračný syndróm ošípaných (PRRS), je spôsobované obaleným RNA vírusom s pozitívnym vláknom z rodiny arteriviridae (E. J. Snijder, 1998). Pred približne 10 až 15 rokmi sa zjavne nezávisle objavili dva odlišné PRRS vírusové kmene v USA a v Európe. Ochorenie je v súčasnosti endemické v mnohých krajinách produkujúcich ošípané v Severnej Amerike, Európe a Ázii. Stále je hlavnou príčinou reproduktívnych strát a respiračných ochorení u ošípaných. V USA sa prevalencia infekcie odhaduje až na 70 %.

Vírus sa prenáša inhaláciou, strávením, koitom, ranami spôsobenými uhryznutím alebo ihlami. Replikuje sa v slizničných, pľúcnych alebo regionálnych makrofágoch.

Subklinicky vedie ochorenie k rozptýlenej alebo perzistentnej infekcii. Perzistentne infikované zvieratá vylučujú vírus do orálnych/faryngeálnych tekutín, krvi, výkalov, moču a spermy.

Klinické symptómy u prasníc sa týkajú potratu a predčasného vrhu so slabými novo narodenými prasiatkami, mŕtvo narodenými prasiatkami a

-2autolyzovanými plodmi. Infikované novo narodené prasiatka majú vysokú úmrtnosť alebo trpia pneumóniou. Následná starostlivosť o prasiatka a ich chov sú komplikované pneumóniou, paralelnými bakteriálnymi infekciami a zvýšenou úmrtnosťou. Kance sú náchylné na horúčku a morfologické zmeny v sperme.

Podobne ako u všetkých arterivírusov, predstavuje PRRS vírusový genóm RNA molekula s jedným pozitívnym vláknom dlhým približne 15 kilobáz. ORF’s (otvorené čítacie rámce) 1a a 1b kódujú replikázy, ORF’s 2 a 5 pravdepodobné glykoproteíny (gp 1 až 4), ORF 6 membránový protein (M) a ORF 7 kóduje nukleokapsidový protein (N).

Originálne opisy PRRS infekcie v USA (izolát ATCC VR-2332, uložený 18. júla, 1991 v Američan Type Culture Collection v Rockville, Maryland, USA, Genebank U 87392 U00153) a v Európe (WO 92/21375, izolát Lelystad Agent (CDINL-2.91), uložený 5. júna 19991 v Inštitúte Pasteur, Paríž, prístupové č. 1-1102) identifikovali vírusy, ktoré mali genomické a serologické odchýlky. Porovnanie demonštrovalo, že oba majú spoločného predka, ktorý sa divergoval pred tým, ako bolo ochorenie opísané na konci 80-tych rokov 20. storočia. Pre množstvo PRRS vírusov a ich kompletné štrukturálne protein kódujúce oblasti boli publikované úplné genomické sekvencie (Snijder a ďalší 1998, Meulenberg a ďalší, 1993b; Conzelmann a ďalší 1993; Murtaugh a ďalší, 1995; Kapur a ďalší 1996). PRRS vírus sa môže replikovať in vitro v prasačích pľúcnych makrofágoch, v monocytoch, gliových bunkách a dvoch MA-104 bunkových subpopuláciách (embryotické opičie obličkové bunky) známych ako CL-2621 a MAEC-145 (K.D. Rossow, Porcine reproductive and respirátory syndróme, Vet Pathol 35:1-20, (1998). Dostupné sú aj rekombinantné prostriedky na generovanie infekčných PRRS klonov (EP 0 839 912 A1).

Na ochranu ošípaných sú komerčne dostupné živé oslabené PRRS vakcíny (RespPRRS/Ingelvac® PRS MLV, Boehringer Ingelheim).

Usmrtené vakcíny (inaktivovaný celý vírus) alebo podjednotkové vakcíny (obvyklým spôsobom purifikované alebo heterológne exprimované purifikované vírusové proteíny) sú najčastejšie horšie ako živé vakcíny, čo sa týka ich účinnosti pri produkovaní úplnej ochrannej imunitnej odpovede, aj v prítomnosti adjuvans. Pre PRRS sa demonštrovalo, že v porovnaní s paralelne dostupnými usmrtenými

-3vakcínami indukujú oslabené vakcíny imunitu voči ochoreniu, ktorá trvá dlhšie a je účinnejšia (Snijder a ďalší, vyššie). Súčasné živé PRRS vakcíny sa obvykle oslabujú seriálnym pasážovaním vírusu vo vhodných hostiteľských bunkách, pokiaľ nedôjde k strate patogenity (EP 0529584 B1). Súčasné živé PRRS vakcíny stále nechávajú priestor na vylepšovanie. Po prvé, nepredchádzajú opätovnej infekcii. Po druhé, neumožňujú serologickú diskrimináciu medzi očkovanými zvieratami a zvieratami infikovanými terénnym vírusom. Ale najdôležitejšie zo všetkého je, že živé vakcíny z kompletných mikroorganizmov, hoci oslabené, môžu byť spojené s vážnymi bezpečnostnými problémami. To sa týka najmä RNA vírusov, ako napríklad PRRS vírusu, ktoré sú považované za vírusy s vysokou rýchlosťou mutácií v dôsledku nepresnej replikácie RNA genómu, ktorá je následkom chýbania opravného čítania RNA replikačným enzýmom.

Potenciálna reverzia oslabených živých vírusov môže spôsobiť vážne následky očkovaným zvieratám. Pri obvyklým spôsobom odvodzovaných vírusoch, kde sa oslabenie dosahuje bežným viacnásobným pasážovaním, ostáva molekulový pôvod, ako aj genetická stabilita neznáma a nedá sa predpokladať kedy nastane nástup revertantov.

Preto bolo technickým problémom riešeným týmto vynálezom poskytnutie PRRS vírusov, ktoré s menšou pravdepodobnosťou revertujú na vírusy divého typu. Podstata vynálezu

Vynález sa týka živých PRRS vírusy, ktoré sú oslabené prostredníctvom aminokyselinových mutácií v špecifických miestach vírusového proteínu, ktoré sú kódované otvoreným čítacím rámcom (ORF) vybraným zo skupiny obsahujúcej ORF 1a, ORF 1b a/alebo ORF 2. Vynález sa týka aj nukleotidových sekvencii kódujúcich uvedené vírusy, spôsobov generovania takýchto vírusov a ich použitia na prípravu farmaceutického prostriedku na profylaxiu a liečenie PRRS infekcií.

Riešenie vyššie uvedeného technického problému sa dosahuje prostredníctvom opisu a uskutočnení charakterizovaných v nárokoch.

Pred opisom samotných uskutočnení treba poznamenať, že tak ako sa používajú tu a v pripojených nárokoch, zahŕňajú formy v jednotnom čísle aj množné

-4číslo, pokiaľ z kontextu jasne nevyplýva opak. Tak napríklad označenie PRRS vírus zahŕňa množstvo takýchto PRRS vírusov, označenie bunka označuje jednu alebo viaceré bunky a jej ekvivalenty známe pre priemerného odborníka v oblasti, a tak ďalej. Ak nie je definované inak, všetky tu používané technické a vedecké termíny majú rovnaké významy ako sú obvykle chápané priemerným odborníkom v oblasti, do ktorej spadá tento vynález. Hoci môže byť použitý akýkoľvek spôsob a materiál podobný alebo ekvivalentný s tými, ktoré sú tu opísané, na uskutočňovanie alebo testovanie predloženého vynálezu, teraz budú opísané výhodné spôsoby, zariadenia a materiály. Všetky tu uvedené publikácie sú tu zahrnuté ich citáciou za účelom opísania bunkových línií, vektorov a metodológií, ktoré boli zverejnené v publikáciách, ktoré by mohli byť použité v spojitosti s vynálezom. Nič v nich však nemá byť považované za relevantný predchádzajúci stav techniky vzhľadom k predloženému vynálezu.

Prekvapujúco sa zistilo, že PRRS vírusy zahŕňajú špecifické genomické miesta v niektorých otvorených čítacích rámcoch, ktoré v danej polohe dôsledne revertujú na aminokyseliny originálneho virulentného terénneho kmeňa VR-2332. Evolučný tlak v tomto, od teraz nazývanom virulentnom špecifickom mieste alebo jednoducho označovanom ako miesto podľa vynálezu alebo jednoducho miesto, je obrovský. Pri dvoch revertantových kmeňoch RespPRRS bolo možné po prvý krát demonštrovať, že aminokyselinová mutácia na originálnu virulentnú terénnu izolátovú aminokyselinu v tomto virulentnom špecifickom mieste nastala nezávisle na geografickej polohe, v oboch oblastiach, tak v USA, ako aj v Európe. Živé vakcíny s definovanými mutáciami ako základom oslabenia podľa vynálezu umožňujú vyhnúť sa nevýhodám súčasnej generácie oslabených vakcín. Ďalšia výhoda uvedených oslabovacích mutácií spočíva v ich známej molekulovej unikátnosti, ktorá umožňuje ich použitie ako charakteristických značiek pre oslabené pestivírusy a na ich rozlíšenie od pestivírusov z terénu.

Aminokyselinové a nukleotidové sekvencie obvyklým spôsobom oslabeného vírusu RespPRRS sa porovnávali s originálnym terénnym izolátom VR-2332. Aby sa identifikovali virulentné špecifické miesta, dva uvedené virulentné revertanty sa porovnávali navzájom a s VR-2332, ako aj s RespPRRS.

-5To umožnilo identifikáciu virulečného špecifického miesta v individuálnom vírusovom proteíne, ktoré sa podieľa na virulencii PRRS vírusov.

Podstatou vynálezu sú živé PRRS vírusy, ktoré nie sú RespPRRS, a ktoré sú menej virulentné ako PRRS vírus ATCC VR-2332, pričom sú charakteristické tým, že obsahujú proteín kódovaný otvoreným čítacím rámcom (ORF) vybraným zo skupiny obsahujúcej ORF 1a ako je opísaný na obrázku 1 pre uvedený VR-2332 kmeň, ORF 1b ako je opísaný na obrázku 2 pre uvedený VR-2332 kmeň a/alebo ÔRF 2 ako je opísaný na obrázku 3 pre uvedený VR-2332 kmeň, pričom aspoň jedna z aminokyselín v identifikovaných virulentných špecifických miestach nie je identická s aspoň jednou z aminokyselín kmeňa VR-2332 v zodpovedajúcich polohách.

Číslovanie aminokyselín a nukleotidov je v súlade s databázovým vstupom VR-2332. Obrázky, 1, 2 a 3 poskytujú informácie, ktoré sú reprezentatívne pre všetky PRRS kmene a umožňujú vizualizáciu vynálezu a identifikáciu výhodných aminokyselín a výhodného miesta vo všetkých PRRS vírusoch, ktoré by mohli byť číslované odlišne. Identifikácia týchto polôh sa dosiahne prostredníctvom identifikácie zachovalých charakteristických identických aminokyselín v PRRS kmeni, o ktorý je záujem, a v uvedenom referenčnom kmeni, a následne stanovením polohy miesta vo víruse, o ktorý je záujem, vzhľadom k miestu na obrázku 1,2 a/alebo 3.

Boli identifikované tri z uvedených miest pre proteín kódovaný vírusovým ORF 1a, ORF 1b a/alebo ORF 2, ktoré sú znázornené pre VR-2332 na obrázku 1,2 a/alebo 3.

Ďalej sa vynález týka živého oslabeného PRRS vírusu obsahujúceho ORF 1a, 1b a 2 v podstate ako vo VR 2332, ktorým nie je RespPRRS, a ktorý je charakteristický tým, že aspoň jedna z aminokyselín v polohách 321 až 341 ORF 1a nie je identická s aminokyselinou (aminokyselinami) kmeňa VR 2332 v zodpovedajúcej polohe (polohách) ako je znázornené na obrázku 1 a/alebo aspoň jedna z aminokyselín v polohách 936 až 956 ORF 1b nie je identická s aminokyselinou (aminokyselinami) kmeňa VR 2332 v zodpovedajúcej polohe (polohách) ako je znázornené na obrázku 2 a/alebo aspoň jedna z aminokyselín v polohách 1 až 20 ORF 2 nie je identická s aminokyselinou (aminokyselinami)

-6kmeňa VR 2332 v zodpovedajúcej polohe (polohách) ako je znázornené na obrázku 3. Takže v mieste 321-341 ORF 1a, v mieste 936 až 956 ORF 1b a/alebo v mieste 1 až 20 ORF 2 (pozri obrázky 4, 5 alebo 6) je mutovaný kódujúci nukleotidový triplet pre jednu aminokyselinu alebo pre viac ako jednu aminokyselinu, čo vedie k jednej alebo k niekoľkým zmenám v sekvencií uvedených miest, buď na úrovni nukleovej kyseliny, alebo aj, a to výhodne, tiež na úrovni aminokyseliny, pričom môžu byť mutované až všetky nukleotidové alebo aminokyselinové polohy v uvedenom mieste. Predložený vynález zahŕňa vírusy, v ktorých je mutované buď jedno, alebo dve, alebo všetky tri uvedené miesta. Mutácia znamená nahradenie aminokyseliny inou alebo nahradenie kódujúceho nukleotidu iným (napr. T za C), tak zvanú substitúciu, výhodne takým spôsobom, že sa zmení kódovaná aminokyselina, alebo akúkoľvek inú mutáciu, ako napríklad deléciu alebo inzerciu. Mutácia sa zvyčajne uskutočňuje v kódujúcej nukleotidovej sekvencií.

Uvedené mutácie sa môžu uskutočňovať štandardnými metódami známymi v oblasti, napr. miestne špecifickou mutagenézou (pozri napr. Sambrook a ďalší (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) infekčnej kópie, ako je opísané napr. v Meulenberg a ďalší, Adv. Exp. Med. Biol, 1998, 440:199-206).

V podstate znamená, že aspoň 75 % sekvencie, výhodne 85 %, najvýhodnejšie celá sekvencia okrem miest podľa vynálezu je zhodná s VR 2332. Avšak mutované môžu byť aj ďalšie nukleové kyseliny kódujúce aminokyseliny mimo miest podľa vynálezu. Uvedený vírus podľa vynálezu musí spĺňať kritéria podľa vynálezu, tzn. musí byť menej náchylný na revertovanie na divý typ a aj menej virulentný ako VR 2332.

Živý PRRS vírus podľa vynálezu označuje PRRS vírus ako je definovaný v E. J. Snijder a ďalší (citácia vyššie), ktorý je schopný infikovať ošípané a je schopný replikovať sa v ošípaných. RespPRRS vírus oslabený obvyklým spôsobom je špecificky vyňatý z nárokov. Nie je to vírus podľa vynálezu a špecificky je vylúčený z rozsahu nárokov. RespPRRS vírus je komerčne dostupný od spoločnosti Boehringer Ingelheim Vetmedica (Ingelvac® PRS MLV). Väčšina jeho sekvencie je verejne dostupná (Genebank AJ 223082).

-7Miesto a aminokyseliny, ktoré sú výnimočne dôležité podľa vynálezu, nie sú žiadnym spôsobom obmedzené na presnú polohu, ako je definovaná pre VR-2332 kmeň, ale sú jednoducho použité ako príklad na označenie výhodných aminokyselín, ktoré sú v danej polohe alebo v polohe, ktorá jej zodpovedá v iných PRRS kmeňoch. Pri odlišných PRRS vírusoch sa číslovanie polôh výhodných aminokyselín môže líšiť, ale priemerný odborník v oblasti molekulárnej biológie vírusov čeľade arteriviridae bude schopný jednoducho identifikovať tieto výhodné aminokyseliny prostredníctvom určenia ich polohy vo vzťahu k iným, konzervovaným, aminokyselinám uvedených proteinov.

Výraz menej virulentný ako PRRS vírus VR-2332 sa má chápať vo vzťahu k porovnaniu klinických symptómov vírusu, o ktorý je záujem, s VR-2332. Výhodné postupy na stanovenie toho, či je PRRS vírus menej virulentný ako PRRS vírus VR2332, sú uvedené v príklade 1. Nie všetky možné výhodné aminokyselinové mutácie vo virulentnom špecifickom mieste sa môžu podieľať na znížení virulencie. Postup podľa príkladu 1 poskytuje presný a priamy experimentálny návod na stanovenie toho, či živý PRRS vírus, ktorý obsahuje protein podľa vynálezu, je menej virulentný ako virulentný terénny izolát VR-2332.

Virulentné špecifické miesto sa identifikovalo prostredníctvom revertovania aspoň jednej aminokyseliny z oslabeného vírusu na aminokyselinu z VR-2332. Táto konkrétna aminokyselina je časťou väčšej sekundárnej peptidovej štruktúry, ako napríklad alfa závitnice alebo β skladaného listu alebo vlásenkového β motívu alebo iných. Je preto vysoko pravdepodobné, že susedné aminokyseliny sa tiež podieľajú na regulácii virulencie tohto proteinu. Odborník v oblasti proteínovej chémie by preto očakával vysokú pravdepodobnosť, že sa identifikujú ďalšie aminokyseliny s vlastnosťami podieľajúcimi sa na virulencii v rámci 10 aminokyselín naľavo a napravo od pôvodne identifikovanej aminokyselinovej polohy. 10 až 20 aminokyselín je typický rozsah peptidových motívov v proteínoch. Preto výhodné vírusy podľa vynálezu zahŕňajú protein znázornený príkladným spôsobom na obrázku 1 alebo jemu zodpovedajúci protein v iných kmeňoch, pričom virulentné špecifické miesto zahŕňa 10 aminokyselín proti prúdu a 10 aminokyselín po prúde od pôvodne identifikovanej aminokyselinovej polohy. Výhodnejšie sú tie vírusy, ako boli uvedené vyššie, v ktorých virulentné špecifické miesto zahŕňa 5 aminokyselín

-8proti prúdu a 5 aminokyselín po prúde od pôvodne identifikovanej aminokyselinovej polohy. Najvýhodnejšie sú tie vírusy, ako boli uvedené vyššie, v ktorých virulentné špecifické miesto zahŕňa 3 aminokyseliny proti prúdu a 3 aminokyseliny po prúde od pôvodne identifikovanej aminokyselinovej polohy.

S návodom podľa predloženého vynálezu je možné generovať oslabené PRRS kmene z virulentných terénnych kmeňov mutovaním aminokyselín vo virulentnom špecifickom mieste. Stále ostáva problém bezpečnosti spojený s vysokou frekvenciou mutácií v RNA vírusoch. Tento problém je možné značne znížiť deletovaním špecifických aminokyselín vo virulentnom špecifickom mieste vírusového proteínu. Vynález sa preto týka PRRS vírusov, ako boli uvedené vyššie, ktoré sú charakteristické tým, že aspoň jedna z aminokyselín vo virulečnom špecifickom mieste vírusového proteínu je deletovaná. Výraz deletovaný treba chápať ako chýbajúci v porovnaní s aminokyselinami znázornenými na obrázku v tejto polohe alebo v týchto polohách. Takže v súlade s vynálezom znamená delécia odstránenie jedného alebo viacerých nukleotidov alebo aminokyselín.

Vo výhodnejšom uskutočnení sa preto vynález týka živého oslabeného PRRS vírusu podľa vynálezu, ktorý je charakteristický tým, že aspoň jedna z aminokyselín v polohe 321 až 341 ORF 1a je deletovaná a/alebo aspoň jedna z aminokyselín v polohe 936 až 956 ORF 1b je deletovaná a/alebo aspoň jedna z aminokyselín v polohe 1 až 20 ORF 2 je deletovaná. Takže buď v mieste 321 až

341 ORF 1a, alebo v mieste 936 až 956 ORF 1b, alebo v mieste 1 až 20 ORF 2, alebo vo všetkých troch miestach, je nukleotidový triplet kódujúci aminokyselinu alebo niekoľko tripletov deletovaných, čo vedie k jednej alebo k niekoľkým deléciám v uvedených miestach. Predložený vynález zahŕňa vírusy, v ktorých je deletovaný len jeden nukleotid alebo len jedna aminokyselina, ako aj vírusy, v ktorých je kompletne deletované jedno uvedené miesto alebo aj všetky miesta (pozri obrázky 4, 5 alebo 6).

Aby sa identifikovalo virulentné špecifické miesto v konkrétnom PRRS vírusovom proteíne, vo výhodnom príklade sa demonštrovalo, že aspoň jedna aminokyselina je pod silným mutačným tlakom a podieľa sa na virulentných vlastnostiach revertantov terénneho kmeňa VR-2332. Táto individuálna aminokyselinová poloha je najvýhodnejším uskutočnením vynálezu.

-9Preto sa najvýhodnejšie uskutočnenie predloženého vynálezu týka živého oslabeného PRRS vírusu podľa vynálezu, ktorým nie je RespPRRS, a ktorý je menej virulentný ako ATCC VR 2332, ktorý je charakteristický tým, že aminokyselina v polohe 331 ORF 1a a/alebo aminokyselina v polohe 946 ORF 1b a/alebo aminokyselina v polohe 10 ORF 2 nie je identická s aminokyselinou kmeňa ATCC VR 2332 v zodpovedajúcej polohe. Takže buď v mieste 331 ORF 1a, alebo v mieste 946 ORF 1b, alebo v mieste 10 ORF 2, alebo vo všetkých troch miestach sú nukleotidový triplet kódujúci aminokyselinu alebo aminokyselina mutované, čo vedie k jednej až trom mutáciám v uvedených miestach (pozri obrázky 4, 5 alebo 6).

Z vyššie uvedených dôvodov je bezpečnejšie a výhodné zabrániť reverzii zmenených aminokyselín na virulentný typ jednoduchým deletovaním aminokyseliny, ktorá je náchylná revertovať.

Preto sa najvýhodnejšie uskutočnenie predloženého vynálezu týka živého oslabeného PRRS vírusu podľa vynálezu, ktorý je charakteristický tým že aminokyselina v polohe 331. ORF 1a a/alebo aminokyselina v polohe 946 ORF 1b a/alebo aminokyselina v polohe 10 ORF 2 je deletovaná, inými slovami chýba, keď sa porovnáva so zodpovedajúcou polohou vo VR-2332.

Ďalším najvýhodnejším uskutočnením je živý oslabený PRRS vírus podľa vynálezu, charakteristický tým, že aminokyselina v polohe 331 ORF 1a, tzn. kódujúci triplet, je deletovaná. Ďalším najvýhodnejším uskutočnením je živý oslabený PRRS vírus podľa vynálezu, charakteristický tým, že aminokyselina v polohe 946 ORF 1b, tzn. kódujúci triplet, je deletovaná. Ďalším najvýhodnejším uskutočnením je živý oslabený PRRS vírus podľa vynálezu, charakteristický tým, že aminokyselina v polohe 10 ORF 2, tzn. kódujúci triplet, je deletovaná (pozri obrázky 4, 5 alebo 6). Uvedený najvýhodnejší vírus je zhodný s VR-2332 vo všetkých ostatných polohách.

Opis predloženého vynálezu teraz umožňuje odborníkovi rekombinantne produkovať infekčné klony PRRS vírusov, ktoré sú menej virulentné ako VR-2332 a sú užitočné na prípravu živého farmaceutického prostriedku. Všetky informácie potrebné na produkciu rekombinantných infekčných klonov RNA vírusov s pozitívnym vláknom sú bez problémov dostupné v oblasti, konkrétne pre PRRSV. Napríklad európska prihláška vynálezu EP 0839912 v mene Meulenberg a ďalší,

-10ktorá je tu kompletne zahrnutá, poskytuje jasný návod na prípravu rekombinantných živých PRRS vírusov. Preto sa ďalší predmet predloženého vynálezu týka nukleotidových sekvencií kódujúcich vírus podľa vynálezu. V dôsledku degenerácie genetického kódu bude výsledkom viacerých nukleotidových variantov identická aminokyselinová translácia. Vynález zahŕňa aj tieto degenerované varianty.

Ako bolo uvedené v úvodnej časti, na organizáciu zdravotníckej starostlivosti ošípaných je dôležitá schopnosť rozlíšiť medzi menej virulentným živým vakcínovým kmeňom farmaceutického prostriedku a virulentnými divými typmi vírusových infekcií. To je často ťažké, najmä keď klinické symptómy terénnej infekcie nie sú tak špecifické alebo sú prevrstvené inými infekciami, alebo keď je krátky čas na pozorovanie a zhodnotenie. Rekombinantné generovanie vírusov, o ktoré je záujem, umožňuje začlenenie modifikácií v genetickom kóde, ktoré zavádzajú serologický marker a/alebo virulentný marker. Serologický marker označuje antigénne detegovateľnú molekulu, ako napríklad peptid, protein, glykoproteín, ktorú je možné izolovať z infikovaných buniek alebo telesných tekutín, ako napríklad, ale bez obmedzenia, z faryngeálnych alebo nosných tekutín alebo z moču. Virulentný marker má byť chápaný ako marker v genetickom kóde, ktorý sa môže identifikovať rekombinantnými analytickými metódami, ako napríklad, ale bez obmedzenia, PCR a obvyklým sekvenovaním. Preto sa výhodné uskutočnenie predloženého vynálezu týka nukleotidovej sekvencie podľa vynálezu, ktorá bola modifikovaná tak, že kóduje virulentný marker a/alebo serologický marker. Ako virulentné a serologické markery sú užitočné najmä mutácie alebo delécie zavedené za účelom oslabenia virulencie. Monitorovaním týchto mutácií v opísaných virulentných špecifických miestach je možné predpovedať objavenie sa možných virulentných revertantov v skorom štádiu.

Výhodnejšie je, keď sú nukleotidové sekvencie podľa vynálezu také, že nukleotidová sekvencia kódujúca uvedený marker je lokalizovaná vo vnútri ktoréhokoľvek z otvorených čítacích rámcov kódujúcich štrukturálne vírusové proteíny.

Ďalej sa vynález týka spôsobu na generovanie infekčného živého oslabeného PRRS vírusu podľa vynálezu, ktorý zahŕňa produkciu rekombinantnej

-11 nukleovej kyseliny ako je opísaná vyššie, ktorá obsahuje aspoň jednu úplnú DNA kópiu alebo in vitro transkribovanú RNA kópiu alebo derivát jednej alebo druhej.

Iné výhodné uskutočnenie podľa vynálezu sa týka spôsobu podľa vynálezu, pri ktorom sa metódami molekulárnej biológie zavádzajú špecifické mutácie, pri ktorých je nukleová kyselina zodpovedajúca aminokyselinovým polohám 321 až 341 ORF 1a a/alebo nukleová kyselina zodpovedajúca aminokyselinovým polohám 936 až 956 ORF 1b a/alebo nukleová kyselina zodpovedajúca aminokyselinovým polohám 1 až 20, mutovaná takým spôsobom, že je v uvedených polohách substituovaný alebo deletovaný aspoň jeden nukleotid.

Iným dôležitým predmetom vynálezu je farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje PRRS vírus podľa vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič.

Farmaceutický prostriedok v podstate pozostáva z jednej alebo viacerých zložiek, ktoré sú schopné modifikovať fyziologické, napr. imunologické, funkcie organizmu, ktorému sa podávajú, alebo organizmov, ktoré v ňom alebo na jeho povrchu žijú, ako napríklad, ale bez obmedzenia na antibiotiká alebo antiparazitiká, ako aj iné zložky, ktoré sa do prostriedku pridávajú, aby sa dosiahli určité iné ciele, ako napríklad, ale bez obmedzenia určité vlastnosti pri spracovávaní, sterilita, stabilita, schopnosť jednoducho podávať prostriedok enterálnym alebo parenterálnym spôsobom, ako napríklad orálne, intranazálne, intravenózne, intramuskulárne, subkutánne, intradermálne ale iným vhodným spôsobom, tolerancia po podaní, vlastnosti riadeného uvoľňovania.

Farmaceutický prijateľný nosič môže obsahovať fyziologicky prijateľné zlúčeniny, ktoré slúžia napríklad na stabilizáciu alebo na zvýšenie absorpcie alebo tvoria časť formulácie PRRS vírusu podľa vynálezu s pomalým vylučovaním. Takéto fyziologicky prijateľné zlúčeniny zahŕňajú napríklad uhľovodíky, ako napríklad glukózu, sacharózu alebo dextrány, antioxidanty, ako napríklad kyselinu askorbovú alebo glutatión, chelatačné činidlá, proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou alebo iné stabilizátory alebo excipienty (pozri napr. Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990). 18. vyd. Mack Publ., Easton). Pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé, že voľba farmaceutický prijateľného nosiča vrátane fyziologicky prijateľnej zlúčeniny závisí napríklad na spôsobe podávania zlúčeniny.

-12Ďalší predmet vynálezu sa týka použitia vírusov podľa vynálezu. Tým, že sú dostupné živé oslabené PRRS vírusy podľa vynálezu, je ich teraz možné použiť na výrobu vakcíny na profylaxiu a liečbu PRRS infekcií. Definovanie molekulového základu ich oslabenia, ich robí vynikajúcimi oproti v súčasnosti bežným oslabeným vírusom. Výhodné je najmä použitie vírusov podľa vynálezu, ktoré obsahujú delécie vo virulentných špecifických miestach, pretože delécie sú menej náchylné na reverziu.

Nasledujúci príklad slúži na detailnejšie ilustrovanie predloženého vynálezu, ale nemá byť považovaný za obmedzujúci rozsah tu opísaného vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: Aminokyselinová sekvencia ORF 1a ATTC VR-2332 s označenými výhodnými oslabovacími miestami podľa vynálezu.

Obrázok 2: Aminokyselinová sekvencia ORF 1b ATTC VR-2332 s označenými výhodnými oslabovacími miestami podľa vynálezu.

Obrázok 3: Aminokyselinová sekvencia ORF 2 ATTC VR-2332 s označenými výhodnými oslabovacími miestami podľa vynálezu.

Obrázok 4: Nukleotidová sekvencia ORF 1a ATTC VR-2332 s tučné vytlačenými výhodnými oslabovacími miestami podľa vynálezu a najvýhodnejšie miesta sú podčiarknuté.

Obrázok 5: Nukleotidová sekvencia ORF 1b ATTC VR-2332 s tučné vytlačenými výhodnými oslabovacími miestami podľa vynálezu a najvýhodnejšie miesta sú podčiarknuté.

Obrázok 6: Nukleotidová sekvencia ORF 2 ATTC VR-2332 s tučné vytlačenými výhodnými oslabovacími miestami podľa vynálezu a najvýhodnejšie miesta sú podčiarknuté.

Príklad uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Zavedenie oslabenia

- 13Tento príklad poskytuje jasný návod na porovnanie virulentnosti dvoch rozdielnych kmeňov PRRS vírusov.

V každom pokuse je zahrnutých aspoň 10 mladých prasníc na skupinu, ktoré sú z farmy bez PRRS.

I

Otestuje sa, že zvieratá neobsahujú PRRS vírusové špecifické sérové protilátky a sú PRRSV negatívne. Všetky zvieratá zahrnuté v štúdii sú z rovnakého zdroja a plemena. Zvieratá sa rozdelia do skupín náhodne.

Infikovanie sa uskutočňuje na 90. deň tehotenstva intranazálnou aplikáciou 1 ml PRRSV s 10⁵ TDCID50 (tretia pasáž) na nozdru. Pre každú testovaciu zostavu sú aspoň tri skupiny: Jedna skupina na VR-2332 infekciu; jedna testovacia skupina na infikovanie s možným oslabeným vírusom; a jedná striktná kontrolná skupina.

Hodnotnosť štúdie je potvrdená, keď striktné kontroly ostávajú v priebehu štúdie PRRS negatívne, a keď je v skupine infikovanej s VR 2332 narodených aspoň o 25 % menej živých zdravých prasiatok v porovnaní so striktnými kontrolami.

Oslabenie, inými slovami nižšia virulencia, je definované ako štatisticky významná zmena jedného alebo viacerých parametrov determinujúcich reproduktívny výkon:

Výhodná je významná redukcia aspoň jedného z nasledujúcich parametrov v testovacej skupine:

- frekvencia mŕtvo narodených

- potrat na 112 deň alebo pred 112 dňom ťarchavosti

- počet scvrknutých prasiatok

- počet živých a slabých prasiatok

- mortalita v dôsledku predčasného odstavenia alebo okrem toho je výhodné významné zvýšenie v jednom z nasledujúcich parametrov v testovacej skupine:

- počet kojených prasiatok v jednom vrhu

- počet živých zdravých prasiatok narodených v jednom vrhu

- v porovnaní s VR2332 infikovanou skupinou.

Použitá literatúra

1. Snijder E. J., Meulenberg J. J. M., 1998. The molecular biology of arteriviruses, Journal of Generál Virology, máj 79(5):961-971.

2. Meulenberg J. J. M., Hulst, M. M. a ďalší, 1993b. Lelystad virus, the causative agent of porcine epidémie abortion and respirátory syndróme, Virology 192, 62-72.

3. Conzelmann K. K., Visser N., Van Woensel P., Thiel H. J., 1993. Molecular characterization of porcine reproductive and respirátory syndróme virus, a member of the arterivirus group, Virology 103, 329-339.

4. Murtaugh M. P., Elam M. R., Kakach L. T., 1995. Comparison of the structural proteín coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus, Archives of Virology 140, 1451-1460.

5. Kapur V., Elam M. R., Pawtovich T. M. Murtaugh M. P., 1996. Genetic variation in porcine reproductive and respirátory syndróme virus isolates in the midwestern United States, Journal of Generál Virology 77,1271-1276.

6. Rossow K. D., 1998. Porcine reproductive and respirátory syndróme, Vet Pathol 35: 1-20.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Živý oslabený PRRS vírus obsahujúci ORF 1a, 1b a 2, v podstate ako vo VR-2332, ktorým nie je RespPRRS, a ktorý je charakteristický tým, že aspoň jedna z aminokyselín v polohe 321 až 341 ORF 1a nie je identická s aminokyselinou (aminokyselinami) kmeňa VR-2332 v zodpovedajúcej polohe (polohách) a/alebo aspoň jedna z aminokyselín v polohe 936 až 956 ORF 1b nie je identická s aminokyselinou (aminokyselinami) kmeňa VR-2332 v zodpovedajúcej polohe (polohách) a/alebo aspoň jedna z aminokyselín v polohe 1 až 20 ORF 2 nie je identická s aminokyselinou (aminokyselinami) kmeňa VR-2332 v zodpovedajúcej polohe (polohách).
2. Živý oslabený PRRS vírus podľa nároku 1, ktorý je charakteristický tým, že aspoň jedna z aminokyselín v polohe 321 až 341 ORF 1a je deletovaná a/alebo aspoň jedna z aminokyselín v polohe 936 až 956 ORF 1b je deletovaná a/alebo aspoň jedna z aminokyselín v polohe 1 až 20 ORF 2 je deletovaná.
3. Živý oslabený PRRS vírus podľa nároku 1 alebo 2, ktorý je charakteristický tým, že aminokyselina v polohe 331 ORF 1a a/alebo aminokyselina v polohe 946 ORF 1b a/alebo aminokyselina v polohe 10 ORF 2 nie je identická s aminokyselinou kmeňa ATTC VR 2332 v zodpovedajúcej polohe.
4. Živý oslabený PRRS vírus podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, ktorý je charakteristický tým, že aminokyselina v polohe 331 ORF 1’a a/alebo aminokyselina v polohe 946 ORF 1b a/alebo aminokyselina v polohe 10 ORF 2 je deletovaná.
5. Nukleotidová sekvencia kódujúca vírus podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4.
6. Nukleotidová sekvencia podľa nároku 5, ktorá bola modifikovaná tak, že kóduje virulentný marker a/alebo serologický marker.
7. Nukleotidová sekvencia podľa nároku 6, v ktorej je nukleová kyselina kódujúca marker lokalizovaná vo vnútri ktoréhokoľvek z otvorených čítacích rámcov kódujúcich štrukturálne vírusové proteíny.
8. Spôsob generovania infekčného živého oslabeného vírusu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa produkciu rekombinantnej nukleovej kyseliny obsahujúcej aspoň jednu úplnú DNA kópiu alebo in vitro transkribovanú RNA kópiu alebo ich derivát, pričom uvedenou nukleotidovou sekvenciou je nukleotidová sekvencia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7.
9. Spôsob podľa nároku 8, pri ktorom sa prostredníctvom metód molekulárnej biológie zavádzajú špecifické mutácie, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina zodpovedajúca aminokyselinovým polohám 321 až 341 ORF 1a a/alebo nukleová kyselina zodpovedajúca aminokyselinovým polohám 936 až 956 ORF 1b a/alebo nukleová kyselina zodpovedajúca aminokyselinovým polohám 1 až 20 ORF 2 je mutovaná takým spôsobom, že v uvedených polohách je aspoň jeden nukleotid substituovaný alebo deletovaný.
10. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje PRRS vírus podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4 a farmaceutický prijateľný nosič.
11. Použitie PRRS vírusu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4 na výrobu vakcíny na profylaxiu a liečbu PRRS infekcií.